Towards the conformational dynamics of multidomain proteins

  • Multidomain enzymes, such as fatty acid synthases (FASs) or polyketide synthases (PKSs), play a crucial role in the biosynthesis of important natural products. They have a high significance in the development of new pharmaceuticals and various research approaches focus on the engineering of these proteins. For example, human type I FAS is an interesting therapeutic target. Owing to its importance in lipogenesis, upregulation of human type I FAS expression has been observed in numerous cancers. Type I FAS is also regarded as important target in antiobesity treatment. Both multidomain enzyme classes - FASs and PKSs - show high structural and functional similarities. Particularly animal type I FAS is most relevant as evolutionary precursor of the PKS family. Therefore, the well characterized FASs are suitable model proteins for the poorly characterized PKSs, to gain deeper understanding in these megasynthases. Furthermore, fatty acids are considered to be strategically important platform chemicals accessible through sustainable microbial approaches. The recently acquired structural information on FASs provides an excellent understanding of the molecular basis of fatty acid synthesis. The specific understanding of chain-length control, the characterization of a multitude of substrate-specific thioesterases, and the emerging tools and means for metabolic engineering have fostered targeted approaches for modulating chain length. There is large interest in short-chain fatty acids, since these compounds are biotechnologically valuable platform chemicals and biofuel precursors, and attempts on the synthesis of short-chain fatty acids have been reported during the last years. Primary focus of this thesis lies on the animal type I FASs, which exhibit large conformational variety, as seen in electron microscopy and high-speed atomic force microscopy. Conformational dynamics facilitate productive protein-protein interactions between catalytic domains within the enzyme and aid acyl carrier protein (ACP)-mediated substrate shuttling during the catalytic cycle of fatty acid biosynthesis. To gain deeper insight into the fundamental processes of ACP-mediated substrate shuttling and the underlying conformational dynamics, spectroscopic methods like Förster resonance energy transfer and electron paramagnetic resonance spectroscopy shall be employed. These spectroscopic methods demand site-specific labeling of proteins with fluorophore or spin labels, which can be accomplished with the amber codon suppression technology. Through amber codon suppression, a non-canonical amino acid (ncAA) with an orthogonal functional group is incorporated site-specifically into the protein sequence, which can be used in chemoselective reactions for protein labeling. This thesis is at the forefront of employing the technology of amber codon suppression for addressing complex biological questions on megasynthases. The successful production of ncAA-modified FASs is challenging. With the aim of incorporating ncAAs into the multidomain 540 kDa large murine FAS, we by far exceed boundaries of documented application of amber codon suppression. Most of the proteins that are reported by Liu & Schultz in applications of amber codon suppression are in the range of 30kDa - for example the TE domain of human FAS. In the same review, the largest protein amber codon suppression was applied to is a potassium channel with roughly 80 kDa. Thus, to the best of my knowledge no protein exceeding 100 kDa has been used in amber codon suppression so far. In this thesis a low-complex, well-plate based reporter assay is presented, based on an ACP-GFP fusion protein for fast and efficient screening of ncAA incorporation. Reliability and applicability of the reporter assay is demonstrated by successful upscaling to larger protein constructs and increased expression scale. As outlined in this thesis, we have carefully set up methods for the modification of murine FAS and made several achievements: (i) We have created our own toolbox with a multitude of suppressor plasmids and various orthogonal pairs. pACU and pACE plasmids are compatible for fast exchange of cassettes, and cloning procedures are optimized for modification of synthetases by site-directed mutagenesis. (ii) We have organic synthesis of several ncAAs stably running in the lab and synthesis of other ncAAs can be established when required. Therefore, extensive screening at moderate costs is possible. (iii) We have established a reporter assay for screening our own library of vectors for amber codon suppression and for optimizing incorporation of ncAAs. (iv) We successfully incorporated ncAAs into subconstructs and full-length murine FAS, and collected initial promising results for the application of these proteins in spectroscopic methods. Thus, laying the foundation for future studies to address fundamental questions of the ACP-mediated substrate shuttling and other conformational dynamics of these enzymes.
  • Multidomänen-Enzyme, wie z. B. Fettsäuresynthasen (FASs) oder Polyketidsynthasen (PKSs), spielen eine bedeutende Rolle in der Biosynthese wichtiger Naturstoffe. Sie sind von großer Bedeutung für die Entwicklung neuer Pharmazeutika und viele Forschungsansätze konzentrieren sich auf das Engineering dieser Proteine. Die beiden Klassen von Multidomänen-Enzymen, FASs und PKSs, sind sich strukturell wie auch funktional sehr ähnlich. Die FAS des Typs I aus Säugern wird als evolutionärer Vorläufer der Familie der PKSs angesehen. Da sie bereits sehr gut untersucht und charakterisiert wurde, eignet sie sich besonders gut als Modellprotein für die Masse an strukturell wenig aufgeklärten PKSs. Darüber hinaus gelten Fettsäuren als strategisch wichtige Plattformchemikalien, deren Verfügbarkeit über nachhaltige mikrobielle Methoden sichergestellt ist. Beispielsweise gelangte Protein-Engineering an FASs mit Hinsicht auf Kettenlängenkontrolle in den letzten Jahren vermehrt in den Fokus der Biotreibstoff-Herstellung. In dieser These liegt der primäre Fokus auf der Säuger-FAS des Typs I. Vorausgegangene Studien an diesem Enzym bestätigten eine außerordentlich hohe konformationelle Vielfalt. Die Vermutung liegt nahe, dass diese konformationellen Dynamiken einen entscheidenden Beitrag zum reibungslosen Ablauf des katalytischen Zyklus der Fettsäurebiosynthese leisten und das Zustandekommen von effektiven Protein-Protein-Interaktionen des ACPs mit anderen katalytischen Domänen unterstützen. Der Transport von Substraten und Intermediaten der Fettsäurekette, der über das ACP sichergestellt ist, spielt eine zentrale Rolle im Katalysezyklus der Fettsäurebiosynthese. Um ein besseres Verständnis der grundlegenden Prozesse des ACP-vermittelten Transports von Substraten und Intermediaten der Fettsäurekette innerhalb des Katalysezyklus der Fettsäurebiosynthese zu erlangen, bedarf es geeigneter Methoden, die in der Lage sind Protein-Dynamiken zu untersuchen. Allen voran stehen spektroskopische Methoden wie Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)- oder Elektronen Spin Resonanz (EPR)-Spektroskopie, mit denen Ensembles konformationeller Zustände selbst großer Proteine in nativem Zustand untersucht werden können. Vor allem Einzelmolekülspektroskopie ist eine wertvolle Methode, um der konformationellen Dynamik und dem Katalysezyklus eines einzelnen Enzyms in Echtzeit zu folgen und so die bisher statischen Bilder der konformationellen Dynamik der Säuger-FAS des Typs I mit zeitaufgelösten Daten zu untermauern. Spektroskopische Untersuchungen wie EPR und FRET erfordern biophysikalische Proben, die mit Fluorophoren oder Spins markiert sind. Um die Säuger-FAS des Typs I mit solchen Markierungen zu versehen, muss auf eine positionsspezifische, bioorthogonale Strategie zurückgegriffen werden. Eine geeignete Markierungsstrategie für solch große Multidomänen-Enzyme stellt die Methode der Amber Codon-Suppression dar. Eine Vielzahl an nicht-natürlicher Aminosäuren (ncAAs) mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen können über diese Methode in Proteine eingebaut werden, darunter auch funktionelle Gruppen, die in chemoselektiven Reaktionen verwendet werden können. Über solche Reaktionen können Fluorophor- oder Spin-Markierungen positionsspezifisch in Proteine eingeführt werden. Die vorliegende These beschäftigt sich grundlegend mit der Anwendung der Amber Codon-Suppressions-Technologie an FASs des Typs I aus Säugern, mit der Absicht diese Multidomänen-Enzyme für spektroskopische Methoden bereitzustellen. Ziel ist es, komplexe biologische Fragestellungen in Bezug auf die konformationelle Dynamik dieser Enzyme - besonders die Prinzipien des ACP-vermittelten Transports der Substrate und Acyl-Ketten der Fettsäurebiosynthese - aufzuklären. Einen großen Teil dieser Arbeit stellt der Aufbau eines vielfältigen Werkzeugkastens, basierend auf der Amber Codon-Suppressions-Technologie und dessen Etablierung an Säuger-FASs des Typs I dar. Dies beinhaltete umfassende Klonierungen von Amber Codon-Suppressions-Plasmiden, pAC-Plasmide. Als Schlüsselmethode, wurde ein Reporter Assay für die Etablierung der Amber Codon Suppressions-Technologie in dieser Arbeit entwickelt. Mit Hilfe des Reporter Assays wurden die Effizienz und Zuverlässigkeit des Einbaus unterschiedlicher ncAAs bestimmt, um eine Auswahl effektiver ncAAs und pAC-Plasmide für unsere Zwecke zu treffen. Der Einbau von ncAAs in Proteine der Größe von Säuger-FASs des Typs I wurde nach meinem besten Wissen zuvor noch nirgends bewerkstelligt und stellt somit eine große Errungenschaft dieser These dar. Über die gewählte Markierungsstrategie konnten Fluoreszenz- und Spin-markierte FASs für FRET- und EPR-Spektroskopie erzeugt werden, die in ersten spektroskopischen Experimenten Anwendung fanden. Ein tiefergehendes Verständnis des katalytischen Zyklus der Fettsäurebiosynthese - vor allem des ACP-vermittelten Substrat-Shuttles und des Einflusses der konformationellen Dynamik des Enzyms - ermöglichen gezieltes Protein-Engineering mit therapeutischer und biotechnologischer Relevanz - besonders im Hinblick auf Kettenlängenkontrolle. Die hohe strukturelle und funktionelle Ähnlichkeit sowie der evolutionäre Zusammenhang zwischen FASs und PKSs lassen darauf schließen, dass sich die hier entwickelten Methoden leicht auf PKSs und andere Multidomänen-Enzyme übertragen lassen. Diese Annahme wurde anhand des Einbaus von ncAAs in Module zweier unterschiedlicher PKSs und anschließende Fluoreszenzmarkierung dieser Proteine in dieser These sogar bewiesen.

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Metadaten
Author:Christina Sabine HeilORCiDGND
URN:urn:nbn:de:hebis:30:3-515792
Place of publication:Frankfurt am Main
Referee:Martin GriningerORCiDGND, Michael Göbel
Document Type:Doctoral Thesis
Language:English
Date of Publication (online):2019/10/23
Year of first Publication:2019
Publishing Institution:Universitätsbibliothek Johann Christian Senckenberg
Granting Institution:Johann Wolfgang Goethe-Universität
Date of final exam:2019/10/23
Release Date:2019/10/24
Page Number:169
HeBIS-PPN:454626614
Institutes:Biochemie, Chemie und Pharmazie
Dewey Decimal Classification:5 Naturwissenschaften und Mathematik / 54 Chemie / 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Sammlungen:Universitätspublikationen
Licence (German):License LogoDeutsches Urheberrecht