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1. Die Membran des SR besitzt mehrere unterscheidbare Transportsysteme für organische und anorganische Anionen. Diese Transportsysteme lassen sich durch Anionenfluxmessungen mit der FilterassayMethode und durch Einzelkanalmessungen mit der Planarmembrantechnik charakterisieren. Der Vergleich der mit beiden Methoden ermittelten Daten ergibt, dass der 35 SO 4 2 Flux unter Standardbedingungen durch den als BCl (Big Chloride Channel) bezeichneten Chloridkanal bewerkstelligt wird und eine Steigerung der Effluxrate im Vesikelfluxexperiment auf die zusätzliche Aktivierung des als SCl (Small Chloride Channel) bezeichneten Chloridkanals zurückzuführen ist. 2. Neben Chlorid und Sulfat werden auch andere organische und anorganische Anionen wie Jodid, Pyrophosphat, Oxalat und Nukleotide transportiert. 3. Der stärkste Hemmstoff von 35 SO 4 2 und NukleotidTransport ist der PurinozeptorAntagonist Suramin mit einer I 50 von 0.91.16 µM. 4. Eine Stimulation des 35 SO 4 2 Transports kann durch die Kationen Calcium, Magnesium und Cholin erreicht werden. Ebenso wirken Hemmstoffe des RyR wie Ryanodin und Atractylosid stimulierend bzw. aktivierend. 5. 35 SO 4 2 Influx und Efflux werden durch Nukleotide unterschiedlich beeinflusst. Der Efflux wird in Abhängigkeit von Nukleotidbase, Anzahl der Phosphatreste und der Ladung gehemmt. Unter Magnesiumeinwirkung ist der Hemmeffekt verstärkt und auch das als nicht hydrolysierbar geltende ATP Analogon AMPPNP wirkt inhibierend. Der maximale 35 SO 4 2 Influx hingegen ist in Anwesenheit von ATP erhöht. Die ATPAnaloga AMPPNP und AMP PCP zeigen diesen stimulierenden Effekt nicht. 6. ATP und GTP werden in Anwesenheit von SRProtein schnell ab und umgebaut. Dieser Umbau lässt sich durch Magnesium und verschiedene Hemmstoffe des Anionenfluxes beeinflussen. 7. Der Eintransport von Nukleotiden in das Lumen des SR lässt sich durch Hemmstoffe des Anionenfluxes inhibieren. Die zusätzliche Hemmbarkeit durch Atractylosid, einen Inhibitor des mitochondrialen ATP/ADP Translokators (AAT), impliziert die Möglichkeit einer Beteiligung dieses Transportproteins am Nukleotidtransport. 8. Inhibitoren der Ca 2 ATPase hemmen auch den Anionenflux. Die Vermittlung des Anionentransports durch die Ca 2 ATPase selbst sowie die Hemmung des Ca 2 Eintransports aufgrund der Inhibition der Anionenkanäle sind ausgeschlossen. Vesikel mit rekonstituierter Ca 2 ATPase weisen keinen Anionen transport auf, obwohl der Ca 2 Eintransport durch Anionenkanalhemmstoffe wie Suramin, DIDS und PPANS inhibiert werden kann. 9. Beim Anionenflux eingesetzt zeigen Aktivatoren und Inhibitoren des Ca 2 ReleaseKanals gegenläufige Effekte. Der Ca 2 ReleaseKanal ist nicht der Vermittler des Anionentransports. Anionentransporter sind im RyRfreien longitudinalen SR ebenso häufig wie in den RyRreichen terminalen SR Zisternen.
Charakterisierung intrazellulärer Bindepartner von metabotropen Glutamatrezeptoren der Gruppe III
(2001)
Die Aminosäure Glutamat ist der maßgebliche exzitatorische Neurotransmitter im zentralen Nervensystem, und glutamaterge Synapsen sind weit über das ganze Hirn ver breitet. Neben den Ionenkanalgekoppelten (ionotropen) Glutamatrezeptoren (iGluRs) aktiviert Glutamat auch prä und postsynaptische metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluRs), die über trimere GProteine und nachgeschalteten Signalkaskaden Einfluss auf die Signalverarbeitung in der Synapse nehmen können (Pin und Duvoisin, 1995). Diesen Rezeptoren werden Aufgaben bei verschiedenen Formen neuronaler Plastizität und Neurotoxizität zugeschrieben (Pizzi et al., 1993; Pin und Duvoisin, 1995; Pekh letski et al., 1996; Pizzi et al., 1996a; Bushell et al., 1997; Maiese et al., 2000; Sabel haus et al., 2000). Zur Zeit sind acht verschiedene mGluRs zuzüglich ihrer Spleißvarian ten bekannt, die in drei Gruppen gegliedert werden, welche sich in ihrer Lokalisation, Struktur und pharmakologischen Eigenschaften unterscheiden (Nakanishi, 1992; Pin et al., 1993). Mitglieder der Gruppe III mGluRs sind spezifisch an der aktiven Zone der Präsy napse lokalisiert und dort an der Regulation der Neurotransmission beteiligt (Shigemoto et al., 1996; Ottersen und Landsend, 1997). Die Mechanismen, die zur spezifischen Lo kalisation führen, konnten bislang noch nicht aufgezeigt werden. Bereits im Vorfeld dieser Arbeit wurde eine Ca 2 abhängige Interaktion von Calmodulin (CaM) mit mGluR7a durch Kopräzipitationsstudien gezeigt. Die CaMBindung ist dabei von phy siologischer Relevanz für die Aktivierung des Rezeptors (O'Connor et al., 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde nach neuen Interaktionspartnern für die Gruppe III mGluRs gesucht, um so weitere Aufschlüsse über die präsynaptische Verankerung und Regulati on dieser Rezeptorgruppe zu gewinnen. In einem ZweiHybridScreen konnten dabei die Proteine PxF und SGT, beides Genprodukte unbekannter Funktion, als zwei mögliche Interaktionspartner für mGluR4b identifiziert werden. Die Natur dieser Interaktionen konnte im Verlauf dieser Arbeit nicht genauer bestimmt werden und bleibt somit Gegenstand weiterer Untersuchungen. In einem parallelem Ansatz wurde die Interaktion von mGluR7a mit CaM näher untersucht. Dabei konnte ein hochkonservierter Bereich in allen Gruppe III mGluRs mit Ausnahme von mGluR4b und mGluR6 identifiziert werden, der eine Konsensussequenz zur CaMBindung (1510Motiv) enthält. Neben der CaMBindung konnte für diesen Bereich in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Dr. Michael Freissmuth auch eine Interaktion mit Gbetagamma nachgewiesen werden. Die GbetagammaBindung an den Rezeptor wird durch Ca 2 abhängige Aktivierung von CaM gehemmt. Es wird daher ein Modell zur dualen Aktivierung von Gruppe III mGluRs vorgeschlagen, welches mögliche Mecha nismen zur negativen Rückkopplung der Glutamatfreisetzung aufzeigt. Zusätzlich wurde eine mögliche Regulation der Gruppe III mGluRs durch PKC Phosphorylierung untersucht. Dabei konnte die in vitroPhosphorylierung eines einzel nen Restes (S862) im intrazellulären CTerminus von mGluR7a nachgewiesen werden, welche zur Hemmung der CaMBindung führte. Aufgrund dieser Daten wird ein erwei tertes Modell formuliert, in dem die Hemmung der Ca 2 /CaMabhängigen Aktivierung der GProteinsignalkaskade durch Phosphorylierung von mGluR7a eine übergeordnete Regulation des Rezeptors darstellt. Da die Gruppe III mGluRs bei Aktivierung zu einer Selbsthemmung der Neuro transmission führen (Pin und Duvoisin, 1995; Takahashi et al., 1996), stellt deren Ca 2 /CaMregulierte Aktivierung und die zusätzliche Regulation durch Phosphorylie rung eine Möglichkeit der Regulation von Lernprozessen dar.
Die Vesikel des sarcoplasmatischen Reticulums (SR) der Skelettmuskulatur von Kaninchen enthalten neben Kanälen hoher (big chloride channel') und geringer (small chloride channel') Leitfähigkeit auch der äußeren Mitochondrienmembran bekannten voltagedependent anionselective channel' (VDAC). Der Kanal konnte mittels Immunodetektion Vesikeln heavy' und light' nachgewiesen, durch Affinitätschromatographie aufgereinigt nach der Spaltung Bromcyan teilsequenziert werden. Die Partialsequenzen beiden erhaltenen Fragmente stimmen Isoform 1 VDAC dem CorneaEndothel Oryctolagus cuniculus (Kaninchen) sowie aus dem Mitochondrium überein. Jedoch weist Kanal unterschiedliche Eigenschaften auf. zeigt Gegensatz dem mitochondrialen VDAC keine Affinität dem AnionenkanalInhibitor SITS bildet SRMembran keine Komplexe anderen Proteinen Bekannte Effektoren mitochondrialen VDAC wie NADH, DCCD antiVDAC Antikörper zeigen SulfatEffluxExperimenten entweder keine oder eine gegensätzliche Wirkung, was einen weiteren Hinweis unterschiedliche Regulationsfaktoren gibt. Die fehlenden Transporteigenschaften des rekonstituierten Kanals unter SulfatEfflux Bedingungen machen seine Beteiligung Sulfattransport und somit Transport SR sehr unwahrscheinlich. Vielmehr scheint den Transport von Nucleotiden, besonders ATP, SRLumen vermitteln. Allerdings weist auch hohe Affinitäten einem speziell synthetisierten GTPAnalogon auf könnte deshalb dem bekannten Eintransport von GTP in SRVesikel beteiligt sein. Nucleotide werden SRLumen Phos phorylierung verschiedener Proteine Sarcalumenin, HCP (histidinerich protein') und Calsequestrin benötigt, neben ihrer Funktion Speicher auch der Regulation Release beteiligt sind. den Vesikeln sarcoplasmatischen Reticulums existieren mindestens zwei Proteine, durch Immunodetektion Affinitätsmarkierung mit einem radioaktiv markierten GTPAnalogon nachgewiesen wurden. greifen regulierend in den Anionentransport SR ein, Antikörper gegen G Untereinheit dieser Proteine den Sulfattransport hemmen. Diese Wirkung scheint allerdings direkt erfolgen nicht über second messenger'. Einen weiteren Hinweis GProteinvermittelte Regulation Anionentransports stellt sehr effiziente Hemmung des SulfatEfflux SRVesikeln durch Suramin verschiedene Arbeitskreis synthetisierte Suraminderivate Ein Analogon, spezifisch GProteingekoppelten Ionenkanälen (P2Y Purinoceptoren) Wechselwirkung und bindet eine alpha Untereinheit der SRVesikel. Ein weiteres Derivat, SB 22, zeigt ebenfalls Affinität zu dieser G alpha Untereinheit sowie zu einem anderen Protein (40 kDa) und der Ca ATPase. ATPase keine Transport eigenschaften für Sulfat aufweist, muß die hemmende Wirkung auf den Anionentransport entweder durch Modifikation einer Galpha Untereinheit oder Zeit noch nicht näher charakterisierten Proteins erfolgen. Der VDAC zeigt Suraminderivaten gegenüber inert und kommt deshalb nicht Sulfattransporter des sarcoplasmatischen Reticulums Frage.
Ziel der Arbeit war es, die strukturellen Eigenschaften einer flüssigen Vorstufe einer Mullitkeramik mit Hilfe der NMR-Spektroskopie zu untersuchen. Die fertige Keramik soll später im Triebwerksbau in der Luft- und Raumfahrttechnik eingesetzt werden. Dazu wurden NMR-Messungen an den Kernen 1 H , 13 C, 27 Al und 29 Si durchgeführt. Als Experimente kamen dabei sowohl eindimensionale als auch zweidimensionale Methoden der NMR-Spektroskopie zum Einsatz. Zur Bildung von Strukturhypothesen wurden verschiedene Modellsysteme im Rechner simuliert. Eine besondere Herausforderung bei der Messung und Interpretation der Spektren stellte die hohe Viskosität der verwendeten Proben dar. Diese hohe Viskosität der Proben führte zu einer starken Verbreiterung der Resonanzlinien in den NMR-Spektren und zu den gezeigten Schwierigkeiten bei den Diffusionsmesungen. Die in der Literatur beschriebene strukturelle Vielfalt der Aluminiumalkoholate konnte nicht nur, wie in der Literatur bekannt, mit Hilfe von Aluminiumspektren, sondern auch über Protonen und Kohlenstoffspektren nachgewiesen und beschrieben werden. Insbesondere konnten Struktureinheiten jenseits der bekannten dimeren, trimeren und tertameren Strukturen der Aluminumalkoholate beschrieben werden. Das trimere Aluminiumsekundärbutylat steht mit einer dimeren Form im Gleichgewicht. Durch Temperaturerhöhung wird dieses Gleichgewicht in Richtung der dimeren Form verschoben. Im Falle der Verbindung [Al(OBu) 2n (iP rEtO) n ] konnte die direkte Nachbarschaft der 2-Butanol und iso-Propoxyethanolreste im Komplex über Signale im ROESY-Spektrum aufgezeigt werden. Es konnte eine sehr exakte und reproduzierbare Methode zur Bestimmung von Diffusionskonstanten in viskosen, gelartigen Lösungen mittels NMR-Messungen gefunden und erfolgreich auf die zu beobachtenden Systeme adaptiert und verwendet werden. Nur mit Hilfe dieser Methode war es möglich, den supramolekularen Charakter der Vorstufen einer Mullit-Keramik nachzuweisen. Insbesondere konnte gezeigt werden, daß das vorgestellte System eine hochgeordnete Struktur aufweist, und daß die einzelnen molekularen Einheiten über nicht kovalente Wechselwirkungen miteinander verbunden sind.
In dieser Arbeit wurde das Hauptkapsidprotein VP1 des murinen Polyomavirus zum Transfer von DNA in eukaryontische Zellen eingesetzt. Das murine Polyomavirus wird der Familie der Papovaviridae zugeordnet. Die Viren dieser Familie sind durch nichtumhüllte, ikosaedrische Kapside gekennzeichnet. Die äußere Hülle wird aus 72 VP1Pentameren gebildet, an die sich intern je ein VP2 bzw. VP3Molekül anlagert. Das Strukturprotein VP1 ist aufgrund folgender Eigenschaften für eine DNABeladung und Transfektion in eukaryontische Zellen prädestiniert: 1. Es wurde am NTerminus von VP1 eine DNABindungsdomäne identifiziert. 2. Es konnte am NTerminus von VP1 eine Kernlokalisationssequenz nachgewiesen werden. 3. Es wurde die exakte Rezeptorerkennungssequenz innerhalb der VP1Struktur bestimmt. 4. VP1 ist in der Lage, nach einer rekombinanten prokaryontischen Expression unter Hochsalzbedingungen zu Kapsoiden zu assemblieren. In dieser Arbeit wurde ein rekombinantes, in E. coli exprimiertes VP1Protein verwendet und hinsichtlich seiner DNABindung und der Fähigkeit zum DNATransfer in eukaryontische Zellen charakterisiert: 1. Das vorhandene Aufreinigungsprotokoll konnte optimiert werden. Die Proteinausbeute aus 1 l Bakteriensuspension wurde von 1,8 mg auf 3 mg gesteigert. Gleichzeitig wurde die Kontamination mit Fremdprotein deutlich reduziert. Es konnten die Ergebnisse hinsichtlich der Kapsoidassemblierung unter Hochsalzbedingungen reproduziert werden. 2. Cytotoxizitätstests in NIH 3T3Zellen belegten, daß die getesteten VP1Kapsoid Konzentrationen (ca. 25 µg/ml) keine signifikanten Anzeichen einer toxischen Reaktion zeigten. 3. Der Vergleich zwischen dem Kapsoid ohne HisTag und mit HisTag (Nterminale Klonierung eines 6xHisAffinitätsTags) zeigte, daß durch den HisTag die Bindung von einzelsträngiger DNA an das Kapsoid von 37% auf 55% erhöht werden konnte. Es wurde aber auch eine konzentrationsabhängige Aggregation des VP1Proteins mit HisTag beobachtet. In späteren Arbeiten wurde aus diesem Grund bevorzugt das VP1Protein ohne HisTag eingesetzt. 4. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal eine Transfektion von eukaryontischen Zellen, in diesem Fall den NIH 3T3Zellen, mit rekombinanten VP1Kapsoiden nachgewiesen werden. Nach Beladung von VP1Kapsoiden mit fluoreszenzmarkierter einzelsträngiger DNA konnte eine eindeutige intrazelluläre Fluoreszenz in den NIH 3T3Zellen beobachtet werden. Diese Fluoreszenz war diffus im Cytoplasma und distinkt im Nukleus lokalisiert. 5. Die biologische Aktivität der über VP1 in die Zelle transportierten einzelsträngigen DNASequenzen wurde mit einer Reduktion der bcl2Expression in MOLT4 Zellen überprüft. Die VP1Kapsoide zeigten im Vergleich zu DOTAP als Transfersystem und Aufnahme freier einzelsträngiger DNA die höchste Antisense Wirkung. Die verwendeten modifizierten Oligodesoxynukleotide zeigten jedoch eine nichtsequenzspezifische Reduktion des Proteinlevels. 6. Nach Beladung von VP1Kapsoiden mit PlasmidDNA unter Hochsalzbedingungen konnte in Transfektionsversuchen der erfolgreiche Transport der verwendeten PlasmidDNA in den Nukleus der Zielzelle über die Expression des Markergens (EGFP) nachgewiesen werden. 7. Im Hinblick auf eine Verbesserung der Transfektionseffizienz wurde die Beladung von VP1 mit DNAKondensaten getestet. Nach Einsatz von Histonen für eine DNAKomplexierung wurden Partikel detektiert, die vor allem aufgrund ihrer Größe nicht für eine Beladung mit VP1 geeignet waren. Als ein zweites Kondensationsagenz wurden polykationische Polyamidoamine, auch Dendrimere genannt, untersucht. Nach Einsatz von kondensierter, fluoreszenzmarkierter doppelsträngiger DNA konnte zusammen mit VP1Pentameren eine wesentlich stärkere Fluoreszenz innerhalb des Cytoplasmas der transfizierten Zellen im Vergleich zur Transfektion von DendrimerDNAKondensaten ohne VP1 nachgewiesen werden. Es konnte jedoch in keinem getesteten Kondensationsansatz in Anwesenheit von VP1 ein Transport der eingesetzten PlasmidDNA zum Nukleus der eukaryontischen Zellen beobachtet werden.