Molekulare und funktionelle Analyse des neu identifizierten APAF-1-bindenden, pro-apoptotisch wirkenden Proteins CABY

Molecular and functional analysis of CABY, a novel pro-apoptotic and Apaf-1 binding protein

  • Der mitochondriale Apoptose-Signalübertragungsweg spielt nicht nur bei der Death Rezeptor-induzierten Apoptose in Typ II-Zellen eine Rolle, sondern z.B. auch bei Bestrahlung und Behandlung mit Chemotherapeutika. Über Cytochrom-c Freisetzung, Apoptosombildung und Caspase-9 Aktivierung kommt es zur Spaltung und Aktivierung der Effektorcaspase-3. Die durch Bindung von dATP und zytosolischem Cyt-c induzierte Konformationsänderung von APAF-1 führt nach anschließender ATP-Hydrolyse zur Oligomerisierung von insgesamt sieben APAF-1-Molekülen unter gleichzeitiger Rekrutierung von Caspase-9 über die in beiden Molekülen vorhandene N-terminale Caspase-Rekrutierungsdomänen (CARD). Es entsteht der so genannte Apoptosomkomplex. Die autoproteolytische Prozessierung und Aktivierung von Caspase-9 mit anschließender Spaltung von Caspase-3 im Apoptosomkomplex führt zum Auslösen der apoptotischen Caspasekaskade und zur Spaltung wichtige zellulärer Substrate. Eine wichtige Rolle bei der Regulation der Apoptosom-vermittelten Caspase-9-Aktivierung spielen u.a. die Mitglieder der Bcl-2 Proteinfamilie, die IAPs und Hitzeschockproteine. Die Blockade des intrinsischen Apoptose-Signalübertragungsweges führt in Tumoren zur Resistenzentwicklung gegenüber Chemo- und Strahlentherapie. Deshalb wurde mit Hilfe des Hefe-Two-Hybrid Systems ein Screen nach neuen regulatorischen Proteinen, die an der Apoptosomkomplex-Bildung beteiligt sind, durchgeführt und dabei ein neuer APAF-1 Interaktionspartner entdeckt, den wir CABY („CED-4 and APAF-1 binding protein found in yeast“) genannt haben. CABY ist ein 160 Aminosäuren großes, pro-apoptotisches Protein, das eine so genannte DUF59 Domäne enthält, für die bisher noch keine Funktion beschrieben wurde. Es konnte nachgewiesen werden, daß CABY ein evolutionär hoch konserviertes Protein darstellt und daß die humane CABY cDNA zwei alternative Translations-Initiationsregionen enthält, die zu der Expression der CABYL bzw. der um 32 Aminosäuren verkürzten CABYS Isoformen führen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte darüber hinaus eine detaillierte molekulare und funktionelle Analyse von CABY durchgeführt werden. Als Hilfsmittel für die molekularbiologische Analyse wurden sowohl CABY-spezifische polyklonale Antiseren als auch Hybridoma-Zelllinien hergestellt, die monoklonale anti-CABY Antikörper produzieren. Mit biochemischen Untersuchungen wie in vitro GST Pulldown und in vivo Ko-Immunpräzipitationsexperimenten, sowie durch Ko-Lokalisationsstudien mit überexprimierten und endogenen Proteinmengen konnte die Bindung von CABY an APAF-1 verifiziert werden. Mit Hilfe von APAF-1-Deletionsmutanten wurden die Aminosäuren 412-420 der zentralen Linkerdomäne als verantwortlicher Bereich für die Interaktion mit CABY identifiziert. Interessanterweise bindet CABY in vitro zusätzlich sowohl an die N-terminale CARD Domäne von APAF-1 als auch an Pro-Caspase-9. Ko-Immunpräzipitationsexperimente mit endogenen Proteinen konnten zeigen, daß CABY in gesunden Zellen nicht nur mit dem vollständigen APAF-1 Protein, sondern auch mit der verkürzten 84 kDa großen APAF-1-Isoform in einem Komplex assoziiert vorliegt. Zudem konnte nachgewiesen werden, daß CABY-Proteine homophile Interaktionen eingehen und Dimere ausbilden können. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CABY mit APAF-1 wurden auch funktionelle Analysen mit Hilfe dominant negativer CABY Deletionsmutanten sowie mit siRNA Zellkulturexperimenten durchgeführt, um die Bedeutung von CABY für den intrinsischen mitochondrialen Apoptose Signalübertragungsweg untersuchen zu können. Es wurde festgestellt, daß bei Überexpression von CABY die Zellen für Mitomycin C-induzierte Apoptose sensitisiert werden. Die Überexpression einer C-terminal um 20 Aminosäuren deletierten CABY Mutante wie auch der N-terminal verkürzten CABYS Isoform inhibieren jedoch Mitomycin C-induzierte Apoptose. Die Ergebnisse aus CABY siRNA-Knockdown-Experimenten lassen vermuten, daß CABY-ähnliche funktionell redundante Proteine existieren. In den mit CABY siRNA stabil transfizierten K562- und RKO-Zelllinien konnte festgestellt werden, daß der Verlust endogener CABY-Expression in diesen Zelllinien nur einen geringen Einfluss auf das Apoptoseverhalten ausübt, und zwar unabhängig von der Art des eingesetzten apoptotischen Stimulus. Einen Hinweis auf einen möglichen kompensatorischen Mechanismus liefert die Existenz des ribosomalen Proteins S28e, dessen DUF59-Domäne zu über 90% identisch ist mit der CABY-DUF59-Domäne. S28e könnte potentiell CABY-Funktionen ausüben. Ausgehend von mit der pro-apoptotischen Funktion von CABY wurde nach Tumortypen gesucht, in denen die CABY-Expression im Vergleich zum Normalgewebe signifikant herunterreguliert wird. Die Analyse endogener CABY Expressionsmengen in humanen Tumoren konnte dabei einen Verlust an CABY Expression in GIST-Tumoren nachweisen. Dieses Ergebnis weist auf eine mögliche Rolle von CABY als Tumorsuppressorprotein hin.
  • The mitochondrial apoptotic signaling pathway plays an important role in death receptor-mediated apoptosis in type II cells and for radiation- and chemotherapy-induced cell death. The release of Cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space, apoptosome formation and subsequent Caspase-9 activation lead to cleavage of the effector pro-Caspase-3, thereby either initiating or amplifying the apoptotic signaling cascade. The interaction of the adaptor protein APAF-1 with released cytoplasmatic Cytochrome c and dATP induces conformational changes within APAF-1, resulting in oligomerisation of seven APAF-1 molecules upon ATP hydrolysis and concurrent recruitment of Caspase-9 via its CARD domain into the newly formed apoptosome complex. Autoproteolytic activation of Caspase-9 and subsequent cleavage of Caspase-3 trigger the caspase cascade, resulting in cleavage of important cellular substrates. Members of the Bcl-2 protein family as well as IAPs and heat shock proteins play an important role for the regulation of apoptosome-mediated Caspase-9 activation. Tumors show a significant correlation between mutational inhibition of the intrinsic apoptotic signaling pathway and the development of resistance to chemo- and radiotherapy. Therefore we performed yeast-two-hybrid interaction screens to identify new proteins which are involved in the regulation and/ or formation of the Apoptosome complex. During these experiments, we discovered a novel APAF-1 binding protein which we named CABY (“CED-4 and APAF-1 binding protein found in yeast”). CABY consists of 160 amino acids and contains a so-called DUF59 domain for which no function has yet been assigned. We could show that CABY protein sequence was strongly conserved during evolution and that humane CABY cDNA contains two alternative translation initiation regions, leading to expression of the two different CABYL and CABYS isoforms which differ by 32 aa in length. The aim of this work was a further detailed molecular and functional analysis of CABY. For this purpose, a CABY-specific polyclonal antiserum, as well as monoclonal anti-CABY antibodies producing hybridoma cell lines were generated and established as tools for further biochemical analysis. In vitro GST pulldown assays, in vivo co-immunoprecipitation experiments and co-localization studies with overexpressed and endogenous proteins confirmed the interaction between CABY and APAF-1. By using APAF-1 deletion mutants, amino acids 412-420 within the central APAF-1 linker domain were identified as the responsible CABY-binding domain. Interestingly, CABY is also able to bind in vitro to the N-terminal CARD domain of APAF-1, as well as to Pro-Caspase-9. Co-immunoprecipitation experiments with endogenous protein levels could demonstrate that under non-apoptotic conditions CABY not only associates with the full length APAF-1 protein but also with the processed 84 kDa large APAF-1 isoform. Furthermore, CABY molecules display homophilic interactions, thereby forming homodimers. In addition, functional analysis with CABY dominant negative deletion mutants as well as with CABY siRNA was performed to evaluate the physiological relevance of CABY within the intrinsic apoptotic signaling pathway. It was observed that CABY overexpression results in sensitization towards apoptosis, specifically upon treatment with Mitomycin C. Overexpression of either a C-terminally truncated CABY mutant or the CABYS isoform alone result in inhibition of Mitomycin C-induced apoptosis. Experiments performed with cell lines stably expressing CABY siRNA showed that the loss of endogenous CABY expression did not influence the apoptotic behaviour significantly. This appears independent of the type apoptotic stimulus applied. Apparently, other proteins with redundant CABY functionality must exist. The ribosomal protein S28e represents one example of a protein which could potentially compensate for the loss of CABY expression since it also consists of a DUF59 domain which is 90% identical with the DUF59 domain of CABY. In support of CABY´s pro-apoptotic properties, an investigation of endogenous CABY expression in human tumor samples was performed and revealed downregulation of CABY expression in human gastrointestinal stroma tumors (GIST). This observation might indicate a potential function for CABY as a tumor suppressor protein.

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Metadaten
Author:Robert Pick
URN:urn:nbn:de:hebis:30-26900
Referee:Bernd Ludwig
Document Type:Doctoral Thesis
Language:German
Date of Publication (online):2006/05/22
Year of first Publication:2006
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2006/05/17
Release Date:2006/05/22
Tag:Apoptosis
Apoptosis
HeBIS-PPN:178221546
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie / Biochemie und Chemie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht