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Den photoaktivierbaren Schutzgruppen PPGs wurde als wichtige Werkzeuge, um z. B. biologische Prozesse zu untersuchen, in den letzten Jahren eine beachtliche Aufmerksamkeit zuteil. Der Einsatz von PPGs weist gegenüber chemischen Schutzgruppen wertvolle Vorteile auf, was deren Einsatz für biologische Konzepte attraktiv macht. Insbesondere, da keine weiteren Reagenzien außer Licht als Mittel für die Photolyse benötigt werden. Darüber hinaus ist es möglich, durch Einsatz moderner Lasertechnik, eine homogene Bestrahlung des Reaktionsvolumens mit einer hohen Lichtdosis auf einer, im Vergleich zu klassischen Lichtquellen, kürzeren Zeitskala zu gewährleisten.
Die Diversität der einsetzbaren photosensitiven Schutzgruppen, kommt einerseits der Vielfalt der anwachsenden biochemischen Fragestellungen insofern zugute, als dass die ausgewählten PPGs auf verschiedenste Anforderungen der zu untersuchenden Systeme zugeschnitten werden können. Anderseits kann die, durch einige Problemstellungen, erforderte chromatische Orthogonalität der eingesetzten Schutzgruppen, gewährleistet
werden, deren Umsetzung sich in den letzten Jahren in zahlreichen Studien als erfolgsversprechend erwies. Beide Aspekte sind unter anderem Gegenstand der vorliegenden Arbeit.
Zum einen sollte das Photocaged Puromycin als photolabiles Antibiotikum Derivat, mithilfe der Cumarinylmethyl-Schutzgruppe (DEACM-Puromycin) optimiert werden und mit dem vorherigen Nitrobenzyl-geschützten NVOC-Puromycin mittels spektroskopischer und biochemischer Methoden verglichen werden. Zum anderen sollte eine neue Strategie etabliert werden, mit deren Hilfe das photolytisch entschützte Puromycin erneut deaktiviert werden kann.
DEACM-Puromycin konnte mithilfe eines fünfstufigen Syntheseweges hergestellt werden. Ausgehend von 7-Amino-4-methylcumarin, dessen allylische Methylgruppe durch die Riley-Reaktion mit Selendioxid Se2O zum entsprechenden DEACM-Aldehyd oxidiert wurde und anschließende Reduzierung in Anwesenheit von NaBH4 zum Cumarinalkohol DEACM-OH. Eine nicht toxische Variante, bei welcher Selendioxid umgangen wurde, zeichnete sich ebenso als zielführend aus. DEACM-OH und Puromycin konnten im Anschluss über ein Carbonat-Intermediat miteinander als Carbamat verknüpft und mithilfe von HPLC aufgetrennt werden.
Die Vorrangigkeit des neuen photolabilen Puromycin Derivates (DEACM-Puromycin), wurde zuerst mithilfe der Laser-NMR-Spektroskopie sowie HPLC Verfahren erfasst. Spektroskopische Analysen im Rahmen einer Kollaboration mit dem AK von Professor Wachtveitl bestätigten, dass DEACM-Puromycin für biologische Anwendungen geeignetere photolytische Eigenschaften, wie z. B. einen höheren Extinktionskoeffizienten, eine bathochrome Verschiebung des Absorptionsmaximums, sowie eine höhere Quantenausbeute und Uncaging Effizienz der Photolyse, aufwies. Basierend auf einer vergleichbaren HOMO-LUMO Differenz beider Verbindungen (DEACM-OH und DEACM-Puromycin), konnte die Spaltung der Schutzgruppe mithilfe der Differenz der Fluoreszenzslebensdauern mit einer Rate von 0,71*108 s-1 charakterisiert werden. Dies war im Vergleich zum vorherigen NVOC-Puromycin um eine Größenordnung höher. Weitere durchgeführte spektroskopische Methoden wurden mittels quantenchemischer Rechnungen unterstützt, um wichtige Erkenntnisse der kinetischen und dynamischen Abläufe der Photolyse des geschützten Puromycins anzueignen, z. B.:
• Der zur Photolyse von DEACM-Puromycin konkurrierende Fluoreszenzprozess, kann durch protische Medien unterdrückt werden. Dies und die somit ermöglichten Wasserstoffbrückenbindungen, welche die entstehenden ionischen Intermediate während der Photolyse stabilisieren, könnten sich für die Erhöhung der Quantenausbeute der photolytischen Abspaltung von DEACM-Puromycin zu Nutze gemacht werden.
• Anhand von Experimenten auf der ultrakurzen Zeitskala wurde die Population eines angeregten S1-ICT-Zustandes detektiert. Bei diesem findet, in Anwesenheit von polarem Lösungsmittel, einen Ladungstransfer der Diethylaminoreste auf den Cumarinring statt.
• Polare Lösungsmittel bewirken ebenfalls den Übergang zu einem TICT Zustand, welcher als nichtstrahlende Relaxation die Fluoreszenz des DEACM-Puromycins reduziert. Die Auswahl von Substituenten sowie polaren und protischen Lösungsmitteln zur Begünstigung der ICT- sowie TICT- Zustände, könnte zukünftig zur Optimierung der Photolyse Effizienz herangezogen werden.
Die gelungene Optimierung des geschützten Puromycins als ein photosensitives Antibiotikum, durch die DEACM-Schutzgruppe, konnte mittels eines XTT-Zellviabilität-Experimentes mit sf9-Insektenzellen nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte die lichtkontrollierte Puromycylierung zur Visualisierung neu synthetisierter Proteine als weitere Funktion des optimierten photoaktivierbaren Puromycins in Zusammenarbeit mit dem AK. Schumann (MPI für
Hirnforschung, Frankfurt am Main) nachgeprüft werden. Obwohl beide photocaged Verbindungen, DEACM- sowie das vorherige NVOC-Puromycin, eine vergleichbare Zellpermeabilität zu den präparierten Neurozellen aufwiesen, zeigte DEACM-Puromycin unter gleichen Bedingungen nach der Belichtung ein signifikant intensiveres Puromycylierungsignal als NVOC-Puromycin. Unter der Annahme, dass sich mehr NVOC- als DEACM-Puromycin in
den Zellen befand, bestätigt diese Beobachtung die Vorrangigkeit des DEACM-Derivates, aufgrund seiner bereits optimierten photochemischen Eigenschaften. Durch den Einsatz eines Zwei-Photonen-Lasers, konnte die Eignung von DEACM-Puromycin für die raumselektive Steuerung der Detektion von neu exprimierten Proteinen, mit größerer Auflösung auf subzellularem Level, nachgewiesen werden.
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Die vorliegende Arbeit Zeitaufgelöste NMR-spektroskopische Untersuchung konformationeller Dynamiken in DNA G-Quadruplexen befasst sich mit der detaillierten biophysikalischen Untersuchung wichtiger strukturdynamischer Eigenschaften von nicht-kanonischen Nukleinsäure Sekundärstrukturelementen.
Im Genom aller eukaryotischer Lebewesen, insbesondere dem menschlichen Genom finden sich DNA-Sequenzabschnitte, die überdurchschnittlich Guanosin (G)-reich sind. Diese poly-G Abschnitte sind nicht zufällig im Genom verteilt, sondern häufen sich vermehrt in Genabschnitten, die besonders wichtig für die Regulation der Genexpression sind. G-reiche DNA-Sequenzen können unter geeigneten Umständen alternative Sekundärstrukturen ausbilden, die von der doppelsträngigen, kanonischen Watson-Crick Konformation abweichen. In Anwesenheit monovalenter Kationen können sich G-Nukleotide in einer Tetrade über Hoogsteen Interaktionen anlagern. Diese Tetraden können sich stapeln und dadurch sogenannte G-Quadruplexe (G4) ausbilden. Das menschliche cMYC Gen wird typischerweise als proto-Onkogen bezeichnet. Es kodiert für einen unspezifischen Transkriptionsfaktor, der bei einer Vielzahl von systematischen und soliden Tumorerkrankungen stark überexprimiert wird. Die zelluläre Konzentration des Genprodukts kann zu 90% über ein G4 cis-Element in der Promotorregion reguliert werden. Der cMYC G4 hat die Möglichkeit verschiedene Konformationen einzunehmen. Im Falle des cMYC G4 kann man zusätzliche, nicht-konventionelle Formen der konformationellen Isomerie finden. Zum einen gibt es die Möglichkeit, dass bei einem G4, der aus drei Tetraden und vier intramolekularen Strangabschnitten (dreistöckiger G4) besteht, einzelne Strangabschnitte mehr als drei konsekutive G-Nukleotide besitzen. Dadurch können sich Faltungs-Isomere bilden, die sich durch Verschieben des Strangs relativ zum verbleibenden dreistöckigen Tetradengerüst ergeben. Man spricht von G-Register Isomeren. Eine zweite Möglichkeit der Strukturisomerie ergibt sich, wenn in einer Nukleotidsequenz mehr als vier G-reiche Strangabschnitte aufeinander folgen. Jeweils vier dieser Strangabschnitte können in unterschiedlicher Weise kombiniert werden, um ein G4 Isomer auszubilden. In jedem dieser so zustande gekommenen G4 verbleibt ein (oder mehrere) G-reicher Strangabschnitt, der im konkreten Isomer nicht zur Faltung verwendet wird. Diese zusätzlichen G-Stränge werden daher auch Ersatzräder (engl. spare-tires) genannt; man erhält spare-tire Isomere.
Obwohl diese Formen des Polymorphismus, deren biologischer Kontext und die biophysikalischen Konsequenzen in Arbeiten von C. Burrows (2015) und A. Mittermaier (2016) erstmals umfassend beschrieben wurden, gab es bis zum Ausgangspunkt dieser Arbeit keine Kenntnisse über deren strukturelle Dynamik, den Faltungswegen und den zugrundeliegenden molekularen Mechanismen. Zeitaufgelöste Kernspinresonanz (engl. nuclear magnetic resonance, NMR) Spektroskopie ist eine bestens geeignete Methode, um die Dynamik von Biomakromolekülen mit atomarer Auflösung zu studieren. Um solche Experimente durchführen zu können, braucht es geeignete Herangehensweisen für die Präparation eines Nicht-Gleichgewichtszustands. In dieser Arbeit wird eine neu erarbeitete Strategie vorgestellt, die es erlaubt, Einblick in die Faltungs- und Umfaltungskinetiken eines dynamischen Konformations-Ensembles nicht-konventioneller Strukturisomere der cMYC G4 DNA-Sequenz zu erhalten.
Hierzu wurden photolabile Schutzgruppen (engl. Photocages) positionsspezifisch an bestimmten G-Nukleobasen (O6-(R)-NPE) angebracht. Die Schutzgruppen blockieren die Basenpaar-Interaktionen des Nukleotids, wodurch dieses sich nicht mehr an einer Tetradenbildung beteiligen kann. Die Photocages wurden jeweils an den Nukleotiden eingeführt, die nur in jeweils einem der G-Register Isomere an der Tetradenbildung beteiligt sind. Durch diese gezielte Destabilisierung konnten die Isomere getrennt und im gefalteten Zustand isoliert werden. Die so erhaltenen Konformationen wurden umfassend spektroskopisch charakterisiert. Der Ansatz, das konformationelle Gleichgewicht durch Photocages transient zu stören, wurde daraufhin weiterentwickelt. Mehrere Photocages wurden an Nukleobasen in zentraler Position einzelner G-Strangabschnitte angebracht. Dadurch konnte eine ausreichende Destabilisierung erreicht werden, die die Faltung jedweder G4 Strukturen unterbindet. Somit wurde ein ungefalteter Zustand erzeugt, der unter ansonsten frei wählbaren, physiologischen Bedingungen besteht. Durch in situ Photolyse der Schutzgruppen konnte so die Licht-induzierte G4 Faltung unter konstanten Puffer- und Temperaturbedingungen untersucht werden. Dieser Ansatz wurde auf die Untersuchung der Faltungswege, die zu verschiedenen spare-tire Isomeren führen, fokussiert.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass es insgesamt erstmalig gelungen ist, die Kinetiken der wesentlichen Faltungs- und Umfaltungswege entlang der konformationellen Energielandschaft des cMYC G4 Elements zu untersuchen. Das komplexe, dynamische Zusammenspiel aller relevanten, nicht-konventionellen isomeren G4 Strukturen konnte entworren und umfassend experimentell beschrieben werden. Der dafür weiterentwickelte Ansatz über konformationelle Selektion mit Hilfe photolabiler Schutzgruppen hat dabei experimentelle Einblicke erlaubt, die bislang nicht zugänglich waren. Die Strukturen und Faltungszustämde, die mit den chemisch modifizierten Oligonukleotiden erhalten und isoliert wurden, sind umfassend spektroskopisch untersucht worden. Die Anwendung verschiedener spektroskopischer Ansätze und deren Kombination mit weiteren biophysikalischen Methoden hat eine Methoden-unabhängige Validierung der erhaltenen kinetischen und thermodynamischen Daten ermöglicht.
In der vorgelegten kumulativen Arbeit wurden strukturelle und funktionale Untersuchungen an Nukleinsäuren durchgeführt, hauptsächlich, aber nicht ausschließlich unter Verwendung von NMR-Spektroskopie (Kernspin Resonanzspektroskopie) als Analysemethode. Die untersuchten Biomoleküle umfassten kleinere und größere biologisch relevante RNAs sowie einen artifiziellen DNA G-Quadruplex. Hierbei konnten Ergebnisse im Bereich der Bestimmung der molekularen Struktur, der Aufklärung der biologischen Funktion und der Wirkstoffentwicklung gewonnen werden, die in sechs verschiedenen Publikationen dargelegt sind, an deren Erstellung der Autor maßgeblich oder hauptverantwortlich beteiligt war. Des Weiteren wird in einem mehrgliedrigen Einleitungssegment auf den Stand der aktuellen Forschung in den jeweiligen Teilgebieten eingegangen.
The work of this thesis focuses on the targeting of G-quadruplexes (G4s), wherein several specific and potential ligands were designed, synthesized and characterized for its structural and biological activity. G4s are nucleic acid secondary structures that may form in single-stranded guanine (G)-rich sequences under physiological conditions. Four Guanines (Gs) bind via Hoogsteen-type hydrogen bonds base pairing to yield G-quartets, which in turn stack on top of each other to form the G4. G4s are highly polymorphic, both in terms of strand stoichiometry (forming both inter and intramolecular structures) and strand orientation/topology. The presence of K+ cations specifically supports G4 formation and stability. In the human genome G4 DNA motifs have been found in telomeres, G-rich micro and mini-satellites, up-stream to oncogene promoters and within the ribosomal DNA (rDNA). Human G4 DNA motifs are over-expressed in recombinogenic regions, which are associated with genomic damage in cancer cells.
In the present work, we focus on lead identification with specificity towards the c-MYC promoter G4s. Drug discovery is a highly time consuming and costly process. Lead identification and development are key steps in the drug discovery program. Studies have suggested that a large number of commercially available drugs exhibit deep structural similarity to the lead compounds from which they were developed. Quality lead identification in terms of compounds with high potency and selectivity, favorable physicochemical parameters and in vitro Absorption Distribution Metabolism and Excretion (ADME) parameters are the foremost requirements for the success of the drug discovery process. We herein describe the fragment-based drug design approach for the development of pyrrolidine-substituted 5-nitroindole derivatives as a new class of G4 ligands that exhibit high affinity and selectivity for the c-MYC promoter G-quadruplex. This chapter focuses on the methodology explored whilst finding a suitable hit and its optimization with fragment expansion strategies which undergo efficient G4 binding.
To target G4 DNA, screenings of numerous heterocycles have been reported including indoles, 7-azaindoles, 1H-indazol-3-yl, benzothiazole, imidazo[1,5-a]pyridine, 2,6- diaminopyrimidin-4-ol, 1H-pyrazolo[4,3 d]pyrimidin-7-amine, morpholino, bis-indoles, 2-hydroxynaphthalene-1,4-dione, 1,4-dihydroxyanthracene-9,10-dione, benzofuran and piperonal derived from several alkaloids. In this part of the thesis, we set out to identify new binders targeting the c-MYC G-quadruplex starting from the indole fragment. Several synthetic strategies are reported to optimize and generate best hits starting from 5-nitro indole derivatives by introducing the secondary cationic linked pyrrolidine side chain. Interestingly, all improved versions of G4-indole fragments 5, 7 and 12 contain this 5-nitro functionality, which may aid in the electrostatic binding and contributes to hydrogen binding interactions of the ligands to G4 DNA. In-silico drug design, biological and biophysical analyses illustrated that the substituted 5-nitro indoles scaffolds show preferential affinity towards the c-MYC promoter G-quadruplex compared to other G-quadruplexes and double stranded DNA. In vitro cellular studies confirm that the substituted indole scaffolds downregulate c-MYC expression in cancer cells and have the potential to induce cell cycle arrest in the G0/G1 phase. NMR analysis suggests that 5, 7, and 12 interacts in a fast exchange regime with the terminal G-quartets (5’ and 3’end) in a 2:1 stoichiometry.
To further optimize the fragment generated in chapter II, a novel series of triazole linked indole derivatives as a potential G quadruplex stabilizers have been described in chapter III. The potential ligands can be obtained through an efficient, convergent, synthetic route in moderate to good yields. The synthesized triazole linked indole derivatives are selective towards c- MYC G4-DNA vs. duplex-DNA. The planarity of the aromatic core and its ability to occupy more surface area by stacking over the G4 greatly affect the ability of the compounds to stabilize the G4. Further biophysical and biological studies revealed that the triazole linked nitro indoles are more promising than the amino indole derivatives.
Additionally, the importance of the nitro functional group has been justified by molecular docking studies, where hydrogen-bonding interactions were observed in between the nitro group and the G4 base pairs of the G-quadruplex. In biological findings, most of the synthesized triazole linked nitro indoles has found to be effective against human carcinoma (cervical) HeLa cell lines. Furthermore, western blot and cell cycle analysis confirms that the novel triazole linked 5-nitro indole derivatives (9b) could down-regulate c-MYC oncogene expression in cancer cells via stabilizing its promoter quadruplex structure, arresting cell cycle in G0/G1 phase. NMR analysis suggests that 9b interacts in slow exchange regime with the terminal G-quartets (5’ and 3’-end).
In chapter IV of the thesis, we have developed the synthetic strategies to generate more potent G4 ligands via Knoevenagel condensation. To investigate novel and selective G4 ligands for cancer chemotherapy, we designed and synthesized a series of azaindolin-2-one derivatives (11, 14, 15, 16 and 22) by attaching cationic pyrrolidine side chains and introducing a fluorine atom into the aromatic chromophore (Fig. 3). Fluorine atoms, with high electronegativity and small size, often exhibit unique properties in functional molecules. The electron-withdrawing effect of fluorine could reduce the electron density of the aromatic chromophore, which might favor a stronger interaction with the electron-rich π-system of the G-quartet. In addition, the introduction of fluorine atoms into small molecules might improve lipophilicity and thus the bioavailability. Fluorescent indicator displacement assay (FID) assays suggests that the synthesized azaindolin-2-one derivatives are selective towards c-MYC G4-DNA vs. duplex-DNA and showed potent anticancer activity against human carcinoma (cervical) HeLa cell lines. They down-regulate c-MYC expression in cancer cells via stabilizing its promoter quadruplex structure, arresting cell cycle in G0/G1 phase. Furthermore, NMR spectroscopy suggests that azaindolin-2-one conjugate interacts with terminal G-quartets as well as with the nearby G-rich tract (G13-G14-G15 and G8-G9-G10) of c-MYC quadruplex in intermediate exchange regime.
Nukleinsäuren besitzen neben der Speicherung und Übertragung der genetischen Information weitere vielfältige Funktionen in einem komplexen und dynamischen Netzwerk von gleichzeitig ablaufenden Prozessen in der Zelle. Die gezielte Kontrolle bestimmter Nukleinsäuren kann helfen, die jeweiligen Prozesse zu studieren oder auch zu manipulieren. Photoaktive Verbindungen, wie photolabile Schutzgruppen oder Photoschalter, sind ideal dazu geeignet die Struktur und Funktion von Nukleinsäuren zu studieren. Photolabile Schutzgruppen werden dazu meistens auf die Nukleobase installiert und stören die Watson-Crick Basenpaarung. Dies verhindert die Ausbildung einer Sekundärstruktur oder die Möglichkeit einen stabilen Doppelstrang zu bilden. Licht ist ein nicht-invasives Trigger-signal und kann mit hoher Orts- und Zeitauflösung angewendet werden, um selektiv die temporär geschützten Nukleinsäuren in der Zelle zu aktivieren.
Das erste Projekt dieser Arbeit ist eine Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Erin Schuman (MPI für Hirnforschung) und beschäftigt sich mit der lichtgesteuerten Regulation der miR-181a Aktivität in hippocampalen Neuronen von Ratten. Die Langzeitpotenzierung (LTP) ist der primäre Mechanismus von synaptischer Plastizität und somit essentiell für Lernen und Gedächtnis. Die langfristige Aufrechterhaltung von LTP erfordert eine gesteigerte (lokale) Proteinbiosynthese, ein Prozess, der noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Die miR-181a reguliert die Genexpression von zwei für synaptische Plastizität wichtigen Proteinen, GluA2 und CaMKIIα. Mit einem lichtaktivierbaren AntimiR sollte der Einfluss der miR-181a auf die lokale Proteinsynthese von CaMKIIα und GluA2 untersucht werden. Photolabile Schutzgruppen sollen eine ortsaufgelöste Aktivierung des AntimiRs in den Dendriten ermöglichen. Ein Tracking-Fluorophor sollte die Lokalisierung des AntimiRs und eine gezielte Lichtaktivierung ermöglichen. Die Bindung der miRNA sollte fluoreszent visualisiert werden können, um eine Korrelation zwischen der inhibierten Menge an miR-181a und den neu synthetisierten CaMKIIα-Molekülen zu untersuchen. In diesem Projekt wurden drei Konzepte zur Synthese von lichtregulierbaren AntimiR-Sonden verglichen: Das erste Konzept verwendete eine Thiazolorange-basierte Hybridisierungssonde nach Seitz et al. Allerdings war mit diesem Konzept der Fluoreszenzanstieg zur Visualisierung der Hybridisierung zu gering. Im zweiten Konzept wurde ein dual-Fluorophor markierter Molecular Beacon entwickelt, bei dem die photolabilen Schutzgruppen in der Schleifen-Region die Hybridisierung der miR-181a vor Belichtung verhinderten. Nach Optimierung der Stammlänge, Anzahl und Position der photolabilen Schutzgruppen, sowie Auswahl des idealen Fluorophor-Quencher Paars, konnte nach UV-Bestrahlung in Anwesenheit der miR-181a ein signifikanter Anstieg des Hybridisierungsreporter-Fluorophors gemessen werden. Das dritte Konzept untersuchte lichtaktivierbare Hairpin-Sonden, bei denen ein Gegenstrang (Blockierstrang) über einen photospaltbaren Linker mit dem AntimiR verknüpft wurde. Dabei musste die optimale Länge des Blockierstrangs und die Anzahl der photo-spaltbaren Linker im Blockierstrang ermittelt werden, sodass die miR-181a erst nach Photoaktivierung das AntimiR binden und den Quencher-markierten Strang verdrängen konnte. Die in vitro Experimente vom Arbeitskreis Schuman waren zu dem Zeitpunkt des Einreichens dieser Arbeit noch nicht abgeschlossen. Erste Ergebnisse zeigten, dass der mRNA und Protein-Level von CaMKIIα eines gesamten hippocampalen Neurons durch ein nicht-lichtaktivierbare AntimiR um den Faktor ~1,5 gesteigert werden konnte. Zudem konnte durch die lokale Bestrahlung einer lichtaktivierbaren Hairpin-Sonde die lokale Gen-expression von CaMKIIα in einem Dendriten deutlich gesteigert werden.
Das zweite Projekt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der reversiblen Lichtregulation von DNA und RNA durch Azobenzol Photoschalter. Azobenzole eignen sich ideal für die Regulation der Duplexstabilität, denn das planare trans-Azobenzol kann zwischen die Basen interkalieren und somit einen Doppelstrang stabilisieren. UV-Licht überführt das trans-Isomer in das cis-Isomer. Dies ist gewinkelt, benötigt mehr Platz und stört dadurch die Stabilität eines Nukleinsäuredoppelstrangs. Entscheidend für die Effizienz der Regulation der Duplexstabilität ist der Linker, der das Azobenzol mit der Nukleinsäure verknüpft. Während vorangegange Studien von Asanuma et al. unnatürliche Linker (D-Threoninol, tAzo) verwendeten, wurde in dieser Studie das Azobenzol mit der C1‘-Position von (Desoxy-)Ribose C-Nukleoside verknüpft, um Azobenzol (pAzo und mAzo) zu erhalten. Der Riboselinker sollte die helikale Natur der Nukleinsäure optimal nachahmen und möglichst wenig Störung des Ribose-Phosphat-Rückgrats bewirken. Thermische Stabilitätsstudien zeigten, dass UV-Licht induzierte trans-zu-cis Isomerisierung den Schmelzpunkt eines RNA- und DNA-Duplexes um 5,9 und 4,6 °C erniedrigte. Dabei führte der Austausch eines Nukleotids gegen pAzo oder mAzo zu einer effektiveren Regulation der Duplexstabilität als der zusätzliche Einbau eines Azobenzol C-Nukleosids in die Sequenz. Ein Vergleich mit dem in der Literatur etablierten System, tAzo, zeigte, dass pAzo und mAzo teilweise einen stärkeren Duplexdestabilisierungseffekt nach UV-Bestrahlung bewirkten.
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Biologischen Systemen liegen Mechanismen zugrunde, die bis heute nicht vollständig aufgeklärt sind. Für die Untersuchung eignen sich externe Trigger, die eine Regulation von außen auf das System erlauben und Prozesse gezielt steuerbar machen. Eine Möglichkeit ist das System unter optische Kontrolle zu bringen, d.h. durch Licht eine externe Steuerung zu implementieren, was von einem internen Chromophor aufgenommen wird. In der vorliegenden Dissertation werden drei individuelle Projekte vorgestellt, die alle dieses Prinzip auf unterschiedliche Weise anwenden.
RNAs haben eine Vielzahl an verschiedenen Funktionen in der Zelle, die von der Proteinsynthese bis zur Genregulation variieren. Im ersten Projekt wurde der Photoschalter Spiropyran im Kontext von RNA eingesetzt. Mit dem Ziel das Derivat PyBIPS kovalent an ein Oligonukleotid zu binden und damit die Hybridisierung eines Duplexes zu steuern, wurden Strukturmotive gesucht, an die der Photoschalter postsynthetisch gebunden werden kann. Dabei soll die sterisch anspruchsvolle Spiropyran-Form die Watson-Crick-Basenpaarung stören und die planare, konjugierte Merocyanin-Form in den Duplex, zur zusätzlichen Stabilisierung, interkalieren. In Vorarbeiten von Clara Brieke wurde festgestellt, dass erstens nur PyBIPS, nach kovalenter Verknüpfung, noch vollständig photochemisch aktiv ist und zweitens eine Herstellung über Festphasensynthese nur in schlechter Ausbeute realisierbar ist. Ausgehend davon wurde PyBIPS an die drei nicht-nukleosidischen Linker, Aminoglykol, D-Threoninol und Serinol, postsynthetisch über eine Amidbindung angebracht, die zuvor über Oligonukleotidfestphasensynthese in 2´-OMe-RNA eingebaut wurden.
In der photochemischen Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass PyBIPS, gebunden an alle drei Motive, noch photochemisch aktiv ist und im Vergleich zu ungebundenem PyBIPS stabiler ist gegenüber Photolyse. In Untersuchungen im Doppelstrang im Wedge Motiv, d.h. im Gegenstrang befindet sich kein Nukleotid gegenüber dem Photoschalter, wurde ein ähnliches Verhalten festgestellt. Zusätzlich zur charakteristischen Merocyanin-Bande bei 550 nm ist ein zweites, rotverschobenes Absorptionsmaximum entstanden, das die gleichen Eigenschaften besitzt. In Schaltzyklen wurde festgestellt, dass eine Isomerisierung bis 660 nm möglich ist, was eine Anwendung im therapeutischen Fenster zwischen ca. 600 und 1000 nm von Blut ermöglichen würde. Das Auftreten der zweiten Bande hängt stark vom Linker und dem Baustein im gegenüberliegenden Strang ab. Es wird vermutet, dass sich das, sonst nicht-bevorzugte, TTT-Isomer der Merocyanin-Form, durch Stabilisierung durch die Umgebung im Oligonukleotid ausbildet.
Zur Untersuchung, inwiefern die Isomerisierung des Photoschalters die Duplexstruktur beeinflusst, wurden Schmelzpunktstudien und Fluoreszenzmessungen zur KD-Bestimmung durchgeführt, ohne dass eine Veränderung zu erkennen war. In einer größeren NMR-Studie, in Kooperation mit Tom Landgraf (Arbeitsgruppe Prof. Dr. Harald Schwalbe) wurde der Fokus darauf-gelegt mehr Informationen über die strukturelle Integrität zu erhalten. Es findet eine Störung der benachbarten Basenpaarungen durch den Photoschalter statt, jedoch kann die Kraft der Isomerisierung des Photoschalters nicht übertragen warden. Der Einfluss war zunächst geringer als erwartet, was in anderen Anwendungen überprüft warden muss.
Im zweiten Projekt steht das Membranprotein OmpG aus E. Coli K12 im Fokus. Proteine besitzen viele verschiedene funktionelle Gruppen, die für selektive Biokonjugation genutzt werden können in einer Reihe von Anwendungen. OmpG gehört zur Gruppe der Porine, die in der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien sitzen und die seltene ß-Fassstruktur ausbilden. Die Pore besitzt einen großen Innendurchmesser ohne Selektivität. Das Molekül wurde bereits intensiv auf seine Struktur, insbesondere Loop 6, der pH-abhängig die Pore verschließt, untersucht. In Vorarbeiten von Grosse et al. wurde der Loop entfernt, sodass ein ruhiger Kanal entstanden ist, der ein optimales Modellsystem darstellt. Außerdem wurden in der Pore zwei Cysteine, die auf gegenüberliegenden Seiten auf halber Höhe des Kanals sitzen, eingeführt. An die Thiolgruppen wurden photolabile Schutzgruppen angebracht, die erst den Kanal blockieren und nach Abspaltung durch Licht wieder freigeben. Dazu wurde jeweils ein 7-Diethylaminocumarin (DEACM) postsynthetisch angebracht.
Der Linker am Cumarin-Alkohol stellt dabei einen Kompromiss dar, da er zum einen selektiv mit der Thiolgruppe des Cysteins reagieren soll, gleichzeitig aber noch photo-induziert wieder abspalten muss. Durch Belichtung findet eine Hydrolyse des Esters unter Abspaltung des Alkohols statt, der einen Carbonsäurerest am Thiol in der Pore zurück lässt. In spannungsabhängigen Einzelkanal-messungen, durchgeführt von Dr. Philipp Reiß (Universität Marburg), konnte gezeigt werden, dass die zwei DEACM Modifikationen eine Reduktion der Leitfähigkeit bewirkten und durch Licht abgespalten und aus dem Kanal entfernt werden konnten. Dabei war außerdem zu erkennen, dass die Leitfähigkeit aufgrund der Carboxylreste über das Niveau von unmodifiziertem OmpG steigt.
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This dissertation contains two chapters. Each chapter covers a unique topic within RNA sci-ence and is divided in two sub sections, part A and B. Each chapter contains an introduction.
Chapter 1 gives an insight into challenges encountered during sample design and preparation for single molecule Förster energy transfer (smFRET) spectroscopy and offers a solution via a newly establishedestablished workflow to obtain accurate smFRET constructs. Following this workflow, a FRET network could be generated, which allowed a detailed structural dynamics study on H/ACA RNP during catalysis with smFRET spectroscopy. This led to detailed mech-anistic insights into H/ACA RNPs dynamics during catalysis.
Chapter 2 deals with RNA synthetic biology whereby a novel eclectic design strategy for RNA of interest (ROI) release platform is presented, which allows to release a diverse ROI se-quences with single nucleotide precision triggered by an external stimulus. This design strat-egy was used to establish a ROI release system and its powerful performance in in vitro and in vivo applications was shown.
This dissertation contains two chapters. Each chapter covers a unique topic within RNA science and is divided in two sub sections, part A and B. Each chapter contains an introduction.
Chapter 1 gives an insight into challenges encountered during sample design and preparation for single molecule Förster energy transfer (smFRET) spectroscopy and offers a solution via a newly establishedestablished workflow to obtain accurate smFRET constructs. Following this workflow, a FRET network could be generated, which allowed a detailed structural dynamics study on H/ACA RNP during catalysis with smFRET spectroscopy. This led to detailed mechanistic insights into H/ACA RNPs dynamics during catalysis.
Chapter 2 deals with RNA synthetic biology whereby a novel eclectic design strategy for RNA of interest (ROI) release platform is presented, which allows to release a diverse ROI sequences with single nucleotide precision triggered by an external stimulus. This design strategy was used to establish a ROI release system and its powerful performance in in vitro and in vivo applications was shown.
H/ACA-RNPs are involved in RNA guided pseudouridylation of rRNAs and snRNAs. In this thesis I reconstituted active and labeled archaeal as well as eukaryotic H/ACA-RNPs and studied the structural dynamics of complex assembly and pseudouridine formation. Single molecule FRET spectroscopy was used as method of analysis to study structure, assembly and dynamics of these important complexes.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der tonische BZR-Signalweg im Burkitt Lymphom näher untersucht werden. Ziel war die Identifizierung von Zielstrukturen, die für die Zellen essentiell für die Aufrechterhaltung des tonischen Signalwegs sind und gleichzeitig die Viabilität der Zellen fördern. Durch die Identifizierung noch unbekannter Zielstrukturen wäre man in der Lage, neue Behandlungsstrategien zu entwickeln oder bereits bestehende zu optimieren. Des Weiteren sollte die Signaltransduktion in der B-ALL, die über einen Vorläufer des BZRs, dem prä-BZR vermittelt wird, hinsichtlich eines tonischen Überlebenssignals untersucht werden.
Durch massenspektrometrische Analysen der tonischen BZR-Signaltransduktion im Burkitt Lymphom, die für die Viabilität der Zellen essentiell ist und die Ergebnisse eines Inhibitorscreens konnte HSP90 als potenzielle neue Zielstruktur im Burkitt Lymphom identifiziert werden.
So konnte gezeigt werden, dass Burkitt-Lymphom-Zellen nach Inhibition der Chaperonfunktion von HSP90 durch zwei auf dem Markt bereits verfügbare Inhibitoren einen Zellzyklusarrest erfahren, der letztlich zur Apoptose der Zellen führt. Dieser Effekt wurde auf einen Verlust des (tonischen) BZR-Signals zurückgeführt, der überwiegend durch den aktiven lysosomalen Abbau von SYK nach HSP90-Inhibition zustande kommt. Demnach führte die Überexpression einer HSP90-resistenten Variante von SYK (TEL-SYK) zu einer Aufhebung der apoptotischen Effekte nach HSP90-Inhibition. Zudem wurde SYK als Interaktionspartner von HSP90 (HSP90-Klientprotein) im Burkitt Lymphom und die für die Interaktion essentielle Phosphorylierungsstelle (pY197 in HSP90α bzw. pY192 in HSP90β) identifiziert bzw. validiert.
Das therapeutische Potenzial der HSP90-Inhibitoren im Burkitt Lymphom offenbarte sich ferner durch den Vergleich der Wirkungseffektivität in gesunden B-Zellen mit der in Tumorzellen. So zeigten HSP90-Inhibitoren eine erhöhte Affinität zu Tumorzellen. Bei verwendeten Konzentrationen der Inhibitoren, die bereits eine apoptotische Wirkung in Tumorzellen hervorriefen, waren gesunde B-Zellen resistent.
In der B-ALL konnte durch den Knockdown von CD79a und der Inhibition von SYK eine tonische Antigenrezeptor-Signalleitung identifiziert werden, die wie im Burkitt Lymphom über den PI3K/AKT-Signalweg vermittelt wird. Durch die Kombination der im Rahmen dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse und weiterführende Analysen (wie zum Beispiel durch Inhibitor- oder CRISPR/Cas-Screens) kann so eine Identifizierung von potenziellen Zielstrukturen mit therapeutischem Nutzen in der B-ALL erfolgen.