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Astrid Stefanie Kahnt

• 5-lipoxygenase (5-LO) catalyzes the first two steps in leukotriene (LT) biosynthesis. In a two step reaction the enzyme oxygenates arachidonic acid (AA) to form the highly unstable epoxide leukotriene A4 (LTA4) in dehydrating a hydroperoxide intermediate (20). LTA4 can then be further metabolized by two terminal synthases yielding either the potent chemoattractant leukotriene B4 (LTB4) or the cysteinyl leukotrienes (CysLTs). 5-LO enzyme expression is primarily found in mature leukocytes (22) where it can either reside in the cytoplasm or in the nucleus associated with euchromatin (29). Its enzymatic activity is embedded in a complicated network in intact cells regulating LT synthesis by various factors dependent on the cell type and nature of stimulus. Factors such as the amount of free AA released by phospholipase A2 enzymes, levels of enzymes involved, catalytic activity per enzyme molecule and availability of different small molecules influence 5-LO activity (36). The 5-LO derived LTs are lipid mediators which were shown to primarily mediate inflammatory and allergic reactions and their role in the pathogenesis of asthma is well defined. CysLTs are among the most potent bronchoconstrictors yet studied in man and play an important role in airway remodeling. LTB4 has no bronchoconstrictory effects in healthy and asthmatic humans but displays potent chemoattractant properties on neutrophils and increases leukocyte adhesion to the vessel wall endothelium (22). Therefore, LTB4 enhances the capacity of macrophages and neutrophils to ingest and kill microbes. In concert with LTB4, histamine and prostaglandin E2 (PGE2) CysLTs are thought to maintain the tone of the human airways (82). Besides their well studied role in asthma, 5-LO derived LTs have also been implicated to play a role in cardiovascular diseases and cancer. In contrast to healthy tissues, LT pathway enzymes and receptors were found to be abundantly expressed in cancer tissues, atherosclerotic lesions in the aorta, heart and carotid artery (86). Pharmacological inhibition of 5-LO potently suppressed tumour cell growth by inducing cell cycle arrest and triggering cell death via the intrinsic apoptotic pathway (92, 93). In several studies LTs were found to exhibit cardiovascular actions by promotion of plasma leakage in postcapillary venules, coronary artery vasoconstriction and impaired ventricular contraction leading to reduced coronary blood flow and cardiac output (24). Unfortunately, the precise molecular mechanisms through which LTs influence carcinogenesis and cardiovascular diseases are still incompletely understood. In contrast, an increasing number of studies questions the correlation between 5-LO and cancer (95-97) since extreme LT concentrations were applied to induce proliferative effects in the majority of the publications. A few studies exist which show susceptibility towards 5-LO products in physiological concentrations or achieve anti-proliferation by applying low concentrations of 5-LO inhibitors (98) ...
• Zwei terminale Synthasen wandeln dieses anschließend in Leukotrien B4 (LTB4) oder in die Cysteinylleukotriene (CysLTs) um. Leukotriene vermitteln entzündliche und allergische Reaktionen. Vor allem in der Pathogenese des Asthma bronchiale ist ihre Rolle gut untersucht und das Zusammenspiel von CysLTs, Prostaglandin E2, Histamin und LTB4 wird für die Regulation des Tonus der menschlichen Atemwege verantwortlich gemacht. Studien der letzten Jahre konnten zeigen, dass neben Atemwegsleiden weitere Krankheiten Leukotrien-vermittelt sein könnten. Vor allem kardiovaskuläre Erkrankungen und Krebs stehen hier im Mittelpunkt, da die Enzyme der Leukotrienkaskade und deren Rezeptoren in einer Vielzahl von Tumoren sowie in arteriosklerotischen Läsionen überexprimiert werden. Auch konnte gezeigt werden, dass die pharmakologische Hemmung der 5-LO das Wachstum von Tumorzellen beeinträchtigt. Die zugrundeliegenden Mechanismen der Leukotrienbeteiligung an diesen Krankheiten sind bisher nur dürftig erforscht und die Rolle der 5-LO in der Karzinogenese ist bisher uneindeutig. Aufgrund der widersprüchlichen Datenlage erschien es möglich, dass den durch 5-LO-Inhibitoren ausgelösten antiproliferativen Effekten ein 5-LO-unabhängiger Mechanismus zugrunde liegt. Daher war das Ziel der vorliegenden Studie, die Charakterisierung dieser vermeintlich 5-LO-unabhängigen antiproliferativen Effekte, sowie die Untersuchung möglicher pleiotroper Wirkungen von 5-LO Inhibitoren und CysLT1-Rezeptorantagonisten (CysLT1RA). Für die Experimente wurden Stellvertreter jeder 5-LO-Inhibitorklasse gewählt. Als Zelllinie wurden humane Capan2-Pankreasadenokarzinomzellen verwendet, die eine gut dokumentierte 5-LO-Überexpression aufweisen. Die Zellen wurden mit den Inhibitoren behandelt und anschließend wurde die Viabilität bestimmt. Rev-5901, AA-861 und MK-886, Substanzen die häufig in der Literatur Verwendung finden, minderten konzentrationsabhängig die Zellviabilität. Die hochwirksamen 5-LO-Inhibitoren CJ-13,610, BWA4C und Zileuton hingegen waren nicht antiproliferativ wirksam. Aufgrund dieser unterschiedlichen Aktivität der einzelnen Inhibitoren wurden deren zytotoxische Eigenschaften näher charakterisiert. Es wurden die Art des Zelltods sowie die potentielle Beeinträchtigung der Zellproliferation ermittelt. AA-861, MK-886 und Rev-5901 führten in höheren Konzentrationen sowohl zur Freisetzung von Laktatdehydrogenase, eine Folge von Nekrose, als auch zu antiproliferativen Wirkungen in Capan2-Zellen. In niedrigeren Konzentrationen induzierten sie eher Apoptose. CJ-13,610 und BWA4C hatten keinen Einfluss auf die Zellviabilität nach 72 Stunden, hemmten jedoch im Langzeitversuch das Zellwachstum, was auf eine Störung der Zellproliferation zurückzuführen ist. Zileuton hingegen löste weder antiproliferative noch zytotoxische Effekte in Capan2-Zellen aus. Auch Zugabe von 5-LO-Produkten zu den inhibitorbehandelten Zellen konnte die 5-LO-inhibitorinduzierte Reduktion der Capan2-Zellviabilität nicht mindern. Auch wiesen die Inhibitoren antiproliferative Effekte in drei 5-LO-negativen Tumorzelllinien auf. Daher kann aus den Daten der vorliegenden Studie geschlossen werden, dass 5-LO-unabhängige Mechanismen den zytotoxischen und antiproliferativen Wirkungen der hier verwendeten 5-LO Inhibitoren zu Grunde liegen. Da gezeigt werden konnte, dass die antiproliferativen Effekte der 5-LO-Inhibitoren unabhängig von deren Fähigkeit die LT-Synthese zu hemmen sind, war es desweiteren von Interesse diese pleiotropen Eigenschaften näher zu untersuchen. DieProstaglandin- und Leukotriensynthese sind eng miteinander verwoben. Alle an diesen Synthesewegen beteiligten Enzyme binden nahverwandte Arachidonsäuremetabolite. Daher sind Interaktionen der Leukotrieninhibitoren mit der Prostaglandinsynthese naheliegend. Deshalb wurde in der vorliegenden Studie zusätzlich die Wechselwirkung von CysLT1RA und 5-LO-Inhibitoren mit der Prostaglandinsynthese untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die CysLT1RA Montelukast, Zafirlukast und Pranlukast die Prostaglandin E2-Bildung in zytokinbehandelten Helazellen hemmen. Aufgrund ihrer hohen Plasmaeiweißbindung sind die Substanzen im humanen lipopolysaccharidstimulierten Vollblut unwirksam. Die Inhibitoren hemmen weder die Zytokinsignaltransduktion, die AA-Freisetzung noch die Aktivität aufgereinigter Prostaglandin H-Synthasen (PGHS). Letztendlich zeigte sich die Hemmung der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) als der für die PGE2-Inhibition verantwortliche Mechanismus. Die IC50-Werte hierfür lagen im niedrig mikromolaren Bereich für alle drei Inhibitoren. Es bleibt abzuwarten, ob die üblichen Dosierungen ausreichen, um eine Enzymhemmung in vivo zu erreichen. Behandlungsschemata mit höheren Dosierungen würden zweifellos zu Plasmakonzentrationen führen, die im Bereich der mPGES-1 Hemmung liegen könnten. Erste Ergebnisse der vorliegenden Studie legen zudem nahe, dass CysLT1RA in der Lage sein könnten Krebszellen gegenüber der Behandlung mit Doxorubicin zu sensibilisieren. Zusätzlich stellen CysLT1RA interessante neue Leitstrukturen für die Entwicklung gut verträglicher mPGES-1-Hemmer dar. Desweiteren konnte diese Studie zeigen, dass auch die 5-LO-Inhibitoren AA-861, BWA4C, C06, CJ-13,610 und Zileuton die PGE2-Synthese hemmen. Im Falle von C06, NDGA, Zileuton und BWA4C liegen die IC50-Werte der PGE2 und 5-LO Hemmung nah beieinander. Diese Tatsache macht die Substanzen zu fast gleichwertigen Inhibitoren der Leukotrien- und der PGE2-Synthese. AA-861 und CJ-13,610 hingegen sind ~ 40-fach selektiver gegenüber der 5-LO. Mit Ausnahme von C06 waren alle Inhibitoren im LPS-stimulierten humanen Vollblut wirksam. Nähere Untersuchungen bezüglich des Wirkmechanismus konnten zeigen, dass CJ-13,610 und BWA4C die Bildung von mPGES-1 geringfügig hemmen. Zileuton, NDGA und BWA4C hingegen hemmen potent die Arachidonsäurefreisetzung. Aufgereinigte ovine PGHS-1 und rekombinante, humane PGHS-2 wurden von den Inhibitoren nicht gehemmt. Die Aktivität der mPGES-1 hingegen wurde durch alle getestet Inhibitoren beeinträchtigt. Daher kann ausgehend von den bisher erhobenen Daten spekuliert werden, dass die 5-LO-Inhibitoren Zileuton und NDGA vor allem direkt mit der Arachidonsäurefreisetzung durch Hemmung der cPLA2? interferieren. BWA4C hemmt neben der Aktivität der cPLA2? zusätzlich leicht die Expression der mPGES-1. Der Wirkmechanismus von AA-861, C06 und CJ-13,610 konnte bisher noch nicht abschließend geklärt werden, könnte aber die Hemmung der mPGES-1 sein. Es ist bemerkenswert, dass keiner der getesteten 5-LO Inhibitoren frei von einer Wechselwirkung mit der PGE2-Synthese ist. Es stellt sich somit die Frage: Kann eine selektive Hemmung der 5-LO und anderer Enzyme, welche chemisch nah verwandte Substanzen binden, erreicht werden, ohne dass eines der anderen Enzyme beeinflusst wird? Zusammenfassend konnte diese Arbeit zeigen, dass 5-LO-Inhibitoren pleiotrope Effekte aufweisen. Diese müssen bei der Interpretation der pharmakologischen Hemmung des Enzyms in Betracht gezogen werden. Es müssen solche Studien neu überdacht und interpretiert werden, deren Folgerungen für die Rolle der 5-LO und der CysLT1-Rezeptorantagonisten in der Pathogenese einer bestimmten Krankheit rein auf der pharmakologischen Hemmung des Enzyms beruhen. Dies gilt insbesondere für experimentelle Entzündungs- und Krebsmodelle, da PGE2 in diesen eine große Rolle spielt und dessen Hemmung durch 5-LO-Inhibitoren zu falschen Schlüssen führen könnte.