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Die vorliegende Studie hat die Häufigkeit familiärer Tumorhäufungen in Familien von Patienten mit kolorektalen Karzinomen und klinische Kriterien untersucht, die mit dem vermehrten Auftreten von Tumoren in diesen Familien assoziiert sind. Die Bedeutung von klinischen Diagnosekriterien zur Erfassung familiärer Häufigkeiten von Tumoren wurde analysiert. Dabei zeigte sich, dass die klassischen Diagnosekriterien im Alltag keine Bedeutung haben (die Amsterdam-Kriterien werden kaum erfüllt). Dass sich andererseits familiäre Tumorhäufungen mit einfachen klinischen Kriterien in hohem Ausmaß erfassen lassen, dazu zählt als wichtiges Kriterium: • Ein weiterer betroffener Patient mit Tumorleiden in der Familien im Diagnosealter <= 55 Jahre, • die Vertikale Transmission HNPCC-typischer Tumore Bei Anwendung dieser Kriterien können nahezu 2/3 der Familiären Cluster erkannt werden. Die Kombination von Kriterien, wie etwa „Diagnosealter des Patienten <= 50 Jahre mit Angehörigen mit Karzinom im Diagnosealter <= 50 Jahre“, sowie die Kombination „Diagnosealter des Patienten <= 50 Jahre und die Vertikale Transmission HNPCC-typischer Karzinome“ verbessert die Erkennung von Familien mit Tumorhäufungen nicht. Das Tumorspektrum in den so definierten Familien entspricht dem des HNPCC. Das legt den Schluss nahe, dass es sich um eine abortive Form des HNPCC oder aber um ein molekulargenetisch differentes, aber in der Manifestation mit dem HNPCC überlappendes Syndrom handeln könnte. Ob bei den so definierten Familien eine präventive Diagnostik erfolgreich ist, bedarf weiterer Studien. Solange kein einfaches molekulargenetisches Verfahren leicht und kostengünstig zur Verfügung steht, sind diese Anamnesekriterien für den klinischen Alltag und für die betroffenen Familien von außerordentlicher Bedeutung.
Die Thrombozytenaktivierung, die PLA-Bildung via CD62, die Leukozytenaktivierung und die entzündliche Aktivität am Endothel nehmen in der heutigen pathophysiologischen Vorstellung der peripheren Atherosklerose und ihrer Entstehung eine zentrale Rolle ein. In dieser Querschnittstudie wurden die PLA-Bildung und Marker der Plättchen-, Leukozyten- und Endothelaktivierung (PAC-1, CD62, Mac-1 und sICAM-1) bei 44 Patienten mit peripherer arterieller Verschlusskrankheit unter Therapie mit ASS (n=17), Clopidogrel (n=12), ihrer Kombination (n=8) oder ohne Therapie (n=7) und bei einer Kontrollgruppe, bestehend aus gesunden Probanden (n=9), untersucht. Die Messungen wurden mittels Flowzytometrie im Vollblut ohne (baseline) und nach in vitro Stimulation mit ADP oder TRAP und eines Immunoassays durchgeführt. Die CD62-Expression zeigte sich bei unbehandelten und mit ASS behandelten Patienten ohne und nach Stimulation signifikant höher als bei mit Clopidogrel oder mit einer Kombination aus ASS und Clopidogrel behandelten Patienten. Gleiches galt für die PLA-Bildung (Monozyten-Leukozyten-Aggregate). Die Mac-1-Expression zeigte sich in den mit TRAP oder ADP stimulierten Proben unter einer Kombina-tionstherapie aus ASS und Clopidogrel gegenüber Patienten ohne oder mit ASS Monotherapie signifikant reduziert. Die sICAM-1-Plasmakonzentrationen waren bei gesunden Probanden und bei antiaggregatorische behandelten Patienten signifikant niedriger als bei unbehandelten Patienten. Die Werte unterschieden sich dabei zwischen den verschiedenen antiaggregatorischen Therapien nur unwesentlich. Dies ist die erste Studie, die zeigt, dass die PLA-Bildung bei Patienten mit pAVK vermehrt ist und unter einer Therapie mit Clopidogrel gemindert wird.
In der vorliegenden Arbeit wird das Wachstums- und Zelltodverhalten von Tumoren des zentralen Nervensystems untersucht. Des Weiteren wird die Expression verschiedener Apoptose-assoziierter Faktoren in den Präparaten analysiert und mit Normalkontrollen verglichen. Es zeigt sich, dass Apoptose von Tumorzellen aller untersuchter Hirntumore und Malignitätsgrade vollzogen werden kann. Die Rate apoptotischer Zellen ist jedoch sehr variabel und korreliert nicht mit dem Malignitätsgrad der Tumore. Auch besteht keine Korrelation zwischen der Apoptose- und der Proliferationsrate. Die Ergebnisse legen insgesamt nahe, dass die Apoptoserate nicht als Marker für die Malignität von Tumoren des zentralen Nervensystems verwendet werden kann. Auch unter Einbeziehung Apoptose-assoziierter Faktoren ist eine Gradifikation der Tumore hinsichtlich der Malignität nicht möglich. So unterscheiden sich z.B. atypische (WHO-II) und anaplastische (WHO-III) Meningiome quantitativ und qualitativ nicht signifikant voneinander. Es können ebenfalls keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der Expression der untersuchten Apoptose-assoziierten Faktoren, sowie der Apoptose- und Proliferationsraten zwischen Medulloblastomen und primitiven neuroektodermalen Tumoren (PNETs) festgestellt werden. Dies spricht dafür, dass sich diese Tumore lediglich bezüglich ihrer Lokalisation im zentralen Nervensystem unterscheiden. Die Analyse der Apoptose-assoziierten Faktoren zeigt, dass alle untersuchten Faktoren grundsätzlich in allen untersuchten Tumoren vorkommen, während die Normalkontrollen diese Faktoren nicht exprimieren. Der Vollzug der Apoptose findet jedoch nicht in diesem Maße statt, da die Apoptoserate der Tumore (markiert durch TUNEL) stets wesentlich geringer ist als die Expressionsraten der Apoptose-assoziierten Faktoren. Es ist davon auszugehen, dass entdifferenzierte Tumorzellen entweder nur begrenzt in der Lage sind, ihr apoptotisches „Selbstzerstörungsprogramm“ in Gang zu setzen und zu Ende zu führen, oder, dass apoptosehemmende Mechanismen greifen. Um so interessanter wäre es, durch therapeutische Intervention Apoptose zu initiieren. Die Analyse der einzelnen Apoptose-assoziierten Faktoren liefert Hinweise darauf, an welchen Stellen des apoptotischen Systems eine solche Intervention ansetzen könnte: Die hochmalignen WHO-IV-Tumore zeigen eine signifikante Hochregulation der Effektor-Caspasen-3 und -6. Die physiologischen Aktivierungsmechanismen dieser Caspasen z.B. durch Caspase-2 und TNFalpha scheinen in diesen hochmalignen Tumoren jedoch weniger eine Rolle zu spielen, da diese Faktoren hier nur in geringem Ausmaß exprimiert werden. Jedoch könnten modifizierte, per se aktive Caspase-3- und -6-Moleküle eine interessante therapeutische Option zur Behandlung maligner Tumore des zentralen Nervensystems darstellen. Zu beachten ist aber unter anderem, dass z.B. Glioblastome auch geringe Expressionsraten apoptotischer Faktoren im peritumoralen, mikroskopisch nicht infiltrierten Normalgewebe zeigen. Dies könnte für eine peritumorale Dysfunktion des Hirngewebes sprechen. Welche Rolle dies bei der Behandlung mit Apoptose-stimulierenden Agenzien spielt und wie spezifisch die Anwendung solcher Stimulanzien für Tumorgewebe wären, muss Gegenstand weiterer Studien sein. Die untersuchten WHO-II- und –III-Tumore zeigen eine Hochregulation vor allem von Faktoren des extrinsischen Apoptoseweges (z.B. TNFalpha). Die Expressionsraten von TNFalpha korrelieren signifikant mit dem WHO-Grad der untersuchten Tumore. Interessante therapeutische Optionen könnten hier zum einen die Aktivierung des extrinsischen Apoptoseweges über TNFalpha sein, zum anderen könnte man versuchen, eine direkte Aktivierung über modifizierte Effektor-Caspasen herbeizuführen. Insgesamt existieren verschiedene mögliche Angriffsorte innerhalb des apoptotischen Netzwerkes der Zelle für eine thepeutische Intervention bei Tumoren des zentralen Nervensystems. Die Komplexität des Kaskade-artigen Systems legt nahe, dass eine therapeutische Intervention möglichst an dessen Ende erfolgen sollte, um möglichst viele Stör- und Hemmfaktoren zu umgehen.
Die meisten nanopartikulären Ansätze im Bereich der Arzneiformenentwicklung befinden sich am Anfang der klinischen Evaluation, sodass das wirkliche Potenzial nanotechnologischer Produkte sich erst in den kommenden Jahren abzeichnen wird. Die Zusammenführung von „Drug-Targeting“ und „sustained release“ mit nanotechnologischer Entwicklung könnte in Zukunft zu einem Fortschritt in der Medizin beitragen. Auf dem Gebiet der Antisense-Oligonukleotid (ASO)-Therapie stellt der ASOTransfer in Zielzellen eine entscheidende Hürde dar. ASO benötigt, um im Körper an den Wirkort zu gelangen, einen zuverlässigen Träger, der vor dem Abbau in physiologischen Milieu schützt, den Transport über extra- und intrazelluläre Barrieren im Körper gewährleistet und die ASO zielgerichtet an den Wirkort bringt. Der Einbau von ASO in kolloidale Trägersysteme wie Nanopartikel vermittelt eine effiziente Aufnahme in Zellen bei gleichzeitigem Schutz vor abbauenden Enzymen im Körper. Des Weiteren kann eine gezielte Aufnahme in Zielzellen erreicht werden, die normalerweise nicht auftritt. Bisherige Trägersysteme bestanden meist aus Nanopartikeln von synthetischen Materialien, die entweder die ASO an der Oberfläche adsorbiert oder in der Partikelmatrix inkorporiert hatten. Als Trägermaterialien wurden oft Polyalkylcyanoacrylate verwendet. Sie sind aufgrund ihrer negativen Ladung und Hydrophobizität nicht geeignet ohne Zugabe von Hilfsstoffen, welche in höheren Konzentrationen toxisch wirken, anionische hydrophile Substanzen wie ASO zu adsorbieren. Außerdem besteht bei Nanopartikeln mit adsorbierten ASO die Gefahr, dass es bei einer intravenösen Gabe zu einer Desorption der ASO kommt und somit ASO die Zielzellen nicht in verpackter Form erreicht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden NP auf Basis von humanem Serumalbumin (HSA) als Trägersystem für ASO entwickelt. Durch Oberflächenmodifikation dieser Trägersysteme wurde eine Kopplung von anti-HER2 Antikörper ermöglicht und ein AK-vermitteltes Drug-Targeting erreicht. HSA als natürliches Makromolekül zeichnet sich durch geringe Toxizität und gute Biodegradierbarkeit aus. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass ein Wirkstoff mit vorhandenen Bindungsstellen im HSA-Molekül Wechselwirkungen eingehen kann, was eine erfolgreiche Einbindung gewährleistet. Zusätzlich eignen sich aus HSA hergestellte NP aufgrund funktioneller Gruppen an der Partikeloberfläche für die Kopplung von Antikörpern und ermöglichen somit eine zielgerichtete Arzneistofftherapie. Die entwickelten Trägersysteme wurden hinsichtlich kolloidaler Parameter wie Teilchengröße, Oberflächenladung, ASOBeladungseffizienz, Stabilität in physiologischen Medium und ihrem Vermögen, einen ASO-Effekt zu erzielen, in Zellkultur evaluiert. 4.1 Optimierung der Beladung von NP mit ASO Zunächst wurden HSA-NP hergestellt, bei denen die Beladung durch Inkorporieren des ASO in die Partikelmatrix erfolgte. Die Evaluierung des Desolvatationsprozesses ergab eine Abhängigkeit der ASO-Beladung vom zugesetzten Desolvatationsmittel Ethanol. Eine Mindestmenge eines 1,8-fachen Überschusses an Ethanol ist für die vollständige Desolvatation des HSA und damit für die Einbindung des daran adsorbierten ASO erforderlich. Ebenso beeinflusste die Quervernetzung der Partikel die ASO-Beladungseffizienz. Je mehr Glutaraldehyd zugesetzt wurde, desto stabiler waren die NP. Nimmt die Menge des Glutaraldehyds von 40% auf 200% zu, löste sich um so weniger ASO während der Waschschritte aus der Partikelmatrix heraus. Jedoch hat das Ausmaß der Quervernetzung einen entscheidenden Einfluss auf die Biodegradierbarkeit des Partikelsystems. Zu stark quervernetzte NP (Quervernetzung von 200%) können von intrazellulären Enzymen nicht mehr abgebaut werden, infolge dessen gelangt das eingebundene ASO nicht zu seinem Wirkort ins Zytoplasma. Im Folgenden wurde versucht über die Einführung einer permanenten kationischen Ladung (EDC/Cholamin-Reaktion) im HSA-Molekül ein Trägerpolymer mit höherer Beladungskapazität im Vergleich zu nativem HSA zu etablieren. Ein geringer Anteil von kationisiertem HSA (cHSA) in der HSA-Partikelmatrix reichte aus, um die ASOBeladungseffizienz um ein 2,5-faches signifikant zu steigern. Das Ziel der Oberflächenmodifikation der HSA-NP war eine Positivierung des Zetapotentials, um die Bindung negativ geladener Wirkstoffe wie ASO über elektrostatische Wechselwirkungen zu ermöglichen. Die Umsetzung der HSA-NP mit EDC und Cholamin führte zu einer deutlichen Verschiebung des Zetapotentials von ca. –20,0 mV in den positiven Bereich (+38,6 mV). Durch die Inkubation mit ASO konnten so große Menge an ASO effizient an die Partikeloberfläche (NP+) gebunden werden. Ein Vergleich dieser Ergebnisse zeigte, dass die Beladung mit ASO in der Reihenfolge von Albumin-NP (HSA-NP) mit einer Beladungseffizienz von 7,6 µg ASO / mg NP zu Nanopartikeln, die in der Partikelmatrix inkorporierten Anteil an kationisiertem Albumin enthielten (cHSA-NP) mit 18,2 µg ASO / mg NP, zu Oberflächen-kationisierten Nanopartikeln (NP+) mit 100 µg ASO / mg NP signifikant zunahm. 4.2 Mit ASO-beladene NP in der Zellkultur HSA-NP wurden von allen verwendeten Brustkrebszell-Linien gut vertragen. Nach Zellaufnahme der HSA-NP wurden bei niedriger Quervernetzung (40%) die Partikel gut intrazellulär abgebaut und das ASO in das Zytoplasma freigesetzt. Es konnte im CLSM gezeigt werden, dass die ASO-Freisetzung innerhalb von 24 h zunahm. Alle Versuche mittels den entwickelten ASO-beladenen Trägersystemen einen Antisense Effekt nachzuweisen schlugen fehl. Da die Beladung der HSA-NP nicht weiter erhöht werden konnte, richtete sich ein neuer Ansatz auf eine verbesserte Aufnahme der NP über einen Rezeptor-vermittelten Mechanismus. 4.3 Antikörper-vermittelte Anreicherung von NP in Zielzellen Die Anwendung von monoklonalen Antikörpern mit einer Spezifität gegenüber Tumorzellen ist eine relativ neue und spannende Modalität in der Krebstherapie. Eine der vielversprechenden Zielstrukturen für eine solche Immunotherapie stellt der HER2-Membranrezeptor dar, dessen Überexpression mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. HER2 ist ein Produkt des Proto-Onkogens erbB2, das für einen 185 kDa Transmembrantyrosinkinase Wachstumsfaktorrezeptor kodiert. Dieser Rezeptor ist in normalem Gewebe bei Erwachsenen nur geringfügig exprimiert [Press et al., 1990], aber ist bei ungefähr 30% der Patienten mit humanem Magenkarzinom, Lungen- und Brustkrebs überexprimiert. Gegenwärtig dient HER2 als Tumormarker für die zielgerichtete Behandlung mit dem humanisierten anti-HER2 AK Trastuzumab (Herceptin®) von Patientinnen bei metastasierendem Brustkrebs. Jedoch können bessere Ergebnisse erreicht werden, wenn Trastuzumab in Kombination mit anderen Zytostatika verabreicht wird. Antikörper haben bei alleiniger Gabe eine ausreichende Antitumoraktivität, aber sie können auch konjugiert mit Zytostatika sowie Toxinen und Radionukliden, genutzt werden, um diese zu den Tumoren bringen. Im Prinzip kann die Trägereigenschaft von Antikörpern gesteigert werden, wenn ein Antikörper an ein Arzneistoffreservoir, wie Nanopartikel oder Liposomen geknüpft ist. Der Vorteil dieses innovativen Ansatzes für eine zellspezifische Anreicherung im Vergleich zu herkömmlichen Biokonjugaten ist, dass eine höhere Arzneistoffträgerkapazität mit einer verbesserten Spezifität für eine zielgerichtete Pharmakotherapie kombiniert werden kann. Wegen seiner erhöhten Expression in Tumorzellen, seiner extrazellulären Verfügbarkeit und seiner Fähigkeit nach Antikörperbindung internalisiert zu werden, stellt HER2 eine geeignete Zielstruktur für die Tumortherapie mit zellspezifischen Nanopartikeln dar. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion Antikörpermodifizierter Protein-basierter Nanopartikel zu untersuchen und eine spezifische Aufnahme in HER2-überexprimierende Zell-Linien zu verbessern. Ein spezifisches Targeting wurde in verschiedenen Krebszell-Linien mit unterschiedlichen HER2- Expressionsleveln durch FACS-Analyse bewiesen. Die Versuche beinhalteten Inhibitionsexperimente durch Vorinkubation mit Trastuzumab, um die Selektivität der Bindungsstellen auf der Zelloberfläche zu unterstreichen. Die zelluläre Aufnahme dieser Nanopartikel, ebenso wie die zelluläre Verteilung, konnte im CLSM beobachtet werden. Diese ermutigenden Ergebnisse heben den potenziellen Wert Antikörper-modifizierter Nanopartikel für eine spezifische Anreicherung in Tumorzellen hervor. Anti-HER2-NP binden effizient an HER2-überexprimierende Zellen (85%) und werden anschließend internalisiert. Im Anschluss wurde die Beladung von ASO in HSA-NP mit den erhaltenen Erkenntnissen Antikörpermodifizierter HSA-NP kombiniert. Zunächst wurde die Freisetzung von farbmarkierten ASO aus AK-modifizierten HSA-NP in SK-Br-3- und MCF7-Zellen untersucht. Durch die spezifische Aufnahme der AK-modifizierten HSA-NP gelangt bereits innerhalb der ersten Stunde deutlich mehr ASO in die Zelle. Die Zellaufnahme und Freisetzung in das Zytosol der Zelle ist abhängig vom HER2- Protein auf der Zelloberfläche und nimmt über 24 h stark zu. SK-Br-3-Zellen reichern das farbmarkierte ASO stärker als die MCF7-Zellen an. Wirksame ASOKonzentrationen können in SK-Br-3-Zellen mit einer sehr geringen Partikelkonzentration von nur 50 µg anti-HER2-NP/ml erzielt werden, während in MCF7- Zellen eine weit aus höhere Partikelkonzentration notwendig ist. Da die HER2- überexprimierenden Zellen, die für einen Antisense-Testung zur Verfügung standen, sich nicht für den Nachweis eines Antisense-Effektes eigneten, konnte die entwickelte Kombination von ASO-beladenen AK-modifizierten Albumin- Nanopartikeln nicht weiter getestet werden. In Kombination mit einem in die Nanopartikel inkorporierten Arzneistoff wird eine wirksame intrazelluläre Arzneistoffabgabe erwartet. Die Anwendung Antikörpermodifizierter Nanopartikel kann Arzneistoff-Trägereigenschaften mit einer zielgerichteten Tumortherapie kombinieren. Diese neue Generation von immunospezifischen Nanopartikeln sollte auf jeden Fall noch weiter im Einzelnen untersucht werden, um die Wirksamkeit dieser Arzneistoffträgersysteme unter in vitro und in vivo Bedingungen zu belegen.
Genetisch prädisponierende Faktoren und äußere Einflussfaktoren haben eine wesentliche ätiopathogenetische Bedeutung bei der multiplen Sklerose. Zahlreiche Fall-Kontroll-Studien und eine zunehmende Anzahl von Kohorten-Studien wurden zur Aufdeckung äußerer Risikofaktoren durchgeführt. Dennoch bleibt bis heute die Ätiologie der multiplen Sklerose weiterhin rätselhaft. In der vorliegenden Fall-Kontroll-Studie wurden Daten von 538 MS-Patienten, die im Laufe einer Langzeitstudie zur multiplen Sklerose in Südhessen von 1979 bis 1998 mittels eines ausführlichen Interviews befragt wurden, mit den Daten von 102 ebenfalls durch Interview befragten stationär chirurgischen Kontrollpersonen verglichen. Die Studie bezog sich hauptsächlich auf Einflüsse in der Kindheit und Jugend. Im Jahre 1998 wurden 102 Patienten (68 Frauen, 34 Männer), die in der Mehrzahl zur Durchführung einer Appendektomie, Thyreoidektomie, Herniotomie oder Cholezystektomiein der Chirurgischen Klinik des Evangelischen Krankenhauses Elisabethenstift in Darmstadt stationär behandelt wurden, während ihres stationären Aufenthaltes befragt. Ausgeschlossen waren Patienten mit malignen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und multimorbide, schwer kranke Patienten. Alle Kontrollpersonen wurden ausschließlich durch den Autor befragt. Von 1979 bis 1998 wurden insgesamt 538 multiple Sklerose-Patienten des Areals Südhessen, die zwischen 1938 und 1978 geboren wurden, ebenfalls mittels Fragebogen erfasst (364 Frauen, 174 Männer). Die meisten Befragungen erfolgten durch ein und denselben Untersucher (K. Lauer). Erfragt wurden zahlreiche Expositionen im Sinne der Hypothesengenerierung aus folgenden Bereichen: Kindliche Infektionen, ausgewählte internistische Erkrankungen, Traumata, Operationen und Anästhesien, Medikamente, Zahnstatus, Ernährung, Zigarettenkonsum, Wohn- und Sanitärverhältnisse, multiple Sklerose in Familie und Umgebung sowie Sozialstatus. In der bivariaten Auswertung wurden für jede Variable die Odds Ratio (OR) und das 95%- Konfidenzintervall (KI) errechnet und der p-Wert wurde mit dem Chi2-Test bzw. mit dem zweiseitigen Fisher-Test ermittelt. Hierzu wurde das Statistikprogramm Epi Info 6.0 verwendet. Für die multivariate Auswertung wurde eine schrittweise logistische Regressionsanalyse mit jeweiliger Elimination einer Variablen bis zum Signifikanzniveau (p X 0,05) vorgenommen. In die multivariate Analyse gingen alle signifikanten Variablen der bivariaten Auswertung (p X 0,05) sowie Geschlecht und Geburtsjahr ein. Die Variable „Tetanusimpfung“ wurde nicht mit einbezogen. Primäre Nachteile der vorliegenden Fall-Kontroll-Studie sind die unterschiedlichen Befragungszeiträume und Interviewer bei den Fällen und Kontrollen, weiterhin die Tatsache, dass der Fragebogen nur eine Reliabilität für eine eingeschränkte Zahl von Variablen bei den MS-Fällen und eine unbekannte Validität aufweist. Alter und Geschlecht wurden durch die Einbeziehung in die multivariate Auswertung kontrolliert. Bei der bivariaten Auswertung der Daten aller MS-Patienten und Kontrollpersonen waren die Variablen „Masern“, „Masern R 6 Jahre“, „Keuchhusten“, „oft Angina“, „Aether-/Chloroformnarkose“, „Karies“, „Konsum tierischer Fette“, „Hausschlachtung“, „Konsum pflanzlicher Fette“, „MS in der Familie“, „Kohleheizung“, „Kontakt zu Mäusen“ sowie „Kontakt zu Ratten“ mit einem signifikant erhöhten MS-Risiko assoziiert. Für das Vorhandensein von MS im Bekanntenkreis zeigte sich eine grenzwertig signifikante positive Assoziation. Die Variablen „Windpocken“, „Nasennebenhöhlenentzündung“ (Sinusitis), „Darmwürmer“ (Helminthosis), „>5 Zahnfüllungen“, „Polio-Impfung“, „Tetanus-Impfung“, „Diphtherie-Impfung“, „Konsum vieler Eier“ und „Abwasserentsorgung über Klärwerk“ waren signifikant invers mit MS assoziiert; für „Scharlach“, „Hypothyreose“ und „Abwasserentsorgung über ausgebaute Kanalisation“ ergab sich eine grenzwertig signifikante negative Assoziation. Außerdem erfolgten getrennte bivariate Auswertungen für die Subgruppen „weibliche MS-Patienten“, „männliche MS-Patienten“, „MS-Patienten mit schubförmigem Krankheitsbeginn“ und „MS-Patienten mit primär chronisch progredienter Verlaufsform“ mit den jeweiligen Kontrollpersonen. In den multivariaten Auswertungen ergaben sich für die Variablen „pflanzliche Fette“, „tierische Fette“, „Masern“ (bei Frauen), „Mäuse“, „MS in Familie“ (bei MS-Patienten mit schubförmigem Krankheitsbeginn) und „Kohleheizung“ positive Korrelationen zur multiplen Sklerose. Negativ korrelierend waren „Diphtherie-Impfung“, „Sinusitis“ und „viele Eier“ (bei Frauen). Der vermehrte Konsum tierischer Fette bei den MS-Kranken steht in Einklang mit zahlreichen Untersuchungen, während die gefundene Häufung von Pflanzenfett vorerst nicht erklärt ist. Zahlreiche andere Studien bestätigen auch das Vorhandensein einer multiplen Sklerose in der Familie als Risikofaktor. Ein erhöhtes Risiko für Mäusekontakte und Kohleheizung sollte in weiteren Untersuchungen überprüft werden. Für den bei den MS-Kranken gefundenen, selteneren Befall mit Würmern deutet sich eine biologische Plausibilität über die vermehrte TH2-Zellantwort bei Wurmbefall an. Zum Auftreten von Sinusitiden, das in der eigenen Studie seltener bei den Fällen war, liegen kontroverse Befunde bisheriger Untersuchungen vor. Ein protektiver Einfluss der Diphtherieimpfung wurde ebenfalls von anderen Untersuchern gefunden und sollte weiter überprüft werden. Letztendlich ist in der vorliegenden Arbeit eine Selektions-Verzerrung des MS-Risikos durch die ländliche Wohnortgröße, die nicht kontrolliert werden konnte, nicht auszuschließen, so dass eine zunächst vorsichtige Interpretation am Platze ist.
Katheterverschluß des Vorhofseptumdefektes unter besonderer Berücksichtigung der Langzeitergebnisse
(2004)
Zwischen 5/93 und 12/1999 wurde bei 166 Patienten mit einem ASD vom Sekundum-Typ und bei 178 Patienten mit persistierendem Foramen Ovale versucht, den intreratrialen Defekt transfemoral zu verschließen. Dies gelang bei 156 Patienten mit ASD (Erfolgsquote 94%) und bei allen Patienten mit PFO. Dabei wurden ASDOS-, Buttoned Device-, Angelwing-, CardioSeal- , Amplatzer- , Starflex-, und Helex-Okkluder verwendet. In dieser Arbeit sollen die Akutergebnisse und insbesondere der Langzeitverlauf nach diesen Verschlüssen dokumentiert werden. Das Alter der 115 weiblichen und 51 männlichen Patienten mit ASD betrug im Mittel 47,1 ± 17 (13 – 77) Jahre, das der 97 weiblichen und 91 männlichen Patienten mit PFO 46 ± 13 (17 – 75) Jahre. Die Defektgröße der ASD im transösophagealen Echokardiogramm betrugen 14,1 ± 6,7 (3,4 - 29,4) mm (n=117). Mittels Ballonpassage gemessen betrugen sie 20,6 ± 5,3 (6 – 35) mm (n=150), der Stretched diameter betrug 17,6 ± 4,7 (7 – 29) mm (n=97). Die Defektgröße der PFO betrug 12,3 ± 3,3 (4 – 24) mm (Ballonpassage n=173) bzw. 8,9 ± 3,1 (3 – 20) mm (Stretched diameter n=122). Bei 130 Patienten (78,3%) mit ASD gelang der Verschluß im ersten Versuch. Bei 9 (5,4%) waren mehrere Versuche in einer Sitzung nötig, bei 6 (3,6%) führte erst eine zweite Sitzung zum Erfolg. Bei 6 (4,6%) wurde ein zweiter Okkluder implantiert. Insgesamt konnten 156 Patienten (94%) erfolgreich transfemoral behandelt werden. Bei 10 Patienten (6 %) gelang der transfemorale Verschluß nicht. Der Verschluß des PFO war bei allen Patienten erfolgreich. Bei 179 der 188 Patienten (95,2%) gelang der Verschluß im ersten Versuch. Bei 4 Patienten (2,1%) waren mehrere Versuche in einer Sitzung nötig, bei 2 Patienten (1,1%) führte erst die zweite Sitzung zum Erfolg. Bei 2 Patienten (1,1%) wurde aufgrund von Restshunt ein zweiter Okkluder implantiert. Der Nachbeobachtungszeitraum betrug im Mittel bei den ASD-Patienten 23,7 und bei den PFO-Patienten 21,3 Monate. Bei den 101 ASD-Patienten, bei denen sowohl vor, als auch nach dem Eingriff das Shuntvolumen bestimmt wurde, sank das Verhältnis von Qp/Qs signifikant von 2 ± 0,5 auf 1,1 ± 0,3 (p<0,001). Im TEE war 6 Monate nach dem Defektverschluß (n=121) bei 77,7% der Patienten kein Shunt mehr feststellbar, bei 8,3% war ein sehr kleiner Shunt (<2 mm) und bei 14,1% ein Shunt >2 mm vorhanden. Jedoch hatten 51,9% der Patienten, bei denen ein Restshunt vorlag, mehr als einen Defekt. Es traten in den ersten 6 Monaten folgende Komplikationen auf: Embolie bei Vorhofflimmern (n=1), Dislokation des Okkluders (mit operativer Entfernung) (n=1), Perforation des Vorhofs durch den Schirm (n=1), retroperitoneale Blutung (n=1), Synkopen bei älterer Patientin (n=1). Die Komplikationsrate betrug 7,7%. Im Langzeitverlauf gab es folgende Komplikationen: Mitralinsuffizienz (n=1), Dislokation des Okkluders (n=2), Hirnstamminsult bei intaktem Okkluder ohne Restshunt (n=1), Hörsturz (n=1), Thrombus (n=1). Die Komplikationsrate betrug 1,6% pro Jahr. Bei den Patienten mit PFO ereigneten sich in den ersten 6 Monaten an Komplikationen Rezidivinsulte (n=3), davon 1 mit Dislokation des Okkluders und Infektionen (n=1). Die Rate an Komplikationen betrug in dieser Zeit 4,3% pro Jahr. Die Rate an Rezidiven betrug 3,2%. Im Langzeitverlauf zeigten sich an Komplikationen Rezidivinsulte bei intaktem Okkluder ohne Restshunt (n=2) und Blutungen (n=1). Die Rezidivrate betrug im gesamten postinterventionellen Verlauf 1,5% pro Jahr.
Synthese von modifizierten Nukleotiden und modifizierten Oligodesoxynukleotiden zur DNA-Analytik
(2004)
1.) Entwicklung eines Verfahrens zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Sondenmolekülen und Targetmolekülen auf einem Sonden-Array Innerhalb des Projektes sollte ein Verfahren entwickelt werden, dass zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Sondenmolekülen und Targetmolekülen auf Sonden-Arrays genutzt werden kann. Der prinzipielle Aufbau dieses Testsystems wird in der vorliegenden Arbeit beschrieben. Einer der entscheidenden Schritte zur Entwicklung dieses Verfahrens, ist die Einführung einer selektiv spaltbaren Bindung innerhalb der DNA. Die von uns hierfür präferierte Bindung ist die 5´-O-P-S-3´ Bindung. Das erste zu realisierende Ziel bestand damit in der Synthese der entsprechend 5´-Thio-modifizierten Amidite. Die Synthese von 4,4´-Dimethoxytriphenylmethanthiol, als alternative Schwefel-Quelle und gleichzeitig temporäre 5´-Schutzgruppe stellt den Schlüsselschritt der erfolgreichen Synthese dar. Mit Hilfe dieser Strategie gelingt es, die entsprechend benötigten modifizierten Amidite in zufriedenstellender Ausbeute herzustellen. Durch die Anwendung eines modifizierten Synthesezyklus ist die Synthese eines entsprechend Schwefel-modifizierten Modelloligodesoynukleotids möglich. Mit Hilfe dieser Verbindung wurde die erwünschte Spaltung der 5´-O-P-S-3´ Bindung mit Silbernitrat in Lösung und an verschiedenen Oberflächen (Chip, Biacore-Chip und Magnetic Beads) untersucht. 2.) Punktmutationsdetektion durch festphasenvermittelte Single Nucleotide Primer Extension (SNuPE) und MALDI-MS Ziel dieses Projektes war die Entwicklung eines neuen, elektrophoresefreien Verfahrens zur Detektion von bekannten Punktmutationen mittels fester Phase und der MALDI-Massenspektrometrie. Hierfür wird zunächst ein synthetisches Oligodesoxynukleotid, welches später als Primer fungiert, über einen photolytisch spaltbaren Linker an eine feste Phase gebunden. Dessen Oligodesoxynukleotid-Sequenz wird dabei so ausgewählt, daß sie komplementär zur Zielsequenz einer mutierten DNA ist und direkt vor der zu detektierenden Punktmutation endet. Durch eine enzymatische Polymerasereaktion wird der Primer dann um eine Base, die entweder komplementär zur korrekten DNA oder zur Mutation ist, verlängert. Das Reaktionsprodukt kann dann direkt mittels MALDI-MS photolytisch von der festen Phase getrennt und analysiert werden. Die Masse des Reaktionsproduktes ist festgelegt durch den erfolgten Einbau einer von vier Nukleobasen und gibt daher unmittelbar Auskunft über das Vorhandensein einer Punktmutation. Zunächst sollte die prinzipielle Durchführbarkeit des Projekts erarbeitet werden. Wesentliche Vorteile dieser neuen Methode im Vergleich zu bestehenden Verfahren wären der außerordentlich geringe Zeitaufwand und die unmittelbare Detektion ohne Label. Das hier entwickelte Konstrukt gestaltete sich allerdings für die Anwendung als ein Standardanalyseverfahren zu komplex, da für die Detektion von Punktmutationen aussagekräftigere und einfachere Verfahren bereits zur Verfügung stehen, der hier beobachtete Spaltungs-mechanismus wirft jedoch einige Fragen auf. Für einen Einsatz als photolabiles Trägermaterial ist dieses Konstrukt jedoch ebenfalls zu kompliziert. 3.) Verknüpfungsreaktionen von Acetal-geschützten Oligodesoxynukleotiden mit Hydrazin-modifizierten Derivaten Die effektive Konjugation von modifizierten Oligodesoxynukleotiden und Hydrazin-Derivaten durch die Verwendung einer 5´-Acetalfunktion konnte hier durch die Verwendung eines aromatischen Phosphitylierungsreagenz gezeigt werden. Das hergestellte 5´-Acetal-modifizierte Oligodesoxynukleotid fungiert hier als ein maskiertes 5´-Aldehyd. Der Einsatz des maskierten Acetals weist gegenüber dem reaktiven Aldehyd-Derivat mehrere Vorteile auf: es ist lagerstabil, gut handhabbar und stabil gegenüber den Bedingungen der Oligodesoxynukleotid-Synthese. Ein aromatisches Acetal-geschützte Oligodesoxynukleotid kann in einer Eintopfreaktion mit einem entsprechenden Hydrazin-Derivat umgesetzt werden. Das verwendete Hydrazin-Derivat muß jedoch als Hydrochlorid oder als Trifluoracetat eingesetzt werden. Die Reaktion erfolgt in wässriger methanolischer Lösung durch den Zusatz von Natriumacetat, dieses katalysiert die Reaktion. Durch den Einsatz von Methanol als Lösungsmittel kann der Reaktionsansatz direkt mit Hilfe der HPL-Chromatographie gereinigt werden. Die Umsetzung des Acetal-modifizierten Oligodesoxynukleotids wurde mit verschiedenen Hydrazinen durchgeführt. Die mit den Hydrazinen erreichten Ausbeuten übersteigen bei weitem (Ausnahme Biotin) die der entsprechenden Aktivester. Vorallem das Arbeiten in wässriger Lösung erleichtert die Synthese und die Aufreinigung. Hiermit steht eine 5´-Modifikation zur Verfügung, die eine Konjugation mit Hydrazin-Derivaten in sehr guten Ausbeuten ermöglicht.
In der medizinischen Praxis in Deutschland ist Klassifikation als essentieller Bestandteil der Dokumentation in vielen Bereichen durch gesetzliche Regelungen vorgeschrieben. Über diesen gesetzlich determinierten Rahmen hinaus können durch Klassifikation vergleichbar gemachte Informationen als Basis neuer wissenschaftlicher Erkenntnisse herangezogen werden und weiterhin helfen, bestehende Lehrmeinungen zu evaluieren. Ein Blick auf die im medizinischen Umfeld vorhandene organisatorische Realisierung der Klassifikation zeigt, daß diese in der Regel von medizinisch qualifiziertem Fachpersonal neben der eigentlichen Tätigkeit durchgeführt wird. Eine Klassifikation vorhandener Dokumentationen im Sinne einer Erschließung zusätzlicher wertvoller Informationsquellen über den gesetzlichen Mindestumfang hinaus scheitert somit häufig an der organisatorisch bedingten Überlastung der eingesetzten Mitarbeiter. Eine Unterstützung medizinischer Klassifikation in der Praxis durch den geeigneten Einsatz von Informationstechnologie (IT) erscheint somit sinnvoll und wünschenswert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wird ein entsprechender Ansatz in Form eines entwickelten Prototypen (XDIAG) vorgestellt und evaluiert. Der entwickelte Prototyp realisiert ein IT-gestütztes leitbegrifforientiertes Verfahren zur automatischen Kodierung von Diagnosen auf Basis vorliegender medizinischer Freitexte. Die hierbei realisierten Ansätze und Verfahren folgen den Vorschlägen von Herrn D. Schalck und sind somit das Resultat langjähriger intensiver und praxisnaher Beschäftigung mit Fragen medizinischer Freitextverarbeitung und Klassifikation. Die besondere Vorgehensweise verleiht dem vorgestellten Prototypen den Charakter einer Heuristik. In Abgrenzung zu zahlreichen bestehenden Verfahren erfolgt eine konsequente Reduktion der Komplexität der eingesetzten Algorithmen und Stammdaten durch einen Verzicht auf eine tiefgreifende linguistische Analyse der zur Kodierung vorgelegten Texte. Durch diesen Verzicht kann auf die Verwendung einer Grammatik und somit auf die Verwendung komplexer Stammdaten verzichtet werden. Als Stammdatenbasis werden vielmehr Datenbestände verwendet, die entweder besonders leicht zu pflegen sind oder aber ohnehin permanent im Rahmen von Langzeitprojekten gepflegt werden. An dieser Stelle spielt insbesondere der ICD10-Diagnosen-Thesaurus mit seiner umfassenden und besonders praxisorientierten Begriffsmenge eine wichtige Rolle. In Erweiterung bestehender Verfahren bietet der vorgestellte Prototyp darüber hinaus die Möglichkeit, mehrere medizinische Diagnosen im Rahmen eines Satzes zu kodieren. Weiterhin können dem Benutzer interaktiv qualifizierte Fehlerhinweise mit dem Ziel einer verbesserten Kodierung bereitgestellt werden. Als Ergebnis der Evaluation des realisierten Prototypen läßt sich festhalten, daß die hierbei eingesetzten Verfahren helfen können, eine synergistische Brücke zwischen praktischer Medizin, medizinischer Verwaltung und medizinischer Forschung zu schlagen, wenn sie an der richtigen Stelle und mit der richtigen Motivation eingesetzt werden.
Das Lupus-Antikoagulans ist mit einem deutlich erhöhten Risiko für arterielle und venöse Thrombosen assoziiert, so dass ihr Nachweis im Labor von großer klinischer Relevanz ist. Bei den meisten bisher verfügbaren Testsystemen sind Sensitivität und Präzision häufig unbefriedigend, und es kann zu falsch positiven Testergebnissen durch Heparin oder orale Antikoagulantien kommen. Ziel dieser Arbeit war es daher, einen präzisen, sensitiven und spezifischen Test zum optimierten Nachweis des Lupus-Antikoagulans zu entwickeln. Hierzu wurde ein auf der aPTT basierendes vollautomatisches Testprinzip entwickelt, bei dem Mischungen eines lupussensitiven und eines lupusinsensitiven aPTT-Reagenzes mit Patientenplasma oder Normalplasma hergestellt wurden. Die Ergebnisangabe erfolgte in Form einer Ratio, bei der jeweils die beiden Ratios des Patienten– und Normalplasmas nochmals in Relation gesetzt werden. Es wurden 99 Blutspender, 10 Patienten unter einer intravenösen, therapeutischen Behandlung mit unfraktioniertem Heparin, 19 oral antikoagulierte Patienten, sowie 5 Patienten mit Hämophilie A und 15 Patienten mit Antiphospholipid-Syndrom mit dem neuen Testsystem untersucht. Für die Präzision innerhalb einer Messreihe und von Tag zu Tag ergaben sich Varianzkoeffizienten von 1,5 – 1,9%. Der Mittelwert + 2SD der Ratio lag für die 99 Blutspender bei 1,07 und diente als Cutoff. Ein negatives Testergebnis zeigten alle mit Heparin oder oralen Antikoagulantien behandelten Patienten (Spezifität: 100%), 1/5 Patienten mit Hämophilie A reagierte positiv (80%), dieser hatte jedoch eine Faktor VIII Hemmkörper entwickelt. Von den 15 Patienten mit einem definitiven Antiphospholipid-Syndrom wiesen 13 eine erhöhte Ratio auf (Sensitivität: 87%). Somit ermöglicht dieses neu entwickelte Testsystem vollautomatisch einen präzisen, sensitiven und spezifischen Nachweis des Lupus-Antikoagulans.
Für ein Assessment Center zur Auswahl von Versicherungs-Außendienstmitarbeitern wurde geprüft, ob Beobachterexperten und Beobachternovizen zu ähnlichen oder zu unterschiedlichen Schlussfolgerungen über die Teilnehmer kommen. Eine ähnliche Schlussfolgerung sollte dabei Indikator dafür sein, dass ein Beobachtertraining (hier: Verbesserung der Beobachterexpertise durch wenigstens einmalige Teilnahme an einem AC als Beobachter) ohne Auswirkungen bleibt. Verglichen wurden die Ergebnisse dieser Beobachtergruppen mit dem AC-Leiter als "Oberexperten" und der AC-Assistenz. Im Rahmen der vorliegenden Untersuchung wurden die Daten von 37 AC mit insgesamt 267 Kandidaten und 171 Beobachtern in zwei unterschiedlichen Datensätzen überprüft. Es konnte nachgewiesen werden, dass sowohl Experten wie auch Novizen eine hohe Übereinstimmung mit der Gesamtrangfolge über die Teilnehmer hatten; hinsichtlich der übungsbezogenen und der merkmalsbezogenen mittleren Korrelationen sowie der mittleren Korrelationen innerhalb der einzelnen Übungen wurden kaum signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen Beobachtergruppen festgestellt. Aus diesem Grunde kann geschlossen werden, dass die Teilnahme an einem AC als Beobachter nicht notwendigerweise die Beobachterexpertise verbessert. Angesichts der hohen Übereinstimmung der Beobachtergruppen mit der Gesamtrangfolge über die Teilnehmer kann geschlossen werden, dass für den vorliegenden einfachen AC-Typ verbunden mit der spezifischen Art der Ergebnisgewinnung der Verzicht auf ein Beobachtertraining nicht notwendigerweise eine Verschlechterung der AC-Ergebnisse bedeutet.
Bei den Non-Hodgkin Lymphomen (NHL) handelt es sich um eine heterogene Gruppe von Erkrankungen, die mit Strahlen- und Chemotherapie behandelt werden können. Im Frühstadium lassen sich mit der Bestrahlung Heilung erzielen, im forgeschrittenen Stadium und bei Rückfällen sind aber, zumindest bei den niedrigmalignen Lymphomen, keine Heilung mehr durch Chemotherapie und Strahlentherapie möglich. Ein neuartiger Therapieansatz erscheint nun möglich mit der Anwendung des ersten monoklonalen Antikörpers in der Hämatologie. Rituximab ist ein chimärer monoklonaler Antkörper mit humanen konstanten IgG1- und Kappa-Regionen und variablen Regionen eines Maus-Antikörpers gegen das CD20-Antigen, das von fast allen B-Zellen und auch den meisten Lymphomzellen exprimiert wird Rituximab richtet sich daher auch gegen normale, nicht maligne B-Zellen, schädigt aber nicht die Stammzellen, die wiederum für die Neubildung von B-Zellen zuständig sind. Die Wirkung des Antikörpers beruht dabei auf verschiedenen Mechanismen der Indukation von Apoptose sowie auf einer direkten Zytotoxizität. Rituximab besitzt bereits in der Anwendung als Monotherapie eine erhebliche antitumorale Aktivität. Die bisherigen Studien belegen, daß Rituximab als Monotherapie gegen B-Zell-Lymphome wirksam ist, diese aber auch nicht dauerhaft heilen kann. Daher stellt sich die Frage nach dem kombinierten Einsatz von Rituximab mit konventionellen Chemotherapien. Die grundsätzlich verschiedenartigen Wirkungs-, Toxizitäts- und Resistenzmechanismen sprechen für eine derartige Therapiekombination. In in vitro durchgeführten Versuchsreihen konnten syneristische Effekte der Kombination aus Chemotherapie und Rituximab beobachtet werden. Insbesondere scheint Rituximab einen chemotherapie- sensiblisierenden Effekt zu haben. in einer randomisierten Studie von Hiddemann et al. konnte die Überlegenheit von einer Polychemotherapie CHOP plus Rituximab gegenüber CHOP allein demonstriert werden. Die Remissionsrate war für die Kombinationstherapie CHOP plus Rituximab signifikant höher im Vergleich für CHOP alleine. Der Vorteil für die Kombination aus CHOP plus Rituximab war bei den Mantelzell-Lymphomen noch ausgeprägter. In unserer Arbeitsgruppe untersuchten wir in einer im Jahre 2000 initiierten Phase-II-Studie die Kombination von Bendamustin plus Rituximab bei Patienten mit fortgeschrittenen progredienten rezidivierten oder refraktären niedrigmalignen oder Mantelzell-Lymphomen. Ein anderes Therapieschema, welches bei diesen Lymphomentitäten in einer Studie geprüft wurde, war die Kombination aus Cladribin und Mitoxantron plus Rituximab. Bei hochmalignen wurde die Kombination aus Rituximab plus Gemcitabin, Oxaliplatin und Bendamustin untersucht. Ziel und Gegenstand dieser retrospektiven Untersuchung war, die eigenen Ergebnisse im Kontext mit anderen Studienergebnissen zu bewerten und diskutieren. 139 Patienten mit therapierefraktärem oder rezidiviertem Non-Hodgkin-Lymphom sind im Zeitraum von 1999 bis 2003 mit einer Rituximab-haltigen Chemotherapie behandelt worden. Das ORR lag für die einzelnen Lymphomentitäten wie folgt: - Follikulärs Lymphom: 89% - Mantelzell-Lymphom: 37% - Immunozytom : 84% - Diffus-großzelliges B-NHL: 64% Im Median dauerte die Remission für die jeweilige Erkrankung: - Follikulärs-Lymphom: 12,8 Monate - Mantelzell-Lymphom: 8,5 Monate - Immunozytom: 11,6 Monate - Diffus-großzelliges B-NHL : 10,2 Monate Die Ansprechraten lagen dabei für das prognostische ungünstige Mantelzell-Lymphom bei 37%, für die indolenten Lymphomentitäten Immunozytom und follikulären Lymphom bei 84% respektive 89%. Bei den hochmalignen Diffus-großzelligem B-NH Lymphomen konnte eine Remissionsrate von 64% erzielt werden. Die kürzeste Remissionsdauer war beim Mantelzell-Lymphom, die längste war beim follikulären Lymphom. Diese Therapieergabnisse erscheinen verbessert im Vergleich zu den etablierten Chemotherapieresultaten und vergleichbar mit internationalen Literatur publizierten Daten. Bei der Durchführung der Therapien mit Rituximab plus Chemotherpie konnte keine klinische relevante erhöhte Toxizität beobachtet werden. Die Patienten haben die Behandlung mit Antikörper Rituximab gut toleriert. nur 1,4% der Patienten (2 von 141) mussten die Behandlung mit Rituximab abbrechen. Ob die Verbesserung der Ansprechraten, die wir in unserer Studie in der retrospektiven Auswertung beobachtet haben, auch zu einer Verlängerung der Überlebenswahrscheinlichkeit und zu einer Verbesserung der Prognose dieser Krankheitsentitäten führen wird, ist noch nicht abschließend geklärt und muss erst noch in größeren prospektiven Studien geklärt werden.
In der vorliegenden Arbeit wird ein Curriculum zur Beugung vorgestellt, welches sich in ein Kerncurriculum und Erweiterungsmodule gliedert. Das Kerncurriculum geht von einer systematischen Erarbeitung von Erscheinungsreihen aus, zunächst in Form von Freihandversuchen. Dabei werden periodische Strukturen vor das Auge gehalten und durchblickt. Erst in einem zweiten Schritt treten entsprechende komplexere Versuchsaufbauten hinzu. Der Zusammenhang zwischen den durchblickten oder durchleuchteten periodischen Strukturen und den Konfigurationen der Beugungsbilder wird im Konzept optischer Wege beschrieben. Optische Wege werden dazu operational definiert und als geometrische Ordnungselemente eingeführt, die dem Zusammenhang zwischen den jeweils wirksamen räumlichen Bedingungen und den auftretenden Erscheinungen immanent sind. Den methodischen Rahmen des Kerncurriculum bildet damit eine phänomenologische Vorgehensweise - insbesondere, weil die optischen Wege nicht als ein Vorstellungskomplex gefasst werden, den man zur ursächlichen Erklärung eines Phänomens heranziehen kann. In einem Erweiterungsmodul des Curriculums wird im Einzelnen ausgeführt, wie es durch dieses methodische Vorgehen schon bei der Thematisierung der Beugung möglich ist, die holistischen Eigenschaften der Quantentheorie anzulegen und vorzubereiten. Dadurch kann der Übergang von der Beugung zur Quantentheorie in einem einheitlichen methodischen Rahmen erfolgen und eine vertikale Vernetzung der Unterrichtsinhalte unterstützen. Entsprechend dem von ERB und SCHÖN ausgearbeiteten Lichtwegkonzept bekommt auch beim Konzept optischer Wege das FERMAT-Prinzip eine zentrale Stellung. Es wird in der vorliegenden Arbeit räumlich formuliert. Im zentralen Thema des Kerncurriculums, der Beugung am Gitter, reichen in Erweiterung des FERMAT-Prinzips dann zwei Bedingungen aus, die man an die optischen Wege stellen muss, um diese Beugungserscheinungen umfassend zu beschreiben. Auch komplexe Zusammenhänge, wie beispielsweise die Invarianz des Beugungsbildes unter Translationen des Gitters, sind so anschaulich zu erklären. Das Beugungsbild eines Gitters tritt in der Brennebene einer Linse auf. Da es invariant unter Translationen des Gitters ist, darf auch ein Abstand zwischen Gitter und Linse gewählt werden, welcher größer als deren Brennweite ist. Je nach Stellung eines Schirms hinter der Linse erhält man so entweder das Beugungsbild oder das Abbild des Gitters. Eine Darstellung beider Situationen im Konzept optischer Wege lässt den Zusammenhang zwischen Beugungs- und Abbild sehr deutlich hervortreten und macht Experimente zur optischen Filterung unmittelbar verständlich. Die in diesem Rahmen eingeführte kontextuale Abbildung rundet das Kerncurriculum ab und arbeitet die Gesamtheit der wirksamen Bedingungen besonders heraus. Gleichzeitig gelingt es, Eigenschaften der FOURIER-Transformation auf einer elementaren Ebene zu behandeln. In einem der Erweiterungsmodule werden die Beugungsbilder bei Rotationen eines Gitters untersucht. Dabei treten Beugungsbilder in Form von Kegelschnitten auf. Es wird gezeigt, wie die schon im Kerncurriculum in Erweiterung des FERMAT-Prinzips formulierten beiden Bedingungen an die optischen Wege sich weiterhin als tragfähiger Beschreibungsansatz erweisen. Dabei können Elemente der Festkörperphysik anschaulich eingeführt werden – hier sind es die LAUE-Kegel. In einem anderen Erweiterungsmodul schließen sich eine anschauliche Herleitung des reziproken Gitters und der EWALD-Kugel an. Das Erweiterungsmodul, welches den Übergang zur Quantentheorie thematisiert, geht von der Beugung am Doppelspalt aus und sieht dort die Einführung des Zeigerformalismus vor. Der Kontrast zur phänomenologischen Vorgehensweise des Kerncurriculums ermöglicht eine saubere Unterscheidung zwischen den optischen Wegen als immanenten Ordnungselementen und den Zeigern als abstrakten Symbolen, die Wellenfunktionen repräsentieren. Methodendiskussionen werden so unterstützt. Im Zentrum des Moduls steht die Besprechung von Welcher- Weg-Experimenten. Die kontextuale Abbildung im Konzept optischer Wege führt dabei, wie oben bereits erwähnt, ohne methodischen Bruch auf das Superpositionsprinzip der Quantentheorie. Die schulische Erprobung des Kerncurriculums und einiger Erweiterungsmodule ergab schließlich, dass die operationale Definition der optischen Wege und die Formulierung von Kriterien an diese optischen Wege zur Beschreibung der Beugung es ermöglicht, durch tragfähige Begriffe bei den Schülern ein Bewusstsein für Zusammenhänge zwischen Teilinhalten des Unterrichtes zu wecken und die Beugung in eine Fülle optischer Erscheinungen zu integrieren. Der Übergang vom Experiment zu abstrakten Lerninhalten wird dann durch den Unterricht deutlich und generiert ein hohes Methodenbewusstsein.
Die chemische Analyse von 17 abundanten Nordseeschwammarten zeigte, dass die Metabolitenzusammensetzung und -konzentration standortbedingt nur geringfügig schwanken. Den Großteil der Schwammmetaboliten bilden mittelpolare bis polare Substanzen ohne UV-Absorption. Allgemein scheinen in Nordseeschwämmen aromatische und olefinische Verbindungen seltener vorzukommen als in tropischen Arten. Die Chemie der einzelnen Nordseeschwämme ist oft ähnlich und wird von kleinen, stickstoffhaltigen Molekülen dominiert. Ubiquitär verbreitete, vermutlich phylogenetisch alte Substanzen wie Inosin, Allantoin, Homarin und Trigonellin wurden in zahlreichen untersuchten Arten nachgewiesen. Trigonellin und Homarin üben, wie für andere marine Organismen bereits dokumentiert, auch in den Nordseeschwämmen Schutzfunktion gegen Konkurrenten und Fouling-Organismen aus. Die identifizierten Verbindungen weisen darauf hin, dass den mit dem Aminosäure- und Purinstoffwechsel verbundenen Biosynthesewegen eine große Bedeutung in der Naturstoffsynthese der untersuchten Schwammarten zukommt. Diese Vermutung wird dadurch untermauert, dass auch die Bildung von Imidazolen (aus Phakellia ventilabrum isoliert) aus Histidin eng mit dem Purinstoffwechsel verbunden ist. Durch den Abbau von Histidin können wiederum Substanzen entstehen, die als Methyldonatoren in Frage kommen (methylierte Verbindungen, vgl. Pachymatisma johnstonia). Biologische Aktivität wurde anhand von Biotests zur antilarvalen, cytotoxischen, antibakteriellen, enzyminhibitorischen und bewuchshemmenden Wirkung in Extrakten der untersuchten Nordseeschwämme nachgewiesen. Dabei zeigten alle Schwammarten Effekte in mehr als einem Biotest. Diese Untersuchungen bestätigen das Vorkommen biologisch aktiver Substanzen in Schwämmen kaltgemäßigter Habitate und widerlegen damit die Latitudinalhypothese. Unabhängig von der geographischen Breite sind Schwämme weltweit einem selektiven Druck ausgesetzt, der die Entwicklung biologisch aktiver Metaboliten begünstigt. Die Art der Selektionsfaktoren scheint jedoch habitatbedingt unterschiedlich zu sein. Während in wärmeren Gewässern vor allem Prädatoren (Fische) das Überleben der Schwämme beeinflussen, sind in kälteren Gebieten Aufwuchsorganismen und Bakterien von entscheidender Bedeutung. Diese Annahme wird durch die Beobachtung der assoziierten Organismen ebenso unterstützt, wie durch die Tatsache, dass in allen untersuchten Nordseeschwammarten (Esperiopsis fucorum, Phakellia ventilabrum, Leucosolenia complicata, Cliona celata, Pachymatisma johnstonia) Bakterien nachgewiesen werden konnten. Neben den ökologischen Beobachtungen bekräftigt auch die starke antibakterielle Wirkung der Schwammmetaboliten diese Hypothese. Während Toxizität seltener beobachtet wurde, zeigten viele Schwämme auch enzyminhibitorische Wirkung. Zusammenhänge zwischen biologischer Aktivität und morphologischen bzw. taxonomischen Kriterien, Lebensweise, Habitatcharakteristika oder assoziierten Organismen waren nicht durch Clusteranalysen aufzudecken. Es konnten jedoch Unterschiede im Metabolitengehalt und der Art der assoziierten Organismen zwischen langlebigen, großen Kieselschwammarten und kleineren, saisonal wachsenden Kalkschwämmen hervorgehoben werden. Leucosolenia compl icata (Calcarea) ist sowohl qualitativ als auch quantitativ relativ metabolitenarm, biologisch sehr aktiv und mit einer großen Zahl an Bakterien assoziiert. Die Mikroorganismen scheinen für diese Art von größerer Bedeutung zu sein als bei den untersuchten Demospongiae. Einige Kieselschwämme (z.B. Cliona celata, Phakellia ventilabrum) sind besonders metabolitenreich, enthalten weniger Bakterien und verfügen ebenfalls über biologisch aktive Substanzen. Um diese Beobachtungen in einem ökologischen Zusammenhang zu sehen, sind eingehendere Studien, wie sie mit Pachymatisma johnstonia durchgeführt wurden, notwendig. Die Isolierung der Hauptmetaboliten von Pachymatisma johnstonia führte zur Identifizierung der methylierten Substanzen Betain, N,N,N-Trimethyl-ß-alanin, L-6-Bromohypaphorin und dem Pyridinalkaloid Trigonellin. Anhand verschiedener biologischer Tests konnte ein Einblick in die Wirkungsweise und Funktion der aktiven Metaboliten gewonnen werden. Die Aminosäure L-6-Bromohypaphorin und eine noch nicht identifizierte Substanz zeigten starke Enzyminhibition gegenüber einer Protein-Tyrosin-Kinase. L-6-Bromohypaphorin wurde im Pinacoderm unbewachsener Individuen in einer höheren Konzentration nachgewiesen als in Schwämmen mit Bryozoenbewuchs, und spielt demnach vermutlich bei der Abwehr von Fouling-Organismen eine Rolle. Bakterien wurden als Produzenten der aktiven Substanzen ausgeschlossen. Eine Abgabe der Metaboliten nach außen ist eher unwahrscheinlich. Die Extrakte von P. johnstonia zeigten starke antibakterielle Wirkung mit einer Breitbandaktivität, vor allem gegen marine Bakterien. Welche Substanzen für diese Effekte verantwortlich sind, ist nicht bekannt. Eine Hälterung von P. johnstonia war möglich. Ebenso wie Cliona celata passte sich der Schwamm an veränderte abiotische und biotische Faktoren an. Verletztes Gewebe wurde regeneriert und Hauptmetaboliten weiter produziert. Die Synthesetätigkeit von P. johnstonia schwankte, die biologische Aktivität blieb über neun Monate hinweg erhalten. Durch eine Optimierung der Hälterungsbedingungen könnte die Naturstoffproduktion vermutlich konstant gehalten werden. Mit P. johnstonia wurde somit ein gutes Beispiel für die Interaktion zwischen Naturstoffchemie, Ökologie und pharmakologischem Potential bzw. biotechnologischer Nutzbarkeit geliefert. Bedingt durch das Ziel der Arbeit, einen Überblick über die Chemie und biologische Aktivität der Nordseeschwämme zu gewinnen, wurde weniger Augenmerk auf die Isolierung neuer Strukturen gelegt. Im Zuge von intensiveren Studien wäre eine Optimierung der chemischen Methodik anzustreben. Die Aufklärung der in geringerer Konzentration vorkommenden Substanzen könnte hilfreich sein, um den ersten Eindruck der Metabolitenzusammensetzung zu überprüfen. Außerdem wird aufgrund der Biotestergebnisse die Existenz zahlreicher biologisch aktiver Substanzen, vor allem antibiotischer Wirkstoffe, vermutet, deren Isolierung eine Herausforderung darstellt. Besonders interessant ist in diesem Zusammenhang auch die Tatsache, dass bisher sämtliche medizinisch genutzten Antibiotika aus Mikroorganismen stammen, Schwämme aber weltweit über ein hohes antibiotisches Potential verfügen. Dadurch stellt sich erneut die Frage, ob Schwämme tatsächlich selbst in der Lage sind, wirksame Substanzen zu produzieren. Diese Ungewissheit zusammen mit der Tatsache, dass alle aus den Nordseeschwämmen isolierten und identifizierten Verbindungen aus Stoffwechselwegen stammen, die bisher als für Mikroorganismen typisch beschrieben wurden, bietet interessante Ansatzmöglichkeiten für weitere Untersuchungen. Auch wenn Schwämme zu den am besten untersuchten Organismen in der marinen Naturstoffchemie zählen, ist das Wissen im Bereich der chemischen Ökologie noch begrenzt. Um mehr über die Beziehung zwischen Schwämmen und ihrer belebten Umwelt zu erfahren und die Rolle der Naturstoffe dabei aufzudecken, müssen geeignete Untersuchungsmethoden bzw. Biotests etabliert werden. Abbildung 4.1 soll die Bedeutung der Schwämme für ihren Lebensraum und den Menschen hervorheben und die komplexen Zusammenhänge, welche durch die Wirkung der Naturstoffe vermittelt werden, verdeutlichen. Häufig werden Schwämme als primitive Organismen beschrieben, da sie sich durch das Fehlen eines Nervensystems und anderer Organe von höheren Tieren unterscheiden. Tatsächlich sind diese Lebewesen aber hochentwickelte Spezialisten. Optimal an eine sessile Lebensweise angepasst, bewohnen sie seit Millionen von Jahren erfolgreich vor allem marine Habitate in großer Artendiversität und Abundanz. Aufgrund der Produktion von aktiven Metaboliten zur Abwehr schädlicher Organismen stellen die Schwämme aus menschlicher Perspektive eine wertvolle Ressource dar. Nicht nur aus diesem Grund sollten wir Ihnen mit Respekt begegnen und versuchen, die (Naturstoff-)forschung nachhaltig zu betreiben, die Beeinträchtigung der Tiere auf ein vertretbares Maß zu reduzieren und ihren Lebensraum zu schützen.
Ultrarelativistische Schwerionenstöße werden seit etwa 15 Jahren untersucht, um Kernmaterie unter extremen Bedingungen zu erforschen; in Kollisionen schwerer Atomkerne kann bei hohen Einschußenergien Kernmaterie stark komprimiert und aufgeheizt werden. Die Bedeutung dieser Experimente wird durch Berechnungen der Quanten-Chromo-Dynamik auf raumzeitlichen Gittern hervorgehoben, die bei ausreichend hoher Energiedichte eine Phase voraussagen, in der die Quarks nicht mehr in Hadronen gebunden sind, sondern zusammen mit den Gluonen ein partonisches System ausbilden. Ist das System hinreichend groß und equilibriert, wird es als Quark-Gluon-Plasma bezeichnet. Die als Signatur für das Überschreiten der Phasengrenze vorgeschlagene erhöhte Produktion Seltsamkeit tragender Teilchen wurde in der Gegenüberstellung von elementaren Proton+Proton-Interaktionen und Kern+Kern-Stößen experimentell über einen weiten Energiebereich bestätigt. Eine solche Überhöhung kann aber auch durch rein hadronische Phänomene hervorgerufen werden. So tritt beispielsweise in statistischen Modellen bereits in einem Hadrongas eine Seltsamkeitserhöhung aufgrund des Übergangs von einem kanonischen zu einem großkanonischen Ensemble mit steigender Systemgröße in Kern+Kern-Stößen auf. Das motivierte die Messung der Systemgrößenabhängigkeit der Seltsamkeitsproduktion bei einer Einschußenergie, bei der in den Stößen der größten Kerne die partonische Phase erreicht werden sollte, während Proton-Proton-Interaktionen überlicherweise als hadronische Systeme betrachtet werden. In Kollisionen von Kohlenstoff- und Siliziumkernen bei 158 GeV pro Nukleon, deren Untersuchung Gegenstand dieser Arbeit ist, kann möglicherweise die Umgebung der Phasengrenze abgetastet werden. Besondere Aufmerksamkeit gilt der Frage nach dem Mechanismus der Seltsamkeitsproduktion in diesen Reaktionen. Das Experiment wurde am SPS-Beschleuniger am CERN in Genf durchgeführt, erstmals wurden dort leichte Projektilkerne durch den Aufbruch des primären Bleistrahls an einem Produktionstarget erzeugt. Das Herzstück des NA49-Spektrometers, mit dem die Daten aufgezeichnet wurden, sind die vier großvolumigen Spurendriftkammern, die die große Akzeptanz ermöglichen. Die Lambda- und Antilambda-Hyperonen aus C+C und Si+Si Kollisionen werden anhand ihrer Zerfallstopologie rekonstruiert und ihre Impulsverteilungen über einen weiten Bereich gemessen; mit zusätzlichen Annahmen werden schließlich die totalen Multiplizitäten extrapoliert. Die Produktion der Hyperonen pro Pion ist im Vergleich zu p+p-Daten bereits in C+C-Reaktionen deutlich erhöht, in Si+Si--Kollisionen ist annähernd der Wert aus Pb+Pb-Stößen erreicht. Mehrere Ursachen für diese Beobachtung werden diskutiert und mögliche Interpretationen vorgeschlagen. Der Grad an chemischer Equilibration und die Lage des Ausfrierpunktes im Phasendiagramm und im Vergleich zu anderen Stoßsystemen wird besprochen. Die Rapiditätsspektren der Lambda-Hyperonen entsprechen zunehmendem Stopping mit steigender Anzahl von Stößen pro Nukleon. Dadurch wird die Energie pro Nukleon im Feuerball erhöht, was zunehmende kinetische Energie der Teilchen und eine ansteigende Teilchenproduktion erzeugt. Die Verbreiterung der Transversalimpulsspektren mit der Systemgröße fügt sich in der Tat in das Bild anwachsenden radialen Flußes ein.
Paläobotanische Untersuchungen an Euramerischen Kohlenbecken haben an der Westfal/Stefan-Grenze in früheren Arbeiten einen deutlichen, weitgehend klimatisch gesteuerten Florenwechsel erkennen lassen. Desweiteren wurden in Kohlen aus dem Saar/Nahe-Becken beginnend mit dem obersten Westfal D erstmals Diageneseprodukte von Isoarborinol bzw. Fernen/Fernenol nachgewiesen, für die Koniferen, Cordaiten oder Farnsamer als mögliche Bioproduzenten vorgeschlagen wurden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten die Arboran-/Fernanderivate MAPH, MATH, DAPH 1 und DAPH 2 in den Gesamtextrakten von Kohlen und Sedimenten aus dem Stefan des Saar/Nahe-Beckens durchgängig identifiziert werden, während die Verbindungen im Westfal lediglich in Proben aus dem obersten Westfal D auftraten. Folglich sind die Arboran-/Fernanderivate tatsächlich in besonderem Maße dazu geeignet, den Florenwechsel an der Westfal/Stefan-Grenze auf molekularer Basis zu beschreiben. Um einzugrenzen, zu welcher Pflanzengruppe die Bioproduzenten der Ausgangsverbindungen der Arboran-/Fernanderivate gehören, wurden isolierte Makrofossilien verschiedener Pflanzengruppen aus verschiedenen Euramerischen Kohlenbecken organisch-geochemisch analysiert. Dabei konnten MATH, MAPH, DAPH 1 und DAPH 2 in nahezu allen Gesamtextrakten fossiler Cordaiten-Reste identifiziert werden. In den Extrakten von Sediment-Vergleichsproben, die in unmittelbarer Nähe der Cordaiten-Reste entnommen wurden, konnten die Verbindungen dagegen nicht bzw. nur in vergleichsweise geringen Konzentrationen identifiziert werden. Ebenso waren die Arboran-/Fernanderivate in den Gesamtextrakten fossiler Koniferen-Reste sowie in den Extrakten verschiedener Farnsamerarten (Alethopteris, Dicroidium, Lescuropteris, Macroneuropteris, Neuropteris) nicht enthalten. Lediglich in der extrahierbaren organischen Substanz einiger fossiler Odontopteris-Reste aus dem Blanzy-Montceau-Becken (Frankreich) konnten MAPH und MATH (sowie teilweise DAPH 1 und DAPH 2) identifiziert werden. Allerdings ist das Auftreten der Verbindungen in diesen Odontopteris-Extrakten wahrscheinlich auf eine Überprägung des Pflanzenmaterials durch das umgebende Sediment zurückzuführen, da die Verbindungen in den Sediment-Vergleichsproben in höheren bzw. ähnlichen Konzentrationen enthalten sind. Insgesamt sind daher in den oberkarbonischen Kohlenbecken die Cordaiten als einer, möglicherweise sogar als „die“ Bioproduzenten der Ausgangsverbindungen der Arboran-/Fernanderivate MATH, MAPH, DAPH 1 und DAPH 2 anzusehen. Die deutlich negativere Kohlenstoffisotopie (-31,68 ‰) einer Sedimentprobe aus der Bohrung Wemmetsweiler-Nord, die gleichzeitig die höchsten Arboran-/Fernanderivat-Konzentrationen enthält, weist auf eine verstärkte mikrobielle Überarbeitung des organischen Materials hin. Fluoreszenz- und Auflichtmikroskopie-Untersuchungen zeigen zudem einen erheblichen, ebenfalls auf bakterielle Aktivität hindeutenden Bituminitanteil, während Relikte von höheren Landpflanzen nur geringfügig vertreten sind. Dies legt den Schluß nahe, daß die Arboran-/Fernanderivate in dieser Probe nicht von Cordaiten, sondern alternativ von Bakterien (oder Algen) abstammen. In diesem Fall ist Isoarborinol als biologischer Vorläufer anzunehmen und es tritt eine deutliche Verschiebung der Kohlenstoffisotopie-Werte zu negativeren Werten auf. Bei den Cordaiten ist eine derartige Isotopenverschiebung dagegen nicht zu beobachten, so daß für MATH, MAPH, DAPH 1 und DAPH 2 Fernen bzw. Fernenol als biologische Vorläufer anzunehmen sind.
Analytik von Kontaminationen auf Siliciumoberflächen : Möglichkeiten und Grenzen des VPD-Verfahrens
(2004)
In der Halbleiterindustrie führen in der Massenproduktion von Mikroelektronik-Bauelementen bereits geringfügige Mengen an metallischen Verunreinigungen zu einer erheblichen Verminderung der Ausbeuten und setzen die Zuverlässigkeit der Bauelemente drastisch herab. Deshalb müssen nicht nur die als Ausgangsmaterial verwendeten Siliciumscheiben bezüglich des Kontaminationsgrades durch Fremdatome höchsten Ansprüchen genügen, sondern auch die einzelnen Fertigungsschritte für die Produktion von elektronischen Bauelementen. Für die Detektion der Oberflächenverunreinigungen kommt in der Halbleiterindustrie die Totalreflexions-Röntgenfluoreszenz-Spektrometrie (TXRF) mit einer Empfindlichkeit von 1010 Atomen/cm2 zum Einsatz. Mittlerweile liegen die Anforderungen deutlich unterhalb dieser Nachweisgrenze. Durch Anwendung des Aufkonzentrierungsverfahrens VPD (Vapour-Phase-Decomposition) in Kombination mit etablierten Analysemethoden wie TXRF oder GF-AAS (Graphitrohr-Atom- Absorptions-Spektrometrie) können die in der Halbleiterindustrie notwendigen Nachweisgrenzen zur Detektion der Metalloberflächenbelegungen erreicht werden. VPD ist ein Verfahren, das thermische, chemische oder native Oxide auf Siliciumscheiben durch HFDampf ätzt. Metallische Verunreinigungen, die sich auf oder in der Oxidschicht befinden, können anschließend durch Abscannen der hydrophoben Oberfläche mit einem Tropfen eingesammelt werden. Zwei wichtige Begriffe, die unmittelbar im Zusammenhang mit dem VPD-Verfahren stehen, sind die Einsammelrate (Collecting Efficiency CE) und die Wiederfindungsrate (Recovery Rate RR) des Analyten. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Bestimmung der beiden Größen am Beispiel des Mangans und des Eisens. Dabei spielt die Frage nach der Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der verwendeten Analysemethode eine wichtige Rolle. Inwiefern beeinträchtigt das Silicium, das aus der SiO2-Schicht in Lösung geht und nach einem Trocknungsprozess im Rückstand verbleibt, die mittels TXRF erhaltenen Wiederfindungsraten des Analyten. Da die Antworten auf diese Fragen nur in Verbindung mit anderen Analyseverfahren gefunden werden konnten, kamen neben TXRF, GF-AAS und Photometrie auch radiochemische Methoden zum Einsatz. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst das Adsorptionsverhalten des Mangans auf der Silicium (100)-Oberfläche in verdünnter ammoniakalischer Wasserstoffperoxid- Lösung (SC1) untersucht. Zwischen der Mangan-Konzentration in der SC1-Lösung und der Oberflächenbelegung auf den Siliciumscheiben besteht ein deutlicher Zusammenhang. Mit zunehmender Konzentration in der Lösung steigen die mit TXRF ermittelten Oberflächenbelegungen an. Eine Sättigung der Manganbelegung war im untersuchten Konzentrationsbereich nicht nachweisbar. XPS-Spektren zufolge handelt es sich bei der adsorbierten Mn-Spezies um Mn(III)- und/oder Mn(IV)-Oxide. Winkelabhängige TXRF-Untersuchungen dokumentieren die Filmeigenschaften der Mn- Kontaminationen der aus SC1-Lösungen präparierten Siliciumscheiben. Erst ab hohen Mangankonzentrationen von 15 ppmw im SC1-Bad sinkt der Filmanteil der Adsorption auf 42 %. Auch die aus wässrigen sauren Mn-Lösungen kontaminierten Proben zeigen überwiegend einen filmartigen Charakter der Metalladsorption. VPD-TXRF Analysen wurden zunächst mit SC1 behandelten Siliciumscheiben durchgeführt, deren Mn-Oberflächenbelegungen im Bereich von 1 10 x 1012 Atomen/cm2 lagen. Die ermittelten Mn-TRR-Werte (TRR (totale Wiederfindungsrate) = CE X RR) zeigten deutliche Differenzen zum Maximalwert von 1 und dehnten sich über einen Bereich von 0,55 0,68 aus. Durch den Vergleich mit AAS und TXRF (Gerät EXTRA IIA) konnten die Ursachen für die Minderbefunde der TRR-Werte u.a. auf die direkten TXRF-Messungen (Gerät 8010) zurückgeführt werden, welche die Mn-Ausgangsbelegungen um etwa 20 % überbewerten. Wie sich herausstellte, führt die Quantifizierung von filmartigen Oberflächenbelegungen mit Hilfe eines externen Partikelstandards zu einer Überbewertung der Kontamination. Diese Feststellung wird durch den Vergleich zwischen TXRF 8010 und radiochemischen Messmethoden untermauert. Generell kann es bei der Quantifizierung der Oberflächenbelegungen mittels TXRF 8010 zu Fehlinterpretationen kommen, wenn der Analyt und der Standard ein unterschiedliches Fluoreszenzverhalten in Abhängigkeit des Einfallswinkels aufweisen. Es kommt dadurch zu einer Unterbewertung von partikelartigen Mangan- und Eisenkontaminationen, die nach eigenen Einschätzungen 10 % betragen kann. Weiterhin dokumentieren die Mn-TRR-Werte deutlich die Unterschiede zwischen externer und interner TXRF-8010 Kalibrierung. Die Differenzen der TRR-Werte von durchschnittlich 0,35 ergeben sich aus der verminderten Fluoreszenzstrahlung des internen Standards Rubidium. Die aus den TXRF-Spektren entnommenen Netto-counts des Rubidiums liegen deutlich unterhalb des Erwartungswertes der 1 ng entsprechenden Menge. Die TRR-Werte des Mangans von TXRF (Gerät EXTRA IIA) und AAS liefern vergleichbare und vor allem reproduzierbare Ergebnisse. Die Übereinstimmung der Ergebnisse zeigt deutlich, dass die beiden Analysemethoden als Vergleichsmethoden zu TXRF 8010 geeignet sind. Die Zuverlässigkeit der beiden Methoden dokumentiert sich auch in den übereinstimmenden Ergebnissen der Mn- und Fe-Wiederfindungsraten. Für diesen Vergleich wurden unterschiedlich konzentrierte Mn- und Fe-Lösungen in verschiedenen Matrices angesetzt. Die im Vergleich zu AAS und TXRF EXTRA IIA niedrigeren Wiederfindungsraten von TXRF 8010 sind u.a. auf die Kalibrierung mit dem 1 ng Ni-Standard zurückzuführen. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die TXRF-Messungen der in Siliciummatrix vorliegenden Mn- und Eisenproben noch deutlichere Minderbefunde aufweisen. Die Ursachen dafür sind Streueffekte, die durch die Siliciummatrix im Rückstand hervorgerufen werden (s.u.). Wie aus den radioaktiven Tracer-Experimenten hervorgeht, kann der überwiegende Teil der Gesamtkontamination des Mangans und des Eisens auf der Siliciumscheibe durch den ersten Abrollvorgang eingesammelt werden. Anhand der Mangan- und Eisenmengen, die im ersten DSE-Tropfen mittels ³-Messung detektiert werden, errechnen sich die durchschnittlichen Collecting Efficiencies von Mangan und Eisen zu 96,5 bzw. 98,5 %. Die Einsammelraten sind in dem untersuchten Konzentrationsbereich unabhängig von der Ausgangsbelegung. Collecting Efficiencies können auch ohne Kenntnis der Ausgangsbelegung bestimmt werden, wenn die Gesamtmenge der Kontamination durch die Analyse der VPD-Rückstände und der Restbelegung auf der Siliciumscheibe ermittelt wird. Die Bestimmung der Collecting Efficiency nach dieser Methode ist sinnvoll, da eine fehlerhafte Analyse der Ausgangsbelegung - wie am Beispiel der direkten TXRF-Messung gezeigt - zu verfälschten Resultaten führt. Die Anwendbarkeit beschränkt sich jedoch nur auf nichtflüchtige Analyten. Im Vergleich zur ³-Analyse zeigen die Mn-Wiederfindungsraten von TXRF 8010 deutliche Minderbefunde. Auch in diesem Beispiel liegen die Ursachen für die Unstimmigkeiten u.a. in der Kalibrierung durch den 1 ng Ni-Standard begründet. Beim Eisen deutet sich ein konzentrationsabhängiger Trend an. Die höchsten Fe-Wiederfindungsraten erhält man von den Proben mit den niedrigsten Ausgangsbelegungen. Ein Erklärungsansatz beruht auf der Annahme, dass hohe Konzentrationen an Kationen (>1015 Fe-Atome pro Siliciumscheibe) die Verflüchtigung des Siliciums als SiF4 verstärkt unterbinden und somit zu einer massiven Siliciummatrix im VPD-Rückstand führen. Daraus resultieren Streueffekte durch die Matrix, die ein vermindertes Fluoreszenzsignal des Analyten zur Folge haben. VPD-Experimente an SC1-gereinigten Siliciumscheiben belegen, dass der eingetrocknete Rückstand im Wesentlichen aus Silicium besteht. Die Summe der Metallverunreinigungen der SC1- gereinigten Proben liegt deutlich unterhalb 1015 Atomen pro Siliciumscheibe. Wie am Beispiel des Mangans und des Eisens gezeigt werden konnte, liegt die Zuverlässigkeit des VPD-Verfahrens in den hohen und vor allem reproduzierbaren Einsammelraten. Die festgestellten Differenzen der TRR-Ergebnisse sind ausschließlich auf die unterschiedlichen Wiederfindungsraten der eingesetzten Analysemethoden zurückzuführen. Radiochemische Messmethoden wurden bis auf wenige Ausnahmen für derartige Untersuchungen noch nicht angewendet. Die übereinstimmenden Ergebnisse mit den etablierten Analysemethoden und die hohe Empfindlichkeit der ²- und ³-Analyse zeigen ihr Potenzial als Ergänzungsmethode auf diesem Anwendungsgebiet. Die chemischen Wechselwirkungen zwischen Flusssäure und der SiO2-Schicht während des Ätzprozesses im VPD-Reaktor sind abhängig von der relativen Luftfeuchtigkeit. Anhand der Siliciummengen, die nach dem Ätzprozess mit Hilfe unterschiedlicher DSE-Lösungen eingesammelt wurden, konnten viele neue Informationen erarbeitet werden. Das entwickelte qualitative Modell beschreibt in Abhängigkeit von der relativen Luftfeuchtigkeit, in welcher Phase (fest/flüssig/gasförmig) das aus der SiO2-Schicht geätzte Silicium vorliegt.
Ein gastroösophagealer Reflux, der keine gastroenterologischen Symptome wie Erbrechen oder saure Regurgitation zeigt, kann im Kindesalter chronische Erkrankungen der Lunge auslösen. Typische Krankheitsbilder sind hierbei zum Beispiel Asthma bronchiale oder rezidivierende Bronchitiden. Die Inzidenz hierfür beträgt 1 : 300 bis 1 : 500. Für die Entstehung eines gastroösophagealen Reflux wird ein multifaktorielles Geschehen diskutiert. So kann zum Beispiel ein verminderter Druck des unteren Ösophagussphinkters, eine verminderte Leistung der Clearancefunktion des Ösophagus, eine pathologische Magensäuresekretion und auch eine verlängerte Entleerung des Magens ursächlich sein. Studien haben einen Zusammenhang zwischen einer pathologischen Magenentleerungszeit und einem symptomatischen gastroösophagealen Reflux beschrieben. Ein primärer Defekt wird hierbei in einer Motilitätsstörung vermutet, da ein signifikanter Zusammenhang zwischen pathologischen Magenentleerungszeiten und Dysrhythmien (abnormen elektrischen Potentialen) des Magens beschrieben ist. Bisher ist kein diagnostisches Verfahren bekannt, dass mit hoher Sensitivität und Spezifität das Vorliegen eines gastroösophagealen Reflux beweist. Vielmehr umfasst die derzeitige Diagnostik lediglich Teilaspekte der Erkrankung und liefert uneinheitliche Bilder. Bei insgesamt 25 Kindern mit Lungenproblemen bedingt durch einen gastroösophagealen Reflux wurde die Magenentleerungszeit, eine 2 Punkt-pH Metrie, eine obere Magendarmpassage sowie eine quantitative Bestimmung von fettbeladenen Alveolarmakrophagen im Rahmen einer Bronchoskopie erhoben. Im Gegensatz zur bisher üblichen Bestimmung der Magenentleerungszeit per Szintigraphie konnten im Rahmen dieser Arbeit die Werte mit einem 13C-Acetat- Atemtest gemessen werden. Eine pathologische Magenentleerungszeit wurde bei ungefähr der Hälfte der Patienten dargestellt. Obwohl ein Zusammenhang zwischen der Magenentleerungszeit und anderen Untersuchungsbefunden vermutet wurde, konnte keine signifikante Korrelation aufgezeigt werde. Alle Testverfahren lieferten unterschiedliche Ergebnisse. Bei keinem Kind mit klinisch gesichertem gastroösophagealen Reflux waren alle erhobenen Parameter pathologisch. Die Verteilung der Ergebnisse erfolgte auch im grenzpathologischen Bereich nicht signifikant. Als Grund hierfür kann vermutet werden, dass der gastroösophageale Reflux bei Kindern unterschiedliche Ursachen hat. So könnte eine pathologische Magenentleerungszeit bei einem Teil der Kinder ursächlich sein oder im Vordergrund stehen, während andere pathologische Korrelate das gleiche Krankheitsbild verursachen. Die Diagnosestellung eines gastroösophagealen Reflux bei Kindern mit pulmonaler Symptomatik kann somit nur mit hinweisenden Untersuchungen erfolgen, bei denen auch Widersprüche geduldet werden müssen.
Bendamustin ist eine Substanz, die seit über 40 Jahren in den Indikationen Non-Hodgkin Lymphom, CLL, multiples Myelom, Morbus Hodgkin, Mammakarzinom und SCLC eingesetzt wird, die jedoch erst nach der Wiedervereinigung Deutschlands systematisch neu entwickelt wurde. Die Wirksamkeit der Substanz als Monotherapie wurde, mit Ausnahme des Morbus Hodgkin, in allen Indikationen nachgewiesen. Obwohl in der Monotherapie hier keine Ergebnisse von randomisierten Studien vorliegen, ist der Stellenwert von Bendamustin als Einzelsubstanz eindeutig belegt, denn es wird als Monotherapie meist in fortgeschrittenen Therapiestadien eingesetzt, in denen es kaum Standardtherapieempfehlungen gibt. Die Ergebnisse in diesen Therapiesituationen sind insbesondere bei NHL beeindruckend (9, 28) und mit den Ergebnissen von Polychemotherapien in früheren Stadien der Erkrankung zu vergleichen (11). Beim Mammakarzinom wird Bendamustin als Monotherapie hauptsächlich palliativ eingesetzt, (36, 38, 64). Der Vorteil gegenüber anderen vergleichbaren Substanzen liegt in der Tatsache, daß Bendamustin kaum Alopezie und Organtoxizität verursacht, so dass die Patientinnen bezüglich Lebensqualität profitieren. In allen Indikationen sind oben beschriebene verschiedenste Kombinationsschemata geprüft worden. In-vitro konnte gezeigt werden, dass Bendamustin mit dem Purinanalogon Cladribin sowie mit dem monoklonalen Antikörper Rituximab synergistisch wirkt. Die Kombination mit einem Purinanalogon erwies sich klinisch zwar als sehr effektiv, aber durch das überschneidende Toxizitätsprofil ist sie mit schweren Nebenwirkungen verbunden (49). Als besonders günstig erwies sich bei den NHL die Kombination mit dem monoklonalen Antikörper Rituximab (68, 79). Die Kombination ist mit Ansprechraten von über 90% hocheffektiv und die Nebenwirkungen waren selten und nur von geringer Ausprägung. Dieses ist die einzige Bendamustin-Kombination, die systematisch vom Labor bis zur klinischen Prüfung entwickelt wurde. Die Prüfung dieser Kombination in prospektiv randomisierten Studien ist für die Weiterentwicklung der Substanz der logische nächste Schritt. Eine Indikationserweiterung erscheint insbesondere beim multiplen Myelom und bei der CLL sinnvoll. Die Ergebnisse der vorliegenden Studien zeigen, dass Bendamustin auch bei diesen Erkrankungen der B-Zellreihe sehr effektiv ist (2, 29, 59). Beim Mammakarzinom liegt der Stellenwert der Substanz eher in der Monotherapie als palliativer Ansatz (38, 64). Die Ergebnisse der Phase-III Studie in der BMF Kombination werden mit Spannung erwartet, jedoch sind die Therapiestandards in dieser Indikation inzwischen durch neue Substanzen, wie den Taxanen, modifiziert, so dass nur eine Prüfung gegen einen modernen Therapiestandard den Stellenwert des Bendamustins realistisch bestimmen könnte. Die Prüfung des Stellenwertes bei soliden Tumoren wäre insbesondere beim SCLC interessant, sofern gezeigt werden kann, dass die Substanz äquipotent ist und eine bessere Verträglichkeit aufweist. Das Toxizitätsprofil der Substanz ist ausreichend belegt. Die Haupttoxizität ist die Hämatotoxizität im Sinne von Leukozytopenie, Granulozytopenie und Thrombozytopenie. Als nicht-hämatologische Toxizität sind Übelkeit und Erbrechen dominierend. Die Toxizitäten sind in der Regel geringer Ausprägung, gut handhabbar und kontrollierbar. Langzeiteffekte sind bisher nicht bekannt, eine kumulative Thrombozytopenie ist anzunehmen (64), jedoch nicht an großen Patientenzahlen belegt. Bisher sind keine Zweittumoren als Langzeiteffekt dokumentiert worden, dies mag an der zum Teil erst relativ kurzen Nachbeobachtungszeit der in neueren Zeiten systematisch durchgeführten Studien liegen. Als Hauptindikation stellen sich die Non-Hodgkin Lymphome dar. In dieser Indikation dominiert die Zahl der durchgeführten Studien . Die Kombination mit Rituximab könnte eine sinnvolle mögliche Vergleichstherapie zur derzeitigen Standardtherapie darstellen. Ein Stellenwert als Standardtherapie kann der Substanz derzeit allerdings noch nicht zugesprochen werden. Die Substanz scheint insbesondere in der Kombination mit Rituximab bei NHL ein ideales Profil zu erfüllen: hohe Effektivität in Einklang mit einem patientenfreundlichen Toxizitätsprofil.
NMDA-Rezeptoren sind als ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) an der Signalübertragung durch den wichtigen Neurotransmitter L-Glutamat beteiligt. Vor allem aufgrund ihrer Bedeutung für das Phänomen der neuronalen Plastizität sind NMDA-Rezeptoren außerordentlich gründlich untersucht worden. Dennoch sind auch heute noch zentrale Fragen zu ihrer Funktionsweise ungeklärt, darunter auch diejenige, wie auf molekularer Ebene die Umsetzung der Glutamatbindung in die Öffnung des Ionenkanals erfolgt. Publizierte Kristallstrukturen der Liganden-bindungsdomänen zweier iGluRs haben die Grundlage für ein Modell der ligandeninduzierten und der Kanalöffnung vorausgehenden Vorgänge in der Bindungsdomäne geschaffen. Diesem zufolge schließt sich die aus zwei Teildomänen bestehende Bindungsdomäne venusfliegenfallenartig um den Liganden und die dabei entstehende mechanische Spannung führt zur Öffnung des Ionenkanals. Dieses Modell wurde in der vorliegenden Arbeit überprüft. Hierzu wurden verschiedene in der Ligandenbindungsdomäne punktmutierte NR1/NR2A-Rezeptoren heterolog in Säugerzellen exprimiert und durch Glutamat hervorgerufene Gesamtzellströme elektrophysiologisch gemessen. Mittels kinetischer Auswertung wurden dann Aminosäurereste in der Bindungsdomäne identifiziert, die einen Beitrag zur Kanalöffnung leisten. Die notwendige Schnelligkeit der Ligandenzugabe wurde dabei durch dessen photochemische Freisetzung aus einer maskierten und dadurch inaktiven Vorstufe (caged compound) erreicht. Die Ergebnisse bestätigen das Modell der Kopplung der Kanalöffnung an das Schließen der Bindungsdomäne und erweitern das Verständnis der genauen zeitlichen Abfolge der ligandeninduzierten Konformationsänderungen in der Bindungsdomäne. Intramolekulare Wechselwirkungen zwischen den Teildomänen S1 und S2 spielen demnach erst relativ spät im Aktivierungsprozeß eine Rolle und dienen vor allem der Stabilisierung des geschlossenen Zustandes der Bindungsdomäne und damit des offenen Ionenkanals.
In dieser Arbeit wurden zwei Idealkristallsysteme und drei Systeme, die im weitesten Sinne als Domänenkristalle zu bezeichnen sind, mit quantenmechanischen Methoden untersucht, die auf Dichte-Funktional-Theorie basieren. Dabei wurden je nach System unterschiedliche Eigenschaften der jeweiligen Kristalle betrachtet. Zusätzlich wurden die berechneten Domänenkristalle jeweils mit entsprechenden Idealkristallen bezüglich ihrer Stabilität verglichen. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass sich die hier verwendeten Rechenmethoden sehr gut zur Untersuchung von Grundzuständen und Strukturen unter hydrostatischem Druck sowie von Bindungseigenschaften eignen. Desweiteren lieferten die Ergebnisse starke Hinweise darauf, dass Kristalle mit Strukturgradienten nur dann existieren können, wenn sie sich vom Idealkristall um sehr geringe Energien unterscheiden, die unter der Fehlergrenze der hier angewendeten Methode (2-3 kJ/Mol) liegen.
Operative Eingriffe am offenen Herzen wie die häufig durchgeführten Bypass- und Herzklappenersatzoperationen bedürfen fast immer der Unterstützung durch die Herz Lungenmaschine bzw. extrakorporale Zirkulation. Durch den Kontakt des Blutes mit nichtorganischen Fremdoberflächen der EKZ kommt es zur Induktion einer transienten Hyperaktivität neutrophiler Granulozyten. Nachdem Herz und Lunge nach Öffnung der Aortenklemme ihre physiologische Funktion wieder aufnehmen und reperfundiert werden, werden aus diesen ischämischen Organen darüber hinaus pathogene Moleküle wie freie Sauerstoffradikale freigesetzt. Von aktivierten Neutrophilen freigesetzte, immmunkompetente Moleküle (z.B. Zytokine) führen zusammen mit diesem oxidativen Stress zu Organdysfunktionen durch Ödembildung in Körpergeweben wie Myokard, Lunge, Gehirn und Gastrointestinaltrakt und dadurch zu typischen Folgeerscheinungen wie z.B. verlängerter postoperativer Beatmungszeit oder (meist transienten) neuropsychologischen Dysfunktionen im Sinne von kognitiven Defiziten. Andere Pathomechanismen wie Mikroembolien durch z.B. Kleinstteilchen und Gasbildungen aus dem OP Gebiet verstärken diese pathogenen Effekte. Resultat ist eine verlängerte Regenerationsdauer und ein verlängerter Krankenhausaufenthalt der operierten Patienten. Zur Minimierung dieser unerwünschten Wirkungen der EKZ wurden in den letzen 20 Jahren diverse Techniken zur Filtration der unterschiedlichen Kreislaufbestandteile innerhalb der EKZ entwickelt. Von besonderem Interesse ist die seit ca. 8 bis 10 Jahren etablierte Filtration aktivierter neutrophiler Granulozyten, die die Hauptverantwortung für das aseptische Entzündungsgeschehen unter Anwendung der EKZ tragen. Entwicklung und Einsatz dieser leukozytenspezifischen Filtersysteme führt zwar zu einer deutlichen Reduktion der zirkulierenden immunaktiven Zellen und zu einer geringgradigen Verringerung der pathogenen EKZ Folgeerscheinungen, die Effektivität der gegenwärtigen Leukozytenfiltration stellt sich allerdings nur in einzelnen Berichten als positiv dar. Die Daten, die einen deutlichen klinischen Vorteil der Leukozytenfiltration zeigen, sind nicht vorhanden. Die unterstützende Anwendung antiinflammatorischer, systemisch angewandter Pharmaka führte zwar bei den meisten Präparaten zu Erfolg versprechenden Ergebnissen im Tierversuch, konnte aber beim operierten Patienten selbst zu keiner deutlichen Verminderung der unerwünschten EKZ Wirkungen beitragen. Unter der Vorstellung, dass gefilterte, aktivierte Leukozyten zum Großteil zwar nicht in den Patientenkreislauf zurückgepumpt werden, jedoch immer noch immunaktive Stoffe von ihnen synthetisiert und sezerniert werden können, liegt es auf der Hand, dass die aktuell zum klinischen Einsatz kommenden Filtersysteme zum Zwecke der Filtrationsoptimierung und konsekutiver Pathogenitätsminimierung durchaus verbesserungsbedürftig sind. Die in Abschnitt 3 angeführten Ergebnisse belegen, dass antikörperbeschichtete Leukozytenfiltermembranen durchaus in der Lage sind, in einem Kreislaufmodell ihre entsprechenden Antigene herauszufiltern und damit zu inaktivieren. Als klinische Anwendung ist dieses Modell allerdings nur unter einem immensem Technik- sowie Kostenaufwand umsetzbar, so dass sich die Frage nach alternativen Lösungsstrategien stellt. Diese Arbeit leistete die theoretische Grundlage zur Entwicklung eines in naher Zukunft möglicherweise klinisch praktikablen Moduls zur Leukozyteninaktivierung. Da anti CD95 IgM in der Lage sind, Apoptose in CD95 Rezeptor tragenden Zellen zu induzieren und diese damit bzgl. ihrer Stoffwechselaktivität zu limitieren bzw. zu inaktivieren, konnte ein ebenfalls in Abschnitt 3 vorgestelltes Modell zeigen, dass in CD 95 Rezeptor tragenden Zellen über ihren Kontakt mit anti CD95 IgM beschichteten Leukozytenfiltermembranen Apoptose induziert werden kann. Ein detailverbessertes, anti CD95 IgM beschichtetes Leukozytenfiltersystem (Leukozyteninhibitionsmodul, „LIM“) zeigte bereits im Schweineversuch eine deutliche Verbesserung der postoperativen Herzfunktion gegenüber der Tiergruppe, die mit herkömmlichem Leukozytenfiltersystem operiert wurde. Außerdem konnte eine deutlich reduzierte Transmigrationsfähigkeit (als Maß des Aktivierungszustandes) der aus dieser EKZ isolierten Neutrophilen nachgewiesen werden, so dass Grund zur Annahme besteht, dass dieses Modell in Zukunft den herkömmlichen Leukozytenfilter ablösen könnte. Mit dieser Arbeit wurde eine Möglichkeit aufgezeigt, wie die Problematik der EKZ induzierten Immunpathogenese grundlegender bekämpft werden kann.
Die antivirale Funktion der RNA-abhängigen Adenosin-Desaminase bei der angeborenen Immunantwort
(2004)
Die angeborene Immunantwort von Säugetieren ist die erste wirkungsvolle Barriere gegen eindringende Pathogene, die sowohl Infektionen als auch die Entstehung von Neoplasien verhindern kann. Insbesondere wird durch sie die Ausbreitung und Replikation von Viren wirksam bekämpft. Bei RNA-Viren wird die angeborene Immunabwehr in infizierten Zellen von der doppelsträngigen RNA aktiviert, die während der Replikation oder Transkription dieser Viren entsteht. Es kommt zur Sezernierung von Interferon-alpha und -beta (IFN-alpha/beta), die wiederum die Expression einer Reihe von antiviralen Proteinen stimulieren. Eines dieser Proteine ist die IFN-alpha-induzierbare RNA-abhängige Adenosin Desaminase (iADAR-1). Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der iADAR-1 in der Immunabwehr näher zu charakterisieren. Bisher wurde die antivirale Aktivität der iADAR-1 gegen verschiedene Virusstämme, deren Genome Adenosin zu Guanosin (A->G) Hypermutationen aufweisen, nur angenommen, jedoch noch nicht direkt gezeigt [4]. In dieser Arbeit wurde am Beispiel des Glykoproteins (GP) des lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) untersucht, ob solche A->G Mutationen im viralen Genom tatsächlich durch die iADAR-1 verursacht werden und ob dadurch die Funktion der viralen Proteine und damit die Infektiösität von LCMV reduziert wird. Des Weiteren wurde die Induktion der iADAR-1 durch die Infektion mit LCMV und die Wirkung der iADAR-1 auf die Replikation von LCMV analysiert. Bekannt war nur, dass die iADAR-1 durch IFN-alpha selbst oder durch die Infektion von Makrophagen mit Adenoviren induziert wird. In dieser Arbeit wurde erstmals für Fibroblasten, neuronale Zellen und in vivo in Mäusen nachgewiesen, dass die iADAR-1 direkt durch die Infektion mit LCMV hochreguliert wird. Dies ist ein weiterer Hinweis, dass die iADAR-1 zu den antiviralen Effektormolekülen der angeborenen Immunabwehr zählt. LCMV induzierte die Expression der iADAR-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Im Gegensatz zu Vaccinia- und Adenoviren, die die Aktivität der iADAR-1 inhibieren [5, 6], konnte bei der Infektion von SH-SY5Y-Zellen mit LCMV keine reduzierte Aktivität der iADAR-1 festgestellt werden. Ferner konnte das schon in anderen Viren beobachtete A->G Hypermutationsmuster nun auch für LCMV bestätigt werden. Sowohl in vitro in L929-Zellen als auch in vivo in Mäusen wurde eine erhöhte A->G Mutationsfrequenz gefunden, die zwischen 50 und 75 % aller Mutationen in der S-RNA von LCMV ausmacht. Dies zeigte sich vor allem in der späten Phase der Infektion, also zu Beginn der Persistenz. Insgesamt wurden zu diesem Zeitpunkt in L929-Zellen 27 % und in der Maus 15 % nicht funktionelles LCMV-GP synthetisiert. Zudem wurde die Relevanz der A->G Hypermutationen für die beeinträchtigte Funktion des GPs deutlich, da sie 62 % der nicht infektiösen GP-Moleküle verursachen. Die desaminierende Wirkung der iADAR-1 auf das virale Genom von LCMV wurde in 293T-Zellen direkt gezeigt. A->G Mutationen in der S-RNA von LCMV nahmen durch die Überexpression der iADAR-1 in 293T-Zellen um 40 % zu. Ebenso wurde die Replikation bzw. das Assembly von Virionen durch die iADAR-1 reduziert, da im Vergleich zu Kontrollzellen der LCMV-Titer im Überstand von iADAR-1-überexprimierenden Zellen wesentlich niedriger war. Des Weiteren konnte bestätigt werden, dass die A->G Mutationen nicht durch die virale Polymerase induziert werden. Hierfür wurden iADAR-1 „knockout“ murine embryonale Fibroblasten (MEF) isoliert und als stabile Zelllinie etabliert. In diesen Zellen war kein A->G Hypermutationsmuster in der LCMV-RNA zu erkennen. In MEF wt war ebenfalls kein A->G Hypermutationsmuster nachweisbar. Der Grund hierfür könnte die im Vergleich zu L929-Zellen deutlich geringere basale iADAR-1-Expression der nicht völlig ausdifferenzierten MEFs sein.
Die Wirkung der 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA-Reduktasehemmer ist auf die Blockierung der Isoprenoid-Bildung in der Cholesterin-de-novo-Synthese zurückzuführen. Unter Statin-Behandlung von glatten Gefäßmuskelzellen kommt es im Zytoplasma zur Akkumulation der inaktiven GTPase Rac, die für ihre Aktivierung Geranylgeranylpyrophosphat zur Verankerung in die Plasmamembran benötigt. Nach Stimulation von Agonisten wie Angiotensin II und Thrombin hemmen Statine die Rac-abhängige NADPH-Oxidase, die eine wichtige Quelle der vaskulären Sauerstoffradikalproduktion (ROS) ist. Die Senkung der ROS-Bildung hat die Blockierung der Phosphorylierung von ERK 1/2 und p38 MAP-Kinase und der Expression redox-sensitiver Gene zur Folge. In der vorliegenden Arbeit werden Untersuchungen an kultivierten glatten Muskelzellen zusammengefasst, die zeigen sollen, dass der Statin-Entzug in der Expression pro-inflammatorischer Gene resultiert, die eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung und Progression der Arteriosklerose spielen. Es wurde nachgewiesen, dass der Entzug von Cerivastatin in vorbehandelten glatten Gefäßmuskelzellen zur Induktion von MCP-1 und Tissue Faktor (TF) mRNA führt. Die Steigerung der Expression von MCP-1 hat schließlich eine relevante MCP-1 Freisetzung zur Folge. Im Falle von TF ist die Expression so ausgeprägt, dass es auch zu einer Erhöhung der Aktivität von TF an der Zellmembran kommt. Durch Zusatz von Geranylgeranylpyrophosphat und Mevalonsäure kann die Wirkung der HMG-CoA-Reduktasehemmer wieder aufgehoben werden. Unter dem Einfluss der Hemmstoffe PD98059, SB203580 und Diphenyleniodonium (DPI) wird die durch Abbruch der Statin-Behandlung bedingte Expression des proarteriosklerotischen Faktors unterdrückt. Diese Beobachtung lässt die Beteiligung von ERK 1/2, p38 MAP-Kinase und NADPH-Oxidase an der Signaltransduktion zu. Der Entzug von Statinen führt zu einer Steigerung der Phosphorylierung der MAP-Kinasen und zu einer Verstärkung der ROS-Bildung. Da die Produktion von Sauerstoffradikalen vermutlich als Folge der Aktivierung der Rac-abhängigen NADPH-Oxidase ist, wurde der Effekt des Entzuges auf die Rac-Translokation in der Zelle untersucht. Es zeigte sich, dass die Unterbrechung der Behandlung mit HMG-CoA-Reduktasehemmer mit einer überschiessenden Translokation der GTPase vom Zytoplasma an die Plasmamembran verbunden ist. Aus den erhobenen Befunden kann somit gefolgert werden, dass der Entzug von Statinen in einer Aktivierung von Rac und konsekutiver ROS-Bildung resultiert. Durch die Aktivierung der nachfolgenden Signaltransduktionskaskaden kommt es zu einer Induktion von MCP-1 und Tissue Faktor.
Ziel der Nachuntersuchung war es, 10 Jahres Ergebnisse nach arthroskopischer vorderer Kreuzbandplastik mittels Patellarsehne zu erhalten. Dafür wurden 74 Patienten, 55 Männer und 19 Frauen mit einem durchschnittlichen Alter von 38 Jahren im Mittel 113 Monaten nach arthroskopischer vorderer Kreuzbandplastik mit Interferenzschraubenfixation nachuntersucht. Evaluiert wurden die IKDC Evaluation, die Tegner - Aktivitätsskala und der Lysholm - Score. Die Bandstabilität wurde instrumentell mit dem Rolimeter getestet. Die statistische Auswertung erfolgte mittels c² Test. Die Tegner - Aktivitätsskala ergab ein durchschnittliches Aktivitätsniveau von 5,2. Vor der Verletzung lag der Wert bei 6,4. Der Lysholm - Score erreichte 93,6 von 100 Punkten. Hinsichtlich der Funktion wurden 74% und hinsichtlich der Stabilität 72% der Patienten in der IKDC Evaluation als normal bzw. als fast normal bewertet. Der mit dem Rolimeter bestimmte Lachman Test war in 88% normal und in 12% fast normal. Der pivot-shift Test war in 95% der Fälle negativ. 30% der Patienten zeigten in den Röntgenaufnahmen zum Nachuntersuchungszeitpunkt deutlich degenerative Veränderungen. Es ergibt sich eine signifikante Korrelation zwischen der Zeitdauer vom Unfall bis zur operativen Versorgung und dem Arthrosegrad. Die Beschwerden an der Transplantatentnahmestelle korrelieren signifikant mit den allgemeinen Symptomen. Das Ausmaß der Arthrose korreliert signifikant mit der Mensikusschädigung. Zur Vermeidung der Folgearthrose sollte daher bei gegebener Indikation eine frühzeitige Kreuzbandversorgung und im Falle der Begleitmeniskusverletzung dessen Erhalt mittels Refixation angestrebt werden.
Im Rahmen der Arbeit wurde eine Methodik zur umfassenden und automatischen Identifizierung von nativen Peptiden aus Extrakten komplexer biologischer Quellen entwickelt und am Beispiel des humanen Hämofiltrats angewendet. Die Firma BioVisioN führt seit der Gründung Forschung auf dem Gebiet der Peptide und kleinen Proteine mit dem Ziel, diagnostisch und therapeutisch relevante Substanzen zu finden, durch. Die Analyse sogenannter Peptidome, der qualitativen und quantitativen Beschreibung aller nativen Peptide und kleinen Proteinen bis ca. 15 kDa, ist als Analogon zur Proteom-Analytik zu verstehen, welche sich umfassend mit Proteinen beschäftigt. Quantitativ wird ein Peptidom über die Kombination chromatographischer Trennung und Fraktionierung mit der massenspektrometrischen „Inventarisierung“ der einzelnen Peptidspezies sowie den relativen Konzentrationen in der Probe erfasst, welches an anderer Stelle ausführlich beschrieben ist. Das Ergebnis einer solchen Peptidomanalyse besteht aus einer Peptidkarte, die die Peptide der Probe repräsentativ abbildet. Die Qualität eines Peptidoms wird über die Massen der Peptide, deren Aminosäuresequenzen und Elutionsverhalten und weitere biologische Informationen beschrieben. Zu diesen Zweck wird der Begriff des Peptide-Inventory eingeführt. Ein Inventory besteht aus allen verfügbaren Informationen nativer Peptide einer Quelle. Zu Beginn der Arbeit standen mit der reproduzierbaren Erstellung von Peptidbanken und deren systematischer Kartierung über MALDI-MS bereits zwei Werkzeuge zur Verfügung, um Daten eines Inventories zu erheben. Lediglich für die Erzeugung der Sequenzdaten wurde mit dem Edman-Abbau zwar eine etablierte, aber viel zu langsame und wenig sensitive Methode eingesetzt. Hier wurde der Ersatz durch eine schnelle und leicht zu automatisierenden Methode angestrebt. Die massenspektrometrische Sequenzierung über MS/MS mit anschließender Datenbanksuche ist ein aus der Proteom-Analytik durchaus bekanntes Verfahren, musste aber für die Analyse der nativen Peptide in einigen Bereichen modifiziert werden. Obwohl die Massenspektrometrie Peptide direkt aus komplexen Mischungen heraus identifizieren kann, stellte sich schnell heraus, dass die vorliegende biologische Beispielprobe (humanes Blutfiltrat) zu komplex war, um sie direkt für die geplante Sequenzierung einzusetzen. Es wurde eine erneute Auftrennung und Feinkartierung der Peptidbank notwendig. Jede dritte Fraktion wurde rechromatographiert und anschließend wiederum kartiert. Die entstandenen 97 Peptidkarten enthalten im Linear Modus ca. 100.000 Signale und im Reflektron Modus ca. 30.000 Signale, so dass nach der Feinkartierung > 10.000 native, im menschlichen Körper zirkulierende Peptide durch diese Methode dargestellt werden können. Zur Automatisierung der Kartierungsmessungen mit MALDI-MS wurde im Laufe dieser Arbeit ein Autosampler für ein MALDI-TOF-MS-System entwickelt und implementiert (DiskJockey). Das System hat eine Kapazität von 20 MALDI-Targets und ist vollständig über die Gerätesoftware steuerbar, so dass MALDI-MS-Messungen vollständig automatisiert über mehrere Tage ablaufen können. Zur Erzeugung der Sequenzdaten wurde eine Kombination aus elektrischer Ionenfalle und Datenbanksuche angewendet. Um zu gewährleisten, dass nur die zuvor kartierten Peptide einer MS/MS-Messung unterzogen werden, wurde das Softwaretool Alcatrap entwickelt. Diese Software übernimmt aus MALDI-MS-Messungen die Werte der monoisotopischen Peaks, überführt sie in mehrfach geladene Spezies und erstellt sowohl eine Methode für das MS-Gerät, als auch eine in die Gerätesoftware importierbare Arbeitsliste. Hierbei wird jeweils die Kollisionsenergie in Abhängigkeit der m/z-Wertes dynamisch gesetzt. Um den Datentransfer vom Fragmentspektrum zur Datenbanksuchmaschine zu gewährleisten, wurde mit „D2M“ eine weitere Softwareschnittstelle entwickelt. Die Erstellung des Inventories aus humanem Hämofiltrat liefert 1.225 verschiedene native, im menschlichen Blut zirkulierende Peptide aus 146 Proteinvorläufern. Darunter befinden sich mehrere Peptide, die neben ihrer physiologischen Bedeutung auch eine potenzielle medizinische Relevanz besitzen. Weiterhin ist auch der dynamische Bereich von acht Größenordnungen, in dem Sequenzen erzeugt wurden, vergleichbar mit dem des menschlichen Blutes. Eine Charakterisierung von Peptidomen ist in diesem Umfang bisher noch nicht durchgeführt worden und stellt eine Neuerung in der Proteomforschung dar. Die Studie ist durchaus vergleichbar mit kürzlich veröffentlichten umfangreichen Proteomstudien aus menschlichem Plasma und Serum und stellt eine Ergänzung dieser für den Bereich der Peptide und kleinen Proteine dar. Limitierungen bei der Identifizierung von Peptiden mit der Ionenfalle wurden analysiert und mit der Adaptierung des Peptide-Inventory Konzepts auf hochauflösende Quadrupol-Time-of-Flight Massenspektrometer zufriedenstellend gelöst. In diesem Rahmen wurde eine Methode entwickelt, die es ermöglicht, native Peptide bis zu einem Molekulargewicht von bis zu 8.500 Da direkt aus der komplexen Mischung zu fragmentieren und über eine Datenbanksuche zu identifizieren. Außerdem konnte exemplarisch gezeigt werden, dass durch die größere Massengenauigkeit und das größere Auflösungsvermögen des QTOF die Datenbanksuche wesentlich effektiver ist und durch die Kombination von Rechromatographie und QTOF-MS/MS nahezu jedes Signal einer Peptidbank der Identifizierung zugänlich gemacht werden kann. Sowohl die integrierte Methodik der Herstellung eines Peptide-Inventories, als auch die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse von nativen Peptiden in humanem Blut stellen wissenschaftliche Neuerungen dar, auf denen eine weitergehende Peptidom-Analytik aufsetzen kann.
Bei einigen Krankheiten bekommt die Knochenmarkstransplantation bzw. die Transplantation peripherer Blutstammzellen als Therapiemöglichkeit eine wachsende Bedeutung. Trotz aller Fortschritte birgt diese Therapieform die Gefahr von schwer zu kontrollierenden Komplikationen (Graft-versus-Host-Krankheit, Host-versus-Graft-Krankheit, lebensbedrohliche Infektionen), die die Behandlungsmöglichkeiten einschränken. Die Eigenschaften und Fähigkeiten von Natürlichen Killer-Zellen (NK-Zellen) eröffnen vielversprechende Möglichkeiten, die Komplikationen einer Stammzelltransplantation besser zu kontrollieren. Dafür ist es notwendig, NK-Zellen in möglichst reiner Form und ausreichender Menge bereitzustellen. Seit einigen Jahren stehen verschiedene immunomagnetische Antikörper zur Verfügung, mit denen Zellen gezielt selektiert oder depletiert werden können. Allerdings sind die Herstellerangaben zu Versuchsbedingungen an experimentellen Ansätzen orientiert. Um die Antikörper im klinischen Bereich in entsprechenden Größenordnungen einzusetzen, sind Versuchsansätze in klinischen Größenmaßstäben nötig. In dieser Arbeit wird eine Methode zur immunomagnetischen T-Zell-Depletion bei der Herstellung von NK-Zell-Präparaten untersucht. Mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern werden Zellen immunomagnetisch markiert und in einem starken Magnetfeld getrennt. Es wird ein etablierter Einzelantikörper („CD3 MicroBeads“) mit einem neuen Antikörper Kit („NK isolation kit“) verglichen. In der Versuchsreihe sollen die Wahl des Antikörpers, die Antikörpermenge, und die Flussgeschwindigkeit durchs Magnetfeld (Auftraggeschwindigkeit) hinsichtlich ihres Einflusses auf die T-Zell-Depletion, die T-Zell-Restkontamination nach Depletion und den NK-Zell-Ertrag untersucht werden. Bei einem der verwendeten Antikörper („NK isolation kit“) interessiert außerdem die NK-Zell-Reinheit des resultierenden NK-Zell-Präparates. Während die T-Zell-Depletion mit dem „NK isolation kit“ tendenziell größer ist als mit „CD3 MicroBeads“, unterscheiden sich beide Antikörper nicht signifikant in der T-Zell-Restkontamination. Mit „CD3 MicroBeads“ kann allerdings eine verlässlichere T-Zell-Restkontamination mit einer geringeren Schwankungsbreite der Ergebnisse erreicht werden. Weiterhin liefern „CD3 MicroBeads“ einen signifikant höheren NK-Zell-Ertrag, da mit dem „NK isolation kit“ abhängig von der eingesetzten Antikörpermenge und der damit zusammenhängenden Antikörperkonzentration mehr NK-Zellen in der magnetischen Trennsäule verloren gehen. Dabei deutet sich an, dass bei einer höheren Auftraggeschwindigkeit der NK-Zell-Verlust geringer ist. Die Menge der eingesetzten Antikörper korreliert beim „NK isolation kit“ positiv mit der erzielten NK-Zell-Reinheit. Die vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass sowohl mit einem Einzelantikörper („CD3 MicroBeads“) also auch mit einem Antikörper-Cocktail („NK isolation kit“) eine ausreichende Depletion von T-Zellen in einem klinischen Maßstab möglich ist. Bei beiden Verfahren kann mit einem Separationsschritt eine höhere T-Zell-Depletion erreicht werden, als mit anderen oder ähnlichen in der Literatur beschriebenen Verfahren. Während mit dem „NK isolation kit“ in einem Depletionsschritt NK-Zell-Präparate mit bis zu 90%iger Reinheit hergestellt werden können, müsste sich nach der T-Zell-Depletion mit „CD3 MicroBeads“ noch eine NK-Zell-Positivselektion anschließen. Während die Auftraggeschwindigkeit von untergeordneter Bedeutung ist, spielt die eingesetzte Antiköpermenge beim „NK isolation kit“ eine signifikante Rolle.
Es wurden Daten von 140 Patienten mit penetrierendem Thorax- und Abdominaltrauma des Zeitraums von 1986 - 06/1996 retrospektiv ausgewertet. Die Patienten wurden anhand einer Reihe von Beurteilungskriterien hinsichtlich Unfallhergang, Verletzungslokalisation, Versorgungsstrategie und Komplikationen während des stationären Aufenthaltes sowie der Letalität untersucht. Von besonderem Interesse waren die prophylaktischen und therapeutischen Antibiotikagaben. Es konnte eine Übersicht hinsichtlich der präklinischen und klinischen Patientenversorgung mit penetrierenden Thorax- und Abdominaltraumen geschaffen werden. Dabei zeigte sich eine mangelhafte Dokumentation zur Erarbeitung der Versorgungsstrategie (Anamnese, Verlauf, etc.) sowie gehäuftes Fehlen einzelner Dokumentationsbögen (Notarzteinsatzprotokoll, Laborbericht, Op-Bericht, etc.). Eine vollständige Bewertung der Versorgungsqualität - und quantität war somit nicht immer möglich. Vorraussetzung zur Identifizierung von Problemen und nachfolgend möglicher Einführung prozessverbessernder Maßnahmen ist jedoch eine solide Datengrundlage. Penetrierende Thorax- und Abdominaltraumen entstanden vor allem im Rahmen von Gewalttaten und Suizidversuchen. Fast die Hälfte der Unfälle ereigneten sich im jungen Erwachsenenalter. Es handelte sich zumeist um isolierte Stichverletzungen bei überwiegend männlichen Patienten. Konkrete Verletzungsmechanismen waren Stich- und Schussverletzungen. Zweihöhlenverletzungen wurden in 10% der Fälle diagnostiziert. Pfählungsverletzungen kamen nicht vor. Es wurden 95% der Patienten chirurgisch behandelt. Davon wurden 67% operiert. Insgesamt 5% der Patienten konnten konservativ behandelt werden. Isolierte penetrierende Thoraxverletzungen wurden bei 46% der Patienten beobachtet. Männer waren deutlich häufiger betroffen wie Frauen. Das durchschnittliche Alter betrug für diese Patienten 33,8 Jahre. An thorakalen Verletzungen wurden überwiegend Pneumo- und / oder Hämatothoraces beobachtet (44% bzw. 31%). Es zeigten sich keine Spannungspneumothoraces. In 6% der Fälle bestanden Verletzungen großer herznaher extrapulmonaler Gefäße. In 12,5% aller penetrierenden Thoraxtraumata wurde das Herz oder der Herzbeutel verletzt. Die Mehrzahl der Patienten (64%) mit Thoraxtrauma konnte mit Thoraxdrainagen suffizient behandelt werden. 4 Patienten konnten unter stationärer Beobachtung primär konservativ behandelt werden. Die Notfallthorakotomie war in 12 Fällen (17%) indiziert. Rethorakotomien waren nicht notwendig. Der durchschnittliche Verletzungsschweregrad I.S.S für Patienten mit Thoraxtrauma betrug 12,6. Die durchschnittliche Gesamthospitalisationszeit bei Patienten mit isolierter thorakaler Verletzung betrug 8,4 Tage. Bei 47 % der Patienten wurde lediglich das Abdomen verletzt. Männer waren deutlich häufiger betroffen wie Frauen. Das durchschnittliche Alter betrug für diese Patienten 30,9 Jahre. Drei Patienten (4,5%) wurden einer konservativen Verlaufsbeobachtung („abdominal observation“) zugeführt. Alle übrigen Patienten (95%) wurden einer operativen Exploration (Laparoskopie / Laparotomie) unterzogen. Die Indikation zur diagnostischen Peritoneallavage wurde nur im Zeitraum 1986 - 1992 gestellt und zunehmend von der Abdomen-Sonographie abgelöst. Es zeigte sich im Beobachtungszeitraum 1992 -1996 ein Rückgang der obligatorischen Laparotomien und zunehmend das Vorgehen der erweiterten Diagnostik mittels Probelaparoskopie. Die Rate positiver Probelaparoskopien lag bei 37,5 %. Die Rate negativer Laparotomien betrug 24%. Bei 6% waren Relaparotomien notwendig. Der durchschnittliche Verletzungsschweregrad I.S.S für Patienten mit Abdominaltrauma betrug 9,2. Die Patienten konnten nach einer im Vergleich zum Thoraxtrauma durchschnittlich längeren Hospitalisationszeit von 11,5 Tage die Klinik wieder verlassen. Es wurden 7% der Patienten mit einem penetrierenden thorakoabdominellen Trauma erfasst. Das Durchschnittsalter betrug 34,4, der durchschnittliche I.S.S. war 22,9. Bei 5 Patienten (50%) war das Zwerchfell mitbetroffen. Alle Patienten wurden zügig laparotomiert und zeigten bei der operativen Exploration eine intrabdominelle Organverletzung. 90% erhielten eine Thoraxdrainage. Die Rate kombinierter Thorakotomie und Laparotomie betrug 20%. Es wurde zuerst die Laparotomie durchgeführt. Postoperativ kam einmal zu einem Spannungspneumothorax. Die Letalitätsrate betrug beim penetrierenden thorakoabdominellen Trauma 10%. Bei insgesamt 34% der Patienten traten postoperativ z.T. mehrere Komplikationen auf. Bei 7 konservativ behandelten Patienten verlief der stationäre Aufenthalt unkompliziert. Die postoperative Morbidität betrug insgesamt 36,8 %. Es handelte sich in 66,7% um definitive lokalisierbare Infektionen wie postoperative Wundinfektionen oder Pneumonien. Das entspricht bei 140 Patienten mit penetrierendem Trauma einer Infektionsrate von 11,4%. Die Inzidenz posttraumatischer Infektionen beim isolierten Thoraxtrauma betrug 17%, beim isolierten Abdominaltrauma 18%. Das thorakoabdominelle Trauma zeigte keine höhere Infektionsrate gegenüber dem isolierten Thorax- oder Abdominaltrauma. Im Gesamtbeobachtungszeitraum wurden etwa drei Viertel der Patienten antibiotisch behandelt. Es handelte sich in 81% der Fälle um Monotherapien und in 19% um Kombinationstherapien. Knapp 50% aller Verordnungen entfielen auf 2 Antibiotikaregimes. Berücksichtigt man die in den Kombinationstherapien verordneten Substanzen einzeln, so ergaben die vier meistverordnete Antibiotikapräparate zusammen 68,9%. Die meisten Antibiotika wurden in der Altersgruppe zwischen 21 und 30 Jahren gegeben. Die durchschnittliche Dauer der Antibiotikaverordnungen betrug 5,1 Tage. 80% der Antibiotikaverordnungen wurden intra- und direkt postoperativ, 86% wurden initial und fortlaufend intravenös, verabreicht. Es wurden 85% als Prophylaxe und 15% als Therapie eingesetzt. Die Indikation zur perioperative Antibiotika-Prophylaxe wurde beim Thoraxtrauma in 43 Fällen (56%), beim Abdominaltrauma in 49 Fällen (68%) und beim thorakoabdominellen Trauma in 8 Fällen (70%) gestellt. 88% der verordneten Antibiotika-Prophylaxen waren erfolgreich. Bei insgesamt 83% der Patienten wurde die perioperative Antibiotika-Prophylaxe aufgrund des erhöhten Risikos einer bakteriellen Kontamination des OP-Gebietes länger als 1 Tag durchgeführt. 42% dieser Patienten erhielten die perioperative Antibiotika-Prophylaxe 1-3 Tage weiter. In 57% der Fälle wurde die Antibiotika-Prophylaxe länger als 3 Tage weitergeführt. Die durchschnittliche Dauer der Antibiotika-Prophylaxen betrug 4,6 Tage. In 7% der Fälle mit prophylaktischen Antibiotikagaben traten Infektionen auf. Sie wurden als „Versager“ der Antibiotika-Prophylaxe bezeichnet. Insgesamt wurden 12% der Patienten nach noch nicht abgeschlossener Behandlung vorzeitig verlegt oder auf eigenen Wunsch entlassen. Die durchschnittliche Hospitalisationszeit betrug insgesamt 10,9 Tage. 75% der Patienten hatten einen I.S.S < 15. Der durchschnittliche Gesamtverletzungsschweregrad I.S.S betrug 11,75. Zwei Patienten verstarben an den Folgen ihrer Verletzungen. Die Todesursachen war der nicht beherrschbare Verlust von intravasalem Volumen. Die Patienten verstarben noch am Aufnahmetag im Schockraum an Herzkreislaufversagen im Volumenmangelschock. Dies ergibt bei diesem Patientenkollektiv eine Letalitätsrate von 1,4%. Der Verletzungsschweregrad I.S.S betrug 38 und 27.
Im Rahmen der vorliegenden wissenschaftlichen Abhandlung wurden die Ergebnisse der Angioplastie von Beckenarterienstenosen oder –okklusionen analysiert. Hierbei wurde insbesondere die neue Einteilung von Gefäßläsionen zur Klassifikation nach dem TransAtlantic Inter-Society Consensus (TASC) Dokument herangezogen als auch der Stellenwert der Excimer-Laser assistierten Angioplastie bei diesen Läsionen evaluiert. Die Bedeutung einer kritischen Betrachtung der interventionellen Möglichkeiten in der Therapie der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (pAVK) liegt zum einen in der weiten Verbreitung dieser Erkrankung als auch in der zunehmenden Prävalenz. Als eindeutige Vorteile der interventionellen Methoden im Vergleich zu operativen Verfahren können die Durchführung in Lokalanästhesie, die geringere Mortalität und Morbidität und der kürzere Krankenhausaufenthalt gelten. Die Rekanalisation von Arterienverschlüssen bereitete jedoch lange Zeit Schwierigkeiten und zeigte die therapeutischen Grenzen der konventionellen Ballonangioplastie auf. Dies führte zur Entwicklung von verschiedenen abtragenden („Debulking“) Verfahren wie z. B. den Excimer-Laser. Mit ihm konnten auch chronische, kalzifizierte Gefäßokklusionen erfolgreich therapiert werden. In dem Zeitraum von Januar 1999 bis Dezember 2001 wurden 91 Patienten mit Gefäßläsionen im Bereich des Beckens therapiert. Dabei handelte es sich um 133 Stenosen, 20 Okklusionen und eine Dissektion. 142 Stents wurden im Rahmen der Interventionen implantiert. Präinterventionell erfolgte die Klassifizierung der Gefäßläsionen nach dem TransAtlantic Inter-Society Consensus (TASC), die Erhebung einer Medikamenten- und Risikofaktoren-Anamnese sowie die Ermittlung der Gehstrecke und der klinischen Stadieneinteilung nach Fontaine. Die postinterventionellen Kontrolluntersuchungen erfolgten in einem Zeitraum von einem Tag nach dem Eingriff sowie nach 1, 3, 6, 12 Monaten und dann jährlich. Im Zuge der Nachuntersuchung wurden neben der aktuellen Anamnese auch eine Überprüfung der Risikofaktoren und der aktuellen Medikamentenanamnese durchgeführt. Zusätzlich beinhaltete die Kontrolluntersuchung die farbkodierte Duplex-Untersuchung der unteren Extremitäten als auch die Bestimmung des Tibio-brachialen Quotienten als Index für den Grad der Durchblutungsstörung. Alle Kontrolluntersuchungen wurden durch die klinischen Partner des Gefäßzentrums (Abt. für Angiologie, Abt. für vaskuläre und endovaskuläre Gefäßchirurgie) der Universitätsklinik Frankfurt durchgeführt. Bei 36, der insgesamt 154 durchgeführten Interventionen, kam der Excimer-Laser zum Einsatz. 55% der Okklusionen (11 von 20) wurden mittels Excimer-Laser therapiert. Trotz des hohen Anteils an Gefäßverschlüssen waren die sekundären Offenheitsraten nach 24 Monaten nahezu identisch mit denen des gesamten Patientenkollektivs (97,14% zu 97,37%). Der technische Erfolg betrug 98,1%, die gesamte Komplikationsrate belief sich auf 3,9%. Die von uns erzielten Ergebnisse liegen im Wertebereich der bislang publizierten Arbeiten und sprechen für den Einsatz der Angioplastie bei Iliakalarterienläsionen. Dies gilt sowohl für Stenosen, als auch für Okklusionen. Lediglich Läsionen im Bereich der A. iliaca externa bei weiblichen Patienten lieferten deutlich schlechtere Ergebnisse (primäre Offenheitsraten nach 24 Monaten: 81,82% Frauen; 90,79% gesamt). Des Weiteren war ein multisegmentaler Gefäßbefall mit einer erhöhten Reinterventionsrate vergesellschaftet. 70% der Läsionen, welche einer Reintervention bedurften, waren multisegmental. Insbesondere nicht passierbare Läsionen stellen das Einsatzgebiet für den Excimer-Laser dar. Die etwas schlechteren primären Offenheitsraten (85,71% zu 90,79%) der Laser-PTA Gruppe im Vergleich zu unserer Gesamt-Gruppe beruhen auf dem größeren Anteil an langstreckigen Gefäßverschlüssen in dieser Gruppe (30,6% zu 7,7%). Die sekundären Offenheitsraten lassen hingegen keine signifikanten Unterschiede mehr erkennen (97,14% zu 97,37%). Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Rekanalisation mittels Angioplastie bei Beckenarterienläsionen sowohl im Falle der AIC als auch der AIE, mit hohem technischen und klinischen Erfolg durchgeführt werden können. Insbesondere die Excimer-Laser assistierte Angioplastie erweitert das Anwendungsspektrum auf langstreckige, chronische Beckenarterien-verschlüsse, mit ermutigenden Resultaten. Die perkutane Rekanalisation von Beckenarterienläsionen stellt somit eine echte Alternative zur chirurgischen Therapie dar und sollte primär angestrebt werden.
Der Transport von antigenen Peptiden in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums ist ein zentraler Vorgang bei der Antigenprozessierung und ihrer MHC-Klasse-I-vermittelten Präsentation auf der Zelloberfläche. Intrazelluläre Translokation über die ER-Membran erfolgt mit Hilfe von TAP, eines ATP-abhängigen ABC-Transporters. Einer ATP-unabhängigen Substratbindung folgt der eigentliche Transportschritt, dessen Energetisierung einer ATP-Spaltung bedarf. In der vorliegenden Dissertation wurde die ATPase-Aktivität des TAP-Komplexes aufgeklärt und detailliert charakterisiert. Es wurde eine schnelle und schonende Isolierungs- und Rekonstitutionsmethode entwickelt, die es erlaubt, den partiell aufgereinigten TAP-Komplex in Liposomen einzubauen und Funktionsstudien in vitro durchzuführen. Zum ersten Mal war es damit möglich, die Peptid-stimulierte TAP-spezifische ATP-Hydrolyse direkt zu beobachten und deren kinetische Parameter zu bestimmen. Eine direkte Korrelation zwischen Bindungsaffinität des Peptides zu TAP (Bindungskonstante KD) und der halbmaximalen Stimulation der ATPase-Aktivität von TAP (Km,pep) wurde festgestellt. Die Versuche mit den verzweigten Peptiden zeigten, dass Peptide, die nicht transportiert werden können, keine Stimulation der ATPase-Aktivität hervorrufen. Somit wurde die allosterische Interaktion zwischen Peptidbindung, ATP-Hydrolyse und Peptidtransport nachgewiesen. Nach der Entfernung des peptidexportierenden Sec61-Komplexes aus den Proteoliposomen konnte die vorläufige Stöchiometrie des Transportschrittes bestimmt werden. Eine weitere Anwendung fand die Rekonstitutionsmethode bei der Aufklärung des molekularen Wirkungsmechanismus des TAP-Inhibitors US6, indem der TAP-Komplex zusammen mit der aktiven ER-luminalen Domäne von US6 in die Proteoliposomen rekonstituiert wurde. Die Bindung von US6(delta147-183) an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung an die zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse wird durch die Inhibition der ATP-Bindung unterbunden, wohingegen die Peptid- und ADP-Bindung von TAP nicht beeinflusst sind.
Die frühe Entwicklung und Differenzierung der sympathischen Ganglien wird durch ein Netzwerk von proneuralen (Mash1/Cash1) und autonomen (Phox2a/b, dHand) Transkriptionsfaktoren kontrolliert. Diese Transkriptionsfaktoren induzieren direkt oder indirekt die Expression neuronaler (SCG10) und subtypspezifischer noradrenerger (TH, DBH) oder cholinerger (ChAT, VAChT) Gene. Die Analyse der frühen Genexpression im Ciliarganglion zeigte ein bemerkenswert ähnliches zeitliches Expressionsschema. Zwei bedeutende Unterschiede sind einerseits die nur transiente Expression noradrenerger Gene und andererseits die Abwesenheit des bHLH-Transkriptionsfaktors dHand, der selektiv in den sympathischen Ganglien exprimiert ist. Das Netzwerk der Transkriptionsfaktoren in den sympathischen Ganglien ist abhängig von einem BMP-Signal aus der dorsalen Aorta. BMPs sind notwendig und ausreichend für die Expression der genannten Transkriptionsfaktoren und damit für die Bildung der sympathischen Ganglien. Diese Arbeit zeigt, daß BMPs auch für die Entwicklung des Ciliarganglions notwendig und ausreichend sind. Fehlen BMPs, differenzieren die Vorläuferzellen nicht, wird BMP4 überexprimiert, differenzieren sie, anders als sympathische Vorläuferzellen im Brachialnerv, zu Zellen mit parasympathischem Phänotyp. Die vorliegenden Ergebnisse weisen auf eine Präspezifizierung von Ciliarvorläuferzellen und sympathischen Vorläuferzellen hin. Der bHLH-Transkriptionsfaktor dHand ist differentiell in sympathischen Vorläuferzellen exprimiert. Seine Expression ist notwendig für die noradrenerge Differenzierung, und die Überexpression im Ciliarganglion reicht aus, um in den Ciliarneuronen die Expression von TH/DBH zu erhalten. Verschiedene Arbeiten schlagen als möglichen Wirkmechanismus eine synergistische Interaktion von dHand und Phox2-Transkriptionsfaktoren vor. Ektopische BMP4-Expression induziert in einem Teil der generierten Neuronen die Expression von dHand. Interessanterweise reicht diese, durch BMP4 induzierte, dHand-Expression nicht aus, den relativen Anteil noradrenerger Neuronen innerhalb der ektopischen und der Ciliarneuronen zu erhöhen. Diese scheinbare Diskrepanz kann erklärt werden, wenn man annimmt, daß ein bestimmter Schwellenwert in der dHand-Funktion erreicht werden muß. Dieser Schwellenwert könnte durch unterschiedliche dHand-Expression, induziert durch BMPs, durch posttranskriptionelle Kontrolle der dHand-Funktion, oder durch unterschiedliche Expression von Cofaktoren in unterschiedlich präspezifizierten Vorläuferzellen reguliert werden. In Zellen, in denen die Konzentration an aktivem dHand einen gewissen Schwellenwert übersteigt, würde dann gemeinsam mit Phox2a/b die noradrenerge Genexpression induziert oder erhalten werden.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, inwieweit psychosoziale Belastungsfaktoren in Kindheit und Erwachsenenalter Einfluss auf Krankheitsentstehung und Verlauf der interstitiellen Cystitis (IC) haben. Als Testinstrumente fanden die MSBA (Mainzer Strukturierte Biographische Anamnese), das BSI (Brief Symptom Inventory) sowie ein IC-spezifischer Symptom- und Problem-Fragebogen Anwendung. Es erfolgte eine deskriptive Auswertung der Daten. An der Studie nahmen 30 Patienten teil, deren Symptomatik und Befunde die aktuellen Diagnosekriterien der IC erfüllen. Es zeigte sich ein erhöhtes Vorkommen wichtiger Kindheitsbelastungsfaktoren. Dazu zählen eine schlechte emotionale Bindung zu den Eltern bei mangelndem Geborgenheitsgefühl im Elternhaus, eine chronische Erkrankung eines Elternteils und körperliche Misshandlung. Sexueller Missbrauch spielte bei dieser Patientengruppe so gut wie keine Rolle. im Gesamtscore der Kindheitsbelastungsfaktoren liegen IC-Patienten ebenfalls weit über publizierten Durchschnittswerten für Stichproben gesunder Probanden. Zwischen Kindheitsbelastungsscore und klinischer IC-Symptomatik ergab sich keine signifikante Korrelation. Die aktuelle Sozialanamnese zeigte kein gehäuftes Vorkommen relevanter psychosozialer Belastungsfaktoren in den einzelnen Lebensbereichen. Die Lebensqualität ist durch die Krankheitssymptomatik stark eingeschränkt. Eine depressive Symptomatik gehörte in der Regel zum Krankheitsbild. Das BSI zeigte insgesamt erhöhte Werte für die subjektive Beeinträchtigung nahezu aller erfragten physischen und psychischen Symptome, insbesondere jedoch für Skalen Somatisierung, Ängstlichkeit und Phobische Angst. Zwischen Kindheitsbelastungsscore und Gesamtwert im BSI besteht ebenfalls keine signifikante Korrelation. Die Ergebnisse der Studie sprechen für eine psychosomatische Mitbeteiligung in der wahrscheinlich multifaktoriellen Genese der Interstitiellen Cystitis.
Der Einbau von Übergangsmetallionen in Polymerketten kann zu Materialien mit vielversprechenden optischen, elektronischen oder magnetischen Eigenschaften führen, wie sie auf der Basis konventioneller organischer Polymere nicht zu erzielen sind. Die für metallorganische Makromoleküle charakteristischen Eigenschaften resultieren vor allem aus der Vielfalt der Strukturtypen, die für Metallkomplexe auftreten, und in vielen Fällen aus kooperativen Effekten zwischen den Übergangsmetallzentren eines Polymerstranges. Gezieltes Materialdesign setzt daher neben einem grundlegenden Verständnis der Interaktion zwischen den Metallkomplexfragmenten die Fähigkeit voraus, diese durch geeignete Verknüpfungseinheiten so miteinander zu verbinden, dass Wechselwirkungen zwischen ihnen auftreten. Kooperative Phänomene lassen sich häufig bereits an kurzkettigen Oligomeren beobachten, die daher als Modellsysteme für die entsprechenden Polymere dienen. Vor diesem Hintergrund lag der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit auf der Synthese und Charakterisierung di- und trinuclearer Metallkomplexe. Darüber hinaus wurden aber auch entscheidende Fortschritte in Bezug auf die Synthese metallhaltiger Polymere auf der Basis ausgewählter Ferrocenderivate erzielt. Zur Darstellung der Zielverbindungen wurden sowohl etablierte Verknüpfungs-Konzepte genutzt als auch neue Syntheserouten entwickelt. Als wichtige Startverbindungen wurden die Ferrocenylborane FcBR2 und 1,1‘-fc(BR2)2 [Fc = (C5H5)Fe(C5H4), fc = Fe(C5H4)2, R = Br, H, CR‘3] eingesetzt, da sich deren Borylsubstituenten in vielfältiger Weise zur Verknüpfung der metallorganischen Bausteine nutzen lassen. Aufgrund der Lewis-sauren Eigenschaften der Borylsubstituenten können Ferrocenylborane mit difunktionellen organischen Lewis-Basen wie 4,4‘-Bipyridin oder Pyrazin zu Polymeren verknüpft werden. Um die Anzahl der Metallatome innerhalb derartiger Makromoleküle zu erhöhen, wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmals metallorganische Lewis-Basen als Verknüpfungseinheiten eingesetzt. In dieser Hinsicht bieten sich 3,4-Dimethyl-1-phosphaferrocen und 3,3‘,4,4‘-Tetramethyl-1,1‘-diphosphaferrocen sowie Ferrocenyllithium und 1,1‘-Dilithioferrocen an, da in diesen Verbindungen das Lewis-basische Zentrum Bestandteil des Cyclopentadienylrings ist. Im Gegensatz zu Phosphaferrocenen bilden die starken Lewis-Basen Ferrocenyllithium und 1,1‘-Dilithioferrocen mit dem Ferrocenylboran FcBMe2 selbst in Lösung stabile Addukte (z. B. Fc2BMe2Li). Polymerisationsversuche mit den Edukten 1,1‘-(fcBMe2)2 und 1,1‘-Dilithioferrocen führen entgegen den Erwartungen jedoch nicht zu polymerem Material, sondern ergeben das borverbrückte [1.1]Ferrocenophan [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2]Li2. Die Struktur von [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2]Li2 im festen Zustand weist als hervorstechendstes Merkmal ein nacktes Lithium-Ion auf, das sich im Zentrum des Käfigs befindet. Dieses supramolekulare Aggregat ist auch in Lösung beständig. Werden jedoch beide Ferroceneinheiten oxidiert, verlässt das Li+-Ion den Makrozyklus, um nach vollständiger Reduktion von [{Fe-(C5H4)2}2{BMe2}2] wieder an seinen ursprünglichen Platz zurückzukehren. Komplementär zum Verknüpfungskonzept über dative Bor-Stickstoff-, Bor-Phosphor- und Bor-Kohlenstoff-Bindungen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Kondensationsreaktion erarbeitet, die auf einfachem Wege zu kovalent verknüpften di- und oligonuclearen Ferrocenkomplexen führt. Bei der Umsetzung von FcBBr2 mit HSiEt3 beobachtet man eine Dimerisierungsreaktion, die unter Bildung von Fc2BBr verläuft. Einer entsprechenden Reaktion lässt sich auch 1,1‘-fc(BBr2)2 unterziehen, womit sich ein Weg zu Poly(ferrocenylenen) eröffnet, in denen die Ferroceneinheiten über dreifach koordiniertes Bar verknüpft sind ([-fcB(R)-]n, R = Br). Weitere Wege zu ferrocenhaltigen Polymeren mit Bar im Polymerrückgrat wurden durch die erfolgreiche Synthese der Ferrocenylborane FcBH2 und 1,1‘-fc(BH2)2 eröffnet, die in Form ihrer Lewis-Säure-Base-Addukte mit Dimethylethylamin [FcBH2 . NMe2Et; 1,1‘-fc(BH2 . NMe2Et)2] oder Dimethylsulfid [FcBH2 . SMe2; 1,1‘-fc(BH2.SMe2)2] isoliert werden konnten. FcBH2 . NMe2Et und FcBH2 . SMe2 erwiesen sich als aktive und selektive Hydroborierungsreagenzien. Durch Umsetzung mit aromatischen Dialkinen werden dadurch konjugierte Polymere zugänglich, welche mit Polyolefinen verwandt sind, in denen einige der Kohlenstoffatome durch Boratome ersetzt wurden. Diese Materialien zeichnen sich durch ausgeprägt pi-Delokalisation aus, die sich über das Bor hinweg erstreckt, und weckten unser Interesse, da Oxidation der Ferrocenyl-Seitenketten eine elektrochemische Modifizierung der Ladungsdichte an den Borzentren erlauben sollte. Gleichzeitig ließen sich auf diese Weise paramagnetische Fe(III)-Ionen in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem elektrisch leitfähigen Polymer generieren. Überdies erhält man Polymere des Typs [-fcB(R)-]n nicht nur über die Reaktion von 1,1‘-fc(BBr2)2 mit HSiEt3 (R = Br) sondern auch über die Kondensationsreaktion von 1,1‘-fc(BH2)2, die unter Abspaltung von BH3 verläuft (R = H).
Therapeutische Konzepte der Radioiodtherapie bei der Autoimmunhyperthyreose vom Typ Morbus Basedow
(2004)
In der vorliegenden Arbeit wurden retrospektiv Ergebnisse einer Radioiodtherapie bei 126 konsekutiven Patienten (19 Männer; 107 Frauen, Alter 50,9±14,6, Median 51,5 Jahre) analysiert, die im Zeitraum von 1992 bis 2001 wegen einer Autoimmuthyreopathie vom Typ M. Basedow in der Klinik für Nuklearmedizin der Gutenberg Universität Mainz behandelt wurden. Ziel der Arbeit war es, die Effektivität unterschiedlicher Therapieansätze zu vergleichen sowie Faktoren, welche einen Einfluss auf die Therapieergebnisse haben könnten, zu ermitteln, wobei Anamnese, Schilddrüsenvolumen, Stoffwechsellage und Thyreostase zum Zeitpunkt der Therapie besondere Berücksichtigung fanden. Bei 47 Patienten erfolgte die Radioiodtherapie nach einem funktionsoptimierten Konzept mit dem Ziel (150 Gy), eine Euthyreose zu erreichen. 79 Patienten wurden nach ablativem Konzept mit dem Ziel einer posttherapeutischen Hypothyreose behandelt. Die Dosis in dieser Gruppe betrug bei 19 Patienten 200 Gy; bei 29 Patienten 250 Gy; bei 15 Patienten 275 Gy und bei 16 Patienten 300 Gy. In 21% aller Fälle erfolgte die Therapie bei Erstmanifestation, bei 15% nach dem 1. Rezidiv und bei 64 % nach dem 2. Rezidiv. Bezüglich der Thyreostase, der Stoffwechsellage und des prätherapeutischen Radioiod-Uptakes waren die Gruppen nicht signifikant unterschiedlich. Entsprechend den Therapiekonzepten wurde bei funktionsorientiertem Konzept im Median 372 MBq als Aktivität errechnet und 400 MBq appliziert (14,3 MBq/ml). Für Patienten mit ablativem Therapiekonzept wurden im Median 514 MBq errechnet und 600 MBq appliziert (28,6 MBq/ml). Erreicht wurden in der ersten Gruppe Organdosen zwischen 80 und 380 Gy (Median 180 Gy). Bei 7 Patienten (14%) wurde dabei der angestrebte Bereich nicht erreicht, bei 27 Patienten (57%) erreicht und bei 13 Patienten (29%) überschritten. Der Variationskoeffizient lag bei 52%. In der Gruppe mit ablativem Ziel erreichten die Organdosen 56-685 Gy (Median 275 Gy). Bei 67 der 79 Patienten (85%) lag die erreichte Dosis wie geplant oder höher, bei 12 Patienten (15%) wurde die angestrebte Dosis nicht erreicht. Nur bei 3 der 47 Patienten (6%) wurde eine Euthyreose erreicht. Eine Hyperthyreose lag dagegen bei 22 Patienten (47%) vor. 22 Patienten (47%) wiesen posttherapeutisch eine Hypothyreose auf. Dagegen waren in der Gruppe mit ablativer Therapie 61 Patienten (77%) wie erwünscht hypothyreot und 18 (23%) hatten eine Resthyperthyreose. Patienten, die nach der ablativen Radioiodtherapie eine erwünschte Hypothyreose erreichten, hatten eine kürzere eff. HWZ und einen höherer Radioiod-Uptake (4,7 Tage; 52%) als Therapieversager (5,4 Tage; 49%) sowie ein geringeres Schilddrüsenvolumen nach der Behandlung (7,2±4,7 vs. 21,5±13,3 ml). Zehn Patienten nach ablativer Therapie (n=10) hatten trotz erreichter Dosis >250 Gy eine Resthyperthyreose. Das Schilddrüsenvolumen lag bei diesen Patienten zwischen 14 und 70 ml (Mittelwert: 29,5 ml). Die posttherapeutische Volumenreduktion war bei funktionsorientierter Therapie geringer als bei ablativem Konzept (um 55% vs. 65%). Die TRAK und anti-TPO-AK-Titer waren in beiden Gruppen gegenüber dem Ausgangswert angestiegen. Dabei waren die posttherapeutischen Konzentrationen bei funktionsoptimiertem Konzept höher als nach ablativer Therapie. Die Radioiodtherapie wurde in beiden Gruppen gut toleriert. Beschwerden durch eine strahleninduzierte Thyreoiditis zeigten sich bei 13 Patienten (10%), die mit Eiskrawatte und nichtsteroidale Antiphlogistika behandelt wurden. Unter Cortisonprophylaxe (n=29) wurde nur bei einem Patienten eine Verschlechterung der vorbestehenden EO beobachtet. Das Schilddrüsenvolumen wurde als wesentlicher, den Therapieerfolg bestimmender Parameter bei ablativem Konzept in der multivariaten Analyse identifiziert. So hatten Patienten mit einem Schilddrüsenvolumen ab 25 ml ein 10-fach höheres Risiko für ein Versagen der Radioiodtherapie in Relation zu Patienten, die eine Schilddrüse <25 ml hatten. Die Radioiodtherapie mit ablativen Dosen erweist sich in einem Iodmangelgebiet gegenüber der funktionsorientierten Behandlung als eine effektivere Therapie. Dieses Konzept geht mit niedrigerem Risiko der Verschlechterung einer vorbestehenden EO (unter Cortisonprophylaxe) einher. Es stellt sich bei diesem Konzept heraus, dass die Thyreostase in niedriger Dosierung keinen bedeutenden Einfluss auf den Therapieerfolg hatte. Die Auswertung der Daten bestätigt, dass die aktuell verwendete individuelle Dosisplanung mittels Radioiodtest eine präzise Abschätzung der notwendigen Aktivität erlaubt. Ausgehend von Ergebnissen diese Studie erscheint bei ablativem Konzept eine volumenadaptierte Korrektur der Zieldosis sinnvoll: während bei Schilddrüsenvolumina zwischen 25-40 ml eine Dosis von 250 Gy (entsprechend aktuellen Empfehlungen der Leitlinie der DGN) optimal ist, sollten bei Volumina > 40 ml höhere Zieldosen gewählt werden. Bei Patienten mit Schilddrüsenvolumina < 20 ml ist eine Dosis von 200 Gy ausreichend.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung, Aufbau und Inbetriebnahme eines Funnelsystems zur Zusammenführung zweier Teilchenstrahlen, bestehend aus zwei Injektionssystemen, zwei RFQ-Beschleunigern, Hochfrequenz-Deflektoren und Diagnoseeinheiten. Die Aufgabe des Experiments ist die praktische Umsetzung eines neuartigen Verfahrens zur Strahlstromerhöhung bei im Idealfall gleichbleibender Emittanz und steigender Brillanz. Notwendig wird dies durch die benötigten hohen Strahlströme im niederenergetischen Bereich einiger zukünftiger geplanter Beschleunigeranlagen. Hier kann der Strahlstrom nicht mehr konventionell von einer einzigen Ionenquelle erzeugt werden. Nur durch die Parallelerzeugung mehrerer Teilchenstrahlen sowie mehrfachem Zusammenführen (Funneling) der Teilchenstrahlen ist es möglich, die notwendigen Strahlströme bei der geforderten kleinen Emittanz zur Verfügung zu stellen. Das Frankfurter Funneling-Experiment ist die skalierte erste HIDIF-Funneling-Stufe als Teil eines Fusionstreibers. Hier werden zwei möglichst identische Helium-Teilchenstrahlen von zwei Ionenquellen erzeugt und in zwei RFQ-Beschleunigern beschleunigt. Der Deflektor biegt die Teilchenstrahlen reißverschlussartig auf eine gemeinsame Strahlachse. Am Anfang der Arbeit stand die Optimierung des Betriebs der Beschleunigerkomponeten und die Entwicklung und der Aufbau eines Einzellendeflektors. Erste erfolgreiche Strahlexperimente zur Strahlvereinigung werden im Kapitel 7.5 vorgestellt. Die Phasenraumellipse des zusammengeführten Strahls zeigt starke bananenförmige Deformierungen, die auf eine schlechte Anpassung des RFQ an den Funnel-Deflektor zurückzuführen sind. Das Elektrodendesign des RFQ ist in zwei unabhängige Bereiche unterteilt. Die erste Zone dient der Beschleunigung der Teilchen. In der zweiten Zone soll erstmals ein sogenannter 3D-Fokus der Strahlradien der x- und y-Ebene und einer longitudinaler Fokussierung erreicht werden. Der zweite Abschnitt bestand für erste Strahltests aus zunächst unmodulierten Elektroden. Zur besseren Anpassung des RFQ an den Funneldeflektor wurde dann das letzte Elektrodenteil erneuert. Der Umbau erfolgte zunächst nur bei einem der beiden RFQ-Beschleuniger. Somit war der direkte Vergleich zwischen altem und neuen Elektrodendesign im Strahlbetrieb möglich. Mit diesem neuen Elektrodenendteil wurde eine Reduktion der Strahlradien der x- sowie y-Ebene, eine bessere longitudinalen Fokussierung sowie eine höhere Transmission erreicht (Kapitel 8). Damit ist es erstmals gelungen mit einer speziellen Auslegung der RFQ-Elektroden eine direkte Anpassung an nachfolgende Elemente zu realisieren. Untersuchungen zur Strahlzusammenführungen werden seit einigen Jahren am Institut durchgeführt. Mit der Entwicklung des 3D-matchers wurde ein weiteres der kritischen Probleme gelöst. Der Umbau des zweiten Beschleunigers findet zur Zeit statt. Nach der Inbetriebnahme werden Funneling-Experimente mit dem Einspalt- und einem neuem Vielspaltdeflektor folgen.
Um zu prüfen, ob das individuelle Risiko einer Flugreisethrombose anhand der Entstehung eines der ersten klinischen Symptome, der Ödembildung im Bereich der unteren Extremität abgeschätzt werden kann, nahmen 70 Probanden an einer simulierten 12-stündigen Flugreise teil. Der Versuch fand in einer Unterdruckkammer statt, in der die Probanden unter entsprechenden atmosphärischen und klimatischen Verhältnissen auf einer originalen Flugzeugbestuhlung saßen. Die Luftfeuchtigkeit in der Kammer war technisch limitiert und mit durchschnittlich 52% erheblich über dem angestrebten Sollwert von unter 20%. Die 70 Probanden waren in drei Riskogruppen aufgeteilt. 20 Probanden (28,6%) hatten eine gesicherte APC-Resistenz und hatten eine länger als 12 Monate zurückliegende Thrombose erlitten. 25 Teilnehmer (35,7%) gehörten zu der Gruppe, bei denen eine APC-Resistenz bekannt war, aber keine Thrombose in der Vorgeschichte. Die Kontrollgruppe bestand aus 25 Probanden (35,7%), die weder eine APC-Resistenz noch eine Thrombose in der Anamnese vorwiesen. Es bestand eine gleiche Geschlechts- und der Altersverteilung. Unmittelbar vor und nach dem Versuch wurde eine standardisierte optoelektronische Messung der Unterschenkelvolumina durchgeführt. Es konnte hier eine signifikante Zunahme des gemessenen Volumens ermittelt werden. Dieses Volumen des venösen Ödems betrug durchschnittlich 118ml (3,6%). Zwischen dem Ausmaß des Ödems und den Variablen Alter, Geschlecht, BMI und Trinkmenge bestand kein signifikanter Zusammenhang. Ebenfalls konnte zwischen den drei Risikogruppen „APC mit Thrombose“, „APC ohne Thrombose“ und der „Kontrollgruppe“ kein signifikanter Unterschied in Bezug auf das Unterschenkelödem nachgewiesen werden. Des weiteren konnte entgegen der Erwartungen ein Abfall des Hämatokrits festgestellt werden. Dieses Ergebnis ist jedoch auf Grund der relativ hohen Trinkmenge von 1300ml und der zu hohen Luftfeuchtigkeit während des Versuches von eingeschränkter Bedeutung. Bei keinem der Probanden konnte vor und nach dem Versuch bei der duplexsonographischen Untersuchung der unteren Extremität ein Strömungshindernis beobachtet werden. Im Rahmen dieser Studie kam es bei einem männlichen Probanden mit bekannter APC-Resistenz und einer Thromboseanamnese in beiden Unterschenkeln zu einem Zwischenfall. Ein 62 Jahre alter Teilnehmer entwickelte nach Abschluss der simulierten Flugreise eine Unterschenkelvenenthrombose. An dem später thrombosierten Bein wurde eine um zwei Standardabweichungen größere Ödembildung dokumentiert, was jedoch ebenso bei 7 anderen Probanden aller Risikogruppen beobachtet werden konnte. Schlussfolgerung: Es konnte zwischen den von uns zusammengestellten Risikogruppen und dem Ausmaß des Unterschenkelödems kein signifikanter Zusammenhang nachgewiesen werden. Bei dem Probanden, der eine Thrombose entwickelte, konnte retrospektiv eine um zwei Standardabweichungen größere Volumenzunahme des betroffenen Unterschenkels beobachtet werden. Ein ausgeprägtes Unterschenkelödem sollte als ein absolutes Warnzeichen verstanden werden, ist aber nicht als zuverlässiges Frühzeichen zu werten.
Der Untersuchungszeitraum von 9 Monaten und die Vergabe der Evaluation der Beratungsstelle der LZKH an die Poliklinik für Zahnerhaltungskunde des ZZMK der Universitätsklinik in Frankfurt (Carolinum) ergeben eine gute Vorraussetzung für eine repräsentative und objektive Beurteilung des bestehenden Services. Der bestehende Service der LZKH stellt eine gute Grundlage dar, was durch die positive Beurteilung der Ratsuchenden bestätigt wird. Diese zeigt, dass die bestehende Beratung die For-derungen des Präsidenten der LZKH nach einer unabhängigen und qualitativ hochwertigen Beratung bereits meist erfüllt. Möchte sich die Beratungsstelle allerdings gegen andere Konkurrenten, und vor allem gegen die geplante Beratungsstelle der Regierung behaupten [6], [25], [38], [57], [58], so muss der Service in einigen Punkten noch verbessert werden. Ein beträchtlicher Mangel stellte die Namensliste der Zahnärzte einer bestimmten Fachrichtung dar, die nur in den wenigsten Fällen mit der Spezialisierung des Zahnarztes übereinstimmte. Es müsste also für jedes Fachgebiet eine neue Liste erstellt werden, und diese in regelmäßigen Abständen aktualisiert werden. Im Bereich „Behandlung unter Anästhesie“ ist dies bereits erfolgt und weitere sind laut Aussage der LZKH geplant. Die Hilfe bei Rechnungsfragen dauerte bei Einsendung der Unterlagen mit bis zu sechs Wochen eindeutig zu lange, denn der Patient muss die Rechnung meist innerhalb von 4 Wochen begleichen. Die Beraterinnen der LZKH können laut eigener Aussage allerdings auf Grund des hohen Arbeitsaufkommens, auch in ihren anderen Tätigkeitsbereichen, die Überprüfung nicht schneller durchführen. Zusätzliche Mitarbeiter/innen wären in diesem Fall die einzige Lösungsmöglichkeit. Um sich in Hessen zu etablieren und für jeden Bürger zur Verfügung stehen zu können, sollte eine wesentlich breit gefächerte in Information in verschiedensten Medien durchgeführt werden. Denn viele Anrufer gaben an, nur durch Zufall auf die Nummer der Hotline gestoßen zu sein. Dieser Zustand entspricht derzeit also nicht einem Service, der allen Bürgern zugänglich ist, wie es das Ministerium für Gesundheit gefordert hat. Des weiteren müsste der Zugriff auf die beratenden Zahnärzte besser organisiert werden, denn es gab einige Fälle, in denen eine Beratung durch einen Zahnarzt nötig gewesen wäre, aber zum Zeitpunkt der Anfrage kein Zahnarzt verfügbar war. Ein Einsatzplan der beratenden Zahnärzte oder ein pensionierter bzw. berufsunfähiger Zahnarzt, der sich jedoch auf dem neusten Stand der Zahnmedizin befindet, sind die Lösungsmöglichkeiten dieses Problems. Eine persönlichen Vorstellung mit eventueller kurzer Befundaufnahme durch einen Zahnarzt wäre absolut wünschenswert, da einige Probleme nur mit einer genauen Diagnose qualitativ hochwertig lösbar sind [18]. Dieser Service müsste jedoch nicht für alle Ratsuchenden zur Verfügung stehen, sondern nur für diejenigen, denen per Telefon keine zufriedenstellende Lösung angeboten werden konnte. Allerdings dürfte der Telefonservice nicht vernachlässigt werden, denn viele Ratsuchenden sehen in dessen schnellen Hilfe den Hauptvorteil, denn hier entfällt die Wartezeit auf einen Termin. Außerdem gibt es einige Patienten, die aus psychischen oder physischen Gründen keinen Arzt aufsuchen können und so die telefonische Beratung oft die einzige Möglichkeit darstellt, um an Informationen zu gelangen [30], [70]. Diese genannten Ergänzungen würden zu einer Optimierung des bestehenden Beratungsser-vices führen, wodurch sich die Beratungsstelle gegenüber anderen Anbietern und vor allem dem Plan der Regierung, weitere Beratungsstellen zu gründen, behaupten könnte. Die Durchführbarkeit ist allerdings eine Kostenfrage, denn die LZKH möchte auch weiterhin dem Patienten ihren Service kostenfrei anbieten. Aus diesem Grund muss der Vorstand der LZKH abwägen, welche Verbesserungsvorschläge mit den vorhandenen finanziellen Mitteln durchgeführt werden können. Die Fortschritte der Veränderungen und eventuell auftretende neue Aspekte sollten regelmäßig durch befragen der Ratsuchenden überprüft werden. Trotz der genannten Mängel, ist die Forderung der Regierung nach einer bundesweiten Beratungsstelle, die dem Patienten gesundheitliche Informationen sowie Beratung und Aufklärung bieten sollen [55], nicht angebracht. Denn diese Forderungen erfüllt der bestehende Service der LZKH bereits. Aber nicht nur in Hessen hat der Patient diese Möglichkeit der Informationsfindung, sondern auch in allen anderen Bundesländern [79]. Der Nachteil anderer Anbieter ist die fragliche fachliche Kompetenz [55], [80], wenn sie keine Berater einsetzen, die aus dem zahnmedizinischen Bereich stammen, bzw. diese nicht auf dem neusten Stand der zahnmedizinischen Entwicklung sind. Wird das Feld durch die Krankenkassen besetzt, so ist hier das Problem die Neutralität, da diese nicht wirtschaftlich unabhängig sind. Außerdem erfolgt hier, im Gegensatz zu den Landeszahnärztekammern, oftmals erst die Beratung, wenn bereits ein Behandlungsfehler erfolgt ist [17]. Die durch die Regierung geplanten Beratungsstellen weisen nicht nur eine fragliche Kompetenz auf, sondern sollen aus Mitteln der Krankenkassen, und somit also durch den Patienten, finanziert werden [50]. Der Präsident der LZKH sieht dies sehr kritisch und betonte in einem Interview gegenüber der Pressereferentin der LZKH, dass in Zeiten knapper Ressourcen im Gesundheitswesen der von Bundesgesundheitsministerin Fischer mit Millionenbeträgen aus Mitteln der GKV geplante Aufbau von Patientenberatungsstellen absolut unnötig und überflüssig ist. Aus diesen Gründen versucht nicht nur die LZKH, sondern auch einige andere Zahnärztekammern, wie zum Beispiel die Landeszahnärztekammer Sachsen [25] und die Landeszahnärztekammer Baden-Württemberg [57], den Versuchen der Krankenkassen, Verbraucherorganisationen und Regierung mit einer besseren Alternative entgegenzutreten. Die Landeszahnärztekammer Hessen hat mit dieser Untersuchung einen wichtigen Schritt in Richtung Qualitätssicherung und Etablierung gegenüber anderer Anbieter unternommen. Voraussetzung ist allerdings, dass zumindest ein Teil der Verbesserungsvorschläge realisiert werden.
Die vorliegende Arbeit befaßte sich mit der Untersuchung der Funktion und der Regulation des neuronalen GABA-Transporter 1 der Maus (mGAT1). Der mGAT1 ist ein elektrogener Neurotransmittertransporter, der in Gegenwart von GABA in Abhängigkeit des Membranpotentials und des Na+-Konzentrationsgradienten über der Membran einen sogenannten mGAT1-vermittelten Strom generiert. Der mGAT1 wurde in Oozyten von Xenopus laevis exprimiert und mit elektro-physiologischen Methoden (Two-Electrode Voltage Clamp), mit radioaktiven Auf-nahmemessungen (3H-GABA, 22Na+, 36Cl-) und mit biochemischen Methoden untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte unter Verwendung des Tiagabin –Analogons SKF-89976-A gezeigt werden, daß der mGAT1-vermittelte Strom aus zwei Komponenten besteht, einem Transportstrom und einem Transporter-assoziierten Strom. Dabei wurde die hier gewonnene neue Erkenntnis genutzt, daß SKF-89976-A die Transporter-assoziierte Stromkomponente selektiv blockieren kann. Als Ursache des Transportstroms konnte die in der Literatur angenommene Transportstöchiometrie von 1GABA : 2Na+ : 1Cl- bewiesen werden. Als Ursache des Transporter-assoziierten Stroms konnte eine vom GABA-Transport entkoppelte Na+-spezifische Leitfähigkeit in Gegenwart von GABA identifiziert werden, die drei bis fünfmal größer ist als die Transport-Leitfähigkeit selbst. Transportstrom und Transporter-assoziierter Strom scheinen von zwei unterschiedlichen Konformeren des mGAT1 vermittelt zu werden, die nicht miteinander im Gleichgewicht stehen. In Abwesenheit von GABA ist in der Stromantwort auf einen Spannungspuls ein mit der Zeit abfallender transienter Strom zu beobachten. Hinsichtlich dieses langsamen transienten Stroms des mGAT1 konnte ein Bindungsmodell für Na+ und Cl- in Abwesenheit von GABA entwickelt werden. Nach diesem Modell kommt es vor der Bindung von GABA am Transporter zu einer sequentiellen Bindung zweier Na+-Ionen und eines Cl--Ion. Regulation des mGAT1 konnte durch Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung des mGAT1 mittels PKC und PP2B gezeigt werden. Dabei scheint der mGAT1-vermittelte Strom durch Serin- / Threonin-Phosphorylierung verstärkt zu werden. Durch Koinjektion von mGAT1-cRNA und humaner Hirn-mRNA konnte der mGAT1 zusammen mit unbekannten zytosolischen bzw. Membranproteinen des humanen Hirns koexprimiert werden. Dabei wird die Transportrate des mGAT1 signifikant gesteigert; der mGAT1-vermittelte Strom wird nicht signifikant beeinflußt. Es scheint, daß eines oder mehrere der koexprimierten humanen Proteine die Bildung des Transport-Modus bzw. die Bildung des Kanal-Modus mit beeinflussen.
Der T-Zell-Wachstumsfaktor Interleukin-2 (IL-2) wird von Antigen-stimulierten T-Zellen sezerniert und spielt eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunantwort. Dabei tragen in aktivierten T-Zellen die MAPK-Signalwege, der Calcineurin/NF-AT-Signalweg und der NF-KB-Signalweg kooperativ zur IL-2-lnduktion bei. In den letzten Jahren wurden mehrere Hinweise gefunden, dass IL-2 möglicherweise bei der HIV- und SIV-Pathogenese eine Rolle spielt. Zwei Publikationen konnten bereits eine verstärkte IL-2-Sekretion HIV-1-infizierter T-Zellen nachweisen, die molekularen Mechanismen dieser IL-2-Induktion sind bisher allerdings kaum untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das apathogene simiane Immundefizienzvirus der Afrikanischen Grünen Meerkatze (SIVagm3) in suboptimal stimulierten PBMC ebenfalls die Interleukin-2-Sekretion verstärken kann. In der humanen T-Zelllinie A3.01 wurde nach Transfektion des Volllängenplasmids des SIVagm3 eine bis zu 38-fach verstärkte transkriptionelle Aktivierung des IL-2-Promotors beobachtet. Die Untersuchung der beteiligten Signalwege zeigte, dass die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK und p38 für die IL-2-Induktion durch SIVagm3 notwendig sind, während die Inhibition der Calcineurin-Aktivität durch das Immunsuppressivum Cyclosporin A keinen Einfluss hatte. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis zeigte die Analyse der Transkriptionsfaktorbindungsstellen des IL-2-Promotors keine Aktivierung der NF-AT-kontrollierten Genexpression durch SIVagm3, womit zum ersten Mal ein Calcineurin/NF-AT-unabhängiger Weg der IL-2-Induktion beschrieben wurde. Dagegen erhöhte SIVagm3 die transkriptionelle Aktivität des NF-KB-responsiven Elements und die Aktivität des CD28/AP-1-responsiven Elements, die auch bei der klassischen T-Zellaktivierung eine Rolle spielen. Eine Aktivierung der CD28/AP-1-kontrollierten Genexpression konnte auch durch Expression des viralen Transaktivator-Proteins Tat induziert werden, das in stimulierten Zellen in der Lage war, die IL-2-Expression zu verstärken. Die Beschränkung dieser Tat-Funktion auf stimulierte Zellen konnte aber nicht auf eine Phosphorylierung von SIVagm3-Tat durch die MAP-Kinasen ERK, JNK/SAPK oder p38 zurückgeführt werden. Weitere Analysen zeigten dagegen, dass SIVagm3-Tat durch die Cyclin-abhängige Proteinkinase 9 (CDK9) phosphoryliert wird, die mit Tat koimmunpräzipitiert. Darüberhinaus konnte eine weitere nicht-identifizierte Tat-assoziierte Kinase nachgewiesen werden, die SIVagm3-Tat ebenfalls phosphorylieren kann. Aktuelle Publikationen zeigen, dass das lentivirale Vif-Protein die Degradation von Apobec3G im Proteasom induziert, da dieser zelluläre Faktor die Infektiosität der entstehenden Viruspartikel stark reduziert. Die antivirale Funktion von Apobec3G, die in der Deaminierung der Minusstrang-DNA während der reversen Transkription besteht, ist bereits weitgehend aufgeklärt, aber über die Regulation von Apobec3G ist noch wenig bekannt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der mitogenen Raf/MEK/ERK-Signalkaskade durch den Phorbolester TPA zu einer verstärkten Apobec3G-Expression führt. Dieser Effekt konnte durch den Proteinkinase C (PKC)-Inhibitor Staurosporin und den MEK-Inhibitor U0126 inhibiert werden, wodurch gezeigt wurde, dass die Aktivität der MAP-Kinase ERK für die Verstärkung der Apobec3G-Expression notwendig ist. Eine Phosphorylierung von Apobec3G durch ERK wurde im Kinase-Assay jedoch nicht beobachtet. Dagegen konnte durch radioaktive in-vivo-Markierung nachgewiesen werden, dass es sich bei Apobec3G nicht um ein Phosphoprotein handelt. Neben den Untersuchungen zur Regulation von Apobec3G, konnten neue Erkenntnisse zu den Apobec3G/Vif-Interaktionen gewonnen werden. Durch Koimmunpräzipitationsstudien wurde die physikalische Interaktion von Vif und Apobec3G nachgewiesen. Zudem konnte gezeigt werden, dass in Gegenwart von Vif der Einbau von Apobec3G in die Viruspartikel gehemmt wird. Damit wurden erste Hinweise gefunden, dass Vif neben der Induktion des proteolytischen Abbaus von Apobec3G weitere Strategien anwendet, um die Inkorporation des antiviralen Faktors zu verhindern.
Inhibition des Stat3-Signalweges durch Peptid-Aptamere : ein neuer Ansatzpunkt für die Tumortherapie
(2004)
In der vorliegenden Arbeit konnten durch den Einsatz modifizierter Hefe-zwei-Hybrid-Screens erstmals Peptid-Aptamere isoliert werden, die spezifisch mit verschiedenen funktionellen Domänen von Stat3 interagieren und dadurch den Stat3-Signalweg auf unterschiedlichen Ebenen inhibieren. Als Zieldomänen im Hefe-zwei-Hybrid-System wurden die Dimerisierungs- bzw. die DNA-Bindedomäne von Stat3 verwendet. Nach der erfolgreichen Identifikation von Peptid-Aptameren im modifizierten Hefe-zwei-Hybrid-System war es zunächst notwendig, die spezifische Interaktion der isolierten Peptid-Aptamere mit Stat3 zu demonstrieren. Die in vitro Interaktion der isolierten Peptid-Aptamere mit dem gesamten Stat3-Molekül wurde in Ko-Immunopräzipitationsexperimenten gezeigt. Im Folgenden bestätigte sich die spezifische Interaktion der isolierten Peptid-Aptamere mit ihren jeweiligen funktionellen Domänen von Stat3 in Hefen mittels Mating-Experimenten. In den nächsten Schritten sollte die Bioaktivität der isolierten Peptid-Aptamere bei der Inhibition des Stat3-Signalweges in verschiedenen Zellsystemen validiert werden. Zunächst konnten in Herc-Zellen, die den Stat3-Signalweg nach exogenem Stimulus (EGF) aktivieren, die molekularen Wirkungs-mechanismen, die der Inhibition des Stat3-Signalweges durch die Peptid-Aptamere zugrunde liegen, aufgeklärt werden. Durch den Einsatz eines biochemisch-molekularbiologischen Methodenrepertoires (Western Blot Analysen, Reportergen-Analysen, und Gelretardierungsexperimente) zeigte sich, dass die verschiedenen selektionierten Peptid-Aptamere mit dem Aktivierungsszenario des Stat3-Signalweges auf zwei unterschiedlichen Ebenen, der Phosphorylierung bzw. der DNA-Bindung von Stat3, interferieren. Um die mögliche Anwendung der isolierten Peptid-Aptamere als potentielle Stat3-Inhibitoren in Tumorerkrankungen zu analysieren, wurden die Untersuchungen auf Tumorzelllinien mit konstitutiv-aktivem Stat3 (murine Melanomazelllinie B16 und humane Myelomazelllinie U266) ausgeweitet. Durch die zelluläre Applikation der für die isolierten Peptid-Aptamere codierenden DNA mittels Transfektion ergaben sich erste Einblicke über den Einfluss der isolierten Peptid-Aptamere auf die transkriptionelle Aktivität von Stat3. In weiteren Untersuchungen konnte eindrucksvoll gezeigt werden, dass durch die transiente Expression eines Peptid-Aptamers (DBD-1) Apoptose in murinen Melanomazellen induziert wird. Die biologische Aktivität des DBD-1 Peptid-Aptamers wurde dann mit Hilfe einer innovativen Methode zur zellulären Applikation von potentiell wirksamen Bio-Molekülen in eukaryotische Zellen studiert. Dabei konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Methode der Proteintransduktion für die Applikation von Peptid-Aptameren etabliert werden. Durch den Einsatz der Proteintransduktion ließ sich die Funktionalität des isolierten DBD-Peptid-Aptamers nicht nur in murinen, sondern auch in humanen Stat3-abhängigen Tumorzellen verifizieren. Dabei konnte auch eine Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen der Überlebensrate von Stat3-abhängigen Tumorzellen und der Menge an applizierten Peptid-Aptamer hergestellt werden. Darüber hinaus demonstrieren weitere Ergebnisse, dass das DBD-1 Peptid-Aptamer keinen Einfluss auf die Überlebensrate von nicht-Stat3-abhängigen Tumorzellen hat, wodurch die hohe Spezifität des DBD-1 Peptid-Aptamers bestätigt wird. Zusätzlich zu diesen funktionellen Analysen konnte der durch das Peptid-Aptamer induzierte Signalweg, der die Einleitung des programmierten Selbstmordes der Stat3-abhängigen Tumorzellen auslöst, charakterisiert werden. Die vorliegenden Daten zeigen zudem die Funktionalität der rekombinant exprimierten Peptid-Aptamere fusioniert mit einer Proteintransduktionsdomäne in einem in vivo Tumormodell in der Maus. Für diesen tierexperimentellen Ansatz fanden B16-Tumorzellen Verwendung, die nach subkutaner Injektion in Mäusen lokale Tumore bilden. In diesem Tumormodell wurde mittels intratumorale Injektion des transduzierbaren DBD-Peptid-Aptamers ein viel versprechender, wachstumshemmender Effekt auf Tumorzellen erzielt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass Stat3 ein ideales Zielprotein für die Entwicklung neuer Tumortherapeutika ist. Dabei stellt nicht nur die Dimerisierungsdomäne, sondern auch die DNA-Bindungsdomäne ein attraktives Ziel für die Inhibition des Transkriptionsfaktors Stat3 dar. Die viel versprechenden Daten sowohl an Tumorzellen als auch im Gesamtorganismus des Maustumormodells, verbunden mit der hier herausgearbeiteten innovativen Applikationstechnik, lassen auf einen Einsatz der isolierten Peptid-Aptamere in der Tumortherapie hoffen. Zudem eröffnen die Daten zur Protein-transduktion von Peptid-Aptameren neue Perspektiven für die Applikation von Bio-Molekülen mittels „Protein-Therapie“ in der molekularen Bio-Medizin.
Das peroxsimale Enzym Katalase wird durch Blaulichtabsorption der prosthetischen Häm- Gruppe im sichtbaren Licht und in Anwesenheit von Sauerstoff in vitro und in vivo inaktiviert. Unter physiologischen Bedingungen wird das inaktivierte Enzym in vivo durch Neusynthese ersetzt. Ist der Proteinbiosyntheseapparat jedoch durch zusätzliche Stressoren wie z. B. Kälte gehemmt, kommt es zu einem Verlust von Katalaseaktivität im Blatt. Alpenpflanzen sind an ihrem natürlichen Standort sowohl hohen Lichtintensitäten, als auch niedrigen Temperaturen ausgesetzt. Streb et al. (1997) identifizierten in Blättern der Alpenpflanze Homogyne alpina eine lichtstabile Katalase. Nach Isolierung von Katalase-cDNAs der Alpenpflanzen Soldanella alpina und Homogyne alpina, sowie der Flachlandpflanze Secale cereale (durchgeführt und zu Verfügung gestellt von M. Schmidt, Universität Frankfurt) sollten diese heterolog exprimiert und auf Lichtstabilität untersucht werden. In Hefen gelang es jedoch nicht, pflanzliche Katalasen funktionell zu exprimieren. Daher wurde die heterologe Katalase-Expression im Baculovirussystem durchgeführt. Nach Infektion von Spodoptera frugiperda Insektenzellen mit rekombinantem Baculovirus, der die jeweilige Katalase-cDNA-Sequenz enthielt, gelang es, aktive pflanzliche Katalasen zu extrahieren. Die rekombinanten Katalasen von Soldanella alpina und Secale cereale waren, ebenso wie die aus Blättern gereinigten Enzyme, lichtsensibel. Die rekombinante Katalase der Alpenpflanze Homogyne alpina war dagegen lichtstabil. Die Ermittlung der Michaelis- Menten-Kinetiken, der peroxidatischen Aktivitäten und der Empfindlichkeit gegen Inhibitoren der lichtsensiblen und lichtstabilen Katalasen ergaben, dass sich die Katalasen in ihren katalytischen Eigenschaften nicht wesentlich voneinander unterschieden. Lediglich die spezifische Aktivität der rekombinanten lichtstabilen Katalase von Homogyne alpina war signifikant herabgesetzt. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz der Katalase von Homogyne alpina mit Katalasesequenzen anderer mono- und dikotyler Pflanzen und Rinderleberkatalase zeigte sechs auffällige Aminosäuresubstitutionen in stark konservierten Bereichen: Val124Thr, Leu135Ile, Leu189Trp, Gly206Ser, His225Thr und Lys291Met. An einer computergestützten Darstellung des Modells einer 3dimensionalen Katalaseuntereinheit der lichtstabilen Katalaseuntereinheit von Homogyne alpina ist zu sehen, dass die auffälligen Aminosäuresubstitutionen in einer Region am Eingang eines seitlichen Kanals, der zum Reaktionszentrum führt, lokalisiert sind. Diese Region repräsentiert bei tierischen Katalasen eine NADPH-Bindungsstelle. NADPH schützt Rinderleberkatalase, im Gegensatz zu den rekombinanten pflanzlichen Katalasen von Secale cereale und Homogyne alpina, komplett vor der Inaktivierung durch Superoxid und partiell vor Starklichtinaktivierung. Der NADPH-vermittelte Schutz der Rinderleberkatalase ist auf eine spezifische NADPH-Bindung zurückzuführen. Die in dieser Arbeit untersuchten Katalasen von Secale cereale und Homogyne alpina binden NADPH nicht. Die aus Blättern isolierte lichtsensible Katalase von Secale cereale wird durch Superoxid nicht inaktiviert, die rekombinante lichtstabile Katalase von Homogyne alpina dagegen schon. Daher liegt der oxidativen Photoinaktivierung ein anderer Mechanismus zu Grunde, als der Superoxid-vermittelten Katalaseinaktivierung. Die Aminosäuresequenz von CATA3 von Helianthus annuus zeigte die gleichen auffälligen Aminosäuresubstitutionen wie CAT-1 von Homogyne alpina. Heterologe Expression von CATA3 mit anschließender Lichtinkubation ergab, dass CATA3, ebenso wie CAT-1 von Homogyne alpina, lichtstabil ist. In Blättern von Helianthus annuus sind Katalasen mit erhöhter Lichtstabilität als semikristalline Einschlüsse, sogenannten Cores, organisiert. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass in den Peroxisomen von Homogyne alpina-Blättern ebenfalls Cores vorhanden sind. Während der Lichtinaktivierung von Katalasen soll die Oxidation von Histidinresten ausgelöst werden. Daher ist die bei den lichtstabilen Katalasen vorkommende Aminosäuresubstitution von His zu Thr (Pos. 225) in einer bei eukaryotischen Katalasen konservierten Region besonders auffällig. Deshalb wurde bei der lichtsensiblen Katalase von Soldanella alpina durch in vitro Mutagenese das His225 durch ein Thr ersetzt. Die mutagenisierte Katalase von Soldanella alpina war noch lichtempfindlicher, als das nichtmutagenisierte rekombinante Emzym. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Region um das His225 eine wichtige Rolle für die Lichtstabilität bzw. –empfindlichkeit von pflanzlichen Katalasen einzunehmen scheint; die His225Thr Substitution ist allerdings nicht alleine für die Lichtstabilität ausreichend.
In der Stratosphäre finden eine Reihe von dynamischen und chemischen Prozessen statt, die u.a. den Abbau von Ozon beeinflussen. Um die langfristigen Veränderungen in der Stratosphäre untersuchen zu können müssen die Abhängigkeit dieser Prozesse von Raum und Zeit bekannt sein. In dieser Arbeit wird eine Untersuchung zur Variabilität der Stratosphäre auf der Grundlage der Varianz von Tracern, die in Form der „Equivalent Displacement Height“, kurz: EDH, dargestellt wird, vorgestellt. Die EDH ist tue mit Hilfe des lokalen vertikalen Gradienten normierte lokale Standardabweichung des Mischungsverhältnisses eines Tracers und besitzt die Dimension einer Länge. Durch die Normierung kann die Varianz verschiedener Tracer miteinander verglichen werden. Mit dem Konzept ist allerdings nur die Diagnose der Variabilität möglich und keine Quantifizierung der dafür verantwortlichen Prozesse. Für die Fragestellung werden drei Datensätze ausgewertet. Ein Datensatz ist mit Hilfe eines kryogenen Luftprobensammlers entstanden. Die Berechnungen iii dieser Arbeit zeigen, dass die zeitliche und räumliche Abdeckung dieses Datensatzes zu niedrig ist, um mit ihm eine repräsentative Aussage über die Varianz von Spurengasen in der Stratosphäre treffen zu können. Eine bessere zeitliche und räumliche Abdeckung besitzt der Datensatz des Satellitenexperimentes HA-LOE. Dieser wird dazu verwendet die monatlichen Verteilungen der mittleren EDH von CH4 und O3 in einem Höhenbereich zwischen 19 und 50 km für einen Zeitraum von 1993 bis 2000 zu berechnen. Die mittlere EDH von OH4 besitzt über den Hemisphären jeweils einen unterschiedlichen Jahresgang. Die Diskussion zeigt, dass dieser hemisphärische Unterschied auf die verschiedenen dynamischen Bedingung in der Stratosphäre über den Hemisphären zurückgeführt werden kann, vor allem auf die Existenz eines stabileren und langlebigeren Polarwirbels in der Südhemisphäre. Im Gegensatz dazu zeigt die mittlere EDH von O3 über beiden Hemisphären einen vergleichbaren Jahresgang, mit minimalen Werten der Varianz während der Sommermonate, wenn die Ausbreitung planetarer Wellen in die Stratosphäre durch die vorherrschende Ostwindzirkulation behindert wird. Dieser Jahresgang steht in Verbindung mit den chemischen und dynamischen Prozessen bzw. der Kombination, welche die Verteilung und Varianz von O3 in der Stratosphäre kontrollieren. Eine eindeutige Trennung der einzelnen Effekte ist dabei allerdings nicht möglich. Der Datensatz des Simulationsmodell KASIMA enthält die Verteilung von CH4 und O3 mit der höchsten zeitlichen und räumliche Abdeckung aller drei Datensätze. Ein Vergleich zwischen den daraus berechneten Verteilungen der mittleren EDH beider Spurengase mit den HALOE-Daten soll helfen, die Varianz welche durch das Modell simuliert wird, mit der gemessenen zu vergleichen. Für das O3 wird eine gute Übereinstimmung zwischen der modellierten und gemessenen Varianz gefunden. Diese guten Übereinstimmungen ergeben sich für CH4 nicht. Aufgrund der unterschiedlichen chemischen Eigenschaften der beiden Tracer wird aus den Ergebnissen geschlossen, dass das Modell die chemischen Prozesse besser simuliert als den atmosphärischen Transport. Mit Hilfe von drei Fallstudien werden weitere Möglichkeiten aufgezeigt. die mit dem Konzept und den Datensätze von HALOE und KASIMA noch bestehen. In der ersten Fallstudie werden anhand der Verteilungen der EDH von CH4 aus dem März 1996 und 1997 die Auswirkungen vorm zwei unterschiedlichen meteorologischen Situation diskutiert, wobei ein eindeutiger Zusammenhang festgestellt wird. In einer zweiten Fallstudie wird der Frage nachgegangen, ob die Normierung auf den vertikalen Gradienten bei der Berechnung der EDH sinnvoll ist, da horizontale Transportprozesse in der Stratosphäre dominieren. Es wird daher zum Vergleich die „Equivalent Displacement Length (EDL)“ von CH4 berechnet, bei der eine Normierung der Varianz auf den horizontalen Gradienten erfolgt. In der dritten Fallstudie wird die Verteilung der mittleren EDH von N20, welche ebenfalls mit dem Datensatz von KASIMA berechnet worden ist, mit der von CH4 verglichen.
Für eine möglichst vollständige analytische Beschreibung werden in der statistischen Klimatologie beobachtete Klimazeitreihen als Realisation eines stochastischen Prozesses, das heißt als eine Folge von Zufallsvariablen verstanden. Die Zeitreihe soll im wesentlichen durch eine analytische Funktion der Zeit beschrieben werden können und die Beobachtung nur durch Zufallseinflüsse von dieser Funktion abweichen. Diese analytische Funktion setzt sich aus der Summe zeitlich strukturierter Komponenten zusammen, welche aus klimatologischem Blickwinkel interpretierbar erscheinen. Es werden Funktionen zugelassen, die den Jahresgang, Trends, episodische Komponenten und deren Änderung beschreiben. Die Extremereignisse sind als eine besondere weitere Komponente in die Zeitreihenanalyse aufgenommen und als von Änderungen in den Parametern der Verteilung unabhängige, extreme Werte definiert. Die Zufallseinflüsse sollen zunächst als Realisierungen unabhängiger normalverteilter Zufallsvariablen mit dem Erwartungswert Null und im Zeitablauf konstanter Varianz interpretiert werden können. In diesem Fall beschreibt die analytische Funktion der Zeit, die Summe detektierter strukturierter Komponenten, den zeitlichen Verlauf des Mittels. Ein zu einem bestimmten Zeitpunkt tatsächlich beobachteter Wert kann dann als eine mögliche Realisation einer Zufallsvariablen interpretiert werden, die der Gaußverteilung mit dem Mittelwert µ(t) zur Zeit t und konstanter Varianz genügt. Da die zugrundeliegenden Annahmen, unter Verwendung klimatologisch interpretierbarer Basisfunktionen, in der Analyse von Klimazeitreihen, die nicht die Temperatur betreffen, zumeist nicht erfüllt sind, wird in eine Verallgemeinerung des Konzepts der Zeitreihenzerlegung in einen deterministischen und einen statistischen Anteil eingeführt. Zeitlich strukturierte Änderungen werden nun in verschiedenen Verteilungsparametern frei wählbarer Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen gesucht. Die gängige Beschränkung auf die Schätzung einer zeitlich veränderlichen Lokation wird aufgehoben. Skalenschätzer sowie Schätzer fär den Formparameter spielen ebenso relevante Rollen fär die Beschreibung beobachteter Klimavariabilität. Die Klimazeitreihen werden wieder als Realisation eines Zufallprozesses verstanden, jedoch genügen die Zufallsvariablen nun einer frei wählbaren Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion. Die zeitlich strukturierten Änderungen in den Verteilungsparametern werden auf Basis der gesamten Zeitreihe für jeden Zeitpunkt geschätzt. Die aus der Analyse resultierende analytische Beschreibung in Form einer zeitabhängigen Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion ermöglicht weiterhin die Schätzung von Über- und Unterschreitungswahrscheinlichkeiten beliebig wählbarer Schwellenwerte für jeden Zeitpunkt des Beobachtungszeitraums. Diese Methode erlaubt insbesondere eine statistische Modellierung monatlicher Niederschlagsreihen durch die Zerlegung in einen deterministischen und einen statistischen Anteil. In dem speziellen Fall von 132 Reihen monatlicher Niederschlagssummen deutscher Stationen 1901-2000 gelingt eine vollständige analytische Beschreibung der Reihen durch ihre Interpretation als Realisation einer Gumbel-verteilten Zufallsvariablen mit variablem Lage- und Streuparameter. Auf Basis der gewonnenen analytischen Beschreibung der Reihen kann beispielsweise im Westen Deutschlands auf Verschiebungen der jährlichen Überschreitungsmaxima des 95%-Perzentils von den Sommer- in die Wintermonate geschlossen werden. Sie werden durch relativ starke Anstiege in der Überschreitungswahrscheinlichkeit (bis 10%) in den Wintermonaten und nur geringe Zunahmen oder aber Abnahmen in den Sommermonaten hervorgerufen. Dies geht mit einer Zunahme der Unterschreitungswahrscheinlichkeit in den Winter- und einer Abnahme in den Sommermonaten einher. Monte-Carlo-Simulationen zeigen, daß jahreszeitlich differenzierte Schätzungen von Änderungen im Erwartungswert, also gebräuchliche Trends, auf Basis der Kleinst-Quadrate-Methode systematischen Bias und hohe Varianz aufweisen. Eine Schätzung der Trends im Mittel auf Basis der statistischen Modellierung ist somit ebenso den Kleinst-Quadrate-Schätzern vorzuziehen. Hinsichtlich der Niederschlagsanalysen stellen jedoch aride Gebiete, mit sehr seltenen Niederschlägen zu bestimmten Jahreszeiten, die Grenze der Methode dar, denn zu diesen Zeitpunkten ist eine vertrauenswürdige Schätzung einer Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion nicht möglich. In solchen Fällen ist eine grundsätzlich andere Herangehensweise zur Modellierung der Reihen erforderlich.
Ziel der vorliegenden Arbeit war, Arzneistoffformulierungen, wie kationische Nanopartikel, Liposomen und virale Hüllkapside, für den Transport von Antisense-Oligonukleotiden in Zellen zu untersuchen. Der Schwerpunkt lag hierbei auf der in vitro Testung in der Zellkultur. Als Zielstruktur wurde der NMDA-Rezeptor gewählt, dessen Expression durch die Gabe von Antisense-Oligonukleotiden gehemmt wurde. Testobjekt waren murine Fibroblasten, die in einer Vorgängerarbeit von Ralf Steinmetz mit der cDNA für die entsprechenden NMDA-Rezeptorsubtypen transfiziert worden sind und deren Eignung für die Testung von Rezeptorantagonisten schon gezeigt worden ist. Beim NMDA-Rezeptor handelt es sich um einen ligandgesteuerten Ionenkanal, der normalerweise nur in neuronalem Gewebe zu finden ist. Eine Überexpression und anschließende Stimulation des Rezeptors führt über einen massiven Ca2+-Einstrom zum Absterben der Zellen. Dieses Modell erlaubte die Auswertung der Antisense-Wirkung in einem funktionellen Assay über ein reduziertes Absterbeverhalten der Zellen. Die spezifischen Reduktion des Zielproteins wurde mittels Western-Blot-Technik gezeigt. Alle eingesetzten Trägersysteme wurden hinsichtilich ihrer physiko-chemischen Eigenschaften untersucht. Im Mittelpunkt standen dabei die Bestimmung von Größe und Oberflächenladung (Zetapotential), die mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung (DLS) bestimmt wurden. Der Schwerpunkt bei der Untersuchung der Drug-Delivery-Systeme lag auf den biodegradierbaren Nanopartikeln auf Basis von Protamin. Im Anschluß an diese physikochemische Charakterisierung wurden diese Partikel in der Zellkultur im Vergleich zu freien, d.h. nicht an ein Trägersystem gebundenen, und zu liposomal (DOTAP) verpackten Oligonukleotiden getestet. Es zeigt sich, dass die Albumin-Protamin-Oligokukleotid-Formulierung gegenüber den freien Oligonukleotiden eine um den Faktor 12 verbesserte zelluläre Aufnahme aufweisen, was mit der liposomen Formulierung vergleichbar ist. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scan-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass 100 % der Zellen transfiziert worden sind. Es wurde sowohl im funktionellen Modell über Zelltod, als auch auf Proteinebene (Western-Blot) eine Reduktion des NMDA-Rezeptors von etwa 35 % 24 Stunden nach der Gabe des Oligonukleotide gefunden. Dieses Ergebnis spricht für eine intrazelluläre Freigabe der Oligonukleotide aus den Partikeln. Im Gegensatz zur liposomalen Zubereitung wurden keine zytotoxischen Nebenwirkungen der Nanopartikel gefunden. In einem abschließenden Vergleich wurden rekombinant hergestellte virale Hüllkapside (VP1 Kapside), zwei kationische liposomale Zubereitungen (DOTAP/Lipofectin), zwei kationische Alkylcyanoacrylat Nanopartikelpräparationen (PBCA/PHCA) und zwei auf Protamin basierende Nanopartikelsystme (mit/ohne Albumin-Zusatz) in der Zellkultur getestet. Untersucht wurde die Transfereffizienz für Oligonukleotide mittels einer Fluoreszenzmethode, die intrazelluäre Verteilung wurde im konfokalen Laser-Scan-Mikroskop dargestellt, es wurde eine Antisense-Wirkung im Vergleich zu einer Kontrollsequenz bestimmt (sowohl im funktionellen System, als auch im Western-Blot) und es wurden die zytotoxischen Nebenwirkungen betrachtet. Zusammenfassend ergaben diese Ergebnisse eine um das 2- bis 18-fache Erhöhung der Zellaufnahme im Vergleich zu freien Oligonukleotiden. Die protamin-basierten Nanopartikel zeigten keine nennenswerten zytotoxischen Nebenwirkungen.
Anthropogene Landnutzung in ariden Savannen verändert die strukturelle Diversität der Vegetation und bedroht damit die Artenvielfalt der Flora und Fauna von etwa 20% der Landoberfläche der Erde. Ziel meiner Dissertation war es, den Einfluss von Landnutzung auf die Abundanz und Diversität von Kleinkarnivoren und ihrer Beutetiere zu untersuchen. Dabei sollten Bioindikatoren identifiziert werden, die eine Einschätzung der Diversität im Farmmosaik der südlichen Kalahari ermöglichen. Entlang eines Weideintensitätsgradienten analysierte ich mit Hilfe freilandökologischer Methoden die komplexen Zusammenhänge zwischen Beweidungsintensität, struktureller Diversität der Vegetation, Beuteverfügbarkeit und Diversität von Kleinkarnivoren. Nach den Ergebnissen dieser Studie in der südlichen Kalahari kann ich folgende Aussagen über die anthropogene Störung der Integrität von ariden Savannensystemen durch Beweidung treffen: 1. Eine Steigerung der Bestockungsdichten von Weidetieren führte zu drastischen Veränderungen der Zusammensetzung und strukturellen Diversität der Vegetation. Dabei sank mit zunehmendem Beweidungsdruck der Anteil an Gräsern an der Vegetationsbedeckung bei gleichzeitigem Anstieg der Strauchvegetation. Die Heterogenität des Habitats, gemessen in Anzahl von Strauchpatches (ø>4m) pro Hektar, zeigte einen unimodalen Verlauf bei steigender Strauchbedeckung und damit bei steigender Weideintensität. Maximale Habitatheterogenität wurde bei einer Strauchbedeckung von ca. 20% festgestellt. 2. Die beobachteten Veränderungen der Vegetation wirkten sich sowohl auf Tierarten aus, die sich direkt von pflanzlicher Kost ernähren als auch auf solche am Ende einer Nahrungskette: Die Effekte zunehmender Strauchbedeckung (und damit steigender Beweidungsintensität) auf die relative Häufigkeit der wichtigsten Beutetiere von Kleinkarnivoren unterschieden sich zwischen den einzelnen Gruppen. Es bestand eine lineare negative Korrelation für Orthopteren, während unimodale Antwortmuster für Käfer mit maximaler Abundanz bei einer Strauchbedeckung von ca. 15% und für Nagetiere bei ca. 12,5% festgestellt wurden, wohingegen keine Korrelation für Termiten ermittelt werden konnte. 3. Am Beispiel der Nagetiergemeinschaft konnte die wesentliche Bedeutung der räumlichen Skala für das Auflösungsvermögen von Abundanz- und Diversitätsmuster gezeigt werden. Ihre Muster und damit die Auswirkungen von Beweidung wurden ausschließlich auf einer großen räumlichen Skala (250ha) identifiziert, nicht jedoch auf der Skala des mittleren Aktionsraums (1ha). Ein wichtiges Fazit dieser Ergebnisse ist, dass zuerst diejenige räumliche Skala identifiziert werden muss, auf der ein Organismus mit Habitatstrukturen (Z.B. geeigneten Nahrungsplätzen) interagiert, um die Effekte von Veränderungen der strukturellen Zusammensetzung von Habitaten verstehen zu können. Dabei führte steigende Grasbedeckung zu einer exponentiellen Sättigung der Gesamtabundanz sowie der Diversität der Nagetiere. Dagegen wurde bei Zunahme der Strauchbedeckung ein unimodales Muster für Gesamtabundanz und Diversität festgestellt. 4. Obwohl ein hoher Strauchanteil sich durchgehend negativ auf die Beuteverfügbarkeit auswirkte, haben Sträucher eine besondere Bedeutung für die Artenvielfalt in diesem Lebensraum, da sie als Schutz- und Nistplatz wichtige Funktionen erfüllen. Am Beispiel von Fuchsmangusten (Cynictis penicillata) konnte ich exemplarisch die zentralen Funktionen von Sträuchern und ihren Einfluss auf den Reproduktionserfolg dieser Art zeigen. Interessanterweise waren die Auswirkungen von Sträuchern inkonsistent für unterschiedliche räumliche Skalen. Im Mikrohabitat haben Strauchstrukturen positive Eigenschaften (Schutzfunktionen). Fuchsmangusten legten ihre Bauten meistens unter Sträuchern an, um ein Einstürzen durch Huftrampeln zu verhindern und ihr Prädationsrisiko durch Greifvögel zu reduzieren. Für die Anlage ihrer Reproduktionsbauten wählten sie Strauchstrukturen mit einem Durchmesser von mindestens sechs Metern (bevorzugt der Art Acacia hebeclada) und außerdem, wenn sich im Umkreis von 10 Metern kein weiterer Strauchpatch befand. Auf einer größeren räumlichen Skala (im Umfeld von einem Hektar um Reproduktionsbauten) wurden Flächen mit einer Strauchbedeckung präferiert, die geringer war, als zufällige Flächen im Habitat. Dabei wirkte sich zunehmende Strauchbedeckung auch negativ auf die Gruppengröße und den Reproduktionserfolg dieser Art aus. Für eine erfolgreiche Reproduktion bei Fuchsmangusten scheint die Strauchbedeckung im Umfeld von einem Hektar um die Reproduktionsbauten einen Schwellenwert zwischen 10 und 15% nicht überschreiten zu dürfen. Dies ist mit der sinkenden Beuteverfügbarkeit (Nagetiere und Arthropoden) bei zunehmender Strauchbedeckung zu begründen. 5. Aufgrund der dramatischen Auswirkungen von Verbuschung auf die Beuteverfügbarkeit von Kleinkarnivoren unterschieden sich die Abundanzen der einzelnen Kleinkarnivoren deutlich zwischen diesen Farmen. Die Abundanz der jeweiligen Einzelarten konnte über Regressionsmodelle mit Vegetationsparameter oder Beutetierverfügbarkeit erklärt werden. Im Gegensatz dazu war die Strauchbedeckung die beste erklärende Variable für Gesamtabundanz und Diversität der Gilde. Sie integriert habitatspezifische Eigenschaften, wie die Verfügbarkeit von vier Beutetiergruppen, die Konnektivität von Nahrungspatches mit hoher Qualität, das Prädationsrisiko durch Greifvögel sowie das Nistplatzangebot. Dabei sank mit zunehmender Strauchbedeckung die Gesamtabundanz, während für die Diversität ein unimodales Muster mit maximaler Diversität bei einer Strauchbedeckung von ca. 12,5% festgestellt wurde. Für eine Einschätzung der Diversität von Kleinkarnivoren eignet sich die Ginsterkatze (Genetta genetta) als Indikatorart. Interessanterweise war die Strauchbedeckung ein noch besserer Bioindikator für die Einschätzung der Diversität von Kleinkarnivoren. 6. Die Schlussfolgerung meiner Ergebnisse ist, dass die Diversität der Kleinkarnivoren einen Großteil der Biodiversität der Untersuchungsflächen in der südlichen Kalahari widerspiegelt. Dabei integriert die Kleinkarnivorengilde als Indikatorvariable neben der zoologischen Diversität (i) auch die strukturelle Diversität der Vegetation (ii) sowie die strukturelle Organisation im Nahrungsnetz (iii). Kleinkarnivoren erhalten dadurch einen Status einer Indikatorgilde und eignen sich damit sehr gut zur Beurteilung der südlichen Kalahari oder einer anderen Weidelandschaft arider Savannen. 7. Das für den Naturschutz wichtigste Ergebnis meiner Arbeit ist, dass höchste Diversität aller Untersuchungsorganismen bei einer Strauchbedeckung zwischen 10 und 15%, also einer mittleren Beweidungsintensität von ca. 3,5 LSU/ l00ha, festgestellt wurde. Daher wirken sich mäßige Bestockungsdichten durchaus positiv auf die Diversität aus, während eine Überbeweidung einen dramatischen Rückgang der Artenvielfalt in diesem Lebensraum verursacht.
Die in der Zwischenzeit erreichten guten Erfolge bei der Herztransplantation in Bezug auf die operative und früh postoperative Letalität werden durch die nach wie vor recht ungünstige Langzeitüberlebensrate relativiert. Als Ursache für das „chronische Transplantatversagen“ konnte die Transplantatvaskulopathie ausgemacht werden. Ihr morphologisches Korrelat ist eine konzentrische Intimaproliferation, die im Gegensatz zur Arteriosklerose häufig diffus auftritt und auch distal die kleinsten Koronararterien betrifft. Die Ursache dieser häufig zum Organverlust führenden, Veränderung der Koronargefäße ist nach wie vor nicht vollständig geklärt. Eine Theorie geht von einer chronischen, von zytotoxischen T-Zellen vermittelten Endothelialitis aus. In unserer Untersuchung, die ein Tiermodell verwendet, in dem es nicht zu einer akuten sondern nur zu einer chronischen Organabstoßung kommt, konnten verschiedene T-Lymphozyten assoziierte Rezeptoren in ihrem zeitlichen Verlauf nachgewiesen werden. LFA-2, CD 4, CD8 und CD 49d fallen durch einen Anstieg in der frühen Phase post transplantationem besonders auf. Durch eine Immunsuppression mit Cyclosporin A wird dieser initiale Anstieg deutlich gemindert. VLA-4 ( CD 49d ) wird ebenfalls in den ersten 20 Tagen unter Immunsuppression signifikant weniger exprimiert; Dann allerdings kommt es zu einem Anstieg auf das Niveau der unbehandelten Gruppe. Eine durch VLA-4 vermittelte Immunreaktion könnte als Kofaktor einer die konzentrische Intimaproliferation unterhaltende Endothelialitis angesehen werden. Hier sehen wir einen Ansatz für weitere Studien.
Die thrombotisch thrombozytopenische Purpura (TTP) ist ein schweres, heterogenes Syndrom, bei welchem es zu einer lebensbedrohlichen, disseminierten Mikrothrombosierung in den arteriellen Kapillaren kommt. Bei Patienten mit TTP wurde 1997 erstmalig ein Mangel an der Von Willebrand Faktor (VWF)-spaltenden Protease entdeckt. Diese Protease wurde 2001 als ein neues Mitglied der "a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs"-Familie identifiziert und als ADAMTS-13 bezeichnet. Der ADAMTS-13-Mangel soll eine Anreicherung großer VWF-Multimere verursachen, welche für die pathologische Thrombenbildung bei Patienten mit TTP verantwortlich gemacht wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität entwickelt. Mittels des neuen Verfahrens wurde die Bedeutung von ADAMTS-13 in der Pathophysiologie der erworbenen TTP und in der Genese anderer Erkrankungen untersucht. Bei der hier entwickelten Methode wird eine beliebige Testprobe mit einem ADAMTS-13-freien VWF-Substrat versetzt und nach entsprechender Inkubation die ADAMTS-13-Aktivität ermittelt, indem der Abfall der VWF-vermittelten Aggregation von Thrombozyten gemessen wird. Das neuartige Verfahren zeigt eine gute Reproduzierbarkeit und wurde durch extensiven Vergleich mit der herkömmlichen Immunoblotting-Methode validiert. Zudem wurde die Richtigkeit der Methode durch erfolgreiche Teilnahme an einer internationalen Multicenterstudie bestätigt. Die neue Methode ist im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren im klinisch-diagnostischen Routinelabor anwendbar, da das Verfahren auf der Verwendung eines routineerprobten, automatisierten Testes zur Bestimmung der VWF:Ristocetin-Kofaktor-Aktivität beruht. Der Test ist bei hohem Probendurchsatz schnell und einfach durchführbar und benötigt keine spezielle Laborausrüstung oder besondere Expertise. In den untersuchten Patientenkollektiven war der schwere ADAMTS-13-Mangel mit einer Spezifität von 100% und einer Sensitivität von 89% mit einer akuten TTP korreliert. Bei 85% der Plasmaproben mit hochgradig erniedrigter ADAMTS-13-Aktivität konnte in vitro eine inhibitorische Aktivität gegen ADAMTS-13 detektiert werden. Die Plasmapherese-Therapie (PP-Therapie) führte in 75% der untersuchten TTP-Episoden zu einer letztendlichen Eliminierung des Inhibitors mit einer korrespondierenden Erhöhung der ADAMTS-13-Aktivität. Der Anstieg der ADAMTS-13-Aktivität war in diesen Fällen eng mit dem Anstieg der Thrombozyten assoziert. In 15% der untersuchten Episoden führte die PP-Therapie zu einer Erniedrigung des Inhibitortiters ohne messbare Rekonstitution der ADAMTS-13-Aktivität. Bei 10% der untersuchten Episoden kam es unter PP-Therapie zu einem permanenten Anstieg des Inhibitortiters. Trotz fehlender Rekonstitution der ADAMTS-13-Aktivität in den letztgenannten Fällen induzierte die PP-Therapie eine klinische Remission. Zwei Patienten zeigten nach Splenektomie bzw. Rituximab-Gabe ohne nachweisbare Rekonstitution der ADAMTS-13-Aktivität ebenfalls eine konsistente, klinische Remission. Die Ergebnisse zeigen, dass die in vitro gemessene ADAMTS-13-Aktivität die pathophysiologisch wirksamen Prozesse der akuten TTP nicht immer eindeutig erklären. Dies weist auf bislang unentdeckte pathogene Mechanismen hin. Zudem könnten die derzeit gängigen Methoden zur Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität (einschließlich des hier entwickelten Verfahrens) die tatsächliche in vivo VWF-Proteolyse durch ADAMTS-13 nicht ausreichend widerspiegeln. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein ADAMTS-13-Mangel als ein Risikofaktor, und nicht als der alleinige Auslöser, für die akute TTP betrachtet werden sollte. Die Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität bei den unterschiedlichsten hämatologischen Erkrankungen offenbarte eine moderat erniedrigte ADAMTS-13-Aktivität in einer Vielzahl von schweren, zumeist intensivpflichtigen Erkrankungen. Bei einigen Patienten konnte nachgewiesen werden, dass sich die ADAMTS-13-Aktivität in Remission normalisiert. Daraus lässt sich möglicherweise vermuten, dass sich die ADAMTS-13-Aktivität generell bei einer Akut-Phasen-Reaktion erniedrigt. Die Untersuchungen der ADAMTS-13-Aktivität bei Patienten mit malignen Erkrankungen zeigte bei 21% der getesteten Patienten einen milden ADAMTS-13 Mangel. Bei den untersuchten Patienten mit Hirn- und Prostatatumoren konnte, im Gegensatz zu vorhergehenden Studien mit anderen Tumortypen, keine Korrelation zwischen erniedrigter ADAMTS-13-Aktivität und dem Grad der Malignität bzw. der Dissemination des Tumors gefunden werden. Die Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität bei einem umfangreichen Patientenkollektiv mit thromboembolischen Erkrankungen zeigte, dass der ADAMTS-13 Mangel kein häufig vorkommender Risikofaktor für das Auftreten von arteriellen oder venösen Thrombosen darstellt. In der vorliegenden Studie wurde jedoch der weltweit erste Fall eines milden, congenitalen ADAMTS-13 Mangels bei einer Patientin mit familiären, rezidivierenden, ischämischen Schlaganfällen gefunden. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung der VWF-spaltenden Proteaseaktivität von ADAMTS-13 entwickelt, welchem durch seine klinische Anwendbarkeit in Zukunft eine weitreichende Bedeutung zufallen könnte. Die klinischen Studien dieser Arbeit belegen zum einen den Zusammenhang zwischen ADAMTS-13 und TTP und weisen zum anderen auf andere bislang nicht identifizierte Mechanismen hin, welche das klinische Bild der TTP determinieren. Des weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass ADAMTS-13 neben einer Beteiligung an der Akut-Phasen-Reaktion, eine möglicherweise sehr bedeutsame Rolle bei malignen und thromboembolischen Erkrankungen spielt. Dies sollte in zukünftigen Studien, insbesondere im Hinblick auf neuartige therapeutische Möglichkeiten durch die Gabe von ADAMTS-13, näher untersucht werden.
Es wurden die Herstellung von protaminbasierten Oligonukleotid-Nanopartikel („binäres System“) physikochemisch charakterisiert. Vermischt man Oligonukleotide mit einer wässrigen Protaminlösung entstehen nach wenigen Sekunden sehr kleine Partikel (<20 nm). Der Partikeldurchmesser nimmt mit der Zeit zu und stabilisiert sich nach etwa 30 Minuten. Danach sind die NP für mindestens 24 Stunden bei Raumtemperatur stabil. Die Größe, die Größenverteilung und die Gestalt der Partikel wurden bestimmt. Diese runden Partikel konnten in ihrer Größe durch die Veränderung von Protamin- und ON-Konzentration in ihrer Größe gesteuert werden (etwa 100-1000 nm Durchmesser). Die Veränderung der Kettenlänge der Oligonukleotide (10-25 mer) zeigte einen nur geringen Einfluss auf die Größe und Größenverteilung der Partikel. Auch konnte die Oberflächenladung (Zetapotential) der Partikel durch die Veränderung des Protamin/OligonukleotidVerhältnisses gesteuert werden. Analytische Ultrazentrifugations-Messungen (durchgeführt vom AK Prof. Schubert) mit diesen Partikeln zeigte das diese schon in geringen Salzkonzentrationen (15 mM NaCl) nach wenigen Minuten zur Aggregation neigen. Diese konnte durch 15% Polyethylenglykol 20.000 Lösung gestoppt werden. Dies war ein wichtiger Hinweis, dass man mittels Makromolekülen die Partikelpräparationen stabilisieren kann. Ferner wurde die Zusammensetzung der Partikel, sowohl hinsichtlich der Oligonukleotide und als auch des Protamingehaltes bestimmt. Mehr als 90% des Wirkstoffes konnte in die Nanopartikel eingebunden werden. Da das von uns verwendete Protamin keine aromatische Aminosäure beinhaltet (Absorptionsmaximum kleiner 200 nm) und die Standard-Proteinnachweise wie z.B. BCA-Assay nur ungenügende Nachweisgrenzen aufweisen, wurde eine neue Protamin-Quantifizierungmethode mittels ortho-Phthaldialdehyd (OPA) und N-Acetyl-L-Cystein (NAC) für die Mikrotiterplatten erarbeitet. Damit war es möglich, auch in Anwesenheit von DNA, Protamin und Protaminsalze in einer Konzentration von 250 ng/ml sicher nachzuweisen. Ein weiteres Problem mit diesem binären Partikelsystem, neben der Aggregationsneigung, zeigte sich in verschiedenen Zellmodellen (durchgeführt von Norbert Dinauer, AK von Briesen). Die Partikel wurden zwar im großen Maße von humanen Macrophagen, humanen T-Zellen aufgenommen, aber danach langsam freigegeben. Auch wurden intrazellulär Aggregate gefunden. Humanes Serum Albumin (HSA) zeigte einen positiven Effekt auf die Aggregationsneigung (AlPrO-Nanopartikel). Es fungiert hierbei als ein Schutzkolloid, welches nur zu einem geringen Teil in die Partikelmatrix inkorporiert wird (<10%). Der Großteil des HSA befindet sich in der äußeren wässrigen Phase. Es ist zu vermuten dass es sterische die Partikel an der Sekundäraggregation hindert. Zusätzlich konnten primäre Komplexe vor der Zugabe von HSA aus HSA und Protamin beobachtet werden (Durchmesser 14 nm). Dies führt zu einem veränderten Self-Assembly der Nanopartikel gegenüber dem binären System. AlPrO-Partikel, hergestellt mit 1 mg/ml HSA, waren über Stunden stabilisiert in Zellmedium. Sie sind von runder Gestallt und 200-350 nm im Durchmesser groß. Sie weisen eine leicht negative Oberflächenladung auf, was auf eine Abdeckung der Partikeloberfläche mit HSA hinweist. Nahezu die gesamte eingesetzte Menge des Oligonukleotides wurde in die Partikelmatrix inkorporiert (> 90%). Es war möglich Partikel dieser Qualität mit unmodifizierten-, phosphorothioat modifizierten Oligonukleotiden und doppelsträngiger RNA (siRNA) herzustellen. Die von uns entwickelten AlPrO-Nanopartikel stellen eine neue Möglichkeit der peptidbasierte Transfektion von Oligonukleotiden in Zellen dar.
Kompakte Sterne stellen neben weissen Zwergen und schwarzen Löchern eine der möglichen Endzustände der Evolution von Sonnen dar. Diese extrem dichten astrophysikalischen Objekte können als Restobjekte von massiven Sternen im Zentrum von Supernova-Explosionen entstehen. Allein in unserer Galaxie sind derzeit ca. 1500 solcher Objekte bekannt. Die Materie innerhalb der kompakten Sterne stellt neben der frühen Urknall-Phase, die dichteste, uns zugängliche Energieform im gesamten Universum dar; sie beschreibt den letzten stabilen Zustand bevor die Materie unaufhaltsam kollabiert und durch die Bildung eines Ereignishorizontes von der Aussenwelt abgetrennt wird. Die Eigenschaften der kompakten Sterne werden massgeblich durch zwei fundamentale Kräfte bestimmt: Die Quanten-Chromodynamik (QCD), die den Kräfteaustausch der elementaren Quarks durch farbgeladene Gluonen beschreibt, und die Allgemeine Relativitätstheorie, die die attraktive, gravitative Wechselwirkung der Sterne durch eine Verformung ihrer raumzeitlichen Struktur formuliert. In den ersten beiden Kapiteln der vorliegenden Arbeit wird zunächst die derzeitige Theorie der elementaren Wechselwirkungen mittels einer eichtheoretischen Formulierung beschrieben. Astrophysikalische Folgerungen der Allgemeinen Relativitätstheorie, wie die Raumzeitkrümmung innerhalb und ausserhalb kompakter Sterne und die Theorie schwarzer Löcher werden im Detail diskutiert und mittels dreidimensionaler Diagramme veranschaulicht. Im dritten Kapitel werden die numerisch erhaltenen Resultate der Eigenschaften der kompakten Sterne zusammengefasst und in folgende Gruppen untergliedert: Neutronensterne, Quarksterne, hybride Sterne und Zwillingssterne. Die mögliche Realisierung des Quark-Gluon-Plasmas im Inneren der kompakten Sterne wird diskutiert. Anhand von existierenden und zukünftig geplanten astrophysikalischen Beobachtungsmöglichkeiten (z.B. Gravitationswellendetektoren) wird die experimentelle Überprüfbarkeit der dargestellten Ergebnisse aufgezeigt.
Im Laufe der letzten Jahre hat sich die Aufmerksamkeit auf die Entwicklung von neuen RNA-bindenden Molekülen gerichtet. Grund dafür waren neue Erkenntnisse über die strukturelle und funktionelle Komplexität der RNA. So spielen spezifische RNA-Protein-Wechselwirkungen eine essentielle Rolle bei regulatorischen Prozessen. Die Spezifität dieser Interaktionen wird durch die dreidimensionale RNA-Struktur bestimmt. Somit bieten diese Wechselwirkungen ein attraktives Angriffsziel für die Suche nach niedermolekularen Substanzen, die in die regulatorischen Prozesse pathogener Organismen eingreifen. So gibt es im Replikationszyklus des HI-Virus mehrere essentielle Schritte, die der Interaktion zwischen charakteristischen, viralen RNA-Strukturen und der viralen Proteine bedürfen. Ein prominentes Beispiel ist die Verpackung der viralen RNA. Es handelt sich um einen hochspezifischen Prozess, bei dem aus einer Vielzahl von zellulären, viralen, gespleißten und ungespleißten RNA-Fragmenten, spezifisch die virale genomische RNA in die neu entstehende Partikel verpackt wird. Die Spezifität der Verpackung basiert auf der Erkennung der dreidimensionalen ps-Verpackungsstruktur am 5´-Ende der ungespleißten, viralen RNA durch die NCp7-Domäne des p55Gag- Vorläuferproteins. Die NCp7-Domäne ist durch zwei Zinkfingermotive, die in allen Onko- und Lentiviren mit Ausnahme der Spumaviren konserviert sind, gekennzeichnet. Durch die zentrale Rolle im HIV-1 Replikationszyklus bietet die ps-NCp7-Interaktion ein potentielles Angriffziel für antivirale Interventionen. Das langfristige Ziel des Projektes war die Identifizierung von Peptidliganden für das HIV-1 ps-Signal mittels der Phage-Display-Methode, welche die Basis für die Entwicklung antiviraler Moleküle liefern sollen. Die Methode des Phage-Display basiert auf der Affinitätsselektion von Peptiden, die als Fusionsproteine mit dem Hüllprotein an der Oberfläche eines Bakteriophagen exprimiert werden. Sie wurde sehr erfolgreich für die Selektion von Peptidliganden für Antikörper oder andere Proteindomänen eingesetzt. Für RNA-Targets gibt es nur gelegentliche Hinweise. Im Vordergrund des Projektes standen strukturelle Erkennungsmerkmale der Ligand-RNAWechselwirkung. Zur Identifizierung von Peptidliganden für das ps-Verpackungssignal sowie deren Teilelement SL3, das ebenfalls Verpackungsaktivitäten aufweist, wurden kommerzielle Phagen-Banken mit zufälliger Aminosäuresequenz eingesetzt. Im Rahmen des ersten Teilabschnitts konnten Phagen selektiert werden, die spezifisch an die Targetstrukturen gebunden haben und die Grundlage für die Ableitung von Peptidmotiven bildeten. Insgesamt konnten neun Motive abgeleitet werden, darunter das tryptophanreiche HXWPWW-Motiv, das Aminosäurehomologien zum nativen Liganden, dem NCp7-Protein, zeigte. Die Spezifität zur Ziel-RNA wurde mittels ELISA, CD-Spektroskopie und Peptidfilter-Bindungsstudien analysiert. Für die tryptophanreichen Peptide wurde die Affinität zur ps- und SL3-RNA ermittelt. Sie lag für das HWWPWWPeptid bei ca. 25 ± 2µM zur ps-RNA und bei ca. 34 ± 2µM zur SL3, also deutlich unter der Affinität des NCp7 (ca. 30nM). Entsprechend ließ sich das HWWPWW-Peptid in einem Kompetitions-ELISA mit ps-RNA als Target durch das native p55Gag- und NCp7-Protein, jedoch nicht durch ein unrelevantes RNA-bindendes Protein, verdrängen. Anschließend wurden mittels der CDspektroskopischen Mutationsanalyse die Bindungseigenschaften der Peptide optimiert, so dass zwei weitere Liganden, das HWWAWW- und HAWPWWPeptid, als potentielle ps-Liganden ermittelt werden konnten. Im zweiten Teil der Arbeit erfolgte die funktionelle Analyse der identifizierten Peptide hinsichtlich ihrer inhibitorischen Eigenschaften. Dazu wurden in HR´YFP-Zellen Pseudoviren, die das verpackbare Konstrukt ps-Yfp, sowie HIV-1 Gag-Pol und das Env des VSV-G enthielten, in Gegenwart des ps-bindenden Peptides, das als Rfp-Vpr-Fusionprotein vorlag, generiert. Eine Hemmung der Peptide auf die Verpackung der viralen RNA sollte dadurch messbar sein, dass die produzierten Pseudoviren weniger von der verpackbaren ps-Yfp-RNA enthielten als die Kontrollviren, die in Gegenwart eines Kontrollpeptids generiert wurden. Die Menge der Virus-RNA in den Partikeln wurde mittels einer quantitativen PCR-Methode, der Real-time-PCR, bestimmt. Einen hemmenden Einfluss auf die Verpackung der ps-Yfp-RNA und somit eine Inhibition der ps-NCp7-Interaktion hatte das HWWAWW-Peptid. Durch den Einsatz von 3 µg der HWWAWW-Rfp-Vpr-Vektors konnte die RNA-Menge um das fast 4000-fache im Vergleich zum Kontrollansatz reduziert werden.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung, inwieweit sich die Expression bestimmter Oberflächenmerkmale auf Lymphozyten im peripheren Blut nach einer Transplantation im Rahmen der chronischen Abstoßungsreaktion verändert. Dazu wurde ein etabliertes Modell zur chronischen Abstoßung mit zwei sich genetisch nur gering differierenden Rattenspezies verwendet. Dabei wurden Herzen von Lewis-Ratten heterotop auf Fischer 344-Ratten transplantiert. Die Untersuchung wurde vergleichend unter der immunsuppressiven Behandlung von Cyclosporin A (CsA), Tacrolimus (FK-506) und Mycophenolate mofetil (MMF) sowie einer unbehandelten Gruppe durchgeführt. Über den Zeitraum von 60 Tagen wurden die Oberflächenmerkmale mit durchflusszytometrischen Messungen bestimmt.
Die intensiven gekühlten Schwerionenstrahlen des ESR-Speicherrings in Kombination mit dem dort installierten Überschallgastarget bieten einzigartige Möglichkeiten, Elektroneneinfangprozesse bei unterschiedlichen Projektilenergien zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Emission der charakteristischen Balmerstrahlung detailliert nach (n, j)-Zuständen untersucht; die Lyman-alpha-Strahlung konnte aufgrund der großen Feinstrukturaufspaltung des 2p3/2-Niveaus darüber hinaus auch nach der Besetzung der magnetischen Unterzustände untersucht werden. Hierbei wurde gezeigt, dass der Einfangmechanismus einen starken Einfluss auf die Besetzung der magnetischen Unterzustände und damit auf die Winkelabhängigkeit der Emission der charakteristischen Photonen hat. Erstmals konnte an einem schweren Stoßsystem die Multipolmischung beim Ly-alpha1-Übergang mit großer Genauigkeit nachgewiesen werden; es ergab sich eine sehr gute Übereinstimmung mit der theoretischen Vorhersage. Aus dem Vergleich der Messung der Anisotropie bei höheren Energien mit der Vorhersage einer relativistisch exakten Theorie wurde geschlossen, dass die Messwerte nur dann erklärt werden können, wenn die Mischung von E1- und M2-Übergängen berücksichtigt wird. Durch den Vergleich der als zuverlässig anzusehenden Vorhersage für den REC-Prozeß mit den Messwerten konnte, erstmals für atomare Übergänge in Schwerionen, die Beeinflussung der messbaren Anisotropie durch Mischung der Strahlung unterschiedlicher Multipolaritäten aufgedeckt werden. Hiermit war es möglich, das Übergangsratenverhältnis Gamma M2 / Gamma E1 und daraus das Übergangsamplitudenverhältnis <M2>/<E1> zu extrahieren. Dieser kleine Beitrag(<1%) ist mit anderen Methoden nicht zu vermessen. Die beiden nichtrelativistischen Theorien, den nichtradiativen Einfang in das Projektil beschreiben, liefern bei den totalen Einfangswirkungsquerschnitten nahezu gleiche Ergebnisse in Übereinstimmung mit dem Experiment. Auch die (n, j)-differentiellen Querschnitte zeigen bei dem Vergleich mit den gemessenen Balmerspektren eine sehr gute Übereinstimmung. Erst wenn die magnetischen Unterzustände in die Untersuchung miteinbezogen werden, weichen die beiden Theorien voneinander ab. Unter Einbeziehung der Multipolmischung stimmt die Vorhersage der CDW-Theorie mit den Messwerten überein; die andere Theorie unterschätzt das Alignment des 2p3/2-Zustands und die daraus folgende Anisotropie der Lyman-alpha1-Strahlung. Es muss hervorgehoben werden, dass es durch die Anwendung der Abbremstechnik für nacktes Uran gelungen ist, diese Prozesse in einem Bereich extrem starker Störung (Q/v) zu untersuchen. Dieser Bereich ist im Allgemeinen experimentell nicht zugänglich und ist eine Herausforderung für die theoretische Beschreibung. Wie sich aus den Ausführungen zu den Zerfallskaskaden ergibt, ist die Messung des Alignments bei niedrigen Stoßenergien stark von Kaskadeneffekten beeinflusst. Das bedeutet, dass das Alignment der Lyman-alpha1-Strahlung sowohl durch den direkten Einfang als auch durch die Zerfallskaskade bestimmt ist. Dieses resultiert in einer von der jeweiligen Theorie abhängigen Vorhersage, wodurch sich eine integrale Aussage über die Güte einer bestimmten Beschreibung ableiten lässt.
Die vorliegende Arbeit wurde partiell als Bestandteil eines von der EU geförderten TME-Projektes angefertigt. Das vorrangige Ziel war die Weiterentwicklung der Methodik, die Ring-Testung und die Freiland-Validierung eines offenen und ungestörten terrestrischen Modellökosystems (TMEs). Hierzu wurden die Auswirkungen der Modellchemikalie Carbendazim (fungizider Wirkstoff der Formulierung Derosal®) auf die Enchytraeidenzönose mit TMEs im Labor und in Freiland- Validierungsstudien untersucht. Die Familie Enchytraeidae (Annelida, Oligochaeta) unterlag auf Grund ihrer hohen ökologischen Wertigkeit und einer bekannten Sensitivität gegenüber Carbendazim, im Rahmen dieser Arbeit einer weitergehenden und vertiefenden Auswertung. Im Detail wurde analysiert, welcher der mittels TMEs für die Enchytraeen erhobenen Parameter gegenüber der Exposition von Carbendazim am sensitivsten reagiert und bei der statistischen Auswertung den niedrigsten NOEC- bzw. EC50-Wert liefert. Darüber hinaus wurde die Frage geklärt, welche der in einer TME-Studie generierten ökotoxikologischen Kenngrößen, NOEC oder EC50, am sinnvollsten in der Risikobeurteilung eingesetzt werden sollte. Die Versuche wurden in Amsterdam (Niederland), Bangor (Wales, England), Coimbra (Portugal) und Flörsheim (Deutschland) durchgeführt. An allen Standorten wurde mit dem gleichen Equipment gearbeitet. Die TMEs bestanden aus intakten Bodensäulen (Ø = 17.5 cm, Länge = 40 cm) mit ungestörter Schichtung, indigener Bodenfauna und natürlichem Pflanzenbewuchs. Die Entnahme der TMEs erfolgte auf den Flächen, auf denen auch die entsprechenden Freiland-Validierungsstudien durchgeführt wurden. Es handelte sich dabei um Grünland bzw. in einem Fall (Coimbra) um eine landwirtschaftliche Nutzfläche. Unabhängig von den jeweiligen Bodeneigenschaften konnten an allen Standorten mit den angewandten Methoden intakte Bodensäulen im Freiland entnommen und über eine dreimonatige Versuchsdauer als TMEs im Labor oder im Gewächshaus installiert werden. Zumindest für diesen Versuchszeitraum war die Aufrechterhaltung einer natürlichen Zönose der Enchytraeen in den TMEs unter den beschriebenen Versuchsbedingungen möglich. Untersucht wurden die Parameter Gesamtabundanz, Artenanzahl, Shannon-Wiener Index, Dominanzspektrum, Abundanz der Gattungen Fridericia und Enchytraeus, Anteil der Juvenilen an der Gesamtabundanz sowie die Vertikalverteilung der Enchytraeidae. Mittels einer multivariaten Statistik (PRC, Principal Response Curve) wurden die Auswirkungen auf den Endpunkt Enchytraeidae-Artengemeinschaft bestimmt. An allen Standorten kam es im TME-Vortest, im TME-Ringtest und in der Freiland-Validierungsstudie bei allen Probennahmezeitpunkten zu einer hohen Variabilität der Messwerte, die durch die heterogene räumliche Verteilung der Enchytraeidae bedingt ist. Traten Unterschiede zwischen den Kontrollen der verschiedenen Probennahmezeitpunkte im TME-Vortest und im TME-Ringtest auf, waren sie meist auf eine hohe Variabilität des jeweiligen Endpunktes zurückzuführen. Nur in wenigen Ausnahmefällen kam es zu einer kontinuierlichen Zunahme während der Versuchsdurchführung. In der Freiland-Validierungsstudie nahmen die jeweiligen Messwerte in den Kontrollen während der Versuchsdauer ab. Dies war die Folge der hohen Sommertemperaturen und der dadurch bedingten Austrocknung des Bodens, die in der Freiland-Validierungsstudie, wie alle Umweltbedingungen, nicht zu kontrollieren war. Beim Vergleich TME-Ringtest versus Freiland-Validierungsstudie lagen die Kontrollwerte der einzelnen Parameter in den beiden Studien in vergleichbaren Größenordnungen. Zwischen den Standorten konnten im TME-Vortest, im TME-Ringtest und in der Freiland- Validierungsstudie für alle Parameter keine prinzipiellen Differenzen bezüglich der Entwicklung der Kontrollen über die Probennahmezeitpunkte beobachtetet werden. An allen Standorten zeigten die untersuchten Parameter im TME-Vortest, im TME-Ringtest und in der Freiland-Validierungsstudie eine gute Übereinstimmung mit in der Literatur veröffentlichten Ergebnissen. Insgesamt lässt sich für die Entwicklung der Kontrollen über die Zeit ableiten, dass sich die Enchytraeenzönosen in den TMEs sowie am entsprechenden Freilandstandort hinsichtlich der untersuchten Parameter und ihrer räumlichen Heterogenität unabhängig von den Bodeneigenschaften nicht unterschieden. Aufgrund dieser Tatsache können systembedingte methodische Fehler bei der Erfassung von Chemikalienwirkungen auf die Enchytraeenzönosen unterschiedlicher Standorte mittels TMEs ausgeschlossen werden. Die grundlegenden Voraussetzungen für den Einsatz von TMEs als ökotoxikologisches Testsystem und Instrument in der Ökotoxikologie sind somit gegeben. An den unterschiedlichen Standorten waren die Auswirkungen von Carbendazim auf die untersuchten Parameter an den unterschiedlichen Probennahmezeitpunkten im TME-Ringtest ähnlich wie in der Freiland-Validierungsstudie. Zum Probennahmezeitpunkt w+16 waren die Effekte im TME-Ringtest und in der Freiland-Validierungsstudie vergleichbar denen im TME-Vortest. Die zwischen den Standorten festgestellten Unterschiede hinsichtlich des zeitlichen Verlaufs der Effekte sind auf die unterschiedlichen Bodeneigenschaften und die speziellen Substanzeigenschaften von Carbendazim zurückzuführen. Daher sollten bei der Planung einer TME-Studie neben den Charakteristika der zu testenden Substanz auch die standortspezifischen pedologischen Gegebenheiten berücksichtigt werden. Dabei sollten die Versuchdauer und das Raster der Probennahmen so angelegt sein, dass die maximalen Auswirkungen einer Testsubstanz sowie eine eventuelle Regeneration festgestellt werden können. Zwischen dem TME-Vortest, dem TME-Ringtest und der Freiland-Validierungsstudie sowie zwischen den verschiedenen Standorten konnten bezüglich der Sensitivität der untersuchten Endpunkte keine Unterschiede beobachtet werden. Die niedrigsten NOEC-Werte wurden im TME-Vortest, im TME-Ringtest und in der Freiland-Validierungsstudie am häufigsten mit den Parametern Dominanzspektrum und Enchytraeidae-Artengemeinschaft bestimmt. Die niedrigsten EC50-Werte (inklusive enger 95 % Vertrauensbereiche) wurden für die mit Hilfe der PRC ermittelten sensitivsten Taxa berechnet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass multivariate statistische Verfahren wie die PRC am besten geeignet sind, um Multispezies-Testsysteme wie die TMEs auszuwerten. Darüber hinaus lassen sich mittels PRC die jeweils empfindlichsten Taxa ermitteln, für welche dann wiederum EC50-Werte mit sehr engen 95 % Vertrauensbereichen berechnet werden können. Eine einfachere Alternative ist die Auswertung des Parameters Dominanzspektrum. Mit diesem Endpunkt lassen sich sowohl NOEC-Werte bestimmen als auch sensitive Taxa ermitteln für die anschließend EC50-Werte zu berechnet werden können. EC50-Werte waren an allen Standorten sowohl im TME-Vortest und im TME-Ringtest als auch in der Freiland-Validierungsstudie häufiger bestimmbar als NOEC-Werte. Die EC50- Werte lagen meist unter den entsprechenden NOEC-Werten. Der Faktor zwischen den an den einzelnen Standorten ermittelten Minimum- bzw. Maximumwerten war für die EC50-Werte niedriger als für die NOEC-Werte. Die im TME-Ringtest ermittelten NOEC- und EC50-Werte entsprachen denen der Freiland-Validierungsstudie. Beim Vergleich der Standorte zeigten die EC50-Werte eine geringere Streuung als die NOEC-Werte. Der Variationskoeffizient der für den TME-Vortest und den TME-Ringtest berechneten EC50- Werte sowie der Faktor zwischen Minimum- und Maximumwert der unterschiedlichen Institute war denen anderer Ringtests, die mit Labormethoden durchgeführt wurden, vergleichbar, obwohl hier unterschiedliche Böden mit unterschiedlichen Enchytraeenzönosen verwendet wurden. Die im TME-Vortest und im TME-Ringtest festgestellten EC50-Werte sind mit den in der Literatur für Enchytraeen und Lumbriciden angegebenen LC/EC50-Werten sehr gut vergleichbar und liegen im unteren Bereich dieser Angaben. Damit konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass die mittels TME generierten Ergebnisse replizierbar und reproduzierbar sind, was eine wichtige Bedingung für die Verwendung als Testsystem in der Ökotoxikologie darstellt. Gleichzeitig wurde mittels der Freiland-Validierungsstudie die ökologische Relevanz der TME-Resultate belegt. TMEs können als sinnvolles Instrument zur Verbesserung der Risikobewertung für das Kompartiment Boden für neue/existierende Chemikalien, Biozide und Pflanzenschutzmittel betrachtet werden. Strukturelle Parameter wie z.B. die Enchytraeidae-Artengemeinschaft oder das Dominanzspektrum sollten in die Auswertung mit einbezogen und multivariate Verfahren wie die PRC verwendet werden. Damit ist es möglich, die sensitivsten Taxa zu identifizieren, Zusammenfasssung 178 für welche EC50-Werte berechnet werden können. Anstelle von NOEC-Werten sollten bei der Auswertung von TME-Studien bevorzugt EC50-Werte als ökotoxikologische Kenngröße in die Risikobewertung eingehen (z.B. zur Berechnung von TER-Werten). Die dabei zu verwendenden Sicherheitsfaktoren sind entsprechend anzupassen. Mit der Kombination Enchytraeidae und TME ist neben der Untersuchung von ökotoxikologischen Effekten zudem eine gute Möglichkeit gegeben, das Bioakkumulationspotential von Chemikalien zu bestimmen. Damit stehen für ökotoxikologische Untersuchungen auf den unterschiedlichsten Ebenen (Labor, Modellökosystem, Freiland, Bioakkumulation) standardisierte Testsysteme mit Enchytraeen zur Bestimmung der Wirkungen und des Verhaltens von Chemikalien zur Verfügung.
Wand- und Gratentwicklung seit dem Spätglazial : ein Beitrag zur Landschaftgeschichte in Graubünden
(2004)
Das Hochgebirge als erdgeschichtlich junge Reliefform ist eine Zone geomorphologisch höchster Aktivität, deren Landschaftshaushalt vom Umsatz großer Materialmengen gekennzeichnet ist. Der überaus vielschichtige Bau der Alpen und ihre quartäre Formgebung durch ausgedehnte Vergletscherung hinterließen nach dem Weichen des Eises ein vielfach übersteiltes und zergliedertes Relief. Bergstürze, Sackungen, Rutschungen, Schlipfe und Murgänge haben das Landschaftsbild weitergeprägt, seitdem das stabilisierende Widerlager der Eisströme fehlt. Je nach geologischer Situation wohnt dem Prozeß eine mehr oder minder große zeitliche Verzögerung zwischen der Disposition der Bewegungsmasse und dem tatsächlichen Ereignis inne. Diese Erkenntnis gelangte in jüngerer Zeit zu mehr Aufmerksamkeit, als neue Untersuchungen die generell spätglazial angenommene Initiation vieler großer Massenbewegungen in Frage stellten und bekannte Bergstürze wie z. B. Köfels, Tschirgant oder Flims mit großer Sicherheit ins Holozän rückten (HAAS & POSCHINGER 1997: 1 sowie HAAS 2000: frdl. mdl. Mitt.). Viele bisher gängige Gedanken zur Vorbereitung, Auslösung und zum Bewegungsverhalten großer Massenbewegungen im Hochgebirge müssen vor diesem Hintergund überdacht werden. Alpine Wand- und Gratentwicklung seit dem Spätglazial hängt damit eng zusammen. Um die heutigen Formen und ihre Entstehung zu erklären, müssen die beteiligten Prozesse und Agentien mit einem breitgefächerten und dem Forschungsgegenstand angepaßten methodischen Instrumentarium synoptisch untersucht werden. Um die Entwicklung einer freien Felswand zu rekonstruieren, muß ihre Gliederung in Flächen, Vorsprünge, Simse, Steinschlagrinnen, Zähne und Pfeiler untersucht werden, weiterhin die korrelaten Schuttkörper an ihrem Wandfuß und deren eventuelle spätglaziale Überformung. Wandfußnahe Schuttkörper sind Zeugen der Formung freier Felswände und Spiegelbilder ihrer Struktur und Entwicklung. Daher kann man sie in Typen unterschiedlicher Genese einteilen, die charakteristische Eigenschaften besitzen und deren Bildung an bestimmte Verhältnisse in den sie nährenden Wand- oder Gratabschnitten gebunden ist. Dies ermöglicht eine sehr präzise Einschätzung von Materialbewegungen in den oberen Schichten und Aussagen über Verlauf und besondere Aktivitätsphasen der Verwitterungsleistung im Nährgebiet. Die bisher unterschiedenen Genotypen sind in Tab. 3 zusammengestellt. Ein Zusammenhang zwischen Exposition und Ausbildung bestimmter Genotypen konnte nicht festgestellt werden. Die tektonische und petrographische Gliederung der Wand bestimmt die Einzugsbereiche der Schuttkörper. Entlang der Klüfte bilden sich Steinschlagrinnen aus, deren Einzugsgebiete durch Grate getrennt sind. Stellenweise kommt es durch ebene Flächen zur Überschneidung von Einzugsbereichen oder zu Materialabgängen direkt wandabwärts, ohne bestimmte Kanalisierung. Wandfußnahe Schuttkörper altern durch Setzungsbewegungen, Frostsprengung in situ und Feinmaterialverspülung. Hohlräume zwischen Schuttstücken werden verfüllt, und der Anteil an Porenraum sinkt. Dadurch werden Schuttkörper weniger gut drainiert und sind anfälliger für Erosion durch abfließendes Niederschlags- oder Schmelzwasser. Typische Reifeerscheinungen sind Runsen, die am Wandfuß tief eingeschnitten beginnen und hangabwärts in eine Schuttlobe umschlagen. Sie entstehen unter den Traufpunkten ausgeprägter Steinschlagrinnen. Mit einem gewissen Abstand vom Ursprung solcher Rinnen ist eine wulstartige Ablagerung oberhalb von beiden Rinnenschultern zu beobachten. Diese entsteht durch überbordende Massen, die das Fassungsvermögen einer solchen Rinne übersteigen. Durch den erhöhten Querschnitt des Abflußprofils beim Ausborden einer solchen “Mure“ verringert sich in den Randbereichen die Transportfähigkeit, es kommt zur Ablagerung. Bewuchs kennzeichnet Oberflächen und Wandabschnitte, die in relativer (jedoch flüchtiger) Formungsruhe verharren. Schuttkörper wachsen nicht durch stetige flächige Überdeckung mit einem neuen Kegelmantel, sondern durch die Bildung von streifig langezogenen Schuttloben, die sich in Rutschungsbewegungen bis zum Auslauf des Kegels fortpflanzen können und bestimmten Fördergebieten des Steinschlages streng zugeordnet werden können. Daher weisen ihre Oberflächen kein einheitliches Alter auf. Die Stabilität von Oberflächenmaterial auf Schuttkörpern ist eine Funktion nicht der durchschnittlichen Korngröße, sondern der Rauhigkeit des Materials, die wiederum unter anderem von der Korngröße beeinflußt wird. Schuttkörper sind a priori flüchtige Erscheinungen von ständigem Wandel, Aufbau und Abtrag; jedoch im Kern festliegend, im Mantel in Ruhe und Setzung begriffen und in ihrer Oberfläche nur in Streifen aktiv, dort aber zum Teil erheblich. Man kann für einzelne Körper wohl eine generelle Tendenz festlegen, muß aber immer kleinräumig mit starken Schwankungen rechnen, die jedoch ungeachtet ihrer heutigen Ausprägung Gesamtbild und Gesamttendenz eines Körpers nicht in Frage stellen. Die genetische Unterscheidung von Schutthalde und Schuttkörper macht sich also an der Art der Förderung (durch die Beschaffenheit der Transportwege in der Wand) und der Speisung (durch die Beschaffenheit der Austragsstelle aus der Wand) fest: Traufkante oder Traufpunkt. Dem entsprechend wird Haldenschutt flächig gefördert und linear gespeist, Kegelschutt aber linear gefördert und punktuell gespeist. Daraus resultieren abweichende Eigenschaften beider Formengruppen, die sich bei freier Entwicklung (i.e. Übereinstimmung von Genotyp und Phänotyp), durch andere Einflüsse differenziert, in unterschiedlichen Erscheinungsformen niederschlagen. Meßprofile auf ausgewählten Schuttkörpern unter der Südwand der Sulzfluh lieferten Daten zum Bewegungsverhalten des Oberflächenschuttes. Die Ergebnisse führten zu einer hochauflösenden Unterteilung der Oberflächen in Aktivitätsstreifen von einigen Dezimetern bis wenigen Metern Breite und mehreren Dekametern bis Hektometern Länge. An solchen hochmobilen Schuttfahnen können heute die Ursachen und Abläufe beobachtet werden, die am Wachsen der Schuttkörper bis zu ihrer heutigen Form mitwirkten. Steinschlagrinnen müssen nach ihrer Fähigkeit beurteilt werden, abgehenden Steinschlag zu bündeln und einem Traufpunkt zuzuführen. Ihre Wertigkeit als Maß dieser Fähigkeit ist abhängig von der Tiefe einer solchen Förderrinne und ihrem Gefälle und kann durch den horizontalen Abstand von Rinnenboden zu Rinnenschulter definiert werden. In Kombination mit der genetischen Typisierung korrelater Schuttkörper läßt sich so die Struktur einer beliebigen Wand schnell und präzise erfassen. In der Zusammenschau mit den Moränen der örtlichen Wandfußgletscher sind umfassende Rückschlüsse auf die spät- und postglaziale Formungsgeschichte der betreffenden Felswände möglich. Moränen, Schuttkörper und Wand müssen also stets gemeinsam betrachtet werden. Die Formenentwicklung zwischen Gipfel und unterstem Rand der wandfußnahen Schuttkörper sind in einer in beiden Richtungen ableitbaren Prozesskette kausal miteinander verknüpft. Neben einer intensiven Zerschneidung exponierter Wandflächen in Steinschlagrinnen und Vorsprünge sind auch Reste alter, glatter Wandoberflächen aus dem ausgehenden Hochglazial erhalten, deren lange Expositionsdauer durch stellenweise tief eingeschnittene Karren belegt wird. Ihre über weite Strecken felsgruppenübergreifende Parallelisierung ist eine wichtige Methode der Rekonstruktion spät- und postglazialer Gratformung. Im Bereich Drusentor konnten im Zusammenhang mit der Moränensituation verschiedene Aktivitätsphasen der Gratzerlegung mit zum Teil erheblichen Kubaturen bewegter Felsmasse unterschieden und zeitlich eingegrenzt werden. Durch Rutschungen und Felsstürze zerfiel der Grat entlang der Schwächelinien von Blattverschiebungen, den Grat kreuzenden Bruchlinien und Trennflächen von Einzelschuppen der Deckenstirn. Der Grat verlor dabei im Vergleich zum Hochglazial mindestens 150 bis 250 Meter seiner damaligen Höhe. Die Deckenstirn nördlich des Drusentores ist nur noch in Bruchstücken der basalen Schuppe (z. B. Zollwärterhöhe) erhalten; der Aufschuppungsbereich zwischen Sulzfluh und Dritürm bildet durch Bruch, Blattverschiebung und Rutschung einen Doppelgrat. Wie im Umfeld des Drusentores finden sich auch In den Schijen Reihen von Zähnen und Galerien von Pfeilern als Zeugen einer zerfallenen oder zurückverwitterten Wand. Die Entstehung der großen glatten Fläche unter der Schijenflue ist jedoch nicht auf ein großvolumiges Sturzereignis zurückzuführen, sondern auf eine Schar von Blattverschiebungen, die Wissplatte und Schijenflue gliedern. Die Felspartie um P. 2442 stammt nicht etwa aus höheren Wandteilen und hinterließ beim Loslösen eine glatte, ebene Ausbruchnische, sondern war basaler Wandteil, der sich entlang einer nordsüdlich verlaufenden Bruchlinie von der Schijenwand trennte und nur um ca. acht Meter abrutschte. Obwohl die Felssturzaktivität im Spätglazial außerordentlich hoch war, wie die Ablagerungen In den Schijen mit ihren zahlreichen Grob- und Riesenblöcken belegen, erreichten diese Massen im Spätglazial durch Wandfußgletscher den Talboden und engten ihn geringfügig ein. Der Partnunsee selbst ist kein Bergsturz-, sondern ein Karsee. Das Gafiental quert in südwestlich-nordöstlicher Richtung eine Bruchlinie, an der östlich der Gämpiflue und bei Hasenflüeli Teile der Sulzfluh-Decke insgesamt 200 Meter abgesunken sind. Die auf dem Eggberg-Grat vor dem Erosionsrand zurückgelassenen Deckenteile sind die einzige isolierte Sulzfluh-Klippe des Rhätikon und gehören zum aufgeschuppten Bereich der Plattenflue. Sie ist im Zuge des Absinkens leicht verstellt worden und wahrscheinlich im frühen Spätglazial in mehrere Teile zerfallen, die - seither von einander getrennt - sich in Zähne und Pfeiler auflösen. Dem nordwärtigen Einfallen des morphologisch weicheren Falknis-Wildflysches im Liegenden folgend gingen alle nennenswerten Massenbewegungen auf der Nordseite des Grates ab. Auf der Südseite findet sich wesentlich weniger blockiges Felssturzmaterial, die postglazialen Schuttkörper sind weitestgehend blockarm. Ammaflue ist von seiner ursprünglichen Position zwischen Geisstschuggen und Hasenflüeli vor Egesen 1 nach Norden abgerutscht und hat dabei auf seiner Rutschbahn einige Klippen-Bruchstücke zurückgelassen. Bi den Nünzgen findet sich ein isoliertes Malmkalkvorkommen, das mit den höheren Schuppenteilen von Hasenflüeli korrespondiert. Der hiesige Klippenteil ist im Spätglazial völlig zerfallen und bildet seither nur noch den Stumpf einer Wand. Anhand der egesenzeitlichen Lokalmoränen beiderseits des Grates Bi den Nünzgen konnte der Betrag der Wandzerlegung im Spätglazial quantifiziert werden. Demnach hat die Nünzgenflue durch Wandzerlegung unter Steinschlag- und Felssturzspende seit Egesen 1 mindestens 54 Meter, in Egesen 2 ca. 27 Meter Höhe eingebüßt. An ihr wird die zukünftige Entwicklung Hasenflüelis sichtbar. Das in dieser Arbeit vorgestellte vielfältige methodische Instrumentarium kann in seinen Modulen je nach gewünschter Auflösung der Geländeanalyse frei kombiniert werden. Je nach Fragestellung und zugebilligtem Aufwand kann eine schnelle und sichere Ansprache der Genotypen wandfußnaher Schuttkörper völlig ausreichen. In umfassenderen Fragen der Wandentwicklung, die komplizierte lokale Zusammenhänge zu erforschen suchen, lohnt sich die Entfaltung sehr genauer und damit erheblich zeitaufwendigerer Methoden. Was sie im einzelnen zu leisten vermögen, wird in der Betrachtung der landschaftgeschichtlichen Beispiele deutlich, die an Schlüsselstellen höheren Einsatz mit umfassenden Erkenntnissen belohnen.
Pflanzenfunde aus archäologischen Ausgrabungen im Norden Burkina Fasos dokumentieren die regionale Geschichte der Pflanzennutzung und damit zusammenhängende Wechselwirkungen zwischen Mensch und Umwelt. Das untersuchte Material besteht überwiegend aus verkohlten Früchten und Samen, die durch das Schlämmen von Kultursedimenten aus mehr als 20 Fundplätzen gewonnen wurden. Sie decken einen Zeitraum von etwa 4000 Jahren ab, der von der Endsteinzeit bis in die jüngste Neuzeit reicht. Die Analysen der archäobotanischen Inventare ermöglichen es, mehrere Phasen der Pflanzennutzung auszuweisen, die mit spezifischen Lebens- und Siedlungsweisen der Bevölkerung assoziiert sind. Eine ausschließlich wildbeuterische Wirtschaftsform wird für die älteste der untersuchten Fundstellen, den Lagerplatz Corcoba, angenommen. Dort nutzten mobile Gesellschaften um 2000 BC reiche Fischressourcen und sammelten systematisch die Früchte von Gehölzen. Im Inventar des Fundplatzes Tin Akof ist um 1800 BC erstmals eine Kulturpflanze, die Perlhirse (Pennisetum glaucum) nachweisbar. Sie markiert den Beginn der produzierenden Wirtschaftsweise. Es wird ein Anbau in kleinem Maßstab rekonstruiert, wobei Feldbau nur eine von mehreren praktizierten Subsistenzstrategien war. Vermutlich handelte es sich bei den Bewohnern von Tin Akof um seminomadische Viehhalter, die aus dem Sahararaum einwanderten und das bereits domestizierte Getreide einführten. Ab der Zeitenwende tritt in der Eisenzeit eine neue, sesshafte Kultur in Erscheinung. Ihre Siedlungen befanden sich vorzugsweise auf sandigen, leicht kultivierbaren Böden in der Nähe permanenter Gewässer. Die Nahrungsproduktion basierte auf der Kultivierung von Perlhirse, daneben wurden Hibiscus cf. sabdariffa und die Hülsenfrüchte Vigna subterranea und V. unguiculata angebaut. Als Anbausysteme lassen sich Mischkulturen mit Perlhirse als Hauptfrucht und Kulturbaumparks, die vom Menschen geschätzte Gehölze (u.a. Vitellaria paradoxa) aus der ursprünglichen Savannenvegetation einbeziehen, rekonstruieren. Die gemischte Wirtschaftsweise umfasste Viehhaltung, aber auch wildbeuterische Praktiken wie das Sammeln von Wildpflanzen, insbesondere von Baumfrüchten. Hinweise auf Handelskontakte liegen aus der zweiten Hälfte des ersten Jahrtausends AD vor. Sie lassen sich zum Teil mit dem Ausbau transsaharischer Handelsnetze im Verlauf der Islamisierung Westafrikas verknüpfen. Sorghum bicolor und die Wassermelone (Citrullus lanatus) wurden möglicherweise auf diese Weise eingeführt. Die Eisenzeit erweist sich insgesamt als stabile Epoche mit langer Siedlungskontinuität. Gleichwohl zeigen die detailliert untersuchten Fundsequenzen sich wandelnde Nutzungsmuster und eine Intensivierung der Landwirtschaft. Im 14. Jahrhundert werden die für die Epoche typischen Siedlungshügel im gesamten Gebiet verlassen. Mögliche Ursachen sind politische Veränderungen in benachbarten Regionen. Erst aus der jüngsten Neuzeit liegen wieder archäobotanische Belege vor. Die Ergebnisse aus Burkina Faso bestätigen die archäobotanischen Forschungen in anderen Gebieten Westafrikas, nach denen Feldbau relativ spät um 2000 BC begann und Perlhirse die erste domestizierte Kulturpflanze darstellt. Die stabile Bedingungen in der Eisenzeit führten vielerorts zur Entstehung von Städten und Handelszentren. Diese Entwicklung ist im ländlichen Raum, zu der auch die Arbeitsregion zählt, weniger deutlich ausgeprägt, aber dennoch fassbar. Die archäobotanischen Inventare der Endsteinzeit und Eisenzeit dokumentieren ein, im Vergleich zu heute, niederschlagsreicheres Klima und einen geringeren anthropozoogenen Einfluss auf die natürliche Vegetation.
Durch anhaltende Entzündungsvorgänge oder Nervenläsionen kommt es zu einem vermehrten nozizeptiven Einstrom ins Rückenmark, was lang anhaltende Sensibilisierungsvorgänge an den zentralen Synapsen zur Folge hat. Auf molekularer Ebene kommt es dabei zur Regulation verschiedenster Proteinsynthesen. Diese plastischen Veränderungen im Zellstoffwechsel der Hinterhornneurone können eine Chronifizierung der zentralen Vorgänge bewirken. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels vergleichender Proteomanalyse Proteine identifiziert, die aufgrund chronischer Entzündungsschmerzen und neuropathischer Schmerzen im Lumbalmark reguliert werden. In Folge einer durch Zymosan induzierten Pfotenentzündung konnten mittels 2D-Gelelektrophorese des Lumbalmarks der Ratte bei neun Proteinspots eine Regulation festgestellt werden. Diese Proteine sind möglicherweise an Mechanismen der zentralen Sensibilisierung in Hinterhornneuronen beteiligt und könnten als innovative Therapieansatzpunkte von Bedeutung sein. Ein Zusammenhang zwischen den identifizierten Proteinen und Mechanismen der Schmerzentstehung und -verarbeitung wurde bislang nicht beschrieben. Eines der Proteine, bei dem es zu einem deutlichen zeitabhängigen Abbau nach Zymosaninjektion kam, wurde massenspektrometrisch als Neurofilament light (NF-L) identifiziert. NF-L spielt insbesondere für die strukturelle Stabilität der Neurone und den axoplasmatischen Transport eine wichtige Rolle. Ein Abbau von Neurofilamenten im Rahmen von neurodegenerativen Erkrankungen wurde bereits mehrfach beschrieben. Für die Degradierung von NF-L wird hierbei hauptsächlich die Protease Calpain verantwortlich gemacht. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Aktivierung von Calpain nach Zymosaninjektion sowohl im Lumbalmark als auch im entzündeten Pfotengewebe nachgewiesen. Der entzündungsassoziierte Abbau von NF-L im Rückenmark und den Hinterwurzelganglien konnte durch die einmalige Verabreichung eines spezifischen Inhibitors von Calpain verhindert werden. Eine Vorbehandlung der Tiere mit dem Calpain Inhibitor zeigte darüber hinaus antiinflammatorische und antihyperalgetische Effekte im Entzündungsmodell. Die antinozizeptive Wirkung des Inhibitors war dabei unabhängig davon, ob die Substanz systemisch (i.p.) oder am Rückenmark (peridural) appliziert wurde. Zusammenfassend zeigen die bisher genannten Ergebnisse, dass die Hemmung einer pathophysiologischen Aktivierung von Calpain ein neues, bislang nicht beschriebenes Wirkprinzip zur Behandlung von Schmerzen und Entzündungen darstellen könnte. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde das Protein Aldose Reduktase (AR), das ebenfalls nach Induktion einer peripheren Entzündung reguliert wurde, näher beleuchtet. Bislang wurde die AR vorwiegend mit der Entstehung diabetischer Spätschäden in Verbindung gebracht. Im Proteinmuster des Lumbalmarks zeigte sich dieses Protein durch zwei verschiedene Spots, wobei nach der Zymosaninjektion eine Verschiebung in der Intensität zwischen diesen beiden Varianten der AR beobachtet wurde. Da die AR nach der Entzündungsinduktion weder auf Transkriptions- noch auf Translationsebene reguliert wurde, ist von einer posttranslationalen Modifikation des Proteins auszugehen, wobei eine Phosphorylierung naheliegend erscheint. In Zellkulturexperimenten wurde gezeigt, dass die AR nach einer Stimulation der transfizierten Zellen mit proinflammatorischen Zytokinen abgebaut wird, wobei hierfür eine Aktivierung des Proteasoms verantwortlich zu sein scheint. Eine Hemmung des Abbaus konnte dabei nicht nur durch einen Proteasominhibitor sondern zum Teil auch durch Dexamethason erzielt werden. Die AR scheint daher bei Entzündungsprozessen auf verschiedene Arten reguliert zu werden. Weiterhin wurden Änderungen im Lumbalmark nach Induktion von neuropathischen Schmerzen proteomanalytisch untersucht. Beim Vergleich der Proteinexpressionsmuster zeigten sich bei vier Proteinen Regulationen infolge der Nervenläsion. Keines dieser Proteine wurde bislang mit neuropathischen Schmerzen in Verbindung gebracht. Eines der identifizierten Proteine, alpha-Crystallin, wurde sowohl bei neuropathischem Schmerz als auch bei chronischem Entzündungsschmerz herunterreguliert. Dieses Protein scheint daher mit beiden dieser chronischen Schmerzzustände korreliert zu sein. Die ansonsten beobachteten Änderungen waren jedoch spezifisch für das jeweilige Schmerzmodell, so dass davon ausgegangen werden kann, dass deutliche Unterschiede in den spinalen Sensibilisierungsvorgängen infolge einer Entzündung oder einer Nervenläsion bestehen. Mit der Identifizierung und Charakterisierung von schmerz- und entzündungsassoziierten Proteinen im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Beitrag zur Aufklärung bislang unbekannter Mechanismen der zentralen Sensibilisierung geleistet. Diese Erkenntnisse könnten in der Zukunft als Grundlage zur Entwicklung innovativer Therapieansätze für die Schmerztherapie genutzt werden.
Vergleichende enzymatische Untersuchungen an Schlangengiften von Bothrops asper und Crotalus atrox
(2004)
An 36 Schlangengiften der Vipernarten Crotalus atrox und Bothrops asper wurden jeweils acht Enzymbestimmungen durchgeführt: Argininester-Hydrolase, Casein- und Hide-Powder-Azure-Hydrolyse, Fibrinogen-Koagulase, Humanplasma-Koagulase, L-Aminosäureoxidase, Phosphodiesterase und Phospholipase A2. 14 Schlangengifte von Bothrops asper wurden zudem mittels Anionenaustausch-Chromatographie fraktioniert und die einzelnen Fraktionen auf ihre proteolytische Aktivität und die Fähigkeit, Humanplasma zu koagulieren, untersucht. Es zeigten sich trotz ähnlicher Lebensumstände der Tiere sowie des standardisierten Umgangs mit den Schlangengiften auch innerhalb einer Art erhebliche Variationen in den Enzymaktivitäten. Bei nur zwei Giften von Bothrops asper gelang es, das Enzym mit Casein-Hydrolyse-Aktivität in jeweils einer einzigen Fraktion anzureichern. Alle anderen fraktionierten Lanzenottern- Gifte wiesen diese Enzymaktivität gleich in mehreren oder allen Fraktionen auf. Humanplasma-Koagulase-Aktivität war ausnahmslos in jeder einzelnen Fraktion der untersuchten Gifte nachweisbar. Wahrscheinlich bewirkt ein komplexes Zusammenspiel gleich mehrer Faktoren oder Enzyme im Gift die Blutgerinnung. Fraktionen mit hoher proteolytischer Aktivität für Casein zeigten nicht zwangsweise hohe prokoagulatorische Aktivität. Die Enzyme mit Casein- Hydrolyse-Aktivität scheinen also nicht für die thrombinähnlichen Eigenschaften der Gifte verantwortlich zu sein. Die hier erneut bestätigte Heterogenität in der Zusammensetzung von Schlangengiften führt zu folgendem Schluss: Vor der Immunisierung eines Vesuchstieres zur Gewinnung eines Antiserums sollten die verwendeten Gifte auf ihre Enzym- sowie biologischen Aktivitäten untersucht werden.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde in den drei für die Weidewirtschaft Westafrikas wichtigsten Naturräumen das Umweltklassifikationssystem von Weidewirtschaft betreibenden und für die Region repräsentativen autochthonen und allochthonen Fulbegruppen erfaßt. Motiv für diese Untersuchung war dabei, im Zuge der derzeit stattfindenden Neubewertung mobiler pastoraler Betriebssysteme das diesen Strategien zugrundeliegende traditionelle Wissen zu dokumentieren und so einen Beitrag zum besseren Verständnis der jahrhundertealten Weidestrategien zu leisten. In den drei Gebieten wurden bei den autochthonen Gruppen jeweils zwischen 70 und 100 Einheiten erhoben, mittels derer die Fulbe die natürliche sowie die anthropogen beeinflußte Umwelt klassifizieren. Für jede Einheit wurde die genaue Beschreibung durch die Fulbe ermittelt. Der Klassifikation liegt ein dichtes Kriteriengefüge zugrunde, dessen Grundkriterien - Relief, Hydrologie, Böden, Vegetation, anthropogene und zoogene Beeinflussung - durch eine große Zahl weiterer Kriterien verfeinert werden. Das hieraus resultierende Gesamtsystem ist ein von allen Mitgliedern der jeweiligen Gemeinschaft geteiltes geoökologisches System, mit dem sich alle für einen Standort relevanten Umweltfaktoren präzise und vollständig beschreiben lassen, und das sämtliche Größenordnungen von Einheiten einbezieht. Gleichzeitig enthält es implizit die für Pastoralisten besonders wichtige Information über den Weidewert einer Einheit. Parallel zum Klassifikationssystem der Fulbe wurde mittels pflanzensoziologischer Aufnahmen die Vegetation der drei Untersuchungsgebiete dokumentiert. Die Aufnahmen wurden in allen traditionellen, von den Fulbe mit Namen bezeichneten Einheiten durchgeführt. Im Sahel wurden 4 Gehölz- und 22 Krautgesellschaften ausgeschieden, im Nordsudan 5 Gehölz- und 12 Krautgesellschaften und im Südsudan 7 Gehölz- und 12 Krautgesellschaften. Die pflanzensoziologischen Aufnahmen ermöglichen eine botanische Referenzierung der Fulbe-Einheiten: Ihnen konnten die jeweils für sie typischen Vegetationseinheiten zugeordnet werden. In zahlreichen Fällen zeigte sich eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß einer Fulbe-Einheit eine oder einige wenige Pflanzengesellschaften entsprechen. Eine vollständige Übereinstimmung zwischen Fulbe-Einheiten und pflanzensoziologischen Gesellschaften, d.h., einer Fulbe-Einheit entspricht zu 100 % einer Pflanzengesellschaft und gleichzeitig tritt letztere ausschließlich in dieser Fulbe-Einheit auf, ist aber selten. Im Rahmen der ethnobotanischen Untersuchungen wurde die Bedeutung der Vegetation für die Bevölkerung der drei Regionen untersucht. Es wurden bei allen Fulbegruppen Namen und Nutzungen der angetroffenen Arten erhoben. Der Schwerpunkt lag dabei auf Weidearten, die für die Fulbe als Pastoralisten einen besonders wichtigen Aspekt darstellen, Medizinalpflanzen für human- und tiermedizinische Zwecke sowie sonstigen Verwendungen als Nahrungsmittel, Werkstoffe etc. Bei den Weidearten zeigte sich, daß der Anteil der auf diese Weise genutzten Arten und Pflanzenfamilien im artenarmen Sahel im Vergleich zu den anderen beiden Regionen am höchsten ist. Im artenreichen Südsudan umfaßt die Weidenutzung dagegen die wenigsten Arten. Dieses Ergebnis belegt die Bedeutung breitgefächerter Nutzungsstrategien gerade in Regionen mit prekärer Ressourcensituation. Die Erhebung der traditionellen Heilpflanzen stellt einerseits einen Beitrag zur Bewahrung traditionellen Wissens dar, das in allen drei Regionen durch sich rasch veränderte Lebensumstände bedroht ist. Außerdem hat sie gezeigt, daß eine traditionelle Lebensweise nicht immer den Erhalt dieser Kenntnisse garantiert. Im Rahmen der Arbeiten wurden 896 sicher bestimmte Arten und Unterarten aus insgesamt 104 Familien dokumentiert. Dies ist ein wichtiger Beitrag zur Erfassung der Biodiversität Westafrikas. Auch die Benennung der Arten wurde erhoben und analysiert: Für insgesamt 752 Arten konnte mindestens ein Vernakulärname erhoben werden. Im einzelnen wurden in den verschiedenen Dialekten erfaßt: Jelgoore (Sahel) 210 Vernakulärnamen, Jelgoore (Nordsudan) 259, Nommaare (Nordsudan) 348, Gu-urmaare (Südsudan) 97, Jugureere (Südsudan) 452. Anhand einer Analyse dieser Bezeichnungen sowie der bei den verschiedenen Fulbe-Gruppen gebräuchlichen Bezeichnungen der Umwelteinheiten wurde untersucht, wie bei Migration zwischen verschiedenen Naturräumen sprachlich mit der vorgefundenen neuen Umgebung und ihren Elementen (Landschaftseinheiten, Arten) umgegangen wird. Die Erhebungen zu Umweltwahrnehmung und -kenntnissen der Fulbe ergaben, daß diese die Standortansprüche zahlreicher Arten genau kennen und nach dem Prinzip der Indikatorarten anhand der Vegetation auf den Zustand des Bodens und sonstige Umweltbedingungen rückschließen. Gleichzeitig sind viele in der Umwelt ablaufenden Prozesse genau bekannt. Auch Faktoren, die die Böden von außen beeinflussen und unter deren Einwirkung es zu Degradationserscheinungen kommt, werden genau analysiert. Bezüglich der Degradation der Vegetation werden im Sahel mit Abstand die meisten zurückgehenden Arten genannt, die meisten von ihnen wichtige Nutzarten. Abschließend konnte durch den regionalen Vergleich der Weidepraktiken festgestellt werden, daß Umweltbedingungen und deren Wahrnehmung durch die Fulbe sich weniger als erwartet auf die Weidestrategien auswirken. Sie beeinflussen hauptsächlich Route und Dauer der Tageswanderungen. Ob und wie dagegen Transhumanz (saisonale Weidewanderungen) praktiziert wird, hängt mindestens ebenso sehr von sozialen und ökonomischen Faktoren wie von den ökologischen Bedingungen ab.
R-Flurbiprofen wird als das „inaktive“ Isomer des NSAIDs Flurbiprofen angesehen, weil es in vitro die Cyclooxygenase-Aktivität in therapeutischen Konzentrationen nicht hemmt. Dennoch zeigte sich, dass R-Flurbiprofen antinozizeptive und antikanzerogene Effekte hervorruft, obwohl das R-Enantiomer bei Ratte und Mensch nur marginal zum S-Enantiomer epimerisiert wird. Um diese Effekte näher untersuchen zu können, wurden sowohl in vivo als auch molekularbiologische Experimente durchgeführt: R- und S-Flurbiprofen wurden intraperitoneal in den Do sierungen 1, 3, 9 mg/kg und Dexamethason (Kontrolle) in einer intraperitonealen Dosis von 0.5 mg/kg Ratten verabreicht. Die Effekte von R- und S-Flurbiprofen und Dexamethason wurden in der Zymosan-induzierten Hinterpfotenentzündung im Vergleich zu Vehikel untersucht. Die Gruppengröße umfasste 3 – 6 Ratten pro Behandlung. Außerdem wurden Gewebeproben aus der entzündeten Pfote und dem Rückenmark auf eine PGE2-Freisetzung, Expression von COX mRNA und COX Protein hin untersucht. Weiterhin wurde die Hemmung der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren (NFkB und AP-1) in RAW 264.7 Mausmakrophagen gemessen. R-Flurbiprofen zeigte in der Zymosan-induzierten Hinterpfotenentzündung der Ratte eine ähnliche antiinflammatorische Aktivität wie Dexamethason. Dieser beobachtete Effekt läßt sich zumindest teilweise über eine Hemmung der NFkB Aktivität erklären. R-Flurbiprofen hemmte: 1.) die LPS-induzierte NFkB DNA-Bindungsaktivität in RAW 264.7 Makrophagen, 2.) die Translokation der p65 Untereinheit in den Kern dieser Zellen und 3.) die Zymosan induzierte NFkB abhängige Gentranskription in der entzündeten Pfote und dem Rückenmark von Ratten. S-Flurbiprofen zeigte ähnliche Effekte, war jedoch weniger potent. R-Flurbiprofen hemmte ebenfalls die DNA Bindungsaktivität von AP-1, einem anderen wichtigen Transkriptionsfaktor bei Entzündungsprozessen. Da R-Flurbiprofen eine wesentlich geringere gastrointestinale Toxizität aufweist, lässt es sich möglicherweise als antiinflammatorische Substanz bei Erkrankungen einsetzen, in der die vermehrte oder konstitutive NFkB und AP-1 Aktivierung an pathophysiologischen Prozessen beteiligt ist. Zusammengefasst lässt sich der antiinflammatorische Effekt von R-Flurbiprofen über eine verminderte COX-2 Expression und eine Hemmung der Aktivierung der Transkriptions faktoren NFkB und AP-1 erklären.
Die Reinigung von Siliciumoberflächen verbraucht große Mengen von hochreinen und teueren Chemikalien. Komplexbildner dienen der Maskierung von Metallionen in den Reinigungschemikalien mit dem Ziel, die vorhandenen Reinigungsverfahren zu vereinfachen, den Reinigungsvorgang zu beschleunigen und Chemikalien und Kosten zu sparen. Zur Beurteilung, ob ein Komplexbildner für diese Anwendung geeignet ist, bedarf es eines analytischen Verfahrens zur Bestimmung seiner Stabilität in Halbleitersilicium-Reinigungsbädern. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden ob die HPLC für diese Aufgabe eingesetzt werden kann. Zusätzlich sollte versucht werden, über die Detektion und die Identifizierung von Zersetzungsprodukten Informationen über die Zersetzungsreaktion zu gewinnen. Es wurden Untersuchungen zur Komplexbildnerstabilität in verschiedenen Reinigungsbädern und in 30% H2O2 durchgeführt. Vier strukturell unterschiedliche Komplexbildner wurden untersucht. Pyrinan (N, N´, N´´-Tris (3-hydroxy-6-methyl-2-pyridylmethyl) 1, 4, 7-Triazacyclononan), ABS-BAMTPH (N,N’,N’’-tris [2-(N-hydroxycarbamoyl) propyl]-1,3,5-benzentricarboxamid), Tiron (Dinatrium-1,2-Dihydroxybenzen-3,5-Disulfonsäure) und die Pyridinone (3-Hydroxy-4(1H)-pyridinone). Bei den Pyridinonen handelte es sich um eine Gruppe von Komplexbildnern mit dem gleichen Grundgerüst, welches mit unterschiedlichen Substituenten verbunden war. Das Verhalten der Pyridinone in 30% H2O2 zeigt, dass es möglich ist mit relativ geringen Modifikationen der Molekülstruktur die Stabilität dieser Komplexbildner gegen Zersetzung zu steigern. Die auftretenden Zersetzungsprodukte wurden mit HPLC-MS untersucht. Die Beobachtung, dass in 30% H2O2 und in dem Reinigungsbad APM (H2O2/NH3/H2O-Gemisch) jeweils identische Zersetzungsprodukte auftraten deutet darauf hin, dass in beiden Fällen eine Oxidation durch H2O2 stattfindet. Die in 30% H2O2 beständigsten Komplexbildner waren ESEHP (Sulfoniumsubstituent) und BMHP (Alkylsubstituent). In APM war ECEHP am stabilsten (Carboxylsubstituent). Tiron wurde nur in 30% H2O2 untersucht. Seine Stabilität wird in dieser Lösung nur von 2 der 13 untersuchten Pyridinone, ESEHP und BMHP, übertroffen. Es wurden keine Zersetzungsprodukte detektiert. ABS-BAMTPH hingegen wurde nur in APM untersucht. In APM erwies sich ABS-BAMTPH als der am wenigsten stabile von allen untersuchten Komplexbildnern. Die Brauchbarkeit von ABS-BAMTPH wurde zusätzlich durch einen hohen Anteil an Nebenprodukten eingeschränkt, die bei der Synthese des Komplexbildners entstanden waren. Die Nebenprodukte konnten mittels HPLC-MS und Kenntnis des Syntheseweges identifiziert werden. Über die Zersetzungsreaktion(en) des Pyrinan konnte mit Hilfe von HPLC-MS und MS/MS eine Reihe von Informationen gewonnen werden. Eine Abfolge von Reaktionen wird zur Erklärung der beobachteten Zersetzung vorgeschlagen. Alle Reaktionen laufen an den 3 tertiären Amin-Stickstoffatomen des Pyrinans ab. Diese stellen den Schwachpunkt der Pyrinanstruktur dar. Die Bildung von Aminoxiden leitet die Zersetzung ein. Die Aminoxide reagieren über eine Meisenheimer-Umlagerung weiter. Eine komplexierende Wirkung der Zersetzungsprodukte kann aufgrund der beobachteten Stabilisierung des H2O2 gegen die durch Übergangsmetallionen katalysierte Disproportionierung angenommen werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, das die HPLC zur Untersuchung der Stabilität von Komplexbildnern in Halbleiter-Reinigungschemikalien geeignet ist. Die HPLC-MS und die MS/MS lieferten zusätzliche Informationen über Zersetzungsprodukte und die stattfindenden Zersetzungsreaktionen. Die HPLC-MS ist darin den bisher in der Halbleiterindustrie für diese Fragestellung benutzten analytischen Methoden überlegen.
Im Rahmen dieser Arbeit wird ein Experiment vorgestellt, mit dem es möglich ist, die Wechselwirkungen zwischen Elektronen in der Gegenwart eines extrem starken Laserfeldes zu untersuchen. Diese resultieren aus der nichtsequentiellen Multiphoton- Doppelionisation von Neon in einem starken elektrischen Feld, das durch einen Hochleistungslaser erzeugt wird. Mit Hilfe der COLTRIMS-Technologie ist es möglich die entstandenen Teilchen nachzuweisen und die Impulskomponenten zu bestimmen. Bei dieser Technologie handelt es sich um ein „Mikroskop“, das atomphysikalische Prozesse vollständig differntiell beobachtet. Die bei der Doppelionisation entstandenen Elektronen und das Rückstossion werden mittels eines schwachen elektrischen Feldes auf orts- und zeitaufgelöste Multichannelplate-Detektoren mit Delaylineauslese geleitet. Zusätzlich wird noch ein magnetisches Feld überlagert. Aus dem Auftreffort und der Flugzeit der Teilchen können die Impulse bestimmt werden. Es ist erstmals möglich die Impulskomponenten der drei Raumrichtungen für alle an der Ionisation beteiligten Teilchen mit hinreichend guter Auflösung zu bestimmen. Es können vollständige differentielle Winkelverteilungen erzielt werden. Damit gelingt es, ein kinematisch vollständiges Experiment zu realisieren. Die Elektronen werden bevorzugt in Richtung des Polarisationsvektors des Laserlichtes emittiert. Aufgrund der guten Impulsauflösung ist es jetzt möglich, die Richtung senkrecht zur Polarisation zu untersuchen und die Erkenntnisse in Bezug zueinander zu bringen. Das der nichtsequentiellen Doppelionisation zu grunde liegende sehr anschauliche Modell ist der „Rescattering-Prozess“: Das Laserfeld koppelt an das Coulombpotential des Atoms und verformt es derart, dass ein Elektron die effektive Potentialbarriere überqueren oder durch diese durchtunneln kann. Dieses zuerst befreite Elektron wird durch das oszillierende elektromagnetische Feld zunächst vom Ursprungsion fortgetrieben. Kehrt aber die Phase des Laserfeldes um, wird es zurück zum Ion beschleunigt, nimmt dabei Energie aus dem Feld auf und kann durch Elektron-Elektron-Stossionisation ein zweites Elektron aus dem Atom ionisieren oder es können kurzzeitige Anregungszustände erzeugt werden, die später feldionisiert werden. Dieses Modell wurde schon durch ein Vielzahl von Experimenten verifiziert. Gleichzeitig wirft es aber auch Fragen auf: Wie sind die Elektron-Elektron-Korrelationen zu erklären? Wie hängt der Longitudinal- mit dem Transversalimpuls zusammen? Welche Ionisationsmechanismen treten wann auf? Zusammenfassend kann man sagen, dass ein Experiment präsentiert wird, das zur Erfoschung von Korrelationseffekten bei Multiphoton-Ionisation beiträgt und sehr detaillierte Einblicke in die Welt der Laseratomphysik gewährt. Die Daten belegen eindeutig, dass eine Messung der korrelierten Impulse mehrerer Teilchen in einem Laserfeld eine Zeitmessung mit einer Auflösung weit unter einer Femtosekunde ermöglicht. Das beobachtete Ein- und Ausschalten der Elektronenabstossung, je nach der über die Longitudinal-Impulskorrelation gemessenen Verzögerungszeit, zeigt die Möglichkeit „Attosekunden Physik ohne Attosekunden-Pulse“ zu betreiben.
Die in vivo MR-Protonenspektroskopie (1H-MRS) ist ein nichtinvasives Verfahren, das die Untersuchung biochemischer Substanzen beim Lebenden ermöglicht. In einer prospektiven Studie wurden Patienten, die an einer Demenz vom Alzheimer-Typ (DAT) litten, und altersentsprechende Probanden mit der 1H-MRS untersucht. Im Hirngewebe wurden Konzentrationen von Molekülen bestimmt, die Aussagen über die zelluläre Zusammensetzung ermöglichen. Das Hauptinteresse galt der Untersuchung von Glutamat und Glutamin, da ein Überangebot des Neurotransmitters Glutamat im synaptischen Spalt möglicherweise für die Neurodegeneration beim M. Alzheimer mitverantwortlich ist. Bei 29 Patienten mit einer DAT sowie 19 Probanden wurden zwei Volumina in Kortex und Marklager des Parietallappens bei 1,5 Tesla Magnetfeldstärke mit einer PRESS-Sequenz (TE = 22 ms, TR = 3 s) untersucht. Die Patienten waren kognitiv leicht bis mittelschwer beeinträchtigt (Mini Mental State Examination, MMSE, 11-27 Punkte). Die quantitative Auswertung der Spektren erfolgte nach der "phantom replacement method" mit dem Softwareprogramm LCModel. Als Kriterium für die Zuverlässigkeit der Konzentrationsangaben diente die vom Programm als %SD-Wert angegebene Auswertegenauigkeit der Einzelmessungen. Neben dem Glutamat- und Glutamingehalt wurden der Liquorgehalt im kortikalen Messvolumen und die Konzentrationen der Moleküle N-Acetyl-Aspartat und N-Acetyl-Aspartyl- Glutamat (tNAA), myo-Inositol (mI), Kreatin und Kreatinphosphat (tCr) sowie der cholinhaltigen Substanzen (tCh) bestimmt. Bei den Patienten konnten 25 aussagekräftige Spektren aus der Rindenregion und 19 aus dem Marklager des Parietallappens gemessen werden, bei den Probanden 17 Kortex- und 13 Marklager-Spektren. Glutamat und Glutamin können mit der in vivo-Spektroskopie wegen ihrer sich überlappenden Resonanzen nicht separat bestimmt werden und wurden deshalb als „Glx“ zusammengefasst. Der Glx-Gehalt betrug in der Rindenregion bei den Patienten im Durchschnitt 15,48 ± 5,15 mmol/l, bei den Probanden 13,98 ± 3,14 mmol/l. Die um 11% höhere Konzentration bei den Patienten war nicht signifikant. Die Glx-Konzentrationen im Marklager betrugen 8,16 ± 3,79 mmol/l bei den Patienten und 8,14 ± 3,71 mmol/l bei den Probanden. Nach dem Kriterium der %SD war die Zuverlässigkeit der Konzentrationsbestimmung von Glutamat und Glutamin eingeschränkt, was auf die protonenspektroskopischen Eigenschaften von Glutamat und Glutamin zurückzuführen ist. Sie erzeugen wegen ihrer gekoppelten Resonanzen breite und mehrgipflige Protonensignale, die wegen der resultierenden niedrigen Signalamplitude für LCModel von Makromolekülresonanzen oder von Artefakten, die durch ungenügende Wasserunterdrückung entstehen, schwierig abzugrenzen sind. Die %SD-Werte der Einzelmessungen von tNAA, mI, tCr und tCh waren gering, die Messergebnisse können daher als zuverlässig angesehen werden. Die tNAA-Konzentrationen in beiden Gruppen unterschieden sich weder in der grauen noch in der weißen Substanz signifikant voneinander. Im Hirnrindenvolumen zeigte sich bei den Patienten jedoch eine positive Korrelation von tNAA und MMSE-Ergebnis, also eine Reduktion von tNAA mit zunehmenden kognitiven Einbußen. Dies spricht für eine Abnahme des neuronalen Volumenanteils mit fortschreitender Erkrankung. Der durchschnittliche myo-Inositolgehalt im Marklagervolumen lag in der Patientengruppe um 20% höher als bei den Probanden. Der Unterschied erreichte jedoch kein Signifikanzniveau (p = 0,09). Im Rindenvolumen war die mittlere myo-Inositolkonzentration bei den Patienten um 7% höher als in der Kontrollgruppe, auch hier war der Unterschied nicht signifikant. Der nichtsignifikante myo-Inositolanstieg lässt sich als mäßige entzündliche oder reaktive Gliaproliferation interpretieren. Die tCr-Konzentrationen in beiden Gruppen unterschieden sich nicht, jedoch bestand bei den DAT-Patienten eine positive Korrelation des tCr-Gehalts mit der MMSE-Punktzahl in der grauen Substanz des Parietallappens, die Konzentration nahm also mit zunehmendem Schweregrad der Demenz ab. Bei der durchschnittlichen tCh-Konzentration bestanden keine Gruppenunterschiede in den untersuchten Regionen. Die Patienten wiesen eine signifikante Zunahme des mittleren Liquoranteils um 16% im kortikalen Volumen auf. Dies ist als kortikale Hirngewebeatrophie in frühen und mittleren Stadien der DAT zu werten. Während die in vivo-Konzentrationen von tNAA, mI, tCr und tCh zuverlässig bestimmt werden konnten, war die Messung von Glutamat und Glutamin bei 1,5 T mit technischen Schwierigkeiten verbunden. Wegen der hohen Standardabweichungen konnte aus dieser Untersuchung keine gesicherte Aussage zu einer möglichen Konzentrationsänderung dieser Aminosäuren bei der DAT abgeleitet werden. Es ist zu erwarten, dass hier durch MR-Geräte mit 3 T Feldstärke sowie durch den Einsatz der parallelen Bildgebung ein erheblich höheres Signal/Rausch-Verhältnis und damit genauere Ergebnisse erzielt werden können.
In dieser klinischen Phase I-Studie an 39 gesunden, männlichen Probanden im Alter zwischen 18 und 45 Jahren wurde die Fragestellung untersucht, wie ein Übergang von intravenöser Blutgerinnungshemmung mit dem direkten Thrombinhemmer Argatroban und den oralen Antikoagulantien Phenprocoumon und Acenocoumarol in der klinischen Praxis zu kontrollieren ist. Bei den bisher verwendeten Laboruntersuchungen, wie der aPTT existieren Interaktionen zwischen Argatroban und oraler Antikoagulation, welche nicht notwendigerweise die wirkliche in vivo Situation reflektieren, was durch eine ex vivo-in vitro-Interferenz des Gerinnungsassays verursacht wird. APTT Reagenzien aktivieren die intrinsische Gerinnungskaskade zu einem sehr frühen Zeitpunkt (gleich zu Beginn derselben bei Faktor XI). Dadurch werden die Interaktionen zwischen der oralen Antikoagulation und den Rückkopplungsmechanismen zwischen beiden Gerinnungswegen, welche durch die orale Antikoagulation teilweise erschöpft sind, begreifbar. Ebenso wurde die Interaktion zwischen anderen direkten Thrombinhemmern und der oralen Antikoagulation am Beispiel Napsagatran mit Warfarin beschrieben 35: Die Gabe von Napsagatran alleine führte zur Erhöhung von aPTT und Prothrombinzeit (PT), die zusätzliche Einmaldosis Warfarin erhöhte die AUEC (Fläche unter der Effekt-Kurve) für die PT zusätzlich um das vierfache und für die aPTT um 45%. Obwohl die PT unter dem Einfluss direkter Thrombinhemmer verlängert ist, wird sie nicht als Parameter des Monitorings der Wirkung therapeutischer Dosierungen von Argatroban und anderen direkten Thrombinhemmern bei der Thrombosephrophylaxe und Behandlung tiefer Beinvenethrombosen empfohlen 39. Die aPTT wird hingegen, neben ihrem Einsatz zur Überwachung der klinischen Therapie direkter Thrombinhemmer 40,41, auch als pharmakodynamischer Schlüsselparameter in Phase-I-Studien derselben eingesetzt 42,43. Da jedoch höhere Konzentrationen der Thrombinhemmer die aPTT-Werte für die Kalibrierung verändern und darüber hinaus verschiedene aPTT-Reagenzien mit unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenüber den Thrombinhemmern angeboten werden, ist die aPTT nicht der ideale Parameter zur Überwachung der Wirkung direkter Thrombinhemmer. Die ECT ist hierfür wesentlich spezifischer 40,41. Dennoch werden validierte ECT-Assays nicht kommerziell vertrieben, was deren Einsatz in der Klinik bisher unmöglich macht. Insofern ist es notwendig geworden, eine Empfehlung für den Übergang von intravenöser auf orale Antikoagulation mit dem bisherigen Instrument der INR zu finden. Auch wenn dies aus den o.g. Gründen nicht optimal ist, mag es zulässig sein, die Nomogramme für Acenocoumarol und Phenprocoumon in einfache Regeln zu übersetzen, ohne daß ein Sicherheitsproblem in der Klinik entsteht. Vorausgesetzt, ein Vorhersagefehler von <± 0,6 wird als annehmbar akzeptiert, 35 so erlaubt das Nomogramm für Phenprocoumon und Acenocoumarol eine valide Vorhersage der realen Gerinnungsverhältnisse bis zu einer Dosis von 2,0 µg/kg/min unter Verwendung eines ISI von 1-2. Derzeitige Richtlinien für die Hepariniserung nach tiefer Beinvenenthrombose 47 erlauben den Stopp der Infusionstherapie mit niedermolekularen Heparinen (bei gleichzeitiger Gabe einer oralen Antikoagluation), wenn der INR wenigstens 2,0 erreicht hat. Um den Übergang von Argatroban zu einer oralen Antikoagulation zu vereinfachen, wird eine Regel für die Berechnung der "wahren" INR während der Übergangsperiode vorgeschlagen: 1. Die Argatrobaninfusion kann eingestellt werden, wenn unter gleichzeitiger oraler Antikoagulation die INR für einen angemessenen Zeitraum der Komedikation bei 4,0 angekommen ist. Das gilt für einen ISI des PT-Reagens von 1-2. Die reale INR befindet sich dann im therapeutischen Bereich zwischen 2,2 und 3,7. 2. aPTT-Ergebnisse unter Argatroban und beginnender oraler Antikoagulation müssen um 5-15 Sekunden verkürzt abgelesen werden. Die Verlängerung der aPTT während des Übergangs von Argatroban auf die oraler Antikoagulation sollten nicht zu einer Unterbrechung bzw. Dosiserniedrigung der Argatroban-Infusion während dieses Zeitraums führen. Prinzipiell sollte die Dosis von Argatroban während der Übergangszeit auf die orale Antikoagulation bei 1-2 µg/kg/min fixiert werden. Genauso wie bei Hirudin 48 sollte die ECT, wenn klinisch angezeigt, zur Überwachung der direkten Argatroban-Effekte auf die Gerinnung benutzt und hierbei der aPTT als Alternative vorgezogen werden. Das gilt sowohl für die Anwendung von Argatroban alleine als auch die Kombination mit oralen Antikoagulanzien. Wie bereits oben erwähnt steht die ECT als validierte Messmethode für die Klinik bisher jedoch nicht zur Verfügung. Die Blutungszeit war in dieser Untersuchung in der Periode der Umstellung von Argatroban auf orale Antikoagulation nicht wesentlich verlängert, so daß für Patienten keine zusätzliche Blutungsgefahr entstanden ist. Einschränkend ist dennoch zu bemerken, daß obwohl in den erwähnten Phase-I-Untersuchungen an gesunden Probanden keine größeren Blutungsereignisse aufgetreten sind, bei Patienten durchaus ein erhöhte Blutungsgefährdung bei einer INR von > 3,0 bestehen kann. Dies ist in der Praxis aufmerksam zu kontrollieren. Argatroban ist also für HIT Typ II-Patienten, die unter klinischen Bedingungen antikoaguliert werden müssen, eine gut steuerbare Alternative, bei welcher auch die anschließende Umstellung auf orale Antikoagulation kontrolliert sicher handhabbar ist.
Für Hepatitis-Viren sind für Westeuropa im allgemeinen und Deutschland im besonderen niedrige bis sehr niedrige Belastungen dokumentiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Prävalenz der serologischen Marker der verschiedenen Erreger in Proben, die dem Institut für Medizinische Virologie der Universitätsklinik Frankfurt am Main vorgelegt wurden, untersucht. Aus den Jahren 1995 - 2002 wurden 220.468 Tests auf Hepatitis-Virus-Antikörper sowie HBs-Antigen und HGV-RNA in die Analysen einbezogen. Dabei ließ sich ein starker Rückgang der jährlichen Testzahlen vom Höchststand in 1996 mit 30.566 auf nur noch 20.435 in 2002 (-33%) belegen. Außerdem wurden die Präferenzen bei den einzelnen Erregern deutlich: 98% aller Untersuchungen entfielen auf die Hepatitis-Viren A-C und ganze 4.114 Tests auf die Viren D-G. Bei der Hepatitis-A-Infektion, die fast immer folgenlos ausheilt und eine lebenslange Immunität hinterlässt, spiegelten die Antikörper-Prävalenzen die kumulative Wahrscheinlichkeit für den Erregerkontakt mit einem altersabhängig hohen Gesamtdurchschnitt (48,02%) wider. Der Nachweis von viralem Antigen bzw. Genom zeigte die aktuelle Infektionslage (für HBV mit 3,9% und HGV mit 6,06%). Bei Erkrankungen, die zu einem komplizierten Verlauf neigen und/oder keine langfristige Immunität hinterlassen, standen unterschiedliche Antikörper-Prävalenzen für das jeweilige Risiko (im Mittel HBV 19,15%, HCV 11,51%, HDV 6,55%, HEV 3,98%). Diese Zahlen liegen über den in anderen Untersuchungen für die deutsche Gesamtbevölkerung angegebenen Werten. Das ist insofern nicht verwunderlich, als hier kein Normalkollektiv untersucht wurde, sondern belastete Probanden, bei denen bereits eine Infektion vermutet wurde oder die einer erhöhten Infektionsgefahr ausgesetzt waren. Die Auswertung der Daten für spezifische Risikogruppen belegte die höhere Belastung von HIV-Positiven und i.v. -Drogenabhängigen für fast alle Hepatitis-Viren, während sich für Empfänger von Organen, Blut- und Blutprodukten vielfach eine unterdurchschnittliche oder zumindest eine gegenüber früheren Untersuchungen gesunkene Belastung als Bestätigung für vorgeschriebene Screening-Methoden zeigte. Ein ähnliches Bild bot das medizinische Personal, das lediglich bei den akuten HBV-Erkrankungen über dem Durchschnitt lag. Die Aufnahme der Hepatitis-B-Impfung in den Impfkalender der STIKO (Ständige Impfkommission am Robert-Koch-Institut) zeigte schon in den ersten acht Jahren einen beachtlichen Erfolg: bereits in dieser kurzen Zeit stieg die Anti-HBs-Prävalenz bei den Unter-10-Jährigen von anfangs 21,53% auf 82,50%. Dabei hatten in 1995 lediglich 40% die Antikörper durch eine Immunisierung, folglich 60% aufgrund einer Infektion entwickelt. Bis zum Jahr 2002 verschob sich dieses Verhältnis auf 96,49% vs. 3,51% zu Gunsten der Impfung.
Unter dem Aspekt der steigenden Inzidenz der Syphilis und häufiger Komorbidität mit HIV-Infektion sowie zahlreicher Berichte über atypische klinische und serologische Befunde bei HIV-infizierten Syphilispatienten wurde in einer prospektiven Studie eine Gruppe (1) von 29 HIV-positiven Patienten (26 Männer und 3 Frauen, Alter median 33 J.) mit einer Gruppe (2) von 28 HIV-negativen Patienten (24 Männer, 4 Frauen, Alter median 32 J.), die alle eine aktive, therapiebedürftige Syphilis hatten, unter standardisierter Therapie bezüglich serologischer und klinischer Verläufe sowie des Therapieerfolges verglichen. Über 50 % aller männlichen Patienten (76 % in Gruppe 1, 25 % in Gruppe 2) gehörten zu der Risikogruppe der Männer die Sex mit Männern haben. Bei HIV-Infizierten kam eine Syphilis latens häufiger als in der Kontrollgruppe vor (41 % vs. 21 % / p = 0,09; n.s.). Syphilis maligna kam ausschließlich bei zwei HIV-Infizierten vor, und trat bei CD4+ Zellzahlen von 494/µl bzw. 390/µl auf. HIV-Patienten mit primärer und sekundärer Syphilis sowie mit Neurosyphilis zeigten ansonsten die gleichen klinischen Symptome wie die Patienten der Kontrollgruppe. Bei HIV-Patienten wurden anamnestisch signifikant häufiger andere STDs als bei nicht HIV-Infizierten gefunden (34,5 % vs. 10,7 % / p < 0,05). Bei HIV-Infizierten wurden falsch negative Seroreaktionen im VDRL-, 19s IgM-FTA-Abs-, IgG-FTA-Abs- und TPHA-Tests registriert. Zum einen traten diese Befunde bei CD4+Zellzahlen <500 auf, und waren daher vermutlich mit der HIV-bedingten Immundefizienz assoziiert. Zum anderen hatten diese Patienten gehäuft eine Syphilis latens, bei der die serologischen Befunde von den frühen klinischen Stadien der Syphilis abweichen können. Extrem hohe TPHA-Titer (größer gleich 1:10240) wurden in hohem Anteil (>30 %) in beiden Gruppen beobachtet. Sie fielen vor allem bei Patienten mit neurologischer Beteiligung in beiden Gruppen auf. Eine Seroreversion des TPHA-Titers, die gleichzeitig ein Verschwinden der Seronarbe bedeutet, konnten wir ausschließlich bei HIV-positiven Patienten finden (n=3 Patienten). Ein nicht reaktiver TPHA-Test schließt bei HIV-Patienten eine frühere Syphilisinfektion nicht aus, weswegen bei diesen Patienten ein TPHA-Test alleine als Screening nicht ausreicht. Bei HIV-negativen Patienten wurden häufiger niedrigere, bei HIV-Infizierten häufiger höhere TPHA-Titer gefunden. Eine frühe serologische Antwort auf die Therapie (mindestens zweifacher Titerabfall im VDRL-Test drei Monate nach Therapiebeginn) war bei HIV-negativen Patienten (75 % vs. 55 %) häufiger zu finden als bei den immundefizienten HIV-Patienten. Ein gehäuftes Vorkommen von Neurosyphilis konnten wir bei den HIV-infizierten Patienten nicht finden. Eine Beteiligung des ZNS bei frühen Formen der Syphilis wird auch bei nicht HIV-Infizierten beobachtet. Die klinische Relevanz ist ungeklärt. Nicht immer führt die Liquorpunktion zu einer klaren Aussage. Sie sollte dennoch bei allen Syphilispatienten mit neurologischen Symptomen, bei ausbleibendem Titerabfall nach einer Therapie und bei ungewöhnlichen klinischen und serologischen Manifestationen erfolgen. Am Ende der einjährigen Nachbeobachtungszeit wurde kein klinisch definierter, aber ein serologisch definierter Therapieversager in der HIV-infizierten Gruppe diagnostiziert. Alle HIV-negativen Patienten waren sowohl klinisch als auch nach serologischen Kriterien erfolgreich therapiert. Die aktuellen Therapieempfehlungen der DSTDG sind auch bei HIV-infizierten Patienten wirksam. Eine erkennbare Verschlechterung der HIV-Infektion (deutliche Abnahme der CD4+T-Zellzahl) konnten wir bei den HIV-Patienten im ersten Jahr nach Therapiebeginn nicht beobachten.
Aufgrund der raschen Fortschritte in der Entwicklung der Informationstechnologie kann der Staat mit immer geringerem Aufwand immer schwerwiegender in Grundrechte eingreifen. Bei der staatlichen Überwachung der Telekommunikation stehen sich Sicherheits- und Freiheitsinteressen gegenüber. Durch die kontinuierliche Ausweitung der Überwachungsbefugnisse in den vergangenen Jahrzehnten konnten sich die Sicherheitsinteressen immer weiter in den Vordergrund schieben. Inzwischen ist die vorsorgliche Speicherung sämtlicher Telekommunikations-Verkehrsdaten in der Diskussion. Angesichts der allgemeinen Entwicklung hin zu mehr Überwachung, deren Ende nicht absehbar ist, ist es für eine freiheitliche Gesellschaft von größter Bedeutung, ob dem staatlichen Zugriff auf die Telekommunikation in Deutschland rechtliche Grenzen gesetzt sind und welche dies sind. Der Autor beschreibt aus Sicht des Staates, der Bürger und der betroffenen Unternehmen das Konfliktfeld, in dem sich Regelungen über den staatlichen Zugriff auf Telekommunikationsdaten bewegen. Anschließend werden die rechtlichen Anforderungen an staatliche Zugriffe auf Telekommunikationsdaten diskutiert und entwickelt. Hierbei geht der Autor exemplarisch auch darauf ein, ob vorhandene und geplante Regelungen und Verfahren diesen Anforderungen gerecht werden. Vertieft wird die rechtliche Zulässigkeit einer generellen Vorratsspeicherung von Telekommunikations- Verkehrsdaten unter dem Aspekt der Freiheitsgrundrechte und des Gleichheitssatzes erörtert. Der Autor stellt fest, dass eine generelle Vorratsspeicherung von Telekommunikations- Verkehrsdaten aus mehreren Gründen mit dem Grundgesetz und der Europäischen Menschenrechtskonvention unvereinbar ist. Weil diese Unvereinbarkeit insbesondere in der Verdachtsunabhängigkeit einer generellen Verkehrsdatenspeicherung begründet ist, besteht sie unabhängig von der inhaltlichen Ausgestaltung einer solchen Regelung im Einzelnen. Nach Auffassung des Autors liegt keine besondere Dringlichkeitssituation vor, in der die sofortige Einführung einer generellen Verkehrsdatenspeicherung geboten wäre.
Rumination im Alltag : Inhalte, Verlauf, Vorhersage und klinische Aspekte gedanklicher Bewältigung
(2004)
Unerwünschte wiederkehrende Gedanken - gewissermaßen gedankliches Wiederkäuen - werden auch als Rumination bezeichnet. Rumination kann harmlose Selbsterinnerung an noch zu erledigende Aufgaben beinhalten, aber auch bis hin zu klinisch bedeutsamen Symptomen reichen. Entsprechend gilt Rumination je nach theoretischem Ansatz beispielsweise als instrumentell im Dienste der Zielerreichung (Martin & Tesser, 1996a; 1996b) oder als maladaptive Bewältigung von dysphorischer oder depressiver Verstimmung (Nolen-Hoeksema, 1991; 1996). Da in den meisten bislang vorliegenden Studien jedoch entweder indirekte Indikatoren für Rumination oder aber Fragebögen zur Ruminationsneigung verwendet wurden, lagen ökologisch valide Daten zur spontan auftretenden Rumination im Alltag bislang kaum vor. Hierzu haben wir vier Studien durchgeführt. In der ersten Studie wurde das Ruminationsverhalten von N = 46 Studienanfängern mittels der aus Alltagsbewältigungsforschung und Therapie bekannten strukturierten Tagebücher untersucht. Der Anteil ruminativer Strategien an der Bewältigung negativer Alltagsereignisse lag je nach zugrundeliegender Ruminationsdefinition bei 28 bis 33%. Zur Vorhersage aktueller Rumination wurden aus den Ruminationstheorien von Martin und Tesser (1996a; 1996b) sowie Nolen-Hoeksema (1991; 1996) Hypothesenmodelle abgeleitet. Ein von uns vorgeschlagenes drittes Hypothesenmodell berücksichtigte mit Appraisal aus dem Bewältigungsmodell von Lazarus (1991; 1993) auch ein kognitives Element. Hierarchisch lineare Datenanalysen ergaben theoriekonforme Belege für die Bedeutung von Zielen und Dysphorie in der aktuellen, spontanen Rumination. Die beste Varianzerklärung gelang jedoch unter Einbeziehen des Appraisal im dritten Hypothesenmodell. Dieses Modell ließ sich anhand der Daten aus Studie II replizieren. Außerdem wurden bei den N = 72 Studienanfängern der zweiten Studie zusätzlich Dauer, Inhalte und Beurteilung des Nachdenkens erfasst und im Hinblick auf theoretische Grundannahmen diskutiert. In Studie III wurde die Bewältigung bei N = 54 Opfern eines Wohnungseinbruches untersucht. Hierbei zeigte sich nach 4 Wochen erwartungsgemäß ein Nachlassen der Rumination über den Einbruch bei gleichzeitiger Normalisierung des subjektiven Wohlbefindens. Die Befunde dieser drei Studien deuten darauf hin, dass Rumination eine bei gesunden Normalpersonen häufig eingesetzte alltägliche Bewältigungsstrategie ist. Trotz ihrer Zusammenhänge mit Dysphorie lassen sich keine längerfristig maladaptive Folgen der Rumination, wie Nolen-Hoeksema (1991; 1996) sie postuliert, nachweisen. Kognitive Ereignisbeurteilungen haben einen größeren Einfluss auf die Alltagsrumination als die in der Theorie von Martin und Tesser (1996a; 1996b) ins Zentrum gerückten Ziele. Die Angemessenheit der Ruminationsmodelle für die Alltagsrumination wird diskutiert. Studie IV schließlich untersuchte die Rumination von N = 50 stationär behandelten AlkoholEntgiftungspatienten. Hinsichtlich Dauer und Bewertung des Nachdenkens unterschieden sich die Patienten deutlich von den Studenten aus Studie II. Nach einem Katamnesezeitraum von 3 Monaten ließ sich bei den abstinent gebliebenen Patienten eine ähnliche Verringerung von Ruminationsneigung, Depressivität und negativem Befinden nachweisen, wie sie Hoyer, Heidenreich und Fecht (2000) bei langzeittherapierten Alkoholpatienten gefunden hatten. Die später abstinent bleibenden Patienten zeichneten sich zudem - gemessen an den weiter oder wieder Alkohol konsumierenden Patienten - bereits am Ende des Klinikaufenthaltes durch eine „kritischere“ Einstellung zum eigenen Nachdenken aus. Die explorative, prospektive Regressionsanalyse auf das Kriterium Abstinenz ergab, dass von Parametern der Rumination eine fast ebenso hohe Varianzerklärung ausging wie von „harten“ krankheitsbezogenen Daten. Hohe Ruminationsneigung sowie eine positive Einstellung zur aktuellen Rumination sind demnach prognostische Faktoren, die einen fortgesetzten Alkoholkonsum fördern. Die Ergebnisse werden im Hinblick auf therapeutische Implikationen diskutiert.
Bei der hier vorgelegten Untersuchung wird die Serumkonzentrationen des Akute-Phase-Proteins Lipopolysaccharid-binding Protein (LBP) in einem Normalkollektiv und in Patientenkollektiven mit rheumatoider Arthritis (RA) und systemischem Lupus erythematodes (SLE) evaluiert. Neben dem Vergleich mit etablierten Akute-Phase-Markern, CRP und BSG, wurde der Bezug zu krankheitsrelevanten Laborparametern und Prognosefaktoren, den radiologischen Veränderungen bei der RA und der Nierenbeteiligung beim SLE, untersucht. Im Normalkollektiv beträgt der Referenzwert für LBP mit dem hier verwendeten Immunoassay von DPC Biermann 5,9 ± 4,1 ? g/ml, die absoluten Werte lagen zwischen 1,5 und 12,4 ? g/ml im Serum. Es konnten keine geschlechtsspezifischen Unterschiede gefunden werden. Lediglich in der Population von 50-59-jährigen Männern war eine signifikante Erhöhung der LBP-Werte nachzuweisen. Im Patientenkollektiv mit rheumatoider Arthritis lagen die Serumkonzentrationen für LBP zwischen 2,9 - 26,4 ?g/ml, beim SLEKollektiv zwischen 2,9 – 15,5 ?g/ml. Die mittleren Serumkonzentrationen von LBP lagen damit in beiden Patientenkollektiven signifikant höher als im Normalkollektiv. Im Vergleich von LBP mit den Akute-Phase-Markern CRP und BSG der 1. und 2. Stunde konnten in den beiden untersuchten Patientenkollektiven jeweils hochsignifikante Ergebnisse nachgewiesen werden, p<0,0001. Bei den Aktivitätsparametern des SLE war eine signifikante Korrelation von LBP mit den Leukozytenwerten nachweisbar (r=0,324, p=0,014). Für C3, dsDNS-Antikörper und Thrombozyten ergaben sich keine signifikanten Korrelationen mit LBP. Die LBP-Konzentration im Serum von RA-Patienten korreliert signifikant mit den radiologischen Veränderungen, gemessen am Larsen- und Ratingen- Score. Diese Korrelation beträgt r=0,260, p=0,009 für den Larsen-Score und r=0,244, p=0,014 für den Ratingen-Score. Beim systemischem Lupus erythematodes konnte keine Korrelation von Lipopolysaccharid-binding Protein und der Nierenbeteiligung gezeigt werden. Sowohl in der Höhe der LBP-Werte, als auch in den dargestellten Korrelationen zeigen sich Unterschiede zwischen den Patientenkollektiven. Die mittleren LBP-Serumkonzentrationen sind beim Patientenkollektiv mit RA signifikant höher als beim SLE-Kollektiv. In beiden Patientenkollektiven finden sich aber gleich hohe Korrelationen zwischen LBP und den Akute- Phase-Markern, CRP und BSG. Diese Arbeit trägt zum besseren Verständnis der durch Lipopolysaccharidbinding Protein dargestellten Akute-Phase-Reaktion bei den beiden relativ häufigen rheumatischen Systemerkrankungen, der rheumatoiden Arthritis und dem systemischen Lupus erythematodes, bei. Dabei wurde auf die für die beiden Erkrankungen wichtigen prognostischen Parameter und den Schweregrad, gemessen an der Erosivität der RA und der Nierenbeteiligung beim SLE, eingegangen. Weitere Untersuchungen mit seriellen Messungen von Lipopolysaccharidbinding Protein erscheinen in beiden Patientenkollektiven erforderlich. Damit könnte die Gleichwertigkeit oder sogar Überlegenheit hinsichtlich der prädiktiven Aussagefähigkeit von LBP gegenüber CRP in Bezug auf die Krankheitsaktivität und –prognose der rheumatoiden Arthritis nachgewiesen werden. Beim systemischen Lupus erythematodes liefern Subgruppen mit Serositis, Synovialitis und Infektionen aufgrund der stärker aktivierten Akute- Phase-Reaktion vermutlich interessante Ansätze.
Charakterisierung der alternativen NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (NDH2) aus Yarrowia lipolytica
(2004)
Neben dem protonenpumpenden Komplex I (NDH-1) der Atmungskette besitzt die obligat aerobe Hefe Yarrowia lipolytica eine alternative NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH-2). Diese Enzyme, die in den Atmungsketten von Pflanzen, Pilzen und Bakterien vorkommen, bestehen aus nur einer Untereinheit, führen jedoch dieselbe Reaktion aus wie Komplex I, nämlich die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon, wobei allerdings keine Protonen über die Membran transloziert werden. Nur peripher mit der Membran assoziiert, können alternative Dehydrogenasen entweder zur cytosolischen Seite (extern) oder zur Matrixseite (intern) orientiert sein. Y. lipolytica besitzt im Gegensatz zu anderen Ascomyceten nur eine einzige extern orientierte alternative Dehydrogenase mit einer vorhergesagten Masse von ca. 60 kD und einem nicht kovalent gebundenem Molekül FAD als Cofaktor. Durch Fusion des Leserasters mit der Präsequenz der 75 kD Untereinheit von Komplex I war die interne Expression des Enzyms (NDH2i) gelungen, die das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten ermöglichte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die alternative Dehydrogenase von Y. lipolytica innerhalb ihrer natürlichen Membranumgebung charakterisiert. Das Enzym reagierte mit verschiedenen Chinonanaloga, wobei mit dem hydrophilen Q1 eine höhere katalytische Rate erzielt wurde als mit DBQ, das dem natürlich vorkommenden Q9 am ähnlichsten ist. Da hydrophobe Substrate fast ausschließlich in der Lipidphase der Membranen gelöst vorliegen, musste bei der Bestimmung von kinetischen Parametern (ebenso wie bei Komplex I) auf eine gleichbleibend große Membranphase im Messvolumen geachtet werden. Mit dem standardmäßig benutzten Substrat DBQ reagierte YLNDH2 nach einem Ping-Pong Reaktionsmechanismus. Dieser beschreibt eine abwechselnde Bindung der beiden Substrate, wobei das Enzym die Elektronen von NADH aufnimmt (E-FADH2) und an Ubichinon weitergibt (E-FAD); es existiert kein ternärer Enzym-Substrat Komplex. Gestützt durch Kristallstrukturen des analogen Enzyms QR1 mit NADPH bzw. mit Durochinon, liegt die Vermutung nahe, dass beide Substrate in ähnlicher Weise und sehr wahrscheinlich in der gleichen Bindungstasche binden. Ein Ping-Pong Reaktionsmechanismus wurde bereits für die NADH:DCPIP Oxidoreduktase Aktivität von zwei weiteren alternativen Enzymen postuliert, jedoch noch nie für ein physiologisches Substrat. Als bislang wirksamster Inhibitor für alternative Dehydrogenasen wurde 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1H)chinolon (HDQ) entdeckt. HDQ hemmte NDH2 in Membranen aus Y. lipolytica mit einer I50 von 200 nM, was der 500fachen Hemmwirkung des gängig verwendeten Flavon auf das isolierte Enzym NDI1 von S. cerevisiae entspricht. Allerdings hemmte HDQ auch Komplex I mit einer I50 von 2 µM, ähnlich wie es bei Platanetin in Pflanzenmitochondrien der Fall war [Roberts et al., 1996]. Mit dem Ziel, ein polyklonales Antiserum gegen die native YLNDH2 zu generieren, wurde das Enzym in E. coli heterolog exprimiert. Die Expression führte zur Bildung von Einschlusskörpern, aus denen das rekombinante Enzym unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und zur Immunisierung eines Kaninchens verwendet werden konnte. Das Antiserum kreuzreagierte mit der nativen und der internen Version von YLNDH2 und zeigte nur wenige unspezifische Bindungen. Es wurde gezeigt, dass Y. lipolytica Stämme ohne NDH2 und Komplex I mit NDH2i als einziger Dehydrogenase erzeugt werden konnten. In N. crassa war der Versuch, NDE2 und Komplex I gleichzeitig zu deletieren, gescheitert, was zu der Schlussfolgerung führte, dass sich die beiden Enzyme in diesem Organismus möglicherweise kompensieren könnten. Dies war in Y. lipolytica ausgeschlossen worden, da wahrscheinlich kein (oder nur unzureichender) Austausch zwischen matrixständigem und cytosolischem NADH stattfindet. Die zielgerichtete Mutagenese hochkonservierter Bereiche im offenen Leserahmen von YLNDH2 lieferte das eindeutige Ergebnis, dass die zweite der beiden beta-alpha-beta-Bindungsdomänen NADH binden muß, da sich der KM Wert für NADH bei Mutation des essentiellen sauren Restes E320 dratisch erhöhte. Alle Mutationen, die die Dinukleotid Bindungsdomäne I betrafen, die danach folgerichtig den Cofaktor FAD binden muß, führten zu einem vollständigen Verlust von NDH2. Dieselbe Zuordnung der Bindungsstellen war bereits von Björklöf et al. [2000] vorgeschlagen worden. Eine Chinonbindungstelle konnte durch Mutagenese der beiden apolar/aromatischen Bereiche der Sequenz nicht identifiziert werden. Die Modifikation des C-Terminus von NDH2i führte zu nicht mehr messbarer Aktivität und stark verringerter Expression des Enzyms in mitochondrialen Membranen (siehe Anhang 7.5.1.1). Es kann daher vermutet werden, dass der C-Terminus für die korrekte Faltung eine wichtige Rolle spielt, möglicherweise sogar bei der Membranassoziation, wie bei Rasmusson [1999] vorgeschlagen wurde. Interessant war in diesem Zusammenhang, dass die C-terminal modifizierte NDH2i trotzdem das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten bzw. das Wachstum auf DQA ermöglichte. In Membranen, die einen unterschiedlichen Gehalt an NDH2, jedoch die gleiche Gesamtmenge an Protein enthielten, wurde eine unerwartete lineare Abhängigkeit zwischen KM und Vmax Werten beobachtet. Dieses Phänomen wurde mit dem Modell der externen Diffusionslimitierung beschrieben, die in ähnlicher Weise auch bei immobilisierten Enzymen auftritt. Danach wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von YLNDH2 sowohl durch die kinetisch kontrollierte Rate, als auch durch die Transportrate des Ubichinons bestimmt, das aus der Membran heraus in die wässrige Umgebung des katalytischen Zentrums gelangen muss. Aus diesem Grund ist nicht nur die Maximalgeschwindigkeit, sondern auch die Michaelis Menten Konstante KM abhängig vom Gehalt des Enzyms in Membranen. Dies führte bei niedrig exprimierten mutanten Enzymen zur gleichzeitigen Abnahme von KM und Vmax. Eine externe Diffusionskontrolle der enzymatischen Reaktion wurde auch für Komplex I, dessen Reaktionszentrum im peripheren Arm vermutet werden kann, aber nicht für Komplex III aus S. cerevisiae, dessen Chinonbindungsstellen sich definitiv in hydrophober Umgebung befinden, beobachtet.
Eine Lavage mit exogenem Surfactant, Perfluorcarbonen alleine oder in Kombination mit der partiellen Flüssigkeitsbeatmung, jeweils mit HFOV, verbessert den pulmonalen Gasaustausch im Modell des MAS bei Ferkeln. In unserem Betrachtungszeitraum von vier Stunden erwies sich die Surfactant Lavage bezüglich des Gasaustausches als die beste Therapie. Eine Perfluorcarbonlavage alleine oder in Kombination mit der PLV erreicht nicht die PaO2-Werte einer Surfactantlavage. Der negative Einfluss einer Mekoniumaspiration auf die Hämodynamik der Versuchstiere der Kontrollgruppe konnte klar dargestellt werden. Innerhalb der Therapiegruppen gibt es während einer Betrachtung von vier Stunden keine wesentlichen Unterschiede in der hämodynamischen Entwicklung der Tiere. Arbeiten, die sich mit den Langzeitveränderungen der systemischen Hämodynamik bei der Therapie des MAS mit Surfactant, PFC, und PLV beschäftigen, müssen folgen. Es konnte in allen Therapiegruppen eine über den Betrachtungsverlauf stabile Hämodynamik (z.B. MABP, Puls, Cardiac Index) und ein stetiger Anstieg des PaO2 ermittelt werden. Zudem war das HZVi zum Zeitpunkt t=240 in allen Therapiegruppen signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Die PFC-Lavage Gruppe zeigte nach vier Stunden das signifikant größte ITBVi und schützt vermutlich in Form einer Pufferfunktion in den Alveolen vor „air-trapping“, Pneumothorax und weiteren Lungenschäden beim MAS. Vor allem in Kenntnis der Pathophysiologie des MAS ist dies ein nicht zu unterschätzender Faktor. Wirkliche Langzeiterfahrungen am menschlichen Neonaten stehen leider noch nicht zur Verfügung. Es zeigten sich bei den untersuchten Therapiestrategien keine negativen Auswirkungen auf die protokollierten hämodynamischen Parameter. Früher publizierte Arbeiten, welche den Indikator GEDVi als Vorlastparameter zur Volumensteuerung empfehlen, konnten wir nicht bestätigen. Der positive Einfluss der untersuchten Therapieformen auf das pulmonale Gefäßbett konnte durch den Verlauf des PBV/EVLW Verhältnisses, welches ein Maß für die pulmonalvaskuläre Permeabilität darstellt, nachgewiesen werden.
Inhalt der vorliegenden Forschungsarbeit ist die Entwicklung und Validierung von Trainingsempfehlungen an jugendliche Basketballspieler für das Konditionstraining. Am Beispiel Basketball wurde das Forschungsziel verfolgt, ein Modell zu erarbeiten, dass die diagnostische Betreuung des Konditionstrainings von jugendlichen Mannschaftssportlern ermöglicht. Die Untersuchung am Institut für Sportwissenschaften (IfS) der Johann Wolfgang Goethe — Universität Frankfurt am Main als Diagnosezentrum erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Basketball-Teilzeit-Internat Langen (BTI) als Trainingsinstitution. Die 35 jugendlichen Versuchspersonen waren weibliche und männliche D-und C-Kaderspieler des Hessischen Basketball Verbandes (HBV) und des Deutschen Basketball Bundes (DBB) im Alter von 13 bis 17 Jahren, die zusätzlich zum eigenen Vereinstraining, im BTI zwei- bis dreimal in der Woche individuell trainierten. Das erste Teilziel war die Auswahl einer Merkmalsstichprobe. Dabei mussten die Diagnosemöglichkeiten am IfS genauso wie die zeitlichen und ökonomischen Rahmenbedingungen des BTI-Trainings beachtet werden. Zudem musste eine für den Basketballsport adäquate Auswahl von konditionellen Leistungsfähigkeiten erfolgen, wofür eine detaillierte Betrachtung der Belastungs- und Beanspruchungsanforderungen im Jugendbasketball nötig war. Das entsprechende Literaturstudium deckte erhebliche Forschungsdefizite im Bereich der Belastungsanforderungen auf, was zunächst dazu führte, dass im Rahmen einer ersten Hauptuntersuchung eine Belastungsanalyse von Jugendbasketballspielen durchgeführt wurde. Nach der Entwicklung eines geeigneten wissenschaftlichen Beobachtungsinstruments, wurden allgemeine Spielmerkmale und Spielzeitstrukturen in je 20 Basketballspielen von Jungen- und Mädchenmannschaften der hessischen U16 Jugendoberliga (Saison 1999/00) systematisch beobachtet und ausgewertet. Beobachtungen von individuellen Belastungen und Spielleistungen erfolgten für jedes Geschlecht anhand von jeweils zehn Basketballspielen derselben Leistungs- und Altersklasse. Damit wurden in knapp 830 effektiven Spielminuten na. die zurückgelegten Laufstrecken, Sprunghäufigkeiten und die Anzahl der Ballaufsetzer (Dribbling) sowie die Anzahl von Pass-, Fang- und Wurfaktionen von jugendlichen Basketballspielern während eines Wettkampfspiels quantitativ erfasst. Die Beobachtungsergebnisse wurden in einem Belastungs- und Beanspruchungsprofil der Spielsportart Basketball mit den Ergebnissen von Forschungsarbeiten zur Beanspruchungsstruktur im Basketball zusammengefasst. Dies bildete gemeinsam mit der Analyse der Trainingsmöglichkeiten im BTI die Grundlage bei der Auswahl der zu untersuchenden konditionellen Fähigkeiten (Merkmalsstichprobe) und den dazu passenden Diagnosetests. Verschiedene kraftdiagnostische Testverfahren waren Teil einer ersten Erprobung des Diagnoseverfahrens im Rahmen einer Voruntersuchung, deren Erkenntnisse eine weitere Optimierung des Hauptdiagnoseverfahren möglich machten. Die zweite Hauptuntersuchung bestand aus fünf Diagnoseterminen, die in einem Abstand von sechs Monaten stattfanden. Die Diagnose der 15 ausgewählten Kraft-, Schnelligkeits- und Ausdauerfähigkeiten ermöglichte im Vergleich zu Normwerten eine detaillierte Einschätzung individueller Defizite der Versuchspersonen im Bereich der konditionellen Leistungsfähigkeit. Den Athleten wurde immer dann eine Trainingsempfehlung für einen Bereich ausgesprochen, wenn die individuelle Leistungsfähigkeit unter dem Richtwert lag. Zur Überprüfung der Trainingsergebnisse diente der darauf folgende Diagnosetermin als Ausgangsdiagnose. Anhand der Ergebnisse konnte durch verschiedene merkmalsinterne und merkmals-übergreifende Untersuchungen nachgewiesen werden, dass Leistungsdiagnosen und externe Trainingsempfehlungen durch Trainingsinstitutionen erfolgreich umgesetzt werden können. Damit helfen sie, das Konditionstraining von jugendlichen Mannschaftssportlern individuell zu differenzieren und zeitlich zu ökonomisieren. Dies hat, auch über das Konditionstraining hinaus positive Effekte auf die zeitliche und inhaltliche Gestaltung des Trainings. Es konnten bei allen Diagnosetests signifikante merkmalsinterne und merkmalsübergreifende Unterschiede der Leistungsentwicklungen zwischen Versuchspersonen mit und Versuchspersonen ohne Trainingsempfehlungen nachgewiesen werden, was auf eine erfolgreiche Individualisierung des Trainingsablaufs schließen lässt. Im Rahmen der diagnostischen Betreuung konnten zugunsten der zeitlichen Optimierung von individuellen Trainingsplänen ausreichende Leistungen konserviert werden und bei Versuchspersonen mit Leistungsdefiziten kam es zur Minimierung der Ist-Sollwert-Differenz. Zudem war eine signifikante Leistungshomogenisierung der Trainingsgruppen zu beobachten. Die diagnostische Betreuung ist nicht alleine auf die Diagnose von Leistungszuständen zu reduzieren, sondern umfasst in einem Planungs-, Steuerungs- und Regelungsprozess außerdem die begleitende Beratung der Trainingsinstitution. Das in dieser Forschungsarbeit beschriebene Modell zur diagnostischen Betreuung im Mannschaftsport bietet ein valides Mittel der Trainingssteuerung und ist über den Basketballsport hinaus übertragbar auf andere Mannschaftssportarten.
Soziale Konflikte am Arbeitsplatz stellen Stressoren dar, die ihren Ursprung in den sozialen Beziehungen haben. Als eine Extremform sozialer Stressoren wird Mobbing am Arbeitsplatz verstanden, das durch drangsalierende, schikanöse oder gezielt benachteiligende Handlungen gekennzeichnet ist. Während aufgrund retrospektiver Befragungen von zumeist ehemals von Mobbing betroffenen Personen zahlreiche Forschungsergebnisse vorliegen, wurden die aktuell erlebten sozialen Konflikte und Mobbinggeschehnisse am Arbeitsplatz, deren verschiedene beschreibende als auch bewertungs- und emotionsbezogene Charakteristika, deren unterschiedliche Bewältigung sowie deren unmittelbare Konsequenzen zeitnah zu deren Erleben insbesondere über einen längeren Zeitraum noch nicht näher betrachtet. Von dieser Feststellung ausgehend konzentriert sich die vorliegende Arbeit auf die Erfassung aktueller Informationen zu den interessierenden Aspekten von sozialen Konflikten und Mobbing am Arbeitsplatz, deren Analyse sowie den Vergleich von Mobbingbetroffenen als auch Nichtbetroffenen. Zur Erhebung entsprechender Daten wurde eine intervallkontingente, ereignisbasierte Tagebuchstudie mit Vorab- und Nachbefragung konzipiert. An der siebenmonatigen Studie mit zwei jeweils 20 Arbeitstage umfassenden Erhebungszeiträumen nahmen 50 Mobbingbetroffene und 65 Nichtbetroffene teil. Insgesamt wurde eine Rücklaufquote von 78.79% erreicht und ein umfangreiches, erlebensnahes Datenmaterial erhoben. Die ermittelten Ergebnisse belegen, dass Mobbingbetroffene im Vergleich zu Nichtbetroffenen am Arbeitsplatz und im Privatleben insgesamt häufiger und intensivere soziale Konflikte erleben. Zudem belegen die Ergebnisse, dass die von den Mobbingbetroffenen erlebten sozialen Konflikte durch andere bewertungsbezogene Charakteristika gekennzeichnet sind als die der Nichtbetroffenen. Aufgrund dessen beurteilen die Mobbingbetroffenen die von ihnen erlebten Konflikte am Arbeitsplatz als nichtkontrollierbar sowie kaum bewältigbar, nehmen diese als durch eine Schädigungsabsicht geleitete Handlungen wahr und reagieren auf die von ihnen erlebten Konflikte mit stärkeren unangenehmen und geringer ausgeprägten angenehmen Emotionen. Auch setzen die Mobbingbetroffenen, insbesondere vor dem Hintergrund der geringeren manageability der von ihnen erlebten Konflikte, zu deren Bewältigung andere Strategien ein, vor allem weniger aktive Problemlösung und mehr Vermeidungsverhalten. Zudem erhalten Mobbingbetroffene am Arbeitsplatz weniger soziale Unterstützung. Mobbingbetroffene berichten im Rahmen der von ihnen erlebten sozialen Konflikte am Arbeitsplatz überwiegend andere unmittelbare Konsequenzen als Nichtbetroffene und es gelingt ihnen im Sinne eines mangelhaften unwinding weniger, ihre während des Konflikts erlebten emotionalen Reaktionen bis zum Abend hin angemessen zu verarbeiten. Anschließend wurden die Ergebnisse in die bestehende Befundlage der aktuellen Forschung eingeordnet. Zudem wurden die Grenzen der vorliegenden empirischen Untersuchung als auch deren Mehrwert kritisch diskutiert und gewürdigt. Abschließend wurden die Kernaspekte der vorliegenden Arbeit zusammengefasst und ein Ausblick auf weitere Forschungsarbeiten gegeben.
Das complexe Prostata-spezifische Antigen (cPSA) in der Routinediagnostik des Prostatakarzinoms
(2004)
Die therapeutische Replantation von Zähnen zählt zu den endochirurgischen Eingriffen, wenn alternative Therapiemethoden nicht zum Erhalt des Zahnes oder der Zahnwurzel geführt haben oder aufgrund der bestehenden Risiken (z.B. Gefährdung des Nervus mandibularis bei einer Wurzelspitzenresektion) vom Patienten abgelehnt werden. Im Gegensatz zu Zahnreplantationen, die in Zusammenhang mit einem Trauma stehen, können therapeutische Zahnreplantationen geplant durchgeführt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, einen Vergleich zwischen zwei unterschiedlichen Replantationsmethoden anhand von histologischen Serienschnitten und klinisch erhobenen Röntgenbilder in einer tierexperimentellen Studie an zwei Mantelpavianen durchzuführen. Die beiden Replantationsarten unterscheiden sich in der extraoralen Phase des Zahnes. In der konventionellen Methodik wird der Zahn in der Extraktionszange bzw. mit den Fingern gehalten und die Wurzelhaut mit Ringerlösung benetzt. In einer von LAUER [81] entwickelten Methodik wird der zu replantierende Zahn atraumatisch in einer speziellen Haltevorrichtung fixiert und dabei die Wurzeln in eine gekühlte, semisolide Nährlösung [72,81] eingebettet. Es besteht dadurch ein besserer Schutz des Desmodonts vor mechanischen, chemischen und thermischen Noxen während der extraoralen Therapiephase des Zahnes. Als Versuchsdesign wurde das Split-mouth-design gewählt. Jeder Zahn ist dabei eine Einheit für sich. Dadurch sind die Ergebnisse nicht nur vergleichbar, sondern auch präzise, da sie unter anderem vom Gesundheitszustand des Versuchstieres unabhängig sind. 82 Tage nach dem operativen Eingriff wurden die Versuchstiere geopfert. Vor den Replantationen und vor der Opferung wurden jeweils Röntgenbilder angefertigt. Die Auswertung der Röntgenbilder war aufgrund von Fehlinterpretationen, die anhand von Vergleichen zu histologischen Präparaten diagnostiziert wurden, nicht zielführend. Die histologische Aufarbeitung des Zahnhalteapparates erfolgte in axialen Serienschnitten zum Wurzelquerschnitt. In Anlehnung an ANDREASEN [9] wurde der Zustand des Desmodonts in fünf Klassen differenziert. Der Klassifizierungsdurchschnitt wies bei der die modifizierten Replantationsmethode nach LAUER mit einem Wert von 2,42 gegenüber der konventionellen Replantationsmethode mit einem Wert von 3,31 einen signifikant verbesserten Wert auf. Die nach der Lauer-Methode replantierten Zähne heilten besser ein, erreichten jedoch nicht die Vergleichswerte von nicht reimplantierten Zähnen (1,52). Auch die statistischen Testverfahren im Rahmen einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) zeigen signifikante Unterschiede bei der histologischen Bewertung des Desmodonts. Sowohl die Grundgesamtheit der Klassifizierungsmittelwerte pro Wurzel als auch die Grundgesamtheit der schlechtesten Desmodontbewertung pro Wurzel fallen bei keinem der angewandten Tests durch. Die Verteilung der Klassifizierungsmittelwerte pro Wurzel weist eindeutig auf einen Trend hin. Die innovative Replantationsmethode nach Lauer weist einen besser bewerteten Zustand des Desmodonts auf als bei der konventionellen Replantationsmethode. Die Ernährung, die Kühlung und der Kontaminationsschutz des Desmodonts während der extraoralen Therapiephase scheinen eine erhöhte Überlebensrate der Fibroblastenzelle zu verursachen. Dies führt zu der statistisch signifikant verbesserten Einheilung eines nach Lauer replantierten Zahnes.
Die vorliegende Arbeit geht der Frage nach veränderten Kommunikationsverhalten am Beispiel der Auswirkungen der Mobilfunknutzung auf soziale Beziehungen nach und vergleicht die sozialwissenschaftlichen Erkenntnisse mit dem herkömmlichen Festnetztelefon sowie der Face-to-face Gesprächssituation. Dazu wurden soziologische Texte, aktuelle Umfrageergebnisse sowie eine eigens durchgeführte Stichprobenanalyse ausgewertet. Der Forschungsschwerpunkt behandelt daher nicht demographische Untersuchungen der Mobilfunkanwender oder Nutzungsprofile sondern konkrete Fragestellungen, ob und wie das Mobiltelefon hilft, soziale Beziehungen aufrechtzuerhalten oder zu vertiefen. Als Einführung wurde die Geschichte des Mobiltelefons anhand von technischen, politischen und wirtschaftlichen Gesichtspunkten erläutert. Dabei sticht die schnelle zeitliche Durchdringung des Mobiltelefons in weite Teile der Bevölkerung hervor (mehr als 70 Prozent in 2002). Diese Entwicklung wurde einerseits möglich durch wirtschaftspolitische Weichenstellungen zur Deregulierung und technischem Fortschritt, andererseits aber vor allem durch eine schnelle gesellschaftliche Akzeptanz. Diese breite Akzeptanz, deren Grundvoraussetzung die Adoption ist, wurde als Hinführung zum Forschungsschwerpunkt in Kapitel 2 ausführlich untersucht. Neben der Diskussion des gesellschaftlichen Wandels in der modernen Gesellschaft stand vor allem das Verhältnis von Technik und Gesellschaft sowie der Adoptionsprozess und die gesellschaftliche Annahme des Mobiltelefons im Mittelpunkt. Nach Erläuterung der relevanten soziologischen Konzepte und Definition der wichtigsten Begriffe sowie der methodischen Vorgehensweise wurde der Forschungsschwerpunkt in drei Kapitel gegliedert. - Der erste Abschnitt untersucht soziale Beziehungen und hinterfragt nach der Steigerung beziehungsweise Verringerung sowie der Intensität der sozialen Kontakte bei Mobilfunknutzung. Letzerer Frage schließt sich eine abwägende Diskussion zwischen Erreichbarkeit und Verfügbarkeit an. - Die Ausführungen zu steigender Mobilität in der modernen Gesellschaft sowie dem Einfluss des Mobiltelefon auf die Mobilität und Flexibilität der Individuen folgt im zweiten Abschnitt inklusive der Fragestellung, ob das Nutzen des Mobiltelefons die Grenzen zwischen Privatheit und Beruf verschiebt. - Im dritten Abschnitt werden die Auswirkungen der Mobilfunknutzung in sozialen Räumen im Sinne des Gegensatzes Privatheit und Öffentlichkeit behandelt. Dazu gehören die Unterpunkte Intimität und Selbstinszenierung, Einflussnahme auf die Umwelt und Konflikte im öffentlichen Raum. Die Untersuchungen führen zu folgenden Haupterkenntnissen: - Das Nutzen des Mobiltelefons erleichtert die Kontaktaufnahme und führt daher zu einer Zunahme medial vermittelter Sozialkontakte. Trotz Substitutionseffekten mit dem Festnetztelefon vor allem im Ortsbereich handelt es sich um ein Ergänzungsmedium, dass für häufigere Kommunikation sorgt, da das Telekommunikationsaufkommen (gemessen in Gesprächsminuten) stark ansteigend ist. - Trotz häufigerer Sozialkontakte ist die Intensität der Gespräche bei der Mobilfunknutzung reduziert. Intensität ist hierbei definiert anhand von Gesprächslänge, -themen, -partner und -anlass, nicht als subjektive Empfindung eines Mobiltelefonates. Diese verminderte Intensität kann im Extremfall den Fortbestand von sozialen Beziehungen gefährden, falls ausschließlich mit Mobiltelefonen kommuniziert wird. Im Einklang mit allgemeinen Tendenzen des sozialen Wandels erlaubt das Mobiltelefon eine schnelle Kommunikation, bei der überwiegend knappe Inhalte übermittelt werden. Dies wird einerseits belegt beim Vergleich der Kommunikationsminuten von Festnetz und Mobiltelefon, als auch in der Stichprobenuntersuchung durch die durchschnittliche Gesprächslänge, welche ungefähr vier- bis sechsmal kürzer ausfällt. Die Wahl der Gesprächsthemen scheint zu sachlicheren Themen fokussiert zu sein. - Das Mobiltelefon ist personifiziert anstelle des herkömmlichen ortsgebundenen Telefons. Der Vorteil der möglichen Erreichbarkeit wird schnell zur Verpflichtung der permanenten Verfügbarkeit. Bisher ungekannte Kontrollmöglichkeiten und Druck nach Rechtfertigung entstehen. - Der intuitiv verstandende Gewinn an Mobilität führt zur einer höheren Flexibilität des Mobilfunknutzers. Aufgrund dieser findet die Loslösung der Kommunikation von lokalen Sozialkontakten statt. Damit steht das Mobiltelefon im Einklang mit dem gesellschaftlichen Wandel zur steigenden Mobilität, wie die Jahresberichte des Statistischen Bundesamtes belegen. - Die gewonnene Mobilität und Flexibilität können durch die permanente Erreichbarkeit ein Verschieben der Grenze zwischen Beruf und Privatheit bewirken und somit teilweise diese Zunahme wieder einschränken. Durch das Nutzen eines Mobiltelefons ist es daher nicht mehr einfach möglich, die eigenen sozialen Räumen zu verlassen. - Der öffentliche Gebrauch eines Mobiltelefons steht im Konflikt zwischen dem intimen Charakter eines Privatgespräches und der Aufmerksamkeit der Öffentlichkeit, welche zur Selbstinszenierung führen kann. Als Folge dessen entstehen Regelverletzungen, besonders da bei Entgegennahme eines Mobilfunkgespräches die Aufmerksamkeit von örtlich Anwesenden zum "virtuellen" Gesprächspartner überwechselt. - Besagte Konflikte im öffentlichen Raum durch gleichzeitige Anwesenheit des Mobilfunknutzers in konkurrierenden sozialen Räumen werden einerseits durch das Entstehen von Gebrauchsregeln für das Mobiltelefon wie dem Mobiltelefonverbot am Steuer, andererseits durch das Gewöhnen der Gesellschaft an das öffentliche Nutzen des Mobiltelefons entschärft. Die vorliegende Arbeit kommt damit zu Erkenntnissen, die mit den Ergebnissen anderer Autoren verglichen werden können: - Auch bei anderen Autoren, die sich aktuell mit dem soziologischen Auswirkungen der Mobiltelefonie beschäftigen, ist unbestritten, dass das Mobiltelefon die Kommunikation fördert und somit zu mehr sozialen Kontakten beiträgt. Dies wird zum Beispiel von Geser und Haddon festgestellt. Über die Intensität im Sinne von Gesprächslänge, -thema, -partner und –anlasses ist hingegen nur ansatzweise in der vorliegenden Literatur diskutiert worden. - Neben der allgemeinen Überzeugung des Gewinns an Flexibilität und Mobilität durch das Mobiltelefon und der damit verbunden Möglichkeit zur Kommunikation in Unkenntnis des Aufenthaltortes sind verschiedene kritische Stimmen zur Frage der Vermischung zwischen Privatheit und Beruf und nach der durch Erreichbarkeitsverpflichtung entstehenden Kontrolle vorhanden. Dies wird besonders bei Geser erörtert. - Übereinstimmend werden auch die besondere Problematik der Mobilfunknutzung in der Öffentlichkeit und dem damit verbundenen Konfliktpotential erkannt. Neben oben genannten Autoren diskutiert Ling dieses Thema ausführlich. In der abschließenden Tabelle sind die sozialwissenschaftlichen Erkenntnisse dieser Arbeit, ihre Begründungen und Schlussfolgerungen sowie einige Kernbeispiele als Kurzzusammenfassung aufgeführt.
Die Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) spielt eine Schlüsselrolle in der Vermittlung proliferativer Effekte sowohl von Rezeptoren vom Tyrosinkinase-Typ (RTK) wie dem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), als auch von G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die MAPK-Aktivierungsmechanismen durch GPCR sind im Gegensatz zum EGFR unzureichend verstanden und stark von Rezeptor- und Zelltyp abhängig. Ziel dieser Arbeit war die nähere Charakterisierung der Signaltransduktion des GPCR-zugehörigen Cholezystokinin (CCK)-Rezeptors bezüglich der Aktivierung der MAPK durch Western-Blot-Analysen in der Pankreasazinus-Karzinomzelllinie AR42J der Ratte. Die Ergebnisse zeigen eine Beteiligung des EGFR im Mechanismus der CCK-induzierten MAPK-Aktivierung mittels einer EGFR-Transaktivierung. Diese ist mit einer Tyrosinphosphorylierung des EGFR und von Shc sowie einer Komplexbildung der Adapterproteine Shc und Grb2 mit dem EGFR verbunden. Diese Vorgänge sind von der intrinsischen Tyrosinkinaseaktivität des EGFR abhängig. Neben dem EGFR konnte durch weitere Untersuchungen eine Aktivierung und Beteiligung von Tyrosinkinasen der Src-Familie (SFTK) an der CCK-induzierten MAPK-Aktivierung gezeigt werden. Dabei stellte sich heraus, dass die CCK-induzierte Shc-Tyrosinphosphorylierung und die EGFR-Shc-Grb2-Komplexbildung im Rahmen der EGFR-Transaktivierung SFTK-abhängig sind. Im Gegensatz dazu ist die EGFR-Tyrosinphosphorylierung SFTK-unabhängig. Diese Daten zeigen, dass die CCK-induzierte Signalvermittlung des EGFR die gemeinsame Aktivierung von SFTK und EGFR benötigt. Neben der EGFR-Transaktivierung konnte im Rahmen der CCK-induzierten MAPK-Aktivierung ein weiterer Signaltransduktionsweg charakterisiert werden, welcher die Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) beinhaltet. Es konnte gezeigt werden, dass CCK in AR42J-Zellen eine Aktivierung der PKC-Isoformen alpha, delta und eta induziert. Eine Hemmung aller drei PKC-Isoformen führte zur Hemmung des MAPK-Signals, während die isolierte Hem-mung von PKC alpha und delta keine Effekte verursachte. Diese Resultate deuten darauf hin, dass PKCeta an der CCK-induzierten MAPK-Aktivierung beteiligt ist. Eine Beteiligung der PKC an der EGFR-Transaktivierung konnte nicht nachgewiesen werden. Demnach scheint der PKC-abhängige MAPK-Aktivierungsmechanismus parallel zum EGFR zu verlaufen und erst distal des EGFR mit dem EGFR/SFTK-abhängigen Signaltransduktionsweg zu konvergieren.
Wasserstoffbrücken als strukturbildendes Element : Synthese und Berechnung supramolekularer Komplexe
(2004)
Die nicht-kovalente Synthese sowie die Berechnung der supramolekularen Komplexe wurden anhand dreier unterschiedlicher Stoffklassen demonstriert. Ziel war es, supramolekulare Dimere zu kristallisieren, die durch zwei Wasserstoffbrücken zusammengehalten werden. Die zuerst untersuchten Indol-Derivate waren potentiell selbstkomplementär. Während der Donor im starren Indol-Ring lag, befand sich der Akzeptor in der Seitenkette, was zu konformationell flexiblen Verbindungen führte. Durch Variation des Abstandes von Donor und Akzeptor, was einer Verlängerung der Seitenkette durch zusätzliche CH2-Gruppen entsprach, sollte herausgefunden werden, bei welcher geometrischen Anordnung dimere Komplexe entstehen Die Ergebnisse zeigten, daß die gewünschten Dimere erst bei einer Kettenlänge von drei CH2-Gruppen um Kristall zu beobachten waren. Diese konformationell flexiblen Verbindungen wiesen somit große Unterschiede zwischen berechneter und realer Komplexgeometrie auf, die darauf zurückzuführen sind, daß im Kristall eine Vielzahl von Molekülen wechselwirken, während in der Rechnung mit dem Kraftfeldprogramm MOMO nur zwei Moleküle berücksichtigt werden. Somit führt die „Sandwich“-Form zu einer günstigeren van-der-Waals-Energie als die planare Form. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit konzentrierten sich unsere Untersuchungen auf die Substanzklasse der Acetylhydrazone, welche ebenfalls potentiell selbstkomplementäre Verbindungen darstellen. Im Gegensatz zu den Indol-Derivaten wurde hier der Abstand zwischen Donor und Akzeptor konstant gehalten, um zu untersuchen, wie sich unterschiedliche Reste der Acetylhydrazone auf die Konformation der Moleküle und somit auch auf die Komplexgeometrie auswirken. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von Verbindungen mit Resten unterschiedlicher sterischer Hinderung synthetisiert. Ziel war es auch in dieser Verbindungsklasse gezielt Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken zu kristallisieren. Eine Suche in der CSD zeigte schnell, daß Acetylhydrazone zwei Vorzugskonformationen besitzen: eine, in der Donor und Akzeptor eine anti-Anordnung besitzen, was in der Regel zu kettenförmigen Wasserstoffbrücken führt, und eine syn-Anordnung, die zu den gewünschten Dimeren führen sollte. Es galt nun zu untersuchen, welche dieser Reste zur syn-Konformation führt und welches die Vorzugskonformation der Acetylhydrazone ist. Die Untersuchungen zeigten, daß zwei sterisch anspruchsvolle Reste zur syn-Anordnung von Donor und Akzeptor führen und somit zu Dimeren im Kristall. Verbindungen mit zwei sterisch wenig anspruchsvollen Resten lagen hingegen in der anti-Konformation vor und bildeten wie erwartet Polymere. Für die Acetylhydrazone konnte folgende These aufgestellt werden: Die syn-Konformation entsteht, wenn beide Reste drei oder mehr (Kohlenstoff-) Atome besitzen, anderenfalls entsteht die anti-Anordnung. Die Rechnungen lieferten, bis auf eine Ausnahme, supramolekulare Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken. Für jene Verbindungen, die ebenfalls in der syn-Konformation in Dimeren kristallisieren, ist die Übereinstimmung zwischen der berechneten und der realen Komplexgeometrie sehr gut. Im letzten Kapitel dieser Arbeit sollten heteromolekulare Komplexe, also solche, die aus zwei unterschiedlichen Molekülen bestehen, untersucht werden. Die erste der eingesetzten Verbindungen sollte zwei Donor-Gruppen enthalten, während die zweite Verbindung zwei Akzeptoren besitzen sollte. Dabei wurde eine Reihe von Diol-Dion-Komplexen untersucht. Dabei gelang es nur einen dieser Komplexe zu kristallisieren und experimentell zu untersuchen. Leider lagen keine Dimere vor, sondern es bildete sich ein 2:1-Komplex (Diol/Dion), der kettenförmige Wasserstoffbrücken ausbildete. Erfreulich war hingegen, daß eine Konformationänderung des Dions zu beobachten war; denn gegenüber der Kristallstruktur der reinen Verbindung lag 25 im Komplex als planare Verbindung vor. Gleichzeitig wurden die möglichen Komplexgeometrien mit MOMO berechnet. Die meisten der berechneten Komplexe wiesen Dimere mit den gewünschten zwei Wasserstoffbrücken auf.
Monoklonale Antikörper und rekombinante Antikörperfragmente gegen sekundäre Arzneipflanzenmetabolite
(2004)
Monoklonale Antikörper sind seit vielen Jahren aus den biochemischen und molekularbiologischen Laboratorien nicht mehr wegzudenken. Sowohl in der Grundlagenforschung, als auch in der angewandten medizinischen Diagnostik und der Therapie spielen sie eine immer wichtigere Rolle. Dennoch konnten sich monoklonale Antikörper als Hilfsmittel im Bereich der Naturstoffanalytik bisher noch nicht durchsetzen. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand daher die Frage, inwieweit sich monoklonale Antikörper und rekombinante Antikörperfragmente für die Analytik komplexer Naturstoffgemische eignen. Eine der Zielstrukturen, gegen die monoklonale Antikörper generiert werden sollten, ist das pentazyklische Triterpen Oleanolsäure. Oleanolsäure ist als Aglykon in zahlreichen verschiedenen Triterpensaponinen enthalten. Triterpensaponine bzw. Triterpensaponin-haltige Arzneipflanzen spielen aufgrund ihres breiten Wirkungsspektrums in der Phytotherapie eine wichtige Rolle. Sie zeichnen sich nachweislich durch venentonisierende, antiödematöse, antiphlogistische, diuretische, expektorierende und broncholytische Eigenschaften aus. Da es sich bei den Triterpensaponinen um eine sehr heterogene Stoffgruppe handelt, ist ihre Analytik sehr aufwendig. Monoklonale Antikörper könnten daher bei der Analytik von komplexen Saponingemischen sehr nützlich sein. In Zusammenarbeit mit Frau Dr. Kerstin Brand aus dem Arbeitskreis von PD Dr. Werner Knöss (Universität Bonn) konnten verschiedene monoklonale Antikörper gegen Oleanolsäure etabliert werden. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Bindungseigenschaften dieser Antikörper eingehend charakterisiert. In kompetitiven ELISAs konnten die Molekülepitope, an die die verschiedenen Antikörper binden, bestimmt werden. Außerdem wurden die Immunglobuline auf Kreuzreaktivitäten gegenüber 72 unterschiedlichen sekundären Arzneipflanzenmetaboliten untersucht. Die monoklonalen Antikörper zeigten dabei keine Interaktion mit Steroiden, Phytosterolen und Herzglykosiden – Substanzen die zwar in die Gruppe der Triterpene eingeordnet werden können, sich aber in ihrer Struktur und Stereochemie deutlich von der Oleanolsäure unterscheiden. Gegenüber zahlreichen pentazyklischen Triterpenen, die strukturelle Ähnlichkeiten mit der Oleanolsäure besitzen, zeigten hingegen alle untersuchten Immunglobuline eine ausgeprägte Kreuzreaktivität. Daher eignen sie sich für die Analytik von komplex zusammengesetzten Triterpengemischen, z.B. von Arzneipflanzenextrakten. Dies konnte durch verschiedene direkte und indirekte Kompetitionsversuche mit unterschiedlichen Arzneipflanzenextrakten im Rahmen dieser Arbeit und der Dissertation von Frau Dr. Kerstin Brand gezeigt werden. Mit Hilfe eines kompetitiven ELISAs ist z.B. ein Screening von unbekannten Arzneipflanzen auf Triterpensaponine möglich. Auch eine Wertbestimmung von Arzneipflanzen oder Arzneipflanzenextrakten mit Hilfe der monoklonalen Antikörper ist denkbar, sofern eine Referenz zur Verfügung steht, auf den die Kompetitionsergebnisse bezogen werden können. Der Einsatz der hier vorgestellten Antikörper wird allerdings dadurch eingeschränkt, dass die Immunglobuline eine unvorhersehbare Polyspezifität gegenüber den polyphenolischen Sekundärmetaboliten Quercetin und Ellagsäure zeigten. Bei einem Einsatz der Antikörper im Rahmen der Naturstoffanalytik sind daher Vorversuche erforderlich, um diese Substanzen zu identifizieren und wenn möglich zu entfernen. Einer der untersuchten monoklonalen Antikörper, der Antikörper der Zelllinie 10F10, zeigte eine Kreuzreaktivität gegenüber verschiedenen ß-Boswelliasäuren. Boswelliasäuren sind in der Lage, das Enzym 5-Lipoxygenase zu hemmen und dadurch die Synthese von entzündungsfördernden Leukotrienen zu inhibieren. Daher scheinen Boswelliasäuren viel versprechende Arzneistoffe bei der Therapie der unterschiedlichsten inflammatorischen Erkrankungen, wie z.B. Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Asthma bronchiale oder rheumatoider Arthritis zu sein. Der Antikörper der Zelllinie 10F10 soll im Arbeitskreis von Prof. Dieter Steinhilber am Institut für Pharmazeutische Chemie der Universität Frankfurt unter anderem für eine Immobilisierung der Boswelliasäuren an Immunaffinitätssäulen eingesetzt werden. In diesem Arbeitskreis wird der Einfluss von ß-Boswelliasäuren auf die 5-Lipoxygenase intensiv erforscht. In einem zweiten Projekt wurden rekombinante scFv-Antikörperfragmente gegen das Triterpen Oleanolsäure und gegen das Pyrrolizidinalkaloid Retrorsin generiert. Pyrrolizidinalkaloide sind hepatotoxische Sekundärmetabolite, die in zahlreichen Nutzpflanzen und traditionellen Arzneipflanzen enthalten sind. Insgesamt wurden vier verschiedene scFv-Fragmente konstruiert. Zwei Anti- Oleanolsäure-Antikörperfragmente konnten in E. coli erfolgreich periplasmatisch exprimiert und ihre Funktionalität in verschiedenen Antigenbindungsstudien nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde eine Phagen-Display- und Phagen- Panning-Methode etabliert, mit deren Hilfe es möglich ist, gezielt nach funktionellen Antikörperfragmenten zu suchen. Mit dieser Methode sollte es möglich sein, nach erfolgter Mutation der verschiedenen scFv-Fragmente, Proteine mit neuen Bindungseigenschaften zu identifizieren. Interessant wären dabei z.B. scFv- Fragmente, die mit Pyrrolizidin-N-oxiden interagieren. Gegen diese Substanzen konnten im Arbeitskreis Dingermann mit Hilfe der konventionellen Hybridoma- Technologie bisher noch keine monoklonalen Antikörper generiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es sich bei monoklonalen Antikörpern und rekombinanten Antikörperfragmenten um interessante Hilfsstoffe für die Naturstoffanalytik handelt, deren Bedeutung für dieses Anwendungsgebiet aber bisher noch deutlich unterbewertet ist. Es wäre daher sehr interessant, die hier vorgestellten Projekte fortzuführen und die Arbeitsmethoden weiter zu optimieren. Mit den im Rahmen dieser Arbeit charakterisierten Anti-Oleanolsäure-Antikörpern stehen bereits drei Immunglobuline für die Arzneipflanzenanalytik zur Verfügung. Von allen drei Antikörpern liegen inzwischen auch scFv-Fragmente vor. Diese Fragmente könnten modifiziert und mit Hilfe der hier vorgestellten Phagen-Display-Methode nach Proteinen mit modifizierten Bindungseigenschaften gesucht werden. Letztendlich wäre auf diese Weise die Generierung eines großen Sortiments von Antikörpern und Antikörperfragmenten für die Analytik der unterschiedlichsten Substanzklassen möglich.
Ziel: Ziel der Untersuchungen war es, selektive und potente P2-Rezeptor-Antagonisten, die sich von Suramin und PPADS ableiten, zu ermitteln sowie die Charakterisierung UTP-sensitiver Rezeptoren in epididymalen Segmenten des Samenleiters der Ratte vorzunehmen. Methoden: Am Samenleiter der Ratte (P2X1-Rezeptoren) und dem Ileum des Meerschweinchens (P2Y1-Rezeptoren) wurden Kontraktions-Inhibitions-Studien durchgeführt. Zur Untersuchung des UTP-sensitiven Rezeptors im Samenleiter der Ratte wurden Kontraktions-, Kontraktions-Inhibitions-Studien und histochemische- bzw. immunzytochemische Studien herangezogen. Ergebnisse: Durch Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Analoga des NF023, Suramin, NF279, PPADS und SB9 konnten symmetrische Suramin-Analoga, wie NF816 (pA2=6,45) und unsymmterische NF279-Analoga, wie NF786 (pA2=6,76), erhalten werden, die potent, selektiv und kompetitiv ADPßS-induzierte Kontraktionen des Meerschweinchen-Ileums antagonisierten. Auch die heterodimer-bivalente Verbindung SB9, erwies sich an nativen P2Y1 -Rezeptoren als potenter, selektiver und kompetitiver Antagonist (P2Y1:pA2=6,91 vs. P2X1: pA2=5,98). Darüber hinaus ist SB9 P2-Rezeptor-spezifisch und schwach wirksam an Ekto-Nukleotidasen von Oozyten des Südafrikanischen Krallenfrosches (IC50 = 40 MikroM). Zur Charakterisierung des UTP-sensitiven Rezeptors des Samenleiters der Ratte wurde Evans Blau verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass Evans Blau die Spaltung von exogenem ATP zu 75 % hemmt. Insbesondere die glatte Muskulatur ist ATPase-aktiv. An epididymalen Segmenten ist UTP (100 MikroM Evans Blau) ein voller Agonist (EC50 = 36 MikroM). Die Kontraktion beruht auf der Aktivierung postsynaptischer Strukturen und wird nicht durch UDP oder Uridin beeinflusst. Mit Agonisten konnte in Anwesenheit von 100 MikroM Evans Blau folgende Reihe der Wirkstärke erhalten werden: natürliche Agonisten, Ap4A > ATP = ADP = UTP > UDP; synthetische Agonisten, 2MeSATP > ATPgammaS > ADPßS. In Anwesenheit von 100 MikroM Evans Blau wurden UTP-induzierte Kontraktionen durch PPADS (IC50 = 20 MikroM) und Reaktiv Blau 2 (IC50 = 43 MikroM) nicht aber durch Suramin und MRS 2179 gehemmt. P2Y2-Rezeptor-spezifische Antikörper ergaben die Expression von P2Y2-Rezeptoren auf der glatten Muskulatur des Samenleiter der Ratte. Schlußfolgerungen: Analoga als auch pharmakophore Gruppen des Suramins und PPADS eignen sich als Ausgangs-Verbindungen bzw. -Strukturen zur Synthese von potenten und Subtyp-selektiven P2-Rezeptor-Antagonisten. Die Wirkungen von UTP sind durch P2u-Rezeptoren vermittelt. Die Ergebnisse deuten auf die Beteiligung von P2Y2- bzw. P2Y4-Rezeptoren in epididymalen Segmenten des Sameneiters der Ratte hin.
Das humane Genom besteht zu etwa 8% aus retroviralen Sequenzen. Davon sind ca. 1-2% dem humanen endogenen Retrovirus K (HERV-K) zuzuordnen. Das Virus ist mit ca. 30-50 Proviren und ca. 10.000 sLTRs im humanen Genom vertreten. HERV-K besitzt intakte ORFs für alle retroviralen Proteine und zusätzlich ein ORF für das akzessorische Protein Rec. Obwohl eine basale Transkription in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden konnte, ist eine Expression von HERV-K Proteinen und Viruspartikeln nur in Keimzelltumoren nachgewiesen worden. In dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation des gewebespezifischen Promotors von HERV-K näher charakterisiert. Hierbei wurden regulatorisch wichtige Sequenzen mit Hilfe des Luziferase-Assays eingegrenzt. Transkriptionell sensitive Regionen wurden daraufhin im EMSA auf die Bindung von Transkriptionsfaktoren untersucht. Durch transiente Transfektionen von Luziferasereporterkonstrukten in verschiedenen Zelllinien stellte sich heraus, dass HERV-K LTRs in Keimzelltumorzellen aktiv sind, dass es aber auch inaktive LTRs gibt, die im Zuge der Evolution durch Punktmutationen ihre transkriptionelle Aktivität verloren haben. Aktive und inaktive LTRs unterscheiden sich durch Punktmutationen, die sich in verschiedenen Sequenzabschnitten häufen. Chimäre Konstrukte aus aktiven und inaktiven Sequenzabschnitten und gezielte Mutationen und Deletionen in aktiven HERV-K LTRs enthüllten verschiedene DNA-Bereiche, die transkriptionelle Sensitivität aufweisen. Die LTR-Bereiche bps 572-578, bps 757-798 und bps 809-823 waren im Aktivitäts-Assay besonders empfindlich gegenüber Mutation. In diesen Bereichen liegen zum einen GC/GT-Boxen, also Konsensussequenzen für die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3, zum anderen Konsensussequenzen für ein Inr und ein DPE. Das Binden von Sp1 und Sp3 auf den GC/GT-Boxen der bps 757-798 konnte durch eine EMSA-Analyse bewiesen werden. Der transkriptionell sensitive Bereich der bps 572-578 weist eine weitere putative GC/GT-Box auf. Die TATA-Box bei bp 532 zeigte sich unempfindlich gegenüber Mutation. Eine Beteiligung dieser Konsensussequenz am basalen Promotor wurde deshalb ausgeschlossen. Unterstützt durch die Ergebnisse einer 5’-RACE, ein Verfahren, dass den Transkriptionsstart eines bestimmten Gens bestimmen kann, konnte gezeigt werden, dass der basale HERV-K Promotor aus Konsensusequenzen für die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3 , einem Inr und einem DPE besteht. Sp1 und Sp3 sind ubiquitäre Transkriptionsfaktoren, die durch ihr Mengenverhältnis in einem bestimmten Gewebe oder durch posttranslationale Modifikationen unterschiedliche Auswirkungen auf die Transkription haben können. Diese Eigenschaften könnten zur Gewebespezifität von HERV-K beitragen. Die Core Promotor Komponenten Inr und DPE sind für die korrekte Positionierung von TFIID und damit der PolII verantwortlich. Des weiteren wurde eine starke Beteiligung des Testis-spezifischen Transkriptionsfaktors SRY an der Transkription von HERV-K belegt. Im Luziferase-Assay konnte ein SRY-Expressionsplasmid die Transkription eines aktiven LTRs in GH- wie auch in HeLa-Zellen steigern. Ein Indiz dafür, dass es sich um einen für die Transkription von HERV-K essentiellen Faktor handelt. Verschiedene SRY-Konsensussequenzen auf der HERV-K LTR machen eine Wirkung in cis wahrscheinlich, doch könnte auch in trans ein für die Transkription wichtiger Transkriptionsfaktor in seiner Expression verstärkt werden. Ebenfalls konnte bewiesen werden, dass epigenetische Mechanismen eine starke Rolle bei der Transkription von HERV-K spielen. Die Methylierung eines LTR-haltigen Luziferase-Reportervektors führte zum fast vollständigen Verlust der transkriptionellen Aktivität. Es bleibt abzuwarten, in welcher Weise die Schlüsselkomponenten Sp1, Sp3, SRY und Hypermethylierung des HERV-K Genoms zur Gewebespezifität von HERV-K beitragen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Modellierung der neuronalen Prozesse, die auditorischen Lokalisationsleistungen zugrunde liegen. Viele der hierzu aktuell diskutierten Modellvorstellungen lassen sich auf ein von L. Jeffress bereits in der Mitte des letzten Jahrhunderts vorgeschlagenes Netzwerkmodell zurückführen: Nach Jeffress werden interaurale Laufzeitunterschiede (ITDs) zwischen beiden auditorischen Pfaden in einem Netzwerk von Detektorneuronen (Koinzidenzdetektoren) ausgewertet. Systematische Laufzeitunterschiede resultieren aus der Architektur des Netzwerks, die sogenannte Delay-Lines realisieren soll. Trotz einer Reihe von Evidenzen für das im auditorischen Diskurs inzwischen als Paradigma geltende Modell, findet Kritik am Jeffress-Modell in jüngerer Zeit zunehmend Beachtung und Interesse. So argumentieren B. Grothe und D. McAlpine gegen die Übertragung des Delay-Line Modells auf die Verhältnisse bei Säugern. Zentrales Moment ihrer Kritik ist eine Afferenz der MSO aus einem weiteren Teilgebiet der Olive (MNTB). Wesentlicher Effekt der von der Projektion gebildeten inhibitorischen Synapse ist eine relative Verschiebung der Best-Delays der MSO-Zellen zur Präferenz contralateraler Delays. Damit besteht nicht nur zu der nach dem Jeffress-Modell notwendigen Aufteilung der Best-Delays ein Widerspruch, die ITDs liegen bei tiefen Frequenzen für kleine Säuger aufgrund deren geringer Kopfgröße außerhalb des Bereichs physiologisch auftretender Delays. In dieser Arbeit werden die Ergebnisse von Grothe und McAlpine durch Compartmental Modeling analysiert. Gegenüber einer Simulationsstudie aus den Gruppen von Grothe und McAlpine werden von uns durch explizite Modellierung der Dendriten zusätzliche Effekte der Inhibiton beschrieben. Wir stellen dar, wie die Topographie von Inhibiton und Excitation die Verarbeitungsprozesse in Bipolar-Zellen durch dendritische Low-Pass Filterung und Kontrastverst ärkung zwischen minimaler und maximaler Spikerate unterstützt. Unsere Ergebnisse können die empirisch nachgewiesene Verteilung excitatorischer (distaler) und inhibitorische (proximaler) Synapsen erklären. In der abschliessenden Analyse der von den Bipolar-Zellen generierten Spike Trains wird das von Grothe und McAlpine entworfene alternative ITD-Codierungsmodell auf der Basis von Ratencodes problematisiert: Bislang erklärt ihr Vorschlag nicht, wie organismische Lokalisationsleistungen auf der Basis weniger Spikes realisiert werden können.
Isolierung und Charakterisierung der Atmungsketten-Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans
(2004)
Isolierung von Atmungsketten-Superkomplexen aus Paracoccus denitrificans: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Reinigungsprotokoll zur Präparation der Atmungskettenkomplexe I, III und IV des Gram-negativen, fakultativ anaeroben Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans in Form eines NADH Oxidase Komplexes erstellt. Bisher konnten stabile Superkomplexe bakterielle Atmungskettenkomplexe nur in Gestalt einer Chinol Oxidase, bestehend aus den Komplexen III (Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase) und IV (Cytochrom c Oxidase), isoliert werden (Berry, et al., 1985). Jedoch enthielten diese Assemblierungen keinen Komplex I (NADH: Ubichinon Oxidoreduktase). Dies ist die erste chromatographische Isolierung eines kompletten "Respirasoms" aus Paracoccus denitrificans. Unter der Verwendung des milden Detergenz Digitonin zur Solubilisierung von Paracoccus denitrificans Membranen gefolgt von zwei chromatographischen Reinigungsschritten, der Hydroxylapatit-Chromatographie und der Gelfiltration, konnte eine NADH Oxidase, bestehend aus den Komplexen I, III und IV in einer 1:4:4 Stöchiometrie isoliert werden. Neben der Isolierung der NADH Oxidase konnten weitere kleine Superkomplexe identifiziert werden, die aus vier Komplex III und vier Komplex IV (III4IV4) sowie vier Komplex III und zwei Komplex IV (III4IV2) assoziiert waren. Charakterisierung der Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans: Die isolierten Atmungskettenkomplexe wurden zur Charakterisierung bezüglich ihrer Funktion, enzymatischen Aktivität, Stöchiometrie und Untereinheiten-Zusammensetzung aus Paracoccus denitrificans Wildtyp-Membranen analysiert. Proben aller Präparationsstufen wurden parallel zur BN-Gelelektrophorese und für enzymatische Einzel- und kombinierte Aktivitäten der Komplexe I-IV eingesetzt. Mittels BN-Gelelektrophorese konnten die apparenten Massen der Komplexe bestimmt werden. Im folgenden denaturierenden SDS-Gel wurde die Untereinheiten-Zusammensetzung der Superkomplexe durch Immunodetektion mit Antikörpern gegen die Komplexe I, III, IV und Cytochrom c552 analysiert. Abschließend konnte nach der Gelfiltration festgestellt werden, das Komplex II eindeutig nicht Teil des Superkomplexes (I1III4IV4) war. Die Stöchiometrie des Superkomplexes a wurde mit Hilfe der fluorimetrischen Bestimmung von FMN (Flavin) als Marker für Komplex I und mittels Pyridin Hämochromogen Spektren für Häm a, b und c bestimmt. Da Komplex III physiologisch als Dimer vorliegt (Mayer et al. 2002), müsste die Stöchiometrie der funktionellen Einheit des Superkomplex a folgendermaßen lauten: I1 (III2)2 IV4. In diesem Fall diente der Vergleich der Wechselzahl einzelner Präparationsstufen als Maß der Verunreinigung der ergab, dass Fremdkomplexe mit Flavin und Cytochrom b im Ausgangsmaterial der Präparation vorhanden waren. Nur die Wechselzahl des Komplexes IV blieb während der Präparation konstant. Um den Gehalt an Komplex I und die Qualität der Präparation abzuschätzen, wurde das Verhältnis der HAR zu dNADH:DBQ Oxidoreduktase Aktivität in Membranen und isoliertem Superkomplex a bestimmt. Es war während der Präparation konstant. Die Bestimmung des Phospholipidgehalts aus isoliertem Superkomplex a im Vergleich zu P. denitrificans Membranen ergab eine Abnahme von 980 ± 80 nmol PL / mg Protein in Membranen auf 290 ± 10 nmol / mg Protein in isoliertem Superkomplex a, wohingegen der Ubichinongehalt von 2,7 ± 0,3 nmol / mg auf 6,7 ± 0,8 nmol / mg in isolierter Oxidase anstieg. Katalytische Aktivitäten von P. denitrificans Membranen des Parentalstamms und verschiedener Mutantenstämme zeigten, dass die Inaktivierung des Gens für fest gebundenes Cytochrom c552 die Bildung eines Superkomplexes nicht verhindern konnte, was ein Hinweis dafür ist, dass dieses Elektronen Carrier Protein nicht essentiell für die strukturelle Verbindung zwischen den Komplexen III und KIV ist. Komplex I Aktivität wurde ebenfalls in Membranen von Mutanten-Stämmen, denen Komplex III oder Komplex IV fehlte, gefunden. Jedoch enthielten diese Stämme keinen assemblierten Komplex I, sondern nur dissoziierte Untereinheiten des Komplexes. Trotz der Verwendung der selben Protokolle für die elektrophoretische Trennung und chromatographische Isolierung wie für Superkomplexe aus dem Wildtyp-Stamm, führte die Isolierung aus Mutantenstämmen, denen Komplex III oder IV fehlte, zum vollständigen Verlust der NADH:DBQ Oxidoreduktaseaktivität. Dies weist darauf hin, dass Paracoccus denitrificans Komplex I durch die Assemblierung in Form eines NADH Oxidase Superkomplex stabilisiert wird. Zusätzlich zum Substrat Channeling scheint die strukturelle Stabilisierung von Membran Protein Komplexen die Hauptaufgabe von respiratorischen Superkomplexen zu sein.
In der vorliegenden Arbeit sollten mittels eines Hefe zweihybrid screens neue Interaktionspartner von ARVCF, einem cadherinbindenden armadillo repeat Protein, gefunden werden. Hierbei wurde aus einer cDNA-Bank differenzierender Myoblasten das Cytoskelettprotein Alpha-actinin als Bindungspartner des armadillo repeat Proteins identifiziert. Der Befund aus dem Hefesystem wurde durch Immunofluoreszenzaufahmen, in welchen gezeigt wurde dass die beiden Proteine kolokalisieren, bestätigt. Auch eine Coimmunopräzipitation bestätigte eine Interaktion der beiden Proteine. Weiterhin konnte eine direkte Interaktion von ARVCF mit Alpha-actinin in in vitro Pull-Down assays gezeigt werden, wobei eine Eingrenzung der Bindungsregion von ARVCF für Alpha-actinin jedoch nicht möglich war. Als nächstes wurde ARVCF im Rahmen dieser Arbeit mittels Computeranalysen auf potentielle Phosphorylierungsstellen hin untersucht. In in vitro Kinase assays wurde eine Phosphorylierung des Proteins durch die Proteinkinase C (PKC) festgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die subzelluläre Lokalisation von ARVCF nach Behandlung der Zellen mit den PKC stimulierenden Cytokinen TNF-alpha und EGF, sowie mit dem Phorbolester PMA ändert. Hierbei wurde ein Ablösen des Proteins von der Plasmamembran und eine Lokalisation in cytoplasmatischen Aggregaten beobachtet. Dieser Effekt erwies sich als Zelltypunabhängig und Spezies übergreifend. Es konnte gezeigt werden, dass der N-Terminus der Splicevariante 5'alt ARVCF notwendig und ausreichend für den beobachteten Effekt ist. p120(ctn), das dem ARVCF am nächsten verwandte Protein, zeigte bei einer Behandlung von Zellen mit PMA oder den oben genannten Cytokinen keinen Effekt in Bezug auf Lokalisationsänderung. Ebenso wenig konnte eine Änderung der Lokalisation nach Behandlung für die Proteine Beta-catenin sowie E-cadherin beobachtet werden. Der erhaltene Effekt nach Stimulation der Zellen war somit spezifisch für ARVCF und konnte nicht für ein anderes hier untersuchtes Catenin oder Cadherin gezeigt werden. Eine stark abgeschwächte Cadherinbindung von ARVCF nach Inkubation der Zellen mit den Cytokinen oder PMA konnte im MOM-recruitment assay beobachtet werden. Auch dieser Effekt erwies sich als ARVCF spezifisch und konnte nicht mit p120(ctn) gezeigt werden. Weiterhin wurden chimäre Moleküle mit dem N-Terminus von ARVCF und dem Rest von p120(ctn) und vice versus hergestellt. Hierbei konnte die abgeschwächte Cadherinbindung im MOM-recruitment assay durch den N-Terminus von ARVCF auf p120(ctn) übertragen werden. Die chimären Moleküle ARVCF/p120(ctn) fanden sich nach Behandlung von Zellen nicht mehr in Aggregaten wieder, waren aber über das Cytoplasma verteilt. Es konnte kein Effekt auf Stimulation der Zellen mit dem chimären Protein p120(ctn)/ARVCF gezeigt werden. Durch diese Art von "gain of function" Experiment konnte noch einmal die Wichtigkeit und Spezifität des N-Terminus von ARVCF in Bezug auf die Reaktion auf PMA- oder Cytokinstimulation gezeigt werden. Auch die Punktmutante T50A, bei welcher eine potentielle Phosphorylierungsstelle der PKC von Threonin nach Alanin mutiert war, löste sich nach Stimulation der Zellen von den Cadherinen, wie im MOM-recruitment assay gezeigt werden konnte. Allerdings lokalisierte diese Mutante nach Behandlung der Zellen nicht in Aggregaten, sondern, wie zuvor schon das chimäre Protein ARVCF/p120(ctn), über das Cytoplasma verteilt. So konnte gezeigt werden, dass es sich bei der abgeschwächten Cadherinbindung und bei der Aggregatbildung um zwei klar voneinander trennbare Eigenschaften des Moleküls handelt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Zellzyklusabhängigkeit der CD95- vermittelten Apoptose besteht. Dazu wurde ein ecdysoninduzierbares Genexpressionsystem für die induzierte Überexpression der CDK-Inhibitoren p21 und p27 in RKO-Zellen (Kolonkarzinomzellen) zur Herbeiführung eines Zellzyklusarrests in der G1-Phase benutzt. Nach Induktion mit dem Ecdysonhomolog Muristeron wurde durch Zugabe von rekombinanten hCD95-Liganden Apoptose ausgelöst und anschließend untersucht. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass der Induktor Muristeron an sich und nicht die p21- bzw. p27-Überexpression die anti-apoptotische Akt-Kinase aktiviert, die Expression des anti-apoptotischen Bcl-xL erhöht, die Caspase-8-Aktivierung (entweder am CD95-DISC oder durch "Feedback"-Aktivierung durch Caspase-3) und die darauf folgenden Ereignisse verhindert und somit die hCD95L-induzierte Apoptose blockiert. Zusätzlich beeinflusst der Induktor auch das Genexpressionsmuster der behandelten Zellen, was ebenfalls für die Hemmung der Apoptose mit verantwortlich sein könnte. Somit ist das ecdysoninduzierbare Genexpressionsystem zur Apoptoseuntersuchung in RKO-Zellen nicht verwendbar. Mit der Untersuchung des Apoptoseverhaltens proliferierender RKO-Zellen konnte gezeigt werden, dass überlebende Zellen nach hCD95L-Behandlung vermehrt in der G0/G1-Zellzyklusphase nachweisbar sind, während apoptotische (Caspase-3-positive) Zellen aus der G2/M-Phase heraus sterben. Allerdings weisen die apoptotischen Zellen kaum Cyclin B1 auf, ein für die G2-Phase wichtiges und typisches Cyclin. Somit bleibt die genaue Verknüpfung von Zellzyklusregulation und Apoptose auch nach diesen Analysen ungeklärt. In einem dritten Ansatz - Zellzyklusarrest durch Dichtearretierung - konnte eine Hemmung der CD95- vermittelten Apoptose in der arretierten Zellpopulation nachgewiesen werden. Allerdings sekretieren RKO-Zellen einen anti-apoptotischen Faktor in ihr Medium, dessen Konzentration und Wirkung mit größerer Zelldichte zunimmt und somit für die Protektion, unabhängig von Zellzyklusarrest oder Proliferation, verantwortlich ist. Konfluente und auch mit konditioniertem Medium behandelte RKO-Zellen zeigen im Vergleich zu dünn ausgesäten RKO-Zellen Veränderungen, die denen sehr ähnlich sind die beim Übergang einer epithelverankerten Zelle zu einer migrierenden Einzelzelle (EMT) auftreten. Beispielsweise verändert sich die Zusammensetzung des Zytoskeletts, die Zellen verlieren den Zell-Zell-Kontakt und lösen sich ab, bleiben aber am Leben. Zusätzlich steigt die Sekretion von Zytokinen an, die Angiogenese, Migration und Invasion positiv beeinflussen. Sowohl konfluente als auch mit konditioniertem Medium behandelte sub-konfluente Zellen sind apoptoseresistent (hCD95L, TRAIL, UV, Staurosporin), woran u.a. die Kinasen PKC und PI3K, aber auch das anti-apoptotische Bcl-xL beteiligt sind. Die Zellen sterben interessanterweise, wenn ein agonistischer anti-CD95-Antikörper statt des rekombinanten CD95-Liganden verwendet wird, was vermuten lässt, dass eine mangelhafte Vernetzung der einzelnen DISC-Komplexe zur Apoptosehemmung führt, welche durch den Antikörper dann aber erzwungen wird. Zwar handelt es sich hierbei um ein reines Zellkulturmodell, dennoch könnte es bedeuten, dass die Umgebung in einer dichten RKO-Zellkultur vergleichbar ist mit der in größeren soliden Tumoren. Die Zellen brauchen Nährstoffe, versuchen über eine Neovaskularisierung Anschluss an ein Blutsystem zu finden und sekretieren Lockstoffe, Wachstumsfaktoren sowie Proteasen, um die Metastasierung zu erleichtern. PI3K, cPKCs und Bcl-xL tragen dabei zu einer Apoptoseresistenz bei, welche die Zellen zum einen resistent gegenüber Anoikis, Nährstoffmangel, aber auch gegen angreifende zytotoxische T-Zellen macht. Eine weitere Aufklärung der hier ablaufenden Prozesse würde es erleichtern, Möglichkeiten zu finden, in diese Signalwege einzugreifen, um die Apoptosesensitivität wieder herzustellen und die Metastasierung zu verhindern. Insbesondere ist die Identifizierung des für die Apoptoseprotektion verantwortlichen Zytokins das nächste wichtige Ziel bei der Fortsetzung dieser Arbeiten.
Das Projekt zum Thema - literarisch-essayistische Reisen zu Beginn der 70er Jahre bei Rolf Dieter Brinkmann, Rom, Blicke und Bernward Vesper, Die Reise stellt ein Experiment dar. Es geht um die wissenschaftliche Bestandsaufnahme des Phänomens 1968 und um das Motiv "Resignation". Die Annäherung erfolgt im Teil A auf wissenschaftlicher Basis, die sich im Teil B in eine literarische Herangehensweise wandelt.
Die Gruppe der T-Lymphozyten beinhaltet je nach Ausprägung des T-Zell-Rezeptors zwei Zell-Populationen, die der Alpha-beta- beziehungsweise der Gamma-delta-T-Zellen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit den Gamma-delta-T-Zellen, da sie eine außerordentlich interessante und wenig erforschte Zellgruppe darstellen. Die Beobachtung einer bevorzugten Anreicherung von Gamma-delta-T-Zellen auf mukosalen Oberflächen, die mit einer Vielzahl von Antigenen konfrontiert sind, hat zur Hypothese geführt, dass Gamma-delta-T-Zellen eine "erste Garde der Immunabwehr" bilden. Des weiteren geben zahlreiche Studienergebnisse Hinweise darauf, dass Gamma-delta-T-Zellen an der Pathogenese vieler Krankheiten, wie z. B. den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, beteiligt sind. Als Mitglied des Immunsystems scheinen Gamma-delta-T-Zellen nicht nur Funktionen sowohl der angeborenen als auch der erworbenen Immunabwehr wahrzunehmen, sondern auch eine Vermittlerrolle zwischen beidem zu spielen. Mit der Intention, ein grosses Tiermodel zu etablieren, um anhand dessen die Beeinflussbarkeit der Gamma-delta-T-Zellen durch die Alterung und durch mikrobielle Faktoren besser analysieren zu können, wurde in vorhergehenden Studien die postnatale Entwicklung des Gamma-delta-T-Zell-Rezeptor(TCR)-Repertoires des Schweins charakterisiert und der von Menschen als sehr ähnlich befunden. Somit war die Verwendung des Schweins als Tiermodell zur weiteren Erforschung der Gamma-delta-T-Zellen gerechtfertigt. In dieser Arbeit richteten wir unser Augenmerk zum einen auf die pränatale Entwicklung des TCR-delta-Repertoires des Schweins, zum anderen darauf, welchen Einfluß Mikroorganismen auf das postnatale TCR-delta-Repertoire des Schweins nehmen. Auf diese Weise sollte die Frage beantwortet werden, ob Fremd- oder Eigenantigene die Selektion und konsekutive Expansion bestimmter Gamma-delta-T-Zellklone in der Postnatalperiode bedingen. Hinsichtlich dieser Fragestellungen führten wir Experimente mit unterschiedlichen Gewebeproben des Schweins durch. Für die Untersuchung der pränatalen Entwicklung des TCR-delta-Repertoires verwendeten wir Gewebeproben von Schweinefeten unterschiedlichen Alters (38.Tag bis 114. Tag der Tragzeit), die aus den verschiedenen Organen stammten: Dünn- und Dickdarm, Leber, Milz und Thymus. Zusätzlich wurden Zellen des Knochenmarks und des peripheren Blutes untersucht. Für die Untersuchungen zum Einfluß durch Mikroorganismen auf das postnatale TCR-delta-Repertoire dienten uns Proben von 10 Wochen alten Schweinen, die unter keimfreien (GF) bzw. spezifisch-Pathogen-freien (SPF) Bedingungen aufgezogen wurden. Die Proben wurden aus Dünn- und Dickdarm, mesenterialen Lymphknoten, Milz und Thymus entnommen. Die Amplifikation der TCRDV1-DV5 Transkripte erfolgte mittels RT-PCR, woran sich eine längenabhängige Auftrennung durch denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese (CDR3 Längenanalyse) anschloß. Einzelne dominante Banden wurden aus den Gelen ausgeschnitten, reamplifiziert, teilweise kloniert und anschließend sequenziert. Unsere Experimente zur pränatalen Entwicklung ergaben, daß das TCR-delta-Repertoire während der frühen Fetalzeit eingeschränkt war und bei Geburt Polyklonalität aufwies. Die durchschnittliche CDR3 Länge der Transkripte nahm während der Ontogenese zu, was auf eine zunehmende Aktivität des Enzyms TdT schließen läßt. Die zentrale Entdeckung dieser Versuche stellt das invariable DV3 Transkript dar, das in allen Feten während der frühen Gestation (38. Tag der Tragzeit) bis hin zur Geburt (114. Tag der Tragzeit) vorhanden war. Während der Mitte der Gestation, etwa um den 55. Tag der Tragzeit, dominierte dieses invariable DV3 Transkript alle analysierten Organe. Gegen Ende der Gestation, also etwa vom 90. Tag bis zum 114. Tag der Tragzeit, verlor dieses Trankript an Dominanz. Gleichzeitig wurde es aber noch häufig in peripheren Organen wie dem Darm und der Milz gefunden. Im Thymus hingegen konnte es zu dieser Zeit nicht mehr nachgewiesen werden. Diese Beobachtung läßt vermuten, daß die invariable DV3 Kette gegen Ende der Gestation im Thymus nicht mehr länger entsteht, wohingegen Gamma-delta-T-Zellen, die diese invariable Kette tragen, in der Peripherie "überleben". Die Tatsache, daß kein anderes invariables TCR-delta-Transkript, welches in verschiedenen Feten präsent gewesen wäre, identifiziert werden konnte, führt zur Annahme, daß den Gamma-delta-T-Zellen, die diesen Rezeptor expremieren, eine einzigartige Rolle zukommen könnte. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die pränatale Entwicklung des TCR-delta-Repertoires des Schweins dem des Menschen ähnlich ist. Es ist jedoch anzumerken, daß beim Menschen kein TCR-delta-Transkript existiert, das das fetale Repertoire in gleicher Weise dominiert. Es bedarf weiterer Untersuchungen in der Zukunft, um die Frage zu klären, ob es sich bei dem invariablen DV3 Transkript des Schweins um das Ergebnis eines vorprogrammierten Rearrangements und/oder einer Selektion durch Eigenantige handelt, ferner, welche wichtige Funktion es während der fetalen Entwicklung erfüllt. Unsere Untersuchungen zum Einfluß durch Mikroorganismen auf das postnatale TCR-delta-Repertoire ergaben keine signifikante Differenz zwischen dem postnatalen TCR-delta-Repertoire von 10 Wochen alten keimfreien (GF) bzw. spezifisch-Pathogen-freien (SPF) Schweinen und dem bereits in Vorarbeiten beschriebenen Repertoire von gleichaltrigen konventionellen Schweinen. Diese Beobachtung veranlasst zur Annahme, daß eine Selektion bestimmter Gamma-delta-T-Zellen eher durch Eigenantige als durch Fremdantigene (z. B. Mikroorganismen) hervorgerufen werden könnte.
Die Familie der ubiquitären ATP binding cassette (ABC)-Membranproteine katalysiert unter Hydrolyse von ATP die Translokation von Substraten über biologische Membranen. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Struktur und Funktion des osmoprotectant uptake (Opu) Systems A aus B. subtilis untersucht, das aus drei Untereinheiten, der ATPase OpuAA, dem integralen Membranprotein OpuAB und dem Substrat-Bindeprotein OpuAC, besteht und unter hyperosmolaren Bedingungen die kompatiblen Solute Glycin-Betain (GB) und Prolin-Betain (PB) in die Zelle importiert, um eine Plasmolyse zu verhindern. Sämtliche Untereinheiten wurden getrennt oder als OpuAA/AB Komplex in E. coli überproduziert und bis zur Homogenität isoliert. OpuAA zeigte ein dynamisches Monomer-Dimer Gleichgewicht (KD= 6 µM), das durch Nukleotide beeinflusst wurde. Unter Bedingungen hoher Ionenstärke konnten Monomer und Dimer getrennt isoliert und analysiert werden. Die Affinitäten und Stöchiometrien der OpuAA/Nukleotid Komplexe wurden unter Verwendung des fluoreszierenden TNP-ATP bzw. einer Nukleotid-sensitiven Trp-Mutante des OpuAA untersucht. Das Monomer hatte ein Molekül TNP-ATP gebunden, während zwei Moleküle TNP-ATP in dimerem OpuAA detektiert wurden. Die Affinität von Nukleotiden zu OpuAA nahm in folgender Reihe zu: ATP<ATP/Mg2+<ADP/Mg2+. Eine Erhöhung der Ionenstärke bewirkte nicht nur eine Erniedrigung der KD-Werte von OpuAA/Nukleotid Komplexen, sondern auch eine Steigerung der ATPase Aktivität. In 1 M NaCl zeigte das Monomer basale ATPase Aktivität, während das Dimer nur sehr geringe Aktivität hatte, jedoch durch Zugabe von OpuAB und OpuAC aktiviert wurde. K+ wurde als ein Modulator der ATPase Aktivität von OpuAA identifiziert. Die Zugabe von TNP-ADP/Mg2+ induzierte in dimeren OpuAA einen konformellen Wechsel, der zu einem Zerfall des Dimers führte. Monomer und Dimer hatten gegenüber Nukleotiden unterschiedliche Affinitäten, was eine unterschiedliche Architektur der Nukleotid-Bindetasche implizierte. Die Architektur des OpuAA Dimers wurde mittels FRET untersucht. Dazu wurde OpuAA ortspezifisch mit Fluorophoren markiert und ein Verfahren etabliert, in dem die intermolekularen Distanzen des Dimers bestimmt werden konnten. Ein Vergleich der Distanzen mit anderen NBD Dimeren zeigte, dass OpuAA eine zu BtuD oder MalKE. coli vergleichbare Dimer Architektur mit einer head-to-tail Orientierung hat. Die Struktur des OpuAC/GB und OpuAC/PB Komplexes wurde durch Röntgenstrukturanalyse mit einer Auflösung von 2,7 Å bzw. 2,8 Å aufgeklärt und zeigte zwei globuläre Domänen, die über zwei Peptidsegmente miteinander verbunden waren. Die delokalisierte positive Ladung des Liganden war von einem cluster aus drei Trp-Resten, dem sog. "Tryptophan-Prisma", über kationische-p-Interaktion komplexiert. Nach Ligandenbindung wurden beide Domänen durch eine Wasserstoffbrücke zwischen den konservierten Asp22 und Trp178 überbrückt. Dieser molekulare Schalter wurde von OpuAC genutzt, um Affinitäten von GB und PB zu regulieren.
Die 2-DE-Technik wurde in der Mitte der 70er Jahre von O` Farrelle und Klose vorgestellt, die schon damals die Inhalte ganzer Zellen unter denaturierenden Bedingungen in hunderte bzw. tausende Proteinspots auftrennen konnten. Mangelnde Reproduzierbarkeit und fehlende Auswertungsmöglichkeiten verhinderten jedoch zu diesem Zeitpunkt eine breite Anwendung und damit größeres Interesse an der Methode. In den 80er Jahren erreichte die Methode mit der Einführung immobilisierter pH-Gradienten und der MALDI-Massenspektrometrie einen entscheidenden Wendepunkt. Seit dem Ende der 80er Jahren wird die Methode aufgrund der Möglichkeit der gleichzeitigen Proteinidentifizierung und Quantifizierung auch zunehmend in der Krebsforschung in der Suche nach neuen Markerproteinen eingesetzt. Das Uterusgewebe ist ein Organ, das während der reproduktiven Phase im Leben einer Frau ständig zyklisch verlaufenden physiologischen Änderungen unterworfen ist. Das Leiomyom, ein gutartiger monoklonaler Tumor aus den glatten Muskelzellen des menschlichen Uterus, ist eine der häufigsten gynäkologischen Erkrankung in der westlichen Welt, über deren Ursachen trotz intensiver Forschung nach wie vor fast nichts bekannt ist. Die 2-DE-Technik eignet sich in hervorragender Weise zur Untersuchung derartiger Abweichungen in der Proteinexpression während eines Krankheitsprozesses. Bezüglich der Methodenetablierung und ihrer Reproduzierbarkeit im speziellen Fall des Uterusgewebes bildet der Zellaufschluss der Probe, insbesondre aus harten Geweben, einen zentralen Punkt in der Erarbeitung der Methodik der 2-DE, da ein hohes Risiko besteht, einen großen Teil der Proteine schon während der ersten Probenbearbeitung zu verlieren. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue Aufschlussmethode für die Aufarbeitung des zähen Muskelgewebes ohne größere Proteinverluste entwickelt, indem das Uterusgewebe zunächst mechanisch (Ultra-Turrax) und anschließend mit Ultraschall homogenisiert wird. Die Solubilisierung der Proteinprobe bildet den zweiten wichtigen Punkt der 2-DE-Methodik. Die Solubilisierung während der Proteinextraktion und des Eintritts der Proteinprobe in die fokussierende Gel-Matrix, die aufgetragene Proteinmenge, die Fokussierungsparameter und die zweite Dimension wurde so optimiert, dass die Proteinauflösung eine konstant hohe Qualität auf den Gelen erreichte und damit eine semiquantitative Auswertbarkeit gesichert wurde. Bezüglich der Reproduzierbarkeit der Methode wurden die methodeninhärenten Probleme wie Gelfärbung, Probenpräparation und Auswertungsverfahren untersucht. Die Methodenvalidierung bezüglich der Gelfärbung zeigte, inwieweit die Auswertung, insbesondre bei schwachen Spots, beeinflusst werden kann. Im allgemeinen wurde die angewendete 2-DE-Technik für die Proteinanalyse des Uterus für gut reproduzierbar gefunden. Die Bestimmung der HKP lieferte die Grundlage einer gewebetypischen Proteindatenbank und erlaubt es außerdem, über die Gele ein Koordinationssystem zu legen, mit dem nachfolgende Proteinidentifizierungen erleichtert werden können. In dieser Arbeit konnten 48 Spots als HKP identifiziert werden. Als thematischer Schwerpunkt der Dissertation wurden die Abweichungen der Proteinexpression im Fall des Uterus myomatosus im Vergleich zu einem Kollektiv ohne muskuläre Pathologie des Uterus untersucht. Die Analyse der 2-DE von Patientenproben ergab gegenüber einer schwachen Expression bei den Vergleichsproben eine Überexpression von Prohibitin (PHB1), alpha-2-Aktin und human Growth Hormon Rezeptorprotein (hGhRP) im Endometrium bzw. im darunter liegenden subendometrialen Myometrium und eine hohe Expression im Tumorgewebe (Myomgewebe). Weiteres zeigte die 2-DE-Analyse bei Patientenproben eine Downregulation von zwei Proteinen (beta-4-Proteasom und Fibrinogen) im Gegensatz zur Expression bei den Gesunden. Die analytischen Ergebnisse aus Tumorgeweben verglichen mit den SE-und SS-Geweben derselben Patientinnen zeigten eine deutliche Expression von einigen Proteinen (Desmin, F-Actin, Transaldolase, Thioredoxin-Peroxidase und mutative Glutathion-Transferase), deren Expression in den morphologisch unauffälligen Geweben aller Schichten des Uterus nicht zu beobachten war.
Schichten V/Al-Intermetallischer Phasen und Schichten aus V(Al) (Schichtdicken 150- 300 nm) wurden durch Interdiffusion von V/Al- und V5Al8/V-Mehrfachschichten bei 400-800°C im Vakuum bei 3 x 10-8 mbar hergestellt. Des Weiteren wurden V5Al8-Schichten durch Sputtern einer V5Al8-Legierung erzeugt. Die Gesamtstöchiometrie der Schichten lag zwischen Al0,86V0,14 und Al0,19V0,81. Als Substrat dienten einkristalline (012) Saphirwafer. Die V/Al-Intermetallischen Phasen und V(Al) wurden im RTP-System bei 600-1250°C mit NH 3 umgesetzt. Zum Vergleich der Reaktivität wurden die V/Al- und V5Al8/V-Mehrfachschichten auch ohne vorherige Vakuumtemperung in NH3 getempert. Die Proben wurden mittels XRD, SNMS, TEM/EFTEM, ESCA, XRR und AFM untersucht. Die V/Al-Mehrfachschichten besaßen eine starke Welligkeit, die von der starken Al-Schichtdickenschwankung herrührte. Trotz dieser Welligkeit zeigten die V- und Al-Schichten der V/Al-Mehrfachschicht eine ausgeprägte Textur. Die V-Schichten waren (110) und die Al-Schichten (111) texturiert. Die Bildung von (112) texturiertem Al3V erfolgte bereits bei 400°C, die Bildung von (110) texturiertem V 5Al8 und V(Al) bei 700°C. In der Nähe der Oberfläche durchmischten sich die V- und Al-Schichten aufgrund von O- und C-Einlagerung während der Vakuumtemperung nicht vollständig, und man beobachtete die Bildung von V-Oxiden. Je größer der V-Gehalt der Intermetallischen Verbindung bzw. V(Al), desto größer war die Reaktivität gegenüber Sauerstoff. Bei der Nitridierung der durch Interdiffusion gewonnen Intermetallischen Phasen Al3V und V5Al8 beobachtete man die Bildung von (001) texturiertem AlN an der Oberfläche. Durch die Nitridierung verarmte die Intermetallische Phase an Aluminium und es bildeten sich die V-reicheren Intermetallischen Verbindungen. Weitere Nitridierung führte zur Bildung von (001) texturiertem V2N. Bei der Nitridierung von V0,81(Al)0,19 bildete sich zunächst V(Al)(N), das bei weiterer Nitridierung zunächst in V2N und schließlich in VN und AlN überging. Das Reaktionsverhalten der Intermetallischen Phasen und der V(Al)-Phase stimmte weitestgehend mit dem von Yong Du et al. berechneten ternären Al/V/N-Phasendiagramm überein. Bei der Nitridierung von V0,61(Al)0,39 beobachtete man jedoch ebenfalls die Bildung von V2N. Dies widerspricht dem berechneten V/Al/N-Phasendiagramm, nachdem sich bei dieser Zusammensetzung auch AlN bilden sollte. Möglicherweise ist das Zweiphasengebiet V(Al)(N) + V2N breiter. Die Intermetallischen Phasen Al3V und V5Al8 zeigten im Vergleich zu reinem Vanadium eine stark verminderte Reaktivität gegenüber NH3. Dies ist auf die Passivierung der Oberfläche durch die AlN-Bildung zurückzuführen. Die ebenfalls schwächere Reaktivität der V(Al)-Phase lässt sich mit der geringen Löslichkeit an Stickstoff in V(Al) und der sehr wahrscheinlich höheren Aktivierungsenergie für die V2N-Bildung erklären. Die Reaktivität der V/Al-Mehrfachschichten war deutlich größer als die der Intermetallischen Phasen. Hierfür ist mit Sicherheit der höhere Anteil an Korngrenzendiffusion verantwortlich. Zum anderen könnte Vanadium die AlN-Bildung katalysieren. Bei der direkten Nitridierung wurde die oberste V-Schicht zu einer VN-Schicht umgesetzt. Die Nitridierung ist also nahe der Oberfläche schneller als die Interdiffusion der Metalle. In Richtung der Oberfläche beobachtete man eine stark ansteigende Al-Konzentration, wofür die im Vergleich zu VN höhere Freie Enthalpie von AlN verantwortlich ist. Durch das Sputtern einer V5Al8-Legierung konnte das Problem der Oxidbildung bei der Interdiffusion umgangen werden. Eine dünne Aluminiumoxidschicht bildete sich jedoch bereits schon bei der Lagerung an Luft. Die Reaktivität der gesputterten V5Al8-Schichten unterschied sich nicht wesentlich von der interdiffundierter V/Al-Mehrfachschichten vergleichbarer Stöchiometrie. Tiefenprofilanalysen an nitridierten V5Al8-Schichten machten deutlich, dass zwischen 600 und 900°C eine bemerkenswerte Menge an Sauerstoff in die AlN-Schicht eingebaut wurde. Ab 900°C stieg die Dicke der Aluminiumoxinitridschicht stark an. Eine weitere Temperaturerhöhung auf 1250°C führte zu keiner sign ifikanten Zunahme der AlN-Schichtdicke, jedoch zu einer starken Reduktion des O-Gehalts im AlN. Gleichzeitig beobachtete man bei 1250°C eine partielle Ablösung der AlN-Schicht.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden auf dem Gebiet reaktiver Silicium-Spezies folgende apparative und experimentelle Forschungsergebnisse erzielt: Zunächst wurde eine Hochtemperatur-Pyrolyse Anlage entworfen, die mit Hilfe von Hochvakuum-Bedingungen (p< 5x10 hoch -9 mbar) Verdünnungseffekte simuliert, um die in der Gasphase erzeugten Moleküle unter solchen Bedingungen zu studieren, bei denen sie keine Folgereaktionen mit weiteren Partnern eingehen können. In die Apparatur integriert wurde ein Ofen (Tmax ungefähr gleich 1200°C) für die Pyrolyse von Stoffgemischen sowie zur Analyse des erzeugten Molekularstrahls ein Quadrupol-Massenspektrometer (0-300 amu, EI-Quelle, SEV). Es wurden Precursoren synthetisiert, die durch Thermolyse infolge intramolekularer Umlagerungen und Abspaltungen definierter Abgangsgruppen Si=X-Doppelbindungen (X= O, S) ausbilden. Diese Precursoren und ihre Pyrolyseprodukte wurden sowohl in der neuen Anlage als auch mittels eines vorhandenen PE-Spektrometers charakterisiert. Parallel zu den Synthesen wurden quantenmechanische Berechnungen an den Produkten der Pyrolysereaktionen durchgeführt, um ihre Eigenschaften, wie z.B. die Orbitalenergien und ihre Strukturparameter, zu bestimmen. Die Ergebnisse sollten die Interpretation der spektroskopischen Untersuchungen (PE und MS) unterstützen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Fragestellungen bearbeitet, die in anderen Teilprojekten der Arbeitsgruppe von essentiellem Interesse sind. Dabei wurden Lösungen zu Fragestellungen der direkten Si-C-Knüpfung und von Silylen-Reaktionen erarbeitet. Eine Versuchsreihe, die durchgeführt wurde, beschäftigte sich mit den Hochtemperaturreaktionen von SiCl4 und SiF4. Die flüchtigen Ausgangssubstanzen wurden im Pyrolyseofen bei ansteigenden Temperaturen mit pulverförmigem elementarem Silicium oder SiO umgesetzt. Hierbei wurden die Bildungsbedingungen von Dihalogensilylenen in der Gasphase optimiert. In einer weiteren Fragestellung wurden die Thermolyseeigenschaften von Si und SiO untersucht. Beide Feststoffe können ab einer Temperatur von ca. 1000°C und einem Druck von 2x10 hoch -6 mbar atomar bzw. molekular in die Gasphase überführt werden. Dort reagieren sie mit Halogensilanen unter Bildung von Silylenen und Chlorsilanen. Weiterhin wurde eine Disproportionierung von SiO zu Silicium und SiO2 unter hohen Temperaturen beobachtet; konsequenterweise wird dabei Sauerstoff freigesetzt. Weiterhin wurde versucht, die Produkte der Halogensilan-Pyrolyse mit Oxidationsmitteln wie Ethylenoxid zur Reaktion zu bringen. Zuletzt wurden Hydrolyse-Versuche mit SiCl4/SiF4 bzw. :SiCl2/:SiF2 und Wasser untersucht.
Die Entwicklung von Wirkstoffträgern für Antisense-Oligdesoxyonukleotide auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln stellt einen interessanten Ansatz für antivirale Strategien dar. So konnte gezeigt werden, dass bereits ab einem 1,5-fachen Massenüberschuss an Protamin eine spontane Komplexbildung mit Antisense-Wirkstoffen stattfindet, die einen Größenbereich von etwa 200 nm aufweisen und durch eine Oberflächenladung von ca. + 20 mV charakterisiert sind. Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften besitzen diese Nanopartikel nahezu ideale Eigenschaften, die intrazelluläre Verfügbarkeit von Antisense-Wirkstoffen entscheidend zu verbessern. Eine sehr gute zelluläre Aufnahme von Protamin/Antisense-Nanopartikeln konnte entsprechend in primären humanen Makrophagen als auch in lymphozytären T-Zellen gezeigt werden. Die Anwendung dieser Wirkstoffträger in den beschriebenen Zellen erwies sich dabei als sehr gut verträglich und zeigte keine toxischen Wirkungen in insgesamt drei unterschiedlichen Testverfahren zur Bestimmung der Zelltoxizität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Protamin/Antisense-Nanopartikel mit unmodifizierten Antisense-Oligodesoxynukleotiden ein sehr günstiges intrazelluläres Auflösungsverhalten besitzen, was zu einer kontinuierlichen Freisetzung des inkorporierten Antisense- Wirkstoffs führte. Dabei wurde deutlich, dass nach spätestens 72 Stunden ein vollständiger Zerfall des Nanopartikels stattfand und der Wirkstoff sich gleichmäßig in intrazellulären Kompartimenten verteilte. Im Gegensatz dazu stellen Protamin/Antisense-Nanopartikel mit modifizierten Phosphorothioat-Wirkstoffen ein äußerst stabiles System dar, das zu keiner merklichen intrazellulären Wirkstofffreisetzung selbst nach 72 Stunden führte. Es konnte gezeigt werden, dass Protamin/AS-ODN-Nanopartikel die Expression eines von einem lentiviralen Vektor exprimierten Reportergens konzentrationsabhängig in primären humanen Makrophagen inhibieren konnte. Die antivirale Wirksamkeit dieser Wirkstoffträger konnte auch gegen das HIV-1-spezifische Transaktivatorprotein Tat in transient transfizierten Zielzellen der HIV-1-Infektion spezifisch demonstriert werden. Hier wurde eine selektive Inhibition der Tat-vermittelten Transaktivierung von 35 % bei einer Konzentration von 2 MikroM in Jurkat-Zellen nachgewiesen. Auch in primären Makrophagen, die mit einem HIV-1-Wildtypisolat infiziert wurden, führte die Anwendung von Protamin/AS-ODN-Nanopartikeln mit spezifischen Sequenzen gegen ein HIV-1-Gen zu einer deutliche Reduktion der Virusausbreitung in der Kultur. Bei einer wiederholten Behandlung von HIV-1-infizierten Makrophagen mit Protamin/AS-ODN-Nanopartikel in einer Konzentration von 2 MikroM zeigten nur einige wenige Zellen eine Infektion mit dem Virus, während sich in unbehandelten Zellen eine komplett durchinfizierte Kultur manifestiert hatte. Entsprechend der ungünstigen Bioverfügbarkeit von AS-PTO-Wirkstoffen nach intrazellulärem Transport in Form von Protamin-Nanopartikeln konnte für diese Formulierungen keine biologische Wirkung in Zellkultursystemen nachgewiesen werden. Die Inkorporation von destabilisierenden Zusätzen in die Nanopartikelmatrix bietet hier Möglichkeiten, die intrazelluläre Dekomplexierung dieser Wirkstoffträger günstig zu beeinflussen. Als Neuentwicklung konnte ein kolloidales Trägersystem für siRNA-Wirkstoffe auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln entwickelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Protaminbase als auch Protaminsulfat siRNA-Wirkstoffe ab einem 2,5-fachen Massenüberschuss komplexieren. Protamin basierte Nanopartikel für siRNA-Wirkstoffe waren durch ein sehr günstiges Zellaufnahmeverhalten und fehlende zytotoxische Wirkung in primären humanen Makrophagen gekennzeichnet. Trotz dieser idealen Ausgangsbedingungen zeigten biologische Wirksamkeitstestungen sowohl gegen das endogene Protein Lamin A/C als auch virale Hemmversuche in HIV-1- infizierten primären Makrophagen nur marginale Effekte. Eine weitere Optimierung der Nanopartikelzusammensetzung und Untersuchungen zur intrazellulären Stabilität sind nötig, um die biologische Aktivität dieser Formulierungen entscheidend zu verbessern. Oberflächenmodifizierte Nanopartikel auf der Basis von Gelatine erwiesen sich in den durchgeführten Experimente als besonders vielversprechend. Hier konnte gezeigt werden, dass ein spezifisches Targeting von T-Zellen mit CD3-Gelatine-Nanopartikel realisiert werden kann, die auf ihrer Oberfläche kovalent einen anti-CD3-Antikörper tragen, der gegen die T-Zell spezifische Zeta-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes gerichtet ist. Untersuchungen mit konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie zeigten, dass dabei die Zellaufnahme dieser Wirkstoffträger von der Expression des durch den Antikörper erkannten Zielantigens auf der Oberfläche der Zielzellen ist. In Zellen mit besonders starker Expression des CD3-Epitops wurden Gelatine-Nanopartikel mit oberflächengebundenem anti-CD3-Antikörper zu einem sehr bedeutendem Ausmaß selektiv aufgenommen. In Kompetitionsexperimenten mit freiem anti-CD3-Antikörper konnte diese Aufnahme deutlich reduziert werden, was für die selektive Bindung und Internalisierung der CD3-Gelatine- Nanopartikel über den oberflächengebundenen Antikörper schließen läßt. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD3-Gelatine-Nanopartikel das Potential besitzen, als selektives Wirkstoffträgersystem für T-Zellen eingesetzt zu werden.
Mit der nichtenzymatischen templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA zu Selektionsexperimenten
(2004)
Die vorliegende Dissertation beruht auf der Nichtenzymatischen Templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA. Dazu inkubiert man einen farbstoffmarkierten Primer mit komplementären Templaten und aktivierten Monomeren, den 2-Methyl-Phosphorimidazoliden. Die Verlängerung des Primers wurde durch Gelelektrophorese mit anschließender Detektion des Fluoreszenzfarbstoffs nachgewiesen. Eine erfolgreiche Primerverlängerung ist an viele Vorraussetzungen gebunden. Wichtig ist, dass der Duplex in der A-Konformation vorliegt. Deshalb ist es nötig, dass wenigstens der Primer oder das Templat aus RNA besteht. Von großem Vorteil ist, wenn die Basenpaare drei Wasserstoffbrücken ausbilden können. Auch die Stapelwechselwirkung ist ebenso wichtig für eine effiziente Kettenverlängerung, der Einbau von Purinen verläuft besser als der Einbau von Pyrimidinen. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Durchführung eines nichtenzymatischen PCR-artigen Experiments möglich ist. Das Verlängerungsprodukt der Hin-Reaktion wurde durch eine präparative Polyacrylamid Gelelektrophorese isoliert. Dieses diente dann als Templat für die Rückreaktion. Das Experiment aus Hin- und Rückreaktion bildete die Grundlage für ein Selektionsexperiment. Die Template wurden dafür um Zufallspositionen erweitert, die zwischen die Primerbindestellen eingefügt wurden. Nach mehrmaligem Durchlaufen des Zyklus aus Hin- und Rückreaktion sollte es sich zeigen, ob sich bestimmte Nucleotide in den Sequenzen angereichert haben. Zur Analyse wurde eine Methode basierend auf einer RP-HPLC entwickelt. Die vollverlängerten Produkte wurden mittels Gelelektrophorese isoliert und durch basische Hydrolyse in Monomere gespalten. Nach anschließender enzymatischer Dephosphorylierung konnte der Anteil der Nucleoside durch RP-HPLC bestimmt werden. Die erste erfolgreiche Anwendung fand diese Methode in der Analyse des Einbaus gegenüber T (U). Hier konkurrieren nämlich D (A) durch Watson/Crick-Paarung und G durch Wobble-Paarung um die Bindestelle. Aus diesem Grund bildeten sich bei Templaten aus C und T und der Inkubation nur mit G-Imidazolid allein die vollverlängerten Produkte zu einem hohen Anteil. Bei Reaktionen mit den Imidazoliden G und D konnte gezeigt werden, dass gegenüber T der Watson/Crick Partner D etwa dreimal häufiger eingebaut wurde als G. Eine weitere wichtige Grundlage für ein Selektionsexperiment bildete die Untersuchung, ob sich gegenüber Zufallspositionen überhaupt eine Kettenverlängerung feststellen lässt. Dazu wurde die Verlängerung unterschiedlicher Primer mit Templaten untersucht, die an einer oder mehreren Stellen Positionen aus [C/T] oder [A/C/G/T] enthielten. Es war deutlich zu sehen, dass die Verlängerung an solchen random-Sequenzen möglich ist. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn man entweder nur mit 2-MeImpG allein oder mit 2-MeImpG und 2-MeImpD inkubierte. Die Verwendung aller vier Imidazolide aus C, D, G und U führte zwar auch zu vollverlängerten Produkten, ihr Anteil war aber deutlich geringer. Eine andere wichtige Aufgabe dieser Dissertation war die Aufklärung der Ursache für die kritische Länge der Template. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung von G-Quadrupelsträngen nicht der Grund ist, der den reibungslosen Einbau an längeren "homoC" Templaten verhindert. Zusätze von NaCl oder LiCl beeinflussten die Effizienz dieser Reaktionen kaum. Gute Resultate wurden bei der Verlängerung an Homopyrimidin-Templaten, die aus C und T bestanden, erzielt. Das vollverlängerte Produkt bildete sich bei der Verwendung von 2-MeImpG und 2-MeImpD in hohen Ausbeuten. Interessante Resultate ergaben sich im Fall des Einbaus von C an "homoG" Templaten. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn völlig auf Na+-Ionen verzichtet wurde. Die Verwendung von Li-Imidazoliden, die auch in höherer Konzentration eingesetzt werden konnten, steigerte die Effizienz dieser Reaktionen deutlich. Durch das reduzierte stacking liefen alle Reaktionen allerdings langsamer und unvollständiger ab als beim Einbau von G an "homoC" Templaten. Die Stabilisierung des Duplexes durch stacking ist also entscheidend für erfolgreiche Primerverlängerungen. Überraschend schlechte Ergebnisse waren zu beobachten, wenn die Template gleichzeitig aus G und C aufgebaut waren. Die vollständig verlängerten Produkte wurden zu einem sehr geringen Anteil gebildet. Zusätzlich zum geringeren stacking der Pyrimidine, wurden Unregelmäßigkeiten in der Doppelhelixstruktur, die durch das abwechselnde Auftreten von Purinen und Pyrimidinen verursacht worden sind, als Ursache ausgemacht. Als neue Vorrausetzung für eine effiziente Kettenverlängerung hat sich also das Vorliegen einer regelmäßigen Doppelhelixstruktur herausgestellt.
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Familie der beta-Herpesviridae. Bis zu 80% menschlichen Bevölkerung sind weltweit mit dem Virus infiziert. Nach einer meist asymptotischen Erstinfektion persistiert HCMV lebenslang in seinem Wirtsorganismus. Im Laufe der Evolution wurden von einigen Herpesviren verschiedene Strategien entwickelt, um der Antigenprozessierung und damit der zellulären Immunantwort zu entgehen. Das HCMV-Protein US6 blockiert die Antigenpräsentation via MHC I. US6 ist ein ER-ständiges Typ I Transmembranglykoprotein bestehend aus einer Signalsequenz, einer ER-luminalen Domäne, einer Transmembranhelix und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminus. US6 inhibiert den TAP-abhängigen Peptidtransport aus dem Zytoplasma in das ER-Lumen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die ER-luminale Domäne von US6 bestehend aus der Primärsequenz 20-146 heterolog in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies rückgefaltet. Das rückgefaltete Protein erwies sich als Monomer (15,6 kDa). Die in der ER-luminalen Domäne befindlichen acht Cysteine bilden ein intramolekulares Netzwerk aus vier Disulfidbrücken. Zur Aufklärung des molekularen Inhibitionsmechanismus von US6(20-146) wurden verschiedene in vitro TAP-Funktions-Assays angewendet. Die Bindung von US6 an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung in den zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid- und ADP-Bindung von TAP ist nicht beeinflusst, durch die Inhibition der ATP-Bindung wird jedoch die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse unterbunden. Für die Inhibitionsreaktion konnte ein halbmaximaler Inhibitionskoeffizient (IC50) von 1 µM ermittelt werden. Für die inhibitorische Aktivität von US6 sind die C-terminalen Aminosäuren 126-139 der ER-luminalen Domäne von US6 verantwortlich. Die innerhalb dieser Region befindlichen Aminosäuren Cys127, Cys129, D130, W134 und R138 wurden gegen Serin bzw. Alanin ersetzt. Dies hatte keine Auswirkung auf die Aktivität von US6(20-146). Auch ist der N-Terminus von US6 nicht essentiell für die Aktivität.
Die Promotionsarbeit stellt sich die Aufgabe, den christlichen Missions- oder Sendungsbegriff in seinem nachkonziliaren Verständnis durch eigene Feldforschung empirisch zu überprüfen. Am Beispiel von überwiegend von Christen durchgeführter Entwicklungsarbeit mit Frauengruppen in Indien kann der v.a. geschichtlich belastete Missionsbegriff revidiert werden. Im Schnittfeld von Soziologie/Ethnologie einerseits und Praktischer sowie Systematischer Theologie andererseits stehend gliedert sich die Arbeit in drei große Teile: Theorie-Teil A. Untersuchung des bisherigen Missionsbegriffs, Empirie-Teil B. Theoriegenerierung aus den erhobenen Daten des Entwicklungsprojektes und Synthese-Teil C. Rückfragen aus der Projektanalyse an den christlichen Sendungsbegriff. Teil A diskutiert die mit dem Zweiten Vatikanum eingeläutete Wende des Missionsverständnisses weg von einer geographischen Begrenzung hin zu einer Wesensaktivität der Kirche und die teilweise Rücknahme dieses Neuverständnisses in nachkonziliaren kirchenamtlichen Dokumenten. Sodann wird das Verständnis von Mission bzw. christlicher Sendung in der heutigen theologischen Forschung unter Einschluss der indischen Theologie dargestellt. Gerade in Indien wird die historische Belastung des Begriffs Mission und zugleich ein Bedarf an missionarischen Handeln in Form von Zeugnis geben deutlich. Vier entscheidende Leitfragen, welche durch die Feldforschung zu beantworten sind, resultieren daraus: Wer betreibt Mission? Bei welcher Zielgruppe spricht man von Mission? Wie ist Mission einzugrenzen? Was ist eine missionarische Tätigkeit? Teil 3 wertet die Daten der Feldforschung in einem südindischen Dorf aus. Dabei gewährleistet die Methode der Grounded Theorie als reflexiv-parallel verlaufender Prozess der Datengewinnung, Datenauswertung und Dateninterpretation, dass theoretische Missionsansätze nicht als Hypothesen herangezogen werden. Die Datenanalyse orientiert sich an der rekonstruktiven Sozialforschung. Der Teil C diskutiert anhand der vier Leitfragen den Überschuß des bisherigen, in Teil A diskutierten Sendungsbegriffs, der im Projekt noch nicht zum Tragen kommt, und zugleich seine Mängel, welche die Projektauswertung aufzeigt. Daraus resultiert: (1) Die Identifikation mit dem christlichen Glauben beinhaltet per se eine missionarische Dimension, jeder Christ handelt also unbewusst missionarisch. (2) Dieses missionarische Handeln geschieht sowohl gegenüber Christen wie gegenüber Nicht-Christen, jedoch ist die Kommunikationsweise verschieden. (3) Deswegen wird zwischen innerer und äußerer Mission unterschieden: Äußere Mission findet überall dort statt, wo Christen mit Nicht-Christen kommunizieren. Sie endet gegebenenfalls bei deren freier Entscheidung für das Christ-sein. Dort, wo die äußere Mission zu einer Identifizierung mit dem Inhalt der christlichen Botschaft führt, beginnt die innere Mission, welche nie endet. (4) Insofern ist jedwedes bewusste und unbewusste, verbale und non-verbale Kommunizieren eines überzeugten Christen als missionarische Tätigkeit zu bezeichnen. Entsprechend wird Entwicklungsarbeit, von Christen durchgeführt, auch zu einer missionarischen Tätigkeit, sofern Christen aus ihrem Christ-sein heraus leben und handeln.