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Zu den wichtigsten Zielgrößen der Unternehmen gehört die Kundenzufriedenheit. Diese wird von Unternehmensseite mit Hilfe von technischen Hilfsmitteln gemessen und analysiert, um sie kontinuierlich steigern zu können. Dabei spielt vor allem eine große Rolle, welche internen oder externen Faktoren mit der Kundenzufriedenheit in Zusammenhang stehen und diese beeinflussen. Der Einfluss der Mitarbeiterzufriedenheit auf die Kundenzufriedenheit wurde vor allem in den letzten Jahren verschiedentlich diskutiert. In der Automobilindustrie kann von einer positiven Wirkung der Händlerzufriedenheit auf die Zufriedenheit der Kunden ausgegangen werden. Dabei werden nicht alle Zufriedenheiten des Händlers mit den Leistungen des Herstellers einen gleich großen Einfluss ausüben. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, welche Händlerzufriedenheitsdimensionen auf die Service- und auf die Kaufzufriedenheit des Kunden wirken. Diese Fragestellung wurde anhand eines, in einem deutschsprachigen Land erhobenen, Datensatzes von einem deutschen Premium-Automobilhersteller analysiert. Es wurden sämtliche Händlerzufriedenheiten mit dem Hersteller als auch alle Zufriedenheiten mit den Kundenprozessen abgefragt und nach einer Dimensionalitätsprüfung mittels der Analysemethode Hierarchisch Lineare Modelle getestet. Wie erwartet bestätigte sich die Hypothese, dass die Händlerzufriedenheit einen positiven Einfluss auf die Kundenzufriedenheit mit dem Service hat. Bei den Testungen des Zusammenhangs mit der Kundenkaufzufriedenheit ergaben sich jedoch keine signifikanten Ergebnisse. Auffällig ist bei den Ergebnissen auch, das nur die Händlerzufriedenheiten eine Wirkung aufweisen, bei denen eine Beziehungskomponente mit dem Hersteller im Vordergrund steht und es weniger um die standardisierten Leistungen des Herstellers in Bezug auf die Produkte geht. Die Relevanz dieser personalen Elemente und die Differenzierung zwischen dem Service- und dem Kaufprozess werden diskutiert.
Determinanten der Langzeitprognose von Patienten mit implantierbaren Cardioverter-Defibrillatoren
(2010)
Die Effektivität der ICD-Therapie in der Verhinderung des Plötzlichen Herztodes ist unbestritten. Implantierbare Defibrillatoren können ventrikuläre Tachykardien und Kammerflimmern mit hoher Sicherheit beenden und damit den Plötzlichen Herztod mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit verhindern. Die vorliegende Studie untersuchte Determinanten der Langzeitprognose von Patienten nach ICD-Implantation. Dabei zeigte sich in unserer Studie bei einer jährlichen Mortalität von 7,2% eine Sterblichkeit am Plötzlichen Herztod von < 1% pro Jahr, was den Nutzen des ICD unterstreicht. Bei der Analyse der Mortalitätsparameter waren ein hohes Alter der Patienten, fortgeschrittene Herzinsuffizienz mit entsprechendem NYHA-Stadium sowie eine deutlich eingeschränkte linksventrikuläre Ejektionsfraktion gute Vorhersagevariablen für die Prognose nach ICD-Implantation mit hohem prädiktiven Wert für die Mortalität. Ebenso scheint die ICD-Indikation ein wichtiger Parameter für die Langzeitprognose zu sein (sekundärprophylaktisch ICD-implantierte Patienten verstarben signifikant häufiger als Patienten, die zur Primärprophylaxe mit einem ICD versorgt wurden), primärprophylaktische Patienten stellen ein Patientenkollektiv mit per se besserer Prognose dar. Bezüglich der Auswertung des Auftretens adäquater Therapien erwiesen sich männliches Geschlecht, hohes Alter, Einnahme antiarrhythmischer Medikation sowie die sekundärprophylaktische ICD-Indikation als bedeutsame Parameter für eine erhöhte ICD-Interventions-Wahrscheinlichkeit. Zur Frage der prognostischen Bedeutung adäquater Therapien zeigte sich, dass im Auftreten adäquater Therapien ebenfalls eine gute Vorhersagevariable für die Langzeitprognose zu sehen ist. Die Auftretenswahrscheinlichkeit von adäquaten ICD-Therapien korrelierte jedoch nichtsignifikant mit dem Plötzlichen Herztod und somit scheinen vorhergehende ICD-Interventionen kein erhöhtes Risiko für diesen darzustellen. Die technische Weiterentwicklung hat in den letzten Jahren zu einer Größenreduktion der ICD´s, zur Vereinfachung der Systemimplantation mit verschwindend geringen peri- und postoperativen Komplikations- und Mortalitätsraten sowie durch die Verlängerung der Systemlebensdauer zum zunehmenden Einsatz von implantierbaren Defibrillatoren als bevorzugte Therapieform mit unbestrittener Effektivität in der Terminierung lebensbedrohlicher Arrhythmien, geführt. Trotzdem wären zukünftig prospektive Studien zur weiteren Risikostratifizierung und Evaluation möglicher diagnostischer Marker zur noch genaueren Abgrenzung von Hochrisikopatienten wünschenswert. Zukünftiges Ziel sollte es zudem sein, diejenigen Patientenpopulationen sicher zu identifizieren, die zwar ein geringeres individuelles Risiko haben dem Plötzlichen Herztod zu erliegen, jedoch absolut gesehen häufiger daran versterben.
Development and characterization of histamine H3 and H4 receptor ligands as pharmacological tools
(2010)
Histamin gilt seit seiner Entdeckung vor ungefähr 100 Jahren als ein wichtiger chemischer Botenstoff im Organismus. Der Transmitter vermittelt pleiotrope Effekte über vier bisher bekannte G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (H1R-H4R), die in die Regulation vielfältiger physiologischer Funktionen involviert und an der Entstehung von Krankheiten beteiligt sind. Antagonisten der ubiquitär im Organismus exprimierten H1R und H2R werden weitreichend zur Therapie von allergischen Erkrankungen bzw. Geschwüren im Gastrointestinaltrakt eingesetzt. H3R und H4R sind die jüngsten Vertreter der Histamin-Rezeptor-Klasse (HR). Auf molekularer Ebene zeigen diese beiden Subrezeptoren einen hohen Verwandtschaftsgrad. Sie ähneln sich u.a. bezüglich ihrer Aminosäuresequenz, ihrer Struktur und der Bindungseigenschaften von Liganden. Beide sind funktionell an inhibitorische/olfaktorische G-Proteine gekoppelt. Negative Rückkopplungsmechanismen werden durch ein hohes Maß an konstitutiver Aktivität ermöglicht. Dies unterstreicht die modulierende Funktion beider Rezeptoren, die wichtige physiologische Prozesse im Gleichgewicht hält. Als Auto- und als Heterorezeptor kommt der H3R hauptsächlich im zentralen Nervensystem vor. Er kontrolliert die Synthese und Freisetzung seines endogenen Liganden, moduliert aber auch die Konzentration anderer Neurotransmitter im synaptischen Spalt, die aus ko-lokalisierten Neuronen freigesetzt werden. Aus diesem Grund nimmt das neuronale histaminerge System eine entscheidende Rolle in der Erhaltung physiologischer Prozesse, wie z.B. Erregung, Aufmerksamkeit und Ernährungsverhalten, ein. Ein Ungleichgewicht der Neurotransmitterkonzentrationen kann die Entstehung neuronaler Erkrankungen verursachen, z.B. neurodegenerative Erkrankungen, Aufmerksamkeitsstörungen oder Übergewicht. Pitolisant ist der erste inverse H3R-Agonist, der sich in Phase III der klinischen Prüfung befindet. Sein erfolgreicher Einsatz bei verschiedenen pathophysiologischen Zuständen kann als Beweis für das H3R-antagonistische Therapieprinzip angesehen werden. Im Gegensatz zum H3R wird der H4R hauptsächlich in der Peripherie exprimiert, wo er an der Modulation des Immunsystems und an der Entstehung entzündlicher Prozesse beteiligt ist. Ergebnisse aus ersten präklinischen Studien sind teilweise widersprüchlich,weisen aber darauf hin, dass H4R-Liganden potenziell zur Therapie von allergischen und entzündlichen Erkrankungen entwickelt werden könnten. In beiden Forschungsgebieten müssen fundamentale Fragen noch geklärt werden, z.B. die Bedeutung von Rezeptor-Isoformen, die Rolle von Rezeptor-Heterodimeren oder die Aufklärung therapeutischer Prinzipien. Zudem müssen Liganden-Bindundgsmodi charakterisiert werden, um in der Zukunft weitere Bindungsareale in den jeweiligen Bindetaschen optimal zu nutzen. Hierdurch können Affinität, Aktivität und Selektivität von Liganden gesteuert werden. Diese Fragestellungen verdeutlichen den Bedarf an neuen Leitstrukturen und pharmakologischen Werkzeugen, die im Rahmen dieser Arbeit synthetisiert wurden. Im Vordergrund des H3R-Projektes standen Prinzipien des bioisosteren Austauschs, um dadurch die Entwicklung verschiedener Vorstufen für Liganden zum Einsatz in bildgebenden Verfahren zu ermöglichen. Ziel des H4R-Projektes war die Etablierung einer neuen Leitstruktur sowie deren Modifikation und Optimierung, um eine für die Aufstellung von Struktur-Wirkungsbeziehungen geeignete Substanzbibliothek zu erhalten. Mit Hilfe verschiedener In-vitro- und In-silico-Experimente wurde diese Bibliothek zur Charakterisierung der H4R-Bindetasche herangezogen und kann zukünftig auch in-vivo verwendet werden. Zu Beginn der Arbeit wurde von wenigen bekannten H4R-Liganden ein Pharmakophormodell abgeleitet. In seinen Grundbausteinen zeigte es große Ähnlichkeit zu einem schon etablierten H3R-Antagonist-Modell, was den hohen Verwandtschaftsgrad der Zielstrukturen widerspiegelte und auf überlappende Struktur-Wirkungsbeziehungen hinwies. Für die Synthese der Liganden bedeutete dies, dass präparative Methoden von einem auf das andere Gebiet übertragen werden konnten. Aufgrund des unterschiedlichen Forschungsstandes werden beide Projekte im Folgenden getrennt behandelt. Die Synthese der nötigen Vorstufen zur Darstellung von H3R-Antagonisten/inversen Agonisten wurde mittels im Arbeitskreis evaluierter Methoden durchgeführt. Standardmethoden wie reduktive Aminierungs- oder Amidierungsreaktionen wurden herangezogen, um das 1-(3-Phenoxypropyl)piperidin-H3R-Pharmakophor (1) zu erweitern. Zusätzlich wurden Triazole als alternative verknüpfende Elemente erprobt, um ein zweites basisches Zentrum, das potenziell Nebenwirkungen hervorruft, zu vermeiden. Die Triazole wurden in einem Klick-Chemie-Ansatz mittels 1,3-dipolarer Zykloaddition nach HUISGEN dargestellt. Sowohl die Zyklisierung als auch die Synthese entsprechender Azid-Vorstufen wurden erfolgreich etabliert und für die Synthese von Liganden aminerger Rezeptoren optimiert. Phenyl- und Benzylgruppen wurden mit dem H3R-Pharmakophor 1 verknüpft, um eine strukturelle Basis zu erhalten, die den Vergleich mit weiteren Liganden ermöglicht. Im Folgenden wurden der zentrale Phenylether sowie die Arylreste im rechten Teil des Pharmakophors durch derartige Gruppen ersetzt, die komplexierende Eigenschaften besitzen und damit zur Darstellung von entsprechenden SPECT (dt. Einzelphotonen- Emissions-Tomografie)-Liganden geeignet sind. Der elektronenziehende und sterisch anspruchsvolle Charakter der Trifluormethylgruppen in Verbindungen 8–10 spiegelt sich sowohl in der reduzierten chemischen Aktivität der jeweiligen Edukte als auch in der nur moderaten H3R-Affinität wider. Daher wurden diese Elemente nicht weiter verfolgt. Mit den Ferrocen-Derivaten 11–15 wurden zum ersten Mal metallhaltige H3R-Liganden entworfen. Die pharmakologische Charakterisierung dieser Verbindungen zeigte, dass die Sandwichkomplexe sich hervorragend zum bioisosteren Ersatz der Phenylreste eignen. Die Affinitäten der analogen Verbindungen sind vergleichbar und liegen im niedrigen nanomolaren Konzentrationsbereich. Der invers-agonistische Charakter des H3RPharmakophors wurde anhand der Verbindungen 11 und 15 bestätigt. Eine vorläufige invivo-Testung der hochaffinen Diamine 11 und 12 zeigte keine zufriedenstellenden Ergebnisse und muss durch weiterführende Untersuchungen ergänzt werden. Verbindung 15 wurde zur Weiterentwicklung zu einem potenziellen SPECT-Liganden ausgewählt. Die elektronenziehenden Eigenschaften des verknüpfenden Triazols erleichterten die Umkomplexierung des Ferrocens zu einem (Tricarbonyl)rhenium-Derivat, jedoch konnten Probleme bei der Aufreinigung einer nicht-radioaktiv markierten Analogverbindung mit den zur Verfügung stehenden chromatographischen Methoden nicht bewältigt werden. Gleichwohl wurden mit den Ferrocen-Verbindungen wertvolle bioisostere Analoga entsprechender SPECT-Liganden synthetisiert. Die Einführung von polaren Kojisäure-Derivaten stellte einen weiteren Ansatz zur Entwicklung von Liganden mit komplexierenden Eigenschaften dar. Außerdem sollten die Molekülgröße reduziert werden, um die Blut-Hirn-Gängigkeit zu erleichtern, und neue Leitstrukturen mit potenziell neuroprotektiven Eigenschaften entwickelt werden. In einem Nebenprojekt wurden Rac1-Inhibitoren dargestellt, die Kojisäure als zentrales Element aufwiesen. Die hier etablierten Synthesewege wurden zur Darstellung der H3RLiganden genutzt. Trotz erheblicher, für g-Pyranone typischer Nebenreaktionen konnte eine Reihe von H3R-Liganden synthetisiert werden (18–24). Die Affinitäten dieser Verbindungen zeigten eine auf den rechten Teil des H3R-Pharmakophors beschränkte bioisostere Potenz von Kojisäure-Derivaten. Besonders die Diamine aus dieser Serie sind als Leitstrukturen für die Entwicklung neuroprotektiver Liganden geeignet. Die neuen H3R-Liganden enthalten außergewöhnliche strukturelle Elemente, die in dieser Art zum ersten Mal am H3R getestet wurden. Die Ergebnisse aus den Bindungsstudien zeigten Grenzen und Möglichkeiten des bioisosteren Ersatzes im zentralen und im rechten Teil des Pharmakophors. Die Verbindungen sind wertvolle Modellsubstanzen, die zur Charakterisierung von lipophilen und hydrophilen Arealen in der H3R-Bindetasche verwendet werden können, und eignen sich als Leitstrukturen, um neue H3R-Liganden mit verschiedenen pharmakologischen Schwerpunkten zu entwickeln. Basierend auf einem von wenigen Referenzliganden abgeleiteten Pharmakophormodell wurde das H4R-Projekt mit verschiedenen Screening-Verfahren initiiert. In-silico wurde nach Fragmenten und neuen Pharmakophoren gesucht, um diese im Folgenden mit Hilfe von klassischen Verfahren der medizinischen Chemie zu modifizieren und zu optimieren. Innerhalb einer Strukturklasse wurden zunächst nur wenige Verbindungen synthetisiert. Zeigten diese ein unzureichendes Bindungsverhalten, wurde die Entwicklung eingestellt. In einem virtuellen Screening wurden zwei heterozyklische Strukturen mit Affinitäten im niedrigen mikromolekularen Konzentrationsbereich identifiziert, die zur Entwicklung einer Reihe von Aminopyrimidinen führten. Ähnliche Verbindungen wurden zeitgleich zu unserem Projekt von der pharmazeutischen Industrie untersucht und durch weitreichende Patente geschützt. Die neue Leitstruktur, N4-Benzyl-6-(4-methylpiperazin-1-yl)pyrimidin-2,4-diamin (46), wurde umfangreich derivatisiert. Prinzipien wie Heteroatom-Austausch, Rigidisierung und Modifikation des Substitutionsmusters am Benzylring nach TOPLISS wurden angewendet, um das Pharmakophor hinsichtlich Affinität, Funktionalität und Selektivität zu diversifizieren und zu optimieren. Die Synthese der Verbindungen 44–71 erfolgte hauptsächlich unter Mikrowelleneinstrahlung. Da konventionelle präparative Methoden keine Produktbildung ermöglichten, wurde eine sequentielle Mikrowellensynthese etabliert, mit Hilfe derer die gewünschte Umsetzung schnell und in hohen Ausbeuten erzielt wurde. Initialschritte zur Darstellung von Fluoreszenzliganden, die auf dem Aminopyrimidin-Pharmakophor basieren, wurden mit Verbindungen 72–75 erfolgreich realisiert. Bezüglich ihrer H4R-Affinität sollten diese Liganden in Zukunft weiter optimiert werden. Struktur-Wirkungsbeziehungen der Verbindung 46 und entsprechender Derivate zeigten, dass Affinitäten im niedrigen nanomolaren Konzentrationsbereich durch die Einführung kleiner, lipophiler benzylischer Substituenten in ortho-Position erreicht werden (z.B. durch 2-Cl- und 2-CH3-Reste in Verbindungen 58 und 59). In Verdrängungsstudien wurde das Bindungsverhalten ausgewählter Verbindungen an anderen HR-Subtypen untersucht. Die Liganden zeigten Selektivität in Bezug auf H1R und H2R und eine Präferenz für den H4R gegenüber H3R. Das 2,6-Dichlor-Derivat 62 stellte eine der potentesten und selektivsten Verbindungen dieser Serie dar. Das Substitutionsmuster des Benzylrestes beeinflusste die Effektivität der Liganden in großem Maße: Ortho- und para-substituierte Verbindungen zeigten in [35S]GTPgS-Bindungsstudien Partialagonismus. Mit steigendem Radius der para-Substituenten wurde eine Verschiebung zum neutralen Antagonismus und zum schwachen inversen Agonismus beobachtet, während meta-Substituenten ausgeprägten inversen Agonismus verursachten. Dieser wurde durch die Rigidisierung der Benzylamin-Gruppierung weiter verstärkt. Verbindung 69 zeigte sogar eine höhere invers agonistische Potenz als der Referenzligand Thioperamid. Um Hinweise auf die strukturellen Voraussetzungen für Agonismus und Antagonismus zu erhalten, wurde eine Moleküldynamiksimulation durchgeführt. Nach der virtuellen Ligandenbindung nahmen der Partialagonist 49 und der inverse Agonist 69 gegensätzliche Bindemodi in der H4R-Bindetasche ein. Die Bindung des inversen Agonisten wurde durch einen scheinbaren „ionic lock“, der hier zum ersten Mal postuliert wurde, stabilisiert. Da in-silico-Experimente von anderen Forschergruppen teilweise gegensätzliche Ergebnisse zeigten, sollten zusätzliche Untersuchungen durchgeführt werden, um zu klären, ob unterschiedliche Bindemodi durch gegensätzlicher Effektivitäten oder verschiedene Pharmakophore hervorgerufen werden. Die Aminopyrimidine stellen exzellente pharmakologische Werkzeuge dar. Die große Diversität bezüglich der Effektivität, die innerhalb einer Strukturklasse vom Partialagonismus bis zum inversen Agonismus reicht, bietet eine geeignete Grundlage, um potenzielle therapeutische Anwendungsbereiche von H4R-Liganden zu untersuchen und zu klären, welche Effekte aus der Aktivierung, Blockade oder Hemmung des H4R resultieren. Klassische Methoden der medizinischen Chemie wurden zur Entwicklung von Liganden zweier eng verwandter Zielstrukturen, H3R und H4R, verwendet. Im H4R-Projekt wurden zusätzlich Computer-gestützte Methoden herangezogen. Die Modifizierung und Optimierung verschiedener Leitstrukturen führte zu der Synthese von 75 Endverbindungen. Das H3R-Projekt, aus dem 22 dieser Verbindungen resultierten, fokussierte auf Prinzipien des Bioisosterismus. Triazole, Ferrocene und Kojisäure-Derivate wurden zum ersten Mal in ein H3R-Pharmakophor integriert. Die Eignung dieser Elemente als bioisosterer Ersatz des zentralen Phenylethers oder der Arylreste im rechten Molekülteil wurde untersucht. Mit dem hieraus gewonnenen Wissen wurden SPECT-Ligand-Vorstufen optimiert. Neue Leitstrukturen mit außergewöhnlichen Elementen stellen zudem Modellsubstanzen dar, die zur anhaltenden Charakterisierung der H3R-Bindetasche dienen. Auf dem H4R-Gebiet gehören die Aminopyrimidine zu einer der am weitesten entwickelten Substanzklassen. Die Derivatisierung der 31 synthetisierten Verbindungen verspricht neue Kenntnisse über diese Stoffklasse. Vor allem inverse Agonisten sollten auf ihre therapeutische Anwendbarkeit als Immunmodulatoren untersucht werden. Eine solche Effektivität könnte strukturell durch die Modifikation der meta-substituierten Aminopyrimidine oder durch die Verzweigung der benzylischen Methylengruppe erreicht werden. Eine ausführliche Charakterisierung der in Bezug auf Affinität und Effektivität vielversprechendsten Derivate, z.B. des 2,6-Dichlor-Derivates 62 oder der inversen Agonisten 68-70, sollte in naher Zukunft durchgeführt werden. Um in-vitro-Daten auf präklinische Tierstudien übertragen zu können, sollten die Liganden zusätzlich an H4Rs unterschiedlicher Arten getestet werden, da Spezies-Unterschiede eine solche Extrapolation derzeit nicht zulassen. Anschließend können die Aminopyrimidine als pharmakologische Werkzeuge in grundlegenden pharmakologischen Experimenten eingesetzt werden, um die Untersuchung der (patho)physiologischen Bedeutung des H4R fortzuführen.
Development of lentiviral vectors for the gene therapy of X-linked chronic granulomatous disease
(2010)
Es gibt eine Vielzahl von Erkrankungen, die auf einen einzelnen Gendefekt zurückzuführen sind (monogene Erkrankungen). Darunter befindet sich auch die Gruppe der primären Immundefizienzen (PIDs), von denen aktuell über 150 verschiedene Typen von der Weltgesundheitsorganisation registriert sind. In vielen fällen leiden betroffene Individuen unter einem stark erhöhten Infektionsrisiko durch bakterielle oder virale Pathogene, sowie den damit verbundenen schweren Symptomen - bis hin zum verfrühten Tod der Patienten. Meist können PIDs mit konventionellen Methoden präventiv behandelt werden. Dazu gehören zum Beispiel die regelmässige Gabe von Antibiotika, Antimykotika, Zytokinen oder Immunglobulinen. Der einzige zur Verfügung stehende kurative Behandlungsansatz beruht auf der Transplantation von hämatopoietischen Stammzellen (HSZT) eines gesunden und passenden Spenders. Häufig steht jedoch kein histokompatibler Spender zur Verfügung.
Für diese Patientengruppe hat sich die gentherapeutische Behandlung mit autologen hämatopoietischen Stammzellen als eine gute Option herausgestellt. Der Beweis hierfür wurde eindrucksvoll in klinischen Heilversuchen für zwei Formen des Schweren Kombinierten Immundefekts (X-SCID und ADA-SCID) geführt, einer Erkrankung die durch das vollständige Fehlen bzw. die nicht-Funktionalität der lymphoiden Immunzellen charakterisiert ist. Autologe hämatopoietische Stammzellen der Patienten wurden hier ex vivo mittels eines gamma-retroviralen Vektors mit einer funktionellen Kopie der defekten cDNA genetisch modifiziert und anschliessend zurück infundiert. In der Summe wurde bei über 30 Patienten eine deutliche Verbesserung des Gesundheitszustandes bis hin zur vollständigen Heilung erzielt. Bei einem vergleichbaren Ansatz wurden in Frankfurt, in einem Heilversuch für die septische Granulomatose (X-CGD), erstmals klinisch relevante Erfolge in der Gentherapie für einen Defekt in der myeloischen Linie von Immunzellen erzielt. Ursache der X-chromosomal gekoppelten Form der septischen Granulomatose sind Mutationen in dem Gen für gp91phox (CYBB), einer essentiellen Untereinheit des in Phagozyten benötigten NADPH-Oxidase Komplexes. In der Folge sind die Phagozyten dieser Patienten nicht mehr in der Lage, die für das Abtöten von Krankheitserregern nötigen reaktiven Sauerstoffspezies zu bilden. Ständig wiederkehrende schwere Infektionen mit sonst unproblematischen Erregern sind die Folge.
Neben klaren gesundheitlichen Verbesserungen in der Mehrzahl der Patienten hatte diese Gentherapeutische Behandlungsstrategie in einigen Fällen auch klare Nebenwirkungen. In fünf von 20 Patienten mit X-SCID, sowie in beiden behandelten X-CGD Patienten, kam es infolge der Therapie zu hämatologischen Veränderungen, die in der Ausbildung eines myelodysplastischen Syndroms (bei X-CGD) und Leukämie (bei X-SCID) mündeten. In allen Fällen war die Ursache eine Hochregulierung von Proto-Onkogenen in der Nähe von g-retroviralen Integrationsstellen. Diese Probleme demonstrieren deutlich die unbedingte Notwendigkeit zur Verbesserung der verwendeten therapeutischen Vektoren.
In der vorliegenden Arbeit wurden lentivirale Vektoren mit myeloid-spezifischen Promotoren entwickelt und auf ihre Eignung für die Gentherapie der X-chromosomal gekoppelten septischen Granulomatose getestet. Lentivirale Vektoren besitzen ein stark verringertes Risiko für Insertionsmutagenese, sowie die exklusive Fähigkeit ruhende Zellen zu transduzieren. Die Verwendung von myeloid-spezifischen Promotoren für die Transgenexpression verringert die Wahrscheinlichkeit der Proto-Onkogen Aktivierung in unreifen Stamm- und Vorläuferzellen – einer Zellpopulation die besonders sensitiv für die in der Leukämieentstehung obligaten Schritte der Immortalisierung und Transformation ist. Gleichzeitig bleibt der volle therapeutische Nutzen erhalten, da das Transgen gp91phox nur in reifen myeloischen Zellen benötigt wird.
Die entwickelten lentiviralen Vektoren exprimieren eine kodonoptimierte gp91phox cDNA unter der Kontrolle des microRNA223-Promoters (223), des MRP8-Promotors (M) oder eines chimären Fusionspromoters bestehend aus den regulatorischen Bereichen des Cathepsin G und des cFes-Promotors (Chim). Zusätzlich wurde ein sogenanntes „ubiquitär aktives Chromatin-öffnendes Element“ (UCOE) in beiden Orientierungen vor den MRP8-Promotor kloniert, um eine erhöhte und stabile Langzeitexpression des Transgens zu erreichen. Ziel der Arbeit war die Selektion eines geeigneten Kandidaten für präklinische Versuchsreihen.
Die für die Evaluierung der Vektoren relevanten Parameter waren die Transgenexpressionslevel, die Spezifität der Expression für myeloische Zellen sowie die vermittelte funktionelle Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität. Die Fragestellungen der Langzeitexpression, der Anfälligkeit für CpG-Methylierung sowie der Genotoxizität der Vektoren wurden ebenfalls bearbeitet. Die Vektoren wurden in vitro in verschiedenen Zelllinien sowie in in vitro differenzierten primären murinen und humanen Blutstammzellen getestet. Die beiden besten Kandidaten (223 und Chim) wurden in vivo in Maustransplantationsexperimenten (Maus-Maus und humane Stammzellen in NOD/SCID-Mäuse) analysiert.
Die beiden lentiviralen Vektoren 223 und Chim eignen sich beide für eine effiziente Expression in myeloische Zellen, die zur funktionellen Rekonstitution der NADPH-Oxidase Aktivität in vitro und in vivo führen. Sie sind den bisher in klinischen Anwendungen verwendeten Vektoren in allen Parametern klar überlegen. Daher ist in zukünftigen klinischen Anwendungen ein verbesserter therapeutischer Nutzen für die Patienten sowie eine Verminderung des Risikos von Nebenwirkungen zu erwarten.
Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einem potenten Werkzeug – auch in der Produktion von Membranproteinen – entwickelt. Da keine lebenden Zellen genutzt werden, kann der Prozess der präparativen Membranproteinproduktion vereinfacht und individuell optimiert werden. Im Gegensatz zu konventionellen zellbasierten Expressionssystemen gewährleistet die zellfreie Proteinsynthese die direkte Zugänglichkeit zum Reaktionsort und damit die Möglichkeit der unmittelbaren Kontrolle. Dies ermöglicht eine genaue Anpassung der Reaktionsbedingungen auf das Zielprotein. Die Verbesserung und Entwicklung neuer Modi der zellfreien Membranproteinsynthese war ein Teil der vorliegenden Arbeit. Setzt man dem Zellfrei-System von Außen keine hydrophobe Umgebung zu, so präzipitiert das neu-synthetisierte Membranprotein im Reaktionsmix (P-CF). Interessanter Weise unterscheiden sich diese Präzipitate von den aus der E.coli zellbasierten Proteinproduktion bekannten Einschlußkörperchen, da sie sich teilweise leicht in mildem Detergenz resolubilisieren lassen. Zudem konnte für verschiedene Transportproteine, die aus Präzpitat resolubilisiert und danach in Liposomen rekonstituiert wurden, spezifische Transportaktivität gezeigt werden (z.B. eukaryotische Ionentransporter, Multi-Drug Resistenzproteine von E.coli). Alternativ können die Membranproteine direkt, durch die Zugabe von Detergenzien in den Reaktionsmix, solubilisiert werden (D-CF). Um die einzelnen Expressionsmodi zu optimieren wurden 24 gebräuchliche Detergenzien auf ihre Eigenschaft hin gestestet, strukturell sehr unterschiedliche Membranproteine zu solubilisieren. Die Familie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether hat sich dabei als sehr geeignet erwiesen um das prokaryotische α-helikale Multi-Drug Resistenzprotein EmrE, den bakteriellen vornehmlich aus ß-sheets bestehenden Transporter Tsx und den eukaryotischen G-Protein gekoppelten Vasopressin Rezeptor V2R direkt im D-CF Modus zu solubilisieren. Zudem konnte eine Abhängigkeit der spezifischen Aktivität von Tsx vom verwendeten Expressionsmodus bzw. des verwendeten Detergenz mit Hilfe der Black Lipid Membrane´ Methode gezeigt werden. Die Expression eines repäsentativen Teils von 134 Zielproteinen des inneren Membranproteoms von E.coli wurde in drei verschiedenen Zellfrei-Expressionsmodi getestet. Ein an jedes Zielprotein des Membranroteoms C-terminal fusioniertes GFP diente der Konzentrationsbestimmung im D-CF Expressionsmodus. Die Faltung von GFP ist in Anwesenheit von Detergenz signifikant reduziert. Zunächst wurden alle Zielproteine in einem batch´ System im D-CF Modus im Mikrotiterplatten Maßstab mit Hilfe eines Roboters hergestellt. Die Etablierung einer robotergestützten Plattform, welche das Pipettieren, Inkubieren und Detektieren kombiniert, diente als Grundlage für den Herstellungsprozess des Membranroteoms von E.coli in einem Medium-Durchsatz Verfahren in batch´ Konfiguration. In dieser ersten Stufe des Screens im D-CF Modus konnten 84 Zielproteine (63%) aufgrund der detektierten GFP-Fluoreszens in Mengen von 1 bis 60μg pro mL Reaktion als erfolgreich produziert identifiziert werden. Zudem wurde das Membranproteom in dem effektiveren continous exchange (CE) Verfahren im P-CF, wie auch im D-CF Modus wiederholt exprimiert. Im Vergleich zur batch´ Konfiguration konnten im CE D-CF Modus deutlich mehr Zielproteine (75%) als positiv identifiziert werden. 16 Zielproteine wurden dabei bereits in Expressionsmengen von mehr als 100μg solubilisierte Membranproteinfusion pro mL Reaktionsmix gewonnen. 99 Zielproteine (74%) konnten als positiv identifiziert werden, nachdem die unlösliche Fraktion der CE P-CF Reaktion elektrophoretisch getrennt und angefärbt wurde. Für 66 Kandidaten (49%) stellt das produzierte Protein nach Coomassie-Färbung eine dominante Bande, und damit (semi-)präparative Proteinmengen, dar. Der Erhalt von Detergenz-solubilisierten Membranproteinproben von hoher Qualität ist ein wichtiger Schritt zur Gewinnung struktureller sowie biochemischer Daten. Das E.coli α-helikale Multi- Drug Resistenz Protein SugE konnte im CE P-CF Verfahren in präparativen Mengen von mehr als 2mg Protein pro mL des Reaktionsansatzes gewonnen werden. Durchgeführte analytische Größenausschlusschromatographie zeigte, dass der Transporter unter optimierten Reaktionsbedingungen in einem homogenen, schlanken Peak eluiert. Mittels elektronenmikroskopischer Gefrierbruchanalysen konnte eine effiziente und homogene Rekonstitution von SugE in E.coli Liposomen gezeigt werden. Bindungsstudien unter der Verwendung fluoreszensbasierter Anisotropie-Messungen haben gezeigt dass Proflavin – im Gegenteil zu Ethidium – ein Substrat von SugE ist. YedZ ist ein 24kDa leucinreiches Membranprotein mit sechs putativen Transmembransegmenten und enthält zwei Kofaktoren, ein Häm b und ein Flavin-mononukleotid (FMN). Im P-CF Modus exprimiertes YedZ kann effizient in den Detergenzien LMPG, LPPG, SDS und DPC resolubilisiert werden. Analytische Größenausschlusschromatographie zeigte einen symmetrischen Elutionspeak der apo-Form. Mittels CD-Spektroskopie des gereinigten apo-YedZ in 0.02% DDM wurde ein α-helikaler Sekundärstrukturanteil von 55% ermittelt. Zur Gewinnung von holo-YedZ wurde anstatt Hämb das chemisch verwandte Hemin eingesetzt. Die aufgenommenen UV/Vis Spektren der zellfrei produzierten holo-YedZ Proteinprobe in ihrer oxydierten und reduzierten Form, zeigen zu einer in vivo exprimierten Vergleichsprobe identische Absorptionsmaxima. Für sechs G-Protein gekoppelten Rezeptoren konnte die zellfreie Expression in präparativen Mengen gezeigt werden. Das Steroid-Derivat Digitonin, sowie einzelne Mitglieder der Detergenzfamilie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether, wurden als am geeignetsten für die lösliche Expression der GPCRs im CE D-CF Verfahren ermittelt. Löslich in Anwesenheit von Brij78 produzierter GPCR Proben, zeigten nach Negativfärbung in elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalysen eine homogene Probenpräparation und geben Hinweis auf eine strukturelle Dimerisierug der Rezeptoren. Detergenzsolubilisierte Rezeptoren konnten in Liposomen, basierend auf E.coli Lipid-Mischungen, rekonstituiert werden. Elektronen-mikroskopische Gefrierbruchanalysen zeigten eine homogene Rekonstitution, welche auf eine funktionelle Faltung der Rezeptoren schließen lässt.
Einleitung: Diese Arbeit vergleicht den Goldstandard der Knochendichtemessung die dual x-ray absorptiometry mit Daten, die durch Vermessungen der Claviculae bds. eines Patientenkollektivs am Röntgenthorax zu dessen Evaluation bzw. zur eventuellen Frakturvorhersagbarkeit. Material und Methoden: Auf den Röntgenbildern wurde die Länge und die Mitte der Claviculae bestimmt, die ROI, die region of interest, befindet sich in der Mitte. Dort wurden mit einem Kaliper der äußere ( outer periostal width / OPW ) und der innere Durchmesser ( inner endostal width / IEP ) gemessen. Für den CCT subtrahiert man den IEW vom OPW, für den %CCT teilt man den CCT durch den OPW. Alle durch die DXA-Messung ermittelten Werte der LWS sowie der Hüften in Form von BMD, bone mineral density, und BMC, bone mineral concentration, wurden korreliert mit der CCT, der combined cortical thickness und der %CCT der rechten und der linken Claviculae, die durch das Vermessen des Röntgenbildes ermittelt wurden. Ergebnisse: Beim Vergleich aller Werte konnte eindeutig eine fehlende Korrelation, also weder eine negative noch eine positive Korrelation, festgestellt werden. Diskussion: Im Vergleich zu vorhergehenden Arbeiten ergibt sich die Bestätigung, dass das konventionelle Röntgenbild keine geeignete Methode ist, die Diagnose der Osteoporose allein zu stellen.Diese Arbeit vergleicht den Goldstandard der Knochendichtemessung die dual x-ray absorptiometry mit Daten, die durch Vermessungen der Claviculae bds. eines Patientenkollektivs am Röntgenthorax zu dessen Evaluation bzw. zur eventuellen Frakturvorhersagbarkeit.
Die Nierentransplantation ist die Therapie der Wahl bei terminaler Niereninsuffizienz. Alle anderen Nierenersatzverfahren (chron. intermittierende Hämodialyse oder Bauchfelldialyse) reichen nicht an die Effizienz und den Komfort einer Transplantatniere heran. Trotz allem stellen verzögerte Funktionsaufnahme (delayed graft function, DGF), Abstoßungen und begrenzte Funktionsdauer heute noch Probleme der Nierentransplantation dar. Interleukin-18, ein wichtiger Mediator der angeborenen und erworbenen Immunantwort und zugleich ein Zytokin, das bei Ischämie-Reperfusionsschaden und akutem Nierenversagen vermehrt ausgeschüttet wird, könnte in diesem Zusammenhang von Bedeutung sein. Bekannt ist, dass zwei Promotorpolymorphismen (-607C/A und -137G/C) die Blutspiegel von Interleukin-18 beeinflussen können. Ziel dieser Dissertation ist es, den Einfluss der Interleukin-18- Genotypen auf die Prädisposition zu Nierenerkrankungen bzw. bestimmte Grunderkrankungen bei terminaler Niereninsuffizienz zu untersuchen. Außerdem wurde vor allem der Einfluss der Interleukin-18 Polymorphismen auf den Transplantationserfolg überprüft, gemessen an DGF, Transplantatüberleben und Patientenüberleben. Zu diesem Zweck wurden bei 233 Nierentransplantierten und bei 222 nierengesunden Organspendern die IL-18 Genotypen bestimmt. Zudem wurden die benötigten klinischen Daten aus den Krankenakten der Patienten entnommen und anschließend mittels statistischer Verfahren mit den Genvarianten in Korrelation gesetzt. Zwar war die Verteilung der Genotypen zwischen Transplantierten und Nierengesunden nicht unterschiedlich, wir konnten jedoch zeigen, dass das -137C-Allel bzgl. Autoimmunerkrankungen prädisponierend wirkt, aber hinsichtlich der diabetischen Nephropathie einen protektiven Einfluss hat. Im Falle des SNP -607C/A erwiesen sich das C-Allel hinsichtlich Autoimmunerkrankungen und das AAllel bzgl. diabetischer Nephropathie als schützend. Es stellte sich weiterhin heraus, dass der Wildtyp des IL-18 SNP’s (-607CC/-137GG) vor einer verzögerten Funktionsaufnahme des Transplantats (DGF) bewahrt. Ein direkter Einfluss der Polymorphismen auf die Langzeitfunktion des Transplantats konnte nicht nachgewiesen werden. Patienten mit DGF zeigten aber auch noch in den ersten drei Jahren nach der Transplantation eine deutlich schlechtere Nierenfunktion als Transplantierte mit unproblematischem postoperativem Verlauf. Obwohl sich die Nierenfunktion der DGF- und Nicht-DGF-Patienten nach drei Jahren wieder einander anglich, waren Patienten, deren Transplantat die Funktion verzögert aufnahm, einem höheren Mortalitätsrisiko ausgesetzt und verstarben durchschnittlich früher als die Vergleichsgruppe mit sofortigem Funktionsbeginn, wobei die Nicht-DGF-Patienten bei Transplantation durchschnittlich etwas jünger waren. Dies zeigt deutlich die Relevanz dieser frühen Phase für den Langzeitverlauf und die Bedeutung der IL-18-Genotypisierung, mit deren Hilfe man für DGF prädisponierte Patienten frühzeitig erkennen und spezifisch behandeln könnte, um so deren Prognose günstig zu beeinflussen. Weitere prospektive Studien sind aber nötig, um die gewonnenen Erkenntnisse zu sichern und so den Erfolg einer Nierentransplantation und damit die Lebensqualität der Patienten weiter zu verbessern.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung des Proteoglykans Biglycan und seiner Funktion als Signalmolekül in inflammatorischen und autoimmunen Prozessen. Die biologische Bedeutung der in vitro gewonnenen Ergebnisse in primären Makrophagen und dendritischen Zellen wurde durch in vivo Modelle der Pathogenvermittelten-und nicht-Pathogen-vermittelten Inflammation und der Autoimmun-Erkrankung Lupus Nephritis bestätigt. In primären Makrophagen und dendritischen Zellen induziert Biglycan die Produktion proinflammatorischer Zytokine und Chemokine durch Interaktion mit Toll-like Rezeptor (TLR) 2 und 4. Mit nucleotide-binding oligomerization like Rezeptorprotein3 (NLRP3)-,apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD (ASC)- , Caspase-1- und TLR2/4- defizienten Mäusen und verschiedenen pharmakologischen Inhibitoren war es möglich in primären murinen peritonealen und Knochenmark-Makrophagen nachzuweisen, dass Biglycan die Caspase-1 NLRP3/ASC-abhängig aktivierte und damit die Prozessierung der Proform und Sekretion von reifem IL-1β induzierte. Durch Bindung an TLR2/TLR4 aktivierte Biglycan die NFκB, Erk und p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) Signalwege und stimulierte die Expression von Interleukin-1 beta (IL-1β). Biglycan aktivierte zudem den P2X7 Rezeptor (P2X7R) in Makrophagen und ist somit in der Lage auch ohne zusätzliche Ko-Stimulation, beispielsweise durch ATP, das NLRP3 Inflammasom zu stimulieren und die Prozessierung von aktivem IL-1β anzuregen. In einem Pathogenvermittelten (Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Sepsis) wie auch –nicht-athogenvermittelten (unilaterale Uretherobstruktion, UUO) Mausmodell der Inflammation wurde die biologische Relevanz dieser Prozesses gezeigt. Die Defizienz von Biglycan ging in diesen Modellen mit verminderter Aktivierung des NLRP3/Caspase-1 Inflammasomes, geringeren Spiegeln von reifem IL-1β und geringerer Organschädigung einher. Nachdem aufgezeigt werden konnte, dass die Biglycan-Konzentrationen in Nierenbiopsien und im Plasma von Patienten mit Lupus Nephritis stark erhöht waren, wurde seine Relevanz in Immunitätsreaktionen einschließlich autoinflammatorischen Prozessen genauer untersucht. Die Effekte von Biglycan in verschiedenen Stadien der Erkrankung wurden mit der MRL-Faslpr (kurz MRL/lpr) Maus, einem etablierten Modell der Lupus Nephritis (LN) und einem dafür generierten Modell der Defizienz (Bgn-/- MRL/lpr) und Überexpression von Biglycan (hBGN MRL/lpr) analysiert. In den verschiedenen Stadien der LN nahm die Konzentration von zirkulierendem und renalem Biglycan in MRL/lpr Mäusen zu und korrelierte gleichermaßen mit dem Fortschreiten der Erkrankung. Die Defizienz von Biglycan verminderte hingegen stark die renale Infiltration von Entzündungszellen, insbesondere B1-Zellen, außerdem die Zytokin-, Chemokin- und Immunglobulin-Konzentrationen und minderte die Progredienz der Niereninsuffizienz verglichen mit Lupus Mäusen gleichen Alters. In der Initialphase der Lupus Nephritis induzierte Biglycan in Mäusen, transient transgen für humanes Biglycan (hBGN MRL/lpr), vermehrte renale Zellinfiltration und Albuminurie als Zeichen nephrotischer Dysfunktion. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Produktion des stark proinflammatorischen Zytokines IL-1β in jungen Lupus Nephritis Mäusen NLRP3/Caspase-1-abhängig ist und durch Biglycan verstärkt wurde. Die Mechanismen, durch die endogenes Biglycan die Leukozyteninfiltration in Lupus Mäusen induzierte und somit inflammatorische und autoimmune Vorgänge potenzierte, wurden insbesondere an B-Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Biglycan die renale Migration von einem besonderen B-Zell Subtyp, B1-Zellen, verantwortlich für die T-Zellenunabhängige Autoimmunglobulinproduktion beim LN, unterhielt. Dabei vermittelte Biglycan die Rekrutierung von B1-Zellen in die Niere durch Regulation der Expression und Synthese der B-Zell C-X-C Chemokin Ligand 13 (CXCL13) in der Niere und in residenten peritonealen Makrophagen. In vitro konnte zudem der Mechanismus aufgeklärt werden, über den Biglycan CXCL13 reguliert. In primären Makrophagen und dendritischen Zellen induziert Biglycan die Expression und Sekretion von CXCL13 über TLR2 und TLR4. Die Daten zeigen auf, dass Biglycan als endogenes Gefahrensignal starke proinflammatorische Reaktionen hervorruft. Über Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, TLR2 und TLR4, aktiviert Biglycan des weiteren Zellen des adaptiven Immunsystems und inuziert die Rekrutierung weiterer Lymphozyten. Demnach kann postuliert werden, dass Biglycan als Brückenmolekül das anegborene und adaptive Immunsystem verbindet, und somit ein potenzielles neues „drug target“ in autoinflammatorischen, wie auch autoimmunen Vorgängen darstellt.
Die Bedeutung verschiedener CRASP-Proteine für die Komplementresistenz von Borrelia burgdorferi s.s.
(2010)
Die vorliegende Arbeit liefert einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des molekularen Mechanismus der Immunevasion von B. burgdorferi s.s., insbesondere der Bedeutung einzelner CRASP-Proteine für die Komplementresistenz. Sie trägt dazu bei, die Relevanz dieser Proteine für die Pathogenese dieses Erregers zu untermauern. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, verschiedene Vektoren mit den ursprünglichen oder mutierten CRASP-kodierenden Genen cspA, cspZ, erpP und erpA aus B. burgdorferi s.s. zu generieren und diese in das CRASP-negative Isolat B. garinii G1 zu transformieren. Die Expression der speziesfremden Gene als auch der Transport der CRASP-Moleküle auf die Zelloberfläche von B. garinii G1 konnten nachgewiesen werden. Für die konstitutiv CRASP-1- oder CRASP-2-produzierenden Borrelienzellen konnte gezeigt werden, dass diese, auf der Zelloberfläche lokalisierten CRASP-Moleküle mit Faktor H und FHL-1 interagieren, die gebundenen Komplementregulatoren ihre funktionelle Aktivität zur C3b-Inaktivierung aufrechterhalten und die Zellen in Gegenwart von Komplement überleben. Damit wurde erstmals der Nachweis erbracht, dass beide CRASP-Moleküle unabhängig voneinander Schutz vor komplementvermittelter Lyse verleihen. Untersuchungen mit den veränderten CRASP-1-Molekülen ergaben, dass die Transformante G1/pCRASP-1 E147K eine verringerte Bindung von Faktor H und FHL-1 aufwies, welche sich jedoch nicht auf die Komplementresistenz der Zellen auswirkte. Im Gegensatz dazu führte eine Aminosäuresubstitution im C-Terminus des CRASP-1-Moleküls an Position 240 zum Verlust der Bindung von Faktor H und einer stark verminderten Bindung von FHL-1, so dass auch keine Kofaktoraktivität nachgewiesen werden konnte. Trotz des Bindungsverlustes beider Komplementregulatoren zeigte die Transformante G1/pCRASP-1 Y240A nur geringe Ablagerungen des lytischen, terminalen Komplementkomplexes (TCC) auf der Zelloberfläche und Wachstum in Gegenwart von aktiven Komplement. Mittels eines Hämolyse-Assays wurde schließlich festgestellt, dass CRASP-1 direkt mit Komponenten des Komplementsystems interagiert und dadurch die Assemblierung des TCC verhindert. Die Bedeutung der Aminosäuren an den Positionen 81, 139, 207 und 211 im CRASP-2-Molekül für die Faktor H / FHL-1-Bindung und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die Komplementresistenz der Borrelien wurde gleichfalls nachgewiesen. Dabei wies insbesondere die Transformante G1/pCRASP-2 Y211A ein inhibiertes Wachstum in Humanserum und verstärkt Komplementablagerungen auf der Zelloberfläche auf, was auf den Verlust bzw. der sehr schwachen Bindung von FHL-1 und Faktor H zurückzuführen ist. Im Gegensatz zu den Transformanten, welche ein CRASP-2-Molekül mit nur einem Aminosäureaustausch produzierten, zeigten die Transformanten, deren CRASP-2-Molekül zwei Aminosäuresubstitutionen aufwies (G1/pCRASP-2 R139A-Y207A, G1/pCRASP-2 R139A-Y211A, G1/pCRASP-2 Y207A-Y211A) keine Bindung der beiden Regulatorproteine und keinen Schutz der Zellen vor der lytischen Wirkung von Komplement. Neue, unerwartete Erkenntnisse ergaben sich aus den Untersuchungen mit Borrelienzellen, welche das CRASP-3- oder CRASP-5-kodierende erpP- bzw. erpA-Gen enthielten. Obwohl gereinigtes als auch denaturiertes CRASP-3 und RASP-5 in der Lage war, Faktor H zu binden, wiesen die vitalen Zellen der Transformanten G1/pCRASP-3 und G1/pCRASP-5 keine Bindung von Faktor H und keinen Schutz der Zellen vor komplementvermittelter Lyse auf. Aus den durchgeführten Untersuchungen konnten für gereinigtes CRASP-3 und CRASP-5 als auch für die CRASP-3- und CRASP-5-produzierenden Transformanten neue Liganden, nämlich CFHR-2 und CFHR-5, aus Humanserum identifiziert werden. Zusammenfassend lassen sich folgende Aussagen hinsichtlich des molekularen Mechanismus der Komplementresistenz bei B. burgdorferi s.s. aus den erhobenen Daten dieser Arbeit mit transformierten Borrelienzellen formulieren: *Die Komplementresistenz der Borrelien wird durch die Faktor H- und FHL-1-bindenden Proteine CRASP-1 und CRASP-2, jedoch nicht durch CRASP-3 und CRASP-5 determiniert, *CRASP-1 als multifunktionelles Protein ist zusätzlich in der Lage, direkt mit Komplement zu interagieren, *Die C-terminalen Domänen von CRASP-1 und CRASP-2 sind für die Bindung der beiden Komplementregulatoren Faktor H und FHL-1 relevant, *CRASP-3 und CRASP-5 auf der Borrelienoberfläche lokalisiert, interagieren mit CFHR-1, CFHR-2 und CFHR-5, aber nicht mit Faktor H.
Die Hämodialyse ist ein etabliertes Verfahren zur Behandlung der terminalen Niereninsuffizienz. Sowohl in Deutschland, als auch international, ist eine Zunahme der Erkrankungshäufigkeit für die terminale Niereninsuffizienz festzustellen, in erster Linie aufgrund einer diabetischen oder hypertonen Nephropathie. Die arteriovenöse Fistel (AVF) hat sich als beste Form des Gefäßzuganges für die Hämodialyse erwiesen. Eine mögliche Komplikation der AVF ist das Dialyseshunt assoziierte Steal-Syndroms (DASS). Die Inzidenz des DASS wird in der Literatur mit 1-8% angegeben, als Risikofaktoren gelten unter anderem Alter und Diabetes mellitus- gerade die Faktoren, die auch für die Zunahme der Nierenerkrankungen verantwortlich sind. Daher ist für die Zukunft mit einem Anstieg der Inzidenz für das DASS unter den über einen Shunt dialysierten, terminal niereninsuffizienten Patienten zu rechnen. Die einzig erfolgsversprechende Behandlung des DASS erfordert ein chirurgisches Vorgehen, andernfalls drohen irreversible trophische Störungen. Ziel der Therapie ist die Beseitigung der Ischämie unter Erhalt der Shuntfunktion. In der vorgestellten Bi-Centerstudie konnten 76 DRIL- Prozeduren ausgewertet werden, die zwischen Mai 1996 und Januar 2008 in der Klinik für Gefäß- und Endovascularchirurgie der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt und in der Chirurgischen/Gefäßchirurgischen Klinik des St. Martinus- Hospitals Olpe an 69 Patienten durchgeführt worden sind. Dabei konnte gezeigt werden, dass die erstmals von Schanzer et al. 1988 beschriebene DRIL- Prozedur geeignet ist, dieses Therapieziel auch langfristig zu erfüllen. Die kombinierte Offenheitsrate sowohl des DRIL- Bypasses als auch des Shunts post DRIL-Prozedur mit Regression oder Beseitigung der Ischämiesymptomatik betrug nach 6 Monaten 89,5%, nach 12 Monaten 80,2% und nach 5 Jahren 60,8%. Die theoretischen Überlegungen zum Verständnis der beim DASS vorliegenden hämodynamischen Verhältnisse erklären die Effektivität der Prozedur und die Überlegenheit gegenüber anderen Verfahren. Schlussfolgerung: Trotz des überwiegend betroffenen multimorbiden Patientenguts ist die technische Durchführbarkeit der DRIL-Prozedur erprobt, sicher und führt zum prompten und nachhaltigen Verschwinden der Ischämiebeschwerden, ohne die Shuntfunktion zu kompromittieren. Aus diesem Grund gehört die DRIL- Prozedur in das Portfolio jedes Shuntchirurgen.
Die Hodgkin/Reed-Sternberg Zellen des klassischen Hodgkin Lymphoms stammen von Keimzentrums-B-Zellen ab. Dennoch prägen sie fast keine B-Zell-spezifischen Gene aus, stattdessen ko-exprimieren sie Marker anderer hämatopoetischer Linien. Die Ursache für den Verlust des B-Zell-Phänotyps ist weitestgehend unbekannt, da die Transkriptionsfaktoren E2A und PAX5, die in reifen B-Zellen zur Aufrechterhaltung der Expression B-Zell-spezifischer Gene essentiell sind, von primären HRS Zellen ausgeprägt werden. Allerdings wird PAX5 im Vergleich zu normalen B-Zellen deutlich schwächer exprimiert. E2A wird durch direkte Interaktion mit dem inhibitor of DNA binding, ID2, negativ reguliert. ID2 besitzt eine bHLH-Struktur und dimerisiert mit Transkriptionsfaktoren. Da ihm jedoch die DNA-bindende Domäne fehlt, wird die Bindung der Heterodimere an die DNA verhindert und die Transkriptionsfaktoren somit inaktiviert. In hämatopoetischen Zellen scheint die ID2-Expression die B-Zell-Entwicklung und auch die Expression B-Zell-spezifischer Gene zu unterdrücken und stattdessen die Ausprägung von Genen anderer Linien zu unterstützen. In reifen B-Zellen wird ID2 während der Plasmazellentwicklung bei gleichzeitigem Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene stark exprimiert. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ID2, das in normalen B-Zellen nicht detektiert werden konnte, dagegen in allen HL-Fällen nicht nur auf RNA-Ebene, sondern auch auf Proteinebene stark exprimiert wird. Ko-Immunopräzipitation des E2A mit ID2 aus HL-Zelllinien zeigte die Interaktion und somit vermutlich auch die transkriptionelle Inaktivierung des E2A durch ID2, wodurch es zum Verlust der Expression B-Zell-spezifischer Gene kommt. Darüber hinaus wird PAX5 zusammen mit EBF durch E2A induziert. So führt die ID2-vermittelte E2A-Inaktivierung im HL vermutlich dazu, dass ID2 via EBF auch die Regulation von PAX5 beeinflusst. PAX5 spielt bei der Differenzierung eine duale Rolle, denn es aktiviert nicht nur B-Zell-spezifische Gene, sondern es unterdrückt auch die Gene anderer Linien. Demnach könnte ID2 auch an der Expression der nicht-B-Zell-spezifischen Gene im HL beteiligt sein. Darüber hinaus ist ID2 im HL durch die E2A-Inaktivierung via EBF auch möglicherweise an der schwächeren Expression des PAX5 im Vergleich zu normalen B-Zellen beteiligt. Obwohl das ID2-Protein in den HL-Zelllinien durch RNA-Interferenz erfolgreich reduziert werden konnte, zeigte sich allerdings weder eine Änderung der Proteinexpression der B-Zell-spezifischen Gene CD19 und CD79A noch der Gene anderer hämatopoetischer Linien GATA-3 und M-CSF-R. Unabhängig von seiner möglichen Beteiligung an der Dedifferenzierung der HRS Zellen im HL, spielt ID2 vermutlich auch eine weitere Rolle in der Pathogenese des HL. Verschiedene Interaktionen weisen darauf hin, dass ID2 auch an der Regulation des Zellzyklus beteiligt ist. Zum einen konnte in dieser Arbeit die Interaktion des ID2 mit dem HLH-Protein HEF1 zumindest in einer der HL-Zelllinien gezeigt werden. HEF1 ist ein Aktivator der Aurora Kinase 1, welche nach Aktivierung Gene phosphoryliert, die den Ablauf der Mitose begünstigen. Zum anderen konnte der negative Zellzyklusregulator p21Cip1 in HL-Zelllinien durch RNAi-vermittelte Reduktion des ID2-Proteins als ID2-Target-Gen identifiziert werden. Auch wenn die Interaktion mit RB, dem zur Familie der Pocket-Proteine gehörenden Schlüsselregulator des Zellzyklusverlaufs, in HL-Zelllinien nicht nachgewiesen werden konnte, zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die aberrante ID2-Expression offenbar an der Veränderung des Zellzyklus im HL beteiligt ist. Sie lassen jedoch noch keinen endgültigen Schluss zu. Wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, wird ID2 ebenfalls im analplastisch großzelligen T-Zell-Lymphom aberrant exprimiert. Auch eine Interaktion mit E2A, das auch in der T-Zell-Entwicklung eine Rolle spielt, konnte gezeigt werden. Nicht zuletzt scheint demnach ID2 auch in der Dedifferenzierung des ALCL ein wichtiger Faktor zu sein. ID2 wird im HL aberrant exprimiert und es konnte die Interaktion mit E2A in den HL-Zelllinien nachgewiesen werden, wodurch die transkriptionelle Aktivität des E2A vermutlich inhibiert wird. Auch wenn in Folge der RNAi-vermittelten Herunterregulation von ID2 in den HL-Linien weder eine Re-Expression B-Zell-spezifischer Gene noch eine Beeinflussung der Expression Marker andere hämatopoetischer Linien gefunden werden konnte, spielt ID2 vermutlich dennoch eine wichtige Rolle in der Dedifferenzierung der HRS Zellen im HL. Unabhängig davon konnte der negative Zellzyklusregulator p21Cip1 als ID2-Target-Gen identifiziert und eine Interaktion mit HEF1 gezeigt werden. Demnach ist ID2 möglicherweise nicht nur an der Dedifferenzierung, sondern auch an der Dysregulation des Zellzyklus im HL beteiligt und somit ein wichtiger Faktor in der Pathogenese des HL.
Reziproke chromosomale Translokationen sind häufig mit Leukämien assoziiert und gelten in den meisten Fällen als Erkrankungsursache. Das MLL-Gen auf der Chromosomenbande q23 des Chromosoms 11 ist an einer Vielzahl chromosomaler Translokationen beteiligt, und die dadurch erzeugten reziproken MLL-Fusionsgene sind ausschließlich mit Hochrisikoleukämien assoziiert. Die häufigste Aberration ist eine reziproke Translokation zwischen den beiden Genen MLL und AF4 (4q21), die t(4;11)-Translokation, die in ca. 80% aller Akuten Lymphatischen Leukämien bei Kleinkindern, aber auch bei älteren Patienten mit einer Sekundärleukämie, auftritt. Die leukämischen Blasten dieser Patienten sind meist gegen konventionelle Therapien resistent, so dass t(4;11) Leukämien mit einer ungewöhnlich schlechten Prognose verbunden sind. Welches der beiden Fusionsproteine, MLL-AF4 oder AF4-MLL, die bei der t(4;11)-Translokation entstehen für die Entstehung der Leukämie verantwortlich ist, wird noch kontrovers diskutiert. Bisherige Publikationen zeigen die Onkogenität beider Fusionsproteine, und ihr Potential, Leukämien im Mausmodell hervorzurufen. Frühere Studien dieser Arbeitsgruppe zeigen die onkogene Wirkung des AF4-MLL Fusionsproteins, dessen Expression zur Wachstumstransformation von murinen Zellen und einer Akuten Lymphatischen Leukämie in der Maus führt. Die onkogene Wirkung von AF4-MLL entsteht, sobald das Fusionsprotein nach seiner Prozessierung durch die Endopeptidase Taspase1 heterodimerisiert und dadurch vor SIAH-vermitteltem proteasomalen Abbau geschützt wird. So kann sich das heterodimerisierte Protein - anders als das AF4-Wildtyp Protein - in den Zellen anhäufen und zu unkontrolliertem Wachstum führen. Um die Heterodimerisierung des AF4-MLL Fusionsproteins kompetitiv zu inhibieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit kleine Fragmente aus der C-terminalen Interaktionsdomäne FYRC von MLL exprimiert. Dazu wurde die Interaktion kleiner Peptide aus der FYRC-Domäne mit dem N-terminalen Fragment des AF4-MLL Proteins mithilfe eines Biosensorsystems und Co-Immunopräzipitationen getestet. Anschließend wurden die kleinsten Peptide, die noch an das N-terminale Fragment binden können (B1 und B3), ausgewählt, und zusammen mit AF4-MLL co-exprimiert. Mithilfe von Western Blot-Analysen von gereinigtem AF4-MLL·N konnte gezeigt werden, dass die Expression dieser Peptide dazu führt, dass das C-terminale Fragment nicht mehr an das N-terminale Fragment binden kann. Durch diese Inhibition der Heterodimerisierung kann der AF4-MLL Multiproteinkomplex nicht vollständig aufgebaut werden, da auch die C-terminalen Komplexpartner WDR5 und RBBP5 nur noch eingeschränkt binden können. Zusätzlich wurde die Stabilität der prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C im Falle einer Inhibition der Dimerisierung untersucht. Offensichtlich sind beide Fragmente nur stabil, wenn sie miteinander heterodimerisiert sind. Eine Blockierung der Interaktion durch kompetitive Peptide führt dazu, dass sowohl AF4-MLL·N als auch MLL·C proteasomal degradiert werden. Da auch das MLL-Wildtyp Protein über die Interaktionsdomänen FYRN und FYRC heterodimerisiert, wurde zusätzlich der Effekt der Expression der Peptide auf die Viabilität von MLL-exprimierenden Zellen untersucht. Dazu wurden die Peptide B1 und B3 in sechs unterschiedlichen Zelllinen, von denen zwei die t(4;11)-Translokation tragen, exprimiert. Anschließend wurde nach einer PI-Färbung der Anteil apoptotischer Zellen mithilfe eines Durchflusszytometers ermittelt. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin, dass keines der beiden Peptide einen starken Einfluss auf Zelllinien hat, die das Wildtyp-MLL Gen besitzen. Die Apoptose der vier untersuchten Zelllinien war kaum erhöht, wenn diese Peptide exprimiert wurden. Interessanterweise scheint das Peptid B1 dagegen einen Apoptosefördernden Effekt auf diejenigen Zellen zu haben, die das AF4-MLL Protein exprimieren. Basierend auf den vorliegenden Daten kann die Aussage getroffen werden, dass es prinzipiell möglich ist, das AF4-MLL Fusionsprotein spezifisch anzugreifen. Eine Blockierung der Heterodimerisierung blockiert die Ausbildung des onkogenen AF4-MLL Multiproteinkomplexes. Dies führt zudem dazu, dass die beiden Taspase1-prozessierten Fragmente AF4-MLL·N und MLL·C proteasomal degradiert werden. Die Inhibition der Heterodimerisierung von AF4-MLL ist mit einer leicht erhöhten Apoptoserate in t(4;11)-positiven Zellen verbunden. Diese Beobachtung könnte in Zukunft von Bedeutung sein, wenn über neue Therapieansätze bei t(4;11) Leukämien nachgedacht werden sollte.
Mit der Identifizierung des Histamin-H3-Rezeptorsubtyps im Jahr 1983 begann eine umfangreiche Erforschung seiner Bedeutung und die Suche nach spezifischen Liganden. Die genaue Sequenzaufklärung und Klonierung des humanen Histamin-H3-Rezeptors (hH3R) erst 16 Jahre später ermöglichte eine detaillierte Aufklärung molekularer Vorgänge, deren Auswirkungen auf physiologische und pathophysiologische Prozesse sowie die Entwicklung selektiver hH3R-Liganden. Es zeigte sich, dass der Rezeptor nicht nur die zentrale und periphere Histaminkonzentration im Körper reguliert, sondern auch die Ausschüttung weiterer Neurotransmitter moduliert und damit Einfluss auf zahlreiche neurologische Prozesse nimmt. Diese Erkenntnis macht ihn zu einer wichtigen Zielstruktur bei der Erforschung neuer Therapieansätze verschiedener Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie Demenz, Schizophrenie, Narkolepsie, Epilepsie, Adipositas oder neuropatischer Schmerz. Obwohl bereits mehrere Liganden bekannt sind, die diesen Rezeptor adressieren, stellt die Entdeckung alternativer Leitstrukturen und neuer Strukturklassen ein wichtiges Ziel für die Entwicklung potentieller Wirkstoffe dar. Auch das Defizit an bildgebenden Liganden und deren stetig wachsende Nachfrage für eine effiziente Wirkstoffentwicklung und eine detaillierte Rezeptoraufklärung machen den Bedarf an neuen hochselektiven hH3R-Liganden deutlich. Ausgehend von der im eigenen Arbeitskreis etablierten antagonistisch/invers agonistisch selektiv wirkenden 1-(3-Phenoxypropyl)piperidin-hH3R-Leitstruktur wurden zunächst rechtsseitige Strukturerweiterungen in para-Position des zentralen Phenylringes durchgeführt (Abb. 4.1). Hauptbestandteile dieser Substituenten waren basische Strukturelemente oder Heterozyklen mit starker Wasserstoffbrücken-Akzeptorfunktion...
Die Gamma-Glutamyl-Carboxylase spielt eine Schlüsselrolle im menschlichen Organismus, da sie für die posttranslationale Modifikation sämtlicher Vitamin-K-abhängiger Proteine verantwortlich ist. Ein hereditärer Mangel aller Vitamin-K-abhängigen Faktoren aufgrund eines Defekts in der Gamma-Glutamyl-Carboxylase (VKCFD1) ist sehr selten und geht mit einer gesteigerten Blutungsneigung einher. Aktuelle Arbeiten zeigen eine weitere Manifestation von Mutationen im Gamma-Glutamyl-Carboxylase-Gen, die ein dermatologisches Krankheitsbild, ähnlich der Pseudoxanthoma elasticum, darstellt. In diesen Fällen zeigen die Patienten sowohl dermatologische Effloreszenzen im Sinne der PXE als auch eine Verminderung der Vitamin-K-abhängigen Faktoren. Es wird vermutet, dass die PXE-ähnlichen Hautveränderungen auf eine Funktionsstörung des Matrix-Gla-Proteins zurückzuführen sein könnten. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutationsdiagnostik bei vier Patienten mit kongenitalem Mangel aller Vitamin-K-abhängigen Gerinnungsfaktoren durchgeführt. Insgesamt wurden dabei fünf Mutationen nachgewiesen, davon vier Missense-Mutationen und eine Stopp-Mutation. Zwei der Patienten wiesen eine „compound Heterozygotie“ auf. Bei den gefunden Mutationen wurden drei im Rahmen dieser Arbeit erstmals aufgezeigt, die anderen zwei waren in der Literatur bereits beschrieben. Bei einer der Mutationen konnte ein „Founder“-Effekt in Bezug auf einen anderen Patienten aus der Literatur nachgewiesen werden. Sollte zukünftig diese Mutation in Deutschland vorkommen und sich auch auf die „Founder“-Mutation zurückführen lassen, böte sich dieser Mechanismus als eine Erklärung für das gehäufte Vorkommen der VKCFD Typ 1 in Deutschland an. Ein Hinweis auf eine PXE-like Disorder konnte bei keinem der Patienten nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde die genetische Variabilität des Gamma-Glutamyl-Carboxylase-Gens in der Normalbevölkerung untersucht. Für die Untersuchungen wurde zunächst die DNA einer phänotypisch unauffälligen Kontrollgruppe, bestehend aus 200 gesunden Blutspendern, auf Genvariationen im GGCX-Gen analysiert. Nach der Isolierung und der Amplifikation der DNA wurde mit sämtlichen Proben zunächst ein Mutations-Screening mittels dHPLC durchgeführt. Auffällige Abschnitte und solche, bei denen häufige und/oder mehrere Polymorphismen bereits bekannt waren, wurden sequenziert. Auf diese Weise wurden acht Polymorphismen in den codierenden bzw. die Exone flankierenden Genabschnitten nachgewiesen. Davon wurden zwei erstmals beschrieben (c.43+33T>A; c.1288-38T>C). Schließlich sollte mit dieser Arbeit versucht werden zu klären, wie eine möglichst effiziente Diagnostik von Mutationen bzw. Polymorphismen des GGCX-Gens möglich ist. In unseren Untersuchungen wurde sowohl mit der dHPLC (Wave-System) als Screening-Methode gearbeitet als auch Genabschnitte sequenziert. Mittels der dHPLC kann ein hohes Probenaufkommen in kurzer Zeit mit vergleichsweise geringem Aufwand und vergleichsweise geringeren Kosten (ca. 30 € pro Genuntersuchung vs. Komplettsequenzierung ca. 300 €) bewältigt werden. Bei Genabschnitten mit vielen oder häufigen Polymorphismen ist dies ineffektiv, weil es nur das Vorhandensein einer Veränderung, nicht jedoch die Veränderung selbst beschreiben kann. Daher empfiehlt es sich, beide Methoden zu kombinieren, welches sich als die effizienteste und rationalste Methode für die Mutationsdiagnostik darstellt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sind von grundsätzlichem Interesse für die biomedizinische Forschung. Eventuell wird es damit dann möglich sein, Krankheitsentstehungen und ihre Verläufe bei Mutationen der Gamma-Glutamyl-Carboxylase besser zu verstehen und damit eine noch effektivere und nebenwirkungsärmere Therapie einzusetzen.
Survivin wird in einer Vielzahl von Tumoren überexprimiert, während es in normalem Gewebe bis auf einige Ausnahmen kaum detektierbar ist. In den Krebszellen vermittelt Survivin eine erhöhte Resistenz gegenüber der Apoptose-Induktion, was eine Therapie jedoch meist bezweckt. Durch sein differenzielles Expressionsprofil wird Survivin mittlerweile als ein interessanter Angriffspunkt in der Entwicklung einer neuen, zielgerichteten Behandlung von Krebs betrachtet. Aus diesem Grund wurde zu Beginn der vorliegenden Arbeit die Eignung des anti-apoptotischen und Zellzyklus-regulierenden Proteins Survivin als Zielstruktur für eine Krebstherapie im Vergleich zu den veröffentlichten Publikationen verifiziert. Die Analyse der Survivin-Expression in unterschiedlichen Zelllinien ergab, dass sich in Tumorzellen eine charakteristische Überexpression des Survivin-Proteins zeigte im Vergleich zu gesunden, nicht-transformierten Zelllinien. Eine Inhibition der Survivin-Proteinexpression wurde mittels der Methode der RNA-Interferenz erzielt, bei der die Zielzellen mit shRNA-kodierenden Lentiviren infiziert wurden, welche eine gegen die Survivin-mRNA gerichtete Sequenz beinhalteten. Während Survivin-positive Tumorzelllinien und gesunde Endothelzellen eine starke Reduktion in der Lebend-Zellzahl in vitro aufwiesen, waren die Survivin-negativen Kontrollzelllinien von einem Verlust der Survivin-Expression nicht beeinträchtigt. Anschließend erfolgten eine Analyse der Survivin-Abhängigkeit etablierter Tumorzelllinien und die Untersuchung eines Survivin-Verlusts auf die murine Brustdrüsenentwicklung in vivo. Bei einer Inhibition der Survivin-Expression in Krebszellen in einem Transplanationsmodell konnte ein deutlich verzögertes Tumorwachstum beobachtet werden. Dagegen hatte Survivin in der Entwicklung der murinen Brustdrüse keinen Einfluss auf die Rekonstitution des Gewebes und die Proliferation bzw. Differenzierung der Brustepithelzellen. Um einen direkten protein-basierenden Inhibitor des Survivin-Proteins zu entwickeln und das Repertoire an allgemeinen Survivin-Interventionsstrategien zu erweitern, wurde im zweiten Teil der Arbeit mittels des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems ein neues Survivin-bindendes Protein isoliert. Nach dem Optimierungsprozess bestehend aus einer Fusion mit einem Trägerprotein zur erleichterten Proteinexpression, der Mutagenese eines Cysteins gegen Serin und der Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne konnte das Protein rekombinant in Bakterien hergestellt und durch Affinitätschromatographie in monomerer Form aufgereinigt werden. Anschließend wurde der Einfluss des artifiziellen, rekombinanten Survivin-inhibierenden Proteins (rSip) auf die Funktionen von Survivin bestimmt. rSip zeigte eine Stabilität von bis zu 14 Stunden im Zellkulturmedium und konnte durch seine C-terminale Proteintransduktionsdomäne in das Zytoplasma der Zielzellen aufgenommen werden. In einer Co-Immunpäzipitation konnte die Bindung von rSip an endogenes Survivin bestätigt werden. In Brustkrebszellen führte rSip in einer Konzentration von 1,5 µM zu einem schnellen Verlust des Survivin-Proteins, was möglicherweise auf eine proteosomale Degradation von Survivin zurückzuführen war. Die Analyse der Konsequenzen einer rSip-Behandlung auf die Funktionen von Survivin in der Apoptose-Inhibition und der Zellzyklus-Progression wurde im letzten Abschnitt der Arbeit durchgeführt. Eine viertägige Inkubation mit 1,5 µM rSip bewirkte eine deutliche Reduktion der Lebend-Zellzahl von bis zu 50% im Falle der Survivin-abhängigen Krebszelllinien. Bei den Survivin-negativen Zelllinien trat dagegen kein veränderter Phänotyp auf. Durch einen TUNEL-Test in Brustkrebszellen konnte gezeigt werden, dass die Ursache für die Abnahme der Zellzahl die Apoptose-Induktion durch rSip ist. In den Zellzyklus-Profilen von rSip-behandelten Krebszellen konnte ebenfalls ein starker Anstieg in der apoptotischen Zell-Population beobachtet werden. Abschließend lässt sich sagen, dass in der vorliegenden Arbeit neben der Methode der lentiviralen Applikation von Survivin-spezifischen shRNA-Sequenzen eine neue Möglichkeit der Interferenz mit der Survivin-Funktion in Krebszellen vorgestellt wurde. Die Entwicklung des Survivin-inhibierenden Proteins rSip steht zugegebenermaßen erst am Anfang. Die ersten hier präsentierten Ergebnisse zeigen jedoch klar ein Potential dieses vielversprechenden direkten Survivin-Inhibitors als ergänzende Wirkstoffklasse auf dem Gebiet der therapeutischen Proteine zu den bereits existierenden niedermolekularen Substanzen bzw. antisense-Oligonukleotiden, die auf Ebene der Transkription bzw. der Translation von Survivin wirken.
Die Notwendigkeit der ipsilateralen Adrenalektomie als obligater Bestandteil einer Tumornephrektomie beim Nierenzellkarzinom wurde in der Literatur kontrovers diskutiert. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, durch einen Vergleich von tumornephrektomierten Patienten mit und ohne Nebennierenbefall Parameter zu ermitteln, die eine präoperative Abschätzung des Nebennierenbefalls erlauben, und somit als Entscheidungshilfe zur Durchführung der Adrenalektomie im Rahmen einer Tumornephrektomie dienen können. In unserer Studie wurden insgesamt 250 Patienten mit Nierenzellkarzinom erfasst, die zwischen 1992 und 2001 in der Klinik für Urologie und Kinderurologie Prof. Dr. med. Dietger Jonas, Johann Wolfgang Goethe – Universität Frankfurt am Main operiert wurden. Dabei wurde in allen Fällen die radikale Tumornephrektomie nach Robson inklusive ipsilateraler Adrenalektomie durchgeführt. Alle Operationspräparate wurden im Senckenbergischen Institut für Pathologie Prof. Dr. med. M.-L. Hansmann, Frankfurt am Main untersucht und nach der 6. Auflage der TNM-Klassifikation in der von der UICC empfohlenen Weise eingestuft. In 9 der 250 Fälle (3,6 %) wurde ein Nebennierenbefall festgestellt. Statistisch signifikante Ergebnisse konnten für folgende Parameter ermittelt werden: · Präoperativer CT-Befund In der präoperativ durchgeführten CT wurden von 235 als unauffällig eingestuften Fällen 5 pathologische Nebennierenbefunde nicht erkannt (2,13 %). Von 15 als auffällig eingestuften Fällen wurden jedoch 4 als richtig pathologisch erkannt (26,6 %). Es ergaben sich für den Nachweis eines Nebennierenbefalls im CT eine Sensitivität von 44 %, eine Spezifität von 95,4 %, ein positiver prädiktiver Wert von 26,6 %, und ein negativer prädiktiver Wert von 97,8 %. · Nierentumorgröße Es zeigte sich ein Nebennierenbefall erst ab einer Tumorgröße von > 5 cm mit einer Wahrscheinlichkeit von 5,8 % (p = 0,035). · pTNM-Stadium Ein Nebennierenbefall ließ sich erst ab Tumorstadium pT 3a erkennen. Bei pT1- oder pT2-Tumoren war kein Nebennierenbefall festgestellt worden. Bei Patienten ohne Lymphknotenmetastasierung konnte ein Tumorbefall der Nebenniere in 2 von 224 Fällen (0,89 %) gefunden werden. Bei den Patienten mit Lymphknotenmetastasierung lag der Nebennierenbefall bei 3 von 12 Fällen (25 %) für die Nierentumoren mit pN1 und bei 4 von 14 Fällen (28,6 %) bei Nierentumoren mit pN2. Bei Patienten ohne Fernmetastasierung (230 Fälle) ließ sich in 3 Fällen (1,3 %) ein Nebennierenbefall aufweisen; bei vorliegender Fernmetastasierung (20 Fälle) lag der Anteil der befallenen Nebennieren mit 6 Fällen bei 30 %. · Tumorgrading Ein Nebennierenbefall war bei keinem der G1-Tumoren festgestellt worden. Bei 4,4 % der G2-Tumoren (6/136 Fällen) und bei 12,5 % der G3-Tumoren (3/24 Fällen) konnte ein Nebennierenbefall nachgewiesen werden. Da das Grading nur am Nephrektomiepräparat vorgenommen werden kann, spielt es als prädiktiver Parameter keine Rolle. · Infiltration benachbarter Strukturen 0,5 % (1/200 Fällen) der Patienten ohne und 16 % (8/50 Fällen) der Patienten mit einem Tumorthrombus in der V. renalis zeigten auch einen Nebennierenbefall (p = 0,000012). 2,9 % (7/240 Fällen) der Patienten ohne und 20 % (2/10 Fällen) der Patienten mit einer Infiltration in die V. cava zeigten einen Nebennierenbefall (p = 0,044). 14,5 % (9/62 Fällen) der Patienten mit Tumorinfiltration in die Nierenkapsel zeigten einen Nebennierenbefall; keiner der Patienten ohne Nierenkapselinfiltration zeigte einen Nebennierenbefall (p = 0,000002). Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass eine ipsilaterale Adrenalektomie heutzutage keine obligate Komponente der Tumornephrektomie sein muß, sondern nur durchgeführt werden sollte, wenn folgende präoperative Bedingungen vorliegen: 1. auffällige präoperative bildgebende Beurteilung der Nebenniere durch Sonographie, Computertomographie oder ggf. Magnetresonanztomographie 2. Größe des Nierentumors > 5 cm unabhängig von der Pollokalisation 3. . Primärtumorstadium >= cT3a 4. CT-graphischer Nachweis von Lymphknoten- und/oder Fernmetastasen 5. CT-graphischer Nachweis einer vaskulären Invasion 6. CT-graphischer Nachweis einer Nierenkapselinfiltration 7. auffälliger intraoperativer Befund
Die Chemokinrezeptoren CXCR3 und CXCR4 sowie deren spezifische Liganden, CXCL9, -10 und -11 bzw. CXCL12, sind in bedeutender Weise an den pathologischen Prozessen der Th1-/Th17-vermittelten (Typ1- und Typ17-T-Helferzelle) Autoimmunerkrankungen beteiligt. Die dabei auftretenden chronischen Entzündungen sind gekennzeichnet durch eine massive Infiltration von Th1-Gedächtniszellen. Ergebnisse sowohl von tierexperimentellen Studien als auch von in vitro Experimenten weisen deutlich auf eine spezifische Wechselwirkung zwischen den proentzündlichen CXCR3- und dem homöostatischen CXCR4-Liganden hin. Weiterführenden Ergebnisse zu der molekularen Wechselwirkung von CXCR3 und -4 wurden jedoch bislang nicht veröffentlicht. Die Untersuchungen dieser Dissertation konzentrierten sich auf die Kooperation der beiden Chemokinrezeptoren in murinen Th1-Gedächtniszellen. Dabei sollte insbesondere der potentielle Einfluss dieser Interaktion auf die einzelnen Teilprozesse der Extravasation der T-Lymphozyten in vitro analysiert werden. Eingesetzt wurden hierfür statische Chemotaxis- und dynamische Flusskammerexperimente, die zum einen sensitiv genug und zum anderen für einen hohen Probendurchsatz geeignet sein mussten. Die verwendeten Techniken wurden dazu im Rahmen der Dissertation etabliert und validiert. Zunächst musste die Präzision des statischen Migrationssytems mit einer hohen Standardabweichung von durchschnittlich ± 40% deutlich verbessert werden. Ein Wechsel auf ein Kammersystem der Firma Corning verringerte die Abweichung auf ± 25%, und sogar auf ± 9,9% bei einer optimierten Auswertung mittels Durchflusszytometrie. Als weitere Methode wurde ein dynamisches Flusskammersystem mit automatischer Videoanalyse zur Bestimmung der Geschwindigkeit von Zellen etabliert. Zur Validierung der neu entwickelten Analysesoftware Imagoquant® wurden identische Filmaufnahmen von Flusskammerexperimenten hinsichtlich Zellrollen und Zellgeschwindigkeit ausgewertet und mit den Ergebnissen von zwei etablierten Methoden, der Handzählung und einem halbautomatischen Tracking-Programm, verglichen. In der gesamten Validierung stimmten die Berechnungen von Imagoquant® mit Ergebnissen der verschiedenen Auswertemethoden qualitativ überein, wobei die Filme um ein Vielfaches (16- bzw. 20-fach) schneller analysiert werden konnten als mit den bisher verwendeten Methoden. Somit konnte erfolgreich eine computergestützte Analysemethode validiert und etabliert werden, die schnell und benutzerunabhängig arbeitet und folglich objektive Daten im Hochdurchsatz generiert. Die Untersuchungen in den statischen und dynamischen Migrationssystemen ergaben, dass die Stimulation von Th1-Zellen mit CXCL9 zu einer heterologen Desensitivierung verschiedener CXCL12-vermittelter Effekte führt. In statischen Migrationsexperimenten wurde sowohl durch eine synchrone als auch eine sequentielle Stimulation mit CXCL9 eine CXCL12-vermittelte Chemotaxis signifikant vermindert. Der auftretende Effekt war dabei lang anhaltend und konnte noch bei einer Stimulationsdauer von 20 h beobachtet werden, ohne an Intensität zu verlieren. Weitere funktionelle Experimente erfolgten in dynamischen Flusskammerexperimenten, um die desensitivierende Wirkung von CXCL9 auf CXCL12-abhängige Interaktionen der Adhäsionskaskade von Th1-Zellen zu untersuchen. In mit E-Selektin und ICAM-1 Fc-Chimära) beschichteten Flusskammern führte immobilisiertes CXCL12 zu vermehrtem integrinabhängigen Rollen, welches durch eine Vorinkubation der Th1-Zellen mit CXCL9 reduziert wurde. In Flusskammern mit murinen Endothelzellen bewirkte immobilisiertes CXCL12 eine rasche integrinabhängige Adhäsion der Zellen und verkürzte dadurch deren Rollphase signifikant. Eine Vorbehandlung der Zellen mit CXCL9 verminderte dagegen die CXCL12-vermittelte Adhäsion und führte damit zu längeren Rollphasen. Deutliche Effekte zeigte CXCL12 bezüglich einer gesteigerten intravasalen und transendothelialen Migrationsrate von T-Lymphozyten, die durch eine Vorstimulation mit CXCL9 aufgehoben wurden. Um die beteiligten Mechanismen dieser Desensitivierung zu entschlüsseln, wurde die Oberflächenexpression von CXCR3 und CXCR4 in dem Th1-Zellklon durchflusszytometrisch analysiert. Dabei zeigte sich, dass eine Stimulation mit CXCL9 neben der ligandenspezifischen Internalisierung von CXCR3 auch eine Kreuzregulation der CXCR4-Oberflächenexpression bewirkte. Im Weiteren wurde die Phosphorylierung bekannter Signalmoleküle der CXCR4-Signalwege analysiert. Eine Vorbehandlung der Zellen mit CXCL9 desensitivierte die CXCL12-induzierte Phosphorylierung von Akt signifikant und führte zu einer zeitlichen Modulation des Signals. Ferner verzögerte eine Vorbehandlung der Th1-Zellen mit CXCL9 das CXCL12-induzierte Calciumsignal erheblich, während dabei eine 3,5-fach höhere maximale Ca2+-Konzentration gemessen wurde. Ein abgeleiteter Mechanismus der CXCL9-abhängigen Desensitivierung von CXCR4-Signalwegen beeinflusst insbesondere die Signaltransduktion über den T-Zellrezeptor und dadurch auch die Regulation von Rac1. Des Weiteren führt CXCL9 zur Gi- oder ZAP-70-vermittelten Aktivierung der PKC, welche darauffolgend den CXCR4-Rezeptor phosphoryliert und damit zu dessen Internalisierung führt. Die in vitro beobachtete Desensitivierung verschiedener CXCL12/CXCR4-vermittelter Effekte durch CXCL9 wirkt potentiell in der in vivo Situation von Autoimmunerkrankungen auf unterschiedliche Weise proinflammatorisch. Zum einen wird die Mobilisierung von Th1-Zellen aus CXCL12 exprimierenden peripheren Gewebe gefördert und gleichzeitig verhindert, dass Th1-Zellen in nicht entzündetes peripheres Gewebe rekrutiert werden. Zum anderen wird im Entzündungsgebiet die Affinität der Th1-Zellen zu den CXCL12-exprimierenden Endothelzellen verringert und die Migration in tieferliegende Gebiete der Entzündung begünstigt. Ferner vermindern CXCR3-Liganden auch antiinflammatorische Effekte des CXCL12s, wie z.B. die Polarisierung der Th1-Zellen in regulatorische T-Zellen.
Das Neuroblastom ist ein Tumor, der sich von sympathoadrenergen Vorläuferzellen ableitet und die häufigste solide Krebsform im Kindesalter darstellt. Das breite klinische Spektrum dieses Tumors, das von spontaner Regression zu fataler Progression reicht, spiegelt die außerordentliche biologische und genetische Heterogenität dieses Tumors wider. Polyploidie und Genexpressionsanalysen werden auf klinischer Seite zur Risiko- und Therapieeinschätzung eingesetzt. Genomweite Screeninganalysen identifizierten den Transkriptionsfaktor Phox2b als erstes Prädispositionsgen für NB. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Phox2b absolut essentiell für die Entstehung aller Ganglien des autonomen NS aus Neuralleistenzellen ist. Ziel der Untersuchungen dieser Arbeit war es, die Auswirkungen der NB-assoziierten Phox2b-Mutationen auf Proliferations- und Differenzierungsverhalten sympathoadrenerger Vorläuferzellen zu untersuchen. Hierzu wurden paravertebrale, sympathische Grenzstränge aus Huhnembryonen des Embryonaltags 7 präpariert, dissoziiert und mit Expressionsplasmiden für Phox2bwt und NB-Phox2b-Mutationen transfiziert. Nach zwei Tagen in Kultur wurden mit molekularbiologische Methoden Veränderungen des Proliferations-und Differenzierungsverhalten untersucht. Die Analyse des Proliferationsverhaltens transfizierter Neurone mit BrdU-Proliferationsassays und Phospho-Histon-3-Antikörpern offenbarte einen stark antiproliferativen Effekt des Phox2bwt-Proteins, den die untersuchten NB-Phox2b-Mutationen nicht aufwiesen. NB-Phox2b-Patienten sind heterozygot, d.h. Träger eines gesunden und eines mutierten Phox2b-Allels. Um die genetische Situation im NB-Patienten nachzuahmen, wurde mit spezifischen siRNAs das endogene Phox2b-Protein-Niveau herunter reguliert. NB-Phox2b-Mutationen mit mis- oder nonsense Mutation in der Homöodomäne zeigten unter Phox2b-Knockdown-Bedingungen einen proliferationsstimulierenden Effekt. Diese Experimente warfen die Frage auf, über welche Mechanismen Phox2b und NB-Phox2b-Mutationen Einfluss auf die Zellzykluskontrolle nehmen. Die quantitative Analyse der Expression bekannter Zellzyklusregulatoren wie Zyklin D1, D2 und D3 und der Zyklin-abhängigen Kinase-Inhibitoren p18, p21 und p57kip2 verlief ergebnislos. Die Überexpression des Zyklin-abhängigen Kinase-Inhibitors p27kip1 wirkte antiproliferativ auf Kulturen sympathoadrenerger Vorläuferzellen und das p27kip1-Epxressionsniveau korrelierte mit dem Phox2b-Proteinniveau. P27kip1 scheidet jedoch als alleiniger Vermittler des antiproliferativen Effekts von Phox2b aus, da die ebenfalls antiproliferativ wirkende Phox2-Homöodomäne keinen Einfluss auf das p27kip1-Expressionsniveau besitzt. Vielmehr wurde der bHLH-Transkriptionsfaktor Hand2 als Mediator der Proliferationseffekte von Phox2b identifiziert. Die Proliferation sympathoadrenerger Vorläuferzellen ist abhängig von der Hand2-Proteinmenge, und Hand2-Überexpression ist ausreichend, den antiproliferativen Effekt von Phox2b aufzuheben. Damit im Einklang geht der proliferationsstimulierende Effekt der Phox2bHDmut bei siRNA-vermitteltem Hand2-Knockdown verloren. Weiterhin führt Phox2b-Überexpression zu verringertem Hand2-Expressionsniveau und Phox2b-Knockdown zu vermehrter Hand2-Transkription. In Protein-Protein-Interaktionsexperimenten konnte eine direkte Bindung von Hand2 an Phox2bwt und die untersuchten NB-Phox2b-Mutanten nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Hand2 in der Vermittlung der Phox2b-Proliferationseffekte auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene involviert ist. Der Wirkungsmechanismus dieser Phox2b-Varianten / Hand2-Komplexe konnte nicht endgültig geklärt werden und wird in Form verschiedener Modelle diskutiert. In NB-Patienten korreliert ein hohes Expressionsniveau von Differenzierungsmarkern mit mildem Krankheitsverlauf. Die Rolle von Phox2b als Schlüsselgen in der Entstehung und Differenzierung autonomer Neurone und die genetische Heterogenität des NB legen eine Funktion von NB-Phox2b-Mutationen auf den Differenzierungsstatus sympathoadrenerger Vorläuferzellen nahe. In quantitativen Analysen wurde die Expression von Phox2b-Zielgenen und in NB-Diagnostik involvierten Genen untersucht. Phox2bK155X, eine C-terminal trunkierte NB-Phox2b-Mutation, wirkte dominant-negativ auf die Expression der noradrenergen Markergene Th und Dbh, Tlx3 und die Neurotrophinrezeptoren trkA und p75, deren reduzierte Expression mit schlechter Prognose und damit aggressiven NB-Formen korreliert ist. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, das NB-Phox2b-Mutationen in sympathoadrenergen Vorläuferzellen, den potentiellen Tumorentstehungszellen des NB, proliferationsstimulierend wirken und zumindest die C-terminal trunkierte Phox2bK155X-Mutation zur Dedifferenzierung dieser Zellen führt. Hereditäre Mutationen in Phox2b könnten im Patienten nicht nur die terminale Differenzierung sympathischer Neurone stören, sondern auch durch eine verlängerte Phase der Neurogenese die Empfänglichkeit für weitere Tumor-initiierende Mutation erhöhen.
Primäre Hirntumore des Zentralen Nervensystems (gehen aus Nervenzellen, Gliazellen, Hirnhäute (Meningen) und auch Hirngefäße aus. Das anaplastische Astrozytom, Oligodendrogliom und Oligoastrozytom (WHO-Grad III) und auch die bösartigste Form, das Glioblastoma multiforme (WHO-Grad IV) bilden den wesentlichen Anteil der astrozytären Tumoren. Bedingt durch die ungünstige Prognose für Patienten mit Glioblastomen bedarf es einer Optimierung der therapeutischen Maßnahmen. Die momentane Therapie besteht nach Konstitution des Patienten und der Lokalisation des Tumors meist aus der Operation mit angeschlossener Strahlen- und eventueller adjuvanten Chemotherapie. Die Prognose ist abhängig von verschiedenen Faktoren, wie der Ausbreitung und der Lokalisation des Tumors und hat sich in den letzten Jahren leider nur unwesentlich verbessert, da immer noch von einer medianen Überlebenszeit des Patienten zwischen 8 und 15 Monaten im Falle eines Glioblastoms ausgegangen werden kann. Die Entstehung und Progression von malignen Tumorerkrankungen sind eng mit Störungen und Defekten in Signalwegen, die das Zellüberleben und den Zelltod regulieren, verknüpft. Aberrationen, wie die Blockade von Tumorsuppressorgenen, oder die Aktivierung bzw. Überexpression von Onkogenen, führen zur veränderten Expression von Zelltod-inhibitorischen Genen wie den anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedern, und letztendlich zu Abweichungen der normalen zellulären Homöostase. Veränderungen dieser Art bewirken, dass Tumorzellen die Fähigkeit erhalten, unkontrolliert zu proliferieren, infiltrativ zu wachsen und eine eigene Vaskularisierung zu initiieren. Tumorzellen besitzen eine erhöhte Apoptose- und Zelltodresistenz, die maßgeblich durch die stark erhöhte Expression von anti-apoptotischen Bcl-2-Proteinen gekennzeichnet ist. In der vorliegenden Arbeit stand daher die Fragestellung im Mittelpunkt, inwieweit anti-apoptotische Proteine der Bcl-2-Familie zur Resistenz von malignen Gliomzellen gegen die Apoptose und den autophagischen Zelltod beitragen und wie diese Mechanismen gezielt überwunden werden können. Die Blockade der vier Familienmitglieder der Bcl-2-Subfamilie (Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1, Bcl-w) wurde über den Einsatz von spezifischen Inhibitoren, den sogenannten BH3-Mimetika, vermittelt. BH3-Mimetika besitzen eine hohe Affinität zur Bindungstasche der Bcl-2-Proteine, wobei durch die Bindung eine Blockade des Proteins hervorgerufen wird. Die eingesetzten BH3-Mimetika haben unterschiedliche Bindungsprofile und können daher ein, zwei oder mehrere Proteine der Bcl-2-Familie inhibieren. Die verwendeten Inhibitoren BH3I-2, HA14-1 und ABT-737, die nur eine limitierte Wirkung auf den Zelltod von Gliomzellen entfalteten, sind allesamt nicht in der Lage, Mcl-1 zu blockieren. Deshalb wurde zusätzlich ein Pan-Bcl-2-Inhibitor, das (-)-Gossypol, verwendet. Dieser Inhibitor hemmt alle anti-apoptotischen Bcl-2-Familienmitglieder, und steigerte über die Inhibition und Degradation von Mcl-1 effizient den Zelltod von Gliomzellen. Dagegen zeigte die (-)-Gossypol-Behandlung in nicht transformierte Astrozytenkulturen keine zytotoxischen Effekte. Zusätzlich wurde nachgewiesen, dass durch das BH3-Mimetikum (-)-Gossypol ein autophagischer Zelltod induziert wird. Unter der Verwendung eines charakteristischen Markerproteins, dem LC3-Protein, konnte nach Induktion des nicht-apoptotischen, autophagischen Zelltodes durch (-)-Gossypol eine Translokation von GFP-LC3 in die Autophagosomen und Autolysosomen festgestellt werden. Viele Gliome weisen eine Methylierung des MGMT-Promotors auf, die es den Zellen erschwert, schnell DNA-Schäden zu reparieren. Aufgrund dieser Methylierung sind diese Tumoren sensitiv für eine Behandlung mit alkylierenden Substanzen (Temozolomid). Auf Grundlage dieser Beobachtungen wurden die kombinatorischen Effekte von BH3 Mimetika und Temozolomid in MGMT-positiven (U87) und MGMT-negativen (U343) Gliomzelllinien verglichen, wobei sich lediglich in MGMT-negativen U343-Gliomzellen signifikante, kombinierte Effekte ergaben. Dieser Zelltod war mit einer Potenzierung der Autophagie assoziiert, nicht jedoch mit einer Aktivierung von Caspasen und einer lysosomalen Dysfunktion. Die Depletion des endogenen Autophagieinhibitors mTOR bewirkte nach den Behandlungen mit (-)-Gossyol und TMZ einen zusätzlichen zytotoxischen Effekt. Im Gegensatz dazu wurde durch lentivirale RNA-Interferenz gegen die Autophagiegene ATG5 und Beclin1 eine potente Reduktion der zellulären Autophagie und des autophagischen Zelltodes erreicht. Insgesamt unterstreichen diese Daten die zentrale Rolle von Bcl-2 Proteinen für die Regulation der Autophagie und legen nahe, dass durch (-)-Gossypol und (-)-Gossypol in Kombination mit Temozlomid in Gliomzellen zytotoxische Autophagie induziert wird.
In der vorliegenden Arbeit wurde in einer Fall-Kontroll-Studie mit 483 Fällen und 300 Kontrollen das Risiko für die berufsbedingte Supraspinatussehnenruptur durch Arbeiten auf oder über Schulterniveau untersucht. Dabei ergab sich eine statistisch signifikante Risikoerhöhung durch das Arbeiten auf oder über Schulterniveau. Eine Dosis-Antwortbeziehung zeigte einen Zusammenhang der Ereignisse. Am stärksten war die Risikoerhöhung bei Patienten, die lebenslang kumulativ mindestens 3195 Stunden auf oder über Schulterniveau arbeiteten. Die adjustierte Odds Ratio dafür betrug 2,1 (CI 1,2-3,7), das Ergebnis ist statistisch signifikant. Neben dem beruflichen Arbeiten auf oder über Schulterniveau gibt es andere Faktoren, die die Entstehung einer Rotatorenmanschettenruptur begünstigen. Dabei sind Alter, Heben/Tragen von Lasten über 20 kg und Arbeiten mit handgeführten vibrierenden Werkzeugen zu nennen. Deshalb wurden die Daten hinsichtlich dieser Faktoren adjustiert. Auch einige Sportaktivitäten können das Risiko für die Rotatorenmanschettenruptur erhöhen. Deshalb wurden die Daten auch für Geräteturnen, Kugelstoßen, Speer- und Hammerwerfen, Ringen und Tennis adjustiert, und die sportliche Anstrengung wurde als Confounder behandelt. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit Ergebnissen früherer Studien, die ebenfalls eine Risikoerhöhung für die Entstehung der Rotatorenmanschettenruptur durch Arbeiten auf oder über Schulterniveau zeigen. Eine genaue Dosis, die zu dieser Risikoerhöhung führt, wurde in der Literatur bisher nicht genannt. Die vorliegende Arbeit liefert die Evidenz für die Annahme eines erhöhten Risikos der Ruptur der Sehne des M. supraspinatus bei Arbeiten auf oder über Schulterniveau. Weiterhin besteht ein Potential für eine primäre Prävention, indem Arbeiten auf oder über Schulterniveau möglichst ganz vermieden wird. Daher sollte die Ruptur der Sehne des M. supraspinatus als eigene Berufskrankheit in die Liste der Berufskrankheiten aufgenommen und die Betroffenen bei kumulativem Arbeiten von mindestens 3200 Stunden auf oder über Schulterniveau entschädigt werden.
Zielsetzung: Die Evaluation der transarteriellen Chemoembolisation (TACE) bei nicht resektablen primären (CCC) und sekundären (Lebermetastasen verschiedener Primärtumoren) Lebermalignomen anhand des lokalen Tumoransprechens, des klinischen Ansprechens und der Überlebensdaten. Material und Methodik: Im Zeitraum vom 1999 bis 2009 wurden in unserem Tumorzentrum 898 Patienten mit CCC und Lebermetastasen mittels TACE behandelt. Die behandelten Tumorentitäten waren im Einzelnen das cholangiozelluläre Karzinom (CCC) (n=46; 5,1%) sowie Lebermetastasen des: kolorektalen Karzinoms (CRC) (n=463; 51,7%), Mammakarzinoms (n=208; 23,2%), Aderhautmelanoms (n=33; 3,7%), Nierenzellkarzinoms (n=22; 2,5%), neuroendokrinen Karzinoms (NET) (n=48; 5,4%), Magenkarzinoms (n=25; 2,8%), Ovarialkarzinoms (n=30; 3,3%) und nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms (NSCLC) (n=21; 2,3%). Als Zytostatika wurden Mitomycin C (8 mg/m²), Gemcitabine (1000 mg/m²), Irinotecan (150 mg/m²) und Cisplatin (60 mg/m²) verwendet. Als Embolisat wurden Lipiodol und Microsphären (EmboCept®) verwendet. Mindestens drei TACE Sitzungen pro Patient wurden in vierwöchigen Abständen ambulant durchgeführt. Das radiologische Tumoransprechen wurde mittels Magnetresonanztomographie (MRT) und/oder Computertomographie (CT) bestimmt und nach den RECIST-Kriterien klassifiziert. Das klinische Ansprechen wurde im Verlauf der Behandlung in neoadjuvant, palliativ und symptomatisch eingeteilt. Die Überlebensdaten wurden nach der Kaplan-Meier-Methode berechnet. Ergebnisse: Die Mindestzahl der durchgeführten TACE war drei. Bei 46 Patienten mit CCC wurden bei 11% PR, bei 60,7% SD und bei 28,3% PD bei einer medianen Überlebenszeit von 14,5 Monaten dokumentiert. 2,2% der Patienten wurden neoadjuvant, 73,9% palliativ und 23,9% symptomatisch behandelt. Bei 463 Patienten mit Lebermetastasen des CRC wurden bei 14,7% PR, bei 48,2% SD und bei 37,1% PD dokumentiert. Die mediane Überlebenszeit lag bei 14 Monaten. 12,9% der Patienten wurden neoadjuvant, 72,4% palliativ und 14,7% symptomatisch behandelt. Bei 208 Patienten mit Lebermetastasen des Mammakarzinoms wurden bei 13% PR, bei 50,5% SD und bei 36,5% PD bei einer medianen Überlebenszeit von 18,5 Monaten dokumentiert. Die Patienten wurden zu 18,75% neoadjuvant, zu 15,38% symptomatisch und zu 65,87% palliativ behandelt. Bei Patienten mit Lebermetastasen des Aderhautmelanoms wurden bei 15,2% PR, bei 42,4% SD und bei 42,4% PD dokumentiert. Die mediane Überlebenszeit betrug 18 Monate. Die klinische Situation war zu 3% neoadjuvant, zu 24,2% symptomatisch und zu 72,8% palliativ. Bei Patienten mit Lebermetastasen des Nierenzellkarzinoms wurden bei 13,7% PR, bei 59% SD und bei 27,3% PD bei einer medianen Überlebenszeit von 6,6 Monaten dokumentiert. Die klinische Situation war zu 81,8% palliativ und zu 18,2% symptomatisch. Bei Patienten mit Lebermetastasen des NET wurden bei 18,8% PR, bei 52,1% SD und bei 29,1% PD dokumentiert. 81,2% der Patienten wurden palliativ und 18,8% symptomatisch behandelt. Patienten mit Lebermetastasen des Magenkarzinoms hatten eine mediane Überlebenszeit von 10,5 Monaten. SD wurde bei 60% und PD bei 40% dokumentiert. 76% der Patienten wurden palliativ und 24% symptomatisch behandelt. Bei den Patientinnen mit Lebermetastasen des Ovarialkarzinoms wurden bei 20% PR, bei 26,7% SD und bei 53,3% PD dokumentiert. Die mediane Überlebenszeit betrug 23,7 Monate bei folgendem klinischen Ansprechen: 13,3% symptomatisch und 86,7% palliativ. Für Patienten mit Lebermetastasen des NSCLC wurden bei 14,3% PR, bei 47,6% SD und bei 38,1% PD bei medianer Überlebenszeit von 11,7 Monaten dokumentiert. Die Patienten wurden wie folgend behandelt: 81% palliativ und 19% symptomatisch. Schlussfolgerung: TACE bei primären (CCC) und sekundären (Lebermetastasen verschiedener Primärtumoren) Lebermalignome stellt ein gut verträgliches, minimal invasives, lokoregionales Verfahren dar, das zu einem guten Tumoransprechen, Lebensverlängerung sowie Verminderung der Symptomatik führt.
Mesenchymale Stammzellen (MSC) rücken in der regenerativen Medizin und im Tissue Engineering immer mehr in den Vordergrund. Im Gegensatz zu embryonalen Stammzellen bergen sie keine ethischen Probleme und sind leicht zu isolieren. Die ursprünglich aus Knochenmark gewonnenen MSC können inzwischen aus vielen verschiedenen Quellen wie Nabelschnurblut [Kern et al. 2006], Dentalgewebe [Huang et al., 2009], Plazenta [Huang et al., 2009], Haut [Salvolini et al., 2009] und aus Fettgewebe isoliert werden [Zuk et al., 2001]. Der Immunphänotyp variiert zwischen den aus verschiedenen Quellen gewonnenen MSC nur gering. Die Gewinnung aus Fettgewebe hat den Vorteil, dass eine minimal invasive Prozedur und eine hohe Ausbeute zusammenkommen. Die Stammzellen aus Fettgewebe (ASC) können in der Therapie eingesetzt werden und zu der Regeneration von Geweben nach Verletzungen beitragen [Wong et al., 2008; Poulsom et al., 2001]. Der genaue Mechanismus mit dem die Stammzellen wirken ist allerdings noch nicht geklärt. Sowohl die Integration der MSCs in das Gewebe als auch ein rein parakriner Einfluss wurden nachgewiesen. Klar ist nur, dass ein positiver Effekt von einer Therapie mit MSC ausgeht [Mizuno et al., 2009]. In vivo sind Zellen verschiedenen Einflüssen ausgesetzt, die den Zustand einer Zelle bestimmen. Lösliche Faktoren wie Wachstumsfaktoren, Hormone oder Vitamine wirken dabei ebenso wie die extrazelluläre Matrix und Zell-Zell-Kontakte auf die Zelle ein, die mit Wachstum, Zellform, Differenzierung oder Ähnlichem antwortet. In meiner Arbeit wurden daher drei unterschiedliche Ansätze für die in vitro Differenzierung von ASC in epitheliale Tubuluszellen untersucht: (1) die Wirkung von löslichen Faktoren, die dem Medium zugesetzt wurden, (2) der Einfluss der extrazellulären Matrix aus zum einen Tubuluszellen und zum anderen Matrigel und (3) die Co-Kultur, bei der auch direkter Zell-Zell-Kontakt untersucht wurde. Damit, und mit einer Kombination der einzelnen Bereiche, sollte das natürliche Umfeld der Tubuluszellen simuliert werden und epitheliale Differenzierung initiieren. Die Zugabe von ATRA, ActA und BMP-7 führte zu einer Differenzierung in die epitheliale Richtung, während die extrazelluläre Matrix aus Tubuluszellen nicht dafür ausreichte. Matrigel hingegen, konnte besonders in der Verbindung mit konditioniertem Medium eine Differenzierung induzieren. Die indirekte Co-Kultur über Membraneinsätze, über die u. a. der parakrine Einfluss der Tubuluszellen untersucht werden sollte, führte zu morphologischen Veränderungen der ASC, die aber nicht mit den hier verwendeten epithelialen Markern nachgewiesen werden konnte. Der direkte Zell-Zell-Kontakt zeigte eine Reduktion des Oberflächen Markers CD90 verbunden mit einer Erhöhung der Expression von CK18. Die Differenzierung von ASC in epitheliale Zellen ist also auf drei verschiedenen Wegen möglich. Zwischen verschiedenen Isolationen von ASC traten hohe Schwankungen bezüglich der Expression von Oberflächenmarkern und Proliferation auf, was auch einen Einfluss auf die Differenzierung haben könnte. Ein Grund dafür könnte die Heterogenität von ASC sein. Zur Reduzierung dieser wurden daher ein Waschschritt eine Stunde nach Kulturbeginn und eine immunomagnetische Isolation mit CD49a, CD90, CD105 oder CD271 durchgeführt. Die immunomagnetische Aufreinigung führte nur zu einer leichten Verbesserung der Heterogenität, aber zu einer sehr geringen Zellausbeute. Für den Waschschritt konnte gezeigt werden, dass die Expression der Stammzellmarker Nestin, oct4 und sall1 signifikant erhöht und Desmin und smA Expression reduziert wurden, was auf eine Reduktion der Heterogenität hindeutete. Der zusätzliche Waschschritt kann also schnell und unkompliziert die Heterogenität der ASC reduzieren. Die Differenzierung von ASC in epitheliale Tubuluszellen durch den Einfluss von Zell-Zell-Kontakten zeigt vielversprechende Ansätze und sollte weiter verfolgt werden. Eine verlängerte Kulturdauer sollte dabei angestrebt werden, da auch die adipogene Differenzierung zumeist erst nach 14 bis 21 Tagen nachweisbar war. Dafür müsste die Markierung mit CellTracker länger nachweisbar sein. Eine Inhibierung der Proliferation könnte die Grundlage dazu liefern. Um den Stand der Differenzierung in die epitheliale Richtung nachzuweisen, könnten andere epitheliale Marker, Ionenkanäle, die erst spät in den Tubuluszellen angelegt werden, und funktionelle Mechanismen untersucht werden. Das Zusammenspiel der verschiedenen Einflüsse auf die Zelle könnte ebenfalls noch genauer untersucht werden. Für die Regenerative Medizin ist es aus Gründen der GMP sinnvoller, die Zellen nur mit dem Zusatz an löslichen Faktoren zu differenzieren. Der Ansatz mit ATRA, ActA und BMP-7 scheint sehr vielversprechend zu sein und könnte in dieser Hinsicht weiter ausgebaut werden.
Fullerene, Nanoröhren und auch anderen hohlen Strukturen können Atome oder Moleküle in ihrem Inneren einschliessen. In solchen Systemen beeinflussen sich die einschliessenden und eingeschlossenen Strukturen gegenseitig, und es existiert eine Vielzahl unterschiedlicher Effekte: Änderungen der Energieeigenwerte, Änderungen der Elektronenstruktur sowie Ladungsaustausch zwischen den beiden Teilen des Systems. All diese Effekte beeinflussen die Absorbtionsspektren beider Systembestandteile. In dieser Arbeit liegt der Schwerpunkt auf einem dieser Effekte: Dem dynamischen Abschirmungseffekt. Den dynamischen Abschrimungseffekt findet man insbesondere bei solchen Systemen, bei denen die einschliessende Struktur viele delokalisierte Elektronen besitzt. Zu solchen Systemen gehören zum Beispiel endohedrale Komplexe sowie "Nano Peapods" (Nanoröhren mit eingeschlossenen Atomen oder Molekülen). Ursächlich für den dynamischen Abschirmungseffekt ist die Tatsache, dass die Elek- tronen des umschliessenden Käfigs die eingeschlossene Struktur gegen elektromagentische Wellen abschirmen. Mit anderen Worten: Dass das elektrische Feld sowohl innerhalb als auch ausserhalb der einschliessenden Struktur wird vom polarisierenden Feld der einschliessenden Struktur beein°usst. Klassisch betrachtet ist die Photoabsorbtionsrate eines Objektes proportional zu der Intensität eines elektrischen Feldes. Somit unterscheidet sich die Photoabsorbtionsrate (und auch der Wirkungsquerschnitt) der gleichen elektromagnetischen Welle einer Struktur innerhalb eines Einschlusses von der Photoabsorbtionsrate eines freien Atoms oder Moleküls. Der dynamische Abschirmungsfaktor dient als Beschreibung des Verhältnisses dieser beiden Wirkungsfaktoren. Darüber hinnaus können, da die Käfigstruktur viele delokalisierte Elektronen besitzt, Elektronen gemeinsam angeregt werden und somit Plasmons hervorrufen. Wenn sich die Frequenz der anregenden elektromagentischen Strahlung der Resonanzfrequenz dieser Plasmonen annähert, wird das polarisierende Feld besonders gross. Im Endeffekt beobachtet man nahe der Plasmon-Frequenz einen starken Anstieg des Wirkungsquerschnittes der eingeschlossenen Struktur. Der Schwerpunkt in dieser Arbeit liegt auf einer spezifischen Art von System: Endo- hedrale Komplexe. Diese Strukturen wurden mit einem klassichen Ansatz untersucht. Die Fullerene wurden, da sie viele delokalisierte Elektronen besitzen als dielektrische Schalen modelliert, mit der dielektrischen Funktion eines freien Elektronengases. Dabei ist der dynamische Abschrimfaktor durch Auswertung des gesamten elektrischen Feldes am Ort des Atoms im Vergleich zur Stärke des externen elektrischen Feldes definiert. Der dynamische Abschrimungsfaktor wurde für eine Vielzahl unterschiedlicher Situationen untersucht. Im einfachsten Fall, bei dem die Polarisierbarkeit des eingeschlossenen Atoms vernachlässigbar klein ist, ist der dynamische Abschirmfaktor unabhängig von der Position des Atoms innerhalb des Fullerens. Die Veranderung des elektrischen Feldes wird vollständig von der dynamischen Reaktion des Fullerens auf das externe Feld bestimmt. Da das Fulleren von endlicher Dicke ist (definiert duch die räumliche Ausdehnung der Elektronenwolke), besitzt es zwei Oberflächen. Die Wirkung der elektromagnetischen Welle induziert oszillierende Oberflächen-Ladungs-Dichten. Die Oberflächen-Ladungs-Dichten wechselwirken und erzeugen somit zwei Plasmon Eigenmoden: eine symmetrische Mode bei der beide Ladungsdichten in Phase oszillieren und eine antisymmetrische bei denen sie gegen-phasig oszillieren. Der dynamische Abschirmfaktor eines solchen eingeschlossenen Atoms zeigt zwei ausgeprägte Peaks, welche eine Manifestation dieser beiden Oberflächen-Plasmone sind. Die Wechselwirkung zwischen diesen Plasmon-Moden wurde untersucht. Darüber hinnaus wurde der Einfluss der Grösse des Käfigs untersucht; mit Fallbeispielen für C20, C60, C240 und C960 [2, 3]. Im Grenzfall eines unendlich dünnen Fulleren-Käfigs ist nur ein einelnes Oberflächen-Plasmon zu beachten. Als nächstes wurde der Einfluss des eingeschlossenen Atoms untersucht [3{5]. Wenn dessen Polarisierbarkeit gross ist, wird ein reziproker Einfluss des Dipol-Moments des Atoms auf das Fulleren messbar. Dies wurde zunächst unter der Annahme eines zentral angeodneten Atoms für die folgenden drei Fälle untersucht: Ar@C60, Xe@C60 and Mg@C60. Der dynamische Abschirmfaktor verÄanderte sich dabei nur wenig. Der stärkste Einfluss auf das Verhalten des Abschirmfaktors ensteht durch Unstetigkeiten in der Polarisierbarkeit des Atoms nahe dessen Ionisierungs-Schwelle. Die Wahl dieser drei Fallstudien ist durch die quantenmechanischen Berechnungen von [7-9] motiviert. Der Vergleich mit diesen Berechnungen zeigt hohe Übereintismmungen für Ar@C60 und Xe@C60. Allerdings fanden sich auch grosse Unterschiede für Mg@C60, vor allem bei niedriger Photonen-Energie. Das Fulleren besitzt zwei Arten von Valenzelektronen: Die ¼-Elektronen und die stärker gebundenen ¾-Elektronen. Dies führt zum Auftreten zweier Oberflächen-Plasmons in Fullerenen. Dabei ist allgemein bekannt, dass das Buckminster-Fulleren ein Plasmon nahe 8 eV, sowie ein deutlich größeres nahe 20 eV besitzt. Diese sind mit den ¼-Elektronen, respektive den ¾-Elektronen verknüpft (auch wenn ¼-Elektronen zusÄatzlich zu dem ¾-Plasmon beitragen). Aufgrund dieser Tatsache wäre es angemessener, die Valenzelektronen nicht als Ein-, sondern als Zwei-Komponenten-Elektronen-Gas zu behandeln. Um dies miteinzubeziehen, passten wir unser Modell dahingehend an, dass wir das Fulleren als zwei unabhängige kozentrische dielektrische Schalen simulieren. Die Valenzelektronen wurden so auf die zwei Schalen aufgeteilt, dass eine Schlale alle Elektronen enthielt, die Teil des ¼{Plasmons sind, und die andere alle Beteiligten am ¾{Plasmon [4, 5]. Der Vergleich dieses modifizierten Modelles mit den quanten{mechanischen Berechnungen zeigte eine deutlich verbesserte Übereintismmung der Ergebnisse. Alle Merkmale der Berechnungen, vor allem das deutliche Maximum nahe 10 eV bei Mg@C60, konnten reproduziert und damit erklärt werden. Bedingt durch die endliche Dicke der Fulleren-Schale spalten jeder der beiden Plasmonen in jeweils zwei Plasmon Eigenmoden auf. Daher zeigt der dynamische Abschirm-Faktor nun vier Haupt{Eigenschaften welche die vier Plasmon-Moden abbilden. Nichtsdestotrotz zeigen sich immer noch quantitative Unterschiede im Falle von Mg@C60. Fürr Ar@C60 und Xe@C60, bei welchen das ursprÄungliche Modell bereits gute Fits zeigte, werden diese Fits durch die Anpassungen im Modell sogar noch verbessert. Interessanterweise zeigen sich die größten Veränderungen des dynamischen Abschirm-Faktors bei niedrigen Photonen{Energien, also im Bereich des ¼-Plasmons. Betrachtet man den Querschnitt dieses Fulleren Modells, so zeigt der Querschnitt Eigenschaften die den vier Ober°Äachen{Plasmon{Moden des Fullerens zugeordnet werden. Vergleicht man dies mit anderen theoretischen Arbeiten [12] und einer Sammlung verschiedener experimenteller Messungen [10], so zeigt sich, dass alle SchlÄussel{Eigenschaften des Querschnittes in unserem Modell vorhanden sind. Abschlie¼end wurde die Abhängigkeit des dynamische Abschirm-Faktors von der Position des endohedralen Atoms innerhalb des Fullerens anhand zweier Fallstudien, Ar@C60 und Ar@C240 [3, 4], untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass der dynamische Abschirmfaktor relativ unempfindlich gegenüber Veränderung des Positions-Winkels des Atoms ist. Die radiale Position hingegen stellte sich als sehr wichtig heraus. Je mehr sich das Atom der Fulleren-Hülle nähert, desto grösser wird der dynamische Abschirmfaktor. Diese Studien zeigen, dass es notwendig ist, eine Art räumlichen Mittelwertes für den dynamische Abschirmfaktor zu bestimmen, um sichtbare Resultate zu erhalten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher eine Methode für solch einen Mittelwert entwickelt [3, 4]. Neben der Untersuchung des dynamische Abschirm-Faktors wurde auch ein Vergleich mit experimentellen Messungen erarbeitet. Im Falle von Ce@C82 war die Photon{Energiespanne sehr hoch, weit über der Plasmon-Energie des Fullerens. Das Fulleren sollte daher für eine solche Bestrahlung durchlässig sein, und daher würde man keinen dynamischen Abschirmungs-Effekt finden können. Der Vergleich für Sc3N@C80 ist komplizierter. Da es sich dabei um ein rein klassisches Modell handelt, muss man achtgeben, es nicht mit dem vollständig freien Komplex zu vergleichen, sondern zusätzlich quanten{mechanische Effekte aus Confinements, wie zum Beispiel Elektronen{Transfers, miteinzubeziehen. Zudem ist das aktuelle Modell zu dynamischer Abschirmung nicht für Moleküle, sondern nur für einzelen Atomeentwickelt worden. Ein erster naiver Vergleich, in welchem der Endohedrale Komplex als Pseudo{Atom modelliert wurde, konnte die breite Struktur der experimentellen Ergebnisse nicht wiedergeben. Berechnungen des dynamischen Abschirmfaktors und des daraus resultierenden Querschnittes für ein einzelnes Scandium{Ion zeigte, dass auch räumliches Mitteln nicht ausreicht um die experi-mentellen Beobachtungen erklären zu können. Die Anwesenheit des Fullerens führt zur Öffnung eines neuen Kanals innerhalbdes Auger Prozesses [6, 11] und damit zur Verbreiterung der atomaren Spektrallinienweite. Berücksichtigt man diesen Effekt, so kann die ÄAhnlichkeit zu den experimentellen Ergebnissen deutlich erhöht werden. Allerdings ist es wichtig dabei auch die räumlichen Abhängigkeiten des Effekts, wie auch die der dynamischen Abschirmung, zu beachten. Erste vorläufige Ergebnisse deuten an, dass die beiden genannten Effekte, zumindest teilweise, dabei helfen können, die experimentell gefunden Ergebnisse zu erklären. Unser Modell zur Berechnung des dynamischen Abschirmfaktors liefert eine detaillierte Beschreibung und mögliche Erklärungen der diskutierten Phänomene, welche über die bisherige Arbeiten in der theoretischen Literatur hinausgehen. Die wichtigen Eigenschaften der experimentellen Arbeiten konnten mit dem Modell reproduziert werden, und mit der Verbreiterung der atomaren Spektrallinienweite und der dynamischen Abschirmung konnten wir zwei Effekte als mögliche bisher nicht berücksichtigete Erklärungen für einige dieser Eigenschaften herausarbeiten.
In unserer Untersuchung wurde die systolischen und diastolischen Funktionsparameter sowohl bei gesunden Kindern als auch im Rahmen der Früherkennung toxischer Kardiomyopathien nach Anthrazyklintherapie mittels 3D- und 2D-Echokardiographie bestimmt. Wir konnten eine signifikante Abnahme der EF unter anthrazyklinhaltiger Chemotherapie durch beide Messverfahren nachweisen (2D: p= 0,013033; 3D: p = 0.001526). Jedoch zeigte sich keine Korrelation der Ergebnisse beider Verfahren (Bland-Altmann´s Korrelationskoeffizient r=0,1897, Student´s t-Test p<0,01). Die nach Teichholz ermittelte LVEF lag in der therapienaiven Gruppe um durchschnittlich 7% in der therapierten um 8% höher als in der 3D-Messung, hier zeigte sich nur bei zwei Kindern eine leichtgradige Einschränkung der EF und bei einem Kind eine höhergradige Einschränkung der EF nach Chemotherapie. Der Mittelwert der dreidimensional ermittelten LVEF lag in der mit Anthrazyklinen therapierten Gruppe nah am unteren Normwert. Bei neunzehn Kindern konnte eine leicht eingeschränkte linksventrikuläre Funktion nachgewiesen werden, bei einem Kind war sie höhergradig eingeschränkt. Es konnten also mit Hilfe der 3D-Echokardiographie signifikant mehr beginnende Einschränkungen der LVEF nachgewiesen werden (p=0,00520). Durch diese Ergebnisse wird die Relevanz guter Vorsorgeuntersuchungen vor und während anthrazyklinhaltigen Chemotherapien offenkundig. Mit Hilfe der 3D-Echokardiographie können schon frühzeitig beginnende Kardiomyopathien entdeckt und behandelt werden. Bei frühzeitigem Behandlungsbeginn können die Spätfolgen deutlich reduziert werden (70/71). Gerade im Kindesalter ist dies von großer Bedeutung, da die jungen Patienten die längste Zeit ihres Lebens noch vor sich haben und am meisten unter der stark eingeschränkten Lebensqualität bei Kardiomyopathie leiden. Einige Kinder mussten in der Vergangenheit nach anthrazyklinhaltiger Chemotherapie herztransplantiert werden (96). Als wesentliches Merkmal einer beginnenden Herzschädigung vor einer manifesten Einschränkung der linksventrikulären systolischen Funktion gilt die diastolische Herzfunktion. Wir konnten zeigen, dass signifikant mehr diastolische Funktionsstörungen (p= 0,011185) nach anthrazyklinhaltiger Chemotherapie als vor der Therapie auftraten, außerdem konnten wir in diesem Zusammenhang auch eine Dosisabhängigkeit mit linearem Trend nachweisen. Patienten, denen Dosen von 200-400 mg/m² appliziert wurden, weisen sigifikant (p= 0,033310) häufiger diastolische Funktionsstörungen auf als vor Therapie. Dies konnte bei Dosen von 0-200 mg/m² nicht gezeigt werden, allerdings kann man durch die graphische Darstellung auf eine Tendenz schließen. Entsprechend der Studie von Sorensen et al. (136) nehmen wir eine Anthrazyklindosis von > 200 mg/m² als Hauptrisikofaktor für die Entwicklung einer toxischen Kardiomyopathie an. Als positives Ergebnis unserer Untersuchung ist das insgesamt seltene Auftreten von relevanten Kardiomyopathien zu werten, auch die diastolische Funktion liegt bei den meisten Kindern nach Therapie im Normbereich. Am ehesten ist dies der sorgfältigen Vorsorge und der strengen Einhaltung der kumulativen Schwellendosis zuzuschreiben.
HINTERGRUND: Die BioPhysio™ (Edwards Lifescience LLC, Irvine, CA) Bioprothese wurde konstruiert um die hämodynamischen Eigenschaften bisher verfügbarer gerüsttragender Aortenklappenprothesen weiter zu verbessern. Ein flexibles Nitinolgerüst, welches die natürlichen Bewegungen der Aortenwurzel während des Herzzyklus zulässt und trotzdem einfach implantiert werden kann, ist die Hauptinnovation dieser Prothese. Das Ziel dieser Studie ist die klinische Evaluation dieser neuen Prothese. METHODEN: Zwischen Dezember 2004 und August 2005 wurden 50 BioPhysio Aortenklappenprothesen implantiert. Das mittlere Alter der Patienten betrug 75,9 ± 5,1 Jahre. Klinische Ergebnisse, Klappenöffnungsflächen, transvalvuläre Gradienten und der Rückgang der Linksventrikelhypertrophie wurden echokardiographisch vor der Entlassung, nach sechs Monaten, zwölf Monaten und 24 Monaten nachuntersucht. ERGEBNISSE: Die Gesamtsterblichkeit betrug 14,3% (n=6), wobei nach zwölf Monaten 9,5% (n=4) und nach 24 Monaten 4,8% (n=2). Alle Todesfälle waren nicht klappenbezogen. Ein Patient erlitt zwei Jahre nach der Operation eine Endokarditis und wurde erneut operiert. Es gab keine Fälle von Herz- oder Nierenversagen. Die Bioprothese zeigte gute hämodynamische Eigenschaften. Eine signifikante Reduktion des mittleren Gradienten auf 15,1 ± 8,3 mmHg konnte erzielt werden. Die mittlere Klappenöffnungsfläche betrug 1,5 ± 0,7 cm² und die mittlere Ejektionsfraktion 60,7 ± 7,2%. Es traten keine Aorteninsuffizienzen auf. Die New York Heart Association Funktionsklasse verbesserte sich bei allen Patienten und es konnte eine signifikante Reduktion des Linksventrikelmasseindex von 185,7 ± 49,6 g/m² festgestellt werden. KONKLUSION: Die klinische Darbietung der neuen BioPhysio Bioprothese ist vergleichbar mit den konventionellen gerüstlosen Herzklappenprothesen. Durch ihr einzigartiges Design ist sie jedoch schneller und einfacher zu implantieren als konventionelle gerüstlose Prothesen.
Die Novellierung des Hochschulrahmengesetzes zum Wintersemester 2005/06 hat den Universitäten die Möglichkeit eröffnet, 60 Prozent der Studierenden direkt auszuwählen und damit intensiv in die Konzeption der zahnmedizinischen Studienplatzvergabe einzugreifen. Vor diesem Hintergrund war das Ziel dieser Untersuchung, sowohl objektive schulische Parameter als auch außerschulische Prädiktoren (soft skills) zu eruieren, welche voraussichtlich für ein erfolgreiches Studium, definiert aus guten Noten und Einhaltung der Regelstudienzeit, sprechen. Dazu wurde nach einer Pilotuntersuchung an 114 Kongressteilnehmern der AFDT-Tagung in Bad Homburg (heutige DGFDT) eine Befragung an 260 Studierenden und 64 Mitarbeitern/übrige an der Universität Frankfurt/Main (Zahnärztliches Universitäts-Institut) durchgeführt und die gewonnen Ergebnisse in Korrelation mit den erbrachten universitären Leistungen gesetzt. Die Bewerberzahlen für das Zahnmedizinstudium belaufen sich auf ein Viertel der Mediziner in Frankfurt/Main. Daraus resultieren in Hinblick auf den Untersuchungszeitraum von einem Jahr zwangsläufig geringere Datenmengen und damit unweigerlich Einschränkungen in der statistischen Zuverlässigkeit. Anhand der Ergebnisse und der erhobenen Daten des Studierendenfragebogens wurde der tendenzielle Prototyp des Zahnmedizinstudierenden ermittelt, welcher voraussichtlich erfolgreich, d.h. schnell und gut sein Studium bewältigen wird. Hierbei handelt es sich um eine Zusammenfassung von zum größten Teil nicht signifikanten, deskriptiv gewonnenen Ergebnissen, welche in ihrer so aufgezeigten Gesamtheit keinen Impuls zur Selektion bieten sollen, sondern lediglich schwache Tendenzen zur Standortbestimmung aufzeigen. Hiernach handelt es sich bei dem erfolgreich Studierenden um eine weibliche Person. Sie belegt während ihrer gymnasialen Schulzeit in Hessen oder im Ausland die Leistungskursfächer Mathematik und Chemie, absolviert das große Latinum und belegt bis zum Ende der Oberstufe das Fach Musik. Die Schülerin widmet der Schulzeit voll und ganz ihre Aufmerksamkeit und investiert deshalb keine Zeit in außerschulische Aktivitäten (soft skills). Während der Oberstufe entscheidet sich die psychisch stabile und nie krank werdende Frau dazu, Zahnmedizin zu studieren, und schließt ihr Abitur mit einer Durchschnittsnote ab, die deutlich besser ist als 2,33. Unter den Familienmitgliedern der Studentin befindet sich kein Zahnarzt oder Zahntechniker, wohl aber ein Arzt. Nach dem Abitur bildet sie sich zunächst noch zur Zahntechnikerin weiter und vollzieht dann das Studium der Zahnmedizin ohne BAföG zu beziehen oder arbeiten zu müssen. Trotz allem muss natürlich in Bezug auf die soft skills festgehalten werden, dass durchaus Studierende ermittelt wurden, welche hervorragende Ergebnisse im Studium erzielten und sich zudem bezüglich außerschulischer Aktivitäten engagierten und herausragende Leistungen (z.B. Preisträger) vollbrachten. Die Ergebnisse bei den Mitarbeitern/übrige zeigen vor allem zwei Tendenzen. Zum einen schnitten diese im Vergleich zu den Studierenden in allen Prüfungsbereichen besser ab und zum anderen zeigt sich ebenso der Trend dahingehend, dass eine Abnahme der Angaben von soft skills eher mit einem erfolgreichen Studium korreliert. Als Hauptgrund sieht der Autor hier die "Erfolgsdruckunabhängigkeit", d.h. es besteht bei diesen nicht der Zwang, sich gegenüber anderen Mitarbeitern behaupten zu müssen, wie es verständlicherweise unter Wettbewerbsdruck vieler Studierender zu finden ist. Eindeutige Ergebnisse liegen bei den Kohorten mit der Zahntechnikerausbildung vor. Sowohl bei den Studierenden als auch bei den Mitarbeitern/übrige zeigt sich ein eindeutig besseres Abschneiden im Physikum im Bereich der Zahnersatzkunde, was eine wichtige Hürde im Verlauf des Zahnmedizinstudiums darstellt. Letztlich sieht der Autor den "goldenen Weg" zur Studierendenauswahl nur in der Kombination von Abiturdurchschnittsnote und manuellen Geschicklichkeitstests, plus Bonifikation derjenigen Studierenden mit Zahntechnikerausbildung. Soft skills können maximal einen Hinweis auf ein erfolgreiches Studium geben, eine signifikante Aussage konnte aber in keinem Fall gefunden werden.
Fischöle (n-3 PUFAs) haben potente antientzündliche Wirkungen und klinische Effekte bei chronischen kardialen Erkrankungen. Ebenso wurden positive Effekte auf die bronchiale Entzündung beschrieben. Ziel unserer Studie war es daher zu prüfen, ob eine alleinige fischölreiche Ernährung ohne zusätzliche PUFA-Supplementation messbare Auswirkungen einerseits auf den Lipidstatus im Blut der Patienten, andererseits auf das Ausmaß der nasalen und bronchialen Beschwerden sowie der bronchialen Entzündungsaktivität bei Graspollenallergikern aufweisen kann. Hierzu untersuchten wir 100 Patienten hinsichtlich ihrer nasalen und bronchialen Allergiesymptomatik, erfassten die Ernährungsgewohnheiten mittels eines standardisierten Fragebogens, und bestimmten im Blut den Lipidstatus (Gehalt an mehrfach ungesättigten Fettsäuren; n-3 PUFA). Wir konnten zeigen, dass die Ernährung einen messbaren Einfluss auf den Gehalt an n-3 PUFA im Blut hat und dass dieser Gehalt bei Patienten mit regelmäßigem Fischkonsum höher lag als bei denjenigen, die keinen Fisch zu sich nahmen (Plasma-EPA-Konzentration: Fischesser 1,01 ± 0,7 wt%, Fischhasser 0,28 ± 0,1 wt%; p< 0,004; Plasma-DHA-Konzentration: Fischesser 2,30 ± 0,6 wt%, Fischhasser: 1,19 ± 0,3 wt%; p< 0,0001). Der Vergleich der Fettsäurewerte unserer Patienten mit den Werten von Milbenallergikern unter fünfwöchiger Fischöl-Supplementation machte allerdings deutlich, dass der n-3 PUFA-Gehalt mit gezielter Nahrungsergänzung noch weiter ansteigen kann. Die möglicherweise durch hohe n-3 PUFA-Konzentrationen bedingten protektiven Effekte auf die allergische Atemwegsentzündung der Patienten wurden an der Höhe des eNO als einem spezifischen und sensiblen Marker gemessen. Es konnte gezeigt werden, dass Patienten, die viel Fisch zu sich nahmen, durchschnittlich einen niedrigeren eNO- Ausgangswert entsprechend einer geringeren Entzündung aufwiesen als Patienten ohne Fischkonsum (Fischesser: 21,38 ± 11,8 ppB; Fischhasser: 31,35 ± 19,8; p=0,188). Allerdings unterschied sich der mittlere eNO-Anstieg 24 Stunden nach Graspollenprovokation nicht zwischen Patienten mit Fischkonsum (18,25 ± 23,7 ppB) und Patienten ohne Fischkonsum (19,53 ± 31,6 ppB). Ebenso zeigte sich kein signifikanter Einfluss der PUFA-Spiegel auf das Gesamt-IgE, das spezifische IgE gegen Graspollen und den FEV1-Abfall nach bronchialer Allergenprovokation. Zusammengefasst macht unsere Untersuchung deutlich, dass eine alleinige Ernährung ohne Supplementation keinen signifikanten Effekt auf allergische und entzündliche Parameter bei Graspollenallergikern und milden Asthmatikern besitzt.
Der Typ 1 Diabetes ist eine klinisch heterogene Erkrankung. Sowohl die genetischen Faktoren als auch die Umwelt wirken bei der Entstehung der autoimmunologischen Prozesse dieser Erkrankung zusammen. Die Fragestellung der vorgestellten Untersuchung war, inwieweit sich ein Einfluss der exogenen Faktoren auf das Risiko des T1D der Betroffenen äußert und sich nachweisen lässt. Als Determinante der Veränderung der Umwelt diente die Migrationsbewegung der Bevölkerung. Die derzeitige Forschungslage bietet, trotz den seit Jahrzehnten geführten kontroversen Diskussionen dieser Frage, keine Klärung der Kausalitäten in der Pathogenese des T1D. Aus der vorliegenden Arbeit ergibt sich ein Hinweis auf einen möglichen Risikoanstieg von T1D bei Probanden mit einem Migrationshintergrund. Dabei wurden zum Einen die Überlegungen der Hygienehypothese berücksichtigt. Zum Anderen scheint ein Abfall der Vitamin D-Konzentration – aufgrund der geringeren Sonneneinstrahlung, die durch eine meist von Süd nach Nord verlaufende Migrationsbewegung bedingt ist – als ein möglicher Risikofaktor. Untersucht wurde eine Stichprobe von insgesamt 187 Typ 1 Diabetikern. Zur Erfassung der möglichen Maßparameter der gestellten Hypothese wurde ein Fragebogen verwendet und die Befragung fand in Form eines Telefoninterviews statt. Die klinischen Daten wurden den Krankenakten entnommen. Die rekrutierte Gesamtkohorte wurde entsprechend dem Migrationsstatus in Gruppen der Einheimischen aus der Bundesrepublik Deutschland (D), der Migranten (M) und der Kinder von Migranten (KM) getrennt. Für die definierten Teilkollektive konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Migrationsstatus und dem Erkrankungsalter gefunden werden: (D) mit 22 Jahren, (KM) mit 11 Jahren und (M) mit 35 Jahren; p < 0,001. Die beobachtete Verschiebung des Manifestationsalters bei Probanden mit einem Migrationshintergrund könnte auf den Einfluss der Umweltfaktoren bei gegebener genetischer Prädisposition hindeuten und somit die Hypothese dieser Studie bestätigen. Andererseits könnte dieses Phänomen durch die selektive Zuweisung von deutschen/migrierten Patienten in das Diabetestherapiezentrum bzw. die Ambulanz der Universitätsklinik bedingt sein. Der Tabakkonsum konnte als ein Risikofaktor nicht bestätigt werden. Desweiteren entwickelte die meist gefährdete Gruppe „Kinder von Migranten“ den Diabetes bevor ein Einstieg ins Raucherleben stattfand (Manifestationsalter bei (KM): 11 Jahre vs. durchschnittliches Einstiegsalter ins Rauchen 11,6 Jahre). Die Belastung durch das Passivrauchen im elterlichen Haushalt unterschied sich weder in Bezug auf den Gruppenvergleich, noch zur Allgemeinbevölkerung. Es wurde eine geringere Prävalenz von zusätzlichen Erkrankungen unter den Migranten in der zweiten Generation beobachtet, die wahrscheinlich auf dem allgemein jüngeren Alter der Probanden beruht. Im Gegensatz dazu ist die Verteilung der Autoimmunopathien zwischen den Gruppen gleich. Die autoimmune Thyreoiditis kommt am häufigsten vor und betrifft fast ausschließlich die Frauen. Aufgrund des höheren Alters bei der Manifestation des T1D unter den männlichen Probanden kann das männliche Geschlecht als ein Risikofaktor in dieser Studie nicht bestätigt werden. Das Alter der Eltern bei der Migration scheint ebenso, wie der Abstand zwischen der Migration und der Schwangerschaft bzw. der Geburt des Kindes, keinen Einfluss auf das Risiko einer früher einsetzenden Diabetesmanifestation bei den Kindern zu spielen. Ein Vitamin D-Mangel wurde bei den einheimischen Patienten mit T1D nicht so häufig wie bei solchen mit Migrationshintergrund beobachtet, was ein höheres Risiko in der letzteren Gruppe bedingen könnte. Dies muss jedoch an einer größeren Stichprobe untersucht werden. Die vorgelegte Untersuchung ist deshalb ein Pilotprojekt einer größer angelegten Folgestudie.
Hämorrhagischer Schock / Reperfusion (H/R) induziert eine inflammatorische Antwort, die zu hepatozellulären Schäden und einem Multiorganversagen führen kann. In vorhergehenden Studien wurde demonstriert, dass H/R die Phosphorylierung von mitogen aktivierten Stress Kinasen (MAPKs), spezifisch c-JUN und ERK, bewirkt; - eine Reaktion, die ebenfalls mit Leberschäden assoziiert ist. Kürzlich wurde ein spezifisches, zellgängiges, protease-resistentes Peptid, D-JNKI-1, entwickelt, welches die c-JUN N-terminale Kinase (JNK) inhibiert. Ziel der vorliegenden Arbeit war es darzustellen, ob D-JNKI-1 durch eine spezifische Inhibierung der JNK den Leberschaden und das Inflammationsgeschehen nach H/R im Tiermodell verringern kann. Als methodischer Ansatz diente ein H/R-Modell an männlichen Sprague-Dawley Ratten. Nach Vorbehandlung mit D-JNKI-1 bzw. NaCl wurde ein hämorrhagischer Schock induziert und durch Reperfusion nach 1 h beendet. Nach 2 h wurden Gewebe- und Blutproben entnommen. Plasmawerte der Alaninaminotransferase, Kreatinkinase, Laktatdehydrogenase und des Interleukin-6 wurden untersucht, die Gewebeproben wurden histochemisch bzw. immunhistochemisch auf Organschäden (Nekrose und Apoptose) und Inflammationsgeschehen (Neutrophileninfiltration der Leber) untersucht, sowie die relative Proteinexpression der aktivierten Stresskinase JNK mittels spezifischer Detektion des phosphorylierten c-Jun im Western Blot quantifiziert. Diese Arbeit stellt die Rolle von D-JNKI-1 als Peptidinhibitor der JNK während H/R dar. H/R führt zu apoptotischen und nekrotischen Zelluntergängen, beides Vorgänge, welche zumindest zum Teil durch JNK gesteuert sind und mittels D-JNKI-1 reduziert werden können. Eine Hemmung der JNK vor einem hämorrhagischen Schock verringert zudem das Ausmaß der Schäden am Lebergewebe, die Produktion von freien Sauerstoffradikalen sowie die Aktivierung pro-inflammatorischer Signalkaskaden im Tiermodell. Diese Erkenntnisse könnten mit die Grundlage eines möglichen therapeutischen Ansatzes in der Verhinderung der Konsequenzen von H/R bilden.
Die arterielle Hypertonie stellt einen bedeutenden Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen dar, ihrer Therapie kommt daher ein hoher Stellenwert zu. Die Medikamentengruppe der Betablocker ist traditionell ein wichtiger Teil der medikamentösen Therapie, in dieser Arbeit wurde untersucht, inwiefern weiterhin ein Einfluss auf die diastolische Funktion, die Leistungsfähigkeit und die Sekretion der natriuretischen Peptide ANP und BNP besteht. Insgesamt wurden 102 Hypertoniepatienten mit zwischen 25 und 75 Jahren untersucht, alle Patienten hatten eine erhaltene systolische linksventrikuläre Pumpfunktion. Es erfolgte ein Gruppenvergleich zwischen den Patienten, die einen Betablocker einnahmen (n = 56) oder nicht (n = 46). Alle Patienten unterzogen sich eine Anamnese, einer Spiroergometrie, einer Echokardiographie samt Bestimmung der diastolischen Funktion und einer Lungenfunktionsprüfung. Laborchemisch wurden unter anderem die Hormone proANP und NT-proBNP erhoben. Zwischen den beiden Gruppen gab es keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich Alter, Geschlecht, NYHA-Klasse oder den kardiovaskulären Risikofaktoren. Bei den Patienten ohne Betablocker bestand mit 21,4 % vs. 6,5 % (p = 0,034) signifikant häufiger die Diagnose einer koronaren Herzerkrankung. Bei der Begleitmedikation gab es keine relevanten Unterschiede in Bezug auf die Substanzen oder die Dosierung. Echokardiographisch ergab sich keine Gruppendifferenz für die diastolische Funktion. In der Spiroergometrie zeigte sich unter Betablockertherapie mit 118 vs.142 Watt (p = 0,019) ein Unterschied in der erreichten Leistung, die maximale Herzfrequenz war mit 128 vs. 142/Min (p < 0,001) ebenfalls erniedrigt. Die systolische Blutdrucksenkung war mit Betablockern sowohl in Ruhe (127 vs. 134 mmHg, p = 134) als auch unter Belastung effektiver. Mit 0,28 vs. 0,25 ml/kg (p = 0,002) war der Sauerstoffpuls pro Kg fettfreien Körpergewichts als Maß für das Schlagvolumen unter Betablockern erhöht. Bei den Patienten unter Betablocker-Medikation waren die Serum-Werte für sowohl proANP (2892 vs. 1839, p < 0,001) als auch NT-proBNP (107 vs. 39, p < 0,001) signifikant erhöht. In der multivariaten Analyse ergaben sich unter Betablockern für ANP das Alter und der HbA1c als unabhängige Prädiktoren, für BNP sind es die NYHA-Klasse und eine Mikroalbuminurie. Ohne Betablocker haben für ANP das Alter und die Belastbarkeit eine unabhängigen prädiktiven Wert, für BNP sind es das HDL, die Größe es linken Atriums und die Belastbarkeit. In Konklusion trägt die Einnahme von Betablockern zu einer effektiveren Blutdrucksenkung bei, vermindert die Belastbarkeit und senkt die Herzfrequenz. Einen Einfluss auf die diastolische Funktion konnten wir nicht zeigen. Die natriuretischen Peptide ANP und BNP sind unter Betablockade erhöht.
Patienten, die sich einer elektiven Operation unterziehen müssen und an einer Leberzirrhose als Vorerkrankung leiden, haben ein deutlich erhöhtes Risko für die Entwicklung postoperativer Komplikationen. Die Auswirkungen einer vorbestehenden Leberzirrhose und/oder eines Alkoholabusus (als typischer Riskofaktor für die Entwicklung einer Leberzirrhose) auf das Outcome schwerverletzter Patienten wurden in der folgenden Studie, unter Berücksichtigung der multizentrischen und anonymisierten Datenbank des Traumaregisters der Deutschen Gesellschaft für Unfallchirurgie, untersucht. Dazu verglichen wir retrospektiv Polytraumapatienten (ISS ≥ 18) mit Alkoholabusus und Leberzirrhose mit einem gesunden Vergleichskollektiv. Letztlich erfüllten 13,527 Patienten die Einschlusskriterien, von 713 (5,3%) einen Alkoholabusus und 91 (0,7%) eine gesicherte Leberzirrhose aufwiesen. Die Gruppe der Leberzirrhotiker zeigte neben einer höheren Rate an Organ- und Multiorganversagen gegenüber der RISC-Prognose eine signifikant erhöhte Krankenhausmortalität (31% gegenüber prognostizierten 19%), wodurch dieser in seiner Verwendung als Prognosescore für verletzte leberzirrhotische Patienten deutlich limitiert wird. In der Matched Pair Analyse unterschieden sich die Patienten mit einer Leberzirrhose verglichen zum Kontrollkollektiv signifikant in Bezug auf Einzel- (Herz, Leber, Niere, Gerinnung) und Multiorganversagen, sowie in der Gesamtmortalität. Die Ergebnisse verdeutlichen die fatalen Auswirkungen einer Leberzirrhose auf das Outcome nach Polytrauma und fordern eine diesbezügliche Evaluierung der Trauma- und Prognosescores (wie z.B. RISC) zur besseren Risikoprofilabschätzung eines Schwerverletzten. Bei den Alkoholikern kam es zwar ebenfalls zu durchschnittlich mehr Organausfällen im Vergleich zur Kontrollgruppe, jedoch war die Krankenhausmortalität gleich. Überraschenderweise verstarben in der Alkoholgruppe innerhalb der ersten 24 Stunden nach Trauma die wenigsten Patienten. Inwieweit dabei Alkohol als möglicher Modulator der posttraumatischen Immunreaktion eine Rolle spielt, konnte bis dahin allerdings nicht beantwortet werden. In einer weiteren Studie wurden deshalb die Interleukin-6 und Interleukin-10 Serumkonzentrationen von 34 alkoholintoxikierten Polytraumapatienten (ISS ≥ 16) des Universitätsklinikums Frankfurt am Main von Aufnahme bis Tag 5 nach Trauma untersucht und mit einer gematchten Gruppe von 15 nüchternen Schwerverletzten verglichen. Während die Alkoholgruppe im Schockraum einen Trend zu erniedrigten IL-6 Konzentrationen aufwies, stiegen diese im posttraumatischen Verlauf immer weiter an und waren am Tag 4 und 5 signifikant gegenüber der nüchternen Gruppe erhöht. Das antiinflammatorische Zytokin IL-10 hingegen zeigte im Gruppenvergleich während des gesamten posttraumatischen Verlaufs keine signifikanten Unterschiede. Die Studie verdeutlicht, dass akute Alkoholintoxikation die Immunantwort des Körpers nach schwerem Trauma moduliert, hier nachgewiesen in einer veränderten Il-6 Antwort im zeitlichen Verlauf bis zum 5. posttraumatischen Tag. Dennoch sind weitere Untersuchung im komplexen Zusammenspiel des janusköpfigen Zytokins IL-6 und anderer hauptsächlich antiinflammatorischer Mediatoren wie z.B. IL-4, IL-11, TGF-β und IL-13 in zusätzlicher Korrelation zum klinischen Outcome notwendig, um die komplexe Immunantwort des Körpers nach Trauma zu verstehen. Letztlich gilt es noch herauszufinden, ob IL-6 als prognostischer Mediator oder Parameter im klinischen Verlauf nach Polyrauma verwendet werden kann.
Die Applikation von Medikamenten zur konservativen Behandlung von Patientinnen mit ektopen Schwangerschaften ist weltweit seit vielen Jahren im klinischen Alltag erfolgreich eingesetzt worden. Am erfolgreichsten zeigte sich über die Jahre, die medikamentöse Methotrexatgabe. Dies wurde eindrucksvoll in in-vivo und in in-vitro Studien bewiesen. Ausgangsbedingungen für die vorliegende Untersuchung sind die zahlreichen experimentellen Untersuchungen zur Wirkung von Prostaglandinen auf den mütterlichen Organismus (speziell glatte Muskelzellen der Blutgefäße, des Uterus und Tubenmuskulatur sowie das Corpus luteum) und die zahlreichen klinischen Fallberichte und Studien zur Anwendung von Prostaglandinen zur Behandlung der EUG. In vitro Studien zu der Wirkweise von Prostaglandinen auf ektopes Schwangerschaftsgewebe gibt es nur in geringer Zahl. Da Prostaglandin E2 in der Geburtshilfe einen festen Platz in der Geburtsinduktion und Zervixreifung hat, haben wir Prostaglandin E2 in vitro auf seine Wirkung auf ektopes Trophoblastengewebe untersucht. In der hier vorgelegten Arbeit sollte die Fragestellung überprüft werden, inwieweit eine medikamentöse Wirkung von Prostaglandin E2 Dinoproston auf Trophoblastengewebe aus extrauterinen Schwangerschaften in einem standardisierten Gewebekultursystem besteht. Aus operativ gewonnenen Extrauteringraviditäten des ersten Trimenons wurde Choriongewebe extrahiert, und in unterschiedlichen Konzentrationen der Wirkstoff Prostaglandin E2 Dinoproston 12 Stunden nach Kulturansatz den Gewebekulturen zugesetzt. Eine weitere Choriongewebekulturzellreihe wurde erst am 6. Tag mit Prostaglandin E2 behandelt. Das durch die Throphoblastenzellen sezernierte Humane Chorion Gonadotropin (HCG) wurde den Kulturen alle zwei Tage entnommen und gemessen. Alle Kulturen zeigten Sekretion von HCG innerhalb der ersten 16 Tage. Das Ergebnis dieser Versuchsreihen zeigte, dass weder die unterschiedlichen Prostaglandin E2-Konzentrationen, noch der Zeitpunkt der Zugabe, eine signifikante Auswirkung auf die HCG Sekretion von ektopen Schwangerschaften hat. Die Kontrollgruppe mit intrauterinem Trophoblastenmaterial bestätigt die fehlende Wirkung auf Throphoblastengewebe in der Zellkultur.
Der hämorrhagische Schock mit nachfolgender Reperfusion induziert eine Inflammationsreaktion, die in hepatozellulären Schäden, Organversagen und / oder Mortalität enden kann. Vorherige Studien können eine antiinflammatorische Wirkung des Simvastatins bei akuter Inflammation zeigen. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es darzustellen, ob Simvastatin durch seine pleiotropen Effekte gemeinsam mit der Reduzierung des Leberschaden und des Inflammationsgeschehen, die Letalität nach H/R im Tiermodell verringern kann.
Als methodischer Ansatz dient ein H/R-Modell an weiblichen LEWIS-Ratten. Nach 6-tägiger intraperitonealer Vorbehandlung mit Simvastatin (5 mg / kg) wird ein 60 minütiger hämorrhagischer Schock (Blutdruck 30 ± 2 mm Hg) induziert und durch eine Reperfusion beendet. Nach 2 Stunden werden Gewebe- und Blutproben entnommen, nach 72 h die Mortalität beurteilt. Die Beurteilung der hepatozellulären Schädigung erfolgt durch die Messung der ALT-Serumkonzentration sowie durch die histopathologische Auswertung repräsentativer Leberschnitte nach HE-Färbung. Apoptotische und nekrotische Zelluntergänge (TUNEL- und M30-Färbung) sowie die lokale als auch systemische Immunantwort (CAE-Färbung und Messung der Serum IL-6 Konzentration) werden untersucht. Der im Lebergewebe bei H/R entstehende oxidative und nitrosative Stress lässt sich durch die 4-HNE- und 3-NT Färbung, die hepatische Umgestaltung des Aktin-Zytoskeletts mittels Alexa Fluor Phalloidin® sichtbar machen. Die ROCK-I, HO-1, eNOS sowie die eNOS (p) Aktivität werden mit Hilfe des Western Blots analysiert. Ein p < 0.05 wird als signifikant erachtet (ANOVA).
Die Neugestaltung des Zytoskeletts, apoptotische und nekrotische Vorgänge, proinflammatorische Signalwege, die Expression der Enzyme Hämoxygenase-1, endotheliale Stickstoffsynthase und RhoKinase-1 sowie oxidativer und nitrosativer Stress werden durch Simvastatin positiv beeinflusst und dadurch wird die Mortalität signifikant reduziert. Die Enzyme ROCK-I, HO-1 und eNOS sind bei den beteiligten Signalkaskaden von entscheidender Rolle.
Die gegenwärtige Studie zeigt, dass Simvastatin neben den bereits bekannten lipidsenkenden Eigenschaften noch weitere pleiotrope Effekte besitzt, die das Ausmaß der systemischen Inflammationsreaktion sowie die Mortalität nach einem hämorrhagischen Schock deutlich beeinflussen. Der Schlüssel zu einer geringeren Sterblichkeit liegt nach unseren Untersuchungen im Erhalt der hepatischen Integrität. Diese viel versprechenden Ergebnisse könnten mit die Grundlage eines möglichen therapeutischen Ansatzes in der Verhinderung der Folgen von H/R bilden.
Morphin-6-Glukuronid (M6G) ist ein aktiver Metabolit von Morphin. Er ist mitverantwortlich für die analgetische und toxische Wirkung nach einer Morphinverabreichung. M6G wird aktuell in klinischen Phase-III-Studien getestet und möglicherweise zukünftig als ein alternatives Schmerzmittel zu Morphin zur Behandlung postoperativer Schmerzen eingeführt. Seine zentralnervösen Opioideffekte könnten sich aufgrund einer erhöhten Konzentration im zentralen Nervensystem (ZNS) als Folge einer erhöhten M6G Blutkonzentration und/ oder einem erhöhten ZNS Transport an der Blut-Hirn-Schranke verstärken. M6G scheint Substrat zahlreicher transmembranöser Transporter zu sein, die u.a. an der Blut-Hirn-Schranke, Niere oder Leber lokalisiert sind. An der Blut-Hirn-Schranke pumpen diese Transporter M6G aktiv aus dem ZNS zurück in das Blut. Die Hemmung der Transporteraktivität könnte somit eine potentielle Ursache einer erhöhten ZNS Konzentration von M6G mit der Folge vermehrter Nebenwirkungen unter Morphin bzw. Morphin-6-Glukuronid Administration sein. Wir untersuchten die Auswirkungen einer pharmakologischen Hemmung der transmembranösen Transporter P-Glykoprotein, sowie den Probenecid sensitiven Transportern multidrug resistance proteins (MRPs), organic anion transporters (OATs) und organic anion transporter polypeptides (OATPs) auf die Rückenmarkkonzentration und antinozizeptiven Effekte von M6G in Ratten. PSC 833 bzw. Probenecid wurden als Inhibitoren von P-Glykoprotein bzw. Probenecid sensitiven Transportern verwendet. Die Rückenmarkkonzentration von M6G wurde direkt mittels in vivo Mikrodialyse durch eine transversal in das Hinterhorn des Rückenmarks implantierten Sonde gemessen. 20 Ratten erhielten M6G als intravenöse Infusion für 8 Stunden, jeweils 5 von diesen bekamen zusätzlich eine Infusion mit PSC 833 oder Probenecid. Die antinozizeptiven Effekte von M6G wurden durch den Formalinschmerztest während der 8. Stunde der M6G Infusion in weiteren Verhaltensexperimenten bestimmt. Dabei wurde die Dosisabhängigkeit der antinozizeptiven Effekte von M6G mit oder ohne PSC 833 bzw. Probenecid im Vergleich mit PSC 833 alleine, Probenecid alleine und Placebo untersucht. In den Mikrodialyseexperimenten wurde unter P-Glykoprotein Hemmung mit PSC 833 eine nahezu dreifach höhere M6G Rückenmarkkonzentration gemessen, während die Blutplasmakonzentration nur um den Faktor 1.2 erhöht war. Die Folge war eine Verdoppelung des Konzentrationsverhältnis Rückenmark zu Blutplasma (von 0.08 ± 0.03 für M6G alleine auf 0.17 ± 0.08 für M6G mit PSC 833). Die antinozizeptiven Effekte von M6G in den Verhaltensexperimenten waren signifikant erhöht unter P-Glykoprotein Hemmung. Die Inhibition Probenecid sensitiver Transporter verursachte einen gleichmäßigen Anstieg der Blutplasma und Rückenmarkgewebekonzentration um den Faktor 1.4, ohne Veränderung des Konzentrationsverhältnis Rückenmark zu Blutplasma (0.081 ± 0.034 für M6G alleine, 0.082 ± 0.021 für M6G mit Probenecid). Die Verabreichung von Probenecid mit M6G zeigte eine signifikante Reduktion der Anzahl der Flinches im Formalinschmerztest um den Faktor 2.5 im Vergleich zu M6G alleine. Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Morphin-6-Glukuronid ein Substrat des Transporters P-Glykoprotein in Ratten ist. Die Verabreichung des P-Glykoprotein Inhibitors PSC 833 erhöhte die Penetration von M6G aus dem Blut in das zentrale Nervensystem und verstärkte dadurch seine antinozizeptive Wirkung. Dieser Effekt ist an der Blut-Hirn-Schranke lokalisiert. Weiterhin wurde demonstriert, dass der Blut-Hirn-Schranken Transport von Morphin-6-Glukuronid nicht durch Probenecid sensitive Transporter beeinflusst wird. Die Verabreichung von Probenecid verstärkte zwar die antinozizeptive Wirkung von M6G aufgrund eines Anstiegs der M6G Rückenmarkkonzentration, jedoch als Folge einer erhöhten Blutplasmakonzentration. Da M6G hauptsächlich in den Urin ausgeschieden wird, ist dieser Effekt wahrscheinlich in der Niere lokalisiert und vermindert die systemische Elimination von M6G. Somit ist M6G ein Substrat Probenecid sensitiver Transporter in Ratten, aber nicht an der Blut-Hirn-Schranke. Da viele Medikamente Inhibitoren von P-Glykoprotein oder Probenecid sensitiven Transportern sind, kann deren gleichzeitige Verabreichung mit Morphin bzw Morphin-6-Glukuronid zu erhöhten M6G ZNS Konzentrationen und Toxizität führen. Die Identifizierung dieser Transporter bedingten Interaktionen in unserer Arbeit kann helfen Medikamentenwechselwirkungen zwischen Inhibitoren und Morphin/ M6G zu vermeiden und die Patientensicherheit unter einer Morphin bzw. Morphin-6-Glukuronid Schmerztherapie zu steigern. Weitere Untersuchungen dieser Interaktionen im Menschen sind nötig, da sie klinisch von großer Bedeutung sind.
In dieser Arbeit sollte der Einfluss von Trockenstress auf die Photosyntheserate von einer repräsentativen C3-Art und dreier repräsentativer Arten unterschiedlicher C4-Subtypen vergleichend untersucht werden, wobei die drei Subtypen der C4-Photosynthese im Vordergrund standen. Anhand der ausgewählten Arten der Modell-Gattung Panicum (s.l.), P. bisulcatum (C3), P. bulbosum (NADP-ME), P. miliaceum (NAD-ME) und P. maximum (PCK), konnten die unterschiedlichen Stoffwechseltypen, an phylogenetisch nah verwandten Arten, auf Unterschiede in der physiologischen Antwort auf den abiotischen Stressfaktor Trockenheit untersucht werden. Hierfür wurden zwei verschiedene Arten der Trockenstressinduktion durchgeführt. Ein Vergleich der Arten in Hinblick auf Unterschiede in der Trockentoleranz erfolgte anhand von Hydrokulturversuchen mit PEG6000 als Osmotikum. In diesem Fall wurde der jeweilige Stress sehr schnell induziert und über die Dauer von 6 Tagen in unterschiedlichen Intensitäten konstant gehalten. Anhand der durchgeführten Gaswechselmessungen und Bestimmungen der Chlorophyllfluoreszenzparameter konnte eindeutig die C3-Art P. bisulcatum als die am sensitivsten auf Trockenstress reagierende Art identifiziert werden. Die drei C4-Arten lagen in ihrer physiologischen Antwort auf die unterschiedlichen Trockenstressintensitäten verhältnismäßig nah zusammen. Bei schwächerem osmotischen Stress zeigte aber P. miliaceum, der Vertreter des NAD-ME Subtyps, eindeutig die geringste Beeinflussung der untersuchten Photosyntheseparameter, was im Wesentlichen auch bei stärkerem osmotischen Stress bestätigt wurde. Zudem zeigte P. miliaceum bei 1400 ppm CO2 im Messgas im Vergleich zu den anderen getesteten Arten eine signifikant höhere Wassernutzungseffizienz, was die bessere Anpassung des NAD-ME Subtypen an osmotischen Stress unterstreicht. Bei dem Trockenstressexperiment in Erde stand die physiologische Maximalantwort auf den natürlicheren, verhältnismäßig langsam induzierten, aber letztendlich starken Trockenstress im Vordergrund. Hier wurde für jede Art untersucht, welche limitierenden Faktoren unter Trockenstress auf die Photosyntheserate wirken. Dafür wurde neben Gaswechsel- und Chlorophyllfluoreszenzmessungen mit der Bestimmung der In-vitro-Aktivitäten der Enzyme des C4-Zyklus, der Bestimmung der PEPC und RubisCO-Gehalte anhand von SDS-PAGE und Western-Blot-Analysen, und der Bestimmung des Deepoxidationsgrades des Xanthophyllzykluses ausgewählte Teilreaktionen der C4-Photosynthese genauer untersucht. Bei allen untersuchten C4- Arten konnte bei dem starken Trockenstress eine eindeutige nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate festgestellt werden. Bei der C3-Art P. bisulcatum sprechen die Ergebnisse für eine Mischung aus stomatären und nicht-stomatären Faktoren, die die Photosynthese unter Trockenstress limitieren. Hier konnte eine Abnahme des RubisCO-Gehalts unter Trockenstress beobachtet werden, was ein möglicher Faktor für eine nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate unter Trockenstress sein kann. Aufgrund der im Mittel reduzierten In-vitro-Aktivitäten der Enzyme des NADP-ME C4-Zyklus (PPDK, PEPC, NADP-MDH und NADP-ME) und einer Abnahme des PEPC- und RubisCOGehalts bei trockengestressten P. bulbosum im Vergleich zu der entsprechenden Kontrolle, konnte bei dem Vertreter des NADP-ME Subtyps die nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate auf eine generelle Abnahme der an der C4-Photosynthese beteiligten Enzyme zurückgeführt werden. Anhand der Bestimmung der In-vitro-Aktivitäten von P. maximum konnte gezeigt werden, dass die als Nebenweg beschriebene Decarboxylierung des CO2 über das NAD-ME in den BSZ, wahrscheinlich im gleichen Maße abläuft wie der von KANAI und EDWARDS (1999) beschriebene Hauptweg (Decarboxylierung in den BSZ durch die PCK). Die beobachtete nicht-stomatäre Limitierung der Photosyntheserate unter Trockenstress wurde auf eine mögliche Abnahme der In-vitro-Aktivitäten des sogenannten Nebenweges zurückgeführt. Bei P. miliaceum, dem repräsentativen Vertreter des NAD-ME Subtyps, zeigte keines der C4-Enzyme eine Abnahme der In-vitro-Aktivität, noch konnte eine Abnahme des RubisCO Gehalts unter Trockenstress im Vergleich zur Kontrolle beobachtet werden. Diese Beobachtung deutete auf eine In-Situ-Inhibierung eines der C4-Enzyme hin. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit bei P. miliaceum weiterführende Untersuchungen zur posttranslationalen Regulation der PEPC durchgeführt. Obwohl die PEPC unter Trockenstress in phosphorylierter und somit aktiver Form vorliegt, konnte gezeigt werden, dass bei trockengestressten P. miliaceum eine In-Situ-Inhibition der PEPC aufgrund einer Feedback-Inhibition durch das unter Trockenstress in den MZ akkumulierende Transportmetabolit Aspartat wahrscheinlich ist und somit die Photosyntheserate limitieren kann.
In der vorliegenden Studie „Einflussfaktoren auf das klinische Outcome von thorakolumalen Frakturen wurden 87 Patienten mit einer operativ versorgten thorakolumbalen Wirbelkörperfraktur, die mindestens 18 Monate zurücklag, untersucht. Die Patienten wurden entweder rein dorsal mittels Fixateur interne oder kombiniert dorsoventral versorgt. Unter den kombiniert operierten Patienten befinden ich Patienten, deren Wirbelkörperfraktur entweder mit einem Knochenspan oder mit einem Knochenspan in Kombination mit einem ventralen winkelstabilen Plattensystem oder mittels Titancage behandelt wurden. Die Patienten wurden körperlich und radiologisch mittels CT untersucht sowie ihre Lebensqualität mit Hilfe vier international anerkannter Scores (SF-36, VASWirbelsäulenscore, Oswestry, LBOS) evaluiert. Ein weiterer Fragebogen analysierte die Spanmorbidität. Bei der Durchführung der körperlichen Untersuchung, die unter anderem die Messung des Finger-Boden-Abstands, das Schober-und Ott-Zeichen, das sensible und motorische Defizit sowie das Bewegungsausmaß der Patienten umfasste, erhielten wir ebenfalls keinen Unterschied unterhalb der Gruppen. Zur radiologischen Analyse kann man sagen, dass der Korrekturverlust im Laufe der Zeit zunimmt, so dass zum Zeitpunkt unserer Nachuntersuchung Kyphosewerte wie zum Zeitpunkt unmittelbar nach dem Trauma erreicht werden. Keine Operationsmethode konnte einen Korrekturverlust verhindern. Der Korrekturverlust lag bei den Gruppen zwischen 5,5 und 8,3°. Bei der Cage-Gruppe ohne Metallentfernung betrug die Sinterungsrate 60%, mit Metallentfernung 85%. Kaudales Einbrechen war häufiger zu beobachten. Bei den Patienten, bei denen ein Knochenspan verwendet wurde, konnte oft eine unzureichende Fusion des Implantats (Span-Gruppe: 44,4%, MACS-Gruppe: 33,3%) festgestellt werden. Alle vier Quality of Life-Scores zeigten keinen Vorteil für eine Operationsmethode. Die Spanentnahmemorbidität stellte ein häufiges Problem für die betroffenen Patienten an. Parästhesien bestanden bei 71%, deren Stärke im Durchschnitt mit 5,8 auf einer Analogskala von 0-10 beziffert wurde. Schmerzen an der Spanentnahmestelle gaben 75% der Patienten an. Die Stärke betrug durchschnittlich 5,8. 52% der Patienten beschreiben die Zusammenfassung Spanentnahmestelle als belastendste Operationsstelle zum Zeitpunkt der Nachuntersuchung.
Wir führten ebenfalls eine Analyse der Frakturart der Patienten durch. Die Patienten wurden je nach Magerl-Klassifikation in die Gruppen A1-2, A 3, B-C eingeteilt. es konnten keine Unterschiede zwischen den Gruppen bezüglich der Lebensqualität oder des Korrekturverlusts festgestellt werden. So kommen wir zu dem Schluss, dass weder die Schwere des Traumas noch die Operationsmethode alleine einen signifikanten Einfluss auf das spätere Outcome haben. Die klinische Indikationsstellung zur Operations des Verfahrens ist daher nicht auf diese einzelnen Faktoren zu reduzieren. Hier spielen zahlreiche weitere Faktoren eine schwer fassbare Rolle. Hinsichtlich der Lebensqualität, des radiologischen Outcomes und der körperlichen Untersuchung konnte keine Versorgungsstrategie favorisiert werden. Angesichts des Problems der mangelnden Fusion der Knochenspäne und der häufig auftretenden Spanmorbidität, halten wir es für sinnvoll in Zukunft auf die Verwendung von Knochenspänen zu verzichten. Man würde dann bei der Wahl des operativen Verfahrens zwischen einem rein dorsalen oder einem kombinierten Verfahren mittels Titancage entscheiden.
Diese retrospektive Aktenstudie hatte die Zielsetzung, diejenigen Mütter von
frühgeborenen Kindern mit einem Gestationsalter von 25 bis einschließlich 30 Wochen
zu identifizieren, die bezüglich der Muttermilchernährung und des Stillen, sowie der
Entwicklung des Trinkverhaltens besondere Unterstützung während des stationären
Aufenthalts benötigen.
Insgesamt werden in den Jahren 2003 bis 2005 an der Universitätskinderklinik 143
Kinder im Alter von 24 bis 30 Schwangerschaftswochen behandelt.
Auf 72 dieser Kinder trafen die Einschlusskriterien der Studie zu: Geburtsalter von 25
bis 30 Schwangerschaftswochen, ein Geburtsgewicht von größer 600g, keine
Fehlbildungen, sowie geboren in der Universitätsklinik Frankfurt am Main und gesund
nach Hause entlassen, keine mütterlichen oder kindlichen Kontraindikationen zum
Stillen, mütterliche Bereitschaft zum Stillen.
Bei diesen Kindern wurden nun anhand der Krankenakten verschiedene Charakteristika
notiert und analysiert.
Sie wurden zum einen bezüglich der Muttermilchernährung, sowie zum anderen
aufgrund der Entwicklung des Trinkverhaltens in Gruppen eingeteilt.
Anschliessend wurden die Gruppen miteinander verglichen und die signifikanten
Unterschiede herausgearbeitet.
Zunächst wurde ein Vergleich zwischen den Mutter-Kind-Paaren mit einer
erfolgreichen und denjenigen mit einer nicht-erfolgreichen Muttermilchernährung
durchgeführt.
Wir definierten die erfolgreiche oder nicht erfolgreiche Muttermilch-Ernährung über
den Anteil der Muttermilch an der Ernährung am Entlassungstag.
Bei den erfolgreichen Mutter-Kind-Paaren war dieser Anteil größer gleich 80% der
Nahrung, bei den nicht erfolgreichen kleiner gleich 20%.
Von den 72 auswertbaren Kindern konnten 43% (n=31) der erfolgreichen und 39%
(n=28) der nicht-erfolgreichen Gruppe zugeordnet werden. 18% (n=13) der Kinder
waren nicht-klassifizierbar, da ihr Muttermilchanteil am Entlassungstag zwischen 20%
und 80% lag.
Es zeigten sich insbesondere signifikante Unterschiede bei den mütterlichen
Charakteristika. Die erfolgreichen Mütter waren älter, kamen an mehr Tagen zu Besuch
und führten mehr Känguruhpflege durch. Bei der Herkunft der Mütter zeigte sich, dass
in der Gruppe der erfolgreichen Mutter-Kind-Paare weniger Mütter mit einem anderen
ethnischen Hintergrund waren, als in der nicht-erfolgreichen Gruppe. Bezüglich der
kindlichen Charakteristika konnte festgestellt werden, dass in der erfolgreichen Gruppe
weniger Kinder an einer nekrotisierenden Enterokolitis erkrankten, als in der nichterfolgreichen
Gruppe.
Die beiden Gruppen unterschieden sich nicht in den kindlichen Charakteristika
Gestationsalter, Geburtsgewicht und der initialen Erkrankungsschwere.
Bei der Entwicklung des Trinkverhaltens wurde die Gruppe der 72 Kinder bezogen auf
den Zeitpunkt „gesamte Nahrungsmenge getrunken“ unterteilt. Es wurden zwei
Gruppen gebildet: die erste beinhaltete die Kinder, die die gesamte Nahrungsmenge zu
einem frühen Zeitpunkt getrunken haben, mit einem Alter von weniger als 36 Wochen,
dies waren 22 Kinder (31%). Die zweite Gruppe enthielt die Kinder die diesen
Zeitpunkt später erreichten, in einem Alter größer 36 Wochen, diese Gruppe bestand aus
34 Kindern (47%). Die übrigen 16 Kinder (22%) erreichten diesen Zeitpunkt mit einem
Alter von genau 36 Wochen.
Hier wurden ebenfalls die kindlichen und mütterlichen Charakteristika beider Gruppen
miteinander verglichen und die signifikanten Unterschiede herausgearbeitet.
Es zeigte sich, dass die Erkrankungsschwere in der späten Gruppe deutlich höher war,
als in der frühen Gruppe. So verbrachten die Kinder die früh die gesamte
Nahrungsmenge getrunken haben, deutlich weniger Tage auf der Intensivstation,
wurden an weniger Tagen beatmet und hatten einen niedrigeren CRIB-Score. Zudem
erkrankte in der frühen Gruppe kein Kind an einer Bronchopulmonalen Dysplasie,
während dies in der späten Gruppe neun der Kinder betraf. Weitere Auffälligkeiten
zeigten sich bei den mütterlichen Merkmalen, die Mütter in der frühen Gruppe führten
an deutlich weniger Tagen die Känguruhpflege durch und wurden seltener per
Kaiserschnitt entbunden als die Mütter der späten Gruppe.
Bezüglich der Charakteristika Gestationsalter, Geschlechtsverteilung, Alter der Mutter,
Herkunft der Mutter, Erstschwangerschaft, Besuchstage, sowie erfolgreiche
Muttermilchernährung zeigte sich kein signifikanter Unterschied.
In dieser Studie zeigt sich also, dass sowohl die jüngeren als auch ausländischen Mütter
mehr Unterstützung bei der Durchführung einer erfolgreichen Muttermilchernährung
benötigen. Zudem wurde deutlich, dass es bei kranken Kindern schwieriger ist, diese
aufrechtzuerhalten als bei gesunden Kindern. Hier bedarf es ebenfalls einer besonderen
Unterstützung der Mütter durch das Fachpersonal auf der Station.
Die Känguruhpflege hat einen positiven Einfluss auf die Muttermilchernährung und die
Wichtigkeit dieser Pflege sollte den Eltern nochmals verdeutlicht werden. Zudem
sollten Eltern, die diese Methode bisher weniger durchgeführt haben, davon überzeugt
und bei der Durchführung verstärkt unterstützt werden.
Es ist außerdem wichtig den Müttern eine Möglichkeit zu geben ihre Sorgen und Ängste
insbesondere bezüglich des Stillens und der Känguruhpflege zu äußern, so dass diesen,
wenn möglich, entgegengewirkt werden kann.
Ein Ansatzpunkt wäre beispielsweise mehr Privatssphäre, gerade für die Mütter, die aus
Scham oder kulturell-religiösem Hintergrund in der Öffentlichkeit der Station die
Känguruhpflege oder das Stillen nicht durchführen. Dabei sollte jedoch nie die
Sicherheit der kleinen Patienten vernachlässigt werden.
Bei der Entwicklung des Trinkverhaltens spielen vor allem kindlichen Faktoren eine
Rolle welche durch das Personal kaum zu beeinflussen sind.
Daher besteht eine der wenigen Möglichkeiten darin, Mütter mit besonders kranken
Kindern, verstärkt bei den Trinkversuchen ihres Kindes anzuleiten, um den Übergang
von der Sondenernährung zum Trinken eventuell zu erleichtern.
Hier könnte den Müttern gezeigt werden, wie sie während des Känguruhens durch
Stimulationen ihres Kindes die Koordination von Atmen, Saugen und Schlucken
fördern und damit das Trinkverhalten verbessern.
Zudem werden Mütter, deren Kinder später trinken, häufig per Kaiserschnitt entbunden.
Auch hier gilt es, Überlegungen anzustellen, wie ein möglichst früher Kontakt
hergestellt werden kann.
Die Muttermilchernährung trägt zu einer gesunden Entwicklung der Kinder bei und
sollte das angestrebte Ziel sein. Deswegen sollte immer versucht werden sie im Rahmen
der Möglichkeiten zu fördern.
Chloridkanäle und -transporter sind an wichtigen physiologischen Prozessen beteiligt [Jentsch et al., 2002; Zifarelli & Pusch, 2007; Jentsch, 2008] und mutationsbedingte Funktionsdefekte können mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden [Planells-Cases & Jentsch, 2009]. Trotz der großen physiologischen Relevanz bilden diese Proteine eine unterrepräsentierte Klasse in der pharmakologischen Wirkstoffsuche [Verkman & Galietta, 2009], auch aufgrund fehlender adäquat robuster und Durchsatz-starker Testsysteme. Vor allem die Vertreter der intrazellulären CLC-Proteine, von denen bereits zwei eindeutig relevanten Krankheiten zugeordnet werden konnten (ClC-5 – Dent´sche Krankheit; ClC-7 – Osteopetrose), entziehen sich aufgrund ihrer vesikulären Lokalisation den klassischen elektrophysiologischen Methoden. Aus diesem Grund kam in dieser Arbeit die SSM-Technik [Schulz et al., 2008] zur Charakterisierung des lysosomalen Cl-/H+-Antiporters ClC-7 zum Einsatz. Bei geeigneter Membranpräparation können mit dieser Methode auch vesikuläre Transportprozesse elektrophysiologisch untersucht werden. Neben der grundlegenden biophysikalischen Untersuchung von ClC-7 war es mit Hilfe der SSM-Technik möglich, die Protonen-gekoppelte Antiportaktivität dieses vesikulären CLC-Vertreters nachzuweisen. Außerdem wurde ein robuster Assay etabliert, der auch die pharmakologische Untersuchung von ClC-7 erlaubt. Mit diesem konnte gezeigt werden, dass ClC-7 spezifisch durch die Chloridkanalblocker DIDS und NPPB mit relativ hoher Affinität (DIDS: IC50= 39 µM, NPPB: IC50= 156 µM) zu inhibieren ist. Da ClC-7 auch als potentielles Target in der Osteoporose-Therapie diskutiert wird [Schaller et al., 2005], bietet die SSM-Technik somit eine Plattform für pharmakologische Untersuchungen an diesem Transporter. Neben dem Wildtyp Protein wurde weiterhin die Funktionalität einer physiologisch wichtigen, der Osteopetrose zuzuordnenden Mutante (G215R), untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Mutante noch immer eine signifikante Transportaktivität besitzt, jedoch einen schweren Lokalisationsdefekt aufweist und nicht mehr korrekt in die Lysosomen transportiert wird. Durch Koexpression der funktionalen beta-Untereinheit Ostm1 [Lange et al., 2006] war es möglich, die lysosomale Lokalisation teilweise, jedoch nicht vollständig wiederherzustellen. Dieser Effekt könnte somit ein Grund für den relativ milden Krankheitsverlauf der mit dieser Mutation verbundenen autosomal dominanten Osteopetrose (ADOII, Alberts-Schönberg Krankheit) sein. Da die SSM-Technik bisher ausschließlich zur Untersuchung primär und sekundär aktiver Transporter zum Einsatz kam [Schulz et al., 2008; Ganea & Fendler, 2009], wurde weiterhin die Eignung der Methode zur Charakterisierung passiver Ionenkanäle anhand des ligandengesteuerten P2X2 Rezeptors überprüft. Ein Vergleich der gewonnenen elektrophysiologischen und pharmakologischen Daten lieferte gute Übereinstimmungen mit den Ergebnissen konventioneller elektrophysiologischer Untersuchungen. So konnte gezeigt werden, dass sich die SSM-Technik auch zur Charakterisierung von Ionenkanälen eignet. Da Ströme über Ionenkanäle bei den klassischen Methoden über eine extern angelegte Spannung gesteuert werden, solch eine Kontrolle bei der SSM-Technik jedoch nicht möglich ist, wurde schließlich in dieser Arbeit versucht, mit Hilfe der lichtgesteuerten Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) eine Spannungskontrolle zu etablieren. Anhand eines Fusions-basierten Modellsystems [Perozo & Hubbell, 1993] konnte gezeigt werden, dass lichtgesteuerte Ionenpumpen prinzipiell zur Kontrolle von Ionenkanälen an der SSM genutzt werden können. Allerdings eignet sich bR aufgrund seiner geringen Plasmamembranexpression in CHO Zellen nicht zur direkten Koexpression und Steuerung von Vertebraten-Proteinen. Der Einsatz eukaryotischer Ionenpumpen, kombiniert mit Anionendiffusionspotentialen [Perozo & Hubbell, 1993], könnte sich allerdings als erfolgsversprechend erweisen und die SSM-Technik auch für die Charakterisierung von stark spannungsabhängigen Ionenkanälen öffnen.
Im ersten Teil der Arbeit wurde eine genetische Disposition für Vorhofflimmern (VHF) untersucht. Der Einzelnukleotidpolymorphismus ("single nucleotide polymorphism", SNP) 38G/S befindet sich im N-Terminus der ß-Untereinheit KCNE1. Diese ß-Untereinheit konstituiert gemeinsam mit der alpha-Untereinheit KCNQ1 die langsame Komponente des verzögerten Gleichrichterstromes, IKs. Die ß-Untereinheit hat hierbei eine modulierende Funktion. Frühere Studien beschäftigten sich hauptsächlich mit der transmembranären Domäne und dem C-Terminus. Über die Rolle des N-Terminus war bislang wenig bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Aufgabe des N-Terminus bei der Modulation der alpha-Untereinheit zu identifizieren. Außerdem sollte festgestellt werden, welche Aminosäuren hierbei besonders von Bedeutung sind. Zu diesem Zweck wurden diverse Konstrukte synthetisiert. Für das Konstrukt delta1-38’ wurden die Aminosäuren 1-38 und damit der Großteil des N-Terminus entfernt. Das Konstrukt "linker" enthält anstelle des Glyzins oder Serins an Position 38 fünf Alanine. In der Nähe der von dem SNP betroffenen Aminosäure befinden sich des Weiteren drei Arginine, die mit jeweils einem Alanin substituiert wurden. Für alle Versuche diente die nicht VHF-assoziierte Variante des SNPs als Kontrolle. Alle Konstrukte konnten erfolgreich heterolog exprimiert werden und gleichermaßen mit der alpha-Untereinheit immunopräzipitiert werden. Die aus der Co-Transfektion von KCNQ1 und KCNE1 resultierende Stromdichte wurde mittels "Patch-clamp"-Technik untersucht. Im Vergleich zum Kontrollstrom (KCNQ1 + KCNE1-38S) waren die Ströme aller anderen Gruppen während De- und Repolarisation signifikant kleiner. Zellfraktionierung und konfokale Mikroskopie zeigten, dass im Vergleich zur Kontrolle alle anderen Konstrukte eine verminderte Plasmamembranlokalisation aufwiesen. Die Aufgabe des N-Terminus liegt offensichtlich im Transport beider Untereinheiten an die Plasmamembran und/oder der Verankerung dort. Sowohl die Aminosäure in Position 38 als auch die drei N-terminalen Arginine in der Nähe scheinen für den hier gesuchten Mechanismus von Bedeutung zu sein. Zukünftige Experimente könnten beispielsweise 3D-Simulationen der Proteinfaltung beinhalten, um die potentielle Membranverankerung weiter zu untersuchen. Der zweite Teil der Arbeit untersuchte erworbene elektrophysiologische Veränderungen im Rahmen von VHF am Beispiel der einwärts gleichrichtenden Kaliumströme IK1 und IKACh. Es sollten die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen für die Heraufregulierung von IK1 und IKACh bei VHF untersucht werden. Alle Experimente wurden an humanem Gewebe des linken Vorhofs durchgeführt. Das Gewebe stammt von VHF-Patienten, die sich einer Mitralklappen-Operation unterzogen. Als Kontrolle wurde Gewebe von Patienten im Sinusrhythmus (SR) verwendet. Zunächst wurde untersucht, ob transkriptionelle und/oder posttranskriptionelle Veränderungen oder funktionelle Effekte der Heraufregulierung der Ströme zugrunde liegen. Entsprechend wurde die Proteinexpression mittels Western Blot quantifiziert. Die Quantifizierung der mRNA erfolgte per Realtime-PCR. Veränderungen für IK1 konnten sowohl auf mRNA- als auch auf translationaler Ebene beobachtet werden. Protein- und mRNA-Expression von Kir2.1, der zugrunde liegenden Proteinuntereinheit, waren bei VHF signifikant erhöht; die Expression der inhibitorischen miR-1 war reduziert. Die Bestimmung der Protein- und mRNA-Expression der zugrunde liegenden Proteinuntereinheiten für den Strom IKACh zeigte dagegen keinen Unterschied zwischen Gewebe von Patienten mit VHF und SR. Eine funktionelle Regulierung schien daher möglich. Die Expression der IKACh modulierenden Proteine Calmodulin und G alpha i-3 unter VHF zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied zu der SR-Gruppe. Es war eine Tendenz zur Reduktion des inhibierenden G alpha i-3 zu beobachten. Die Regulierung von IKACh,c bei VHF bleibt in zukünftigen Arbeiten zu untersuchen. Ein möglicher Versuch wäre, therapeutisch in die Regulation der Kir-Untereinheiten einzugreifen, um das VHF-unterstützende, elektrische "Remodeling" des IK1 zu verhindern.
Lichtgesteuerte Channelrhodopsine (ChR) haben im letzten Jahrzehnt neue Wege zur Untersuchung neurophysiologischer Zusammenhänge eröffnet. Die ersten grundlegenden Charakterisierungen von Channelrhodpsin-1 und Channelrhodopsin-2 (ChR-1 und ChR-2) zeigten bereits die hohe Selektivität dieser Ionenkanäle für Protonen gegenüber monovalenten und divalenten Kationen und veranschaulichten die Dominanz der einwärtsgerichteten gegenüber den auswärtsgerichteten Kationenströmen durch die Kanalpore (Einwärtsgleichrichtung) (Nagel et al., 2002; Nagel et al., 2003). Nach Expression von Channelrhodopsin können erregbare Zellen mit einem Ruhepotential von -60 mV durch Licht depolarisiert und Aktionspotentiale (AP’s) ausgelöst werden (Boyden et al., 2005; Li et al., 2005; Nagel et al., 2005b). Aufgrund der Einwärtsgleichrichtung von ChR nehmen die lichtaktivierten Ströme mit zunehmender Depolarisation ab, sodass die vollständige Ausbildung des AP’s nicht gestört wird. Dadurch wird ChR zu einem optimalen optogenetischen Werkzeug. Dennoch ist die Einwärtsgleichrichtung bisher wenig detailliert charakterisiert. Auch die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht genau bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte anhand von Patch-Clamp Messungen gezeigt werden, dass zwei Mechanismen die Rektifizierung des Kanalstroms durch ChR-2 hervorrufen: eine Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit und eine Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit. Die Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit ist von der Art der geleiteten Ionen abhängig und konnte experimentell über die Unterschiede der stationären IV-Kurve für H+ und Na+ bei symmetrischen Ionenkonzentrationen bewiesen werden. Des Weiteren wurden die Resultate für unterschiedliche Ionenbedingungen anhand eines Ionenbindungsmodells mit einem „3-Barrieren 2-Bindungsstellen“ Profil für die Kanalpore simuliert. Die Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit ist an eine Lichtadaption des ChR-2 Proteins gekoppelt. Diese Lichtadaption konnte mithilfe von repetitiven Messungen, d.h. Strommessungen mit mehrfachen kurzen Lichtblitzen (10 ns), gezeigt werden. Da die Lichtadaption wie auch die Kanalkinetik stark vom pH abhängig sind, ist anzunehmen, dass mechanistisch wichtige De- und Reprotonierungsreaktionen mit diesen Prozessen einhergehen. Ferner konnte über die Untersuchung der elektrophysiologischen Eigenschaften der ChR-2 Mutante E90A eine Region im Protein identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich am Protonentransport durch die Kanalpore beteiligt ist. Die Mutante E90A wies eine verringerte Protonenleitfähigkeit und eine natriumabhängige Blockierung der lichtaktivierten Ströme bei niedrigem extrazellulären pH auf. Doppelbelichtungsexperimente mit gelbem oder kurzwelligem blauen Licht ergaben außerdem neue Hinweise auf die Identität einiger Intermediate des Photozyklus. Die vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die bisher beschriebene „lichtadaptierte“ Form, die als P480 Intermediat bezeichnet wird, eher einem P520 Intermediat entspricht. Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit eine funktionelle Beteiligung des Intermediats P390, in dem die Schiff Base deprotoniert ist, am Photostrom von ChR-2 im Wildtyp-Protein gezeigt werden. Diese Beteiligung ist bisher nur für ChR-2 Mutanten bekannt (Bamann et al., 2010). Neben der Untersuchung der Kanaleigenschaften von ChR-2 wurde in dieser Arbeit auch der Frage nachgegangen, ob an den Photozyklus von ChR-2 eine vektorielle Protonenverschiebung über der Membran gekoppelt ist. Mithilfe der BLM-Technik und Patch-Clamp Messungen an elektrofusionierten HEK-293 Zellen (Zimmermann et al., 2006) konnte gezeigt werden, dass auch ohne elektrochemische Triebkraft lichtaktivierte Ströme (Pumpströme) zu beobachten sind, die einer vektoriellen Protonenverschiebung von 0,2 - 0,4 Ladungen pro Photozyklus entsprechen. Die Doppelbelichtungsexperimente und der vektorielle Protonentransport geben einen Einblick in den Zusammenhang zwischen Photozyklus und den funktionalen Zuständen des Kanals. Die Ergebnisse zeigen das komplexe Geflecht zwischen Spannungsabhängigkeit, der Kinetik und den offenen Zuständen und wurden in einem Modell zusammengefasst. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine stabile Zelllinie für die Expression von ChR-1 etabliert, die eine genauere Charakterisierung dieses Proteins möglich macht. Es konnte gezeigt werden, dass ChR-1 ebenso wie ChR-2 eine Kationenleitfähigkeit besitzt. Aus zeitaufgelösten Messungen wurde außerdem ermittelt, dass ChR-1 gegenüber ChR-2 eine verkürzte Zykluszeit besitzt. Die verkürzte Zykluszeit von ChR-1, die zu kleineren Gesamtstromamplituden im Vergleich zu ChR-2 führt und die vergleichsweise geringere Expression, v.a. in transienten Expressionssystemen, limitiert dessen neurophysiologische Anwendung. Zusammenfassend stellt die vorliegende Dissertation eine detaillierte biophysikalische Charakterisierung von Channelrhodopsinen dar, die neue Erkenntnisse über die mechanistische Kopplung der Kanalfunktion an den Photozyklus hervorbringt. Zudem kann sie eine Grundlage für die gezielte Suche nach Channelrhodopsin Mutanten bieten, deren Kinetik oder analeigenschaften für die neurophysiologische Anwendung optimiert sind.
Eine effektive Zusammenarbeit in interdisziplinären Projektteams ist nur möglich, wenn die involvierten Personen miteinander kommunizieren und zudem ein intersubjektives, d. h. ein gemeinsames und einheitliches, Verständnis der Anforderungen, Aufgaben, Arbeitsschritte und der zur Verfügung stehenden Ressourcen besitzen. Der Aufbau eines intersubjektiven Verständnisses kann nur durch Sprache gelingen, indem zwei oder mehrere Personen mit den von ihnen verwendeten sprachlichen Zeichen die gleichen Gegenstände der Realwelt assoziieren und im umgekehrten Fall den Gegenständen die gleichen Zeichen zuordnen. Ist das intersubjektive Verständnis dieser Personen hergestellt, verwenden sie eine gemeinsame Sprache (im engeren Sinne) und bilden eine sogenannte Sprachgemeinschaft. Diese Arbeit widmet sich dem Konzept der Sprachgemeinschaft. Nach der theoretischen Fundierung wird im Rahmen einer explorativen Fallstudie untersucht, wie sich sprachliche Gemeinsamkeiten und Unterschiede auf den Erfolg eines IS-Projekts auswirken können. Die Erkenntnisse dieser Studie motivieren das Ziel dieser Arbeit, Sprachgemeinschaften empirisch nachzuweisen. Der Nachweis gelingt mit Hilfe von zwei sprachwissenschaftlichen Experimenten und dem Einsatz der Latent Semantischen Analyse, mit der sich die semantische Ähnlichkeit von Textdokumenten auf Basis von Worthäufigkeiten bestimmen lässt. Die beiden Experimente werden ferner dazu benutzt, Sprachgemeinschaften einer Effizienzanalyse zu unterziehen. Hierbei wird untersucht, ob die Mitglieder im Vergleich zu Nichtmitgliedern einer Sprachgemeinschaft mit einem geringeren sprachlichen Aufwand kommunizieren.
Entnahmestrategien subgingivaler Plaqueproben für mikrobiologische Gensonden-Tests: 4 oder 6 Proben?
(2010)
Für die systemische Antibiotikagabe in der Therapie spezieller Parodontitisformen ist nicht die subgingivale Flora einzelner Taschen, sondern ein repräsentatives Bild der subgingivalen Flora des jeweiligen Patienten relevant. Aus Kostengründen werden Proben aus mehreren Taschen zusammengefasst und als sogenannte „gepoolte“ Probe ausgewertet (Flemmig et al. 1998, Beikler et al. 2005). Die gepoolte Auswertungsstrategie bietet für den Nachweis von A. actinomycetemcomitans, T. forsythia, P. gingivalis und T. denticola eine zumindest gleichwertige Nachweissicherheit wie Einzelauswertungen der Proben (Schacher et al. 2007). Die Probenentnahme aus der tiefsten Tasche eines jeden Quadranten (MT4) erwies sich als relativ verlässliche Methode, um Parodontalpathogene - bei Patienten die bisher keine Parodontitistherapie hatten -, nachzuweisen (Mombelli et al. 1991, 1994, Haffajee & Socransky 1992). Neuere Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass die Entnahme von subgingivalen Plaqueproben an den 6 tiefsten Stellen (MT6), die höchste Prävalenz ergeben (Beikler et al. 2006). Allerdings erhöht die Entnahme von 6 statt 4 Proben den Aufwand. Bislang gab es nur Studien, die einen Vergleich zwischen 4 und 6 Stellen nur anhand von PCR-basierter Analyse, untersuchten (Himmer et al. 2009). Ziel dieser Studie war der Vergleich von Zahl und Nachweishäufigkeit von Parodontalpathogenen, bei Patienten mit aggressiver (AgP) oder generalisierter schwerer chronischer Parodontitis (ChP), mittels gepoolten subgingivalen Plaqueproben aus den tiefsten Taschen pro Quadrant und pro Sextant, mithilfe eines 16S rRNA-Gensonden-Tests. Insgesamt wurden bei 50 Patienten (30 weiblich) mit einer unbehandelten aggressiven (n=16) oder generalisierten schweren chronischen Parodontitis (n= 34) klinische Befunde erhoben und vor antiinfektiöser Therapie von jeweils den tiefsten Taschen jedes Quadranten (MT4) bzw. jedes Sextanten (MT6) subgingivale Plaqueproben für mikrobiologische Analysen gewonnen. Dazu wurden an 4 Stellen jeweils 2 sterile Papierspitzen gleichzeitig in den parodontalen Taschen platziert. Jeweils 1 Papierspitze aus jeder Tasche wurde mit den 3 Proben aus den anderen Taschen gepoolt (MT4). Die jeweils verbleibenden 4 Papierspitzen wurden mit 2 weiteren Papierspitzen aus den tiefsten Taschen der 2 verbliebenen Sextanten gepoolt (MT6). MT4 und MT6 wurden zum Nachweis von Aggregatibacter actinomycetemcomitans (AA), Porphyromonas gingivalis (PG), Tannerella forsythia (TF) und Treponema denticola (TD) mit einem 16S rRNS-Gensonden-Test verschickt. Für die statistische Analyse wurden die Bakterienzahlen logtransformiert. Mit MT6 wurde A. actinomycetemcomitans statistisch signifikant häufiger (46%) und in höheren Mengen (2,53±2,79) nachgewiesen als mit MT4 (32%/1,67±2,48) (P=0,035/P=0,002). Die Nachweishäufigkeiten und Durchschnittszahlen für PG, TF und TD waren generell hoch (>95%/>6,0), d.h. sie wurden insgesamt häufiger und in höheren Zahlen nachgewiesen als AA. Somit ergaben sich für die Keime PG, TF und TD keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen MT4 und MT6 hinsichtlich der Nachweishäufigkeit. Nur TF wird durch die Entnahmestrategie MT6 in statistisch signifikant höheren Zahlen nachgewiesen als mit MT4. Innerhalb der Grenzen der vorliegenden Studie können folgende Schlüsse gezogen werden: 1) Beim Gebrauch eines 16S rRNS Gensonden-Tests, ist die Nachweishäufigkeit und Zahl von A. actinomycetemcomitans bei der Entnahmestrategie MT6 gegenüber MT4 erhöht. Die Probenentnahme der tiefsten Tasche je Sextant (MT6) erscheint günstiger als die je Quadrant (MT4). 2) Die Nachweishäufigkeiten von P. gingivalis, T. forsythia und T. denticola lagen bei allen Patienten, die in dieser Studie untersucht wurden, bei mehr als 95%. Auch wurden diese Keime in höheren Mengen nachgewiesen, d.h. die logarithmierten Bakterienzahlen lagen bei 6.0. Diese Studie wurde von der Firma IAI Pado, Zuchwil, Schweiz unterstützt.
In den vergangenen Jahren wurden zahlreiche Stoffe als Photosensibilisatoren evaluiert, deren photodynamische Aktivität gegenüber den Pioniersubstanzen deutlich verbessert werden konnte. Vielen dieser Moleküle blieb jedoch aufgrund ihrer ungünstigen physikochemischen Eigenschaften oder der auftretenden Toxizität die Marktreife versagt. Nanopartikuläre Trägersysteme sind geeignet, Verträglichkeit und Effektivität der Photodynamischen Therapie zu verbessern sowie die Selektivität bei der Behandlung bestimmter Tumorspezies deutlich zu erhöhen. Um dieses Prinzip auf verschiedene Photosensibilisatoren anwenden zu können, wurden in der vorliegenden Arbeit Nanopartikel aus humanem Serumalbumin (HSA) durch Desolvatation hergestellt und die adsorptive, die inkorporative sowie die kovalente Bindung an das Trägersystem untersucht. ...
Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen des Forschungsprojekts „Integrierte Analyse von mobilen, organischen Fremdstoffen in Fließgewässern“ (INTAFERE) am Institut für Physische Geographie an der Goethe-Universität Frankfurt erstellt. In INTAFERE wurde das Gefährdungspotenzial von mobilen, organischen Fremdstoffen (MOF) für aquatische Ökosysteme und die natürlichen Wasserressourcen in integrierter und partizipativer Art und Weise untersucht. MOF sind chemische Substanzen, die in Alltagsprodukten enthalten sind und durch unterschiedliche Eintragsfade in unbekannten Mengen in Oberflächengewässer eingetragen werden. Problematisch sind aus Umweltgesichtspunkten ihre Eigenschaften: sie besitzen im Wasser eine hohe Mobilität und sind schwer abbaubar. Dies führt zu einer Persistenz über lange Zeiträume. Für einige dieser Substanzen wurde zudem gezeigt, dass sie in sehr geringen Konzentrationen biologisch aktiv sind und für aquatische Ökosysteme eine Gefahr darstellen. In INTAFERE wurden drei zentrale Ziele verfolgt: Charakterisierung des Problemfeldes MOF, Erzeugung von praxisrelevantem Wissen für das Management von MOF und Entwicklung einer Softwareanwendung, die gesellschaftliche Aushandlungsprozesse durch eine transparente Darstellung der Wirkungszusammenhänge im Problemfeld unterstützt. Um einen Beitrag für die Erfüllung der Ziele zu leisten, war es die Aufgabe der Verfasserin, eine Akteursanalyse und -modellierung durchzuführen sowie Zukunftsszenarien im Bereich der MOF zu entwickeln. Dafür existierte keine adäquate Methodik, daher verfolgt die Dissertation zum einen die Entwicklung einer Methodik und zum anderen deren Anwendung im Kontext des Projektes INTAFERE. Da im Forschungsprozess die Durchführung von Analysen, die wissenschaftliche und gesellschaftliche Sichtweise der Problematik sowie die Erarbeitung von praktischen Lösungen im Mittelpunkt standen, wurde eine transdisziplinäre Herangehensweise gewählt. Ziel war es, eine Methodik zu entwerfen, die sowohl eine Entwicklung von Szenarien als auch eine Modellierung von Handlungsentscheidungen umfasst. Eine Modellierung und Visualisierung von Handlungsentscheidungen ist notwendig, um Strategien für ein Umweltproblem für verschiedene Szenarien zu ermitteln, und damit einen Lernprozess der Stakeholder zu initiieren. Dies wurde mit der transdisziplinären Methode „Akteursbasierte Modellierung“ umgesetzt. Hierbei wurden insbesondere Aspekte der Problemwahrnehmung von Akteuren und deren Darstellung, der partizipativen Szenarienentwicklung sowie der semi-quantitativen Modellierung von Handlungsentscheidungen berücksichtigt. Die Verfasserin hat mit der semi-quantitativen akteursbasierten Modellierung eine Methode erarbeitet und getestet, die bisher unverbundene Komponenten (wie die Software Dynamic Actor Network Analysis (DANA) und die Szenarienentwicklung) zusammenführt. Um Handlungsentscheidungen unter verschiedenen Szenarien zu modellieren hat die Autorin eine sequentielle Modellierung entwickelt, die mit der Software DANA durchgeführt werden kann. Die dafür notwendige Weiterentwicklung von DANA wurde von Dr. Pieter Bots (TU Delft) umgesetzt. Die akteursbasierte Modellierung läuft in drei methodischen Schritten ab: 1. Modellierung von Akteurs-Sichtweisen in Form von Wahrnehmungsgraphen und deren Analyse, aufbauend auf Ergebnissen von qualitativen, leitfaden-gestützten Expertengesprächen (= Akteursmodellierung), 2. partizipative Szenarienentwicklung mit den Akteuren und 3. Zusammenführung der Ergebnisse der Akteursmodellierung und der Szenarienentwicklung und darauf aufbauend eine sequentielle Modellierung von Handlungsentscheidungen und deren Auswirkungen auf Schlüsselfaktoren. Im Zuge der Anwendung auf das Problemfeld der MOF wurde für folgende Akteure jeweils ein Wahrnehmungsgraph modelliert: Obere Wasserbehörde, Umweltbundesamt, Umwelt- und Verbraucherschutzorganisationen, Wasserversorger sowie für die Hersteller von verschiedenen MOF, weiterhin für die European Flame Retardants Association und die Weiterverarbeitende Industrie. Das Ergebnis der Szenarienentwicklung waren vier Szenarien: ein Gesundheitsszenario, unter der Annahme von hohen lokalen Umweltstandards durch nachhaltigkeitsorientierte KonsumentInnen, ein Umweltszenario, in dem eine starke Regulierung und nachhaltigkeitsorientierter Konsum Hand in Hand gehen, ein Globalisierungsszenario, in dem Wirtschaftsmacht und preisbewusste KonsumentInnen statt staatliche Regulierung vorherrschen und ein Technikszenario, unter der Annahme, dass Kläranlagen, bedingt durch eine starke Regulierung, aufgerüstet werden. Bei der Modellierung von Handlungsentscheidungen wurden die Wahrnehmungsgraphen und die vier Szenarien miteinander verknüpft. Pro Substanz wurde ein Modell entwickelt, welches die wichtigsten Systemkomponenten in einer angemessenen Komplexität umfasst und die von den Akteuren gemeinsam getragene Einschätzung der Wirkungsbeziehungen darstellt. Insgesamt wurden 16 Modelle entwickelt. Basierend auf den simulierten Akteurshandlungen wurden relativen Veränderungen der Schlüsselfaktoren Produktion, Import und Leistungsfähigkeit der Kläranlagen für die vier genannten Szenarien berechnet. In Zusammenarbeit mit Pieter Bots konnten algorithmische Beiträge zur Analyse- und Modellierungssoftware DANA getestet und verbessert werden. Da keine vollständige und zugleich leicht verständliche Einführung zu DANA vorlag, wurde für Nutzer im Rahmen dieser Dissertation eine Anleitung verfasst, die die Modellierung von Wahrnehmungsgraphen und deren Analyse sowie alle Schritte der akteursbasierten Modellierung mit DANA erläutert.
In dieser Arbeit wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem die Entfaltung von Proteinen simuliert werden kann. Anhand der Simulation kann die Schmelztemperatur bestimmt und damit die Thermostabilität einer Struktur untersucht werden. Außerdem ist die Untersuchung struktureller Veränderungen möglich, die während der Entfaltung auftreten und letztendlich zum globalen Zerfall der Struktur führen. Die Bereiche, von denen der globale Zerfall der Struktur ausgeht, können bestimmt werden. Es wurde untersucht, inwieweit diese Entfaltungsregionen Strukturbereiche darstellen, deren Mutation die thermische Stabilität der Struktur beeinflusst. Das entwickelte Verfahren basiert auf der Anwendung von Methoden aus der Rigiditätstheorie. Die thermische Entfaltung der Strukturen wird über das sukzessive Aufbrechen nichtkovalenter Wechselwirkungen in den Netzwerken simuliert. An-sätze aus der Perkolations- und Netzwerktheorie werden verwendet, um die Rigidität und Flexibilität in den Netzwerken während der Entfaltung zu untersuchen. Diese unter dem Begriff der Analyse statischer Netzwerke (constraint network analysis, CNA) zusammengefassten Methoden wurden im ersten Teil dieser Arbeit auf einen Datensatz homologer meso- und thermophiler Proteine angewendet. Dabei wurde untersucht, ob die thermophile Anpassung tatsächlich über eine Rigidisierung der Struktur erfolgt. Außerdem wurde die Theorie der korrespondierenden Zustände getestet, die besagt, dass bei der thermophilen Anpassung trotz globaler Rigidisierung für die Bioaktivität wichtige flexible Bereiche konserviert sind. Mit Hilfe der CNA wurden Entfaltungsregionen der Proteine aus dem Datensatz bestimmt und mit Strukturbereichen verglichen, in die thermostabilisierende Mutationen eingeführt wurden. Außerdem wurde untersucht, inwieweit vorhergesagt werden kann, ob eine möglicherweise thermostabilisierende Mutation die Aktivität negativ beeinflusst. Für zwei Drittel der thermophilen Proteine aus dem Datensatz konnte eine höhere Thermostabilität vorhergesagt werden als für das entsprechende mesophile Protein. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die thermophile Anpassung dieser Proteine tatsächlich über eine Rigidisierung der Struktur erfolgt. Offensichtlich werden bei der Anwendung der CNA implizit alle möglichen Mechanismen der thermophilen Anpassung berücksichtigt. Die für zwei Paare meso- und thermophiler Proteine vorhergesagten Entfaltungsregionen stimmten sehr gut mit Bereichen überein, in die thermostabilisierende Mutationen eingeführt wurden. Damit wurde gezeigt, dass die CNA hilfreich zur Unterstützung des Protein Engineering ist, da die thermische Stabilität einer Struktur abgeschätzt werden kann, andererseits Hinweise darauf gegeben werden, in welchen Bereichen der Struktur thermostabilisierende Mutationen eingeführt werden können. Anhand des Vergleichs mikroskopischer Stabilitäten homologer Proteine konnte gezeigt werden, dass die CNA ein Abschätzen des Effekts einer thermostabilisierenden Mutation auf die Aktivität erlaubt, was wiederum für den Einsatz der CNA zur Unterstützung des Protein Engineering spricht. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die CNA auf eine Serie von Phytasen unterschiedlicher Thermostabilitäten angewendet. Da es sich bei den Phytase-Strukturen um Homologie-modelle handelte, die nicht direkt mit der Analyse statischer Netzwerke untersucht werden konnten, wurde eine ensemblebasierte CNA etabliert. Dazu wurden kurze MD-Simulationen zur Verbesserung der homologiemodellierten Strukturen durchgeführt, aus denen dann ein konformationelles Strukturensemble extrahiert wurde. Aus den konformationellen Ensembles werden Thermostabilitäten vorhergesagt. Bei der Vorhersage der Thermostabilitäten ergab sich eine bemerkenswert gute Übereinstimmung mit experimentell bestimmten relativen Halbwertszeittemperaturen. Bereiche mit hoher Entfaltungsregionwahrscheinlichkeit stimmen gut mit Regionen überein, in denen thermostabilisierende Mutationen experimentell eingeführt wurden. Diese Ergebnisse offenbaren, dass mit der Entwicklung der ensemblebasierten CNA die methodischen Grundlagen für den Einsatz des Verfahrens zur Unterstützung des Protein Engineering von Phytasen geschaffen wurden.
Bei der GSI – Helmholtzzentrum für Schwerionenforschung in Darmstadt wird im Rahmen des HITRAP-Projekts ein linearer Abbremser für schwere, hochgeladene Ionen für atomphysikalische Präzisionsexperimente in Betrieb genommen. Während der Inbetriebnahme wurden transversale Emittanzmessungen mit der Pepperpot- und der Multi-Gradienten-Methode durchgeführt, um die Emittanz des aus dem Experimentierspeicherring (ESR) extrahierten Strahls zu messen. Weiterhin wurde auch die Phasenraumverteilung des auf eine Zwischenenergie von 500keV/u abgebremsten Strahls hinter der IH-Struktur gemessen. Dazu wurden neue Auswertealgorithmen in die Analyse der digitalen Bilder integriert. Die longitudinalen Bunchstrukturmessungen des Strahls am Eintrittspunkt in den Abbremser und die Funktionsweise des Doppel-Drift Bunchers wird gezeigt. Die Konzeption und der Aufbau sowie die erste Inbetriebnahme einer neuartigen Einzelschuss-Pepperpot-Emittanzmessanlage für kleinste Strahlströme und -energien wird beschrieben, die es ermöglichen, den Strahl hinter den Abbremskavitäten zu vermessen. Zusätzlich wurden transversale Strahldynamikrechnungen durchgeführt, welche theoretische Grundlagen zur Inbetriebnahme von HITRAP lieferten. Es wird beschrieben, wie die gesamte Strahllinie vom ESR bis zum Radio-Frequenz Quadrupol nach der erfolgreichen Integration einer Abbremsroutine innerhalb des Softwarepakets COSY Infinity optimiert werden kann.
Mitte des 19. Jahrhunderts demonstrierte John Snow anhand differenzierter Beobachtungen zur Cholera in London, wie epidemiologisches Wissen und gezielte Maßnahmen zur Bewältigung öffentlicher Gesundheitsprobleme beitragen können. Rund 150 Jahre später sieht sich die Bevölkerung einem stetig wachsenden globalen Güter- und Personenverkehr gegenüber, welcher auch Krankheitserregern eine interkontinentale Ausbreitung innerhalb weniger Stunden ermöglicht, wie eindrucksvoll am Beispiel SARS im Jahre 2003 deutlich wurde. Nationale Beispiele, allen voran die Salmonellen-Epidemie in Fulda im Jahre 2007, zeigen, welche bedeutungsvolle Rolle die Infektionsepidemiologie und die -hygiene auch im 21. Jahrhundert einnimmt. Das frühzeitige Erkennen und ein effizientes Eingreifen durch die Öffentlichen Gesundheitsbehörden sind zur Eindämmung einer Epidemie unabdingbar. Die Verknüpfung medizinischer und geographischer Daten kann Beides wesentlich beschleunigen und ermöglicht die frühzeitige Erkennung eskalierender Infektionsherde. Ziel der vorliegenden Pilotstudie ist die Entwicklung einer Schnittstelle zur Implementierung und Analyse meldepflichtiger Infektionskrankheiten in einem geomedizinischen Informationssystem. Erstmals im Öffentlichen Gesundheitsdienst wird diese Verknüpfung technisch mittels eines Geoinformationssystems realisiert, welches die Georeferenzierung mithilfe von Regionalidentifikationsnummern und der anschließende Visualisierung der im Gesundheitsamt anfallenden krankheitsbezogenen Daten ermöglicht. Der Datentransfer von dem im Amt für Gesundheit genutzten Datenbankprogramm Gumax® zu dem im Vermessungsamt der Stadt Frankfurt am Main probaten Geoinformationssystem Office-GIS gelingt über einen SQL-Server, einem Datenbankmanagementsystem, welches das Speichern, Bearbeiten und Analysieren vergleichsweise großer Datenmengen ermöglicht. Anschließend können Meldeort und Wohnort des an einer nach §§ 6, 7 IfSG meldepflichtigen Infektionserkrankung Erkrankten in der Stadtplan-, Liegenschaftskarte oder Luftbildaufnahme visualisiert werden. Hierüber lassen sich zudem personen- und objektbezogene Krankheitsquellen (z. B. Restaurant, Schule, Kindergarten, Krankenhaus) eruieren. Diese Daten können effizient genutzt werden, um schnell und dezidiert in ein Krankheitsgeschehen eindämmend eingreifen zu können. Mit diesem System könnten auch bioterroristische Anschläge wesentlich schneller erkannt werden, da die Ausbreitungsmodalitäten beispielsweise vom verwendeten Agens, meteorologischen, tageszeitlichen und demographischen Gegebenheiten abhängen. Diesen zusätzlichen Größen soll in erweiterten technischen Realisationen dieses Systems Rechnung getragen werden.
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Synthese von spaltbaren Linkern. Dabei wurden zwei unterschiedliche Themengebiete bearbeitet: 1) Entwicklung eines enzymatisch spaltbaren Safety-Catch-Linkers, der eine flexible Modifizierung ermöglicht für den potentiellen Einsatz zur zielgerichteten Zellaufnahme von (Antisense-)Oligonukleotiden. 2) Entwicklung eines Fluorid-spaltbaren Linkers für die reversible Fluo¬reszenz¬markie¬rung von Triphosphaten zum Einsatz in einer neuen Methode der DNA-Sequenzierung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuer, variabler enzymatisch spaltbarer Safety-Catch-Linker entwickelt und es wurden drei Derivate synthetisiert. Die drei neuen Safety-Catch-Linker sind über Amid- bzw. Esterbindungen an die 5' Position von 2' Desoxythymidin angebunden und sind Substrate für zwei unterschiedliche Enzyme. Zwei der synthetisierten Derivate des Linkers sind Substrate der Penicillin G Acylase und eins ist ein Substrat für die Pyroglutamyl Aminopeptidase I. Sie wurden hinsichtlich ihrer Spaltungs- und Stabilitätseigenschaften intensiv untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Ester-verknüpften Linker für eine Anwendung unter physiologischen Bedingungen geeignet sind. Es wurden kinetische Spaltungsexperimente durchgeführt und dabei eine sehr effektive enzymatische Spaltung durch das entsprechende Enzym beobachtet. Es wurde außerdem der Mechanismus einer, bei höheren pH-Werten beobachteten, nicht-enzymatischen Spaltung aufgeklärt. Darüber hinaus konnte das sehr basenlabile, mit Pyroglutamyl Aminopeptidase I spaltbare Derivat unter Anwendung einer aminoschutzgruppenfreien Oligonukleotidsynthesemethode erfolgreich in ein Antisense-Oligonukleotid eingebaut werden. Für das EU-Projekt „ArraySBS“ wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neuer, hoch effizient mit Fluoridionen spaltbarer Linker für die reversible Anbindung eines Fluoreszenzfarbstoffs an die Baseneinheit eines Nukleotids entwickelt. Die spaltbare Einheit des Linkers basiert auf dem Strukturmotiv der 2-Cyanoethylgruppe, als Spacer zwischen dem Nukleotid und dem Fluoreszenzfarbstoff wurde eine Triglykoleinheit verwendet. Die Spaltungseigenschaften wurden an einer Modellverbindung, einem modifizierten Nukleosid und einem immobilisierten Oligonukleotid intensiv untersucht. Dabei wurde eine vollständige Spaltung mit 1 M TBAF in THF in weniger als einer Minute gefunden und die erwartete beta-Eliminierung als Spaltungsmechanismus bestätigt. Mit Hilfe des entwickelten Linkers wurden vier neue, Fluoreszenz-markierte, reversible Terminatoren in sehr hoher Reinheit hergestellt und analytisch eindeutig identifiziert. Dabei handelt es sich um ein Fluorescein-markiertes 2'-Desoxyuridin Derivat, ein Cy3-markiertes 2' Desoxycytidin, ein Cy5-markiertes 2'-Desoxyguanosin und ein TexasRed-markiertes 2' Desoxyadenosin Derivat. Diese wurden dann in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern des EU Projekts erfolgreich durch eine DNA-Polymerase in DNA-Template eingebaut und in einem ersten Anwendungsexperiment an immobilisierten Hairpin-Templaten in zwei Sequenzierungszyklen eingesetzt.
Die mikroskopische Anatomie sowie die pathologische Anatomie bilden einen wichtigen Baustein der Ausbildung von Medizin- und Zahnmedizinstudenten. Da die zeitlichen und personellen Kapazitäten in den Instituten für Pathologie bzw. Anatomie keine vierundzwanzigstündige Betreuung erlauben, bestand der Wunsch, ein zeit- und ortsunabhängiges webbasiertes und interaktives multimediales Lernprogramm zu entwickeln. Es sollte den Studierenden beim Erlernen der Histologie und Histopathologie helfen und die Präsenzveranstaltungen am Mikroskop und Vorlesungen Ergänzen. Das Lernprogramm wurde mit zahlreichen hochauflösenden Bildern aller histologischen Präparate, die Bestandteil der Histologie- und Histopathologiekurse sind, in verschiedenen Vergrößerungen ausgestattet und in die Kurse des Frankfurter Curriculum für Medizin- und Zahnmedizin integriert. Darüber hinaus wurden alle histologischen Webseiten mit den entsprechenden histopathologischen Seiten verlinkt und umgekehrt. Ein Autorensystem zur Aktualisierung, Korrektur und Erweiterung der Programme wurde entwickelt. Mit der Hilfe der Evaluation durch die Studierenden wurde das System im Verlauf stark verbessert. Die hohe Zahl der Zugriffe auf die Website über das Internet (500.000 – 800.000 im Monat) weist auf die hohe Akzeptanz und Beliebtheit des Programms hin. Im wesentlichen zeigt die vorliegende Arbeit, dass internet-basierte Multimedia-Projekte von Studierenden verwendet werden und ihnen helfen, komplexe Sachverhalte der Histologie und Histopathologie zu erlernen. Die enge Verzahnung zwischen histologischen und histopathologischen Themen und Präparaten ermöglicht Studierenden der vorklinischen Fächer, über krankheitsbedingte Veränderungen zu erfahren, Studierende der klinischen Fächer hingegen können das histologische Basiswissen rekapitulieren. Das Autorensystem kann zur Entwicklung weiterer webbasierter Anwendungen, wie z. B. Virtuelle Mikroskopie oder Wissensprüfungsprogramme für die Histologie/Histopathologie, verwendet werden.
Seit Implementierung eines Qualitätsmanagement-Systems nach DIN EN ISO 9001 führt die Klinik für Anästhesiologie, Intensivmedizin und Schmerztherapie am Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität in Frankfurt am Main kontinuierlich Maßnahmen zur Qualitätsverbesserung durch. Hierzu zählen als klassisches Element des Qualitätsmanagements Befragungen sogenannter interessierter Parteien. Neben den Patienten stellen, vor allem auf einer Intensivstation, die Angehörigen der Patienten, häufig in Funktion eines gesetzlichen Betreuers, wichtige Partner in der Therapie dar. Bisher sind jedoch für diese Zielgruppe keine validen Befragungsinstrumente vorhanden. Nach Eröffnung der neuen Intensivstation C1 im Jahr 2008 soll eine standardisierte Befragung der Angehörigen intensivpflichtiger Patienten bezüglich deren Erwartungen an das Personal und den Aufenthalt des Patienten auf der Intensivstation durchgeführt werden. Ebenso soll die vom Personal antizipierte Erwartungshaltung der Angehörigen erfasst und im Sinne des GAP-Modells von Parasuraman et al. evaluiert werden. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein geeignetes Befragungsinstrument (C1GAP) zu entwickeln und durch geeignete Pretests zu validieren. Nach Identifizierung übergeordneter Themenkomplexe für die Befragung wurde der erste Entwurf eines anonymen Fragebogens für Angehörige mit insgesamt 82 Items verteilt auf 8 Themenkomplexe erstellt. Hieraus wurden anschließend Fragebögen für die Personalgruppen des ärztlichen Dienstes, der Pflege und des Außendienstpersonals am Empfangsschalter erstellt. Zur Information der Teilnehmer über die Intention und den Ablauf der Befragung wurden ein Begleitschreiben des Institutsdirektors Prof. Dr. Dr. K. Zacharowski sowie ein Extrablatt mit Informationen zum Datenschutz beigefügt. Zur Validierung des Fragebogens wurden Pretests in Form von kognitiven Interviews durchgeführt. Aus den kognitiven Interviews ergaben sich neben einer überwiegenden Zustimmung zu Form und Inhalt der Befragung inhaltliche Verbesserungsvorschläge, die in der finalen Überarbeitung des Fragebogens umgesetzt werden konnten. Der validierte, endgültige Fragebogen für Angehörige enthält insgesamt 81 Items, welche auf die Themenkomplexe „Rahmenbedingungen“, „Kommunikation mit Ärzten“, „Kommunikation mit dem Pflegepersonal“, „Information über Behandlungsziele und -ablauf“, „Beteiligung bei Therapieentscheidungen“, „Beurteilung weiterer Betreuungsangebote“, „Verlegung und Entlassung“ sowie „Angaben zur Person“ verteilt sind. Die Fragebögen für die Personalgruppen der Ärzte, Pflegekräfte und des Servicepersonals enthalten zwischen 26 und 61 Fragen zu den genannten Themenkomplexen. Anders als durch reine Zufriedenheitsbefragungen können mit Hilfe des vorliegenden Fragebogens Daten über die Erwartungshaltung von Angehörigen intensivpflichtiger Patienten gewonnen werden und im Vergleich zur vom Personal der Intensivstation C1 antizipierten Erwartungshaltung der Angehörigen einer GAP-Analyse unterzogen werden. Diese Daten können im Rahmen der Qualitätssicherungsmaßnahmen an der Klinik für Anästhesiologie, Intensivmedizin und Schmerztherapie zur Optimierung der Arbeitsabläufe und Leistungsprozesse sowie zur Ressourcenallokation verwendet werden. So kann letztendlich die Versorgung unserer Patienten auf der Intensivstation C1 nachhaltig verbessert werden.
Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Mit dem Ziel Kranheitsgene ihren Signalwegen zuzuordnen wurde in dieser Dissertation ein in situ Proteinmarkierungssystem entwickelt, das Hochdurchsatz-proteomik in mES Zellen ermöglicht. Das System beinhaltet die Einführung einerProteinmarkierungskassette in mES Zellen, die konditionale FlipROSAβgeo-Genfal-lenintegrationen in proteinkodierenden Genen enthalten. Weil die Konditionalität der FlipROSAβgeo-Genfallenkassette auf einem sequenzspezifischen Rekombinations-mechanismus beruht, kann diese postinsertionell über Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) durch eine Proteinmarkierungskassette ersetzt werden. Das hierfür entwickelte Konstrukt entspricht einem durch 5’ Spleißakzeptor- und 3’ Spleißdonorsequenzen definierten dizistronischen Exon, in dem ein Hygromyzin-Resistenzgen über eine P2A Polyproteinspaltungssequenz mit einem für das egfp (enhanced green fluorescent protein) kodierenden nLAP-Tag (N-terminal localization and affinity purification) verbunden ist. Eine erste Validierung dieses Exons in einem retroviralen Genfallenansatz ergab, dass sämtliche in Hygromyzin selektierte und auf DNA-Kassettenintegrationen untersuchte Klone nLAP-markierte Proteine exprimierten. Im Folgenden wurden in den GGTC (German Gene Trap Consortium) und EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis Project) mES Zellressourcen Genfallenintergationen identifiziert, die sich für eine RMCE vermittelte, N-terminale in situ Proteinmarkierung eignen. Als kompatibel wurden Genfallenklone klassifiziert, die eine FlipROSAβgeo-Integration im ersten Intron eines proteinkodierenden Gens aufweisen, wobei diese Integration sowohl hinter einem ersten nichtkodierenden, als auch hinter einem ersten kodierenden Exon liegen kann. Allerdings darf im letzteren Fall die kodierende Sequenz keine funktionale Domäne enthalten und muss kurz genug sein, um bei Verlust nicht mit der endogenen Proteinfunktion zu interferieren. Auf diesen Kriterien basierend wurden in den GGTC und EUCOMM Ressourcen 25.130 Proteinmarkierungs-kompatible Genfallenklone identifiziert, die 3.695 mutierten Genen entsprechen. Hiervon wurden acht für die Validierung der RMCE-vermittelten Proteinmarkierungsstrategie ausgewählt. In jedem Fall gelang es die Genfallen-kassette mit dem Proteinmarkierungsexon zu ersetzten. Sowohl der Genfallen-, als auch der RMCE-Proteinmarkierungsansatz führte ohne Ausnahme zur Expression nLAP-Tag markierter Proteine, wobei in allen 13 untersuchten Klonen die Größe der markierten Proteine derjenigen der entsprechenden nativen Proteine mit zusätzlichem Marker entsprach. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die physiologische Expression der markierten Proteine sich von denen der Wildtypproteine in der Regel nicht unterscheidet und für Lokalisations- und massenspektrometrische Interaktionsstudien ausreicht. Darüber hinaus spiegelten 90% der hier untersuchten markierten Proteine das subzelluläre Lokalisationsmuster der entsprechenden nativen Proteine wider. Ähnlich verhielt es sich mit den Interaktionspartnern der jeweiligen Proteine, die sich aus bereits bekannten, aber auch noch bisher unbekannten Proteinen zusammensetzen. Insgesamt wurden in dieser Dissertation die Voraussetzungen zu einer Hochdurchsatzproteomanalyse in mES Zellen geschaffen. Während der RMCE-Ansatz die Markierung von über 3.600 Proteinen in mES Zellen ermöglicht, eignet sich der Genfallenansatz neben der Proteinmarkierung in murinen auch für die Markierung von Proteinen in humanen Zellen. In dieser Hinsicht ist die Markierung von Proteinen in humanen ES Zellen und in reprogrammierten Stammzellen (iPS) von Patienten mit unterschiedlichsten Erkrankungen besonders attraktiv, weil damit sowohl Spezies- als auch Krankheitsspezifische Unterschiede im Ablauf individueller Signaltransduktionskaskaden definiert werden können.
1. In dieser Arbeit konnten durch chemische Mutagenese drei Pigmentmutanten erzeugt werden, die entsprechend ihrer Pigmentierung in drei Kategorien eingeteilt wurden:hellorange (OC-Mutante), gelb (YC-Mutante) und weiß (WH-Mutante). 2. Durch MS- und NMR-Analysen konnte die Struktur des von H. halophilus produzierten Carotinoids als Methylglykosyl-3,4-dehydro-apo-8’-lycopenoat aufgeklärt werden. Zusätzlich wurden auch die von der OC-Mutante produzierten Carotinoide als Hydroxy-3,4-dehydro-apo-8’-lycopin und Methylhydroxy-3,4-dehydro-apo-8’- lycopinoat identifiziert. Bei allen Pigmenten handelt sich um 8’-Apoderivate mit einer asymmetrischen Anordnung der Methylgruppen. Diese Art von Carotinoiden konnte zuvor nur in dem marinen Isolat P. maritimus gefunden werden (Shindo et al., 2008) 3. Auf Basis der genetischen und biochemischen Daten hinsichtlich der Carotinoide in H. halophilus konnte ein neuartiger Biosyntheseweg postuliert werden. Dabei beginnt die Synthese des C30-Carotinoids nicht wie bei allen bekannten Pigmenten dieser Art mit der Kondensation von zwei C15-Körpern, sondern durch die Kondensation von einem C10- mit einem C20-Molekül. Durch anschließende Desaturierungen, Hydroxylierungen, Methylierungen und Glykosylierungen entsteht das in H. halophilus identifizierte Carotinoid Methylglykosyl-3,4-dehydro-apo-8’-lycopenoat. Dieser Biosyntheseweg ist bisher einzigartig. 4. Die Carotinoide in H. halophilus sind essentiell für den Schutz der Zellen vor oxidativen Schäden. Während das Wachstum des pigmentierten Wildtyps nur wenig durch die Zugabe von bis zu 150 μM Duroquinon beeinträchtigt wurde, wurde das Wachstum der farblosen Pigmentmutante WH schon ab einer Duroquinonkonzentration von 120 μM vollständig gehemmt. Auch durch in vitro-Versuche konnte die antioxidative Eigenschaft von Methylglykosyl-3,4-dehydro-apo-8’-lycopenoat und der Derivate Hydroxy-,4-dehydro-apo-8’-lycopin und Methylhydroxy-3,4-dehydro-apo-8’-lycopinoat bestätigt werden. Dabei war die Wirksamkeit des Carotinoids aus H. halophilus sogar besser als die der biotechnologisch genutzten Pigmente ß-Carotin und Astaxanthin. 5. Durch Wachstumsexperimente konnte gezeigt werden, dass die Carotinoide auch eine Rolle in der Salzadaptation des Bakteriums spielen. Bei niedrigen Salinitäten zeigten der Wildtyp und die farblose Pigmentmutante keine Unterschiede im Wachstum. Eine hohe NaCl-Konzentration von 3,0 M NaCl führte jedoch zu einem verlangsamten Wachstum der Carotinoidmutante WH. 6. Im Genom von H. halophilus konnten anhand von Sequenzvergleichen mit bereits bekannten Kompetenzproteinen aus B. subtilis eine Reihe von putativen Genen identifiziert werden, die dem Bakterium theoretisch die Fähigkeit zur Ausbildung einer natürlichen Kompetenz verleihen. 7. Um die Fähigkeit von H. halophilus zur natürlichen DNA-Aufnahme zu testen, wurde eine Methode entwickelt, durch die es möglich war, viele unterschiedliche Bedingungen zu analysieren. Als Donor-DNA wurde die chromosomale DNA einer Erythromycin-resistenten Mutante von H. halophilus eingesetzt, die innerhalb dieser Arbeit erzeugt wurde. Insgesamt konnten so über 3000 Ansätze getestet werden. Jedoch konnte bei keiner dieser Bedingungen eine natürliche Kompetenz von H. halophilus festgestellt werden. 8. Innerhalb dieser Arbeit ist es gelungen eine Methode zur effizienten Transformation von H. halophilus zu etablieren. Dabei erfolgte die DNA-Aufnahme durch eine PEGvermittelte Protoplastenfusion. Mit dieser Methode konnten für H. halophilus Transformationseffizienzen von 2-102 Transformanden/μg DNA erreicht werden. 9. Durch die Möglichkeit H. halophilus transformieren zu können, ist es in dieser Arbeit erstmalig gelungen, ein System zur markerlosen Deletion von Genen in H. halophilus zu etablieren. Dabei wurde in einem ersten Schritt ein nicht-replizierendes Plasmid, das den gewünschten mutierten Locus enthält, durch Protoplastenfusion in H. halophilus transformiert. Durch einfach homologe Rekombination konnte das Plasmid in das Genom integrieren. Die so erhaltenen Integranten wurden im zweiten Schritt unter nicht-selektiven Bedingungen für etwa 90 Generationen kultiviert. Hierbei kam es zu einer zweiten homologen Rekombination, wodurch das Plasmid wieder aus dem Genom geschnitten wurde (Segregation). Dies resultierte entweder in den Wildtyp-Locus oder in den gewünschten mutierten Locus. Potentielle Integranten wurden auf einen CmS-Phänotyp getestet und mit Hilfe von Southern-Blot-Analysen verifiziert. 10. Mit Hilfe des in dieser Arbeit etablierten Systems zur markerlosen Mutagenese von H. halophilus wurde eine pro-Mutante generiert, deren proHJA-Operon deletiert war. 11. Überraschenderweise konnte die Mutante immer noch Prolin synthetisieren und war demnach nicht prolinauxotroph. Jedoch war H. halophilus pro nicht mehr in der Lage, Prolin als ein kompatibles Solut zu synthetisieren. Trotzdem zeigte das Wachstum der Mutante unter Hochsalzbedingungen keine Beeinträchtigung. Dies konnte auf eine gesteigerte Akkumulation von Glutamat, Glutamin und Ectoin zurückgeführt werden, wodurch der Verlust von Prolin als Osmolyt kompensiert wurde. 12. Die Expression der Gene glnA2, gltA und ectA, die für Biosyntheseenzyme von Glutamin, Glutamat und Ectoin kodieren, ist in H. halophilus pro induziert. Dabei hatte die Salinität einen stärkeren Einfluss auf die relativen RNA-Mengen von glnA2 und ectA in der pro-Mutante als im Wildtyp. gltA zeigte keine salzabhängige Expression im Wildtyp, der mRNA-Level des Gens stieg jedoch in H. halophilus pro bei hohen Salinitäten um das Doppelte im Vergleich zu Niedrigsalzbedingungen an. 13. Für die Glutaminsynthetase, dem Enzym der Glutaminsynthese, konnte eine gesteigerte spezifische Aktivität nachgewiesen werden. Dabei erhöhte sich die Aktivität mit steigender Salinität, sie war jedoch immer 30 bis 50% höher als im Wildtyp. 14. In dieser Arbeit wurde ein möglicher Biosyntheseweg zur salzunabhängigen Prolinsynthese aufgestellt. Hierbei dient Ornithin als Ausgangsmolekül, das entweder durch eine Ornithin-Aminotransferase (RocD) und eine Pyrrolin-5-Carboxylat-Reduktase (ProC und ComER) oder direkt durch eine Ornithin-Cyclodeaminase (ArcB) zu Prolin umgesetzt wird. Für alle Enzyme konnten die entsprechenden Gene im Genom von H. halophilus identifiziert werden. 15. Vor dieser Arbeit konnte bereits gezeigt werden, dass Prolin das dominante kompatible Solut unter Hochsalzbedingungen ist. Dabei war die Expression des pro-Operons sowohl von der Salzkonzentration als auch vom Anion Chlorid abhängig. Es zeigte sich, dass auch die zelluläre Konzentration von ProJ salzabhängig war, mit einem Maximum bei 2,0 – 3,0 M NaCl. Zudem war der ProJ-Gehalt wachstumsphasenabhängig. Während das Enzym besonders in frühexponentiellen Zellen detektiert werden konnte, sank die zelluläre ProJ-Konzentration kontinuierlich in stationären Zellen. Nach einem Salzschock von 0,8 auf 2,0 M NaCl stieg die ProJMenge nach 2 h leicht an und sank nach 4 h wieder kontinuierlich. Der ProJ-Level war in Gegenwart von NaCl maximal, sank aber nur leicht um 25%, wenn die Zellen mit 2 M Na-Glutamat oder Na-Nitrat inkubiert wurden. Die Prolinbiosynthese in H. halophilus wird demnach auch auf Ebene der Translation und/oder der Proteinstabilität reguliert. 16. Die Aminosäure Prolin wird nicht nur als kompatibles Solut in H. halophilus synthetisiert, sondern kann auch als C- und Energiequelle und als Stickstoffquelle genutzt werden. 17. Liegt Prolin als alleinige C- und Energiequelle im Medium vor, erfolgt eine salzabhängige Akkumulation des Osmolyts in H. halophilus, während der zelluläre mRNA-Level der pro-Gene stark reduziert ist. Prolin wird demnach nicht nur als Cund Energiequelle aufgenommen, sondern auch als kompatibles Solut. 18. Im Genom von H. halophilus konnten zwei Gene, die für die potentiellen Na+/Prolin- Symporter 3541 und 1381 kodieren, identifiziert werden, deren mRNA-Level bei Wachstum auf Prolin induziert war. 19. Durch Aminosäuresequenzvergleiche konnten in dieser Arbeit im Genom von H. halophilus jeweils zwei Isogene gefunden werden, die für potentielle Prolindehydrogenasen (prodh1/prodh2) und Pyrrolin-5-Carboxylat-Dehydrogenasen (p5cdh1/p5cdh2) kodieren. Mittels reverser Transkription von mRNA und anschließender PCR-Analysen konnte gezeigt werden, dass prodh2 und p5cdh2 ein Operon bilden (put-Operon). Eine Quantifizierung der Transkriptmengen der Abbaugene prodh1/p5cdh1 und prodh2/p5cdh2 mittels quantitativer PCR in Zellen, die in Gegenwart von Prolin als alleiniger C- und Energiequelle oder Stickstoffquelle gezogen wurden, zeigten deutlich, dass unter diesen Bedingungen nur die Expression von prodh2/p5cdh2 induziert wurde. Wurden die Zellen in Gegenwart von Glukose als C- und Energiequelle gezogen, stieg die mRNA-Menge von prodh2/p5cdh2 unter Hochsalzbedingungen um den Faktor 10 – 20 im Vergleich zu Zellen, die bei niedrigen Salinitäten kultiviert wurden, an. Die mRNA-Menge des put- Operons war in Glukose-gewachsenen Zellen wachstumsphasenabhängig mit einem Maximum in der stationären Wachstumsphase. In Gegenwart von 1,0 M NaCl stieg die mRNA-Menge um das 20-Fache, in Gegenwart von 3,0 M NaCl um das Doppelte. 20. Mit Hilfe des Systems zur markerlosen Mutagenese in H. halophilus konnte eine glnA2-Mutante generiert und verfiziert werden. H. halophilus glnA2 zeigte keinen Wachstumsphänotyp bei Anzucht in Gegenwart von unterschiedlichen NaCl-Konzentrationen. Die Deletion von glnA2 führte zu einer Inhibierung der salzabhängigen Prolinbiosynthese, während der Glutamat- und Glutaminpool bei allen getesteten Salinitäten im Vergleich zum Wildtyp nicht verändert war. Der Verlust von Prolin als kompatibles Solut konnte teilweise durch einen Anstieg des Ectoinlevels kompensiert werden. Die zelluläre Transkriptmenge von glnA1 und ectA war in H. halophilus glnA2 stärker von der Salinität beeinflusst als im Wildtyp, während die salzabhängige Regulation der proH-Expression aufgehoben wurde. Im Gegensatz zum Wildtyp wurde die spezifische Aktivität der Glutaminsynthetase in H. halophilus glnA2 durch steigende NaCl-Konzentrationen inhibiert.
Erkrankungen des hämatopoietischen Systems treten oft als Folge balancierter chromosomaler Translokationen auf. Dabei ist das MLL Gen auf Chromosom 11 Bande q23 in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen involviert. Alle diese Veränderungen sind entweder mit einer akuten myeloischen oder lymphatischen Leukämie assoziiert. Translokationen mit Beteiligung des MLL Gens - mit Ausnahme der Translokation t(9;11) - werden aufgrund ihrer schlechten Therapierbarkeit und schlechten Prognose als Hochrisiko- Leukämien eingestuft. Das häufigste Partnergen ist das AF4 Gen (42% aller MLL Translokationen) auf Chromosom 4 Bande q21. Die daraus resultierende Translokation t(4;11) ist mit einer akuten lymphatischen Leukämie (pro-B ALL) assoziiert und tritt gehäuft bei Säuglingen und Kleinkindern auf. Das Resultat der Translokation t(4;11) ist letztendlich die Entstehung zweier reziproker Derivatchromosomen, die die beiden Fusionsgene MLL•AF4 und AF4•MLL kodieren. Welcher Mechanismus die Entstehung der Leukämie hervorruft, konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Basierend auf den Daten anderer MLLassoziierter Translokationen, dass ausschließlich das Derivat 11 Fusionsprotein onkogene Effekte vermittelt, wurde das Fusionsprotein MLL•AF4 intensiv erforscht. Erst Ende 2008 gelang es einer amerikanischen Arbeitsgruppe in einem Mll•AF4 knock-in Mausmodell den Krankheitsphänotyp einer AML bzw. einer prä-B ALL auszulösen. Allerdings exprimieren 80% aller t(4;11)-Patienten auch das reziproke AF4•MLL Fusionstranskript und die restlichen 20% tragen komplexe Aberrationen zwischen MLL, AF4 und einem dritten oder sogar einem vierten Partnergen. Deshalb befassen sich die Studien unserer Arbeitsgruppe hauptsächlich mit dem reziproken AF4•MLL Fusionsprotein. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein in den Zellen akkumuliert und dadurch onkogene Ereignisse auslöst, welche letztendlich in der Wachstumstransformation der Zellen resultieren. Aufgrund dieser Daten war davon auszugehen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein ebenfalls einen entscheidenden Beitrag bei der Entstehung der Leukämie leistet. Um das leukämogene Potential der beiden Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL in einem Mausmodell weiter zu untersuchen, wurde zunächst ein retrovirales Transduktionssystem in BA/F3-Zellen etabliert. Dabei wurden BA/F3-Zellen sowohl einzeln mit MLL•AF4 oder AF4•MLL als auch mit beiden Fusionsgenen der Translokation t(4;11) cotransduziert. Nachdem die Funktionalität der beiden Expressionskassetten, durch full-length Integration und durch Transkription erfolgreich nachgewiesen werden konnte, erfolgten erste Transduktions-/Transplantationsexperimente in Mäusen. Dafür wurden Lin-/Sca-1+ aufgereinigte Knochenmarkzellen mit retroviralen Überständen von MLL•AF4 und AF4•MLL einzeln- als auch co-transduziert. Mäuse denen MLL•AF4- oder Mock-transduzierte Lin-/Sca-1+-Zellen transplantiert wurden, entwickelten über einen Beobachtungszeitraum von 13 Monaten keinerlei Anzeichen einer leukämischen Erkrankung. Im Gegensatz dazu resultierte die Transplantation von AF4•MLLoder co-transduzierten Lin-/Sca-1+-Zellen in der Entwicklung einer leukämischen Erkrankung innerhalb von 7 Monaten. Anhand pathologischer Parameter, sowie durch histochemische, molekulare als auch durchflusszytometrische Analysen konnten drei verschiedene Immunophänotypen identifiziert werden. Die Expression des Fusionsproteins AF4•MLL resultierte in der Ausprägung des Phänotyps einer pro-B ALL oder einer B/T biphänotypischen akuten Leukämie (B/T BAL). In Anwesenheit beider Fusionsproteine der Translokation t(4;11) entwickelte sich ebenfalls eine B/T BAL oder einer Mixed Lineage Leukemia (MLL). Retransplantationsexperimente mit den primären leukämischen Blasten zeigten, dass die drei verschiedenen Krankheitsphänotypen stabil transplantierbar sind, wobei sich die Latenzzeit erheblich verkürzte. Damit wurde zum ersten Mal der Beweis erbracht, dass das Fusionsprotein AF4•MLL auch allein ohne die Gegenwart des Fusionsproteins MLL•AF4 in der Lage ist eine leukämische Erkrankung auszulösen. Aufgrund dieser Daten, vorausgehenden Studien unserer Arbeitsgruppe sowie den Studien zum Fusionsprotein MLL•AF4 ist davon auszugehen, dass der pathomolekulare Mechanismus der Translokation t(4;11) auf zwei Onkoproteinen basiert.
Als Teil der Atmungskette des hyperthermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus besteht die NADH:Ubichinon-Oxidoreduktase aus 13 Untereinheiten, die durch 24 unterschiedliche Gene codiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde für den massenspektrometrischen Nachweis dieser Untereinheiten nach der Aufreinigung des Komplexes eine SDS-PAGE durchgeführt, an die sich eine tryptische Proteolyse und eine Messung per MALDI MS und MS/MS anschlossen. Mit dieser analytischen Strategie war es möglich, jede nicht-homologe Untereinheit nachzuweisen und 20 von 24 genombasierten Isoformen eindeutig zu identifizieren. Selbst kleine bzw. sehr hydrophobe Untereinheiten mit vielen Transmembranhelices konnten mit Hilfe dieser Methode analysiert werden. Die hohe Anzahl an präsenten, unterschiedlichen Isoformen und die vorherrschenden Verunreinigungen durch Fremdproteine (z.B. ATP-Synthase) könnten Indizien dafür sein, dass bis jetzt keine hinreichend stabile und reproduzierbare Enzympräparation gelungen ist, um eine Kristallstrukturanalyse durchzuführen. Im Allgemeinen kann der Ablauf eines solchen Proteomics-Experiments in drei Teile gegliedert werden: die Auftrennung eines Protein- oder Peptidgemischs zur Verringerung der Probenkomplexität, die Identifikation des Proteins per Massenspektrometrie und die damit verbundene bioinformatische Datenanalyse. Neben chromatographischen Methoden ist die Elektrophorese in Polyacrylamidgelen immer noch das am häufigsten angewandte Trennverfahren im Proteomics-Bereich. Vor der MS-Messung werden die aufgetrennten Proteine in der Regel direkt in der Gelmatrix verdaut. Die Qualität der Ergebnisse wird stark durch Proteinmenge und die auftretenden Probenverluste beeinflusst. Diese werden beispielsweise durch eine unzureichende Peptidextraktion aus dem Gel hervorgerufen. Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein neues Gelsystem entwickelt, dass vor allem für die Proteolyseeffizienz, die Peptidextraktion und somit auch für die anschließende massenspektrometrische Messung von Vorteil ist. Das Monomer Acrylamid wird hierzu mit den beiden Quervernetzern N,N-Methylenbisacrylamid (MBA) und Ethylenglykoldiacrylat (EDA) polymerisiert. Es entsteht ein Gel, dessen Poren durch die basische Hydrolyse der Esterbindungen des EDAs vergrößert werden können, ohne die dreidimensionale Grundstruktur des Gels zu zerstören.   Die gemischten Gele mit MBA und EDA als Crosslinkern sind sowohl für Tris-Glycin- als auch Tris-Tricin-Puffersysteme einsetzbar. Die Evaluierung der Daten erfolgte meist gegen ein Standardgel mit T= 14% und C= 2,6%. Durch eine experimentell ermittelte Anpassung der Mischgele auf T+10% und C+45% mit einem MBA/EDA-Verhältnis von 0,5 verhalten sich die beiden Gelsysteme empirisch gleich und zeigen eine übereinstimmende elektrophoretische Trennung und Auflösung. Es gibt keine wesentlichen Nachteile in Bezug auf die Handhabung, die elektrophoretische Trennung und die anschließenden Analysen und Techniken, solange diese in sauren bis leicht basischen pH-Bereichen durchgeführt werden. So wurde das gemischte Gelsystem sowohl bei einer 2D IEF/SDS-PAGE als auch bei einem Western Blot-Experiment angewendet und für vollständig kompatibel befunden. Die gemessenen MS-Daten profitieren im Fall von Trypsin und Elastase erheblich von der besseren Zugänglichkeit des Enzyms zum Substratprotein und der verbesserten Peptidextraktion. Die Gelaufweitung führt zu signifikant besseren Ergebnissen, die größtenteils auf höhere S/N-Werte zurückzuführen sind. Die Signalintensitäten der Peptide sind um den Faktor 5 besser als die des Referenzgels. Der Nachweis von je 1 pmol der Proteine BSA, Serotransferrin und Alkoholdehydrogenase profitiert stark von den zusätzlich erhaltenen Daten, da die Zunahme an identifizierten Peptiden bei der PMF-Suche im Bereich von 40 bis 80% liegt. Auch bei geringen Proteinmengen wie 250 bzw. 50 fmol BSA ist die Anzahl der zugeordneten Signale um den Faktor 2-3 besser. Der in-Gel Verdau von 1 pmol Bacteriorhodopsin mit Elastase zeigt ebenfalls einen Anstieg der Peptidsignale um 60% im Vergleich zum Referenzgel. Da die Proteine im Gel alle mit kolloidalem Coomassie Brilliant Blue angefärbt wurden, kann davon ausgegangen werden, dass sich die guten MS-Ergebnisse auf jede mit diesem Farbstoff visualisierte Probe übertragen lassen. Für den Fluoreszenzfarbstoff RuPBS trifft dies ebenso zu, insgesamt wurden aber weniger Peptide als bei kolloidaler Coomassie Brilliant Blue-Färbung detektiert. Dementsprechend handelt es sich bei Acrylamidgelen mit MBA/EDA-Vernetzung um ein vielversprechendes alternatives Gelsystem, dass auf eine Vielzahl anderer Methoden angewendet werden kann.
Etablierung eines universellen Testsystems zur funktionellen Analyse neuer MLL-Fusionspartner
(2010)
Leukämische Erkrankungen entstehen häufig aufgrund genetischer Aberrationen. Dabei handelt es sich in den meisten Fällen um reziproke chromosomale Transloka-tionen, die an der Entstehung chimärer Fusionsgene mit intaktem Leserahmen betei-ligt sind und letztendlich zur Expression neuartiger Fusionsproteine führen. Das auf Chromosom 11 Bande q23 lokalisierte MLL-Gen (Mixed Lineage Leukemia) spielt bei einigen dieser chromosomalen Aberrationen eine wichtige Rolle. Es entstehen Fusi-onsproteine, die phänotypisch sowohl mit akuten myeloischen Leukämien (AML) als auch mit akuten lymphatischen Leukämien (ALL) assoziiert sind. Diese hämatopoie-tischen Erkrankungen werden aufgrund ihrer ungünstigen Prognose und schlechter Heilungschance als Hochrisiko-Leukämien klassifiziert. Neben Translokationen des MLL-Gens sind für die Leukämogenese noch weitere genetische Aberrationen von Bedeutung. Ebenso spielen, allerdings in geringerem Maße, Deletionen, Inversionen sowie Insertionen eine Rolle. Allen chromosomalen Translokationen sowie den übrigen chromosomalen Veränderungen geht mindestens ein DNA-Doppelstrangbruch voraus. Dieser findet sowohl beim MLL als auch beim Partnergen in sogenannten Bruchpunktsregionen statt. Inzwischen sind 104 verschiedene Veränderungen des MLL-Gens bekannt, von de-nen 64 auf molekularer Ebene charakterisiert wurden. Allein über 20 Partnergene wurden in den letzten fünf Jahren im Diagnostikzentrum DCAL (Diagnostic Center of Acute Leukemia) des Universitätsklinikums Frankfurt identifiziert. Allerdings sind bis heute noch keine universellen Ansätze zur Etablierung eines Tiermodells zur Unter-suchung neuer Partnergene bekannt. Somit ist es von großem Interesse möglichst schnell und zuverlässig dieses Ziel zu erreichen, um weitere Informationen über das onkogene Potential der beteiligten MLL-Partner zu erhalten. Als neue Kandidaten wurden im Rahmen dieser Arbeit DCPS, MAML2 sowie NRIP3 untersucht, die auf die Positivkontrolle ENL und auf die Negativkontrolle LASP1 bezogen wurden. Zunächst wurde ein universelles retrovirales Vektorsystem entwickelt, welches den MLL-N-Terminus (Exon 1 - Exon 9) trägt. Das zu untersuchende Partnergen kann durch Einklonieren der entsprechenden DNA-Sequenz in diesen Vektor eingefügt werden. Um ein authentisches Fusionsprodukt mit durchgehendem Leserahmen zu erhalten, sind die beiden Gene durch eine intronische Sequenz voneinander separiert. Die korrekte Fusion konnte auf Transkriptebene via RT-PCR nachgewiesen werden. In Vorversuchen wurden die Konstrukte MLL•DCPS, MLL•ENL (Positivkontrolle), MLL•LASP1 (Negativkontrolle), MLL•MAML2 sowie MLL•NRIP3 in murine hämato-poietische Progenitorzellen (Ba/F3 und 32D) transduziert. Die erfolgreiche Infektion konnte sowohl fluoreszenzmikroskopisch als auch auf Transkriptebene nachgewie-sen werden. Des Weiteren zeigten die Konstrukte unterschiedliche Einflüsse auf die Hox-Genexpression der Hox-Gene a5, a7, a9, a10, b3 und b4. Zur Untersuchung wachstumstransformierender und proliferierender Eigenschaften der Fusionsproteine folgten nach Abschluss der Vorversuche erste Transduktionsex-perimente mit murinen Lin-/Sca1+-hämatopoietischen Zellen. Mittels eines Methylcel-lulose-Assays sollten die transformierenden Eigenschaften der MLL-Fusionen über-prüft werden. Lediglich die Positivkontrolle wies wachstumstransformierende Eigen-schaften auf. Somit legen die bisherigen Ergebnisse die Vermutung nahe, dass noch weitere Faktoren für die Leukämogenese relevant sein müssen. Um Aussagen über das Verhalten der zu untersuchenden MLL-Fusionen in vivo tref-fen zu können, wurden retroviral infizierte, Lin-/Sca1+-aufgereinigte hämatopoietische Stammzellen in Empfängermäuse transplantiert. Bis zum jetzigen Zeitpunkt konnten bei den Mäusen noch keinerlei Symptome einer leukämischen Erkrankung diagnosti-ziert werden. Es ist abzuwarten, ob die transplantierten Mäuse in den nächsten Wo-chen leukämische Verhaltensauffälligkeiten aufweisen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erfolgreich ein Testsystem etabliert werden, das es ermöglicht, neue Partnergene in kürzester Zeit funktionell zu analysieren. So können in Zukunft hoffentlich neue Erkenntnisse zur Leukämogenese gewonnen werden, die eventuell neue Therapieansätze ermöglichen.
Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie
(2010)
Bei chronischen Erkrankungen ist eine regelmäßige Arzneimitteleinnahme eine der Vo-raussetzungen für den Therapieerfolg. Trotzdem nehmen viele Patienten ihre Arzneimit-tel nicht wie vorgeschrieben ein. Dies kann im Rahmen von kardiovaskulären Erkrankun-gen (z. B. Hypertonie) schwerwiegende Folgen wie Herzinfarkt oder Schlaganfall haben. Es ist bekannt, dass die Therapietreue (Adhärenz bzw. Compliance und Persistenz) bei Hypertonikern nur bei 30 – 55 % liegt. Daher ist es von größter Wichtigkeit, die Therapie-treue und die Gründe für mangelnde Adhärenz zu erfassen, um danach gezielte Interven-tionen zur Verbesserung dieser entwickeln zu können. Allerdings liegen aus Deutschland zu dieser Thematik nur wenige Untersuchungen aus Feldstudien in Apotheken oder Ana-lysen aus Verordnungsdatenbanken vor.
Um die zur Verfügung stehenden Möglichkeiten zur Ermittlung der Therapietreue großflä-chig abzudecken, wurden unterschiedliche Erfassungswege genutzt. Zum einen wurde eine Patientenbefragung in öffentlichen Apotheken zur Erfassung der Adhärenz und Ein-nahmegewohnheiten unter medikamentöser Therapie mit Antihypertensiva durchge-führt. Zum anderen diente die Analyse von Verordnungsdaten der DAPI-Datenbank dazu, die Persistenz und Compliance von Patienten unter antihypertensiver Therapie zu be-stimmen. Als Spezialfall wurde weiterhin betrachtet, ob die Umstellung von einem Origi-nal- auf ein generisches Ramipril-Präparat nach dessen Patentauslauf mit einer vermin-derten Compliance einhergeht.
Die Patientenbefragung wurde sowohl von Patienten wie auch von den 24 teilnehmenden Apotheken gut angenommen. Dies zeigen die Rücklaufquoten der ausgegebenen Frage-bögen (46,8 % für die Befragung per zugesandtem Fragebogen (KF; kurze Form des Frage-bogens) und 32,8 % für das Interview in der Apotheke (LF; lange Form des Fragebogens)) Gemessen anhand des eingesetzten Adhärenz-Scores beschrieben sich 71,9 % der Patien-ten im LF und 58,2 % im KF selbst als adhärent. Der Bedarf für strukturierte, einfach durchführbare Adhärenz-Erfassungsinstrumente für die öffentliche Apotheke wurde sehr deutlich, wie u. a. der Abschlussbericht, welcher von den Apotheken nach Abschluss der Befragung ausgefüllt wurde, zeigte. Demnach hielten die Apotheken die Befragung von Umfang und Verständlichkeit für angemessen. Die Patienten waren bereit, detaillierte
Kapitel V Zusammenfassung V
Dissertation Miriam Ude
Evaluation der Adhärenz, Compliance und Persistenz bei Patienten unter antihypertensiver Therapie 160
Auskünfte über ihre Erkrankung zu geben. Dies zeigten auch die vielen in den Bogen ein-getragenen Anmerkungen seitens der Patienten und Apothekern, in denen individuelle Probleme dokumentiert wurden.
Bei der Analyse von Persistenz und Compliance im Substanzklassenvergleich wurde ein-drücklich gezeigt, dass die Therapietreue unter den First-line-Antihypertensiva (AHT) sub-optimal ist. Patienten unter der Therapie mit β-Blockern (77,3 %) weisen den geringsten non-persistenten Anteil auf, gefolgt von Patienten mit Verordnungen über ACE-Hemmer (78,7 %), AT1-Antagonisten (79,0 %), Calcium-Kanal-Blocker (81,4 %) und Diuretika (83,0 %). Hinsichtlich der Compliance findet sich in der Gruppe der mit AT1-Antagonisten be-handelten Patienten der niedrigste Anteil mit Non-Compliance (52,1 %), gefolgt von ACE-Hemmern (54,1 %), β-Blockern (54,7 %), Calcium-Kanal-Blockern (58,5 %) und Diuretika (63,6 %).
Die primäre Hypothese, dass die Compliance nach Umstellung von einem Ramipril-Original-Präparat nach dessen Patentauslauf auf ein Generikum signifikant abnimmt, konnte nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse wurden für Patienten ermittelt, welche mit Ramipril-Monopräparaten, nur mit Fixkombinationen aus Ramipril mit einem Diuretikum, oder mit beidem (duale Therapie) behandelt wurden.
Die Ergebnisse der im Rahmen dieser Dissertation untersuchten Projekte zeigen, dass die medikamentöse Therapietreue bei Patienten unter antihypertensiver Therapie in Deutschland verbesserungswürdig ist, und dass die Ermittlung der Adhärenz, Compliance und Persistenz von immenser Wichtigkeit ist. Trotz der unterschiedlichen gewählten An-sätze kongruieren die Ergebnisse sehr gut. Patienten benötigen Unterstützung in der Durchführung ihrer medikamentösen Therapie mit AHT, um gesteckte Therapieziele zu erreichen, welche dazu beitragen können, Morbidität und Mortalität zu verringern bzw. die Lebensqualität zu verbessern. Ein erster Schritt dazu ist das zielgerichtete Erkennen therapiebezogener Probleme. Da es hierfür in Deutschland bisher keine strukturierten Instrumente gibt, welche flächendeckend in den Apothekenalltag implementiert wurden, könnte das neu entwickelte und auf Machbarkeit getestete Befragungsinstrument ein Ansatz sein, die Patienten gezielt und zeitsparend nach ihren Problemen mit der Arznei-mitteleinnahme zu befragen und frühestmöglich intervenieren zu können.
Das Ziel dieser Arbeit war es, eine neuartige, drei-dimensionale Messmethode (BodyScan) zur Körperoberflächenbestimmung an Neugeborenen zu evaluieren. Die exakte Bestimmung der Oberfläche ist, besonders in der Pädiatrie, von großer Bedeutung für die Beurteilung physiologischer Parameter und der Dosierung von Medikamenten bzw. Infusionstherapien. Bestimmungen der Körperoberfläche mit 3D-Scannern liegen zwar für Erwachsene in zahlreichen Studien vor, jedoch wurden Neugeborene aus technischen Gründen bislang nicht untersucht, da ihre komplette Oberfläche in einem Scan nicht dargestellt werden kann. Das verwendete Messgerät „BodyScan“ der Firma 3D-Shape GmbH, Erlangen, arbeitete mit einer Messmethode, die es ermöglichte eine kontaktfreie, schonende, drei-dimensionale Vermessung der Körperoberfläche vorzunehmen (Streifenprojektionstechnologie). Die Neugeborenen konnten nur in liegender Position vermessen werden. Mit Hilfe einer Spiegelkonstruktion war es möglich drei Körperseiten des Neugeborenen im gescannten Bild zu erfassen. Diese gescannte Fläche wurde mit einem Korrekturfaktor zur gesamten Körperoberfläche extrapoliert. Dazu wurde der BodyScan vor Beginn der Studie mit einem artifiziellen Objekt (Messpuppe) kalibriert. Die genaue Oberfläche der Messpuppe war zuvor von einem ähnlichen genormten Gerät (BodyScan3DShape) auf 1632,24 cm², als Zähler des Korrekturfaktors bestimmt worden. Danach fanden 20 Messungen der Puppe mit dem Studien-Scanner statt. Es konnte gezeigt werden, dass der BodyScan die Körperoberfläche der Messpuppe mit einen Fehler von unter 0,1 % genau bestimmen konnte. Die ermittelte mittlere Oberfläche war der Nenner des so erhobenen Korrekturfaktors für unseren BodyScan, der schließlich 1,9787 betrug. Danach wurden 209 gesunde Neugeborenen, geboren in der Universitätsklinik Frankfurt am Main, untersucht. Sie wurden mit dem BodyScan in Bauch- und Rückenlage abgebildet, und die Körperoberfläche wurde zu beiden Ansichtsmodi computerunterstützt ermittelt. Die Ergebnisse des BodyScan wurden mit herkömmlichen, als empirischer Standard betrachteten Methoden, und zwar aus der Literatur bekannten Formeln nach DU BOIS & DU BOIS (1916), nach BOYD (1935), nach HAYCOCK ET AL. (1978), nach MEBAN (1983), und nach MOSTELLER (1987) verglichen. Zwei Neugeborene wurden außerdem mit der Geometrischen Methode untersucht, dazu wurden verschiedene Strecken und Umfänge einzelner Körperteile vermessen und deren Oberfläche mittels mathematischer Formeln bestimmt. Zudem wurde auch ein Subkollektiv von 25 Neugeborenen aus dem Gesamtkollektiv hinsichtlich der Ergebnisse der Körperoberflächenbestimmung mit dem BodyScan und den Formeln gesondert betrachtet. Dieses Subkollektiv setzte sich aus Neugeborenen zusammen, welche unter optimalen Bedingungen abgebildet wurden und von welchen qualitativ „sehr gute“ Aufnahmen erstellt wurden. Die durchschnittliche Körperoberfläche eines unter optimalen Bedingungen vermessenen Neugeborenen betrug mit dem BodyScan 2163,66 cm². Der Vergleich mit den fünf Formeln zur Oberflächenberechnung zeigte zwar geringfügige Abweichungen , aber dennoch gute Übereinstimmung der Ergebnisse unter den optimalen Studienbedingungen [besonders mit den Formeln nach DU BOIS & DU BOIS (1916), HAYCOCK ET AL. (1978), MEBAN (1983) , und MOSTELLER (1987)]. Die durchschnittliche Abweichung des BodyScans von den Formeln lag hier bei 2,55%. Als weiteres Ergebnis erhielten wir gute Übereinstimmungen für die Körperlängenbestimmung durch den BodyScan sowohl im Vergleich zu den Messungen der Hebammen als auch zu denen des Infantometers. Er betrug weniger als 0,1 % Fehler bei der Messpuppe und 2,8 % bei den Neugeborenen. Abschließend kann die Körperoberflächenmessung an Neugeborenen mit dem BodyScan als valide Methode bezeichnet werden. Sie setzt jedoch eine exakte Einstellung des Probanden in der Apparatur voraus. Weitere Untersuchungen sollten an kranken Neugeborenen und Frühgeborenen stattfinden, da die Methode wenig belastend und durch die Verwendung von weißem Licht unschädlich ist.
Die kontrastmittelverstärkte MRT hat in den letzten Jahren als Bildgebungsmethode in der abdominellen Diagnostik eine zunehmende Bedeutung in der klinischen Patientenversorgung gewonnen. Neben der Entwicklung neuer Geräte mit schnellen Untersuchungssequenzen in Atemstillstand, hat auch der Einsatz von MRT-Kontrastmitteln entscheidend dazu beigetragen. Mit der Entwicklung neuer Kontrastmittel - höher konzentriert – stellt sich die Frage, ob und wie sich diese von den Standardkontrastmitteln hinsichtlich der Kontrastierung von Organparenchym, Organläsion und Gefäßen unterscheiden. Diese Studie konzentrierte sich auf mögliche Unterschiede zwischen dem neuen höher konzentrierten Kontrastmittel Gadobutrol und dem Standardkontrastmittel Gd-DTPA im Hinblick auf die Charakterisierung von Nierenläsionen. Gadobutrol 1,0 M (Gadovist®, Schering AG, Deutschland), ein hochmolares Gd-Chelat, hat im Vergleich zu herkömmlichem niedermolaren Gd-DTPA (Magnevist®, Bayer Schering Pharma, Deutschland) einen größeren Effekt auf die Verkürzung der T1-Relaxationszeit bei geringerer Osmolalität und Viskosität. Die höhere Konzentration ermöglicht eine Reduktion des Kontrastmittelvolumens und damit einen kompakteren Bolus. Ziel dieser Studie war die Evaluierung des höher konzentrierten Gadobutrols (1,0 molar) im Vergleich zum niedermolekularen Standardkontrastmittel Gd-DTPA (0,5 molar) in der MRT-Nierendiagnostik hinsichtlich der Differenzierung von Nierenläsionen. Außerdem sollen die erzielten Ergebnisse genutzt werden, um die klinischen Anwendungsmöglichkeiten von Gadobutrol erweitern zu können. Die Ergebnisse der vorliegenden interindividuellen Phase-III-Studie basieren auf der MRT-Untersuchung und Auswertung von 30 Patienten mit verschiedenen Nierenläsionen (benigne und maligne) vor und nach Applikation von Gadobutrol 1,0 M bzw. Gd-DTPA 0,5 M. Die Wahl des Kontrastmittels erfolgte nach einer randomisierten Zuordnung. Hierbei erhielten 15 Patienten Gadobutrol 1,0 M und 15 Patienten Gd-DTPA 0,5 M. Die MRT-Befunde wurden mit einem definierten Goldstandard korreliert. Die Applikation beider Kontrastmittel erfolgte nach der automatisierten Bolusmethode, damit eine dynamische Bildgebung ermöglicht werden konnte. Dabei konnte für beide KM eine gute Verträglichkeit evaluiert werden. Die Ergebnisse dieser Studie haben gezeigt, dass bezüglich der Kontrastierung des Nierenparenchyms signifikante Unterschiede zwischen den untersuchten Gadolinium-Chelaten bestehen. Hierbei zeigte sich in der T1-gewichteten Gadobutrol-verstärkten Dynamik während der nephrographischen Phase eine stärkere Anreicherung in Nierenrinde und Nierenmark mit einem langsameren Übertritt des Kontrastmittels ins Nierenbeckenkelchsystem im Vergleich zur Gd-DTPA-verstärkten Bildgebung. Die stärkere Kontrastierung des Nierenmarks während dieser wichtigen Phase ermöglichte eine bessere Abgrenzung und Sichtbarkeit der Nierenläsionen zum umliegenden Gewebe. Die Nierenläsionen zeigten Unterschiede in der Kontrastmittelaufnahme, mit einem Trend für höhere Werte für die Gadobutrol-Gruppe. Gleiche Resultate ergaben sich für die Gefäßkontrastierung. Hier zeigte Gadobutrol-verstärkte Bildgebung keine wesentliche Erhöhung des arteriellen und venösen Gefäßsignals gegenüber dem Standardkontrastmittel Gd-DTPA. Unter Verwendung beider Kontrastmittel konnte eine gute Bildqualität erzielt werden. Jedoch erzielte dabei das höher konzentrierte Gadobutrol höhere Werte im Vergleich zu dem Standardkontrastmittel Gd-DTPA. Ferner zeigte sich für den Gadobutrol-Kontrast eine verbesserte Abgrenzbarkeit der Nierenläsionen. Bezüglich der diagnostischen Sicherheit in der Differenzierung der Nierenläsionen ließ sich zwischen den beiden Kontrastmitteln kein wesentlicher Unterschied feststellen. Die Ergebnisse dieser Studie weisen darauf hin, dass Gadobutrol 1,0 M als höher konzentriertes MR-Kontrastmittel ein gut geeignetes Kontrastmittel zur Detektion und Differenzierung von Nierenläsionen ist. Es kann ebenso wie das bis jetzt verwendete niedermolare Kontrastmittel Gd-DTPA 0,5 M bei der Abklärung von Nierenpathologien mittels MRT eingesetzt werden.
Die Quantenspieltheorie stellt eine mathematische und konzeptuelle Erweiterung der klassischen Spieltheorie dar. Der Raum aller denkbaren Entscheidungswege der Spieler wird vom rein reellen, messbaren Raum in den Raum der komplexen Zahlen (reelle und imaginäre Zahlen) ausgedehnt. Durch das Konzept der möglichen quantentheoretischen Verschränkung der Entscheidungswege im imaginären Raum aller denkbaren Quantenstrategien können gemeinsame, durch kulturelle oder moralische Normen entstandene Denkrichtungen mit einbezogen werden. Ist die Strategienverschränkung der Spieler im imaginären Raum der denkbaren Entscheidungswege nur genügend groß, so können zusätzliche Nash-Gleichgewichte auftreten und zuvor existente dominante Strategien sich auflösen. Die der evolutionären Entwicklung zugrundeliegende Replikatordynamik besitzt in der evolutionären Quantenspieltheorie eine komplexere Struktur und die jeweiligen evolutionär stabilen Strategien können sich, abhängig vom Maß der Verschränkung, abändern. Neben einer detaillierten Darstellung der evolutionären Quantenspieltheorie werden in dieser Dissertation mehrere Anwendungsbeispiele besprochen. So wird durch eine quantentheoretische Erweiterung die aktuelle Finanzkrise mittels eines Anti-Koordinationsspiels beleuchtet, das unterschiedliche Publikationsverhalten von Wissenschaftlern erklärt und erste Ansätze einer experimentellen Bestätigung der Theorie dargestellt.
Die vorliegende Arbeit hat die Charakterisierung und Untersuchung des Stabilitätsverhaltens von
Parvulustat (PL), einem Homologen des α-Amylase-Inhibitors Tendamistat, zum Inhalt. Zur
weitreichenden Charakterisierung wurden verschiedene Proteinregionen des Parvulustats der CTerminus,
das hydrophobe Cluster, die Disulfidbrücken sowie die Proline auf ihren jeweiligen
Einfluss auf die Struktur und die thermodynamische Stabilität untersucht. In der vorliegenden
Zusammenfassung werden die Ergebnisse dieser Studien komprimiert präsentiert:
· Charakterisierung des Parvulustat-Wildtyps
Es galt vorweg herauszufinden, wie sich der Inhibitor unter nativen und denaturierten
Bedingungen verhält, um Rückschlüsse auf seine Merkmale und Strukturen zu ziehen. Die
erzielten Ausbeuten und die hohe Reinheit des isolierten Parvulustats erlaubten eine umfassende
Charakterisierung, einschließlich zahlreicher Kristallisationsexperimente, die vermuten lassen,
dass eine Kristallisation möglich sein sollte. Aufgrund der Tatsache, dass die Struktur des
Parvulustats bis 2009 unbekannt war, wurde die sekundäre Struktur mittels Circulardichroismus
und Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Die Analyse des fernen UV-CD-Spektrums bei pH 7,0
und 25°C offenbarte eine „all-b-sheet“ Protein-Struktur. Mittels Fluoreszenzspektroskopie wurde
deutlich, dass die aromatischen Aminosäuren exponiert vorliegen. Um zunächst einen Einblick in
die Strukturveränderungen und die thermodynamische Stabilität zu erhalten, wurde der
temperaturinduzierte Entfaltungsübergang mittels CD-Spektroskopie verfolgt. Das Angleichen der
bei 230 nm gemessenen CD-Daten nach der linearen Extrapolations-Methode für eine
Zweizustands-Faltung ergab einen Tm-Wert von 82°C und D H(Tm) von 201,6 kJ/mol. Die
beträchtlichen Werte veranschaulichen die hohe Stabilität des Parvulustats. Eine aus den CDMessungen
bei 50° ergebende Übergangskurve zeigte, dass sich die Sekundärstruktur mit einem
Übergangsmittelpunkt bei 5,62 M GdnHCl kooperativ und reversibel entfaltet. Das Protein
entfaltet sogar infolge einer pH-Wert-Senkung bis auf pH 1 nicht vollständig, sondern es wechselt
direkt in einen Säure-Zustand („acid-state“). Dieser Zustand zeigt spektroskopisch die gleichen
Eigenschaften wie das native Protein, wobei die volle Inhibierungs-Aktivität nicht erhalten bleibt.
In sehr basischem Milieu bei pH 14 nimmt Parvulustat einen alkalisch denaturierten
Zwischenzustand IB an, der sich erheblich von dem GdnHCl-denaturierten, dem säurebehandelten
oder vom „molten globule“ Zustand unterscheidet. Allgemein behielt Parvulustat
über ein breites pH-Wert Spektrum (1,0-10,0) die native Struktur, bzw. eine „native like“ Struktur,
was erneut auf die enorme Stabilität des Proteins hindeutet. Die von Rehm et al. (Rehm et al.,
Theoretischer Teil
-4-
2009) aufgeworfene Hypothese des „induced fit“ Inhibierungsmechanismus des Parvulustats
konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bekräftigt werden. Mittels
Sekundärstrukturbestimmungen des Parvulustats unter Komplexbildung mit der a-Amylase
konnte eindeutig gezeigt werden, dass strukturelle Veränderungen am Inhibitor im Komplex
vorliegen. Durch zahlreiche Tests konnte festgestellt werden, dass die WRY-Region des
Parvulustats sich der Struktur der a-Amylase anpasst. Die Komplexierung des Parvulustats
bewirkte aber eine thermodynamische Destabilisierung der Inhibitor-Struktur.
· Einfluss des C-Terminus auf die Stabilität des Parvulustats
Um die Ursachen für die hohe Stabilität des Parvulustats auch im Vergleich zu Tendamistat (Tm:
79°C) zu finden, wurde der Einfluss des hoch flexiblen C-Terminus untersucht. Die Derivate mit
um zwei (PL-2AA), vier (PL-4AA) und sieben (PL-7AA) Aminosäuren verkürztem C-Terminus
wurden isoliert und analysiert. Die Entfaltungstemperaturen der verkürzten Derivate des
Parvulustats sinken mit abnehmender Zahl der Aminosäuren. Die Ergebnisse suggerieren, dass
der C-Terminus des Parvulustats eine entscheidende Rolle in der strukturellen Vollständigkeit des
Proteins während der thermischen Entfaltung spielt und damit auch in der Faltung (Tab.: 2.1). Der
Vergleich der Inhibitoraktivitäten der verkürzten Proteine mit dem nativen Parvulustat ergibt für
die Varianten PL-2AA und PL-4AA eine dem Wildtyp ähnliche Aktivität. Die Variante PL-7AA
weist eine leicht verringerte Aktivität auf.
Tabelle 2.1: ...
Einfluss hydrophober Oberflächenclustern auf Stabilität und Faltung
des Parvulustats
Parvulustat besitzt in der Mitte des ersten b-Faltblatts, um die Position 22 liegend, einen
hydrophoben Oberflächencluster. Wie mit Hilfe von Substitutionsexperimenten in dieser Region
gezeigt werden konnte, ist die thermodynamische Stabilität des Parvulustats in hohem Maße von
der Bildung dieses kleinen aber wichtigen hydrophoben Kerns bestimmt. Demnach muss das b-
Faltblatt I und das b-Hairpin I eine entscheidende Rolle in der Faltung von Parvulustat spielen.
Position 22 ist in zweierlei Hinsicht für die Stabilität des Parvulustats wichtig: einerseits durch die
energetisch wichtigen Wasserstoffbrückenbindungen und zum zweiten steuert die Stelle zur
Formation des hydrophoben Kerns bei. Die Daten suggerieren, dass es auch eine
thermodynamische Kopplung zwischen dem hydrophoben Effekt und der Präsenz von
Wasserstoffbrückenbindungen geben könnte. Zumindest aus der Sicht der Stabilität ist es
eindeutig, dass interatomare Interaktionen wie Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waalsund
Dipol-Dipol-Wechselwirkungen notwendig sind, um eine stabile Bildung von b-Faltblättern
in Parvulustat und seinen Derivaten zu verwirklichen.
· Der Effekt der Proline auf die Stabilität des Parvulustats
Der Effekt der Substitution des Prolins durch Alanin an verschiedenen Positionen des Parvulustats
wurde ebenfalls untersucht. Im Ganzen betrachtet führt auch die Mehrfachsubstitution von Prolin
zu keiner nennenswerten strukturellen Veränderung im Parvulustat. Die durchgeführten
thermischen Entfaltungsexperimente bestätigen diese Beobachtungen. Alle Einzelmutanten (P5A,
P42A, P48A, P72A) zeigten eine höhere thermische Stabilität als der Wildtyp (Abb. 2.1).
Abbildung 2.1: Tm-Werte des Parvulustat-Wildtyps und seinen Prolin Mutanten.
Theoretischer Teil
-6-
Die fast gleich bleibenden Tm-Werte bzw. die Erhöhung der Stabilität des Parvulustats sind durch
die strukturelle Fluktuationen zu erklären, denn die rigide XAS-Pro-Bindung wurde durch die
flexible XAS-Ala-Bindung ersetzt.
· Der Einfluss der Disulfidbindung auf die Stabilität des Parvulustats
Der Einfluss der zwei Disulfidbrücken des Parvulustats wurde bezüglich Aktivität, spektraler
Eigenschaften sowie Stabilität untersucht. Hierfür wurden 25 Inhibitorvarianten mittels gezielter
Mutagenese gewonnen, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im natürlich vorkommenden
Parvulustat Disulfidbrücken bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Die Ergebnisse
zeigten, dass die Faltung Parvulustats ein zwei Zustand Verhalten besitzt, das außer in
Tendamistat in keinem anderen disulfid-verknüpftem Protein gefunden wurde. Dieses Verhalten
wurde durch die Entfernung von Disulfidbrücken nicht beeinflusst. Wie durch die CD- und
fluoreszenzspektroskopischen Experimente belegt werden konnte, ist die native Struktur des
Parvulustats durch die Entfernung der C43-C70-Disulfidbindung tiefgreifend verändert worden.
Passend zu den Veränderungen der Struktur haben die Mutationen schwerwiegende
Destabilisierungseffekte auf das Protein verursacht, was auch an der Erniedrigung der Freien
Gibbs Energie der Denaturierung und der Tm-Werte zu erkennen ist. Die Untersuchung des
Einflusses der Aminosäure-Substitution in den Positionen 43 und 70 auf die thermodynamische
Stabilität des Parvulustats führt zum Ergebnis, dass die Hydrophobizität und Polarität des Restes
70 einen bedeutenden Effekt auf die Stabilität des Proteins besitzt. Die Betrachtung der
thermodynamischen Daten macht deutlich, dass der Beitrag der freien Energie zur Stabilisierung
nicht nur abhängig von der eingeführten Aminosäure ist, sondern zum Teil auch von dem
strukturellen Kontext abhängt. Die Daten zeigen, dass die Substitution des Alanins an der Stelle
70 durch Leucin oder Threonin die Struktur um 0,3 bzw. 1,7 kJ/mol stabilisieren. Zusätzliche
Beiträge zum Unterschied bezüglich des ΔG°-Werts zwischen den Varianten C43AC70L/T und
C43L/TC70A können sich auch durch die unterschiedliche lokale Umgebung, wie z.B. die
Seitenketten von benachbarten Aminosäuren um die zwei Mutationsstellen ergeben. Der Tm-Wert
des Wildtyp-Proteins beträgt 82°C. Die Vergleiche dieser Größe mit der von der stabilsten
Cystein-defizitären Doppelmutante C43AC70T (47,3°C) ergibt eine Differenz von 34,7°C. Dieses
Ergebnis untermauert, dass die Disulfidbindung 2 eine extrem wichtige strukturelle Komponente
in der ungewöhnlich hohen Stabilität des Parvulustats darstellt.
Das Ziel der Arbeit war es dennoch die Daten der Stabilitäten einzelner Disulfidmutanten zu
sammeln und zu erfassen, um dadurch allgemeine Grundregeln für eine rationale Gestaltung der
Elimination beider Disulfidbrücken im Sinne einer vorhersagbaren Auswirkung auf die
Proteinstabilität zu bekommen.
Theoretischer Teil
-7-
Der Versuch ein disulfidfreies Protein in großen Mengen aus S. lividans zu isolieren, stellte sich
aber als extrem schwierig dar. Nach der Änderung des Stamms des Wirtsorganismus
(Streptomyces lividans TK23), Erhöhung der Qualität der Protoplasten und der Expressions-
Bedingungen (19°C, 150 rpm) konnten auf dem SDS-Gel stärkere Banden des Derivats
C9AC25TC43AC70T-4AA beobachtet werden. Die Expression der Mutante
C9AC25TC43AC70L-4AA konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die anschließende
Reinigung des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA des Parvulustats mittels Gelfiltration und RPHPLC
bzw. Isolierung des Proteins aus dem SDS-Gel brachte das erwünschte Produkt. Dieses
konnte mit der MALDI-Massenspektroskopie eindeutig nachgewiesen werden. Das aktive
Cystein-freie Derivat C9AC25TC43AC70T-4AA konnte auch auf dem a-Amylase Plattentest
nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Expression und der Nachweis einer
cystein-freien Variante möglich sind, dennoch haben die Ausbeuten dieses Proteins für
weiterreichende Analytik nicht ausgereicht. Demnach sind die Disulfidbrücken für die Stabilität
und Struktur des Parvulustats von enormer Bedeutung dennoch sind sie nicht zwingend
erforderlich für die Aktivität und die Expression in S. lividans.
Das Studium der Medizin umfasst eine sehr heterogene Zusammenstellung von Fächern. Die große Anzahl unterschiedlicher Leistungsnachweise im klinischen Studium macht es dabei fast unmöglich, sich auf alle Fächer intensiv vorzubereiten, so dass vom Studenten eine Auswahl getroffen werden muss. Bisher liegen keine Untersuchungen dazu vor, nach welchen Kriterien Studenten ihren Lernaufwand einteilen. Anhand der fachspezifischen Prüfungsleistungen von etwa 1000 Medizinstudenten der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt/Main mit dem Beginn des klinischen Studiums zwischen dem Sommersemester 2003 und dem Wintersemester 2005/2006 wurde untersucht, welche Korrelationen zwischen den 33 Fachnoten des klinischen Studienabschnitts vorliegen, die durch schriftliche Prüfungen ermittelt wurden. Dazu wurden die Noten der Erstprüfung verwendet, bei erst im Wiederholungsversuch bestandenen Fächern wurde für Korrelationen die Note auf 5 gesetzt. Zusätzlich wurde untersucht, ob es Unterschiede der Prüfungsleistungen zwischen den Studentenkohorten gibt, die zum Wintersemester (überwiegend Regelzeitstudenten) oder Sommersemester (keine Regelzeitstudenten) den klinischen Studienabschnitt beginnen. Für diese Berechnungen wurden alle Studenten in Kohorten zusammengefasst, die zum gleichen Zeitpunkt mit dem klinischen Studium begannen. Zur Klassifizierung von Fächern wurden diese nach inhaltlichen Gesichtspunkten zusammengefasst (internistische Fächer, operative Fächer, neurologische Fächer, Reproduktionsblock); daneben wurde eine Gruppierung nach Relevanz im Staatsexamen vorgenommen (Kernfächer des Studiums, Nebenfächer). Die Ergebnisse legen nahe, dass die Studenten kein interessensgesteuertes Lernen anwenden, wie sich an den relativ niedrigen Korrelationen zwischen inhaltlich ähnlichen Fächern zeigt. Dagegen zeigen sich hohe Korrelationen zwischen den Kernfächern des Curriculums, die eine große Fragenanzahl im Staatsexamen besitzen, sowie zwischen Fächern, die im gleichen Zeitraum gelehrt und geprüft wurden. Niedrige Korrelationen (auch negativ) wurden nur für wenige Fächer gefunden, bei denen keine inhaltliche Übereinstimmung vorliegt und offensichtlich keine Bedeutung für das Staatsexamen angenommen wird. Andererseits spricht die deutliche Korrelation zwischen Innerer Medizin und Pädiatrie dafür, dass eine inhaltliche Übereinstimmung in relevanten Fächern den Prüfungserfolg beeinflussen kann, auch wenn die Prüfungen zu unterschiedlichen Zeitpunkten stattfinden. Als Nebenergebnis wird ein deutlicher Leistungsunterschied zwischen den Kohorten gefunden, die im Wintersemester bzw. im Sommersemester ihr klinisches Studium beginnen; hierbei haben die Kohorten ohne Studenten in der Regelstudienzeit deutlich schlechtere Noten. Diese Leistungsunterschiede sind in den Kernfächern mit einer angenommenen großen Relevanz für das Staatsexamen besonders ausgeprägt. Insgesamt bestätigen die Ergebnisse die aus anderen Fächern bekannten Daten, dass von den Charaktereigenschaften nur der Parameter „Fleiß/Gewissenhaftigkeit“ mit einem schnellen, erfolgreichen Studium korreliert, während andere Persönlichkeitseigenschaften keinen Bezug zum Studienerfolg haben. Die Lernsteuerung durch Fleiß mit dem Kriterium „Prüfung zum gleichen Zeitpunkt“ steht in einem Gegensatz zur Tatsache, dass etwa 50% der Studenten bereits zum Studienbeginn genaue Vorstellungen über ihr späteres ärztliches Tätigkeitsfeld haben.
In der vorliegenden Arbeit konnten wir in den einzelnen Lipidfraktionen die gleichen Unterschiede zeigen, die bereits in anderen Untersuchungen aufgezeigt worden waren. Vor allem in den Phospholipiden, im Plasma und in den Erythrozyten ließen sich für die cis-Linolensäure (C18:2ω6c), die Arachidonsäure (C20:4ω6) und die Docosahexaensäure (C22:6ω3) Erniedrigungen beschreiben. Auch in den Cholesterylestern und den Triglyceriden, die als direkte Nahrungsfette gewertet werden können, zeigt sich diese Verteilung, so dass von einer Unterversorgung mit diesen Fettsäuren ausgegangen werden muß. Die Ergebnisse zeigen, dass bereits wenige Fettsäuren zur Beurteilung der Fettsäure-Situation bei Cystische Fibrose-Patienten ausreichen, so dass in Folgeuntersuchungen auf die Auswertung bei Cystische Fibrose-Patienten aller Fettsäuren verzichtet werden kann. Die Gruppen sollten zur Stabilisierung und besseren Reproduzierbarkeit der Werte vergrößert werden. In Folgeuntersuchungen sollte die Ernährung und der Ernährungstatus dokumentiert werde. Die Patienten in unserer Gruppe hatten alle die gleiche Mutation (ΔF 508) und waren adäquat ernährt. Im Einzelnen lässt sich jedoch nicht mehr sagen in welcher Form und Menge Fett zugeführt worden waren. Die Verteilungsmuster in den Triglyceriden und den Cholesterylestern lassen jedoch eindeutig, wie schon in der Literatur beschrieben, auf einen essentiellen Fettsäuremangel schließen. Keiner der Patienten erhielt eine zusätzliche Substitution mit ultralangkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren der ω3/ω6- Familien. Es lässt sich nur mit Hilfe der Literatur diskutieren welche Ursachen bei unseren Patienten für den essentiellen Fettsäuremangel verantwortlich sind, da unsere Arbeit lediglich eine Erhebung über den Ist-Zustand darstellt. Für die Klärung der Malabsorption müssten Untersuchungen angeschlossen werden, die mit einer Substitution von ultralangkettigen mehrfach ungesättigten Fettsäuren einhergehen. Das Membranverhalten und Rezeptorverhalten kann über die Messung der Phospholipide konkretisiert werden. Im Bezug auf die inflammatorische Antwort könnten die Leukotriene und andere Mediatoren der inflammatorischen Antwort parallel gemessen werden. Als weiteres Ergebnis zeigten sich bei den von uns untersuchten Cystische Fibrose-Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe keine oder nur in Spuren vorhandene trans-Fettsäuren.
Quasi-zweidimensionale organischen Ladungstransfersalze weisen gewisse Analogien zu den Hochtemperatur-Kupratsupraleitern (HTSL) auf. Zu nennen ist einerseits der ähnliche schichtartige Aufbau, wobei sich leitfähige und isolierende Ebenen abwechseln. Zum anderen liegt der antiferromagnetische Grundzustand in direkter Nachbarschaft zur Supraleitung und bei höheren Temperaturen wird ebenfalls die Entstehung einer Pseudo-Energielücke diskutiert. Im Gegensatz zu den HTSL können die elektronischen Eigenschaften der organischen Ladungstransfersalze jedoch leicht durch äußere Parameter wie hydrostatischen bzw. chemischen Druck - die Verwendung verschiedener Anionen X läßt sich in einem verallgemeinerten Phasendiagramm ebenfalls auf die Achse W/U abbilden, siehe Abschn. 4.2 - oder moderate Temperaturen beeinflußt werden. In den quasi-zweidimensionalen K-(BEDT-TTF)2X-Salzen ist bspw. ein moderater Druck p ~ 250 bar ausreichend, um das antiferromagnetisch-isolierende System (X=Cu[N(CN)2]Cl) auf die metallische Seite des Phasendiagramms zu verschieben, wobei dann im Grundzustand Supraleitung auftritt (Tc ~ 12,8 K). Eine Dotierung wie bei den HTSL und die damit einhergehende unerwünschte Unordnung ist nicht notwendig um einen Isolator-Metall-übergang zu induzieren. Demnach sind die experimentellen Anforderungen im Vergleich zu anderen stark korrelierten Elektronensystemen auf relativ einfache Weise zu realisieren. Auch das macht die organischen Ladungstransfersalze zu idealen Modellsystemen, um fundamentale Konzepte der theoretischen Festkörperphysik zu studieren, wovon einige bislang lediglich von akademischem Interesse waren. Erstmalig wird in dieser Arbeit die Fluktuationsspektroskopie als experimentelle Methode angewendet, um die Dynamik des TT-Elektronensystems in den quasi-zweidimensionalen organischen Ladungstransfersalzen K-(BEDT-TTF)2X bei niedrigen Frequenzen zu studieren. Ziel ist es, Informationen über die Temperatur-, Druck- und Magnetfeld-Abhängigkeit der spektralen Leistungsdichte des Widerstandsrauschens und damit über die Dynamik der Ladungsfluktuationen zu gewinnen. Insbesondere in der Nähe korrelationsgetriebener Ordnungsphänomene spielt die Dynamik der Ladungsträger eine entscheidende Rolle. Auch die Kopplung des elektronischen Systems an bestimmte strukturelle Anregungen hat Einfluß auf das Widerstandsrauschen. Zu Beginn wird eine kurze Einführung in die Signalanalyse gegeben und daran anschließend werden verschiedene Arten des Rauschens in Festkörpern dargestellt (Kap. 1). Einige der für diese Arbeit relevanten Ordnungsphänomene werden in Kap. 2 in knapper Form eingeführt, wobei auf die dynamischen Eigenschaften in der Nähe eines Glasübergangs etwas ausführlicher eingegangen wird. Nach der Vorstellung der eingesetzten Meßmethoden, des Versuchsaufbaus und der Probenkontaktierung (Kap. 3) werden die experimentellen Ergebnisse an den K-(BEDT-TTF)2X-Salzen in Kap. 4 ausführlich diskutiert.
Mit der vorliegenden Arbeit wurden zu ersten Mal die seit mehreren Jahren vorhergesagten dynamischen Aufbruchsmechanismen - der direkte, der sequentielle und der asynchrone Zerfall - in mehratomigen Molekülen kinematisch vollständig untersucht. Experimentell wurde hierfür ein Kohlenstoffdioxid-(CO2)-Molekül in langsamen Ion-Molekül Stößen dreifach ionisiert, indem die Elektronen des Targets von den langsamen, hochgeladenen Projektilionen (Ar8+-Ionen) eingefangen wurden. Die Untersuchung des Zerfalls des CO2-Ions in die einfach geladenen ionischen Fragmente C+ + O+ + O+ zeigte, dass bei diesem Zerfall das Projektilion vornehmlich einen positiven Ladungszustand von q = 6 und nicht den zunächst erwarteten Ladungszustand q = 5 aufweist. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die eingefangenen Elektronen oftmals elektronisch hoch angeregte Zustände im Projektil populieren und demnach im weiteren Verlauf über Autoionisationsprozesse dieses auch wieder verlassen können. Ähnliche Autoionisationsprozesse können auch im Target ablaufen, treten dort jedoch mit einer geringeren Wahrscheinlichkeit auf, da der Wirkungsquerschnitt für Autoionisationsprozesse im Target um einen Faktor 1,3 kleiner ist als für Autoionisationen im Projektil. Zusätzlich zeigte die Untersuchung der Stoßdynamik, dass der dreifache Elektroneneinfang primär bei einer parallelen Orientierung der Molekülachse zur Projektilstrahlachse auftritt. Eine weitere Abhängigkeit der Stoßdynamik zum Beispiel vom Stoßparameter beziehungsweise vom Streuwinkel konnte nicht beobachtet werden. Durch die koinzidente Messung aller vier Reaktionsteilchen konnte der Kanal Ar8+ + CO2 --> Ar6+ + C+ + O+ + O+ eindeutig bestimmt werden und die Reaktionsdynamik des CO2-Ions nach dem Stoß analysiert werden. Dabei tritt deutlich der direkte Aufbruch hervor, bei welchem die drei einfach geladenen Ionen sich rein aufgrund ihrer Coulombkräfte voneinander abstoßen. Bei einer solchen Coulombexplosion bleibt dem Molekülion kaum Zeit, um eine molekulare Schwingung zu vollführen. Neben diesem schnellen Zerfall konnten aber auch jene Zerfälle beobachtet werden, bei denen das Molekülion zuerst molekular schwingt und dann zu einem späteren Zeitpunkt in die ionischen Fragmente zerfällt. Dieser letztere Zerfallsprozess gehört zu den sogenannten asynchronen Zerfallsmechanismen. Er stellt einen Zwischenprozess zwischen dem reinen 1-Stufen-Prozess wie dem direkten Aufbruch und dem reinen 2-Stufen-Prozess dar. Bei solchen sequentiellen 2-Stufen Prozessen fragmentiert das CO2-Molekül im ersten Schritt in ein O+- und ein CO2+-Ion. Im zweiten Schritt dissoziiert dann das CO2+-Fragment, nachdem es nahezu keine Wirkung der Coulombkräfte des ersten Sauerstoffions mehr spürt, in ein C+- und ein O+-Ion. Durch die Darstellung der Schwerpunktsimpulse der Fragmente in Dalitz- und Newton-Diagrammen ist es mit dieser Arbeit erstmals gelungen diesen sequentiellen Prozess experimentell eindeutig nachzuweisen. In der weiteren Analyse konnte gezeigt werden, dass über die im System deponierte Energie, welche über die kinetische Energie der Fragmente bestimmt wird, die verschiedenen Reaktionsmechanismen direkt kontrolliert werden können. Speziell bei Energien unterhalb von 20 eV wurde gezeigt, dass es keine Potentialflächen gibt, die über einen direkten bzw. simultanen Aufbruch zu dem Endzustand C+ + O+ + O+ führen. Bei mehratomigen Molekülen erweist sich das Treffen detaillierter Aussagen über mögliche Dissoziationskanäle ohne die genaue Kenntnis der Lage der Potentialflächen und den Übergängen zwischen diesen als äußerst schwierig. Selbst bei genauer Kenntnis der Lage und Form der Potentialflächen, ist es aufgrund der hohen Dichten innerhalb der Übergangsbereiche der Potentialflächen nahezu unmöglich, den Verlauf der Dissoziationskanäle zu verfolgen. Mit dieser Arbeit ist es gelungen, die verschiedenen Reaktionskanäle ohne die Existenz von Energiepotentialflächen eindeutig zu identifizieren. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Energie, die während des Stoßes im Molekül deponiert wird, eine Schlüsselgröße darstellt, mit welcher die Fragmentationskanäle direkt kontrolliert werden können.
Ziel der vorliegenden experimentellen Untersuchung war die Erfassung und vergleichende Beurteilung der mechanischen Belastbarkeit sowie des Frakturverhaltens von karbonfaserverstärkten, keramischen und palladiumfreien Wurzelstiftsystemen. Des Weiteren galt es, die Ergebnisse im Vergleich zum Permador®-Stift, dessen Bewährung in einer vorangegangenen klinischen Untersuchung nachgewiesen wurde, und zu wurzelgefüllten Zähnen zu überprüfen. Gegenstand der Untersuchung waren der palladiumhaltige Permador®-Stift, die palladiumfreien Stiftaufbausysteme AF1, ER® Pt-IR, die keramischen Stifte Cerapost®, Celay® Alumina und Celay® Zirkonia sowie der Karbonfaserstift Composipost®. Als Kontrollgruppe dienten wurzelgefüllte, nicht stiftversorgte Wurzeln. Um die Streuung der Messwerte, die durch die individuell unterschiedliche Dimensionierung und Morphologie von extrahierten natürlichen Frontzähnen beeinflusst werden, zu minimieren, fanden künstliche Zähne aus dem lichthärtenden BisGMAKomposit Estilux hybrid VS posterior (Heraeus Kulzer, Wehrheim/Ts.), Verwendung. Dessen Elastizitätsmodul beträgt nach Aushärtung 19.000 MPa und entspricht somit dem Wert des natürlichen Dentins. Die Herstellung der Wurzeln, Aufbauten und Kronen fand mit sogenannten Modeln statt, wodurch die Herstellung identischer Prüfkörper gewährleistet wurde. Als Aufbaumaterial fand für die metallischen Stiftsysteme ein Phantom-Metall, für das Cerapost®- und Composipost®-System ein Komposit und für die kopiergefrästen Systeme Celay® Alumina und Celay® Zirkonia-Keramik Verwendung. Sämtliche Stiftverankerungen wurden, nach Konditionierung mit dem Rocatec®-Verfahren, mit Panavia® 21 in den Wurzeln zementiert. Im Anschluss erfolgte die Zementierung standardisierter Kronen aus Phantommetall auf allen Wurzeln. Die zyklische Wechselbelastung (1,2x106 Zyklen; 1,4 Hz und 30 N) wurde im Willytec-Kausimulator Version 3.1. (Fa. Willytec, München) vorgenommen. Die Simulation der Wurzelhaut für die Wechsel- und die Bruchbelastung wurde durch Einbettung der Wurzeln in einem Elastomer (Permadyne® Garant; Espe, Seefeld) vorgenommen. In einer Universal-Prüfmaschine (Zwicki 1120; Zwick, Ulm) (Vorschubgeschwindigkeit 0,5 mm/min) wurden die Versuchszähne palatinal, 2 Millimeter unterhalb der Inzisalkante, unter einem Winkel von 135° bis zum Bruch der Wurzel belastet. Hinsichtlich der Bruchlast ergaben die Medianwerte folgende Resultate: Metallstifte: Permador®: 475,4 N; AF1: 444,7 N; ER Pt-Ir: 422,4 N. Der KRUSKAL-WALLIS-Test mit BONFERRONI-Korrektur (p ≤ 0,05) zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen diesen drei Stiftsystemen einerseits und der Kontrollgruppe andererseits. Für die keramischen Stifte wurden 432,2 N [Celay® Alumina], 488,8 N [Celay® Zirkonia] bzw. 416,4 N [Cerapost®] und für den Karbonfaserstift [Composipost®] 515,7 N ermittelt. Bei der Kontrollgruppe trat eine Bruchlast von 363,4 N auf. Bezüglich der Bruchlastwerte lagen unter Berücksichtigung des BONFERRONI-Tests bei der statistischen Datenanalyse zwischen dem kopiergefrästen Keramikstiftaufbau Celay® Zirkonia aus zirkoniumoxidverstärkten Al2O3 einerseits bzw. dem Karbonfaserstift Composipost® und der Kontrollgruppe andererseits signifikante Unterschiede vor (p ≤ 0,05). Die ermittelten Distanzen zwischen Kraftangriffspunkt und den oberen Bruchspaltenden ergaben Medianwerte von 8,0 mm bis 11,1 mm auf der vestibulären Seite und 7,6 mm bis 14,7 mm auf der palatinalen Seite der Wurzeloberfläche. Bezüglich der Distanzen der Frakturverläufe lagen unter Berücksichtigung des BONFERRONI-Tests bei der statistischen Datenanalyse nur palatinal zwischen dem Cerapost®-Stift einerseits und dem Celay® Alumina-Stift und der Kontrollgruppe andererseits signifikante Unterschiede vor. Die vorliegende Studie zeigt, dass hinsichtlich der Bruchlastwerte nach dynamischer Belastung der Karbonfaserstift Composipost® und, bei hohen ästhetischen Ansprüchen, der kopiergefräste Keramikstift Celay® Zirkonia als interessante Alternative zum klinisch bewährten Permador®-Stift zu sehen sind. Des Weiteren zeigt die Untersuchung, dass sich die Verwendung palladiumfreier Stiftsysteme nicht nachteilig auf das Bruchverhalten nach dynamischer Belastung auswirkt.
Funktionelle Analyse der Helper-Component Proteinase (HC-Pro) aus Zucchini Yellow Mosaic Virus
(2010)
In dieser Arbeit wurde der Einfluss einer Punktmutation der ZYMV HC-ProFINK auf die RNA Silencing Suppressor-Aktivität und die miRNA-Akkumulation in N. benthamiana-Pflanzen untersucht. Dabei konnte eine RNA Silencing Suppressor-Aktivität der HC-ProFINK nachgewiesen werden. Sowohl die HC-ProFRNK als auch die HC-ProFINK zeigten in vivo keinen Einfluss auf die Änderung der miRNA-Mengen in N. benthamiana-Pflanzen. Untersuchungen der in vitro sRNA-Bindung mit rekombinanten HC-Pro-Proteinen aus Pflanzen führte zu einer Bindung von 21 bp siRNAs und miRNAs durch die HC-ProFRNK, wobei kein Einfluss zwischen der Anzahl und Lage der Basenfehlpaarungen der miRNAs und der Bindungskapazität identifiziert werden konnte. Diese Bindung ist vermutlich abhängig von der Sequenz der miRNAs. Die Mutation von HC-ProFRNK zu HC-ProFINK bewirkte dagegen den Verlust der Bindung von kleinen RNA-Molekülen. Die HC-Pro Proteine konnten rekombinant mit einem N-terminalen Fusionsprotein exprimiert und gereinigt werden. Die funktionelle Analyse des MBP-HA-HC-ProFRNK-Proteins wies eine längenspezifische Bindung von 21 bp siRNAs auf. Die Analyse der in vitro Bindung von unterschiedlichen miRNAs aus A. thaliana und Mensch durch das rekombinante HC-ProFRNK-Protein aus Bakterien zeigte keinen Zusammenhang zwischen der Anzahl und Lage der Basenfehlpaarungen in den miRNAs und der Bindekapazität. Die Mutation im MBP-HA-HC-ProFINK-Protein führte zum Verlust der sRNA-Bindung. Diese Ergebnisse bestätigten die Beobachtungen der Gelshift-Analysen mit den rekombinanten HC-Pro-Proteinen aus Pflanzen. Durch die Fraktionierung eines A. thaliana-Proteinextrakts konnte ein nicht näher beschriebenes Protein unbekannter Funktion, welches eine Cupin-Domäne (QP) besitzt, identifiziert werden. Dies hat einen Einfluss auf die in vitro Bindung von sRNA-Molekülen durch die HC-Pro. Eine funktionelle Analyse des Trx-QP-His-Proteins mit Hilfe von Gelshift-Analysen nach der Expression in Bakterien und Reinigung zeigte einen konzentrationsabhängigen verstärkenden Effekt der siRNA Bindung durch das rekombinante MBP-HA-HC-Pro-Protein. Die Zugabe eines fraktionierten N. benthamiana-Proteinextrakts zur in vitro Bindungsreaktion führte ebenfalls zu einer verstärkten siRNA-Bindung durch die HC-Pro; Proteinextrakte von N. tabacum und der ZYMV Wirtspflanze Zucchini zeigten jedoch keinen Effekt. Die ZYMV HC-Pro besitzt eine von der TEV HC-Pro abweichende proteolytisch aktive Domäne. Durch eine rekombinante Expression des MBP-HA-HC-Pro-GFP-Fusionsproteins in Bakterien und Deletionsanalysen konnten zwei kritische Aminosäuren im C-terminalen Bereich der HC-Pro identifiziert werden. Eine Deletion der AS Asn-353 oder Glu-356 führte zum vollständigen Verlust der autoproteolytischen Aktivität des Proteins. Ein Austausch der AS Gly-456 innerhalb der Schnittstelle sowie eine N-terminale Deletion von 93 AS der HC-Pro hatten dagegen keinen Einfluss auf die autoproteolytische Aktivität. Mit Hilfe einer N-terminalen Sequenzierung des C-terminalen Spaltproduktes des MBP HC Pro mut C7-GFP, welches vermutlich in Folge einer Spaltung durch bakterielle Proteasen entsteht, sollten durch Deletionsmutanten die kritischen Aminosäuren für die Spaltung untersucht werden. Eine Deletion der konservierten AS Thr-146 von ZYMV HC-Pro sowie der flankierenden AS Val-145 bzw. Gln-147 hatte jedoch keinen Einfluss auf die Spaltung der HC-Pro. Dies deutet darauf hin, dass die Schnittstelle der Protease von deren Erkennungssequenz abweicht. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse zeigen, dass die ZYMV HC-Pro neben der sRNA-Bindung einen weiteren Mechanismus besitzt, um die Funktion als RSS auszuüben. Weitere Analysen sind nötig, um die Interaktion mit pflanzlichen Komponenten zu identifizieren und den Einfluss auf den RNA Silencing-Mechanismus aufzuklären.
Für eine erfolgreiche Gentherapie ist zunächst ein effizientes Gentransfersystem nötig, das das Transgen in möglichst vielen Zellen einbaut und es aktiv hält. Damit sich dann der Anteil der geschützten Zellen vergrößert, muss eine Selektivität der genmodifizierten Zellen gegenüber den nativen Zellen gegeben sein, wobei die Sicherheit nicht außer Acht gelassen werden darf, da ein ungünstiger Einbau des Transgens eine Insertionsmutagenese und somit Tumoren induzieren kann. Der durch die Arbeitsgruppe von Laer entwickelte retrovirale Vektor M87o codiert den membranständigen Fusionsinhibitor maC46 (membran-anchored C-Peptid 46), der den Eintritt von HIV (Human Immunodeficiency Virus) in die Zielzelle effektiv verhindert. Diese Gentherapie mit M87o wurde in einer klinischen Studie an T-Lymphozyten von 10 weit fortgeschrittenen AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome)-Patienten durchgeführt, wobei die Therapie gut verträglich war und keine Toxizität zeigte. Allerdings hatten die Patienten auch keinen klaren Vorteil von der Therapie. In der vorliegenden Arbeit wurden SIN Vektoren (Self-inactivating Vektoren) in 5 verschiedenen Konstruktionen getestet, um die optimale Vektordesign zu ermitteln und eine langfristige hohe Expression zu ermöglichen. Da die SIN Vektoren im Vergleich zu konventionellen gammaretroviralen Vektoren ein geringeres Risiko bezüglich der Insertionsmutagenese aufweisen, stellen sie ein sichereres Vektorsystem dar. Um eine bessere Transgenexpression zu erzielen, wurde in den SIN Vektoren entweder ein zellulärer Promotor oder ein viraler SFFV (spleen focus forming virus) als internen Promotor verwendet. Zusätzliche regulatorische Elemente, wie wPRE (Woodchuck Posttranscriptional Regulatory Element), cHS4 (chicken Hypersensitive Site) Insulator und SAR (Scaffold Attachment Region) Element wurden dann in unterschiedlichen Kombinationen zu stärkeren und langanhaltenden Expressionen integriert, wobei wPRE die RNA Prozessierung verbessert und somit die RNA Stabilität erhöht und SAR und cHS4 Insulator dem Silencing entgegenwirken und so die Expression aufrechterhalten. Diese fünf SIN Konfigurationen wurden untereinander und mit dem klassischen gammaretroviralen Vektor M87o bezüglich des Titers, der Expressionsstärke und der Langzeit-Genexpression verglichen. Dazu wurden zunächst humane T-Zelllinien PM-1 und primäre humane T-Zellen als Testzellen verwendet. Die Versuche wurden dann mit murinen T-Zellen wiederholt, die in die immundefiziten Mäuse transplantiert wurden, um die Genexpression in vivo weiter zu verfolgen. Die SIN Konstrukte zeigten jedoch eine deutlich schwächere Expression als die LTR (Long Terminal Repeat)-getriebene Vektoren und nur ein Konstrukt mit dem viralen Promotor und wPRE zeigte eine annähernd so hohe Expression wie die konventionellen Vektoren. Während der virale SFFV Promotor eine höhere Expressionsstärke gegenüber dem zellulären EF1α (Elongationsfaktor 1 alpha) Promotor zeigte, hatte der cHS4 Insulator nur geringfügige Einflüsse sowohl auf den Titer als auch auf die Expressionsstärke. Der Vektor mit dem SAR-Element zeigte zwar die geringsten Titer und Expressionsstärke, aber in Langzeitbeobachtung wies er sowohl in vitro als auch in vivo eine relativ konstante Anzahl von transgenpositiven Zellen auf. SIN Vektoren, in denen mit einer Kombination von wPRE und SAR-Element die RNA Prozessierung verbessert und das methylationsbedingte Silencing verhindert wird, könnten eine weitere Optimierungsmöglichkeit des Gentransfersystems bei der Gentherapie darstellen.
Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die Dynamik des Retinalchromophors in archaealen, bakteriellen sowie eukaryotischen Retinalproteinen zeitaufgelöst zu untersuchen und so Informationen über die unterschiedlichen lichtgesteuerten zyklischen Reaktionen zu erhalten. Für das bakterielle Proteorhodopsin (PR) wurde die Primärdynamik im sichtbaren Spektralbereich unter D2O-Bedingungen bei unterschiedlichen pD-Werten untersucht. Es zeigte sich, dass das isomerisierte K-Photoprodukt mit zwei Zeitkonstanten im Bereich von 1 ps und 20 ps gebildet wird. Der Vergleich mit Messungen in H2O erlaubte es den kinetischen Isotopeneffekt für die Deaktivierung des S1-Zustandes zu berechnen. Die Ergebnisse weisen dabei auf unterschiedliche Wasserstoffbrückenmuster unter sauren und alkalischen Bedingungen hin. Um diesem Resultat weiter nachzugehen, wurde die D97N-Mutante untersucht, bei der der primäre Protonenakzeptors ungeladen vorliegt. Die gefundene Primärdynamik von PR D97N läuft nur unwesentlich langsamer ab als die des Wildtyp-Proteins bei pD 6,4. Um weitergehende Einsichten in die Primärdynamik von PR zu erlangen, wurden am Wildtyp-Protein sowie der D97N-Mutante transiente Absorptionsmessungen im Bereich der C=C- und C=N-Schwingung des Retinals durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass die Quantenausbeute der K-Bildung unabhängig vom pD-Wert ist. In einem weiteren Schritt wurde der Einfluss des hochkonservierten His-75 auf die Isomerisierungsdynamik untersucht. Hierfür wurden die Mutanten H75N und H75M verwendet. Die Kurzzeitmessungen lassen keinen ausgeprägten Einfluss auf die Isomerisierungsdynamik erkennen. Auch der nachfolgende Teil des Photozyklus war im Blickpunkt dieser Arbeit. Die Tieftemperaturstudien im sichtbaren Spektralbereich erlaubten das in kinetischen Messungen nicht beobachtete M-Intermediat des sauren Photozyklus nachzuweisen. Um strukturelle Einblicke in den Photozyklus zu erlangen und die am Pumpvorgang beteiligten Aminosäuren zu identifizieren, wurden nachfolgend Tieftemperaturuntersuchungen im infraroten Spektralbereich durchgeführt. Die Implementierung eines Faserspektrometers in den Strahlengang des FTIR-Aufbaus erlaubte hierbei die simultane Aufnahme der lichtinduzierten Änderungen der Bandenposition im sichtbaren Spektralbereich und der Änderungen der Proteinstruktur sowie der Seitenketten. Für den M-Zustand bei pH 5,1 konnte gezeigt werden, dass auch hier eine Aspartat- oder Glutamat-Seitenkette als Protonenakzeptor fungiert. Weiterhin konnte dargelegt werden, dass der Photozyklus von PR nicht nur vom pKa-Wert des Protonen-akzeptors Asp-97 abhängt, sondern von einem Zusammenspiel mehrerer pH-abhängiger Gleichgewichte, da schon kleinste Änderungen des pH-Werts im Bereich des pKa großen Einfluss auf die beobachteten Differenzspektren sowie die Dynamik haben. Auch für das in jüngster Vergangenheit zur optogenetischen Kontrolle neuronaler Netze eingesetzte eukaryotische Retinalprotein Channelrhodopsin-2 (ChR-2) wurden umfangreiche Photozyklusstudien durchgeführt. Mit Hilfe von transienter Absorptionsspektroskopie im Sichtbaren sowie der Fluoreszenz-aufkonvertierung konnte gezeigt werden, dass der angeregte Zustand monoexponentiell mit 0,4 ps zerfällt. Die Reaktion setzt sich mit einem Kühlprozess und kleineren Änderungen der Linienbreite des K-Photoprodukts fort. Durch die schnelle Deaktivierung des angeregten Zustands war es zudem möglich die direkten Auswirkungen der Retinalisomerisierung auf die Proteinumgebung zu beobachten. Die Vielzahl ausgeprägter Differenzbanden zeigte hierbei, dass neben der schnellen Isomerisierung auch der Energietransfer der im Retinal gespeicherten Überschussenergie an das Protein sehr effizient ist. Über Blitzlichtphotolyseexperimente konnte die Langzeitdynamik des ChR-2-Photozyklus erstmals mit einer sub-µs-Zeitauflösung charakterisiert werden. Neben der für Retinalproteine typischen Abfolge von blau- und rot-verschobenen Intermediaten, ist der Photozyklus mit einer Dauer von etwa 5 s signifikant langsamer als der gemeinhin schon langsame Zyklus der sensorischen Retinalproteine. Um die Aktivierungs-barrieren des ChR-2-Photozyklus zu untersuchen, wurden weiterhin temperaturabhängige Messungen durchgeführt. Diese ergaben, dass der Photozyklus durch entropische Faktoren bestimmt wird. In einem letzten Ansatzpunkt wurde die Imidazol-Abhängigkeit der Langzeitdynamik des ChR-2-Photozyklus untersucht. Es zeigte sich, dass die Dynamik um die De- und Reprotonierung stark von diesem externen Donor beeinflusst wird. Es wurde jedoch nicht nur eine Beschleunigung der Reprotonierungsreaktion beobachtet, sondern auch der molekulare Mechanismus scheint sich nach Zugabe von Imidazol geändert zu haben. Diese Effekte können am ehesten durch eine Verstärkung des Histidin-Donor-Effekts durch das strukturell verwandte Imidazol erklärt werden. Genau dieser Einfluss externer Donor-Moleküle stand ebenfalls in einer Kurzzeit-Studie archaealer Retinalproteine im Fokus. Vorausgegangene Studien konnten zeigen, dass die Zugabe von Azid-Anionen die Isomerisierungsdynamik sowie den nachfolgenden spektral stillen Übergang der Protonenakzeptor-mutante von SRII D75N beeinflusst. Die vorliegende Arbeit stellte heraus, dass dieser Effekt ein einzigartiges Merkmal dieser Mutante ist. Abschließend wurde überdies die Bedeutung des in der Zelle in 2:2-Stöchiometrie beobachteten Transducerkomplexes auf die Primärreaktion von SRII untersucht. Es zeigte sich, dass dieser keinen Einfluss auf die Isomerisierungsdynamik aufweist, was eine wichtige Information bezüglich der Signalweitergabe sensorischer Retinalproteine ist.
Die wichtigste Aufgabe der mitotischen Spindel ist die genaue Segregation der duplizierten Chromosomen in der Mitose. Diese dynamische Struktur wird von sich teilenden Zellen gebildet, um die Bewegung der Chromosomen, das Markenzeichen der Mitose, zu dirigieren. Trotz aller Unterschiede in Form und Größe der Spindeln unterschiedlicher Zelltypen, haben alle eukaryontischen Spindeln fundamentale strukturelle Eigenschaften gemeinsam. Eine der wichtigsten Eigenschaften ist die bipolare Symmetrie. Innerhalb der Spindel sind unterschiedliche Klassen der Mikrotubuli vorhanden, die durch ihre Organisation und durch ihre dynamischen Eigenschaften unterteilt sind. Alle Klassen der Mikrotubuli zeigen dynamische Instabilität. Dennoch weisen die Kinetochor-Mikrotubuli und die Spindel-Mikrotubuli zusätzlich ein anderes Verhalten auf, das als polwärts gerichteter Mikrotubuli-Flux ("Poleward Microtubule Flux") bezeichnet wird. Dabei werden die Tubulin-Untereinheiten stetig an den Plus-Enden der Mikrotubuli eingefügt und dann zu den Minus-Enden getragen, wo sie abgebaut werden. Dieser polwärts gerichtete Mikrotubuli-Flux ist für die Segregation der Chromosomen von großer Bedeutung. Mehrere regulatorische Proteine der Mikrotubuli, einschließlich der destabilisierenden und der depolymerisierenden Proteine, steuern die Dynamik dieser Mikrotubuli, um eine fehlerfreie Bildung der Spindel und eine korrekte Segregation der Chromosomen gewährleisten zu können. Die Kinesin-13 Familie der Depolymerasen gehört zu den prominentesten Modulatoren der Dynamik der Mikrotubuli. Das am Besten charakterisierte und intensiv studierte Mitglied dieser Familie ist das Protein KIF2C/MCAK. Aufgrund der unterschiedlichen Lokalisationen von MCAK während der Mitose, an den Spindelpolen, an den Chromosomen-Armen, an den Centromeren/Kinetochoren, kann MCAK eine Reihe an wichtigen Funktionen erzielen. Allerdings bleibt die Korrektur von Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen die wichtigste Aufgabe von MCAK während der Mitose. Diese wesentliche Funktion steht unter der Kontrolle von Aurora B. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass MCAK während der Mitose auch von einem wichtigen Komplex, dem Cyclin B1/CDK1 Komplex, reguliert wird. In der Tat steuert die Kinase CDK1 sowohl die Lokalisation als auch die katalytische Aktivität von MCAK. Mit Hilfe einer systematischen Reihe an Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass MCAK sowohl in vitro als auch in vivo von CDK1 phosphoryliert wird. CDK1 phosphoryliert den katalytischen Bereich von MCAK genau am Threonin 537 und führt zu einer deutlichen Abnahme der Depolymerisierungsaktivität von MCAK in vitro und in humanen Zellen. Diese Inhibition erfolgt wahrscheinlich durch eine Reduzierung der Affinität von MCAK zu den Mikrotubuli-Enden. Die Expression der Phosphostatus-vortäuschenden Mutante T537E in HeLa-Zellen verursachte eine fehlerhafte Verteilung der Chromosomen in der Mitose. Die Chromosomen waren in Anwesenheit der T537E Mutante nicht mehr in der Lage, sich auf der Metaphaseplatte anzuordnen. Darüber hinaus führte die Expression von T537E zu einer signifikanten Reduzierung des centromerischen Abstandes, was auf eine Anhäufung von Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen hindeutet. Ferner zeigt die Expression der nichtphosphorylierbaren Mutante T537A in den HeLa-Zellen eine verstärkte Lokalisation an den Spindelpolen, was zum Auftreten von erheblichen Spindel-Aberrationen führte. Basierend auf den Daten der vorliegenden Arbeit wurde ein Modell entwickelt, in dem die Phosphorylierung von MCAK durch CDK1 früh in der Mitose stattfinden muss, um einerseits MCAK zu inaktivieren und andererseits diese Depolymerase aus den Spindelpolen zu verdrängen. Beide Ereignisse sind für den Aufbau einer bipolaren Spindel unentbehrlich. Zu späteren Zeitpunkten der Mitose muss das Threonin 537 dephosphoryliert werden, um eine Reaktivierung von MCAK an den Centrosomen/Kinetochoren zu ermöglichen. Dies wird die Korrektur-Funktion für Kinetochor-Mikrotubuli Fehlverknüpfungen von MCAK wiederherstellen, was eine korrekte Anordnung der Chromosomen auf der Metaphaseplatte fördert.
Die Zelle repliziert ihre DNA während der S-Phase und segregiert sie dann später in der M Phase des Zellzykluses. Kommt es während dieser Prozesse zu DNA Schädigungen, arretiert die Zelle den Zellzyklus mit Hilfe spezifischer Kontrollmechanismen und versucht den Schaden zu beheben. Der DNA Kontrollpunkt wird bei DNA Schädigungen aktiviert, um mit Hilfe der DNA Reparatur den Schaden zu beheben und somit dafür zu sorgen, dass die DNA fehlerfrei repliziert werden kann. Der zweite Zellzyklus Kontrollpunkt, der Spindel Kontrollpunkt, stellt sicher, dass die Chromosomen während der M Phase unter gleicher Spannung innerhalb der Äquatorialplatte der Metaphase Spindel angeordnet sind. Kann in der Zeit, in der der Zellzyklus Kontrollpunkt aktiv ist, der Schaden nicht behoben werden, so wird Apoptose ausgelöst und die Zelle wird aus dem Zellverband entfernt. Krebszellen haben Strategien entwickelt, Zellzyklus Kontrollpunkte zu umgehen und darüber hinaus normalen Mechanismen der Apoptose zu entkommen. Die genauen molekularen Vorgänge der Deregulierung der Apoptose sind weitestgehend unaufgeklärt. Procaspase 8 ist ein wichtiges Schlüsselenzym des extrinsischen Apoptose Signalweges. Der extrinsische Signalweg wird extrazellulär über die Bindung von Liganden an ihre korrespondierenden Rezeptoren ausgelöst. In dieser Studie wird gezeigt, dass Procaspase 8 an Ser-387 in vitro als auch in vivo von Cdk1/Cyclin B1 phosphoryliert wird. Darüber hinaus zeigt diese Phosphorylierungsstelle die typische Struktur einer Bindungsstelle für Plk1, einer weiteren mitotischen Kinase. Die Interaktion von Procaspase 8 mit Cdk1/Cyclin B1 wird über die DE Domäne („death-effector-domain“ DED) von Procaspase 8 vermittelt. Wird Procaspase 8 an Ser 387 zu Alanin (S387A) mutiert, so wird die Phosphorylierung durch Cdk1/Cyclin B1 fast vollständig verhindert. Wird zudem diese Mutante (S387A) in humanen Krebszellen überexprimiert, so hemmt dies die Apoptose nach Stimulation des Fas Rezeptors. Wird umgekehrt Cyclin B1 mittels RNA Interferenz depletiert und dadurch Cdk1 nicht aktiviert, wird extrinsische Apoptose verstärkt. Diese Studie zeigt erstmals eine gezielte Inhibierung des extrinsischen Apoptose Signalweges durch mitotische Kinasen und schlägt ein Modell vor, in dem Serin/Threonin Kinasen extrinsische Apoptose inhibieren und somit der Tumorzelle ermöglichen, der Apoptose zu entkommen. Darüber hinaus wird ein neuartiger Mechanismus der Inhibition der autokatalytischen Spaltung von Procaspase 8 durch eine mitotische Kinase gezeigt.
Tauopathien sind eine Gruppe von neurodegenerativen Erkrankungen zu denen auch die Alzheimer Demenz zählt, die als gemeinsames pathologisches Merkmal die intrazelluläre Akkumulation von neurofibrillären Bündeln (NFTs) aufweisen. Diese bestehen aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein, das hierdurch seine physiologische Funktion, die Assemblierung von Mikrotubuli zu fördern und diese zu stabilisieren, verliert. Der genaue Mechanismus, der bei diesen Erkrankungen zur Neurodegeneration führt und mit Demenz, Parkinsonismus und motorischen Störungen einhergehen kann, ist bisher weitgehend ungeklärt. Da mitochondriale Dysfunktion bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen eine entscheidende Rolle spielt, wurde in der vorliegenden Arbeit anhand eines Zellmodells zum Einen der Effekt durch die Überexpression von gesundem Wildtyp-Tau (hTau40) und zum Anderen die Auswirkungen der P301L-Mutation, wie sie auch bei der frontotemporalen Demenz mit Parkinsonismus (FTDP-17) auftritt, auf die mitochondriale Morphologie und Funktion untersucht. Die grundlegende Charakterisierung deckte eine weitreichende Einflussnahme von Tau auf den Energiestoffwechsel der Zellen auf. Die Überexpression von Tau führt zu einer verminderten Expression der Komplexe I, II und IV sowie einer veränderten Aktivität der mitochondrialen Atmungskettenkomplexe I-III. Zudem weist die verminderte Aktivität der Citrat-Synthase auf eine Beeinträchtigung des Citratzyklus hin. Der maßgebliche Unterschied zwischen den Tau überexprimierenden Zellen besteht in dem deutlich erniedrigtem Gehalt (NADH:HAR-Aktivität) und der drastisch erniedrigten Aktivität (NADH:DBQ-Aktivität) von Komplex I in den TauP301L-Zellen, wohingegen die hTau40-Zellen trotz eines vermindertem Gehalts im Vergleich zu den Kontroll-Zellen eine deutlich erhöhte Aktivität (DBQ/HAR-Aktivität) aufweisen. Diese gegensätzliche Aktivität von Komplex I führt zu weitreichenden Veränderungen der Zellphysiologie, was sich am deutlichsten in der daraus resultierenden metabolischen Aktivität (NADH-Spiegeln), den ATP-Spiegeln und dem mitochondrialen Membranpotential zeigt. Diese Parameter sind in den hTau40-Zellen aufgrund der hohen Komplex I-Aktivität erhöht und in den TauP301L-Zellen entsprechend erniedrigt. Ebenso spiegeln sich diese funktionellen Parameter in der veränderten Morphologie, Dynamik sowie der Ultrastruktur der Mitochondrien wieder. Die Cristae-Struktur sowie die Dichte der Matrix lassen eindeutige Rückschlüsse auf die aus den unterschiedlichen Komplex I-Aktivitäten resultierenden ATP-Spiegel zu. Weiterhin gibt es in der Literatur Hinweise, dass zum Einen die Transportrichtung der Mitochondrien von der Affinität der Motormoleküle von dem ATP-Gehalt der Mitochondrien abhängig zu sein scheint und zum Anderen, dass die Hemmung von Komplex I zu einem retrograden Transport und perinukleären Morphologie der Mitochondrien führt. Dies konnte ebenfall in den TauP301L-Zellen gezeigt werden. Zusätzlich sind hier die mitochondriale Bewegung sowie die Dynamik (Fusion und Fission) verringert. Interessanterweise spiegeln viele der funktionellen und strukturellen Veränderungen der TauP301L-Zellen den Alterungsprozess wieder, da es im Alter zu einer erhöhten Rate an oxidativen mtDNA-Schäden, einer verminderten Aktivität von Komplex I sowie zu einer verringerten Effektivität und Kapazität der oxidativen Phosphorylierung kommt, die in niedrigeren ATP-Spiegeln resultiert. Anhaltspunkte aus der Literatur bringen auch die morphologischen und dynamischen Veränderungen der Mitochondrien mit dem Alterungsprozess in Verbindung, wodurch das in dieser Arbeit verwendete Zellmodell anscheinend den Alterungsprozess widerspiegelt, der bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen den Hauptrisikofaktor für die Erkrankung darstellt. Die Mutation P301L führt weiterhin dazu, dass die Zellen eine erhöhte Vulnerabilität gegenüber sekundären Insulten aufweisen. Obwohl die Toxizität der einzelnen Stimuli – seien es nun Inhibitoren der einzelnen Atmungskettenkomplexe oder oxidativer sowie nitrosativer Stress – sich unterschiedlich auf die gemessenen physiologischen Parameter der Zellen auswirkte, so zeigt sich durchgängig bei den TauP301L-Zellen ein stärkerer Abfall der metabolischen Aktivität und der ATP-Spiegel. Zudem führte die Überexpression von hTau40 zu einer geringeren Vulnerabilität gegenüber den sekundären Insulten. Trotz der geringen Auswirkungen von oligomerem und fibrillärem Aß1-42 auf die mitochondriale Funktion der SH-SY5Y Zellen kann nicht ausgeschlossen werden, dass in vivo nicht doch ein Teufelskreislauf besteht, sodass sich die Toxizität von Aß und Tau potenziert. Insgesamt machen die Ergebnisse dieser Arbeit deutlich, dass mitochondriale Dysfunktion auch bei Tauopathien eine entscheidende Rolle in der Pathogenese spielt und sich hierdurch neue Aspekte zur therapeutischen Intervention ergeben.
Gemeinsam ist den Autoimmunendokrinopathien, dass genetische Faktoren als auch Umweltfaktoren für die Ätiologie von Bedeutung sind. Das Vererbungsschema dieser genetischen Prädispositionsfaktoren ist komplex und schließt mehrere Kandidatengene ein. Besonders die HLA-Gene wurden eingehend in den letzten Jahren untersucht. Sie stellen einen wichtigen Risikofaktor für die Entstehung von Autoimmunendokrinopathien dar. Allerdings ist für keinen der bekannten Autoimmunendokrionopathien die genetische Prädisposition, die durch die HLA-Region vermittelt wird, weder ausreichend noch notwendig für die Entwicklung der Erkrankung. So nehmen weitere Kandidatengene eine bedeutende Rolle in der Entstehung von Autoimmunendokrinopathien ein. In den letzten Jahren haben Studien gezeigt, dass diejenigen Mechanismen des Immunsystems, die zur Erhaltung der peripheren T-Zell-Toleranz beitragen, essentiell für die Kontrolle von autoreaktiven T-Zellen sind. Die Elimination bzw. die Störung solcher Mechanismen kann somit in einer Autoimmunerkrankung münden. Folglich sind Gene, die Einfluss auf diese Mechanismen der peripheren Toleranz ausüben, eindeutige Prädispositionsfaktoren für die Entstehung von Autoimmunerkrankungen. CTLA-4 ist ein essentielles inhibitorisches Regulatormolekül für T-Zellen. In vivo- und In vitro- Untersuchungen haben gezeigt, dass CTLA-4 eine bedeutende Rolle in der Regulation von Selbsttoleranz einnimmt. Damit ist CTLA-4 ein entscheidendes Suspezeptibilitätsgen für Autoimmunität im Allgemeinen und könnte insbesondere für die T-Zell-vermittelten Autoimmunendokrinopathien bedeutend sein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nach einem Zusammenhang dieses Genortes mit Typ 1 Diabetes mellitus, Morbus Addison, Hashimoto-Thyreoiditis und Morbus Basedow in der kaukasischen Bevölkerung geforscht. Bei der Suche nach einer Assoziation zwischen CTLA-4 Polymorphismen und Typ 1 Diabetes mellitus zeigt sich eine signifikante Assoziation des -MH30 C/G - und -1661 A/G - Polymorphismus sowie des +49 A/G Exon 1- Polymorphismus des CTLA-4 Gens mit Typ 1 Diabetes mellitus. Beim Polymorphismus –MH30 C/G des CTLA-4 Gen zeigt sich ein signifikant gehäuftes Auftreten des Allels „G“ bei Patienten, die an Typ 1 Diabetes mellitus erkrankt sind. Dabei vermittelt das Allel „G“ bei der Allelfrequenzanalyse - wie auch bei der Genotypenanalyse ein signifikant erhöhtes Diabetes-Risiko. Das Allel „C“ hingegen ist signifikant seltener an Patienten und scheint somit eher protektiv gegen Typ 1 Diabetes mellitus zu wirken. Bei der Untersuchung des -1661 A/G Polymorphismus des CTLA-4 Gens bei Patienten mit Typ 1 Diabetes mellitus zeigt sich das Allel „A“ als krankheitsprädisponierend. Beim +49 A/G Polymorphismus führt die Substitution von Adenin zu Guanin an Position 49 des Exon 1 zu eine Threonin (Thr) /Alanin (Ala) Substitution am Kodon 17 der Signalpeptidsequenz. Die Untersuchung des +49 A/G Polymorphismus in der deutschen Population verdeutlicht, dass der Genotyp „G/G“ sowie das Allel „G“ (Alanin) krankheitsprädisponierend sind. Das Allel „A“ hat eine protektive Wirkung und tritt gehäuft in der Kontrollgruppe auf. Der – 319 – Promotorpolymorphismus zeigt keine Assoziation mit Typ 1 Diabetes mellitus. Die Haplotypanalyse -MH30/-1661 zeigt, dass der Haplotyp „CG“ bei Typ 1 Diabetes mellitus signifikant häufiger auftritt als in der Kontrollgruppe. Der Haplotyp –MH30G/- 1661G hat eine protektive Wirkung. Weiterhin vermittelt der Haplotyp -318/+49G ein erhöhtes Diabetes-Risiko, während der Haplotyp „C/A“ protektiv wirkt. Des Weiteren wurde die Assoziation der oben genannten vier Polymorphismen im CTLA-4 Gen mit der Autoimmunerkrankung Morbus Addison, untersucht. Beim - 1661A/G-Polymorphismus zeigt sich eine signifikant erhöhte Frequenz des Genotyp „A/A“ bei Patienten mit Morbus Addison. Der Genotyp „G/G“ sowie das Allel „G“ des Exon 1- Polymorphismus sind häufiger bei Patienten mit Morbus Addison als bei den Kontrollen und vermitteln somit ein erhöhtes Risiko an Morbus Addison zu erkranken. Im Gegensatz hierzu hat das Allel „A“ eine protektive Wirkung und tritt gehäuft in der Kontrollgruppe auf. Der –MH30 – Polymorphismus und der Promotorpolymorphismus des CTLA-4 Gen zeigen keine relevanten Assoziationen mit Morbus Addison in der deutschen Population. Die Haplotypanalyse der -319 und +49 Polymorphismen zeigt, dass der Haplotyp „C/A“ eine protektive Wirkung hat und daher das Risiko an Morbus Addison zu erkranken, senkt. Der Haplotyp – 319C/+49G birgt dagegen ein erhöhtes Erkrankungsrisiko. Bei Hashimoto-Thyreoiditis zeigte sich, dass der –MH30 C/G-Polymorphismus mit der Erkrankung assoziiert ist. Im Gegensatz zu den Ergebnissen bei Typ 1 Diabetes mellitus zeigt sich das Allel „C“ als krankheitsprädisponierend. Der Genotyp „C/C“ ist signifikant häufiger im Patientenkollektiv als in der Kontrollgruppe. Das Allel „G“ am Genort CTLA-4 –MH30 wirkt dagegen protekiv. Beim -1661 A/G – Polymorphismus treten beide homozygote Genotypen „A/A“ und „G/G“ im Patientenkollektiv häufiger auf als in der Kontrollgruppe. Der heterozygote Genotyp hingegen „A/G“ ist signifikant seltener in der Patientengruppe zu finden als in der Kontrollgruppe und hat somit eine protektive Wirkung. Die Untersuchung des -319 C/T – und des +49 A/G –Polymorphismus zeigt keine Assoziation mit Hashimoto – Thyreoiditis. Die Haplotypanalyse - MH30 / CTLA-4 – 1661 zeigt, dass die Haplotypen „CG“ und „GG“ eine krankheitsprädisponierende Wirkung haben und gehäuft im Patientenkollektiv auftreten als in der Kontrollgruppe. Der Haplotyp -319/ +49 weist bei Patienten mit Hashimoto- Thyreoiditis keine Assoziation auf. Analog zu den anderen oben aufgeführten Autoimmunendokrinopathien wurden auch vier CTLA-4 Polymorphismen auf ihre Korrelation mit Morbus Basedow hin untersucht. Es konnte hier gezeigt werden, dass die untersuchten Polymorphismen keinen wesentlichen Beitrag zur Vermittelung des genetischen Risikos für Morbus Basedow leisten. Die Korrelationsuntersuchung der Polymorphismen zeigte auch keine Assoziation der Haplotypen mit Morbus Basedow. Dies schließt jedoch das CTLA-4 Gen als ein Suspezeptibilitätsgen für Morbus Basedow nicht aus, zumal Assoziationen mit weiteren in dieser Arbeit nicht untersuchten CTLA-4 Polymorphismen bestehen können. Zusammengefasst wird durch die Untersuchung dieser Doktorarbeit die These unterstützt, dass das CTLA-4 Gen eine wichtige Rolle in der Entstehung der Autoimmunendokrinopathien einnimmt. Die hier untersuchten Polymorphismen des CTLA-4 Gens sind prädisponierende Faktoren für Autoimmunendokrinopathien, insbesondere für Typ 1 Diabetes mellitus, Morbus Addison und Hashimoto-Thyreoiditis.
Suchtverhalten wird zu wesentlichen Anteilen durch die mesolimbische, dopaminerge Signalweiterleitung vermittelt. Daher wurde der gesamte DRD2-Genlokus und ergänzend der ANKK1 rs1800497C>TEinzelnukleotid Polymorphismus (SNP), der früher als „Dopamin D2 Rezeptor Taq1A C>T Polymorphismus“ bezeichnet wurde, auf Assoziationen mit dem Risiko, an einer Opiatabhängigkeit zu erkranken, und dem Methadondosisbedarf einer Methadonsubstitutionstherapie untersucht.
Die Allelfrequenzen der DRD2/ANKK1-Polymorphismen wurden zwischen 85 methadonsubstituierten, kaukasischstämmigen Patienten und 99 zufällig ausgewählten, gesunden kaukasischstämmigen Kontrollen verglichen. Innerhalb der Patientengruppe wurde untersucht, ob die tägliche Methadondurchschnitts- bzw. -höchstdosis im ersten Jahr der Behandlung und die Zeit, bis die Höchstdosis erreicht wurde, mit genetischen Varianten der Gene für DRD2 und ANKK1 assoziiert werden kann.
Verglichen mit der Kontrollgruppe findet sich bei Drogenabhängigen das minor-Allel des DRD2 rs1076560G>T-SNPs (p=0.022, Odds Ratio 2.343) oder der ATCT-Haplotyp des DRD2 rs1799978A>G, rs1076560G>T, rs6277C>T, ANKK1 rs1800497C>T häufiger (p=0.048, Odds Ratio 2.23). Ähnliche Tendenzen zeigen sich für ANKK1 rs1800497C>T (p=0.056, Odds Ratio 2.12) und den TCCTCTT-Haplotyp des DRD2-Rezeptors, der sich aus rs12364283T>C, rs1799732Cdel, rs4648317C>T, rs1076560G>T, rs6275C>T, rs6277C>T und ANKK1 rs1800497C>T zusammensetzt (p= 0.059, Odds Ratio 2.31). Die Methadondurchschnitts– und -höchstdosierungen ließen sich signifikant mit dem DRD2 rs6275C>TSNP assoziieren (p=0.016 für die Durchschnittsdosis und p=0.005 für die Höchstdosis). Träger des rs6275T-Allels benötigten höhere Methadondosierungen als Patienten, die dieses Allel nicht tragen. Zusätzlich wurde diese genetische Variante mit einer längeren Zeitperiode bis zum Erreichen der Methadonhöchstdosis assoziiert (p=0.025).
Zusammenfassend wurde in dieser Dissertationsarbeit der gesamte Genlokus des DRD2-Rezeptors von der Promotorregion bis hin zum ANKK1 rs1800497C>T-Polymorphismus analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass Polymorphismen, die den DRD2-Rezeptor betreffen, das Risiko, an einer Opiatabhängigkeit zu erkranken, entscheidend beeinflussen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der Dosisbedarf zur erfolgreichen Aufrechterhaltung einer Methadonsubstitutionstherapie durch diese Polymorphismen beeinflusst wird.
Der Schreibkrampf ist eine Form der fokalen Dystonie, die durch unwillkürliche Verkrampfungen der Hand beim Schreiben gekennzeichnet ist, wobei es zu abnormen und funktionell beeinträchtigenden Fehlstellungen kommen kann. Hinsichtlich der Pathophysiologie vermutet man neben einer defizienten sensomotorischen Integration eine abnorme kortikale Plastizität. So findet sich bei Schreibkrampf-Patienten eine abnorm verstärkte PAS-induzierte LTP-ähnliche Plastizität (Quartarone et al., 2003). Diese weist wie auch die LTD-ähnliche Plastizität einen Verlust der somatotopen Spezifität auf: Veränderungen der motorkortikalen Erregbarkeit können im Gegensatz zu Gesunden auch durch PAS mit nicht-homologer peripher-elektrischer Stimulation induziert werden (Weise et al., 2006). Darüber hinaus scheint die für das Gleichgewicht von neuronalen Netzwerken notwendige homöostatische Metaplastizität beim Schreibkrampf gestört zu sein, wenn die Interaktion zwischen zwei aufeinanderfolgenden TMS-Protokollen getestet wird, die LTP- und LTD-ähnliche Plastizität hervorrufen (Quartarone et al., 2005). Da es sich beim motorischen Lernen um einen LTP-abhängigen Prozess handelt, war zu vermuten, dass dessen homöostatische Regulierung beim Schreibkrampf ebenfalls gestört ist. Diese Hypothese ist Ausgangspunkt der vorliegenden Untersuchungen. Hierfür wurde die als Modell für assoziative LTP- und LTD-ähnliche Plastizität beim Menschen entwickelte PAS bei 10 Schreibkrampf-Patienten und 10 gesunden bezüglich Alter und Geschlecht angepassten Probanden angewandt. Verschiedene PAS-Protokolle, die entweder eine LTP-ähnliche Steigerung (PAS25ms), eine LTD-ähnliche Reduzierung (PAS10ms) oder keine Veränderung (PAS100ms) der Motorkortex-Exzitabilität induzieren, wurden kombiniert mit einem nachfolgenden motorischen Training, bei dem die Teilnehmer schnellstmögliche Daumenabduktionsbewegungen der rechten Hand über einen Zeitraum von 2x15 Minuten durchführen mussten. Bei den gesunden Probanden führte eine Konditionierung durch PAS25ms- und PAS10ms-Protokolle zu einer homöostatischen Regulierung nachfolgender übungsabhängiger Plastizität mit einer Verschlechterung des motorischen Lernens nach dem fazilitierenden PAS25ms-Protokoll und einer Verbesserung des motorischen Lernens nach einem inhibierenden PAS10ms-Protokoll. Bei den Schreibkrampf-Patienten konnte diese homöostatische Metaplastizität nicht nachgewiesen werden. Zusätzlich korrelierte das Ausmaß dieser Störung (Verlust der Herunterregulierung motorischen Lernens nach Konditionierung mit PAS25ms) mit dem klinischen Schweregrad der Dystonie als behavioralem Korrelat, so dass mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit die Hypothese gestützt werden kann, dass eine gestörte homöostatische Metaplastizität eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie des Schreibkrampfes spielt. Inwieweit sich hieraus auch therapeutische Implikationen bzw. Strategien ableiten lassen, soll in weiteren Studien überprüft werden.
Nach den Worten des Bundesverfassungsgerichts ist die Gewaltenteilung ein tragendes Organisationsprinzip des Grundgesetzes (BVerfGE 3, S. 225 ff. [247]). Keine Gewalt darf ein von der Verfassung nicht vorgesehenes Übergewicht über die andere Gewalt erhalten (BVerfGE 9, S. 268 ff. [279]). Wo in der deutschen Verfassungswirklichkeit im Verhältnis zwischen Exekutive und Judikative solche Organisationsstrukturen von zureichender Wirkungskraft zu finden sind, stellt das Bundesverfassungsgericht nicht klar. Die allein mit rechtswissenschaftlichen Instrumentarien nicht zu klärende Frage, ob die Bundesrepublik Deutschland bereits Organisationsstrukturen besitzt, die ein psychosoziales Übergewicht der Exekutive über die Rechtsprechung ausschließen, begegnet bei näherer Betrachtung der Verfassungswirklichkeit in Deutschland (Kapitel III., Schwerpunkt der Dissertation) erheblichen Zweifeln. Die nach dem Ende des 2. Weltkriegs vorgefundene und bis heute in ihrer Grundstruktur unveränderte Verwaltung der Dritten Gewalt durch die Exekutive entspricht nicht den Zielen des Gewaltenteilungsprinzips. Ein Prinzip ist eine Einsicht, ein Ziel und eine Handlungsregel, die methodisch am Anfang eines theoretischen Aufbaus oder Systems von Handlungsorientierungen steht. Montesquieu umschreibt die seinem Gewaltenteilungsprinzip zu Grunde liegende anthropologische Einsicht mit den Worten: „Eine ewige Erfahrung lehrt jedoch, dass jeder Mensch, der Macht hat, dazu getrieben wird, sie zu missbrauchen. Er geht immer weiter, bis er an Grenzen stößt. Wer hätte das gedacht: Sogar die Tugend hat Grenzen nötig“. Die deutsche Verfassungswirklichkeit der Rechtsprechung kennt keine Schutzgrenzen gegenüber der Exekutive. Es gibt keine Organisationsstrukturen, die subtile Übergriffe der vollziehenden Gewalt auf die Rechtsprechung von vornherein objektiv unmöglich machten. Deutschland begnügt sich mit Appellen an die mit der Justizverwaltung betrauten Regierungsmitglieder (i.d.R. Justizminister) und an die ihnen nachgeordneten Staatsorgane (z.B. Gerichtspräsidenten); sie hofft auf deren Rechtstreue und Augenmaß. Deutschland folgt dem Hoffnungsprinzip, nicht dem Gewaltenteilungsprinzip. Das im Grundgesetz festgeschriebene Prinzip der Gewaltenteilung organisatorisch umzusetzen, ist ein Ziel und eine Handlungsregel und damit eine vom Grundgesetz gestellte Aufgabe (a.M. BVerfGE 55, S. 372 ff. [388]). Die der Dreiteilung der Staatsgewalten (Art. 20 II 2 GG) vorausgehende anthropologische Einsicht Montesquieus ist überdies einer der bei der Auslegung des Grundgesetzes anzulegenden Maßstäbe. Der Wortlaut des Art. 92 erster Halbsatz GG ist die an die Spitze des Abschnitts „IX. Die Rechtsprechung“ gestellte Bestätigung der Grundentscheidung des Art. 20 II 2 GG für die Gewaltenteilung. Er bringt den Willen des Grundgesetzes zum Ausdruck, dass in der Verfassungswirklichkeit Deutschlands die rechtsprechende Gewalt in einer organisatorisch gleich wirkungsvollen Weise den Richtern anvertraut sein möge wie die gesetzgebende Gewalt den Parlamentsabgeordneten.
Die Arbeit widmet sich Jim Jarmuschs Film DEAD MAN (1995) unter besonderer Berücksichtigung der akustischen Ebene. Dabei geht es einerseits um eine Interpretation und historische Einordnung des Werkes sowie andererseits um die exemplifizierte Darstellung der besonderen Bedeutung der auditiven Gestaltungsebene innerhalb des vermeintlich primär visuellen Mediums Film.
Die hämatologische Diagnostik wurde in den letzten zwei Jahrhunderten bis zum heutigen Stand stark geprägt und es gibt mittlerweile eine Menge an hämatologischen Diagnostikgeräten. Das Humacount 5 ist ein vollautomatischer hämatologischer Analyzer der mit der Volumetrischen Impedanz Methode Blutbilder erstellt. Ein idealer Einsatzort für das Humacount 5 ist der tägliche Gebrauch sowohl in Ambulanzen als auch auf klinischen Stationen. Es ist ein kompaktes und einfaches Tischgerät, dass auf allen Stationen die für Prävention , Diagnostik, Therapie und Nachsorge Laborwerte benötigen eingesetzt werden kann. Ziel dieser Arbeit war die Testung dieses Gerätes auf Validität, Reliabilität, Objektivität Präzision, Geschwindigkeit und Messgenauigkeit im Vergleich mit der Standardlabormaschine Advia 120. Um auf Häufigkeit und Stärke der Abweichungen zu überprüfen in einem Bereich in dem es äußerst sensitiv arbeiten soll, wurden 50 physiologische Proben benutzt. 250 pathologischen Proben wurden benutzt um eine Auslastung in allen Laborparametern zu erreichen und das Humacount 5 ebenfalls auf Häufigkeit und Stärke der Abweichungen in diesen Bereichen zu überprüfen. Das Humacount 5 liegt mit seinen Werten in einem sehr gutem Variationsbereich die unter den geforderten 5% Abweichintervall liegen. Insgesamt zeigt sich ein sehr gut übereinstimmendes Ergebnis der 22 Laborparameter in der Einteilung auf physiologische Proben und pathologische Proben zwischen dem Advia 120 und dem Humacount 5. In einer zweiten Testreihe wurde die Reliabilität in einem internen Vergleich des Humacount 5 überprüft. Es wurden 50 physiologische und 250 pathologische Proben jeweils zwei mal im Humacount 5 zeitlich direkt hintereinander gemessen. In einer dritten Testreihe werden die 50 physiologischen Proben und die 250 pathologischen Proben verglichen mit einer Messung dieser Proben nach 24 Stunden und in einer vierten Testreihe wurden 10 pathologische Proben jeweils zehn mal hintereinander gemessen. Es haben sich gute Ergebnisse in der Reliabilität und Messgenauigkeit in Bezug auf die Häufigkeit der abweichenden Laborparameter gezeigt. Das Humacount 5 zeigt hierbei besonders, dass in den stark ausgelasteten pathologischen Grenzbereichen der Laborwerte eine sehr hohe Messqualität besteht. Insgesamt betrachtet ist das Humacount 5 also ein sehr valides und reliables Messgerät, das in vielen seiner 22 Laborparameter exzellente Werte abgeliefert hat. Das Gerät wurde in allen Laborparametern vollständig ausgelastet und zeigt sehr sensible Ergebnisse bis in hohe pathologische Werte. Als zweiter Teil der Arbeit wurde der CD4+ Select Test mit einem Standardverfahren in der HIV-Diagnostik, der Flow Zytometrie, verglichen; der CD4+ Select Test ist ein HIVTestverfahren, das CD4 positive Lymphozyten identifizieren und zählen soll. Ziel dieses Teils der Arbeit war die Testung des Verfahrens auf Validität, Reliabilität, Objektivität, Präzision und Messgenauigkeit. Dieses Testverfahren soll vor allem in der HIV Diagnostik und im Patientenmonitoring in der Antiretroviralen Therapie eingesetzt werden. Vor allem ist dieses Testverfahren für die Entwicklungsländer gedacht, die sich das teure Standardverfahren der Flow Zytometrie nicht leisten können. CD4+ Select ist eine kostengünstige aber hochqualitative Alternative für diese Länder. Der CD4+ Select Test wurde validiert anhand bestimmten Kriterien der Firma TriMedCare und auf korrekte Durchführung und korrekte Werte überprüft. Die Blutproben die für die Tests verwendet wurden sind zuvor im Zentrallabor standardisiert gemessen worden. Die CD4 + Werte des CD4+ Select Testverfahrens wurden mit diesen Referenzwerten verglichen. Das Ergebnis des Testverfahrens ist sehr zufriedenstellend und ohne Bedenken in den gewünschten Bereichen einsetzbar. Es ist ein sehr effektiver Test für die CD4+ Lymphozytenbestimmung, der äußerst korrekt arbeitet wenn er sehr sauber durchgeführt wird; außerdem ist er kostengünstig, benötigt wenig Arbeitsaufwand und beinhaltet eine einfache Handhabung. Besonderes Interesse für diese Methode besteht dadurch natürlich in den HIV Ambulanzen und den infektiologischen Fachbereichen.
Aufbau der Arbeit Auf der Grundlage einer Definition von Integrationsprozessen bzw. Integrationszuständen (Kap. 2.1) werden Heterogenitätsmerkmale diskutiert, die für Anerkennungsunterschiede zwischen Ingroup und Outgroup verantwortlich sein können (Kap. 2.1.2). Anschließend werden Integrations- und Desintegrationsmechanismen moderner Gesellschaften aufgezeigt und Erkenntnisse der Vorurteilsforschung zur Verbesserung der Outgroup-Anerkennung erörtert (Kap. 2.1.3 und 2.1.4). Im darauffolgenden Kapitel 2.2 werden Formen des Sports im Hinblick auf deren Integrations- und Desintegrationspotenziale diskutiert. Kapitel 2.3 beschäftigt sich zunächst mit der grundlegenden pädagogischen Rahmung des erziehenden Sportunterrichts, stellt einzelne Integrationsansätze vor und legt dabei den Fokus auf die Frage der bewussten oder unbewussten Auseinandersetzung mit Heterogenität. Da Kooperatives Lernen als eine erfolgversprechende Methode für gelingende Integration gehandelt wird und diese Methode zudem Integrationsmechanismen sowie Kontakthypothese berücksichtigt, wird sie in Kapitel 2.4 ausführlich beschrieben. Nachdem die wichtigsten Theorien zu heterogenitätsbedingten Anerkennungsunterschieden sowie integrationspädagogischen Überlegungen im Sportunterricht behandelt worden sind, schließt der Theorieteil mit der Ableitung der Fragestellungen (Kap. 2.5). Fragestellungen: In der soziologischen Untersuchung wird der Frage nach den tatsächlich desintegrierenden Heterogenitätsmerkmalen im Sportunterricht nachgegangen. In der pädagogischen Untersuchung wird erforscht, ob Kooperatives Lernen im Sportunterricht in der Lage ist, den selektiven Einfluss der desintegrierenden Heterogenitätsmerkmale abzubauen.
Hintergrund: Geschlechtsunterschiede in der kardialen Repolarisation und der korrigierten QT-Zeit sind seit der Beschreibung von Bazett in den 1920er Jahren bekannt. Gesunde Frauen haben längere QT-Zeiten und werden öfter durch medikamenteninduzierte Arrhythmien betroffen als Männer. Patientinnen, die unter der erblichen Form des Langen QT-Syndroms (LQTS) leiden, weisen ein niedrigeres Risiko für kardiale Ereignisse während der Schwangerschaft auf. Dies ist nach einer Schwangerschaft deutlich erhöht. Weibliche Geschlechtshormone könnten eine wichtige Rolle spielen; ihr Einfluss ist aber noch unklar. Hypothese: Veränderungen von Östrogen, Progesteron und dem Östrogen/Progesteron Quotienten sind mit einer Veränderung der QTc-Zeit assoziiert. Methoden: Diese Studie gliedert sich in einen klinischen und einen experimentellen Teil. Im klinischen Teil wurden die Geschlechtshormone und die QTc-Zeiten von insgesamt 21 Frauen untersucht. Drei LQTS2-Patientinnen (heterozygote Trägerinnen der HERG-Mutante R752P) und zwei Genotyp negativen weiblichen Familienmitgliedern wurden während des Menstruationszyklus gemessen (inklusive Elektrolytbestimmung). Die zweite Gruppe bestand aus elf gesunden Frauen, die während einer hormonalen Stimulationstherapie gemessen wurden. Eine letzte Gruppe bestand aus fünf gesunden Frauen, die vor, während und nach einer Schwangerschaft untersucht wurden. Im experimentellen Teil wurde die Wirkung von Östradiol (E2) auf Zellkulturen, die mit HERG-DNA (Wildtyp oder R752P), Östrogenrezeptor-DNA (ERalpha oder ERbeta) oder beidem transfiziert waren, mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Ergebnisse: Im klinischen Teil der Studie zeigte sich, dass E2 mit steigender Serum-Konzentration (in allen drei Gruppen) die QTc-Zeit verkürzte (p <= 0,001). Dieser Effekt ist als elektrolyt-unabhängig zu werten. Einen signifikanten Effekt von Progesteron oder dem E2/Progesteron Quotienten konnten wir nicht nachweisen. Als zugrunde liegender zellulärer Mechanismus zeigte sich eine ERalpha-abhängige Zunahme von HERG-Kaliumkanälen an der Plasmamembran. Dieser Effekt war bei der Mutante (R752P) nicht nachweisbar und konnte für ERbeta oder ohne ER nicht gezeigt werden. Ob die Zunahme durch vermehrtes "Trafficking", eine vermehrte Transkription oder einen anderen Mechanismus bedingt ist, kann noch nicht abschließend beurteilt werden. Schlussfolgerung: Eine Zunahme der E2-Serumkonzentration führt in Abhängigkeit von ERalpha zu vermehrter HERG-Lokalisation an der äußeren Zellmembran und erklärt so die Verkürzung der QTc-Zeit. Für die Zukunft könnte man erwägen, LQTS-Patientinnen in der Postpartal-Periode mit E2 zu behandeln, um so möglichen kardialen Ereignissen durch tachykarde Rhythmusstörungen vorzubeugen. Weiterhin wäre zu erwägen, Patientinnen mit erworbenem LQTS ebenso zu behandeln.
Der G-Protein-gekoppelte Histamin-H3-Rezeptor (H3R) ist einer von vier bekannten Histamin-Rezeptorsubtypen. Die Verbreitung erstreckt sich hauptsächlich auf das ZNS, wo der Rezeptor maßgeblich an der Regulation des Schlaf-Wach-Rhythmus, der Kognition, der Aufmerksamkeit und dem Ernährungsverhalten beteiligt ist. Als Autorezeptor reguliert er die Darstellung und Freisetzung von Histamin im Gehirn und moduliert darüberhinaus als Heterorezeptor auch die Konzentration anderer wichtiger Neurotransmitter. Ein Ansatz für die Entwicklung neuer Arzneistoffe bei multifaktoriellen Erkrankungen entspringt der Hybridtheorie. In dieser Arbeit wurde der Hybridansatz durch verschiedene Varianten realisiert, bei denen die jeweiligen Pharmakophore durch Überlappung oder Aneinanderkopplung verknüpft wurden. Als Grundstruktur für das H3-Pharmakophor diente das 4-(3-Piperidin-1-ylpropoxy)-phenyl-Element, als andersartige Pharmakophore dienten neben Arzneistoffen aus der Gruppe der Neuroleptika, Antidepressiva und SSRI auch solche Pharmakophore, die das Wirkprofil von H3R-Liganden durch spezifische Eigenschaften (z. B. neuroprotektiv) ergänzen können. Bei der Kopplung der Pharmakophore lag der Fokus auf der Untersuchung von Aminvariationen. Mit Hilfe des Hybridansatzes wurden in dieser Arbeit zahlreiche neue und potente Histamin-H3-Hybridliganden entwickelt. Es wurden hohe Bindungsaffinitäten im nano- bis subnanomolare Bereich erzielt und wichtige Struktur-Wirkungsbeziehungen abgeleitet. In-vitro zeigte sich eine hohe Toleranz des H3R bezüglich der heterogenen Liganden, darunter solche mit sterisch anspruchsvollen, stark basischen und sauren Gruppen.
Die Cystische Fibrose oder Mukoviszidose ist die häufigste autosomal, rezessiv vererbte Stoffwechselerkrankung in der kaukasischen Bevölkerungsgruppe.
Die Beteiligung der Lungen bei diesem syndromalen Krankheitsbild wiegt bei weitem am schwersten. Neben der Besiedlung der Lunge mit fakultativ pathogenen Keimen wie Pseudomonas aeruginosa, die zu chronischen Entzündungen führen, besteht außerdem eine gestörte Immunregulation. Diese führt zu einer durch neutrophile Granulozyten dominierten Inflammation, ohne dass die Lunge bereits mit Erregern besiedelt ist. Der massive Einstrom der Leukozyten in das Lungengewebe wird durch erhöhte Konzentrationen des proinflammatorischen Zytokins Interleukin 8 ausgelöst. Es kommt zur
unverhältnismäßigen Freisetzung lysosomaler Enzyme und Sauerstoffradikale, die neben bakteriellen Erregern auch das körpereigene Lungenparenchym zerstören.
Die Ursache für den erhöhten IL–8–Gehalt in den Atemwegssekreten von CF–Patienten ist bisher ungeklärt. Hyperosmotische Belastungen können in Atemwegen zu inflammatorischen Vorgängen ohne eine zugrunde liegende Infektion führen.
In der vorliegenden Arbeit wird ein möglicher Signalweg für IL–8 ausgelöst durch hyperosmotischen Stress untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen eine zeit– und dosisabhängige Induktion der Interleukin 8–Expression und –Sekretion unter osmotischer Belastung.
Wir zeigen, dass an der verstärkten IL–8–Synthese verschiedene Tyrosinkinasen beteiligt sind, die aufgrund der Änderungen des Zellvolumens durch hypertone Bedingungen aktiviert werden.
Die Rezeptor–Tyrosinkinase EGFR wird durch hyperosmotischen Stress
aktiviert und beeinflußt die IL–8–Sekretion.
Der EGFR wird durch die Nicht–Rezeptor–Tyrosinkinase Src aktiviert, die bekanntlich mit Integrinen interagiert, die an der osmosensorischen Mechanotransduktion von Zellen beteiligt sind. Neben der direkten Aktivierung des EGFR an dem Src–abhängigen Tyrosylrest Tyr845, erfolgt außerdem eine Beeinflussung der durch Autophosphorylierung aktivierten Tyrosylreste des EGFR.
Die Aktivierung der Src durch hyperosmotische Bedingungen führt ebenfalls zu einer verstärkten Interleukin 8–Expression und –Sekretion.
Auch die p38 MAPK ist an der vermehrten IL–8–Produktion durch hypertonen Stress beteiligt. Die Stresskinase führt wie die Src–Kinase zur Aktivierung des EGFR, wobei sie auch den Src–abhängigen Tyrosylrest Tyr845 beeinflußt.
Die p38 MAPK selbst wird wiederum durch die Src–Kinase aktiviert, was einen zusammenhängenden Signalweg von Interleukin 8 unter hyperosmotischen Belastungen vermuten lässt. Bemerkenswert ist, dass der EGFR unter osmotischer Belastung die p38 MAPK reguliert, also eine bidirektionale Verbindung zwischen diesen Proteinkinasen
besteht. Dieser Umstand deutet auf das Vorliegen Src–unabhängiger
Signalwege in der Interleukin 8–Signaltransduktion hin (siehe Abbildung 5.1).
Der veränderte Ionenhaushalt bei der Cystischen Fibrose aufgrund eines
defekten CFTR–Proteins könnte eine durch neutrophile Granulozyten
dominierte Inflammation ohne vorliegende Infektion der Lunge mit pathogenen Erregern erklären, die zur verstärkten Lungendestruktion bei den CF–Patienten führt.
Durch eine pharmakologische Hemmung einzelner oder mehrerer Komponenten des Interleukin 8–Signalweges könnte eine reduzierte Produktion des Chemokins erreicht werden, wodurch sich die Lungendestruktion möglicherweise verzögern ließe und die Lebensqualität der CF–Patienten länger erhalten bliebe.
Die vorliegende Arbeit soll klären, in wieweit erhöhte Serumprolaktinwerte mit psychischen Auffälligkeiten korrelieren. 34 Patienten, die in dem Zeitraum von 1977 bis 1999 in der endokrinologischen Ambulanz der Universitätsklinik Frankfurt am Main, mit der Diagnose Prolaktinom, Hyperprolakteinämie und hormoninaktives Adenom behandelt wurden. beantworteten einen Fragebogen mit 18 offenen Fragen zu deren Befindlichkeit zu Beginn und im Verlauf der Behandlung.. Von diesen 34 Patienten zeigten 10 psychische Auffälligkeiten. Dabei bedeuteten 10 betroffene Patienten immerhin einen Anteil von 29,4% Nach Ausschluss von Patienten mit erhöhten Hormonparametern, Erkrankungen oder anderweitiger Medikamentation die Depressionen verursachen könnten, verblieben 8 Patienten, deren psychische Auffälligkeiten möglicherweise auf den erhöhten Serumprolaktinspiegel zurückzuführen waren. 2 leichte Depressionen, laut der ICD 10 F 31.9, traten bei einem Prolaktinwert von 377,4 ng/ml und 4,1 ng/ml auf. 3 Patienten zeigten die Symptome einer mittelschweren Depression, F 31.1, diese Fälle traten bei Serumprolaktinspiegel von 10,3, 3000 und 53 ng/ml auf. Eine Manisch-Depressive Manie trat bei 4770 ng/ml auf. Ein Fall einer Agoraphobie, ICD 10 F 140.0 konnte bei einem Serumprolaktinwert von 6,6 ng/ml beobachtet werden, währenddem eine Karzinophobie, F 40.2, bei einem Serumprolaktinwert von 105,3 diagnostiziert wurde. Psychische Auffälligkeiten traten also bereits in den Bereichen mäßig erhöhter und normaler Prolaktinspiegel auf. Unsere Ergebnisse besagen, dass zwischen psychiatrischen Auffälligkeiten und erhöhten Prolaktinwerten keine Korrelation besteht. Sie beträgt zu Anfang der Behandlung tau b = .048 p = .745, zu Ende der Behandlung wurde tau b =.101, p = .484 gefunden. Der Durchschnitt der während der Behandlung gemessenen Prolaktinwerten korreliert mit dem Auftreten von psychischen Auffälligkeiten mit tau b = .073, p = .620. Auch die Differenz der Prolaktinwerte zwischen Anfang und Ende der Behandlung korreliert nicht mit dem Auftreten psychischer Auffälligkeiten. Tau b beträgt .050, p= .731 Die bei der Patientin S.M. beobachtete Koinzidenz von hohen Serumprolaktinspiegel und psychischen Auffälligkeiten, die den Anstoß zu dieser Untersuchung gegeben hatte, ließ sich nicht auf die gesamte Stichprobe im Sinne eines statistischen Zusammenhanges generalisieren. Die Hypothese, dass eine enge Korrelation zwischen psychischen Auffälligkeiten und einem hohen Prolaktinspiegel besteht, kann anhand der vorliegenden Daten nicht aufrechterhalten werden.
I-kappaB-Kinase epsilon - ein neues Zielprotein für die Pharmakotherapie bei Schmerz und Entzündung?
(2010)
Der Transkriptionsfaktor NF-kappaB spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Immunantworten, Apoptose und Entzündungen sowie bei der Entstehung und Verarbeitung von Schmerzen. Ein pharmakologischer Eingriff in die NF-kappaB-Aktivierungskaskade könnte daher eine Schmerzhemmung bewirken und so Ansätze für die Entwicklung neuer Therapien für pathophysiologische Schmerzen liefern. Die NF-kappaB-Signalübertragungskaskade bietet verschiedene Angriffspunkte für Pharmaka, wobei zurzeit IkappaB Kinasen (IKK) als hoffnungsvolle Zielmoleküle im Fokus der Untersuchungen stehen. Verschiedene IKKs regulieren die Aktivität von NF-kappaB über die Phosphorylierung des inhibitorischen Proteins IkappaB oder über die direkte Phosphorylierung von NF-kappaB. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der neu entdeckten IKK epsilon bei der Schmerzentstehung und -verarbeitung sowie deren Eignung als neues Zielmolekül für die Schmerztherapie näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass IKK epsilon konstitutiv in Geweben der Maus, welche an der Entstehung und Verarbeitung von Schmerzen beteiligt sind, exprimiert ist. Im Rückenmark konnte die Lokalisation von IKK epsilon in den schmerzrelevanten Laminae I und II des Dorsalhorns nachgewiesen werden und auch in den Hinterwurzelganglien (Dorsal Root Ganglia (DRG’s)) war IKK epsilon in kleinen, nozizeptiven Neuronen exprimiert. Nach peripherer entzündlich-nozizeptiver Stimulation mit Formalin oder Zymosan kam es im Lumbalmark und den DRG’s zu einem signifikanten Anstieg der IKK epsilon-Expression sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene. Diese Beobachtungen machten eine Beteiligung von IKK epsilon an der Prozessierung von Schmerz sehr wahrscheinlich. Um die Rolle von IKK epsilon während der Schmerzentstehung und -verarbeitung besser beurteilen zu können wurde das Verhalten von IKK epsilon defizienten Mäusen in akuten und inflammatorischen Schmerzmodellen charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass der Knockout von IKK epsilon zu einem signifikant verringerten nozizeptiven Verhalten im Formalintest und einer Hemmung der mechanischen Hyperalgesie nach Zymosaninjektion im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen führte. Gleichzeitig konnte kein Unterschied im akut nozizeptiven Verhalten festgestellt werden. Der Knockout von IKK epsilon hatte demnach keine Auswirkung auf den akuten physiologischen Nozizeptorschmerz, zeigte jedoch eine Verbesserung bei pathophysiologischen Schmerzen. Das verringerte nozizeptive Verhalten der IKK epsilon defizienten Mäuse im Formalintest ging mit einer Hemmung der NF-kappaB-Aktivierung im Rückenmark einher. Auch konnte eine verringerte mRNA-Expression der NF-kappaB-abhängigen Gene Cyclooxygenase-2 (COX-2), Matrixmetalloprotease-9 (MMP-9) und induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), die an der Regulation von Entzündungsschmerzen beteiligt sind, im Rückenmark und den DRG’s nachgewiesen werden. Da IKK epsilon bisher hauptsächlich mit der Aktivierung des TypI Interferon-Signalweges in Zusammenhang gebracht wurde, wurde außerdem geprüft, ob es nach Injektion mit Formalin zu einer Aktivierung des Trankriptionsfaktors Interferon-regulierender Faktor (IRF)-3 in Wildtyp-Mäusen kommt, was nicht beobachtet werden konnte. Der Knockout von IKK epsilon scheint demnach seine antinozizeptive Wirkung direkt über eine fehlende Aktivierung von NF-kappaB zu entfalten, wonach IKK epsilon eine bedeutendere Rolle als bisher angenommen bei der Aktivierung von NF-kappaB spielt. Dies konnte durch in vitro Daten untermauert werden. Der Knockdown von IKK epsilon in Makrophagen-Zellkultur mit spezifischer siRNA verhinderte die Phosphorylierung von NF-kappaBp65 am Serinrest 536 nach Stimulation mit LPS. Anhand der vorliegenden Daten lässt sich also schlussfolgern, dass IKK epsilon an der Schmerzentstehung und verarbeitung bei Entzündungen beteiligt zu sein scheint. Eine Hemmung dieser Kinase könnte demnach ein neues, lohnendes Ziel für die Entwicklung neuer Medikamente für die Schmerztherapie sein.
Ein erblich bedingter Funktionsverlust der DNA Mismatch Reparatur (MMR) Proteine hMSH2 und hMLH1 führt zu genetischer Instabilität und frühzeitiger Ausbildung von Krebserkrankungen, insbesonders des Kolons und des Endometriums. Diese Erkrankung wird nach ihrem Erstbeschreiber als Lynch Syndrom oder im Falle eines kolorektalen Karzinoms auch als erbliches nichtpolypöses kolorektales Karzinom (hereditary non polyposis colorectal cancer, HNPCC) bezeichnet. Neben der DNA Reparatur sind MMR Proteine auch an weiteren regulatorischen Prozessen wie genetischer Rekombination, Antikörperbildung sowie Zellzyklus Regulation und Apoptose beteiligt. Aus onkologischer Sicht ist besonders der letzte Punkt von Interesse, da man davon ausgeht, dass MMR Proteine bei exzessiven DNA-Schäden den Zellzyklus anhalten und entweder die DNA reparieren oder die Apoptose einleiten. Dies ist von klinischer Bedeutung, da viele Chemotherapeutika künstliche DNA-Läsionen hervorrufen, die in MMR defizienten Zellen weder zu einem Zellzyklus Stop noch zur Apoptose führen, so dass die Wirksamkeit bestimmter Substanzen vermindert ist. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorgelegten Dissertation ein Screening zur Identifikation von Interaktionspartnern von hMLH1 durchgeführt. hMLH1 ist hauptsächlich im Zellkern lokalisiert, über Interaktionspartner im Zytoplasma ist bisher wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neues bakterielles Zweihybrid-System etabliert. In diesem System besitzen die Wirtszellen keinen Zellkern, so dass die detektierten Interaktionen unabhängig von der intrazellulären Lokalisation stattfinden. Die Klone einer cDNA-Datenbank wurden mit hMLH1 in Bakterienzellen koexprimiert und die Interaktionen durch positives Zellwachstum auf Minimalnährböden angezeigt. Die positiven Klone wurden anschließend sequenziert und die Sequenz mit Hilfe der BLAST-Funktion mit der PubMed Online-Datenbank abgeglichen. Insgesamt wurden 108 bisher unbekannte Interaktionspartner von hMLH1 detektiert. Von diesen konnten zahlreiche Proteine den bekannten Funktionen der MMR zugeordnet werden. Von besonderem Interesse sind einige Interaktionspartner aus den Bereichen Zellzyklus Regulation (ANXA6, LPP2, NDRG1, PTP4A2/RH, RAPGEFL1, SPTLC2 und ARAF1), Apoptose (CTSB, CAPN5, DDX47, DES und Atmungskettenproteine) und ribosomale Proteine (EIF2A, EEF2, RPS2, RPS5 und RPS16). Weitere Untersuchungen müssen zeigen, welche dieser Interaktionspartner sich möglicherweise als prognostische bzw. prädiktive Biomarker nutzen lassen. Weiterhin könnten sich durch fundierte Kenntnis der Interaktion von MMR und Zellzyklus Regulation bzw. Apoptose neue Ansatzpunkte bei der Entwicklung zukünftiger therapeutischer Substanzen ergeben.
Das extrem thermophile Eubakterium Thermus thermophilus ist in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen geworden und verdankt seinen Statuszum Teil seiner hohe Wachstumsrate, den guten Zellerträgen und der konstitutivenExpression eines natürlichen Kompetenzapparates, der seine genetische Manipulation ermöglicht. Die Verfügbarkeit von kompatiblen Plasmiden und bis zu vier thermostabilen Antibiotikaresistenzmarkern konnten den Wert des Organismus in Hinblick auf biotechnologische Anwendungen noch weiter steigern und tatsächlich besteht nach wie vor ein ungebrochenes Interesse an der Struktur- und Funktionsaufklärung thermophiler Proteine. Der Focus der hier vorliegenden Arbeit richtete sich auf eine der insgesamt zwei terminalen Oxidasen der Atmungskette von T. thermophilus, die Cytochrom ba3 Oxidase. Es wurden verschiedene rekombinante Varianten des Proteins, die sich hinsichtlich der Position und Länge des verwendeten Histidin-Tags unterschieden, kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Das Einfügen eines internen His12-Tags in einen periplasmatischen Loop zwischen den Transmembranhelices IV und V führte zu einer rekombinanten Version der Oxidase, die in ihren Eigenschaften dem nativen Wildtyp entsprach und sich durch die in dieser Arbeit etablierte Aufreinigungsstrategie relativ schnell, in guten Ausbeuten und hoher Reinheit aufreinigen ließ. Weiterhin konnten verschiedene Punktmutationen von möglicherweise am Elektronentransfer beteiligten Aminosäureresten generiert und die resultierenden Proteine aufgereinigt und über ihre enzymatische Aktivität charakterisiert werden. Eine weiterführende Charakterisierung der Mutanten erfolgte im Rahmen einer Kooperation und ist bisher noch nicht abgeschlossen. Das Herzstück dieser Arbeit machte jedoch die Definition der Transkriptionseinheit der Cytochrom ba3 Oxidase und die sich daraus ergebenden Fragestellungen aus. So konnte gezeigt werden, dass das ba3 Operon zusätzlich zu den Strukturgenen der dort kodierten Untereinheiten noch mindestens ein, höchst wahrscheinlich jedoch zwei zusätzliche Gene enthält: cbaX und cbaY. Bioinformatische Charakterisierungen ordneten CbaY der diversen Gruppe von sekundären Transportern zu, und es konnte experimentell gezeigt werden, dass seine Anwesenheit für die Expression der Cytochrom ba3 Oxidase förderlich ist. CbaX hingegen konnte über die durchgeführte Homologiesuche keine Funktion zugeordnet werden; uncharakterisierte Homologe waren einzig in der Thermaceae Gruppe zu finden. Durch Deletions- und Komplementationsstudien konnte dem Protein eine entscheidende Rolle in der Assemblierung der ba3 Oxidase bescheinigt werden. CbaX scheint eine zentrale Aufgabe bei der Häm a Insertion in Untereinheit I zu spielen und könnte, ohne Sequenzhomologie aufzuweisen, die Rolle des Surf1-Proteins übernehmen, welches in den sequenzierten Organismen der Thermaceae Gruppe nicht konserviert ist. Die homologe Expression und Aufreinigung von CbaX führte nicht zur erwarteten Ausbeute und Reinheit des Proteins, konnte aber durch immunologische Experimente eine potentielle Interaktion von CbaX und der Cytochrom ba3 Oxidase nachweisen.
Nicht hämolytische Transfusionsreaktionen (NHTR) sind eine häufige Komplikation der Transfusion von Blut und Blutkomponenten. Als Ursachen der NHTR gelten sowohl von Leukozyten freigesetzte Zytokine, die in den Blutkomponenten enthalten sind und während der Herstellung und Lagerung freigesetzt werden, als auch durch HLA-Antikörper verursachte Reaktionen gegen Leukozytenantigene. Im Rahmen eines etablierten Hämovigilanz-Systems werden NHTR dem Blutspendedienst gemeldet. Mit den daraufhin durchgeführten Untersuchungen kann die Ursache der Transfusionsreaktion in vielen Fällen nicht geklärt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die in den 10 Jahren von 1996 – 2006 gemeldeten NHTR systematisch in Bezug auf die Häufigkeit und die festgestellten Ursachen ausgewertet. Insgesamt wurden im o.g. Zeitraum 1595 Transfusionsreaktionen gemeldet, was einer Häufigkeit von 0,05% aller Transfusionen entsprach. Vor Einführung der Leukozytendepletion (2001) waren Erythrozytenkonzentrate – im Untersuchungszeitraum von 1996 – 1998 – signifikant häufiger mit einer NHTR assoziiert (4,09/10.000 Transfusionen) als Thrombozytenkonzentrate (2,64/10.000 Transfusionen) oder gefrorenes Frischplasma (2,05/10.000 Transfusionen). Vermutlich ist diese höhere NHTR-Rate bei Erythrozytenkonzentraten auf die relativ hohe Kontamination mit Leukozyten zurückzuführen. Allerdings ging die Anzahl der nicht hämolytischen Transfusionsreaktionen im Institut Frankfurt insgesamt nach Einführung der Leukozytendepletion nicht zurück. Im Gegenteil war die Häufigkeit nach Einführung der Leukozytenfiltration (5,66/10.000 Transfusionen) sogar höher als vorher (4,43/10.000 Transfusionen). Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass durch die gleichzeitige Einführung der gesetzlich vorgeschriebenen Meldepflicht mehr NHTR gemeldet wurden. Als weitere mögliche Ursachen einer Transfusionsreaktion wurden das in Blutbeuteln vorhandene Allergen Di(-2-ethylhexyl)phtalat (DEHP) und das in Infusionssystemen enthaltene Allergen Toluylen-2,4-diisocyanat (TDI) angesehen. Beide können im Rahmen einer Bluttransfusion den Patienten übertragen werden. Hierzu wurden 154 NHTR auf spezifische IgE-Antikörper gegen Phthalsäureanhydrid und TDI untersucht. In einem Fall konnten spezifische Antikörper gegen Phthalsäureanhydrid (CAP-Klasse 2) und in einem weiteren Fall gegen TDI (CAP-Klasse 2) ermittelt werden. Hieraus konnte jedoch nicht retrospektiv geschlossen werden, dass der jeweils vorliegende Antikörper für die NHTR verantwortlich war. Neben diesen beiden positiv getesteten Fällen wurden zusätzlich ausgewählte Transfusionsempfänger mit einer frischen und nicht geklärten NHTR (n = 12) in vitro mit verschiedenen Konzentrationen von DEHP und TDI restimuliert. In keinem der Fälle führte die Restimulation mit DEHP und TDI zu einer Degranulation basophiler Granulozyten als Ausdruck einer allergischen Reaktion. Eine allergische Reaktion von Transfusionsempfängern gegen in Beuteln oder Transfusionsbestecken enthaltenes DEHP oder TDI kann somit zwar nicht sicher ausgeschlossen werden, scheint aber als Ursache für bisher ungeklärte NHTR keine signifikante Rolle zu spielen.
Implantatprothetische Versorgung von Lippen-, Kiefer-, Gaumenspalt-Patienten mit ITI-Implantaten
(2010)
Ziel dieser Arbeit war es, die implantatprothetische Rehabilitation von LKG-Patienten mit transgingivalen ITI-Implantaten mit einer dreimonatigen Einheilphase hinsichtlich Funktion, Ästhetik und Patientenzufriedenheit zu untersuchen. Insgesamt wurden bei 17 Patienten 24 Implantate im Bereich der ehemaligen Spalte inseriert. Diese wurde bei allen Patienten mit einer sekundären Osteoplastik geschlossen. Bei 14 Patienten wurde aufgrund eines insuffizienten Knochenangebotes eine Augmentation im Sinne einer tertiären Osteoplastik durchgeführt. Bei zwei Patienten konnte simultan implantiert werden. Alle Knochendefekte wurden mit autologen Transplantaten vom Beckenkamm oder Kieferwinkel augmentiert. Nach dreimonatiger Einheilphase wurden die Implantate mit verschraubten oder zementierten Suprakonstruktionen prothetisch versorgt. Die Mundgesundheitsbezogene Lebensqualität (MLQ) wurde mit der Deutschen Kurzversion des Oral Health Impact Profile (OHIP-G 14) gemessen und mit den Normwerten der Deutschen Allgemeinbevölkerung verglichen. Das ästhetische Ergebnis wurde anhand von Farbfotos von Zahnärzten, zahnmedizinischen Laien und den Patienten selbst bewertet. Als objektives Messinstrument wurde der Implantat Kronen Ästhetik Index verwendet. Nach einer durchschnittlichen Nachuntersuchungszeit von 40 (±22) Monaten ergaben sich folgende Ergebnisse: 23 Implantate (95,8%) befanden sich in situ und unter Belastung. Der röntgenologisch gemessene marginale Knochenabbau betrug 1,15±2,16 mm. Des Weiteren wurden periimplantäre Sondierungstiefen von 2,56±0,66 mm, eine Breite der keratinisierten Mukosa von 2,71±1,1 mm und ein Periotestwert von 0,18±6,5 gemessen. Der Summenwert des OHIP G-14 betrug bei 50% der Patienten ≤ 2. Es konnte festgestellt werden, dass die implantatprothetische Versorgung von augmentierten LKG-Spalten mit transgingivalen ITI-Implantaten und einer Belastung nach drei Monaten eine sichere Behandlungsmethode mit langfristig hoher Erfolgsrate ist. Aus funktioneller Sicht sind die Ergebnisse vergleichbar mit Patienten ohne Spalte oder Augmentation. Die MLQ von LKG-Patienten nach implantatprothetischer Rehabilitation ist vergleichbar mit Individuen der Allgemeinbevölkerung, die keinen herausnehmbaren Zahnersatz tragen. Aufgrund von Einschränkungen im Bereich der periimplantären Weichgewebe sind die ästhetischen Resultate kompromittiert aber für alle Befragten zufriedenstellend. Der Implantat Kronen Ästhetik Index kann zur Dokumentation der ästhetischen Ergebnisse der implantologischen Behandlung von LKG-Patienten empfohlen werden. Das Ziel zukünftiger Konzepte sollte sein, das ästhetische Endresultat der periimplantären Weichgewebe zu verbessern. Da die funktionelle Belastung von transgingivalen Implantaten im augmentierten Spaltbereich nach drei Monaten zum jetzigen Zeitpunkt kein Standardvorgehen ist, müssen weitere Untersuchungen zeigen, inwieweit dieses Therapiekonzept eventuell höhere Verlustraten oder ästhetische Ergebnisse beeinflusst.
Mesenchymale Stromazellen stellen derzeit eine der vielversprechensten Zellpopulationen dar und werden in Hinblick auf ihre zahlreichen Fähigkeiten und Eigenschaften intensiv erforscht. In dieser Arbeit konzentrierten wir uns auf das für die Behandlung von immunvermittelten Erkrankungen wertvolle immunmodulatorische Potential der mesenchymalen Stromazellen. Dieses ist für standardmäßigplastikadhärent isolierte MSCs vielfach belegt. Der große Nachteil dieser Isolierungsmethode jedoch, ist die Gewinnung nur sehr heterogener Zellpopulationen, was das klonogene, proliferative und möglicherweise auch immunsuppressive Potential dieser Zellen betrifft. Deshalb schien es uns sinnvoll, die Eigenschaften mesenchymaler Stromazellen zu untersuchen, welche nach einer alternativen Selektionsprozedur, die sich des Oberflächenmarkers CD271 (LNGFR) bedient, und homogenere Zellpopulationen von MSCs hervorbringt. Den auf diese Art isolierten und angereicherten MSCs wird in der Literatur bereits ein erhöhtes klonogenes und proliferatives Potential bescheinigt, welches wir im Rahmen dieser Arbeit überprüften und schließlich auch bestätigen konnten. Im Zentrum dieser Dissertation standen jedoch Untersuchungen zum immunsuppressiven Potential dieser alternativselektierten MSCs, welches bis Dato noch nicht erforscht war. Zur Beantwortung der Frage, ob CD271-selektierte MSCs ein vergleichbares oder möglicherweise durch ihre Homogenität erreichtes, verbessertes immunsuppressives Potential auf Immunzellen entfalten, kultivierten wir diese Zellen mit auf unterschiedliche Weise stimulierten PBMNCs und evaluierten darunter deren Proliferationspotential. Wir fanden heraus, dass CD271+-MSCs in bestimmten Konzentrationen ein im Vergleich mit PA-MSCs erhöhtes immunsuppressives Potential auf allogen stimulierte PBMNCs entfalten und dabei in keinem unserer Versuche den standardmäßig selektierten MSCs unterlegen waren. Bei einem Anteil von 50% MSCs an der Zellsuspension vermögen CD271+- MSCs die Proliferation in stärkerem Maße zu inhibieren, als es PA-MSCs tun. Werden MSCs und PBMNCs in gleichem Verhältnis kultiviert, unterscheidet sich das Maß der Inhibition durch die beiden Zelltypen nicht signifikant. Betrug der Anteil der eingesetzten MSCs an der Zellsuspension nur geringe 1%, stimulierten CD271+-MSCs nicht die Proliferation der Lymphozyten, während es unter dem Einfluss von PA-MSCs zu signifikanter Proliferationssteigerung kam. Insgesamt stellte sich das immunmodulatorische Potential der CD271+-MSCs, genau wie das der PA-MSCs als dosisabhängig dar. Je höher der MSC-Anteil an der Zellsuspension, desto höher war das Suppressionspotential auf die Lymphozytenproliferation. Vergleichbare Ergebnisse lieferten Versuche, in denen MSCs zusammen mit IL-2 stimulierten allogenen PBMNCs eingesetzt wurden, was beweist, dass CD271+-MSCs auch maximal stimulierte PBMNCs signifikant proliferativ hemmen können. In Versuchen mit mitogen stimulierten PBMNCs konnten wir nachweisen, dass CD271+-MSCs auch die Proliferation von zuvor mit PHA, ConA und IL-2 stimulierten PBMNCs inhibieren. Im Gegensatz zu PA-MSCs vermochten sie aber nicht, die proliferationsfördernde Wirkung des Staphylokokken-Enterotoxin-B (SEB) aufzuheben. Um den Mechanismen der immunsuppressiven Fähigkeit mesenchymaler Stromazellen näher zu kommen, untersuchten wir drei erst kürzlich beschriebene mögliche Mediatoren der MSCvermittelten Immunmodulation. Wir analysierten die Wirkung mesenchymaler Stromazellen auf regulatorische T-Zellen, auf die Produktion von PGE2 und NO. Unter der Präsenz der MSCs kam es in der Population der allogen-stimulierten PBMNCs zu keiner signifikanten Zu- oder Abnahme an regulatorischen CD4+/CD25+-Zellen. Innerhalb der Population der regulatorischen T-Zellen kam es jedoch unter dem Einfluss der CD271+-MSCs zu einer signifikanten Zunahme der primitiveren Subpopulation CD4+CD25+CD45RA+ T-regulatorischer Zellen, welcher in der Literatur eine robuste suppressive Aktivität nach in vitro-Expansion bescheinigt wird. NO konnten wir durch unsere Untersuchungen als möglichen Mediator der Immunmodulation ausschließen. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede für den NO-Gehalt in PBMNC-Kulturen, die in Anwesenheit oder Abwesenheit von MSCs inkubiert worden waren. Auch NO-Blockierungsversuche erbrachten keinen Effekt auf die Zellproliferation. Jedoch fanden wir eine signifikant positive Korrelation zwischen der PGE2-Konzentration und dem inhibitorischen Effekt von CD271+-MSCs auf die Proliferation der PBMNCs. Dass das PGE2 in unseren Experimenten das wichtigste Vermittlermolekül des immunsuppressiven Effekts von CD271+-MSCs darstellt, konnten wir zusätzlich in Versuchen mit dem PGE2-Syntheseinhibitor Indomethacin beweisen. In Zusammenschau mit Daten anderer Arbeitsgruppen ist insgesamt die Schlussfolgerung zulässig, dass es sich bei der Immunmodulation durch MSCs um einen komplexen Mechanismus handelt, der sowohl lösliche Faktoren, als auch Immunzellen einschließt und welcher weiterer Erforschung bedarf. Anhand unserer Untersuchungen konnten wir zeigen, dass CD271-selektierte MSCs neben der verbessert klonogenen und proliferativen Aktivität eine teilweise erhöhte und mindestens ebenbürtige immunsuppressive Fähigkeit, verglichen mit den nach Standard angereicherten MSCs, aufweisen. Letztlich befürworten und bestärken unsere Ergebnisse einen Einsatz CD271-angereicherter mesenchymaler Stromazellen zur Behandlung immunvermittelter Erkrankungen und versprechen eine vielseitige Verwendung dieser Zellen in Zukunft. Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zur notwendigen Standardisierung und Weiterentwicklung der Gewinnung und Anreicherung funktionsfähiger mesenchymaler Stromazellen und zum sicheren und raschen Einsatz dieser Zellen im klinischen Gebrauch. Weil es sich bei den vorgestellten Ergebnissen allerdings ausschließlich um ex vivo Experimente handelt, sind weitergehende Untersuchungen im Tierexperiment notwendig.
Hintergrund: Epoxyeicosatriensäuren (Epoxyeicotrienoic acids, EETs) sind antihypertensiv, anti-inflammatorisch, anti-proliferativ und pro-fibrinolytisch wirksam. Die lösliche Epoxid-Hydrolase (soluble epoxid hydrolase, sEH) wandelt EETs in ihre korrespondierenden, weniger aktiven Diole (DHETEs) um. Das legt die Vermutung nahe, dass eine Steigerung der EET-Spiegel durch sEH-Inhibition eine Strategie zur Verhinderung von Endorganschäden sein kann. Wir untersuchten den Effekt der sEH-Inhibition im Modell der chronischen Niereninsuffizienz bei der Maus. Methoden: Es wurde eine 5/6 Nephrektomie (5/6 Nx) an männlichen SV129 Mäusen durchgeführt um eine chronisch progressive Niereninsuffizienz zu induzieren. Postoperativ wurden die Tiere in Gruppen randomisiert und mit Placebo (Leitungswasser), einem ACE-Hemmer (Ramipril, 40 mg/kgKG/d), dem sEH-Inhibitor 1471 (15 mg/kgKG/d) und dem CYP-Inhibitor Fenbendazol (15 mg/kgKG/) für 8 Wochen behandelt. Ergebnisse: Verglichen mit den sham-operierten Mäusen induzierte die 5/6 Nx einen arteriellen Hypertonus, eine Proteinurie, Glomerulosklerose und eine erhöhte Sterblichkeit. Wie erwartet führte die Gabe von Ramipril zu einer Blutdrucksenkung, einer verminderten Albuminurie und einer verbesserten Überlebensrate. Fenbendazol senkte die Plasma- Konzentration von einigen EETs, hatte aber keinen Einfluss auf die Progression der Niereninsuffizienz. Überraschenderweise kam es unter sEH-Inhibitor-Therapie zu keiner Blutdrucksenkung in diesem Modell. Im Gegenteil, die Proteinurie war sogar noch verstärkt bei den 5/6 Nx-Tieren unter 1471-Therapie verglichen mit der Placebo-Gruppe. Die Plasma-EET-Spiegel waren >2 mal höher in den 5/6 Nx-Mäusen als in der korrespondierenden sham-Gruppe. Die renale sEH-Expression war in den 5/6 Nx-Mäusen vermindert, eine medikamentöse sEH-Inhibition steigerte die EET-Spiegel in diesen Tieren noch weiter. Bemerkenswert war, dass, ausschließlich in den 5/6 Nx-Gruppen, eine sEH-Inhibition und eine CYP-Inhibition zu einer gesteigerten Konzentration von 5-Hydroxyeicosatriensäure (5-HETE), 12-HETE und 15-HETE führte, welche Lipid Peroxidations- und Lipoxygenase-Produkte sind. Fazit: Im Modell der 5/6 Nephrektomie bei der Maus führt die Hemmung der sEH zu keiner Blutdrucksenkung, sondern zu einer Verschlechterung der Proteinurie. Ursächlich hierfür sind vermutlich die durch die Niereninsuffizienz hervorgerufe Akkumulation von EETs sowie eine Verschiebung des Arachidonsäure-Metabolismus hin zu Lipoxgenase-Produkten mit nierenschädigender Wirkung.
Seit Einführung der Operationen mit HLM vor etwa 50 Jahren haben zahlreiche Veränderungen von Komponenten zu Fortschritten bezüglich einer verbesserten Biokompatibilität der EKZ geführt (Daniel S 1996; Gu Y 1993). Die EKZ ist nach wie vor eine Voraussetzung für die Mehrzahl der Herzoperationen und ist mit einer systemischen inflammatorischen Reaktion verbunden (SIRS), welche für eine postoperative Organdysfunktion verantwortlich sein kann. Herz-, Lungen- und Nierenfunktion als auch Gerinnungssystem sind in verschiedenem Ausmaß betroffen (Kirklin JK (1983); Westaby S 1987). Dieser Ganzkörperschaden ist ein multifaktorieller Prozess, der hauptsächlich durch den Kontakt von Blut mit fremden Oberflächen verursacht wird und sowohl zu einer Aktivierung der Leukozyten als auch der Komplementkaskade führt (Gourlay T 2001; Levy JH 2003). In Zeiten der minimal-invasiven Herzchirurgie besteht nun nicht nur die Absicht, das chirurgische Trauma zu reduzieren, sondern auch die pathologischen Auswirkungen der EKZ zu minimieren. Deshalb führten neuartige Konzepte und Strategien zur Entwicklung minimierter extrakorporaler Zirkulationssysteme, die vor allem durch reduzierte Fremdoberflächen und geringeres Primingvolumen charakterisiert sind (von Segesser LK 2003). Das CorX™ System folgt diesem Konzept und besteht aus einem geschlossenen System mit sehr geringere Oberfläche, einer integrierten Pumpe mit Oxygenator und einem Luftelimierungssystem. Außerdem wird weder ein Kardiotomie-Reservoir noch eine perikardiale Saugung verwendet, um den zusätzlichen Blutluftkontakt zu vermeiden. Das Ziel dieser Untersuchung war, dass CorX™ System in einer prospektiv randomisierten Studie mit einer konventionellen HLM in Bezug auf perioperative klinische und biochemische Parameter bei koronararteriellen Bypassoperationen in einem Niederigrisiko Patientenkollektiv zu vergleichen. 200 Patienten wurden entweder der CorX™ System-Gruppe (n = 100, Gruppe A) oder der Standard-HLM-Gruppe (n = 100, Gruppe B) zugeteilt. Neben der Auswertung von perioperativen Daten und routinemäßigen Blutproben waren vor allem die Lungenfunktion und der Myokardschaden Gegenstand dieser Untersuchung. Die PMNElastase und TCC dienten dazu, die inflammatorische Reaktion zu beurteilen. Demographische und operative Patientendaten unterschieden sich zwischen beiden Gruppen nicht, sie waren daher vergleichbar. Die postoperative Lungenfunktion zeigte postoperativ keinen signifikanten Unterschied in beiden Gruppen. Zwar war der Oxygenierungsindex in der ersten postoperativen Messung in der CorX-Gruppe signifikant niedriger, dies hatte aber keine Auswirkungen auf die Ergebnisse der Lungenfunktionstests am 5. postoperativen Tag. In der CorX™-Gruppe beobachteten wir verminderte CK-MB Werte postoperativ, was auf einen signifikant niedrigeren Herzmuskelzelluntergang hinweist. Auch dieses Ergebnis hatte aber keine klinische Relevanz. Eine Stunde nach HLM waren sowohl PMN-Elastase als auch TCC signifikant niedriger in Gruppe A im Vergleich zu Gruppe B (PMNE:76±44ng/ml vs 438±230ng/ml, p<0,0001; TCC: 16±8IU/ml vs 29±19IU/ml, p<0,0001). Dies zeigt eine deutlich verminderte inflammatorische Reaktion in der CorX-Gruppe auf, welche sich aber klinisch in diesem Niedrigrisikopatientengut nicht ausgewirkt hat. Die klinischen Ergebnisse hinsichtlich Morbidität und Mortalität, Intensiv- und Krankenhausaufenthalt waren nicht signifikant unterschiedlich im Gruppenvergleich. Das CorX™ System ist sicher und erfordert nur eine kurze Trainingsperiode für das chirurgische Team. Es wurde von den Kardiotechnikern gut angenommen und sogar gegenüber der konventionellen HLM favorisiert. Die inflammatorische Reaktion nach EKZ war signifikant reduziert, jedoch gab es bei Niedrigrisikopatienten keinen messbaren Unterschied bei Betrachtung der klinischen Ergebnisse. Die Reduktion der inflammatorischen Reaktion durch den Einsatz einer minimierten HLM könnte bei Hochrisikopatienten aber von großer Bedeutung sein.
Um Materie mit Nanometergenauigkeit anzuordnen, ist Selbstorganisation die mächtigste Strategie. DNA (Desoxyribonukleinsäure) ist hierfür ein hervorragendes Baumaterial, da sie ein billiges, programmierbares, biokompatibles und gut verstandenes Polymer ist. Aus diesen Gründen ist DNA zur Basis für ein schnell wachsendes Gebiet geworden: die DNA-Nanotechnologie. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Interaktionsmöglichkeiten für die DNA-Nanotechnologie zu entwickeln und neuartige Strukturen aus DNA-minicircles aufzubauen, einem bislang vernachlässigten Konstruktionselement. ...
Die vorliegende Dissertationsschrift im Fachgebiet Musikpädagogik widmet sich dem heutigen Stand des Instrumentalunterrichts auf Blechblasinstrumenten und dessen möglicher Weiterentwicklung unter besonderer Berücksichtigung neuer methodischer Ansätze. Hierbei stehen interdisziplinäre Übungskonzepte zur Förderung einer ganzheitlichen Instrumentalpädagogik im Vordergrund, insbesondere unter systematischer Miteinbeziehung spezieller mundmotorischer logopädischer Übungen. Mit der Zielsetzung, gängige Unterrichtskonzepte zu untersuchen und potenziell innovative Methoden aufzuzeigen, war zunächst grundlegende Forschungstätigkeit notwendig, da musikpädagogische Forschung im deutschen Sprachraum bisher die Blechblasinstrumente so gut wie nicht mit einbezogen hat (Suppan, 1994: 431; Bastian, 1992: 128ff). Nach entsprechender Recherche und dem Erstellen eines ersten Studiendesigns erwies sich eine Eingrenzung der Untersuchung auf die Instrumentalpädagogik von Trompete, Horn und Posaune als sinnvoll. Entsprechend dem Untertitel dieser Studie zu Theorie, Empirie und Didaktik modernen Instrumentalunterrichts gliedert sich diese Schrift in drei Hauptteile. Der theoretische Teil der Arbeit erläutert die sogenannte Ansatzphysiognomie und stellt diese ausführlich dar. Hierbei werden auf die didaktische Vermittlung des Bläseransatzes, dessen Anatomie sowie die Elemente des orofazialen Systems in Bezug zu deren Funktion beim Spielen eines Blechblasinstruments eingegangen. Ebenso werden Pathologien und ihre Konsequenzen für das Erlernen eines Blechblasinstruments erörtert. Nach einer Betrachtung des Mundes als Quelle sensorischer-integrativer Funktion, erfolgt eine Einführung in die orofaziale Muskelfunktionstherapie mit ihren „myofunktionellen Übungen“. Für die klare bildliche Darstellung der Anatomie wurde ein separater, auch für „Nicht-Anatomen“ verständlicher, Bildband (Band 2 dieser Dissertationsschrift) verfasst. Der didaktische Teil dieser Arbeit widmet sich den aktuellen Lehrplänen und Lehrmitteln für den Instrumentalunterricht bei Trompete, Horn und Posaune. Hierfür wurde in einem ersten Schritt zunächst der Verbreitungsgrad von Anfänger-Instrumentalschulen für diese Blechbläser ermittelt. Für eine systematische und einheitliche Bewertung dieser Schulen war es dann in einem zweiten Schritt erforderlich, ein entsprechendes Bewertungsinstrument zu entwickeln, welches als der „Frankfurter Analysebogen für Instrumentalschulen (FAI)“ vorgestellt wird. Mit diesem Fragebogen wurden insgesamt 40 Instrumentalschulen für Trompete, Horn und Posaune analysiert und evaluiert (Band 3 dieser Dissertationsschrift). Zum Abschluss des Kapitels erfolgt eine Betrachtung der aktuellen VdM-Lehrpläne sowie des Jugendmusiker-Leistungsabzeichens der BDB-Bläserjugend. Im empirischen Teil werden im Wesentlichen die Ergebnisse und Implikationen der Studie "Moderner Instrumentalunterricht auf Blechblasinstrumenten" aus Sicht der Lehrkräfte sowie der Schülerinnen und Schüler dargestellt. Die Befragung von 140 Lehrkräften und 853 Schülerinnen und Schüler soll hierbei Antworten auf grundlegende Fragen der Didaktik im gegenwärtigen Blechbläserunterricht geben. Die interdisziplinäre Evaluationsstudie "Zur musikpädagogischen Bedeutung von myofunktionellen Übungen" eröffnet aufgrund ihrer Ergebnisse die Möglichkeit einer Weiterentwicklung der Methodik im Bereich der Blechbläserpädagogik.
Einleitung: Patienten nach operativen Eingriffen haben ein hohes Risiko in Folge von nosokomialen Infektionen, Wundinfekten oder Nahtdehiszensen eine Sepsis zu entwickeln. Die Sterblichkeitsraten des septischen Schocks haben sich mit 40-60% in den letzten 20 Jahren kaum verändert. Der Zeitpunkt der Diagnose und damit der frühzeitige Beginn v.a. einer kausalen, aber auch einer frühzeitigen supportiven Therapie sind entscheidende Determinanten der Überlebenswahrscheinlichkeit. Die vorliegende Arbeit untersucht erstmalig, ob IL-22, ein Mitglied der IL-10 Familie und, zur angeborenen Immunität gehörend, zur besseren Differenzierung von Inflammation und Infektion bei Patienten im perioperativen Kontext geeignet ist. Material & Methoden: 115 Patienten wurden in einem Zeitraum zwischen November 2005 und November 2007 in drei Gruppen untersucht. Nach Genehmigung durch die Ethikkommission wurden nach entsprechender Einwilligung durch die Patienten, oder die gesetzlichen Betreuer, zum einen Patienten mit schwerer Sepsis [n= 36], elektiven großen viszeralchirurgischen Eingriffen (CAB) [n= 31] und Patienten bei orthotoper Lebertransplantation (LTX) [n= 48] rekrutiert. Es wurden Blutproben prä-, postoperativ sowie an den ersten fünf postoperativen Tagen entnommen. Die Proben wurden unmittelbar nach Abnahme kühl zentrifugiert, aliquotiert und anschließend bei -70°C gelagert. Parallel wurden Blutkulturen angefertigt und Procalcitonin, IL-6, IL-10, Lipopolysaccharid-bindendes Protein (LBP), C-reaktives Protein (CRP) und Leukozyten sowie ein Standardlabor bestimmt. Mittels ELISA in Sandwichtechnik bestimmten wir in nachfolgenden Labormessungen die IL-22 Konzentrationen. IL-6, IL-10 und LBP wurden mittels Immulite® gemessen. Die Daten der Hämodynamik wurden entsprechend einem Protokoll erhoben und in einer Datenbank gespeichert. Ergebnisse: Große, elektive viszeralchirurgische Eingriffe sowie die orthotope LTX haben keinen Einfluss auf Serumkonzentrationen von IL-22. Die Blutspiegel liegen sowohl prä-, als auch postoperativ nahe unter der Nachweisgrenze von 10pg/ml (CAB 7,3pg/ml, LTX 9,4pg/ml). Patienten mit einer schweren Sepsis hatten im Vergleich zu Patienten nach viszeralchirurgischen Eingriffen signifikant höhere IL-22 Konzentrationen im Serum (75pg/ml, p= 0,003, Mann-Whitney-Test). Bei Unterteilung nach dem Sepsisfokus hatten Patienten mit einer vom Abdomen ausgehenden Infektion einen Median von 101,6pg/ml, bei Sepsis pulmonaler Genese eine signifikant niedrigere IL-22 Konzentration von 56,9pg/ml (p= 0,037). Die Stimulation von IL-22 hält postoperativ nach Fokussanierung bei Patienten mit abdomineller Sepsis an, so dass ein Abfall in den ersten fünf postoperativen Tagen bis auf 30% des Ausgangswertes beobachtet werden kann. Auch bei den LTX Patienten zeigt sich, wenn auch nicht signifikant, dass eine bakterielle Infektion (primäre Sepsis) zu einer deutlichen Stimulation von IL-22 führt (9,4pg/ml versus 49,7pg/ml bei Sepsis). Quo ad vitam führt IL-22 bei LTX Patienten in der 1-Jahresüberlebenswahrscheinlichkeit zu einer signifikanten Reduktion des Überlebens, wenn die präoperativen IL-22 Serumspiegel über 100pg/ml liegen. Eine kausale Verknüpfung kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht hergestellt werden. Der MELD Score (Model for end-stage liver disease) korreliert mit den erhobenen IL-22 Werten, so dass auch ein MELD > 30 mit erhöhten IL-22 Spiegeln einhergeht. Zusammenfassung: IL- 22 eignet sich im postoperativen Verlauf nach viszeralchirurgischen Eingriffen zur Detektion von Patienten mit schweren Komplikationen. Bei Erhöhung des IL-22 Serumspiegels >100pg/ml kann von einer Darmperfusionsstörung bzw. peritonealen Reizung ausgegangen werden. Unsere Daten weisen weiter darauf hin, dass bei schweren Perfusionsstörungen bis hin zu kompletter Ischämie einzelner Darmabschnitte Werte von >500pg/ml erreicht werden. Hingegen führen eine primäre Sepsis sowie Pneumonien zu einer IL-22 Stimulation mit Serumspiegeln zwischen 50 und 100pg/ml. Eine Korrelation mit anderen Markern der Inflammation war bei relativ kleinen Fallzahlen nicht zu beobachten. Lediglich auffällig erscheinen hohe IL-22 Spiegel, welche eher mit einer Leukopenie einhergehen als mit einer Leukozytose. Ist IL-22 bei Patienten vor Lebertransplantation erhöht, d.h. unabhängig einer Sepsis bei >100 pg/ml, ist die 1-Jahres Überlebenswahrscheinlichkeit signifikant erniedrigt. Dies korreliert entsprechend einer Überlebenswahrscheinlichkeit mit einem MELD>30 vor Transplantation. Hiermit ist zu prüfen, ob eine ggf. längerfristige Aktivierung der angeborenen Immunität bei Leberzirrhose vor Transplantation auf das Überleben nach Transplantation einen wesentlichen Einfluß hat. Eine entsprechende Anpassung der Therapie vor Transplantation könnte dann möglicherweise das eingeschränkte Überleben positiv beeinflussen.
Es gilt als erwiesen, dass nach Zahnextraktion die Resorption des Bündelknochens unvermeidlich ist. Dies kann einen horizontalen und vertikalen Knochenverlust zur Folge haben, der ein erhebliches Problem für eine spätere dentale Implantation darstellt. Nachdem die Therapiemethode der Sofortimplantation nicht immer die gewünschten Ergebnisse gezeigt hat, scheint das Konzept der Socket Preservation, bei dem unmittelbar nach Extraktion eine Augmentation der Alveole durchgeführt wird, ein vielversprechender Ansatz zur Lösung dieses klinischen Problems zu sein. Ziel dieser Studie war es, anhand von Patientenfällen zu klären, inwieweit bei Alveolen mit bukkalem Knochendefekt nach Zahnextraktion durch gesteuerte Knochenregeneration im Sinne einer Ridge Augmentation der Alveolarknochen erhalten werden und einem Kollaps der Hart- und Weichgewebe und der damit verbundenen narbigen Defektheilung vorgebeugt werden kann. Es wurden an 10 Patienten 11 Alveolen mit der Ridge Preservation Technik versorgt. Nach erfolgter Befundaufnahme und Aufklärung des Patienten wurde der betreffende Zahn extrahiert. Danach wurden die Breite der keratinisierten lingualen und bukkalen Gingiva gemessen sowie die Höhe und der Durchmesser der Alveole bestimmt. Im Anschluß erfolgte die Messung der Distanz zwischen der Höhe des Alveolarkamms im Zentrum der Alveole und der Höhe der Schmelz-‐ Zementgrenze des Nachbahrzahnssowie der Distanz zwischen der angrenzenden Fläche des Nachbahrzahnes und dem Zentrum der Alveole. Zum Abschluss wurde die horizontale und vertikale Ausdehnung des bukkalen Knochendefekts bestimmt. Dann wurde die Augmentation der Alveole mit Geistlich Bio Oss® Collagen und mit einer Bio Gide® Membran durchgeführt. Die Wundheilung wurde kontrolliert und dokumentiert. Nach 3 bis 6 Monaten Ausheilungszeit wurde die Implantation durchgeführt, wobei die oben beschriebenen Messungen nochmals durchgeführt und mit den Daten der ersten Operation verglichen wurden. Mittels einer Trepanbohrung wurde eine Biopsie gewonnen, die zunächst makroskopisch untersucht und dann zur histologischen Aufbereitung in ein klinisch-chemisch-histologisches Labor geschickt wurde. Alle Operationen verliefen erfolgreich ohne postoperative Wundheilungsstörungen und ohne Verlust einer Membran oder von Knochenersatzmaterial. Sowohl das Weichgewebe wie auch die knöchernen Strukturen zeigten in wenigen Fällen nur leichte Verluste. Das Profil des Alveolarkamms blieb somit in der überwiegenden Zahl der Fälle nahezu gänzlich erhalten. Bei 10 von 11 Alveolen (91%) konnte aufgrundder vollständigen Regeneration des bukkalen Knochendefekts ein Implantat ohne weitere Augmentation inseriert werden. Die makroskopische Auswertung der bei der Implantation gewonnen Biopsien ergab keine Auffälligkeiten. Die histologischeUntersuchung der Präparate zeigte neben bindegewebigen Einschlüssen des Biomaterials vorwiegend Bio Oss® -‐ Partikel, die vollständig von neu gebildetem Knochen umgeben waren und direkten Kontakt zu diesem hatten, was auf einen Einbau des Knochenersatzmaterials in den neu gebildeten Knochen hindeutet. Die histometrische Auswertung ergab, dass in den regenerierten Alveolen der flächenmäßige Anteil an Bindegewebe und Knochenmark überwog. Die Resorption der Bio Oss® -Partikel verlief unabhängig von der Zeitspanne der Ausheilung und war bis auf wenige Ausnahmen auch nach 6 Monaten noch nicht abgeschlossen. Auf Grundlage der gewonnen Ergebnisse lässt sich somit eine Therapieempfehlung für die Praxis ableiten. Die Augmentation einer Alveole mit bukkalem Knochendefekt mittels Bio Oss® Collagen und Bio Gide® führt mit hoher Wahrscheinlichkeit sowohl zu einer vollständigen Regeneration des knöchernen Defekts als auch zu einemErhalt des Alveolarkammprofils und kann damit einer narbigen Ausheilung vorbeugen. Eine Implantation erscheint allerdings aufgrund der langsamen Resorption von Bio Oss® erst nach 6 Monaten Ausheilungszeit sinnvoll zu sein.
Knochenszintigraphie beim Mammakarzinom - nur bei Knochenschmerzen und erhöhten Tumormarkern?
(2010)
Im Rahmen dieser retrospektiv angelegten Dissertation wird die Wertigkeit der beiden Indikatoren „Tumormarker“ und „Knochenschmerzen“ als Entscheidungsbasis zur Durchführung einer Knochenszintigraphie beim Mammakarzinom untersucht. Des Weiteren geht es um die Frage, ob es diesbezüglich Unterschiede in den einzelnen UICC-Stadien gibt. Zur Überprüfung des Indikators „Knochenschmerzen“ wurden die Daten von insgesamt 474 Patientinnen (Grundkollektiv) erfasst und ausgewertet. Auf dieser Basis wurde der Indikator „Tumormarker“ für ein weiteres Kollektiv von 253 Patientinnen untersucht. In beiden vergleichbaren Kollektiven wurden die Ergebnisse der Indikatoren mit denen der Knochenszintigraphie im Rahmen des Primärstagings (PS) und von Follow up-Untersuchungen (KO) in den einzelnen UICC-Stadien verglichen und Vierfeldertafeln angelegt, deren Auswertung mittels Fisher-Test erfolgte. Im Rahmen des Grundkollektivs wurden zwei Varianten getestet, wobei bei der Ersten eine örtliche Korrelation zwischen dem Schmerz der Patientin und dem Szintigraphiebefund bestehen musste, um das Gesamtergebnis als pathologisch zu werten. Bei der zweiten Variante war dies unbedeutend. Die erste Variante zeigte im PS und in den KO allseits unsignifikante Ergebnisse (p>0,05), wobei im PS eine Gesamtindikatorensensitivität von 21% erzielt wurde bei einer Indikatorenspezifität von 91%. Im Rahmen der KO betrugen diese 39% und 55%, wobei hier ein Anstieg der Indikatorenspezifität proportional zum UICC-Stadium von 50% auf 65% beobachtet wurde. Des Weiteren konnten keine Stadienunterschiede festgestellt werden. In der zweiten Variante zeigte sich eine deutliche Signifikanz des Gesamtkollektivs im Rahmen des PS (p<0,01), bei einer Indikatorensensitivität von nur 30% und einer Spezifität von 92%. Die Ergebnisse bei den KO waren unsignifikant (p> 0, 05), mit einer Indikatorensensitivität von 46% und einer Indikatorenspezifität von 60%, wobei auch hier ein Spezifitätsanstieg proportional zum Stadium von 60% auf 100% verzeichnet wurde ohne sonstige stadienspezifische Unterschiede. Im Rahmen der KO wurden zur Deckung der Fallzahl Mehrfachuntersuchungen miteinbezogen, die zu einer Verfälschung des Ergebnisses geführt haben könnten. Zur Untersuchung der Tumormarker wurden CEA und CA 15.3 als Indikatoren erfasst und mit den Ergebnissen des Skelettszintigramms ebenfalls in zwei Varianten verglichen. Im Rahmen der ersten Variante wurde der Gesamtindikator lediglich als „positiv“ gewertet, wenn beide Werte positiv waren. Bei der zweiten Variante wurde der Gesamtindikator auch als positiv gewertet, wenn lediglich einer der Werte oder beide positiv waren. Die Ergebnisse des PS im Rahmen der ersten Variante erwiesen sich als unsignifikant (p>0,1), bei einer Indikatorensensitivität des Gesamtkollektivs von 8% und einer Spezifität von 86%. Die Ergebnisse der KO waren deutlich signifikant (p<0,001), bei einer Indikatorensensitivität von 68% und einer Indikatorenspezifität von 83% ohne Unterschiede der Variante in den Einzelstadien. In der zweiten Variante konnten im Rahmen des PS ebenfalls keine signifikanten Ergebnisse erzielt werden (p>0,1). Die Gesamtindikatorensensitivität lag hier bei 25%, bei einer Indikatorenspezifität von 63%. Auch bei dieser Variante waren die Ergebnisse der KO allseits signifikant (p<0,001). Lediglich das UICC IV-Kollektiv wies eine verminderte Signifikanz auf (p=0,095), was auf die kleine Fallzahl von 35 Patientinnen zurückzuführen sein könnte, da sich auch die Indikatorensensitivität und - spezifität nicht von den Werten der anderen UICC-Stadien unterschieden. Die Gesamtindikatorensensitivität lag bei 90%, die Spezifität bei 50% ohne Unterschiede im Bezug auf die Einzelstadien. Im Rahmen einer logistischen Regression mit Abbau wurden folgende Indikatoren mit eingeschlossen: Schmerzen, Tumormarker einzeln (CEA und CA 15.3), Lymphknotenstatus, Hormonrezeptorstatus und UICC-Stadium. Der Vorteil lag darin, dass Mehrfachuntersuchungen vermieden wurden. Im Gesamtassay wurde der höchste Vorhersagewert mit 76,6% erreicht. Dieser unterscheidet sich im Wesentlichen nur marginal von der Aussagekraft der reinen CA 15.3-Bestimmung (75,0%), wobei hier die Indikatorensensitivitäten beide bei 76,8% liegen, bei leicht verminderter Indikatorenspezifität in der CA 15.3-Gruppe. Dasselbe gilt allerdings auch für den Assay aus Schmerzen, CEA und CA 15.3, da Schmerzen und CEA praktisch keinen Einfluss auf die Modellgüte haben. Ein Assay aus Lymphknotenstatus und CA 15.3 verbessert die Indikatorensensitivität auf bis zu 78,6%, wobei die Gesamtvorhersagegüte auf Grund einer deutlich verminderten Indikatorenspezifität von 69,4% allgemein niedriger ist (73,4%). In der Praxis wäre der Lymphknotenstatus als Indikaton jedoch schwer umzusetzen. Im Allgemeinen kann man aus den Ergebnissen schließen, dass der Indikator „Schmerzen“ in keinem Fall ein geeignetes Kriterium zur Entscheidungsfindung für eine Knochenszintigraphie ist. Auch hat sich gezeigt, dass der Tumormarker CEA von minderer Relevanz bei dieser Entscheidung ist. Es konnten des Weiteren keine relevanten Unterschiede im Bezug auf die einzelnen UICC-Stadien festgestellt werden. Der am besten geeignete Assay besteht aus CA 15-3 als Einzelindikator mit einer Indikatorensensitivität von 76,8%. Da jede vierte Patientin mit Skelettmetastasen im Rahmen dieses Assays jedoch übersehen würde, ist es nicht vertretbar, sich in jedem Fall nur auf diesen Indikator zu stützen, weil vorangehende Arbeiten gezeigt haben, dass eine frühzeitige Erkennung und Therapie von Skelettmetastasen zu einer deutlichen Verminderung der Morbidität führt.
Die Röntgenstrukturanalyse ist eine der wichtigsten analytischen Methoden zur Bestimmung der Kristallstrukturen und zur Aufklärung von Struktur-Eigenschaftsbeziehungen. Voraussetzung für eine Röntgenstrukturanalyse ist ein Einkristall mit einer Größe von ca. 1-10 mikro m. Jedoch gibt es eine Vielzahl an Verbindungen, bei denen es aufgrund ihrer geringen Löslichkeit nicht gelingt, hinreichend große Kristalle zu erzeugen. In dieser Arbeit konnte aufgezeigt werden, dass die Kristallstrukturen solcher schwerlöslichen Verbindungen aus Röntgenpulverdaten bestimmt werden können. Organische Pigmente haben eine geringe Löslichkeit. Sie werden daher im Anwendungsmedium nicht gelöst, sondern fein dispergiert. Die Teilchengrößen liegen typischerweise im Bereich von 50-500 nm. Bedingt durch die Schwerlöslichkeit lassen sich nur selten Einkristalle züchten. Jedoch kann die Kristallinität häufig durch Lösungsmittelbehandlung verbessert werden. Dies ermöglicht die Strukturbestimmung aus den Röntgenpulverdaten. Die untersuchten organischen Pigmente haben allesamt ungewöhnliche Eigenschaften: So zeigen beispielsweise Pigment Yellow 101 und einige seiner Derivate sowie einige mesoionischen Pigmente Fluoreszenz im Festkörper. Die Fluoreszenz-Eigenschaften dieser Verbindungen waren bisher nur begrenzt verstanden. In dieser Arbeit konnten sieben Kristallstrukturen von festkörperfluoreszenten Pigmenten bestimmt und so ein Beitrag zum Verständnis der Festkörper-Fluoreszenz geleistet werden. Pigment Yellow 183 und Pigment Yellow 191 sind gelbe verlackte Azopigmente, die großtechnisch zur Einfärbung von Kunststoffen verwendet werden. Hier konnten erstmals Einkristalle erhalten werden, und drei Kristallstrukturen bestimmt werden. Alle drei Kristallstrukturen weisen ungewöhnliche Strukturmerkmale auf: eine der beiden Sulfonatgruppen koordiniert nicht an das Ca2+-Ion oder an ein Lösungsmittelmolekül, sondern bildet nur intermolekulare van der Waals-Wechselwirkungen. Wodurch elektrostatisch ungünstige Separation von Kation (Ca2+) und Anion (RSO3-) verursacht wird, bleibt unklar. Die Benzimidazolon-Pigmente sind industriell sehr wichtige Azo-Pigmente mit exzellenter Lichtstabilität und hervorragender thermischer Stabilität. Im Rahmen dieser Arbeit gelang es erstmals, Einkristalle eines Solvates eines kommerziellen Benzimidazolon-Pigmentes zu züchten und die Struktur durch Röntgenstrukturanalyse zu bestimmen. Bei zwei weiteren kommerziellen Benzimidazolon-Pigmenten wurden die Kristallstrukturen aus Röntgenpulverdiagrammen bestimmt, wobei die Strukturlösung mit simulated-annealing-Methoden (Programm DASH) erfolgte. Das Pigment Yellow 213 ist ein neu entwickeltes Pigment für Wasserbasislacke, welches sich durch seine hohe Lichtechtheit auszeichnet. Mithilfe der Kristallstruktur konnten Eigenschaften dieser Verbindungen erklärt werden. Alle kommerziellen Azo-Pigmente liegen im Festkörper nicht in der Azoform, sondern in der hydrazon-tautomeren Form vor. Die Pigmente sind daher, streng genommen, keine Azo-Pigmente, sondern Hydrazon-Pigmente. Es gibt jedoch Ausnahmen: Für zwei p-dialkylamino-substitutierte Azopigmente auf beta-Naphthol-Basis konnte durch Einkristallstrukturanalysen aufgezeigt werden, dass die Azoform im Festkörper überwiegt. Es handelt sich hierbei also um den seltenen Fall „wirklicher Azo-Pigmente“. Die in dieser Arbeit untersuchten Verbindungen Bis-(acetoacetyl)-p-phenylen-diamin (DAEP) und 5-(Acetoacetylamino)benzimidazolon sind Vorprodukte für die Synthesen verschiedener industrieller Azo-Pigmente. Bei beiden Verbindungen gelang es, die Kristallstrukturen aus Röntgenpulverdiagrammen zu lösen. Die Orientierung der endständigen -COCH3-Gruppen lässt sich allerdings nicht mit Sicherheit feststellen (weil ein O-Atom fast die gleiche Streukraft besitzt wie eine CH3-Gruppe). Die Pulverstrukturlösungen wurden daher mit Gitterenergieberechnungen mittels dispersion-korrigierten Dichtefunktionalrechnungen kombiniert. Derartige dispersions-korrigierte DFT-Rechnungen im Festkörper könnten zukünftig auch in anderen Fällen zur Validierung von Kristallstrukturen, die aus Röntgenpulverdaten bestimmt wurden, dienen. Die Verbindungen Omeprazol, Rasagilin und Risedronat sind pharmazeutische Wirkstoffe. An verschiedenen Salzen dieser pharmazeutischen Wirkstoffe wurden Polymorphieuntersuchungen durchgeführt. Dabei wurden für Omeprazol vier, für Rasagilin eine und für Risedronat vier neue Phasen gefunden. Zudem konnten für Rasagilin und Omeprazol jeweils eine und für Risedronat drei Kristallstrukturen bestimmt werden, die es erlauben Eigenschaften wie außergewöhnliche Feuchtigkeitsbeständigkeit oder Bioverfügbarkeiten zu erklären. Für Risedronat wurde ein bisher unbekanntes Solvat gefunden (Essigsäure Disolvat), das patentiert wurde. Auch hier konnte die Kristallstruktur aufgeklärt werden. In dieser Arbeit wird aufzeigt, dass es bei schwerlöslichen Pigmenten, deren Vorprodukten sowie von pharmazeutischen Wirkstoffen in etlichen Fällen möglich ist, Einkristalle zu züchten (wenn auch mit großem Aufwand), sodass man die Kristallstrukturen durch Röntgenstrukturanalyse ermitteln kann. Für die Verbindungen, bei denen keine hinreichend großen Einkristalle erhalten werden konnten, gelang es in den meisten Fällen, die Kristallstrukturen aus Röntgenpulverdiagrammen zu bestimmen, und anschließend Struktur-Eigenschaftsbeziehungen abzuleiten.