Structural investigation of complexes involved in endoplasmic-reticulum-associated protein degradation

  • The endoplasmic-reticulum-associated protein degradation pathway ensures quality control of newly synthesized soluble and membrane proteins of the secretory pathway. Proteins failing to fold into their native structure are processed in a multistep process and finally ubiquitinated and degraded by the proteasome in order to protect the cell from proteotoxic stress. My thesis covers structural as well as functional studies of various protein components that constitute the protein complexes that are responsible for this process. One sub-project addressed the mechanism of glycan recognition by Yos9 as part of the ERAD substrate selection. NMR solution structures of the mannose-6-phosphate homology (MRH) domain of Yos9 both in a free and glycan bound conformation reveal a gripping movement of loop regions upon binding of correctly processed glycan structures. The main projects focused on revealing the mechanism of efficient ubiquitin chain assembly by the ERAD ubiquitination machinery. This included the investigation of the role of the ERAD components Cue1 and Ubc7 in processive ubiquitin chain formation, how ubiquitin chain conformations change during elongation, how the conformation of a chain is impacted by interacting proteins and finally understand the activity regulation of the ERAD E2 enzyme Ubc7 by its cognate RING E3 ligases. Nuclear magnetic resonance (NMR) analysis and fluorescence-based ubiquitination assays show that the CUE domain of Cue1 contributes with its proximal binding preference as well as with its position dependent accelerating effect to efficient ubiquitin chain formation. This is required to efficiently drive degradation of substrates. Specific ubiquitin binding events dictate and coordinate the spatial arrangement of the E2 enzyme relative to the distal tip of a chain. This process can be further accelerated by RING E3 ligases that promote Ubc7 activity by more than ~20 fold via inducing allosteric changes around the catalytic cysteine. My results additionally suggest a model where Ubc7 dimerization results in proximity induced activation of the E2. This data ensures rapid diubiquitin formation that is followed by a CUE domain assisted chain elongation mechanism where Cue1 acts in an E4 like fashion. How ubiquitin binding events can modulate the conformations of a ubiquitin chain were investigated by pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) spectroscopy combined with molecular modeling. This shows that K48-linked diubiquitin samples a broad conformational space which can be modulated in distinct ways. The CUE domain of Cue1 uses conformational selection of pre-populated open conformations to support ubiquitin chain elongation. In contrast, deubiquitinating enzymes shift the conformational distribution to weakly or even non-populated conformations to allow cleavage of the isopeptide bond that connects adjacent ubiquitins. Ubiquitin chain elongation increases the sampled conformational space and suggests that this high conformational flexibility might contribute to efficient proteasomal recognition.
  • Die Qualitätskontrolle von sowohl löslichen als auch membran-gebundenen Proteinen des sekretorischen Weges erfolgt über das Endoplasmatische Retikulum (ER) assoziierte Degradationssystem (ERAD). Die vorliegende Dissertation umfasst strukturelle und funktionelle Studien zu diversen Proteinkomplexen, welche für den ERAD Prozess verantwortlich sind. Die ERAD Ubiquitin E3 Ligase Komplexe HRD1 und DOA10 bewerkstelligen die Erkennung fehlgefalteter Proteine, deren Transport über die ER Membran und den Prozess der Synthese von K48-verknüpften Ubiquitinketten auf Substratproteinen, um diese für den Abbau durch das Proteasom zu markieren. In dieser Arbeit habe ich mittels NMR-Spektroskopie die Struktur der MRH Domäne von Yos9, dem ERAD-Substratrezeptor, in zwei distinkten Konformationen gelöst: in einer freien Form, sowie gebunden an ein komplexes Oligosaccharid (3a, 6a-Mannopentaose). Dieser Zucker weist dabei das gleiche terminale a1,6-gebundene Mannose-Strukturmerkmal auf, welches auch auf fehlgefalteten Proteinen im ER Lumen präsentiert wird, um diese für den ERAD Prozess zu markieren. Die Struktur der MRH Domäne besteht aus einer aus neun b-Strängen bestehenden b-Fassstruktur, der eine 20 Aminosäure lange a Helix angelagert ist. Erkennung der richtig prozessierten Glykanstruktur erfolgt durch eine greifendende Bewegung von drei Schleifenregionen (b1b2, b6b7, b8b9) der MRH Domäne und involviert auch das konservierte FW-Motif. Die Polyubiquitinierung der Substratproteine auf der zytoplasmatischen Seite der ER Membran wird durch das Zusammenwirken der Proteine Cue1, Ubc7 und Hrd1 vermittelt. Cue1 ist ein Aktivator des E2 Enzyms Ubc7 und trägt sowohl eine Ubiquitin-bindende CUE Domäne als auch eine Ubc7- aktivierende Region (U7BR). Meine NMR Titrationsstudien zeigen, dass die CUE Domäne präferentiell an das proximale, K48-verknüpfte Ubiquitin in Diubiquitin bindet. Obwohl diese Bindungspräferenz nur gering ausgeprägt ist, zeigen kinetische Studien mittels Fluoreszenz-basierten Ubiquitinierungsassays, den Einfluss und die Korrelation zwischen Ubiquitinbindung und Ubiquitinkettenelongationsraten. Zudem ist die Abbaurate des ERAD Modelsubstrates Ubc6 in vivo bei dysfunktionaler CUE Domäne verlangsamt, welches die Bedeutung von Ubiquitinbindungsprozessen beim effizienten Aufbau der Ubiquitinsignale verdeutlicht. Die Unfähigkeit der CUE Domäne die Bildung von Diubiquitin zu fördern, Mutationen an bestimmten Stellen innerhalb eine Ubiquitinkette, sowie Experimente an chemisch vernetzten CUE-Ub Komplexen zeigen, dass der Verlängerungsprozess nur dann optimal stattfindet, wenn die CUE Domäne eine Bindestelle direkt benachbart zum distalen Akzeptorubiquitin einnimmt. Durch die Positionspräferenz organisiert Cue1 die räumliche Anordnung der enzymatischen Komponenten und beteiligten Moleküle am distalen Ende einer Ubiquitinkette und bewirkt eine effiziente Verlängerung. Diese Kettenbildungsaktivität von Ubc7 kann durch Bindung der RING Domänen der E3 Ubiquitin Ligasen weiter moduliert und beschleunigt werden. Mittels NMR-basierter Titrationsexperimente habe ich die Interaktionsoberflächen des Donorubiquitins und der RING Domänen von Hrd1 und Doa10 auf den beteiligten Proteinen kartiert und auch ein HADDOCK Modell des Ubc7-U7BR-Hrd1(RING)-Komplexes berechnet. Fluoreszenz-basierte kinetische Messungen zeigen, dass Hrd1 deutlich aktivierender wirkt als Doa10, da Hrd1 im Gegensatz zu Doa10 allosterische Veränderungen in der Region um das katalytische Cystein von Ubc7 auslöst und so höchstwahrscheinlich die Entladung des E2 Enzyms fördert. Ubc7 ist weiterhin in der Lage transient zu dimerisieren. Ubiquitinkettenelongationsexperimente zeigen, dass Ubc7 deutlich schneller Diubiquitin aus Monoubiquitin formt als in zehnfach-höherer Konzentration vorliegende Diubiquitinketten zu verlängern. Die schnelle und präferentielle Bildung von Diubiquitin lässt sich dabei durch Dimerisierung von Ubiquitin-beladenen Ubc7 Molekülen erklären. NMR Experimente, welche auf paramagnetischer Relaxationsverstärkung basieren, unterstützen das Modell der Bildung von transienten dimeren Ubc7-Komplexen. Diese Erkenntnisse erweitern das Modell der Ubiquitinierung im ERAD Prozess dahingehend, dass Ubc7-Dimerisierung die Ketteninitiation durch Konjugation eines Diubiquitins auf ein Substrat katalysiert. Anschließend erfolgt CUE Domänen- abhängige und prozessive Kettenelongation. Die im Rahmen des ERAD Prozesses gebildeten Ubiquitinketten weisen vorwiegend K48- Verknüpfungen zwischen den Ubiquitinen auf und dienen als Signal zur proteasomalen Degradation. In der Literatur sind zahlreiche Studien zu finden, welche sich speziell mit der Konformation dieser Kettenart beschäftigen. Jedoch liefern diese Studien nur Schnappschüsse spezifischer Konformationen, die entweder durch Kristallkontakte stabilisiert sind (Kristallstrukturen) oder basierend auf kurzreichweitigen Distanzeinschränkungen bestimmt wurden. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe von gepulster Elektronen-Elektronen Doppelresonanz (PELDOR) Spektroskopie gezeigt, dass K48-verknüpfte Ubiquitinketten eine breite Konformationsverteilung einnehmen, welche durch distinkte höher populierte Regionen gekennzeichnet ist. Dieser Konformationsraum kann über interagierende Proteine verschiedenartig moduliert werden. Die CUE Domäne von Cue1 bindet die untersuchte Diubiquitinkette unter konformationeller Selektion von vorher schon hoch- populierten, offenen Konformationen, um die Zugänglichkeit des Lysinrestes des distalen Akzeptorubiquitins sicherzustellen. Im Gegensatz verschieben deubiquitinierende Enzyme das Konformations-Ensemble zu Gunsten vorher sehr gering oder sogar nicht populierten Konformationen, um sich so über einen Mechanismus der konformationellen Umgestaltung Zugang zur Isopeptidbindung zwischen den Ubiquitineinheiten zu verschaffen. Verlängerung der Ubiquitinkette erhöht die konformationelle Flexibilität und der Konformationsraum wird stark erweitert. Die gefundene hohe Flexibilität längerer Ketten scheint notwendig zu sein um beispielsweise die simultane Assoziation mit den proteasomalen Rezeptoren Rpn10 und Rpn13 zu bewerkstelligen, ohne eine weitere strukturelle Umgestaltung der Kette zu benötigen.

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Metadaten
Author:Andreas Kniß
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-465340
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Volker DötschORCiDGND, Thomas Sommer
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2018/05/23
Year of first Publication:2018
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2018/05/09
Release Date:2018/05/24
Page Number:VIII, 131
HeBIS-PPN:431954240
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 57 Biowissenschaften; Biologie / 570 Biowissenschaften; Biologie
Sammlungen:Universitätspublikationen
Sammlung Biologie / Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht