Electron tomography of membrane proteins

  • Electron tomography was used to investigate membrane proteins in a variety of contexts. A high-angle tilt holder, suitable for electron tomography was designed, constructed and characterised. 2D crystals of membrane proteins, NhaA and YidC, were examined as a resolution test, and a method established for determining planarity of crystals. A model for specific gold binding to NhaA crystals was also presented. ATP synthase, a membrane protein complex in mitochondria, were imaged in a frozen hydrated state. They were found to form ribbons of dimers at highly curved regions of the membrane. Dimers from bovine heart and rat liver were excised from the tomographic volumes and averaged. Based on the location of the dimers in the mitochondrion, a model was established whereby ATP synthase, a molecular motor driven by the proton motive force, benefits from the high curvature that it induces in the membrane. Whole yeast mitochondria, imaged by electron cryo-tomography, also contained long ribbons of dimeric ATP synthase. Multiple copies of an unknown membrane protein complex were visualised by electron cryo-tomography, excised and averaged. A general method for the identification of unknown proteins was presented to deal with this inevitable issue, as native tissues and organelles are imaged, and the structures of complexes determined in situ.
  • Einleitung Die Elektronentomografie ist ein relativ neues biophysikalisches Verfahren, mit dem dreidimensionale Bilder eines Objektes aus einer Reihe elektronenmikroskopischer Aufnahmen aus verschiedenen Winkeln errechnet werden können. Die maximale Probendicke ist durch die Beschleunigungsspannung bestimmt und beträgt etwa 500 nm für ein 300 kV Elektronenmikroskop. Proben für die Elektronentomografie werden entweder chemisch fixiert und in Kunstharz eingebettet, mit Kontrastmittel wie Uranylacetat gefärbt, oder in flüssigem Ethan in einer dünnen amorphen Eisschicht gefroren (vitrifiziert). Die letztere Methode ist für biologische Objekte vorzuziehen, da sie ein Bild des nativen, unveränderten Objektes liefert. Kipphalter Um eine möglichst isotrope Auflösung der rekonstruierten Volumen zu erhalten, ist es nötig, die Proben bei hohen Kippwinkeln aufzunehmen. Idealerweise müssten die Proben 360º kippbar sein. Der Kupfernetz-Präparatträger sowie der Probenhalter selbst verursachen jedoch eine unvermeidbare Abschattung des Elektronenstrahls. Ein Probenhalter für ein Zeiss 922 Elektronenmikroskop, der von -70º bis 70º kippbar ist, wurde entworfen, gebaut und getestet. Der neue Halter erlaubt eine von 56% auf 82% verbesserte Abdeckung des Fourier-Raums. Die Konstruktion aus Messing und Edelstahl war schmäler und länger als der ursprüngliche Halter und kann somit bei einem höheren Kippwinkel zum Einsatz gebracht werden. Auch wenn dieser Probenhalter stärker für mechanische Drift anfällig ist, ist er für tomografische Messungen gut verwendbar. Elektronentomografie von zweidimensionalen Kristallen Negativ gefärbte zweidimensionale Kristalle von zwei verschiedenen Membranproteinen, NhaA und YidCwurden als Testobjekte verwendet, um die erreichbare Auflösung der Tomogramme in der xy-Ebene zu bestimmen. Die etwa 60 Bilder der Kippserien ergaben eine Auflösung von rund 3 nm im rekonstruiertem Volumen. Zusätzlich bietet diese Methode einen neuen Ansatz zur Messung der Planariät der Kristalle. Hochauflösende Aufnahmen von 2D-Kristallen erfordern eine maximale Abweichung von der Planarität von um weniger als 1%. Erst mit Hilfe der Elektronentomografie kann die Abweichung von einer perfekt planaren Geometrie exakt gemessen werden. Zwei Beispiele solcher Messungen werden hier erstmals gezeigt. Es wurde festgestellt, dass sich 6 nm Goldpartikel regelmässig auf den Kristallen von NhaA anordnen. Der Abstand zwischen den Reihen der Goldpartikel war 19.5 nm, was dem Gitterabstand der Membranproteine in dem 2D Kristall entspricht. Eine Elementanalyse der Kristalle mit Hilfe des Elektronen-Energiefilters bewies, dass die Partikel aus Gold bestehen, und dass an diesen Stellen wenig oder kein Uranylacetat vorhanden war. Die Röntgenstruktur des Proteins zeigt, dass zwei in der Sequenz aufeinander folgende und Gold bindende Aminosäueren, Cys200 und Gly201, an der Proteinoberfläche frei zugänglich sind. Zudem liegen diese Aminosären an benachbarten Dimeren in den 2D Kristallen einander gegenüber. Ein Modell zeigt die Bindungsstelle der 6 nm Goldpartikelin NhaA. Die Möglichkeit zur Verwendung dieser selektiven Bindung in biotechnologischen oder bildgebenden Verfahren wird diskutiert. Elektronentomografie von Mitochondrien-Membranen Mitochondrien-Membranen aus Rinderherz oder Rattenleber wurden elektronentomografisch untersucht, zunächst mit negativ gefärbten, danach überwiegend mit vitrifizierten Proben. Zahlreiche Membranproteine waren eindeutig als ATP Synthase zu erkennen. Die Anordnung der ATP Synthasen war in den Kryo-Proben besonders auffällig, da sie oft in Doppelketten, oder Dimer-Reihen, gefunden wurden. Diese Dimer-Reihen verliefen immer dort, wo die Krümmung der Membran am stärksten war, entweder entlang tubulären Vesikeln, oder am Aussenrand von abgeflachten scheibenförmigen Vesikeln. Einzelne Dimere wurden als Subvolumen aus den Tomogrammen geschnitten und gemittelt. Die gemittelten Dimere zeigten einen äußeren Membran-Krümmungsradius von 17 nm. Ähnliche Dimer-Reihen wurden auch in intakten Hefemitochondrien beobachtet, was beweist, dass die Dimere nicht durch die Membranpräparation erzeugt werden, und sehr wahrscheinlich in allen Mitochondrien auftreten. Eine stärkere Krümmung der Membran bewirkt, dass an diesen Stellen eine höhere Ladungsdichte vorhanden ist als in den flachen Membranregionen. Dies bedeutet, dass die Protonenkonzentration an diesen Stellen höher und der lokale pH damit niedriger ist. Aus diesen Beobachtungen wurde ein Modell erstellt, in dem die ATP Synthase die Membran krümmt um die Protonenkonzentration lokal für die Funktion der ATP-Synthase zu optimieren. Elektronentomografische Untersuchung eines unbekannten Membranproteinkomplexes In Tomogrammen von Hefe Mitochondrien wurden gelegentlich Membranvesikel entdeckt, deren Oberfläche mit vielen Kopien eines unbekannten Proteinkomplexes bestückt war. 279 dieser Komplexe wurden ausgeschnitten und gemittelt. Das Ergebniss zeigte ein fassförmiges Protein mit einem Außendurchmesser von 16.5 nm und einer Höhe von 18.5 nm. Der Innenraum ist leicht konisch, da der obere Innendurchmesser 7 nm und der untere 4 nm betrug. Das Molekulargewicht wurde an Hand des tomographischen Volumens auf 1800 kDa geschätzt. Der obere Teil des Komplexes zeigt deutliche 6-fach Symmetrie. Das Problem der Identifizierung unbekannter Proteinkomplexe in Elektronentomogrammen wird in Zukunft häufiger auftreten, , da molekulare Auflösung in der Elektronentomografie immer öfter erreicht wird. Eine Methode der retroaktiven Identifizierung des Proteins wird vorgeschlagen.

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Metadaten
Author:Michael Strauss
URN:urn:nbn:de:hebis:30-59991
Publisher:Univ.-Bibliothek
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Josef WachtveitlORCiDGND, Werner KühlbrandtORCiDGND
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2008/12/04
Year of first Publication:2008
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2008/09/05
Release Date:2008/12/04
Page Number:124
First Page:IX
Last Page:115
Note:
Diese Dissertation steht außerhalb der Universitätsbibliothek leider (aus urheberrechtlichen Gründen) nicht im Volltext zur Verfügung, die CD-ROM kann (auch über Fernleihe) bei der UB Frankfurt am Main ausgeliehen werden.
HeBIS-PPN:353739790
Institutes:Physik / Physik
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 53 Physik / 530 Physik
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