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Philipp Demmer

• Die akute myeloische Leukämie (AML) ist charakterisiert durch einen Differenzierungsblock sowie aberrante Selbsterneuerung („self-renewal“) hämatopoetischer Vorläuferzellen im Knochenmark (Grignani, 1993). Bei Patienten mit akuter Promyelozyten-Leukämie (APL), einem Subtyp der AML, bezeichnet als M3 gemäß FAB(„French-American-British“)-Klassifikation, ist dieser Phänotyp induziert durch die spezifischen Leukämie-assoziierten chromosomalen Translokationen t(15;17) sowie t(11/17). Beide involvieren einen identischen Anteil des Retinsäure-Rezeptors Alpha (RAR-Alpha) und jeweils entweder Gene der Promyelozyten-Leukämie (PML) oder promyelozytäre Zinkfinger (PLZF). Durch homologe Oligomerisierung, vermittelt durch die PCC(“coiled-coil”)-Domäne beim PML (Grignani, 1999) und die BTB/POZDomäne beim PLZF (Benedetti, 1997), formieren die Fusionsproteine PML/RAR und PLZF/RAR-Alpha in vivo HMW(“high molecular weight“)-Komplexe (Melnick, 1999). Im Vergleich zum RAR-Alpha von Wildtyp-Zellen zeigen diese erhöhte Affinität zu “Histone-Deacetylase-Recruiting-Nuclear- Corepressor”-Komplexen, was über aberrante Rekrutierung der Histon- Deazetylase zu konstitutiver Hypoazetylierung der Histone und schließlich zur Blockade der Transkription von Genen, die für eine Ausdifferenzierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen bedeutsam sind, führt. Gegenstand der vorliegenden Dissertation ist das molekulare Targeting der Oligomerisierungsdomänen von PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha in vitro. Hierfür werden retrovirale Vektoren mit artifiziellen Fusionsgenen kloniert. Diese bestehen aus jeweils PCC-ABL oder POZ-ABL, welche sich aus der ABLKinase des Philadelphia-Chromosoms BCR/ABL und den spezifischen Oligomerisierungsdomänen von PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha zusammensetzen sowie den Peptiden PCC und POZ mit analogen Strukturen zu diesen Domänen. Fusionen der ABL-Kinase mit den Oligomerisierungsdomänen von PML und PLZF führen wie bei BCR (Beissert, 2003) zur konstitutiven ABLAktivität und vermitteln IL-3-unabhängiges Wachstum von Ba/F3-Zellen (murine Pro-B-Zelllinie). Die jeweils koexprimierten Peptide lagern sich an die analogen Proteinstrukturen von PCC-ABL und POZ-ABL an und stören deren homologe Oligomerisierung, was die IL-3-Unabhängigkeit gänzlich aufhebt. Dies wird über Wachstumskurven, Durchflusszytometrie (FACS) und Westernblot gezeigt. Folgend werden Vektoren zur Koexpression der kompletten APLcharakterisierenden Fusionsgene PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha zusammen mit identischen Peptiden kloniert, um mit diesen Sca1+/lin--selektionierte, murine, hämatopoetische Stammzellen zu infizieren. Deren Differenzierungsgrad wird über Zählung der Kolonien-formenden Einheiten (“Colony Forming Units” - CFUs), über deren Kolonie-Morphologie, deren Zytologie sowie Stammzell- und Differenzierungsoberflächenmarker bestimmt. Die Kontrollen mit alleiniger Expression der Fusionsproteine sowie zusammen mit vertauschten Peptiden zeigen die bekannte Morphologie von Promyelozyten, während die Koexpression der interferierenden Peptide zu deutlich akzelerierter Ausdifferenzierung führt. Eine erhöhte Replating-Effizienz durch die aberrante Fähigkeit zur Selbsterneuerung, eine typische Eigenschaften leukämischer Blasten, wird unter Einfluss interferierender Peptide nicht beobachtet. Hierfür wird ursächlich eine Störung der HMW-Komplex-Bildung beschrieben. Die Fusionsproteine PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha werden durch dieses Targeting über Westernblot nicht mehr nachgewiesen und somit als proteasomal degradiert angenommen. Das Vorliegen der Fusionsgene von PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha in den bei diesen Experimenten verwendeten Zellen kann auf RNA-Ebene über RT-PCR gezeigt werden. Zusammenfassend beschreibt die Koexpression von spezifischen Peptiden, die mit Oligomerisierungsdomänen von Fusionsproteinen, wie hier PML/RAR-Alpha und PLZF/RAR-Alpha, interferieren, einen neuen, vielversprechenden Ansatz bei der Therapie von Leukämien.
• Targeting of domains mediating oligomerization of leukemia-associated fusion proteins PML/RAR-Alpha and PLZF/RAR-Alpha with peptides Acute myeloid leukemia (AML) is characterized by a differentiation block as well as by an increased aberrant self-renewal of hematopoetic precursor cells in the bone marrow (Grignani, 1993). In patients with acute promyelocytic leukemia (APL), a subtype of AML, called M3 following FAB(‘French-American- British’)-classification, this phenotype is induced by specific leukemiaassociated chromosomal translocations, such as t(15;17) and t(11;17). Both involve an identical portion of the retinoic acid receptor -Alpha (RAR-Alpha) and either the promyelocytic leukemia (PML) or promyelocytic zinc finger (PLZF) genes, respectively. Through homologous oligomerization mediated by the PCC(“coiled-coil”)-domain of PML (Grignani, 1999) and the BTB/POZ-domain of PLZF (Benedetti, 1997) PML/RAR-Alpha and PLZF/RAR-Alpha form HMW(‘high molecular weight’)-complexes in vivo (Melnick, 1999). In comparison to RAR-Alpha of wild-type cells these HMW-complexes show increased affinity to ‘Histone- Deacetylase-Recruiting-Nuclear-Corepressor’-complexes, which leads to aberrant recruitment of the Histone-Deacetylase, consecutively hypoacetylation of histones and finally a transcriptional blockage of genes indispensable for differentiation of hematopoetic precursor cells. Aim of this doctorate thesis is an in vitro investigation of domains mediating oligomerization of PML/RAR-Alpha and PLZF/RAR-Alpha through molecular targeting. Thus, retroviral vectors with artificial fusion genes are cloned. These consist of PCC-ABL or POZ-ABL, comprising the ABL-Kinase of the Philadelphia Chromosome BCR/ABL and specific oligomerization domains of PML/RAR-Alpha or PLZF/RAR-Alpha, respectively, as well as peptides PCC or POZ with analogous structures to these domains. Fusions of the ABL-Kinase together with oligomerization domains of PML and PLZF lead to constitutive activity of the ABL-Kinase similar to BCR (Beissert, 2003) and, hence, mediate IL-3- independent growth of Ba/F3 cells (murine pro-B-cell line). The coexpressed peptides attach to analogous protein structures of PCC-ABL and POZ-ABL and interfere with their homologous oligomerization, which fully abrogates L-3- independent growth. This is highlighted through growth curves, flow cytometry (FACS) and Westernblot. Consecutively, vectors for coexpression of complete APL-characterizing fusion genes PML/RAR and PLZF/RAR-Alpha together with identical peptides are cloned in order to infect Sca1+/lin--sorted, murine, hematopoetic stem cells. Their degree of differentiation is investigated by counting “colony-forming units” (CFUs), describing colony morphology, cytology as well as measuring stem cell and differentiation surface markers. Controls with single expression of the fusion proteins and together with inappropriate peptides both show the typical morphology of promyelocytes, whereas coexpression of interfering peptides leads to remarkably accelerated differentiation. Increased replating efficiency as cause of an aberrant capacity of self-renewal, a typical feature characterizing leukemic blasts, is not found in cells coinfected with these peptides. This is presumably due to an inhibited formation of HMW-complexes. Affected by this targeting the fusion proteins PML/RAR-Alpha and PLZF/RAR fail to be detected by Westernblot and therefore are presumed to be degraded by proteasoms. Presence of fusion genes in cells used for these experiments is shown on RNAlevel by means of RT-PCR. Summarizing these results, coexpression of specific peptides interfering with oligomerization domains of fusion proteins, such as PML/RAR-Alpha and PLZF/RAR-Alpha, provide a new promising approach in leukemia therapy.