Open Access

Aresu Gorgin

• Das Mammakarzinom umfasst eine heterogene Gruppe von Tumoren und lässt sich bei prognostischen Aussagen und der Auswahl von Therapiestrategien an spezifischen Kriterien wie dem Tumorgrad, dem Hormonrezeptorstatus und der Expression von HER2/neu-Rezeptoren klassifizieren (Schindler, 2008). Die so genannten “triple-negativen” Mammakarzinome tragen weder Östrogen-, noch Progesteron-, noch HER2/neu-Rezeptoren. Sie stellen aufgrund ihrer besonders aggressiven Wachstumsrate, ihrer verhältnismäßig ungünstigen Prognose sowie dem Fehlen zielgerichteter Therapien eine große klinische Herausforderung dar. Kombinierte Chemotherapien versprechen bis dato die größten Erfolgsaussichten. Allerdings gibt es bis heute noch keine spezifische systemische Therapie für triple-negative Mammakarzinome (Cleator et al. 2007). Demzufolge muss es das Ziel der aktuellen Forschung sein, die bestehenden Therapiekonzepte zu optimieren bzw. weitere Methoden für neue zielgerichtete Therapien zu entwickeln. In der aktuellen molekularbiologischen Forschung ist es mit Hilfe von neuartigen Strategien wie der RNA-Interferenz (RNAi) möglich, gezielt die Expression eines bestimmten Gens zu unterdrücken, wodurch dann beispielsweise das Wachstumsverhalten von Tumorzellen gehemmt werden kann. Wie vorausgegangene Studien gezeigt haben, fällt Polo-like Kinase 1 (Plk1) in Zellen mit hohem mitotischem Index und einer dadurch verstärkten Proliferation eine besondere Bedeutung zu. So liegt Plk1 in nahezu allen humanen Tumorarten überexprimiert vor (Strebhardt et al. 2006). Zudem besteht ein Zusammenhang zwischen Überexpression von Plk1 und einem Schutz der Tumorzellen vor Apoptose (Cogswell et al. 2000). Im Rahmen der hier vorgelegten Promotionsarbeit wurden diese Erkenntnisse aufgegriffen und mögliche Therapieformen geprüft. Dabei wurde die Applikation von siRNA zur Hemmung der Expression von Plk1 bei der bislang wenig untersuchten triple-negativen Mammakarzinomzelllinie EVSA-T getestet. Darüber hinaus wurde nach eventuellen synergistischen Effekten von siRNA in Kombination mit bereits etablierten Therapeutika, wie Paclitaxel oder Carboplatin gesucht. Synergistische Effekte könnten für die Krebstherapie von höchster Relevanz sein. Bei der Einzelbehandlung der triple-negativen EVSA-T-Zelllinie sowohl mit siRNA4 gegen Plk1, als auch mit Paclitaxel oder Carboplatin, wurde die Zellproliferation signifikant inhibiert. Mittels FACS-Analyse konnte einhergehend mit verminderter Plk1-Expression ein deutlich erhöhter Anteil von Zellen in der G2/M-Phase festgestellt werden. Desweiteren wurden für Apoptose typische Ereignisse, wie DNA-Kondensation, ein Schrumpfen der Zellsomata und die Aktivierung der Procaspasen 3 und -9 festgestellt. Im Vergleich zur Wirkung der Einzelsubstanzen wurden durch kombinierte Applikation von siRNA4 mit Paclitaxel oder Carboplatin synergistische Effekte bezüglich einer Hemmung der Zellproliferation beobachtet (CI < 1). Auch die Untersuchung der Zellzyklusverteilung ergab eine synergistische Verstärkung des G2/M-Arrest durch Kombination von siRNA4 mit Paclitaxel (CI < 1). Dies liefert wichtige Erkenntnisse für die Weiterentwicklung und Optimierung von Kombinationstherapien. So könnten potentielle Nebenwirkungen minimiert werden, indem statt einer definierten Konzentration einer Einzelsubstanz, zwei Therapeutika in geringeren Konzentrationen verabreicht werden. Weiterhin läßt sich anhand der durchgeführten Experimente der Schluss ziehen, dass in triplenegativen Brusttumoren eine tumorintrinsische Wachstumsregulation durch Plk1 stattfindet und dass siRNA4, welche gegen Plk1 gerichtet ist, in vitro in der Lage ist, die Proliferation triple-negativer Tumorzellen zu inhibieren. Um Plk1 als potentes Zielgen für die Therapie des triple-negativen Mammakarzinoms nachhaltig zu bestätigen und die Innovation von Kombinationstherapien voranzutreiben, müssten in weiterführenden Untersuchungen zunächst im Rahmen von Zellkulturexperimenten alternative triple-negative Zelllinien verwendet werden. Um die in vitro beobachteten Effekte auf die in vivo-Situation übertragen zu können, sollte ein Xenograft-Mausmodell etabliert werden. Nach erfolgversprechenden und quantitativ ausreichenden Tierexperimenten sowie vorklinischen Studien könnten beschriebene Therapieformen anschließend in klinischen Studien angewendet werden. Besonders positiv fällt dabei ins Gewicht, dass bis auf siRNA alle hier verwendeten Therapeutika bereits eine klinische Zulassung besitzen.
• Breast carcinomas cover a group of heterogenic tumors that can be classified using prognostic statements and the choice of different therapy strategies that are based on specific criteria like tumor grade, hormonal receptor status and expression of HER2/neu-receptors (Schindler 2008). The so called “triplenegative” breast carcinomas do not produce estrogen-, progesterone-, or HER2/neu-receptors. Due to their particular aggressive growth rate and their proportional inconvenient prognoses as well as the missing of optimal therapies they represent a great clinical challenge. The biggest chances of success up to date are the combined chemotherapies. However, until now there are still no specific systemic therapies for triple-negative breast carcinomas (Cleator et al.2007). Therefore present research approaches aim to optimize already existing therapy concepts, or to develop alternative methods in order to achieve new therapies. Meanwhile RNA interference (RNAi), a new technique within molecular biology, has shown its great potential to inhibit the expression of specific genes involved in cell proliferation and thus obtain a disturbance in tumor growth. Advanced studies showed that Polo-like kinase 1 (Plk1) gives a special meaning to cells with high mitotic index and a thereby intensified proliferation. Plk1, a mitotic serine/threonine-kinase, is overexpressed in nearly all human tumors (Strebhardt et al. 2006). Furthermore there is a connection between overexpression of Plk1 and a protection of apoptosis in tumor cells. (Cogswell et al. 2000). All previous findings were taken for prove and development of possible new therapies. Within this study the application of siRNA was tested, in order to inhibit the expression of Plk1 in the triple-negative breast carcinoma cell line EVSA-T, which was previously not very often used for research experiments concerning triplenegative breast carcinomas. Beyond that, investigations were made aiming in arrangement of synergistic effects by application of Plk1-specific siRNA (siRNA4)combined with already established therapeutics like paclitaxel and carboplatin. Synergistic effects should be of high relevance for cancer therapies in view of minimizing side effects. As a result cell proliferation was inhibited significantly by the individual treatment of triple-negative EVSA-T cell lines using single Plk1-specific siRNA4, as well as in combination with paclitaxel or carboplatin. Through FACS-analysis a remarkable high contingent of cells remaining in G2/M-phase could be observed, due to diminished Plk1-expression. Also typical occurrences of apoptosis like DNA-condensation, cell shrinkage and the activation of the caspases 3 and 9 were additionally detected. Effects provoked by combined application of siRNA4 and paclitaxel or carboplatin regarding the inhibition of cell proliferation were found synergistic (CI<1) in comparison with application of single therapeutics. Even the investigation of the cell cycle distribution showed a synergistic increased G2/M-arrest through combination of siRNA4 with paclitaxel (CI<1). This finding provides important knowledge for further development and optimization of combined therapies. In this way side effects could be minimized by administration of two therapeutics in small dosage instead of administration of one single substance in high dosage. Taken together, based on the implemented experiments it could be shown that triple-negative tumor cells exhibit a separate internal growth regulation dependent on Plk1 expression. Furthermore administration of Plk1-specific siRNA4 is sufficient to inhibit cell proliferation of triple-negative tumor cells in vitro. In order to confirm Plk1 as a potent target gene on a long term basis and to bear the innovation of combined therapies, additional experiments are required. Therefore alternative triple-negative tumor cell lines within cell culture experiments should be tested. In order to transfer the in vitro observed effects to in vivo situations, a xenograft mouse model should be established. After promising and sufficient in vivo experiments as well as preclinical studies, described therapy concepts could be used in clinical studies. A particular positive criterion is, that except siRNA all the named and used therapeutics possess a clinical approval.