Biowissenschaften
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Struktur-Funktionsbeziehungen des Verpackungschaperons Gsf2 in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
(2007)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des in der Membran des Endoplasmatischen Retikulum lokalisierten Proteins Gsf2 der Hefe Saccharomyces cerevisiae näher charakterisiert. Gsf2 ist ein 46 kDa großes ER-Transmembranprotein mit zwei membrandurchspannenden Domänen, wobei C- und N-Terminus cytosolisch orientiert sind. Zudem besitzt Gsf2 C-terminal ein klassisches Dilysin-Motiv. Eine Deletion des GSF2-Gens resultiert in einer Retention der Hexosetransporter Hxt1, Hxt3 und Gal2 im ER, so dass es sich bei Gsf2 möglicherweise um ein Hexosetransporterspezifisches Verpackungschaperon handelt.
Um Sequenzbereiche zu determinieren, die für die Funktion des Verpackungschaperons bezüglich der Reifung und des ER-Transportes von Hxt1 notwendig sind, wurden verkürzte Versionen des Gsf2-Proteins hergestellt. Die funktionelle Analyse zahlreicher verkürzter Versionen ergab die Lokalisation eines essentiellen Sequenzbereiches in den hinteren 40 Aminosäuren der carboxyterminalen Domäne des Gsf2-Proteins.
Vorläufige genetische und biochemische Untersuchungen hatten ergeben, dass Gsf2 mit Komponenten der Ribosomen, des Sec61-Translokationsapparates und mit Proteinen der COPII-Vesikel interagiert.
Mit Hilfe des Split-Ubiquitin Systems konnte in der vorliegenden Arbeit eine direkte Interaktion zwischen Gsf2 und dem Sec61-Translokations-Komplex und den Komponenten des sekretorischen Weges Sec12 und Sar1 bestimmt werden. Sec12 ist ein Sar1-spezifischer Guanin-Nucleotid-Austausch-Faktor, der für die Aktivierung von Sar1 benötigt wird. Sar1 ist ein kleines G-Protein, welches für die Initiation der COPII-Vesikelbildung benötigt wird. Sar1 ist aber auch für die Erkennung di-basische ER-Exportsignale spezifischer Cargo-Proteine zuständig. Diese Interaktion weist daraufhin, dass Gsf2 über solch ein Motiv verfügt und somit die Verpackung von Hxt1 in COPII-Vesikel gewährleisten könnte.
Postuliert wird ein Modell, wonach Gsf2 bereits eine wichtige Funktion bei der Translokation des Hexosetransporter Hxt1 in die ER-Membran übernimmt. Dabei interagiert Gsf2 mit dem Sec61-Translokon, um den Reifungsprozess der naszierenden Polypeptidkette des Metabolittransporters zu ermöglichen. Anschließend rekrutiert Gsf2 das gefaltete Proteine an Exit-Sites des Endoplasmatischen Retikulums. Es interagiert dort mit Sec12 und Sar1, so dass Gsf2 zusammen mit dem Hexosetransporter in die COPII-Vesikel verpackt und zum Golgi-Apparat transportiert wird. Aufgrund des ERRetentionssignals wird Gsf2 über COPI-Vesikel recycelt.
Dieses Modell impliziert, dass Hxt1 über kein ER-Exportsignal verfügt und daher Gsf2 als guide eine ausschlaggebende Funktion bei dessen Translokation übernimmt.
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae hat sich wie kaum ein anderer Organismus auf die Verwertung von Glukose spezialisiert. Die Aufnahme dieser Hexose stellt dabei den ersten Schritt der Metabolisierung dar. Saccharomyces cerevisiae besitzt hierfür eine große Zahl an Hexosetransportern und eignet sich daher gut zur Untersuchung der Wirkungsweise und Regulation dieser Transporter, sowie deren Translokation zur Plasmamembran.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Funktion des in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums lokalisierten Proteins Gsf2 der Hefe Saccharomyces cerevisiae näher zu charakterisieren. Gsf2 ist an der Translokation der Hexosetransporter Hxt1, Hxt3 und Gal2 zur Plasmamembran beteiligt. Die Deletion von GSF2 führt zur Akkumulation dieser Transporter in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums. Interaktionen von Gsf2 mit ribosomalen Proteinen, Komponenten der Translokationsmaschinerie und COPII-Hüllproteinen deuten auf eine multifunktionelle Hexosetransporterspezifische Funktion des Verpackungschaperons Gsf2 hin.
Mit Hilfe des „Synthetic Genetic Arrays“ wurde nach synthetisch letalen und synthetisch kranken Interaktionspartnern von GSF2 gesucht, die zur Aufklärung der Funktion von GSF2 beitragen beziehungsweise bisherige Forschungsergebnisse verifizieren sollten. Unter den nicht-essentiellen Genen der Hefe konnte allerdings kein synthetisch letaler oder synthetisch kranker Interaktionspartner von GSF2 ermittelt werden.
Im zweiten Projekt sollten Multicopy-Suppressoren aus einer Genbank identifiziert werden, die in der Lage sind die Deletion von GSF2 und damit verbundene Retention von Hxt1 in der Membran des Endoplasmatischen Retikulums zu komplementieren. Mit Hilfe dieses Screenings konnten einzig GSF2-kodierende Plasmide identifiziert werden.
Die Ergebnisse der beiden genetischen Screening-Verfahren belegen, dass Gsf2 eine herausragende Rolle innerhalb des Translokationsprozesses von Hxt1 einnimmt.
Daphnien sind ein wichtiger Bestandteil des Süßwasserzooplanktons und in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen als Modellorganismus etabliert. Ihr zyklisch parthenogenetischer Lebenszyklus und die hohen Raten von interspezischer Hybridisierung mancher Artkomplexe machen sie zu einem interessanten Forschungsobjekt. Die vorliegende Arbeit bietet Einblicke in die Populationsstruktur einer dieser Komplexe, des D. longispina-Artkomplexes, und testete ein neu entwickeltes Markersystem bei diesen Tieren auf gesamteuropäischer Ebene (33 Sammelorte, 1155 Individuen). Es wurden dazu molekulare Analysetechniken mit zwölf polymorphen Mikrosatelliten-Markern mit etablierten ITS-RFLP-Analysen verglichen.
Durch statistische Auswertemethoden mit den Programmen NewHybrids und Structure konnten Elternarten gut zugeordnet werden. Die Betrachtung der Kullback-Leibler Divergenzen in den Analysen durch NewHybrids deuten sogar darauf hin, dass die Anzahl der Mikrosatellitenmarker auf wenige besoders informative Loci reduziert werden kann, was bei Fragestellungen zur Art- und Hybrididentifizierung Zeit und Kosten spart. Ein Protokoll zur Vorgehensweise bei der Art- und Hybrididentifizierung wurde entwickelt.
Die Arten und Populationen selbst waren hoch differenziert. Zwischen den drei untersuchten Arten wurde ein FST von 0,29 gefunden. Ergebnisse aus einer AMOVA zeigten sogar, dass die Differenzierung zwischen den Populationen innerhalb der Arten leicht über dieser interspezifischen Differenzierung liegt (D galeata 0,40; D. longispina 0,52 und D. cucullata 0,42). Da auch keine isolation by distance gefunden wurde, lassen die Ergebnisse meiner Analysen auf „Provinzialismus“ schließen – ein Konzept, das genau dieses Muster voraussagt. Erklärt wird dieser Provinzialismus durch die Monopolisierungshypothese. Die Beobachtung, dass in der Regel in den untersuchten Populationen ein Heterozygotendefizit vorliegt, obwohl klonale Vermehrung oft zu einem Heterozygotenüberschuss führt (Meselson-Effekt), zeigt häufig vorkommende sexuelle Vermehrung an. Das Heterozygotendefizit deutet ebenfalls auf einen Wahlund-Effekt hin.
Es wurde weiterhin getestet, ob das Vorkommen von introgressiver, interspezifischer Hybridisierung in bestimmten Lokalitäten im Vergleich mit Lokalitäten, in denen ein Taxon allopatrisch lebt, einen Einfluss auf die Populationsstruktur hat. Die klonale Diversität sowie die beobachtete Heterozygotie standen dabei im Mittelpunkt der Analysen. Es wurde kein statistisch signifikanter Einfluss der Hybridisierung auf die Diversität gefunden.
Ulrike Anders hat zwischen Januar und September 2005 Zähne und Gebiß rezenter Schleichkatzen (Viverridae) untersucht und Parameter identifiziert, anhand derer sich Nahrungspräferenzen zuordnen lassen. Viverriden gelten als basale Carnivoren mit omnivorem Nahrungsspektrum. Da die für echte Katzen so typische Brechschere und die Reduktion des Gebisses nur wenig ausgeprägt ist, gilt ihr Gebiss als unspezialisiert. Dennoch besitzen Viverriden Nahrungspräferenzen, die sich in der Umgestaltung ihres Gebisses, auch in einzelnen Zahnpositionen niederschlägt. Diese Veränderungen wurden metrisch charakterisiert.
Sandra Engels hat zwischen August 2006 und Juni 2007 Schädel und Gebiß südostasiatischer Ursiden im Hinblick auf Ernährungspräferenzen rekonstruiert. Obwohl die Ursiden systematisch zur Ordnung der Carnivora gehören, verfolgen ihre Vertreter völlig unterschiedliche Ernährungsstrategien. Darunter sind spezialisierte Herbivoren genauso vertreten wie Carnivoren und Omnivoren. Ziel der Arbeit von Sandra Engels war es, anhand der unterschiedlichen Ernährungsregime, Parameter an Schädel, Gebiss und Einzelzähnen rezenter Tiere festzulegen und diese dann auf fossiles Material anzuwenden.
Julia Hansen hat zwischen März und Dezember 2006 Untersuchungen zu Funktion und Struktur der Okklusalflächen in der postcaninen Zahnreihe von Viverriden durchgeführt. Unter verschiedenen Ernährungsregimen bilden Höcker und Täler auf Zähnen, die sich im Gebiss gegenüber stehen, eine Funktionseinheit, mit der Schleichkatzen sowohl in der Lage sind, Früchte zu zerquetschen, als auch den Panzer von Insekten aufzuknacken. In ihrer Studie ist es Frau Hansen gelungen, konstruktive Unterschiede zwischen beiden Nutzungsweisen zu identifizieren. Diese Unterschiede hat sie an verschiedenen fossilen Einzelzähnen der Sammlung Koenigswald überprüft.
Die vorliegende Arbeit umfasst die Rekonstruktion der Körpermasse pleistozäner Cerviden in Java. Zunächst wird ein Rezentmodell erstellt, das den Zusammenhang zwischen Körpermasse und dem jeweiligen Messparameter aufzeigt. Die daraus resultierenden Regressionsgleichungen werden für die Rekonstruktion verwendet. Das fossile dentale und postcraniale Material wird vermessen und die Körpermasse für jedes einzelne Stück rekonstruiert. Die absoluten Werte werden in Körpermassenklassen eingeteilt, um einen Wert unabhängig vom physiologischen Zustand zu erhalten. Die Körpermassen werden, soweit möglich, getrennt nach Gattungen rekonstruiert. Ein Vergleich zeigt, dass es deutliche Unterschiede in der Körpermasse der Gattungen Axis und Muntiacus im Vergleich zu Cervus gibt. Bei der Einteilung in Klassen fällt auf, dass die Klassen 3a (10 kg bis 20 kg) und 3b (20 kg bis 50 kg) ausschließlich von Axis und zu einem kleinen Teil von Muntiacus besetzt werden. Die Klassen 4a und 4b ausschließlich von Cervus. Die einzige von Axis und Cervus besetzte Klasse ist 3c (50 kg bis 100 kg). Anhand dieser aus den Fossilien der Dubois Sammlung gewonnenen Erkenntnisse können nun die Fossilien der von Koenigswald Sammlung beurteilt werden, da diese nicht auf Gattungsniveau bestimmt sind. In beiden Sammlungen liegt der höchste Prozentsatz in der Klasse 3b. Daraus kann man schließen, dass sehr viele Tiere der Gattung Axis vorhanden sind. Die Gattung Cervus hingegen ist nur zu einem recht geringen Prozentsatz vertreten. Diese Verteilung spiegelt sich auch in der Untersuchung der Fundstellen wider. An nur drei der acht untersuchten Fundstellen wurden Tiere der Gattung Cervus gefunden. Ein Vergleich der Körpermassen ergibt keinen signifikanten Unterschied zwischen diesen. Innerhalb der Axis-Hirsche kann man einen Körpermassenunterschied erkennen, der jedoch nicht mit der geographischen Lage der Fundstellen begründet werden kann. Die Untersuchung der Fundstellen aufgrund ihrer Chronologie ergibt keinen signifikanten Unterschied zwischen den Faunenleveln Trinil H.K. und Kedung Brubus. Jedoch ist innerhalb der Faunenlevel eine deutliche Variationsbreite der Körpermasse zu erkennen, welche auf das an den einzelnen Fundstellen herrschende Habitat zurückgeführt werden kann. Die Zuordnung der bisher nicht datierten Fundstellen in die Faunenlevel ist alleine aufgrund der rekonstruierten Körpermassen nicht möglich, jedoch können erste Aussagen über das umgebende Habitat getroffen werden.
Die vorliegende Arbeit umfasst die Rekonstruktion der Körpermasse pleistozäner Rhinocerotidae in Europa und Südost-Asien , hier speziell der Insel Java. Methodisch wird dieses Ziel durch lineare Regressionen nach Janis (1990) verfolgt. Zunächst wird ein Rezentmodell erstellt, das es ermöglicht Körpermasse mit verschiedenen Zahnparametern in Zusammenhang zu bringen. Die aus dem Rezentmodell resultierenden Regressionsgleichungen für jeden Zahn werden dann für die Rekonstruktion fossiler Körpermassen verwendet. Das fossile Zahnmaterial wurde vermessen und die Körpermassen für alle Zahnparameter errechnet. Um einen Vergleich mit veröffentlichten Werten zu ermöglichen, wurde die Körpermasse gleichfalls nach Legendre (1986) ermittelt, welcher eine Formel zur Körpermassenrekonstruktion entwickelte, die heute allgemein Verwendung findet. Um die oftmals sehr großen Schwankungen in der Körpermasse, verursacht durch Ernährungs- und Gesundheitszustand eines Tieres abzufedern, sind die absoluten Werte in Körpermassenklassen eingeteilt. Die ermittelten Körpermassen wurden dann in verschiedenen Zusammenhängen betrachtet und, soweit möglich , Aussagen über Gründe für Veranderungen oder Unterschiede zwischen Messstrecken, Zeiträumen, Habitaten oder auch Spezies genannt.
Die vorliegende Studie dient als Basis einer neuen, zuverlässigen Populationsschätzung von Wildschweinen (Sus scrofa). Nach dem hier entwickelten Feldprotokoll soll Wildschweinkot in ausreichenden Mengen, ausreichend guter Qualität und nicht-invasiv gewonnen werden. Die daraus gewonnen Gewebeproben dienen anschließend als DNS-Quelle für individuelle Erkennung und Markierung der beprobten Tiere. Durch Kenntnis des zum Kot gehörigen Tieres lässt sich ein Fang-Wiederfang-Verfahren simulieren. Ein Sammelverfahren, gegliedert in zwei identische Blöcke zu je sechs Tagen, kombiniert aus Strip-Transekt-Sampling (Buckland 2001) und Adaptive-Sampling (Thompson 1991) führte hierbei zum besten Resultat von 0,48 Funden je abgesuchten Kilometer und 1,04 Funden je aufgewendeter Stunde. Die Untersuchung fand auf einem bewaldeten etwa 40 km2 großen Areal im Pfälzerwald, südlich von Kaiserslautern - südliches Rheinland-Pfalz – statt. Im Rahmen der Untersuchung wurden 1605 km abgesucht und vier verschiedene Transektmodelle getestet. Insgesamt wurden hierbei 268 Kothaufen erfasst, die zusätzlich auf ihre physischen Eigenschaften (Kotgröße, Härtegrad, Konsistenz, Insektenbefall), Lage im Gelände (Verteilung auf Laub-, Nadel- und Mischwälder, sowie auf Geländeneigung, Exposition und Höhenlage) und räumliche Verteilung im Untersuchungsgebiet analysiert wurden. Die Untersuchungen fanden zu verschieden Jahreszeiten (Sommer, Herbst und Winter) statt. Als geeigneter Zeitraum für eine solche Kotsammlung hat sich der Winter herausgestellt, aufgrund der längeren Zersetzungszeit des Kots und der durch den Laubfall bedingten, besseren Sichtverhältnisse. Bei ausreichender Stichprobenzahl des Kots hat es sich zu dem ergeben, dass Rückschlüsse auf die Habitatnutzung des Schwarzwilds anhand der Kotverteilung machbar sind. Eine Interpretation der Populationsstruktur anhand der Kotgröße ist in Ansätzen erkennbar. Ein Vergleich mit den gängigen Bestandesschätzverfahren durch Jagdstrecken und Kotzählungen bestätigt die Tauglichkeit des Feldprotokolls zur Beschaffung von Wildschweinkotmengen, die der Population entsprechen. In zwei von vier Versuchsansätzen konnten entsprechende Kotmengen erfasst werden.
Das Thema der vorliegenden Arbeit war die molekulargenetische Charakterisierung der Funktion der Glukosesensoren Snf3 und Rgt2 in der Hefe S. cerevisiae. Snf3 und Rgt2 gehören zur Familie der Hexosetransporter. Sie unterscheiden sich von ihnen jedoch in ihrer Funktion als Glukosesensoren wie auch durch ihre ungewöhnlich langen Cterminalen Domänen. Snf3 und Rgt2 sind integrale Membranproteine, die als Reaktion auf extrazelluläre Glukose Signale auslösen, die zur Expression bestimmter Hexosetransporter führt. Einige Komponenten, die an der Signaltranduktion beteiligt sind, wurden bereits identifiziert. Jedoch ist der genaue Mechanismus, der zur Expression der Hexostransporter führt, noch nicht vollständig aufgeklärt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Proteine Snf3, Rgt2, Mth1, Std1 und Rgt1 auf direkte Interaktionen untereinander getestet, um Einblicke in den molekularen Mechanismus der Signaltransduktion zu erhalten. Desweiteren sollte festgestellt werden, ob die Protein-Wechselwirkungen von der C-Quelle abhängig sind. Es konnte gezeigt werden, dass zwischen den Membranproteinen Rgt2 bzw. Snf3 und den löslichen Proteinen Mth1 bzw. Std1 Interaktionen in Abhängigkeit von Glukose stattfanden. Diese Ergebnisse unterstützen das von Moriya und Johnston aufgestellte, gegenwärtige Modell für eine glukoseinduzierte HXT Genexpression. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde geprüft, ob sich aus dem Glukosesensor Snf3 durch eine Aminosäuresubstitution ein bifunktionaler Sensor für Glukose und Galaktose erzeugen läßt. Dazu wurden die für den Galaktosetransport verantwortlichen Aminosäuren in den homologen Positionen von Snf3 ausgetauscht. Die Bestimmungen der Regulation des Snf3-kontrollierten HXT7 Promotors ergaben, dass das mutierte Snf3 Protein, wie das Wildtyp-Snf3 Protein, eine normale Glukosesensorfunktion ausübt aber keine Galaktosesensorfunktion vorzeigt.