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Seit Implementierung eines Qualitätsmanagement-Systems nach DIN EN ISO 9001 führt die Klinik für Anästhesiologie, Intensivmedizin und Schmerztherapie am Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität in Frankfurt am Main kontinuierlich Maßnahmen zur Qualitätsverbesserung durch. Hierzu zählen als klassisches Element des Qualitätsmanagements Befragungen sogenannter interessierter Parteien. Neben den Patienten stellen, vor allem auf einer Intensivstation, die Angehörigen der Patienten, häufig in Funktion eines gesetzlichen Betreuers, wichtige Partner in der Therapie dar. Bisher sind jedoch für diese Zielgruppe keine validen Befragungsinstrumente vorhanden. Nach Eröffnung der neuen Intensivstation C1 im Jahr 2008 soll eine standardisierte Befragung der Angehörigen intensivpflichtiger Patienten bezüglich deren Erwartungen an das Personal und den Aufenthalt des Patienten auf der Intensivstation durchgeführt werden. Ebenso soll die vom Personal antizipierte Erwartungshaltung der Angehörigen erfasst und im Sinne des GAP-Modells von Parasuraman et al. evaluiert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein geeignetes Befragungsinstrument (C1GAP) zu entwickeln und durch geeignete Pretests zu validieren. Nach Identifizierung übergeordneter Themenkomplexe für die Befragung wurde der erste Entwurf eines anonymen Fragebogens für Angehörige mit insgesamt 82 Items verteilt auf 8 Themenkomplexe erstellt. Hieraus wurden anschließend Fragebögen für die Personalgruppen des ärztlichen Dienstes, der Pflege und des Außendienstpersonals am Empfangsschalter erstellt. Zur Information der Teilnehmer über die Intention und den Ablauf der Befragung wurden ein Begleitschreiben des Institutsdirektors Prof. Dr. Dr. K. Zacharowski sowie ein Extrablatt mit Informationen zum Datenschutz beigefügt. Zur Validierung des Fragebogens wurden Pretests in Form von kognitiven Interviews durchgeführt. Aus den kognitiven Interviews ergaben sich neben einer überwiegenden Zustimmung zu Form und Inhalt der Befragung inhaltliche Verbesserungsvorschläge, die in der finalen Überarbeitung des Fragebogens umgesetzt werden konnten. Der validierte, endgültige Fragebogen für Angehörige enthält insgesamt 81 Items, welche auf die Themenkomplexe „Rahmenbedingungen“, „Kommunikation mit Ärzten“, „Kommunikation mit dem Pflegepersonal“, „Information über Behandlungsziele und -ablauf“, „Beteiligung bei Therapieentscheidungen“, „Beurteilung weiterer Betreuungsangebote“, „Verlegung und Entlassung“ sowie „Angaben zur Person“ verteilt sind. Die Fragebögen für die Personalgruppen der Ärzte, Pflegekräfte und des Servicepersonals enthalten zwischen 26 und 61 Fragen zu den genannten Themenkomplexen. Anders als durch reine Zufriedenheitsbefragungen können mit Hilfe des vorliegenden Fragebogens Daten über die Erwartungshaltung von Angehörigen intensivpflichtiger Patienten gewonnen werden und im Vergleich zur vom Personal der Intensivstation C1 antizipierten Erwartungshaltung der Angehörigen einer GAP-Analyse unterzogen werden. Diese Daten können im Rahmen der Qualitätssicherungsmaßnahmen an der Klinik für Anästhesiologie, Intensivmedizin und Schmerztherapie zur Optimierung der Arbeitsabläufe und Leistungsprozesse sowie zur Ressourcenallokation verwendet werden. So kann letztendlich die Versorgung unserer Patienten auf der Intensivstation C1 nachhaltig verbessert werden.
Die Entwicklung Philadelphia Chromosom-positiver (Ph+) chronischer myeloischer und
akuter lymphatischer Leukämie (CML und ALL) ist auf das Verschmelzen von ABL-und
BCR-Gensequenzen zurückzuführen. Die Bildung dieses BCR/ABL-Fusionsprotein führt
zu einer konstitutiv gesteigerten ABL-Tyrosinkinase-Aktivität mit der Folge einer
Deregulierung vielfältiger intrazellulärer Signalwege und der Induktion des
leukämischen Phänotyps.
Eine zielgerichtete Inhibierung von BCR/ABL mit Hilfe von ABL-Kinase-Inhibitoren
induziert Apoptose in BCR/ABL-transformierten Zellen und hat eine komplette
hämatopoetische Remission in Ph+ Leukämie-Patienten in der chronischen Phase zur
Folge. Eine große Zahl an Patienten mit fortgeschrittener Ph+ Leukämie erleidet
allerdings einen Rückfall und entwickelt Resistenzen gegen die molekularen
Therapeutika. Ein Hauptgrund für die Resistenzentwicklung sind Punktmutationen im
Bereich der ABL-Tyrosinkinase.
Die Punktmutation T315I ist als einzige Mutation gegen alle bisher entwickelten
Medikamente resistent. Sie ist auf eine Punktmutation von Threonin zu Isoleucin an
einer äußerst kritischen Stelle, der so genannten „Gatekeeper-Position“
zurückzuführen. Die T315I scheint nicht nur die Bindungsaffinität der Kinase-
Inhibitoren zu verhindern, sondern erzeugt zusätzliche Eigenschaften, die das
leukämogene Potential von BCR/ABL verstärken.
Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit war es daher, den Einfluss der T315I auf das
transformatorische Potential von BCR/ABL aufzuklären. Es konnte gezeigt werden, dass
die T315I sowohl bei p185BCR/ABL, als auch bei p210BCR/ABL zu einem gesteigerten und
Faktor-unabhängigen Wachstum führt. Zudem wurde im Rahmen einer Struktur-
Funktionsanalyse verdeutlicht, dass die T315I unabhängig von BCR-Sequenzen in der
Lage ist, Faktor-unabhängiges Zellwachstum in 32D- und Ba/F3-Zellen, aber nicht
klassisches Transformationspotential in Fibroblasten zu vermitteln.
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Ebenfalls war Gegenstand der experimentellen Arbeiten die Untersuchung, ob die
durch die T315I-vermittelte Resistenz gegenüber der Hemmung der Oligomerisierung
durch kompetitive Peptide von der Präsenz von BCR-Funktionsdomänen abhängt,
welche für die Aktivierung der Ras-Signalwege unerlässlich sind.
Es konnte nachgewiesen werden, dass die T315I-Punktmutation nur dann Resistenz
gegenüber der Hemmung der Oligomerisierung induziert, wenn BCR-Sequenzen als
Ausgangspunkt für den Ras-Signalweg (Tyr 177), in den verwendeten Konstrukten
vorhanden sind. Fehlen BCR-Sequenzen, so hemmen die kompetitiven Peptide auch
T315I-positive BCR/ABL-Deletionsmutanten.
Darüber hinaus wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht, neue Lösungsansätze in der
Grundlagenforschung aufzuzeigen, indem ein neuartiges Zellkultursystem mit drei BALL-
Patienten-abgeleiteten Langzeitkulturen (PDLTCs) angewendet wurde. Die CMPDLTC
trägt unmutiertes BCR/ABL, während die KÖ-PDLTC BCR/ABL-T315I positiv ist.
Als dritte PDLTC stand die CR als BCR/ABL-negative Zellkultur zur Verfügung.
Zum ersten Mal war es mit Hilfe dieses relevanten Zellmodells möglich, die
inhibitorische Wirkung des Helix-2-Peptids in primären ALL-PDLTCs zu überprüfen.
Es konnten die bisherigen Ergebnisse aus den murinen Zelllinien zur Wirkung der
Hemmung der Oligomerisierung bestätigt werden, da auch in diesem Modell die Zellen
mit T315I-BCR/ABL resistent gegenüber den kompetitiven Peptiden waren.
Zusammenfassend lassen die Daten dieser wissenschaftlichen Arbeit die
Schlussfolgerung zu, dass die Punktmutation T315I nicht zum Schwerpunkt in der
Erforschung weiterer molekularer Therapeutika erklärt werden sollte. Vielmehr scheint
es in naher Zukunft von äußerster Bedeutung zu sein, besonders die Kaskade der
aberranten Signaltransduktionswegen mit dem Ausgangspunkt in wesentlichen BCRFunktionsdomänen
zu inhibieren.
Außerdem stellen die primären Patienten-abgeleiteten Langzeitkulturen eine
Möglichkeit dar, die Wirkung neuer molekularer Therapeutika effektiv zu überprüfen
und die Pathogenese von Ph+ Leukämien noch besser zu verstehen.
In der vorliegenden Dissertation wird eine Zusammenfassung über den aktuellen Wissensstand zu Aufmerksamkeitsdefizit- /Hyperaktivitätsstörungen sowie bestehenden Therapieoptionen gegeben. Anschließend wird eine eigene Pilotstudie vorgestellt, in welcher zwei nicht-pharmakolgische Interventionen, Neurofeedback (NF, EEG-Biofeedback) und Marburger Konzentrationstraining (MKT), miteinander verglichen werden. In den letzten Jahren hat der Evidenzgrad des Neurofeedbacks kontinuierlich zugenommen. Neurofeedback ist ein verhaltenstherapeutisches Verfahren mit dem Ziel, abhängig vom angewandten Trainings-Protokoll eine entsprechende Veränderung des EEG-Frequenzspektrums oder der ereigniskorrelierten Potentiale bei Patienten zu bewirken. Mittels dieser Modifikationen soll eine Verbesserung der ADHS-Symptomatik bedingt werden. Das Marburger Konzentrationstraining stellt eine kognitiv-behaviorale Gruppentherapie dar, deren Durchführung an das Manual von Krowatschek und Mitarbeiter (2004a) angelehnt wurde. Aus dem natürlichen Patientenzulauf der kinder- und jugendpsychiatrischen Ambulanz der Johann Wolfgang Goethe-Universität wurden 47 Kinder im Alter von 6 bis 14 Jahren mit der Diagnose einer einfachen Aktivitäts- und Aufmerksamkeitsstörung (F90.0) zufällig auf die Interventionen verteilt. Unter gleichen Rahmenbedingungen erhielten 22 Probanden 10 Einzelsitzungen à 45 Minuten NF-Training mit einem Theta/Beta-Protokoll und 25 Probanden 6 Gruppensitzungen des Marburger Konzentrationstrainings à 60 Minuten. Parallel wurde ein Elterntraining mit insgesamt 5 Sitzungen angeboten. Zur Erfassung und Evaluation der ADHS-Kernsymptomatik sowie begleitender Psychopathologien wurden zu zwei Messzeitpunkten T1 (= direkt vor) und T2 (= direkt nach) dem Training sowohl neuropsychologische Testungen (objektive Ebene) durchgeführt als auch Fragebögen an Kinder, Eltern und Lehrer (subjektive Ebenen) verteilt. Die Analysen ergaben für beide Interventionen eine Reduktion der Kernsymptomatik. Wider Erwarten kam es in der NF-Gruppe lediglich zu einer tendenziellen Verminderung impulsiver und hyperaktiver Verhaltensweisen, während die MKT-Gruppe signifikante Ergebnisse für alle Verhaltensbereiche aufwies. Dementsprechend bestätigte eine Vergleichsevaluation, entgegen der ursprünglichen Annahmen eine Überlegenheit der MKT-Bedingung bezüglich der Kernsymptomatik. 125 von 189 Vergleichsanalysen zur Begleitproblematik erbrachten für beide Interventionen signifikante Verbesserungen im schulischen und sozialen Bereich sowie in Bezug auf begleitende Psychopathologien und die Gesamtproblematik. Hier wiederum erwies sich das Neurofeedback im familiären Bereich als überlegen. Auf der Suche nach Prädiktoren zeigten die Variablen „Alter“, „Erziehungsstil“ und „Teilnahme am Elterntraining“ bedeutsame Effekte. So scheinen ältere Kinder eher vom NF, die jüngeren Kinder hingegen vor allem vom MKT zu profitieren. Die Einbeziehung der Eltern ins Training scheint auf jeden Fall sinnvoll zu sein, wobei sich hier keine eindeutigen Rückschlüsse ziehen lassen. Des Weiteren ließ sich bei den Teilnehmern des Marburger Konzentrationstrainings ein prädiktiver Einfluss von Geschlecht und Intelligenzquotient erahnen. In der Zusammenschau konnte für beide Interventionen der Evidenzgrad als Therapie einer Aufmerksamkeitsdefizit- /Hyperaktivitätsstörung erhöht werden. Beide Behandlungen vermindern die Kernsymptomatik, wobei das Neurofeedback scheinbar speziell die Impulskontrolle erhöht während das Marburger Konzentrationstraining einen besonders großen Einfluss auf die Unaufmerksamkeit ausübt. Auch bezüglich der Begleitsymptomatik werden jeweils signifikante Effekte erzielt. Diesbezüglich zeigte sich hier das Neurofeedback im familiären Bereich überlegen. Zum Teil lassen sich die Veränderungen auf spezifische Trainingseffekte zurückführen. Es ergaben sich erstmalig Hinweise auf Prädiktoren. In jedem Fall ist weitere Forschungsarbeit mit größeren Stichproben, angemessenen Kontrollbedingungen und Veränderungsmaßen notwendig. So bleiben noch viele Fragen offen, wie beispielsweise die spezifischen Wirkungsweisen beider Interventionen, entsprechende Rahmenbedingungen, Prädiktoren und die Langfristigkeit der Behandlungsmethoden.
Hämorrhagischer Schock / Reperfusion (H/R) induziert eine inflammatorische Antwort, die zu hepatozellulären Schäden und einem Multiorganversagen führen kann. In vorhergehenden Studien wurde demonstriert, dass H/R die Phosphorylierung von mitogen aktivierten Stress Kinasen (MAPKs), spezifisch c-JUN und ERK, bewirkt; - eine Reaktion, die ebenfalls mit Leberschäden assoziiert ist. Kürzlich wurde ein spezifisches, zellgängiges, protease-resistentes Peptid, D-JNKI-1, entwickelt, welches die c-JUN N-terminale Kinase (JNK) inhibiert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es darzustellen, ob D-JNKI-1 durch eine spezifische Inhibierung der JNK den Leberschaden und das Inflammationsgeschehen nach H/R im Tiermodell verringern kann. Als methodischer Ansatz diente ein H/R-Modell an männlichen Sprague-Dawley Ratten. Nach Vorbehandlung mit D-JNKI-1 bzw. NaCl wurde ein hämorrhagischer Schock induziert und durch Reperfusion nach 1 h beendet. Nach 2 h wurden Gewebe- und Blutproben entnommen. Plasmawerte der Alaninaminotransferase, Kreatinkinase, Laktatdehydrogenase und des Interleukin-6 wurden untersucht, die Gewebeproben wurden histochemisch bzw. immunhistochemisch auf Organschäden (Nekrose und Apoptose) und Inflammationsgeschehen (Neutrophileninfiltration der Leber) untersucht, sowie die relative Proteinexpression der aktivierten Stresskinase JNK mittels spezifischer Detektion des phosphorylierten c-Jun im Western Blot quantifiziert. Diese Arbeit stellt die Rolle von D-JNKI-1 als Peptidinhibitor der JNK während H/R dar. H/R führt zu apoptotischen und nekrotischen Zelluntergängen, beides Vorgänge, welche zumindest zum Teil durch JNK gesteuert sind und mittels D-JNKI-1 reduziert werden können. Eine Hemmung der JNK vor einem hämorrhagischen Schock verringert zudem das Ausmaß der Schäden am Lebergewebe, die Produktion von freien Sauerstoffradikalen sowie die Aktivierung pro-inflammatorischer Signalkaskaden im Tiermodell. Diese Erkenntnisse könnten mit die Grundlage eines möglichen therapeutischen Ansatzes in der Verhinderung der Konsequenzen von H/R bilden.
Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einem potenten Werkzeug – auch in der Produktion von Membranproteinen – entwickelt. Da keine lebenden Zellen genutzt werden, kann der Prozess der präparativen Membranproteinproduktion vereinfacht und individuell optimiert werden. Im Gegensatz zu konventionellen zellbasierten Expressionssystemen gewährleistet die zellfreie Proteinsynthese die direkte Zugänglichkeit zum Reaktionsort und damit die Möglichkeit der unmittelbaren Kontrolle. Dies ermöglicht eine genaue Anpassung der Reaktionsbedingungen auf das Zielprotein. Die Verbesserung und Entwicklung neuer Modi der zellfreien Membranproteinsynthese war ein Teil der vorliegenden Arbeit. Setzt man dem Zellfrei-System von Außen keine hydrophobe Umgebung zu, so präzipitiert das neu-synthetisierte Membranprotein im Reaktionsmix (P-CF). Interessanter Weise unterscheiden sich diese Präzipitate von den aus der E.coli zellbasierten Proteinproduktion bekannten Einschlußkörperchen, da sie sich teilweise leicht in mildem Detergenz resolubilisieren lassen. Zudem konnte für verschiedene Transportproteine, die aus Präzpitat resolubilisiert und danach in Liposomen rekonstituiert wurden, spezifische Transportaktivität gezeigt werden (z.B. eukaryotische Ionentransporter, Multi-Drug Resistenzproteine von E.coli). Alternativ können die Membranproteine direkt, durch die Zugabe von Detergenzien in den Reaktionsmix, solubilisiert werden (D-CF). Um die einzelnen Expressionsmodi zu optimieren wurden 24 gebräuchliche Detergenzien auf ihre Eigenschaft hin gestestet, strukturell sehr unterschiedliche Membranproteine zu solubilisieren. Die Familie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether hat sich dabei als sehr geeignet erwiesen um das prokaryotische α-helikale Multi-Drug Resistenzprotein EmrE, den bakteriellen vornehmlich aus ß-sheets bestehenden Transporter Tsx und den eukaryotischen G-Protein gekoppelten Vasopressin Rezeptor V2R direkt im D-CF Modus zu solubilisieren. Zudem konnte eine Abhängigkeit der spezifischen Aktivität von Tsx vom verwendeten Expressionsmodus bzw. des verwendeten Detergenz mit Hilfe der Black Lipid Membrane´ Methode gezeigt werden. Die Expression eines repäsentativen Teils von 134 Zielproteinen des inneren Membranproteoms von E.coli wurde in drei verschiedenen Zellfrei-Expressionsmodi getestet. Ein an jedes Zielprotein des Membranroteoms C-terminal fusioniertes GFP diente der Konzentrationsbestimmung im D-CF Expressionsmodus. Die Faltung von GFP ist in Anwesenheit von Detergenz signifikant reduziert. Zunächst wurden alle Zielproteine in einem batch´ System im D-CF Modus im Mikrotiterplatten Maßstab mit Hilfe eines Roboters hergestellt. Die Etablierung einer robotergestützten Plattform, welche das Pipettieren, Inkubieren und Detektieren kombiniert, diente als Grundlage für den Herstellungsprozess des Membranroteoms von E.coli in einem Medium-Durchsatz Verfahren in batch´ Konfiguration. In dieser ersten Stufe des Screens im D-CF Modus konnten 84 Zielproteine (63%) aufgrund der detektierten GFP-Fluoreszens in Mengen von 1 bis 60μg pro mL Reaktion als erfolgreich produziert identifiziert werden. Zudem wurde das Membranproteom in dem effektiveren continous exchange (CE) Verfahren im P-CF, wie auch im D-CF Modus wiederholt exprimiert. Im Vergleich zur batch´ Konfiguration konnten im CE D-CF Modus deutlich mehr Zielproteine (75%) als positiv identifiziert werden. 16 Zielproteine wurden dabei bereits in Expressionsmengen von mehr als 100μg solubilisierte Membranproteinfusion pro mL Reaktionsmix gewonnen. 99 Zielproteine (74%) konnten als positiv identifiziert werden, nachdem die unlösliche Fraktion der CE P-CF Reaktion elektrophoretisch getrennt und angefärbt wurde. Für 66 Kandidaten (49%) stellt das produzierte Protein nach Coomassie-Färbung eine dominante Bande, und damit (semi-)präparative Proteinmengen, dar. Der Erhalt von Detergenz-solubilisierten Membranproteinproben von hoher Qualität ist ein wichtiger Schritt zur Gewinnung struktureller sowie biochemischer Daten. Das E.coli α-helikale Multi- Drug Resistenz Protein SugE konnte im CE P-CF Verfahren in präparativen Mengen von mehr als 2mg Protein pro mL des Reaktionsansatzes gewonnen werden. Durchgeführte analytische Größenausschlusschromatographie zeigte, dass der Transporter unter optimierten Reaktionsbedingungen in einem homogenen, schlanken Peak eluiert. Mittels elektronenmikroskopischer Gefrierbruchanalysen konnte eine effiziente und homogene Rekonstitution von SugE in E.coli Liposomen gezeigt werden. Bindungsstudien unter der Verwendung fluoreszensbasierter Anisotropie-Messungen haben gezeigt dass Proflavin – im Gegenteil zu Ethidium – ein Substrat von SugE ist. YedZ ist ein 24kDa leucinreiches Membranprotein mit sechs putativen Transmembransegmenten und enthält zwei Kofaktoren, ein Häm b und ein Flavin-mononukleotid (FMN). Im P-CF Modus exprimiertes YedZ kann effizient in den Detergenzien LMPG, LPPG, SDS und DPC resolubilisiert werden. Analytische Größenausschlusschromatographie zeigte einen symmetrischen Elutionspeak der apo-Form. Mittels CD-Spektroskopie des gereinigten apo-YedZ in 0.02% DDM wurde ein α-helikaler Sekundärstrukturanteil von 55% ermittelt. Zur Gewinnung von holo-YedZ wurde anstatt Hämb das chemisch verwandte Hemin eingesetzt. Die aufgenommenen UV/Vis Spektren der zellfrei produzierten holo-YedZ Proteinprobe in ihrer oxydierten und reduzierten Form, zeigen zu einer in vivo exprimierten Vergleichsprobe identische Absorptionsmaxima. Für sechs G-Protein gekoppelten Rezeptoren konnte die zellfreie Expression in präparativen Mengen gezeigt werden. Das Steroid-Derivat Digitonin, sowie einzelne Mitglieder der Detergenzfamilie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether, wurden als am geeignetsten für die lösliche Expression der GPCRs im CE D-CF Verfahren ermittelt. Löslich in Anwesenheit von Brij78 produzierter GPCR Proben, zeigten nach Negativfärbung in elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalysen eine homogene Probenpräparation und geben Hinweis auf eine strukturelle Dimerisierug der Rezeptoren. Detergenzsolubilisierte Rezeptoren konnten in Liposomen, basierend auf E.coli Lipid-Mischungen, rekonstituiert werden. Elektronen-mikroskopische Gefrierbruchanalysen zeigten eine homogene Rekonstitution, welche auf eine funktionelle Faltung der Rezeptoren schließen lässt.
Erkrankungen des hämatopoietischen Systems treten oft als Folge balancierter chromosomaler Translokationen auf. Dabei ist das MLL Gen auf Chromosom 11 Bande q23 in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen involviert. Alle diese Veränderungen sind entweder mit einer akuten myeloischen oder lymphatischen Leukämie assoziiert. Translokationen mit Beteiligung des MLL Gens - mit Ausnahme der Translokation t(9;11) - werden aufgrund ihrer schlechten Therapierbarkeit und schlechten Prognose als Hochrisiko- Leukämien eingestuft. Das häufigste Partnergen ist das AF4 Gen (42% aller MLL Translokationen) auf Chromosom 4 Bande q21. Die daraus resultierende Translokation t(4;11) ist mit einer akuten lymphatischen Leukämie (pro-B ALL) assoziiert und tritt gehäuft bei Säuglingen und Kleinkindern auf. Das Resultat der Translokation t(4;11) ist letztendlich die Entstehung zweier reziproker Derivatchromosomen, die die beiden Fusionsgene MLL•AF4 und AF4•MLL kodieren. Welcher Mechanismus die Entstehung der Leukämie hervorruft, konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Basierend auf den Daten anderer MLLassoziierter Translokationen, dass ausschließlich das Derivat 11 Fusionsprotein onkogene Effekte vermittelt, wurde das Fusionsprotein MLL•AF4 intensiv erforscht. Erst Ende 2008 gelang es einer amerikanischen Arbeitsgruppe in einem Mll•AF4 knock-in Mausmodell den Krankheitsphänotyp einer AML bzw. einer prä-B ALL auszulösen. Allerdings exprimieren 80% aller t(4;11)-Patienten auch das reziproke AF4•MLL Fusionstranskript und die restlichen 20% tragen komplexe Aberrationen zwischen MLL, AF4 und einem dritten oder sogar einem vierten Partnergen. Deshalb befassen sich die Studien unserer Arbeitsgruppe hauptsächlich mit dem reziproken AF4•MLL Fusionsprotein. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein in den Zellen akkumuliert und dadurch onkogene Ereignisse auslöst, welche letztendlich in der Wachstumstransformation der Zellen resultieren. Aufgrund dieser Daten war davon auszugehen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein ebenfalls einen entscheidenden Beitrag bei der Entstehung der Leukämie leistet. Um das leukämogene Potential der beiden Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL in einem Mausmodell weiter zu untersuchen, wurde zunächst ein retrovirales Transduktionssystem in BA/F3-Zellen etabliert. Dabei wurden BA/F3-Zellen sowohl einzeln mit MLL•AF4 oder AF4•MLL als auch mit beiden Fusionsgenen der Translokation t(4;11) cotransduziert. Nachdem die Funktionalität der beiden Expressionskassetten, durch full-length Integration und durch Transkription erfolgreich nachgewiesen werden konnte, erfolgten erste Transduktions-/Transplantationsexperimente in Mäusen. Dafür wurden Lin-/Sca-1+ aufgereinigte Knochenmarkzellen mit retroviralen Überständen von MLL•AF4 und AF4•MLL einzeln- als auch co-transduziert. Mäuse denen MLL•AF4- oder Mock-transduzierte Lin-/Sca-1+-Zellen transplantiert wurden, entwickelten über einen Beobachtungszeitraum von 13 Monaten keinerlei Anzeichen einer leukämischen Erkrankung. Im Gegensatz dazu resultierte die Transplantation von AF4•MLLoder co-transduzierten Lin-/Sca-1+-Zellen in der Entwicklung einer leukämischen Erkrankung innerhalb von 7 Monaten. Anhand pathologischer Parameter, sowie durch histochemische, molekulare als auch durchflusszytometrische Analysen konnten drei verschiedene Immunophänotypen identifiziert werden. Die Expression des Fusionsproteins AF4•MLL resultierte in der Ausprägung des Phänotyps einer pro-B ALL oder einer B/T biphänotypischen akuten Leukämie (B/T BAL). In Anwesenheit beider Fusionsproteine der Translokation t(4;11) entwickelte sich ebenfalls eine B/T BAL oder einer Mixed Lineage Leukemia (MLL). Retransplantationsexperimente mit den primären leukämischen Blasten zeigten, dass die drei verschiedenen Krankheitsphänotypen stabil transplantierbar sind, wobei sich die Latenzzeit erheblich verkürzte. Damit wurde zum ersten Mal der Beweis erbracht, dass das Fusionsprotein AF4•MLL auch allein ohne die Gegenwart des Fusionsproteins MLL•AF4 in der Lage ist eine leukämische Erkrankung auszulösen. Aufgrund dieser Daten, vorausgehenden Studien unserer Arbeitsgruppe sowie den Studien zum Fusionsprotein MLL•AF4 ist davon auszugehen, dass der pathomolekulare Mechanismus der Translokation t(4;11) auf zwei Onkoproteinen basiert.
Chloridkanäle und -transporter sind an wichtigen physiologischen Prozessen beteiligt [Jentsch et al., 2002; Zifarelli & Pusch, 2007; Jentsch, 2008] und mutationsbedingte Funktionsdefekte können mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden [Planells-Cases & Jentsch, 2009]. Trotz der großen physiologischen Relevanz bilden diese Proteine eine unterrepräsentierte Klasse in der pharmakologischen Wirkstoffsuche [Verkman & Galietta, 2009], auch aufgrund fehlender adäquat robuster und Durchsatz-starker Testsysteme. Vor allem die Vertreter der intrazellulären CLC-Proteine, von denen bereits zwei eindeutig relevanten Krankheiten zugeordnet werden konnten (ClC-5 – Dent´sche Krankheit; ClC-7 – Osteopetrose), entziehen sich aufgrund ihrer vesikulären Lokalisation den klassischen elektrophysiologischen Methoden. Aus diesem Grund kam in dieser Arbeit die SSM-Technik [Schulz et al., 2008] zur Charakterisierung des lysosomalen Cl-/H+-Antiporters ClC-7 zum Einsatz. Bei geeigneter Membranpräparation können mit dieser Methode auch vesikuläre Transportprozesse elektrophysiologisch untersucht werden. Neben der grundlegenden biophysikalischen Untersuchung von ClC-7 war es mit Hilfe der SSM-Technik möglich, die Protonen-gekoppelte Antiportaktivität dieses vesikulären CLC-Vertreters nachzuweisen. Außerdem wurde ein robuster Assay etabliert, der auch die pharmakologische Untersuchung von ClC-7 erlaubt. Mit diesem konnte gezeigt werden, dass ClC-7 spezifisch durch die Chloridkanalblocker DIDS und NPPB mit relativ hoher Affinität (DIDS: IC50= 39 µM, NPPB: IC50= 156 µM) zu inhibieren ist. Da ClC-7 auch als potentielles Target in der Osteoporose-Therapie diskutiert wird [Schaller et al., 2005], bietet die SSM-Technik somit eine Plattform für pharmakologische Untersuchungen an diesem Transporter. Neben dem Wildtyp Protein wurde weiterhin die Funktionalität einer physiologisch wichtigen, der Osteopetrose zuzuordnenden Mutante (G215R), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutante noch immer eine signifikante Transportaktivität besitzt, jedoch einen schweren Lokalisationsdefekt aufweist und nicht mehr korrekt in die Lysosomen transportiert wird. Durch Koexpression der funktionalen beta-Untereinheit Ostm1 [Lange et al., 2006] war es möglich, die lysosomale Lokalisation teilweise, jedoch nicht vollständig wiederherzustellen. Dieser Effekt könnte somit ein Grund für den relativ milden Krankheitsverlauf der mit dieser Mutation verbundenen autosomal dominanten Osteopetrose (ADOII, Alberts-Schönberg Krankheit) sein. Da die SSM-Technik bisher ausschließlich zur Untersuchung primär und sekundär aktiver Transporter zum Einsatz kam [Schulz et al., 2008; Ganea & Fendler, 2009], wurde weiterhin die Eignung der Methode zur Charakterisierung passiver Ionenkanäle anhand des ligandengesteuerten P2X2 Rezeptors überprüft. Ein Vergleich der gewonnenen elektrophysiologischen und pharmakologischen Daten lieferte gute Übereinstimmungen mit den Ergebnissen konventioneller elektrophysiologischer Untersuchungen. So konnte gezeigt werden, dass sich die SSM-Technik auch zur Charakterisierung von Ionenkanälen eignet. Da Ströme über Ionenkanäle bei den klassischen Methoden über eine extern angelegte Spannung gesteuert werden, solch eine Kontrolle bei der SSM-Technik jedoch nicht möglich ist, wurde schließlich in dieser Arbeit versucht, mit Hilfe der lichtgesteuerten Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) eine Spannungskontrolle zu etablieren. Anhand eines Fusions-basierten Modellsystems [Perozo & Hubbell, 1993] konnte gezeigt werden, dass lichtgesteuerte Ionenpumpen prinzipiell zur Kontrolle von Ionenkanälen an der SSM genutzt werden können. Allerdings eignet sich bR aufgrund seiner geringen Plasmamembranexpression in CHO Zellen nicht zur direkten Koexpression und Steuerung von Vertebraten-Proteinen. Der Einsatz eukaryotischer Ionenpumpen, kombiniert mit Anionendiffusionspotentialen [Perozo & Hubbell, 1993], könnte sich allerdings als erfolgsversprechend erweisen und die SSM-Technik auch für die Charakterisierung von stark spannungsabhängigen Ionenkanälen öffnen.
Tauopathien sind eine Gruppe von neurodegenerativen Erkrankungen zu denen auch die Alzheimer Demenz zählt, die als gemeinsames pathologisches Merkmal die intrazelluläre Akkumulation von neurofibrillären Bündeln (NFTs) aufweisen. Diese bestehen aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein, das hierdurch seine physiologische Funktion, die Assemblierung von Mikrotubuli zu fördern und diese zu stabilisieren, verliert. Der genaue Mechanismus, der bei diesen Erkrankungen zur Neurodegeneration führt und mit Demenz, Parkinsonismus und motorischen Störungen einhergehen kann, ist bisher weitgehend ungeklärt. Da mitochondriale Dysfunktion bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen eine entscheidende Rolle spielt, wurde in der vorliegenden Arbeit anhand eines Zellmodells zum Einen der Effekt durch die Überexpression von gesundem Wildtyp-Tau (hTau40) und zum Anderen die Auswirkungen der P301L-Mutation, wie sie auch bei der frontotemporalen Demenz mit Parkinsonismus (FTDP-17) auftritt, auf die mitochondriale Morphologie und Funktion untersucht. Die grundlegende Charakterisierung deckte eine weitreichende Einflussnahme von Tau auf den Energiestoffwechsel der Zellen auf. Die Überexpression von Tau führt zu einer verminderten Expression der Komplexe I, II und IV sowie einer veränderten Aktivität der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I-III. Zudem weist die verminderte Aktivität der Citrat-Synthase auf eine Beeinträchtigung des Citratzyklus hin. Der maßgebliche Unterschied zwischen den Tau überexprimierenden Zellen besteht in dem deutlich erniedrigtem Gehalt (NADH:HAR-Aktivität) und der drastisch erniedrigten Aktivität (NADH:DBQ-Aktivität) von Komplex I in den TauP301L-Zellen, wohingegen die hTau40-Zellen trotz eines vermindertem Gehalts im Vergleich zu den Kontroll-Zellen eine deutlich erhöhte Aktivität (DBQ/HAR-Aktivität) aufweisen. Diese gegensätzliche Aktivität von Komplex I führt zu weitreichenden Veränderungen der Zellphysiologie, was sich am deutlichsten in der daraus resultierenden metabolischen Aktivität (NADH-Spiegeln), den ATP-Spiegeln und dem mitochondrialen Membranpotential zeigt. Diese Parameter sind in den hTau40-Zellen aufgrund der hohen Komplex I-Aktivität erhöht und in den TauP301L-Zellen entsprechend erniedrigt. Ebenso spiegeln sich diese funktionellen Parameter in der veränderten Morphologie, Dynamik sowie der Ultrastruktur der Mitochondrien wieder. Die Cristae-Struktur sowie die Dichte der Matrix lassen eindeutige Rückschlüsse auf die aus den unterschiedlichen Komplex I-Aktivitäten resultierenden ATP-Spiegel zu. Weiterhin gibt es in der Literatur Hinweise, dass zum Einen die Transportrichtung der Mitochondrien von der Affinität der Motormoleküle von dem ATP-Gehalt der Mitochondrien abhängig zu sein scheint und zum Anderen, dass die Hemmung von Komplex I zu einem retrograden Transport und perinukleären Morphologie der Mitochondrien führt. Dies konnte ebenfall in den TauP301L-Zellen gezeigt werden. Zusätzlich sind hier die mitochondriale Bewegung sowie die Dynamik (Fusion und Fission) verringert. Interessanterweise spiegeln viele der funktionellen und strukturellen Veränderungen der TauP301L-Zellen den Alterungsprozess wieder, da es im Alter zu einer erhöhten Rate an oxidativen mtDNA-Schäden, einer verminderten Aktivität von Komplex I sowie zu einer verringerten Effektivität und Kapazität der oxidativen Phosphorylierung kommt, die in niedrigeren ATP-Spiegeln resultiert. Anhaltspunkte aus der Literatur bringen auch die morphologischen und dynamischen Veränderungen der Mitochondrien mit dem Alterungsprozess in Verbindung, wodurch das in dieser Arbeit verwendete Zellmodell anscheinend den Alterungsprozess widerspiegelt, der bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen den Hauptrisikofaktor für die Erkrankung darstellt. Die Mutation P301L führt weiterhin dazu, dass die Zellen eine erhöhte Vulnerabilität gegenüber sekundären Insulten aufweisen. Obwohl die Toxizität der einzelnen Stimuli – seien es nun Inhibitoren der einzelnen Atmungskettenkomplexe oder oxidativer sowie nitrosativer Stress – sich unterschiedlich auf die gemessenen physiologischen Parameter der Zellen auswirkte, so zeigt sich durchgängig bei den TauP301L-Zellen ein stärkerer Abfall der metabolischen Aktivität und der ATP-Spiegel. Zudem führte die Überexpression von hTau40 zu einer geringeren Vulnerabilität gegenüber den sekundären Insulten. Trotz der geringen Auswirkungen von oligomerem und fibrillärem Aß1-42 auf die mitochondriale Funktion der SH-SY5Y Zellen kann nicht ausgeschlossen werden, dass in vivo nicht doch ein Teufelskreislauf besteht, sodass sich die Toxizität von Aß und Tau potenziert. Insgesamt machen die Ergebnisse dieser Arbeit deutlich, dass mitochondriale Dysfunktion auch bei Tauopathien eine entscheidende Rolle in der Pathogenese spielt und sich hierdurch neue Aspekte zur therapeutischen Intervention ergeben.
Die X-chromosomal gebundene chronische Granulomatose (X-CGD) ist eine seltene Erbkrankheit, bei der die NADPH-Oxidase der Phagozyten nicht funktionell ist. Der Grund hierfür liegt meist in Mutationen in der GP91phox Untereinheit der Phagozyten-Oxidase. Hierdurch treten lebensbedrohliche Bakterien- und Pilzinfektionen bei Patienten auf, was neben einer geringen Lebensqualität zu einer erheblich verkürzten Lebenserwartung führt. Eine Stammzelltransplantation eines gesunden Spenders ist bislang der einzige heilende Therapieansatz. Für X-CGD-Patienten, die keinen passen-den Spender zur Verfügung haben, stellt die genetische Modifikation autologer hämato-poetischer Stammzellen eine alternative Form der Therapie dar. Im Jahr 2004 wurden daher in einer präklinischen Phase I/II Studie in Frankfurt zwei X-CGD-Patienten gentherapeutisch behandelt. Hierbei wurden CD34+ Stammzellen ex vivo mit einem γ-retroviralen Vektor transduziert, der eine LTR-getriebene Expressionskassette für GP91phox trägt. Nach einer nicht-myeloablativen Konditionierung wurden die genetisch modifizierten Zellen der Patienten retransplantiert. Beide behandelten Patienten zeigten schon kurz nach Therapiebeginn eine deutliche Verminderung der Infektionsanfälligkeit und somit eine stark verbesserte Lebensqualität. Auf zellulärer Ebene konnte ein gutes Engraftment der modifizierten hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark beobachtet werden. In funktionellen Tests konnte die Bildung superoxidproduzierender Phagozyten für die Immunabwehr gezeigt werden. Das molekulare Monitoring beider Patienten hat jedoch über die Zeit eine Verringerung der Enzymaktivität in den Phagozyten (Superoxidproduktion) gezeigt, obwohl der Anteil genetisch modifizierter Zellen nicht geringer wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte durch quantitative RT-PCR-Analysen proviraler mRNA-Transkripte, eine Korrelation zwischen dem Verlust der Enzymaktivität und reduzierter Transgen-expression gezeigt werden. Durch DNA-Analysen peripherer Blutproben beider Patienten konnte eine verstärkte Methylierung an der Promotor-CpG-Insel, welche die Transgen-expression reguliert, als Ursache identifiziert werden. Weiterführende klonale Untersuchungen genmodifizierter Kolonien aus dem Knochenmark der Patienten offenbarten einen direkten Zusammenhang zwischen der Abwesenheit von Transkription bzw. Superoxidbildung und der Methylierung dieser CpG-Insel im proviralen Promotor-bereich. Somit konnte zum ersten Mal ein epigenetisches Silencing bei Patienten nach einer Behandlung mit Gentherapie nachgewiesen werden. In weiteren Versuchen konnte die vollständig ausgebildete, spezifische Methylierung des SFFV-Promotors in transduzierten Knochenmarkzellen eines Patienten durch in vitro Behandlung mit einem Methyltransferase-Inhibitor (Aza-D) in Kombination mit einem Histondeacetylase-Inhibitor (TSA) bis zu 30% reduziert werden. Dieser Teilerfolg zeigt, dass eine klinisch relevante Reaktivierung der Transgenexpression, durch Umkehrung des Silencings am SFFV-Promotor, prinzipiell möglich ist. Das Phänomen der Abschaltung der Genexpression des γ-retroviralen Vektors in der Frankfurter Gentherapiestudie, hat ein Testsytem zur Evaluierung zukünftiger Gentherapie-Vektoren erfordert. Durch Monitoring proviraler Parameter (Kopien, Transgenexpression, Proteinexpression und Promotor-CpG-Methylierung), in der murinen embryonalen Stammzelllinie P19 konnte in dieser Arbeit ein prädiktiver Silencing-Assay erfolgreich etabliert werden. Mit Hilfe dieses Systems wurden vielversprechende Silencing-resistente Vektoren mit dem UCOE (Ubiquitous Chromatin Opening Element) identifiziert. Hierdurch wurden wichtige Grundlagen geschaffen, um zukünftige virale Vektorsysteme in Bezug auf ihre Langzeitexpression testen zu können. Zusätzlich zu der Inaktivierung der transduzierten Expressionskassette konnte in beiden Patienten ein klonales Auswachsen von Subklonen beobachtet werden, das letztendlich zu einem myelodisplastischen Syndrom bei beiden Patienten führte. Der virale Enhancer war im Gegensatz zum viralen Promotor niemals methyliert, wodurch seine transaktivierenden Eigenschaften unbeeinflusst blieben. Diese enhancervermittelte Aktivierung proliferationsfördernder Gene (Mds1-Evi1-Genlokus) konnte durch RT-PCR-Analysen zunächst in Mischpopulationen aus peripherem Blut der Patienten nach-gewiesen werden. Weiterführende klonale Analysen in Knochenmarkzellen zeigten den direkten Zusammenhang zwischen der transkriptionellen Aktivierung des Mds1-Evi1-Genlokus und den proviralen Insertionen. Somit konnte die Ursache für die therapie-assoziierte, klonale Dominanz in beiden X-CGD-Patienten aufgeklärt werden. In der Frankfurter Gentherapiestudie wurde erstmals ein klinischer Erfolg für X-CGD-Patienten erzielt. Durch intensives molekulares Monitoring konnte im Rahmen dieser Arbeit aufgedeckt werden, dass der eingesetzte γ-retrovirale Vektor über das Phänomen der Insertionsmutagenese hinaus, auch in Bezug auf die epigenetische Abschaltung der Transkription (Silencing), für zukünftige Studien modifiziert werden muss. Sicherheits-verbesserte Vektoren mit einer Resistenz gegenüber Silencing in murinen embryonalen Stammzellen konnten in dieser Arbeit charakterisiert werden. Mit diesen Genfähren könnte der angestrebte Langzeittherapieerfolg in Zukunft möglich werden.
Größere Knochendefekte, Pseudarthrosen oder verzögerte Frakturheilungen erfordern
die Transplantation von autologer Spongiosa mit dem Nachteil schmerzhafter
Entnahmedefekte. Die biologische Wertigkeit alternativer und osteokonduktiv
wirkender Knochenersatzmaterialien sollte in der vorgelegten Arbeit in vitro beurteilt
werden. Hierbei sollten Adhäsion und Funktion mesenchymaler Stammzellen (MSC)
und endothelialer Progenitorzellen (EPC) alleine und in Co-Kultur untersucht werden.
Während die MSCs auf Scaffolds die Knochenneubildung fördern können, wird
angenommen, dass die zusätzliche Verwendung von EPCs die Gefäßeinsprossung
zusätzlich fördert. Zur Anwendung kamen Tutoplast® als humaner Knochenersatz,
Cerabone® als boviner Knochenersatz, drei verschiedene Tricalciumphophate (ß-TCP:
Chronos® und Vitoss®; -TCP BioBase®) und ein mit Silikon-beschichtetes
Hydroxylapatit (Actifuse®). Hierzu wurde die Zahl der adhärenten Zellen auf den
verschiedenen Matrices fluoreszenzmikroskopisch ermittelt. Außerdem wurde die
metabolische Aktivität der Zellen auf den Knochenersatzstoffen mit dem MTT-Test
untersucht sowie mittels RT-PCR nachgewiesen, ob sich die Zellen weiter
differenzieren und ihre Fähigkeit beibehalten. Darüberhinaus wurden die einzelnen
Knochenersatzstoffe in der Zusammenschau mit den adhärenten Zellen
elektronenmikroskopisch bewertet.
Grundsätzlich konnten erhebliche Unterschiede sowohl zwischen den einzelnen
Knochenersatzstoffen als auch zwischen den untersuchten Zellpopulationen
festgestellt werden. Bei alleiniger Besiedlung mit MSCs ist festgestellt worden, dass
Tutoplast® die höchsten Adhäsionsraten, gekoppelt mit einer guten
Stoffwechselaktivität im MTT-Test und bei der Expression der osteogenen Proteine
cbfa-1 und Osteocalcin aufweist. Diese Ergebnisse wurden durch die REM bestätigt, die
eine fibrillenähnliche Struktur von Tutoplast® zeigt und somit eine fast flächige
Adhäsion ermöglicht. Chronos® zeigt als einziges Knochenersatzmaterial ebenfalls eine
gute Adhäsion, Funktion und Morphologie, während die anderen Tricalciumphophate,
Actifuse® und Cerabone® deutlich abfielen.
Interessanterweise findet sich bei der reinen EPC-Gruppe ein ganz anderes Ergebnis.
Hier zeigt Actifuse® eine sehr gute Zelladhäsion, gefolgt von Biobase®. Dies bestätigt
sich auch im MTT-Test und bei der mRNA-Expression endothelialer Proteine, wie dem
von Willebrandt Faktor und VEGF. Die Ergebnisse der Co-Kultur zeigen hingegen
wiederum Tutoplast® und Chronos® mit guten Ergebnissen, interessanterweise aber
auch Actifuse® und Biobase® mit deutlicher Überlegenheit gegenüber den allseits
schlecht abschneidenden Produkten Cerabone® und Vitoss®. Während Tutoplast® und
Chronos® in der Co-Kultur höhere Anteile an MSCs aufwiesen, konnte bei Actifuse®
und Biobase® ein relativ hoher Anteil an EPCs festgestellt werden. Alleine bei Chronos®
konnte ein synergistischer Effekt der Co-Kultur in Bezug auf die adhärenten Zellzahl
festgestellt werden, die gegenüber der Einzelkultur über die Zeit stabil blieb. In der
Summe sind die Zelladhäsionen, -funktionen und Genexpressionen bei den vier
wirksamen Knochenersatzmaterialien in dieser Gruppe statistisch nicht
unterschiedlich.
Die Ergebnisse zeigen, dass bei der Verwendung von osteokonduktiven
Knochenersatzmaterialien deren spezifische Auswirkungen auf die Zelladhäsion und
Funktion berücksichtigt werden muss. Sowohl die Funktion der EPCs im Hinblick auf
eine vaskulären Anschluss des neugebildeten Knochens wie auch der MSCs im Hinblick
auf eine osteogene Differenzierung sollten optimal sein. Die in dieser Studie
festgestellten Effekte konnten bereits in einer in vivo Studie an einem critical size
Femurdefektmodell bestätigt werden, indem die kombinierte Anwendung von EPCs
und MSCs auf Chronos® die beste Frakturheilung zeigte.
Abschließend kann festgehalten werden, dass man bei der Verwendung des richtigen
Scaffolds mit den geeigneten Zellen einen adäquaten Knochenersatz induzieren kann,
der mittelfristig zu einer Vermeidung der schmerzhaften Entnahme von Spongiosa aus
dem Beckenknochen führen kann.
Das bakterielle Transfusionsrisiko stellt eine große Herausforderung in der Transfusionsmedizin dar, bei dem aufgrund der Lagerungstemperatur vor allem die Thrombozytenkonzentrate, aber auch Erythrozytenkonzentrate betroffen sind. In Deutschland wurde als Maßnahme zur Reduzierung des Risikos die Haltbarkeit der Thrombozytenkonzentrate von 5 Tagen auf 4 Tage verkürzt. Neben bakteriellen Kulturmethoden sind in den letzten Jahren auch Schnellnachweismethoden entwickelt worden. Die Einführung von Realtime-PCR Methoden hat besonders bei viralen transfusionsmedizinisch relevanten Pathogenen zu einer signifikanten Reduktion des Restinfektionsrisikos geführt. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Optimierung einer generischen Bakterien PCR aus Thrombozytenkonzentraten und aus Vollblut sowie eine Anwendungsstudie des entwickelten Nachweisverfahrens aus Vollblutproben.
Im ersten Teil, in dem die Entwicklung und Optimierung der Bakterien-PCR im Vordergrund stand, wurden sieben unterschiedliche Extraktionsverfahren synoptisch miteinander verglichen. Eine Hauptherausforderung bestand darin, dass einzelne PCR-Reagenzien und auch Verbrauchsartikel mit bakteriellen ribosomalen Nukleinsäuren kontaminiert waren und somit reaktive Signale sowohl in Negativkontrollen als auch in Wasserkontrollen detektiert wurden. Letztendlich erwies sich eine Extraktion aus Vollblutproben in Kombination mit einer SYBR Green 16S-PCR als zuverlässig, um Bakterien in Vollblut nachzuweisen. Die entwickelte PCR wurde anschließend in drei Phasen überprüft. Bei einer Untersuchung in unterschiedlichen Poolgrößen ergibt sich die höchste Sensitivität in einer Einzelprobenanalyse, eine Poolgröße von maximal 5 Proben pro Pool ergab akzeptable Nachweisgrenzen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass es gerade bei Raumtemperatur (21° C) zunächst zu einer Reduktion der Bakterienkonzentration durch leukozytäre Phagozytose kommt, bevor anschließend ein sigmoidales Wachstum einsetzt.
Die vorliegende Arbeit stellt somit eine mögliche Alternative zu vorhandenen Kulturmethoden dar und hat den Vorteil, dass die Ergebnisse eine Relevanz für alle Blutkomponenten haben. Dies bietet somit die Option, die Sicherheit der Blutprodukte weiter zu erhöhen.
Semiotik der Außenkulturpolitik : Sport, Künste, Wissenschaft & Personenaustausch in der Staatenwelt
(2010)
Die Bindung von regulatorischen Proteinen an die Zelloberfläche ist eine wirkungsvolle Strategie, die sich humanpathogene Bakterien, insbesondere B. burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose, zu eigen gemacht haben, um der bakteriolytischen Wirkung von Komplement zu entgehen. Die Grundlage der Serumresistenz bei B. burgdorferi besteht vornehmlich in der Interaktion der Komplementregulatoren Faktor H und FHL-1 mit fünf verschiedenen Borrelienproteinen, die als Complement Regulator-Acquiring Surface Proteins bezeichnet werden. Bei der Genospezies B. burgdorferi s.s. nimmt das BbCRASP-2 Protein aufgrund seines spezifischen Bindungsverhaltens gegenüber Faktor H und FHL-1 eine Sonderstellung ein. In früheren Untersuchungen konnten vier potenzielle Bindungsregionen von Faktor H und FHL-1 im BbCRASP-2 Protein lokalisiert werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der detaillierten Charakterisierung der an der Bindung mit Faktor H und FHL-1 beteiligten Aminosäuren von BbCRASP-2 innerhalb der putativen Bindungsregionen 2, 3 und 4 sowie in einer Region, die eine coiled-coil Struktur aufweist. Dazu wurden selektiv Aminosäuren mittels gerichteter Mutagenese durch die neutrale Aminosäure Alanin ausgetauscht und das Bindungsverhalten der mutierten BbCRASP-2 Proteine untersucht. Mittels Ligandenaffinitätsblot-Analyse und ELISA konnten insgesamt 17 Aminosäuren – geladen, neutral polar, neutral unpolar - identifiziert werden, die nach Mutagenese eine erniedrigte Bindungskapazität oder keine Bindung gegenüber Faktor H und FHL-1 in mindestens einem der beiden Testmethoden aufwiesen. Von diesen Mutanten zeigen 6 Proteine (BbCRASP-2S72A, BbCRASP-2D84A, BbCRASP-2F91A, BbCRASP-2R139A, BbCRASP-2Y207A, BbCRASP-2Y211A) in beiden Testsystemen ein deutlich verändertes Bindungsverhalten. 12 weitere BbCRASP-2 Mutanten fielen im ELISA durch ihre reduzierte Bindungskapazität auf, verhielten sich jedoch im Ligandenaffinitätsblot im Vergleich zu BbCRASP-2 in ihrer Bindungseigenschaft unverändert. Die für die Faktor H/FHL-1 Bindung relevanten Aminosäuren verteilten sich in allen der drei untersuchten Bindungsregionen, wobei Austausche in der C-terminal gelegenen Region 4 den größten Effekt auf die Bindung zeigten. Dies deutet darauf hin, dass dem C-Terminus eine essentielle Rolle bei der Interaktion zugeordnet werden kann. In Bezug auf die Ladungseigenschaften der identifizierten Aminosäuren ergab sich ebenfalls ein sehr heterogenes Bild. Da sowohl geladene als auch polare und unpolare Aminosäuren an der Bindung von Faktor H und FHL-1 partizipieren, ist davon auszugehen, dass gleichermaßen elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen an der Bindung beteiligt sind. Zusätzlich konnte in der putativen coiled-coil Region eine Aminosäure (Phe91) identifiziert werden, die direkt oder indirekt an der Bindung von BbCRASP-2 und Faktor H/FHL-1 beteiligt ist. Für die Hypothese einer an der Interaktion beteiligten coiled-coil Struktur spricht, dass Aminosäuresubstitutionen an drei weiteren Positionen (Leu-94, Ile-98 und Tyr-101) eine reduzierte Bindung bewirkten. Die räumlich weit auseinander liegenden Positionen der als bindungsrelevant identifizierten Aminosäuren deuten darauf hin, dass sich der Bindungsmechanismus von BbCRASP-2 an Faktor H und FHL-1 komplexer darstellt, als zunächst vermutet. Es ist ferner zu erwarten, dass noch weitere Aminosäuren außerhalb der putativen Bindungsregionen die Interaktion von BbCRASP-2 mit den Regulatorproteine beeinflussen, da in dieser Studie gezeigt werden konnte, dass die Substitution von Phenylalanin an Position 91 einen deutlichen Einfluss auf die Bindung von Faktor H und FHL-1 aufwies, obwohl sie außerhalb der ermittelten Bindungsregionen lokalisiert ist. Mit großer Wahrscheinlichkeit stellt die genaue Topologie des BbCRASP-2 Proteins ebenfalls einen entscheidenden Faktor für die Bindung dar. Deshalb sollte mit Kenntnis der dreidimensionalen Struktur des BbCRASP-2 Moleküls eine genauere Beschreibung des molekularen Bindungsmechanismus möglich sein. Die vorliegenden Untersuchungen zum molekularen Mechanismus der Serumresistenz von B. burgdorferi tragen wesentlich zum Verständnis der komplexen Interaktion zwischen BbCRASP-2 mit Faktor H und FHL-1, den beiden Komplementregulatoren des alternativen Weges bei. Diese Erkenntnisse könnten langfristig gesehen für die Entwicklung eines Impfstoffs genutzt werden.
Die Notwendigkeit der ipsilateralen Adrenalektomie als obligater Bestandteil einer Tumornephrektomie beim Nierenzellkarzinom wurde in der Literatur kontrovers diskutiert. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, durch einen Vergleich von tumornephrektomierten Patienten mit und ohne Nebennierenbefall Parameter zu ermitteln, die eine präoperative Abschätzung des Nebennierenbefalls erlauben, und somit als Entscheidungshilfe zur Durchführung der Adrenalektomie im Rahmen einer Tumornephrektomie dienen können. In unserer Studie wurden insgesamt 250 Patienten mit Nierenzellkarzinom erfasst, die zwischen 1992 und 2001 in der Klinik für Urologie und Kinderurologie Prof. Dr. med. Dietger Jonas, Johann Wolfgang Goethe – Universität Frankfurt am Main operiert wurden. Dabei wurde in allen Fällen die radikale Tumornephrektomie nach Robson inklusive ipsilateraler Adrenalektomie durchgeführt. Alle Operationspräparate wurden im Senckenbergischen Institut für Pathologie Prof. Dr. med. M.-L. Hansmann, Frankfurt am Main untersucht und nach der 6. Auflage der TNM-Klassifikation in der von der UICC empfohlenen Weise eingestuft. In 9 der 250 Fälle (3,6 %) wurde ein Nebennierenbefall festgestellt. Statistisch signifikante Ergebnisse konnten für folgende Parameter ermittelt werden: · Präoperativer CT-Befund In der präoperativ durchgeführten CT wurden von 235 als unauffällig eingestuften Fällen 5 pathologische Nebennierenbefunde nicht erkannt (2,13 %). Von 15 als auffällig eingestuften Fällen wurden jedoch 4 als richtig pathologisch erkannt (26,6 %). Es ergaben sich für den Nachweis eines Nebennierenbefalls im CT eine Sensitivität von 44 %, eine Spezifität von 95,4 %, ein positiver prädiktiver Wert von 26,6 %, und ein negativer prädiktiver Wert von 97,8 %. · Nierentumorgröße Es zeigte sich ein Nebennierenbefall erst ab einer Tumorgröße von > 5 cm mit einer Wahrscheinlichkeit von 5,8 % (p = 0,035). · pTNM-Stadium Ein Nebennierenbefall ließ sich erst ab Tumorstadium pT 3a erkennen. Bei pT1- oder pT2-Tumoren war kein Nebennierenbefall festgestellt worden. Bei Patienten ohne Lymphknotenmetastasierung konnte ein Tumorbefall der Nebenniere in 2 von 224 Fällen (0,89 %) gefunden werden. Bei den Patienten mit Lymphknotenmetastasierung lag der Nebennierenbefall bei 3 von 12 Fällen (25 %) für die Nierentumoren mit pN1 und bei 4 von 14 Fällen (28,6 %) bei Nierentumoren mit pN2. Bei Patienten ohne Fernmetastasierung (230 Fälle) ließ sich in 3 Fällen (1,3 %) ein Nebennierenbefall aufweisen; bei vorliegender Fernmetastasierung (20 Fälle) lag der Anteil der befallenen Nebennieren mit 6 Fällen bei 30 %. · Tumorgrading Ein Nebennierenbefall war bei keinem der G1-Tumoren festgestellt worden. Bei 4,4 % der G2-Tumoren (6/136 Fällen) und bei 12,5 % der G3-Tumoren (3/24 Fällen) konnte ein Nebennierenbefall nachgewiesen werden. Da das Grading nur am Nephrektomiepräparat vorgenommen werden kann, spielt es als prädiktiver Parameter keine Rolle. · Infiltration benachbarter Strukturen 0,5 % (1/200 Fällen) der Patienten ohne und 16 % (8/50 Fällen) der Patienten mit einem Tumorthrombus in der V. renalis zeigten auch einen Nebennierenbefall (p = 0,000012). 2,9 % (7/240 Fällen) der Patienten ohne und 20 % (2/10 Fällen) der Patienten mit einer Infiltration in die V. cava zeigten einen Nebennierenbefall (p = 0,044). 14,5 % (9/62 Fällen) der Patienten mit Tumorinfiltration in die Nierenkapsel zeigten einen Nebennierenbefall; keiner der Patienten ohne Nierenkapselinfiltration zeigte einen Nebennierenbefall (p = 0,000002). Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass eine ipsilaterale Adrenalektomie heutzutage keine obligate Komponente der Tumornephrektomie sein muß, sondern nur durchgeführt werden sollte, wenn folgende präoperative Bedingungen vorliegen: 1. auffällige präoperative bildgebende Beurteilung der Nebenniere durch Sonographie, Computertomographie oder ggf. Magnetresonanztomographie 2. Größe des Nierentumors > 5 cm unabhängig von der Pollokalisation 3. . Primärtumorstadium >= cT3a 4. CT-graphischer Nachweis von Lymphknoten- und/oder Fernmetastasen 5. CT-graphischer Nachweis einer vaskulären Invasion 6. CT-graphischer Nachweis einer Nierenkapselinfiltration 7. auffälliger intraoperativer Befund
Die vorliegende Arbeit beinhaltet die tierexperimentelle Evaluierung von zwei Fragestellungen innerhalb eines Tiermodels. a) Zum einen sollten die Möglichkeiten der vaskulären MR-gesteuerten Interventionen am Model der Carotis-PTA in vivo evaluiert und optimiert, und zum anderen b) die Auswirkungen von intrakraniellen CO2-Embolien bei Herzoperationen unter CO2-Protektion evaluiert werden. Insgesamt wurden an 22 Hausschweinen Gefäßinterventionen unter MRT-Kontrolle durchgeführt. Die Punktion der A. iliaca communis, als Voraussetzung für beide Fragestellungen erfolgte im Angiographieraum. Hier erfolgte auch die Positionierung der Interventionsmaterialien im Zielgefäß, der A. carotis communis. Über das Hybridsystem erfolgte der Transport in den MRT, in dem die unterschiedlichen Interventionsmaterialien getestet und die MRT-Sequenzen angepasst werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit wurden über einen in der A. carotis communis liegenden Katheter unterschiedliche Mengen CO2 oder Luft intracerebral appliziert. Durch eine Diffusionssequenz (DWI) konnten die hierdurch verursachten Effekte auf das Gehirngewebe beobachtet werden. Eine lokale hyperintense Zunahme in der DWI um mehr als 20% wurde als signifikant, in Bezug auf das Vorliegen einer Gehirnischämie bezeichnet. Im Rahmen der 22 Tierexperimente des interventionell, radiologischen Teils konnten die Interventionsmaterialien gut über die entwickelte Echtzeitsequenz dargestellt werden. Durch die Weiterentwicklung dieser Sequenz konnten letztendlich sowohl die Bewegungen, als auch die Öffnungsvorgänge der Ballonkatheter mittels Echtzeitbildgebung dargestellt werden. Darüber hinaus konnten Inteventionsmaterialien bezüglich ihrer Eignung für die MR-Angiographie bewertet werden. Unsere Studie konnte zeigen, dass Interventionen im Bereich der A.carotis communis unter MR-Kontrolle möglich sind. Dies gelingt bislang jedoch nur durch passive Darstellung der Intervenionsmaterialien durch deren Suszeptibilitätsartefakte. Allerdings bedarf es noch der Entwicklung von Interventionsmaterialien, hier vor allem Führungsdrähte, welche nicht magnetisch leitend sind um eine Gefährdung des Patienten auszuschließen. Im herzchirurgischen Teil konnten 16 Tiere eingeschlossen werden. Diese wurden je nach Aplikationsgas und -menge in 3 Gruppen unterteilt: Gruppe I: Gruppe II: Gruppe III: Bei allen Tieren wurden Signalanhebungen in der Diffusionssequenz in der ipsi- und kontralateralen Hemisphäre, deren Persistenz über 25 Minuten, sowie klinische Symptome registriert. Herauszustellen sind die deutlich unterschiedlichen klinischen Reaktionen der Gruppe I zu den Gruppen II und III in unserer Studie. Die Kreislaufreaktionen, die in der Gruppe I bei 4 von 5 Tieren bis zum Kreislaufstillstand reichten, wurden von deutlichen, bilateralen Signalveränderungen in der DWI begleitet. In diesen Fällen muss von einem irreversiblen, großen cerebralen Insult ausgegangen werden. Lediglich bei 2 von 11 Tieren der beiden CO2 Gruppen, waren die Signalanhebungen progredient und dehnten sich in den späten Messungen auch auf die kontralaterale Hemisphäre aus. Bei allen übrigen Tieren dieser Gruppen waren nur leichte Signalanhebungen nach 10 Minuten zu erkennen. Daraus ist zu schließen, dass mit keinen bleibenden Schädigungen der Gehirnzellen zu rechnen ist, da die Ischämiezeit deutlich unter 15 Minuten lag.
Um Materie mit Nanometergenauigkeit anzuordnen, ist Selbstorganisation die mächtigste Strategie. DNA (Desoxyribonukleinsäure) ist hierfür ein hervorragendes Baumaterial, da sie ein billiges, programmierbares, biokompatibles und gut verstandenes Polymer ist. Aus diesen Gründen ist DNA zur Basis für ein schnell wachsendes Gebiet geworden: die DNA-Nanotechnologie. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Interaktionsmöglichkeiten für die DNA-Nanotechnologie zu entwickeln und neuartige Strukturen aus DNA-minicircles aufzubauen, einem bislang vernachlässigten Konstruktionselement. ...
Morphin-6-Glukuronid (M6G) ist ein aktiver Metabolit von Morphin. Er ist mitverantwortlich für die analgetische und toxische Wirkung nach einer Morphinverabreichung. M6G wird aktuell in klinischen Phase-III-Studien getestet und möglicherweise zukünftig als ein alternatives Schmerzmittel zu Morphin zur Behandlung postoperativer Schmerzen eingeführt. Seine zentralnervösen Opioideffekte könnten sich aufgrund einer erhöhten Konzentration im zentralen Nervensystem (ZNS) als Folge einer erhöhten M6G Blutkonzentration und/ oder einem erhöhten ZNS Transport an der Blut-Hirn-Schranke verstärken. M6G scheint Substrat zahlreicher transmembranöser Transporter zu sein, die u.a. an der Blut-Hirn-Schranke, Niere oder Leber lokalisiert sind. An der Blut-Hirn-Schranke pumpen diese Transporter M6G aktiv aus dem ZNS zurück in das Blut. Die Hemmung der Transporteraktivität könnte somit eine potentielle Ursache einer erhöhten ZNS Konzentration von M6G mit der Folge vermehrter Nebenwirkungen unter Morphin bzw. Morphin-6-Glukuronid Administration sein. Wir untersuchten die Auswirkungen einer pharmakologischen Hemmung der transmembranösen Transporter P-Glykoprotein, sowie den Probenecid sensitiven Transportern multidrug resistance proteins (MRPs), organic anion transporters (OATs) und organic anion transporter polypeptides (OATPs) auf die Rückenmarkkonzentration und antinozizeptiven Effekte von M6G in Ratten. PSC 833 bzw. Probenecid wurden als Inhibitoren von P-Glykoprotein bzw. Probenecid sensitiven Transportern verwendet. Die Rückenmarkkonzentration von M6G wurde direkt mittels in vivo Mikrodialyse durch eine transversal in das Hinterhorn des Rückenmarks implantierten Sonde gemessen. 20 Ratten erhielten M6G als intravenöse Infusion für 8 Stunden, jeweils 5 von diesen bekamen zusätzlich eine Infusion mit PSC 833 oder Probenecid. Die antinozizeptiven Effekte von M6G wurden durch den Formalinschmerztest während der 8. Stunde der M6G Infusion in weiteren Verhaltensexperimenten bestimmt. Dabei wurde die Dosisabhängigkeit der antinozizeptiven Effekte von M6G mit oder ohne PSC 833 bzw. Probenecid im Vergleich mit PSC 833 alleine, Probenecid alleine und Placebo untersucht. In den Mikrodialyseexperimenten wurde unter P-Glykoprotein Hemmung mit PSC 833 eine nahezu dreifach höhere M6G Rückenmarkkonzentration gemessen, während die Blutplasmakonzentration nur um den Faktor 1.2 erhöht war. Die Folge war eine Verdoppelung des Konzentrationsverhältnis Rückenmark zu Blutplasma (von 0.08 ± 0.03 für M6G alleine auf 0.17 ± 0.08 für M6G mit PSC 833). Die antinozizeptiven Effekte von M6G in den Verhaltensexperimenten waren signifikant erhöht unter P-Glykoprotein Hemmung. Die Inhibition Probenecid sensitiver Transporter verursachte einen gleichmäßigen Anstieg der Blutplasma und Rückenmarkgewebekonzentration um den Faktor 1.4, ohne Veränderung des Konzentrationsverhältnis Rückenmark zu Blutplasma (0.081 ± 0.034 für M6G alleine, 0.082 ± 0.021 für M6G mit Probenecid). Die Verabreichung von Probenecid mit M6G zeigte eine signifikante Reduktion der Anzahl der Flinches im Formalinschmerztest um den Faktor 2.5 im Vergleich zu M6G alleine. Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Morphin-6-Glukuronid ein Substrat des Transporters P-Glykoprotein in Ratten ist. Die Verabreichung des P-Glykoprotein Inhibitors PSC 833 erhöhte die Penetration von M6G aus dem Blut in das zentrale Nervensystem und verstärkte dadurch seine antinozizeptive Wirkung. Dieser Effekt ist an der Blut-Hirn-Schranke lokalisiert. Weiterhin wurde demonstriert, dass der Blut-Hirn-Schranken Transport von Morphin-6-Glukuronid nicht durch Probenecid sensitive Transporter beeinflusst wird. Die Verabreichung von Probenecid verstärkte zwar die antinozizeptive Wirkung von M6G aufgrund eines Anstiegs der M6G Rückenmarkkonzentration, jedoch als Folge einer erhöhten Blutplasmakonzentration. Da M6G hauptsächlich in den Urin ausgeschieden wird, ist dieser Effekt wahrscheinlich in der Niere lokalisiert und vermindert die systemische Elimination von M6G. Somit ist M6G ein Substrat Probenecid sensitiver Transporter in Ratten, aber nicht an der Blut-Hirn-Schranke. Da viele Medikamente Inhibitoren von P-Glykoprotein oder Probenecid sensitiven Transportern sind, kann deren gleichzeitige Verabreichung mit Morphin bzw Morphin-6-Glukuronid zu erhöhten M6G ZNS Konzentrationen und Toxizität führen. Die Identifizierung dieser Transporter bedingten Interaktionen in unserer Arbeit kann helfen Medikamentenwechselwirkungen zwischen Inhibitoren und Morphin/ M6G zu vermeiden und die Patientensicherheit unter einer Morphin bzw. Morphin-6-Glukuronid Schmerztherapie zu steigern. Weitere Untersuchungen dieser Interaktionen im Menschen sind nötig, da sie klinisch von großer Bedeutung sind.
Behaviorale und neuronale Effekte eines Emotionserkennungstrainings bei Autismus-Spektrum-Störungen
(2010)
Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Wirksamkeit eines computerbasierten Emotionserkennungstrainings bei Personen mit Autismus-Spektrum-Störungen (ASS) zu überprüfen. Dies geschieht durch den Vergleich einer mit dem Frankfurter Training des Erkennens von fazialem Affekt (FEFA) trainierten und einer nicht trainierten Personengruppe mit ASS. Das FEFA ist das einzige deutschsprachige Emotionserkennungstraining, das mit dem Ziel entwickelt wurde, die Erkennung von Basisemotionen in Gesichtsausdrücken bei autistischen Menschen zu verbessern. Da ASS mit deutlichen, nicht ursächlich behandelbaren Beeinträchtigungen in der sozialen Interaktion und Kommunikation einhergehen, bieten übende Verfahren eine Möglichkeit, soziale Fertigkeiten aufzubauen und die Symptomatik abzumildern. Das Erkennen emotionaler Zustände anderer Personen stellt eine relevante Basisfähigkeit für angemessenes sozial-kommunikatives Verhalten dar. Autistischen Personen gelingt die Emotionserkennung oft nicht und es gibt Hinweise, dass sie emotionale Gesichtsausdrücke neuronal anders verarbeiten als nicht autistische Menschen. Daher werden in dieser Studie neben Testverfahren zur Emotionserkennung funktionelle Bildgebungsverfahren (fMRT) eingesetzt, um neuronale Aktivierungsmuster mitzuerfassen. Die Studie gliedert sich in zwei Teile. Im ersten Teil wird ein Querschnittsvergleich durchgeführt, bei dem die Emotionserkennungsfertigkeiten durchschnittlich begabter Personen mit ASS (n=40) sowie deren neuronale Aktivierungsmuster bei der Wahrnehmung emotionaler, fazialer Reize mit denen einer, nach Alter und nonverbaler Intelligenz parallelisierten, unauffälligen Kontrollgruppe (n=26) verglichen werden. Diese Vergleiche zeigen, dass der ASS-Gruppe in den verwendeten Emotionserkennungstests deutlich weniger korrekte Zuordnungen gelingen als der unauffälligen Kontrollgruppe. Darüber hinaus weist die ASS-Gruppe auch in einem Gesichtererkennungstest und einem Wortschatztest gegenüber den unauffälligen Kontrollen Beeinträchtigungen auf. In fMRT-Aufgaben zur impliziten Emotionserkennung ist bei den unauffälligen Kontrollen eine Mehraktivierung in neuronalen Arealen, die mit sozial-emotionaler Reizverarbeitung in Zusammenhang stehen, feststellbar, und zwar im fusiformen Gyrus, der Amygdala und auch im dorsalen lateralen präfrontalen Kortex. Bei Aufgaben zur expliziten Emotionserkennung und der Wahrnehmung neutraler Gesichter bestehen keine Unterschiede in den neuronalen Aktivierungen zwischen den Gruppen in den interessierenden Regionen (Regions of Interest). Der zweite Teil der Studie umfasst die Trainingsevaluation. Hierzu wird das FEFA-Training mit 15 autistischen Personen in acht Einzelstunden innerhalb eines Zeitraums von fünf bis sechs Wochen durchgeführt. Die parallelisierte ASS-Kontrollgruppe besteht ebenfalls aus 15 Personen, die keine Intervention erhalten. Die vor dem Training (bzw. der Wartezeit) erfassten Emotionserkennungsfähigkeiten und neuronalen Aktivierungsmuster werden mit den unmittelbar nach dem Training (bzw. der Wartezeit) erhobenen verglichen. Zudem werden zu einem dritten Messzeitpunkt, etwa vier Wochen nach Beendigung des Trainings, die Testleistungen der beiden ASS-Gruppen einander erneut gegenüber gestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die trainierte ASS-Gruppe in allen verwendeten Tests zur Erkennung von Basisemotionen deutliche, stabile Verbesserungen erreicht, die mit einer Mehraktivierung im fusiformen Gyrus und der Amygdala bei Aufgaben zur impliziten Emotionserkennung einhergehen. Keine Verbesserungen werden bei der Erkennung komplexer emotionaler und mentaler Zustände sowie in der, von den Eltern eingeschätzten, affektiven Reaktivität im Alltag erzielt. In einem visuellen Gedächtnistest und einem Konzentrationstest, die zur Kontrolle der Spezifität des Trainings zu allen Messzeitpunkten angewendet werden, sind keine Verbesserungen in der trainierten ASS-Gruppe feststellbar. Somit kann davon ausgegangen werden, dass keine emotionsunspezifischen Fertigkeiten trainiert wurden. Das FEFA-Training wird von den Teilnehmern hinsichtlich des Ablaufs und des subjektiv erlebten Behandlungserfolges als überwiegend positiv bewertet. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass die Anwendung des FEFA-Trainings über einen relativ kurzen Zeitraum bei autistischen Personen mit normativer Intelligenz die Emotionserkennungsleistung verbessert, allerdings sind darüber hinaus weitere Interventionen erforderlich, um einen Transfer in den Alltag zu ermöglichen.
Einleitung: Es kommt immer wieder vor, dass Patienten mit Schmerzen in der Brust, im Arm oder Rücken, mit Übelkeit oder anderen Symptomen eines möglichen Herzinfarktes zu ihrem Hausarzt oder dem Notärztlichen Dienst gehen und mit einer falschen Diagnose und der damit verbundenen falschen medizinischen Behandlung nach Hause geschickt werden. Tritt dann aufgrund solch einer fehlerhaften Diagnose der Tod ein, stellt sich hinterher die Frage warum der Herzinfarkt nicht schon früher erkannt wurde und ob eine fachgerechte, rechtzeitige Behandlung das Leben des Betroffenen hätte retten oder ihm zumindest unnötige Schmerzen ersparen können. Material und Methode: Grundlage der vorliegenden Arbeit sind die Sektionsprotokolle des Zentrums der Rechtsmedizin des Klinikums der Goethe-Universität Frankfurt am Main. Über die institutsinternen Datenprogramme „Obduktio“ und „Sektio“, wurden sämtliche Daten zu Todesfällen gesammelt, bei denen als Todesursache ein Herzinfarkt festgestellt werden konnte und die in dem Zeitraum vom 1.1.1994 bis 31.12.2007 durch Ärztinnen und Ärzte der Frankfurter Rechtsmedizin obduziert wurden. Zusätzlich standen für die Auswertung folgende Unterlagen zu Verfügung: Sektionsprotokolle mit allen rechtsmedizinischen Zusatzuntersuchungen, Ermittlungsergebnisse der Polizei (soweit diese aus den Akten hervorgehen), staatsanwaltschaftliche Akten (inklusiver klinischer Gutachten, soweit in Auftrag gegeben) und Gerichtsurteile (wenn diese bis zum Abschluss der Arbeit vorlagen). Auf diese Weise konnten 38 Fälle von verkannten Herzinfarkten festgestellt werden. Ergebnisse: Von den 38 Verstorbenen waren 16 Frauen und 22 Männer. 21 (55%) waren unter und 17 (44,7%) über 50 Jahre alt. Bei 20 der 38 Patienten (52,6%) erfolgte die ärztliche Konsultation an einem Freitagnachmittag, Samstag oder Sonntag. 20 Verstorbene wurden von einem Notarzt oder ärztlichen Notdienst behandelt. Von den untersuchten 38 Fällen verstarben 13 Patienten in den frühen Morgen- und Vormittagsstunden zwischen 6 und 12 Uhr. 9 Patienten verstarben zwischen 12 und 17 Uhr. 11 verstarben in den Abendstunden zwischen 17 und 22 Uhr und 4 Patienten in den Nachtstunden zwischen 22 und 6 Uhr morgens. Fünfmal wurde ein 12 Kanal-EKG entsprechend den Leitlinien der WMF abgeleitet. Bei 29 der 38 Fälle wurde eine Reanimation durchgeführt. Bei den untersuchten Fällen zeigte sich ein durchschnittliches Herzgewicht bei den Frauen von 370 g, wobei sich ein Durchschnittsalter von 50,1 Jahren und eine Durchschnittsgröße von 165 cm fanden, bei einem durchschnittlichen BMI von 25,5 kg/m2. Bei den untersuchten männlichen Fällen lag das durchschnittliche Herzgewicht bei 499 g und das Durchschnittsalter bei 51,6 Jahren bei einer Durchschnittsgröße von 172 cm und einem durchschnittlichen BMI von 22,4 kg/m2 Bei beiden Geschlechtern zeigt sich ein deutlich erhöhtes Herzgewicht im Vergleich zu den physiologisch Daten bei „Gesunden“. Diagnostisch wurden die Ursachen der Symptome von Seiten der Hausärzte am ehesten im muskuloskeletalen (fast 37% der untersuchten Fälle) oder gastrointestinalen Bereich (30% der bearbeiteten Fälle) vermutet, danach am ehesten an pulmonale Ursachen (5% der Fälle) gedacht. Ein psychischer Hintergrund als Auslöser für die Symptome wurde nur in einem Fall vermutet, allerdings war bei der Verstorbenen auch eine psychiatrische Grunderkrankung vorbekannt. Bei 21% der Fälle wurde keine klare Arbeitsdiagnose gestellt. Diese Patienten wurden hauptsächlich mit Schmerzmedikamenten meist nicht steroidale Antirheumatika (NSAR) behandelt, also am ehesten im Sinne einer möglichen muskuloskeletalen Erkrankung. In 11 Fällen wurde von Seiten der jeweilig zuständigen Staatsanwaltschaft Anklage erhoben. Von diesen 11 erhobenen Anklagen wurde in 9 Fällen das Ermittlungsverfahren nach § 170 Abs.2 StPO eingestellt. Ein Verfahren wurde am Landgericht Frankfurt verhandelt und es kam zu einem rechtskräftigen Urteil. Die angeklagte Ärztin wurde aufgrund eines unnötig aufrechterhaltenden Schmerzzustandes zu einer Geldstrafe von 1500,- DM sowie einer Bewährungsstrafe von einem Jahr verurteilt. Bei einem etwas länger zurückliegenden Verfahren aus dem Jahre 1994 waren die Akten bereits vernichtet worden und der Ausgang des Ermittlungsverfahrens war nicht mehr nachvollziehbar. Es ist aber davon auszugehen, dass auch dieses Verfahren eingestellt wurde. Diskussion: Herz-Kreislauf-Krankheiten sind weiterhin die häufigste Todesursachen bei Frauen und Männern in Deutschland. Zudem führen sie nicht selten durch einen vorzeitigen Tod unter 70 Jahren zu einem erheblichen Verlust (potenzieller) Lebensjahre. Die hier ermittelte Fallzahl von n= 38 erscheint nicht sehr repräsentativ, zumal auch noch die hohe Selektion bias mitbedacht werden muss. Allerdings muss man zusätzlich eine wahrscheinlich sehr hohe Dunkelziffer berücksichtigen, da es zu einer deutlichen Selektion der Verstorbenen bezüglich einer Obduktion durch die jeweiligen behandelnden Ärzte kommt. Insgesamt ist von einer relativ großen Anzahl verdeckter Fälle auszugehen, die nicht obduziert werden und somit die eigentlichen Gründe, die letztendlich zum Tod des Patienten führten oftmals unerkannt bleiben. Bezüglich der Anzahl der geschriebenen EKGs muss die Frage gestellt werden, ob die geringe Anzahl von geschriebenen EKGs nur einen Zufallsbefund der hier untersuchten Fälle darstellen und ansonsten bei vergleichbaren Fällen regelmäßig ein EKG geschrieben wird, oder ob wirklich in den meisten Fällen bei Patienten mit einer unklaren Symptomatik eher auf ein EKG verzichtet wird. Ein weiterer auffälliger Aspekt ist, dass sich das Durchschnittsalter der 38 Verstorbenen bei ca. 51,3 Jahren befindet, und damit deutlich unter dem bundesweiten Durchschnittsalter von > 65 Jahren bei Herzinfarktverstorbenen liegt. Bezüglich des Zusammenhanges zwischen BMI und Herzgewicht lässt sich interessanter Weise eine deutliche Auffälligkeit bzgl. des Herzgewichtes der untersuchten Verstorbenen feststellen. In beiden Geschlechtern fand sich bei über 80% der Untersuchten ein teilweise deutlich über das physiologische Herzgewicht reichendes Herzgewicht bei durchschnittlich normwertigem BMI. Im Zusammenhang mit den hier ermittelten Daten kann ansatzweise überlegt werden, ob evtl. Ultraschalluntersuchungen zur Bestimmung des Herzgewichtes und der Wanddicke zur Diagnostische Abklärung bei fraglichen Brustschmerzen und unauffälligem EKG gehören sollten, um die Gefahr eines evtl. drohenden Infarktes zeitnah eingrenzen zu können. Sicherlich bedarf es hierfür aber noch weiterer Untersuchungen mit größeren Fallzahlen. Bezüglich der strafrechtlichen Konsequenzen ist zu sagen, dass bisher ein verkannter Herzinfarkt mit tödlichen Ausgang ohne strafrechtliche Konsequenzen geblieben ist, da der kausale Zusammenhang zwischen ärztlichem Fehlverhalten und dem Tod des Patienten nicht mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit nachgewiesen werden konnte mit Ausnahme des einen erwähnten Falles am Landgericht Frankfurt/Main. Ein möglicher neuer Ansatz ist jedoch zunehmend erkennbar. In den letzten staatsanwaltlich untersuchten Fällen zeichnet sich ein Trend zur verstärkten Einzelfallanalyse, bei welcher ausdrücklich die Frage nach einer möglichen längeren Überlebenszeit in den Vordergrund gestellt wird, wenn durch erforderliche, mögliche und unverzügliche Intervention eingegriffen worden wäre. Im Oktober 2007 stellte der BGH erstmalig in einem offiziellen Urteil fest, dass jeden Bereitschaftsarzt klar umrissene diagnostische Pflichten treffen. Auch wenn weiterhin nicht mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit nachgewiesen werden kann, dass der Tod eines Patienten hätte vermieden werden können, so ist doch in Zukunft die Frage nach einer möglichen Pflichtverletzung bei der durchgeführten Diagnosestellung und –sicherung bei einem Behandlungsfehlervorwurf mit zu berücksichtigen.
Das C-reaktive Protein (CRP) ist ein systemischer Marker für unspezifische Infektionen und wird bei einer Entzündungsreaktion in der Leber produziert. Seine Serum-Konzentration steigt im Rahmen einer Immunreaktion innerhalb von 24 - 48 Stunden auf ein vielfaches an und induziert zahlreiche Prozesse des Immunsystems. Erhöhte CRP-Werte konnten als Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen identifiziert werden. Zahlreiche Querschnittsstudien konnten erhöhte Serum-CRP-Werte bei Parodontitispatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen finden. Der Anstieg des Serum-CRP könnte ursächlich an den Zusammenhängen zwischen Parodontitis und kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt sein. Die Neutrophile Elastase ist ein weiterer systemischer Parameter, der im Rahmen chronischer Entzündungsreaktionen, wie der chronischen obstruktiven Lungenerkrankung (COPD), erhöhte Werte annimmt. Zahlreiche Studien konnten erhöhte Leukozytenzahlen bei Parodontitispatienten finden. Bisher wurde von den meisten Studien die Erhöhung des CRP-Wertes, sowie weiterer anderer Entzündungsparameter im Zusammenhang mit Parodontitis untersucht. Nach unserem Kenntnisstand konnten lediglich erhöhte Elastase-Werte im Zusammenhang mit Gingivitis gezeigt werden. Ziel der Untersuchung: Vergleich der Entzündungsparameter (CRP, Elastase, Leukozytenzahl, LBP, IL-8, IL-6) bei parodontal gesunden Probanden (Pro) und Patienten mit aggressiver (AgP) und chronischer Parodontitis (ChP). Methode: Es wurden 30 Pro (Sondierungstiefe (ST) < 3,6 mm oder < 5 mm ohne Bluten auf Sondieren (BOP), BOP < 10 %), 31 Patienten mit ChP (ST ≥ 3,6 mm und Attachmentverlust (AL) ≥ 5 mm ≥ 30 % der Stellen, Alter ≤ 35 Jahre) und 29 Patienten mit AgP (klinisch gesund (d.h. keine Allgemeinerkrankungen, die für Parodontitis prädisponieren), ST ≥ 3,6 mm > 30 % der Stellen, röntgenologischer Knochenabbau von ≥ 50 % der Wurzellänge an ≥ 2 Zähnen, Alter ≥ 18 Jahre und ≤ 35 Jahre) wurden klinisch auf folgende parodontologische Parameter untersucht: Entzündungsbefund, Plaquebefund, ST, AL, BOP. Bei allen Patienten wurde der BMI erhoben und Blutproben zur Bestimmung von CRP (untere Nachweisgrenze: 0,01 mg/dl), Elastase, Leukozytenzahl, LBP, IL-8 und IL-6 entnommen. Ergebnisse: Es wurden 30 Pro (16 Frauen, 8 Raucher), 31 Patienten mit ChP (12 Frauen, 10 Raucher) und 29 Patienten mit AgP (16 Frauen, 9 Raucher) eingeschlossen. Die Ergebnisse der CRP-Konzentration (Pro: 0,10 ± 0,12; ChP: 0,17 ± 0,23; AgP: 0,55 ± 0,98 mg/dl [p < 0,001]), der Elastase-Werte (Pro: 10,0 ± 4,7; ChP: 17,1 ± 12,3; AgP: 32,0 ± 14,6 mg/dl [p < 0,001]) unterschieden sich in allen drei Gruppen signifikant, wohingegen keine signifikanten Unterschiede in der Leukozytenzahl und der Konzentrationen von IL-8 festzustellen war. Die Werte für LBP (p < 0,01) waren signifikant höher in der AgP-Gruppe als in der Pro-Gruppe und der ChP-Gruppe (Pro = ChP < AgP). Die IL-6 Konzentration war in der Kontrollgruppe signifikant niedriger (p < 0,001) als in den Testgruppen (Pro < ChP = AgP). Die unterschiedlichen CRP-Werte in den Testgruppen sind teilweise durch den BMI zu erklären (p = 0,003). Schlussfolgerung: Die Konzentrationen für Serum-CRP und Elastase sind signifikant erhöht bei Patienten mit aggressiver Parodontitis im Vergleich zu parodontal gesunden Probanden als auch zu Patienten mit chronischer Parodontitis. Erhöhte Serum-CRP-Werte könnten bei Patienten mit aggressiver Parodontitis zu einem erhöhten kardiovaskulären Risiko beitragen.
Die vorliegende Dissertationsschrift im Fachgebiet Musikpädagogik widmet sich dem heutigen Stand des Instrumentalunterrichts auf Blechblasinstrumenten und dessen möglicher Weiterentwicklung unter besonderer Berücksichtigung neuer methodischer Ansätze. Hierbei stehen interdisziplinäre Übungskonzepte zur Förderung einer ganzheitlichen Instrumentalpädagogik im Vordergrund, insbesondere unter systematischer Miteinbeziehung spezieller mundmotorischer logopädischer Übungen. Mit der Zielsetzung, gängige Unterrichtskonzepte zu untersuchen und potenziell innovative Methoden aufzuzeigen, war zunächst grundlegende Forschungstätigkeit notwendig, da musikpädagogische Forschung im deutschen Sprachraum bisher die Blechblasinstrumente so gut wie nicht mit einbezogen hat (Suppan, 1994: 431; Bastian, 1992: 128ff). Nach entsprechender Recherche und dem Erstellen eines ersten Studiendesigns erwies sich eine Eingrenzung der Untersuchung auf die Instrumentalpädagogik von Trompete, Horn und Posaune als sinnvoll. Entsprechend dem Untertitel dieser Studie zu Theorie, Empirie und Didaktik modernen Instrumentalunterrichts gliedert sich diese Schrift in drei Hauptteile. Der theoretische Teil der Arbeit erläutert die sogenannte Ansatzphysiognomie und stellt diese ausführlich dar. Hierbei werden auf die didaktische Vermittlung des Bläseransatzes, dessen Anatomie sowie die Elemente des orofazialen Systems in Bezug zu deren Funktion beim Spielen eines Blechblasinstruments eingegangen. Ebenso werden Pathologien und ihre Konsequenzen für das Erlernen eines Blechblasinstruments erörtert. Nach einer Betrachtung des Mundes als Quelle sensorischer-integrativer Funktion, erfolgt eine Einführung in die orofaziale Muskelfunktionstherapie mit ihren „myofunktionellen Übungen“. Für die klare bildliche Darstellung der Anatomie wurde ein separater, auch für „Nicht-Anatomen“ verständlicher, Bildband (Band 2 dieser Dissertationsschrift) verfasst. Der didaktische Teil dieser Arbeit widmet sich den aktuellen Lehrplänen und Lehrmitteln für den Instrumentalunterricht bei Trompete, Horn und Posaune. Hierfür wurde in einem ersten Schritt zunächst der Verbreitungsgrad von Anfänger-Instrumentalschulen für diese Blechbläser ermittelt. Für eine systematische und einheitliche Bewertung dieser Schulen war es dann in einem zweiten Schritt erforderlich, ein entsprechendes Bewertungsinstrument zu entwickeln, welches als der „Frankfurter Analysebogen für Instrumentalschulen (FAI)“ vorgestellt wird. Mit diesem Fragebogen wurden insgesamt 40 Instrumentalschulen für Trompete, Horn und Posaune analysiert und evaluiert (Band 3 dieser Dissertationsschrift). Zum Abschluss des Kapitels erfolgt eine Betrachtung der aktuellen VdM-Lehrpläne sowie des Jugendmusiker-Leistungsabzeichens der BDB-Bläserjugend. Im empirischen Teil werden im Wesentlichen die Ergebnisse und Implikationen der Studie "Moderner Instrumentalunterricht auf Blechblasinstrumenten" aus Sicht der Lehrkräfte sowie der Schülerinnen und Schüler dargestellt. Die Befragung von 140 Lehrkräften und 853 Schülerinnen und Schüler soll hierbei Antworten auf grundlegende Fragen der Didaktik im gegenwärtigen Blechbläserunterricht geben. Die interdisziplinäre Evaluationsstudie "Zur musikpädagogischen Bedeutung von myofunktionellen Übungen" eröffnet aufgrund ihrer Ergebnisse die Möglichkeit einer Weiterentwicklung der Methodik im Bereich der Blechbläserpädagogik.
Die Ausbreitung von HIV stellt ein kontinuierlich wachsendes Problem dar [132]. Durch Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) konnte die Morbidität und Mortalität der HIV-Infektion deutlich gesenkt werden, jedoch limitieren Resistenzbildungen des Virus und Toxizität der Medikamente den Erfolg. Eine mögliche Therapiealternative bietet die HIV-Gentherapie. Hierbei werden Zellen eines Patienten genetisch modifiziert, so dass sie ein antivirales Genprodukt exprimieren. In der Arbeitsgruppe von Laer (Georg-Speyer-Haus, Frankfurt) wurde der retrovirale Vektor M87o entwickelt, der das antivirale, membranverankerte Peptid maC46 kodiert. Dieses hemmt als Fusionsinhibitor effizient den Viruseintritt von HIV. Als Zielzellen einer HIV-Gentherapie können neben TLymphozyten, den eigentlichen Zielzellen von HIV, auch deren Vorläufer, die hämatopoetischen Stammzellen, verwendet werden. Durch Generierung der gesamten Hämatopoese sollte dies zur Expression des antiviralen Transgens in allen Blutzelllinien führen. Besonders wichtig hierbei ist, dass die Funktion der hämatopoetischen Stammzellen durch die genetische Modifikation möglichst nicht gestört wird. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, toxische Effekte von M87o auf die Repopulierungsfähigkeit hämatopoetischer Stammzellen auszuschließen. Neben den Toxizitätsanalysen sollte auch die Langzeitexpression des retroviralen Vektors nach Transplantation genetisch modifizierter T- und Stammzellen untersucht werden. Eine stabile Expression des Transgens ist vor allem in T-Lymphozyten als Hauptzielzellen von HIV ausschlaggebend für den Erfolg der Gentherapie. Daher war ein weiteres Ziel dieser Arbeit, die Transgenexpression in vivo besonders in T-Lymphozyten im Verlauf zu untersuchen. Hierzu wurden in einem syngenen Mausmodell hämatopoetische Stammzellen mit dem retroviralen Vektor M87o transduziert und in bestrahlte Rag1-defiziente Mäuse transplantiert. Damit mögliche toxische Effekte von M87o auf die Hämatopoese nicht durch den Anteil untransduzierter Zellen im Transplantat maskiert werden, wurde in einer Versuchgruppe der Anteil transduzierter Stammzellen durch MACS-Sortierung auf über 95% angehoben. bAls Kontrollgruppen wurden untransduzierte, aber gleichermaßen kultivierte Stammzellen sowie mit dem Kontrollvektor M87c transduzierte Stammzellen transplantiert. Im folgenden Beobachtungszeitraum von 18-20 Wochen wurde regelmäßig das periphere Blut der Empfängertiere analysiert sowie nach Tötung der Tiere die einzelnen Zellpopulationen der hämatopoetischen Organe Blut, Lymphknoten und Milz charakterisiert. Hierbei konnte keine Toxizität durch M87o nachgewiesen werden. Zwar wurde für M87o-angereicherte Stammzelltransplantate eine verminderte bzw. verzögerte Lymphozytenrepopulierung beobachtet, dies war jedoch wahrscheinlich auf eine eingeschränkte „Fitness“ der Stammzellen durch den Sortierungsprozess und eine geringere Zellzahl im Transplantat zurückzuführen. M87o-transduzierte Stammzellen waren schließlich in der Lage, die komplette Lymphopoese zu generieren. Im Blut, Lymphknoten und Milz der Rezipienten konnten NK-, T- und B-Zellen nachgewiesen werden. Die lymphatische Differenzierung wurde also durch M87o nicht beeinträchtigt. Eine Aussage über die Toxizität von M87o auf die Myelopoese konnte leider nicht getroffen werden. Nach subletaler Bestrahlung der Empfängertiere und damit nur teilweisen Ablation des endogenen Knochenmarks wurden die meisten Zellen der myeloischen Linie durch die Wirts-Stammzellen generiert. Es müssen somit hinsichtlich der Unbedenklichkeit von M87o noch weitere präklinische Untersuchungen erfolgen, bei denen durch letale Bestrahlung der Empfängertiere lediglich die durch Spenderzellen differenzierte Myelopoese analysiert werden kann. Bei den Untersuchungen zur Transgenexpression nach Transplantation genetisch modifizierter Stammzellen konnte eine Langzeitexpression des maC46-Peptids auf allen lymphatischen Zelllinien (T-, B- und NK-Zellen) nachgewiesen werden. Dies zeigt also, dass eine stabile und effiziente Integration des Transgens und somit eine langfristige Expression in vivo möglich ist. Im Verlauf konnten jedoch bei nahezu allen Tieren fallende Anteile M87o-exprimierender Lymphozyten nachgewiesen werden. Dieser beobachtete Expressionsverlust war variabel hinsichtlich des zeitlichen Auftretens sowie zelltypabhängig. Die höchsten Anteile M87o-exprimierender Zellen zeigten sich innerhalb der B-Lymphozyten. Im Rahmen der M87o-Expressionsanalyse nach Transplantation genetisch modifizierter T-Lymphozyten wurden T-Lymphozyten mit unterschiedlicher Transduktionseffizienz in Rag1-defiziente Mäuse transplantiert. Unterschiede in der Langzeitexpression in Abhängigkeit von der ins Genom integrierten Kopienzahl des Vektors konnten hierbei nicht eindeutig gezeigt werden. Bei einigen Tieren konnte eine relativ langfristige in vivo Expression des maC46-Peptids nachgewiesen werden, bei anderen hingegen nachlassende Transgenexpressionen. Insgesamt war die Aussagekraft hier jedoch durch eine nach Transplantation auftretende schwere Kolitis bei den Versuchstieren und somit limitierte Beobachtungszeit stark eingeschränkt.
Das Wiedemann-Beckwith-Syndrom (WBS, OMIM 130650) gehört zu den angeborenen
Übergrößensyndromen und tritt mit einer Häufigkeit von 1:8000 bis 1:14000 Neugeborene
auf. Das Syndrom wurde erstmals zwischen 1963 und 1964 von HR Wiedemann und JB
Beckwith beschrieben. In der vorliegenden Studie wurden 52 Betroffene (24 weibliche, 28
männliche) aus ganz Deutschland untersucht, welche größtenteils der WBS-Selbsthilfegruppe
angehörten, darunter auch Patienten aus dem Institut für Humangenetik der Universitätsklinik
Frankfurt am Main. Bisher basierte die Phänotypbeschreibung des Wiedemann-Beckwith-
Syndroms häufig auf Literaturbeschreibungen und Einzelfallanalysen. Diese Studie ist neben
den Studien von Pettenati et al. (1986) und Elliot et al. (1994) eine mit dem größten
Patientenkollektiv.
Die Makroglossie war mit 96,2% das häufigste Symptom, dem folgten mit 75% die
Bauchwanddefekte (darunter in 36,2% die Omphalozele) und mit 72,5% die Makrosomie.
Alle Patienten zeigten kraniofaziale Auffälligkeiten. Neben der Makroglossie waren dies:
Naevus flammeus im Gesicht (57,7%), Infraorbitalfalten (51,9%), Gesichtshemihypertrophie
(40,4%), antevertierte Nares (21,2%), Exophthalmus (15,4%), Gaumenspalte (9,8%),
Mittelgesichtshypoplasie (9,6%) und flache Wangenknochen (3,8%). 82,4% der Patienten
hatten Ohrauffälligkeiten wie Ohrkerben, Ohrgrübchen und Ohreindellungen.
45,1% der Betroffenen hatten eine postnatale Hypoglykämie, die nicht länger als 3 Monate
dauerte. Eine Viszeromegalie trat bei 73,9% der Patienten und eine Hemihypertrophie bei der
Hälfte der Patienten auf. 7 Patienten hatten einen Herzfehler.
In 48% der Fälle wurden bereits pränatal Ultraschallauffälligkeiten wie Makroglossie,
Gigantismus, Polyhydramnion und große Plazenta festgestellt. 53,8% der Kinder wurden vor
der 38. SSW geboren. Nach der Geburt mußten 78,8% der Neugeborenen wegen
Hyperbilirubinämie, Omphalozele, Hypoglykämie, Atemnotsyndrom durch Makroglossie
oder frühgeburtlichen Komplikationen intensivmedizinisch betreut werden. Die Omphalozele
wurde in den ersten Lebenstagen operativ behandelt. 78,8% der Betroffenen erhielten wegen
der Makroglossie eine Therapie, darunter 44,2% eine operative Zungenverkleinerung.
Die kraniofazialen Auffälligkeiten und die Hemihypertrophie verbesserten sich in 80% der
Fälle im Laufe der Kindheit. Die Wachstumsrate verlangsamte sich im Verlauf und die
Körperlänge näherte sich der 90. bzw. der 97. Perzentile bis zur Adoleszenz.
In unserer Studie wurden bei 9 Patienten 9 Tumoren diagnostiziert, wovon 6 Tumoren
bösartig (darunter 4 Wilm’s-Tumoren) und 3 Tumoren gutartig waren.
Aufgrund des erhöhten Risiko für embryonale Tumoren ist ein regelmässiges, engmaschiges
Tumorscreening indiziert.
Die geistige Entwicklung verläuft bei WBS-Patienten in der Regel normal. Es wurden aber
auch Entwicklungsverzögerungen beobachtet, die durch WBS-spezifische Komplikationen
wie z.B. unerkannte postpartale Hypoglykämie, Frühgeburtlichkeit, und Makroglossie
bedingte Apnoe-Anfälle entstehen können. In unserer Studie hatte ein Patient eine mentale
Retardierung, weitere 16 Patienten hatten mehr oder weniger ausgeprägte Sprachprobleme
und /oder eine motorische Entwicklungsverzögerung.
Die meisten Ergebnisse der vorliegenden Arbeit waren vergleichbar mit anderen
Studienergebnissen (z.B. Pettenati et al., 1986, Elliot et al., 1994) über das Wiedemann-
Beckwith-Syndrom. Jedoch kamen maligne Tumoren, Hemihypertrophie,
Entwicklungsverzögerung und Gaumenspalte bei unseren Patienten häufiger vor.
Das Wiedemann-Beckwith-Syndrom ist eine genetisch heterogene Störung, die durch
Mutationen, Epimutationen und veränderte Expression mehrerer benachbarter Gene auf
Chromosom 11p15 entsteht, die dem genomischen Imprinting unterliegen. Die an der
Ätiologie von WBS beteiligten Gene sind die väterlich exprimierten (wachstumsfördernden)
IGF2- und KCNQ1OT1-Gene und die mütterlich exprimierten (wachstumshemmenden) H19-,
CDKN1C- (P57KIP2) und KCNQ1-Gene.
Ca. 15% der WBS-Fälle treten familiär und ca. 85% der Fälle treten sporadisch auf. Bei
familiären Fällen erfolgt die Vererbung autosomal-dominant mit reduzierter Penetranz und
variabler Expressivität. Die familiären Fälle werden überwiegend mütterlich übertragen.
Chromosomenaberrationen sind nur für 1-2% der Patienten verantwortlich. Das individuelle
Wiederholungsrisiko hängt von der genetischen Ursache ab, so dass bei jedem Patienten eine
genetische Untersuchung und Beratung erfolgen sollte.
Die frühzeitige Diagnose (eventuell sogar pränatal) des Wiedemann-Beckwith-Syndroms ist
für das Management der Patienten und die Prognose sehr wichtig. Die primäre Diagnose
erfolgt anhand der klinischen Merkmale. Die genetische Diagnostik wird zur genaueren
Prognose für den zu erwartenden Krankheitsverlauf, Komplikationen (Tumorrisiko),
Möglichkeiten der Prävention und Einschätzung des Wiederholungsrisikos bei weiteren
Geschwistern bzw. eigenen Nachkommen durchgeführt.
Die wichtigste Aufgabe der mitotischen Spindel ist die genaue Segregation der duplizierten Chromosomen in der Mitose. Diese dynamische Struktur wird von sich teilenden Zellen gebildet, um die Bewegung der Chromosomen, das Markenzeichen der Mitose, zu dirigieren. Trotz aller Unterschiede in Form und Größe der Spindeln unterschiedlicher Zelltypen, haben alle eukaryontischen Spindeln fundamentale strukturelle Eigenschaften gemeinsam. Eine der wichtigsten Eigenschaften ist die bipolare Symmetrie. Innerhalb der Spindel sind unterschiedliche Klassen der Mikrotubuli vorhanden, die durch ihre Organisation und durch ihre dynamischen Eigenschaften unterteilt sind. Alle Klassen der Mikrotubuli zeigen dynamische Instabilität. Dennoch weisen die Kinetochor-Mikrotubuli und die Spindel-Mikrotubuli zusätzlich ein anderes Verhalten auf, das als polwärts gerichteter Mikrotubuli-Flux ("Poleward Microtubule Flux") bezeichnet wird. Dabei werden die Tubulin-Untereinheiten stetig an den Plus-Enden der Mikrotubuli eingefügt und dann zu den Minus-Enden getragen, wo sie abgebaut werden. Dieser polwärts gerichtete Mikrotubuli-Flux ist für die Segregation der Chromosomen von großer Bedeutung. Mehrere regulatorische Proteine der Mikrotubuli, einschließlich der destabilisierenden und der depolymerisierenden Proteine, steuern die Dynamik dieser Mikrotubuli, um eine fehlerfreie Bildung der Spindel und eine korrekte Segregation der Chromosomen gewährleisten zu können. Die Kinesin-13 Familie der Depolymerasen gehört zu den prominentesten Modulatoren der Dynamik der Mikrotubuli. Das am Besten charakterisierte und intensiv studierte Mitglied dieser Familie ist das Protein KIF2C/MCAK. Aufgrund der unterschiedlichen Lokalisationen von MCAK während der Mitose, an den Spindelpolen, an den Chromosomen-Armen, an den Centromeren/Kinetochoren, kann MCAK eine Reihe an wichtigen Funktionen erzielen. Allerdings bleibt die Korrektur von Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen die wichtigste Aufgabe von MCAK während der Mitose. Diese wesentliche Funktion steht unter der Kontrolle von Aurora B. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MCAK während der Mitose auch von einem wichtigen Komplex, dem Cyclin B1/CDK1 Komplex, reguliert wird. In der Tat steuert die Kinase CDK1 sowohl die Lokalisation als auch die katalytische Aktivität von MCAK. Mit Hilfe einer systematischen Reihe an Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass MCAK sowohl in vitro als auch in vivo von CDK1 phosphoryliert wird. CDK1 phosphoryliert den katalytischen Bereich von MCAK genau am Threonin 537 und führt zu einer deutlichen Abnahme der Depolymerisierungsaktivität von MCAK in vitro und in humanen Zellen. Diese Inhibition erfolgt wahrscheinlich durch eine Reduzierung der Affinität von MCAK zu den Mikrotubuli-Enden. Die Expression der Phosphostatus-vortäuschenden Mutante T537E in HeLa-Zellen verursachte eine fehlerhafte Verteilung der Chromosomen in der Mitose. Die Chromosomen waren in Anwesenheit der T537E Mutante nicht mehr in der Lage, sich auf der Metaphaseplatte anzuordnen. Darüber hinaus führte die Expression von T537E zu einer signifikanten Reduzierung des centromerischen Abstandes, was auf eine Anhäufung von Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen hindeutet. Ferner zeigt die Expression der nichtphosphorylierbaren Mutante T537A in den HeLa-Zellen eine verstärkte Lokalisation an den Spindelpolen, was zum Auftreten von erheblichen Spindel-Aberrationen führte. Basierend auf den Daten der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell entwickelt, in dem die Phosphorylierung von MCAK durch CDK1 früh in der Mitose stattfinden muss, um einerseits MCAK zu inaktivieren und andererseits diese Depolymerase aus den Spindelpolen zu verdrängen. Beide Ereignisse sind für den Aufbau einer bipolaren Spindel unentbehrlich. Zu späteren Zeitpunkten der Mitose muss das Threonin 537 dephosphoryliert werden, um eine Reaktivierung von MCAK an den Centrosomen/Kinetochoren zu ermöglichen. Dies wird die Korrektur-Funktion für Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen von MCAK wiederherstellen, was eine korrekte Anordnung der Chromosomen auf der Metaphaseplatte fördert.
Development and characterization of histamine H3 and H4 receptor ligands as pharmacological tools
(2010)
Histamin gilt seit seiner Entdeckung vor ungefähr 100 Jahren als ein wichtiger chemischer Botenstoff im Organismus. Der Transmitter vermittelt pleiotrope Effekte über vier bisher bekannte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (H1R-H4R), die in die Regulation vielfältiger physiologischer Funktionen involviert und an der Entstehung von Krankheiten beteiligt sind. Antagonisten der ubiquitär im Organismus exprimierten H1R und H2R werden weitreichend zur Therapie von allergischen Erkrankungen bzw. Geschwüren im Gastrointestinaltrakt eingesetzt. H3R und H4R sind die jüngsten Vertreter der Histamin-Rezeptor-Klasse (HR). Auf molekularer Ebene zeigen diese beiden Subrezeptoren einen hohen Verwandtschaftsgrad. Sie ähneln sich u.a. bezüglich ihrer Aminosäuresequenz, ihrer Struktur und der Bindungseigenschaften von Liganden. Beide sind funktionell an inhibitorische/olfaktorische G-Proteine gekoppelt. Negative Rückkopplungsmechanismen werden durch ein hohes Maß an konstitutiver Aktivität ermöglicht. Dies unterstreicht die modulierende Funktion beider Rezeptoren, die wichtige physiologische Prozesse im Gleichgewicht hält. Als Auto- und als Heterorezeptor kommt der H3R hauptsächlich im zentralen Nervensystem vor. Er kontrolliert die Synthese und Freisetzung seines endogenen Liganden, moduliert aber auch die Konzentration anderer Neurotransmitter im synaptischen Spalt, die aus ko-lokalisierten Neuronen freigesetzt werden. Aus diesem Grund nimmt das neuronale histaminerge System eine entscheidende Rolle in der Erhaltung physiologischer Prozesse, wie z.B. Erregung, Aufmerksamkeit und Ernährungsverhalten, ein. Ein Ungleichgewicht der Neurotransmitterkonzentrationen kann die Entstehung neuronaler Erkrankungen verursachen, z.B. neurodegenerative Erkrankungen, Aufmerksamkeitsstörungen oder Übergewicht. Pitolisant ist der erste inverse H3R-Agonist, der sich in Phase III der klinischen Prüfung befindet. Sein erfolgreicher Einsatz bei verschiedenen pathophysiologischen Zuständen kann als Beweis für das H3R-antagonistische Therapieprinzip angesehen werden. Im Gegensatz zum H3R wird der H4R hauptsächlich in der Peripherie exprimiert, wo er an der Modulation des Immunsystems und an der Entstehung entzündlicher Prozesse beteiligt ist. Ergebnisse aus ersten präklinischen Studien sind teilweise widersprüchlich,weisen aber darauf hin, dass H4R-Liganden potenziell zur Therapie von allergischen und entzündlichen Erkrankungen entwickelt werden könnten. In beiden Forschungsgebieten müssen fundamentale Fragen noch geklärt werden, z.B. die Bedeutung von Rezeptor-Isoformen, die Rolle von Rezeptor-Heterodimeren oder die Aufklärung therapeutischer Prinzipien. Zudem müssen Liganden-Bindundgsmodi charakterisiert werden, um in der Zukunft weitere Bindungsareale in den jeweiligen Bindetaschen optimal zu nutzen. Hierdurch können Affinität, Aktivität und Selektivität von Liganden gesteuert werden. Diese Fragestellungen verdeutlichen den Bedarf an neuen Leitstrukturen und pharmakologischen Werkzeugen, die im Rahmen dieser Arbeit synthetisiert wurden. Im Vordergrund des H3R-Projektes standen Prinzipien des bioisosteren Austauschs, um dadurch die Entwicklung verschiedener Vorstufen für Liganden zum Einsatz in bildgebenden Verfahren zu ermöglichen. Ziel des H4R-Projektes war die Etablierung einer neuen Leitstruktur sowie deren Modifikation und Optimierung, um eine für die Aufstellung von Struktur-Wirkungsbeziehungen geeignete Substanzbibliothek zu erhalten. Mit Hilfe verschiedener In-vitro- und In-silico-Experimente wurde diese Bibliothek zur Charakterisierung der H4R-Bindetasche herangezogen und kann zukünftig auch in-vivo verwendet werden. Zu Beginn der Arbeit wurde von wenigen bekannten H4R-Liganden ein Pharmakophormodell abgeleitet. In seinen Grundbausteinen zeigte es große Ähnlichkeit zu einem schon etablierten H3R-Antagonist-Modell, was den hohen Verwandtschaftsgrad der Zielstrukturen widerspiegelte und auf überlappende Struktur-Wirkungsbeziehungen hinwies. Für die Synthese der Liganden bedeutete dies, dass präparative Methoden von einem auf das andere Gebiet übertragen werden konnten. Aufgrund des unterschiedlichen Forschungsstandes werden beide Projekte im Folgenden getrennt behandelt. Die Synthese der nötigen Vorstufen zur Darstellung von H3R-Antagonisten/inversen Agonisten wurde mittels im Arbeitskreis evaluierter Methoden durchgeführt. Standardmethoden wie reduktive Aminierungs- oder Amidierungsreaktionen wurden herangezogen, um das 1-(3-Phenoxypropyl)piperidin-H3R-Pharmakophor (1) zu erweitern. Zusätzlich wurden Triazole als alternative verknüpfende Elemente erprobt, um ein zweites basisches Zentrum, das potenziell Nebenwirkungen hervorruft, zu vermeiden. Die Triazole wurden in einem Klick-Chemie-Ansatz mittels 1,3-dipolarer Zykloaddition nach HUISGEN dargestellt. Sowohl die Zyklisierung als auch die Synthese entsprechender Azid-Vorstufen wurden erfolgreich etabliert und für die Synthese von Liganden aminerger Rezeptoren optimiert. Phenyl- und Benzylgruppen wurden mit dem H3R-Pharmakophor 1 verknüpft, um eine strukturelle Basis zu erhalten, die den Vergleich mit weiteren Liganden ermöglicht. Im Folgenden wurden der zentrale Phenylether sowie die Arylreste im rechten Teil des Pharmakophors durch derartige Gruppen ersetzt, die komplexierende Eigenschaften besitzen und damit zur Darstellung von entsprechenden SPECT (dt. Einzelphotonen- Emissions-Tomografie)-Liganden geeignet sind. Der elektronenziehende und sterisch anspruchsvolle Charakter der Trifluormethylgruppen in Verbindungen 8–10 spiegelt sich sowohl in der reduzierten chemischen Aktivität der jeweiligen Edukte als auch in der nur moderaten H3R-Affinität wider. Daher wurden diese Elemente nicht weiter verfolgt. Mit den Ferrocen-Derivaten 11–15 wurden zum ersten Mal metallhaltige H3R-Liganden entworfen. Die pharmakologische Charakterisierung dieser Verbindungen zeigte, dass die Sandwichkomplexe sich hervorragend zum bioisosteren Ersatz der Phenylreste eignen. Die Affinitäten der analogen Verbindungen sind vergleichbar und liegen im niedrigen nanomolaren Konzentrationsbereich. Der invers-agonistische Charakter des H3RPharmakophors wurde anhand der Verbindungen 11 und 15 bestätigt. Eine vorläufige invivo-Testung der hochaffinen Diamine 11 und 12 zeigte keine zufriedenstellenden Ergebnisse und muss durch weiterführende Untersuchungen ergänzt werden. Verbindung 15 wurde zur Weiterentwicklung zu einem potenziellen SPECT-Liganden ausgewählt. Die elektronenziehenden Eigenschaften des verknüpfenden Triazols erleichterten die Umkomplexierung des Ferrocens zu einem (Tricarbonyl)rhenium-Derivat, jedoch konnten Probleme bei der Aufreinigung einer nicht-radioaktiv markierten Analogverbindung mit den zur Verfügung stehenden chromatographischen Methoden nicht bewältigt werden. Gleichwohl wurden mit den Ferrocen-Verbindungen wertvolle bioisostere Analoga entsprechender SPECT-Liganden synthetisiert. Die Einführung von polaren Kojisäure-Derivaten stellte einen weiteren Ansatz zur Entwicklung von Liganden mit komplexierenden Eigenschaften dar. Außerdem sollten die Molekülgröße reduziert werden, um die Blut-Hirn-Gängigkeit zu erleichtern, und neue Leitstrukturen mit potenziell neuroprotektiven Eigenschaften entwickelt werden. In einem Nebenprojekt wurden Rac1-Inhibitoren dargestellt, die Kojisäure als zentrales Element aufwiesen. Die hier etablierten Synthesewege wurden zur Darstellung der H3RLiganden genutzt. Trotz erheblicher, für g-Pyranone typischer Nebenreaktionen konnte eine Reihe von H3R-Liganden synthetisiert werden (18–24). Die Affinitäten dieser Verbindungen zeigten eine auf den rechten Teil des H3R-Pharmakophors beschränkte bioisostere Potenz von Kojisäure-Derivaten. Besonders die Diamine aus dieser Serie sind als Leitstrukturen für die Entwicklung neuroprotektiver Liganden geeignet. Die neuen H3R-Liganden enthalten außergewöhnliche strukturelle Elemente, die in dieser Art zum ersten Mal am H3R getestet wurden. Die Ergebnisse aus den Bindungsstudien zeigten Grenzen und Möglichkeiten des bioisosteren Ersatzes im zentralen und im rechten Teil des Pharmakophors. Die Verbindungen sind wertvolle Modellsubstanzen, die zur Charakterisierung von lipophilen und hydrophilen Arealen in der H3R-Bindetasche verwendet werden können, und eignen sich als Leitstrukturen, um neue H3R-Liganden mit verschiedenen pharmakologischen Schwerpunkten zu entwickeln. Basierend auf einem von wenigen Referenzliganden abgeleiteten Pharmakophormodell wurde das H4R-Projekt mit verschiedenen Screening-Verfahren initiiert. In-silico wurde nach Fragmenten und neuen Pharmakophoren gesucht, um diese im Folgenden mit Hilfe von klassischen Verfahren der medizinischen Chemie zu modifizieren und zu optimieren. Innerhalb einer Strukturklasse wurden zunächst nur wenige Verbindungen synthetisiert. Zeigten diese ein unzureichendes Bindungsverhalten, wurde die Entwicklung eingestellt. In einem virtuellen Screening wurden zwei heterozyklische Strukturen mit Affinitäten im niedrigen mikromolekularen Konzentrationsbereich identifiziert, die zur Entwicklung einer Reihe von Aminopyrimidinen führten. Ähnliche Verbindungen wurden zeitgleich zu unserem Projekt von der pharmazeutischen Industrie untersucht und durch weitreichende Patente geschützt. Die neue Leitstruktur, N4-Benzyl-6-(4-methylpiperazin-1-yl)pyrimidin-2,4-diamin (46), wurde umfangreich derivatisiert. Prinzipien wie Heteroatom-Austausch, Rigidisierung und Modifikation des Substitutionsmusters am Benzylring nach TOPLISS wurden angewendet, um das Pharmakophor hinsichtlich Affinität, Funktionalität und Selektivität zu diversifizieren und zu optimieren. Die Synthese der Verbindungen 44–71 erfolgte hauptsächlich unter Mikrowelleneinstrahlung. Da konventionelle präparative Methoden keine Produktbildung ermöglichten, wurde eine sequentielle Mikrowellensynthese etabliert, mit Hilfe derer die gewünschte Umsetzung schnell und in hohen Ausbeuten erzielt wurde. Initialschritte zur Darstellung von Fluoreszenzliganden, die auf dem Aminopyrimidin-Pharmakophor basieren, wurden mit Verbindungen 72–75 erfolgreich realisiert. Bezüglich ihrer H4R-Affinität sollten diese Liganden in Zukunft weiter optimiert werden. Struktur-Wirkungsbeziehungen der Verbindung 46 und entsprechender Derivate zeigten, dass Affinitäten im niedrigen nanomolaren Konzentrationsbereich durch die Einführung kleiner, lipophiler benzylischer Substituenten in ortho-Position erreicht werden (z.B. durch 2-Cl- und 2-CH3-Reste in Verbindungen 58 und 59). In Verdrängungsstudien wurde das Bindungsverhalten ausgewählter Verbindungen an anderen HR-Subtypen untersucht. Die Liganden zeigten Selektivität in Bezug auf H1R und H2R und eine Präferenz für den H4R gegenüber H3R. Das 2,6-Dichlor-Derivat 62 stellte eine der potentesten und selektivsten Verbindungen dieser Serie dar. Das Substitutionsmuster des Benzylrestes beeinflusste die Effektivität der Liganden in großem Maße: Ortho- und para-substituierte Verbindungen zeigten in [35S]GTPgS-Bindungsstudien Partialagonismus. Mit steigendem Radius der para-Substituenten wurde eine Verschiebung zum neutralen Antagonismus und zum schwachen inversen Agonismus beobachtet, während meta-Substituenten ausgeprägten inversen Agonismus verursachten. Dieser wurde durch die Rigidisierung der Benzylamin-Gruppierung weiter verstärkt. Verbindung 69 zeigte sogar eine höhere invers agonistische Potenz als der Referenzligand Thioperamid. Um Hinweise auf die strukturellen Voraussetzungen für Agonismus und Antagonismus zu erhalten, wurde eine Moleküldynamiksimulation durchgeführt. Nach der virtuellen Ligandenbindung nahmen der Partialagonist 49 und der inverse Agonist 69 gegensätzliche Bindemodi in der H4R-Bindetasche ein. Die Bindung des inversen Agonisten wurde durch einen scheinbaren „ionic lock“, der hier zum ersten Mal postuliert wurde, stabilisiert. Da in-silico-Experimente von anderen Forschergruppen teilweise gegensätzliche Ergebnisse zeigten, sollten zusätzliche Untersuchungen durchgeführt werden, um zu klären, ob unterschiedliche Bindemodi durch gegensätzlicher Effektivitäten oder verschiedene Pharmakophore hervorgerufen werden. Die Aminopyrimidine stellen exzellente pharmakologische Werkzeuge dar. Die große Diversität bezüglich der Effektivität, die innerhalb einer Strukturklasse vom Partialagonismus bis zum inversen Agonismus reicht, bietet eine geeignete Grundlage, um potenzielle therapeutische Anwendungsbereiche von H4R-Liganden zu untersuchen und zu klären, welche Effekte aus der Aktivierung, Blockade oder Hemmung des H4R resultieren. Klassische Methoden der medizinischen Chemie wurden zur Entwicklung von Liganden zweier eng verwandter Zielstrukturen, H3R und H4R, verwendet. Im H4R-Projekt wurden zusätzlich Computer-gestützte Methoden herangezogen. Die Modifizierung und Optimierung verschiedener Leitstrukturen führte zu der Synthese von 75 Endverbindungen. Das H3R-Projekt, aus dem 22 dieser Verbindungen resultierten, fokussierte auf Prinzipien des Bioisosterismus. Triazole, Ferrocene und Kojisäure-Derivate wurden zum ersten Mal in ein H3R-Pharmakophor integriert. Die Eignung dieser Elemente als bioisosterer Ersatz des zentralen Phenylethers oder der Arylreste im rechten Molekülteil wurde untersucht. Mit dem hieraus gewonnenen Wissen wurden SPECT-Ligand-Vorstufen optimiert. Neue Leitstrukturen mit außergewöhnlichen Elementen stellen zudem Modellsubstanzen dar, die zur anhaltenden Charakterisierung der H3R-Bindetasche dienen. Auf dem H4R-Gebiet gehören die Aminopyrimidine zu einer der am weitesten entwickelten Substanzklassen. Die Derivatisierung der 31 synthetisierten Verbindungen verspricht neue Kenntnisse über diese Stoffklasse. Vor allem inverse Agonisten sollten auf ihre therapeutische Anwendbarkeit als Immunmodulatoren untersucht werden. Eine solche Effektivität könnte strukturell durch die Modifikation der meta-substituierten Aminopyrimidine oder durch die Verzweigung der benzylischen Methylengruppe erreicht werden. Eine ausführliche Charakterisierung der in Bezug auf Affinität und Effektivität vielversprechendsten Derivate, z.B. des 2,6-Dichlor-Derivates 62 oder der inversen Agonisten 68-70, sollte in naher Zukunft durchgeführt werden. Um in-vitro-Daten auf präklinische Tierstudien übertragen zu können, sollten die Liganden zusätzlich an H4Rs unterschiedlicher Arten getestet werden, da Spezies-Unterschiede eine solche Extrapolation derzeit nicht zulassen. Anschließend können die Aminopyrimidine als pharmakologische Werkzeuge in grundlegenden pharmakologischen Experimenten eingesetzt werden, um die Untersuchung der (patho)physiologischen Bedeutung des H4R fortzuführen.
Flusssysteme im mediterranen Raum reagieren besonders sensitiv auf Veränderungen von Umweltbedingungen, z.B. durch Neotektonik, Klimaänderungen und Landnutzung. Geowissenschaftler der Goethe-Universität Frankfurt untersuchen in diesem Zusammenhang das Einzugsgebiet des Rio Palancia (Spanien), um über die Erstellung einer Sediment-Massenbilanzierung die Entwicklungsgeschichte des Systems zu erforschen. Zur Identifizierung und Quantifizierung verschiedener Sediment-Ablagerungstypen wurde das Georadarverfahren (GPR) eingesetzt. Ziel dieser Arbeit ist es, am Beispiel fluvialer Lockersedimente das Zustandekommen von Radargrammen noch besser zu verstehen und möglichst viel Information über den Untergrund aus einem Radargramm zu extrahieren. An 30 Standorten wurden GPR-Messungen durchgeführt und mit Geoelektrik und Rammkernsondierungen kombiniert. Die Einführung einer Bearbeitungs- und Auswertesystematik gewährleistet die Vergleichbarkeit von Radardaten unterschiedlicher Standorte. Als Besonderheit werden die Radargramme jeweils auf zwei verschiedene Arten bearbeitet und dargestellt, um sowohl Strukturen herauszuarbeiten als auch die – zumindest relative – Amplitudencharakteristik zu erhalten. Erst dadurch wird eine Auswertung mithilfe der erweiterten Radarstratigraphie-Methode möglich. Diese setzt sich aus der klassischen Radarstratigraphie und der neu entwickelten Reflexionsanalyse zusammen. Dabei werden systematisch Radar-Schichtflächen, Radareinheiten und Radarfazies ermittelt und anschließend die Amplitudengröße, die Polarität und die Breite der Reflexionen betrachtet. Die Radarstratigraphie liefert objektive Erkenntnisse über Form und Verlauf von Untergrundstrukturen, während mithilfe der Reflexionsanalyse Aussagen zu relativen Änderungen von Wassergehalt, Korngrößenverteilung und elektrischer Leitfähigkeit möglich sind. Mithilfe der Radarstratigraphie wurde die Radarantwort verschiedener Sediment-Ablagerungstypen im Untersuchungsgebiet verglichen. Die Radargramme zeigen unterschiedliche Zusammensetzungen von Radarfazies. Eine Unterscheidung und räumliche Abgrenzung verschiedener Ablagerungstypen mit GPR ist somit durchführbar. Die Dielektrizität des Mediums bestimmt, zusammen mit der elektrischen Leitfähigkeit, die Geschwindigkeit und Dämpfung der elektromagnetischen Welle sowie die Reflexionskoeffizienten. Um das Zustandekommen von Radargrammen im Detail nachvollziehen zu können, ist es notwendig, die Dielektrizitätskoeffizienten (DK) der untersuchten Sedimente zum Zeitpunkt der Messung zu kennen und die Abhängigkeit des DK von petrophysikalischen Parametern zu verstehen. Deshalb wurden Proben aus den Rammkernsondierungen entnommen. Im Labor wurden der Real- und Imaginärteil des DK im Radarfrequenzbereich (mit Schwerpunkt auf 200 MHz) in Abhängigkeit von Wassergehalt, Trockendichte, Korngrößenverteilung und Kalkgehalt mithilfe der Plattenkondensatormethode bestimmt. Der DK ist in erster Linie vom Wassergehalt abhängig. Es konnte eine für die Sedimente im Untersuchungsgebiet charakteristische Wassergehalts-DK-Beziehung ermittelt werden. Die resultierende Kurve ist gegenüber entsprechenden in der Fachliteratur zu findenden Beziehungen verschoben, was vermutlich auf die hohen Kalkgehalte der Proben zurückzuführen ist. Für trockene Sedimente wurde eine Korrelation des DK mit der Trockendichte festgestellt. Bei der Bestimmung der Absorptionskoeffizienten fiel auf, dass Proben mit hohem Tonanteil selbst bei geringen Wassergehalten außerordentlich hohe Dämpfungskoeffizienten aufweisen können. Die charakteristische Wassergehalts-DK-Beziehung wurde für Modellierungen von Radardaten genutzt, die dann mit Messdaten verglichen wurden. Über die Modellierung einer einzelnen Radarspur konnte die spezielle Charakteristik der entsprechenden gemessenen Spur erklärt werden, die durch den Einfluss einer dünnen Schicht zustande kommt, deren Mächtigkeit an der Grenze der theoretischen Auflösung für die verwendete Radarfrequenz liegt. Auf Basis der Erkenntnisse aus der erweiterten Radarstratigraphie an einem Radargramm auf fluvialen Lockersedimenten war es zudem möglich, ein komplettes Radargramm zu simulieren. Es gibt das gemessene Radargramm vereinfacht, aber in guter Übereinstimmung wieder. Die Georadarmethode erwies sich als sehr gut geeignet für die Untersuchung, Identifizierung und Quantifizierung fluvialer Sedimente im Palancia-Einzugsgebiet. Die im Rahmen dieser Doktorarbeit entwickelte erweiterte Radarstratigraphie-Methode stellt ein systematisches und weitgehend objektives Verfahren zur Auswertung von Radargrammen dar, das sich auch auf andere Untersuchungsgebiete übertragen lassen sollte. Durch Laboruntersuchungen wurde der Einfluss petrophysikalischer Parameter auf den DK bestimmt. Über die Modellierungen konnten die Ergebnisse großskaliger Geländemessungen mit denen kleinskaliger Labormessungen verknüpft werden. Die insgesamt gewonnenen Erkenntnisse tragen zu einem besseren Verständnis von Radargrammen bei.
Suchtverhalten wird zu wesentlichen Anteilen durch die mesolimbische, dopaminerge Signalweiterleitung vermittelt. Daher wurde der gesamte DRD2-Genlokus und ergänzend der ANKK1 rs1800497C>TEinzelnukleotid Polymorphismus (SNP), der früher als „Dopamin D2 Rezeptor Taq1A C>T Polymorphismus“ bezeichnet wurde, auf Assoziationen mit dem Risiko, an einer Opiatabhängigkeit zu erkranken, und dem Methadondosisbedarf einer Methadonsubstitutionstherapie untersucht.
Die Allelfrequenzen der DRD2/ANKK1-Polymorphismen wurden zwischen 85 methadonsubstituierten, kaukasischstämmigen Patienten und 99 zufällig ausgewählten, gesunden kaukasischstämmigen Kontrollen verglichen. Innerhalb der Patientengruppe wurde untersucht, ob die tägliche Methadondurchschnitts- bzw. -höchstdosis im ersten Jahr der Behandlung und die Zeit, bis die Höchstdosis erreicht wurde, mit genetischen Varianten der Gene für DRD2 und ANKK1 assoziiert werden kann.
Verglichen mit der Kontrollgruppe findet sich bei Drogenabhängigen das minor-Allel des DRD2 rs1076560G>T-SNPs (p=0.022, Odds Ratio 2.343) oder der ATCT-Haplotyp des DRD2 rs1799978A>G, rs1076560G>T, rs6277C>T, ANKK1 rs1800497C>T häufiger (p=0.048, Odds Ratio 2.23). Ähnliche Tendenzen zeigen sich für ANKK1 rs1800497C>T (p=0.056, Odds Ratio 2.12) und den TCCTCTT-Haplotyp des DRD2-Rezeptors, der sich aus rs12364283T>C, rs1799732Cdel, rs4648317C>T, rs1076560G>T, rs6275C>T, rs6277C>T und ANKK1 rs1800497C>T zusammensetzt (p= 0.059, Odds Ratio 2.31). Die Methadondurchschnitts– und -höchstdosierungen ließen sich signifikant mit dem DRD2 rs6275C>TSNP assoziieren (p=0.016 für die Durchschnittsdosis und p=0.005 für die Höchstdosis). Träger des rs6275T-Allels benötigten höhere Methadondosierungen als Patienten, die dieses Allel nicht tragen. Zusätzlich wurde diese genetische Variante mit einer längeren Zeitperiode bis zum Erreichen der Methadonhöchstdosis assoziiert (p=0.025).
Zusammenfassend wurde in dieser Dissertationsarbeit der gesamte Genlokus des DRD2-Rezeptors von der Promotorregion bis hin zum ANKK1 rs1800497C>T-Polymorphismus analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass Polymorphismen, die den DRD2-Rezeptor betreffen, das Risiko, an einer Opiatabhängigkeit zu erkranken, entscheidend beeinflussen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der Dosisbedarf zur erfolgreichen Aufrechterhaltung einer Methadonsubstitutionstherapie durch diese Polymorphismen beeinflusst wird.
Die vorliegende Studie hat sich die Untersuchung der Auswirkung einer Entnahme
des Fixateur internes nach thorakolumbalen Wirbelkörperfrakturen zur
Aufgabe gemacht.
Dazu wurden 87 Patienten mit einer operativ versorgten thorakolumbalen Wirbelkörperfraktur,
die mindestens 18 Monate zurücklag, untersucht. Die Patienten
wurden entweder rein dorsal mittels Fixateur interne oder kombiniert dorsoventral
versorgt. Unter den kombiniert operierten Patienten befinden sich Patienten,
deren Wirbelkörperfraktur entweder mit einem Knochenspan oder mit
einem Knochenspan in Kombination mit einem ventralen winkelstabilen Plattensystem,
oder mittels Cage behandelt wurde. Die Patienten wurden körperlich
untersucht und aktuelle Computertomogramme wurden ausgewertet. Die Lebensqualität
wurde außerdem mit Hilfe vier international anerkannter Scores
(SF-36, VAS-Wirbelsäulenscore, Oswestry, LBOS) evaluiert. Weitere von uns
erstellte Fragebögen analysierte die Spanentnahme- sowie die Metallentfernungsmorbidität.
Anschließend führten wir eine körperliche Untersuchung, die
unter anderem die Messung des Finger-Boden-Abstands, das Schober- und
Ott-Zeichen, das sensible und motorische Defizit sowie das Bewegungsausmaß
der Patienten umfasste, durch.
Bei der Analyse der radiologischen Daten zeigte sich insgesamt nach der Metallentfernung
eine Zunahme des Korrekturverlustes in Keilwinkel (von 9,5° auf
10,2°) und Grund- Deckplattenwinkel (von 9,8° auf 1 2,7°). Allerdings konnten
keine Zusammenhänge dieser statistisch nicht signifikanten Daten mit der Lebensqualität
oder der körperlichen Untersuchung ermittelt werden.
Bei der Betrachtung der subjektiven Lebensqualität zeigte sich in allen Fragebögen
eine bessere Selbsteinschätzung nach der Metallentfernung. Retrospektiv
würden 71,8% der Patienten mit Metallentfernung diese aufgrund der gesteigerten
Lebensqualität erneut durchführen lassen.
Zusammenfassung
114
Auch die Beweglichkeit der Patienten in den hier durchgeführten Untersuchungen
konnte durch die Metallentfernung gesteigert werden.
Aufgrund der vorliegenden Daten gehen wir von einer Verbesserung der Lebensqualität
des Patienten nach der Entfernung des Fixateur internes aus. Diese
sollte demnach durchgeführt werden, sobald von einer sicheren Heilung der
Fraktur ausgegangen und das Risiko für übermäßige Korrekturverluste als minimal
eingeschätzt werden kann.
Wie lange dieser Heilungsverlauf benötigt und wie die in weiteren Studien mit
noch größerer Patientenzahl untersucht werden.
Bei ventraler Instrumentierung mit Entfernung von Bandscheiben kann nach
Entfernung des Fixateur interne die Beweglichkeit nicht wieder hergestellt werden.
Mit dieser dauerhaften Steifigkeit gehen sekundäre Schäden der angrenzenden
Bandscheiben einher. Um diese zu reduzieren wurde im Rahmen der
Studie der Einsatz von federbaren Cages angedacht, welche die Funktion der
extrahierten Bandscheiben ersetzen sollen. Die Praktikabilität sowie deren Wirkung
sollte in nachfolgenden Studien überprüft werden.
Für eine erfolgreiche Gentherapie ist zunächst ein effizientes Gentransfersystem nötig, das das Transgen in möglichst vielen Zellen einbaut und es aktiv hält. Damit sich dann der Anteil der geschützten Zellen vergrößert, muss eine Selektivität der genmodifizierten Zellen gegenüber den nativen Zellen gegeben sein, wobei die Sicherheit nicht außer Acht gelassen werden darf, da ein ungünstiger Einbau des Transgens eine Insertionsmutagenese und somit Tumoren induzieren kann. Der durch die Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o codiert den membranständigen Fusionsinhibitor maC46 (membran-anchored C-Peptid 46), der den Eintritt von HIV (Human Immunodeficiency Virus) in die Zielzelle effektiv verhindert. Diese Gentherapie mit M87o wurde in einer klinischen Studie an T-Lymphozyten von 10 weit fortgeschrittenen AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)-Patienten durchgeführt, wobei die Therapie gut verträglich war und keine Toxizität zeigte. Allerdings hatten die Patienten auch keinen klaren Vorteil von der Therapie. In der vorliegenden Arbeit wurden SIN Vektoren (Self-inactivating Vektoren) in 5 verschiedenen Konstruktionen getestet, um die optimale Vektordesign zu ermitteln und eine langfristige hohe Expression zu ermöglichen. Da die SIN Vektoren im Vergleich zu konventionellen gammaretroviralen Vektoren ein geringeres Risiko bezüglich der Insertionsmutagenese aufweisen, stellen sie ein sichereres Vektorsystem dar. Um eine bessere Transgenexpression zu erzielen, wurde in den SIN Vektoren entweder ein zellulärer Promotor oder ein viraler SFFV (spleen focus forming virus) als internen Promotor verwendet. Zusätzliche regulatorische Elemente, wie wPRE (Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element), cHS4 (chicken Hypersensitive Site) Insulator und SAR (Scaffold Attachment Region) Element wurden dann in unterschiedlichen Kombinationen zu stärkeren und langanhaltenden Expressionen integriert, wobei wPRE die RNA Prozessierung verbessert und somit die RNA Stabilität erhöht und SAR und cHS4 Insulator dem Silencing entgegenwirken und so die Expression aufrechterhalten. Diese fünf SIN Konfigurationen wurden untereinander und mit dem klassischen gammaretroviralen Vektor M87o bezüglich des Titers, der Expressionsstärke und der Langzeit-Genexpression verglichen. Dazu wurden zunächst humane T-Zelllinien PM-1 und primäre humane T-Zellen als Testzellen verwendet. Die Versuche wurden dann mit murinen T-Zellen wiederholt, die in die immundefiziten Mäuse transplantiert wurden, um die Genexpression in vivo weiter zu verfolgen. Die SIN Konstrukte zeigten jedoch eine deutlich schwächere Expression als die LTR (Long Terminal Repeat)-getriebene Vektoren und nur ein Konstrukt mit dem viralen Promotor und wPRE zeigte eine annähernd so hohe Expression wie die konventionellen Vektoren. Während der virale SFFV Promotor eine höhere Expressionsstärke gegenüber dem zellulären EF1α (Elongationsfaktor 1 alpha) Promotor zeigte, hatte der cHS4 Insulator nur geringfügige Einflüsse sowohl auf den Titer als auch auf die Expressionsstärke. Der Vektor mit dem SAR-Element zeigte zwar die geringsten Titer und Expressionsstärke, aber in Langzeitbeobachtung wies er sowohl in vitro als auch in vivo eine relativ konstante Anzahl von transgenpositiven Zellen auf. SIN Vektoren, in denen mit einer Kombination von wPRE und SAR-Element die RNA Prozessierung verbessert und das methylationsbedingte Silencing verhindert wird, könnten eine weitere Optimierungsmöglichkeit des Gentransfersystems bei der Gentherapie darstellen.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des HIV-Protease-Inhibitors Saquinavir und seines Derivates Saquinavir-NO auf die ABC-Transporter vermittelte Chemoresistenz in Tumorzellen untersucht. Saquinavir-NO zeigte in drei verschiedenen Tumorentitäten stärkere zytotoxische Wirkung als Saquinavir. Weder die Expression der ABC-Transporter MDR1 oder BCRP1 noch der zelluläre p53-Status hatten einen Einfluss auf die Zellsensitivität. MDR1-exprimierende chemoresistente Tumorzellen wurden durch Saquinavir-NO stärker gegen ausgewählte Zytostatika resensitiviert als durch Saquinavir. An chemosensitiven MDR1-negativen Zellen wurden keine Effekte beobachtet. Des Weiteren wurde die Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für MDR1 transduziert. In diesem MDR1-transduzierten Zellmodell wurde die Sensiti-vität gegen das MDR1-Substrat Vincristin durch Saquinavir-NO stärker erhöht als durch Saquinavir. Am Durchflusszytometer wurde der Einfluss von Saquinavir und Saquinavir-NO auf die intrazelluläre Akkumulation des fluoreszierenden MDR1-Substrates Rhodamin 123 untersucht. In MDR1-exprimierenden Zelllinien führte Saquinavir-NO zu einer deutlich stärkeren Akkumulation von Rhodamin 123 als Saquinavir. In MDR1-negativen Zellen wurden keine Effekte beobachtet. Mit Hilfe des MDR1-ATPase-Assays und Wash-Out-Kinetiken am Durchflusszytometer wurde die Frage geklärt, ob Saquinavir und Saquinavir-NO als Substrate oder als allosterische Inhibitoren für MDR1 fungieren. Die Ergebnisse beider Assays lassen den Schluss zu, dass sowohl Saquinavir als auch Saquinavir-NO jeweils ein Substrat für MDR1 darstellen. Um den Einfluss von Saquinavir und Saquinavir-NO auf den ABC-Transporter BCRP1 zu untersuchen, wurde die Neuroblastomzelllinie UKF-NB-3 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für BCRP1 transduziert. Die BCRP1-transduzierten Zellen wurden durch Saquinavir und Saquinavir-NO in vergleichbarem Ausmaß zu dem BCRP1-Substrat Mitoxantron sensibilisiert. Saquinavir-NO ist somit im Vergleich zu Saquinavir der deutlich potentere MDR1-Inhibitor, während beide Substanzen gleichermaßen BCRP1 beeinflussten. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss des MDM2-Inhibitors Nutlin-3 auf die ABC-Transporter-vermittelte Chemoresistenz in Tumorzellen untersucht. Nutlin-3 zeigte aufgrund seiner Funktion als MDM2-Inhibitor an Zellen mit Wildtyp-p53 stark zytotoxische Effekte. An Zellen mit einer p53-Mutation oder an Zellen, die p53-negativ sind, waren diese Effekte nicht zu beobachten. Die Behandlung mit Nutlin-3 führte in p53-Wildtypzellen zur Induktion diverser p53-Zielgene (p21, MDM2, GADD). In Zellen mit mutiertem p53 blieb diese Induktion nach Nutlin-3-Behandlung aus. Chemoresistente MDR1-exprimierende Tumorzellen wurden durch Nutlin-3 stark gegen ausgesuchte Zytostatika resensitiviert. Des Weiteren wurde die chemosensitive, p53-mutierte (Nutlin-3-insensitive) und MDR1-negative Rhabdomyosarkomzelllinie RH30 mit Hilfe lentiviraler Vektoren mit cDNA für MDR1 transduziert. In diesem MDR1-transduzierten Zellmodell wurde die Sensitivität gegen das MDR1-Substrat Vincristin durch Nutlin-3 stark erhöht. Am Durchflusszytomter zeigte sich in MDR1-exprimierenden Zellen durch Behandlung mit Nutlin-3 eine signifikant erhöhte intrazelluläre Akkumulation des fluoreszierenden MDR1-Substrates Rhodamin 123. In MDR1-negativen Zellen wurde dieser Effekt nicht beobachtet. Mit Hilfe des ATPase-Assays und Wash-Out-Kinetiken am Durchflusszytometer wurde die Frage geklärt, ob Nutlin-3 als Substrat oder als allosterischer Inhibitor für MDR1 fungiert. Die Ergebnisse beider Assays lassen den Schluss zu, dass Nutlin-3 ein Substrat für MDR1 darstellt. Nutlin-3 ist ein Racemat und wurde in allen Versuchen als solches verwendet. Das Enantiomer Nutlin-3a hemmt die MDM2-p53-Interaktion als aktives Enantiomer ca. 150-fach stärker als Nutlin-3b. Im letzten Schritt der vorliegenden Arbeit wurde Nutlin-3 in seine Enantiomere Nutlin-3a und Nutlin-3b aufgetrennt und beide Enantiomere wurden im Hinblick auf ihre Wirkung auf MDR1 untersucht. Dabei wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Enantiomeren festgestellt. Nutlin-3a und Nutlin-3b interferieren demnach zu gleichen Teilen mit MDR1. Um den Einfluss von Nutlin-3 auf den ABC-Transporter MRP1 zu untersuchen, wurde mit zwei verschiedenen Zellmodellen gearbeitet. In beiden Zellmodellen zeigte sich, dass Nutlin-3 auch den MRP1-vermittelten Efflux der fluoreszierenden Substrate Rhodamin 123 und Calcein-AM inhibiert. Der Befund, dass Nutlin-3 mit der MDR1- und MRP1 vermittelten Chemoresistenz interferiert, ist neu und eine wichtige Information für die Bewertung der beginnenden klinischen Studien zur Untersuchung von Nutlin-3 als antitumorale Substanz.
Nicht hämolytische Transfusionsreaktionen (NHTR) sind eine häufige Komplikation der Transfusion von Blut und Blutkomponenten. Als Ursachen der NHTR gelten sowohl von Leukozyten freigesetzte Zytokine, die in den Blutkomponenten enthalten sind und während der Herstellung und Lagerung freigesetzt werden, als auch durch HLA-Antikörper verursachte Reaktionen gegen Leukozytenantigene. Im Rahmen eines etablierten Hämovigilanz-Systems werden NHTR dem Blutspendedienst gemeldet. Mit den daraufhin durchgeführten Untersuchungen kann die Ursache der Transfusionsreaktion in vielen Fällen nicht geklärt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die in den 10 Jahren von 1996 – 2006 gemeldeten NHTR systematisch in Bezug auf die Häufigkeit und die festgestellten Ursachen ausgewertet. Insgesamt wurden im o.g. Zeitraum 1595 Transfusionsreaktionen gemeldet, was einer Häufigkeit von 0,05% aller Transfusionen entsprach. Vor Einführung der Leukozytendepletion (2001) waren Erythrozytenkonzentrate – im Untersuchungszeitraum von 1996 – 1998 – signifikant häufiger mit einer NHTR assoziiert (4,09/10.000 Transfusionen) als Thrombozytenkonzentrate (2,64/10.000 Transfusionen) oder gefrorenes Frischplasma (2,05/10.000 Transfusionen). Vermutlich ist diese höhere NHTR-Rate bei Erythrozytenkonzentraten auf die relativ hohe Kontamination mit Leukozyten zurückzuführen. Allerdings ging die Anzahl der nicht hämolytischen Transfusionsreaktionen im Institut Frankfurt insgesamt nach Einführung der Leukozytendepletion nicht zurück. Im Gegenteil war die Häufigkeit nach Einführung der Leukozytenfiltration (5,66/10.000 Transfusionen) sogar höher als vorher (4,43/10.000 Transfusionen). Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass durch die gleichzeitige Einführung der gesetzlich vorgeschriebenen Meldepflicht mehr NHTR gemeldet wurden. Als weitere mögliche Ursachen einer Transfusionsreaktion wurden das in Blutbeuteln vorhandene Allergen Di(-2-ethylhexyl)phtalat (DEHP) und das in Infusionssystemen enthaltene Allergen Toluylen-2,4-diisocyanat (TDI) angesehen. Beide können im Rahmen einer Bluttransfusion den Patienten übertragen werden. Hierzu wurden 154 NHTR auf spezifische IgE-Antikörper gegen Phthalsäureanhydrid und TDI untersucht. In einem Fall konnten spezifische Antikörper gegen Phthalsäureanhydrid (CAP-Klasse 2) und in einem weiteren Fall gegen TDI (CAP-Klasse 2) ermittelt werden. Hieraus konnte jedoch nicht retrospektiv geschlossen werden, dass der jeweils vorliegende Antikörper für die NHTR verantwortlich war. Neben diesen beiden positiv getesteten Fällen wurden zusätzlich ausgewählte Transfusionsempfänger mit einer frischen und nicht geklärten NHTR (n = 12) in vitro mit verschiedenen Konzentrationen von DEHP und TDI restimuliert. In keinem der Fälle führte die Restimulation mit DEHP und TDI zu einer Degranulation basophiler Granulozyten als Ausdruck einer allergischen Reaktion. Eine allergische Reaktion von Transfusionsempfängern gegen in Beuteln oder Transfusionsbestecken enthaltenes DEHP oder TDI kann somit zwar nicht sicher ausgeschlossen werden, scheint aber als Ursache für bisher ungeklärte NHTR keine signifikante Rolle zu spielen.
Die Nierentransplantation ist die Therapie der Wahl bei terminaler Niereninsuffizienz. Alle anderen Nierenersatzverfahren (chron. intermittierende Hämodialyse oder Bauchfelldialyse) reichen nicht an die Effizienz und den Komfort einer Transplantatniere heran. Trotz allem stellen verzögerte Funktionsaufnahme (delayed graft function, DGF), Abstoßungen und begrenzte Funktionsdauer heute noch Probleme der Nierentransplantation dar. Interleukin-18, ein wichtiger Mediator der angeborenen und erworbenen Immunantwort und zugleich ein Zytokin, das bei Ischämie-Reperfusionsschaden und akutem Nierenversagen vermehrt ausgeschüttet wird, könnte in diesem Zusammenhang von Bedeutung sein. Bekannt ist, dass zwei Promotorpolymorphismen (-607C/A und -137G/C) die Blutspiegel von Interleukin-18 beeinflussen können. Ziel dieser Dissertation ist es, den Einfluss der Interleukin-18- Genotypen auf die Prädisposition zu Nierenerkrankungen bzw. bestimmte Grunderkrankungen bei terminaler Niereninsuffizienz zu untersuchen. Außerdem wurde vor allem der Einfluss der Interleukin-18 Polymorphismen auf den Transplantationserfolg überprüft, gemessen an DGF, Transplantatüberleben und Patientenüberleben. Zu diesem Zweck wurden bei 233 Nierentransplantierten und bei 222 nierengesunden Organspendern die IL-18 Genotypen bestimmt. Zudem wurden die benötigten klinischen Daten aus den Krankenakten der Patienten entnommen und anschließend mittels statistischer Verfahren mit den Genvarianten in Korrelation gesetzt. Zwar war die Verteilung der Genotypen zwischen Transplantierten und Nierengesunden nicht unterschiedlich, wir konnten jedoch zeigen, dass das -137C-Allel bzgl. Autoimmunerkrankungen prädisponierend wirkt, aber hinsichtlich der diabetischen Nephropathie einen protektiven Einfluss hat. Im Falle des SNP -607C/A erwiesen sich das C-Allel hinsichtlich Autoimmunerkrankungen und das AAllel bzgl. diabetischer Nephropathie als schützend. Es stellte sich weiterhin heraus, dass der Wildtyp des IL-18 SNP’s (-607CC/-137GG) vor einer verzögerten Funktionsaufnahme des Transplantats (DGF) bewahrt. Ein direkter Einfluss der Polymorphismen auf die Langzeitfunktion des Transplantats konnte nicht nachgewiesen werden. Patienten mit DGF zeigten aber auch noch in den ersten drei Jahren nach der Transplantation eine deutlich schlechtere Nierenfunktion als Transplantierte mit unproblematischem postoperativem Verlauf. Obwohl sich die Nierenfunktion der DGF- und Nicht-DGF-Patienten nach drei Jahren wieder einander anglich, waren Patienten, deren Transplantat die Funktion verzögert aufnahm, einem höheren Mortalitätsrisiko ausgesetzt und verstarben durchschnittlich früher als die Vergleichsgruppe mit sofortigem Funktionsbeginn, wobei die Nicht-DGF-Patienten bei Transplantation durchschnittlich etwas jünger waren. Dies zeigt deutlich die Relevanz dieser frühen Phase für den Langzeitverlauf und die Bedeutung der IL-18-Genotypisierung, mit deren Hilfe man für DGF prädisponierte Patienten frühzeitig erkennen und spezifisch behandeln könnte, um so deren Prognose günstig zu beeinflussen. Weitere prospektive Studien sind aber nötig, um die gewonnenen Erkenntnisse zu sichern und so den Erfolg einer Nierentransplantation und damit die Lebensqualität der Patienten weiter zu verbessern.
Synthese und Optimierung von Nitroxyl-Spin-Labeln zur Analyse von Nukleinsäuren mittels EPR und NMR
(2010)
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Einsatz der Nitroxyl-Spin-Markierung für die Strukturaufklärung von Oligonukleotiden getestet. Dafür wurden im Vorfeld verschiedene Spin-Label synthetisiert und charakterisiert. Bei den Nitroxiden handelt es sich hierbei um das Spin-Label TPA (2,2,5,5-Tetramethyl-pyrrolin-1-oxyl-3-acetylene) und TEMPA (2,2,6,6-Tetramethyl-3,4-dehydro-piperidin-N-oxyl-4-acetylene). Beide Spin-Label wurden auch als deuteriert und 15N-markiert synthetisiert. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen auf dem Gebiet der Modell-Systeme und Modell-RNAs wurden biologisch relevante und strukturell anspruchsvolle Oligonukleinsäuren untersucht. Dabei konnten DNA-RNA-Hybride, die HCV-IRES Domain II, ein Tetra-Loop, das Neomycin-B Aptamer, das Diels-Alder Ribozym und ein Nep1-RNA-Komplex charakterisiert werden. Die Einführung des Spin-Labels erfolgte noch auf der Festphase mittels der Sonogashira-Kreuz-Kupplungs Reaktion.
Hintergrund und Problemstellung: Viele vermeidbare Medikamentennebenwirkungen bei älteren Patienten haben ihre Ursache in der fehlenden Dosisanpassung bei Niereninsuffizienz. Beim Patienten über 65 Jahre liegen die Serumkreatininwerte oft noch im Normbereich, während die tatsächliche Nierenfunktion schon deutlich beeinträchtigt ist. Eine genauere Beurteilung der Nierenfunktion ist mit der Berechnung der glomerulären Filtrationsrate möglich. In der vorliegenden Untersuchung wurde in einer Praxisgemeinschaft einer hausärztlich tätigen Internistin und einer Fachärztin für Allgemeinmedizin in Frankfurt retrospektiv exploriert, ob niereninsuffiziente Patienten als solche erkannt wurden und wenn ja, ob sie dosisadaptiert mit Medikamenten versorgt wurden, bzw. in wie vielen Fällen sie fehlerhafte Verordnungen erhielten. Methode: Eine Zielpopulation von 100 Patienten mit moderater bis schwerer Nierenfunktionseinschränkung (Kreatinin-Clearance von 60 oder kleiner) wurde retrospektiv hinsichtlich der verordneten Medikation untersucht. Dabei wurde die glomeruläre Filtrationsrate mittels Cockroft-Gault-Formel errechnet. Bei nierensensiblen Substanzen wurde die in der Fachinformation empfohlene Dosis mit der tatsächlich verordneten Dosis verglichen. Ergebnisse: Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass von 232 auswertbaren Patienten 102 eine errechnete Kreatinin-Clearance von weniger als 60 ml/min aufwiesen, obwohl bei 48 Patienten der Serumkreatininlevel noch im Normbereich lag. Eine Dosisanpassung wegen Niereninsuffizienz war bei 261 von 613 Verordnungen erforderlich und wurde in 189 Fällen wie empfohlen umgesetzt. In 72 Fällen (27%) wurde sie nicht korrekt durchgeführt. Hier wurde die Dosis 32 mal nicht angepasst, 40 mal wurde trotz Kontraindikation verordnet. Das Risiko einer Fehlverordnung war signifikant assoziiert mit dem Vorliegen einer schweren Nierenfunktionsstörung (GFR < 30ml/min). Mit dem Vorliegen eines normalen Serumkreatininwerts waren keine signifikanten Assoziationen nachweisbar. Die Substanzen Metformin, Ramipril, Enalapril, HCT, Spironolacton und Simvastatin machten den Hauptanteil der Fehlverordnungen im Bereich der Dauermedikation aus. Bei den temporären Verordnungen waren im Schwerpunkt Antibiotika (Cefuroxim, Cefpodoxim, Levofloxacin) und Antiphlogistika (Diclofenac, Ibuprofen) betroffen. Schlussfolgerung: In einer durchschnittlichen Hausarztpraxis kommen in signifikanten Maße Fehlverordnungen vor. Die Gründe hierfür sind vielfältig. Insbesondere das Verschreibungsverhalten von Hausärzten hat eine zentrale Bedeutung für die Patientensicherheit bei Medikamentenverordnung und sollte unbedingt Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Die Genexpression in prokaryotischen Organismen unterliegt einer Vielzahl von Regulationsmechanismen, deren Aufgabe darin besteht, die Zelle an sich ändernde Umweltbedingungen anzupassen, um so das Überleben des prokaryotischen Organismus zu gewährleisten. Eine Reihe von Hitzeschock- und Virulenzgenen unterliegen temperaturabhängiger Regulation, mit dem Ziel, die Zelle an die sich ändernde Umgebung anzupassen. Die Messung der Temperatur erfolgt dabei über temperatursensitive RNA-Elemente, sogenannte RNA-Thermometer, die sich üblicherweise in der 5’-untranslatierten Region der Gene befinden, die sie regulieren. Sie unterdrücken die Translationsinitiation, indem sie die Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz bei niedrigen Temperaturen über Basenpaarung blockieren und dadurch die Bindung des Ribosoms verhindern. In Kapitel 2 der vorliegenden Arbeit wurde die thermodynamische Stabilität der temperatursensitiven Haarnadelschleife 2 des Salmonella FourU RNA-Thermometers über einen breiten Temperaturbereich analysiert. Freie Enthalpie-, Enthalpie- und Entropie-Werte für die Basenpaaröffnung der einzelnen Nukleobasen innerhalb der RNA wurden über die temperaturabhängige Messung von Iminoprotonen-Austauschraten mittels NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Austauschraten wurden für die Wildtyp-RNA und die A8C-Mutante bestimmt und miteinander verglichen. Es zeigte sich, dass die Wildtyp-RNA durch das außergewöhnlich stabile Basenpaar G14-C25 stabilisiert wird. Dies konnte durch die Untersuchung der Entfaltung der destabilisierenden G14A-C25U-Doppelmutante verifiziert werden. Über CD-spektroskopsiche Untersuchungen konnte der globale Entfaltungsübergang der jeweiligen RNA analysiert werden. Das Mismatch-Basenpaar innerhalb des Wildtyp-RNA-Thermometers (A8-G31) erwies sich als Ursache für die geringere Kooperativität des Entfaltungsübergangs der Wildtyp-RNA im Vergleich zur A8C-Mutante. Enthalpie- und Entropie-Werte für die Basenpaaröffnung einzelner Nukleotide sind für beide RNAs linear korreliert. Die Steigungen dieser Korrelationen stimmen mit den Schmelzpunkten der RNAs überein, die über CD-Spektroskopie bestimmt wurden. Entfaltung der RNA tritt also genau dann auf, wenn alle Nukleotide gleiche thermodynamische Stabilitäten besitzen. Die Resultate sind mit einem Reißverschluss-Mechanismus für die RNA-Helix Entfaltung konsistent und erklärbar, in dem die Stapelinteraktionen der benachbarten Nukleobasen innerhalb der RNA-Helix verantwortlich für die beobachtete Kooperativität sind. Die Ergebnisse weisen auch auf die Wichtigkeit der RNA-Lösungsmittel-Interaktion für die Stabilität der RNA-Struktur hin. So konnten langreichweitige Wechselwirkungen der A8C-Mutation auf die Stabilität der G14-Nukleobase identifiziert werden, die möglicherweise über die Hydrathülle der RNA vermittelt werden. Schließlich konnte für das FourU-Motiv eine Mg2+-Bindestelle identifiziert werden, die die temperaturabhängige Stabilität des RNA-Thermometers beeinflusst. Es besteht also die Möglichkeit, dass Änderungen der intrazellulären Mg2+-Konzentration die Expression des agsA-Gens in vivo modulierend beeinflussen. In Kapitel 3 dieser Arbeit wurden die dynamischen Eigenschaften des Phosphodiesterrückgrats einer perdeuterierten cUUCGg-Tetraloop-14mer-RNA untersucht. Dazu wurden die Relaxationseigenschaften aller 31P-Kerne dieser RNA bei magnetischen Feldstärken von 300, 600 und 900 MHz untersucht. Dipolare Relaxationsbeiträge konnten unterdrückt werden, indem eine perdeuterierte RNA-Probe in einem D2O-Puffer verwendet wurde. Um die 31P-Relaxationsdaten (R1, R2) interpretieren zu können, wurde zusätzlich mittels Festkörper-NMR die Chemische Verschiebungsanisotropie (CSA) der 31P-Kerne des Phosphodiesterrückgrats bestimmt. Die Messungen wurden bei verschiedenen Salzkonzentrationen und unter unterschiedlichen Hydratationsbedingungen durchgeführt. Aus den Daten konnte ein 31P-CSA-Wert von 178.5 ppm im statischen Zustand (S2 = 1) bestimmt werden. Auf der Grundlage der durchgeführten R1- und R2-Messungen wurde eine Modelfree-Analyse durchgeführt, um Informationen über die schnellen Dynamiken des Phosphodiesterrückgrats zu erhalten. Die Resultate zeigen, dass die Dynamiken des Phosphodiesterrückgrats auf der Subnanosekundenzeitskala stärker ausgeprägt sind als die Dynamiken der Ribofuranosylreste und der Nukleobasen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Dynamik einer individuellen Phosphatgruppe zu der jeweiligen 5’-benachbarten Nukleobase korreliert ist. In Kapitel 4 dieser Arbeit wird die Entwicklung neuer Methoden beschrieben, mit denen Torsionswinkelinformation aus der Analyse kreuzkorrelierter Relaxationsraten gewonnen werden können. Im ersten Teil des Kapitels wird die Entwicklung einer neuen NMR-Pulssequenz beschrieben, über die der glykosidische Torsionswinkel Chi in 13C,15N-markierten Oligonukleotiden bestimmt werden kann. Mit dem neuen quantitativen Gamma-HCNCH-Experiment ist es möglich, die dipolaren kreuzkorrelierten Relaxationsraten Gamma-C6H6-C1´H1´ (Pyrimidine) und Gamma-C6H6-C1´H1´ (Purine) zu messen. Die kreuzkorrelierten Relaxationsraten wurden an einer 13C,15N-markierten cUUCGg-Tetraloop-14mer-RNA bestimmt. Die aus den Raten extrahierten Chi-Winkel wurden mit bereits vorhandener Strukturinformation verglichen. Sie stimmen bemerkenswert gut mit den Winkeln der Kristallstruktur des Tetraloops überein. Zusätzlich wurde die neue Methode an einer größeren 30mer-RNA, dem „Stemloop D“ (SLD) aus dem Coxsackievirus-B3-Kleeblatt, getestet. Für die SLD-RNA wurde der Effekt von anisotroper Rotationsdiffusion auf die Relaxationsraten untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Chi-Winkelbestimmung besonders für Nukleotide in der anti-Konformation sehr genau ist und die Methode eine eindeutige Unterscheidung von syn- und anti-Konformation zulässt. Im zweiten Teil von Kapitel 4 wird die Entwicklung des Gamma-HCCCH-Experiments beschrieben. Hierbei handelt es sich um eine neue NMR-Pulssequenz zur Messung der Gamma-C1´H1´-C3´H3´-Rate in 13C-markierten RNAs. Die Funktionsfähigkeit der neuen Methode wurde an einer cUUCGg-Tetraloop-14mer-RNA demonstriert. Zusätzlich dazu wurden die analytischen Gamma-C1´H1´-C3´H3´(P,nü_max)-, Gamma-C1´H1´-C4´H4´(P,nü_max)- und Gamma-C2´H2´-C4´H4´(P,nü_max)-Abhängigkeiten mathematisch hergeleitet. Die an der 14mer-RNA gemessenen Gamma-C1´H1´-C3´H3´-Raten wurden mit Hilfe der Gamma-C1´H1´-C3´H3´(P,nü_max)-Beziehung analysiert. Die Ergebnisse für die Pseudorotationsphase P sind konsistent mit Referenzwinkeln aus der 14mer-NMR-Struktur und den bereits bekannten (Gamma-C1´H1´-C2´H2´)/(Gamma-C3´H3´-C4´H4´)-Ratenverhältnissen. Die neue Methode liefert zusätzliche Informationen, um Konformation (P, nü_max) und Dynamik S2(C1´H1´-C3´H3´) der Ribosereste in RNA-Molekülen genauer beschreiben zu können. In Kapitel 5 dieser Arbeit wird die Entwicklung des 3D-HNHC-Experiments, einer neuen NMR-Pulssequenz, beschrieben. Dieses Experiment ermöglicht es, die H2-, C2- und N1-Resonanzen in Adenin-Nukleobasen 13C, 15N-markierter RNA-Oligonukleotide miteinander zu korrelieren. Die Funktionsfähigkeit der neuen Methode wurde an einer mittelgroßen, entsprechend markierten 36mer-RNA demonstriert. Die neue Methode vereinfacht die Zuordnung der Kerne der Adenin-Nukleobasen, da Zuordnungsmehrdeutigkeiten aufgrund überlappender Resonanzen in der 1H-Dimension aufgelöst werden können. In Kombination mit dem TROSY-relayed-HCCH-COSY-Experiment liefert das neue 3D-HNHC-Experiment das fehlende Glied für die Zuordnung der Imino-H3-Resonanzen der Uracil-Nukleobasen über das AU-Basenpaar hinweg zu den H8-Resonanzen der Adenin-Nukleobasen.
Diese Dissertation befasst sich mit der massenspektrometrischen Analytik von Membranproteinen. Diese gestaltet sich aufgrund der hydrophoben Natur der Proteine und der damit verbundenen schlechten Löslichkeit in wässrigen Puffersystemen als deutlich schwieriger als die Untersuchung löslicher Proteine. Einige weitere Probleme entstehen durch die konsequente Verwendung der Referenzprotease Trypsin zur Hydrolyse der Proteine. Sie spaltet ausschließlich Peptidbindungen nach basischen Aminosäuren, die naturgemäß in den unpolaren Helixbereichen der Membranproteine nur vereinzelt anzutreffen sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden auf weniger spezifischen Proteasen basierende Protokolle zur Analyse von ganzen Membranproteomen entwickelt, welche einige der ursprünglichen Probleme umgehen oder zumindest vermindern. Die Proteolysereaktion fand in Anwesenheit von Methanol statt, welcher die Membranstruktur destabilisiert und so die Zugänglichkeit der in die Membran eingebetteten Proteinteile für das Enzym erhöht. Zusätzlich erhöhte sich dadurch die Löslichkeit gebildeter hydrophober Peptide im Puffer. Das neue Protokoll wurde an Bacteriorhodopsin, einem geläufigen Modellsystem für α helikale Membranproteine, erfolgreich etabliert. Bei Verwendung der Proteasen Elastase und Pepsin konnten nach nLC-Trennung und MALDI-MS/MS deutlich mehr Peptide des Membranproteins signifikant identifiziert werden, als es mit Trypsin möglich gewesen ist. Auch qualitativ ergaben sich Unterschiede zwischen beiden Enzymen. Mit den alternativen Enzymen ließen sich nicht nur die hydrophilen peripheren Proteinabschnitte nachweisen, sondern auch zahlreiche Peptide aus den hydrophoben Transmembranbereichen. Das am Modellprotein etablierte Elastase-Protokoll konnte problemlos auf die Analyse des komplexeren Membranproteoms von Corynebacterium glutamicum transferiert werden. So konnten ca. 150 verschiedene Proteine identifiziert werden, darunter auch zahlreiche Membranproteine. Die erzeugten Peptidmischungen wurden nicht nur mittels nLC-MALDI-TOF/TOF sondern auch mit einer nLC-ESI-Orbitrap-Plattform analysiert. Anhand einer detaillierten Analyse der physikochemischen Eigenschaften der entstandenen Peptide konnte gezeigt werden, dass der dabei beobachtete Vorteil des ESI-Instrumentes zu großen Teilen auf die bessere Detektion aliphatischer Neutralpeptide zurückzuführen war. Diese werden bei der MALDI vornehmlich aufgrund der schlechteren Ionisation bei Verwendung der Standardmatrix α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure diskriminiert. Ein weiterer Vorteil des verwendeten ESI-Gerätes ist seine bessere Massengenauigkeit durch den hochauflösenden Orbitrap-Massenanlysator. Wurden die MALDI-TOF/TOF-Fragmentierungsdaten durch, auf einem zweiten Instrument gemessene, genaue MALDI-Orbitrap-Vorläufermassen supplementiert, konnten über 30% mehr Peptide signifikant identifiziert werden. Die gesammelten Daten konnten zur Erhebung einiger Statistiken über Elastase und Pepsin herangezogen werden. Erstmals wurde eine umfassende Untersuchung der Spaltspezifität von Elastase vorgenommen. Das Enzym hydrolysiert in ca. 82% der Fälle nach den kleinen hydrophoben Aminosäuren Ala, Val, Ile, Leu, Ser und Thr. Diese Spezifität ist für proteolytische Schnitte innerhalb der hydrophoben Helixbereiche von Membranproteinen äußerst vorteilhaft. Sie reicht aus, um Peptide Mass Fingerprinting an Einzelproteinen durchzuführen, wie exemplarisch am Modellprotein Bacteriorhodopsin gezeigt wurde. Die für Pepsin erhaltene Spezifität ist hingegen zu undifferenziert für solche Experimente, weshalb hier MS/MS-basierte Strategien vorzuziehen sind. Weitergehende Verbesserungen für Datenbanksuchen mit weniger spezifischen Proteasen wurden vorgeschlagen. Hierzu wurde erstmals eine größere Fragmentierungsstatistik eines nichttryptischen Datensatzes auf einem MALDI-Instrument erstellt, deren Aussage zur Verifizierung von Suchergebnissen in die Algorithmen implementiert werden kann. Beim Einsatz weniger spezifischer Proteasen erhöht sich im Vergleich zu Trypsin die entstehende Peptidkomplexität. Zur Kompensation dessen wurde eine Fraktionierung mittels Off-gel IEF vor der nLC-MALDI-Analyse etabliert. Zwecks direkter Kompatibilität zur nLC wurde ein Off-gel IEF-Protokoll ohne die Probeninjektion störendes Glycerol entwickelt. So ließ sich die dreifache Menge an Peptiden nachweisen, als mit ausschließlich eindimensionaler nLC-Trennung. In Verbindung mit den durch Trypsin erzielbaren Resultaten lassen sich mit den weniger spezifischen Enzymen viele Membranproteine umfassender charakterisieren, da zusätzlich die hydrophoben Transmembranbereiche und somit mehr Informationen für die Analytik zugänglich sind. Der gezielte Einsatz von alternativen Enzymen verbessert die momentane Situation in der Membranproteom-Analytik deutlich und führt diese einen weiteren Schritt an die Analytik löslicher Proteine heran.
Selektive COX-2-Inhibitoren wie Rofecoxib und Celecoxib haben sich im klinischen Alltag bewährt, da sie im Gegensatz zu den herkömmlichen NSAIDs wie ASS oder Ibuprofen weniger gastrointestinale Komplikationen verursachen. Jedoch wurde in klinischen Studien ein erhöhtes Risiko für das Entstehen kardiovaskulärer Ereignisse nachgewiesen, was zur Stigmatisierung der selektiven COX-2 Inhibitoren und zu einer strengenIndikationstellung von Celecoxib führte. Verschiedene Studien, welche den - 765G>C SNP des PTGS2-Promotorgens untersuchten, kamen zu konträren Ergebnissen. Einerseits wurde bei Trägern des SNP eine verminderte COX-2- Proteinexpression und im Rahmen dieser Studie ein protektiver Effekt für das Entstehen kardiovaskulärer Ereignisse atherosklerotischer Genese beschrieben. Andererseits gab es Ergebnisse klinischer Studien, die bei Trägern des SNP eine erhöhte COX-2-Expression zeigten. Das Ziel der Studie war es herauszufinden, ob bei Trägern der Mutation nach COX-2-Inhibition durch Celecoxib verglichen mit Trägern der Wildtypvariante ein erhöhter, verminderter oder kein Effekt auf Prostaglandinsynthese, COX-2-Proteinexpression und COX-2-mRNA-Expression zu beobachten ist. Je 10 gesunde homozygote Träger des PTGS2 -765GG-Genotyps sowie des PTGS2 -765CC-Genotyps erhielten 200 mg Celecoxib per os, nachdem Einflüsse der COX-1 auf die Prostaglandinsynthese 24 Stunden zuvor mit der Einnahme von 500 mg ASS ausgeschlossen wurden. Blutproben wurden vor der Applikation (Referenzwert) sowie 1,3,6,9 und 24 Stunden nach der Applikation entnommen. Mittels LC-MS/MS wurden die Plasmakonzentrationen von Celecoxib sowie die ex vivo PGE2-Produktion von LPS-stimulierten Monozyten des peripheren Blutes gemessen. m-RNA Expression des COX-2-Gens wurde mit real-time quantitativer PCR gemessen. Mithilfe von Western Blot-Analysen wurde die COX-2-Expression dargestellt. Ex vivo Stimulation der Blutproben führte zu einem statistisch signifikantem Anstieg der PGE2-Produktion (P<0,001) ohne Inhibition durch Celecoxib. In Anwesenheit von Celecoxib kam es zu einer reduzierten PGE2-Produktion (von 19,3±7,2 ng/ml vor Applikation [Referenzwert] zu 7,4±4,8 ng/ml nach 1 Stunde; P<0,001), welche bis 9 Stunden nach Applikation statistisch signifikant bestehen blieb (P 0,001). Celecoxib inhibierte die PGE2-Produktion (EC 50%) bei einer Konzentration von 155,1 ng/ml bei Trägern der homozygoten Wildtypvariante sowie bei einer Konzentration von 186,6 ng/ml bei Trägern der homozygoten Allelvariante, was statistisch nicht signifikant war (P=0,36). Die Referenzwerte der PGE2-Produktion sowie die AUCs der PGE2-Konzentration in Bezug zur Zeit, ähnelten sich zwischen den Genotypen (P>0,28). LPS führte zu einer Hochregulation der COX-2 mRNAExpression (P=0,016), was jedoch unabhängig vom Genotyp war. Die COX-2-Proteinexpression zeigte bei beiden Genotypen keinen Unterschied (P=0,63). Ein Unterschied zwischen den Genotypen konnte weder auf Ebene der Prostaglandinproduktion ex vivo, noch auf Ebene der COX-2-Proteinexpression und mRNA-Expression nachgewiesen werden. Das Resultat dieser Studie steht weder zu den Ergebnissen der einen, noch zu den Ergebnissen der anderen Seite in komplettem Kontrast. Dass zur Zeit ungenügende Wissen über die Rolle der PTGS2-Mutationen ist vielmehr Ausdruck dieser konträren Studienergebnisse.
Mitte des 19. Jahrhunderts demonstrierte John Snow anhand differenzierter Beobachtungen zur Cholera in London, wie epidemiologisches Wissen und gezielte Maßnahmen zur Bewältigung öffentlicher Gesundheitsprobleme beitragen können. Rund 150 Jahre später sieht sich die Bevölkerung einem stetig wachsenden globalen Güter- und Personenverkehr gegenüber, welcher auch Krankheitserregern eine interkontinentale Ausbreitung innerhalb weniger Stunden ermöglicht, wie eindrucksvoll am Beispiel SARS im Jahre 2003 deutlich wurde. Nationale Beispiele, allen voran die Salmonellen-Epidemie in Fulda im Jahre 2007, zeigen, welche bedeutungsvolle Rolle die Infektionsepidemiologie und die -hygiene auch im 21. Jahrhundert einnimmt. Das frühzeitige Erkennen und ein effizientes Eingreifen durch die Öffentlichen Gesundheitsbehörden sind zur Eindämmung einer Epidemie unabdingbar. Die Verknüpfung medizinischer und geographischer Daten kann Beides wesentlich beschleunigen und ermöglicht die frühzeitige Erkennung eskalierender Infektionsherde. Ziel der vorliegenden Pilotstudie ist die Entwicklung einer Schnittstelle zur Implementierung und Analyse meldepflichtiger Infektionskrankheiten in einem geomedizinischen Informationssystem. Erstmals im Öffentlichen Gesundheitsdienst wird diese Verknüpfung technisch mittels eines Geoinformationssystems realisiert, welches die Georeferenzierung mithilfe von Regionalidentifikationsnummern und der anschließende Visualisierung der im Gesundheitsamt anfallenden krankheitsbezogenen Daten ermöglicht. Der Datentransfer von dem im Amt für Gesundheit genutzten Datenbankprogramm Gumax® zu dem im Vermessungsamt der Stadt Frankfurt am Main probaten Geoinformationssystem Office-GIS gelingt über einen SQL-Server, einem Datenbankmanagementsystem, welches das Speichern, Bearbeiten und Analysieren vergleichsweise großer Datenmengen ermöglicht. Anschließend können Meldeort und Wohnort des an einer nach §§ 6, 7 IfSG meldepflichtigen Infektionserkrankung Erkrankten in der Stadtplan-, Liegenschaftskarte oder Luftbildaufnahme visualisiert werden. Hierüber lassen sich zudem personen- und objektbezogene Krankheitsquellen (z. B. Restaurant, Schule, Kindergarten, Krankenhaus) eruieren. Diese Daten können effizient genutzt werden, um schnell und dezidiert in ein Krankheitsgeschehen eindämmend eingreifen zu können. Mit diesem System könnten auch bioterroristische Anschläge wesentlich schneller erkannt werden, da die Ausbreitungsmodalitäten beispielsweise vom verwendeten Agens, meteorologischen, tageszeitlichen und demographischen Gegebenheiten abhängen. Diesen zusätzlichen Größen soll in erweiterten technischen Realisationen dieses Systems Rechnung getragen werden.
Das Neuroblastom ist ein Tumor, der sich von sympathoadrenergen Vorläuferzellen ableitet und die häufigste solide Krebsform im Kindesalter darstellt. Das breite klinische Spektrum dieses Tumors, das von spontaner Regression zu fataler Progression reicht, spiegelt die außerordentliche biologische und genetische Heterogenität dieses Tumors wider. Polyploidie und Genexpressionsanalysen werden auf klinischer Seite zur Risiko- und Therapieeinschätzung eingesetzt. Genomweite Screeninganalysen identifizierten den Transkriptionsfaktor Phox2b als erstes Prädispositionsgen für NB. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Phox2b absolut essentiell für die Entstehung aller Ganglien des autonomen NS aus Neuralleistenzellen ist. Ziel der Untersuchungen dieser Arbeit war es, die Auswirkungen der NB-assoziierten Phox2b-Mutationen auf Proliferations- und Differenzierungsverhalten sympathoadrenerger Vorläuferzellen zu untersuchen. Hierzu wurden paravertebrale, sympathische Grenzstränge aus Huhnembryonen des Embryonaltags 7 präpariert, dissoziiert und mit Expressionsplasmiden für Phox2bwt und NB-Phox2b-Mutationen transfiziert. Nach zwei Tagen in Kultur wurden mit molekularbiologische Methoden Veränderungen des Proliferations-und Differenzierungsverhalten untersucht. Die Analyse des Proliferationsverhaltens transfizierter Neurone mit BrdU-Proliferationsassays und Phospho-Histon-3-Antikörpern offenbarte einen stark antiproliferativen Effekt des Phox2bwt-Proteins, den die untersuchten NB-Phox2b-Mutationen nicht aufwiesen. NB-Phox2b-Patienten sind heterozygot, d.h. Träger eines gesunden und eines mutierten Phox2b-Allels. Um die genetische Situation im NB-Patienten nachzuahmen, wurde mit spezifischen siRNAs das endogene Phox2b-Protein-Niveau herunter reguliert. NB-Phox2b-Mutationen mit mis- oder nonsense Mutation in der Homöodomäne zeigten unter Phox2b-Knockdown-Bedingungen einen proliferationsstimulierenden Effekt. Diese Experimente warfen die Frage auf, über welche Mechanismen Phox2b und NB-Phox2b-Mutationen Einfluss auf die Zellzykluskontrolle nehmen. Die quantitative Analyse der Expression bekannter Zellzyklusregulatoren wie Zyklin D1, D2 und D3 und der Zyklin-abhängigen Kinase-Inhibitoren p18, p21 und p57kip2 verlief ergebnislos. Die Überexpression des Zyklin-abhängigen Kinase-Inhibitors p27kip1 wirkte antiproliferativ auf Kulturen sympathoadrenerger Vorläuferzellen und das p27kip1-Epxressionsniveau korrelierte mit dem Phox2b-Proteinniveau. P27kip1 scheidet jedoch als alleiniger Vermittler des antiproliferativen Effekts von Phox2b aus, da die ebenfalls antiproliferativ wirkende Phox2-Homöodomäne keinen Einfluss auf das p27kip1-Expressionsniveau besitzt. Vielmehr wurde der bHLH-Transkriptionsfaktor Hand2 als Mediator der Proliferationseffekte von Phox2b identifiziert. Die Proliferation sympathoadrenerger Vorläuferzellen ist abhängig von der Hand2-Proteinmenge, und Hand2-Überexpression ist ausreichend, den antiproliferativen Effekt von Phox2b aufzuheben. Damit im Einklang geht der proliferationsstimulierende Effekt der Phox2bHDmut bei siRNA-vermitteltem Hand2-Knockdown verloren. Weiterhin führt Phox2b-Überexpression zu verringertem Hand2-Expressionsniveau und Phox2b-Knockdown zu vermehrter Hand2-Transkription. In Protein-Protein-Interaktionsexperimenten konnte eine direkte Bindung von Hand2 an Phox2bwt und die untersuchten NB-Phox2b-Mutanten nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Hand2 in der Vermittlung der Phox2b-Proliferationseffekte auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene involviert ist. Der Wirkungsmechanismus dieser Phox2b-Varianten / Hand2-Komplexe konnte nicht endgültig geklärt werden und wird in Form verschiedener Modelle diskutiert. In NB-Patienten korreliert ein hohes Expressionsniveau von Differenzierungsmarkern mit mildem Krankheitsverlauf. Die Rolle von Phox2b als Schlüsselgen in der Entstehung und Differenzierung autonomer Neurone und die genetische Heterogenität des NB legen eine Funktion von NB-Phox2b-Mutationen auf den Differenzierungsstatus sympathoadrenerger Vorläuferzellen nahe. In quantitativen Analysen wurde die Expression von Phox2b-Zielgenen und in NB-Diagnostik involvierten Genen untersucht. Phox2bK155X, eine C-terminal trunkierte NB-Phox2b-Mutation, wirkte dominant-negativ auf die Expression der noradrenergen Markergene Th und Dbh, Tlx3 und die Neurotrophinrezeptoren trkA und p75, deren reduzierte Expression mit schlechter Prognose und damit aggressiven NB-Formen korreliert ist. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, das NB-Phox2b-Mutationen in sympathoadrenergen Vorläuferzellen, den potentiellen Tumorentstehungszellen des NB, proliferationsstimulierend wirken und zumindest die C-terminal trunkierte Phox2bK155X-Mutation zur Dedifferenzierung dieser Zellen führt. Hereditäre Mutationen in Phox2b könnten im Patienten nicht nur die terminale Differenzierung sympathischer Neurone stören, sondern auch durch eine verlängerte Phase der Neurogenese die Empfänglichkeit für weitere Tumor-initiierende Mutation erhöhen.
Die chronische Hepatitis C Virus-Infektion ist eine der häufigsten Ursachen für Leberzirrhose und das hepatozelluläre Karzinom. CD81 ist ein Oberflächenprotein aus der Familie der Tetraspanine, welches auf Hepatozyten und Lymphozyten exprimiert ist. CD81 interagiert mit dem Hepatitis C Virus-Hüllprotein E2. Die Interaktion ist essentiell für die Infektion von Hepatozyten durch das Hepatitis C Virus und beteiligt an der Hepatitis C Virus assoziierten Immunmodulation, welche in Zusammenhang mit der Chronifizierung und dem Auftreten von autoimmunologischen Phänomenen steht. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass CD81 von Lymphozyten sezerniert werden kann. Die Bedeutung der CD81-Serumkonzentration wurde bislang nicht untersucht. Um neue Erkenntnisse über die Rolle von CD81 innerhalb der Pathogenese der chronischen Hepatitis C zu erlangen, wurde in der vorliegenden Arbeit die CD81-Serumkonzentration bei Patienten mit chronischer Hepatitis C untersucht. Nach Anreicherung von CD81 mittels differentieller Zentrifugation konnte durch Anwendung des Western Blot-Verfahrens gezeigt werden, dass CD81 im Serum bei Patienten mit chronischer Hepatitis C im Vergleich zu gesunden Probanden signifikant erhöht ist (p = 0,001). Im Hinblick auf die CD81-vermittelte Immunmodulation wurde anschließend die CD81-Serumkonzentration mit der Höhe der Lebertransaminase GPT als Surrogatmarker für die entzündliche Aktivität der Leber verglichen. Die Untersuchungen ergaben eine signifikante Korrelation zwischen der CD81- Serumkonzentration und der Höhe der GPT (Korrelationskoeffizient r = 0,334, p = 0,016). Im nächsten Schritt wurde der Einfluss der antiviralen Therapie auf die CD81- Serumkonzentration untersucht. Bei Patienten mit chronischer Hepatitis C und erhöhten Transaminasen, die nach Therapie ein dauerhaftes Ansprechen entwickelten, zeigte sich unter Therapie ein signifikanter Abfall der CD81-Serumkonzentration im Vergleich zu der vor Therapie (p = 0,045). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse der Promotionsarbeit, dass CD81 im Serum nachweisbar ist, dass die CD81-Serumkonzentration bei Patienten mit chronischer Hepatitis C erhöht ist und dass es einen Zusammenhang zwischen Leberentzündung und Therapieansprechen gibt. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass CD81 für die Pathogenese der Hepatitis C Virus-Infektion möglicherweise von Bedeutung ist.
Dynamische Proteininteraktionen sind die Grundlage biologischer Prozesse, ihr korrekter Ablauf ist essentiell für die intakte Physiologie aller Organismen. Die Aufklärung der Struktur und Funktion von Proteinen inklusive ihrer komplexen Interaktionen, ist entscheidend für das Verständnis biologischer Prozesse. Methoden zur Untersuchung von Protein-Interaktionen sind in der Regel auf die Modifikation von Proteinen angewiesen. Zum Einen ist die selektive Markierung von Proteinen mit spektroskopischen Sonden – insbesondere mit Fluorophoren – ein wichtiger Ansatz zur in vivo und in vitro Interaktionsanalyse. Zum Anderen gewinnen festphasenbasierte Analysemethoden zunehmend an Bedeutung. Multivalente Chelatoren (MCH) bieten vielseitige Möglichkeiten, rekombinante Proteine reversibel an spektroskopische Sonden oder Oberflächen anzubinden und haben dadurch ein enormes Potential für Anwendungen zur funktionalen Charakterisierung von Proteinen. Ziel dieser Arbeit war es, die Energetik und Dynamik der Interaktion von MCH mit Oligohistidinen zu charakterisieren, um diese insbesondere zur Organisation von Proteinen in Mikro- und Nanostrukturen einzusetzen. Die Interaktion der MCH mit Histidin-Tags unterschiedlicher Länge und Sequenz wurde in Lösung und an Oberflächen charakterisiert. Es zeigte sich, dass die zunehmende Länge und die Redundanz auf Seiten des Histidin-Tags in einer erhöhten Affinität resultierten. Das Einführen einzelner Spacer-Aminosäuren resultierte hingegen in einer drastischen Reduktion der Komplexstabilität. Ein Alanin-Scanning zeigte, dass vor allem die zentralen Histidine besonders wichtig für eine stabile Bindung sind. Dieser Effekt lässt sich dadurch erklären, dass es sich bei der MCH-Oligohistidin-Interaktion um einen äußerst dynamischen Prozess handelt, bei dem die Metallkoordinationsstellen mit ständig wechselnden Histidinen interagieren. Diese Permutation erhöht die Entropie des Komplexes, und ist somit Grund für die erhöhte Affinität mit steigender Redundanz des Histidin-Tags. Anhand von Chelator-Dichte-Arrays konnte gezeigt werden, dass die Stabilität der Bindung von Histidin-getagten Proteinen nicht nur mit der Multivalenz der Chelatoren, sondern auch mit der MCH-Dichte ansteigt. In Kompetitionsexperimenten mit Hexa- und Dekahistidinen auf den MCH-Dichte-Arrays wurden veränderte Stabilitäten beobachtet. Die Stabilität von H6 ver5. veringert sich in Anwesenheit von H10, wobei sich die scheinbare Affinität von H10 in Anwesenheit von H6 erhöht. Dies wird auf die gleichzeitige Interaktion mit verschiedenen MCH-Molekülen auf der Oberfläche, die Oberflächenmultivalenz, zurückgeführt. Um diesen Effekt anhand von MCHMolekülen mit definiertem Abstand zu untersuchen, wurde ein Tris-NTABiotin-Konjugat (BTTris-NTA) hergestellt und auf Streptavidin-Oberflächen bzw. fluoreszenzmarkiertem Streptavidin eingesetzt. Echtzeit TIRFS-RIf-Kompetitionsexperimente zeigten eine veränderte Bindungskinetik für H6 in Anwesenheit von H10, welche darauf zurückzuführen ist, dass H6 aktiv durch H10 verdrängt wird. Dieser Effekt ist offenbar auf die dynamische Interaktion des Oligohistidins mit multiplen Chelatoren auf der Oberfläche zurückzuführen, welche den aktiven Austausch von H6 gegen H10 ermöglicht. Sowohl auf Oberflächen als auch in Lösung wurden für die Interaktion von Streptavidin-gebundenem BTTris-NTA mit Oligohistidinen um Faktor 3-5 erhöhte Affinitäten, im Vergleich zu freiem Tris-NTA, festgestellt. Interaktionsanalysen in Lösung zeigten maximale Komplex-Stöchiometrien von 1:2 für die Interaktion von Streptavidin-BTTris-NTA mit Oligohistidinen. Diese Stöchiometrien sowie die erhöhte Affinität lassen sich durch die gleichzeitige Interaktion von zwei benachbarten an Streptavidin gebundenen BTTris-NTA-Molekülen mit einem Oligohistidin erklären. Die räumliche Nähe der Tris-NTA-Moleküle erhöht die Redundanz auf Seiten des Chelators, was sich wiederum positiv auf die Entropie auswirkt und damit zu einer erhöhten Affinität führt. Diese Ergebnisse bestätigen den postulierten Effekt der Oberflächenmultivalenz. Es wurde gezeigt, dass BTTris-NTA die reversible Biotinylierung Histidingetagter Proteine ermöglicht, und damit eine Brücke zwischen den zwei am meisten eingesetzten Werkzeugen der Biochemie, dem Histidin-Tag und dem Biotin-(Strept)Avidin-System, schlägt. BTTris-NTA findet in verschiedenen Bereichen Anwendung: zur Umwandlung kommerzieller (Strept)Avidin-Oberflächen in Tris-NTA-Oberflächen, in Phage-Display-Screenings und Western Blot Analysen sowie zur Markierung von Rezeptoren auf Zelloberflächen. Die Biotinylierung über BTTris-NTA ermöglicht es zudem, auch Proteine geringer Konzentrationen (<10 nM) effizient auf Streptavidinoberflächen zu immobilisieren. Diese Selbstassemblierung Histidin-getagter Proteine wurde zur Organisation von Proteinen auf Oberflächen in Mikro- bis Nanometer-Dimensionen genutzt.
An chemischen Synapsen diffundieren von der präsynaptischen Nervenendigung ausgeschüttete Neurotransmitter durch den synaptischen Spalt und aktivieren Rezeptormoleküle in der postsynaptischen Plasmamembran. Eine schnelle und zuverlässige Kommunikation an Synapsen bedingt, dass die Rezeptoren in Clustern direkt gegenüber den aktiven Zonen der Präsynapsen angereichert sind. Eine hohe Rezeptorendichte in der postsynaptischen Membran wird durch sog. Gerüstproteine, die mit den Rezeptormolekülen assoziieren, erreicht. Bisher wurden für verschiedene Synapsen unterschiedliche Gerüstproteine identifiziert. An glutamatergen Synapsen werden Rezeptoren durch u.a. das Postsynaptic Density 95 (PSD 95)-Protein, an cholinergen Synapsen durch Rapsyn, und an GABAergen und glyzinergen Synapsen durch Gephyrin verankert. An inhibitorischen Synapsen wurde bisher ausschliesslich Gephyrin als Ankerprotein für Glyzin- und GABAARezeptoren identifiziert. An exzitatorischen glutamatergen Synapsen dagegen regulieren weitere Gerüstproteine wie Shank, Homer und das Glutamatrezeptor interagierende Protein (GRIP) die Lokalisation, den Transport und die Stabilität verschiedener Glutamatrezeptor- Subtypen. Gephyrin wurde ursprünglich als peripheres Membranprotein zusammen mit dem Glyzin-rezeptorkomplex aufgereinigt. Es bindet an die große intrazelluläre Schleife der ß-Untereinheit des Glyzinrezeptors. Experimente mit Antisense-Oligonukleotiden und Gephyrin-defizienten Mäusen zeigten, dass Gephyrin essentiell für die synaptische Lokalisation von Glyzinrezeptoren und α2- und γ2-Untereinheiten enthaltenden GABAARezeptoren ist. Die Rezeptorlokalisation an der Synapse wird durch eine stabile Verankerung des Gephyrin-Gerüstes am Zytoskelett gewährleistet. Die Gerüstbildung erfolgt durch die Oligomerisierung zweier Gephyrin-Domänen, der aminoterminalen G-Domäne und der carboxyterminalen E-Domäne, wodurch ein hexagonales Gephyrinnetzwerk entsteht, welches für die Clusterbildung an der Synapse notwendig ist. Live-imaging Studien in Neuronenkulturen zeigten, daß an Rezeptor-Transportvesikel gebundenes Gephyrin kontinuierlich an und von aktiven Synapsen weg transportiert wird, was eine hochdynamische Modulation des Gephyrin-Gerüsts nahelegt. Der retro- und anterograde Transport von Gephyrin wird durch Dynein bzw. Kinesin bewerkstelligt. Einige zytosolische Proteine wie Profilin, das Mena/Vasodilator-stimulierte Phosphoprotein (VASP) und Collybistin (Cb) spielen in der Zytoskelett-Regulation eine Rolle und interagieren mit Gephyrin. Cb ist notwendig für die Gephyrin-Clusterbildung an bestimmten GABAergen Synapsen. Im Hippocampus Cb-defizienter Mäuse befindet sich kein Gephyrin an den Postsynapsen. Cb gehört zur Familie der Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF), die durch eine DH-PH (Dbl Homologie-/Pleckstrin-Homologie) Tandem-Domäne charakterisiert sind und existiert in zwei Spleißvarianten, CbI und CbII. Die DH-Domäne aktiviert spezifisch das kleine G-Protein Cdc42, und die PH-Domäne interagiert mit Phosphoinositol-3-Phosphat (PI3P). In vitro-Studien haben gezeigt, dass die Interaktion von Gephyrin mit Cb II eine Reduktion der GEF-Aktivität für Cdc42 bewirkt. Basierend auf diesen Resultaten wurde vorgeschlagen, dass Gephyrin die Cdc42-Aktivierung durch Cb beendet. Dieser Mechanismus könnte für die initiale Bildung inhibitorischer Synapsen notwendig sein. Analysen mit Domänen-deletierten Cb-Konstrukten zeigten, dass sowohl die DH- als auch die PH-Domäne für die Bildung von submembranären Gephyrin-Microclustern an der Plasmamembran notwendig sind. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Gephyrin-Gerüstbildung durch Cb weiter untersucht. Insbesondere wurde geklärt, inwiefern Cdc42-Aktivierung bzw. PI3P-Bindung durch Cb an der Gephyrin-Gerüstbildung beteiligt ist. Zusätzlich wurde anhand einer eigens erzeugten GFP-Gephyrin transgenen Maus untersucht, ob sich die Stabilität des Gephyrin-Gerüsts während der Differenzierung ändert und in die Regulation der Stabilität und Plastizität inhibitorischer Synapsen involviert ist. Die Rolle von Cdc42 in der Gephyrin-Gerüstbildung wurde mittels einer konstitutiv aktiven Spleißvariante von Cb untersucht. Basierend auf Homologien zu anderen bereits charakterisierten GEFs und der publizierten Kristallstruktur des CbII-Cdc42 Komplexes wurden Aminosäurereste in der DH-Domäne von Cb mutiert, um die Cdc42-Aktivierung zu unterbrechen (CB T61A, K192A und NE232-233AA). In vitro GTPase-Aktivierungsassays und Filopodien-Induzierung in NIH-3T3-Zellen bestätigten, dass diese Mutationen die Cdc42-Aktivierung reduzierten bzw. aufhoben. Dennoch induzierten sie die Gephyrin-Gerüstbildung in heterologen Zellen und hippocampalen Neuronen ähnlich effektiv wie Wildtyp-Cb II. Die Rolle von Cdc42 in der synaptischen Gephyrin-Clusterbildung wurde außerdem in konditionell Cdc42-defizienten Mäusen, in denen das Cdc42-Gen selektiv im Vorderhin inaktiviert wurde, untersucht. Die Dichte von Gephyrin- und das GABAA-Rezeptor-Clustern war bei Verlust von Cdc42 im Hippocampus nicht verändert. Dies steht im Gegensatz zu einem fast 80%igen Verlust von Gephyrin- und GABAA-Rezeptor-Clustern im Hippocampus von Cb-defizienten Mäusen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Cdc42 für die Gephyrin-Gerüstbildung an inhibitorischen Synapsen nicht notwendig ist. Die Rolle der PH-Domäne von Cb bei der Gephyrin-Clusterbildung wurde ebenfalls durch Mutagenese-Experimente analysiert. Viele PH-Domänen haben die Fähigkeit, Phosphoinositide zu binden und damit Membranbindung zu vermitteln, während andere PHDomänen, die nicht an Phosphoinositide binden, nur nach Bindung weiterer Liganden mit Membranen assozieren. In früheren Arbeiten war gezeigt worden, dass humanes Cb PI3P bindet. Hier wurde eine mögliche Beteiligung von Phospholipid-Bindung an der Gephyrin-Gerüstbildung durch Substitution zweier basischer Reste in der β3- und β4- Schleife, R303 und R304, mit Asparaginen untersucht. Ein Lipid-Dot-Blot-Assay mit der Cb II-RR303-304NN-Mutante zeigte einen völligen Verlust der PI3P-Bindung in vitro. Die Expression dieser Mutante in heterologen Zellen und hippocampalen Neuronen zeigte, dass die Gerüstbildung und die synaptische Lokalisation von Gephyrin Phosphoinositidbindung erfordern. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Aktivierung von Cdc42, nicht aber die PI3P- Bindung, für die Cb II-vermittelte Gephyrin-Gerüstbildung entbehrlich ist. Cb hat also zumindest zwei biologische Funktionen: Einerseits ist die DH-Domänen vermittelte Aktivierung von Cdc42 notwendig für die Regulation des Aktinzytoskeletts und die Bildung von Filopodien; andererseits wird die PH-Domänen-abhängige und Cdc42-unabhängige Phospholipidbindung für die Gephyrin-Gerüstbildung an inhibitorischen Postsynapsen benötigt. Um die Dynamik von Gephyrin an inhibitorischen Synapsen zu untersuchen, wurde eine transgene Maus entwickelt, welche GFP-Gephyrin unter der Kontrolle des Neuronspezifischen Thy1-Promotors exprimiert. In verschiedenen Hirnregionen der transgenen Mauslinie, wie Hippocampus, Stammhirn, Rückenmark und Kortex, wurde punktuelle synaptische GFP- Fluoreszenz beobachtet. Diese GFP-Gephyrin-Fluoreszenz kolokalisierte mit einem inhibitorischen Präsynapsenmarker, dem vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT). Immunfärbungen von Hirnschnitten mit Gephyrin-spezifischen Antikörpern zeigten, daß die durchschnittliche Größe und Dichte der GFP-Gephyrin-Cluster mit denen endogener Gephyrin-Cluster identisch waren. Eine Western-Blot Analyse inhibitorischer synaptischer Proteine zeigte keinen Unterschied zwischen Thy1-GFP-Gephyrin- und Wildtyp-Mäusen auf, ebensowenig wie elektrophysiologische Untersuchungen von GFP-Gephyrin-positiven und -negativen Neuronen. Sowohl die durchschnittliche Amplitude der mIPSCs als auch deren Frequenz waren nicht signifikant verändert, was dafür spricht, dass die transgene Expression von GFP- Gephyrin keine funktionellen Veränderungen verursacht. Verhaltensversuche zeigten gleiche Ergebnisse für Thy1-GFP-Gephyrin und WTMäuse. Daher kann die GFP-Gephyrin-Maus als verlässliche Reporterlinie für Studien zur Gephyrin-Dynamik an inhibitorischen Synapsen im Hippocampus und in einigen anderen Hirnregionen eingesetzt werden. Die Dynamik des synaptischen Gephyrin-Gerüsts wurde an inhibitorischen Postsynapsen in organotypischen entorhinal-hippocampalen Schnittkulturen aus GFPGephyrin-Mäusen untersucht. Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP)-Analysen individueller GFP-Gephyrin-Cluster in 1-Woche- und 4-Wochen-alten Kulturen zeigten eine entwicklungsabhängige Stabilisierung der GFP-Gephyrin-Cluster auf. Diese Stabilisierung ist eng verbunden mit einer Größenzunahme der Gephyrin-Cluster an GABAergen Synapsen. Mit elektrophysiologischen Ableitungen wurde eine Reifung der GABAergen synaptischen Übertragung ebenfalls während dieser Periode beobachtet. Die Stabilisierung und Grössenzunahme des Gephyrin-Gerüsts spiegelte sich in einer erhöhten miniature inhibitory postsynaptic current (mIPSC)- Amplitude wieder. Außerdem wies die Zunahme der mIPSCFrequenz auf eine effiziente Reifung der präsynaptischen Endigungen hin, die immunhistochemisch durch eine Zunahme der VIAAT-Immunfluoreszenz erhärtet werden konnte. Ein möglicher Einfluss der GABAergen, synaptischen Aktivität auf die Grösse und Stabilität der Gephyrin-Cluster wurde in reifen Neuronenkulturen durch pharmakologische Modulation der GABAA-Rezeptoren untersucht. Die Behandlung 4-Wochen-alter Kulturen mit GABAA-Rezeptor-Antagonisten und mit dem potenzierenden Benzodiazepin Diazepam zeigte eine homöostatische Regulation der Stabilität und Größe des Gephyrin-Gerüsts durch die Aktivität inhibitorischer Synapsen auf. Zusammenfassend sind diese Resultate starke Hinweise für dynamische Veränderungen in synaptischen Gephyrin-Gerüsten während der Reifung und Aktivitäts-induzierten Plastizität GABAerger Synapsen
Schülerinnen und Schüler mit Migrationshintergrund in Deutschland schneiden in nationalen und internationalen Schulleistungsstudien deutlich schlechter ab als Schülerinnen und Schüler ohne Migrationshintergrund. Auch hinsichtlich der Lesekompetenz im Deutschen sind die Ergebnisse eines großen Teils der Schülerinnen und Schüler mit Migrationshintergrund immer wieder bedenklich schlecht. Um die Frage, welche Förderung gegen Defizite in der Deutsch-Lesekompetenz bei dieser Schülergruppe eingesetzt werden sollte, hat sich in Deutschland eine wissenschaftliche Auseinandersetzung mit breiter öffentlicher Wirkung entwickelt. Die drei Beiträge der vorliegenden Dissertation liefern aus unterschiedlicher Perspektive einen Beitrag zur Erforschung der Lesekompetenz von Personen mit unterschiedlicher Sprachbiographie.
Beitrag I (Rauch & Hartig, 2010) zeigte, dass es möglich ist, mit den Mitteln der mehrdimensionalen Item Response Theorie den diagnostischen Nutzen eines Deutsch-Lesekompetenztests zu erhöhen. Für Schülerinnen und Schüler, die zu Hause nicht das Deutsche zur Kommunikation nutzen, zeigte sich, dass sie insbesondere bei Basisfähigkeiten, die zur Bewältigung höherer Lesekompetenzprozesse notwendig sind, gegenüber ihren deutschsprachigen Mitschülerinnen und Mitschülern benachteiligt sind. Beitrag II (Rauch, Jurecka & Hesse, 2010) belegte, dass Türkisch-Deutsch bilinguale Schülerinnen und Schüler über niedrigere Deutsch-Lesekompetenzen verfügen als ihre monolingual Deutsch aufgewachsenen Mitschülerinnen und Mitschüler. In der Englisch-Lesekompetenz wurde kein Gruppenunterschied nachgewiesen. Es fand sich darüber hinaus ein signifikant positiver Effekt der Türkisch-Lesekompetenz auf die Englisch-Lesekompetenz, aber nicht auf die Deutsch-Lesekompetenz. Beitrag III (Rauch, Jude & Naumann, in Druck) zeigte, dass Türkisch-Deutsch bilinguale Schülerinnen und Schüler, die in beiden Sprachen Texte selbständig lesen und verstehen können, besser im Englisch-Lesekompetenztest abschneiden als monolingual aufgewachsene Schülerinnen und Schüler. Türkisch-Deutsch bilinguale Schülerinnen und Schüler, die über niedrigere Lesekompetenzen im Türkischen und Deutschen verfügen, schnitten im Englisch-Lesekompetenztest schlechter ab als beide anderen Vergleichsgruppen. Zudem zeigte Beitrag III, dass Sprachbewusstheit den Zusammenhang zwischen Biliteralität und drittsprachlicher Lesekompetenz teilweise mediiert.
Aus den Ergebnissen kann gefolgert werden, dass es für die Förderung der Deutsch-Lesekompetenz von Schülerinnen und Schülern, die zu Hause nicht das Deutsche zur Kommunikation nutzen, sinnvoll ist, insbesondere auf die Förderung der Bildung von adäquaten Makrostrukturen und die Vermittlung von Lesestrategien abzuheben. Die unterschiedlichen Befunde zur Interdependenz von Kompetenzen im Türkischen einerseits und im Deutschen und Englischen andererseits wurden auf die Art des schulischen Unterrichts in Deutsch und Englisch zurückgeführt. Während Schülerinnen und Schüler mit Herkunftssprache Türkisch im Englischunterricht, der das Englische im formalen Sprachunterricht vermittelt, in der Lage sind, Bezüge zu ihrer Herkunftssprache herzustellen, ist dies im Deutschunterricht, der das Deutsche selbst weitgehend voraussetzt, nicht möglich. Ein Teil des wiederholt in der Literatur berichteten Befundes, dass bilinguale Schülerinnen und Schüler, die in ihren beiden Sprachen lesen können, in drittsprachlichen Lesekompetenztests besser abschneiden als monolinguale Schülerinnen und Schüler, scheint auf erhöhte Sprachbewusstheit zurückzuführen zu sein. Dieses besondere Potential bilingualer Schülerinnen und Schüler könnte durch Herkunftssprachlichen Leseunterricht und einen auf Sprachbewusstheit ausgerichteten Unterricht weiter ausgeschöpft werden.
Einführung Seit Einführung der Diffusionstensorbildgebung- (DTI) basierten Traktographie von zerebralen Bahnsystemen besteht der Verdacht einer zu dünnen Ausdehnung der Faserbahnen in der unmittelbaren Nachbarschaft von zerebralen Läsionen. Der gegenüber der tatsächlichen Ausdehnung verminderte Durchmesser verjüngt sich zusätzlich mit zunehmendem Abstand von dem sog. seed-Volume (“seed-VOI”). Die unterrepräsentierte Ausdehnung der Faserbahnen stellt in der neurochirurgischen Operationsplanung und intraoperativen Neuronavigation ein erhebliches Problem bei der Beurteilung der Resektionsgrenzen von Tumoren bzw. der Grenze dringlich zu erhaltender eloquenter Faserbahnen dar. Mit einem zusätzlichen, auf die Läsion fokussierten Traktographie-Algorithmus – Lesion-based Fibertracking (LBFT) – soll die Auswertbarkeit von Faserbahnen in der Umgebung von intrazerebralen Läsionen verbessert werden. Der Algorithmus von LBFT wird vorgestellt und das Verfahren anhand der Darstellung von Bahnen des Tractus corticospinalis (TCS) mit dem Standardverfahren verglichen. Methode In 40 Patienten mit intrazerebralen Läsionen in Nachbarschaft zu kortikospinalen Bahnen (Pyramidenbahn) wurde eine Diffusionstensor-bildgebung und fMRT basierte Faserbahndarstellung des Tractus corticospinalis auf Grundlage eines „tensor-deflection-Algorithmus“ (TEND) durchgeführt. Hierfür wurden Bahnen von den kortikalen motorischen Repräsentationen der Hand, des Fußes und der Zunge zum Hirnstamm visualisiert. Im Standardverfahren wird ein würfelförmiges Volumen – das sog. seed-Volume oder Ursprungsvolumen – im Gyrus praecentralis entsprechend der anatomischen und funktionellen Bildgebung definiert. Ein zweites würfelförmiges Volumen, lokalisiert im Hirnstamm selektiert ausschließlich Fasern welche durch beide Volumen verlaufen. Die resultierenden Fasern werden bezüglich ihres Verlaufes durch typische anatomische Landmarken kontrolliert und ggf. korrigiert. Anschließend wird das Faserbündel mittels einer Oberflächenrekonstruktionstechnik („surface rendering“) dreidimensional rekonstruiert (iPlan 2.5Cranial, BrainLab®, Feldkirchen, Germany). Für das neue Verfahren des LBFT wird die Region definiert, in welcher die Faserbahn des Standardverfahrens der Läsion am nächsten kommt und hier, um die Faserbahn des Standardverfahrens, ein neues seed-Volume platziert, welches das Standardfaserbündel um 10 mm überragt. Traktographie und Segmentierung werden analog dem Standardverfahren durchgeführt. Fasern, die nicht den Gyrus praecentralis erreichen oder nicht durch den Pedunculus cerebri verlaufen, werden eliminiert. Die Faserzahl, die Größe der Faserbahnen und die Größendifferenz zwischen den Bahnen des Standardverfahrens und LBFT werden verglichen und das Verfahren auf inter- und intra-rater Reliabilität geprüft. Ergebnisse Das Standardverfahren und LBFT waren in allen 40 Patienten durchführbar. Die Faserzahl bei LBFT erhöhte sich signifikant gegenüber dem Standardverfahren um 383,27% (p<0,0001). Der maximale Durchmesser in der Ebene, in welcher das Faserbündel der Läsion am nächsten kommt, sowie der Durchmesser in Richtung der Läsion erhöhen sich signifikant um 171,75 % bzw. 196,45 % (jeweils p<0.0001). Daraus folgt eine durchschnittliche Zunahme des Durchmessers in Richtung der Läsion um 4.48mm (± 2.35). Fazit Die Fehleinschätzung des Durchmessers und der Distanz des TCS zu subkortikalen Läsionen bei Anwendung des Standardverfahrens DTI-basierter Traktographie stellt ein erhebliches Problem in der funktionellen neurochirurgischen Operationsplanung und intraoperativen Neuronavigation dar. Durch den zusätzlichen Schritt des LBFT kann die Fehleinschätzung korrigiert und der in vorhergehenden Studien eingeforderte Sicherheitsabstand standardisiert robust und reliabel realisiert werden.
In dieser Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem die Entfaltung von Proteinen simuliert werden kann. Anhand der Simulation kann die Schmelztemperatur bestimmt und damit die Thermostabilität einer Struktur untersucht werden. Außerdem ist die Untersuchung struktureller Veränderungen möglich, die während der Entfaltung auftreten und letztendlich zum globalen Zerfall der Struktur führen. Die Bereiche, von denen der globale Zerfall der Struktur ausgeht, können bestimmt werden. Es wurde untersucht, inwieweit diese Entfaltungsregionen Strukturbereiche darstellen, deren Mutation die thermische Stabilität der Struktur beeinflusst. Das entwickelte Verfahren basiert auf der Anwendung von Methoden aus der Rigiditätstheorie. Die thermische Entfaltung der Strukturen wird über das sukzessive Aufbrechen nichtkovalenter Wechselwirkungen in den Netzwerken simuliert. An-sätze aus der Perkolations- und Netzwerktheorie werden verwendet, um die Rigidität und Flexibilität in den Netzwerken während der Entfaltung zu untersuchen. Diese unter dem Begriff der Analyse statischer Netzwerke (constraint network analysis, CNA) zusammengefassten Methoden wurden im ersten Teil dieser Arbeit auf einen Datensatz homologer meso- und thermophiler Proteine angewendet. Dabei wurde untersucht, ob die thermophile Anpassung tatsächlich über eine Rigidisierung der Struktur erfolgt. Außerdem wurde die Theorie der korrespondierenden Zustände getestet, die besagt, dass bei der thermophilen Anpassung trotz globaler Rigidisierung für die Bioaktivität wichtige flexible Bereiche konserviert sind. Mit Hilfe der CNA wurden Entfaltungsregionen der Proteine aus dem Datensatz bestimmt und mit Strukturbereichen verglichen, in die thermostabilisierende Mutationen eingeführt wurden. Außerdem wurde untersucht, inwieweit vorhergesagt werden kann, ob eine möglicherweise thermostabilisierende Mutation die Aktivität negativ beeinflusst. Für zwei Drittel der thermophilen Proteine aus dem Datensatz konnte eine höhere Thermostabilität vorhergesagt werden als für das entsprechende mesophile Protein. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die thermophile Anpassung dieser Proteine tatsächlich über eine Rigidisierung der Struktur erfolgt. Offensichtlich werden bei der Anwendung der CNA implizit alle möglichen Mechanismen der thermophilen Anpassung berücksichtigt. Die für zwei Paare meso- und thermophiler Proteine vorhergesagten Entfaltungsregionen stimmten sehr gut mit Bereichen überein, in die thermostabilisierende Mutationen eingeführt wurden. Damit wurde gezeigt, dass die CNA hilfreich zur Unterstützung des Protein Engineering ist, da die thermische Stabilität einer Struktur abgeschätzt werden kann, andererseits Hinweise darauf gegeben werden, in welchen Bereichen der Struktur thermostabilisierende Mutationen eingeführt werden können. Anhand des Vergleichs mikroskopischer Stabilitäten homologer Proteine konnte gezeigt werden, dass die CNA ein Abschätzen des Effekts einer thermostabilisierenden Mutation auf die Aktivität erlaubt, was wiederum für den Einsatz der CNA zur Unterstützung des Protein Engineering spricht. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die CNA auf eine Serie von Phytasen unterschiedlicher Thermostabilitäten angewendet. Da es sich bei den Phytase-Strukturen um Homologie-modelle handelte, die nicht direkt mit der Analyse statischer Netzwerke untersucht werden konnten, wurde eine ensemblebasierte CNA etabliert. Dazu wurden kurze MD-Simulationen zur Verbesserung der homologiemodellierten Strukturen durchgeführt, aus denen dann ein konformationelles Strukturensemble extrahiert wurde. Aus den konformationellen Ensembles werden Thermostabilitäten vorhergesagt. Bei der Vorhersage der Thermostabilitäten ergab sich eine bemerkenswert gute Übereinstimmung mit experimentell bestimmten relativen Halbwertszeittemperaturen. Bereiche mit hoher Entfaltungsregionwahrscheinlichkeit stimmen gut mit Regionen überein, in denen thermostabilisierende Mutationen experimentell eingeführt wurden. Diese Ergebnisse offenbaren, dass mit der Entwicklung der ensemblebasierten CNA die methodischen Grundlagen für den Einsatz des Verfahrens zur Unterstützung des Protein Engineering von Phytasen geschaffen wurden.
Die hämatologische Diagnostik wurde in den letzten zwei Jahrhunderten bis zum heutigen Stand stark geprägt und es gibt mittlerweile eine Menge an hämatologischen Diagnostikgeräten. Das Humacount 5 ist ein vollautomatischer hämatologischer Analyzer der mit der Volumetrischen Impedanz Methode Blutbilder erstellt. Ein idealer Einsatzort für das Humacount 5 ist der tägliche Gebrauch sowohl in Ambulanzen als auch auf klinischen Stationen. Es ist ein kompaktes und einfaches Tischgerät, dass auf allen Stationen die für Prävention , Diagnostik, Therapie und Nachsorge Laborwerte benötigen eingesetzt werden kann. Ziel dieser Arbeit war die Testung dieses Gerätes auf Validität, Reliabilität, Objektivität Präzision, Geschwindigkeit und Messgenauigkeit im Vergleich mit der Standardlabormaschine Advia 120. Um auf Häufigkeit und Stärke der Abweichungen zu überprüfen in einem Bereich in dem es äußerst sensitiv arbeiten soll, wurden 50 physiologische Proben benutzt. 250 pathologischen Proben wurden benutzt um eine Auslastung in allen Laborparametern zu erreichen und das Humacount 5 ebenfalls auf Häufigkeit und Stärke der Abweichungen in diesen Bereichen zu überprüfen. Das Humacount 5 liegt mit seinen Werten in einem sehr gutem Variationsbereich die unter den geforderten 5% Abweichintervall liegen. Insgesamt zeigt sich ein sehr gut übereinstimmendes Ergebnis der 22 Laborparameter in der Einteilung auf physiologische Proben und pathologische Proben zwischen dem Advia 120 und dem Humacount 5. In einer zweiten Testreihe wurde die Reliabilität in einem internen Vergleich des Humacount 5 überprüft. Es wurden 50 physiologische und 250 pathologische Proben jeweils zwei mal im Humacount 5 zeitlich direkt hintereinander gemessen. In einer dritten Testreihe werden die 50 physiologischen Proben und die 250 pathologischen Proben verglichen mit einer Messung dieser Proben nach 24 Stunden und in einer vierten Testreihe wurden 10 pathologische Proben jeweils zehn mal hintereinander gemessen. Es haben sich gute Ergebnisse in der Reliabilität und Messgenauigkeit in Bezug auf die Häufigkeit der abweichenden Laborparameter gezeigt. Das Humacount 5 zeigt hierbei besonders, dass in den stark ausgelasteten pathologischen Grenzbereichen der Laborwerte eine sehr hohe Messqualität besteht. Insgesamt betrachtet ist das Humacount 5 also ein sehr valides und reliables Messgerät, das in vielen seiner 22 Laborparameter exzellente Werte abgeliefert hat. Das Gerät wurde in allen Laborparametern vollständig ausgelastet und zeigt sehr sensible Ergebnisse bis in hohe pathologische Werte. Als zweiter Teil der Arbeit wurde der CD4+ Select Test mit einem Standardverfahren in der HIV-Diagnostik, der Flow Zytometrie, verglichen; der CD4+ Select Test ist ein HIVTestverfahren, das CD4 positive Lymphozyten identifizieren und zählen soll. Ziel dieses Teils der Arbeit war die Testung des Verfahrens auf Validität, Reliabilität, Objektivität, Präzision und Messgenauigkeit. Dieses Testverfahren soll vor allem in der HIV Diagnostik und im Patientenmonitoring in der Antiretroviralen Therapie eingesetzt werden. Vor allem ist dieses Testverfahren für die Entwicklungsländer gedacht, die sich das teure Standardverfahren der Flow Zytometrie nicht leisten können. CD4+ Select ist eine kostengünstige aber hochqualitative Alternative für diese Länder. Der CD4+ Select Test wurde validiert anhand bestimmten Kriterien der Firma TriMedCare und auf korrekte Durchführung und korrekte Werte überprüft. Die Blutproben die für die Tests verwendet wurden sind zuvor im Zentrallabor standardisiert gemessen worden. Die CD4 + Werte des CD4+ Select Testverfahrens wurden mit diesen Referenzwerten verglichen. Das Ergebnis des Testverfahrens ist sehr zufriedenstellend und ohne Bedenken in den gewünschten Bereichen einsetzbar. Es ist ein sehr effektiver Test für die CD4+ Lymphozytenbestimmung, der äußerst korrekt arbeitet wenn er sehr sauber durchgeführt wird; außerdem ist er kostengünstig, benötigt wenig Arbeitsaufwand und beinhaltet eine einfache Handhabung. Besonderes Interesse für diese Methode besteht dadurch natürlich in den HIV Ambulanzen und den infektiologischen Fachbereichen.
Tanzen ist eine Form des Umgangs mit Musik, die in allen Kulturen weltweit existiert. Eine der vielen Funktionen, die dem Tanzen im Laufe der Geschichte zugeschrieben wurden, ist sein Nutzen als heilkräftiges Medium. Bisher gibt es jedoch nur wenige Untersuchungen, die sich mit den potenziellen Effekten des Tanzens als gesundheitsfördernde Tätigkeit beschäftigt haben. Ziel der vorliegenden Arbeit war es einerseits, eine Orientierung in diesem zersplitterten und gleichwohl viel versprechendem Forschungsfeld zu bieten und andererseits die subjektiven Wirkungen des Amateur Tanzens, seine psychobiologischen Korrelaten, sowie die dabei zu Grunde liegenden Einflüsse von Musikstimulation und Partner zu untersuchen. Es wurde gezeigt, dass Tanzen eine multidimensionale Tätigkeit darstellt, die verschiedene gesundheitsfördernden Komponenten, nämlich Körperbewegung, soziale Interaktion und Musikstimulation, einschließt. Wahrgenommen werden positive Wirkungen des Tanzens auf das emotionale Befinden, das körperliche Wohlergehen, das Selbstwertgefühl, das Sozialempfinden sowie das spirituelle Wohlbefinden. Tanzen wird darüber hinaus als wichtige Strategie zur Stressbewältigung anerkannt. Die Untersuchung der Wirkung des Paartanzens auf den emotionalen Zustand sowie auf Cortisol- und Testosteronkonzentrationen ergab, dass Tanzen zu einem Anstieg des positiven und einem Absinken des negativen Affektes führt. In Bezug auf die psychobiologischen Parameter wurden Cortisolreduktionen nach dem Tanzen nachgewiesen, welche von der Musikstimulation abhängig waren, während Testosteronerhöhungen zu Beginn der Untersuchung mit der Präsenz des Partners assoziiert waren. Die hier skizzierten Studien geben Hinweise auf die gesundheitsfördernde Bedeutung des Amateurtanzens sowie auf seine subjektiven und neuroendokrinen Korrelate. Darüber hinaus trägt diese Arbeit dazu bei, die differentiellen Einflüsse von Musik und Partner beim Tanzen zu verstehen. Diese Befunde sollen zukünftige Forschungsvorhaben fördern, die den Nutzen des Tanzens als gesundheitsfördernde Tätigkeit weiter verdeutlichen und das Verständnis der dahinter liegenden psychobiologischen Mechanismen erweitern.
Neue Synthesestrategien als Thema des Chemieunterrichts - Experimente zur Kombinatorischen Chemie
(2010)
In der vorliegenden Dissertation wurde die experimentelle Umsetzung der Thematik Kombinatorische Chemie für den Chemieunterricht in der Sekundarstufe II ausgearbeitet. Dazu wurden geeignete Experimente erarbeitet, die einen Einblick in die Kombinatorische Chemie und somit in die neuen Arbeitmethoden der heutigen Chemie schaffen. Mit deren Hilfe gängige Synthesemethoden wie die Split and Combine-Synthese, Teabag-Methode, Spot-Methode und Pin-Methode aufgezeigt werden können und von den Schülern selbst durchgeführt werden. Als ein vorteilhaftes Modell zum Aufzeigen der Arbeitsweise der Kombinatorischen Chemie haben sich Farbstoffe erwiesen, da sie schnell darstellbar sind und keiner aufwendigen Detektion der entstandenen Produkte bedürfen. Als erstes Farbstoffsystem wurden Azofarbstoffe ausgewählt, da sie auch im fakultativen Themenbereich „Farben“ im Chemieunterricht thematisiert werden. Die Übertragung der normalerweise in Lösung hergestellten Azofarbstoffe auf die Festphasenchemie musste zuerst eine geeignete und kostengünstige Festphase gefunden werden. Hierbei haben sich im Handel erhältliche Ionenaustauscher (Harze ohne Linker), die auch zur Wasseraufbereitung verwendet werden, als geeignet herausgestellt. Die erforderlichen Reaktionsbedingungen der Lösungsreaktionen wurden erprobt, optimiert und auf die Festphasenchemie übertragen. Eine Übertragung der Syntheseprinzipien auf drei weitere Farbstoffsysteme wie der Fluoreszenzfarbstoffe der Pyrydin- und Pyrylium-Reihe sowie der Oxidationsfarbstoffe schloß sich an. Nunmehr stehen für den schulischen Einsatz, aber auch für die Ausbildung, einfache Systeme zur Verfügung, die anhand schnell und problemlos durchzuführender Experimente einen Zugang zu unterschiedlichen Methoden der Kombinatorischen Chemie vermitteln können. Dabei bieten die Experimente Anregungen für weitere Arbeiten. Als problematisch stellte sich jedoch der Zugang zu mehrstufigen kombinatorischen Synthesen auf dem Gebiet der Farbstoffe dar. Hier stößt man mit den aus didaktischen Überlegungen sehr einfach gewählten Beispielen an eine Grenze. Ergänzend wurde die Thematik Kombinatorische Chemie mit hochbegabten Schülern der Internatsschule Schloß Hansenberg und interessierten Schülern aus dem Raum Frankfurt, die an dem Projekt Science Camp teilnahmen, erprobt und das Verständnis für diese Thematik mittels eines Fragebogens untersucht. Ein direkter Vergleich beider Schülergruppen konnte aufgrund unterschiedlicher schulischer Bildung nicht vorgenommen werden, weshalb die Auswertung lediglich erste Eindrücke vermittelt. Danach ist das bisher ausgearbeitete Konzept in Lerngruppen mit hochbegabten Schülern gut einsetzbar. Ein Vergleich mit durchschnittlich leistungsstarken Lerngruppen steht noch aus. Eine wünschenswerte Erweiterung und ein Ausbau der Thematik aus Sicht der Schulchemie sollte anorganische Systeme mit einbeziehen und Strategien der Dekonvolution.
Einleitung: Schwer verletzte Patienten nach Trauma (ISS > 16) sind häufig in Folge der Verletzungen über mehrere Tage beatmet. 40% dieser Patienten weisen eine Lungenkontusion auf. Mit zunehmender Beatmungsdauer steigt das Risiko einer Ventilator-assoziierten Pneumonie (VAP). Zeitgleich findet eine Reparation des Lungengewebes statt. Eine zeitnahe antiinfektive Therapie bei Verdacht auf eine VAP zu initiieren ist schwierig. Derzeit existiert kein validierter Parameter oder Score, der eine sichere Diskriminierung zwischen Infektion und Inflammation zulässt. Triggering receptor on myeloid cells (TREM-1) ist ein Rezeptor des angeborenen Immunsystems und wurde im Jahr 2000 erstmalig beschrieben. Sein löslicher Anteil, sTREM-1, ist in der bronchoalveolären Lavage (BAL) bei Patienten mit Pneumonie signifikant erhöht (> 200pg/ml). Es liegen keine Daten zu sTREM-1 bei Patienten nach Lungenkontusion vor. Unklar ist, ob sTREM-1 als Pneumonie-Marker nach Lungenkontusion geeignet ist. Material & Methoden: Nach Zustimmung der Ethikkommission und Einwilligung durch einen Angehörigen wurden prospektiv 42 Patienten mit Thoraxtrauma rekrutiert. Am ersten (im Median 15h nach dem Trauma) und an den Behandlungstagen zwei, drei, fünf, sechs und sieben wurden bei allen Patienten über den Tubus mit einem Aero-Jet Katheter BAL (20ml Spülung) gewonnen und zeitgleich Serumproben entnommen. Die Messung der sTREM-1-Konzentration erfolgte mittels Sandwich-ELISA in Doppelbestimmung (Quantikine sTREM-1 Immunoassay; Firma R&D Systems). Die Serum-Konzentrationen der Interleukine (IL) 6 und 10 sowie des Lipopolysaccharid bindenden Proteins (LBP) wurden mittels Immulite® bestimmt. Die Diagnose Pneumonie wurde retrospektiv mittels Clinical Pulmonary Infection Score (CPIS) gestellt: CPIS > 6 Pneumonie, ≤ 6 keine Pneumonie. Ergebnisse & Diskussion: 15 Stunden nach Trauma wurde der sTREM-1 Spiegel in der BAL, bei im Verlauf pulmonal klinisch unauffälligen Patienten, im Median mit 219pg/ml bestimmt. Im Weiteren stieg sTREM-1 im Median nach 24h auf 575pg/ml an und zeigte ähnliche Konzentrationen im Beobachtungszeitraum. Der Schweregrad der Lungenkontusion korreliert mit der Höhe des sTREM-1-Spiegels in der BAL 40h nach Trauma. Patienten mit schwerer Lungenkontusion (im Median 2240pg/ml) haben signifikant höhere Werte gegenüber Patienten ohne Kontusion (Median 217pg/ml), oder geringer Kontusion (Median 339pg/ml). Am Tag der Diagnosestellung Pneumonie (CPIS > 6, n= 9) zeigten die betroffenen Patienten einen signifikant erhöhten sTREM-1-Spiegel in der BAL (Median 2145pg/ml, p < 0,05) im Vergleich zum Tag vor der Pneumonie (Median 588pg/ml). Wird der cut off für sTREM-1 bei 800pg/ml festgelegt ergibt sich eine Sensitivität von 87% und eine Spezifität von 38%. Eine positive BAL weist im Vergleich zu einer negativen BAL signifikant höhere sTREM-1-Konzentrationen (Median 1492pg/ml vs. 971pg/ml, p < 0,05) auf. Die Sensitivität (85%) ist hoch, die Spezifität (51%) gering. Somit ist sTREM-1 nicht nur durch eine Infektion, sondern auch durch eine Gewebeschädigung mit Einblutung und Inflammation stimulierbar. sTREM-1 ist durch die kontusionsbedingte Stimulation in der ersten Woche nach Trauma ungeeignet, um sicher zwischen einer Pneumonie und einer kontusionsbedingten Inflammation zu unterscheiden. Zytokine und akute Phase Proteine (IL-6, LBP, Procalcitonin) sind bekanntermaßen ebenfalls nicht zur sicheren Diskriminierung einer Infektion geeignet. In Kombination mit sTREM-1 lassen sich jedoch zur Diagnosestellung einer Pneumonie vergleichbare Werte für Sensitivität und Spezifität erreichen wie mittels CPIS Score, wobei der CPIS nur retrospektiv ermittelt werden kann. Die Laborparameter liegen bereits am Tag des Verdachts auf eine Infektion vor. Die klinische Entscheidung zur Initiierung einer Antiinfekitvatherapie korrelierte weder mit dem CPIS noch mit den Inflammationsparametern. Drei von neun Patienten erhielten trotz steigenden Entzündungszeichen und einem CPIS > 6 keine Antiinfektiva. In der Konsequenz könnte eine Kombination aus IL-6 und LBP im Serum, sTREM-1 in der BAL und klinischen Parameter des CPIS eine sensitive und spezifische Entscheidungshilfe für eine antiinfektive Therapie bei Polytrauma und Verdacht auf eine VAP werden.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit periprothetischen Frakturen nach endoprotheti-schen Gelenkersatz von Schultergelenk, Hüftgelenk und Kniegelenk.
Über einen Zeitraum von 6 Jahren konnten 64 operative Frakturversorgungen bei 59 Patienten identifiziert werden.
Diese unterteilten sich in 8 Frakturen des Humerus, sowie 44 Frakturen des Femur nach Hüftgelenkersatz und 12 femorale Frakturen nach Kniegelenkersatz.
Die epidemiologischen Daten unseres Kollektivs mit PPF nach Hüft- und Kniegelenker-satz decken sich mit denen der aktuellen Fachliteratur. So wiesen unsere Patienten einen Altersdurchschnitt von 77,7 +/- 11,0 Jahre auf. Ein Großteil (77% der Patienten) war weiblich. Das follow up erfolgte durchschnittlich nach 27,2 +/- 16,8 Monaten.
Im Falle einer zementfreien primären Endoprothetik erfolgte die Fraktur früher, nach durchschnittlich 64,6 Monaten, gegenüber 103,4 Monate bei zementierter Prothese (p=0,11).
Der Zeitpunkt der PPF lag bei Hüftendoprothesen nach durchschnittlich 96 Monaten und bei Kniegelenkendoprothesen nach durchschnittlich 56 Monaten.
Hinsichtlich der Krankenhausliegezeit zeigten sich keine signifikanten Unterschiede. Ebenso war die Mobilisation gemessen am timed „up and go― Test in Abhängigkeit von der Prothesenlokalisation und Versorgungsart nicht signifikant unterschiedlich (Range 22-32 Sekunden).
Bei der gezielten Nachuntersuchung von periprothetischen Femurfrakturen nach Hüft-gelenkersatz mit festem Prothesensitz zeigte sich bei der plattenosteosynthetischen Versorgung eine signifikant höhere verfahrensbezogene Komplikationsrate (66,7% gegenüber 18,8 %), p= 0,01. Die beiden Patientenkollektive unterschieden sich hin-sichtlich epidemiologischer Daten (Alter, Geschlecht, Rate an primär zementierten Pro-thesen, follow up) nicht.
In der Gesamtzusammenschau bleiben PPF Verletzungen, die eine große Herausfor-derung an die behandelnden Chirurgen stellen.
Aufgrund des multimorbiden Patientenkollektivs im hohen Lebensalter mit einer hohen lost to follow up Rate sind retrospektive Analysen meist von geringer Fallzahl.
Die Effizienz der jeweiligen Versorgungsart in Abhängigkeit von Prothesentyp, Fraktur-klassifikation und Verwendung von Zement bei der Primärendoprothetik sollte in mulit-zentrischen, randomisiert kontrollierten Studien geprüft werden.
Die Wahrnehmung unserer Umwelt erfolgt über verschiedene Sinnesmodalitäten, deren Informationen bevorzugt in bestimmten Hirnarealen verarbeitet werden und sich schließlich zu einem kohärenten Bild ergänzen. Wie diese Prozesse ablaufen und durch welche Vorgänge die Wahrnehmungen einen einheitlichen Sinneseindruck formen, sind fundamentale Fragen der kognitiven Neurowissenschaft. Ziel der vorliegenden Studie war es, diese sensorischen Verarbeitungsprozesse genauer zu untersuchen und bisherige Ergebnisse zu bestätigen sowie neue Erkenntnisse bezüglich audio-haptischer und audio-visuo-haptischer Integration zu gewinnen. Weiterhin sollten angemessene Kriterien für die Auswertung der Daten untersucht werden mit dem Schwerpunkt sinnvoller Kontrollbedingungen. Sechzehn Probanden wurden hierzu mittels fMRT während uni-, bi- und trimodaler Stimulation untersucht. Die Stimulation bestand aus der Darbietung von schwarz-weißen Tierbildern, Tierstimmen und Tierfiguren, die einzeln oder in unterschiedlichen Kombinationen präsentiert wurden. Weiterhin gab es eine motorische Kontrollbedingung ohne sensorische Stimulation. Die unisensorischen Ergebnisse fanden sich in den modalitätsspezifischen Kortexarealen und bestätigten zum großen Teil bisherige Erkenntnisse und die Existenz der Was- und Wo-Pfade. Bimodale audio-visuelle Stimulation führte zu Aktivierungen im Temporallappen um den STS/STG, welcher bei audio-visueller Integration von großer Bedeutung ist. Aktivierungen im Gyrus cinguli, Gyrus fusiformis und Precuneus spielen anscheinend eine Rolle bei der Präsentation von familiären Stimuli und kongruenten Darbietungskombinationen. Auf Ebene früher visueller und auditorischer Leitungsbahnen zeigte sich ebenfalls audio-visuelle Interaktion. Visuo-haptische Integration scheint sich nach den vorliegenden Daten im LOtv, IPS und ventralen Zerebellum abzuspielen. LOtv und IPS sind vermutlich insbesondere für die Verarbeitung von geometrischen Formen von Bedeutung. Im ventralen Zerebellum kommt es durch kortiko-zerebelläre Verschaltungen zur Beteiligung bei visuo-haptischer Informationsverarbeitung. Die Aktivationsmuster bei audio-haptischer Stimulation deuteten auf Verarbeitung bilateral im temporo-parietalen Bereich hin in Temporallappen, Parietallappen und der Insula. Die Aktivierungen kommen vermutlich durch Feedforward-Projektionen und Konnektivität zwischen auditorischem und somatosensorischem Kortex zustande, in der Insula durch Konvergenz der auditorischen und somatosensorischen Was-Informationen. Trimodale Stimulation zeigte bei Anwendung des Max-Kriteriums, bei welchem die audio-visuo-haptische Aktivität stärker als die einzelnen unisensorischen Signalantworten ausfallen sollte, ein Areal im linken temporo-parietalen Bereich. Bei weniger strenger Auswertung wurde eine weitere Region im rechten Zerebellum nachgewiesen. Beide konnten der Erweiterung des Max-Kriteriums zum Vergleich zwischen tri- und bisensorischer Aktivität nicht standhalten. Beim Affen existiert eine superior temporale polysensorische Region, welche auf visuelle, auditorische und haptische Reize reagiert. Ob ein integratives trisensorisches Areal beim Menschen existiert, sollte in weiteren Studien untersucht werden. Vielleicht liegt eine ausgeprägte interindividuelle Variabilität der Lokalisation des Konvergenzpunktes vor. Eine andere Möglichkeit ist, dass die Verarbeitung im Gehirn vermehrt bisensorisch gegliedert verläuft. Um dies in zukünftigen Studien besser zu untersuchen, könnte es von Vorteil sein simple sensorische Stimuli zu verwenden. Eine Reizdegradierung hätte verminderte Signalamplituden zur Folge, was multisensorische Interaktionen mit nachfolgendem Signalanstieg besser beurteilen ließe. Darüber hinaus könnte in den Studien fMRT-Adaptation angewendet werden. Über die repetitive Stimulusdarbietung kommt es ebenfalls zu verminderter BOLD-Signalantwort. Die vorliegende Studie hat weiterhin die Notwendigkeit der Einführung von Kontrollbedingungen demonstriert. Neben unisensorischen sollten bisensorische Kontrollbedingungen zur Beurteilung trisensorischer Aktivität herangezogen werden. Eine Kontrollbedingung zur Beurteilung des Ruhezustandes ohne sensorischen Reiz sollte ebenfalls vorhanden sein. Prinzipiell scheint das Max-Kriterium zur Detektion multisensorischer Integration angemessen zu sein.
Es ist die Hypothese der hier vorgelegten Arbeit, dass bei Asthmatikern oxidativer Stress in der Lunge durch die nichtinvasive Methode der Atemkondensatsammlung und Messung der [H2O2] im EBC erfasst werden kann. Basierend auf dieser Hypothese sollte geprüft werden, inwieweit bei stabilen Patienten mit intermittierendem allergischem Asthma (Grad I, WHO) eine erhöhte [H2O2] im EBC nachweisbar ist und ob es zu einem differenten Anstieg der [H2O2] nach niedrig dosierter Allergenbelastung mit und ohne Supplementation von n-3 PUFA kommt. In dieser Arbeit wurden Patienten mit intermittierendem Asthma und Hausstaubmilbenallergie einbezogen und repräsentierten die Milbenallergikergruppe. Sie wurde in einer randomisierten, doppelblinden und placebokontrollierten fünfwöchigen Studie getestet. Die Patienten erhielten entweder in Gruppe A n-3 PUFA-reiche Kapseln oder in Gruppe B PlaceboKapseln über fünf Wochen. Nach einer dreiwöchigen Aufsättigungsphase wurden die Probanden über zehn Werktage zusätzlich mit niedrig dosiertem Milbenallergen provoziert (FEV1-Abfall 5 %). Atemkondensatuntersuchungen wurden mit Hilfe des ECoScreen® und des ECoCheck® (VIASYS Healthcare GmbH) vor Beginn (V1), nach drei Wochen (V2) und nach der letzten Milbenprovokation (V3) durchgeführt. Zur Erfassung der pulmonalen Entzündung erfasste man zusätzlich bei den genannten Visiten die [eNO] als Kontrollparameter. Weiterhin, zur Erfassung des normalen Verlaufs der [H2O2], wurde bei einer gesunden Kontrollgruppe, die weder provoziert noch supplementiert wurde, die [H2O2] im EBC nach identischem zeitlichen Schema erfasst. In der Milbenallergikergruppe nahmen 30 Patienten und in der Kontrollgruppe 13 Probanden an der Studie teil. Aufgrund technischer Schwierigkeiten und nicht auswertbarer Messwerte, wurden in der Milbenallergikergruppe 17 Patienten und in der Kontrollgruppe neun Probanden zu statistischen Analysen herangezogen. In der Verumgruppe (p = 0,246), der Placebogruppe (p = 0,180) und der Kontrollgruppe (p = 0,185) war kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der [H2O2] im EBC zwischen den Visiten vorhanden. Zwischen der Verum- und der Placebogruppe bestand zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied. In der Milbenallergikergruppe unterschied sich der Verlauf der [H2O2] im EBC deutlich vom Verlauf der [eNO]: Die [H2O2] konnte allenfalls einen Trend (p = 0,101) zwischen den Visiten aufweisen, wobei die [eNO] einen hochsignifikanten (p < 0,001) Unterschied zwischen V3 und V2 aufwies. Es bleibt zum einen offen, ob n-3 PUFA einen antientzündlichen Effekt bei Asthma bronchiale (Grad I, WHO) hat, und zum anderen, inwieweit die Messung der [H2O2] im EBC anhand des ECoCheck® (Fa. VIASYS Healthcare GmbH) als diagnostischer Marker oder zur Verlaufskontrolle bei Asthma bronchiale (Grad I, WHO) geeignet ist.
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien assoziiert und gelten in den meisten Fällen als Erkrankungsursache. Das MLL-Gen auf der Chromosomenbande q23 des Chromosoms 11 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt, und die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusionsgene sind ausschließlich mit Hochrisikoleukämien assoziiert. Die häufigste Aberration ist eine reziproke Translokation zwischen den beiden Genen MLL und AF4 (4q21), die t(4;11)-Translokation, die in ca. 80% aller Akuten Lymphatischen Leukämien bei Kleinkindern, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie, auftritt. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapien resistent, so dass t(4;11) Leukämien mit einer ungewöhnlich schlechten Prognose verbunden sind. Welches der beiden Fusionsproteine, MLL-AF4 oder AF4-MLL, die bei der t(4;11)-Translokation entstehen für die Entstehung der Leukämie verantwortlich ist, wird noch kontrovers diskutiert. Bisherige Publikationen zeigen die Onkogenität beider Fusionsproteine, und ihr Potential, Leukämien im Mausmodell hervorzurufen. Frühere Studien dieser Arbeitsgruppe zeigen die onkogene Wirkung des AF4-MLL Fusionsproteins, dessen Expression zur Wachstumstransformation von murinen Zellen und einer Akuten Lymphatischen Leukämie in der Maus führt. Die onkogene Wirkung von AF4-MLL entsteht, sobald das Fusionsprotein nach seiner Prozessierung durch die Endopeptidase Taspase1 heterodimerisiert und dadurch vor SIAH-vermitteltem proteasomalen Abbau geschützt wird. So kann sich das heterodimerisierte Protein - anders als das AF4-Wildtyp Protein - in den Zellen anhäufen und zu unkontrolliertem Wachstum führen. Um die Heterodimerisierung des AF4-MLL Fusionsproteins kompetitiv zu inhibieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit kleine Fragmente aus der C-terminalen Interaktionsdomäne FYRC von MLL exprimiert. Dazu wurde die Interaktion kleiner Peptide aus der FYRC-Domäne mit dem N-terminalen Fragment des AF4-MLL Proteins mithilfe eines Biosensorsystems und Co-Immunopräzipitationen getestet. Anschließend wurden die kleinsten Peptide, die noch an das N-terminale Fragment binden können (B1 und B3), ausgewählt, und zusammen mit AF4-MLL co-exprimiert. Mithilfe von Western Blot-Analysen von gereinigtem AF4-MLL·N konnte gezeigt werden, dass die Expression dieser Peptide dazu führt, dass das C-terminale Fragment nicht mehr an das N-terminale Fragment binden kann. Durch diese Inhibition der Heterodimerisierung kann der AF4-MLL Multiproteinkomplex nicht vollständig aufgebaut werden, da auch die C-terminalen Komplexpartner WDR5 und RBBP5 nur noch eingeschränkt binden können. Zusätzlich wurde die Stabilität der prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C im Falle einer Inhibition der Dimerisierung untersucht. Offensichtlich sind beide Fragmente nur stabil, wenn sie miteinander heterodimerisiert sind. Eine Blockierung der Interaktion durch kompetitive Peptide führt dazu, dass sowohl AF4-MLL·N als auch MLL·C proteasomal degradiert werden. Da auch das MLL-Wildtyp Protein über die Interaktionsdomänen FYRN und FYRC heterodimerisiert, wurde zusätzlich der Effekt der Expression der Peptide auf die Viabilität von MLL-exprimierenden Zellen untersucht. Dazu wurden die Peptide B1 und B3 in sechs unterschiedlichen Zelllinen, von denen zwei die t(4;11)-Translokation tragen, exprimiert. Anschließend wurde nach einer PI-Färbung der Anteil apoptotischer Zellen mithilfe eines Durchflusszytometers ermittelt. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass keines der beiden Peptide einen starken Einfluss auf Zelllinien hat, die das Wildtyp-MLL Gen besitzen. Die Apoptose der vier untersuchten Zelllinien war kaum erhöht, wenn diese Peptide exprimiert wurden. Interessanterweise scheint das Peptid B1 dagegen einen Apoptosefördernden Effekt auf diejenigen Zellen zu haben, die das AF4-MLL Protein exprimieren. Basierend auf den vorliegenden Daten kann die Aussage getroffen werden, dass es prinzipiell möglich ist, das AF4-MLL Fusionsprotein spezifisch anzugreifen. Eine Blockierung der Heterodimerisierung blockiert die Ausbildung des onkogenen AF4-MLL Multiproteinkomplexes. Dies führt zudem dazu, dass die beiden Taspase1-prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C proteasomal degradiert werden. Die Inhibition der Heterodimerisierung von AF4-MLL ist mit einer leicht erhöhten Apoptoserate in t(4;11)-positiven Zellen verbunden. Diese Beobachtung könnte in Zukunft von Bedeutung sein, wenn über neue Therapieansätze bei t(4;11) Leukämien nachgedacht werden sollte.
Bei der GSI – Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung in Darmstadt wird im Rahmen des HITRAP-Projekts ein linearer Abbremser für schwere, hochgeladene Ionen für atomphysikalische Präzisionsexperimente in Betrieb genommen. Während der Inbetriebnahme wurden transversale Emittanzmessungen mit der Pepperpot- und der Multi-Gradienten-Methode durchgeführt, um die Emittanz des aus dem Experimentierspeicherring (ESR) extrahierten Strahls zu messen. Weiterhin wurde auch die Phasenraumverteilung des auf eine Zwischenenergie von 500keV/u abgebremsten Strahls hinter der IH-Struktur gemessen. Dazu wurden neue Auswertealgorithmen in die Analyse der digitalen Bilder integriert. Die longitudinalen Bunchstrukturmessungen des Strahls am Eintrittspunkt in den Abbremser und die Funktionsweise des Doppel-Drift Bunchers wird gezeigt. Die Konzeption und der Aufbau sowie die erste Inbetriebnahme einer neuartigen Einzelschuss-Pepperpot-Emittanzmessanlage für kleinste Strahlströme und -energien wird beschrieben, die es ermöglichen, den Strahl hinter den Abbremskavitäten zu vermessen. Zusätzlich wurden transversale Strahldynamikrechnungen durchgeführt, welche theoretische Grundlagen zur Inbetriebnahme von HITRAP lieferten. Es wird beschrieben, wie die gesamte Strahllinie vom ESR bis zum Radio-Frequenz Quadrupol nach der erfolgreichen Integration einer Abbremsroutine innerhalb des Softwarepakets COSY Infinity optimiert werden kann.
In der Therapie des Diabetes mellitus Typ 2 ist neben Patientenschulung, Fewichtsreduktion und körperlicher Aktivität die Therapie mit oralen Antidiabetika von besonderer Bedeutung, um langfristig die Blutzuckereinstellung zu verbessern und kardiovaskuläre wie andere Folgeerkrankungen zu minimieren. Allerdings sinkt im Verlauf die Effizienz dieser Therapie, so dass die dauerhafte Gabe von Insulin notwendig wird. Dabei können jedoch auch schwerwiegende Nebenwirkungen, wie z.B. Hypoglykämien und eine wiederrum mit einem erhöhten Risiko an kardiovaskulären Erkrankungen verbundene ausgeprägte Gewichtszunahme auftreten. Demgegenüber führte der GLP-1 Rezeptor-Agonist Exenatide in jüngsten Studien zu einer Verbesserung der Blutzuckereinstellung und Reduktion des Körpergewichts und kann somit als eine neuartige Therapiealternative zum bisher verwendeten Insulin angesehen werden. In der hier vorliegenden prospektiven Studie wurde Exenatide mit Insulin bei Typ 2-Diabetes Patienten mit einer unzureichenden Stoffwechseleinstellung unter Metformin in Bezug auf deren Blutzuckereinstellung und das Hypoglykämie-Risiko verglichen. In dieser 26-wöchigen, multizentrischen, kontrollierten, randomisierten und zweiarmigen Phase IIIb-Studie wurden insgesamt 494 Patienten aus ganz Deutschland untersucht. Die Patienten mit einer unzureichenden Metformin- (Primärkollektiv) oder Kombinationstherapie (exploratives Kollektiv: Metformin plus Sulfonylharnstoff) wurden im Verhältnis 3:1 auf zweimal täglich Exenatide oder zweimal täglich Mischinsulin Aspart 30/70 randomisiert. In einem hierarchischen Modell wurde zunächst die Nichtunterlegenheit von Exenatide gegenüber dem Mischinsulin im Hinblick auf das primäre Endziel der Blutzuckereinstellung (in Form des HbA1c-Wertes) untersucht und anschließend die Überlegenheit von Exenatide in Hinblick auf ein geringeres Hypoglykämie-Risiko. Sekundäre Studienziele waren die Häufigkeit von schweren und von nächtlichen Hypoglykämien, die Veränderung des Körpergewichts sowie des Body Mass Index. Ferner wurden 7-Punkt-Blutzuckertagesprofile und Patientenfragebögen in die Auswertung einbezogen. Bei der insgesamt in acht Visiten unterteilten Studie erfolgte nach zwei Wochen die Randomisierung auf die beiden Therapie-Arme. Während die Dosierung des Mischinsulins im Verlauf der gesamten Studiendauer vom Arzt individuell titriert werden konnte, wurde die Dosis von Exenatide nach vier Wochen von 2 x 5 μg/Tag auf 2 x 10 μg/Tag verdoppelt und bis zum Ende der Studie nicht verändert. Die hier vorliegende Arbeit ist die erste Studie, die das Hypoglykämie-Risiko unter Exenatide und Mischinsulin als primären Endpunkt prospektiv und konfirmatorisch vergleichend untersucht. Im Primärkollektiv konnte die Nicht-Unterlegenheit von Exenatide zum Mischinsulin in Bezug auf den HbA1c-Wert festgestellt werden. Bei der Vermeidung von Hypoglykämien war Exenatide dem Mischinsulin statistisch signifikant überlegen. Zusätzlich konnte unter der Exenatide-Behandlung ein signifikanter Gewichtsverlust festgestellt werden, wohingegen die Patienten im Mischinsulin-Arm signifikant an Gewicht zunahmen. Die gleichzeitige Erreichung dieser Therapieziele (HbA1c<7,0%, keine Gewichtszunahme und keine Hypoglykämien) wurde als Triple-Endpoint definiert und im Exenatide-Arm signifikant häufiger als unter der Mischinsulin-Therapie beobachtet. In den 7-Punkt-Blutzuckertagesprofilen konnte neben einer allgemeinen Blutzuckersenkung in beiden Therapiearmen eine zusätzliche postprandiale Senkung zu den Zeiten der morgendlichen und abendlichen Exenatide-Injektion beobachtet werden. Demgegenüber waren die präprandialen Blutzuckerwerte im Mischinsulin-Arm niedriger, so dass insgesamt eine vergleichbare Verbesserung des Flächenintegrals in den Blutzuckertageskurven erzielt wurde, was die vergleichbare HbA1c-Verbesserung erklärt. Entsprechend zum Gewicht nahmen auch BMI und Hüftumfang der Patienten unter Exenatide ab und unter Insulin zu. Das Gesamtcholesterin und die Triglyceride sanken unter beiden Therapien leicht ab, HDL-Cholesterin stieg leicht an, wohingegen nur unter Exenatide das LDL-Cholesterin abnahm. Ebenfalls sanken nur im Exenatide-Arm der systolische und diastolische Blutdruck. Die häufigsten unerwünschten Ereignisse unter Exenatide waren Übelkeit, Erbrechen, Verdauungsstörungen, Durchfall, Kopfschmerzen und Erkältungen, wobei Durchfall, Kopfschmerzen und Erkältungen auch unter Insulin zu beobachten waren. Bei der in den Patientenfragebögen DTSQ und SF-12 dokumentierten subjektiven Empfindung der Nebenwirkungen zeigten sich allerdings eine Kompensation der deutlicheren Nebenwirkungen von Exenatide durch dessen Vorteile, u.a. im Hinblick auf seine einfachere Dosierung und der als angenehm empfundenen Gewichtsreduktion. Insgesamt war in beiden Therapie-Armen eine ausreichende Patientenzufriedenheit festzustellen. Unter denjenigen Patienten, bei denen Antikörper gegen Exenatide festgestellt wurden, nahm die Prävalenz einer Antikörperbildung gegen Exenatide bis zum Ende der Studie ab. Die Ergebnisse der hier vorgelegten Studie lassen die Schlussforderung zu, dass der GLP-1 Agonist Exenatide eine therapeutische Alternative zum Mischinsulin in der Behandlung des Diabetes Mellitus Typ 2 darstellt. Da eine Restfunktion der pankreatischen ß-Zellen eine Voraussetzung für den Therapieerfolg darstellt, sollte Exenatide möglichst früh bei nachlassender Wirkung des oralen Antidiabetikums Metformin eingesetzt werden. Hier wirkt Exenatide durch eine Verbesserung der Blutzuckereinstellung, die zudem mit einem verminderten Hypoglykämie-Risiko und einer Gewichtsreduktion verbunden ist. Die Kombination dieser drei bedeutenden Effekte hat den klinisch relevanten Vorteil, das Risiko an kardiovaskulären Spätfolgen und somit die Morbidität und Mortalität von Typ 2-Diabetikern langfristig zu senken. Dieses sollte in einer prospektiven Langzeitstudie untermauert werden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine allgemein anwendbare Methode zur Identifizierung und Quantifizierung kleiner Moleküle mittels MALDI-TOF-MS entwickelt. Dabei wurden zahlreiche Analyten, wie unterschiedliche Arzneistoffe, Neurotransmitter und Lebensmittelinhaltsstoffe in verschiedenen Probenmatrizes analysiert. Bei den verwendeten Matrizes wurden mit a-Cyano-4-Hydroxy-Zimtsäure (CHCA) die besten Ergebnisse erzielt. Es zeigte sich jedoch, dass die Probenpräparation wichtiger war als die Wahl der Matrix, da auch mit anderen Matrizes bei optimierter Probenpräparation sensitive Messungen im niedrigen Massenbereich möglich waren. Insbesondere eine schnelle Trocknung des Probenspots, und damit verbunden die Bildung kleiner Kristalle, ist für die Analytik kleiner Moleküle hilfreich. Bei gleichzeitiger Verwendung geringer Matrixkonzentrationen und geringer Laserintensität konnte so der störende Matrixhintergrund minimiert werden. Eine noch stärkere Suppression der Matrixsignale bei gleichzeitiger Anreicherung der Analyten auf dem Probenspot konnte durch eine Dünnschichtpräparation (TLP) mit CHCA und Nitrozellulose erreicht werden. Allerdings war die TLP für eine automatische Quantifizierung kleiner Moleküle nur bedingt geeignet. Die für kleine Moleküle so wichtige Quantifizierung war durch Verwendung einer optimierten schnell trocknenden Dried Droplet Präparation (DDP) möglich. Die Kombination dieser optimierten DDP mit ausreichend aufsummierten Einzelschussspektren bei gleichzeitiger Verwendung eines internen Standards (IS) ermöglichte eine valide Quantifizierung mit guter Präzision, Linearität und Richtigkeit. Dabei erfüllten die quantifizierten Analyten die Vorgaben der FDA für Präzision und Richtigkeit. Diese Quantifizierungsmethode wurde an Mischungen unterschiedlicher Arzneistoffe, sowohl in Standardlösungen als auch in humanem Plasma, erfolgreich durchgeführt. Dabei genügte ein einziger interner Standard, um alle Arzneistoffe der Mischung schnell und sensitiv zu bestimmen (Bestimmungsgrenze 1-5 ng/ml). Weiterhin war es möglich, den Wirkstoff einer pharmazeutischen Tablette ohne aufwändige Probenvorbereitung schnell und genau zu bestimmen. Dass MALDI über eine hohe Salztoleranz verfügt, wurde bei der Bestimmung von Acetylcholin (ACh) und Cholin (Ch) in Mikrodialysaten bestätigt. Trotz des hohen Salzgehalts der Proben (~150 mM) war eine direkte Messung ohne vorherige Aufarbeitung möglich. Dabei lag die Nachweis- und Bestimmungsgrenze für ACh bei 0,3 bzw. 1 fmol/µl und für Ch bei 20 bzw. 100 fmol/µl. Nach den Standardlösungen wurden in-vivo Mikrodialysate aus dem rechten Striatum verschiedener CD1-Mäuse quantifiziert. Durch Verbindung der Dialysesonde mit einem MALDI-Spotter konnte außerdem die zeitliche Auflösung der Dialyse deutlich verbessert werden. Ein weiterer Anwendungsbereich stellte die Bestimmung von Melamin in Milch und Milchpulver dar. Nach einfacher Probenvorbereitung war es möglich, Melamin mit einer Bestimmungsgrenze von 0,25 ppm in Milchpulver bzw. 0,625 ppm in Milch direkt und schnell zu quantifizieren. Damit wurden die geforderten Grenzwerte von 1 ppm für Babynahrung bzw. 2,5 ppm für übrige Lebensmittel leicht erreicht. Als letzte Methode wurden verschiedene Inhaltstoffe in Energy Drinks bestimmt. Bei Verwendung von Theophyllin als IS konnte so neben Koffein auch Niacin und Pyridoxin erfolgreich und ohne Probenvorbereitung schnell quantifiziert werden. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass MALDI auch für die Analytik kleiner Moleküle gut geeignet ist. Neben der Identifizierung der Analyten war auch die Quantifizierung mit guter Linearität, Reproduzierbarkeit und Richtigkeit möglich. Dabei konnten mit der Standardmatrix CHCA verschiedenste niedermolekulare Analyten in unterschiedlichsten Probenmatrizes bestimmt werden. Im direkten Vergleich war die Sensitivität der vorgestellten MALDI-Methoden mindestens vergleichbar, wenn nicht gar besser als bestehende LC-MS-Methoden. Da auf den Einsatz einer LC verzichtet werden kann, ermöglich MALDI einen sehr viel höheren Probendurchsatz. Zudem war keine spezielle Matrix, besondere Geräte oder zeitaufwändige Probenvorbereitung und Präparation notwendig.
Die vorliegende Arbeit beinhaltet die Untersuchung des Schwingungsenergietransfers im N-Methylazetamid (NMA) Molekül und von Wärmetransportprozessen im lichtschaltbaren 310-Aib-Oktapeptid. Dazu unternahmen wir Nichtgleichgewichts-MD-Simulationen und analysierten den zeitlichen Energiefluss in den jeweiligen Biomolekülen. Die Simulationsergebnisse wurden dann im Rahmen der in Kapitel 2 vorgestellten Theorien zum Energietransfer diskutiert. ...
In dieser Arbeit wird die Verteilung von zeitlich abhängigen Tasks in einem verteilten System unter den Gesichtspunkten des Organic Computing untersucht. Sie leistet Beiträge zur Theorie des Schedulings und zur selbstorganisierenden Verteilung solcher abhängiger Tasks unter Echtzeitbedingungen. Die Arbeit ist in zwei Teile gegliedert: Im ersten Teil werden Tasks als sogenannte Pfade modelliert, welche aus einer festen Folge von Aufträgen bestehen. Dabei muss ein Pfad ununterbrechbar auf einer Ressource ausgeführt werden und die Reihenfolge seiner Aufträge muss eingehalten werden. Natürlich kann es auch zeitliche Abhängigkeiten zwischen Aufträgen verschiedener Pfade geben. Daraus resultiert die Frage, ob ein gegebenes System S von Pfaden mit seinen Abhängigkeiten überhaupt ausführbar ist: Dies ist genau dann der Fall wenn die aus den Abhängigkeiten zwischen den Aufträgen resultierende Relation <A irreflexiv ist. Weiterhin muss für ein ausführbares System von Pfaden geklärt werden, wie ein konkreter Ausführungsplan aussieht. Zu diesem Zweck wird eine weitere Relation < auf den Pfaden eingeführt. Falls < auf ihnen irreflexiv ist, so kann man eine Totalordnung auf ihnen erzeugen und erhält somit einen Ausführungsplan. Anderenfalls existieren Zyklen von Pfaden bezüglich der Relation <. In der Arbeit wird weiterhin untersucht, wie man diese isoliert und auf einem transformierten Pfadsystem eine Totalordnung und damit einen Ausführungsplan erstellt. Die Größe der Zyklen von Pfaden bezüglich < ist der wichtigste Parameter für die Anzahl der Ressourcen, die für die Ausführung eines Systems benötigt werden. Deshalb wird in der Arbeit ebenfalls ausführlich untersucht, ob und wie man Zyklen anordnen kann, um die Ressourcenzahl zu verkleinern und somit den Ressourcenaufwand zu optimieren. Dabei werden zwei Ideen verfolgt: Erstens kann eine Bibliothek erstellt werden, in der generische Zyklen zusammen mit ihren Optimierungen vorliegen. Die zweite Idee greift, wenn in der Bibliothek keine passenden Einträge gefunden werden können: Hier erfolgt eine zufällige oder auf einer Heuristik basierende Anordnung mit dem Ziel, den Ressourcenaufwand zu optimieren. Basierend auf den theoretischen Betrachtungen werden Algorithmen entwickelt und es werden Zeitschranken für ihre Ausführung angegeben. Da auch die Ausführungszeit eines Pfadsystems wichtig ist, werden zwei Rekursionen angegeben und untersucht. Diese schätzen die Gesamtausführungszeit unter der Bedingung ab, dass keine Störungen an den Ressourcen auftreten können. Die Verteilung der Pfade auf Ressourcen wird im zweiten Teil der Arbeit untersucht. Zunächst wird ein künstliches Hormonsystems (KHS) vorgestellt, welches eine Verteilung unter Berücksichtigung der Eigenschaften des Organic Computing leistet. Es werden zwei Alternativen untersucht: Im ersten Ansatz, dem einstufigen KHS, werden die Pfade eines Systems direkt durch das KHS auf die Ressourcen zu Ausführung verteilt. Zusätzlich werden Mechanismen zur Begrenzung der Übernahmehäufigkeit der Pfade auf den Ressourcen und ein Terminierungs-mechanismus entwickelt. Im zweiten Ansatz, dem zweistufigen KHS, werden durch das KHS zunächst Ressourcen exklusiv für Klassen von Pfaden reserviert. Dann werden die Pfade des Systems auf genau den reservierten Ressourcen vergeben, so dass eine Ausführung ohne Wechselwirkung zwischen Pfaden verschiedener Klassen ermöglicht wird. Auch hierfür werden Methoden zur Beschränkung der Übernahmehäufigkeiten und Terminierung geschaffen. Für die Verteilung und Terminierung von Pfaden durch das einstufige oder zweistufige KHS können Zeitschranken angegeben werden, so dass auch harte Echtzeitschranken eingehalten werden können. Zum Schluss werden beide Ansätze mit verschiedenen Benchmarks evaluiert und ihre Leistungsfähigkeit demonstriert. Es zeigt sich, dass der erste Ansatz für einen Nutzer einfacher zu handhaben ist, da die benötigten Parameter sehr leicht berechnet werden können. Der zweite Ansatz ist sehr gut geeignet, wenn eine geringe Anzahl von Ressourcen vorhanden ist und die Pfade verschiedener Klassen möglichst unabhängig voneinander laufen sollen. Fazit: Durch die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse ist jetzt möglich, mit echtzeitfähigen Algorithmen die Ausführbarkeit von zeitlich abhängigen Tasks zu untersuchen und den Ressourcenaufwand für ihre Ausführung zu optimieren. Weiterhin werden zwei verschiedene Ansätze eines künstlichen Hormonsystems zur Allokation solcher Tasks in einem verteilten System bereit gestellt, die ihre Stärken unter jeweils verschiedenen Randbedingungen voll entfalten und somit ein breites Anwendungsfeld abdecken. Für den Rechenzeitaufwand beider Ansätze können Schranken angegeben werden, was sie für den Einsatz in Echtzeitsystemen qualifiziert.
Lorenz von Stein und die Französische Revolution : Zeitgeschichte als Theorie der Gesellschaft
(2010)
Die Präkonditionierung mit den bakteriellen Zellwandbestandteilen Lipopolysaccharid (LPS) oder Lipoteichonsäure (LTA) führt in vivo zu einer Reduktion der myokardialen Infarktgröße nach Ischämie und Reperfusion (I/R). Hierbei wird durch die Präkonditionierung u.a. die Akkumulation neutrophiler Granulozyten im Ischämiegebiet während der Reperfusionsphase reduziert und somit einer der wichtigsten Mechanismen bei der Entstehung des Reperfusionsschadens am Herzen vermindert. In dieser Studie bedienten wir uns eines ex vivo Modells nach Langendorff mit regionaler I/R und zellfreier Perfusion. Wir konnten erstmalig eine LTA-Präkonditionierung in einem leukozytenfreien System zeigen und somit demonstrieren, dass die LTA-Präkonditionierung Mechanismen involviert, die unabhängig sind von einer Akkumulation neutrophiler Granulozyten. 24 Stunden nach einer Vorbehandlung der Ratten mit LPS, LTA, Kochsalz und/oder Dexamethason wurden die Herzen entfernt und retrograd mit oxygenierter Krebs-Henseleit-Lösung perfundiert. Die Herzen wurden einer 20-minütigen Ischämie, gefolgt von einer 2-stündigen Reperfusionsphase, unterzogen. Das Infarktrisikogebiet (Evans-Blue-Färbung) und das Infarktgebiet (pNBT-Färbung) wurden planimetrisch bestimmt. Die ischämische Präkonditionierung (IPC) wurde als Positivkontrolle unseres Modells verwendet. LTA- und LPS-Präkonditionierung führten - ebenso wie IPC - bei gleicher Dosierung in vergleichbarem Umfang zu einer signifikanten Reduktion der Infarktgröße. Dieser Effekt konnte durch Vorbehandlung mit Dexamethason vollständig aufgehoben werden, so dass gefolgert werden kann, dass die Protektion durch LPS bzw. LTA. von der Modulation der inflammatorischen Vorgänge im Endothel und Myokard mit abhängt.
In der vorliegenden Arbeit konnten wir in den einzelnen Lipidfraktionen die gleichen Unterschiede zeigen, die bereits in anderen Untersuchungen aufgezeigt worden waren. Vor allem in den Phospholipiden, im Plasma und in den Erythrozyten ließen sich für die cis-Linolensäure (C18:2ω6c), die Arachidonsäure (C20:4ω6) und die Docosahexaensäure (C22:6ω3) Erniedrigungen beschreiben. Auch in den Cholesterylestern und den Triglyceriden, die als direkte Nahrungsfette gewertet werden können, zeigt sich diese Verteilung, so dass von einer Unterversorgung mit diesen Fettsäuren ausgegangen werden muß. Die Ergebnisse zeigen, dass bereits wenige Fettsäuren zur Beurteilung der Fettsäure-Situation bei Cystische Fibrose-Patienten ausreichen, so dass in Folgeuntersuchungen auf die Auswertung bei Cystische Fibrose-Patienten aller Fettsäuren verzichtet werden kann. Die Gruppen sollten zur Stabilisierung und besseren Reproduzierbarkeit der Werte vergrößert werden. In Folgeuntersuchungen sollte die Ernährung und der Ernährungstatus dokumentiert werde. Die Patienten in unserer Gruppe hatten alle die gleiche Mutation (ΔF 508) und waren adäquat ernährt. Im Einzelnen lässt sich jedoch nicht mehr sagen in welcher Form und Menge Fett zugeführt worden waren. Die Verteilungsmuster in den Triglyceriden und den Cholesterylestern lassen jedoch eindeutig, wie schon in der Literatur beschrieben, auf einen essentiellen Fettsäuremangel schließen. Keiner der Patienten erhielt eine zusätzliche Substitution mit ultralangkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren der ω3/ω6- Familien. Es lässt sich nur mit Hilfe der Literatur diskutieren welche Ursachen bei unseren Patienten für den essentiellen Fettsäuremangel verantwortlich sind, da unsere Arbeit lediglich eine Erhebung über den Ist-Zustand darstellt. Für die Klärung der Malabsorption müssten Untersuchungen angeschlossen werden, die mit einer Substitution von ultralangkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren einhergehen. Das Membranverhalten und Rezeptorverhalten kann über die Messung der Phospholipide konkretisiert werden. Im Bezug auf die inflammatorische Antwort könnten die Leukotriene und andere Mediatoren der inflammatorischen Antwort parallel gemessen werden. Als weiteres Ergebnis zeigten sich bei den von uns untersuchten Cystische Fibrose-Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe keine oder nur in Spuren vorhandene trans-Fettsäuren.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, eine weltweit einmalige Messapparatur zu entwickeln, mit der Wasserstoffmolekülionen mittels kurzer Laserpulse ionisiert und die Reaktionsprodukte kinematisch vollständig vermessen werden können. Es wird dazu eine an die Coltrims-Technik angelehnte Detektionsmethode genutzt, bei der sowohl Protonen als auch Elektronen über den vollen Raumwinkel nachgewiesen werden können. Die H2+ -Ionen stammen aus einer Hochfrequenz-Ionenquelle und werden auf 400keV beschleunigt. Die Besetzungshäufigkeit der Vibrationsniveaus entspricht daher der Franck-Condon-Verteilung für den Übergang aus dem Grundzustand des neutralen Wasserstoffmoleküls in den elektronischen Grundzustand des Molekülions: H2 (xPg, ν = 0) → H2+ (1sσg, ν′) Dieser Ionenstrahl wird mit einem 780 nm Laserpuls der Pulslänge 40 fs überlappt. Nach der Reaktion fragmentiert das Molekülion entweder über den Dissoziationskanal H2+ + nhν ⇒ H + H+ oder über eine Ionisation gefolgt von einer Coulomb-Explosion: H2+ + nhν ⇒ H+ + H+ + e−. Die Projektile werden nach einer Driftstrecke von etwa 3 m auf einem Ionendetektor nachgewiesen. Für den Nachweis der Elektronen wurde ein spezielles Spektrometer konzipiert, das eine Unterdrückung ungewollter Elektronen erlaubt und so die Messung der Elektronen ermöglicht. Um Elektronen auszublenden, die vom Laser aus dem Restgas ionisiert werden, ist der Elektronendetektor in Flugrichtung der Ionen versetzt angebracht. Durch die unkonventionelle Ausrichtung des Lasers in einem Winkel von 20◦ relativ zur Flugrichtung der Ionen können vom Laser erzeugte Elektronen nur dann den Elektronendetektor erreichen, wenn sie aus dem bewegten Bezugsystem der Projektile stammen. Diese Unterdrückung macht die Messung der Elektronen erst möglich, hat aber auch eine nachteilige Geometrie der Verteilungen gegenüber den Detektorebenen zur Folge. Durch die Ausnutzung der Projektilgeschwindigkeit ist überdies die Benutzung eines B-Feldes zur Verbesserung der Flugzeitauflösung der Elektronen nicht möglich. Um eine Überlappung des Ionenstrahls mit dem Laserfokus zu erreichen, wurde im Bereich der Reaktionszone ein System zur Visualisierung der Strahlpositionen integriert. Dieses kann überdies für eine Intensitätseichung bei linear polarisiertem Licht verwendet werden. Bei der Reaktion kommt es durch die vergleichsweise lange Pulsdauer schon bei relativ niedrigen Intensitäten zu Dissoziationsprozessen. Das dissoziierende Molekül erreicht noch während der ansteigenden Flanke des Laserpulses auf diese Weise Abstände, bei denen der Prozess der Charge-Resonance-Enhanced-Ionization (CREI) stattfinden kann. Auch die in einem sehr engen Winkelbereich um die Polarisationsrichtung des Lasers liegende Winkelverteilung der gemessenen Protonen deutet darauf hin, dass CREI der dominante Ionisationsprozess ist. Durch die vorausgehende Dissoziation nimmt das Molekül schon vor der Ionisation eine kinetische Energie auf, so dass die gemessene KER-Verteilung einer Summe aus KERDissoziation und KERIonisation darstellt. Ein Vergleich mit den KER-Spektren des Dissoziationsprozesses zeigt, dass die aufgenommene Energie durch Dissoziation zu einem überwiegenden Anteil in einem Bereich von 0, 6 ± 0, 35 eV besitzt, während die Gesamt-KER-Verteilung deutlich höhere Werte bis zu 6 eV aufweist. Dies ermöglicht, aus der gemessenen KER-Verteilung den internuklearen Abstand zum Ionisationszeitpunkt näherungsweise zu bestimmen. Die gemessenen Elektronen weisen, ebenso wie die Protonen, eine scharfe Ausrichtung entlang der Laserpolarisation auf, was durch den Einfluss des Lasers auf dieser Achse nicht verwunderlich ist. Bei zirkularer Polarisation dagegen findet eine Netto-Beschleunigung der Elektronen senkrecht zur Richtung des elektrischen Feldes zum Ionisationszeitpunkt statt, sodass die Messung der Elektronenimpulse eine geeignete Messgröße zur Untersuchung des Ionisationsprozesses darstellt. Auf diese Art konnten Winkelverteilungen der Elektronen bezüglich der internuklearen Achse innerhalb der Polarisationsebene gemessen werden. Abhängig von KER und Elektronenergie konnte dabei eine Verdrehung der Verteilung gegenüber den klassisch erwarteten 90◦ relativ zur internuklearen Achse festgestellt werden. Die Winkelverteilung rotiert dabei mit steigendem KER entgegen des Drehsinns. Dies widerspricht der gängigen Vorstellung einer Tunnelionisation, bei der nur die Beschleunigung des Elektrons im Laserfeld eine Rolle spielt und der Einfluss des Coulomb-Potentials vernachlässigt wird. Für höhere Elektronenergien zeigt sich eine zweite konkurrierende Struktur, die für die höchsten Energien die sonst vorherrschende erste Struktur sogar dominiert. Da sich in den Protonenspektren für linear polarisiertes Licht kein Einfluss einer Ionisationsenkrecht zur Polarisationsrichtung findet, erscheint dies als Grund für die zweite Struktur in den Elektron-Winkelverteilungen als unwahrscheinlich. Eine stichhaltige und gestützte Erklärung gibt es bisher weder für die Rotation der ersten Struktur noch für die Herkunft der zweiten. Dies zeigt deutlich, dass es auch für dieses einfachste Molekülsystem noch einen erheblich Handlungsbedarf sowohl auf theoretischer als auch von experimenteller Seite gibt. Da dieses Experiment den ersten experimentellen Zugang für die direkte Untersuchung der Elektronimpulse bei der Ionisation von H2+ -Ionen in kurzen Laserpulsen darstellt, bietet sich hier die bisher einzige Möglichkeit, dieses Verhalten experimentell zu untersuchen.
Das Junior Temperament und Charakter Inventar (JTCI) ist ein auf C. R. Cloningers (Cloninger et al., 1993) psychobiologischem Persönlichkeitskonzept basierender Persönlichkeitsfragebogen für Jugendliche im Alter von 12 bis 18 Jahren. Er ist aus der Erwachsenenversion TCI (Temperament and Character Inventory) hervorgegangen und trennt „Persönlichkeit“ in die Konstrukte „Temperament“ (automatische emotionale Reaktionen beim Erleben, Verhaltensstil) und „Charakter“ (Selbstkonzepte und individuelle Unterschiede in Zielen und Werten, welche die Entscheidungsfreiheit, die Intentionen und die Bedeutung dessen, was im Leben erfahren wird, beeinflussen), welche sich wiederum aus insgesamt sieben Dimensionen zusammensetzen. In den letzten Jahren ist das internationale Interesse an Cloningers Konzept insbesondere in der Psychiatrie stark gestiegen, was sich in stetig zunehmenden Veröffentlichungen (insbesondere für das Erwachsenenalter) zeigt. Besonders ist an diesem rein theoriebasierten Inventar, dass in Abgrenzung zu den meisten gängigen Inventaren sowohl „normale“ als auch pathologische Persönlichkeitsvarianten gleichermaßen beschrieben werden können, wobei das Temperament den spezifischen Stil auffälligen Verhaltens aufklären soll, während anhand der Charakterausprägung eine Aussage darüber möglich sein soll, ob überhaupt eine psychische Auffälligkeit vorliegt. Da sich für die erste Jugendversion des Inventars JTCI 80 (Schmeck et al., 1995) trotz guter Konstruktvalidität eine nur geringe Skalenreliabilität zeigte, wurde eine grundlegende Revision zum in dieser Arbeit zentralen JTCI 12-18 (Goth, Schmeck, Meyenburg & Poustka, 2000) durchgeführt. Zur Überprüfung der inhaltlichen und diagnostischen Validität im Sinne einer inhaltlichen Lokalisation der erfassten Konstrukte sowie der Einflüsse sozio-demographischer Variablen (Alter, Geschlecht, Bildungsniveau, Nationalität, sozialer Status) auf die Persönlichkeit wurde neben einer umfangreichen Felduntersuchung an 715 Frankfurter Schülern eine klinisch / ambulante Stichprobe (N = 92) erhoben. Es ergab sich eine sehr gute Konstruktvalidität sowie eine überzeugende Kriteriumsvalidität. Der geringe Einfluß sozio-demographischer Faktoren insbesondere auf das Temperament konnte sich ebenfalls bestätigen. Sofern gleiche Außenkriterien vorhanden waren, wurde durch einen deskriptiven Vergleich mit den Ergebnissen der Vorgänger- und der mittlerweile erschienenen NachSeite 129 folgeversion des JTCI ein Versuch einer „differenzierten Nachuntersuchung“ der Äquivalenz der drei „Inventar-Generationen“ unternommen, um daraus wichtige Rückschlüsse zur weiteren Verwendbarkeit der einzelnen Versionen zu ziehen. Besonders wichtig ist dies, da auch heute noch aktuelle Forschungen mit den verschiedenen Versionen des Jugendfragebogens durchgeführt werden und eine ausreichende Äquivalenz für eine inhaltliche Übertragbarkeit der Ergebnisse unabdingbar ist. Es zeigten sich dabei zwischen den beiden jüngeren Versionen durchweg in Richtung und Höhe übereinstimmende Korrelationen im Vergleich mit verwandten und diagnostischen Inventaren. Ähnliche Ergebnisse erbrachte der Vergleich mit der ursprünglichen JTCI-Version, wobei hier die „Schadensvermeidung“ entgegen der Erwartung keine Beziehung zur IVE-Waghalsigkeit aufwies. Insgesamt sprechen die Ergebnisse jedoch für eine „generationsübergreifende“ stabile inhaltliche und klinische Validität, was die von Cloninger aufgestellte Theorie bekräftigt. Dennoch konnten die Skalenreliabilitäten des JTCI 12-18 nicht ausreichend verbessert werden, um den gängigen Kriterien zu genügen (Goth, 2008), weshalb in den letzten Jahren eine nochmalige Revision durchgeführt wurde, die sich speziell an Cloningers revidierter Operationalisierung im Erwachsenenbereich anlehnt. Heute existiert das JTCI / 12-18 R sowie eine komplette „JTCI-Familie“ (Goth & Schmeck, 2009), deren Verwendung ohne Einschränkung auch im Rahmen längsschnittlicher Erforschungen der Entwicklung von Persönlichkeit und Psychopathologie empfohlen werden kann, da hiermit erstmals eine fundierte Erfassung „der gleichen“ Persönlichkeitseigenschaften bei Kindern und Erwachsenen ohne Konzeptwechsel möglich ist (Goth, 2008). Aufgrund der verbesserten Skalenreliabilitäten und der Aktualität der Skalenoperationalisierung sollte heute ausschließlich die aktuellste Version JTCI/ 12-18 R Anwendung finden. Ergebnisse der Vorgängerversion JTCI 12-18 können in Anbetracht der durchweg guten Inhaltsäquivalenz jedoch durchaus berichtet werden, während die erste Version JTCI 80 insbesondere wegen der o.g. fehlenden Beziehungen nicht mehr verwendet werden sollte.
Protein-Protein Interaktionen der NADH: Ubichinon-Oxidoreduktase (Komplex I) aus Yarrowia lipolytica
(2010)
Protein-Protein Interaktionen der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase (Kolmplex I) aus Y. lipolytica In der inneren Mitochondrienmembran sind die Atmungskettenkomplexe I bis IV und die ATP-Synthase lokalisiert. Parallel zum Elektronentransport werden Protonen von der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase (Komplex I), der bihydrochinon:Cytochrom c-Oxidoreduktase (Komplex III) und der Cytochrom c-Oxidase (Komplex IV) über die Membran in den Intermembranraum gepumpt. Der resultierende chemiosmotische Gradient wird von der ATPase verwendet um ATP zu generieren. Die NADH:Ubichinon- xidoreduktase ist der Startpunkt des Elektronentransfers. Der Komplex I wurde in verschiedenen Organismen in Interaktion mit Komplex III und IV beobachtet. Diese funktionellen Einheiten werden als Respirasomen oder Superkomplexe bezeichnet (Pfeiffer und Schägger, 2000). Der Komplex I in prokaryotischen Zellen stellt die kleinstmögliche Variante dieses Enzyms dar. Da er in der Lage ist, alle bioenergetischen Reaktionen durchzuführen, werden die beteiligten 14 Untereinheiten als zentrale Untereinheiten bezeichnet (Fearnley et al. 1992). In den Eukaryoten findet sich ein Enzym, das je nach Organismus bis zu 31 weitere, sogenannte akzessorische Untereinheiten aufweist. Da diese Untereinheiten keine Homologie mit bakteriellen Proteinen aufweisen, wird davon ausgegangen, dass sie eher eine Funktion im Assemblierungsprozess ausüben als am Elektronentransfer oder der Translokation der Protonen beteiligt zu sein. Ziel dieser Arbeit war es daher mögliche Interaktionspartner des Komplex I oder weitere Untereinheiten zu finden. Für die Detektion möglicher Interakteure sollten neben einem Two-Hybrid-Screen noch weitere Methoden etabliert werden. Als Modellsystem wurde Yarrowia lipolytica verwendet. Unter Verwendung des BacterioMatchII® Systems konnte die mitochondriale Malat-Dehydrogenase, ein Enzym des Citrat-Zyklus, als ein Interaktionspartner des Komplex I gefunden werden. Bei der Reaktion entsteht NADH, das Energieäquivalent, welches dem Komplex I Elektronen liefert. Im Kontext des Substratchannelings deutet die Interaktion der mitochondrialen Malat- ehydrogenase auf hochgeordnete Stukturen im Matrixraum hin, die einen Transfermechanismus oder eine zielgerichtete Diffusion des NADH gewährleisten könnten. Durch die Kombination der Methoden Immunpräzipitation, Gelelektrophorese und MALDI-MS konnten erstmals Hinweise auf Superkomplexe in Y. lipolytica gefunden werden, was dann durch mehrdimensionale Gelelektrophorese bestätigt werden konnte. In dieser Arbeit konnten die Superkomplexe I1III2 ,I1III2IV1 und I1III2IV2 identifiziert werden. Ein vollständiges Respirasom mit einer Stöchiometrie von I1III2IV4 konnte nicht gezeigt werden. Desweiteren konnte die Anwesenheit eines Komplex I-Dimers nachgewiesen werden. In dem bisher postulierten Modell der respiratory strings werden die Superkomplexe durch tetramere Komplex IV-Module zu hochmolekularen Strukturen verknüpft (Wittig et al., 2006). Die detektierten Komplex I-Dimere lassen vermuten, dass sie zusammen mit dem tetrameren Komplex IV als Linker-Moleküle die Superkomplexe zu einem zweidimensionalen respiratory patch verbinden. Zudem konnte eine neue Untereinheit des Komplex I, genannt NEBM, durch das Zusammenspiel von LILBID- und MALDI-Massenspektrometrie und Gelelektophorese identifiziert werden. Durch MALDI-Massenspektrometrie wurde diese Untereinheit de novo sequenziert. Die Charakteristik des identifizierten Proteins entspricht den sogenannten single-transmembrane domain Untereinheiten (Brandt et al., 2005; Brandt 2006), die eventuell eine Funktion in der Assemblierung des Komplex I einnehmen könnten. Weder bei den Messungen der NADH:HAR- noch der dNADH:DBQ-Aktivität zeigte der Deletionsstamm enzymatisch aktiven Komplex I. Weder in blau-nativer Elektrophorese noch in silbergefärbten 2D SDS-Gelen war ein Komplex I noch ein Subkomplex sichtbar und auch In-Gel-Aktivitäts-Tests verliefen für die Detektion von Komplex I im Deletionsstamm negativ. Erst durch eine Western Blot Analyse konnte ein Subkomplex mit einer Größe von ca. 300kDa detektiert werden. Unter Berücksichtigung der für den Rinderkomplex vorgeschlagenen Einteilung des Komplex I in die Subkomplexe Iα und Iβ (Brandt et al. 2006) könnte der detektierte Subkomplex Iβ zugeordnet werden, da er zwei Untereinheiten beinhaltet, die diesem Komplex zuzuordnen sind. Die NEBM Untereinheit könnte also an der Assemblierung der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase beteiligt sein. Erstmals konnten Superkomplexe in Y. lipolytica Mitochondrien nachgewiesen werden. Die Identifizierung der neuen NEBM Untereinheit vervollständigt die Kenntnisse über die Untereinheitenzusammensetzung. Das Wechselspiel mit anderen Proteinen und die Zusammensetzung des Komplexes können für die Strukturaufklärung und zur Analyse des Reaktionsmechanismus wichtig sein. Somit leisten diese Ergebnisse einen wichtigen Beitrag zur Charakterisierung der NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase aus Y. lipolytica.
Neuere Daten weisen p53 eine wichtige Rolle in der Verarbeitung von Mangelsignalen zu und deuten darauf hin, dass p53-abhängige molekulare Mediatoren des Warburg-Effektes Glukoseverbrauch und mitochondriale Funktion regulieren. Wir stellten deshalb die Hypothese auf, dass p53-wildtyp (p53wt) in Gliomzellen den metabolischen Bedarf reduzieren kann, der durch deregulierte Signaltransduktionsprozessen unter Mangelbedingungen zu Stande kommt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die shRNA-vermittelte p53-Gensuppression als auch die Temperatur-sensitive dominant-negative p53V135A Mutante in humanen p53wt-Gliomzellen Glukoseverbrauch und Laktatproduktion erhöht, den Sauerstoffverbrauch reduziert und den Hypoxie-induzierten Zelltod steigert. Überdies konnte beobachtet werden, dass eine zelluläre p53-Suppression die Expression von Synthesis of Cytochrome c Oxidase 2 (SCO2), eines Effektors, der in der Atmungskette benötigt wird, reprimiert. Die Restoration von SCO2 in p53wt-defizient-Zellen konnte Glukoseverbrauch, Laktatproduktion und Sauerstoffverbrauch wieder normalisieren, und vermittelte zugleich eine Resistenz gegenüber Hypoxie von Rotenone, einem Inhibitor des Komplex I der Atmungskette, abhängige Weise. Dies zeigte, dass die SCO2-vermittelten Effekte von einer intakten oxidativen Phosphorylierung abhängig waren. Schließlich vermittelte eine Gensuppression von SCO2 in p53wt-Gliomzellen eine Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber moderater Hypoxie. Es konnte auch gezeigt werden, dass p53 und HIF-1alpha miteinander kooperieren, um SCO2 unter Hypoxie zu induzieren, was suggeriert, dass i) SCO2 ein neues HIF-1alpha Zielgen sein könnte und ii) SCO2 ein neues Zielprotein darstellen könnte, um Atmung und ROS-Prävention über HIF-alpha zu modulieren. Diese Befunde deuten darauf hin, dass Gliomzellen einen Nutzen aus dem Aufrechterhalten eines p53wt-Status erzielen können, da dies ihre Vulnerabilität gegenüber moderater Tumor-Hypoxie reduzieren kann, und dass dieser Effekt SCO2-vermittelt ist. Dennoch konnte die Sensitivität von p53wt-defizient-Zellen gegenüber hochgradiger Hypoxie-induziertem Zelltod nicht über die Effekte von SCO2 erklärt werden, da diese Oxidase ihre Funktionen nur unter ausreichend oxyschen Bedingungen erfüllen kann. Um die Mechanismen aufzuklären, die p53wt-Zellen vor hochgradiger Hypoxie Schutz verleihen, wurde die Rolle von TIGAR (Tp53 Induced Glycolysis and Apoptosis Regulator), eines weiteren kürzlich charakterizierten metabolischen p53-Zielgens, untersucht. TIGAR zeigt Ähnlichkeit mit der Fruktose-Bisphosphatase-2-Domäne des bifunktionalen Enzyms 6-Phosphofrukto-2-Kinase/Fruktose-2,6-Biphosphatase 2, und reduziert die intrazellulären Konzentrationen von Fruktose-2,6-Bisphosphat (FBP-2). FBP-2 ist ein Glykolyse-Regulator, der in höheren Konzentrationen die Glykolyse hemmt und den Pentose-Phosphat-Weg (PPP) induziert, was zu einer Verringerung der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies-Konzentrationen (ROS) führt. Die Überexpression von TIGAR in p53wt-Zellen verstärkte die Glykolyse-Hemmung unter normoxischen Bedingungen und erlaubte oxidative Phosphorylierung als kompensatorischen metabolischen Mechanismus. Zudem förderte TIGAR die Expression von Lon, einer Protease, die Untereinheiten der Atmungskette modulieren kann, und zugleich als Radikalfänger fungiert. Jedoch reduzierte TIGAR die Expression von SCO2. Die Restoration von TIGAR in p53wt-defizient-Zellen konnte die Sensibilität gegenüber hochgradiger Hypoxie aufheben. TIGAR reduzierte auch die ROS-Menge und verringerte die Sensitivität gegenüber oxidativen Stress. Zugleich sensibilisierte die Gensuppression von TIGAR in p53wt-Gliomzellen diese Zellen vor hochgradiger Hypoxie. Zudem korrelierte die Expression von HIF-1alpha mit der TIGAR-Expression, was eine neue Rolle von HIF-1alpha in der Regulation des Hypoxie-induzierten Zelltodes und der Protektion vor ROS vermuten ließ. Die Expression der Transketolase-Like-1 (TKTL1), eines Isoenzym der Transketolase im Pentose-Phosphat-Weg, ist in vielen Tumoren hochreguliert. Es wurde spekuliert, dass TKTL1 Zellen Schutz vor oxidativem Zellstress vermitteln kann. Zugleich ist bekannt, dass TKTL1 mit hohen phospho-Akt-Mengen in Gliomen korreliert. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass TKTL1 ein indirektes p53-Zielgen ist, welches über TIGAR reguliert werden kann. Eine Suppression der TKTL1-Expression in TIGAR-exprimierenden Zellen konnte die über TIGAR vermittelten protektiven Effekte gegenüber endogenen ROS, oxidativem Stress und Hypoxie-induziertem Zelltod aufheben. Folglich wurde hier ein bis jetzt unbekannter Zusammenhang zwischen TIGAR, TKTL1 und HIF-1alpha entdeckt. Ebenso konnte eine TKTL1-Suppression mittels siRNA wie die TIGAR-Suppression die HIF1-alpha-Transaktivierungsfähigkeit reduzieren, was zu der Vermutung Anlass gab, dass TKTL1 HIF1-alpha unter Hypoxie reguliert.
Die Gamma-Glutamyl-Carboxylase spielt eine Schlüsselrolle im menschlichen Organismus, da sie für die posttranslationale Modifikation sämtlicher Vitamin-K-abhängiger Proteine verantwortlich ist. Ein hereditärer Mangel aller Vitamin-K-abhängigen Faktoren aufgrund eines Defekts in der Gamma-Glutamyl-Carboxylase (VKCFD1) ist sehr selten und geht mit einer gesteigerten Blutungsneigung einher. Aktuelle Arbeiten zeigen eine weitere Manifestation von Mutationen im Gamma-Glutamyl-Carboxylase-Gen, die ein dermatologisches Krankheitsbild, ähnlich der Pseudoxanthoma elasticum, darstellt. In diesen Fällen zeigen die Patienten sowohl dermatologische Effloreszenzen im Sinne der PXE als auch eine Verminderung der Vitamin-K-abhängigen Faktoren. Es wird vermutet, dass die PXE-ähnlichen Hautveränderungen auf eine Funktionsstörung des Matrix-Gla-Proteins zurückzuführen sein könnten. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutationsdiagnostik bei vier Patienten mit kongenitalem Mangel aller Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsfaktoren durchgeführt. Insgesamt wurden dabei fünf Mutationen nachgewiesen, davon vier Missense-Mutationen und eine Stopp-Mutation. Zwei der Patienten wiesen eine „compound Heterozygotie“ auf. Bei den gefunden Mutationen wurden drei im Rahmen dieser Arbeit erstmals aufgezeigt, die anderen zwei waren in der Literatur bereits beschrieben. Bei einer der Mutationen konnte ein „Founder“-Effekt in Bezug auf einen anderen Patienten aus der Literatur nachgewiesen werden. Sollte zukünftig diese Mutation in Deutschland vorkommen und sich auch auf die „Founder“-Mutation zurückführen lassen, böte sich dieser Mechanismus als eine Erklärung für das gehäufte Vorkommen der VKCFD Typ 1 in Deutschland an. Ein Hinweis auf eine PXE-like Disorder konnte bei keinem der Patienten nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde die genetische Variabilität des Gamma-Glutamyl-Carboxylase-Gens in der Normalbevölkerung untersucht. Für die Untersuchungen wurde zunächst die DNA einer phänotypisch unauffälligen Kontrollgruppe, bestehend aus 200 gesunden Blutspendern, auf Genvariationen im GGCX-Gen analysiert. Nach der Isolierung und der Amplifikation der DNA wurde mit sämtlichen Proben zunächst ein Mutations-Screening mittels dHPLC durchgeführt. Auffällige Abschnitte und solche, bei denen häufige und/oder mehrere Polymorphismen bereits bekannt waren, wurden sequenziert. Auf diese Weise wurden acht Polymorphismen in den codierenden bzw. die Exone flankierenden Genabschnitten nachgewiesen. Davon wurden zwei erstmals beschrieben (c.43+33T>A; c.1288-38T>C). Schließlich sollte mit dieser Arbeit versucht werden zu klären, wie eine möglichst effiziente Diagnostik von Mutationen bzw. Polymorphismen des GGCX-Gens möglich ist. In unseren Untersuchungen wurde sowohl mit der dHPLC (Wave-System) als Screening-Methode gearbeitet als auch Genabschnitte sequenziert. Mittels der dHPLC kann ein hohes Probenaufkommen in kurzer Zeit mit vergleichsweise geringem Aufwand und vergleichsweise geringeren Kosten (ca. 30 € pro Genuntersuchung vs. Komplettsequenzierung ca. 300 €) bewältigt werden. Bei Genabschnitten mit vielen oder häufigen Polymorphismen ist dies ineffektiv, weil es nur das Vorhandensein einer Veränderung, nicht jedoch die Veränderung selbst beschreiben kann. Daher empfiehlt es sich, beide Methoden zu kombinieren, welches sich als die effizienteste und rationalste Methode für die Mutationsdiagnostik darstellt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind von grundsätzlichem Interesse für die biomedizinische Forschung. Eventuell wird es damit dann möglich sein, Krankheitsentstehungen und ihre Verläufe bei Mutationen der Gamma-Glutamyl-Carboxylase besser zu verstehen und damit eine noch effektivere und nebenwirkungsärmere Therapie einzusetzen.
Mit der vorliegenden Arbeit wurden zu ersten Mal die seit mehreren Jahren vorhergesagten dynamischen Aufbruchsmechanismen - der direkte, der sequentielle und der asynchrone Zerfall - in mehratomigen Molekülen kinematisch vollständig untersucht. Experimentell wurde hierfür ein Kohlenstoffdioxid-(CO2)-Molekül in langsamen Ion-Molekül Stößen dreifach ionisiert, indem die Elektronen des Targets von den langsamen, hochgeladenen Projektilionen (Ar8+-Ionen) eingefangen wurden. Die Untersuchung des Zerfalls des CO2-Ions in die einfach geladenen ionischen Fragmente C+ + O+ + O+ zeigte, dass bei diesem Zerfall das Projektilion vornehmlich einen positiven Ladungszustand von q = 6 und nicht den zunächst erwarteten Ladungszustand q = 5 aufweist. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die eingefangenen Elektronen oftmals elektronisch hoch angeregte Zustände im Projektil populieren und demnach im weiteren Verlauf über Autoionisationsprozesse dieses auch wieder verlassen können. Ähnliche Autoionisationsprozesse können auch im Target ablaufen, treten dort jedoch mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit auf, da der Wirkungsquerschnitt für Autoionisationsprozesse im Target um einen Faktor 1,3 kleiner ist als für Autoionisationen im Projektil. Zusätzlich zeigte die Untersuchung der Stoßdynamik, dass der dreifache Elektroneneinfang primär bei einer parallelen Orientierung der Molekülachse zur Projektilstrahlachse auftritt. Eine weitere Abhängigkeit der Stoßdynamik zum Beispiel vom Stoßparameter beziehungsweise vom Streuwinkel konnte nicht beobachtet werden. Durch die koinzidente Messung aller vier Reaktionsteilchen konnte der Kanal Ar8+ + CO2 --> Ar6+ + C+ + O+ + O+ eindeutig bestimmt werden und die Reaktionsdynamik des CO2-Ions nach dem Stoß analysiert werden. Dabei tritt deutlich der direkte Aufbruch hervor, bei welchem die drei einfach geladenen Ionen sich rein aufgrund ihrer Coulombkräfte voneinander abstoßen. Bei einer solchen Coulombexplosion bleibt dem Molekülion kaum Zeit, um eine molekulare Schwingung zu vollführen. Neben diesem schnellen Zerfall konnten aber auch jene Zerfälle beobachtet werden, bei denen das Molekülion zuerst molekular schwingt und dann zu einem späteren Zeitpunkt in die ionischen Fragmente zerfällt. Dieser letztere Zerfallsprozess gehört zu den sogenannten asynchronen Zerfallsmechanismen. Er stellt einen Zwischenprozess zwischen dem reinen 1-Stufen-Prozess wie dem direkten Aufbruch und dem reinen 2-Stufen-Prozess dar. Bei solchen sequentiellen 2-Stufen Prozessen fragmentiert das CO2-Molekül im ersten Schritt in ein O+- und ein CO2+-Ion. Im zweiten Schritt dissoziiert dann das CO2+-Fragment, nachdem es nahezu keine Wirkung der Coulombkräfte des ersten Sauerstoffions mehr spürt, in ein C+- und ein O+-Ion. Durch die Darstellung der Schwerpunktsimpulse der Fragmente in Dalitz- und Newton-Diagrammen ist es mit dieser Arbeit erstmals gelungen diesen sequentiellen Prozess experimentell eindeutig nachzuweisen. In der weiteren Analyse konnte gezeigt werden, dass über die im System deponierte Energie, welche über die kinetische Energie der Fragmente bestimmt wird, die verschiedenen Reaktionsmechanismen direkt kontrolliert werden können. Speziell bei Energien unterhalb von 20 eV wurde gezeigt, dass es keine Potentialflächen gibt, die über einen direkten bzw. simultanen Aufbruch zu dem Endzustand C+ + O+ + O+ führen. Bei mehratomigen Molekülen erweist sich das Treffen detaillierter Aussagen über mögliche Dissoziationskanäle ohne die genaue Kenntnis der Lage der Potentialflächen und den Übergängen zwischen diesen als äußerst schwierig. Selbst bei genauer Kenntnis der Lage und Form der Potentialflächen, ist es aufgrund der hohen Dichten innerhalb der Übergangsbereiche der Potentialflächen nahezu unmöglich, den Verlauf der Dissoziationskanäle zu verfolgen. Mit dieser Arbeit ist es gelungen, die verschiedenen Reaktionskanäle ohne die Existenz von Energiepotentialflächen eindeutig zu identifizieren. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Energie, die während des Stoßes im Molekül deponiert wird, eine Schlüsselgröße darstellt, mit welcher die Fragmentationskanäle direkt kontrolliert werden können.
Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung lichtinduzierter Strukturänderungen verschiedener photoschaltbarer Moleküle durch zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie. Hierzu war es notwendig, eine komplexe Messapparatur zu konzipieren, aufzubauen und zu optimieren. Das entwickelte Anreg-/Abtast-Experiment ermöglicht die Messung kleinster transienter Absorptionsänderungen (delta A<1E-5) im Spektralbereich von 1000 cm^-1 bis 2500 cm^-1 mit einer Zeitauflösung von etwa 0,3 ps. Es können Anregungspulse im Bereich von 258nm bis über 600nm generiert werden. Über ein computergesteuertes Wellenplättchen kann die Polarisation des Anregungslichtes während der Datenaufnahme variiert werden, was eine Auswertung hinsichtlich der molekularen Anisotropie ermöglicht. Die eingesetzten Probenzellen gestatten die Untersuchung geringster Probenmengen (V <20µL) bei Temperaturen bis zu 50°C. Nitrophenylacetat (NPA) wurde hinsichtlich seiner Photodecarboxylierungsreaktion untersucht. Für alle drei Konstitutionsisomere konnte nachgewiesen werden, dass die Freisetzung von CO2 innerhalb von 1 ns erfolgt. Es zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen den Reaktionsverläufen der drei Konstitutionen, wobei die erhaltenen Amplituden der Photoproduktspektren mit den bekannten Decarboxylierungsquantenausbeuten korrelieren. Die globale Analyse ergibt einen multiexponentiellen Aufbau des CO2-Signals. Im Fall von meta- und para-NPA erfolgt die Abspaltung von CO2 über einen dominanten Zerfallskanal mit einer Zeitkonstante von t~200 ps. Quantenchemische Rechnungen legen nahe, dass dieser Hauptreaktionspfad über den Triplettzustand verläuft. Bei ortho- NPA wird dieser Zerfallskanal effektiv gequencht, was mit einer schnellen Deaktivierung des angeregten Singulettzustandes durch einen intramolekularen Protonentransfer erklärt wird. Nach diesen Messungen steht fest, dass meta-Nitrophenylacetat hervorragend als caged compound für CO2 geeignet ist. Die Primärdynamik von solubilisiertem Proteorhodopsin (PR) in D2O wurde im infraroten und sichtbaren Spektralbereich sowohl bei saurem als auch bei alkalischem pD-Wert untersucht. Dies erlaubt den direkten Vergleich der in beiden Spektralbereichen gemessenen Daten. Der primäre Protonenaktzeptor Asp97 liegt dabei entweder protoniert (pD=6,4) oder deprotoniert (pD=9,2) vor. Die transienten vis-Absorptionsspektren ergaben, wie bei PR in H2O, einen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands und die gleichzeitige Bildung des PRK-Photoproduktes. Die Abweichung der bei PR in D2O ermittelten Werte von den publizierten Zeitkonstanten der H2O-Messung wird als kinetischer Isoptopeneffekt interpretiert. Dieser variiert mit dem pD-Wert, was auf Unterschiede der Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke in der Retinalumgebung hinweist. Die Signaturen der transienten Infrarotspektren werden den C=C- und C=N-Moden des Retinals sowie der Amid I-Mode des Proteins zugeordnet. Es konnte ebenfalls die Bildung des PRK-Produktes nachgewiesen werden, wobei die Isomerisierungsquantenausbeute des Retinals unabhängig von der Protonierung von Asp97 ist. Die im IR bestimmten Zeitkonstanten sind dabei unabhängig vom pD-Wert und weichen von den im Sichtbaren ermittelten Werten ab. Dieser Befund wird mit dem Einfluss der molekularen Temperatur auf die transienten IR-Spektren und dem Auftreten von Kühlprozessen erklärt. Zusätzlich zum Wildtyp-Protein wurde die PR-D97N-Mutante als Modellsystem für PR im sauren pH-Bereich ebenfalls im vis- und IR-Bereich untersucht. Die dabei erzielten Ergebnisse stehen im Einklang mit den bisherigen Ausführungen. Der geringe kinetische Isotopeneffekt weist auf ein ähnliches Wasserstoffbrückennetzwerk wie beim Wildtyp unter sauren Bedingungen hin. Als letztes wurde ein synthetisches Modellcollagen untersucht. Die Seitenkettenverbrückung der Peptidsequenz mit einem Azobenzol-basierten, künstlichen Photoschalter sollte eine lichtinduzierte Entfaltung der Tertiärstruktur ermöglichen. Der isolierte Photoschalter und die gekoppelte Sequenz wurden zunächst unter Gleichgewichtsbedingungen sowohl im UV/vis- als auch im IR -Bereich umfangreich spektroskopisch charakterisiert. Diese Messdaten lagen zum großen Teil bereits vor und wurden in dieser Arbeit einer detaillierten Auswertung unterzogen. Für den isolierten Schalter konnte im IR-Bereich eine umfassende Bandenzuordnung erstellt werden. Dabei wird im photostationären Gleichgewicht eine reversible trans-> cis-Isomerisierung festgestellt, welche keine Temperaturabhängigkeit aufweist. Darüberhinaus wurden polarisationsabhängige, transiente IR-Spektren des isolierten Azoschalters für die trans->cis- und die cis->trans-Isomerisierungsrichtung aufgenommen. Die instantan auftretenden, markanten Differenzsignale können den Amid I- und Amid II-Moden der im Schalter enthaltenen Peptidbindungen sowie den Phenylmoden zugeordnet werden. Die extrahierten kinetischen Parameter sind für beide Isomere nahezu identisch, was durch einen dominanten Beitrag molekularer Kühlprozesse erklärt werden kann. Aufgrund der geringen Isomerisierungsquantenausbeute (< 10 %) können die Differenzspektren der photostationären Gleichgewichte nicht in den Produktspektren dieser Messungen reproduziert werden. Hinsichtlich der ermittelten Anisotropieparameter ergeben sich kleine Unterschiede zwischen beiden Datensätzen. Zusammen mit theoretischen Modellierungen werden diese in Zukunft genauere Aussagen über die Strukturen der Isomere erlauben. Die UV/vis-Absorptionsspektren des gekoppelten Systems zeigen, dass die Absorptionsbanden des Azoschalters durch die Kopplung an das Collagen nicht signifikant beeinflusst werden. Im IR-Absorptionsspektrum konnten wichtige Amid I-, Amid II- und Amid II0-Banden des Azoschalters und der Peptidsequenz sowie eine große Anzahl weiterer Banden zugeordnet werden. Temperaturabhängige Absolut- und Differenzspektren im UV/vis- und IR-Bereich zeigen eine irreversible thermische Denaturierung der Collagentripelhelix ab etwa 50°C. Das verwendete, deuterierte Lösungsmittelgemisch führt zu einem H/D-Austausch. Anhand der Amid II-Bande der in der tripelhelikalen Struktur geschützten Glycine kann die Existenz der Collagenstruktur und ihre Entfaltung nachgewiesen werden. Die Amplituden der photostationären Differenzspektren sind jedoch kleiner als beim isolierten Schalter, was auf eine verringerte Isomerisierungsquantenausbeute hinweist. Die bei Erwärmung beobachtete Vergrößerung der Differenzsignale wird mit einer effizienteren Isomerisierung nach dem Aufschmelzen der Tripelhelix erklärt. Für die trans->cis-Isomerisierungsrichtung wurden transiente IR-Spektren des Azocollagens bei unterschiedlichen Temperaturen aufgenommen. Alle instantan auftretenden Differenzsignale können auf die Schwingungsmoden des Azoschalters zurückgeführt werden. Bei einer Temperatur von 50°C lässt sich ein Einfluss der Peptidsequenz auf die transienten Spektren nicht nachweisen, was mit einer aufgeschmolzenen Tertiärstruktur im Einklang ist. Hingegen wird bei 20°C das Ausbleichen von Amid I-Schwingungsbanden der Peptidsequenz beobachtet, was eindeutig einen Energietransfer auf diese Moden zeigt. Bei 35°C sind die Bleichsignale des Collagens in diesem Bereich bereits deutlich abgeschwächt. Die transienten Spektren des isolierten Azoschalters besitzen keine derartige Temperaturabhängigkeit.
Die Sicherung der Atemwege ist eine der wichtigsten Aufgaben des mit dem Atemwegsmanagement beauftragten Arztes, da eine fehlgeschlagene Intubation und sich über längere Zeit erstreckende Intubationsversuche schnell zu einer kritischen Hypoxie führen können. Gelingt eine endotracheale Intubation mittels konventioneller Larnygoskopie mit dem Macintosh-Spatel unerwartet nicht, stehen verschiedene supraglottische Atemwegshilfen wie z.B. die Larynxmaske zur Atemwegssicherung zur Verfügung. Falls sich jedoch aus verschiedenen Gründen der Einsatz eines supraglottischen Atemwegs verbietet und die Notwendigkeit einer endotrachealen Intubation besteht, muss eine andere Intubationsmethode als die konventionelle Laryngoskopie gewählt werden. Das Standardverfahren für den erwartet schwierigen Atemweg, die Intubation mit dem flexiblen Endoskop am spontan atmenden Patienten, eignet sich nicht für den unerwartet schwierigen Atemweg. Hierfür werden die Intubationslarynxmaske, Videolaryngoskope, Führungsstäbe mit Transillumination und verschiedene starre Fiberoptiken wie das Bonfils Intubationsfiberskop oder das Laryngoskop nach Bullard eingesetzt. Der Erfolg des Bonfils Intubationsfiberskops am unerwartet schwierigen Atemweg und am erwartet schwierigen Atemweg, basierend auf einer Reihe klinischer Faktoren, wurde bereits bewiesen. Es ist jedoch nicht bekannt, ob sich das Instrument für einen klar definierten schwierigen Atemweg im Sinne einer eingeschränkten Mundöffnung und eingeschränkten Beweglichkeit in der Halswirbelsäule eignet. Ziel der vorliegenden Studie war es zu untersuchen, ob sich das Bonfils Intubationsfiberskop für den Einsatz am schwierigen Atemweg, simuliert durch einen Immobilisationskragen, eignet. Nach Einwilligung der Ethikkommission wurde die Studie an 76 Patienten durchgeführt, die sich einem elektiven gynäkologischen Eingriff unterzogen. Nach der Simulation des schwierigen Atemwegs durch Anlegen eines Immobilisationskragens wurden jeweils 38 Patienten randomisiert entweder mittels direkter Laryngoskopie oder dem Bonfils Intubationsfiberskop intubiert. Die erfolgreiche Platzierung des Endotrachealtubus mit dem jeweiligen Instrument war der primäre Zielparameter der Studie. Nach Immobilisierung der Halswirbelsäule betrug die maximale Mundöffnung 2,6 cm ± 0,7 cm in der Macintosh-Gruppe und 2,6 cm ± 0,8 cm in der Bonfils-Gruppe. Mit dem Laryngoskop mit Macintosh-Spatel konnten 15/38 Patienten (39,5%) erfolgreich intubiert werden, mit dem Bonfils Intubationsfiberskop konnten 31/38 Patienten (81,6%) erfolgreich intubiert werden (P<0,05). Die benötigte Zeit bis zur erfolgreichen Platzierung des Endotrachealtubus war mit dem Laryngoskop geringer (53 ± 22 s) als mit dem Bonfils Intubationsfiberskop (64 ± 24 s), dieser Zeitunterschied besitzt jedoch weder statistische, noch klinische Relevanz. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass das Bonfils Intubationsfiberskop der direkten Laryngoskopie mit Macintosh-Spatel an Patienten mit eingeschränkter Mundöffnung und immobilisierter Halswirbelsäule überlegen ist.
Hintergrund: Die klinische Wirksamkeit einer pharmakochirurgischen Kombinationstherapie zur Behandlung des diabetischen Makulaödems (DMÖ) bestehend aus einer posterioren Kernvitrektomie mit Entfernung von 1,5 ml liquefiziertem Glaskörper und zeitgleicher isovolumetrischer Injektion von 1,25 mg Bevacizumab und 8 mg Triamcinolon wurde in der vorliegenden Arbeit analysiert. Methodik: Daten von 73 Augen (60 Patienten; 65,4 ± 10,4 Jahre) mit einem DMÖ nach pharmakochirurgischer Kombinationstherapie wurden analysiert. Untersucht wurde neben dem Visus und der zentralen Makuladicke die Notwendigkeit von Re-Interventionen und dem Einsatz der konventionellen Verfahren (Laser, klassische 3port ppV). Wir unterschieden zwischen Gruppe I (n=38): nicht-proliferative DR (NPDR) ohne ischämische Makulopathie (I.M.); Gruppe II (n=17): NPDR mit I.M. und Gruppe III (n=18): proliferative DR mit oder ohne I.M. Die Kontrollintervalle betrugen im Median 9 Wochen (ca. 2 Monate, T1), 25 Wochen (ca. 6 Monate, T2) und 44 Wochen (ca.10 Monate, T3) nach Intervention. Ergebnisse: Die präoperativen Sehschärfen betrugen 0,52 ± 0,21 logMAR in Gruppe I, 0,99 ± 0,5 logMAR in Gruppe II, 0,77 ± 0,42 logMAR in Gruppe III. In Gruppe I verbesserte sich der Visus nach 2 Monaten zunächst auf 0,45 ± 0,21 logMAR (T1; p=0,7), nach 6 Monaten (T2) hochsignifikant auf 0,36 ± 0,16 logMAR (p<0,01) und blieb zum Zeitpunkt T3 stabil (0,36 ± 0,1 logMAR; p=1,0). Die Gruppe II zeigte zum Zeitpunkt T1 eine signifikante Visusbesserung auf 0,64 ± 0,18 logMAR (p<0,05) und war mit 0,77 ± 0,43 logMAR (T2; p>0,05) und 0,82 ± 0,4 logMAR (T3; p>0,05) leicht rückläufig. In der Gruppe III wurde zum Zeitpunkt T1 ein nicht-signifikante Visusverbesserung auf 0,53 ± 0,24 logMAR (p=0,08) erreicht, während nach 6 Monaten einen Visus von 0,62 ± 0,29 logMAR (p=0,6) und nach 10 Monaten mit 0,72 ± 0,34 logMAR (p=0,9) nahezu den Ausgangsvisus erreicht wurde. Die präoperativen Makuladicken betrugen 386,6 μm in Gruppe I, und 418,65 μm in Gruppe II und 385,17 μm in Gruppe III. Das Makulaödem konnte in allen 3 Gruppen bereits nach 2 Monaten hochsignifikant reduziert: -110μm (-28%; p<0,01) und im erreichten Niveau stabilisiert werden. 27,4 % der Augen (20/73) benötigten nach durchschnittlich 6,3 Monate eine Re-Intervention und 32,9 % benötigten im Verlauf eine Lasertherapie. Schlussfolgerung: Durch die pharmakochirurgische Kombinationstherapie konnte kurz- und mittelfristig eine Reduktion des Makulaödems mit Visusverbesserung in der Mehrzahl der Augen erreicht werden. Die Notwendigkeit von Re-Interventionen konnte zudem signifikant reduziert werden. Durch einen möglichen synergistischen Effekt kann diese Behandlungsmethode bestehende Therapieoptionen sinnvoll ergänzen und erweitern.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war der Einbau, die Inbetriebnahme, die Abstimmung und der Test eines Strahlmatchingsystems in eine Zweistrahl-RFQ-Beschleunigerstruktur. Dieses Strahlmatchingsystem wurde entwickelt, um die Beschleunigereinheit des Frankfurter Funneling-Experimentes besser an die nachfolgende HF-Deflektoreinheit anzupassen und um zu zeigen, dass ein Strahlmatching innerhalb der RFQ-Beschleunigerstruktur möglich ist. Des Weiteren wurden die zum Versuch gehörigen Ionenquellen modifiziert, um eine bessere Anpassung der Strahlherstellung an die Beschleunigerstruktur zu erreichen. Die Spannungsverteilung in der Beschleunigerstruktur selbst wurde durch weitergehende Tuningmaßnahmen verbessert, um die Teilchenverluste weiter zu minimieren Mit dem Funnelingexperiment soll experimentell geprüft werden, ob eine Strahlstromerhöhung durch das Zusammenführen mehrerer Ionenstrahlen verschiedener Ionenquellen möglich ist. Solch ein System ist für einige Zukunftsprojekte (HIDIF, SNS-Ausbau, ESS, u.ä.), die große Strahlströme benötigen, die nicht aus nur einer Ionenquelle extrahiert werden können, erforderlich. Das in dieser Arbeit behandelte Strahlmatching ist für das Experiment notwendig, da zu große Teilchenverluste in der Funnelsektion entstanden und somit eine bessere Anpassung des Strahls an den HF-Deflektor erforderlich wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die hier verwendete Art der Strahlfokussierung auch in eine komplizierte RFQ-Beschleunigerstruktur integrierbar ist, in der zwei Strahlkanäle auf der gleichen Stützen-Bodenplatten-Konstruktion aufgebaut sind. Die Verlängerung der Endelektroden und die Integration einer Strahlanpassung haben einen positiven Einfluss auf die Transsmission innerhalb des Beschleunigers und verbessern die Transmission durch den Deflektor. Es konnten Energiemessungen und zeitaufgelöste Faradaytassenmessungen der Teilchenbunche sowie zeitaufgelöst Makropulse mit der Faradaytasse gemessen werden. Floureszensschirmmessungen zeigten, dass die beiden Teilchenstrahlen auf eine neue gemeinsame Strahlachse gebogen wurden. Die Energiemessung zeigte, dass die Simulationen mit RFQSIM sehr genau die Endenergie der Teilchen berechnen konnte. Im Strahlkreuzungspunkt hinter dem Zweistrahl-RFQ-Beschleuniger konnten nahezu identische Teilchenbunche erzeugt werden. Diese Teilchenbunche wiesen zudem die in vorherigen Simulationen errechneten Charakteristika auf, in denen eine transversale und eine longitudinale Fokussierung gegenüber dem ungematchten Strahl simuliert wurden. Es konnte auch eine weitere Strahlradiusreduzierung gemessen werden, die auf eine exaktere Justierung der Elektroden zurückzuführen ist. Die Phasenfokussierung konnte verbessert werden, indem die Elektrodenspannung besser an die Strahlmatchingsektion angepasst wurde. Hierzu mussten auch die Einschussparameter der Strahlen in die Beschleuniger angepasst werden, damit die Transmission der Beschleuniger sich nicht verschlechterte. Insgesamt konnte mit den durchgeführten Experimenten erstmals demonstriert werden, dass zwei Strahlen in einem RFQ-Beschleuniger auf einen Punkt hinter dem Beschleuniger angepasst werden können und die Spannungsverteilung in solch einer Struktur durch Tuningmaßnahmen abstimmbar ist. Es konnte erstmals demonstriert werden das über 90% der Teilchen beider Strahlen, bei guten Strahleigenschaften, auf eine neue gemeinsame Strahlachse abgelenkt (gefunnelt) wurden.
I-kappaB-Kinase epsilon - ein neues Zielprotein für die Pharmakotherapie bei Schmerz und Entzündung?
(2010)
Der Transkriptionsfaktor NF-kappaB spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Immunantworten, Apoptose und Entzündungen sowie bei der Entstehung und Verarbeitung von Schmerzen. Ein pharmakologischer Eingriff in die NF-kappaB-Aktivierungskaskade könnte daher eine Schmerzhemmung bewirken und so Ansätze für die Entwicklung neuer Therapien für pathophysiologische Schmerzen liefern. Die NF-kappaB-Signalübertragungskaskade bietet verschiedene Angriffspunkte für Pharmaka, wobei zurzeit IkappaB Kinasen (IKK) als hoffnungsvolle Zielmoleküle im Fokus der Untersuchungen stehen. Verschiedene IKKs regulieren die Aktivität von NF-kappaB über die Phosphorylierung des inhibitorischen Proteins IkappaB oder über die direkte Phosphorylierung von NF-kappaB. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der neu entdeckten IKK epsilon bei der Schmerzentstehung und -verarbeitung sowie deren Eignung als neues Zielmolekül für die Schmerztherapie näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass IKK epsilon konstitutiv in Geweben der Maus, welche an der Entstehung und Verarbeitung von Schmerzen beteiligt sind, exprimiert ist. Im Rückenmark konnte die Lokalisation von IKK epsilon in den schmerzrelevanten Laminae I und II des Dorsalhorns nachgewiesen werden und auch in den Hinterwurzelganglien (Dorsal Root Ganglia (DRG’s)) war IKK epsilon in kleinen, nozizeptiven Neuronen exprimiert. Nach peripherer entzündlich-nozizeptiver Stimulation mit Formalin oder Zymosan kam es im Lumbalmark und den DRG’s zu einem signifikanten Anstieg der IKK epsilon-Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Diese Beobachtungen machten eine Beteiligung von IKK epsilon an der Prozessierung von Schmerz sehr wahrscheinlich. Um die Rolle von IKK epsilon während der Schmerzentstehung und -verarbeitung besser beurteilen zu können wurde das Verhalten von IKK epsilon defizienten Mäusen in akuten und inflammatorischen Schmerzmodellen charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass der Knockout von IKK epsilon zu einem signifikant verringerten nozizeptiven Verhalten im Formalintest und einer Hemmung der mechanischen Hyperalgesie nach Zymosaninjektion im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen führte. Gleichzeitig konnte kein Unterschied im akut nozizeptiven Verhalten festgestellt werden. Der Knockout von IKK epsilon hatte demnach keine Auswirkung auf den akuten physiologischen Nozizeptorschmerz, zeigte jedoch eine Verbesserung bei pathophysiologischen Schmerzen. Das verringerte nozizeptive Verhalten der IKK epsilon defizienten Mäuse im Formalintest ging mit einer Hemmung der NF-kappaB-Aktivierung im Rückenmark einher. Auch konnte eine verringerte mRNA-Expression der NF-kappaB-abhängigen Gene Cyclooxygenase-2 (COX-2), Matrixmetalloprotease-9 (MMP-9) und induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), die an der Regulation von Entzündungsschmerzen beteiligt sind, im Rückenmark und den DRG’s nachgewiesen werden. Da IKK epsilon bisher hauptsächlich mit der Aktivierung des TypI Interferon-Signalweges in Zusammenhang gebracht wurde, wurde außerdem geprüft, ob es nach Injektion mit Formalin zu einer Aktivierung des Trankriptionsfaktors Interferon-regulierender Faktor (IRF)-3 in Wildtyp-Mäusen kommt, was nicht beobachtet werden konnte. Der Knockout von IKK epsilon scheint demnach seine antinozizeptive Wirkung direkt über eine fehlende Aktivierung von NF-kappaB zu entfalten, wonach IKK epsilon eine bedeutendere Rolle als bisher angenommen bei der Aktivierung von NF-kappaB spielt. Dies konnte durch in vitro Daten untermauert werden. Der Knockdown von IKK epsilon in Makrophagen-Zellkultur mit spezifischer siRNA verhinderte die Phosphorylierung von NF-kappaBp65 am Serinrest 536 nach Stimulation mit LPS. Anhand der vorliegenden Daten lässt sich also schlussfolgern, dass IKK epsilon an der Schmerzentstehung und verarbeitung bei Entzündungen beteiligt zu sein scheint. Eine Hemmung dieser Kinase könnte demnach ein neues, lohnendes Ziel für die Entwicklung neuer Medikamente für die Schmerztherapie sein.
Patienten, die sich einer Bypassoperation am offenen Herzen unterziehen erleiden häufig kognitive Beeinträchtigungen durch Mikroembolien, insbesondere ausgelöst durch Luft. Ins Operationsfeld eingeleitetes Kohlendioxid soll durch seine physikalischen Eigenschaften protektiv auf die kognitiven Funktionen wirken. In die Studie waren 69 Patienten eingeschlossen, die sich jeweils einer aortokoronaren Bypassoperation unter Einsatz der Herz-Lungen-Maschine unterzogen. Es erfolgte randomisiert die Einteilung in eine Kontrollgruppe und eine protegierte Gruppe. Am ersten präoperativen und am fünften postoperativen Tag wurde jeweils eine Testbatterie aus sechs verschiedenen Einzeltest mit den Patienten durchgeführt. Als neurokognitives Defizit wurde eine Verschlechterung der Ergebnisse um mindestens 20% im Vergleich zu den präoperativen Werten in zwei oder mehr Einzeltests definiert. Intraoperativ wurde durch einen Zweikanal-Ultraschall-Mikroblasendetektor, der in den Kreislauf der Herz-Lungen-Maschine eingeschaltet war, ein Monitoring von Größe und Anzahl der entstehenden Gasblasen durchgeführt. Die Gruppen wiesen bezüglich der klinischen Parameter keine signifikant unterschiedlichen Werte auf. Der einzig signifikante Unterschied in den gemessenen Werten der Mikrobubbles ist eine Reduktion der Gasblasen zwischen Kanal I und Kanal II in beiden Gruppen. Dies beweist das Vorhandensein und die Funktionsfähigkeit des arteriellen Filters. Jedoch lässt sich ein Trend zur Verringerung von Blasenanzahl und Blasenvolumen unter Verwendung von CO2 erkennen. Die neurokognitiven Tests konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen ausmachen. Somit war kein signifikanter Vorteil für die aortokoronare Bypassoperation unter Protektion durch CO2 auszumachen. Der Neuroscore als Instrument zur Objektivierung eines neurokognitiven Defizits ist diskussionsbedürftig. Da Studien, z. B. im Bereich der minimalinvasiven Chirurgie, den Vorteil von CO2 belegen ist die Anwendung zur Protektion weiter zu empfehlen Jedoch fehlt der endgültige Beweis für den Benefit speziell bei der aortokoronaren Bypassoperation.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung des Proteoglykans Biglycan und seiner Funktion als Signalmolekül in inflammatorischen und autoimmunen Prozessen. Die biologische Bedeutung der in vitro gewonnenen Ergebnisse in primären Makrophagen und dendritischen Zellen wurde durch in vivo Modelle der Pathogenvermittelten-und nicht-Pathogen-vermittelten Inflammation und der Autoimmun-Erkrankung Lupus Nephritis bestätigt. In primären Makrophagen und dendritischen Zellen induziert Biglycan die Produktion proinflammatorischer Zytokine und Chemokine durch Interaktion mit Toll-like Rezeptor (TLR) 2 und 4. Mit nucleotide-binding oligomerization like Rezeptorprotein3 (NLRP3)-,apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD (ASC)- , Caspase-1- und TLR2/4- defizienten Mäusen und verschiedenen pharmakologischen Inhibitoren war es möglich in primären murinen peritonealen und Knochenmark-Makrophagen nachzuweisen, dass Biglycan die Caspase-1 NLRP3/ASC-abhängig aktivierte und damit die Prozessierung der Proform und Sekretion von reifem IL-1β induzierte. Durch Bindung an TLR2/TLR4 aktivierte Biglycan die NFκB, Erk und p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) Signalwege und stimulierte die Expression von Interleukin-1 beta (IL-1β). Biglycan aktivierte zudem den P2X7 Rezeptor (P2X7R) in Makrophagen und ist somit in der Lage auch ohne zusätzliche Ko-Stimulation, beispielsweise durch ATP, das NLRP3 Inflammasom zu stimulieren und die Prozessierung von aktivem IL-1β anzuregen. In einem Pathogenvermittelten (Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Sepsis) wie auch –nicht-athogenvermittelten (unilaterale Uretherobstruktion, UUO) Mausmodell der Inflammation wurde die biologische Relevanz dieser Prozesses gezeigt. Die Defizienz von Biglycan ging in diesen Modellen mit verminderter Aktivierung des NLRP3/Caspase-1 Inflammasomes, geringeren Spiegeln von reifem IL-1β und geringerer Organschädigung einher. Nachdem aufgezeigt werden konnte, dass die Biglycan-Konzentrationen in Nierenbiopsien und im Plasma von Patienten mit Lupus Nephritis stark erhöht waren, wurde seine Relevanz in Immunitätsreaktionen einschließlich autoinflammatorischen Prozessen genauer untersucht. Die Effekte von Biglycan in verschiedenen Stadien der Erkrankung wurden mit der MRL-Faslpr (kurz MRL/lpr) Maus, einem etablierten Modell der Lupus Nephritis (LN) und einem dafür generierten Modell der Defizienz (Bgn-/- MRL/lpr) und Überexpression von Biglycan (hBGN MRL/lpr) analysiert. In den verschiedenen Stadien der LN nahm die Konzentration von zirkulierendem und renalem Biglycan in MRL/lpr Mäusen zu und korrelierte gleichermaßen mit dem Fortschreiten der Erkrankung. Die Defizienz von Biglycan verminderte hingegen stark die renale Infiltration von Entzündungszellen, insbesondere B1-Zellen, außerdem die Zytokin-, Chemokin- und Immunglobulin-Konzentrationen und minderte die Progredienz der Niereninsuffizienz verglichen mit Lupus Mäusen gleichen Alters. In der Initialphase der Lupus Nephritis induzierte Biglycan in Mäusen, transient transgen für humanes Biglycan (hBGN MRL/lpr), vermehrte renale Zellinfiltration und Albuminurie als Zeichen nephrotischer Dysfunktion. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Produktion des stark proinflammatorischen Zytokines IL-1β in jungen Lupus Nephritis Mäusen NLRP3/Caspase-1-abhängig ist und durch Biglycan verstärkt wurde. Die Mechanismen, durch die endogenes Biglycan die Leukozyteninfiltration in Lupus Mäusen induzierte und somit inflammatorische und autoimmune Vorgänge potenzierte, wurden insbesondere an B-Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Biglycan die renale Migration von einem besonderen B-Zell Subtyp, B1-Zellen, verantwortlich für die T-Zellenunabhängige Autoimmunglobulinproduktion beim LN, unterhielt. Dabei vermittelte Biglycan die Rekrutierung von B1-Zellen in die Niere durch Regulation der Expression und Synthese der B-Zell C-X-C Chemokin Ligand 13 (CXCL13) in der Niere und in residenten peritonealen Makrophagen. In vitro konnte zudem der Mechanismus aufgeklärt werden, über den Biglycan CXCL13 reguliert. In primären Makrophagen und dendritischen Zellen induziert Biglycan die Expression und Sekretion von CXCL13 über TLR2 und TLR4. Die Daten zeigen auf, dass Biglycan als endogenes Gefahrensignal starke proinflammatorische Reaktionen hervorruft. Über Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, TLR2 und TLR4, aktiviert Biglycan des weiteren Zellen des adaptiven Immunsystems und inuziert die Rekrutierung weiterer Lymphozyten. Demnach kann postuliert werden, dass Biglycan als Brückenmolekül das anegborene und adaptive Immunsystem verbindet, und somit ein potenzielles neues „drug target“ in autoinflammatorischen, wie auch autoimmunen Vorgängen darstellt.
Die Hämophile ist eine X-chromosomal vererbbare Blutungserkrankung, die durch einen funktionellen Mangel der Gerinnungsaktoren Faktor VIII oder Faktor IX im Fall der Hämo-philie A oder Hämophilie B hervorgerufen wird. Der niedrige therapeutische Schwellenwert in der Behandlung der Hämophilie (Faktorenspiegel >1%) macht diese Krankheit zu einem idealen Zielobjekt in der Gentherapie. Eine schwerwiegende Komplikation in der Behandlung der Hämophilen besteht in der Entwicklung von neutralisierenden Antikörpern gegen das the-rapeutisch substituierte Protein. Akute Blutungen in solchen Hemmkörper-Patienten werden derzeit durch FVIII- und FIX-unabhängigen Bypass-Agenzien kontrolliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nach einer erfolgten Optimierung eines nicht-viralen Ansatzes zur Transgenex-pression von FIX in der Leber der Maus dieses Gentransfersystem dazu verwendet, um eine Entwicklung von neuen, auf FIX basierenden, FVIII-Bypass-Strategien in vivo zu ermöglichen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Plasmidvektoren und Vektorrückgrat-freie Minicircle-Konstrukte auf ihre Effizienz zur Expression des FIX-Transgens nach hydrodyna-misch basiertem Gentransfer in die Leber der Maus untersucht. Der Gentransfer der Mini-circle führte hierbei zu einer höheren Transgenexpression und einem geringeren Abfall der FIX-Antigen-Spiegel über die Zeit. Darüber hinaus war das FIX-Protein selbst bei den höchs-ten Expressionsleveln (700% des physiologischen Levels) völlig funktional aktiv. Der Abfall der Transgenexpression über die Zeit konnte größtenteils auf den Verlust des Vektors zurück-geführt werden. Ein signifikanter Silencing-Effekt konnte nur in den Plasmidvektor- und nicht in den Minicircle-behandelten Gruppen beobachtet werden. Diesbezüglich wurde nach 100 Tagen Persistenz der nicht-viralen Vektoren in der Mausleber eine signifikante Akkumulation an CpG-Methylierungen in regulatorischen Sequenzen des hAAT-Promoters im Plasmidvek-tor gegenüber den Minicirclen ermittelt. Außerdem konnte ebenfalls eine Demethylierung von Cytosin-Nukleotiden in bakteriellen Dcm-Sequenzmotiven über die Zeit beobachtet werden, die eine signifikant höhere Rate für das Minicircle-Konstrukt im hAAT-Promoter aufwies. Die erprobten nicht-viralen Vektoren versprechen somit eine ausreichende Effizienz, um eine Translation in den Menschen, z. B. über eine spezifische Behandlung von Lebersegmenten, möglich erscheinen zu lassen. Die Methylierungsanalyse von Promoterelementen auf Sequenzebene erbrachte zudem konkrete Ansätze zum Design von nicht-viralen Vektoren mit einer noch stabileren FIX-Expression. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mit Hilfe eines Screening-Systems zur Aktivitätstestung von rekombinant exprimierten FIX-Varianten die Mutation K265T als die entscheidende Sub-stitution im 99-loop identifiziert, welche die FVIII-unabhängige Aktivität im FIX-Protein unter physiologischen Bedingungen begünstigt. Das Wildtyp- IX-Protein braucht hingegen FVIII um eine 106-fache Steigerung seiner proteolytischen Aktivität zu erreichen. Durch Kombination der Mutation K265T mit V181I und I383V konnte diese spezifische FVIII-Bypass-Aktivität in der resultierenden FIX-Variante (ITV) auf 15,6% (verglichen zu FIX in Anwesenheit von FVIII) gesteigert werden. Durch Inkubation der FIX-Varianten mit Plasma-proben aus Hemmkörper-Patienten konnte die Funktionalität der FIX-Varianten selbst in der Anwesenheit von inhibitorischen FVIII-Antikörpern demonstriert werden. Durch Untersu-chungen des Aktivierungszustands von FIX konnte zudem gezeigt werden, dass die im Rah-men dieser Arbeit generierten FIX-Varianten nicht voraktiviert sind und die messbare FVIII-Bypass-Aktivität FIX spezifisch ist. Darüber hinaus konnte hier erstmals eine hämostatische Effizienz von FIX-Varianten mit einer FVIII-unabhängigen Aktivität in einem relevanten Krankheitsmodel demonstriert werden. Diesbezüglich resultierte der nicht-virale Gentransfer der FIX-Varianten in FVIII-K.O.-Mäusen in einer dosisabhängigen Verkürzung der aPTT-basierenden Gerinnungszeit und in einer Reduktion des Blutverlustes im tail-clip-Assay in An- oder Abwesenheit von inhibitorischen FVIII-Antikörpern. Desweiteren konnte zudem mittels Vakzinierung von FIX-WT-tolerierten Mäusen mit den FIX-Varianten demonstriert werden, dass die hier eingeführten Mutationen keine hoch-immunogenen Epitope des FIX-Proteins betreffen. Schließlich konnte die Expression der FIX-Varianten in hämostatisch normalen Mäusen nicht mit der Entstehung von thromboembolischen Ereignissen selbst in einem intakten Gerinnungssystem assoziiert werden. Die hier beschriebenen FIX-Varianten könnten somit einen sicheren und effizienten Therapieansatz zur Behandlung der Hämophilie A mit inhibitorischen Antikörpern darstellen und hinsichtlich der Halbwertszeit und des möglichen throboembolischen Risikos zu einer wesentlichen Verbesserung der bereits verfügbaren Bypass-Strategien beitragen.
Die Verfügbarkeit synthetischer Oligonukleotide hat der Entwicklung einer Vielzahl molekularbiologischer, biochemischer und medizinischer Anwendungen den Weg geebnet. Und sind viele diese Anwendungen für sich genommen schon hochinteressant, so eröffnet die Kombination mehrerer Methoden oft noch ganz neue Möglichkeiten. In der vorliegenden Doktorarbeit ist es gelungen, die Technik der photolabilen Schützung auf die Anwendungen von siRNAs und molecular beacons zu übertragen und diesen damit die Option der orts- und zeitaufgelösten Aktivierung zu ermöglichen. Durch die Einführung eines Nukleotids mit 2-(2-nitrophenyl)propyl-geschützter Nukleobase in eine siRNA, konnte der katalytische Schritt der RNA-Interferenz, die mRNA-Spaltung, unterbunden werden. Hierzu wurde das photolabil modifizierte Nukleotid so in der siRNA positioniert, dass es gegenüber der mRNA-Schnittstelle bzw. in unmittelbarerer Nachbarschaft zu dieser lag. Dabei war das modifizierte Nukleotid selbst kein Ribonukleotid sondern ein Desoxynukleotid. Zuvor konnte gezeigt werden, dass die Einführung einzelner Desoxynukleotide in eine siRNA keinerlei Einfluss auf deren Aktivität hat. Als Modellsystem diente der RFP/eGFP-Reportergenassay, wobei die Plasmide mit der siRNA in die verwendeten HeLa-Zellen kotransfiziert wurden. Die verwendete siRNA regulierte dabei die eGFP-mRNA, die gemessene Fluoreszenz wurde auf die RFP-Fluoreszenz normiert. In der Studie gelang es, ein sauberes „An/Aus-Verhalten“ zu erzielen, das heißt, die modifizierte siRNA zeigte zunächst keinerlei Einfluss auf die eGFP-mRNA. Bestrahlte man diese siRNA jedoch für drei Minuten bei 366 nm, erzielte man eine Unterdrückung der eGFP-Expression, die der einer unmodifizierten siRNA entsprach. Dies funktionierte für vor der Transfektion bestrahlte siRNAs ebenso, wie für solche, die erst nach der Transfektion in der Zelle entschützt wurden. Vereinfachte Darstellung der lichtaktivierbaren RNA Interferenz. Links: solange die Photoschutzgruppe (rot) auf dem Führungsstrang sitzt wird das Substrat des RISC nicht geschnitten. Rechts: Bestrahlung mit UV-Licht entfernt die Photoschutzgruppe und aktiviert die RNAi-Maschinerie. Ein bis jetzt ungeklärtes und noch näher zu untersuchendes Phänomen ist die Stabilität der Modifikationen in der Zelle. Aus bisher nicht eindeutig zu benennender Ursache fand nach einer definierten Zeit eine Aktivierung der ausgeschalteten siRNA statt, ohne dass diese bestrahlt wurde. Versuche mit photolabil modifizierten Nukleotiden an anderen Positionen innerhalb der siRNA, sowie eine Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Studie mit fluoreszenzmarkierter siRNA und fluoreszenzmarkiertem RISC erlaubten es Rückschlüsse auf den Schritt der RNAi zu ziehen, der durch die Einführung der Basenmodifikation blockiert wird. Offenbar handelt es sich tatsächlich um den katalytischen Schritt der mRNA-Spaltung, ein Einbau der modifizierten siRNA in den RISC findet statt. Zudem zeigte die erfolgreiche Inaktivierung der für die FCS-Studie genutzten anti-TK siRNA, dass der Ansatz, die Modifikation im Bereich der Schnittstelle einzubauen, von der anti-eGFP siRNA auf andere siRNAs übertragbar ist. Im zweiten erfolgreichen Projekt gelang es, molecular beacons durch Einführung zahlreicher photolabiler Basenmodifikationen lichtaktivierbar zu machen. Hierzu wurde ein bereits beschriebener GAPDH-molecular beacon verwendet. Modifiziert man die Schleife dieses molecular beacon mit sieben photolabilen Basenschutzgruppen (NPP und NPE) so gelingt es die Bindung desselben an seine komplementäre Ziel-RNA komplett zu unterbinden, während ein GAPDH-beacon mit drei oder fünf Modifikationen noch in verringertem Maße bindungsfähig ist. Dieses Verhalten wurde sowohl mittels einfachen Auslesens der Fluoreszenzintensität, als auch anhand eines PA-Geles belegt. Eine große Herausforderung bei diesem Projekt stellte die Aufreinigung des hochmodifizierten molecular beacon dar, der neben Fluorophor und Quencher auch zahlreiche Photoschutzgruppen trägt. Diese gelang schließlich durch den Einsatz einer extra densely bond-RP-HPLC-Säule und wiederholter HPL-Chromatographie. Ebenfalls konnte der große Vorteil eines lichtaktivierbaren molecular beacon, die Möglichkeit der präzisen Ortsauflösung der Aktivierung, dargestellt werden. Hierzu wurde modellhaft die Ziel-RNA auf einer Objektträgeroberfläche immobilisiert. Die dann aufgetragene molecular beacon-Lösung zeigte zunächst keine Fluoreszenz. Diese trat erst nach Bestrahlung und auch nur begrenzt auf den wenige Quadratmikrometer großen Bestrahlungsbereich auf.
Somsanit® (Natrium-γ-Hydroxybutyrat) wird schon seit vielen Jahren zur Langzeitsedierung von Intensivpatienten eingesetzt. Durch das Vorliegen als Natriumsalz, kann bei Langzeitanwendung oft schon nach wenigen Tagen eine Hyperatriämie auftreten, die zum Absetzen des Präparates führen kann. Um diesen Nachteil von Somsanit® zu überwinden, wurde von Dr. F. Köhler Chemie das Natrium-freie GHB-Analogon Butamidol (γ-Hydroxybuttersäure-Ethanolamid) entwickelt. In klinischen Studien zeigte Butamidol eine adäquate Sedierung von Intensivpatienten, besaß aber selbst in hohen Dosierungen keine narkotische Wirkung. GHB, welches auch physiologisch in Gehirn vorkommt, führt konzentrationsabhängig von einer tiefen Sedation bis hin zur Narkose. Aus der Literatur ist bekannt, dass beide GHB-Effekte durch einen Agonismus an GABAB-Rezeptoren ausgelöst werden. Die GHB-Konzentrationen die dafür benötigt werden, können aber nur durch exogen zugeführtes GHB erreicht werden. In physiologischen Konzentrationen bindet GHB an den GHB-Rezeptor, dessen Funktion bisher noch nicht eindeutig aufgeklärt werden konnte. Das Ziel dieser Arbeit war, die Affinität von Butamidol und GHB an den beiden Systemen GABAB- und GHB-Rezeptor zu untersuchen und mögliche Unterschiede aufzuklären. Im Radiorezeptor-Assay zeigte Butamidol eine geringere Affinität zum GABAB-Rezeptor als GHB (Butamidol: Ki = 399.5 mM; GHB: Ki = 10.6 mM) und eine agonistische Wirkung am GABAB-Rezeptor wurde, über die Hemmung spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle in Synaptosomen, nur für GHB nachgewiesen. In der nachfolgenden Untersuchung der GABAB-Rezeptor Signaltransduktionskaskade wurden, durch die akute GHB-Gabe, die Phospho-ERK-Level im Hippocampus von Mäusen vermindert. Der gleiche Effekt wurde für die akute Behandlung mit dem GABAB-Agonisten Baclofen erhalten, aber nicht für Butamidol. In Experimenten zur Modulation des GABAergen Systems, durch die subchronische Behandlung von Mäusen mit GHB oder Butamidol, wurde nur nach GHB-Behandlung eine Steigerung des synaptosomalen GABA-Uptakes detektiert. Somit konnte eine Beeinflussung des GABAergen Systems durch Butamidol an mehreren möglichen Angriffspunkten ausgeschlossen werden. Als zweites in Frage kommendes Target für Butamidol wurde das GHB-System untersucht. In Radiorezeptor-Bindungs-Versuchen wurden zur Verdrängung des antagonistischen Radioliganden [3H]NCS-382 höhere Butamidol Konzentrationen benötigt, als zur Verdrängung des Agonisten [3H]GHB (Ki: 1296 vs. 452 μM). Ein vergleichbarer „Shift“ zu höheren Konzentrationen zeigte auch der „kalte“ Agonist GHB und nicht der „kalte“ Antagonist NCS-382 (GHB: Ki 3.10 vs. 1.41 μM; NCS-382: Ki 0.431 vs. 0.447 μM). In einer weiteren subchronischen Behandlungsstudie von Ratten mit Butamidol und GHB wurde für GHB eine Erniedrigung der Gesamt-Rezeptor-Population und für Butamidol eine Erhöhung des Anteils der Agonist-Bindungsstellen an der Gesamt-Rezeptor-Population erhalten. Dieses Ergebnis kann für GHB als Hinweis auf ein agonistisches und für Butamidol als partiell agonistisches Bindungsverhalten am GHB-Rezeptor interpretiert werden. Da im GHB-Radio-Rezeptor-Assay relativ hohe Butamidol Konzentrationen zur Verdrängung der Radioliganden eingesetzt werden mussten, wurden daran anschließend Untersuchungen zur klinischen Relevanz, der für die GHB-Rezeptor Bindung notwendigen Butamidol Konzentrationen, durchgeführt. In Behandlungsstudien von Mäusen, mit anschließender Bestimmung der Butamidol Plasma- und Hirnspiegel, wurde die Hirn/Plasma Ratio ermittelt. Aus der erhaltenen Hirn/Plasma Ratio und den aus klinischen Studien bekannten beim Menschen wirksamen Plasma-Spiegeln, lassen sich für Butamidol Hirnkonzentrationen von 200-350 μM extrapolieren, die im Konzentrationsbereich für die Bindung von Butamidol am GHB-Rezeptor liegen.
Übergangsmetallboride und -nitride weisen besondere physikalische und mechanische Eigenschaften auf; sie vereinen dabei sowohl die Merkmale von Metallen als auch von Keramiken. Sie besitzen z. B. große Härten, hohe Schmelzpunkte und hohe Abriebfestigkeiten. Des Weiteren sind sie sehr beständig gegenüber Hitze und Korrosion. Sie zeigen eine hohe elektrische und thermische Leitfähigkeit. In den industriellen Anwendungen kommen oft Übergangsmetallboride und -nitride der 4. und 5. Gruppe zum Einsatz. Die Boride und Nitride des Niobs gelten als potentielle Kandidaten für Baumaterialien, welche hohen Temperaturen standhalten sollen. Niobnitride werden zum Teil schon als Beschichtungen von Turbinenmotoren und in der Raumfahrt eingesetzt. Für den industriellen Einsatz als Beschichtung oder Überzug werden in der Regel dünne Filme benötigt, diese werden oft durch Gasphasenabscheidung aufgebracht. Eine alternative Möglichkeit zur Präparation dünner Filme bietet das Rapid Thermal Processing (RTP). Dabei handelt es sich um einen optischen Schnellheizofen, mit dem Aufheiz- und Abkühlraten bis zu 300 K s-1 erreicht werden können. Im Vergleich zu gängigen Ofenprozessen werden Reaktionszeiten deutlich verkürzt. Durch eine Variation der Reaktionsbedingungen ist es möglich, verschiedene Phasen zu erzeugen und deren Abfolge zu beeinflussen. Zusätzlich können metastabile Phasen und Zwischenstufen abgefangen werden. Als Ausgangsschichten für die in dieser Arbeit untersuchte Darstellung von Niobboriden und -nitriden dienten verschiedene B/Nb- sowie B/Nb2N-Schichtsysteme. Diese wurden mittels Magnetronsputtern bzw. Elektronenstrahlverdampfung auf Si/SiO2-Substraten abgeschieden. Die Ausgangsschichten wurden anschließend in der RTP im Temperaturbereich von 600 °C bis 1200 °C getempert. Die Temperungen wurden in Argon bzw. Ammoniak durchgeführt. Zur Charakterisierung der Proben dienten verschiedene Analyseverfahren (XRD, LM, REM, AFM, SIMS, EPMA). Die folgenden Niobboride sowie -nitride können durch Temperungen in der RTP dargestellt werden. Die hexagonale NbB2-Phase entsteht bei Argon- sowie Ammoniaktemperungen in B/Nb-Schichtsystemen mit einem 1 : 1-Schichtdickenverhältnis. Das NbB2 erweist sich unter den untersuchten Reaktionsbedingungen als effektive Diffusionsbarriere gegenüber Sauerstoff, Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff. Weitere boridische Phasen werden nur bei Argontemperungen gefunden. Das tetragonale Nb3B2 entsteht in Schichtsystemen mit einem B : Nb-Verhältnis von 1 : 4 und 1 : 10 sowie mit einem Nb : B : Nb-Verhältnis von 5 : 1 : 5. Die Nb3B2-Phase wird durch Kohlenstoff und Sauerstoff verunreinigt. Die Verunreinigungen stammen sowohl aus den Ausgangsschichten als auch aus anderen Quellen (z. B. Trägermaterial). Durch eine Änderung der Sputter- Methode konnten die in den Ausgangschichten vorhandenen Verunreinigungen reduziert werden. In entsprechend neupräparierten Schichtsystemen mit einem B : Nb-Verhältnis von 1 : 4 und 1 : 10 führt dies bei den Argontemperungen zur Ausbildung des orthorhombischen NbB neben dem Nb3B2. Die Bildung der Nitride erfolgt bei den Ammoniaktemperungen der verwendeten Schichtsysteme (außer bei B : Nb im Verhältnis 1 : 1). Welche Phase dabei entsteht ist abhängig von der gewählten Temperatur. Es zeigt sich dabei von niedrigeren zu höheren Temperaturen folgende Phasenabfolge: hexagonales Nb2N -> hexagonales delta‘-NbN -> kubisches NbN. Beim Übergang zwischen den einzelnen Phasen liegen diese nebeneinander vor. Durch die schnellen Aufheiz- und Abkühlraten des RTP-Systems, bildet sich neben dem Nb2N das kinetisch bevorzugte delta‘-NbN. Die Bildung der delta‘-NbN-Phase wird durch die Ähnlichkeit der beiden Elementarzellen unterstützt. Die Nb2N-Phase der B/Nb2N-Bilayer behindert stark die Eindiffusion des Bors, des Stickstoffes und der Verunreinigungen. Damit ist das Nb2N eine relativ gute Diffusionsbarriere. Ein Teil der Nb2N-Schicht weicht dem Druck der Eindiffusion durch Aufstauungseffekte an der Grenzfläche aus. Die aus der Literatur bekannten Phasen Nb3B4 (orthorhombisch), epsilon-NbN (hexagonal) und Nb5N6 (hexagonal) werden bei den untersuchten Reaktionsbedingungen nicht gefunden. Die vorhandenen Verunreinigungen führen vor allem während der Argontemperungen zu verschiedenen Oberflächenphänomenen und zur Ausbildung carbidischer und oxidischer Phasen. Im Zuge der Ammoniaktemperungen spielen die Verunreinigungen eine deutlich geringere Rolle. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass durch Temperungen in der RTP verschiedene Niobboride sowie -nitride innerhalb weniger Minuten dargestellt werden können. Jedoch sollten für weiterführende Arbeiten reinere Ausgangschichten bzw. anderer Trägermaterialien verwendet werden um die Ergebnisse weiter zu verbessern.
In der vorliegenden Studie wurde die Erfolgsrate der intrauterinen Insemination im Hinblick auf die andrologischen Parameter analysiert. Der praktische Teil dieser Arbeit bestand darin, einen Fragebogen mit allen interessierenden Merkmalen zu erstellen. Anschließend wurden die Patientendaten aller im Jahre 2003 mittels intrauteriner Insemination in der Frauenklinik der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main behandelter Paare, anhand des erstellten Fragebogens erfasst. Die zusammengetragenen Daten wurden in einer Excel-Datentabelle ausgewertet und anschließend anhand des Chi-Quadrat-Vierfeldertests auf ihre statistische Signifikanz hin überprüft. Das Nichtschwangerenkollektiv, welches sich aus 197 Paaren zusammensetzte, wurde mit dem Schwangerenkollektiv, bestehend aus 35 Paaren, verglichen. Insgesamt wurden 475 Behandlungszyklen durchgeführt. Es kam insgesamt zu 36 Schwangerschaften (2 Schwangerschaften davon bei einem Paar nach Abort in der ersten Schwangerschaft), woraus eine Schwangerschaftsrate von 15,5 % resultiert und eine Wahrscheinlichkeit einer Schwangerschaft pro Behandlungszyklus 7,6 % errechnet wurde. Als die wichtigsten prognostischen Faktoren haben sich folgende Parameter herausgestellt. Erstens die Anzahl an schnell progressiven Spermien im Ejakulat. Es sollten mindestens 1 Million sein, sind weniger als 1 Millionen schnell progressiver Spermien vorhanden, kann mittels intrauteriner Insemination zwar eine Schwangerschaft erzielt werden, jedoch ist die Erfolgsaussicht deutlich geringer. Zweitens der Grad der Teratozoospermie. Eine moderate Teratozoospermie zeigte ein gutes Outcome bei der intrauterinen Insemination, wohingegen bei Paaren mit einer schweren Teratozoospermie die intrauterine Insemination kritisch betrachtet werden muss. In dieser Studie lag die Grenze bei 6 % Normalformen. Paaren mit mindestens 6 % Normalformen im Ejakulat kann zu einer intrauterinen Insemination geraten werden. Somit lässt sich zusammenfassend aus dieser Studie schlussfolgern, dass die intrauterine Insemination als eine im Vergleich zur IVF und ICSI relativ gering invasive und kostengünstige Methode bei moderater andrologischer Sterilität immer noch als Behandlung der ersten Wahl in Betracht kommt. Bei einer schweren männlichen Sterilität sollte die Indikation strenger gestellt werden und Alternativmethoden, wie z. B. die ICSI, als primäre Behandlungsoption zum Einsatz kommen.
Die Zelle repliziert ihre DNA während der S-Phase und segregiert sie dann später in der M Phase des Zellzykluses. Kommt es während dieser Prozesse zu DNA Schädigungen, arretiert die Zelle den Zellzyklus mit Hilfe spezifischer Kontrollmechanismen und versucht den Schaden zu beheben. Der DNA Kontrollpunkt wird bei DNA Schädigungen aktiviert, um mit Hilfe der DNA Reparatur den Schaden zu beheben und somit dafür zu sorgen, dass die DNA fehlerfrei repliziert werden kann. Der zweite Zellzyklus Kontrollpunkt, der Spindel Kontrollpunkt, stellt sicher, dass die Chromosomen während der M Phase unter gleicher Spannung innerhalb der Äquatorialplatte der Metaphase Spindel angeordnet sind. Kann in der Zeit, in der der Zellzyklus Kontrollpunkt aktiv ist, der Schaden nicht behoben werden, so wird Apoptose ausgelöst und die Zelle wird aus dem Zellverband entfernt. Krebszellen haben Strategien entwickelt, Zellzyklus Kontrollpunkte zu umgehen und darüber hinaus normalen Mechanismen der Apoptose zu entkommen. Die genauen molekularen Vorgänge der Deregulierung der Apoptose sind weitestgehend unaufgeklärt. Procaspase 8 ist ein wichtiges Schlüsselenzym des extrinsischen Apoptose Signalweges. Der extrinsische Signalweg wird extrazellulär über die Bindung von Liganden an ihre korrespondierenden Rezeptoren ausgelöst. In dieser Studie wird gezeigt, dass Procaspase 8 an Ser-387 in vitro als auch in vivo von Cdk1/Cyclin B1 phosphoryliert wird. Darüber hinaus zeigt diese Phosphorylierungsstelle die typische Struktur einer Bindungsstelle für Plk1, einer weiteren mitotischen Kinase. Die Interaktion von Procaspase 8 mit Cdk1/Cyclin B1 wird über die DE Domäne („death-effector-domain“ DED) von Procaspase 8 vermittelt. Wird Procaspase 8 an Ser 387 zu Alanin (S387A) mutiert, so wird die Phosphorylierung durch Cdk1/Cyclin B1 fast vollständig verhindert. Wird zudem diese Mutante (S387A) in humanen Krebszellen überexprimiert, so hemmt dies die Apoptose nach Stimulation des Fas Rezeptors. Wird umgekehrt Cyclin B1 mittels RNA Interferenz depletiert und dadurch Cdk1 nicht aktiviert, wird extrinsische Apoptose verstärkt. Diese Studie zeigt erstmals eine gezielte Inhibierung des extrinsischen Apoptose Signalweges durch mitotische Kinasen und schlägt ein Modell vor, in dem Serin/Threonin Kinasen extrinsische Apoptose inhibieren und somit der Tumorzelle ermöglichen, der Apoptose zu entkommen. Darüber hinaus wird ein neuartiger Mechanismus der Inhibition der autokatalytischen Spaltung von Procaspase 8 durch eine mitotische Kinase gezeigt.
Innerhalb der letzten 30 Jahre haben sich photoaktivierbare Verbindungen („caged compounds“) zu einem äußerst wertvollen Werkzeug entwickelt. Seit der erstmals publizierten Anwendung von lichtaktivierbarem ATP im Jahre 1978 durch Hoffman et al. konnten viele neue Erkenntnisse im Bereich der Physiologie, Molekularbiologie und Biochemie mit Hilfe von photoaktivierbaren Verbindungen gewonnen werden. Hierunter versteht man Substanzen, deren biologische Wirksamkeit temporär inaktiviert ist, jedoch durch Bestrahlung mit Licht wiederhergestellt werden kann. Die Inaktivierung wird durch spezielle, lichtreaktive Chromophore erreicht, sogenannten photolabilen Schutzgruppen („cages“). Der Einsatz dieser Technik zur Aktivierung von Nukleinsäuren eröffnet ein weites Feld an Anwendungsmöglichkeiten. So ist auf diese Weise eine orts- und zeitaufgelöste Kontrolle der Aktivität von z.B. Antisense-DNA, siRNA oder Aptameren durch Licht möglich. Während der vorliegenden Doktorarbeit konnten zwei neuartige photolabil geschützte Desoxythymidine als Phosphoramidite zum Einsatz in der automatisierten DNA-Synthese dargestellt werden. Hierfür wurden jeweils NDBF-OH bzw. pHP-OH in O4-Position der Nukleobase eingeführt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die beiden Nukleoside nach ihrem Einbau in DNA mittels UV-Licht entschützen lassen. Die photolabilen Schutzgruppen besaßen jedoch nur eine geringe chemische Stabilität unter verschiedenen basischen Abspaltbedingungen und sind deshalb nicht für die automatisierte DNA-Festphasensynthese unter Standardbedingungen geeignet. Durch Homologisierung der NDBF-Gruppe mit einer zusätzlichen Methyleneinheit zu hNDBF-OH wurde eine verbesserte Variante synthetisiert, welche eine ausreichende Basenstabilität und hervorragende photochemische Eigenschaften aufweist. Wie im Arbeitskreis Heckel gezeigt werden konnte, ist mittels in O6-Position hNDBF-modifiziertem Desoxyguanosin sowohl die DNA-Festphasensynthese unter Standardbedingungen möglich, als auch die spätere Photolyse dieser Schutzgruppe bei einer Wellenlänge von 420 nm. Hierdurch eröffnet sich zum ersten Mal die Möglichkeit, bei Verwendung von beispielsweise NPP und hNDBF, photolabil geschützte Bereiche in Nukleinsäuren wellenlängenselektiv durch Licht unterschiedlicher Wellenlänge zu aktivieren. In einem weiteren Projekt wurden erfolgreich photoaktivierbare Varianten des bivalenten Fusionsaptamers HD1-22 getestet. HD1-22 besitzt zwei Aptamerdomänen, HD1 und HD22, welche jeweils an eine der beiden Exosites I bzw. II von Thrombin binden. Im konkreten Fall konnten wir die Blutgerinnungsaktivität von Thrombin unter Verwendung einer photolabil geschützten Aptamersequenz von vollständig aktiv zu komplett inaktiv modulieren: Vor der UV-Bestrahlung war lediglich die Exosite II durch die HD22-Domäne blockiert. Dies erlaubte keinerlei Bindung des natürlichen Antikoagulans Antithrombin III an Thrombin – weder durch Heparin vermittelt noch ohne Beteiligung von Heparin. Der Zugang zur Exosite I war hingegen nicht eingeschränkt, die Blutgerinnungsaktivität des Thrombins somit durch die Rekrutierung von Fibrinogen an die Exosite I vollständig aktiv und nicht durch Antithrombin inhibierbar. Durch lichtvermittelte Entschützung der HD1-Domäne konnte nun eine Inaktivierung der Exosite I erfolgen, welche durch die hohe Bindungsaffinität der HD22-Aptamerdomäne stärker ausfiel als bei der ausschließlichen Verwendung eines HD1 Aptamers. Die koagulative Wirkung des Thrombins wurde somit vollständig aufgehoben. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde der Grundstein für die Entwicklung eines kovalenten, lichtaktivierbaren Thrombin-Thrombinaptamer-Reagenzes gelegt. Dieses könnte zur gezielten Thromboembolisierung bei bestimmten malignen Tumorerkrankungen eingesetzt werden, um das entartete Gewebe von der Blut- und damit Nährstoffversorgung abzuschneiden. Zudem könnte so möglicherweise während einer Tumorexzision die Freisetzung von metastasierenden Krebszellen unterbunden werden. Das Reagenz besteht aus der von Heckel et al. publizierten „ausschaltbaren“ Variante des HD1-Aptamers. Diese besitzt einen photolabil geschützten Gegenstrang. Solange die Schutzgruppe intakt ist, bindet das Aptamer an die Exosite I von Thrombin und verhindert auf diese Weise die Rekrutierung von Fibrinogen. Wird die Sequenz jedoch mit UV-Licht bestrahlt, so erfolgt die Entschützung des Gegenstrangs und durch die folgende Basenpaarung eine Inaktivierung des HD1 Aptamers. Hieraus resultiert die Freisetzung von aktivem Thrombin, welches direkt zur Ausbildung eines Thrombus führt. Durch die – ebenfalls photospaltbare – kovalente Anbindung des „ausschaltbaren“ HD1 an die Proteinoberfläche werden eine vorzeitige Dissoziation des Aptamers und damit eine vorzeitige Wiederherstellung der Proteinaktivität verhindert.
Einleitung: Seit der Entschlüsselung des menschlichen Genoms ist die Bedeutung genetischer Forschung im Bereich der Prävention und Therapie chronischer Erkrankungen, zum Beispiel des Typ-1-Diabetes, stark gestiegen. Großangelegte multizentrische Forschungsarbeiten wie die Projekte des International Type 1 Diabetes Genetics Consortium (T1DGC) arbeiten an der Aufdeckung noch unbekannter genetischer Prädispositionen zur Entwicklung eines Typ-1-Diabetes und benötigen dafür die Hilfe von Multiplex-Familien. Die Rekrutierung dieser Familien ist schwierig, da in nur 15% der Familien mit Typ-1-Diabetes mehrere Familienangehörige betroffen sind. Um die Motivation zur Studienteilnahme eines solch kleinen Kollektivs besser zu verstehen, wurde die Einstellung zu genetischer Forschung aus Teilnehmersicht untersucht. Hintergrund sind hier die bei vielen Forschern vorhandenen ethischen Bedenken hinsichtlich der psychischen Belastung bei genetischen Untersuchungen für die Teilnehmer. So besteht ein – bisher kaum untersuchter - allgemeiner Konsens, dass die Konsequenzen von Genanalysen für die Betroffenen nicht einzuschätzen sind. Somit stehen die Forscher vor dem Dilemma, welches in der Notwendigkeit, Genanalysen durchzuführen, und in der Furcht vor einer zu hohen psychischen Belastung der teilnehmenden Personen besteht. Dies hat derzeit zur Folge, dass den Teilnehmern die Ergebnismitteilung in der Regel verwehrt wird. Ergebnisse: Von 180 angeschriebenen füllten 140 Teilnehmer des T1DGC-Projektes einen Fragebogen hinsichtlich ihrer Meinung zu genetischer Forschung und ethischen Fragestellungen anonym aus: 88,6% der Teilnehmer äußerten, dass sie generell genetische Forschung als sehr wichtig ansehen. Es gaben 60% der Befragten an, dass sie nicht genügend Informationen über das Projekt erhalten hatten. 95% der Teilnehmer wünschten ein vollständiges Verständnis der wichtigsten Studiendetails. Als bevorzugte Informationswege gaben die Teilnehmer schriftliche Informationen per Post oder durch eine Internet-Website an. 83,2% der Befragten möchten über das Vorliegen einer erblichen Hochrisiko-Konstellation für das Auftreten von Komplikationen informiert werden. Im Falle des Nachweises eines Hochrisikogens für Typ-1-Diabetes möchten 87,6% darüber aufgeklärt werden. 96,4% der Teilnehmer sind generell an einer Ergebnismitteilung interessiert. Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede im Antwortverhalten in Abhängigkeit von Betroffenenstatus, Alter, Geschlecht, Staatsangehörigkeit, Familienstand sowie Schul- bzw. Berufsabschluss. Schlussfolgerung: Für die Teilnehmer genetischer Studien zum Thema Typ-1-Diabetes ist der Wunsch nach ausführlicher, individuell angepasster Information grundlegend. Es muss festgestellt werden, dass die Teilnehmer am International Type 1 Diabetes Genetics Consortium (T1DGC) sich gut betreut, doch letztlich nicht ausreichend informiert gefühlt haben. Daraus lässt sich ableiten, dass neben dem individuellen Beratungsgespräch auch schriftliche Informationen mit klar konzipierter Wissensaufbereitung in Form von Websites, Broschüren und Rundbriefen (in elektronischer und/oder gedruckter Form) empfehlenswert sind. Ein wichtiges Ergebnis ist ferner, dass die Befragten die Sorge vieler Wissenschaftler und Ärzte nicht teilen, die Mitteilung eines erhöhten Erkrankungs- bzw. Komplikationsrisikos für einen Typ-1-Diabetes würde als zusätzliche Belastung empfunden werden. Im speziellen Fall der Multiplexfamilien bestanden allerdings bereits Erfahrungen mit der untersuchten Erkrankung des Typ-1-Diabetes. Eine Mitteilung, ob nun negativ oder positiv, wird im Vergleich zum Wissen um das Risiko keineswegs als psychische Bürde, sondern vielmehr als Chance zur Einflussnahme wahrgenommen. Es muss allerdings festgehalten werden, dass die Ergebnisse dieser Untersuchung sich mit dem Typ-1-Diabetes auf eine chronische, jedoch gut therapierbare und nicht generell lebenszeitverkürzende Erkrankung beziehen. Für die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf andere genetisch-bedingte Erkrankungen ist weitere Forschung notwendig. Der bisher bestehende Konsens, im Rahmen genetischer Studien keine Ergebnismitteilung bezüglich chronischer, unheilbarer Krankheiten durchzuführen, muss überdacht werden. Den Studienteilnehmern ist das Recht auf Selbstbestimmung ein grundlegender Wert. Diese Selbstbestimmung beinhaltet, dass das Pro und Contra einer Ergebnismitteilung selbst eingeschätzt werden kann. Möchte ein Studienteilnehmer das Ergebnis der Auswertung seiner biologischen Proben erhalten, sollte ihm dies nicht verwehrt werden.
Gepaarte assoziative Magnetstimulation (PAS) kann im primären menschlichen Motorkortex (M1) sowohl langzeitpotenzierungs- (LTP) als auch langzeitdepressionsähnliche (LTD) Erregbarkeitsveränderungen hervorrufen. Dies kann durch die Untersuchung magnetisch evozierter Potentiale (MEP) erfasst werden. Dagegen ist wenig über die Auswirkungen von PAS auf willkürliche Aktivität des motorischen Kortex bekannt. Im ersten Experiment haben wir bewegungsabhängige kortikale Potentiale (MRCP) bei zehn gesunden Probanden im EEG registriert, um die willkürliche Aktivität im Motorkortex während der Vorbereitung zweier motorischer Aufgaben zu erfassen. Die Probanden mussten dabei entweder den Daumen abduzieren (Hauptmuskel: Musculus abductor pollicis brevis, APB) oder das Handgelenk strecken (Hauptmuskel: Musculus extensor carpi radialis, ECR). Die Amplituden der motorisch evozierten Potentiale im APB wurden dabei durch PASLTP gesteigert, durch PASLTD vermindert und blieben bei PAScontrol unverändert. Im Gegensatz dazu wurden sie im ECR durch keine PAS-Bedingungen verändert. PASLTP verminderte die Negativität der MRCP während des späten Bereitschaftspotentials (-500 bis 0 ms vor Bewegungsbeginn) nur in der APB-Aufgabe. Diese Veränderungen zeigten sich hauptsächlich über zentralen Elektroden kontralateral zur bewegten Hand. Dieser Effekt korrelierte negativ mit dem durch PASLTP induzierten MEP-Anstieg im APB. PASLTD und PAScontrol hatten dagegen keinen Einfluss auf die MRCP Amplituden. Unsere Ergebnisse deuten auf eine spezifische Wechselwirkung von PAS mit willkürlicher Aktivität im Motorkortex während der Vorbereitung motorischer Aufgaben hin. Dies könnte durch ein Zusammenspiel aus erhöhter Exzitabilität von M1 und einer unterbrochenen effektiven Konnektivität zwischen prämotorischen Arealen und M1 erklärt werden. Die Modulation des dorsolateralen prämotorischen Kortex (PMd) durch repetitive transkranielle Magnetstimulation (rTMS) verändert die kortikospinale Erregbarkeit in M1. Die Auswirkungen von PMd-rTMS auf vorbereitende Prozesse für willkürliche Bewegungsabläufe sind jedoch unklar. Contingent negative variation (CNV) repräsentiert im EEG kortikale Vorbereitungsprozesse äußerlich getriggerter Bewegungen während das Bereitschaftspotential (BP) Vorbereitungsprozesse intern getriggerter Bewegungen repräsentiert. Im zweiten Experiment wurden CNV und BP jeweils vor und nach PMd-rTMS untersucht. Das Experiment bestand aus drei CNV-Versuchsblöcken mit insgesamt 243 Durchgängen. Dabei mussten die Probanden auf visuelle Anweisung hin eine zwei-Item Finger-Bewegungssequenz durchführen. RTMS wurde sowohl mit 1 Hz als auch mit 5 Hz bei einer Intensität von 110% der aktiven motorischen Schwelle (AMT) unter individueller MR-Navigation appliziert. Die Erfassung des BP erfolgte während der Durchführung derselben motorischen Aufgaben, allerdings bekamen die Probanden keine Anweisungen. Die Durchschnittsamplituden der frühen und späten Komponente von CNV (CNV1:1500-500 ms vor dem Startsignal (S2); CNV: 500-0 ms vor S2) und der frühen und späten Komponente des BP (BP1: 1500-500 ms vor EMG Beginn; BP2: 500-0 ms vor EMG-Beginn) wurden quantitativ für 25 zentrale Elektrodenpositionen verglichen. CNV2 zeigte eine signifikante Bahnung über dem frontal-zentralen Bereich nach 1 Hz PMd-rTMS, blieb aber unverändert nach 5 Hz PMd-rTMS. CNV1, BP1 und BP2 blieben durch 1 Hz und 5 Hz PMd-rTMS unbeeinflusst. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der dominante PMd eine wichtigere Rolle in der Vorbereitung extern getriggerter Bewegungen spielt, als dies bei intern getriggerten Bewegungen der Fall zu sein scheint. Die CNV2-Antwort könnte eine intensive Interaktion innerhalb des menschlichen motorischen Kontrollnetzwerks anzeigen, die möglicherweise auf kompensationsähnlichen Mechanismen beruht.
Fullerene, Nanoröhren und auch anderen hohlen Strukturen können Atome oder Moleküle in ihrem Inneren einschliessen. In solchen Systemen beeinflussen sich die einschliessenden und eingeschlossenen Strukturen gegenseitig, und es existiert eine Vielzahl unterschiedlicher Effekte: Änderungen der Energieeigenwerte, Änderungen der Elektronenstruktur sowie Ladungsaustausch zwischen den beiden Teilen des Systems. All diese Effekte beeinflussen die Absorbtionsspektren beider Systembestandteile. In dieser Arbeit liegt der Schwerpunkt auf einem dieser Effekte: Dem dynamischen Abschirmungseffekt. Den dynamischen Abschrimungseffekt findet man insbesondere bei solchen Systemen, bei denen die einschliessende Struktur viele delokalisierte Elektronen besitzt. Zu solchen Systemen gehören zum Beispiel endohedrale Komplexe sowie "Nano Peapods" (Nanoröhren mit eingeschlossenen Atomen oder Molekülen). Ursächlich für den dynamischen Abschirmungseffekt ist die Tatsache, dass die Elek- tronen des umschliessenden Käfigs die eingeschlossene Struktur gegen elektromagentische Wellen abschirmen. Mit anderen Worten: Dass das elektrische Feld sowohl innerhalb als auch ausserhalb der einschliessenden Struktur wird vom polarisierenden Feld der einschliessenden Struktur beein°usst. Klassisch betrachtet ist die Photoabsorbtionsrate eines Objektes proportional zu der Intensität eines elektrischen Feldes. Somit unterscheidet sich die Photoabsorbtionsrate (und auch der Wirkungsquerschnitt) der gleichen elektromagnetischen Welle einer Struktur innerhalb eines Einschlusses von der Photoabsorbtionsrate eines freien Atoms oder Moleküls. Der dynamische Abschirmungsfaktor dient als Beschreibung des Verhältnisses dieser beiden Wirkungsfaktoren. Darüber hinnaus können, da die Käfigstruktur viele delokalisierte Elektronen besitzt, Elektronen gemeinsam angeregt werden und somit Plasmons hervorrufen. Wenn sich die Frequenz der anregenden elektromagentischen Strahlung der Resonanzfrequenz dieser Plasmonen annähert, wird das polarisierende Feld besonders gross. Im Endeffekt beobachtet man nahe der Plasmon-Frequenz einen starken Anstieg des Wirkungsquerschnittes der eingeschlossenen Struktur. Der Schwerpunkt in dieser Arbeit liegt auf einer spezifischen Art von System: Endo- hedrale Komplexe. Diese Strukturen wurden mit einem klassichen Ansatz untersucht. Die Fullerene wurden, da sie viele delokalisierte Elektronen besitzen als dielektrische Schalen modelliert, mit der dielektrischen Funktion eines freien Elektronengases. Dabei ist der dynamische Abschrimfaktor durch Auswertung des gesamten elektrischen Feldes am Ort des Atoms im Vergleich zur Stärke des externen elektrischen Feldes definiert. Der dynamische Abschrimungsfaktor wurde für eine Vielzahl unterschiedlicher Situationen untersucht. Im einfachsten Fall, bei dem die Polarisierbarkeit des eingeschlossenen Atoms vernachlässigbar klein ist, ist der dynamische Abschirmfaktor unabhängig von der Position des Atoms innerhalb des Fullerens. Die Veranderung des elektrischen Feldes wird vollständig von der dynamischen Reaktion des Fullerens auf das externe Feld bestimmt. Da das Fulleren von endlicher Dicke ist (definiert duch die räumliche Ausdehnung der Elektronenwolke), besitzt es zwei Oberflächen. Die Wirkung der elektromagnetischen Welle induziert oszillierende Oberflächen-Ladungs-Dichten. Die Oberflächen-Ladungs-Dichten wechselwirken und erzeugen somit zwei Plasmon Eigenmoden: eine symmetrische Mode bei der beide Ladungsdichten in Phase oszillieren und eine antisymmetrische bei denen sie gegen-phasig oszillieren. Der dynamische Abschirmfaktor eines solchen eingeschlossenen Atoms zeigt zwei ausgeprägte Peaks, welche eine Manifestation dieser beiden Oberflächen-Plasmone sind. Die Wechselwirkung zwischen diesen Plasmon-Moden wurde untersucht. Darüber hinnaus wurde der Einfluss der Grösse des Käfigs untersucht; mit Fallbeispielen für C20, C60, C240 und C960 [2, 3]. Im Grenzfall eines unendlich dünnen Fulleren-Käfigs ist nur ein einelnes Oberflächen-Plasmon zu beachten. Als nächstes wurde der Einfluss des eingeschlossenen Atoms untersucht [3{5]. Wenn dessen Polarisierbarkeit gross ist, wird ein reziproker Einfluss des Dipol-Moments des Atoms auf das Fulleren messbar. Dies wurde zunächst unter der Annahme eines zentral angeodneten Atoms für die folgenden drei Fälle untersucht: Ar@C60, Xe@C60 and Mg@C60. Der dynamische Abschirmfaktor verÄanderte sich dabei nur wenig. Der stärkste Einfluss auf das Verhalten des Abschirmfaktors ensteht durch Unstetigkeiten in der Polarisierbarkeit des Atoms nahe dessen Ionisierungs-Schwelle. Die Wahl dieser drei Fallstudien ist durch die quantenmechanischen Berechnungen von [7-9] motiviert. Der Vergleich mit diesen Berechnungen zeigt hohe Übereintismmungen für Ar@C60 und Xe@C60. Allerdings fanden sich auch grosse Unterschiede für Mg@C60, vor allem bei niedriger Photonen-Energie. Das Fulleren besitzt zwei Arten von Valenzelektronen: Die ¼-Elektronen und die stärker gebundenen ¾-Elektronen. Dies führt zum Auftreten zweier Oberflächen-Plasmons in Fullerenen. Dabei ist allgemein bekannt, dass das Buckminster-Fulleren ein Plasmon nahe 8 eV, sowie ein deutlich größeres nahe 20 eV besitzt. Diese sind mit den ¼-Elektronen, respektive den ¾-Elektronen verknüpft (auch wenn ¼-Elektronen zusÄatzlich zu dem ¾-Plasmon beitragen). Aufgrund dieser Tatsache wäre es angemessener, die Valenzelektronen nicht als Ein-, sondern als Zwei-Komponenten-Elektronen-Gas zu behandeln. Um dies miteinzubeziehen, passten wir unser Modell dahingehend an, dass wir das Fulleren als zwei unabhängige kozentrische dielektrische Schalen simulieren. Die Valenzelektronen wurden so auf die zwei Schalen aufgeteilt, dass eine Schlale alle Elektronen enthielt, die Teil des ¼{Plasmons sind, und die andere alle Beteiligten am ¾{Plasmon [4, 5]. Der Vergleich dieses modifizierten Modelles mit den quanten{mechanischen Berechnungen zeigte eine deutlich verbesserte Übereintismmung der Ergebnisse. Alle Merkmale der Berechnungen, vor allem das deutliche Maximum nahe 10 eV bei Mg@C60, konnten reproduziert und damit erklärt werden. Bedingt durch die endliche Dicke der Fulleren-Schale spalten jeder der beiden Plasmonen in jeweils zwei Plasmon Eigenmoden auf. Daher zeigt der dynamische Abschirm-Faktor nun vier Haupt{Eigenschaften welche die vier Plasmon-Moden abbilden. Nichtsdestotrotz zeigen sich immer noch quantitative Unterschiede im Falle von Mg@C60. Fürr Ar@C60 und Xe@C60, bei welchen das ursprÄungliche Modell bereits gute Fits zeigte, werden diese Fits durch die Anpassungen im Modell sogar noch verbessert. Interessanterweise zeigen sich die größten Veränderungen des dynamischen Abschirm-Faktors bei niedrigen Photonen{Energien, also im Bereich des ¼-Plasmons. Betrachtet man den Querschnitt dieses Fulleren Modells, so zeigt der Querschnitt Eigenschaften die den vier Ober°Äachen{Plasmon{Moden des Fullerens zugeordnet werden. Vergleicht man dies mit anderen theoretischen Arbeiten [12] und einer Sammlung verschiedener experimenteller Messungen [10], so zeigt sich, dass alle SchlÄussel{Eigenschaften des Querschnittes in unserem Modell vorhanden sind. Abschlie¼end wurde die Abhängigkeit des dynamische Abschirm-Faktors von der Position des endohedralen Atoms innerhalb des Fullerens anhand zweier Fallstudien, Ar@C60 und Ar@C240 [3, 4], untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass der dynamische Abschirmfaktor relativ unempfindlich gegenüber Veränderung des Positions-Winkels des Atoms ist. Die radiale Position hingegen stellte sich als sehr wichtig heraus. Je mehr sich das Atom der Fulleren-Hülle nähert, desto grösser wird der dynamische Abschirmfaktor. Diese Studien zeigen, dass es notwendig ist, eine Art räumlichen Mittelwertes für den dynamische Abschirmfaktor zu bestimmen, um sichtbare Resultate zu erhalten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher eine Methode für solch einen Mittelwert entwickelt [3, 4]. Neben der Untersuchung des dynamische Abschirm-Faktors wurde auch ein Vergleich mit experimentellen Messungen erarbeitet. Im Falle von Ce@C82 war die Photon{Energiespanne sehr hoch, weit über der Plasmon-Energie des Fullerens. Das Fulleren sollte daher für eine solche Bestrahlung durchlässig sein, und daher würde man keinen dynamischen Abschirmungs-Effekt finden können. Der Vergleich für Sc3N@C80 ist komplizierter. Da es sich dabei um ein rein klassisches Modell handelt, muss man achtgeben, es nicht mit dem vollständig freien Komplex zu vergleichen, sondern zusätzlich quanten{mechanische Effekte aus Confinements, wie zum Beispiel Elektronen{Transfers, miteinzubeziehen. Zudem ist das aktuelle Modell zu dynamischer Abschirmung nicht für Moleküle, sondern nur für einzelen Atomeentwickelt worden. Ein erster naiver Vergleich, in welchem der Endohedrale Komplex als Pseudo{Atom modelliert wurde, konnte die breite Struktur der experimentellen Ergebnisse nicht wiedergeben. Berechnungen des dynamischen Abschirmfaktors und des daraus resultierenden Querschnittes für ein einzelnes Scandium{Ion zeigte, dass auch räumliches Mitteln nicht ausreicht um die experi-mentellen Beobachtungen erklären zu können. Die Anwesenheit des Fullerens führt zur Öffnung eines neuen Kanals innerhalbdes Auger Prozesses [6, 11] und damit zur Verbreiterung der atomaren Spektrallinienweite. Berücksichtigt man diesen Effekt, so kann die ÄAhnlichkeit zu den experimentellen Ergebnissen deutlich erhöht werden. Allerdings ist es wichtig dabei auch die räumlichen Abhängigkeiten des Effekts, wie auch die der dynamischen Abschirmung, zu beachten. Erste vorläufige Ergebnisse deuten an, dass die beiden genannten Effekte, zumindest teilweise, dabei helfen können, die experimentell gefunden Ergebnisse zu erklären. Unser Modell zur Berechnung des dynamischen Abschirmfaktors liefert eine detaillierte Beschreibung und mögliche Erklärungen der diskutierten Phänomene, welche über die bisherige Arbeiten in der theoretischen Literatur hinausgehen. Die wichtigen Eigenschaften der experimentellen Arbeiten konnten mit dem Modell reproduziert werden, und mit der Verbreiterung der atomaren Spektrallinienweite und der dynamischen Abschirmung konnten wir zwei Effekte als mögliche bisher nicht berücksichtigete Erklärungen für einige dieser Eigenschaften herausarbeiten.
Zielstellung: Die Untersuchung des klinischen Effekts der topischen subgingivalen Applikation eines 14%igen Doxycyclin-Gels zusätzlich zu mechanischem Debridement (DEB) während der unterstützenden Parodontitistherapie (UPT) auf die Furkationsbeteiligung mehrwurzeliger Zähne. Material und Methoden: Bei 39 UPT-Patienten mit zumindest vier Zähne mit Sondierungstiefen (ST) ≥ 5 mm und Bluten nach Sondieren (BOP) (davon mindestens eine Furkationsstelle) erfolgte ein DEB aller Stellen mit ST ≥ 4mm. Nach Randomisierung wurde bei 19 Patienten zusätzlich ein 14%iges Doxycyclin-Gel subgingival instilliert (DEB & DOXY). Die klinischen Parameter wurden vor der Therapie (Baseline) sowie 3, 6 und 12 Monate danach erhoben. Der zusätzliche Nutzen des Doxycyclin-Gels wurde bestimmt als 1) Verbesserung der Furkationsbeteiligung und 2) Einfluss auf die Häufigkeit der Reinstrumentierung während der 12 Monate. Ergebnisse: Insgesamt wurden 323 Furkationsstellen (Grad 0: 160; Grad I: 101; Grad II: 18; Grad III: 44) behandelt (DEB: 165; DEB & DOXY: 158). DEB & DOXY resultierte nach 3 Monaten in einer stärkeren Reduktion der Furkationsbeteiligung als alleiniges DEB (p = 0,041). Allerdings führte DEB & DOXY zu keiner Reduktion der Häufigkeit der Reinstrumentierung während der 12 Monate. Schlussfolgerung: Die topische subgingivale Doxycyclingabe zusätzlich zu DEB hat einen kurzzeitigen Effekt auf die Furkationsbeteiligung. Aber es reduziert nicht die Häufigkeit der Reinstrumentierung über einen Zeitraum von 12 Monaten.
Im Hinterhorn des Rückenmarks werden aus der Peripherie kommende nozizeptive Reize auf zentrale Neurone umgeschaltet. Sphingosin-1-Phosphat ist ein potentieller Modulator dieser spinalen nozizeptiven Transmission. Vorarbeiten zeigten, dass die intrathekale Applikation von S1P zu einer Verringerung des nozizeptiven Verhaltens führt. Aus diesem Grund sind sowohl Enzymsysteme, welche die spinale S1P-Konzentration regulieren, als auch spezifische S1P-Rezeptoren und deren Aktivatoren und Inhibitoren potentielle ‚Targets’ und ‚Tools’ für eine suffiziente Schmerztherapie. Zur Charakterisierung der dem antinozizeptiven Effekt von S1P zugrunde liegenden Mechanismen konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die S1P-Rezeptoren S1P1 und S1P2 in den für die Schmerzverarbeitung wichtigen äußeren Laminae I-III des dorsalen Hinterhorns des Rückenmarks exprimiert werden. S1P verringert über Aktivierung Gi-Protein-gekoppelter Rezeptoren die Hemmung der cAMP-Synthese in exzitatorischen Rückenmarksneuronen dieser Laminae, was die antinozizeptive Wirkung von S1P erklären könnte. Zur Aufklärung der Regulation der S1P-Konzentration im Rückenmark nach peripherer nozizeptiver Stimulation sollte die Aktivität S1P metabolisierender Enzyme näher betrachtet werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass es nach peripherer nozizeptiver Stimulierung in vitro und in vivo zu einer negativen Rückkopplung durch S1P kommt, basierend auf einer anfänglichen Aktivierung beider SPHKs. Das durch SPHK-1 gebildete S1P vermittelt extrazellulär über den S1P1-Rezeptor die Hemmung der SPHK-1, während es über den S1P2-Rezeptor die SPHK-2 hemmt und dadurch zu einer Absenkung der S1P-Konzentration führt. Das durch SPHK-2 gebildete S1P hingegen wird nicht sezerniert, bedingt demnach keine Hemmung der S1P-Synthese und übt keinen direkten Einfluss auf die akute spinale Schmerzverarbeitung aus. Bei dem antinozizeptiv wirkenden S1P handelt es sich um von SPHK-1 gebildetes und anschließend sezerniertes S1P. Auch in nicht-neuronalen Zellen konnte die negative Rückkopplung detektiert werden und stellt daher einen allgemeinen regulatorischen Mechanismus dar. Des Weiteren sollte die Untersuchung von neu synthetisierten S1P-Rezeptor-Agonisten und Antagonisten weitere Grundlagen für eine neuartige, pharmakologische Schmerztherapie liefern. Vorarbeiten zeigten, dass die intraperitoneale oder intrathekale Gabe des strukturellen S1P-Analogons FTY720 das Schmerzverhalten von Tieren reduziert. Die hemmende Wirkung des FTY720 auf die Eicosanoidsynthese durch direkte Hemmung der cPLA2 kann zur Vermittlung des antinozizeptiven Effekts von FTY720 beitragen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass FTY720-Analoga die PGE2-Synthese in vivo und in vitro hemmen können. Die strukturelle Vorraussetzung für die hemmende Wirkung dieser S1P-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten ist der Besitz eines basischen Zentrums und darüber hinaus die Freiheitsgrade der Substanzen eine Rolle für die Bindung an die cPLA2 spielen. Die Verwendung von FTY720-Analoga, welche keine Aktivierung der für Nebenwirkungen verantwortlichen S1P-Rezeptoren bedingen und dennoch eine Reduktion der Prostaglandin- und cAMP-Synthese vermitteln, wären viel versprechende neue Substanzen zur Behandlung chronischer Schmerzen.
Frühere Studien haben gezeigt, dass während des hämorrhagischen Schocks freie Radikale gebildet werden. Diese reaktiven Sauerstoffverbindungen und reaktiven Stickstoffverbindungen spielen eine ursächliche Rolle beim Multiorganversagen. ZIEL: Es sollte die Hypothese überprüft werden, ob die enterale Applikation eines polyphenolhaltigen Extraktes des chinesischen Grünen Tees (Camellia sinensis/GTE) die Bildung freier Radikale verringert, die Organschäden und die Mortalität bei Ratten nach hämorrhagischen Schock und Reperfusion beeinflusst. METHODE: Gruppen von weiblichen Sprague Dawley Ratten wurden entweder mit 100 mg GTE/kg Körpergewicht oder Placebo zwei Stunden vor dem hämorrhagischen Schock gavagiert. Die Hypothese wurde anhand zweier Schockmodelle überprüft: 1.) Nicht-Überlebensmodell: Entnahme von Blut bis ein mittlerer arterieller Blutdruck von 40 mmHg erreicht war, gefolgt von zunehmender Entnahme über eine Stunde bis dann ein mittlerer arterieller Druck von 28 mmHg erreicht war (schwerer hämorrhagischer Schock), 2.) Überlebensmodell: Entnahme von Blut bis ein mittlerer arterieller Blutdruck von 40 mmHg erreicht war, welcher dann für eine Stunde konstant gehalten wurde (moderater hämorrhagischer Schock). Alle Ratten wurden dann über eine Stunde mit 60% des bis dahin entnommenen Blutes plus das doppelte Volumen hiervon als Ringerlaktat- Lösung reperfundiert. 10 Minuten und zwei Stunden nach Ende der Reperfusion wurden Blutproben entnommen. 18 Stunden nach Reperfusion wurden die Lebern zur Zytokinmessung und Bestimmung von 3-Nitrotyrosin mittels ELISA sowie zur immunhistochemischen Darstellung von 4-Hydroxynonenal entnommen. ERGEBNISSE: Im schweren hämorrhagischen Schock stieg die Überlebensrate im Beobachtungszeitraum von 18 Stunden von 20% (2 von 10) bei placebobehandelten Ratten und auf 70% (7 von 10) bei mit GTE behandelten Ratten (p < 0.02). Im moderaten hämorrhagischen Schock war die Überlebensrate höher (80%) und es bestand kein Unterschied zwischen mit GTE und placebobehandelten Gruppen. Im moderaten hämorrhagischen Schock stieg jeweils die Alaninaminotransferase (ALT) 10 Minuten und zwei Stunden nach Reperfusion auf 345 ± 12 und 545 ± 13 IU/l. Die Behandlung mit GTE verringerte die ALT-Freisetzung auf 153 ± 9 und 252 ± 12 IU/l 10 Minuten und zwei Stunden nach Reperfusion (p < 0,01). TNF-α im Lebergewebe war in placebobehandelten Ratten höher (5,76 ± 0,62 pg/mg) im Vergleich zu GTE gavagierten Ratten (4,02 ± 0,26 pg/mg, p < 0,05). IL-1β im Lebergewebe war ebenfalls bei placebobehandelten Ratten höher (0,8 ± 0,18 pg/mg) im Vergleich zu GTE behandelten Ratten (0,37 ± 0,07 pg/mg, p < 0,05). Analoges galt für IL-6 (6,93 ± 0,48 vs. 5,15 ± 0,58 pg/mg, p < 0,04). Auch 3-Nitrotyrosin war in den Lebergeweben der placebobehandelten Ratten höher (1,88 ± 0,51 pg/mg) als in den GTE behandelten Ratten (0,63 ± 0,23 pg/mg, p < 0,04). Immunhistochemische Färbung von Lebergewebe, welches 18 Stunden nach Reperfusion zur Darstellung von 4-Hydroxynonenal entnommen wurde und welches als Maß für die Lipidperoxidation gilt, sank von 4,81 ± 0,99 % in placebobehandelten Ratten auf 1,46 ± 0,42 % in GTE behandelten Ratten (p < 0,02). SCHLUSSFOLGERUNG: Enterale Applikation von GTE Polyphenolen erscheint im hämorrhagischen Schock und Reperfusion von Vorteil.
Die Chloroplastenbewegung ist eine der wichtigsten Anpassungen, die Pflanzen entwickelt haben, um eine effiziente Ausbeute an Lichtquanten für die Photosynthese zu gewährleisten. Auch wenn der genaue Mechanismus und die Signalwege, die diesen Prozess vermitteln, noch nicht vollständig verstanden sind, konnten einige an der Chloroplastenbewegung beteiligte Proteine (phot1, phot2, chup1, Aktin, Profilin) in den letzten Jahren identifiziert werden. Chup1, das an der äußeren Chloroplastenmembran verankerte Protein, wird als putativer Linker zwischen den Chloroplasten und dem Aktin-Zytoskelett gesehen. Durch die Interaktion mit Profilaktin reguliert chup1 die Aktin-Polymerisierung und somit auch die Chloroplastenbewegung. Die Analyse der intra- und intermolekularen Interaktionen von chup1, die in dieser Studie ermittelt wurden, deutet auf eine Homodimerisierung von chup1 durch die Coiled coil Domäne sowie auf eine Assoziation des N- mit dem C-terminalen Leuzin- Zipper hin. Neben diesen Interaktionen konnte für einen der vier putativen Interaktionspartner von chup1, der wall associated kinase 3, eine mögliche Funktion bei der Vermeidungsbewegung der Chloroplasten gezeigt werden. In Anbetracht dieser Interaktion und der postulierten Phosphorylierungsstellen in chup1, könnte eine Regulierung von chup1 durch Phosphorylierung erfolgen. Um die Funktionen von chup1 und phot2 besser zu verstehen, wurden die Pflanzen mit knock-out in diesen Gene genauer charakterisiert und die T-DNA Insertionslinien von chup1 und phot2 zeigen keine Reduzierung in der photosynthetischen Aktivität. Im Gegensatz dazu, bedingt der knock out von beiden Genen eine deutliche Verminderung der photosynthetischen Leistung. Infolge der fehlenden Chloroplastenbewegung im chup1phot2 Doppel knock out führt das möglicherweise zu einem verringerten Schutz der Photosynthese. Dies bestätigt weiter die Verbindung zwischen der durch phot2 induzierten Signalkaskade und der Aktin-Polymerisierung, die durch chup1 reguliert wird. Um den Einfluss von chup1, phot1 und phot2 auf die transkriptionelle Regulierung nach BL zu analysieren, wurde das globale Expressionsmuster nach BL-Behandlung untersucht. Bei der Analyse der Mutanten-Pflanzen mit einem Defekt in der Chloroplastenbewegung (chup1, phot1, phot2) konnte keine Beeinflussung der Regulierung der Genexpression in BL-gesteuerten Signalkaskaden durch diese Proteine beobachtet werden. Die Regulierung der Expression geschieht eher auf posttranskriptioneller Ebene und wird mit Hilfe von microRNA gesteuert.
Hintergrund und Zielsetzung: Die Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste chronisch-entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) mit einem klinisch sehr heterogenen Erscheinungsbild. Sie ist durch zeitlich und örtlich disseminiert auftretende Entmarkungsherde hauptsächlich in der weißen Substanz gekennzeichnet. Obwohl die Läsionen im gesamten ZNS auftreten, ist u. a. das Corpus Callosum (CC) frühzeitig und häufig betroffen. Oft ist es erst nach vielen Jahren möglich, den weiteren Verlauf der Erkrankung abzuschätzen. Allerdings ist die Entzündungsaktivität im Frühstadium der MS stärker als im späteren Verlauf. Daher ist es wichtig, gerade zu Anfang der MS einen Frühmarker zu haben, um schon entsprechend früh mit einer krankheitsmodifizierenden Behandlung beginnen zu können, um Behinderungen möglichst gering zu halten. Die vorliegende Arbeit fokussiert auf jene Fasern des CCs, die die beiden motorischen Areale (M1) verbinden, denn die Intaktheit des motorischen CCs ist ausschlaggebend für bimanuelle Bewegungen. Diese transkallosalen motorischen Verbindungen (TMVs) im humanen CC liegen weiter kaudal als beim Rhesusaffen. Unbeantwortet blieb bisher die Frage, ob auch beim Menschen die TMVs, ähnlich wie beim Rhesusaffen, eine somatotope Organisation im CC aufweisen. Ziel der vorliegenden Arbeit war, in einem multimodalen integrativen Ansatz das motorische CC auf struktureller sowie funktioneller und behavioraler Ebene bei gesunden Probanden sowie Multiple Sklerose Patienten zu untersuchen. Methoden: 12 gesunde Probanden und 13 Patienten mit Multipler Sklerose wurden untersucht. Die Untersuchungen umfassten Bildgebung mit Magnet Resonanz Tomographie (MRT) und funktioneller MRT (fMRT) zur Identifizierung der funktionellen Areale von Händen, Füßen und Lippen im M1 und diffusionsgewichtete MRT/Diffusions-Tensor MRT (DTI) zur Feststellung der fraktionalen Anisotropie (FA)-Werte und der Hauptdiffusionsrichtung von Wasser. Mithilfe der DTI konnten die Faserverläufe in jedem Voxel bestimmt werden. Dies war die Grundlage für die ebenfalls durchgeführte Fasertraktographie. In mehreren Traktographieschritten wurden die Fasern, die über das CC die Areale der Hände, Füße und Lippen im M1 verbinden, sichtbar gemacht. So konnten gezielt die FA-Werte im CC gemessen und die Lage der Faserbündel bestimmt werden. Desweiteren wurde die interhemisphärische Inhibition (IHI) zwischen den Handarealen von M1 als Maß für die effektive Konnektivität des CC mittels transkranieller Magnetstimulation (TMS) in einem etablierten Doppelpuls-TMS-Protokoll untersucht. In einem weiteren Versuchsteil wurden behaviorale Tests durchgeführt. Elektromyographische Spiegelaktivität wurde bei einer unimanuellen Aufgabe im homonymen Muskel der „Spiegelhand“ als Maß für interhemisphärische motorische Hemmung untersucht. Koordinationstests umfassten die bimanuelle temporale Koordination (BTK) mittels bimanuellem Fingertapping und Labyrinth-Test. Durch schnellstmögliches Fingertappen mit dem rechten, dem linken und simultan mit beiden Zeigefingern wurde sowohl uni- als auch bimanuelle Koordination und Schnelligkeit überprüft. Resultate: Die Hand- und Fuß-TMVs befanden sich durchweg im posterioren Truncus und/oder dem Isthmus des CC mit den Hand-TMVs etwas mehr ventral und anterior der Fuß-TMVs. Bei einem Probanden konnten die Lippenfasern dargestellt werden, die am weitesten anterior lagen und bis in den anterioren Truncus reichten. Bei der Analyse der FA-Werte der Hand-TMVs lagen die Werte der Patienten durchschnittlich signifikant niedriger als die der Kontrollen. Die IHI bei kurzem Interstimulus-Intervall (SIHI) war bei Patienten signifikant erniedrigt im Vergleich zu den Kontrollen, die IHI bei langem Interstimulus-Intervall (LIHI) war dagegen zwischen den Gruppen nicht unterschiedlich. Bei der elektromyographischen Spiegelaktivität zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen sondern lediglich ein Trend zu höheren Werten bei den Gesunden. Bei der BTK hielten die Patienten die Phasenrelationen genauer ein mit einer geringeren Streuung als die Kontrollen. Beim Labyrinth-Versuch und beim schnellstmöglichen Fingertappen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen. Die lineare Regressionsanalyse zeigte bei den Kontrollen eine signifikante Korrelation zwischen den mittleren FA-Werten der Hand-TMVs und der Stärke der SIHI. Bei den Patienten zeigte sich keine solche Korrelation. Zwischen SIHI bzw. LIHI und elektromyographischer Spiegelaktivität wurden bei den Kontrollen nicht aber bei den Patienten inverse Korrelationen gefunden. Schlussfolgerung: Durch die Kombination der verschiedenen Untersuchungsmethoden konnte die frühzeitige Schädigung des CCs bei MS auf verschiedenen Ebenen nachgewiesen und gleichzeitig die Möglichkeit einer nicht-invasiven Verlaufskontrolle geschaffen werden, die eine frühe Abschätzung des weiteren Verlaufes der MS ermöglichen kann. Dies wird aktuell in einem longitudinalen Versuchsdesign weiter untersucht.
Das Ziel dieser Arbeit war es, eine neuartige, drei-dimensionale Messmethode (BodyScan) zur Körperoberflächenbestimmung an Neugeborenen zu evaluieren. Die exakte Bestimmung der Oberfläche ist, besonders in der Pädiatrie, von großer Bedeutung für die Beurteilung physiologischer Parameter und der Dosierung von Medikamenten bzw. Infusionstherapien. Bestimmungen der Körperoberfläche mit 3D-Scannern liegen zwar für Erwachsene in zahlreichen Studien vor, jedoch wurden Neugeborene aus technischen Gründen bislang nicht untersucht, da ihre komplette Oberfläche in einem Scan nicht dargestellt werden kann. Das verwendete Messgerät „BodyScan“ der Firma 3D-Shape GmbH, Erlangen, arbeitete mit einer Messmethode, die es ermöglichte eine kontaktfreie, schonende, drei-dimensionale Vermessung der Körperoberfläche vorzunehmen (Streifenprojektionstechnologie). Die Neugeborenen konnten nur in liegender Position vermessen werden. Mit Hilfe einer Spiegelkonstruktion war es möglich drei Körperseiten des Neugeborenen im gescannten Bild zu erfassen. Diese gescannte Fläche wurde mit einem Korrekturfaktor zur gesamten Körperoberfläche extrapoliert. Dazu wurde der BodyScan vor Beginn der Studie mit einem artifiziellen Objekt (Messpuppe) kalibriert. Die genaue Oberfläche der Messpuppe war zuvor von einem ähnlichen genormten Gerät (BodyScan3DShape) auf 1632,24 cm², als Zähler des Korrekturfaktors bestimmt worden. Danach fanden 20 Messungen der Puppe mit dem Studien-Scanner statt. Es konnte gezeigt werden, dass der BodyScan die Körperoberfläche der Messpuppe mit einen Fehler von unter 0,1 % genau bestimmen konnte. Die ermittelte mittlere Oberfläche war der Nenner des so erhobenen Korrekturfaktors für unseren BodyScan, der schließlich 1,9787 betrug. Danach wurden 209 gesunde Neugeborenen, geboren in der Universitätsklinik Frankfurt am Main, untersucht. Sie wurden mit dem BodyScan in Bauch- und Rückenlage abgebildet, und die Körperoberfläche wurde zu beiden Ansichtsmodi computerunterstützt ermittelt. Die Ergebnisse des BodyScan wurden mit herkömmlichen, als empirischer Standard betrachteten Methoden, und zwar aus der Literatur bekannten Formeln nach DU BOIS & DU BOIS (1916), nach BOYD (1935), nach HAYCOCK ET AL. (1978), nach MEBAN (1983), und nach MOSTELLER (1987) verglichen. Zwei Neugeborene wurden außerdem mit der Geometrischen Methode untersucht, dazu wurden verschiedene Strecken und Umfänge einzelner Körperteile vermessen und deren Oberfläche mittels mathematischer Formeln bestimmt. Zudem wurde auch ein Subkollektiv von 25 Neugeborenen aus dem Gesamtkollektiv hinsichtlich der Ergebnisse der Körperoberflächenbestimmung mit dem BodyScan und den Formeln gesondert betrachtet. Dieses Subkollektiv setzte sich aus Neugeborenen zusammen, welche unter optimalen Bedingungen abgebildet wurden und von welchen qualitativ „sehr gute“ Aufnahmen erstellt wurden. Die durchschnittliche Körperoberfläche eines unter optimalen Bedingungen vermessenen Neugeborenen betrug mit dem BodyScan 2163,66 cm². Der Vergleich mit den fünf Formeln zur Oberflächenberechnung zeigte zwar geringfügige Abweichungen , aber dennoch gute Übereinstimmung der Ergebnisse unter den optimalen Studienbedingungen [besonders mit den Formeln nach DU BOIS & DU BOIS (1916), HAYCOCK ET AL. (1978), MEBAN (1983) , und MOSTELLER (1987)]. Die durchschnittliche Abweichung des BodyScans von den Formeln lag hier bei 2,55%. Als weiteres Ergebnis erhielten wir gute Übereinstimmungen für die Körperlängenbestimmung durch den BodyScan sowohl im Vergleich zu den Messungen der Hebammen als auch zu denen des Infantometers. Er betrug weniger als 0,1 % Fehler bei der Messpuppe und 2,8 % bei den Neugeborenen. Abschließend kann die Körperoberflächenmessung an Neugeborenen mit dem BodyScan als valide Methode bezeichnet werden. Sie setzt jedoch eine exakte Einstellung des Probanden in der Apparatur voraus. Weitere Untersuchungen sollten an kranken Neugeborenen und Frühgeborenen stattfinden, da die Methode wenig belastend und durch die Verwendung von weißem Licht unschädlich ist.
Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass sich trotz der Verwendung von Dentinadhäsiven in deninbegrenzten Klasse-II-Kavitäten keine randspaltfreien Füllungen erzielen lassen. Die Ergebnisse dieser in-vitro-Studie zeigen dies ebenfalls, dass mit Dentinadhäsiven der fünften und sechsten Generation keine komplett spaltfreien Kompositfüllungen im Dentin hergestellt werden können. Zu diesem Schluss kam auch Manhart, J. et al 2000. Selbst bei Anwendung moderner Dentinadhäsivsysteme unter Einhaltung aller Verarbeitungsvorschriften lässt sich das Zustandekommen einer Komposit-Dentinhaftung in Klasse-II-Kavitäten nicht mit Sicherheit vorhersagen. Bei allen getesteten Dentinadhäsiven wurde an den Kavitätenrändern Farbstoffpenetration nachgewiesen. Die Farbstoffpenetration zeigte an den Kavitäten die Tendenz von approximal nach pulpal geringer zu werden. Optibond Solo mit Füllstoffgehalt erreichte in der Farbstoffpenetration am zervikalenFüllungsrand mit (54,54 %) und ohne (31,89 %) Liquorsimulation die besten Resultate. Auch am oralen Füllungsrand hatte Optibond Solo mit (36,38 %) und ohne (37,09 %) Liquorfluss die besten Ergebnisse. An der vestibulären Kavitätengrenze waren Optibond Solo und Syntac Sprint an der Spitze: mit Liquorsimulation Syntac Sprint 32,68 %, Optibond Solo 38,42 %; ohne Liquorsimulation Syntac Sprint 35,97 %, Optibond Solo 35,3 %. Alle Ränder zusammen betrachtet, wies ebenfalls Optibond Solo die geringste Farbstoffpenetration auf: mit Liquor 43,2 %, ohne Liquor 34,72 %. Das wasserhaltige Syntac SC belegte den letzten Platz bei Auswertung aller Ränder zusammen mit Liquor 82,89 %, ohne Liquorsimulation war hingegen Etch & Prime 3.0 absolutes Schlusslicht (80,03 %). Das schlechteste Ergebnis erreichte Syntac SC ebenfalls am vestibulären Füllungsrand ohne (75,59 %) und mit Liquorsimulation (81,16 %), sowie zervikal mit Liquor (95,32 %). Syntac SC konnte genauso mit der angewandten Moist-bonding-Technik in der REM (20 % "perfekte Ränder" vor und 8 % nach Thermocycling) nur den letzten Platz einnehmen. Das acetonbasierende Adhäsiv Syntac Sprint erlangte in der REM sowohl vor (77 %) als auch nach (76 %) Temperaturwechselbadbelastung den höchsten Anteil an "perfekten Rändern", gefolgt von Optibond Solo mit 65 % vor und 50 % nach Thermocycling. Die Temperaturwechselbadbelastung hatte Einfluss auf die Qualität der Randadaptation. Bei allen untersuchten Dentinadhäsiven reduzierte sich der prozentuale Anteil an perfekten Rändern nach Thermocycling im Vergleich zuvor. Die Qualität des Zustandekommens eines akzeptablen Füllungsrandes ist von der chemischen Zusammensetzung, insbesondere dem enthaltenen Lösungsmittel, dem Füllstoffgehalt und der Dentinfeuchtigkeit abhängig. Die Durchführung der Simulation des Liquors führte am zervikalen Rand bei Syntac SC (ohne: 92,54 %; mit: 95,32 %), Optibond Solo (ohne: 31,89 %; mit: 54,55 %) und Scotchbond 1 (ohne: 63,44 %; mit: 83,24 %) zur erhöhten Farbstoffpenetration - im Falle von Etch & Prime 3.0 (ohne: 93,11 %; mit: 86,42 %), Syntac Sprint (ohne: 81,98 %; mit: 73,75 %) und Prime & Bond NT (ohne: 88,86 %; mit: 81,01 %) jedoch zu einer verringerten Penetration des Methylenblaus.
Die Cystische Fibrose oder Mukoviszidose ist die häufigste autosomal, rezessiv vererbte Stoffwechselerkrankung in der kaukasischen Bevölkerungsgruppe.
Die Beteiligung der Lungen bei diesem syndromalen Krankheitsbild wiegt bei weitem am schwersten. Neben der Besiedlung der Lunge mit fakultativ pathogenen Keimen wie Pseudomonas aeruginosa, die zu chronischen Entzündungen führen, besteht außerdem eine gestörte Immunregulation. Diese führt zu einer durch neutrophile Granulozyten dominierten Inflammation, ohne dass die Lunge bereits mit Erregern besiedelt ist. Der massive Einstrom der Leukozyten in das Lungengewebe wird durch erhöhte Konzentrationen des proinflammatorischen Zytokins Interleukin 8 ausgelöst. Es kommt zur
unverhältnismäßigen Freisetzung lysosomaler Enzyme und Sauerstoffradikale, die neben bakteriellen Erregern auch das körpereigene Lungenparenchym zerstören.
Die Ursache für den erhöhten IL–8–Gehalt in den Atemwegssekreten von CF–Patienten ist bisher ungeklärt. Hyperosmotische Belastungen können in Atemwegen zu inflammatorischen Vorgängen ohne eine zugrunde liegende Infektion führen.
In der vorliegenden Arbeit wird ein möglicher Signalweg für IL–8 ausgelöst durch hyperosmotischen Stress untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen eine zeit– und dosisabhängige Induktion der Interleukin 8–Expression und –Sekretion unter osmotischer Belastung.
Wir zeigen, dass an der verstärkten IL–8–Synthese verschiedene Tyrosinkinasen beteiligt sind, die aufgrund der Änderungen des Zellvolumens durch hypertone Bedingungen aktiviert werden.
Die Rezeptor–Tyrosinkinase EGFR wird durch hyperosmotischen Stress
aktiviert und beeinflußt die IL–8–Sekretion.
Der EGFR wird durch die Nicht–Rezeptor–Tyrosinkinase Src aktiviert, die bekanntlich mit Integrinen interagiert, die an der osmosensorischen Mechanotransduktion von Zellen beteiligt sind. Neben der direkten Aktivierung des EGFR an dem Src–abhängigen Tyrosylrest Tyr845, erfolgt außerdem eine Beeinflussung der durch Autophosphorylierung aktivierten Tyrosylreste des EGFR.
Die Aktivierung der Src durch hyperosmotische Bedingungen führt ebenfalls zu einer verstärkten Interleukin 8–Expression und –Sekretion.
Auch die p38 MAPK ist an der vermehrten IL–8–Produktion durch hypertonen Stress beteiligt. Die Stresskinase führt wie die Src–Kinase zur Aktivierung des EGFR, wobei sie auch den Src–abhängigen Tyrosylrest Tyr845 beeinflußt.
Die p38 MAPK selbst wird wiederum durch die Src–Kinase aktiviert, was einen zusammenhängenden Signalweg von Interleukin 8 unter hyperosmotischen Belastungen vermuten lässt. Bemerkenswert ist, dass der EGFR unter osmotischer Belastung die p38 MAPK reguliert, also eine bidirektionale Verbindung zwischen diesen Proteinkinasen
besteht. Dieser Umstand deutet auf das Vorliegen Src–unabhängiger
Signalwege in der Interleukin 8–Signaltransduktion hin (siehe Abbildung 5.1).
Der veränderte Ionenhaushalt bei der Cystischen Fibrose aufgrund eines
defekten CFTR–Proteins könnte eine durch neutrophile Granulozyten
dominierte Inflammation ohne vorliegende Infektion der Lunge mit pathogenen Erregern erklären, die zur verstärkten Lungendestruktion bei den CF–Patienten führt.
Durch eine pharmakologische Hemmung einzelner oder mehrerer Komponenten des Interleukin 8–Signalweges könnte eine reduzierte Produktion des Chemokins erreicht werden, wodurch sich die Lungendestruktion möglicherweise verzögern ließe und die Lebensqualität der CF–Patienten länger erhalten bliebe.
Durchgeführte Arbeiten und Ergebnisse: Zur Erschließung des Themas Lebensmittelverpackungen im Chemieunterricht wurde zunächst eine grundlegende fachliche Recherche durchgeführt, um mögliche thematische Schwerpunkte zu identifizieren und Grundlagen für eine experimentelle Zugänglichkeit zu erarbeiten. Parallel hierzu wurde der derzeitige Stand der fachdidaktischen Forschung unter besonderer Berücksichtigung des Themas Lebensmittelverpackungen erhoben. Es zeigte sich, dass nur vereinzelt auf diese Themenstellung eingegangen wird. Dabei steht allerdings, wie etwa bei dem Recycling von Joghurtbechern, die stoffliche Weiterverwendung von Abfällen im Vordergrund, während die Anforderungen an die Eigenschaften einer Verpackung keine Rolle spielen. Daher erfahren Bau und Funktion unterschiedlicher Verpackungsmaterialien in der vorliegenden Arbeit eine besondere Berücksichtigung. Die vorliegende Arbeit umfasst im Wesentlichen zwei Schwerpunkte: - Die schulexperimentelle Erschließung des Themas Lebensmittelverpackungen für unterschiedliche Klassenstufen, - die exemplarische Ausarbeitung von Unterrichtseinheiten, die die Möglichkeit der Integration der Experimente in die Schulpraxis aufzeigen. Bei der experimentellen Entwicklung stand die Barrierefunktion der Lebensmittelverpackungen und im Hinblick auf die Verträglichkeit mit Lebensmitteln deren chemische Zusammensetzung im Vordergrund. Gesichtspunkte wie die mechanische Belastbarkeit, z. B. die Reißfestigkeit einer Verpackungsfolie, wurden erst in zweiter Linie erarbeitet. Die Struktur-Eigenschaftsbeziehungen wurden thematisiert. Zunächst wurde eine Versuchsreihe ausgearbeitet, die die Funktion von Aluminiumschichten in Lebensmittelverpackungen in das Zentrum der Betrachtung stellt. Hierbei konnte zur Bestimmung der Dicke einer Aluminiumschicht mit schulischen Mitteln ein Verfahren ausgearbeitet werden, in dem die Aluminiumanteile einer ausgemessenen Fläche einer Verpackung gelöst und anschließend über eine Titration bestimmt werden. Diese Versuchsreihe kann auf viele Beispiele angewandt werden und liefert zuverlässige Ergebnisse. Der Nachweis unterschiedlicher Kunststoffe in Lebensmittelverpackungen stand im Mittelpunkt einer zweiten Versuchsserie. Hierbei wurden Versuche zur Analyse von Verpackungsstoffen (Polyolefine und Polykondensate) entwickelt und zusammengestellt. Einfache Versuche zeigen die Möglichkeit zur Trennung der Schichten von Verbundfolien sowie die chemische Beschaffenheit der verwendeten Polymere. Es wird anhand der gewählten Beispiele auf die unterschiedlichen Eigenschaften von Folien, wie Sauerstoffdurchlässigkeit und Wasserdampflöslichkeit, eingegangen. Dabei wird die gezielte Kombination unterschiedlicher Folien berücksichtigt. Eine wesentliche Fragestellung bei der Auswahl von Lebensmittelverpackungen ist die Frage nach der Barrierewirkung gegenüber unerwünschten Stoffen, z.B. von Sauerstoff. Hierbei gelang es, eine Zink-Luft-Batterie so in eine geeignete Schaltung einzubauen, dass sie zum Nachweis des Sauerstoffdurchtritts durch eine Folie verwendet werden kann. Allerdings ist dieser bei üblicherweise verwendeten Folien so gering, dass im Sinne einer didaktischen Reduktion für einen Modellversuch Backpapier eingesetzt wird, um ein Experiment zu erhalten, das in einer Schulstunde durchgeführt werden kann. Eine weitere umfangreiche Versuchsserie wurde zur Durchlässigkeit von PET-Flaschen gegenüber Kohlenstoffdioxid entwickelt. Besonders interessant für Schülerinnen und Schüler sind dabei Experimente, die zeigen, dass PET Kohlenstoffdioxid in geringen Mengen speichert. Exemplarische Unterrichtsentwürfe zeigen, welche konkreten Möglichkeiten für die Umsetzung des Themas gegeben sind. Hierfür wurden exemplarisch Entwürfe zum Forschend-entwickelnden Unterrichtsverfahren, zum Analytisch-synthetischen Verfahren, zum Expertenunterricht, zur Chemie im Kontext, zum Wahldifferenzierten Chemieunterricht und zum Projektunterricht / projektorientierten Chemieunterricht ausgearbeitet. Insgesamt vermittelt die vorliegende Arbeit einen umfassenden Zugang zum Thema Lebensmittelverpackung im Chemieunterricht, wobei ausgehend von den fachlichen Grundlagen die schulexperimentellen Möglichkeiten und Wege der unterrichtlichen Umsetzung entwickelt wurden.
Nachstehend werden die wesentlichen Ergebnisse der Arbeit zusammenfassend dargestellt: Die Kriegszeit · Die wesentlichen Einflussfaktoren für die Entwicklung der drei Großbanken im Krieg waren das spezifisch deutsche System der Kriegsfinanzierung, die Zinspolitik der Reichsbank, die Konditionenpolitik der Berliner Stempelvereinigung, die Zentralisierung der Kriegswirtschaft, die Kriegskonjunktur in vielen Bereichen der Wirtschaft, der weit gehende Wegfall der Auslandsbeziehungen und der Verlust eines großen Teils ihres Auslandsvermögens. Der wachsende Zugriff des Reiches auf die Reichsbank zur Abdeckung der kriegsbedingt steigenden Haushaltsdefizite führte im Ergebnis mangels ausreichender Konsolidierung durch Anleihebegebung zu einem enormen Anstieg der schwebenden Schuld des Reiches und einer Überliquidisierung der Volkswirtschaft. · Nach den Ausführungen in den Geschäftsberichten waren den Banken die Ursachen und Wirkungen von Staatsdefiziten und Geldwertverschlechterung frühzeitig bewusst. Direkte Kritik an der Politik von Reich und Reichsbank haben sie – soweit ersichtlich – angesichts der schwierigen Situation des Reiches nicht geübt. Sie hätten dafür auch in der Bevölkerung kaum Verständnis gefunden. Konkrete Vorschläge zur Besserung der Verhältnisse haben die Banken nicht gemacht. · Die Bilanzsummen der drei Großbanken stiegen durch den anhaltenden Zufluss von Kreditoren sowohl in nominaler als auch in realer Rechnung beträchtlich an. Da die Großbanken die Anlage in den lang laufenden Kriegsanleihen scheuten und die Kreditvergabemöglichkeiten an Unternehmen und Private kriegsbedingt begrenzt waren, investierten die drei Großbanken die ihnen zufließenden Mittel zum großen Teil in die hoch liquiden, jederzeit bei der Reichsbank rediskontierbaren Schatzwechsel des Reiches. Hinzu kamen Kredite an die verschiedensten staatlichen Stellen und Kriegsgesellschaften. Ende 1918 machten die Forderungen an staatliche Stellen bei allen drei Banken mehr als zwei Drittel der Bilanzsumme aus. · Die Stärke der gesamtwirtschaftlichen Bedingungen begrenzte die Möglichkeiten einer eigenständigen Geschäftspolitik und nivellierte zum großen Teil die bisher noch bestehenden strukturellen Unterschiede zwischen den drei Banken sowohl auf der Passiv- als auch auf der Aktivseite. Die drei Banken wurden während der Kriegszeit immer stärker zu inlandsorientierten „Einlagebanken“, die primär den Staat finanzierten und damit schon mittelfristig auch ein entsprechendes Risiko eingingen. Wie schon vor dem Krieg hatte die Deutsche Bank auch noch Ende 1918 einen deutlich höheren Anteil an eigentlichen Depositen als die beiden anderen Banken. Die besondere Stärke von Dresdner Bank und Commerzbank blieb das Kontokorrentgeschäft mit der gewerblichen Kundschaft. · Die Rentabilität der drei Großbanken – gemessen an den bereinigten laufenden Gewinnen – lag während der ersten drei Kriegsjahre unter dem Niveau des Jahres 1913. In den Jahren 1917 und 1918 sorgten stark steigende Bilanzsummen und ein lebhaftes Emissions- und Effektengeschäft für sehr hohe Eigenkapitalrenditen, teilweise über dem Niveau von 1913. Die Commerzbank, die im Unterschied zu den beiden anderen Banken kontinuierlich niedrige Liquiditätsquoten unterhielt und die Möglichkeiten positiver Fristentransformation gezielt nutzte, lag hierbei an der Spitze. Deutsche Bank und Dresdner Bank litten stärker unter den Kriegsverlusten (u.a. Zwangsliquidation der wichtigen Filialen in London) als die Commerzbank mit ihren nur geringen Vermögenswerten im feindlichen Ausland. Auch in realer Rechnung waren die Ergebnisse befriedigend. · Alle drei Großbanken weisen nach den Bilanzzahlen – also ohne Berücksichtigung von stillen Reserven bzw. Bewertungsverlusten – in den Jahren 1914 bis 1918 teilweiseverhebliche Überschusse der nominalen Aktiva über die nominalen Passiva auf, d.h. sie finanzierten nominale Aktiva mit Eigenkapital und waren damit den Risiken einer Geldwertverschlechterung ausgesetzt. Die Großbanken waren sich dieses Risikos offenbar nicht bewusst und betrieben keine erkennbare Inflationsrisikopolitik. Die Verluste aus dem Verstoß gegen das „Prinzip der Wertgleichheit“ waren während der Kriegszeit (mit Schwerpunkt im Jahr 1918) sowohl absolut als auch in Relation zum Eigenkapital bei der Deutschen Bank am größten. Doch selbst im ungünstigsten Fall haben die (rechnerischen) Verluste aus der Geldentwertung und Bewertungsverluste die laufenden Gewinne bei den drei Banken mit größter Wahrscheinlichkeit nicht aufgezehrt. Der dann noch verbleibende Restgewinn deckte bei der Commerzbank mit Sicherheit, bei Deutscher Bank und Dresdner Bank mit großer Wahrscheinlichkeit die Kriegsverluste ab. Im Ergebnis dürfte es in der Kriegszeit nicht zu einer Minderung des Eigenkapitals gekommen sein. · Nach einer kurzen Unterbrechung durch den Kriegsbeginn kam der säkulare Prozess der Konzentration und Expansion bei den drei Großbanken wieder in Gang. Die durch den Krieg erzwungene weit gehende Beschränkung auf das Inland und die hohe Liquidität in der Volkswirtschaft begünstigten diese Entwicklung. Die drei Großbanken gingen systematisch daran, ihre Positionen durch Übernahme anderer Banken und Filialgründungen in den Gebieten zu stärken, in denen sie bisher nicht oder nur schwach vertreten waren oder in denen sie sich aufgrund der politischen und militärischen Entwicklung günstige Geschäftsmöglichkeiten versprachen. Gegen Ende des Krieges verfügten Deutsche Bank und Dresdner Bank jeweils über ein flächendeckendes Netz von rd. 100 Filialen. Die Commerzbank blieb mit 23 Filialen noch deutlich hinter den beiden anderen Banken zurück. Allen drei Banken gelang es in den Kriegsjahren, die Zahl ihrer Konten/Kunden sehr stark zu steigern. Einher ging dies allerdings mit einem starken Anstieg der Mitarbeiterzahl und einem überproportionalen Kostenanstieg. Ihrem Ziel, Universalbanken für weite Bevölkerungskreise und in allen Regionen Deutschlands vertreten zu sein, waren die drei Großbanken jedoch ein großes Stück näher gekommen. · Ohne Berücksichtigung der Kriegsverluste, nur auf das Inlandsgeschäft bezogen, waren die Jahre 1913 bis 1918 für die drei Großbanken keine schlechten Jahre. Die noch moderate Inflation bzw. Geldentwertung erwies sich unter den gegebenen Bedingungen insgesamt gesehen als eher förderlich für die Geschäfte und das Wachstum der drei Großbanken. ....
Hintergrund: Die Behandlung kindlicher Linsentrübungen stellt nach wie vor eine Herausforderung für die behandelnden Augenärzte dar. Im Bezug auf die Nachstarprävention ist man sich einig, dass das Belassen der intakten Linsenhinterkapsel bei Patienten unterhalb des sechsten Lebensjahres mit einem sehr hohen Nachstarrisiko behaftet ist. Aus diesem Grund haben sich einige Therapieformen mit primärer hinterer Linsenkapseleröffnung etabliert. Die beiden Nachstarpräventionstechniken bei Kindern, vordere Vitrektomie und Knopflochimplantation der Kunstlinse ohne Vitrektomie, wurden in einigen internationalen Studien bereits untersucht. Aus Deutschland stammende Untersuchungsergebnisse aus der kindlichen Kataraktchirurgie, mit einem Beobachtungszeitraum über mehrere Jahre, liegen in der Literatur noch nicht vor.
1. In dieser Arbeit konnten durch chemische Mutagenese drei Pigmentmutanten erzeugt werden, die entsprechend ihrer Pigmentierung in drei Kategorien eingeteilt wurden:hellorange (OC-Mutante), gelb (YC-Mutante) und weiß (WH-Mutante). 2. Durch MS- und NMR-Analysen konnte die Struktur des von H. halophilus produzierten Carotinoids als Methylglykosyl-3,4-dehydro-apo-8’-lycopenoat aufgeklärt werden. Zusätzlich wurden auch die von der OC-Mutante produzierten Carotinoide als Hydroxy-3,4-dehydro-apo-8’-lycopin und Methylhydroxy-3,4-dehydro-apo-8’- lycopinoat identifiziert. Bei allen Pigmenten handelt sich um 8’-Apoderivate mit einer asymmetrischen Anordnung der Methylgruppen. Diese Art von Carotinoiden konnte zuvor nur in dem marinen Isolat P. maritimus gefunden werden (Shindo et al., 2008) 3. Auf Basis der genetischen und biochemischen Daten hinsichtlich der Carotinoide in H. halophilus konnte ein neuartiger Biosyntheseweg postuliert werden. Dabei beginnt die Synthese des C30-Carotinoids nicht wie bei allen bekannten Pigmenten dieser Art mit der Kondensation von zwei C15-Körpern, sondern durch die Kondensation von einem C10- mit einem C20-Molekül. Durch anschließende Desaturierungen, Hydroxylierungen, Methylierungen und Glykosylierungen entsteht das in H. halophilus identifizierte Carotinoid Methylglykosyl-3,4-dehydro-apo-8’-lycopenoat. Dieser Biosyntheseweg ist bisher einzigartig. 4. Die Carotinoide in H. halophilus sind essentiell für den Schutz der Zellen vor oxidativen Schäden. Während das Wachstum des pigmentierten Wildtyps nur wenig durch die Zugabe von bis zu 150 μM Duroquinon beeinträchtigt wurde, wurde das Wachstum der farblosen Pigmentmutante WH schon ab einer Duroquinonkonzentration von 120 μM vollständig gehemmt. Auch durch in vitro-Versuche konnte die antioxidative Eigenschaft von Methylglykosyl-3,4-dehydro-apo-8’-lycopenoat und der Derivate Hydroxy-,4-dehydro-apo-8’-lycopin und Methylhydroxy-3,4-dehydro-apo-8’-lycopinoat bestätigt werden. Dabei war die Wirksamkeit des Carotinoids aus H. halophilus sogar besser als die der biotechnologisch genutzten Pigmente ß-Carotin und Astaxanthin. 5. Durch Wachstumsexperimente konnte gezeigt werden, dass die Carotinoide auch eine Rolle in der Salzadaptation des Bakteriums spielen. Bei niedrigen Salinitäten zeigten der Wildtyp und die farblose Pigmentmutante keine Unterschiede im Wachstum. Eine hohe NaCl-Konzentration von 3,0 M NaCl führte jedoch zu einem verlangsamten Wachstum der Carotinoidmutante WH. 6. Im Genom von H. halophilus konnten anhand von Sequenzvergleichen mit bereits bekannten Kompetenzproteinen aus B. subtilis eine Reihe von putativen Genen identifiziert werden, die dem Bakterium theoretisch die Fähigkeit zur Ausbildung einer natürlichen Kompetenz verleihen. 7. Um die Fähigkeit von H. halophilus zur natürlichen DNA-Aufnahme zu testen, wurde eine Methode entwickelt, durch die es möglich war, viele unterschiedliche Bedingungen zu analysieren. Als Donor-DNA wurde die chromosomale DNA einer Erythromycin-resistenten Mutante von H. halophilus eingesetzt, die innerhalb dieser Arbeit erzeugt wurde. Insgesamt konnten so über 3000 Ansätze getestet werden. Jedoch konnte bei keiner dieser Bedingungen eine natürliche Kompetenz von H. halophilus festgestellt werden. 8. Innerhalb dieser Arbeit ist es gelungen eine Methode zur effizienten Transformation von H. halophilus zu etablieren. Dabei erfolgte die DNA-Aufnahme durch eine PEGvermittelte Protoplastenfusion. Mit dieser Methode konnten für H. halophilus Transformationseffizienzen von 2-102 Transformanden/μg DNA erreicht werden. 9. Durch die Möglichkeit H. halophilus transformieren zu können, ist es in dieser Arbeit erstmalig gelungen, ein System zur markerlosen Deletion von Genen in H. halophilus zu etablieren. Dabei wurde in einem ersten Schritt ein nicht-replizierendes Plasmid, das den gewünschten mutierten Locus enthält, durch Protoplastenfusion in H. halophilus transformiert. Durch einfach homologe Rekombination konnte das Plasmid in das Genom integrieren. Die so erhaltenen Integranten wurden im zweiten Schritt unter nicht-selektiven Bedingungen für etwa 90 Generationen kultiviert. Hierbei kam es zu einer zweiten homologen Rekombination, wodurch das Plasmid wieder aus dem Genom geschnitten wurde (Segregation). Dies resultierte entweder in den Wildtyp-Locus oder in den gewünschten mutierten Locus. Potentielle Integranten wurden auf einen CmS-Phänotyp getestet und mit Hilfe von Southern-Blot-Analysen verifiziert. 10. Mit Hilfe des in dieser Arbeit etablierten Systems zur markerlosen Mutagenese von H. halophilus wurde eine pro-Mutante generiert, deren proHJA-Operon deletiert war. 11. Überraschenderweise konnte die Mutante immer noch Prolin synthetisieren und war demnach nicht prolinauxotroph. Jedoch war H. halophilus pro nicht mehr in der Lage, Prolin als ein kompatibles Solut zu synthetisieren. Trotzdem zeigte das Wachstum der Mutante unter Hochsalzbedingungen keine Beeinträchtigung. Dies konnte auf eine gesteigerte Akkumulation von Glutamat, Glutamin und Ectoin zurückgeführt werden, wodurch der Verlust von Prolin als Osmolyt kompensiert wurde. 12. Die Expression der Gene glnA2, gltA und ectA, die für Biosyntheseenzyme von Glutamin, Glutamat und Ectoin kodieren, ist in H. halophilus pro induziert. Dabei hatte die Salinität einen stärkeren Einfluss auf die relativen RNA-Mengen von glnA2 und ectA in der pro-Mutante als im Wildtyp. gltA zeigte keine salzabhängige Expression im Wildtyp, der mRNA-Level des Gens stieg jedoch in H. halophilus pro bei hohen Salinitäten um das Doppelte im Vergleich zu Niedrigsalzbedingungen an. 13. Für die Glutaminsynthetase, dem Enzym der Glutaminsynthese, konnte eine gesteigerte spezifische Aktivität nachgewiesen werden. Dabei erhöhte sich die Aktivität mit steigender Salinität, sie war jedoch immer 30 bis 50% höher als im Wildtyp. 14. In dieser Arbeit wurde ein möglicher Biosyntheseweg zur salzunabhängigen Prolinsynthese aufgestellt. Hierbei dient Ornithin als Ausgangsmolekül, das entweder durch eine Ornithin-Aminotransferase (RocD) und eine Pyrrolin-5-Carboxylat-Reduktase (ProC und ComER) oder direkt durch eine Ornithin-Cyclodeaminase (ArcB) zu Prolin umgesetzt wird. Für alle Enzyme konnten die entsprechenden Gene im Genom von H. halophilus identifiziert werden. 15. Vor dieser Arbeit konnte bereits gezeigt werden, dass Prolin das dominante kompatible Solut unter Hochsalzbedingungen ist. Dabei war die Expression des pro-Operons sowohl von der Salzkonzentration als auch vom Anion Chlorid abhängig. Es zeigte sich, dass auch die zelluläre Konzentration von ProJ salzabhängig war, mit einem Maximum bei 2,0 – 3,0 M NaCl. Zudem war der ProJ-Gehalt wachstumsphasenabhängig. Während das Enzym besonders in frühexponentiellen Zellen detektiert werden konnte, sank die zelluläre ProJ-Konzentration kontinuierlich in stationären Zellen. Nach einem Salzschock von 0,8 auf 2,0 M NaCl stieg die ProJMenge nach 2 h leicht an und sank nach 4 h wieder kontinuierlich. Der ProJ-Level war in Gegenwart von NaCl maximal, sank aber nur leicht um 25%, wenn die Zellen mit 2 M Na-Glutamat oder Na-Nitrat inkubiert wurden. Die Prolinbiosynthese in H. halophilus wird demnach auch auf Ebene der Translation und/oder der Proteinstabilität reguliert. 16. Die Aminosäure Prolin wird nicht nur als kompatibles Solut in H. halophilus synthetisiert, sondern kann auch als C- und Energiequelle und als Stickstoffquelle genutzt werden. 17. Liegt Prolin als alleinige C- und Energiequelle im Medium vor, erfolgt eine salzabhängige Akkumulation des Osmolyts in H. halophilus, während der zelluläre mRNA-Level der pro-Gene stark reduziert ist. Prolin wird demnach nicht nur als Cund Energiequelle aufgenommen, sondern auch als kompatibles Solut. 18. Im Genom von H. halophilus konnten zwei Gene, die für die potentiellen Na+/Prolin- Symporter 3541 und 1381 kodieren, identifiziert werden, deren mRNA-Level bei Wachstum auf Prolin induziert war. 19. Durch Aminosäuresequenzvergleiche konnten in dieser Arbeit im Genom von H. halophilus jeweils zwei Isogene gefunden werden, die für potentielle Prolindehydrogenasen (prodh1/prodh2) und Pyrrolin-5-Carboxylat-Dehydrogenasen (p5cdh1/p5cdh2) kodieren. Mittels reverser Transkription von mRNA und anschließender PCR-Analysen konnte gezeigt werden, dass prodh2 und p5cdh2 ein Operon bilden (put-Operon). Eine Quantifizierung der Transkriptmengen der Abbaugene prodh1/p5cdh1 und prodh2/p5cdh2 mittels quantitativer PCR in Zellen, die in Gegenwart von Prolin als alleiniger C- und Energiequelle oder Stickstoffquelle gezogen wurden, zeigten deutlich, dass unter diesen Bedingungen nur die Expression von prodh2/p5cdh2 induziert wurde. Wurden die Zellen in Gegenwart von Glukose als C- und Energiequelle gezogen, stieg die mRNA-Menge von prodh2/p5cdh2 unter Hochsalzbedingungen um den Faktor 10 – 20 im Vergleich zu Zellen, die bei niedrigen Salinitäten kultiviert wurden, an. Die mRNA-Menge des put- Operons war in Glukose-gewachsenen Zellen wachstumsphasenabhängig mit einem Maximum in der stationären Wachstumsphase. In Gegenwart von 1,0 M NaCl stieg die mRNA-Menge um das 20-Fache, in Gegenwart von 3,0 M NaCl um das Doppelte. 20. Mit Hilfe des Systems zur markerlosen Mutagenese in H. halophilus konnte eine glnA2-Mutante generiert und verfiziert werden. H. halophilus glnA2 zeigte keinen Wachstumsphänotyp bei Anzucht in Gegenwart von unterschiedlichen NaCl-Konzentrationen. Die Deletion von glnA2 führte zu einer Inhibierung der salzabhängigen Prolinbiosynthese, während der Glutamat- und Glutaminpool bei allen getesteten Salinitäten im Vergleich zum Wildtyp nicht verändert war. Der Verlust von Prolin als kompatibles Solut konnte teilweise durch einen Anstieg des Ectoinlevels kompensiert werden. Die zelluläre Transkriptmenge von glnA1 und ectA war in H. halophilus glnA2 stärker von der Salinität beeinflusst als im Wildtyp, während die salzabhängige Regulation der proH-Expression aufgehoben wurde. Im Gegensatz zum Wildtyp wurde die spezifische Aktivität der Glutaminsynthetase in H. halophilus glnA2 durch steigende NaCl-Konzentrationen inhibiert.
Während der vergangenen Jahrzehnte stieg die durchschnittliche Lebenserwartung der Bevölkerung in den westlichen Industrieländern durch die Verbesserung der allgemeinen Lebensbedingungen, insbesondere durch die Fortschritte in der Hygiene und der Medizin sowie stabile politische Verhältnisse, kontinuierlich an. Aufgrund dieser demographischen Entwicklung zu einer zunehmend älter werdenden Gesellschaft nimmt auch das Auftreten von progressiven, altersabhängigen Erkrankungen, wie zum Beispiel der Parkinson‟schen Krankheit zu. Dieser Trend stellt sowohl für die betroffenen Patienten und ihre Angehörigen als auch für die Gesundheits- und Sozialsysteme eine gewaltige und kostenintensive Herausforderung dar. Um wirkungsvolle Therapien entwickeln zu können, die früh im Krankheitsverlauf eingreifen und die Manifestation der Erkrankung verhindern oder verzögern beziehungs-weise die darauf abzielen, die Symptome der Erkrankung nach deren Manifestation zu lindern, ist es unerlässlich, die diesen progressiven, altersabhängigen Krankheiten zugrundeliegenden Mechanismen zu erforschen und entsprechende krankheitsspezifische, molekulare Biomarker zu identifizieren. Darüber hinaus stellt die Identifizierung solcher Biomarker einen wichtigen Ansatzpunkt für die klinische Diagnostik und Therapeutik sowie für die Entwicklung neuer therapeutischer Behandlungsstrategien dar. Das subzellulär vorwiegend präsynaptisch lokalisierte Protein alpha-Synuklein blieb in den Jahren nach seiner Erstbeschreibung 1988 durch Luc Maroteaux von der biomedizinischen Forschung weitgehend unbeachtet. Erst die Assoziationen von unterschiedlichen Mutationen des alpha-Synuklein-Gens mit seltenen, autosomal-dominant vererbten, monogenetischen Varianten der Parkinson‟schen Krankheit (PARK1 und PARK4) seit 1997 sowie die Identifizierung des Proteins im Jahre 1998 als Hauptbestandteil von intrazellulären Proteinaggregaten (Lewy-Körpern und Lewy-Neuriten), deren Vorkommen charakteristisch für progressive, neurodegenerative und unter dem Sammelbegriff „Synukleinopathien“ klassifizierte Erkrankungen (wie beispielsweise auch die häufigen, sporadischen Formen der Parkinson‟schen Krankheit) ist, ließen das alpha-Synuklein in den Fokus der biomedizinischen Forschung rücken. Trotz intensiver Bemühungen der weltweiten Forschungsgemeinschaft konnten seitdem in den vergangenen 13 Jahren die physiologischen Funktionen von alpha-Synuklein und die den unterschiedlichen Synukleinopathien zugrundeliegenden, molekularen pathophysiologischen Mechanismen nicht genau identifiziert werden. Stattdessen führte die intensive Forschung an alpha-Synuklein mit den unterschiedlichsten experimentellen Herangehensweisen und Modellsystemen zu verschiedenen und teilweise kontroversen Hypothesen und Theorien über dessen physiologische Funktion und pathophysiologische Wirkungsweisen. Die in dieser Dissertationschrift dargestellten experimentellen Untersuchungen wurden an zwei speziellen transgenen Mausmodellen durchgeführt, die entweder einen vollständigen Mangel (= „knockout“; KO) des alpha-Synuklein-Proteins oder eine transgene Überexpression von humanem, A53T-mutierten alpha-Synuklein aufwiesen. Das Hauptziel der dargestellten Studien war es, neue Erkenntnisse hinsichtlich der physiologischen Funktionen des alpha-Synuklein-Proteins, beziehungsweise der krankheits-relevanten, pathophysiologischen Mechanismen der den familiären PARK1- und PARK4-Varianten der Parkinson‟schen Krankheit zugrundeliegenden alpha-Synuklein-Mutationen (Substitution von Alanin durch Threonin an Position 53 der Aminosäuresequenz (A53T; PARK1) sowie Überexpression (Genduplikation/-triplikation; PARK4)) zu gewinnen...