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Marloes Penning de Vries

• An application of EPR spectroscopy that is becoming increasingly important is the measurement of distances between electron spins. Several EPR methods have been developed for this purpose, all based on measuring the dipolar coupling between two spins. Due to the specific nature of the sample, we applied dipolar relaxation enhancement measurements to study the geometry of a protein-protein complex. The paramagnetic centers in question had EPR spectra that were too broad and had such short relaxation time that they could not be studied using the more straightforward PELDOR technique. EPR spectral resolution can be increased appreciably by measuring at a frequency higher than conventional X-band (9 GHz) frequency. The spectra of many paramagnetic species can only be resolved at frequencies higher than 90 GHz. For accurate measurement of the orientation of the vector between two dipolar coupled spins with respect to the g-tensors of the spins, high spectral resolution is required. We therefore performed our EPR measurements at G-band (180 GHz) frequency. Dipolar relaxation measurements were applied to study the complex that is formed by the two electron-transfer proteins cytochrome c and cytochrome c oxidase (CcO) from the soil bacterium Paracoccus denitrificans. We were able to detect dipolar relaxation enhancement due to complex formation of soluble subunit II of P.d. CcO (CcOII) with two substrate cytochromes, which was practically absent in a mixture of CcOII with the negative control protein cytochrome c1. This complex formation was characterized by a pronounced temperature dependence that could be simulated using a home-written computer program. The G-band EPR measurements could not be simulated with a single complex geometry. This provided evidence for the hypothesis that electron-transfer protein complexes are short-lived and highly dynamic; they do not seem to form one specific electron-transfer conformation, but rather move around on each other’s binding surfaces and transfer an electron as soon as the distance between donor and acceptor is short enough. As a test of our simulation program, we also applied dipolar relaxation measurements to specially synthesized organic molecules that contained a nitroxide radical and a metal center. The transverse relaxation of Cu2+-OEP-TPA was compared to the relaxation of Ni2+-OEP-TPA at temperatures between 20 and 120 K. In this temperature range, the nitroxide relaxation was enhanced due to the presence of Cu2+, but not by Ni2+. Similarly, relaxation enhancement was found in the nitroxide-Mn2+ pair in Mn2+-terpyridine-TPA with respect to the terpyridine-TPA ligand. Due to the fast T2 relaxation of the nitroxide radical at high temperatures, the measurements were all performed in the low-temperature regime where the T1 relaxation rate of the metal ion was smaller than the dipolar coupling frequency. In this region, no structural information about the molecule can be deduced, since the dipolar relaxation enhancement is only determined by the T1 of the metal ion. The dipolar relaxation measurements we performed at high field indicated a difference in relaxation times between X-band and G-band frequencies. Extensive T1 - measurements of different paramagnetic centers (CuA, Cu2+) confirmed a strong dependence of T1 on magnetic field in the temperature range where the direct process is the dominating T1 relaxation process. This dependence is very strong (factor of 103 with respect to X-band), but does not follow the B04 dependence predicted in literature. The T1 relaxation of low-spin iron in cytochrome c at high magnetic field, estimated from dipolar relaxation data, is also in agreement with a larger contribution by the direct process (factor of 104). Dipolar relaxation enhancement was found to be a technique that is useful for measuring distances between paramagnetic centers, but only for systems where several important conditions are met, such as: the system exists in one certain static geometry, and the relaxation rate of the fast-relaxing spin is faster than the dipolar coupling frequency within the accessible temperature range. Additionally, it is a great advantage for the analysis of dipolar relaxation data if the procedure of dividing the relaxation trace of the dipolar-coupled slow-relaxing spin by the relaxation trace of the slow-relaxing spin in absence of dipolar coupling can be applied. Another useful application of dipolar relaxation enhancement measurements is the measurement of T1 relaxation of extremely fast-relaxing spins, or spins that are otherwise difficult to detect.
• Das Messen von Abständen zwischen Elektronen ist in den letzten Jahren zu einem wichtigen Teil der EPR Spektroskopie geworden. Zu diesem Zweck sind mehrere EPR Methoden entwickelt worden, die alle auf einem Prinzip beruhen: das Messen der dipolare Kopplung zwischen den Elektronenspins. Auf Grund spezifischer Eigenschaften der Probe, haben wir die Methode der dipolare Relaxationsmessung ausgeübt, um die Geometrie eines Protein-Protein Komplexes zu bestimmen. Die paramagnetische Zentren, an die wir interessiert waren, zeigten sehr breite Spektren auf, und hatten eine so grosse Relaxationsrate, dass sie nicht mit der besser überschaubare PELDOR Methode gemessen werden konnten. Die spektrale Auflösung eines EPR Spektrens kann vielmals vergrössert werden wenn man bei Mikrowellenfrequenzen misst die höher sind als die konventionellen X-Band (9 GHz) Frequenz. Die EPR Spektren vieler paramagnetischen Zentren können erst bei Frequenzen ab 90 GHz völlig aufgelöst werden. Für die genaue Bestimmung der Orientierung des dipolaren Vektors zwischen zwei Spins bezüglich die g-Tensore der Spins, ist es notwendig über eine hohe spektrale Auflösung zu verfügen. Unsere EPR Experimente sind deshalb bei G-Band Frequenz (180 GHz) ausgeführt worden. Die Doktorarbeit besteht aus drei Teilen: der erste Teil berichtet von der Bestimmung der Geometrie des Protein-Protein Komplexes von Cytochrom c und Cytochrom c Oxidase (CcO) mit Hilfe von EPR bei X-Band und G-Band Frequenzen und Simulationen. Der zweite Teil handelt von Strukturuntersuchungen an Modellsystemen, die durchgeführt wurden um ein Simulationsprogramm für dipolare Relaxations-messungen zu testen. Im dritten Teil werden T1 Relaxationsmessungen bei G-Band Frequenz präsentiert. Für die Aufklärung der Struktur des Elektronen-Transfer Komplexes, das von den Membranproteinen des Bakteriums Paracoccus denitrificans (P.d.), Cytochrom c und CcO, gebildet wird, sind EPR dipolare Relaxationsmessungen durchgeführt worden. Wir haben eine Zunahme der Relaxationsrate des CuA Zentrums durch Komplexbildung von wasserlösliches Subunit II aus P.d. CcO (CcOII) mit zwei Substrat Cytochromen festgestellt. Diese war nahezu abwesend in einer Mischung aus CcOII und der negativen Kontrolle Cytochrome c1. Die Komplexbildung wird gekennzeichnet durch eine charakteristische Temperaturabhängigkeit. Für die X-Band Daten konnte diese von einem im Haus geschriebenen Computerprogramm simuliert werden. Die G-Band EPR Daten konnten allerdings nicht mit einer einzigen Komplexgeometrie simuliert werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass Elektronen-Transfer Proteinen Komplexe bilden die dynamisch und kurzlebig sind; sie formen offenbar nicht ein spezifisches Elektronen-Transfer Komplex, sondern sie bewegen sich über ihre gegenseitige Bindungsflächen und es wird einen Elektron übertragen sobald der Abstand zwischen Elektronendonator und Akzeptor kurz genug ist. Als Test für unseres Simulationsprogramm haben wir zusetzlich dipolare Relaxationsmessungen angewandt auf speziell synthetisierte Organische Molekülen die ein Nitroxidradikal und einen Metallatom enthalten. Die transversale Relaxation des Nitroxidspins in Cu2+-Orthoethylprophyrin-TPA wurde mit der Relaxation des Nitroxidspins in Ni2+-Orthoethylporphyrin-TPA verglichen bei Temperaturen zwischen 20 und 120 K. In diesem Temperaturbereich wurde die Relaxation des Nitroxidradikals beschleunigt auf Grund der Anwesenheit des Cu2+, aber nicht in Anwesenheit des Ni2+. Ebenso war die Relaxation des Nitroxids schneller in Mn2+-Terpyridin-TPA im Vergleich zu der Relaxation des Nitroxids in Terpyridin-TPA wegen der Präsenz des paramagnetischen Mn2+. Wegen der schnellen T2 Relaxation des Nitroxids wurden die Messungen bei relativ niedrigen Temperaturen durchgeführt wo die T1 Rate des schnell relaxierenden Spins kleiner war als die dipolare Kopplung. In dem Temperaturbereich ist die dipolare Relaxation unabhängig von der exakten Grösse der dipolare Kopplung, und kann keine Strukturelle Information aus den dipolare Relaxationsmessungen hergeleitet werden. Die dipolaren Relaxationsmessungen hatten schon angedeutet dass es Unterschiede gibt zwischen T1 Relaxation in X-Band und in G-Band. T1 Relaxations-messungen in G-band an verschiedenen paramagnetischen Zentren (CuA, Cu2+) zeigten auf, dass es eine starke Magnetfeldabhängigkeit des T1-Wertes gibt in dem Temperaturbereich wo die Relaxation von dem direkten Prozess bestimmt wird. Diese Abhängigkeit ist sehr stark (Faktor 103 im Vegleich zu X-Band), aber stimmt nicht überein mit der B04 Abhängigkeit, die in der Literatur hantiert wird. Die T1 Relaxation von low-spin Eisen in Cytochrom c in G-band, geschätzt aus den dipolaren Relaxations-messungen, stimmt auch überein mit einem grösseren Beitrag des direkten Prozesses (Faktor 104). Es wurde befunden dass die dipolare Relaxationsmessung eine geeignete Methode ist zur Abstandsbestimmung zwischen paramagnetischen Zentren, wenn einige Punkten betrachtet werden: die Probe liegt in einer festen Konformation vor, und die T1 Relaxationsrate des schnell relaxierenden Elektronenspins ist grösser als die dipolare Kopplung in dem verfügbaren Temperaturbereich. Es ist auch ein grosser Vorteil für die Interpretation der dipolaren Relaxationsdaten wenn die reine dipolare Relaxation bekommen werden kann in dem man die Relaxationskurve des langsam relaxierenden gekoppelten Spins durch die Relaxationskurve des langsam relaxierenden ungekoppelten Spins dividieren kann. Für Fragestellungen deren Antwort eher Qualitativ ist, z.B.: „bilden diese zwei Proteinen einen Komplex oder nicht?“, ist die dipolare Relaxationsmethode eine sehr geeignete Messmethode. Eine andere Anwendung der dipolare Relaxationsmessung ist die Messung der T1 Relaxation von sehr schnell relaxierenden Spins, oder von Spins die aus anderen Gründen schwer zu Detektieren sind.