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Bei dieser Studie wurde die antivirale Effektivität, sowie die Verträglichkeit von einem selektiven NS3/4A Protease-Inhibitor als Monotherapie und in Kombination mit Peginterferon alfa-2a über einen Behandlungszeitraum von 14 Tagen evaluiert. Bezüglich der Hepatitis unvorbehandelte Patienten mit einer Genotyp 1 Infektion wurden in unterschiedliche Therapiearme randomisiert: (i) Placebo und Peginterferon alfa-2a (n=4), (ii) Telaprevir Monotherapie (n=8) oder (iii) Telaprevir in Kombination mit Peginterferon alfa-2a (n=8). Telaprevir wurde in oraler Tablettenform mit jeweils 750 mg alle 8 Stunden verabreicht und Peginterferon alfa-2a wurde einmal wöchentlich 180 μg subkutan injiziert. Bei der Studie zeigte sich ein medianer Abfall der HCV RNA von Beginn der Therapie bis zu letztem Behandlungstag 15 von -1.09 log10 (Bereich: -2.08 log10 und -0.46 log10) in der Placebo und Peginterferon alfa-2a-Gruppe; -3.99-log10 (Bereich: -5.28 und -1.26) in der Telaprevir-Gruppe, und -5.49-log10 (Bereich: -6.54 und -4.30) in der Kombinations- Gruppe mit Telaprevir plus Peginterferon alfa-2a. Bei 4 Patienten, die mit Telaprevir und Peginterferon alfa-2a behandelt wurden, war die HCV RNA an Tag 15 nicht mehr nachweisbar und bei einem Patienten, der initial mit Telaprevir behandelt wurde. Insgesamt kam es unter der Therapie zu keinem viralen Durchbruch unter der Kombination mit Telaprevir und Peginterferon alfa-2a während der 14-tägigen Behandlung innerhalb der Studie. Die meisten Nebenwirkungen waren von milder Intensität und es kam zu keinen schwerwiegenden Nebenwirkungen oder vorzeitigen Therapieabbrüchen. Die Studie zeigte eine potente antivirale Wirksamkeit von Telaprevir als Monotherapie und bei der Kombination mit Peginterferon alfa-2a kam es zu einer gesteigerten antiviralen Aktivität. Bereits aufgrund dieser Ergebnisse initiierte, größere Studien werden nun evaluieren, ob Telaprevir in Kombination mit Peginterferon alfa und Ribavirin die dauerhaften antiviralen Ansprechraten verbessern kann.
Kollagen des marinen Schwammes Chondrosia reniformis Nardo: Optimierte großtechnische Herstellung, Analytik und neue pharmazeutisch-technologische Anwendungsmöglichkeiten Großtechnische Isolierung und Untersuchung von Chondrosia-Kollagen Schwämme spielen eine wichtige Rolle im Ökosystem des Meeres und ihr Vorkommen ist begrenzt. Zur schonenden und nachhaltigen Nutzung als Rohstoffquelle müssen im Hinblick auf eine industrielle Nutzung alternative Wege zur Gewinnung von marinem Schwammkollagen entwickelt werden. Ein Beispiel hierfür sind die sogenannten „Marikulturen“ direkt im Meer, aus denen die im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Schwämme stammten. Im Gegensatz zu den früher eingesetzten Methoden zur Isolierung des Chondrosia-Kollagens, die Laborcharakter trugen, konnte in der vorliegenden Dissertationsarbeit ein stark vereinfachtes, für die großtechnische Produktion geeignetes Verfahren mit einer hohen Ausbeute (ca. 35%) beschrieben werden. Das Schwammausgangsmaterial wurde über ca. 4 Tage mit Hilfe von Natriumsulfit reduktiv behandelt und die Kollagenfasern (nach einem Filtrationsschritt) in saurem Medium gewonnen. Atomkraftmikroskopische Aufnahmen des isolierten Materials zeigten die kollagentypische Fibrillenquerstreifung, die Unlöslichkeit der Faserbündel in saurem Milieu sowie deren Abbau in die einzelnen Fibrillen in neutraler Pufferlösung. Die von tierischen Kollagenen abgeleitete Bestimmung des Proteingehaltes ergab einen im Vergleich zum kalkulierten Kollagenanteil höheren Gesamtproteingehalt. Dies ist ein Hinweis auf mögliche nichtkollagene Proteinanteile, die an Kollagen assoziiert vorliegen können. Untersuchungen zur Aminosäurenzusammensetzung des isolierten Materials ergaben im Vergleich zu den von Swatschek et al. (2002a) publizierten Ergebnissen einen deutlich höheren Glycin- und einen mehr als doppelt so hohen Hydroxyprolingehalt. Dies kann dahingehend gedeutet werden, dass die neue Isolierungsmethode die bekannten Verunreinigungen des Kollagens mit Glykoproteinen reduziert und zu einem deutlich reineren Kollagenmaterial führt. Mit Hilfe einer neu entwickelten Methode konnten erstmalig Partikel aus Chondrosia-Kollagen hergestellt werden, deren Größe im Nanometerbereich lag. Hierbei handelte es sich um eine kontrollierte alkalische Hydrolyse des isolierten, gefriergetrockneten Kollagens in 1,5 M NaOH. Es konnte eine Partikelausbeute in Höhe von ca. 10% erzielt werden. Atomkraftmikroskopische Aufnahmen zeigten gleichförmige, sphärische Partikel. Die Partikelgrößenuntersuchungen mittels Photonenkorrelationsspektroskopie (nach Resuspension der gefriergetrockneten Schwammkollagennanopartikel (SKNP)) ergaben eine Größe von 168 ± 9,1 nm. Somit sind diese Partikel im Gegensatz zu den bisher aus Chondrosia-Kollagen gewonnenen Mikropartikeln auch für intravenöse Anwendungen geeignet und haben eine größere Trägerkapazität. Die hergestellten Nanopartikel wurden adsorptiv mit dem Wirkstoff 17?-Estradiol-Hemihydrat beladen. In Abhängigkeit von der eingesetzten Stoffkonzentration (1,25 bis 5,0 mg/ml) konnten Beladungsraten von bis zu 13,1% erzielt werden. Die Stabilitätsprüfung von wässrigen Partikelsuspensionen ergab nach 180 Tagen Einlagerung eine auf 7 bis 8% reduzierte Beladungsrate. Nach Inkorporation der beladenen Partikel in eine Hydrogelgrundlage wurde die transdermale Bioverfügbarkeit des Arzneistoffs im Rahmen der Hormonersatztherapie bei postmenopausalen Frauen untersucht. SKNP-Gele mit einer Estradiolkonzentration in Höhe von 0,06% wurden mit gleichkonzentrierten partikelfreien Gelen verglichen. In den Speichelproben der Patientinnen konnten nach täglicher einmaliger Applikation des Nanopartikelgels nach 28 Tagen signifikant höhere Estradiolkonzentrationen gemessen werden. Die ermittelten Flächen unter den Konzentrations-Zeit-Kurven (AUC) über 24 h nach der einmaligen topischen Applikation von 0,75 mg Estradiol waren um das 2,3 bis 3,4-fache höher als die entsprechenden AUC-Werte des Vergleichsgels. 24 h nach Auftragen des Gels lagen die Estradiolspiegel des Vergleichsgels in etwa wieder auf Höhe der Basalwerte, wohingegen die Estradiolwerte nach Applikation des SKNP-Gels zum gleichen Messzeitpunkt mindestens doppelt so hoch waren. Somit konnten bei Anwendung der SKNP-Zubereitung eine deutlich erhöhte transdermale Estradiolabsorption und eine verlängerte Arzneistoffwirkung beobachtet werden. Das nanopartikuläre Trägersystem aus Chondrosia-Kollagen stellt damit eine vielversprechende Möglichkeit zur Erhöhung der transdermalen Bioverfügbarkeit von lipophilen, schlecht resorbierbaren Wirkstoffen dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Formulierung für einen magensaftresistenten Überzug mit Chondrosia-Kollagen als Filmbildner entwickelt. Die Sprühsuspension bestand aus 15% gefriergetrocknetem Kollagen, dem Weichmacher Triethylcitrat (1,5%), dem Trennmittel Talkum (7,5%) und Wasser. Der Coating-Prozess wurde in einem Dragierkessel mit Placebotabletten durchgeführt. In regelmäßigen Abständen wurden Tabletten-Stichproben entnommen, um die erforderliche Kollagenschichtdicke für eine Magensaftresistenz zu bestimmen. Tabletten mit einer Kollagenauftragsmenge von 12,9 mg/cm2 entsprachen der Prüfung auf Magensaftresistenz gemäß Europäischem Arzneibuch. Die Widerstandsdauer in 0,1 M Salzsäure betrug mehr als 2 h und der Zerfall in Phosphatpufferlösung pH 6,8 höchstens 10 min. Rasterelektronenmikrosko-pische Aufnahmen bei unterschiedlichen Vergrößerungen zeigten eine gleichmäßige und glatte beschichtete Oberfläche. Das Auftragsverfahren im Dragierkessel erwies sich als reproduzierbar. Die mechanischen Eigenschaften der überzogenen Tabletten waren zufriedenstellend und die Magensaftresistenz wurde durch eine 6-monatige Lagerung nicht beeinträchtigt. Als Naturprodukt eignet sich Schwammkollagen als Überzugsmaterial für Nichtarzneimittel. Der schnelle Zerfall des Kollagenüberzugs in neutraler Pufferlösung stellt einen Vorteil gegenüber den häufig verwendeten Schellacküberzügen dar, die sich im Darmtrakt zu langsam auflösen und daher nicht selten mit synthetischen Polymeren kombiniert werden.
Das photoneuroendokrine System der Vertebraten steuert die rhythmische Melatoninsynthese. Melatonin ist ein wichtiges Signal für circadiane und saisonale Rhythmen und für die Synchronisation der Föten mit dem mütterlichen Organismus. Bei Säugetieren besteht das photoneuroendokrine System aus den folgenden Komponenten: der Retina für die circadiane Lichtperzeption, dem endogenen Rhythmusgenerator im Nucleus suprachiasmaticus (SCN) und dem Pinealorgan als neuroendokrinem Effektor. Dieses System vermittelt, durch die nächtliche Abgabe des Hormons Melatonin vom Pinealorgan, Änderungen in den Belichtungsverhältnissen der Umgebung an den Körper. Bei der Synthese von Melatonin im Pinealorgan ist die Arylalkylamin Nacetyltransferase (AANAT) das geschwindigkeitsbestimmende Enzym. Die nächtlich erhöhte Expression von Aanat in Pinealozyten wird vor allem durch die Freisetzung des Neurotransmitter NA aus sympathischen Nervenendigungen angetrieben. NA bindet an adrenerge Rezeptoren in der Pinealozytenmembran und aktiviert den cAMP-Signaltransduktionsweg, der zur CRE-vermittelten gesteigerten Aanat Expression führt. In der Promoterregion von Aanat ist auch ein E-box Promoterelement vorhanden, das durch Uhrenproteine angesteuert werden kann. Bislang jedoch war die Rolle des molekularen Uhrwerkes für die Expression von Aanat noch unklar. Um zu untersuchen, wie sich eine Schwächung des negativen Regulatorkomplexes auf die Expression von Aanat im Pinealorgan und in anderen Geweben auswirkt, wurden Mäuse mit gezielter Deletion des Per1 Gen (Per1 KO) untersucht. Die Expression von Aanat im Pinealorgan von Per1 KO Mäusen, die in der Standardphotoperiode gehalten wurden, zeigte einen circadianen Rhythmus mit ähnlicher Dynamik, aber erhöhter Amplitude im Vergleich zum WT. AANAT Enzymaktivität und Melatoninkonzentration folgen dem gleichen Profil. Eine Verkürzung der Photoperiode hat bei Per1 KO Mäusen starke Auswirkungen auf dieendogene Periodenlänge der Aanat Expression, die sich gegenüber dem WT drastisch verlängert. Bei einer Verlängerung der Photoperiode kommt es zu einer Verzögerung im Rhythmus der Aanat Expression von ca. 8 h gegenüber dem WT. Dies zeigt, dass das molekulare Uhrwerk je nach Photoperiode Amplitude, Periodenlänge und Phasenlage modulieren kann. Um zu untersuchen, ob es sich dabei um Pinealorgan-intrinsische Effekte handelt, wurden in vitro Experimente durchgeführt. Im WT-Pinealorgan gibt es zum Zeitpunkt CT18 ein Sensitivitätsfenster für die NA-induzierte Aanat Expression. Überraschenderweise steigt die Aanat Expression im unstimulierten Per1 KO Pinealorgan in der Nacht signifikant gegenüber dem subjektiven Tag an. Eine weitere Induktion durch NA ist nicht möglich. Dies deutet darauf hin, dass ein abgeschwächter negativer Regulator Komplex (NRC), welcher über das E-box Element wirkt, dieselben Auswirkungen in der Per1 KO Maus hat, wie eine NA-Stimulation im WT. Im WT wird der inhibitorische Effekt des NRC offenbar durch die NA-abhängige Aktivierung von CRE überwunden. Untersuchung zur ektopischen Expression von Aanat zeigten, dass dieses Gen in der Hypophyse einen cicadianen Rhythmus aufweist, der unabhängig von einem intakten molekularen Uhrwerk abläuft. Im Gegensatz dazu findet sich in der Milz von Per1 KO Mäusen eine verstärkte Aanat Expression am subjektiven Tag im Vergleich zum WT. Offenbar hat das molekulare Uhrwerk auch einen Einfluss auf die Gewebespezifität der Aanat Expression. Weiterhin wurde in dieser Arbeit die ontogenetische Entwicklung des molekularen Uhrwerkes im SCN von Melatoninrezeptor1 und 2 defizienten (MT1,2 -/-) Mäusen untersucht. Im Gegensatz zu Mäusen mit intakten Melatoninrezeptoren, zeigen diese Mäuse im Fötalstadium noch keinen Rhythmus in der Anzahl mPER1- und mPER2-Ir Zellen. In diesem Stadium sind die einzelnen SCN-Neurone noch kaum durch Synapsen miteinander gekoppelt. Dies deutet darauf hin, dass das mütterliche Melatonin die rhythmischen Uhrengenexpression in den einzelnen fötalen SCN-Zellen synchronisiert. Erst im juvenilen SCN ist ein Rhythmus der Uhrenproteine identisch mit dem adulten Tier. Zu diesem Stadium sind die intrasuprachiasmatischen Kontakte vermutlich schon soweit ausgebildet, dass kein rhythmisches Eingangssignal für die Synchronisation der SCN-Zellen notwendig ist.
Einleitung: Die der Entwicklung des Normaldruckhydrozephalus (NPH) zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen sind trotz intensiver Forschung weitgehend ungeklärt. Ein bildgebend prominenter Befund beim NPH ist die z.T. massive Erweiterung der inneren liquorführenden Räume (sog. Ventrikel). Diagnostisch hinweisend auf das Vorliegen eines NPHs ist neben einer charakteristischen, jedoch nicht pathognomonischen klinischen Befundkonstellation das rasche klinische Ansprechen auf einen lumbalen Liquorablassversuch, bei dem insbesondere eine Besserung der Gehfähigkeit verzeichnet werden kann. Die dieser raschen Besserung zugrunde liegenden physiologischen Mechanismen sind jedoch unbekannt, allgemein wird davon ausgegangen, dass durch eine Abnahme des Liquorvolumens eine Druckentlastung auf bedeutsame zerebrale, insbesondere periventrikuläre Strukturen erfolgt. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss des diagnostischen Liquorablassversuches auf Volumenänderungen der inneren liquorführenden Räume und Änderungen klinischer Parameter untersucht. Material + Methoden: Bei 15 NPH-Patienten wurden nach einem definierten Studienprotokoll standardisierte klinische Tests und magnetresonanztomografische Untersuchungen vor und nach einem Liquorablassversuch durchgeführt. Die klinische Testbatterie sollte insbesondere die Kardinalsymptome des NPH (kognitive Störungen, Gangstörungen, Harninkontinenz) erfassen. Computergestützt wurden die Volumina der Seitenventrikel vor und nach Liquorablassversuch bestimmt. Zur Validierung der volumetrischen Methode wurden zusätzlich 11 gesunde, ältere (> 50 Jahre) Probanden nach dem gleichen bildgebenden Protokoll magnetresonanztomografisch untersucht. Ergebnisse: Nach dem Liquorablassversuch konnte eine insgesamt geringe, aber signifikante Abnahme der Volumina der Seitenventrikel nachgewiesen werden. Diese beträgt höchstens wenige Prozent des initialen Ventrikelvolumens bei NPH-Patienten und damit weniger als 10% des abgelassenen Volumens. Klinisch konnte eine gewisse Besserung kognitiver Funktionen und eine Verbesserung der z.T. ausgeprägten Gangstörungen festgestellt werden. Ein Zusammenhang zwischen den volumetrischen Veränderungen der Seitenventrikel und den klinischen Tests konnte nicht gefunden werden. Schlussfolgerung: Durch den Liquorablassversuch kommt es zu einer geringen Volumenreduktion der inneren liquorführenden Räume, allerdings ergibt sich kein Zusammenhang zu klinischen Parametern. Insofern kann die gängige Hypothese, dass die nach Liquorablassversuch zu verzeichnende klinische Besserung auf einer Volumenreduktion der inneren liquorführenden Räume beruht, nicht bestätigt werden. Im Rahmen der Arbeit werden alternative Erklärungsmodelle erläutert und kritisch hinterfragt.
Dank neuer Diagnoseverfahren zeigt die Inzidenz der Krebserkrankungen einen zunehmenden Verlauf. Durch verbesserte Methoden in der chirurgischen und medikamentösen Therapie wird aus einer ehemals tödlichen, häufig eine chronische Krankheit. Immer mehr Patienten leben jahrelang mit ihrer Erkrankung. Die Erhaltung der Lebensqualität bei diesem steigenden Patientenkollektiv rückt immer mehr in den Fokus der Wissenschaft. Ziele der Forschung auf diesem Gebiet bestehen darin, die Nebenwirkungen der Therapiemaßnahmen zu minimieren oder sie durch zusätzliche Therapieoptionen zu mildern. Sport bzw. Bewegung ist dabei eine der möglichen unterstützenden Maßnahmen sowohl noch während der Therapie als auch in der Zeit danach. Obwohl noch bis in die 90er-Jahre die Meinung verbreitet war, dass körperliche Aktivität das Tumorwachstum fördern und die Effekte der Chemotherapie negativ beeinflussen könnte, werden heute in immer mehr Studien die positiven Auswirkungen eines moderaten Ausdauertrainings auf körperliche und psychische Parameter bei Krebskranken nachgewiesen. Das Verlieren der körperlichen Integrität, die funktionellen Einschränkungen und Nebenwirkungen der Therapie lassen die Psyche des Patienten nicht unberührt – psychopathologische Komorbiditäten können die Folge sein. Folglich nimmt die Lebensqualität aufgrund der physischen und psychischen Einschränkungen ab. Die vorliegenden Studie untersucht, ob und inwieweit sich durch Sport bzw. Bewegung ein positiver Einfluss auf die Verbesserung der psychischen Belastung und der Lebensqualität bei Krebspatienten erzielen lässt. Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurde eine heterogene Stichprobe, bestehend aus 70 Patienten, davon 38 (54,3%) Frauen, herangezogen. Die Patienten hatten verschiedene Krebsarten, befanden sich in unterschiedlichen Stadien und erhielten entweder eine kurative oder eine palliative Therapie. Nach einer sportmedizinischen Untersuchung der körperlichen Leistungsfähigkeit wurde den Patienten eine individualisierte Sportempfehlung und -anleitung für ein moderates selbstständiges Ausdauertraining ausgesprochen. Zuvor wurde ein Interview durchgeführt und die Patienten wurden gebeten, psychometrische Fragebögen zu bearbeiten. Vier bis sechs Wochen nach dem Beginn der Sportintervention wurde erneut die körperliche Leistung im sportmedizinischen Institut untersucht, ein zweites Interview durchgeführt und psychometrische Fragebögen vom Patienten bearbeitet. Die Interviews wurden durchgeführt, um in einer weiteren Studie ausgewertet zu werden. Mit den Fragebögen SCL-K-9, POMS und EORTC QLQ-C30 wurden die psychische Belastung, die emotionale Befindlichkeit und die Lebensqualität vor und vier bis sechs Wochen nach dem Sportprogramm erfasst. Dabei stellte sich eine signifikante Reduktion des mittels SCL-K-9 erfassten psychischen Befindens und eine Verbesserung der Skala Müdigkeit des POMS heraus. Die mittels EORTC QLQ-C30 erfasste Lebensqualität ergab eine signifikante Verbesserung der Skalen Globaler Gesundheitsstatus/ Lebensqualität, Kognitive Funktion, Soziale Funktion, Fatigue und Schlaflosigkeit. Die Untersuchung oben genannter psychischer Parameter bei der Gruppe der Brustkrebspatientinnen, die die größte homogene Gruppe innerhalb der Krebsdiagnosen der Stichprobe darstellte, ergab eine signifikante Senkung der psychischen Belastung. Die Untersuchung der Effekte soziodemographischer und medizinischer Merkmale wie Geschlecht, Alter, Stadium und palliative vs. kurative Therapie auf signifikante Änderungen der psychischen Parameter durch Sport wiesen keine Signifikanz auf. Dies könnte sowohl an der zu kleinen Stichprobe als auch an der inhomogenen Verteilung der Patienten innerhalb der Merkmalsgruppen liegen, sodass unklar bleibt, ob diese Merkmale einen Prädiktor für die signifikanten Verbesserungen durch Sport darstellen und ob sie sich aufgrund der statistischen Gegebenheiten signifikant erfassen ließen. Dieser Aspekt sollte zukünftig genauer untersucht werden. Insgesamt hat die Sportintervention durchschnittlich bei keiner der untersuchten Skalen der psychischen Parameter zu einer Verschlechterung bei der Gesamtstichprobe der in diese Arbeit eingeschlossener Krebspatienten geführt. Vielmehr ist es entweder zu einer signifikanten Verbesserung gekommen oder, wenn auch nicht signifikant, doch mit eindeutigen Tendenzen in Richtung Besserung der Stimmung und der Lebensqualität durch Sport und das unabhängig von Art, Stadium oder Therapie der Krebserkrankung. Somit fügt sich diese Arbeit in die Reihe der Studien ein, die die positive Wirkung des Sports bei Krebskranken bestätigt. Sport bzw. Bewegung sollten zukünftig als unterstützende Maßnahme in der Therapie und Betreuung krebskranker Menschen eingesetzt werden, um sowohl körperliche als auch psychische Beschwerden und insbesondere die Fatigue zu lindern.
Das Ziel dieser Arbeit ist die Synthese von nicht-kovalenten supramolekularen Komplexen, um nachfolgend aus den Kristallstrukturen dieser Verbindungen bessere Einsichten über die H-Brückenwechselwirkungen zwischen den organischen Molekülen zu erlangen. Um an dieses Ziel zu kommen, wurde ein Konzept zur gezielten Synthese von supramolekularen Komplexen entwickelt. Die Steuerung des Co-Kristallisationsprozesses ist keine einfache Aufgabe, deshalb darf der Verlauf einer solchen Synthese von nicht-kovalenten Verbindungen nicht einfach dem Zufall überlassen werden. Der Start erfolgt mit einer gründlichen Auswahl der Verbindungen durch Intuition mit Hilfsmitteln (Chemikalienkataloge und chemische Datenbanken). In einem Selektionsabschnitt werden chemische Datenbanken, analytische Methoden und rechnergestützte Programme zu Hilfe genommen. Aussichtsreiche Kandidaten werden mit dem Programm SUPRA getestet; so zeigt sich, ob das gewünschte H-Brückenmuster prinzipiell realisierbar ist. Auch die verschiedenen Vorproben zum Test auf H-Brücken gebundene Komplexe (siehe Kapitel 8 und 9) liefern wertvolle Informationen. Mit den so ausgewählten Kandidaten wurden schließlich Kristallisationsversuche angesetzt. Falls möglich können Strukturvorhersagen der jeweiligen Komplexe mit Hilfe von Strukturvorhersageprogrammen getroffen werden (siehe Kapitel 7). Die erhaltenen Co-Kristalle werden anschließend am Einkristalldiffraktometer gemessen und darauf folgend die Kristallstrukturen gelöst. Um die Reaktionsbedingungen zur Bildung von bestimmten supramolekularen Komplexen kontrollieren zu können, wurden die Gitterenergie des Komplexes berechnet und die Schmelzpunkte bestimmt. Mit Kenntnis der Gitterenergie des Komplexes, der Edukte bzw. der Pseudokomplexe kann die Reaktionsbedingung so eingestellt werden, dass nur eine bestimmte Verbindung bei einer vorgegebenen Reaktionsbedingung auskristallisiert. Der Einfluss bzw. die Auswahl von Lösungsmitteln darf bei Co-Kristallisationsprozessen nicht vernachlässigt werden. Der erste Abschnitt dieser Arbeit befasst sich mit der Synthese von supramolekularen Komplexen aus Komponenten, die ausschließlich zwei Protonen-Akzeptoren bzw. zwei Protonen-Donoren (AA-DD-Muster) beinhalten. Die fehlgeschlagenen Experimenten passen zur Trefferquote dieser Verbindungsklasse in der CSD. Der Grund für diesen Misserfolg ist grundsätzlich auf die geometrische Anordnung der freien Elektronenpaare der Akzeptoren zurückzuführen. Sind Sauerstoffatome an solchen H-Brückenmustern als H-Akzeptoren beteiligt, ist es oft nicht möglich, eine lineare Anordnung der H-Donorengruppe mit diesen Sauerstoffatomen als Akzeptoren zu bewerkstelligen. Nach erfolglosen Bemühungen wandten wir uns Verbindungen zu, die mindestens drei Akzeptoren bzw. Donoren im jeweiligen Molekül aufweisen. Für dieses Experiment wurden zunächst starre, kleine organische Moleküle ausgesucht. Das AAA-DDD-Muster konnte im gesamten Verlauf dieser Arbeit nicht hergestellt werden. Es ist nicht leicht, eine Verbindung zu synthetisieren, bei der alle H-Akzeptorgruppen auf einer Seite benachbart angeordnet sind. Eine Literaturaussage, dass Verbindungen mit dem AAA-DDD-Muster die stabilsten aller dreifach gebildeten Wasserstoffbrückenbindungen sind, konnte daher nicht experimentell verifiziert werden. Unsere Gruppe hat daraufhin versucht, die bekannten H-Brückenmuster aus den Watson-Crick-Basenpaarungen (AAD-DDA) sowie das ADA-DAD-Muster nachzuahmen. Nur mit dem Muster ADA-DAD konnten Erfolge erzielt werden. Die entsprechenden Komplexe konnten nicht nur erfolgreich synthetisiert, sondern auch durch die Einführung sterisch anspruchsvoller Substituenten die Bildung von unerwünschten Wasserstoffbrückenmustern gezielt verhindert werden. Nachdem die Synthese von zahlreichen Komplexen gelang, sind wir zu pharmazeutischen Wirkstoffen übergegangen. Mit diesem Schritt soll eine Brücke zur Pharmazie geschlagen werden. Vier pharmazeutische Wirkstoffe mit definiertem Wasserstoffbrückenmuster wurden ausgesucht und anschließend mit den passenden Gegenstücken zur Kristallisation angesetzt. Nur für Trimethoprim konnten Co-Kristalle erhalten werden. Mit diesem Wirkstoff konnte anschließend gezeigt werden, wie sich Moleküle in bestimmten chemischen Umgebungen im Festkörper anpassen und ihre geometrische Anordnung ändern, um die bestmöglichen Wechselwirkungen zu erreichen. Sämtliche Kristallstrukturen von Trimethoprim, die in der CSD in neutraler Form aufzufinden sind, demonstrieren, wie flexibel diese Verbindung in Abhängigkeit von der Umgebung ihre Konformation ändert. In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, wie Kristallisationsbedingungen verändert werden sollten, um den gewünschten Komplex herstellen zu können. Die Schmelzpunktbestimmung sowie die Kombination mit der Gitterenergie dienten dazu, für die gegebenen Verbindungen die passenden Bedingungen für den Kristallisationsprozess zu ermitteln. Die Schmelztemperaturen von drei in der Struktur ähnlichen Komplexen liegen jeweils zwischen den Schmelztemperaturen ihrer Ausgangsverbindungen, was zu der Annahme verleitet, dass bei höheren Temperaturen die Verbindungen mit höheren Schmelztemperaturen und somit stabileren Kristallgittern bevorzugt gebildet werden. Wird die Temperatur gesenkt, so könnten alle Formen von Kristallen (die der Edukte, Pseudokomplexe und der supramolekularen Komplexe) in einer einzigen Probe anfallen. Um die Gültigkeit dieser Annahme zu überprüfen, bedarf es der Durchführung von Pulveraufnahmen der gesamten Proben. Diese konnten aufgrund der geringen Mengen an Kristallsubstanz nicht realisiert werden. In Zukunft wird das Augenmerk besonders auf die Erforschung von supramolekularen Komplexen mit anspruchsvolleren Freiheitsgraden gelegt. Diese Komplexe sollen mehrere Rotationsfreiheitsgrade besitzen bzw. aus mehr als vier H-Brücken komplementär zusammengesetzt sein. Darüber hinaus ist unsere Gruppe immer noch bemüht, Komplexe zu co-kristallisieren, die am Ende die Muster bzw. die Konstellationen aufweisen, die von vornherein konzeptionell ausgearbeitet wurden.
Die Detektion und die Charakterisierung von Leberläsionen gehört zu den wichtigsten Aufgaben der radiologischen Leberdiagnostik. Dafür stehen verschiedene bildgebende Verfahren wie Sonographie, Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) zur Verfügung. Aufgrund der technischen Verbesserungen und der Entwicklung von neuen Sequenzen zur Leberbildgebung in der MRT hat sich die Diagnostik von fokalen Leberläsionen entscheidend verbessert. Verbunden mit dem Einsatz von modernen MRT-Kontrastmitteln ist die MRT in den letzten Jahren zum Goldstandard für die bildgebende Diagnostik von Lebertumoren, vor allem in deren Differentialdiagnose, avanciert. Magnevist® (Gd-DPTA), wurde 1988 als erstes extrazelluläres MRT-Kontrastmittel auf dem Markt eingeführt, und ist seither verfügbar. Resovist® (SHU 555 A) ist ein leberspezifisches, superparamagnetisches Kontrastmittel bestehend aus Eisenoxid (SPIO)- Partikeln, das seit 2001 für die Magnetresonanztomographie der Leber zugelassen ist. Als ein extrazelluläres Kontrastmittel ist Gadovist® (Gadobutrol), das einzige 1.0 molare Kontrastmittel, seit dem Jahr 2000 von der deutschen Gesundheitsbehörde (BfArM) für die Magnetresonanztomographie des zentralen Nervensystems zugelassen. Das Sicherheitsprofil, Kontrastverhalten und die Wertigkeit von Gadovist® in der Diagnostik der Leber wurde unter Verwendung unterschiedlicher Sequenzprotokolle in Phase-III-Studien weiter untersucht. Als ein Teil einer klinisch offenen, randomisierten, doppelblinden, interindividuell kontrollierten Phase III-Studie wurden 60 Patienten mit dem hochgradigen Verdacht auf eine Leberläsion oder mit einer bekannten Leberläsion an unserem Institut in diese Studie eingeschlossen. Der Hälfte der Patienten wurde Gadobutrol (Gadovist®, Molarität 1,0 mol/l), der anderen Hälfte Gd-DTPA (Magnevist®, Molarität 0,5 mol/l) intravenös im Bolus für die MRTBildgebung der Leber appliziert. Hierbei wurden keine schwerwiegenden Nebenwirkungen registriert. Die Sicherheit und Verträglichkeit von Gadobutrol war mit der von herkömmlichen, Gadolinium-haltigen MRT-Kontrastmitteln vergleichbar. Routinemäßig wurden weitere Vergleichsuntersuchungen bei den Patienten aufgrund der vorliegenden Erkrankung durchgeführt. Als Goldstandard zur Erfassung der Leberläsionen wurden MRT-Untersuchungen mit Resovist® (50 Patienten), CT-Untersuchungen (10 Patienten), Sonographie, Biopsie, chirurgische Maßnahmen, Szintigraphie und Laboruntersuchungen eingesetzt. In der dynamischen und statischen Gd-verstärkten MRT wiesen die einzelnen Läsionen in Abhängigkeit vom Vaskularisationsgrad ein spezifisches Kontrastverhalten auf, was eine Unterscheidung in maligne und benigne zu einem hohen Grad ermöglichte. In der eisenverstärkten MRT zeigte sich die T2- gewichtete Sequenz als die geeignetste Methode zur Detektion und Differenzierung der Leberläsionen. Besonders bei den gutartigen Lebertumoren mit Kupffer’schen Sternzellen, wie FNH oder hoch differenzierten HCC’s, war ein signifikanter Signalintensitätsverlust zu evaluieren. Anders hingegen zeigten die undifferenzierten bis mäßig differenzierten HCC’s und maligne Lebermetastasen keinen wesentlichen Signalintensitätsabfall. In einem Vergleich mit dem Goldstandard wurden die Sensivität, die Spezifität und die Genauigkeit der nativen-MRT, Gd-MRT, SPIO-MRT/CT und SPIO-MRT ermittelt. Der Einsatz von MRT-Kontrastmitteln führte zur Erhöhung von Sensivität, Spezifität und Genauigkeit bei der Untersuchung der Leberläsionen im Vergleich zur MRT ohne Kontrastmittel. Die Sensivität von Gadolinium-MRT (94%) war vergleichbar mit der von SPIO-MRT/CT (96%) und SPIO-MRT (95%). Im indirekten Vergleich wurde für die Gadobutrol-MRT eine höhere Sensivität (100%) als für die Gd-DTPA-MRT (86%) dokumentiert. Die Spezifität war bei Gadolinium-MRT mit 88% schlechter als bei SPIO-MRT/CT (95%) und SPIO-MRT (95 %). In der indirekten Evaluierung zeigte sich für die Gadobutrol-MRT eine höhere Sensivität (100%) und Spezifität (91%) als für die Gd-DTPA-MRT (Sensivität 86%, Spezifität 84%). Die diagnostische Genauigkeit der Gd-DTPA-verstärkten MRT war mit 85% schlechter als die der Gadobutrol-verstärkten MRT (96%). Jedoch war zwischen der Genauigkeit von Gadobutrol-MRT (96%), SPIO-MRT/CT (96%) und SPIO-MRT (95%) kein statistisch signifikanter Unterschied feststellbar. Insgesamt zeigte sich für die Gadobutrol-verstärkte MRT im Vergleich zur Gd-DTPAverstärkten MRT eine verbesserte Sensivität, Spezifität und diagnostische Genauigkeit. Aufgrund des interindividuellen Ansatzes der Studie konnte kein direkter Vergleich der Wertigkeit zwischen den beiden extrazelluären Kontrastmitteln dargestellt werden. Die Ergebnisse dieser Studie weisen Gadovist® als ein ausgezeichnetes extrazelluläres Kontrastmittel mit gutem Sicherheitsprofil, hoher Detektionsrate, ausgezeichneter Charakterisierung von Lebertumoren und guter diagnostischer Genauigkeit aus.
Protein S-100B als Serummarker der zerebralen Schädigung bei pädiatrischen Schädel-Hirn-Verletzungen
(2009)
Protein S-100 ist ein Calcium-bindendes Protein, das die Aktivität seiner Zielproteine moduliert. Der Aufgabenbereich umfasst die Regulation von Zellwachstum und Zellstrukturbildung. Entdeckt wurde es im Jahre 1965 von B.W. Moore, der es erstmals aus Rinderhirn isolierte. Seinen Namen erhielt es aufgrund seiner Löslichkeit in 100% gesättigtem Ammoniumsulfat bei neutralem ph-Wert. Protein S-100 besteht aus mehreren Untereinheiten, von denen S-100B nur im Hirngewebe vorkommt, hauptsächlich im Zytosol von Gliazellen. Bei astroglialer Zerstörung und konsekutiver Störung der Blut-Hirn-Schranke können erhöhte Konzentrationen von Protein S-100B im Serum gemessen werden. Durch seine spezifische Herkunft besitzt Protein S-100B einen potentiellen Wert als biochemischer Marker einer strukturellen Hirnschädigung. Ziel dieser Studie ist die Überprüfung des posttraumatischen Protein S-100B Serumspiegels bezüglich seiner Korrelation mit dem Schweregrad kindlicher Schädel-Hirn-Verletzungen und deren Prognose. In Form einer prospektiven Studie wurden insgesamt 45 Kinder (23 Jungen und 22 Mädchen) zwischen 4 Monaten und 17 Jahren (Mittelwert 7,64 Jahre) mit Hirnverletzungen unterschiedlicher Schweregrade untersucht, bei denen innerhalb der ersten 20 posttraumatischen Stunden mittels eines immunoluminometrischen Assays die Protein S-100B Serumkonzentration bestimmt wurde. Der Normalbereich für Protein S-100B liegt bei < 0,15 µg/l. Werte zwischen 0,15 und 0,5 µg/l gelten als leichtgradig erhöht, Werte über 0,5 µg/l als deutlich erhöht. Die S-100B-Werte wurden mit den klinischen Daten und dem posttraumatischen Outcome (Nachbeobachtungszeit mindestens 6 Monate) korreliert. Die statistischen Signifikanzberechnungen erfolgten mittels des Fisher-Exact-Tests.Die gemessenen S-100B Werte lagen zwischen 0,05 und 3,05 µg/l (Mittelwert 0,46 µg/l). Die mittlere Latenzzeit der posttraumatischen Protein S-100B Bestimmung betrug 5 Stunden. 38 % der Kinder zeigten leichtgradige Erhöhungen (>= 0,2-0,5 µg/l), 29 % deutliche Erhöhungen (> 0,5 µg/l). Niedrige Punktwerte in der initialen Glasgow-Coma-Scale (GCS) bedeuteten im Mittel höhere Werte für Protein S-100B. Ein initialer GCS-Wert von unter 8 ging in allen Fällen mit S-100B Werten über 0,5 µg/l einher (p=0,005). In Fällen ohne Verlust des Bewusstseins, bzw. maximal einer leichten Eintrübung des Bewusstseins (Lange-Cosack I-II) lagen die S-100B Werte im Mittel niedriger als bei Vorliegen eines Bewusstseinsverlustes (III-IV). Ein Bewusstseinsverlust ging immer mit einem S-100B Wert von mindestens 0,2 µg/l einher (p=0,04), meist lag der Wert über 0,5 µg/l (p=0,015). 25 Kinder erhielten eine Computer- und /oder Magnetresonanztomographie. Hier zeigten sich erhöhte S-100B Werte vor allem bei schweren Kontusionen und Subduralblutungen. Den höchsten Wert (3,05 µg/l) wies ein Kind mit ausgedehnten diffusen axonalen Verletzungen auf. Bei 38 der 45 Patienten konnte nach einer durchschnittlichen Nachbeobachtungszeit von 27,5 Monaten das neurologische Outcome (Glasgow Outcome Scale, GOS) erhoben werden. 8 Kinder (21 %) wiesen neurologische Residuen auf, vor allem Koordinationsstörungen und Verlangsamungen im Sinne eines Psychosyndroms, 1 Kind verstarb im Akutverlauf an einem malignen Hirnödem. Die Kinder mit posttraumatischen Residuen / Behinderungen wiesen im Mittel tendenziell höhere Werte für Protein S-100B auf. Die unterschiedlichen Beschwerdebilder und Residualzustände nach leichten und schweren Schädel-Hirn-Verletzungen lassen sich anhand der etablierten klinischen, neurophysiologischen und neuroradiologischen Prognosemarker bislang nur bedingt vorhersagen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen gute Korrelation des Serum S-100B Wertes mit der Schwere und Dauer der initialen Bewusstseinsstörung sowie dem Ausmaß der hirnparenchymatösen Läsionen. Die Aussagekraft bezüglich des posttraumatischen Outcomes ist aufgrund der Fallzahl und der zu einem großen Teil einbezogenen leichten Schädel-Hirn-Verletzungen begrenzt. Die Untersuchungsergebnisse unterstützen die bei Erwachsenen erhobenen Daten und zeigen, dass Protein S-100B auch im Kindesalter einen viel versprechenden Parameter zur Objektivierung einer akuten Hirnschädigung darstellt und bereits zu einem frühen posttraumatischen Zeitpunkt einen Beitrag zur Beurteilung des Schweregrades und der Prognose von Schädel-Hirn-Verletzungen leisten kann. Der posttraumatische Protein S-100B Serumwert bringt hier als biochemischer Marker eine zusätzliche Information und kann so bei der Einschätzung und Initiierung von diagnostischen, therapeutischen, rehabilitativen und Follow-up-Maßnahmen hilfreich sein.
In dieser Arbeit sollte die Bindung von Tetrahydromethanopterinderivaten an zwei Enzyme des methanogenen, CO2-reduzierenden Energiestoffwechselweges strukturell charakterisiert werden. In jenem Stoffwechselweg verläuft die schrittweise Reduktion von CO2 über die Bindung an den C1-Carrier Tetrahydromethanopterin (H4MPT), ein Tetrahydrofolat-Analogon, welches unter anderem in methanogenen Archaeen zu finden ist. Die thermophilen bzw. hyperthermophilen Ursprungsorganismen der untersuchten Enzyme, Methanothermobacter marburgensis, Methanocaldococcus jannaschii und Methanopyrus kandleri, sind aufgrund ihrer Anpassung an extreme Habitate durch spezielle genomische, strukturelle und enzymatische Eigenschaften von strukturbiologischem Interesse. Beim ersten in dieser Arbeit untersuchten Enzym handelte es sich um den aus acht Untereinheiten bestehenden membrangebundenen N5-Methyl-H4MPT:Coenzym M-Methyltransferasekomplex (MtrA-H). Dieser katalysiert in einem zweistufigen Mechanismus den Methyltransfer von H4MPT zum Co(I) der prosthetischen Gruppe 5’-Hydroxybenzimidazolylcobamid (Vitamin B12a), um die Methylgruppe dann auf Coenzym M zu übertragen. Gleichzeitig findet ein der Energiekonservierung dienender vektorieller Natriumtransport über die Membran statt. Für den Mtr-Komplex aus M. marburgensis (670 kDa) lag bereits ein Protokoll zur Reinigung unter anaeroben Bedingungen vor. Dieses wurde im Rahmen dieser Arbeit verbessert, für die Isolierung und Reinigung unter aeroben Bedingungen vereinfacht und für die Erfordernisse der zur Strukturbestimmung verwendeten elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung optimiert. Neben der Präparation des kompletten Komplexes MtrA-H wurde als Alternative die Präparation des Enzymkomplexes MtrA-G unter möglichst vollständiger Abtrennung der hydrophilsten Untereinheit MtrH gewählt. Mit der zu diesem Zweck entwickelten Methode konnte das Abdissoziieren von MtrH besser als im etablierten Protokoll kontrolliert und somit die Homogenität der Probe deutlich verbessert werden. Dies schafft zum einen die Vorraussetzungen für eine Kristallisation zur Röntgenstrukturanalyse, zum anderen war auch in bei der elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung erkennbar, dass mit dem Mtr-Komplex ohne MtrH bessere Ergebnisse zu erzielen sind. Parallel zu den Untersuchungen am Gesamtkomplex sollten die den Cobamid-Cofaktor bindende Untereinheit MtrA sowie die H4MPT-bindende Untereinheit MtrH in für die Kristallisation und röntgenkristallographische Untersuchung ausreichender Menge und Qualität gereinigt werden. Hierfür wurden MtrA und MtrH aus oben genannten Organismen für die heterologe Expression in E. coli kloniert, die Expressionsbedingungen optimiert und Reinigungsprotokolle etabliert. Anschließend wurden die Untereinheiten umfangreichen Kristallisationsversuchen unterzogen. Die Untereinheit MtrA aus M. jannaschii konnte ohne die C-terminale Transmembranhelix als lösliches Protein in E. coli produziert und als Holoprotein bis zur Homogenität gereinigt werden. Bei M. kandleri MtrA gelang die Herstellung von geringen Mengen teilweise löslichen StrepII-Fusionsproteins ohne C-terminale Transmembranhelix in E. coli. Eine Produktion der Untereinheit MtrH in E. coli als lösliches Protein war bei keiner der in dieser Arbeit getesteten Varianten möglich. Mit dem in Einschlusskörperchen exprimierten Protein aus M. marburgensis wurde eine Reinigung und Rückfaltung versucht. Auch eine Co-Expression der Untereinheiten MtrA und MtrH, durch welche eine bessere Faltung und Löslichkeit erreicht werden sollte, war nur in Einschlusskörperchen möglich. Das zweite in dieser Arbeit untersuchte Enzym, die F420 abhängige N5,N10 Methylen-H4MPT-Dehydrogenase (Mtd), katalysiert den reversiblen, stereospezifischen Hydrid-Transfer zwischen reduziertem F420 (F420H2) und Methenyl-H4MPT+, welches hierbei zu Methylen-H4MPT reduziert wird. Die Reaktion verläuft über einen ternären Komplex bestehend aus Protein, Substrat (Methylen-H4MPT) und Cosubstrat (F420), welcher strukturell charakterisiert werden sollte. Das gereinigte, rekombinante Enzym aus M. kandleri wurde mit verschiedenen H4MPT- und F420-Derivaten co-kristallisiert, die Struktur des ternären Komplexes röntgenkristallographisch bestimmt und die Bindung von H4MPT und F420 analysiert. Methenyl-H4MPT+ und F420H2 sind in der in dieser Arbeit gelösten Kristallstruktur in katalytisch aktiver Konformation gebunden, jedoch kann bei einer Auflösung von 1,8 Å nicht beurteilt werden, ob Methylen-H4MPT und F420 oder Methenyl-H4MPT+ und F420H2 vorlagen. Ein Vergleich mit der Struktur von M. kandleri-Mtd (KMtd) ohne Substrat und Cosubstrat ergab nur äußerst geringe Abweichungen in der Proteinkonformation, sodass sich KMtd überraschenderweise als Beispiel für ein Enzym mit ungewöhnlich starrer, vorgegebener Bindetasche erwies.
In dieser Arbeit wurden die physiologische Funktion innerhalb der Ribosomenbiogenese und die physikalischen Interaktionen des nukleolären, essentiellen Proteins Nep1p in der Hefe Saccharomyces cerevisiae untersucht. Durch Hefe-Zwei-Hybrid-Experimente und biochemische Analysen konnte eine Homodimerisierung des Proteins festgestellt sowie eine strukturabgeleitete Dimerisierungsmutante identifiziert werden. Ebenfalls aus der Struktur des Nep1p-Homologs aus Methanocaldococcus jannaschii konnte eine Nop14p-Bindungsregion auf der der Dimerkontaktfläche abgewandten Seite des Hefeproteins vorhergesagt und nach in vitro-Mutagenese bestätigt werden. Innerhalb des Nop14-Proteins wurden zwei Domänen charakterisiert, die im Zwei-Hybrid-System mit Nep1p interagieren. Aus Strukturdaten in Kombination mit Hefe-Drei-Hybrid-Experimenten konnte die RNA-Bindungsregion an der Dimerkontaktfläche des Nep1-Proteins lokalisiert werden. In Drei-Hybrid-Selektionen wurden RNA-Sequenzen mit hoher Affinität zu dem M. jannaschii Nep1p identifiziert, die auf eine Bindung des Proteins bei Helix 35 der 16S rRNA schließen lassen. Aufgrund der hohen Konservierung dieser rRNA-Region ist eine Bindung des Hefeproteins an die 18S rRNA-Schleife von Nukleotid 1189-1196 sehr wahrscheinlich. Da Nep1p eine große Ähnlichkeit zu Proteinen der SPOUTFamilie von Methyltransferasen aufweist, war von einer rRNA-Methylierung im Verlauf der Ribosomenbiogenese als katalytische Funktion des Proteins auszugehen. Aus verschiedenen Drei-Hybrid-Experimenten zur RNA-Bindungungsspezifität ergab sich als mögliche Reaktion die N1-Methylierung des Nukleotids 1-Methyl-3-(3-Amino-3-Carboxypropyl)-Pseudouridin (m1acp3Y) 1191 der 18S rRNA. Durch eine spezifische radioaktive Markierung der acp-Gruppe konnte gezeigt werden, dass Nep1p keinen Einfluss auf die spätere Aminocarboxypropylmodifizierung hat. Diese findet auch bei einer Deletion der snoRNA35 statt, also auch an einem Uridin, und ist unabhängig von dem cytoplasmatischen Protein Tma20p. In RP-HPLC-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass die 18S rRNA einer Dnep1Dnop6-Doppelmutante ein Aminocarboxypropyl-modifiziertes Nukleosid enthält, dass sich in seinem Retensionsverhalten von dem m1acp3Y eines Wildtyps unterscheidet. Bei dem in diesem Stamm detektierten acp-modifizierten Nukleosid handelt es sich vermutlich um ein nicht-methyliertes acpY, was eine Funktion von Nep1p als N1-Methyltransferase des Nukleotids Y1191 der 18S rRNA höchst wahrscheinlich macht. Diese katalytische Funktion konnte in Zusammenarbeit mit Prof. Wöhnert auch für das M. jannaschii Nep1p gezeigt werden. Dass sowohl eine snr35- Deletion als auch eine 18S rRNA-Mutation des Nukleotids 1191 nicht letal sind, machte deutlich, dass die N1-Methylierung nicht die essentielle Funktion von Nep1p darstellen kann. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass die Suppression der nep1-1ts-Mutante durch S-Adenosylmethionin nicht auf der Unterstützung der Methyltransferase-Aktivität des Proteins, sondern vermutlich eher auf einer generellen Stabilisierung des temperatursensitiven Proteins beruht. Sowohl im Hefe-Nep1p als auch im humanen Homolog wurden durch biochemische und genetische Experimente mehrere Phänotypen der Bowen-Conradi-Mutation (Aspartat 90 zu Glycin in ScNep1p) nachgewiesen. Diese lassen auf eine Aggregation des mutierten Proteins sowie eine dadurch bedingte Fehllokalisation innerhalb der Zelle schließen. Zusätzlich ist aber auch ein RNA-Bindungsdefekt durch den Aminosäureaustausch wahrscheinlich. Nichtsdestotrotz liegt offensichtlich ausreichend Nep1p-Protein vor, dass seine essentielle Funktion erfüllen kann, da die Mutation selbst zu keinem Wachstumsphänotyp führt. Erst bei einer partiellen Translationsrepression des mutierten Proteins unter Verwendung des artifiziellen Tetrazyklin-Aptamer-Systems ist ein verlangsamtes Wachstum von Hefezellen zu beobachten, was dieses System geeignet zur Analyse von möglichen Therapeutika macht.