Open Access

Frank Bicker

• In neurobiology the preexisting dogma on the unchangeability of the adult mammalian brain and its inability to give rise to new neurons has been challenged since the early nineties. Generally, it is now accepted that neurogenesis persists in adults. Progress in developmental and stem cell biology in recent years led to an increasing interest in regeneration-based treatment strategies for damaged tissue of the central nervous system. Thus, the enhancement of the endogenous potential of the brain to repair itself is potentially a feasible therapeutic strategy to treat various types of brain damage. Therefore, it is of great interest to understand the molecular mechanism that regulate adult neurogenesis. One of the prominent pathways suggested to be involved here is the Notch signaling cascade. Previously, it has been shown that various components of Notch signaling are expressed in the stem cell niche of the adult subventricular zone (SVZ) in vivo. Interestingly, a recent study demonstrated that the self-renewal potential of adult neural stem cells (NSCs) isolated from the SVZ depend on Notch signaling in vitro. Recently, we identified a novel non-canonical Notch ligand termed epidermal growth factor-like domain 7 (EGFL7), which was originally described as a protein secreted by endothelial cells and functionally implicated in cellular responses of the vascular system such as cell migration and blood vessel formation. We were able to show that secreted EGFL7 binds to a region in Notch that is involved in ligand-mediated receptor activation, thus acting as an antagonist of Notch signaling. The present study identifies neurons of the human and murine brain as a novel source of EGFL7, which suggests functions of EGFL7 in the neural system. Expression analyses by quantitative RT-PCR (qRT-PCR) revealed EGFL7 is down regulated in the adult SVZ, which suggests that endogenous EGFL7 may act as a Notch modulator of NSCs. We assessed the expression of Notch pathway components in adult NSCs isolated from the SVZ of adult mice and demonstrated that inhibition of Notch activity by the γ-secretase inhibitor DAPT reduced the self-renewal potential of NSCs. Accordingly, adenoviral-mediated expression of EGFL7 in vitro decreased Notch-specific signaling and reduced proliferation and self-renewal of NSCs. Conversely, activation of Notch by a constitutive active form of Notch (NICD) rescued the EGFL7-mediated reduction of NSC self-renewal verifying that this effect was directly linked to Notch signaling. Congruent to the reduced proliferation rate measured in vitro, induced expression of EGFL7 in vivo significantly reduced the number of Ki-67 positive cells within the SVZ upon cerebroventricular injection of EGFL7 adenovirus. Expression analyses in the developing brain showed single EGFL7-positive cells within the marginal zone of the neocortex as measured by in situ hybridization. These cells might be Cajal-Retzius cells, specialized neurons, which specifically express Reelin, which is a protein of the extracellular matrix known to control neuronal migration and differentiation. Interstingly, we could show that Reelin and EGFL7 are expressed in a subtype of neurons of the adult mouse cortex. This implied an interaction of both proteins and was verified by co-immunoprecipitation assays, suggesting an additional role for EGFL7 in neuronal maintenance. QRT-PCR based expression analyses in vitro comparing differentiated and non-differentiated NSCs displayed an increase in EGFL7 expression during the differentiation process, which was paralled by reduced Notch signaling. NSCs differentiated on coverslips coated with EGFL7 differentiated into all three cell types - neurons, oligodendrocytes and astrocytes. EGFL7 favored the formation of neurons as compared to control comparable to the effect of the Notch-inhibitor DAPT. Furthermore, additional oligodendrocytes were formed. These cells displayed a mature morphology with distinct sprouts and branches in contrast to the small and round oligodendrocytes that formed on control coverslips, which resembled us of precursor cells. Neurons and oligodendrocytes were formed at the expense of astrocytes. Congruently to the effect observed in vitro, adenoviral-based expression of EGFL7 in the SVZ yielded a slight induction of neuronal differentiation in vivo. Taken together, these results show for the first time a previously unrecognized role for EGFL7 in the brain by modulation of the Notch pathway in adult NSCs, which changes the proliferation and differentiation potential of adult NSCs in vitro and in vivo.
• Das vorherrschende Dogma der Unveränderlichkeit des adulten Säugerhirns und seinem Unvermögen neue Neuronen zu produzieren wird seit den frühen Neunzigern hinterfragt. Heutzutage ist es weitestgehend akzeptiert, daß Neurogenese im Adulten andauert. Der Fortschritt in Entwicklungs- und Stammzellbiologie hat in den letzten Jahren zu einem ansteigenden Interesse in erneuerungsbasierenden Behandlungsstrategien für das verletzte Gewebe des zentralen Nervensystems geführt. Aufgrund dessen ist die Verbesserung des endogenen Potentials des Gehirns sich selbst zu reparieren ein möglicher Ansatz für die Behandlung verschiedener Hirnverletzungen. Daher ist es von großem Interesse die molekularen Mechanismen, die den Prozess der adulten Neurogenese regulieren, zu verstehen. Einer der prominentesten Signaltransduktionswege, von dem angenommen wird darin involviert zu sein, ist der Notch Signalweg. Es wurde bereits gezeigt, daß die Komponenten des Notch Signalweges in der Stammzellnische der adulten Subventrikulärzone (SVZ) in vivo exprimiert sind. Interessanterweise wurde zudem kürzlich gezeigt, daß das Selbsterneuerungspotential von adulten neuralen Stammzellen (NSZ), die aus der SVZ isoliert wurden, abhängig vom Notch Signalweg in vitro ist. Kürzlich haben wir einen neuen nicht-kanonischen Notch Liganden, genannt "Epidermal Growth Factor-like 7" (EGFL7) identifiziert. Dieser Faktor wurde ursprünglich als ein spezifisch von Endothelzellen sekretiertes Protein beschrieben, welches in zellulären Antworten für das vaskuläre System mit einbezogen ist, wie zum Beispiel der Migration von Zellen oder der Anordnung von Blutgefäßen. Es war uns möglich zu zeigen, daß das sekretierte EGFL7 an eine bestimmte Region von Notch bindet, die in einer Liganden vermittelnden Rezeptoraktivierung involviert ist, was wiederum zeigt, daß EGFL7 als ein Antagonist des Notch Signalweges agiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von EGFL7 im Gehirn und seine mögliche Rolle im Kontext der Notch abhängigen Regulation von NSZ in vitro und in vivo untersucht. Meine Studie weist neue Erkenntnisse über ein sekretiertes Protein mit einer Funktion in Angiogenese und einer nur wenig beschriebenen Rolle in Neurogenese auf, das sehr wohl als Mediator zwischen beiden Welten fungieren könnte. Die initiale Expressionsstudie im murinen Embryo mittels quantitativer RT-PCR ergab sich ändernde Expressionsniveaus von EGFL7, die nicht den Verlauf von embryonaler Angiogenese wiederspiegeln. Insbesondere der signifikante Anstieg in der Produktion von EGFL7 zu späten embryonalen Stadien suggerierte eine weitere Rolle für EGFL7 neben der ursprünglich beschriebenen in der Gefäßentwicklung. Weiterhin wurden einzelne EGFL7 positive Zellen in der Marginalzone der sich bildenden kortikalen Platte durch in situ Hybridisierung identifiziert. Diese Zellen wiesen eine nicht endotheliale Morphologie auf. Die zusätzliche immunhistochemische Expressionsanalyse von EGFL7 im humanen fötalen Gehirn zeigte EGFL7 positive Zellen mit einer deutlich neuronalen Formgebung. Zusammen mit der im Anschluß durchgeführten Quantifizierung der Färbung läßt sich daraus die Aussage treffen, daß EGFL7 in Hirnregionen mit erhöhter neuronaler Dichte und Differenzierung detektierbar ist, woraus sich die Vermutung ergab, daß EGFL7 nicht ausschließlich von Endothelzellen exprimiert wird. Weitere Expressionsanalysen mittels quantitativer RT-PCR wiesen einen kontinuierlichen Anstieg im EGFL7 Expressonsniveau zu frühen postnatalen Stadien im murinen Gehirn auf. Korrelierend hierzu wurde auch eine erhöhte Menge an EGFL7 positiven Zellen im frühen postnatalen Gehirn innerhalb des Kortex identifiziert. Im Vergleich dazu wurden im adulten Gehirn geringere Mengen des EGFL7 Transkripts gemessen und parallel auch weniger EGFL7 positive Zellen im Kortex identifiziert. Mittels immunhistochemischer Doppelmarkierung von EGFL7 und verschiedenen neuralen Markern konnten reife Neuronen als Ursprungsquelle für EGFL7 identifiziert werden, wodurch angenommen werden konnte, daß EGFL7 eine Funktion im neuralen System ausübt. Im Rahmen oben beschriebener Expressionsstudie konnte zudem gezeigt werden, daß EGFL7 in der adulten SVZ herunterreguliert ist, was die Vermutung aufwirft, daß endogenes EGFL7 möglicherweise als ein Modulator für NSZ fungiert. Wir untersuchten die Expression von Komponenten des Notch Signalweges in adulten NSZ, welche von der SVZ von adulten Mäusen isoliert wurden, und zeigten, daß die Inhibierung der Notch Aktivität unter der Verwendung des γ-Secretase Inhibitors DAPT zu einer Reduktion des Selbsterneuerungspotentials von NSZ führte. Demzufolge reduzierte die adenoviral vermittelte Expression von EGFL7 in vitro die Notch-spezifische Signalgabe und reduzierte die Proliferation und Selbsterneuerung von NSZ. Im Gegensatz dazu führte die Aktivierung von Notch durch die Expression seiner konstitutiv aktiven Form (NICD) zu einer Wiederherstellung der EGFL7 vermittelten Reduktion des Selbsterneuerungspotentials von NSZ, was wiederum belegt, daß dieser Effekt direkt mit dem Notch Signalweg verbunden ist. Die Inhibierung und die damit verbundende Herunterregulation von Notch induziert durch DAPT oder durch die Expression eines inhibitorisch wirkenden Faktors des Signaltransduktionsweges in vitro führte zu einer Hochregulation von EGFL7. Hieraus lässt sich eine wechselseitige Regulation von EGFL7 und Notch über einen negativen "Feedback-loop" vermuten. Es ist bekannt, daß eine DAPT-vermittelte Inhibierung von Notch den Zellzyklus von humanen neuralen Stammzellen embryonaler Herkunft (ENSZ) verändert. Demnach stellte sich die Frage, ob der EGFL7 mediierte Effekt auf das Selbsterneuerungspotential neuraler Stammzellen ebenso auf Veränderungen hinsichtlich des Zellzyklus´ basiert. In der Tat konnte mittels FACS basierter Zellzyklusanalyse gezeigt werden, daß ähnlich dem Effekt von DAPT auf ENSZ die adenoviral vermittelte Expression von EGFL7 in adulten NSZ zu einer Erhöhung der sich in G1 Phase befindenden Zellen führte. Zudem war eine Reduktion der sich in S- und G2/M-Phase befindenden Zellen zu verzeichnen. Die durch EGFL7 induziere Akkumulation von NSZ in G1 deutet auf eine Verlangsamung des Zellzyklusverlaufs hin. Analog zu der gemessenen verringerten Proliferation in vitro führte die durch zerebroventrikulare Injektion des EGFL7 Adenoviruses induzierte Expression von EGFL7 in vivo zu einer signifikanten Reduktion in der Anzahl von Ki-67 positiven Zellen in der SVZ. Die Expressionsanalyse mittels in situ Hybridisierung im sich entwickelnden Gehirn wies einzelne EGFL7 positive Zellen in der Marginalzone des Neokortex auf. Diese Zellen könnten Cajal-Retzius Zellen sein, welche spezialisierte Neuronen sind, die spezifisch Reelin exprimieren, ein Protein der extrazellulären Matrix, welches bekannt ist für Steuerung von neuronaler Migration und Differenzierung. Interessanterweise konnten wir zeigen, daß Reelin und EGFL7 beide von einem neuronalen Subtyp im adulten Kortex von Mäusen exprimiert werden, was eine mögliche Interaktion beider Proteine impliziert, die wiederum mittels Co-Immunoprezipitationsstudien verifiziert werden konnte. Aufgrund dieses Ergebnisses wurde angenommen, daß EGFL7 eine zusätzliche Rolle in der Erhaltung von Neuronen hat. QRT-PCR basierende Expressionsanalysen in vitro wiesen auf, daß beim Vergleichen von differenzierten versus undifferenzierten NSZ eine Erhöhung in der EGFL7 Expression während des Differenzierungsprozesses zu verzeichnen war, was interessanterweise wiederum von einer Reduktion in der Notch Signalgebung begleitet war. NSZ, welche auf EGFL7 beschichteten Deckgläsern differenzierten, bildeten alle drei Zelltypen - Neuronen, Oligodendrozyten und Astrozyten - wobei neuronale Differenzierung durch EGFL7 favorisiert war. Weiterhin bildeten sich mehr Oligodendrozyten, welche eine reifere Morphologie mit ausgeprägten Fortsätzen und Verzweigungen aufwiesen. Neuronen und Oligodendrozyten bildeten sich auf Kosten von Astrozyten. In Übereinstimmung mit dem beobachteten Effekt in vitro, führte die adenoviral-basierende Expression von EGFL7 in der SVZ zu einer geringen Induktion von neuronaler Differenzierung in vivo. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der hier vorgestellten Arbeit erstmalig eine vorher nicht beachtete Rolle für EGFL7 in der Modulation des Notch Signalweges in adulten NSZ, welche die Proliferation sowie das Differenzierungspotential von adulten NSZ in vitro und in vivo ändert. EGFL7 fördert die Bildung neuer Neuronen von NSZ. Im embryonalen wie auch im adulten Gehirn ist dieser Prozess essentiell für die Homeostase des nervösen Systems. Die Funktion der adulten Neurogenese ist nicht voll verstanden, aber eventuell fördert sie lebenslanges Lernen und die Regenerierung nach Verletzungen wie zum Beispiel bei einem Schlaganfall. Es wurde bereits gezeigt, daß adulte Neurogenese durch verschiedenste Hirnverletzungen induziert wird, jedoch nur ein sehr geringer Teil der dadurch exzessiv gebildeten Vorläuferzellen in funktionierende Neuronen reift. Dies läßt vermuten, daß die Reifung und Integration von Neuronen zu den kritischen Schritten im Prozess adulter Neurogenese angesehen werden können. Der chronisch progrediente Verlauf neurodegenerativer Erkankungen läßt primär die Vermutung zu, daß das Gehirn nicht in der Lage ist, durch endogene Mechanismen den Verlust von Neuronen zu kompensieren. Obwohl das Gehirn befähigt zu sein scheint, sich selbst "auszubessern", kann die Kapazität der adulten Neurogenese nicht dafür angesehen werden zu einer Besserung beizutragen. Aufgrund dessen sollten bisherige Transplantations- und Manipulierungsstrategien, die auf die Genesung nach einer Hirnverletzungen abzielen, mit Mitteln, welche die Rekrutierung und Navigation von mobilisierten neuralen Vorläuferzellen (NVZ) zu ihrer Zielregion begünstigen. Im Wesentlichen sollte ein derartiger Wirkstoff das Überleben und die Reifung der Neuronen fördern, um die funktionierende Integration in das bestehende neuronale Netzwerk zu gewährleisten. Unserer Meinung nach ist EGFL7 ein vielversprechendes Agenz in diesem Kontext. Als ein Inhibitor der Jagged induzierten Notch Signalgebung und ein Faktor, der von reifen Neuronen ausgeschüttet wird, könnte EGFL7 als lokaler Modulator innerhalb des Gehirns agieren. Als eine Komponente der extrazellulären Matrix wäre es möglich, daß EGFL7 ein Mikromilieu in der Umgebung von Neuronen schafft und dadurch die Differenzierung ankommender neuraler Vorläuferzellen antreibt. Gleichzeitig agiert EGFL7 proneurogen und fördert die Bildung von Neuronen von NSZ. So könnte EGFL7 als therapeutisches Ziel genutzt werden, die Differenzierung von NZS und NVZ in reife Neuronen in vivo zu stimulieren. Weiterhin handelt es sich bei EGFL7 um einen sektretierten Faktor, was hinsichtlich der Anwendbarkeit von Vorteil ist, verglichen zu den anderen Notch Liganden. Bei diesen handelt es sich in den meisten Fällen um transmembrane Moleküle, die aufgrund dessen in ihrer rekombinanten Form nicht ohne weiteres verabreicht werden können. Zwar gibt es "Köder" von Notch Rezeptoren und Notch Liganden, jedoch haben derartige Verbindungen den Nachteil, daß sich nicht voraussagen lässt, ob sie als Agonist oder Antagonist fungieren, was von ihrem physiologischen Status abhängt, wie zum Beispiel, ob sie vollständig löslich oder mit der extrazellulären Matrix und der Signal gebenden Zelle verbunden sind. EGFL7 vermindert die Notch Signalgebung in beiden Formen, was dieses Protein besonders interessant hinsichtlich einer klinischen Applikation macht.