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Mara Elisa Reifenrath

• Metabolic engineering can serve to convert microorganisms to microbial cell factories with the goal of producing various chemicals. Commonly used strategies to modify metabolic pathways include deletions and overexpression of genes, as well as the introduction of heterologous genes or genes which have been optimized for the host organism or for a reaction of interest. Aside from these classic metabolic engineering strategies, researchers have also implemented pathway compartmentalization strategies, which mimic nature’s strategies of colocalizing enzymes for pathway optimization. In this thesis, classic metabolic engineering strategies were combined with pathway compartmentalization strategies. For pathway compartmentalization, mitochondria and peroxisomes were harnessed, and additionally a new strategy to create artificial subcellular organelles was evaluated. In the latter approach, the so-called Zera peptide was fused to the enzymes of interest. Zera consists of the first 113 amino acids of the plant storage protein γ-Zein (Zea mays). Natively, plant storage proteins accumulate in endoplasmic reticulum (ER)-derived vesicles in plant seeds and serve as an amino acid source for the germinating plant. In this thesis, it was shown that Zera also induces the formation of artificial, ER-derived vesicles in Saccharomyces cerevisiae. Furthermore, it was shown that Zera fusion enzymes remained active, albeit with sometimes reduced activity. In line with the goal of compartmentalizing pathways in these artificial, Zera-induced vesicles, a new tool was developed to determine the pH in the ER of S. cerevisiae and in the ER-derived vesicles. pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP) variant, is commonly used to analyze the cytosolic pH or the pH of subcellular organelles. In this thesis, it was shown that pHluorin has very low fluorescence intensity and pH sensitivity in the ER and in Zera-induced ER-derived vesicles. Therefore, a superfolder variant of pHluorin was developed which allows reliable pH measurements in these compartments and can be used to analyze whether the organellar or vesicular pH suits a pathway of interest....
• Beim sogenannten metabolic engineering werden Organismen genetisch verändert, um sie für die Produktion von Kraftstoffen, Chemikalien oder pharmazeutischen Wirkstoffen zu optimieren. Klassische Strategien, die zur Anpassung von Stoffwechselwegen eingesetzt werden, umfassen Gendeletionen, die Überexpression von Genen, die Verwendung von heterologen Genen sowie der Einsatz von Genen, welche für den jeweiligen Produktionsorganismus oder die gewünschte Reaktion optimiert wurden. Neben diesen klassischen metabolic engineering-Strategien wurden in den vergangenen Jahren auch verstärkt Ansätze zur Kompartimentierung von Stoffwechselwegen eingesetzt. Dabei orientieren sich Wissenschaftler an Strategien der Natur, Enzyme bestimmter Stoffwechselwege zu kolokalisieren und dadurch deren Effizienz zu steigern. In dieser Arbeit wurden klassische Strategien des metabolic engineering mit Ansätzen zur Kompartimentierung von Stoffwechselwegen kombiniert. Für letztere wurden sowohl natürliche Organellen verwendet als auch ein völlig neuartiger Ansatz verfolgt, der darauf abzielt, in der Hefe Saccharomyces cerevisiae künstliche subzelluläre Organellen zu erzeugen und diese für die Kompartimentierung von Stoffwechselwegen einzusetzen. Hierbei wurde ein sogenanntes Zera-Peptid als Fusionspartner für die jeweiligen Enzyme eingesetzt. Zera besteht aus den ersten 113 Aminosäuren des pflanzlichen Speicherproteins γ-Zein (Zea mays). Speicherproteine assemblieren natürlicherweise im endoplasmatischen Retikulum (ER) in Zellen von Pflanzensamen und induzieren dort die Abschnürung von Vesikeln. Diese mit Speicherproteinen gefüllten Vesikel dienen der keimenden Pflanze später als Aminosäurequelle. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Zera auch in der Hefe S. cerevisiae die Bildung von künstlichen intrazellulären Vesikeln hervorruft, welche aus dem ER abstammen. Ebenso konnte über Immunfluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden, dass Enzyme über Fusionen mit Zera in diese Vesikel dirigiert werden können. Mit Hilfe von Wachstumstests und der Analyse von Produkttitern konnte gezeigt werden, dass die Zera-Fusionsenzyme aktiv waren