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Markus Schwab

• Disruption of the complex gastrointestinal ecosystem between the resident microflora and the colonic epithelial cells has been associated with increased inflammation and altered cell growth. Possible endpoints of this disturbance are IBD and CRC. The data presented in this thesis, entitled "PPARgamma as molecular target of epithelial functions in the gastrointestinal tract", shed further light on the underlying molecular mechanisms contributing to the well ordered homeostasis of this gastrointestinal ecosystem. Except for elucidating important roles for mesalazine and the dietary HDAC inhibitors butyrate and SFN in a) the modulation of cellular growth, b) the induction of APs, and c) the control of NFkappaB signalling in CRC cells, the involvement of the nuclear hormone receptors PPARgamma und VDR as "gatekeepers" in these intricate regulatory mechanisms were established. Future work will be engaged in analysing whether these in vitro findings are also physiologically relevant in regard to prevention and therapy of gastrointestinal diseases. Within the scope of this work, in Paper I and II it could be demonstrated that butyrate and mesalazine act via PPARgamma to induce their anti-proliferative and pro-apoptotic actions along the caspase signalling pathway. Activation of the intrinsic and extrinsic signalling trail and the down-regulation of anti-apoptotic proteins are responsible for increased caspase-3 activity caused by butyrate. In contrast, mesalazine merely activates this cascade via the extrinsic trail and the IAPs. Moreover, a signal transduction pathway leading to increased cell death via p38 MAPK - PPARgamma - caspase-3 in response to butyrate was unveiled. In addition, there is strong evidence that mesalazine-mediated pro-apoptotic and growth-inhibitory abilities are controlled by PPARgamma-dependent and -independent mechanisms which appear to be triggered at least in part by the modulation of the tumor suppressor gene PTEN and the oncoprotein c-myc, respectively. In Paper III and IV the induction of the APs HBD-2 and LL-37 in response to the dietary HDAC inhibitors butyrate and SFN was pinpointed. Regarding the molecular events of this regulation, the data presented in this thesis provide strong evidence for the involvement of VDR in HBD-2- and LL-37-induced gene expression, while the participation of PPARgamma was excluded. Moreover, the role for p38 MAPK and TGF-beta1 in the up-regulation of LL-37 caused by butyrate was established. In contrast, SFN-mediated induction of HBD-2 is modulated via ERK1/2 signalling. The findings in Paper V clearly refer to the involvement of the nuclear hormone receptors PPARgamma and VDR in butyrate-mediated suppression of inducible NFkappaB activation dependent on the stimulated signalling pathway caused by LPS or TNFalpha. Moreover, an inhibitory role for VDR in the regulation of basal NFkappaB activation was revealed. On the contrary, a modulating role for PPARgamma on basal NFkappaB could be debarred. Altogether the data presented in this thesis not only provide new insights in the understanding of the fundamental gastrointestinal physiology regulated by nuclear hormone receptors, but also may offer opportunities for the development of potential drug targets and therapeutic strategies in the treatment of IBD and CRC.
• Die Mukosa des Gastrointestinaltraktes befindet sich in einem komplexen dynamischen Gleichgewicht. Schon kleinste Störungen dieses epithelialen Systems können zu einer veränderten Expression von antimikrobiell wirkenden Peptiden, zur Initiierung von unkontrolliertem Zellwachstum sowie zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkappaB verbunden mit der Freisetzung zahlreicher Entzündungsparameter führen. Diese Faktoren begünstigen die Entstehung gastrointestinaler Erkrankungen wie des kolorektalen Karzinoms und chronisch entzündlicher Darmerkrankungen. Die vorliegende Arbeit mit dem Titel "PPARgamma als molekulares Target epithelialer Funktionen im Intestinaltrakt" hatte das Ziel, das Verständnis molekularer Mechanismen, die zur Aufrechterhaltung der gastrointestinalen Homäostase beitragen, zu vertiefen. Neben der Entschlüsselung wichtiger Funktionen von Mesalazin sowie der natürlich vorkommenden Histondeacetylase-Inhibitoren Butyrat und Sulforaphan in a) der Regulierung des Zellwachstums, in b) der Induktion der antimikrobiellen Peptide Beta-Defensin-2 und Cathelicidin, sowie in c) der Modulation des NFkappaB-Signaltransduktionsweges in kolorektalen Tumorzellen, konnte die Beteiligung der nukleären Hormonrezeptoren PPARgamma und VDR als sog. "Gatekeepers" in diesen komplexen Regulierungsvorgängen aufgezeigt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmals die Bedeutung von PPARgamma als zentrales zwischengeschaltetes Signalmolekül an den durch Butyrat- und Mesalazin-vermittelten pro-apoptotischen Effekten entlang der Caspase-Kaskade in Kolonozyten nachgewiesen. Die durch Butyrat-induzierte Caspase-3 Aktivität resultierte dabei aus der Initiierung sowohl des intrinsischen als auch des extrinsischen Signaltransduktionsweges bei simultaner Expressionshemmung der beiden inhibitorischen Apoptoseproteine Survivin und Xiap. Im Gegensatz dazu aktivierte Mesalazin diese Kaskade lediglich über den extrinsischen Weg. Zudem konnte ein durch Butyrat-vermittelter p38-MAPK-PPARgamma-Caspase-3-Signalweg etabliert werden. Im vorliegenden in vitro Zellsystem wurden ferner PPARgamma-abhängige und -unabhängige Regulierungsmechanismen an den durch Mesalazin-induzierten pro-apoptotischen und anti-proliferativen Wirkungen nachgewiesen. Diese Vorgänge werden u. a. über die modulierende Funktion von Mesalazin auf das Tumor-Suppressor-Gene PTEN bzw. auf das Onkoprotein c-Myc vermittelt. Des Weiteren konnte aufgezeigt werden, dass die durch Butyrat- und Sulforaphan-induzierte Expressionssteigerung der antimikrobiellen Peptide Beta-Defensin-2 und Cathelicidin von einer Vielzahl von Signalkaskaden und Rezeptoren reguliert wird. In diesem Induktionsprozess konnte erstmalig die essentielle Bedeutung des VDR aufgezeigt werden. Eine Beteilung von PPARgamma wurde hingegen ausgeschlossen. Zudem wird die durch Butyrat-gesteigerte Cathelicidin-Expression vorwiegend über den p38-MAPK-Signalweg sowie über TGF-beta1 reguliert. Der ERK1/2-Signalweg ist hingegen in die durch Sulforaphan-induzierte Expressionssteigerung von Beta-Defensin-2 involviert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem erstmals die Bedeutung von PPARgamma und VDR als zwischengeschaltete Signalmoleküle der supprimierenden Wirkung von Butyrat auf die NFkappaB-Aktivität in Abhängigkeit von dessen Triggerung durch die pro-inflammatorischen Stimuli LPS und TNFalpha aufgezeigt werden. Darüber hinaus wurde eine regulatorische Funktion des VDR auf die basale NFkappaB-Aktivität nachgewiesen. Eine modulierende Wirkung von PPARgamma auf die basale NFkappaB-Aktivität konnte hingegen nicht beobachtet werden. Mit den vorliegenden Resultaten in kolorekatalen Tumorzellen wird das Spektrum der intestinalen Zellregulierung durch die modulierende Funktion von Mesalazin, Butyrat und Sulforaphan auf die Caspase-Kaskade, auf antimikrobielle Peptide sowie auf den NFkappaB- Signaltransduktionsweg erweitert. Ferner konnte eine Beteiligung der nukleären Hormonrezeptoren PPARgamma und VDR an den genannten Signaltransduktionsprozessen aufgezeigt werden. Die vorliegende Arbeit unterstreicht somit nicht nur die allgemeine zellbiologische Bedeutung der beiden nukleären Hormonrezeptoren PPARgamma und VDR an gastrointestinalen Regulierungsvorgängen, sondern impliziert auch deren Potential zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze in der Behandlung des kolorektalen Karzinoms und von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. Die prinzipielle Relevanz der gefundenen Daten muss jedoch durch weitere grundlagenwissenschaftliche und intensive klinische Forschungsbemühungen untersucht werden.