Open Access

Yogesh Bhargava

• P2X receptors represent the third superfamily of ligand gated ion channels with ATP as their natural ligand. Most of the mammalian P2X receptors are non-selective cation channels, which upon activation, mediate membrane depolarization and have physiological roles ranging from fast excitatory synaptic transmission, modulation of pain-sensation, LTP to apoptosis etc. In spite of them being an attractive drug target, their potential as a drug target is limited by the lack of basic understanding of the structure-function relationship of these receptors. In my thesis, I have investigated the behavior of homomeric P2X receptor subunits with the help of photolabeling and fluorescence techniques coupled to electrophysiological measurements using Xenopus laevis oocytes heterologous expression system. Concurrent photolabeling by BzATP and current recordings from the same set of receptors in real time has revealed that the gating process in homomeric P2X receptors is contributed individually by each subunit in an additive manner. Our study for the first time describes the agonist potency of Alexa-ATP (a fluorescent ATP analog) on P2X1 receptors. The use of Alexa-ATP in our experiments elucidated that receptor subunits are not independent but interacting with each other in a cooperative manner. The type of cooperativity, however, depended on the type and concentrations of allosteric/competing ligands. Based on our results, in my thesis we propose an allosteric model for ligand-receptor interactions in P2X receptors. When simulated, the model could replicate our experimental findings thus, further validating our model. Further, correlation between occupancy of P2X1 receptors (determined using binding curve for Alexa-ATP) with the steady-state desensitization suggests that binding of three agonist molecules per receptor are required to desensitize P2X1 receptors. We further extended the approach of fluorescence with electrophysiological measurement to assign the role for different domains in P2X1 receptors with the help of environmental sensitive, cysteine reactive fluorophore (TMRM). Cysteine rich domain-1 of P2X1 receptors (C117-C165) was found to be involved in structural rearrangements after agonist and antagonist binding. In contrast to the present understanding, that the binding of an antagonist cannot induce desensitization in P2X1 receptors and the receptors need to open first before undergoing desensitization, we propose based on our results that a competitive antagonist can also induce desensitization in P2X1 receptors by bypassing the open state. We have attempted to answer few intriguing questions in the field of P2X receptor research and we think that our answers provide many avenues to the basic understanding of functioning of P2X receptors.
• P2X-Rezeptoren repräsentieren die dritte Superfamilie liganden-aktivierter Ionenkanäle mit ATP als ihrem natürlichen Liganden. Die meisten der bislang bekannten P2XRezeptorsubtypen sind nichtselektive Kationenkanäle, die nach Aktivierung eine Membrandepolarisation induzieren. P2X-Rezeptoren sind an einer Vielzahl physiologischer Prozesse beteiligt, wie zum Beispiel der excitatorischen synaptischen Übertragung, der Modulation des Schmerzempfindens, der Langzeitpotenzierung und der Apoptose. Obwohl diese Rezeptorklasse damit ein attraktives Target für die Wirkstoffsuche darstellt, wird ihr Potenzial darin durch die geringe Informationsbasis über Struktur-Funktionsbeziehungen limitiert. In meiner Dissertation habe ich die funktionellen Eigenschaften der P2XRezeptoruntereinheiten durch Einsatz von Photoaffinitätsmarkierung und Fluoreszenzmessungen, parallel zu elektrophysiologische Messungen, untersucht. Dazu wurden verschiedene homomere P2X-Rezeptoren in Xenopus laevis Oozyten exprimiert. Durch BzATP-Photoaffinitätsmarkierung und gleichzeitiger Messung der Rezeptorströme konnte gezeigt werden, dass die Untereinheiten während der Aktivierung kooperativ miteinander interagieren. Zusätzlich konnte erstmals gezeigt werden, dass das fluoreszierende ATP-Analog Alexa-ATP als Agonist für den P2X1-Rezeptor eingesetzt werden kann. Die Experimente mit Alexa-ATP ergaben, dass die Untereinheiten im desensibilisierten Zustand ebenfalls kooperativ wechselwirken. Art und Ausmaß der Kooperativität waren dabei vom jeweiligen Liganden abhängig. Darauf basierend wurde ein kinetisches Reaktionsmodell entwickelt, mit dem es möglich war die experimentellen Befunde quantitativ zu modellieren. Weiterhin ergab ein Vergleich zwischen Fluoreszenzmessungen und der ATP-Abhängigkeit der Desensibilisierung, dass erst die Bindung von drei ATP-Molekülen zur Desensibilisierung führt. Ergebnisse über die strukturelle Umorientierung des P2X1-Rezeptors während Aktivierung und Desensibilisierung konnten mit Hilfe der Voltage-Clamp-Fluorometrie gewonnen werden. Dazu wurden durch ortsgerichtete Mutagenese eingebrachte Cysteine mit Rhodamin markiert und die Fluoreszenzänderung während und nach ATP-Gabe untersucht. Diese Messung ergaben, dass der erste Bereich der Cysteinreichen Domäne (Aminosäuren 120-125) Konformationsänderungen während der Aktivierung bzw. Desensibilisierung ausführen. Ebenfalls konnte gezeigt werden, dass der kompetitive Antagonist NF449 zu Konformationsänderungen führt, die nahelegen, dass NF449 seinen Antagonismus durch Desensibilisierung unter Umgehung des offenen Zustands entfaltet.