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Die Niere stellt im Organismus einen der Hauptangriffspunkte für Toxine dar. Dies liegt zum einen in der Tatsache begründet, dass zahlreiche Substanzen renal eliminiert werden. Eine weitere Funktion der Niere ist die Regulation des Flüssigkeitsund Elektrolythaushaltes durch Rückresorption von Wasser, Ionen, Aminosäuren und Glucose. Dies führt zu einer Aufkonzentrierung des Primärharns und folglich werden für die zu eliminierenden Toxine im Harn normalerweise höhere Konzentrationen erreicht, als beispielsweise im Blutplasma. Ein Portfolio von verschiedenen metabolisierenden Enzymen, die hauptsächlich in der Niere auftreten, sorgt weiterhin dafür, dass einige der gefilterten Substanzen erst in der Niere eine Bioaktivierung zum Toxin erfahren. Es ist somit von grosser Bedeutung, geeignete Testsysteme zu entwickeln, mit denen die Nephrotoxizität von Arzneistoffen, Chemikalien und anderen Substanzen untersucht werden kann. Die globale Analyse der Genexpression mit Hilfe von Mikroarrays bietet die Möglichkeit, die Veränderungen in der Expression von mehreren Tausend Genen gleichzeitig in der Niere oder in renalen Zellkulturen nach der Einwirkung eines potenziellen Nephrotoxins zu untersuchen. Eines der Ziele dieser Arbeit bestand darin, diese vielversprechende Methode für den Einsatz bei der Untersuchung von Nephrotoxizität zu evaluieren. In diesem Zusammenhang sollte geklärt werden, inwiefern sich aus der Literatur bekannte Tatsachen über den Toxizitätsmechanismus bestimmter Nephrotoxine bestätigen lassen und ob Hinweise auf bisher unbekannte Aspekte bezüglich der Vermittlung der Nephrotoxizität der Nephrotoxine gewonnen werden können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war es, ein Zellkulturmodell zu etablieren und zu charakterisieren, das es ermöglicht, Genexpressionsanalysen zur Untersuchung der Nephrotoxizität in vitro durchzuführen und das ausserdem mit in vivo vergleichbare Daten liefert. In verschiedenen Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass eine Kultur primärer Zellen etabliert werden konnte, die die funktionellen Eigenschaften von proximalen Tubuluszellen zeigt und keine Verunreinigung mit anderen Zelltypen des Nierencortex aufweist. Weiterhin wurden die optimalen Bedingungen für die Durchführung von Expressionsanalysen mit dieser Zellkultur definiert. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden das Expressionsprofil von Ochratoxin A mit Hilfe von cDNA-Mikroarrays, sowie die Profile von Quecksilber-II-chlorid, Paraquat und Puromycin mit Hilfe von Oligonukleotid-Mikroarrays in vivo und in vitro untersucht und bewertet. Ein Vergleich der beiden verfügbaren Plattformen (cDNA-Mikroarrays und Oligonukleotid-Mikroarrays) mit der Echt-Zeit-PCR als unabhängiger Methode lieferte aufschlussreiche Erkenntnisse über ihre Vor- und Nachteile. Die Analyse der Genexpressionsveränderungen nach der Einwirkung von OTA, HgCl2, Paraquat und Puromycin zeigte, dass sich mit Hilfe des Genexpressionsprofils zahlreiche Erkenntnisse über den Toxizitätsmechanismus der Substanzen gewinnen lassen, die sowohl durch die histopathologischen Befunde als auch mit Hilfe der einschlägigen Literatur bestätigt werden konnten. Zum Teil konnten sogar bisher unbekannte Aspekte der nephrotoxischen Wirkungen der untersuchten Modell- Toxine aufgedeckt werden, wie zum Beispiel die verstärkte Induktion von Golgi- Transport-assoziierten Genen im Nierencortex der Ratte nach Behandlung mit Paraquat. Die Analyse des Genexpressionsprofils kann somit vielversprechende Hinweise für das umfassende Verständnis des Toxizitätsmechanismus von Nephrotoxinen liefern. Der Vergleich der Expressionsmuster von HgCl2, Paraquat und Puromycin machte weiterhin deutlich, dass es einerseits transkriptionelle Änderungen gibt, die für das jeweilige Toxin spezifisch waren, andererseits aber auch Expressionsmuster aufgezeigt werden konnten, die allen untersuchten Nephrotoxinen gemeinsam waren. Durch die Identifizierung solcher gemeinsamen Genexpressionsprofile aus einer Datenbank mit zahlreichen bekannten Nephrotoxinen, könnte es in Zukunft sogar möglich sein, die potenzielle Nephrotoxizität unbekannter Arzneistoffe oder Chemikalien mit Hilfe von Mikroarrays vorherzusagen oder beispielsweise aus mehreren Kandidaten für einen neuen Arzneistoff, denjenigen mit dem geringsten nephrotoxischen Potenzial bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Entwicklung herauszufiltern.
Das Ziel dieser Studie war es, den Diodenlaser (980nm) in Bezug auf die Epithelentfernung am Tiermodell (subgingivale Kürettage) zu untersuchen und mit herkömmlichen Methoden zu vergleichen. Es wurden zehn Unterkiefer von frisch geschlachteten erwachsenen Schweinen mit vorhandenen parodontalem Weichgewebe und Entzündungen im Sinne von Taschenbildungen verwendet. Die bukkalen Seitenzähne (P2-P4, M1-M3) wurden von drei verschiedenen Behandlern mit konventionellen Küretten bearbeitet (Kontrollgruppe). Die lingualen Taschen wurden ausschließlich mit einem Diodenlaser (980nm) (Fa. Biolitec, Jena, Deutschland) kürettiert (Testgruppe). Der Laser wurde im kontinuierlichen Modus mit zwei unterschiedlichen Leistungseinstellungen (2 und 4 Watt) verwendet, wobei die Glasfaserstärke 360 µm betrug (Leistungsdichte: 1.96-3.93 x 105 W/cm2). Beide Gruppen wurden auf jeder Seite für 15 sec. bearbeitet. Diese Behandlungszeit hat sich Anhand unserer klinischen Erfahrung als effizient erwiesen. Alle drei Behandler hatten wie folgt unterschiedliche Erfahrungen im Bereich der Parodontalchirurgie: Level 1: Ein Zahnarzt im Weiterbildungsbereich Oralchirurgie Level 2: Ein Zahnarzt mit der Zusatzbezeichnung "Oralchirurgie" Level 3: Ein Zahnarzt mit der Zusatzbezeichnung "Oralchirurgie" und dreijähriger Weiterbildung in Parodontologie. Unmittelbar nach der Behandlung wurden bukkale und linguale Weichgewebebiopsien mit einem Skalpell exzidiert und histologisch bearbeitet. In den mit Laser behandelten Präparaten wurden keine Epithelreste gefunden. Der Laser mit einer geringeren Leistungseinstellung (2 Watt), war unabhängig vom Erfahrunggrad des Behandlers dazu befähigt, das dünne Taschenepithel zu entfernen. Bei Verwendung einer höheren Leistungseinstellung (4 Watt) konnte man Beschädigungen des Bindegewebes und Weichgewebsnekrosen erkennen, welche temperaturbedingt durch den Laser verursacht wurden. Unabhängig vom parodontalchirurgischen Erfahrungsgrad der Behandler, wurden in allen mit Handinstrumenten bearbeiteten Präparaten lineare Epithelreste gefunden. Allerdings wiesen die Präparate von Behandler 3 im Vergleich zur Gruppe der nicht behandelten Präparate bedeutend weniger Epithelreste auf, als die von Behandler 1. Kollagenfasern und extrazelluläre Matrix zeigten eine normale Form ohne Gewebeschäden. Die in dieser In vitro-Studie präsentierten histologischen Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung des parodontalen Weichgewebes mit dem Diodenlaser (980nm), im Vergleich zu konventionellen Methoden mit Handinstrumenten, zu einer vollständigen Epithelentfernung in der Tasche führt. Unabhängig vom parodontalchirurgischen Erfahrungsgrad war jeder Behandler mit dem Laser dazu befähigt, das Epithel effizient zu entfernen. Es ist von klinischer Bedeutung, daß der Laser ein charakteristisch leichtes Handling im Vergleich zur Weichgewebskürettage mit konventionellen Methoden hat. Um das Risiko von Kollateralschäden im angrenzenden gesunden Bindegewebe zu minimieren, muß die Leistungeinstellung der Lasereinheit relativ gering sein. Der zusätzliche antibakterielle Effekt des Diodenlasers hat einen signifikanten Vorteil in Bezug auf die Regeneration des zerstörten parodontalen Gewebes. Dieses Verfahren erlangt durch die zusätzliche Instrumentierung der Wurzeloberfläche mittels koventionellen Techniken entscheidende klinische Relevanz. Der Laser erlaubt eine adäquate Koagulation, die das gesunde benachbarte Gewebe nicht beschädigt. Gleichzeitig stimuliert er, wenn er in richtiger Weise angewendet wird, neues Knochenwachstum. Dies wurde durch zahlreiche Studien beobachtet. Weiterhin sind klinische Studien an Tier und Mensch erforderlich, damit dieses Verfahren in der täglichen Praxis angewendet werden kann. Gleichzeitig sind Training in der Laserchirurgie und spezielle Operationstechniken von großer Wichtigkeit, um dem Kliniker das notwendige Know-how für den klinischen Gebrauch zu vermitteln und mögliche Komplikationen zu vermeiden.
In der vorliegenden Arbeit beschäftigen wir uns mit der Verallgemeinerung des Satzes von Belyi [B]. Dieser besagt, dass eine Riemannsche Fläche Y genau dann als algebraische Kurve über einem Zahlkörper definiert ist, wenn es auf Y eine nicht-konstante holomorphe Funktion gibt, die über höchstens drei Punkten verzweigt. Die Arbeit gliedert sich in zwei Teile. Wir untersuchen darin jeweils die Verallgemeinerung einer der beiden Implikationen aus dem Satz von Belyi auf Varietäten der Dimension zwei und höher. Im ersten Teil der Arbeit zeigen wir, dass eine n-dimensionale projektive komplex algebraische Varietät über einem Zahlkörper definiert ist, falls sie den Pn (oder eine beliebige projektive über Q definierte Varietät) endlich und höchstens über einem rationalen Divisor verzweigt überlagert. Dazu beschreiben wir im ersten Kapitel den Zusammenhang zwischen Varietäten und komplex analytischen Räumen. Wir zeigen, dass die Kategorie der endlichen algebraischen Überlagerungen einer projektiven komplexen Varietät äquivalent zur Kategorie der endlichen verzweigten analytischen Überlagerungen des assoziierten komplex analytischen Raumes ist. Außerdem erläutern wir den Zusammenhang zwischen topologisch unverzweigten Überlagerungen und deren Algebraisierung, den étalen Morphismen zwischen Varietäten. Im zweiten Kapitel führen wir Definitionskörper und Modulkörper von Varietäten ein. Anschließend untersuchen wir die Operation von Körperautomorphismen s E Aut (C/Q) auf komplexen Varietäten. Im dritten Kapitel zeigen wir zunächst, dass der Modulkörper einer endlichen Überlagerung eines geeigneten Grundraumes ein Zahlkörper ist. Danach stellen wir das Resultat von Derome [D] vor, nachdem es einen Definitionskörper im algebraischen Abschluss des Modulkörpers gibt. Daraus folgern wir die Verallgemeinerung dieser Richtung des Satzes von Belyi. Im zweiten Teil beschäftigen wir uns mit der Frage, wie der Verzweigungsdivisor D im Pn aussehen sollte, damit jede über Q definierte Varietät ein Modell besitzt, dass Pn endlich und nur über D verzweigt überlagert. Im vierten Kapitel stellen eine Heuristik zur Korrespondenz zwischen topologischen Überlagerungen und Körpererweiterungen von Q vor. Daraus leitet sich folgende Vermutung ab: Zu jeder über einem Zahlkörper definierten n-dimensionalen Varietät Y gibt es eine birational äquivalente normale Varietät Y und einen Morphismus f : Y -> Pn, der nur über dem Komplement von M0,n+3 verzweigt. Die Vermutung steht im Einklang mit dem eindimensionalen Satz von Belyi. Alle Modulräume erfüllen die Voraussetzung für die im dritten Kapitel bewiesene Umkehrung. Im letzten Kapitel beschäftigen wir uns mit komplex algebraischen Flächen. Wir zeigen, dass die Vermutung aus dem vierten Kapitel für abelsche Flächen richtig ist. Dieses Ergebnis haben wir gemeinsam mit Horst Hammer (Karlsruhe) erzielt. Anschließend geben wir einen Überblick über weitere Resultate in dieser Richtung. Schließlich beschreiben wir die topologischen Überlagerungen von M0,5 und stellen eine Verallgemeinerung der Dessins d'Enfants vor.
Das Spektrum der Einfachionisation von Helium unterhalb der Doppelionisationsschwelle bei 79 eV ist reich an komplexen Strukturen. Eine Vielzahl von Resonanzen tritt dort auf. Diese Resonanzen sind unmittelbar verbunden mit doppelt angeregten Zuständen von Helium. Unterhalb einer Photonenenergie von ca. 77 eV liegen diese Resonanzen geordnet vor, und sie können dort mit Hilfe weniger Quantenzahlen klassifiziert werden. Das trifft aber nicht auf den Bereich dicht unterhalb der Doppelionisationsschwelle zu, d.h. zwischen ca. 78,2 eV und 79 eV. Hier verlieren die bis dahin verwendeten Quantenzahlen ihre Gültigkeit. Dieses Gebiet ist sowohl theoretisch als auch experimentell nahezu unerforscht. Traditionelle experimentelle Methoden stoßen hier auf Hindernisse, die auch in den kommenden Jahren höchstwahrscheinlich nicht überwunden werden können. Das größte Problem hierbei sind die sehr geringen Reaktionsraten. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neuer Weg gewählt, der diese Probleme weitgehend hinter sich läßt und Untersuchungen in dieser äußerst schwer zugänglichen Region ermöglicht. Die neue Technik weist gegenüber bisherigen Methoden eine um mehrere Größenordnungen gesteigerte Nachweiseffizienz auf, wodurch Messungen in diesem Energiebereich innerhalb eines vernünftigen Zeitrahmens praktisch erst ermöglicht werden. Erreicht wird dies durch ein Spektrometer, das zu allen Raumrichtungen hin sensitiv ist und die Impulse und Flugrichtungen der emittierten Elektronen individuell für jede einzelne Reaktion nachweisen kann. Die Elektronen werden zusammen mit dem jeweiligen He+-Ion in Koinzidenz nachgewiesen, wodurch eine sehr effiziente Unterdrückung von Untergrundereignissen realisiert wird. Die vorgestellte Meßmethode basiert auf der sogenannten Coltrims-Technik, die seit einigen Jahren im Bereich der Atom- und Molekülphysik äußerst erfolgreich eingesetzt wird. Ihre Anwendung auf niederenergetische Elektronen mit kinetischen Energien im Bereich zwischen 0 eV und 0,5 eV war bisher jedoch nur sehr eingeschränkt möglich und mit großen Unsicherheiten verbunden, da in diesem Fall die Einflüsse verschiedener Störquellen wie beispielsweise das Erdmagnetfeld berücksichtigt werden müssen. Diese Probleme konnten gelöst werden, so daß nun auch winkelaufgelöste Messungen an Elektronen mit weniger als 100 meV kinetischer Energie möglich sind. Die Apparatur wurde im Rahmen einer Messung am Berliner Synchrotron BESSY II erfolgreich eingesetzt. Untersucht wurden die partiellen Wirkungsquerschnitte sN(E) der verschiedenen Ausgangskanäle der Reaktion g(E) + He -> He** -> e- + He+(N), wobei E die Photonenenergie und N die Hauptquantenzahl des erzeugten Heliumions ist. Zusätzlich wurde zu jedem dieser Reaktionskanäle die Winkelverteilung bN(E) der emittierten Elektronen bestimmt. Ziel der Messung war es, zunächst einen Bereich des Energiespektrums abzudecken, für den theoretische Vorhersagen existieren. Im weiteren Verlauf der Messung wurde dieser Bereich ausgedehnt bis hin zur Doppelionisationsschwelle. Die Ergebnisse werden verschiedenen theoretischen Vorhersagen gegenübergestellt und diskutiert. Die aufgenommenen Daten umfassen auch Bereiche des Energiespektrums, für die noch keine theoretischen Ergebnisse vorliegen (78,3 eV<E<78,9 eV). Die hier beobachteten Verhaltensweisen insbesondere der Winkelverteilungen der emittierten Elektronen werden mit veröffentlichten Daten verglichen, die bei einer Photonenenergie von E=80,1 eV aufgenommen wurden, d.h. dicht oberhalb der Doppelionisationsschwelle. Die beobachteten Parallelen können innerhalb eines klassischen Modells interpretiert werden.
Der Einfluss der zellulären mitogenen Signalkaskade auf die Pathogenese einer Infektion mit HIV oder SIV (humanes, simianes Immundefizienzvirus) ist bis heute weitgehend unbekannt, obwohl in mehreren Studien eine Wechselwirkung zwischen HIV und dieser Signalkaskade festgestellt wurde. Unter anderem wurde eine direkte Interaktion von HIV-1-Nef mit c-Raf, einem wichtigen Mitglied der klassischen mitogenen Signalkaskade, beschrieben. In dieser Arbeit sollten daher die physiologischen Konsequenzen dieser Virus-Wirtszell-Interaktion analysiert werden. Für die Untersuchungen ist der akut enteropathische SIV-Stamm PBj ein geeignetes Modellsystem, da PBj im Gegensatz zu anderen Lentiviren in nichtmitogen- stimulierten Zellen repliziert. Außerdem induziert PBj die Proliferation von unstimulierten Zellen, wofür eine Aktivierung mitogener Signale notwendig ist. Weiterhin sind die Ursachen für die ausgeprägte PBj-induzierte akute Erkrankung nur unvollständig aufgeklärt. Für die Untersuchungen wurde ein replikationsfähiger Virusklon von PBj mit zwei Punktmutationen in der Raf-Bindungs-Domäne (RBD) des viralen Nef-Proteins erzeugt. In der erzeugten Virusmutante, PBj-Delta-RBD, wurden im Nef-Protein zwei benachbarte Aspartate zu Glycin verändert. Die erzeugte Virusmutante PBj-Delta-RBD war in der Lage in unstimulierten primären Zellen zu replizieren und zeigte die gleiche Replikationskinetik wie das Wildtypvirus (PBj-wt). Im Gegensatz zu PBj-wt induzierte PBj-Delta-RBD in vitro keine Zellproliferation, ERK1/2-Aktivierung oder IL-2- Sezernierung. Diese Ergebnisse zeigen, dass die RBD für die Fähigkeit, in unstimulierten Zellen zu replizieren, nicht benötigt wird. Dagegen ist die RBD für eine Induktion der ERK-Aktivität, Zellproliferation oder IL-2 Sezernierung notwendig. Die Infektion von Schweinsaffen (Macaca nemestrina) mit PBj-wt induzierte wie erwartet eine akute Enteropathie mit Symptomen wie blutigem Durchfall, Anorexie, Exikose und Tod. In pathologischen Untersuchungen wurden in den mit PBj-wt infizierten Tieren nekrotische Läsionen im gesamten Darmbereich beobachtet. Die Histopathologie des Kolons zeigte, dass die gesamte Mikrovilli-Struktur der Darmschleimhäute zerstört war. Darüber hinaus war eine massive Infiltration von Lymphozyten in die Mikrovilli erkennbar. Im Gegensatz dazu entwickelte keiner der mit PBj-Delta-RBD infizierten Schweinsaffen eines der für SIV-PBj charakteristischen Symptome, trotz einer vergleichbaren Replikationskinetik in vivo. Zusätzlich waren makroskopisch keine Veränderungen des Kolons festzustellen. Die histologische Untersuchung des Kolons der PBj-RBD-infizierten Schweinsaffen zeigte lediglich eine moderate Infiltration von Lymphozyten in die Mikrovilli. Die Analyse der frühen und späten Aktivierungsmarker auf T-Zellen im peripheren Blut und in den lymphatischen Geweben Milz und Lymphknoten zeigte, dass in PBj-wt-infizierten Schweinsaffen ein deutlich erhöhter Anteil aktivierter CD3+-T-Zellen im Vergleich zu PBj-Delta-RBD-infizierten Affen nachweisbar war. Zusammenfassend lassen die Ergebnisse dieser Arbeit den Schluss zu, dass in PBj-infizierten Zellen über eine Interaktion von PBj-Nef mit c-Raf die klassische mitogene Signalkaskade aktiviert wird. Dies induziert wiederum physiologische Aktivitäten wie Zellproliferation, Zellaktivierung und IL-2-Ausschüttung. Die festgestellte Aktivierung von CD8+-T-Zellen führt in vivo zu einer massiven Infiltration von aktivierten CD8+-T-Zellen in die Schleimhäute des Magen-Darm- Trakts. Es ist anzunehmen, dass die aktivierten CD8+-T-Zellen hier Perforin ausschütten und auf diese Weise massive Gewebsveränderungen der Mucosa induzieren. In der Folge kommt es zu den beobachteten Symptomen wie blutigem Durchfall und daraufhin zu Exikose. Ähnliche Mechanismen könnten auch bei der HIV-Enteropathie eine Rolle spielen. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass eine Verhinderung der Nef-Raf-Interaktion das Auftreten einer Enteropathie unterdrücken könnte. Die Nef-Raf-Interaktion ist somit ein potentielles Ziel für einen therapeutischen Ansatz.
Protease-aktivierbare Retroviren bieten die Möglichkeit des gezielten Gentransfers in solche Tumorzellen, die an der Zelloberfläche proteolytisch aktive Proteasen, wie beispielsweise Matrix Metalloproteasen (MMP), exprimieren. Hierfür wird zunächst der Zelleintritt der Retroviren durch eine mit den Hüllproteinen fusionierte Blockierungsdomäne verhindert. Zwischen dieser Blockierungsdomäne und dem Hüllprotein befindet sich ein für eine zelluläre Protease fungierender Substratlinker, worüber die Blockierung entfernt und der natürliche Infektionsmechanismus der Retroviren wieder hergestellt wird. In Bezug auf die Tumortherapie mittels eines solchen Gentransfers ist es jedoch unmöglich vorherzusagen, welches Protease- Substrat für einen bestimmten Tumortyp am besten geeignet ist. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit retrovirale Protease-Substrat-Bibliotheken entwickelt, um erstmalig die Substrate der tumorassoziierten MMPs in lebenden Tumorzellen zu selektionieren und damit verbunden MMP-aktivierbare Retroviren mit verbesserten molekularen Eigenschaften für den gezielten Gentransfer zu evolvieren. Hiefür wurden, ausgehend von einem Protease-aktivierbaren Retrovirus, welches als Substratlinker das MMP-Standardsubstrat P-L-G-L-W-A präsentiert, Retroviren erzeugt, in denen dieses Substrat kombinatorisch diversifiziert wurde. In einer ersten retroviralen Protease-Substrat-Bibliothek wurde zunächst an drei Stellen zu P-X-G-L-X-X unter Ausschluss der Aminosäure Arginin diversifiziert, um die Selektion durch Proprotein-Konvertasen wie Furin zu vermeiden. Anschließend erfolgte die Selektion der Virus-Bibliothek in der Modell-Tumorzelllinie HT1080, wofür hier das entsprechende Protokoll etabliert wurde. Die Substratlinker der am häufigsten selektionierten Retroviren enthielten die beiden Konsensusmotive P-QG- L-Y-[Q/K] und P-Q-G-L-Y-[A/S]. Zur Identifizierung der optimalen Aminosäuren an allen sechs Positionen des Substrates wurden in einer zweiten Bibliothek die variierten Positionen auf Grundlage der selektionierten Konsensusmotive fixiert und die zuvor konstanten Positionen zu X-Q-X-X-Y-[Q/A] diversifiziert. Die aus dieser Bibliothek selektionierten Retroviren enthielten das Konsensusmotiv P-Q-G-[L/I/V]-Y-[Q/A], womit die zuvor selektionierten MMP-aktivierbaren Retroviren bestätigt wurden. Die biochemische Charakterisierung von mit den selektionierten Substratlinkern rekonstituierten Retroviren zeigte, dass ihre Substratlinker eine bemerkenswerte Verbesserung der Spaltung durch MMP-2 und eine erhöhte Inkorporation der dazugehörigen Hüllproteine in die Partikel aufwiesen. Außerdem ermöglichten die selektionierten Substratlinker den entsprechenden Retroviren sich schneller innerhalb der Zellpopulation auszubreiten, ohne dabei die Abhängigkeit von der MMP-Aktivierung zu verlieren. Darüber hinaus konnte sowohl die Kinetik des Zelleintritts bis zu 10-fach als auch die Infektiosität bis zu 1000-fach gegenüber dem parentalen Virus, das den Standard-Substratlinker trug, gesteigert werden. Letztendlich waren hierfür nur zwei selektionierte Aminosäureaustausche gegenüber dem MMP-Standardsubstrat verantwortlich, nämlich Glutamin (Q) und Tyrosin (Y), die zu dem Motiv P-Q-G-L-Y-A führten. Ausschlaggebend für die beschriebenen Selektionen waren die mehrfache Abdeckung der kombinatorischen Vielfalt der Substratlinker auf Partikel-Ebene bereits vor Selektion sowie die langsame Erhöhung des angelegten Selektionsdrucks während der Selektion. Dadurch konnte eine Deletion des kodierenden Bereichs der Blockierungsdomäne (EGF) im Virusgenom vermieden werden. Als treibende Kraft der Selektion stellte sich die proteolytische Aktivierung der selektionierten Retroviren an der Zelloberfläche heraus. Die Ergebnissen führen schließlich zu einem Modell der MMP-Aktivierung EGF-blockierter Retroviren. Danach binden die Partikel an die EGF-Rezeptoren der Zelloberfläche und gelangen so in die räumliche Nähe des MMP-Aktivierungskomplexes. Daraufhin werden sie proteolytisch aktiviert und infizieren die Zielzellen. Die hier selektionierten Substratlinker bzw. die entsprechenden Viren sind in Bezug auf die proteolytische Aktivierung optimal an die gewählte Tumorzelllinie angepasst.
In der vorliegenden Arbeit wurde nachgewiesen, dass bei Krebspatienten Tumorspezifische Gedächtnis T-Zellen im Verlauf einer Tumorerkrankung generiert und erhalten werden. Dies konnte sowohl für einen soliden Tumor, das Mammakarzinom, als auch für eine hämatologische Neoplasie, das Multiple Myelom, verifiziert werden. Dabei konnte zum ersten Mal belegt werden, dass im Verlauf einer MM-Erkrankung MUC-1 als autologes Tumor-assoziiertes Antigen immunologisch erkannt wird und zur Generierung von Gedächtnis T-Zellen mit einer Anreicherung im Knochenmark der Patienten führt. Weiterhin konnte eine Anreicherung TAA-spezifischer Gedächtnis T-Zellen innerhalb der EM Zellpopulation bei Mammakarzinom-Patientinnen demonstriert werden. Die Analyse der Funktionalität und Langlebigkeit von EM und CM T-Zellen im Hinblick auf ihre klinische Relevanz zeigte wesentliche Unterschiede zwischen beiden Gedächtniszell- Populationen. So war eine IFN-gamma Induktion und Proliferation in CM T-Zellen in stärkerem Ausmaß von einer zusätzlichen Costimulation abhängig verglichen zu EM T-Zellen. Außerdem fiel eine Apoptose-Induktion in CM stärker aus als in EM T-Zellen. Unterschiede in Funktion und Viabilität von CM und EM T-Zellen korrelierten dabei mit der Expression des Chemokinrezeptors CCR7. ELISpot-Analysen der Polarisierung induzierter TH-Antworten beim Mammakarzinom ergaben eine große Heterogenität zwischen den Patienten. So exhibierte ein Teil der Patienten dominante TH1-Antworten, während bei einem anderen Teil lediglich TH2- oder toleranzinduzierende IL-10-Antworten induziert werden konnten. Darüber hinaus traten auch gemischt-polarisierte TH-Antworten auf. Eine Analyse ausgewählter Zytokine resultierte in der Detektion immunsuppressiver und immunstimulatorischer Zytokine im Tumorgewebe, wobei die Zytokinprofile interindividuell stark schwankten und kein einheitliches Muster erkennen ließen. Interessanterweise bestand jedoch eine inverse Korrelation zwischen der Induktion einer TH1-Antwort im ELISpot und dem erhöhten Vorkommen immunsuppressiver Zytokine im autologen Tumorgewebe von Mammakarzinom-Patienten. Eine derartige Korrelation impliziert, dass das vorherrschende Milieu der Tumorumgebung bei einer tumorspezifischen Aktivierung einen Einfluss auf infiltrierende Dendritische Zellen und ihre nachfolgende Polarisierung von T-Zellantworten hat. Folglich könnte die Untersuchung eines breiten Spektrums an Zytokinen in der Tumor-Mikroumgebung zu relevanten Zeitpunkten einer Tumorentwicklung, einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von Tumor-Immun Interaktionen liefern.
Angiotensin II (ANG II), das physiologisch aktivste Produkt des Renin-Angiotensin-Systems (RAS), ist als ein Vasokonstriktor maßgeblich an der Modulation des Blutdrucks beteiligt. Darüber hinaus spielt das Octapeptid eine wichtige Rolle in der Freisetzung von Vasopressin und Hypophysenhormonen und reguliert den Flüssigkeits- und Salzhaushalt. Die Modulation des Blutdrucks sowie die Stimulation der Vasopressinfreisetzung werden über seine AT1-Rezeptoren vermittelt. Viele dieser physiologischen Funktionen zeigen eine klare Tag/Nacht-Variation. Der Nucleus suprachiasmaticus des Hypothalamus (SCN) repräsentiert den zentralen Schrittmacher der circadianen Uhr der Säugertiere und reguliert mitunter den Schlaf/Wach-Zyklus und den circadianen Rhythmus des Blutdrucks. Mit der Entwicklung eines transgen-hypertensiven Rattenstammes [TGR(mREN2)27], der über eine der Herzfrequenz und Aktivität entgegengesetzt phasenverschobene circadiane Rhythmik des Blutdrucks verfügt, konnte eine enge physiologische Beziehung zwischen ANG II und dem SCN aufgezeigt werden. Diese Hypertonie wird durch das zusätzliche und zudem noch übermäßig exprimierte Mäuse-Renin2-Gen im Zirkulations-RAS dieser Ratten verursacht. Die hieraus folgende übermäßige Bereitstellung von Renin im Blutkreislauf führt zu einer erhöhten Konzentration von ANG II im systemischen Kreislauf. Die Funktionswege, die zur phasenverschobenen circadianen Rhythmik des Blutdrucks bei TGR führen sowie die Rolle, die das Octapeptid ANG II generell in der Blutdruckmodulation bei normotensiven und transgen-hypertensiven Tieren spielt, sind noch weitgehend unbekannt. Es wird angenommen, dass das Gehirn-RAS über eine autonome ANG II-Synthese Einfluss auf die Modulation des Blutdrucks ausübt. Ob dieser Einfluss des Gehirn-RAS direkt am zentralen Schrittmacher der circadianen Rhythmik ansetzt und ob und wie sich dieser Einfluss durch das Transgen der TGR verändert, ist ebenfalls nicht bekannt. Um die Wirkung des im Blutkreislauf übermäßig vorhandenen ANG II auf Komponenten des Gehirn-RAS in Hirnarealen vor und hinter der funktionellen Blut/Hirn-Schranke auf zuzeigen, wurden im Verlauf dieser Arbeit der SCN sowie zwei Zirkumventrikularorgane von normotensiven Sprague-Dawley (SDR) und transgen-hypertensiven TGR(mREN2)27 (TGR) Ratten auf die Dichte und Verteilung ihrer AT1-Rezeptoren hin überprüft. Da die physiologische Rolle von ANG II im SCN selbst auch ungeklärt ist und ultrastrukturelle Befunde zur Lokalisation des Octapeptids und seiner AT1-Rezeptoren im SCN bisher nicht verfügbar sind, wurde in dieser Dissertationsarbeit eine immunhistologische Technik entwickelt, mit deren Hilfe sich Immunreaktionen gegen das Octapeptid ANG II und seine AT1-Rezeptoren auf licht- und elektronenmikroskopischer Ebene darstellen lassen. Die hier beschriebenen Befunde machen den Einfluss des Transgens - vermittelt durch die erhöhte ANG II-Konzentration im Blutkreislauf von TGR - auf Veränderungen in Dichte und Verteilung der AT1-Rezeptoren in Hirnarealen vor und hinter der funktionellen Blut/Hirn-Schranke deutlich. AT1-Rezeptoren erscheinen in Hirnarealen mit offenem Kapillarsystem reduziert, im SCN dagegen unverändert und in anderen Regionen mit funktioneller Blut/Hirn-Schranke teilweise erhöht. Lokal begrenzte Veränderungen in der Bereitstellung der AT1-Rezeptoren innerhalb einzelner Kerngebiete hängen maßgeblich von deren topographischer Organisation ab, die bei bisherigen autoradiographischen- und Ligand-Bindungs-Studien jedoch keine Berücksichtigung fand. Die hier vorliegende Arbeit demonstriert erstmalig, dass ANG II im SCN als ein Neurotransmitter und -Modulator fungiert, dessen Effekte über seinen AT1-Rezeptor vermittelt werden. Der Rezeptor vermittelt des Weiteren auch den aktiven - vermutlich bidirektionalen - Transport von ANG II durch die Kapillarendothelien des SCN und ist an der Aufnahme von ANG II (Endozytose) und dessen intrazellulären Transport in einem Hormon/Rezeptor-Komplex in Neuronen, Glia- und Endothelzellen im SCN beteiligt. Die Befunde machen darüber hinaus eine Synthese von ANG II in distinkten Neuronen des SCN wahrscheinlich und deuten an, dass autonom produziertes ANG II im SCN an der Regulation des Blutdrucks und der Freisetzung von Vasopressin beteiligt ist.
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Mess-Systems zur energie- und winkelaufgelösten Spektroskopie von koinzidenten Elektronenpaaren, die in Reaktionen an einer Oberfläche emittiert wurden. Das Hauptinteresse galt hierbei dem Zwei-Elektronen-Photoemissionsprozess an Oberflächen. Das Prinzip des Spektrometers stellt eine Erweiterung der existierenden COLTRIMS-Spektrometer (COld Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) für Gasphasen-Experimente auf den Themenkreis der Oberflächenphysik dar. Anders als bei den in der Photoelektronen-Spektroskopie häufig eingesetzten elektrostatischen Analysatoren, wird hier eine Flugzeittechnik verwendet. Die Elektronen, die in der Reaktion erzeugt wurden, werden h ierzu mit einem schwachen homogenen elektrostatischen Feld vom Target abgesaugt und in Richtung eines orts- und zeitauflösenden Detektors beschleunigt. Zusätzlich wird ein homogenes Magnetfeld überlagert, das einen Einschluss der Elektronen bis zu einem maximalen Transversal-Impuls gewährleistet. Durch Messung der Flugzeiten und Auftrefforte auf dem Detektor können - unter Kenntnis d er elektrischen und magnetischen Feldstärken - die Startimpulse der Elektronen rekonstruiert werden. Auf diese Weise konnten Elektronen von 0 eV bis zu 50 eV mit einem Raumwinkel von nahezu 2p gleichzeitig abgebildet werden. Durch diesen sehr großen Aktzeptanzbereich, konnte eine wesentliche Erhöhung der Koinzidenzeffizienz der Anordnung gegenüber anderen Systemen erreicht werden (> 10 hoch 2 - 10 hoch 6 je nach Mess-System). Wesentlich hierfür ist des weiteren die Fähigkeit des Detektors mehrere Treffer mit verschwindender Totzeit zu verarbeiten. Mit dem beschriebenen System wurde die Zwei-Elektronen-Photoemission an Oberflächen untersucht. Die Experimente hierzu wurden im wesentlichen am Hamburger Synchrotron Strahlungslabor (HASYLAB) durchgeführt. Als Target wurde die (111)-Oberfläche eines einkristallines Kupfer-Targets verwendet. Mehrere Messreihen mit Photonenenergien im Bereich h? = 40 eV bis h? = 100 eV wurden aufgezeichnet. Durch die vollständige Vermessung des gesamten Impulsraumes der beiden Elektronen, stellt dies die erste kinematisch vollständige Untersuchung (bis auf die Spin-Freiheitsgrade) der Zwei-Elektronen-Photoemission an Oberflächen dar. Im Anschluss an vorangegangene Experimente [HER98], konnte auch hier in den Zwei-Elektronen-Energieverteilungen (innerhalb der experimentellen Auflösung) als Maximal-Energie des Paares der Wert E1 + E2 = h? - 2W0 festgestellt werden, der auf eine Selbst-Faltung der Bänder für die Zwei-Elektronen-Photoemission hindeutet. Die Form der Spektren wird wesentlich durch das Transmissionsverhalten der Elektronen beim Durchgang durch die Oberfläche bestimmt. Die auftretende energieabhängige Brechung der Trajektorie führt dabei zu einer starken Unterdrückung niederenergetischer Elektronen. In der Betrachtung der Kinematik der Emission konnten deutliche Analogien des Effektes zum analogen Prozess der Doppel-Photoionisation an freien Atomen bzw. Molekülen gefunden werden. Die Bewegung des Schwerpunktsimpulses des Paares ist daher durch die Richtung des Polarisationsvektor des Lichtes bestimmt. Im Gegensatz zur Emission am freien System, tritt hier allerdings - je nach Orientierung des Polarisationsvektors - ein Symmetriebruch auf, da Elektronen entweder auf die Oberfläche zu oder von ihr weg emittiert werden. Ein Bruchteil der in den Festkörper emittierten Intensität kann schließlich wieder am Gitter reflektiert werden und die Oberflächenbarriere noch überwinden. Die Energie- und Winkelverteilungen der Elektronen zeigen, dass, je nach Energieaufteilung des Paares, zwischen den Beiträgen durch einen "shake-off"-Mechanismus und einem "knock-out"-Mechanismus unterschieden werden kann. Auch hierin zeigt sich eine Ähnlichkeit des Zwei-Elektronen-Photoemissionsprozesses an Oberflächen mit der Doppel-Ionisation von Helium-Atomen. Während bei der Doppel-Ionisation von Helium diese Unterscheidung allerdings erst bei höheren Photonenenergien (> 100 eV) möglich ist, kann hier schon bei ca. 60 eV zwischen beiden Prozessen getrennt werden. Der Grund hierfür liegt sehr wahrscheinlich in der Abschirmung der Elektronen im Festkörper begründet, die die direkte Coulomb-Wechselwirkung der Elektronen im Endzustand reduziert. Insbesondere der starke Beitrag des "shake-off"-artigen Prozesses ist ein deutlicher Hinweis darauf, dass die gegenwärtigen theoretischen Modelle zur Beschreibung der Zwei-Elektronen-Photoemission nicht ausreichend sein können, da nur die Wechselwirkung im End-Zustand berücksichtigt wird. Vielmehr ist die Einbeziehung von Grundzustandswellenfunktionen jenseits des Bildes unabhängiger Teilchen nötig.