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Die Lyme-Borreliose stellt in Deutschland mit ca. 60.000 Neuinfektionen pro Jahr die am häufigsten durch Zecken übertragene Zoonose beim Menschen dar. Obwohl adäquat antibiotisch therapiert, konnte in wenigen Fällen bei Patienten mit Erythema migrans eine persistierende Borrelieninfektion nachgewiesen werden. Die zugrunde liegenden Mechanismen einer möglichen Antibiotikaresistenz sind jedoch nur unzureichend untersucht. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde daher der Frage nachgegangen, ob und wie B. burgdorferi der inhibitorischen Wirkung von Antibiotika entgehen. Basierend auf einer vergleichenden Proteomanalyse von antibiotisch behandelten und unbehandelten Borrelienzellen, sollten Unterschiede in den Proteinsignaturen einzelner Moleküle, als Ausdruck einer koordinierten Abwehrreaktion aufgezeigt werden. Die unter subinhibitorischen Antibiotikakonzentrationen inkubierten Borrelienzellen wiesen mikroskopisch keine morphologischen Veränderungen auf. Gleichermaßen konnten keine signifikanten Unterschiede in der Proteinexpression nachgewiesen werden. Sichtbare, strukturelle Veränderungen liessen sich erst in Gegenwart von 0,5mg/l bis 1mg/l Penicillin bzw. Doxycyclin nachweisen, was der MHK beider Antibiotika entsprach. Die unter identischen Bedingungen durchgeführte Proteomanalyse ergab eine deutliche Veränderung bei 14 Proteinen der mit Penicillin-behandelten Borrelienzellen und 5 Proteinen der mit Doxycyclin-behandelten Borrelienzellen. Mit Ausnahme eines einzelnen Proteins waren alle anderen Moleküle durch eine signifikante Repression gekennzeichnet. Interessanterweise wurde die Expression bei drei Proteinen sowohl von Penicillin als auch von Doxycyclin beeinflusst. Mittels massenspektrometrischer Analyse (MALDI-TOF-MS) konnten insgesamt 9 zytoplasmatische Proteine und ein membranständiges, porenbildendes Protein (p66) eindeutig identifiziert werden. Von den im Zytoplasma lokalisierten Proteinen besitzen vier Proteine als Isomerasen, Transferasen, bzw. Kinasen enzymatische Aktivität und ein Protein (FtsZ) ist bei der Zellteilung beteiligt. Die Ergebnisse dieser Studie lassen vermuten, dass Borrelien auf Penicillin und Doxycyclin mit einem koordinierten Regulations- bzw. Abwehrmechanismus reagieren, der in unterschiedliche Stoffwechselprozesse eingreift. Inwieweit dieser Antibiotika-induzierte Prozess als Stressantwort zu deuten ist oder Teil eines Resistenzmechanismus darstellt, sollte Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein.
Die Kombination aus proteolytischer Spaltung, massenspektrometrischer Analyse und Datenbanksuche ist eine etablierte Methode zur Identifizierung von Proteinen. Ist die Identität eines Proteins geklärt, dann stellt sich im Anschluß daran häufig die Frage nach den posttranslationalen Modifikationen des Proteins. Auch hierfür ist die Massenspektrometrie eine prädestinierte und häufig angewandte Methode. Eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen eukaryotischer Proteine ist die Phosphorylierung an Ser-, Thr- und Tyr-Resten. In der vorliegenden Arbeit ist die Weiterentwicklung und Anwendung zweier massenspektrornetrischer Methoden zur Analyse der Proteinphosphorylierung beschrieben: i) der Neutralverlust-Scan zur selektiven Detektion von Ser/Thr-phosphorylierten Peptiden, und ii) die Metallaffinitätschromatographie zur selektiven Anreicherung von Phosphopeptiden. Bei der Optimierung der Analytik der Proteinphosphorylierung mittels Neutralverlust-Scan hatte sich am Beispiel der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A gezeigt, dass die Verwendung einer Protease mit geringer Spaltungsspezifität (Elastase) wesentliche Vorteile gegenüber einer Protease mit hoher Spaltungsspezifität (Trypsin) besitzt. Die kleineren Elastase-generierten Phosphopeptide zeigen im Vergleich zu den Trypsin-generierten Phosphopeptiden eine effektivere Phosphorsäure-Abspaltung und lassen sich im Neutralverlust-Scan mit deutlich besserer Empfindlichkeit detektieren. in weiterer Vorteil der Elastase ist in ihrer Eigenschaft partiell überlappende Peptide zu generieren begründet. Die Metallaffinitätschrornatographie wurde eingesetzt, um die Elastase-generierten Phosphopeptide selektiv anzureichern. Es konnte gezeigt werden, dass die Metallaffinitätschromatographie eine geeignete Methode ist, um die Komplexität des Elastase-generierten Peptidgemischs drastisch zu reduzieren, so dass eine automatische Fragmentionen-Analyse aller angereicherten Peptide mittels nanoESl möglich ist. Die Leistungsfähigkeit der Kombination aus Elastase-Verdau, Metallaffinitätschromatographie und Q-TOF- Tandem-MS wurde am Beispiel des Transkriptionsinitiationsfaktors IA unter Beweis gestellt, wo mit Hilfe dieser Analysen-Strategie drei bislang unbekannte in-vivo-Phosphorylierungsstellen nachgewiesen werden konnten. Neben der Proteinphosphorylierung wurden in dieser Arbeit auch eine Reihe anderer kovalenter Modifikationen untersucht. Bei der Analyse der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A konnten neben einer bislang unbekannten fünften Phosphorylierungsstelle an Ser259 auch die Modifikation von Cys343 durch Glutathion und die N-terminale Modifikation durch Gluconsäure nachgewiesen werden. Mittels Q-TOF-Tandem-MS wurde die in-vivo-Myristoylierung des humanen Proteins GAPR 1 nachgewiesen. Mittels der sog Top-Down-Analyse wurde am Beispiel des Proteins Dynamin A gezeigt, wie mittels dieser Strategie eine vollständige Charakterisierung aller kovalenten Modifikationen eines Proteins erreicht werden kann. Im Falle von Dynamin A konnte die Acetylierung des N-terminalen Methionins nachgewiesen werden. Andere kovalente Modifikationen konnten ausgeschlossen werden. Im letzten Kapitel der vorliegenden Arbeit wird am Beispiel von Dynamin A gezeigt, wie sich die Kombination aus partieller proteolytischer Spaltung, Tandem-MS und Datenbanksuche effektiv zur Charakterisierung der Domänenstruktur von Proteinen einsetzen lässt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der tonische BZR-Signalweg im Burkitt Lymphom näher untersucht werden. Ziel war die Identifizierung von Zielstrukturen, die für die Zellen essentiell für die Aufrechterhaltung des tonischen Signalwegs sind und gleichzeitig die Viabilität der Zellen fördern. Durch die Identifizierung noch unbekannter Zielstrukturen wäre man in der Lage, neue Behandlungsstrategien zu entwickeln oder bereits bestehende zu optimieren. Des Weiteren sollte die Signaltransduktion in der B-ALL, die über einen Vorläufer des BZRs, dem prä-BZR vermittelt wird, hinsichtlich eines tonischen Überlebenssignals untersucht werden.
Durch massenspektrometrische Analysen der tonischen BZR-Signaltransduktion im Burkitt Lymphom, die für die Viabilität der Zellen essentiell ist und die Ergebnisse eines Inhibitorscreens konnte HSP90 als potenzielle neue Zielstruktur im Burkitt Lymphom identifiziert werden.
So konnte gezeigt werden, dass Burkitt-Lymphom-Zellen nach Inhibition der Chaperonfunktion von HSP90 durch zwei auf dem Markt bereits verfügbare Inhibitoren einen Zellzyklusarrest erfahren, der letztlich zur Apoptose der Zellen führt. Dieser Effekt wurde auf einen Verlust des (tonischen) BZR-Signals zurückgeführt, der überwiegend durch den aktiven lysosomalen Abbau von SYK nach HSP90-Inhibition zustande kommt. Demnach führte die Überexpression einer HSP90-resistenten Variante von SYK (TEL-SYK) zu einer Aufhebung der apoptotischen Effekte nach HSP90-Inhibition. Zudem wurde SYK als Interaktionspartner von HSP90 (HSP90-Klientprotein) im Burkitt Lymphom und die für die Interaktion essentielle Phosphorylierungsstelle (pY197 in HSP90α bzw. pY192 in HSP90β) identifiziert bzw. validiert.
Das therapeutische Potenzial der HSP90-Inhibitoren im Burkitt Lymphom offenbarte sich ferner durch den Vergleich der Wirkungseffektivität in gesunden B-Zellen mit der in Tumorzellen. So zeigten HSP90-Inhibitoren eine erhöhte Affinität zu Tumorzellen. Bei verwendeten Konzentrationen der Inhibitoren, die bereits eine apoptotische Wirkung in Tumorzellen hervorriefen, waren gesunde B-Zellen resistent.
In der B-ALL konnte durch den Knockdown von CD79a und der Inhibition von SYK eine tonische Antigenrezeptor-Signalleitung identifiziert werden, die wie im Burkitt Lymphom über den PI3K/AKT-Signalweg vermittelt wird. Durch die Kombination der im Rahmen dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse und weiterführende Analysen (wie zum Beispiel durch Inhibitor- oder CRISPR/Cas-Screens) kann so eine Identifizierung von potenziellen Zielstrukturen mit therapeutischem Nutzen in der B-ALL erfolgen.
Das humane Genom besteht zu etwa 8% aus retroviralen Sequenzen. Davon sind ca. 1-2% dem humanen endogenen Retrovirus K (HERV-K) zuzuordnen. Das Virus ist mit ca. 30-50 Proviren und ca. 10.000 sLTRs im humanen Genom vertreten. HERV-K besitzt intakte ORFs für alle retroviralen Proteine und zusätzlich ein ORF für das akzessorische Protein Rec. Obwohl eine basale Transkription in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden konnte, ist eine Expression von HERV-K Proteinen und Viruspartikeln nur in Keimzelltumoren nachgewiesen worden. In dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation des gewebespezifischen Promotors von HERV-K näher charakterisiert. Hierbei wurden regulatorisch wichtige Sequenzen mit Hilfe des Luziferase-Assays eingegrenzt. Transkriptionell sensitive Regionen wurden daraufhin im EMSA auf die Bindung von Transkriptionsfaktoren untersucht. Durch transiente Transfektionen von Luziferasereporterkonstrukten in verschiedenen Zelllinien stellte sich heraus, dass HERV-K LTRs in Keimzelltumorzellen aktiv sind, dass es aber auch inaktive LTRs gibt, die im Zuge der Evolution durch Punktmutationen ihre transkriptionelle Aktivität verloren haben. Aktive und inaktive LTRs unterscheiden sich durch Punktmutationen, die sich in verschiedenen Sequenzabschnitten häufen. Chimäre Konstrukte aus aktiven und inaktiven Sequenzabschnitten und gezielte Mutationen und Deletionen in aktiven HERV-K LTRs enthüllten verschiedene DNA-Bereiche, die transkriptionelle Sensitivität aufweisen. Die LTR-Bereiche bps 572-578, bps 757-798 und bps 809-823 waren im Aktivitäts-Assay besonders empfindlich gegenüber Mutation. In diesen Bereichen liegen zum einen GC/GT-Boxen, also Konsensussequenzen für die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3, zum anderen Konsensussequenzen für ein Inr und ein DPE. Das Binden von Sp1 und Sp3 auf den GC/GT-Boxen der bps 757-798 konnte durch eine EMSA-Analyse bewiesen werden. Der transkriptionell sensitive Bereich der bps 572-578 weist eine weitere putative GC/GT-Box auf. Die TATA-Box bei bp 532 zeigte sich unempfindlich gegenüber Mutation. Eine Beteiligung dieser Konsensussequenz am basalen Promotor wurde deshalb ausgeschlossen. Unterstützt durch die Ergebnisse einer 5’-RACE, ein Verfahren, dass den Transkriptionsstart eines bestimmten Gens bestimmen kann, konnte gezeigt werden, dass der basale HERV-K Promotor aus Konsensusequenzen für die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3 , einem Inr und einem DPE besteht. Sp1 und Sp3 sind ubiquitäre Transkriptionsfaktoren, die durch ihr Mengenverhältnis in einem bestimmten Gewebe oder durch posttranslationale Modifikationen unterschiedliche Auswirkungen auf die Transkription haben können. Diese Eigenschaften könnten zur Gewebespezifität von HERV-K beitragen. Die Core Promotor Komponenten Inr und DPE sind für die korrekte Positionierung von TFIID und damit der PolII verantwortlich. Des weiteren wurde eine starke Beteiligung des Testis-spezifischen Transkriptionsfaktors SRY an der Transkription von HERV-K belegt. Im Luziferase-Assay konnte ein SRY-Expressionsplasmid die Transkription eines aktiven LTRs in GH- wie auch in HeLa-Zellen steigern. Ein Indiz dafür, dass es sich um einen für die Transkription von HERV-K essentiellen Faktor handelt. Verschiedene SRY-Konsensussequenzen auf der HERV-K LTR machen eine Wirkung in cis wahrscheinlich, doch könnte auch in trans ein für die Transkription wichtiger Transkriptionsfaktor in seiner Expression verstärkt werden. Ebenfalls konnte bewiesen werden, dass epigenetische Mechanismen eine starke Rolle bei der Transkription von HERV-K spielen. Die Methylierung eines LTR-haltigen Luziferase-Reportervektors führte zum fast vollständigen Verlust der transkriptionellen Aktivität. Es bleibt abzuwarten, in welcher Weise die Schlüsselkomponenten Sp1, Sp3, SRY und Hypermethylierung des HERV-K Genoms zur Gewebespezifität von HERV-K beitragen.
Die vaskuläre NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS). Viele dieser Daten wurden unter Verwendung des Inhibitors Apocynin (4'-Hydroxy-3' methoxyacetophenon) erhoben, dessen Wirkungsweise jedoch nicht bekannt war. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Hemmung der vaskulären NADPH-Oxidase näher untersucht, sowie nach weiteren Inhibitoren gesucht. In HEK293-Zellen wurden die NADPH-Oxidase-Isoformen Nox1, Nox2, Nox4, Duox1 oder Duox2 überexprimiert und die von den Zellen produzierten Radikale durch verstärkte Chemilumineszenz gemessen. Hierbei wurde festgestellt, dass Apocynin die Produktion von Superoxidanionen nicht hemmt, aber die Detektion von Wasserstoffperoxid- oder Hydroxylradikalen beeinflusst. Wenn die Radikale durch Xanthin/Xanthin-Oxidase oder nicht-enzymatische Systeme generiert wurden, beeinflusste Apocynin direkt die Peroxid-, aber nicht die Superoxid-Detektion. In Leukozyten ist Apocynin ein Pro-Pharmakon, das durch Myeloperoxidase (MPO) aktiviert werden kann. Dieser Prozess führt zur Bildung eines Apocyninradikals, das zu einem Dimer umgewandelt wird. Allerdings kann man aufgrund der hohen Reaktivität des Radikals nur das Dimer nachweisen. Endothelzellen und glatte Muskelzellen sind nicht in der Lage dieses Dimer zu bilden und können daher Apocynin nicht aktivieren. In Nox-überexprimierenden HEK293-Zellen konnte die Dimer-Bildung gezeigt werden, wenn MPO zugegeben wurde. Apocynin kann ohne MPO-Zugabe nur die NADPH-Oxidase in Leukozyten hemmen und wirkt in vaskulären Zellen als Antioxidans. Tatsächlich wurde in vaskulären glatten Muskelzellen die Aktivierung der redoxsensitiven Kinasen p38-MAP-Kinase, Akt und Erk1/2 durch Wasserstoffperoxid und durch den intrazellulären Radikal-Generator Menadion in Anwesenheit von Apocynin verhindert. Des Weiteren wurde untersucht, ob Cyclooxygenase 2 (COX-2), die eine ähnliche Peroxidase-Domäne wie MPO besitzt, mit Apocynin interagiert. Die COX-2-Aktivität wurde durch Apocynin gehemmt. In COX-2 überexprimierenden HEK293- Zellen wurden die Superoxidanion- sowie die Wasserstoffperoxid-Bildung durch Apocynin völlig gehemmt. Allerdings konnte durch die Peroxidaseaktivität von COX-2 Apocynin nicht aktiviert und somit kein Dimer nachgewiesen werden. Diese Beobachtung unterstützt ferner die unspezifische Natur der Nox-Hemmung durch Apocynin.Intravenös appliziertes Apocynin in Mäusen und Schweinen führte zu einer Aktivierung von Apocynin. In vivo wirkt Apocynin somit als möglicher Nox2-Inhibitor und als Antioxidans. Flavonoide, insbesondere die des Katechol-Typs, in dem der B-Ring monomethyliert ist, haben eine ähnliche Struktur wie Apocynin. Daher wurde in dieser Arbeit auch das Potenzial der Flavonoide Epicatechin, 3'-O-Methyl-Epicatechin, Procyanidin B2 und Isorhamnetin als Inhibitoren der NADPH-Oxidase analysiert. Nox-überexprimierende HEK293-Zellen (Nox1, Nox2 sowie Nox4) wurden mit verschiedenen Flavonoiden inkubiert und die ROS-Bildung mittels verstärkter Chemilumineszenz gemessen. Epicatechin und Procyanidin B2 hemmten die Radikal-Detektion der verschiedenen Nox-Isoformen in allen Detektionssystemen. Isorhamnetin hemmte die Radikal-Detektion durch Nox1 nur leicht, allerdings wurde die Bildung der Radikale durch Nox4 und Nox2 fast komplett blockiert. 3'-O-Methyl-Epicatechin wies die schwächste antioxidative Wirkung auf. Es hemmte zwar die Wasserstoffperoxidbildung, jedoch kaum die Nox1- und Nox2-abhängige Superoxidanion-Bildung. Keine der getesteten Substanzen konnte den „respiratorischen Burst“ in mit Phorbolmyristatacetat stimulierten Leukozyten blockieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass Apocynin und Katechine potente Antioxidantien für Wasserstoffperoxid, aber keine spezifischen NADPH-Oxidase- Hemmer in vaskulären Systemen sind.
Durch die Behandlung HIV-positiver Patienten mit einer Kombinationstherapie verschiedener antiviraler Substanzen (HAART = hochaktive antiretrovirale Therapie) kann die Virusreplikation über einen längeren Zeitraum unterdrückt werden. Allerdings hat diese Therapie Limitationen. Die Medikamente verursachen hohe Therapiekosten, haben zum Teil starke Nebenwirkungen und es entstehen mit der Zeit resistente Viren. Eine Alternative besteht in der somatischen Gentherapie der HIV-Infektion. Bei diesen Ansätzen werden Zellen der Patienten genetisch modifiziert, so dass sie ein antivirales Genprodukt exprimieren. In der vorliegenden Arbeit wurde ein membrangebundenes, antivirales C46 Peptid (maC46) sowohl in vitro in Zelllinien und primären humanen T-Zellen als auch in vivo in zwei humanisierten Mausmodellen getestet. Das C46 Peptid entstammt der C-terminalen "heptad repeat" Sequenz des HIV Hüllproteins gp41. C-Peptide wie C46 oder auch T20, welches bereits für die HAART Therapie zugelassen ist, binden während der Fusion des Virus mit der Zielzelle an gp41 und inhibieren so die Fusion. Werden T-Zelllinien oder primäre humane T-Zellen mit einem gammaretroviralen Vektor, der maC46 codiert, transduziert, können sie sehr effizient vor einer Infektion mit HIV geschützt werden [30]. Dieser Vektor wurde bereits in einer klinischen Studie mit T-Zellen von 10 HIV-positiven Patienten getestet [142]. Dabei konnte allerdings kein antiviraler Effekt der Gentherapie beobachtet werden. Hier wurde nun ein lentiviraler Vektor für maC46 (LV-maC46-GFP) verwendet. Lentivirale Vektoren transduzieren im Gegensatz zu gammaretroviralen auch ruhende Zellen, was ein kürzeres ex vivo Aktivierungs- und Transduktionsprotokoll ermöglicht. Außerdem ist für lentivirale Vektoren das Risiko der Transformation der Zelle niedriger als für gammaretrovirale. Für eine mögliche klinische Anwendung sollte es daher tolerierbar sein, für lentivirale Vektoren eine höhere MOI zu verwenden als für gammaretrovirale. Eine höhere Transduktionseffizienz sollte auf der anderen Seite auch eine effektive und langanhaltende Transgenexpression ermöglichen. Zunächst wurde gezeigt, dass sowohl die T-Zelllinie PM-1 als auch primäre humane T-Zellen nach Transduktion mit LV-maC46-GFP vor einer Infektion mit HIV geschützt waren und während der Infektion einer gemischten Kultur einen Selektionsvorteil gegenüber nicht-transduzierten Zellen hatten. Dabei konnte auch durch konfokale Mikroskopie gezeigt werden, dass das Virus die maC46-exprimierenden Zellen nicht injizieren konnte, sondern lediglich auf der Zelloberfläche gebunden wurde. Im Weiteren wurden zwei humanisierte Mausmodelle etabliert, um LV-maC46-GFP in vivo zu testen. Im humanen Immunsystem Mausmodell (HIS-Mausmodell) wurden immundefiziente Mäuse mit humanen Blutstammzellen repopuliert. In den Tieren kam es zu einer de novo Bildung von humanen, reifen T-Lymphozyten durch Thymopoese. Dabei wurden im Blut der Tiere humane, maC46- exprimierende CD4+ T-Zellen detektiert. Nach Infektion der Tiere mit HIV wurden diese T-Zellen depletiert. Es kam allerdings nicht zu einer Anreicherung oder einem selektiven Überleben der genmodifizierten T-Zellen. Eine Erklärung dafür könnte eine gestörte T-Zellhomeostase in den Tieren sein. Das zweite humanisierte Mausmodell (T-Zellmausmodell) verwendete immundefiziente Mäuse, die mit transduzierten humanen T-Zellen repopuliert wurden. Die Infektion mit HIV erfolgte entweder in vitro vor Transplantation der Zellen oder in vivo nach Repopulierung der Tiere. In beiden Fällen konnte ein selektives Überleben maC46-exprimierender CD4+ T-Zellen nach HIV-Infektion beobachtet werden. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Weiterentwicklung von maC46, eine sekretierte Variante des C46-Peptids (iSAVE), im T-Zellmausmodell getestet. Ein sekretierter Fusionsinhibitor stellt insofern eine Weiterentwicklung des membrangebundenen dar, als nicht nur die genmodifizierten Zellen, sondern zusätzlich auch nicht-modifizierte Nachbarzellen vor einer Infektion mit HIV geschützt werden könnten. Dadurch erhöht sich auch das Spektrum an möglichen Produzentenzellen für den Fusionsinhibitor. In den hier beschriebenen Experimenten wurden humane T-Zellen entweder mit einem gammaretroviralen (RV-iSAVE) oder einem lentiviralen Vektor (LV-iSAVE) transduziert und die Experssion das iSAVE-Peptids wurde im Serum der Tiere gemessen. In beiden Ansätzen konnte iSAVE Peptid im Serum der Tiere detektiert werden. In weiteren Experimenten sollte nun untersucht werden, ob dieses in vivo sekretierte iSAVE Peptid antiviral aktiv ist und die humanisierten Mäuse vor einer Infektion mit HIV schützen kann.
Innerhalb des adaptiven Immunsystems spielt der Major Histocompatibility Complex (MHC)-Klasse I-Weg der Antigenpräsentation eine essenzielle Rolle bei der Erkennung und Zerstörung Virus-infizierter Zellen. Ein grundlegender Schritt innerhalb dieses Prozesses ist die Translokation endogener Peptide durch den transporter associated with antigen processing (TAP) in das ER-Lumen. Der TAP-Transporter ist zusammen mit verschiedenen Chaperonen und weiteren Faktoren in einem Peptidbeladungskomplex (PLC) assoziiert. Insbesondere Herpesviren, die durch eine lebenslange Persistenz im Wirt und wiederkehrende Reaktivierung unter Stresssituationen gekennzeichnet sind, interferieren direkt mit dem PLC und dem TAP-Transporter. Das varicellovirale Typ-I-Membranprotein UL49.5 inhibiert den TAP-Komplex, wobei das Protein des Rinderherpesvirus (Bovines Herpesvirus 1, BHV-1) zusätzlich die proteasomale Degradation verschiedener Komponenten des PLCs einleitet. Dieser Mechanismus wird durch die C-terminale Domäne des UL49.5-Proteins vermittelt und ist von keinem anderen Virusprotein bekannt. Welche Aminosäuren des Virusproteins jedoch für diese Inhibition und Degradation essenziell sind, wurde bisher nicht aufgeklärt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die Funktionsweise des BHV-1 UL49.5-Proteins zu verstehen und insbesondere zu analysieren, welche Bereiche des Proteins für die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes verantwortlich sind. Das UL49.5-Protein wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgreich in Insektenzellen und in HeLa-Zellen exprimiert. Mittels Coimmunpräzipitation (Co-IP) wurde daraufhin die Bindung verschiedener UL49.5-Varianten an den TAP-Komplex analysiert. Unterstützt wurden diese Daten durch einen in vivo Interaktionsscreen (BiFC) und in vitro translatiertes UL49.5. Hierbei stellte sich heraus, dass das UL49.5-Protein in Abwesenheit sämtlicher Komponenten des Immunsystems an beide Untereinheiten des TAP-Transporters bindet. Die Bindung erfolgt sowohl an vollständige TAP-Untereinheiten als auch an den sogenannten coreTAP-Komplex, der nur die inneren sechs Transmembranhelices besitzt. Weiterhin wurden systematisch verkürzte UL49.5-Varianten generiert, um wichtige Reste für TAP-Inhibition und proteasomale Degradation zu identifizieren. Interessanterweise sind weder die N-terminale noch die C-terminale Domäne von UL49.5 für die Bindung an den TAP-Komplex zwingend notwendig. Die Bindung an den TAP-Transporter wird demnach über die Transmembrandomäne von UL49.5 vermittelt. Mit Hilfe von Peptidtransport-Analysen wurde die inhibitorische Aktivität verschiedener UL49.5-Mutanten eingehend untersucht. Zusätzlich wurde eine Untersuchung der MHC I-Oberflächenexpression in transient transfizierten HeLa-Zellen etabliert. In diesen Zellen wurde nach Sortierung eine drastisch reduzierte TAP-Konzentration nachgewiesen, die auf proteasomale Degradation des TAP-Komplexes zurückzuführen war. Die Untersuchung von C-terminal verkürzten UL49.5-Mutanten zeigte, dass die letzten zwei C-terminalen Aminosäuren essenziell für die Induktion der TAP-Degradation sind. Die C-terminale Domäne von UL49.5 konnte jedoch, nach Übertragung auf andere Proteine, keine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleiten. Demnach ist ein weiterer Bereich des Proteins für diesen Prozess zwingend notwendig. Erstaunlicherweise waren auch N-terminal verkürzte UL49.5-Proteine deutlich in ihrer inhibitorischen Funktion beeinträchtigt. Bereits nach der Deletion von 10 N-terminalen Aminosäuren war das Protein nicht mehr in der Lage, eine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einzuleiten. Demnach spielt auch die ER-luminale Domäne von UL49.5 eine wichtige Rolle bei der UL49.5-induzierten TAP-Degradation. Somit wurde ein bisher noch nicht beschriebener neuartiger Inhibitionsmechanismus für das BHV-1 UL49.5-Protein entdeckt. Nach Bindung von UL49.5 über die Transmembrandomäne an beide Untereinheiten des TAP-Transporters scheint die ER-luminale Domäne von UL49.5 ein Signal über die ER-Membran an die zytoplasmatische Domäne zu übertragen, die dann die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleitet. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals gezeigt werden, dass additive Effekte eines sehr kleinen Virusproteins auf zwei unterschiedlichen Seiten der ER-Membran zu einer proteasomalen Degradation eines sehr großen Membran-Komplexes führen.
Eine weltweite Veränderung der Lebensweise hat eine Zunahme der Anzahl adipöser Menschen und damit ein verstärktes Auftreten von Typ 2 Diabetes mellitus zur Folge. Eine häufig auftretende Komplikation dieser Erkrankung ist das diabetische Fußulkus, dessen molekularen und zellbiologischen Grundlagen weitestgehend unbekannt sind. Für einen normalen Wundheilungsverlauf ist ein Zusammenspiel vieler Wachstumsfaktoren und Zytokine essentiell. Auch die Insulinsensitivität der Haut scheint von großer Bedeutung zu sein. Die Funktionen von Insulin im Wundheilungsprozess und in der Haut sind weitestgehend unerforscht. Um ein besseres Verständnis für die Bedeutung von Insulin in der Wundheilung zu erhalten, bestand das Ziel dieser Arbeit in der Analyse eines Insulin-regulierten Enzyms in der Haut, der HMG-CoA-Reduktase, während des Heilungsprozesses normaler sowie diabetisch chronischer Wunden. Die HMG-CoA-Reduktase katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Mevalonat-Stoffwechselweg und ist somit indirekt an vielen zellulären Ereignissen beteiligt. Die Verletzung von murinem Hautgewebe führte zu einem Anstieg der HMG-CoA-Reduktase-mRNA-Expression an Tag 3 und an Tag 13 nach Verletzung. Die Lokalisation der HMG-CoA-Reduktase im Wundgewebe zeigte, dass insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten durch eine besonders starke mRNA-Expression des Enzyms charakterisiert waren. Im Gegensatz dazu konnte im diabetischen, chronischen Wundgewebe keine Regulation der mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase detektiert werden. Wundheilungsrelevante Faktoren, wie Insulin und EGF, induzierten die mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase in HaCaT-Keratinozyten (in vitro). Für die Insulin-vermittelte mRNA-Induktion konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor SREBP2 für die Transkription des Gens essentiell war. Neben einer erhöhten Transkription der HMG-CoA-Reduktase wurde ebenfalls eine gesteigerte Enzymaktivität nach Insulin- oder EGF-Stimulation detektiert. Die Induktion der Insulin-vermittelten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität stand in einem funktionellen Zusammenhang zur Biosynthese des angiogenen Faktors VEGF. Der Einfluss der HMG-CoA-Reduktase auf die VEGF-Biosynthese war posttranskriptionell über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1 vermittelt. Auch im tierexperimentellen Modell (in vivo) konnte durch eine Statin-Behandlung bei Mäusen gezeigt werden, dass die Enzymaktivität der HMG-CoA-Reduktase in Keratinozyten für eine normale VEGF-Expression essentiell war. Die VEGF-Synthese wurde von der Aktivität der HMG-CoA-Reduktase in vivo, wie in vitro nach Insulin-Stimulation, posttranskriptionell beeinflusst. Die Analyse weiterer wundheilungsrelevanter Vorgänge ergab, dass eine Inhibierung der HMG-CoA-Reduktase in vivo wie in vitro eine Verringerung der Keratinozytenproliferation zur Folge hatte. Die Keratinozytenproliferation ist ein wichtiger Vorgang bei der Reepithelisierung einer Wunde. Ist das Wundareal durch Keratinozyten geschlossen, beginnt die Differenzierung der Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass der Differenzierungsprozess von Keratinozyten in vitro mit einer Induktion der HMG-CoA Redukase Aktivität assoziiert war. Eine Hemmung der Enzymaktivität hatte eine Inhibierung der mRNA-Expression von Keratinozyten-Differenzierungsmarkern, wie Involucrin, Filaggrin und Keratin 1 zur Folge. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die HMG-CoA-Reduktase wichtige Prozesse, wie Wundangiogenese und Keratinozytenproliferation, im kutanen Wundheilungsverlauf beeinflusst.
Die Bindung von regulatorischen Proteinen an die Zelloberfläche ist eine wirkungsvolle Strategie, die sich humanpathogene Bakterien, insbesondere B. burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose, zu eigen gemacht haben, um der bakteriolytischen Wirkung von Komplement zu entgehen. Die Grundlage der Serumresistenz bei B. burgdorferi besteht vornehmlich in der Interaktion der Komplementregulatoren Faktor H und FHL-1 mit fünf verschiedenen Borrelienproteinen, die als Complement Regulator-Acquiring Surface Proteins bezeichnet werden. Bei der Genospezies B. burgdorferi s.s. nimmt das BbCRASP-2 Protein aufgrund seines spezifischen Bindungsverhaltens gegenüber Faktor H und FHL-1 eine Sonderstellung ein. In früheren Untersuchungen konnten vier potenzielle Bindungsregionen von Faktor H und FHL-1 im BbCRASP-2 Protein lokalisiert werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der detaillierten Charakterisierung der an der Bindung mit Faktor H und FHL-1 beteiligten Aminosäuren von BbCRASP-2 innerhalb der putativen Bindungsregionen 2, 3 und 4 sowie in einer Region, die eine coiled-coil Struktur aufweist. Dazu wurden selektiv Aminosäuren mittels gerichteter Mutagenese durch die neutrale Aminosäure Alanin ausgetauscht und das Bindungsverhalten der mutierten BbCRASP-2 Proteine untersucht. Mittels Ligandenaffinitätsblot-Analyse und ELISA konnten insgesamt 17 Aminosäuren – geladen, neutral polar, neutral unpolar - identifiziert werden, die nach Mutagenese eine erniedrigte Bindungskapazität oder keine Bindung gegenüber Faktor H und FHL-1 in mindestens einem der beiden Testmethoden aufwiesen. Von diesen Mutanten zeigen 6 Proteine (BbCRASP-2S72A, BbCRASP-2D84A, BbCRASP-2F91A, BbCRASP-2R139A, BbCRASP-2Y207A, BbCRASP-2Y211A) in beiden Testsystemen ein deutlich verändertes Bindungsverhalten. 12 weitere BbCRASP-2 Mutanten fielen im ELISA durch ihre reduzierte Bindungskapazität auf, verhielten sich jedoch im Ligandenaffinitätsblot im Vergleich zu BbCRASP-2 in ihrer Bindungseigenschaft unverändert. Die für die Faktor H/FHL-1 Bindung relevanten Aminosäuren verteilten sich in allen der drei untersuchten Bindungsregionen, wobei Austausche in der C-terminal gelegenen Region 4 den größten Effekt auf die Bindung zeigten. Dies deutet darauf hin, dass dem C-Terminus eine essentielle Rolle bei der Interaktion zugeordnet werden kann. In Bezug auf die Ladungseigenschaften der identifizierten Aminosäuren ergab sich ebenfalls ein sehr heterogenes Bild. Da sowohl geladene als auch polare und unpolare Aminosäuren an der Bindung von Faktor H und FHL-1 partizipieren, ist davon auszugehen, dass gleichermaßen elektrostatische und hydrophobe Wechselwirkungen an der Bindung beteiligt sind. Zusätzlich konnte in der putativen coiled-coil Region eine Aminosäure (Phe91) identifiziert werden, die direkt oder indirekt an der Bindung von BbCRASP-2 und Faktor H/FHL-1 beteiligt ist. Für die Hypothese einer an der Interaktion beteiligten coiled-coil Struktur spricht, dass Aminosäuresubstitutionen an drei weiteren Positionen (Leu-94, Ile-98 und Tyr-101) eine reduzierte Bindung bewirkten. Die räumlich weit auseinander liegenden Positionen der als bindungsrelevant identifizierten Aminosäuren deuten darauf hin, dass sich der Bindungsmechanismus von BbCRASP-2 an Faktor H und FHL-1 komplexer darstellt, als zunächst vermutet. Es ist ferner zu erwarten, dass noch weitere Aminosäuren außerhalb der putativen Bindungsregionen die Interaktion von BbCRASP-2 mit den Regulatorproteine beeinflussen, da in dieser Studie gezeigt werden konnte, dass die Substitution von Phenylalanin an Position 91 einen deutlichen Einfluss auf die Bindung von Faktor H und FHL-1 aufwies, obwohl sie außerhalb der ermittelten Bindungsregionen lokalisiert ist. Mit großer Wahrscheinlichkeit stellt die genaue Topologie des BbCRASP-2 Proteins ebenfalls einen entscheidenden Faktor für die Bindung dar. Deshalb sollte mit Kenntnis der dreidimensionalen Struktur des BbCRASP-2 Moleküls eine genauere Beschreibung des molekularen Bindungsmechanismus möglich sein. Die vorliegenden Untersuchungen zum molekularen Mechanismus der Serumresistenz von B. burgdorferi tragen wesentlich zum Verständnis der komplexen Interaktion zwischen BbCRASP-2 mit Faktor H und FHL-1, den beiden Komplementregulatoren des alternativen Weges bei. Diese Erkenntnisse könnten langfristig gesehen für die Entwicklung eines Impfstoffs genutzt werden.
Elefanten sind die größten landlebenden Säugetiere und werden schon seit Jahrhunderten in Menschenobhut gehalten. In der heutigen Zeit liegt der Schwerpunkt der Elefantenhaltung auf dem Unterbringen dieser anspruchsvollen Tiere in verhaltensgerechten Bedingungen, die auch das Wohlbefinden der Tiere berücksichtigen. Es mangelt jedoch an langfristigen Studien, die Veränderungen im Verhalten und im Wohlbefinden von Elefanten in Menschenobhut erforschen. Vor allem das nächtliche Verhalten fand bisher wenig Beachtung, obwohl Studien im natürlichen Lebensraum als auch in Menschenobhut zeigen, dass Elefanten den größten Teil der Nacht aktiv sind. Die vorliegende Studie konzentriert sich daher auf eine langfristige Überwachung des nächtlichen Verhaltens von Afrikanischen Elefanten und stellt, unter Anwendung chronoethologischer Methoden, die haltungsbedingten Einflüsse auf das Verhaltensmuster dar. Es wurden insgesamt 16 Afrikanische Elefanten (Loxodonta africana) mit Zeitraffer-Videoaufnahmen überwacht, im Opel-Zoo in Kronberg 600 Nächte, im Tiergarten Schönbrunn in Wien 300 Nächte und im Wuppertaler Zoo 70 Nächte. Dies ergibt bei einer Erfassungszeit von jeweils 16:00 Uhr bis 8:00 Uhr für alle Elefanten zusammen eine Summe von 64.320 Stunden Verhaltensregistrierung. Es konnte nachgewiesen werden, dass das nächtliche Verhalten von Elefanten durch die Haltungsbedingungen beeinflusst wird. Drei Haltungssysteme konnten zum ersten Mal in einer Studie direkt miteinander verglichen und Unterschiede aufgezeigt werden. Auch eine saisonale Abhängigkeit des nächtlichen Verhaltens konnte beobachtet werden. Es stellte sich heraus, dass Elefanten im Winter mehr und früher schlafen als im Sommer. Dies muss im nächtlichen Management berücksichtigt werden. Soziale Kontakte beeinflussen das nächtliche Verhalten ebenfalls. Es konnte erstmals beschrieben werden, dass Elefanten sich gegenseitig aus dem „Schlaf im Liegen“ aufwecken und dieses „Aufwecken“ einen Einfluss auf die Schlafdauer im Liegen hat. Die Verfügbarkeit von Nahrung ist ebenfalls ein wichtiger Faktor. Es konnte gezeigt werden, wie Elefanten zu unterschiedlichen Zeiten der Nacht auf zusätzliche Futtergaben reagieren und dass sie zu bestimmten Zeiten durch das zusätzliche Nahrungsangebot gestört werden. Unter Anwendung chronoethologischer Methoden konnte herausgearbeitet werden, dass Störungen im nächtlichen Verhaltensmuster durch vermehrtes „Weben“ erhöhte „Lokomotion“ und Reduzierung des Schlafverhaltens angezeigt werden. Beim Auftreten von Krankheiten mit Schmerzen wird die schmerzende Stelle gekühlt, indem sie mit z.B. Matsch beworfen wird. Die in dieser Studie dargestellten Einflüsse auf das nächtliche Verhalten von Afrikanischen Elefanten wurden vorher noch nicht beschrieben oder systematisch untersucht. Sie stellen wichtige Erkenntnisse für die zukünftige Haltung und das Management von Elefanten dar, sowohl im Hinblick auf eine weitere Optimierung als auch in Bezug auf die Beurteilung ihres Wohlbefindens.
Stickstoff (NO), Kohlenmonoxid (CO) und Schwefelwasserstoff (H2S) gehören zur Gruppe der Gasotransmitter. Dabei handelt es sich um kleine gasförmige Signalmoleküle, welche innerhalb des Körpers gebildet werden und dort wichtige physiologische Funktionen bei der Regulation der Apoptose, der Proliferation, der Entzündungsreaktion und der Genexpression übernehmen. Aufgrund ihrer Membranpermeabilität ist die Wirkung der Gasotransmitter nicht an die Interaktion mit spezifischen membranständigen Rezeptoren gebundenen. Je nach Organ, Gewebe und Konzentration können diese Mediatoren unterschiedliche Prozesse beeinflussen und teils sogar gegenteilige Wirkungen hervorrufen.H2S beispielsweise kann im Verlauf der Leukozytenadhäsion im Epithelium anti-inflammatorisch, bei Brandwunden oder rheumatischen Erkrankungen jedoch pro-inflammatorisch wirken. Im Kreislaufsystem hingegen bewirkt H2S durch die Aktivierung von ATP-abhängigen K+-Kanälen und die damit zusammenhängende Vasorelaxion der glatten Muskelzellen einen eindeutig protektiven Effekt.
H2S kann je nach Substrat und Zelltyp durch eines von 3 Enzymen gebildet werden. Die Cystathionin-γ-Lyase (CSE) und die Cystathionin-β-Synthase (CBS) nutzen L-Cystein als Substrat für die Synthese von H2S. Das dritte H2S-bildende Enzym, die 3-Mercaptopyruvate Sulfurtransferase (3-MST) verwendet α-Ketoglutarat als Substrat, welches zuvor von der Cystein-Aminotransferse (CAT) aus L-Cystein synthetisiert wurde. Während die beiden Enzyme CSE und CBS im Zytosol der Zelle zu finden sind, ist die 3-MST hauptsächlich in den Mitochondrien der Zelle zu finden. Im Gegensatz zur CBS, welche eher ein konstitutiv exprimiertes Protein ist, wird die Expression der CSE auf der Transkriptionsebene durch u.a. Entzündungsmediatoren wie TNF-α oder Wachstumsfaktoren wie PDGF-BB induziert.
Ein Ziel der Arbeit war es, die Wirkung von H2S bei der Wundheilung, bei entzündlichen glomerulären Erkrankungen der Niere und beim Schlaganfall zu untersuchen. Für diesephänotypische Analysen stand ein Knockoutmodell für die CSE zur Verfügung.
Zudem wurden in dieser Arbeit Untersuchungen mit einem Knockoutmodell für das zytoskeletäre Protein durchgeführt. Bei Clp36 (PDLIM1) handelt es sich um ein PDLIM-Protein (PDZ and LIM domain protein),welches durch die Gasotransmitter NO und H2S auf transkriptioneller und translationaler Ebene reguliert wird ist und aufgrund seiner Assoziation mit dem Zytoskelett dynamische Vorgänge der Zelle moduliert. Es ist bereits bekannt, dass Clp36 ein negativer Regulator des Glykoprotein VI (GPVI), welches eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Thrombozyten spielt, ist.
Beide Knockoutmodelle wurden in murinen Mesangiumzellen der Niere und in Krankheitsmodellen der Haut (kutane Wundheilung)und des Gehirns (Schlaganfall mit dem MCAO-Modell) analysiert.
Neben nicht signifikanten Effekten im MCAO-Modell, konnten sowohl Effekte des CSE-, als auch des CLP36-KOs auf die Migration und Proliferation und im Falle der CSE auch auf die Adhäsion der murinen Mesangiumzellen beobachtet werden. Die Depletion von Clp36 führte zu einer Verringerung der Migrations- und einer Erhöhung der Proliferationsrate, wohingegen die Depletion der CSE zu einer Erhöhung der Migrations-, Proliferations- und Adhäsionsrate führte. Die vielversprechendsten Ergebnisse konnten im Tiermodell der kutanen Wundheilung generiert werden. Untersucht wurde die Expression der H2S-produzierenden Enzyme CSE, CBS und 3-MST. Alle drei Enzyme zeigten im Tiermodell keine transkriptionelle Regulation und blieben auch während der akuten Entzündungsphase und der proliferativen Phase der Wundheilung unverändert. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Expression der CSE in der späten Phase der Wundheilung signifikant anstieg, wenn die Proliferation innerhalb des Granulationsgewebes und der Neoepidermis geringer wurde. Die Vermutung, dass H2S in dieser Phase eine wichtige Rolle spielt, konnte durch die Analyse der CSE-KO Mäuse bekräftigt werden, da dort der Verlust der CSE offenbar durch die CBS kompensiert wurde.
In immunhistochemischen Untersuchungen konnten insbesondere follikuläre Keratinozyten der Neo-Epidemis als Quelle der CSE-Expression identifiziert werden. Durch in-vitro Studien auf mRNA und Proteinebene in HaCaT Zellen wurde gezeigt, dass H2S die Keratinozyten-Differenzierung beeinflusst. Der langsam freisetzendeH2S-Donor GYY4137 konnte in humanen Keratinozyten zu einer signifikanten Erhöhung der Ca2+- induzierten Expression der frühen Keratinozyten-Differenzierungsmarker Cytokeratin 10 (CK10) und Involucrin (IVN) beitragen.
Im Laufe dieser Arbeit konnte der molekulare Mechanismus hinter diesen Beobachtungen noch nicht geklärt werden.
Durch weitere Versuche meiner Arbeitsgruppe konnte jedoch gezeigt werden, dass die GYY4137-abhängige Induktion der CK10-Expression durch eine verstärkte Bindung der RNA-Polymerase II an den CK10 Promotor zustande kommt.
In der vorliegenden Arbeit konnte das Subkompartiment der synaptischen aktiven Zone erstmals in der für Proteomstudien erforderlichen Qualität aufgereinigt werden. Nach Präparation des Gesamthirns der Ratte wurden über verschiedene Homogenisations- und Zentrifugationschritte Synaptosomen gewonnen, die durch einen hypoosmotischen Schock zum Platzen gebracht wurden. Der Inhalt, vornehmlich synaptische Vesikel, wurde in einem Saccharosedichtegradienen aufgetrennt. Die Analyse dieses Gradienten bestätigte, dass sich in den unteren, dichteren Fraktionen (Fraktionen 28-34) Elemente synaptischer Vesikel und auch der Plasmamembran befanden. Damit war eine wichtige Grundvoraussetzung für eine nachfolgende Proteomuntersuchung gedockter synaptischer Vesikel erfüllt. Die Analyse dieser Fraktionen durch Western-Blot und mittels Transmissionselektronenmikroskopie zeigte aber auch, dass sie diverse Organellmarker enthielten und insgesamt eine heterogene Zusammensetzung von membranären Strukturen zeigten. Daher folgte als weiterer Aufreinigungsschritt eine immunmagnetische Trennung mit monoklonalen Antikörpern gegen das ubiquitäre integrale Protein synaptischer Vesikel, SV2. Die hohe Reinheit der resultierenden Fraktion gedockter synaptischer Vesikel konnte durch elektronenmikroskopische Analysen und proteinchemische Methoden (2D BAC-/SDS-PAGE und Western Blot) nachgewiesen werden. Die Optimierung der Integrität der verwendeten Proben erlaubte eine funktionelle Zuordnung der durch die hochsensensitiven massenspektrometrischen Analysen identifizierten Proteine. Zur Proteinidentifikation wurden zwei verschiedene Methoden herangezogen: die zweidimensionale BAC-/SDS-PAGE mit anschliessender MALDI-TOF Analyse und die eindimensionale SDS-PAGE mit nachfolgender nanoLC ESI MS/MS. Beide Methoden ergänzten sich; generell wurde über die zweite Methode eine größere Anzahl von Proteinen identifiziert. Durch die Verwendung und Kombination der verschiedenen massenspektrometrischen Methoden und unterstützt durch eine Western Blot Analyse konnten insgesamt 245 Proteine identifiziert werden. Dabei handelte es sich um (i) integrale synaptische Vesikelproteine, (ii) transient mit synaptischen Vesikeln assoziierte Proteine, (iii) Proteine der Plasmamembran und Zelloberfläche, (iv) Signalkaskadenproteine und kleine GTPasen, (v) Proteine des Zytoskeletts, (vi) glykolytische und andere metabolische Enzyme, sowie (vii) Chaperone und (viii) mitochondriale Proteine. Im zweiten Teil der Arbeit wurden ausgewählte Proteine genauer untersucht. Die Analyse der löslichen Proteine WK1 und WK2 zeigten in Genexpressionsstudien eine ubiquitäre Gewebeverteilung. Rekombinante Proteine wurden in Zelllinien exprimiert, um einen Einblick in deren subzelluläre Lokalisierung zu erhalten. Die Expressionsanalyse der integralen Transmembranproteine zeigte für alle Kandidaten eine neuronale Expression der mRNA. Für jeden der Kandidaten wurden individuelle Genexpressionsmuster im Hirn beobachtet. Gegen zwei der Kandidatenproteine konnten funktionelle Antikörper erzeugt werden. Die Immunomarkierung mit anti-Ttyh1-Antikörpern zeigt eine hochspezifische Färbung der Fasertrakte in verschiedenen Hirnarealen sowie eine neuronale Lokalisation in Primärkulturen des Hippokampus und des Neokortex der Ratte. Lingo1-Immunfärbungen markierten selektiv Nervenzellen des limbischen Systems und Mitralzellen des Bulbus olfactorius. Diese Studie führt konsequent die Idee der spezifischen Aufreinigung von Vesikelkompartimenten der Synapse weiter: Mit der Einführung eines hochaffinen immunchemischen Anreicherungsschrittes in dem Aufreinigungsprozess wird dem bisherigen Methodenarsenal zur Spezifizierung der Probe über physiko-chemische Parameter eine neue Dimension hinzugefügt: Die molekulare Identität.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1. Eindimensionale Gelelektrophoresen Die Analyse mitochondrialer Proteine aus juvenilen und seneszenten P. anserina-Wildstämmen mit Hilfe von eindimensionalen SDS- und eindimensionalen Blau-Nativen-Gelelektrophoresen zeigt keine deutlichen, seneszenzspezifischen Unterschiede. Im Gegensatz dazu werden in initialen Versuchen der nicht-radioaktiven 2D-PAGE differentiell gebildete Proteine visualisiert. 2. 2D-PAGE mit radioaktiv-markierten, mitochondrialen Proteinen aus jungen und alten P. anserina-Wildstämmen In der ungerichteten Proteomanalyse wurden 29 differentiell-gebildete Proteine identifiziert und zusätzlich zahlreiche Isoformen einiger Proteine gezeigt. Von der ß-ATPase wurden modifizierte Isoformen gefunden. Außerdem wurde eine seneszenspezifisch verringerte Bildung von ROS-Abwehr-Proteinen in den Mitochondrien detektiert. Im Gegensatz dazu wurde eine größere Menge eines Chaperons gefunden, das bei der Proteinsynthese eine Rolle spielt: eine Protein-Disulfid-Isomerase, die die Umlagerung und Neubildung von Di-Sulfid-Brücken bei der Faltung von Proteinen katalysiert. Zusätzlich wurde eine erhöhte Menge des Proteins SSC1 identifiziert. Dieses gehört zur Hsp70-Hitzeschock-Proteinfamilie. Es wurde ebenfalls eine erhöhte Menge des Apoptosefaktors Cyclophilin D in den mitochondrialen Proben aus den seneszenten Wildstämmen identifiziert. Die Identifizierung dieses Proteins in Mitochondrien von P. anserina stellt neben der Charakterisierung der Metacaspasen (Hamann et al., 2007) einen weiteren Ansatzpunkt für die Apoptoseforschung in P. anserina dar. Die molekularbiologische Analyse dieses Proteins wurde aufgrund dieser Proteomanalyse im Arbeitskreis aufgenommen (Dissertation D. Brust). Ein weiteres Protein, das in stark erhöhter Menge in den Proteinisolaten identifiziert wurde, ist PaMTH1. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Struktur und die Funktion dieser neu identifizierten differentiell-gebildeten Methyltransferase während der Alterung in P. anserina mit Hilfe molekularbiologischer, biochemischer und physiologischen Analysen untersucht. 3. Charakterisierung von PaMTH1 Im Rahmen von Northernblot-Analysen wurde gezeigt, dass die PaMth1-Transkriptmenge in drei unabhängigen alten Wildstämmen im Vergleich zu den entsprechenden jungen Wildtsämmen deutlich erhöht ist. In einer Westernblot-Analyse von Gesamtproteinen und Mitochondrien aus jungen und seneszenten Wildstämmen wird der seneszenzspezifische Anstieg der Proteinmenge verifiziert. Die genauere Einordnung von PaMTH1 in die Klasse I der Methyltransferasen und die Ergebnisse der Analyse der Substratspezifizität geben einen Hinweis auf eine Schutzfunktion durch die Verhinderung einer ROS-Entstehung unter der Beteiligung von Substanzen mit einer Catecholgruppe. Die Ergebnisse der Analyse der Modulation der PaMth1-Expression in P. anserina deuten ebenfalls auf eine Schutzwirkung von PaMTH1 hin: PaMth1-Überexpressionsstämme zeigen eine verbesserte Wuchsrate auf stress-induzierenden Medien, weniger carbonylierte Proteine und vor allem eine verlängerte Lebensspanne ohne physiologische Nachteile im Vergleich zum Wildstamm. Dagegen lebt die PaMth1-Deletionsmutante kürzer und wächst schlechter auf ROS-induzierenden Medien, sie zeigt allerdings keine erhöhte Menge von carbonylierten Proteinen im eindimensionalen „Oxyblot“. Die beobachtete Lebensspannenverkürzung der PaMth1-Deletionsmutante wird jedoch durch die Reversion dieser Stämme wieder aufgehoben, sodass die Hypothese des Schutzes vor der ROS-Generierung durch die Methylierung von Dihydroxylgruppen anhand der erhaltenen Daten unterstützt wird.
Das Ziel dieser Dissertation war die Suche nach Drogenkonzentrationen, ab denen ein signifikanter Anstieg der Unfallraten im Straßenverkehr zu beobachten ist. Hierüber sollte die Grenzwertforschung für Drogen vorangetrieben werden, um für diese in Zukunft einen Grenzwert analog dem des Alkohols zu finden. Dies galt in besonderem Maße der Droge Cannabis, da diese zweifelsfrei die am häufigsten konsumierte illegale Substanz darstellt. Auswertungsgrundlage bildete dabei ein großes Kollektiv von 20.458 auffällig gewordenen Verkehrsteilnehmern, welche seit dem Jahre 1995 vom Institut für Forensische Toxikologie der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main registriert und seit 1997 in einer Datenbank verzeichnet worden waren. Diese Personen sollten auf diverse Parameter, wie beispielsweise Alter, Geschlecht und Art des begangenen Deliktes bei Vorliegen bestimmter Konzentrationen berauschender Substanzen untersucht werden. ... Dabei war auf sämtliche allgemein bekannten Drogen wie beispielsweise Cannabis, Kokain, Opiate und Amphetamine, sowie einige Medikament hin untersucht worden. Vorteil dieses Datenmaterials war die Fähigkeit zur Abbildung der Realität, was drogenassoziierte Ereignisse im Straßenverkehr betrifft. Nachteil war ein mangelndes nüchternes Vergleichskollektiv, das in der Lage gewesen wäre, die nüchtern am Verkehr teilnehmende Allgemeinheit abzubilden, da sämtliche Personen der Selektion durch die Polizei aufgrund des Merkmals „Verkehrsauffälligkeit“ unterlegen hatten. Als statistische Auswertungsmethode bot sich aufgrund der Beschaffenheit des Datenmaterials die so genannte Konfigurationsfrequenzanalyse (KFA) an, welche als komplexe Erweiterung der Kreuztabellenanalyse aufgefasst werden kann. Hierüber war aber zusätzlich eine Identifizierung einzelner, statistisch signifikant über- oder unterfrequentierter Werte möglich. Weiterhin wurden die unterschiedlichsten Risikoanalysen mittels Berechnung des Odds Ratio durchgeführt, um bestimmte stärker gefährdete Gruppen bzw. den Verkehr stärker gefährdende Drogen identifizieren zu können. Die Datenlage dieser Arbeit wies stellenweise große Ähnlichkeiten zu Ergebnissen anderer Studien auf. Andererseits kollidierten einige Befunde mit bisher bekannten Ansichten. Bei einer insgesamt von 14 bis 94 Lebensjahren reichenden Spanne, waren doch die meisten verzeichneten Personen zwischen 18 und 34 Jahre alt, wobei insgesamt der Männeranteil mit 93 % deutlich überwog. Allerdings wiesen Frauen bzgl. des Gesamtkollektivs eine größere Assoziation mit Unfallgeschehen auf. Dagegen war dieses Verhältnis in der Gruppe der Cannabiskonsumenten eindeutig umgekehrt. Eine Assoziation zu Unfällen zeigten sich darüber hinaus bei Betrachtung der Gesamtdatenbank, besonders bei Personen über 34 Jahren. Bei Vergleichsanalysen des Unfallrisikos bestimmter Drogen und Alkohol, konnte keine Droge das ermittelte Risiko des Alkohols auf den Verkehr übertreffen. Besonders der Vergleich zu Cannabis könnte nun aber vorschnell zu dem Schluss führen, dass von diesem keine Gefährdung des Straßenverkehrs ausgeht, da hier im Vergleich zu den übrigen Substanzen die geringste Assoziation zu Unfällen vorlag. Allerdings gilt hier erneut zu betonen, dass aufgrund des fehlenden nüchternen Vergleichskollektivs eine Aussage über die Gefährlichkeit von Cannabis im Straßenverkehr nur im Vergleich zu anderen berauschenden Mitteln möglich war. Eine Kalkulation des absoluten Risikos einer Droge war somit nicht möglich. Nach den vorliegenden Daten ereignet sich der typische Drogenunfall relativ unabhängig vom Alter, abhängig vom männlichen Geschlecht, nicht selten unter Mischkonsum diverser Substanzen und vor allem bei Nacht. Grundsätzlich fiel im Verlauf der Datenanalyse, trotz des ursprünglich auf Drogen – vornehmlich Cannabis - fokussierten Interesses, regelmäßig der Alkohol durch seinen starken Zusammenhang mit Verkehrdelikten auf. Während der Analysen zeichneten sich darüber hinaus bezüglich einiger Substanzen erstaunliche Ergebnisse ab, welche häufigere Unfallraten bei niedrigeren Drogenkonzentrationen demonstrierten. Es ergab sich ein bislang in der Forschung wenig beachteter Gedankenansatz, der zur These führte, dass möglicherweise drogennaive Personen aufgrund einer kaum ausgebildeten Toleranz gegenüber den konsumierten Substanzen, eher in Verkehrsdelikte wie Unfälle involviert sind, als drogenadaptierte Dauerkonsumenten. Fraglich ist aber, wie mit dieser Information in der Praxis umgegangen werden könnte. Es ergäbe sich folgendes Dilemma: für die Bewertung der tatsächlichen Leistungseinbußen eines Fahrers unter dem Einfluss von Drogen, müsste auch sein Konsummuster berücksichtigt werden. Diese Rechtsprechung existiert allerdings derzeit für kein berauschendes Mittel, ebenfalls nicht für Alkohol, obwohl hier ebenfalls von geringeren Leistungseinbußen durch Toleranzentwicklung ausgegangen werden kann. Das Dilemma bestünde somit in der Kollision von Wissenschaft und Ethik. Wissenschaftlich wäre es also sicher richtig einen Gelegenheitstrinker mit einer bestimmten Alkoholkonzentration im Blut als weniger fahrtüchtig zu erachten, als einen toleranten Alkoholiker mit gleicher BAK. Doch neben ethischen Bedenken und Fragen nach Gerechtigkeit findet dieser Gedanke seine Grenze schon allein bei der Vorstellung nach der praktischen Durchführbarkeit. So sollte diese Arbeit nicht als Schlusswort in der Diskussion um Alkohol und Drogen im Straßenverkehr angesehen werden, sondern vielmehr zu weiteren Untersuchungen in dieser Richtung anregen. Diese Notwendigkeit ergibt sich allein aus den Tatsachen, dass Drogen im Straßenverkehr präsent und Unfälle mit diesen assoziiert sind. Weiterhin konnte bisher stets nach Einführung gesetzlicher Regelungen, wie beispielsweise den Promillegrenzen beim Alkohol, ein Rückgang der Verkehrstoten verzeichnet werden. Da sich bei den Personen des Kollektivs dieser Arbeit die meisten Unfälle vor allem im Bereich legaler Alkoholisierungen ereignet hatten, sollten weitere Überlegungen und Untersuchungen prüfen, ob nicht konsequenterweise die Einführung einer 0,0 Promillegrenze gerechtfertigt, wenn nicht sogar notwendig ist, um die Sicherheit auf den Straßen ein weiteres Stück voran zu treiben.
In einer retrospektiven Analyse wurden Patienten mit akuter myeloischer Leukämie, die in der Abteilung Hämatologie in der Universitätsklinik in Frankfurt am Main zwischen 1996 bis 1999 behandelt wurden und im Rahmen dieser Behandlung fieberhafte Infektionen entwickelt hatten, ausgewertet. Es wurden insgesamt 402 Episoden von 135 Patienten (76 Frauen und 59 Männer) mit AML auf geschlechtsspezifische Unterschiede im Infektionsverlauf untersucht. Hierbei wurde neben den Patientencharakteristika die Inzidenz der verschiedenen Infektionsklassifikationen, das Erregerspektrum (gram-positiv, gram-negativ, Pilzinfektion), die Therapie und das Therapieergebnis analysiert. Als Erfolgskriterien wurden die Entfieberung, sowie die Rückbildung von Infektionslokalisationen definiert. Die Therapieerfolge wurden eingeteilt in komplettes, partielles und fehlendes Ansprechen. In der vorliegenden Analyse wurden für den Infektionsverlauf wichtige Faktoren wie der Remissionsstand der Grunderkrankung, antibiotische Prophylaxe, G-CSF und die Neutropeniedauer untersucht, wobei sich hierbei keine signifikanten Unterschiede ergaben. Bei den Infektionsklassifikationen fiel auf, dass Männer signifikant mehr Pneumonien hatten und dass bei Frauen häufiger primäre Bakteriämien nachweisbar waren. Gram-positive Erreger traten insgesamt signifikant mehr bei Männern, gram-negative Erreger signifikant mehr bei Frauen auf. Nachgewiesene invasive Pilzinfektionen waren bei beiden Geschlechtern in ähnlichen Anteilen zu finden. Wegen der höheren Rate an Pneumonien bei männlichen Patienten (32,6 % versus. 18,1 %) haben diese mehr Amphotericin B und 5-Flucytosin erhalten, da bei Pneumonien ein hohes Risiko für Fadenpilzinfektionen besteht und dieses entsprechend in der empirischen Therapie berücksichtigt wurde. Eine endgültige Entfieberung trat bei insgesamt 95,5 % aller Episoden auf, wobei es keinen Unterschied zwischen männlichen und weiblichen Patienten gab. Der Anteil bei den weiblichen Patienten, die einen Rückgang der Infektlokalisation hatten, war signifikant höher verglichen mit den männlichen (90,9 % versus 52,5 %, p < 0,0001). Auch ein kompletter Rückgang der Infektlokalisation war in höherem Anteil bei Frauen als bei Männern zu verzeichnen (41 % vs 20,3 %). Insgesamt 12,7 % aller Infektepisoden führte zu einer Verlegung auf die Intensivstation, ein geschlechtsspezifischer Unterschied wurde nicht gefunden. In der Gesamtbeurteilung des Verlaufs der Infektionsepisoden war das komplette Ansprechen (82,3% vs 67,4%; p < 0,001) sowie die Ansprechrate insgesamt (komplett und partiell; 93% vs 79%; p < 0,0005) bei den weiblichen Patienten signifikant höher.
Hintergrund: Moderne Schrittmacher erlauben eine automatische Detektion atrialer Tachyarrhythmien und bieten Speicherfunktionen für diese Arrhythmien. Während dies die Erkennung atrialer Tachyarrhythmien bei Schrittmacher-Patienten verbessern kann, können andererseits inadäquate Detektionen auftreten und sollten berücksichtigt werden. Die vorliegende Analyse betrifft Elektrogramme, die im Rahmen der BEATS- (Balanced Evaluation of AT in Stimulated Patients) Studie bei atrialer Tachyarrhythmie-Detektion durch den Schrittmacher gespeichert wurden und deren zugrunde liegende Arrhythmien bzw. die Häufigkeiten und Ursachen inadäquater Detektionen. Methodik: Bei 255 Patienten (159 Männer, mittleres Alter 70  11 Jahre) mit einer Klasse I-Indikation zur permanenten Schrittmacher-Stimulation wurde ein DDDR-System (Discovery/Pulsar I oder II, Fa. Guidant Co., MN) implantiert, das eine atriale Tachyarrhythmie-Detektion zusammen mit gespeicherten Zweikanal-Elektrogrammen bietet. Alle Patienten erhielten bipolare atriale Elektroden, die Detektion atrialer Tachyarrhythmien stellte den einzigen Auslöser einer Elektrogramm-Speicherung dar (8 Elektrogramme bei Discovery/Pulsar I, 5 bei Discovery/Pulsar II). Sechs Wochen, 6 und 12 Monate nach Schrittmacherimplantation wurden die Systeme abgefragt, alle gespeicherten Daten ausgedruckt und die gespeicherten Elektrogramme analysiert. Primäre Studienendpunkte waren der Anteil adäquater und Ursachen inadäquater atrialer Tachyarrhythmie-Detektionen. Ergebnisse: Es wurden insgesamt 1932 Elektrogramme gespeichert und nachfolgend analysiert: Atriale Tachyarrhythmien 715 episodes (36.4%) Nicht-anhaltende atriale Salven 308 episodes (16.3%) Andere supraventrikuläre Tachykardien 12 episodes (0.6%) Ventrikuläres Fernfeld-Oversensing 716 episodes (36.0%) Elektromagnetische Interferenz 27 episodes (1.4%) Myopotential-Oversensing 46 episodes (2.3%) Ineffektive atriale Stimulation 2 episodes (0.1%) Unklar 132 episodes (6.9%) Der Organisationsgrad war hoch (Typ I) bei 456 von 715 Episoden atrialer Tachyarrhythmien (64%), intermediär bei 148 (21%) und niedrig bei 103 Elektrogrammen (15%), in denen sich eine atriale Tachyarrhythmie bestätigte. Oversensing ventrikulärer Fernfeld-Signale war die häufigste Ursache inadäquater Detektion atrialer Tachyarrhythmien und trat trotz Programmierung der atrialen Blanking-Zeit auf >80 ms auf. Episoden mit Myopotential-Oversensing traten bei versehentlicher Programmierung auf unipolare Wahrnehmung (Nominal-Einstellung) auf. Schlussfolgerungen: Episoden atrialer Tachyarrhythmien, die von Schrittmachern automatisch detektiert werden, erfordern gespeicherte Elektrogramme zur Überprüfung, da ein signifikanter Anteil durch Oversensing verursacht sein oder nicht-anhaltende atriale Salven darstellen kann. Inadäquate Detektionen atrialer Tachyarrhythmien sollten genutzt werden, um die Schrittmacher-Programmierung zu optimieren (atriale Ausblendzeiten, Detektionskriterien atrialer Tachyarrhythmien, atriale Empfindlichkeit).
Einleitung: Analysen kinematischer und elektromyographischer Daten verwenden häufig zeit-diskrete Werte. Bewegungen und EMGs sind jedoch zeitkontinuierliche Größen. Ziel der Arbeit ist eine verlaufsorien-tierte Analyse von Kinematik und EMG mit der Fragestellung, ob Unter-schiede innerhalb und zwischen den gesunden und operierten Proban-den bestehen. Methodik: Untersucht wurden 21 Patienten nach Hüft-TEP-Operation (43-71 Jahre) und 12 vergleichbare gesunde Probanden (KG). Dazu wurden beim Gehen auf dem Laufband bei frei wählbarer Geschwindigkeit die kinematischen Merkmale der Beckenbewegung und bilateral die EMGs des M. gluteus medius registriert. Mittels ortho-gonaler Referenzfunktionen wurden die Merkmalszeitverläufe einzelner Schritte auf Matrizen abgebildet und anschließend mit Hilfe eines Ähn-lichkeitsmaßes und einer Clusteranalyse untersucht. Ergebnisse: Indi-viduelle Gangmuster konnten in der vorliegenden Arbeit sowohl durch Analyse der kinematischen Daten als auch der EMGs erkannt werden. Es wurden jedoch keine einheitlichen Muster in der Patientengruppe festgestellt, obgleich verschiedene Gruppierungen zu finden waren, die jedoch anhand der erhobenen Patientendaten und Fragebogenscores nur eingeschränkt nachvollzogen werden konnten. Schlussfolgerung: Mit der verwendeten verlaufsorientierten multivariaten Analysemethode konnten intraindividuelle Ähnlichkeiten deutlich besser aufgefunden werden als interindividuelle Ähnlichkeiten, falls durch einen krankheits-spezifischen Anpassungsprozess vorhanden. Die Individualität ist somit dominierend.
Soziale Konflikte am Arbeitsplatz stellen Stressoren dar, die ihren Ursprung in den sozialen Beziehungen haben. Als eine Extremform sozialer Stressoren wird Mobbing am Arbeitsplatz verstanden, das durch drangsalierende, schikanöse oder gezielt benachteiligende Handlungen gekennzeichnet ist. Während aufgrund retrospektiver Befragungen von zumeist ehemals von Mobbing betroffenen Personen zahlreiche Forschungsergebnisse vorliegen, wurden die aktuell erlebten sozialen Konflikte und Mobbinggeschehnisse am Arbeitsplatz, deren verschiedene beschreibende als auch bewertungs- und emotionsbezogene Charakteristika, deren unterschiedliche Bewältigung sowie deren unmittelbare Konsequenzen zeitnah zu deren Erleben insbesondere über einen längeren Zeitraum noch nicht näher betrachtet. Von dieser Feststellung ausgehend konzentriert sich die vorliegende Arbeit auf die Erfassung aktueller Informationen zu den interessierenden Aspekten von sozialen Konflikten und Mobbing am Arbeitsplatz, deren Analyse sowie den Vergleich von Mobbingbetroffenen als auch Nichtbetroffenen. Zur Erhebung entsprechender Daten wurde eine intervallkontingente, ereignisbasierte Tagebuchstudie mit Vorab- und Nachbefragung konzipiert. An der siebenmonatigen Studie mit zwei jeweils 20 Arbeitstage umfassenden Erhebungszeiträumen nahmen 50 Mobbingbetroffene und 65 Nichtbetroffene teil. Insgesamt wurde eine Rücklaufquote von 78.79% erreicht und ein umfangreiches, erlebensnahes Datenmaterial erhoben. Die ermittelten Ergebnisse belegen, dass Mobbingbetroffene im Vergleich zu Nichtbetroffenen am Arbeitsplatz und im Privatleben insgesamt häufiger und intensivere soziale Konflikte erleben. Zudem belegen die Ergebnisse, dass die von den Mobbingbetroffenen erlebten sozialen Konflikte durch andere bewertungsbezogene Charakteristika gekennzeichnet sind als die der Nichtbetroffenen. Aufgrund dessen beurteilen die Mobbingbetroffenen die von ihnen erlebten Konflikte am Arbeitsplatz als nichtkontrollierbar sowie kaum bewältigbar, nehmen diese als durch eine Schädigungsabsicht geleitete Handlungen wahr und reagieren auf die von ihnen erlebten Konflikte mit stärkeren unangenehmen und geringer ausgeprägten angenehmen Emotionen. Auch setzen die Mobbingbetroffenen, insbesondere vor dem Hintergrund der geringeren manageability der von ihnen erlebten Konflikte, zu deren Bewältigung andere Strategien ein, vor allem weniger aktive Problemlösung und mehr Vermeidungsverhalten. Zudem erhalten Mobbingbetroffene am Arbeitsplatz weniger soziale Unterstützung. Mobbingbetroffene berichten im Rahmen der von ihnen erlebten sozialen Konflikte am Arbeitsplatz überwiegend andere unmittelbare Konsequenzen als Nichtbetroffene und es gelingt ihnen im Sinne eines mangelhaften unwinding weniger, ihre während des Konflikts erlebten emotionalen Reaktionen bis zum Abend hin angemessen zu verarbeiten. Anschließend wurden die Ergebnisse in die bestehende Befundlage der aktuellen Forschung eingeordnet. Zudem wurden die Grenzen der vorliegenden empirischen Untersuchung als auch deren Mehrwert kritisch diskutiert und gewürdigt. Abschließend wurden die Kernaspekte der vorliegenden Arbeit zusammengefasst und ein Ausblick auf weitere Forschungsarbeiten gegeben.
Soziale Konflikte am Arbeitsplatz stellen Stressoren dar, die ihren Ursprung in den sozialen Beziehungen haben. Als eine Extremform sozialer Stressoren wird Mobbing am Arbeitsplatz verstanden, das durch drangsalierende, schikanöse oder gezielt benachteiligende Handlungen gekennzeichnet ist. Während aufgrund retrospektiver Befragungen von zumeist ehemals von Mobbing betroffenen Personen zahlreiche Forschungsergebnisse vorliegen, wurden die aktuell erlebten sozialen Konflikte und Mobbinggeschehnisse am Arbeitsplatz, deren verschiedene beschreibende als auch bewertungs- und emotionsbezogene Charakteristika, deren unterschiedliche Bewältigung sowie deren unmittelbare Konsequenzen zeitnah zu deren Erleben insbesondere über einen längeren Zeitraum noch nicht näher betrachtet. Von dieser Feststellung ausgehend konzentriert sich die vorliegende Arbeit auf die Erfassung aktueller Informationen zu den interessierenden Aspekten von sozialen Konflikten und Mobbing am Arbeitsplatz, deren Analyse sowie den Vergleich von Mobbingbetroffenen als auch Nichtbetroffenen. Zur Erhebung entsprechender Daten wurde eine intervallkontingente, ereignisbasierte Tagebuchstudie mit Vorab- und Nachbefragung konzipiert. An der siebenmonatigen Studie mit zwei jeweils 20 Arbeitstage umfassenden Erhebungszeiträumen nahmen 50 Mobbingbetroffene und 65 Nichtbetroffene teil. Insgesamt wurde eine Rücklaufquote von 78.79% erreicht und ein umfangreiches, erlebensnahes Datenmaterial erhoben. Die ermittelten Ergebnisse belegen, dass Mobbingbetroffene im Vergleich zu Nichtbetroffenen am Arbeitsplatz und im Privatleben insgesamt häufiger und intensivere soziale Konflikte erleben. Zudem belegen die Ergebnisse, dass die von den Mobbingbetroffenen erlebten sozialen Konflikte durch andere bewertungsbezogene Charakteristika gekennzeichnet sind als die der Nichtbetroffenen. Aufgrund dessen beurteilen die Mobbingbetroffenen die von ihnen erlebten Konflikte am Arbeitsplatz als nichtkontrollierbar sowie kaum bewältigbar, nehmen diese als durch eine Schädigungsabsicht geleitete Handlungen wahr und reagieren auf die von ihnen erlebten Konflikte mit stärkeren unangenehmen und geringer ausgeprägten angenehmen Emotionen. Auch setzen die Mobbingbetroffenen, insbesondere vor dem Hintergrund der geringeren manageability der von ihnen erlebten Konflikte, zu deren Bewältigung andere Strategien ein, vor allem weniger aktive Problemlösung und mehr Vermeidungsverhalten. Zudem erhalten Mobbingbetroffene am Arbeitsplatz weniger soziale Unterstützung. Mobbingbetroffene berichten im Rahmen der von ihnen erlebten sozialen Konflikte am Arbeitsplatz überwiegend andere unmittelbare Konsequenzen als Nichtbetroffene und es gelingt ihnen im Sinne eines mangelhaften unwinding weniger, ihre während des Konflikts erlebten emotionalen Reaktionen bis zum Abend hin angemessen zu verarbeiten. Anschließend wurden die Ergebnisse in die bestehende Befundlage der aktuellen Forschung eingeordnet. Zudem wurden die Grenzen der vorliegenden empirischen Untersuchung als auch deren Mehrwert kritisch diskutiert und gewürdigt. Abschließend wurden die Kernaspekte der vorliegenden Arbeit zusammengefasst und ein Ausblick auf weitere Forschungsarbeiten gegeben.
Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, auf Basis der Analyse leistungsrelevanter Parameter der Kraulrollwende, insbesondere der Wendenabstoßphase, und der Erprobung der Wirksamkeit eines Trainingsblocks zur Verbessening der reaktiven Sprungkraftfähigkeiten Erkenntnisse zur Gestaltung eines wendenspezifischen Krafttrainings zu gewinnen. Die folgenden Abschnitte geben einen kurzen Überblick zu Problemstellungen, Methoden, Ergebnissen und Folgerungen der Arbeit. Problemstellung Eine Leistungssteigerung im heutigen Hochleistungsschwimmsport kann aufgrund der bereits realisierten hohen Trainingsumfange vorwiegend durch eine Verbesserung des Wirkungsgrades des Trainings erreicht werden. Dies erfordert - eine optimale Trainingsplanung, die gewährleistet, dass alle für die Wettkampfleistung relevanten Einflussgrößen ihre bestmögliche Ausprägung mit dem Eintritt in die Hauptwettkampfperiode erreicht haben. Zum Einfluss des Wendenabschnitts auf die Gesamtzeit bei Schwimmwettkämpfen (vgl. z.B. Blanksby et al., 1996; Cossor et al., 1999; Mason et al., 2000) sowie zu defnitären Leistungen der deutschen Hochleistungsschwimmer im Wendenbereich (vgl. 2.B. Icüchler et al., 2002; Leopold, 1996) liegen eine Vielzahl von Untersuchungen vor. Gleichzeitig existieren nur wenige und zum Teil widersprüchliche Veröffentlichungen zu leistungsrelevanten Parametern der Wendenleistung und zur Planung des wendenspezifischen Krafttrainings. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die folgenden~Problemfelder betrachtet: - Analyse leistungsrelevanter biomechanischer und konditioneller Parameter der Wendenleistung, - Identifikation geeigneter Trainingsmethoden zur Leistungsverbesserung im Wendenabschnitt, - Entwicklung von Trainingskonzeptionen zur Planung des wendenspezifischen Trainings. Methoden Der zentrale Bestandteil der Untersuchung lag in einer Wendenanalyse und der Erfassung von Kraftmerkmalen der Beinstreckmuskulatur vor und nach einem 12-wöchigen Trainingsblock zur Verbesserung der Schnellkraftfahigkeiten der Beinextensoren bei Schwimmern einer 1. Bundesligamannschaft. Zur Bestimmung leistungsrelevanter Parameter der Kraulrollwende und des Kraulrollwendenabstoßes wurde im Rahmen des Eingangstests eine Feldstudie durchgeführt. Die quasiexperimentelle Längsschnittstudie diente der Überprüfung von Auswirkungen eines reaktiven Sprungkrafttrainings auf die Leistungsfähigkeit der Beinstreckrnuskulatur und auf die Wendenleistung. Zur Analyse des Wendenabschnitts wurden von jedem Probanden mindestens acht gelungene Wendenversuche (Kraulrollwende) in Wettkampfgeschwindigkeit an einem auf kinematographischen (Videoaufnahmen mit bis zu 125 Bildern/s) und dynamometrischen Messmethoden (Unterwasser-IGaftmessplatte) basierenden Wendenmessplatz (vgl. Kaiser, 2002) aufgenommen. Zusätzlich absolvierten die Probanden einen Standardsprungkrafttest, bestehend aus Squat Jumps, Counter Movement Jumps und Drop Jumps aus verschiedenen Fallhöhen. Zur Bestimmung der Kraftvoraussetzungen der Beinstrechuskulatur wurde eine isometrische Maximalkraftmessung (Kniegelenkwinkel 100°) durchgeführt. Als weitere Erhebungsverfahren dienten die Messung relevanter anthropometrischer Merkmale sowie die Ermittlung persönlicher Kenndaten. Zusätzlich wixde ein Trainingstagebuch angelegt, welches Aufschluss über trainingsquantitative Merkmale erlaubte. ... Ergebnisse und Diskussion Die Ergebnisse der Feldstudie bestätigen die Relevanz der Wendenabstoßleistung für die Höhe der Wendenzeit. Kurze 5 m-Wendenzeiten wurden irn Zusammenhang mit geringen Kontaktzeiten und hohen Abstoßgeschwindigkeiten beobachtet. Die Fähigkeit, in kürzester Kontaktzeit möglichst hohe Abstoßgeschwindigkeiten zu erzeugen, hängt von biokinematischen, biodynamischen und konditionellen Parametern ab. Herauszustellen ist in diesem Zusammenhang der leistungsbestimmende Einfluss der reaktiven Kraftfähigkeit der Beinextensoren im kurzen Dehnungs-Verkürzungs-Zyklus (DVZ) für die Bremszeit und der Zusammenhang zwischen Abstoßgeschwindigkeit und Maximalkraftfähigkeit der Beinstrecker sowie der Leistungsfähigkeit im langen DVZ. Zudem ist sowohl die Kontaktzeit als auch der für die Abstoßgeschwindigkeit grundlegende Kraftstoß in erheblichem Maße von der Größe des Kniegelenkwinkels zu Beginn der Abstoßaktion determiniert. Als interessante Beobachtung in Bezug auf strömungsmechanische Beschreibungsgrößen der Abstoßgeschwindigkeit ist auf das Auftreten von Sogkräften nach dem Abstoß von der Beckenwand hinzuweisen, welche möglicherweise die Abstoßgeschwindigkeit positiv beeinflussen können. ...
Aufgrund der problematischen Situation von mobilen Notebook-Arbeitsplätzen mit mannigfaltigen negativen Einflüssen auf den Muskel- und Skelettapparat wurde ein neuartiges, wandlungsfähiges Notebook entwickelt. Dieses besitzt ein ausziehbares Display. Ziel dieses Forschungsvorhabens war die erste wissenschaftliche Analyse und Evaluation der Anwendung dieses Notebooktyps. Es wurden verschiedene Testungen durchgeführt, die die Eigenschaften des Displays, welches sich mit Teleskopschienen nach oben herausziehen lässt, auf wissenschaftlicher Ebene analysiert.
In der Studie wurden Probanden in unterschiedlichen Stellungen bei der Arbeit an einem klassischen Notebook mit gewöhnlicher Notebook-Stellung, sowie an einem höhenverstellbaren Notebook untersucht. Die Daten zeigen, dass es hochsignifikante Unterschiede in den unterschiedlichen Stellungen gibt. Die ausgefahrene Stellung des höhenverstellbaren Notebooks ist dabei mit einem hochsignifikant geringeren Neigungswinkel des Kopfes verbunden. Da die vertikale Belastung der WS direkt von der Neigung des Kopfes abhängig ist, ist davon auszugehen, dass die ausgefahrene Displaystellung eine wesentlich geringere vertikale Belastung der Wirbelkörper induziert als eine gewöhnliche Notebookhaltungsposition. Diese Eigenschaften des höhenverstellbaren Notebooks entsprechen eher den ergonomischen Forderungen der BildscharbV. In Hinblick auf eine Trennung von Bildschirm und Tastatur, wie es die BildscharbV vorsieht, lassen sich allerdings die Defizite von Notebooks funktionsbedingt nicht ausräumen.
Die Untersuchungen zeigen, dass es keine Unterschiede zwischen Männern und Frauen bezüglich des Kopfneigungswinkels gibt.
Die Untersuchungen zeigen ferner, dass es in dieser Hinsicht auch keine Unterschiede zwischen Sehhilfeträgern und Nicht-Sehhilfeträgern gibt.
Zukünftige Studien sollten den Einsatz bei Patienten mit Erkrankungen des Muskel- und Skelettapparates untersuchen. Für zukünftige Studien sind darüber hinaus Einflüsse auf den gesamten oberen Haltungsapparat, sowie die Position der Tastatur von Interesse.
Die Analyse der Phosphorylierung mittels Massenspektrometrie stellt in vielerlei Hinsicht große Anforderungen an die Analysenmethoden, die eingesetzt werden. Durch die substöchiometrische Modifzierung einer Aminosäure mit einem Phosphatrest ist die grundlegende Herausforderung der Sensitivtät an anzuwendende Analysetechniken gegeben. Die Biomassenspektrometrie hat mit den weichen Ionisierungmethoden ESI und MALDI zwar die Techniken zur Verfügung gestellt, die eine routinemäßige Identifzierung von vorher per MS nicht zugänglichen Proteinen über die Untersuchung der enzymatischen Spaltpeptides ermöglicht, gleichwohl ist der Aufwand, der für die massenspektrometrische Charakterisierung eines bestimmten Proteins besteht, um ein vielfaches höher. Wegen des in vivo variablen und potentiell sehr geringen Phosphorylierungsgrades ist die genaue Identifizierung der Phosphorylierungstelle allein durch das Vermessen der Probe in einem modernen Massenspektrometer nicht zu bewerkstelligen. Die sich in der Probe befindlichen Phosphopeptide stehen nach einem Verdau des entsprechenden Proteins einer mengenmäßig großen Zahl unphosphorylierter Peptide gegenüber. Auch die hohe Sensitivität von modernen Massenspektrometern reicht in der Regel nicht aus, um das entsprechende Phosphopeptid zu analysieren. Soll die exakte Phosphorylierungstelle des untersuchten Phosphopeptids bestimmt werden, so müssen ausreichende Mengen an Analyten für eine MS/MS-Analyse generiert werden. Bei realen Proben kann der Phosphorlyierungsgrad nicht erhöht werden, somit ist auch die Menge an vorhandenen Phosphopeptiden begrenzt. Somit kommt man an eine Anreicherung von Phosphopeptiden bzw. Abreicherung von unmodifzierten Peptiden nicht vorbei. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Anreicherungstechniken für Phosphopeptide hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität untersucht. Hierfür wurden verschiedene Affinitätstechniken (Graphit, IMAC und TiO¬¬2) hinsichtlich Empfindlichkeit und Selektivität untersucht. Von diesen drei Methoden zeigte sich Graphit aufgrund zu geringer Wechselwirkung zwischen Analyt und Medium als ungeeigneteste Methode. IMAC zeigt bei verbesserter Sensitvität eine höhere Spezifität, gleichwohl saure Peptide nicht von Phosphopeptiden zu trennen sind. Von den drei genannten Methoden zeigte TiO¬¬2 die höchste Sensitivität und Selektivität. Da das TiO¬¬2 als Goldstandard in der Anreicherung von Phosphopeptiden angesehen wird, sollte im Rahmen dieser Dissertation eine neuartige Methode entwickelt werden, die dieser Technik sowohl im Hinblick auf Spezifität und Selektivität überlegen sein sollte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden MALDI-Probenteller erstmals mit Hilfe von SAMs (Self Assembled Monolayers) mit Phosphonatgruppen modifiziert, aus denen durch Beladen mit vierwertigem Zirkonium eine neue funktionelle Oberfläche für die Anreicherung von Phoshopeptiden hergestellt werden kann, die der Titandioxid-Methode überlegen ist. Anhand von reproduzierbaren Modellsystemen von bekannten Phosphoproteinverdaus (z.B. Ovalbumin) konnte gezeigt werden, dass diese neue Technik Analyten im niedrigen Femtomol-Bereich auch vor einem großen nicht-phosphorlyierten Hintegrund selektiv anreichern kann. Um zu demonstrieren, dass die Phosphonat-Oberfläche auch bei realen Proben die massenspektrometrische Phosphorylierungsanalyse ermöglicht, wurden in der vorliegenden Arbeit zum einen die Mitogen Activated Protein Kinase 1 (MAPK-1) aus einem in-Lösungs-Verdau und das Heat Shock Protein (HSP), welches aus einem 2-D-Gel stammt, untersucht. Mit der neu etablierten Phosphonat-Oberfäche konnten die Phosphopeptide aus den Proben angereichert und mittels MALDI-MS/MS die Phosphatgruppe eindeutig der modifizierten Aminosäure zugeordnet werden. Neben dem Komplex der Anreicherungstechniken wurden im Rahmen dieser Dissertation noch andere relevante Fragestellungen für die Phosphoproteomanalytik untersucht. So konnte gezeigt werden, dass für phosphorylierte Peptide keine Suppression der Signale im MALDI-Gerät stattfindet, was eine noch weit verbreitete Meinung in vielen Arbeitsgruppen ist. Auch Versuche zur MALDI-Matrix und deren Kombination mit der Säurekomponente wurden durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass es neben DHB in Kombination mit Phosphorsäure momentan keine bessere Matrix-Kombination gibt. Im Hinblick auf die Quantifizierung der Phosphorlyierung eines Proteins konnte exemplarisch am Ovalbumin als Modellsystem eine einfache und valide Quantifizierungsmethode mit Hilfe der Dephosphorylierung entwickelt werden, die nicht die Nachteile von sonst häufig eingesetzten Derivatisierungsreagenzien besitzt.
Analyse und Vorhersage von Kristallstrukturen tetraederförmiger Moleküle und fehlgeordneter Phasen
(2012)
Die Kristallstrukturen tetraederförmiger EX4-Moleküle mit E = C, Si, Ge, Sn, Pb und X = F, Cl, Br, I konnten in sieben Strukturtypen eingeteilt werden. In fast allen Verbindungen nehmen die Halogenatome eine verzerrte Kugelpackung (ccp, hcp, bcc, cp) ein. Die E-Atome besetzen in den dichtesten Kugelpackungen 1/8 aller Tetraederlücken, wobei sich für diese Atome ebenfalls eine Anordnung wie für verzerrte Kugelpackungen ergibt (cp, ccp, hcp). In den anderen Fällen (bcc, cp für die Anordnung der Halogenatome) ergibt sich für die Anordnung der E-Atome selbst ebenfalls eine verzerrte Kugelpackung (bcc, s). Dabei steht s für die Anordnung der E-Atome analog der Schwefelatome im Pyrit (FeS2). Jeder Strukturtyp unterscheidet sich in der Art der kürzesten Halogen-Halogen-Wechselwirkungen. Die in der Literatur für halogenierte organische Verbindungen beschriebenen Typen der Wechselwirkung lassen sich auch bei den EX4-Verbindungen finden. Die E-X-X-Winkel liegen in einem Bereich von 80-100° und 130-160° und sind damit etwas kleiner als für die halogenierten organischen Verbindungen. Mit Hilfe von Gitterenergieminimierungen konnten diverse potentielle Polymorphe für die EX4-Verbindungen vorhergesagt werden.
Eine vollständige Kristallstrukturvorhersage wurde für SiBr4 durchgeführt. Für diese Vorhersage wurden die Van-der-Waals-Parameter neu bestimmt. Dazu wurde das Br-Br-Potential mit Hilfe von Vergleichsrechnungen an den beiden experimentellen Strukturen des GeBr4 in den Raumgruppentypen Pa3, Z = 8 (s/ccp), und P21/c, Z = 4 (hcp/hcp), optimiert. Für die Vorhersage des SiBr4 konnten zwei der vorhergesagten Strukturen durch extern durchgeführte Kristallisationsexperimente bestätigt werden. Eine Hochtemperaturmodifikation kristallisiert oberhalb von 168K im Raumgruppentyp Pa3, Z = 8 im Strukturtyp s/ccp. Diese Struktur konnte bei der Vorhersage auf Rang 9 gefunden werden. Die Tieftemperaturmodifikation, die unterhalb von 168K vorliegt, kristallisiert im Raumgruppentyp P21/c, Z = 4 (Strukturtyp hcp/hcp). Diese Struktur hat Rang 4 der Vorhersage. Die vorhergesagten und experimentellen Strukturen zeigen nur geringe Abweichungen voneinander.
Für die tetraederförmigen E(CH3)4-Moleküle wurden für Tetramethylsilan und Tetramethylgerman vollständige Kristallstrukturvorhersagen durchgeführt. Die energetisch günstigste Struktur ist für beide Verbindungen im Raumgruppentyp Pa3 mit Z = 8 zu finden. Die energetisch zweitgünstigste Struktur hat den Raumgruppentyp Pnma mit Z = 4. Für Tetramethylsilan konnten die Strukturen mit Rang 1 und 2 experimentell bestätigt werden. Eine Hochdruckmodifikation des Tetramethylsilans kristallisiert im Raumgruppentyp Pa3 mit Z = 8. Diese Struktur entspricht der berechneten energetisch günstigsten Struktur auf Rang eins. Ihr konnte der Strukturtyp s/ccp zugeordnet werden. Mit Tieftemperatur-Röntgenpulverbeugungsexperimenten konnte eine Tieftemperaturmodifikation bei T = 100 K im Raumgruppentyp Pnma, Z = 4, mit Strukturtyp ccp/hcp gefunden werden.
Gitterenergieberechnungen wurden für die Strukturanalysen von drei fehlgeordneten Phasen eingesetzt. Experimentell bestimmte Kristallstrukturen von Azulen und Pigment Red 194 haben den Raumgruppentyp P21/c, Z = 2. Die Moleküle befinden sich dabei auf einer Punktlage mit Inversionssymmetrie. Da beide Moleküle kein Inversionszentrum aufweisen, kommt es zu einer Orientierungsfehlordnung. Für die rechnerische Analyse der Fehlordnung wurden jeweils sechs geordnete Modelle ausgehend von den fehlgeordneten Strukturen erstellt, die möglichst wenige Moleküle pro Elemenarzelle aufweisen sollten. Gitterenergieberechnungen und die Auswertung der Boltzmann-Verteilung zeigten, dass in bei beiden Kristallstrukturen eine statistische Fehlordnung der Moleküle vorliegt, die sich aus mehreren geordneten Modellen aufbauen lässt. Bei Azulen ist eine geordnete Struktur im Raumgruppentyp Pa, Z = 4, energetisch etwas günstiger als die anderen Modell. Für Pigment Red 194 zeigte sich, dass die Fehlordnung unter der Annahme, dass nur die berechneten Modelle die fehlgeordnete Struktur bilden, mit über 99%iger Wahrscheinlichkeit aus den vier energetisch günstigsten Modellen Pc, Z = 2, P21, Z = 2, P21/c, Z = 4 und Pc, Z = 4 besteht.
Die dritte untersuchte fehlgeordnete Struktur ist die des Natrium-p-chlorphenylsulfonat-Monohydrats. Die Fehlordnung bezieht sich hier nur auf die Phenylringe, die dort mit einer Besetzung von 50% zueinander senkrecht stehen. Mit Hilfe der Order-Disorder-Theorie konnten zwei geordnete Modelle im Raumgruppentyp P21/c und ein weiteres geordnetes Modell im Raumgruppentyp C1c1 (Z = 16, Z'= 2) aufgestellt werden. Gitterenergieminimierungen dieser Modelle zeigten, dass sich die Fehlordnung statistisch aus allen drei Modellen zusammensetzt. Das energetisch günstigste geordnete Modell im Raumgruppentyp P21/c, Z = 8 (Z' = 2), konnte als verzwillingte Struktur aus Einkristalldaten bestätigt werden.
Ziel dieser klinischen Studie war es, die Ergebnisse der operativen Behandlung eines idiopathischen Makulaforamens durch Vitrektomie, ggf. in Kombination mit einer Phakoemulsifikation, ILM-Peeling und einer Tamponade entweder mit Luft oder mit 20%-igem SF6-Gas zu vergleichen. Primärer Endpunkt war die Verschlussrate nach einer Vitrektomie und die Reoperationsrate bei primär nicht geschlossenen Makulaforamina. Sekundärer Endpunkt war die Visusentwicklung in der ersten postoperativen Woche und nach 3 Monaten.
In der vorliegenden Arbeit wurden hierzu retrospektiv 117 Augen von 117 konsekutiven Patienten analysiert. Es wurden die Ergebnisse von 2 Patientengruppen verglichen. In der ersten Gruppe wurden 66 Augen (m=27, w=39, Altersmedian 70 Jahre), bei denen am Ende der Vitrektomie eine Tamponade mit Luft erfolgte, untersucht. In der zweiten Gruppe wurden die Ergebnisse von 51 Augen (m=20, w=31, Altersmedian 71 Jahre), bei denen 20%-SF6-Gas als Tamponade verwendet wurde, ausgewertet. Bei etwa 70 % der Augen beider Gruppen erfolgte eine simultane Phakoemulsifikation. Der Verschluss des Makulaforamens wurde bereits in den ersten postoperativen Tagen mit einem modifizierten Fourier Domain-OCT untersucht. Sobald der Verschluss des Makulaforamens im OCT gesichert werden konnte, wurde die postoperative „Gesicht nach unten“-Lagerung („Bauchlage“) beendet. Die mediane Lagerungszeit betrug 1 Tag (Spanne 1-6 Tage). Der Zeitraum der Nachbeobachtung betrug 3 Monate (Median).
Die Verschlussrate nach einer Vitrektomie aller Makulaforamina betrug 87,2% (102/117 Augen). Die primäre Verschlussrate der Luft-Gruppe und der SF6-Gas-Gruppe betrug 83,3% (55/66 Augen) bzw. 92,2% (47/51 Augen). Bei Augen mit einem persistierenden Foramen erfolgte eine frühe Reoperation. Die Verschlussrate nach 3 Monaten lag insgesamt bei 99,1% (116/117 Augen), in der Luft-Gruppe bei 98,5% (65/66 Augen) und in der SF6-Gas-Gruppe bei 100% (51/51 Augen). Es zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied der Verschlussrate bzw. der anatomischen Ergebnisse zwischen den beiden Endotamponade-Gruppen.
Es konnte jedoch ein statistisch signifikanter Unterschied des Fernvisus bei der Entlassung zwischen beiden Endotamponadegruppen nachgewiesen werden. Der logMAR-Visus bei Entlassung lag in der Luft-Gruppe mit 1,3 (Median) deutlich unter dem Visus der SF6-Gas-Gruppe mit 1,9 (Median). Die Anwendung von Luft führte somit im Vergleich zu SF6 zu einem schnelleren postoperativen Visusanstieg. In beiden Gruppen zeigte sich nach 3 Monaten eine signifikante Visusbesserung. Es ließ sich kein signifikanter Unterschied des Fernvisus zwischen den beiden Gruppen mehr nachweisen.
Die Makulaforamenchirurgie mit pars plana Vitrektomie und Peeling der ILM erzielte sowohl mit einer Luft- als auch mit einer 20%-SF6-Gas-Tamponade guten anatomischen und funktionellen Ergebnissen. Mit einer kurz wirksamen Endotamponade erscheint eine postoperative Lagerung essenziell, dürfte aber in den meisten Fällen nur wenige Tage erforderlich sein, um den Verschluss eines durchgreifenden Makulaforamens zu erreichen. Die Reoperations-Rate nach einer Lufttamponade war bei sehr großen Foramina (> 600 µm) signifikant höher als bei Foramina mit einem Durchmesser kleiner 600 µm. Daher scheint die Anwendung von Gasen, die länger als Luft wirken, nur bei sehr großen Foramina erforderlich zu sein. Vorteil einer kurz wirkenden Lufttamponade ist die postoperativ um einige Tage schneller einsetzende visuelle Rehabilitation, so dass die Patienten früher in ihren Alltag zurückkehren können. Eine frühe postoperative Untersuchung der Makula unter Einsatz der optischen Kohärenztomographie ist Voraussetzung für eine individualisierte Steuerung der Lagerung und für eine möglichst frühe Erkennung und Reoperation von nicht geschlossenen Makulalöchern.
Ein gentherapeutischer Ansatz für die Behandlung der HIV-Infektion ist die "intrazelluläre Immunisierung" von CD4+-Zellen die den Hauptangriffspunkt des HI-Virus darstellen. Potentiell therapeutische Gene zur Hemmung der HIV-Replikation sind in großer Zahl und für praktisch jeden schritt des Replikationszyklus des Virus publiziert. Ein Problem war allerdings bisher das Fehlen eines einheitlichen und reproduzierbaren Vergleichssystems zur Identifizierung erfolgversprechender Gene für Studien im Tiermodell und in der Klinik. In dieser Arbeit wurde ein solches auf die Gentherapie abgestimmtes Zellkultursystem entwickelt, das auf stabilem Transfer von HIV-inhibitorischen Genen durch retrovirale Transduktion von T-Zellen und Belastungsversuchen mit replikationsfähigen Viren beruht. Dazu wurden auf Basis der humanen T-Zellinie PM1 Zellinien etabliert, die das Markergen egfp sowie ein therapeutisches Gen stabil exprimieren. Für den Gentransfer wurden [MLV(GaLV)]-Vektoren verwendet, die sich für die Transduktion von hämatopoetischen Zellen besonders eignen. Mit Hilfe der etablierten HIV-inhibitorischen Gene RevM10 und STHM (membrangebundenes T20) wurden Methoden zur Generierung dieser stabilen Zellinien optimiert. Um eine höchstmögliche Vergleichbarkeit zu erreichen, müssen die Voraussetzungen für eine HIV-Replikation in allen Zellinien in gleicher Weise gegeben sein. Deshalb wurden Zellinien bei mit praktisch gleicher Zellteilungsrate und HIV-Rezeptorexpression etabliert. Die untrschiedliche Hemmwirkung der Kontrollgene konnte so in Belastungsexperimenten mit drei verschiedenen, repräsentativen HIV-1-Laborstämmen reproduzierbar gezeigt werden. Das erarbeitete Zellkultursystem wurde dann zur Evaluierung verschiedener Gene eingesetzt. Zunächst wurden zwei neue Ansätze für die HIV-Gentherapie getestet. Die hohe Wirksamkeit von APOBEC3Gagm gegen HIV-1, die zuvor in einem "single-round"-Infektionssystem gezeigt worden war, konnte bestätigt werden. Der Versuch, das als natürlicher HIV-Inhibitor in humanem Hämofiltrat gefundene Peptild VIRIP auf der Zelloberfläche zu exprimieren, bewirkte hingegen keine HIV-Hemmung. Zusätzlich wurden mehrere potentiell therapeutische Gene getestet, die von Kooperationspartnern im Rahmen eines HIV-Netzwerkes entwickelt worden waren. Für die humanisierte transdominant-negative Gag-Mutante TDsg Delta 2 konnte eine HIV-Hemmwirkung nachgewiesen werden, während weder die Wildtyp-Mutante TDwt Delta 2 noch das minimale GAG-Fragment L2GAL2-V3 eine signifikante Wirkung zeigten. Für die beiden HIV-1 p6-Konstrukte L4 und L6 war eine HIV-Hemmung ebensowenig wie für die gp41 c-tail-Konstrukte 9/1 und 9/2 feststellbar. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, daß sich die Hemmwirkung der unterschiedlichen Gene gegen HIV-1-Primärisolate im wesentlichen der gegen die Laborstämme entspricht. Nach Infektion der Zellinien mit HIV-2 wurde wie erwartet die Virusreplikation nur durch STHM und TDsg Delta 2 gehemmt. Schließlich wurde getestet, ob sich die Hemmeffekte auch in primären humanen Lymphozyten nachvollziehen lassen. Obwohl aufgrund der in diesen Zellen niedrigen erreichbaren Transduktionseffizienzen und einer starken Donorabhängigkeit keine Standardisierung möglich war, konnte gezeigt werden, daß es prinzipiell möglich ist, Hemmeffekte sichtbar zu machen.
Kenntnisse über die dreidimensionale Struktur therapeutisch relevanter Zielproteine bieten wertvolle Informationen für den rationalen Wirkstoffentwurf. Die stetig wachsende Zahl aufgeklärter Kristallstrukturen von Proteinen ermöglicht eine qualitative und quantitative rechnergestützte Untersuchung von spezifischen Protein-Liganden Wechselwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Algorithmen für die Identifikation und den Ähnlichkeitsvergleich von Proteinbindetaschen und ihren Eigenschaften entwickelt und in dem Programm PocketomePicker zusammengefasst. Die Software gliedert sich in die Routinen PocketPicker, PocketShapelets und PocketGraph. Ferner wurde in dieser Arbeit die Methode ReverseLIQUID reimplementiert und im Rahmen einer Kooperation für das strukturbasierte Virtuelle Screening angewendet. Die genannten Methoden und ihre wissenschaftliche Anwendungen sollte hier zusammengefasst werden: Die Methode PocketPicker ermöglicht die Vorhersage potentieller Bindetaschen auf Proteinoberflächen. Diese Technik implementiert einen geometrischen Ansatz auf Basis „künstlicher Gitter“ zur Identifikation zusammenhängender vergrabener Bereiche der Proteinoberfläche als Orte möglicher Ligandenbindestellen. Die Methode erreicht eine korrekte Vorhersage der tatsächlichen Bindetasche für 73 % der Einträge eines repräsentativen Datensatzes von Proteinstrukturen. Für 90 % der Proteinstrukturen wird die tatsächlich Ligandenbindestelle unter den drei wahrscheinlichsten vorhergesagten Taschen gefunden. PocketPicker übertrifft die Vorhersagequalität anderer etablierter Algorithmen und ermöglicht Taschenidentifikationen auf apo-Strukturen ohne signifikante Einbußen des Vorhersageerfolges. Andere Verfahren weisen deutlich eingeschränkte Ergebnisse bei der Anwendung auf apo-Strukturen auf. PocketPicker erlaubt den alignmentfreien Ähnlichkeitsvergleich von Bindetaschenfor-men durch die Kodierung berechneter Bindevolumen als Korrelationsdeskriptoren. Dieser Ansatz wurde erfolgreich für Funktionsvorhersage von Bindetaschen aus Homologiemodellen von APOBEC3C und Glutamat Dehydrogenase des Malariaerregers Plasmodium falciparum angewendet. Diese beiden Projekte wurden in Zusammenarbeit mit Kollaborationspartnern durchgeführt. Zudem wurden PocketPicker Korrelationsdeskriptoren erfolgreich für die automatisierte Konformationsanalyse der enzymatischen Tasche von Aldose Reduktase angewendet. Für detaillierte Analysen der Form und der physikochemischen Eigenschaften von Proteinbindetaschen wurde in dieser Arbeit die Methode PocketShapelets entwickelt. Diese Technik ermöglicht strukturelle Alignments von extrahierten Bindevolumen durch Zerlegungen der Oberfläche von Proteinbindetaschen. Die Überlagerung gelingt durch die Identifikation strukturell ähnlicher Oberflächenkurvaturen zweier Taschen. PocketShapelets wurde erfolgreich zur Analyse funktioneller Ähnlichkeit von Bindetaschen verwendet, die auf Betrachtungen physikochemischer Eigenschaften basiert. Zur Analyse der topologischen Vielfalt von Bindetaschengeometrien wurde in dieser Arbeit die Methode PocketGraph entwickelt. Dieser Ansatz nutzt das Konzept des sog. „Wachsenden Neuronalen Gases“ aus dem Bereich des maschinellen Lernens für eine automatische Extraktion des strukturellen Aufbaus von Bindetaschen. Ferner ermöglicht diese Methode die Zerlegung einer Bindestelle in ihre Subtaschen. Die von PocketPicker charakterisierten Taschenvolumen bilden die Grundlage für die Methode ReverseLIQUID. Dieses Programm wurde in dieser Arbeit weiterentwickelt und im Rahmen einer Kooperation zur Identifikation eines Inhibitors der Serinprotease HtrA des Erregers Helicobacter pylori verwendet. Mit ReverseLIQUID konnte ein strukturbasiertes Pharmakophormodell für das Virtuelle Screening erstellt werden. Dieser Ansatz ermöglichte die Identifikation einer Substanz mit niedrig mikromolarer Affinität gegenüber der Zielstruktur.
Analyse von Heuristiken
(2006)
Heuristiken treten insbesondere im Zusammenhang mit Optimierungsproblemen in Erscheinung, bei solchen Problemen also, bei denen nicht nur eine Lösung zu finden ist, sondern unter mehreren möglichen Lösungen eine in einem objektiven Sinne beste Lösung ausfindig gemacht werden soll. Beim Problem kürzester Superstrings werden Heuristiken herangezogen, da mit exakten Algorithmen in Anbetracht der APX-Vollständigkeit des Problems nicht zu rechnen ist. Gegeben ist eine Menge S von Strings. Gesucht ist ein String s, so dass jeder String aus S Teilstring von s ist. Die Länge von s ist dabei zu minimieren. Die prominenteste Heuristik für das Problem kürzester Superstrings ist die Greedy-Heuristik, deren Approximationsfaktor derzeit jedoch nur unzureichend beschränkt werden kann. Es wird vermutet (die sogenannte Greedy-Conjecture), dass der Approximationsfaktor genau 2 beträgt, bewiesen werden kann aber nur, dass er nicht unter 2 und nicht über 3,5 liegt. Die Greedy-Conjecture ist das zentrale Thema des zweiten Kapitels. Die erzielten Ergebnisse sind im Wesentlichen: * Durch die Betrachtung von Greedyordnungen können bedingte lineare Ungleichungen nutzbar gemacht werden. Dieser Ansatz ermöglicht den Einsatz linearer Programmierung zum Auffinden interessanter Instanzen und eine Vertiefung des Verständnisses solcher schwerer Instanzen. Dieser Ansatz wird eingeführt und eine Interpretation des dualen Problems wird dargestellt. * Für die nichttriviale, große Teilklasse der bilinearen Greedyordnungen wird gezeigt, dass die Länge des von der Greedy-Heuristik gefundenen Superstrings und die des optimalen Superstrings sich höchstens um die Größe einer optimalen Kreisüberdeckung der Strings unterscheiden. Da eine optimale Kreisüberdeckung einer Menge von Strings stets höchstens so groß ist wie ein optimaler Superstring (man schließe einen Superstring zu einem einzelnen Kreis), ist das erzielte Ergebnis für die betrachtete Teilklasse der Greedyordnungen stärker als die klassische Greedy-Conjecture. * Es wird eine neue bedingte lineare Ungleichung auf Strings -- die Tripelungleichung -- gezeigt, die für das eben genannte Hauptergebnis wesentlich ist. * Schließlich wird gezeigt, dass die zum Nachweis der oberen Schranke von 3,5 für den Approximationsfaktor herangezogenen bedingten Ungleichungen (etwa die Monge-Ungleichung) inhärent zu schwach sind, um die Greedy-Conjecture selbst für lineare Greedyordnungen zu beweisen. Also ist die neue Tripelungleichung auch notwendig. Zuletzt wird gezeigt, dass das um die Tripelungleichung erweiterte System bedingter linearer Ungleichungen inhärent zu schwach ist, um die klassische Greedy-Conjecture für beliebige Greedyordnungen zu beweisen. Mit der Analyse von Queueing Strategien im Adversarial Queueing Modell wird auch ein Fall betrachtet, in dem Heuristiken auf Grund von anwendungsspezifischen Forderungen wie Online-Setup und Lokalität eingesetzt werden. Pakete sollen in einem Netzwerk verschickt werden, wobei jeder Rechner nur begrenzte Information über den Zustand des Netzwerks hat. Es werden Klassen von Queueing Strategien untersucht und insbesondere untersucht, wovon Queueing Strategien ihre lokalen Entscheidungen abhängig machen sollten, um ein gewisses Qualitätsmerkmal zu erreichen. Die hier erzielten Ergebnisse sind: * Jede Queueing Strategie, die ohne Zeitstempel arbeitet, kann zu einer exponentiell großen Queue und damit zu exponentiell großer Verzögerung (im Durchmesser und der Knotenzahl des Netzwerks) gezwungen werden. Dies war bisher nur für konkrete prominente Strategien bekannt. * Es wird eine neue Technik zur Feststellung der Stabilität von Queueing Strategien ohne Zeitnahme vorgestellt, die Aufschichtungskreise. Mit ihrer Hilfe können bekannte Stabilitätsbeweise prominenter Strategien vereinheitlicht werden und weitere Stabilitätsergebnisse erzielt werden. * Für die große Teilklasse distanzbasierter Queueing Strategien gelingt eine vollständige Klassifizierung aller 1-stabilen und universell stabilen Strategien.
Die Hyperhomocysteinämie wird als unabhängiger Risikofaktor atherosklerotischer Gefäßerkrankungen angesehen. Viele Studien haben eine deutliche Korrelation zwischen Hyperhomocysteinämie, koronarer Herzkrankheit, cerebrovaskulären und peripheren thromboembolischen Erkrankungen aufgezeigt. Aus diesem Grund hat natürlich die Homocysteinbestimmung in die diagnostischen Maßnahmen, die bei Verdacht auf Arteriosklerose durchgeführt werden, Eingang gefunden. Mit der Zielsetzung, ein zuverlässiges und standardisiertes Verfahren für die Routinediagnostik bereitzustellen, wurde im Rahmen dieser Dissertation eine quantitative HPLC-Methode zur Bestimmung von Homocystein im Blut etabliert. Weiterhin erfolgte auch eine Homocysteinbestimmung mit dem ELISA und im Anschluß daran ein Methodenvergleich zwischen HPLC und ELISA. Der Methodenvergleich ergab, daß die ELISA-Homocysteinwerte immer um etwa 4,77% niedriger lagen als die HPLC-Homocysteinwerte. Dies bestätigte auch die Literatur. Die wichtigste Aufgabenstellung dieser Doktorarbeit war allerdings die Suche nach einer neuen genetischen Mutation auf dem MTHFR-Gen mittels Probenscreening von Patienten mit Hyperhomocysteinämien. Die katalytische Domäne der MTHFR liegt im N-terminalen Bereich des Proteins. Dieser Bereich entspricht Exon 1 bis Exon 6 des MTHFR-Gens. Folglich wurde für diese Exonbereiche 1,2,3,4,5 und 6 das Mutationsscreening etabliert. Dieses ließ sich mit der Temperaturgradientengelelektrophorese (TGGE) erfolgreich durchführen, wobei für jeden Exonbereich 300 Proben aus der Luric-Studie durchgemessen worden sind. LURIC steht für LUdwigshafener RIsikofaktor- und Cardiovaskuläre Gesundheits-Studie. Das Ziel dieser Untersuchungen ist das Erkennen neuer Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere die zum Herzinfarkt führen. Für alle Probenwerte erhielten wir Angaben über Geschlecht, Geburtsdatum, Größe, Gewicht, KHK-Status, Hypertonie, Diabetes mellitus, Homocystein, Vitamin B6, Vitamin B12 und Folsäure. Nach eingehender Betrachtung ließen sich nun drei Kollektive mit unterschiedlichen Homocystein-/ Folsäurewerten ermitteln, welche dann durchgescreent wurden: Das erste Kollektiv erfaßt Homocysteinwerte, welche größer als 16µmol/l sind und zwar unabhängig von den Folsäurewerten. Das zweite Kollektiv enthält Homocysteinwerte, welche größer als 10µmol/l sind und Folsäurewerte, welche ebenfalls größer als 10 µmol/l sind. Das dritte Kollektiv ist das größte und enthält die übrigen Werte, welche negativ auf schon bekannte Mutationen auf Exon 4 und Exon 7 sind. Dieses Kollektiv wurde hier zunächst betrachtet und enthält etwa für jeden Exonbereich 200 Proben. Bei jeder Art von Korrelationsuntersuchungen in den einzelnen Kollektiven (1. Kollekiv, 2. Kollektiv, 3. Kollektiv, homozygotes Kollektiv, heterozygotes Kollektiv und Referenzkollektiv) konnte zwischen Homocystein und Folsäure, zwischen Homocystein und Vitamin B12, zwischen Homocystein und Vitamin B6 und Homocystein und dem Alter keine Korrelation festgestellt werden. Die Korrelationen lagen alle unter -0,5 und 0,3. Einen negativen Korrelationskoeffizienten weisen die Parameter Homocystein/Folsäure, Homocystein/Vitamin B12 und Homocystein/Vitamin B6 auf. Einen positiven Korrelationskoeffizienten weisen Homocystein und das Alter auf. Bei den Signifikanzuntersuchungen ergab sich, daß fast alle Mittelwerte der einzelnen Kollektive signifikant unterschiedlich sind. Die Mittelwerte aller Kollektive von Folsäure/Homocystein, Vitamin B12/Homocystein und das Alter/Homocystein sind signifikant unterschiedlich Nur bei dem Vergleich Vitamin B6/Homocystein ist bei den meisten Kollektiven keine Signifikanz festgestellt worden. D. h. diese Mittelwerte sind annähernd gleich, sie sind nicht bedeutend unterschiedlich. Nur das 1. Kollektiv und das homozygote Kollektiv sind bei dem Vergleich der Mittelwerte Vitamin B6/Homocystein signifikant unterschiedlich. Mit Hilfe der TGGE und anschließender Sequenzierung konnten drei verschiedene Mutationen identifiziert werden: Auf Exon 4 ließ sich eine bekannte Mutation und zwar die (C-677-T) mit dem Basenaustausch Alanin gegen Valin an Patient 540 und Patient 786 feststellen. Dies ließ sich auch durch eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym Hinfl bestätigen. Auf Exon 6 konnte eine stille Mutation mit dem Basenaustausch (T-1068-C) an zwei Patienten (762 und 624) identifiziert werden. Die Aminosäure Serin bleibt hierbei erhalten (AGT-AGC). Auf Exon 5 ließ sich eine interessante Mutation erkennen, welche weitere Messungen wie Enzymaktivität und Familienanamnesen erfordert. Am Patient 569 entsteht hier durch einen Basenaustausch (C-844-T) aus der Aminosäure Glutamin (CAG) ein Stopcodon (TAG). Dies ließ sich weiterhin durch eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym Mae III bestätigen. Erhöhte Homocysteinspiegel und reduzierte MTHFR-Aktivitäten erklären ebenfalls das Mutationsergebnis. Auch die Familienanamnese ergab eine interessante Entdeckung. Die gleiche Mutation (C-844-T) vom Patienten 569 ließ sich auch bei seinem Bruder feststellen. Damit wurde die Mutation vererbt und ereignete sich nicht spontan.
Die Chloroplastenbewegung ist eine der wichtigsten Anpassungen, die Pflanzen entwickelt haben, um eine effiziente Ausbeute an Lichtquanten für die Photosynthese zu gewährleisten. Auch wenn der genaue Mechanismus und die Signalwege, die diesen Prozess vermitteln, noch nicht vollständig verstanden sind, konnten einige an der Chloroplastenbewegung beteiligte Proteine (phot1, phot2, chup1, Aktin, Profilin) in den letzten Jahren identifiziert werden. Chup1, das an der äußeren Chloroplastenmembran verankerte Protein, wird als putativer Linker zwischen den Chloroplasten und dem Aktin-Zytoskelett gesehen. Durch die Interaktion mit Profilaktin reguliert chup1 die Aktin-Polymerisierung und somit auch die Chloroplastenbewegung. Die Analyse der intra- und intermolekularen Interaktionen von chup1, die in dieser Studie ermittelt wurden, deutet auf eine Homodimerisierung von chup1 durch die Coiled coil Domäne sowie auf eine Assoziation des N- mit dem C-terminalen Leuzin- Zipper hin. Neben diesen Interaktionen konnte für einen der vier putativen Interaktionspartner von chup1, der wall associated kinase 3, eine mögliche Funktion bei der Vermeidungsbewegung der Chloroplasten gezeigt werden. In Anbetracht dieser Interaktion und der postulierten Phosphorylierungsstellen in chup1, könnte eine Regulierung von chup1 durch Phosphorylierung erfolgen. Um die Funktionen von chup1 und phot2 besser zu verstehen, wurden die Pflanzen mit knock-out in diesen Gene genauer charakterisiert und die T-DNA Insertionslinien von chup1 und phot2 zeigen keine Reduzierung in der photosynthetischen Aktivität. Im Gegensatz dazu, bedingt der knock out von beiden Genen eine deutliche Verminderung der photosynthetischen Leistung. Infolge der fehlenden Chloroplastenbewegung im chup1phot2 Doppel knock out führt das möglicherweise zu einem verringerten Schutz der Photosynthese. Dies bestätigt weiter die Verbindung zwischen der durch phot2 induzierten Signalkaskade und der Aktin-Polymerisierung, die durch chup1 reguliert wird. Um den Einfluss von chup1, phot1 und phot2 auf die transkriptionelle Regulierung nach BL zu analysieren, wurde das globale Expressionsmuster nach BL-Behandlung untersucht. Bei der Analyse der Mutanten-Pflanzen mit einem Defekt in der Chloroplastenbewegung (chup1, phot1, phot2) konnte keine Beeinflussung der Regulierung der Genexpression in BL-gesteuerten Signalkaskaden durch diese Proteine beobachtet werden. Die Regulierung der Expression geschieht eher auf posttranskriptioneller Ebene und wird mit Hilfe von microRNA gesteuert.
Im adulten Säugerhirn findet Neurogenese in der SVZ der Seitenventrikel kontinuierlich statt. Eine Vielzahl von Signalsystemen steuert in komplexer Weise zelluläre Antworten und reguliert die Proliferation, Differenzierug und Wanderung NSZ. Gegenwärtig ist nur wenig über die zugrundeliegenden Signalwege bekannt. Zunehmend gibt es Hinweise darauf, dass Nukleotide an diesen Prozessen beteiligt sind. Frühere Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe zeigten, das die Nukleotide ADPbetaS und UTP in kultivierten NSZ der adulten SVZ einen schnellen Kalziumeinstrom induzieren und die Wachstumsfaktor-vermittelte NSZ-Proliferation steigern. In der vorliegenden Arbeit wurde ein System zur Kultivierung adhärenter adulter NSZ etabliert. Die Untersuchungen zeigen, dass adulte NSZ eine Vielzahl an P2Y- und P2X-Rezeptoren, sowie die Nukleotid-hydrolysierenden Enzyme NTPDase2 und TNAP exprimieren. Untersuchungen der ADPbetaS-, UTP- und EGF-vermittelten Signalwege zeigen, dass alle drei Agonisten eine ERK1/2- und CREB-Phosphorylierung induzieren, wobei sich die zeitlichen Charakteristika zwischen den Nukleotiden und EGF unterscheiden. Inhibierungsexperimente geben Einblicke in die dabei aktivierten Signalkaskaden und weisen auf eine ADPbetaS-induzierte Transaktivierung des EGF-Rezeptors hin. Während UTP über den P2Y2-Rezeptor wirkt, übt ADPbetaS seine Funktion über den P2Y1- und P2Y13-Rezeptor aus. Die Daten implizieren zudem, dass Nukleotide und EGF gleiche Zielproteine über verschiedene Signalwege induzieren und dass sie das Potenzial besitzen, bei der Kontrolle der Zellproliferation in der adulten Neurogenese synergistisch zu agieren. Vergleichende Analysen mit kultivierten NSZ aus Wildtyp-, P2Y1- und P2Y2-Rezeptor-Knockout-Mäusen belegen ein verändertes Antwortverhalten in Gegenwart von ADPbetaS, UTP und EGF und lassen kompensatorische Mechanismen vermuten. Die Resultate dieser Arbeit demonstrieren zudem, dass ATP, ADPbetaS, UTP und EGF die Migration von NSZ induzieren. Parallel dazu konnten Veränderungen des Aktinzytoskelletes, wie die Zunahme an F-Aktin, die Bildung von Stressfasern und eine Veränderung der Zellmorphologie gezeigt werden. Diese Prozesse gehen mit einer Aktivierung der Proteinkinasen Akt und FAK einher. Die Daten weisen darauf hin, dass Nukleotide und EGF für die Zytoarchitektur der SVZ und die Wanderung von Neuroblasten zum OB eine wichtige Rollen spielen könnten.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den nichtlinearen Zusammenhangsstrukturen in Form von Moderator- und quadratischen Effekten, die einen aktuellen Gegenstand der Forschung darstellen. In der Arbeit wurden zunächst die theoretischen Grundlagen von Strukturgleichungsmodellen sowie die Problematik von manifesten und latenten nichtlinearen Modellen erläutert. Die komplexeren Strukturgleichungsmodelle, die neben einem Moderatorterm auch quadratische Termen enthalten, wurden besprochen und danach sowohl die Produktindikatorverfahren vorgestellt, die zur Parameterschätzung die Maximum-Likelihood-Methode verwenden, als auch die neu entwickelten verteilungsanalytischen Verfahren, nämlich LMS (Klein, 2000; Klein & Moosbrugger, 2000) und QML (Klein & Muthén, 2007) vorgestellt. Das Thema wurde zuerst aus theoretischer Perspektive analysiert und unter "Fragestellung 1" dargestellt. Bei der Analyse von Moderator- und quadratischen Termen in multiplen Regressionsmodellen kann es bei steigender Prädiktorkorrelation wegen des zunehmenden gemeinsamen Varianzanteils dieser beiden Terme zu einer Fehlspezifizierung der tatsächlich vorhandenen nichtlinearen Effekte kommen. Um eine zuverlässige Aufdeckung dieser Effekte zu ermöglichen, wurde daher in der Vergangenheit mehrfach empfohlen, grundsätzlich Moderator− und quadratische Effekte simultan zu untersuchen. Da psychologische Variablen jedoch selten messfehlerfrei erfasst werden können, erwiesen sich entsprechende Untersuchungen, die lediglich auf manifester Variablenebene durchgeführt worden waren und somit, von perfekt reliablen Messungen ausgingen, als methodisch problematisch. Zur weiterführenden Untersuchung der simultanen Analyse nichtlinearer Effekte empfiehlt sich daher der Einsatz latenter Strukturgleichungsmodelle, die den Messfehler manifester Variablen explizit berücksichtigen. Im Anschluss daran wurden die neu entwickelten verteilungsanalytischen Verfahren, LMS und QML vorgestellt. Diese neuen Verfahren berücksichtigen erstmals explizit die multivariate nichtnormale Verteilung der Indikatorvariablen, die aus nichtlinearen Modellen resultiert. Unter "Fragestellung 2“ wurde ihre Leistungsfähigkeit im Vergleich zu LISRELML-Verfahren überprüft. Die Voraussetzungen zur Anwendung der beiden Methoden ist die Normalverteilung der Indikatoren der latenten Prädiktorvariablen. Da in der empirischen Forschung zu psychologischen oder sozialwissenschaftlichen Fragestellungen normalverteilte Variablen sehr selten sind, wurde unter "Fragestellung 3" die Frage untersucht, wie robust beide Verfahren gegenüber der Verletzung der Verteilungsvoraussetzung sind. Es wurden zahlreiche Simulationsstudien durchgeführt, anhand derer die Robustheit der verteilungsanalytischen Verfahren bei variierender Schiefe und Kurtosis der Variablen nachgewiesen werden konnte. Auch unter weiteren praxisrelevanten Bedingungen, z.B. sehr komplexen Modellen mit bis zu sechs nichtlinearen Effekten und relativ kleinen Stichproben, zeigten beide Methoden sehr gute Schätzeigenschaften. Diese Ergebnisse sind für Anwender sehr ermutigend, da sie zeigen konnten, dass für die Untersuchung von multiplen nichtlinearen Effekten unter verschiedenen simulierten Bedingungen die verteilungsanalytischen Verfahren LMS und QML sehr zuverlässig sind und eingesetzt werden können. Beide Methoden wiesen unter den realisierten Bedingungen bezüglich der Güte der Parameterschätzungen keine bedeutsamen Unterschiede auf. Beide Verfahren lieferten unabhängig von der Komplexität der untersuchten Modelle erwartungstreue Parameterschätzungen und unverzerrte Standardfehlerschätzungen. Anschließend konnte neben dem Nachweis der erweiterten Leistungsfähigkeit der verteilungsanalytischen Verfahren anhand eines empirischen Beispiels aus der Burnout-Forschung gezeigt werden, dass die Analyse von multiplen nichtlinearen Effekten eine praktische Relevanz für die Weiterentwicklung von Theorien haben kann.
Unter humanbiologischen, geschichtlichen und soziokulturellen Aspekten wird eine umfangreiche Sammlung von Röntgen- und Patientenbildern des Annastifts Hannover (ehemals ”Krüppelheim“) aus der Zeit von Oktober 1908 bis September 1942 analysiert. Einige der häufigsten Erkrankungen dieser Sammlung (Hüftluxation, Infektionskrankheiten, Rachitis und Skoliose) werden beschrieben, ausgewertet und im Kontext der Epoche diskutiert. Dabei wird folgender Arbeitshypothese nachgegangen: Wenn das frühe 20. Jahrhundert als entscheidende Phase des Übergangs von einer hohen zu einer niedrigen Mortalität gilt, so müsste sich das auch in der Sammlung des Annastifts nachweisen lassen. Auch wäre zu erwarten, dass in der frühen Phase ein hoher Morbiditäsindex, welcher über die Anzahl von Harris-Linien ermittelt werden kann, festgestellt werden müsste. Patientenbilder (Fotografien) Von 6519 Patientenbildern konnten 6047 mit einer Diagnose erfasst werden. Für den Zeitraum Oktober 1908 bis 1.Oktober 1934 sind dies 3275 und für den Zeitraum 2. Oktober 1934 bis 1. September 1942 sind es 2772 Diagnosen. Die genannten Zeitrüume unterscheiden sich deutlich hinsichtlich der Häufigkeit der einzelnen Krankheitsbilder. Besonders auffällig: • Die Zahl fotografierter Patienten mit Infektionserkrankungen (u. a. Osteomyelitis und Tuberkulose) reduzierte sich im Untersuchungszeitraum. Maßgeblichen Einfluss hatten dafür vorteilhaftere Lebensbedingungen. Die therapeutischen Möglichkeiten waren zu dieser Zeit noch vergleichsweise gering. • Es wird eine Vervielfachung der Diagnosen Skoliose und Rundrücken in der Zeit des Nationalsozialismus’ beobachtet. Dass dies einen Anstieg der Pathologien widerspiegelt, ist unwahrscheinlich, eher zeigt es das besondere Augenmerk, welches im Nationalsozialismus der ”Haltung“ entgegengebracht wurde. Röntgenbilder Die 1894 Röntgenbilder stammen von 1063 Patienten, die zwischen dem 21. 07. 1909 und dem 18. 08. 1925 geröntgt wurden. Das Durchschnittsalter der Patienten lag bei zehn Jahren. In der Sammlung der Röntgenbilder gab es folgende Auffälligkeiten: • Der Anteil von Hüftluxationen lag bei über 21%. Dieser hohe Wert ist als Resultat einer fehlenden Frühdiagnose zu werten, so dass aufwendige orthopädische Behandlungen notwendig wurden. Mit Dr. Peter Bade stand dem Annastift ein anerkannter Spezialist auf dem Gebiet der Behandlung von Hüftluxationen vor, so dass das Annastift für diese Erkrankung als Schwerpunktklinik zu betrachten ist. • Bei dem Stressmarker ”Harris-Linien“ (in der Literatur auch meist als Wachstumsstillstandslinien“ bezeichnet) zeigt sich ein Paradoxon: Entgegen der Erwartung im Untersuchungszeitraum, aufgrund der zahlreichen und schweren Infektionserkrankungen und Hungersnöte, ein gehäuftes Auftreten der Harris-Linien als unspezifisches Zeichen von Stress vorzufinden, zeigten sich diese nur bei 15% der Patienten. Sie signalisieren mit der insgesamt geringen Anzahl einen vermeintlich niedrigen Morbiditäts-Index (= 0,32), welcher gemäß Literatur [z. B. Blanco et al. (1974); Nowak & Piontek (2002)] auf günstige Lebensbedingungen schließen ließe. Das Phänomen der Harris-Linien ist hier so zu erklären, dass allein eine Veränderung der Ernährungsbedingungen eine Ausbildung von Harris-Linien hervorrufen kann. In diesem Fall wird eine schlechte Grundsituation abgelöst durch eine optimale Versorgung im Annastift. Die Bezeichnung ”Wachstumsstillstandslinien“ ist für diese Serie somit wahrscheinlich unzutreffend, ”Wachstumslinie“, als Ausdruck für einen Wachstumsschub, würde das Phänomen besser erklären. Der Begriff ”Gesundheitsveränderungslinie“, sei es Ernährungs- oder Krankheitsbedingt, trüge dem Umstand Rechnung, dass eine einmalige Krankheit oder einmalige Hungerperiode bei einer allgemein guten Lebenssituation genauso eine Linie erzeugt, wie eine Periode des Wohlbefindens bei einer allgemein schlechten Lebenssituation. Im Ganzen zeigt diese Sammlung deutliche Indizien für nahezu katastrophale Lebensumstände im frühen 20. Jahrhundert: Infektions- und Mangelerkrankungen sind weit verbreitet. Es ist aber auch zu konstatieren, dass sich diese Bedingungen mit der Zeit besserten, was zu einer Reduzierung der Mortalität geführt haben dürfte.
Elektronische Gesundheitsnetzwerke entwickeln sich zunehmend zu einer wichtigen Sparte im Bereich der Gesundheitsinformation. Mittlerweile stehen zahlreiche Online-Foren und -Expertenräte für den Austausch von Patienten untereinander oder zur Ratsuche in Gesundheitsfragen zur Verfügung. Besonders chronisch kranken Patienten kann so der Kontakt zur Außenwelt erleichtert und einer psychosozialen und medizinischen Unterversorgung entgegen gewirkt werden. Während es unstrittig ist, dass virtuelle Foren und Expertenräte bedeutende Chancen eröffnen, gibt es bisher kaum wissenschaftlich begleitete Projekte, die die Qualität und Effizienz der verfügbaren Dienste evaluieren. In der vorliegenden Arbeit wird der Nutzen elektronischer Gesundheitsnetzwerke am Beispiel des Online- Expertenrats muko.info analysiert. Das Modellprojekt wurde 2003 in Kooperation zwischen der Johann- Wolfgang- Goethe- Universität Frankfurt und dem Mukoviszidose e.V. zum Schwerpunktthema „Mukoviszidose“ initiiert. Hierbei wird die Hypothese geprüft, dass professionelle Beratungsangebote im Internet geeignet sind, einen relevanten Beitrag in dem vielschichtigen Versorgungskonzept chronisch kranker Patienten mit Mukoviszidose zu leisten. Im Rahmen einer 4- jährigen Projektphase wurden insgesamt 1.035 Kontaktaufnahmen mit 2.045 gestellten Fragen registriert. Davon verteilten sich 1.922 der Fragen auf das Patientenforum, während 123 Fragen aus dem Fachforum stammten. Die Fragen wurden unter Berücksichtigung quantitativer, qualitativer sowie emotionaler und psychosozialer Parameter untersucht. Als quantitative Parameter fanden in unserer Analyse die Gesamtzahlen der Kontakte und Fragestellungen, der Ratsuchenden und Ratgeber sowie eine Auswahl von 15 thematischen Kategorien Berücksichtigung. Ebenso ging die Unterscheidung zwischen Fragestellern und Patienten sowie die jeweilige Geschlechter- und Altersverteilung, aber auch die Berufsparten und Fachrichtungen sowohl der berufsbedingten Fragesteller als auch der Experten mit ein. Hinsichtlich der qualitativen Parameter wurden die Gründe der Ratsuchenden für ihre Teilnahme am jeweiligen Forum, die professionellen Rahmenbedingungen des Projekts und die Patientenzufriedenheit in die Auswertung miteinbezogen. Hierfür war ebenfalls die Betrachtung sowohl der inhaltlichen und haftungsrechtlichen Richtlinien als auch der organisatorischen, ethischen und prozeduralen Prinzipien erforderlich. Ferner fand eine Analyse der verbalisierten Emotionen in den Fragetexten statt. Es wurde eine Einteilung in 10 Emotionen gewählt und diese quantitativ der Anzahl der rein sachlich formulierten Antworten gegenübergestellt. Die daraus gewonnenen Ergebnisse wurden in Korrelation mit speziellen Rubriken, Altersklassen und Personengruppen gesetzt. Die Ergebnisse unserer Analyse belegen eine ausgeglichene Frequentierung des Expertenrats während der Projektzeit, wobei sich ein deutlicher Überhang weiblicher Fragesteller in beiden Foren zeigte. Die Gründe für die Teilnahme der Patienten beruhten in beiden Foren primär auf dem Wunsch nach Beantwortung fachlichmedizinischer Fragen, relevant häufig auch in den Bemühungen um eine Zweitmeinung. Qualitativ herrschte im Expertenrat eine grundsätzlich freundliche und spannungsarme Atmosphäre, welche von dem professionellen Verhalten der Experten sowohl in fachlicher als auch in psychosozialer Hinsicht gestützt wurde. Der sensible und ermutigende Umgang mit den Patienten sowie die meist zeitnahe, ausführliche und fundierte Bearbeitung der Anliegen wurde von den Fragestellern hoch geschätzt und wiederholt positiv bewertet. Im Zusammenhang der emotionalen und psychosozialen Situation der Betroffenen spiegelten sich im Patientenforum die enormen Belastungen und der starke emotionale Druck der Menschen im Umgang mit der chronischen Erkrankung in einer Vielzahl der Fragen wider. Demgegenüber wies sich das Fachforum durch fachlich- distanzierte, meist sachlich formulierte Anliegen aus. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Qualität der Antworten und die Patientenzufriedenheit wesentlich davon abhängen, ob es dem Experten gelingt, sich von der rein fachlichen Problematik zu lösen und seinen Blick für die emotionalen Bedürfnisse der Patienten zu öffnen. Ein respektvoller, ermutigender Umgang mit den Fragestellern sowie die Berücksichtigung ihrer emotionalen Bedürfnisse konnten neben der medizinisch- fundierten Beratung als wichtigste Aufgaben der Experten registriert werden. Finden diese Basisvariablen ihre Anwendung, hat ein professioneller Expertenrat im Internet nicht nur das Potential, einen ergänzenden Beitrag zum bestehenden Versorgungssystem für Patienten mit Mukoviszidose zu leisten. Vielmehr zeigte sich der Expertenrat vor dem Hintergrund der spezifischen Vorteile des Mediums Internet in einem geschützten, professionellen Rahmen als geeignetes Angebot für chronisch kranke Menschen, um diese zeitlich, geographisch, fachlich sowie emotional zu entlasten und zu stabilisieren. Die komplexen Anforderungen des Online- Expertenrats stellen die aktiven Mitglieder vor besondere Belastungen. Unsere Ergebnisse machen deutlich, dass neben medizinisch- fachlicher Expertise auch psychosoziale Kompetenz notwendig ist, welche ggfs. im Rahmen projektbegleitender Schulungen vermittelt und gepflegt werden sollte.
Der weltweiten Ausbreitung des humanen Immundefizienzvirus versucht man neben der Entwicklung eines präventiven HIV-Impfstoffes auch durch die Verbesserung der chemotherapeutischen Behandlung HIV-Infizierter entgegen zu wirken. Die hochwirksame antiretrovirale Kombinationsstherapie (HAART) hat neben der Anzahl der opportunistischen Infektionen und AIDS-bedingten Todesfälle auch die Viruslast in vielen HIV-Infizierten über einen langen Zeitraum unterhalb der Detektionsgrenze senken können. Es sind daher neben den klassischen Verlaufsmarkern wie der Viruslast und der Anzahl der CD4 T-Zellen neue Surrogatmarker zur Beurteilung der Effizienz der antiretroviralen Therapie notwendig. Der Einfluss der Viruslast auf den CD8 T-Zellaktivierungsstatus während der antiretroviralen Therapie zeigte sich durch den Vergleich von HAART-Respondern und den durch eine hohe Viruslast infolge eines Therapie-Versagens gekennzeichneten HAART-Non-Respondern. Die Beobachtung einer signifikant erhöhten Anzahl an basal, d.h. ohne vorangegangene in vitro Stimulation, aktivierten CD8 CD69 T-Zellen bei HAART-Non-Respondern (p = 0,0049) konnte die Rolle des T-Zell-Aktivierungsstatus als Marker der verbleibenden Viruslast unter HAART nachweisen. Um das Potential der von CD8 T-Zellen sezernierten HIVsupprimierenden ß-Chemokinen und IL-16 als HAART-begleitende Surrogatmarker zu untersuchen, wurde die Expression von MIP-1a, MIP-1ß und RANTES sowie des Lymphokins IL-16 im Serum und im Zellkulturüberstand aktivierter CD8 T-Zellen untersucht. Für HAART-Non-Responder konnte im Zellkulturüberstand von in vitro stimulierten CD8 TZellen eine signifikante Erhöhung der IL-16-Expression (p = 0,0077) und eine erhöhte Expression von MIP-1a im Vergleich zu HAART-Respondern gezeigt werden. Darüber hinaus wurde eine signifikant erhöhte MIP-1ß-Serumkonzentration bei HAART-Non- Respondern (p = 0,0175) nachgewiesen, die mit einer erhöhten Anzahl aktivierter CD8 CD69 T-Zellen assoziiert war. Im Rahmen dieser Untersuchungen konnte somit gezeigt werden, dass neben MIP-1a, vor allem das ß-Chemokin MIP-1ß und das Lymphokin IL-16 vielversprechende Surrogatmarker zur Beurteilung der Effizienz der antiretroviralen Therapie darstellen, die als sensitive therapiebegleitende Marker die rechtzeitige therapeutische Intervention vor einem signifikanten Anstieg der Viruslast ermöglichen könnten. Da trotz der intensiven Entwicklung und Verbesserung antiretroviral wirkender Therapeutika die vollständige Elimination des HI-Virus bislang nicht möglich ist, wurde in den vergangenen Jahren konzentriert an der Entwicklung neuer Impfstoffstrategien gearbeitet. Eine durch einen Impfstoff induzierte protektive Immunantwort gegen HIV sollte vor allem gegen Strukturproteine, sowie gegen die regulatorischen Proteine Tat und Rev gerichtet sein. Mit einem MLV-abgeleiteten Transfervektor für die SHIV-Gene tat, rev und env wurde in dieser Arbeit das immunogene Potential zur Induktion einer humoralen und zellulären Immunantwort im Rhesusaffen-Tiermodell untersucht. Durch die Etablierung einer stabilen Verpackungszellinie für den Transfervektor pMgDenv/tat/rev/Dlngfr konnte der effiziente Gentransfer in CD4 T-Zellen mittels [MLV(SHIV)]-Pseudotypvektoren gezeigt werden. Durch Optimierung der Transduktionsbedingungen konnte ein Transduktionstiter von 1-2 x 107 i.E./ml in primäre Rhesus-Lymphozyten erreicht werden. Um das immunogene Potential dieser HIV-Antigen-exprimierenden Zellen in vivo zu untersuchen, wurden in einer Immunisierungsstudie 0,7 - 3,4 x 107 Transfergen-positive PBMC in 3 aufeinander folgenden Transplantationen in einen Rhesusaffen reinfundiert. Die transplantierten Zellen waren nach der 3. Applikation bis zu 7 Tage nach Transplantation in vivo mittels PCR detektierbar. Eine HIV-gp120-spezifische Antikörperantwort konnte fünf Wochen nach der ersten bzw. zwei Wochen nach der letzten Immunisierung nachgewiesen werden. In einem ELIspot-Assay konnte erfolgreich die Induktion einer HIV-1-Env- und Rev-spezifischen CTL-Antwort in den nach 7,5 bzw. 10 Wochen nach der letzten Immunisierung entnommenen PBMCs nachgewiesen werden. Interessanterweise zeigten Sequenzanalysen, dass die induzierte CTL-Aktivität gegen die für einen effizienten Schutz bedeutenden Determinanten des HIV-1- Hüllproteins, gegen die variable Domäne des gp120 als auch gegen die CD4- Bindungsregion gerichtet war. In dieser Immunisierungsstudie war es somit erstmals möglich, durch die Transplantation autologer HIV-Antigen-exprimierender CD4 T-Zellen eine spezifische humorale wie auch zelluläre Immunantwort in vivo zu induzieren.
Die LC/MS/MS Methoden zur Quantifizierung des selektiven COX-2-Hemmers Celecoxib und des selektiven COX-1-Hemmers SC-560 wurden auf einem Sciex API 3000 Tandem Massenspektrometer mit einer TurboIon Spray Quelle entwickelt und validiert. Für Celecoxib wurden zwei Assays mit internem Standard für die Quantifizierung aus Plasmaproben und ein Assay ohne internen Standard für die Quantifizierung aus Microdialysaten entwickelt. Die Plasmaproben wurden mittels Festphasenextraktion über C18 Material extrahiert. Für die Methode CLX-1 wurde über eine RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Methanol/Wasser/NH4OH 20% 80:20:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 10-1000 ng/ml für Humanplasma und 10-500 ng/ml für Rattenplasma validiert. Für die Methode CLX-2 wurde die Chromatographie mit einer RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 85:15:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml für Humanplasma validiert. Für die Methode CLX-Microdialysate wurde die Elution über eine RP-C18 Säule (70 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 65:25:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min durchgeführt. Das Assay wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml validiert. Die Analytik von SC-560 mittels LC/MS/MS wurde für den Nachweis in Microdialysaten entwickelt. Die Microdialysate wurden mit dem Äquivalenten Volumen Acetonitril verdünnt, um den Analyten vollständig in Lösung bringen zu können. Eine RP-C18 Säule (60 x 1 mm) wurde verwendet und die chromatographische Trennung mit einem Gradientenprogramm durchgeführt. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,5-20 ng/ml für Microdialysate validiert. Die Assays wurden für pharmakologische Untersuchungen zur Wirkung und zum molekularen Wirkmechanismus von selektiven Cyclooxygenasehemmern eingesetzt. Die Rolle der Cyclooxygenase-Isoformen bei der nozizeptiven Transmission im Rückenmark wurde in der ersten Studie untersucht. SC-560 reduzierte das Schmerzverhalten der Tiere und hemmte die spinale Prostaglandinproduktion. Celecoxib hatte auf die Effekte keinen Einfluss. Die Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass die Wirksamkeit von Celecoxib bei Trauma-bedingten Akutschmerzen der Wirksamkeit unselektiv wirkender NSAIDs unterlegen ist. In der zweiten Studie wurden Die Effekte hoher Dosen von Celecoxib untersucht. In Tierversuchen mit Zymosan-induzierten Entzündungen der Hinterpfoten konnte Celecoxib bei 50 mg/kg das Ödem in der Hinterpfote reduzieren, aber nicht bei Dosierungen größer gleich 100 mg/kg. In Zellkultur konnte an Mesangiumzellen der Ratte gezeigt werden, dass eine Dosis von 50 µM Celecoxib den Transskriptionsfaktor NF-_B aktiveren kann. In einer dritten Studie wurde der Einfluss COX-abhängiger und -unabhängiger Mechanismen auf die antiproliferative Wirkung von Celecoxib untersucht. SC-560 und Celecoxib verursachten einen Zellzyklus-Block. Celecoxib beeinflusste die Expression Zellzyklus-regulierender. Celecoxib induzierte Apoptose unabhängig vom COX-2 Status der Zellen. In vivo wurde das Wachstum von COX-2 defizienten Tumoren durch Celecoxib und SC-560 reduziert. Die in vitro und in vivo Daten deuten auf COX-2 unabhängige Mechanismen der antiproliferativen Wirkung von Celecoxib hin.
Analytik von Kontaminationen auf Siliciumoberflächen : Möglichkeiten und Grenzen des VPD-Verfahrens
(2004)
In der Halbleiterindustrie führen in der Massenproduktion von Mikroelektronik-Bauelementen bereits geringfügige Mengen an metallischen Verunreinigungen zu einer erheblichen Verminderung der Ausbeuten und setzen die Zuverlässigkeit der Bauelemente drastisch herab. Deshalb müssen nicht nur die als Ausgangsmaterial verwendeten Siliciumscheiben bezüglich des Kontaminationsgrades durch Fremdatome höchsten Ansprüchen genügen, sondern auch die einzelnen Fertigungsschritte für die Produktion von elektronischen Bauelementen. Für die Detektion der Oberflächenverunreinigungen kommt in der Halbleiterindustrie die Totalreflexions-Röntgenfluoreszenz-Spektrometrie (TXRF) mit einer Empfindlichkeit von 1010 Atomen/cm2 zum Einsatz. Mittlerweile liegen die Anforderungen deutlich unterhalb dieser Nachweisgrenze. Durch Anwendung des Aufkonzentrierungsverfahrens VPD (Vapour-Phase-Decomposition) in Kombination mit etablierten Analysemethoden wie TXRF oder GF-AAS (Graphitrohr-Atom- Absorptions-Spektrometrie) können die in der Halbleiterindustrie notwendigen Nachweisgrenzen zur Detektion der Metalloberflächenbelegungen erreicht werden. VPD ist ein Verfahren, das thermische, chemische oder native Oxide auf Siliciumscheiben durch HFDampf ätzt. Metallische Verunreinigungen, die sich auf oder in der Oxidschicht befinden, können anschließend durch Abscannen der hydrophoben Oberfläche mit einem Tropfen eingesammelt werden. Zwei wichtige Begriffe, die unmittelbar im Zusammenhang mit dem VPD-Verfahren stehen, sind die Einsammelrate (Collecting Efficiency CE) und die Wiederfindungsrate (Recovery Rate RR) des Analyten. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Bestimmung der beiden Größen am Beispiel des Mangans und des Eisens. Dabei spielt die Frage nach der Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit der verwendeten Analysemethode eine wichtige Rolle. Inwiefern beeinträchtigt das Silicium, das aus der SiO2-Schicht in Lösung geht und nach einem Trocknungsprozess im Rückstand verbleibt, die mittels TXRF erhaltenen Wiederfindungsraten des Analyten. Da die Antworten auf diese Fragen nur in Verbindung mit anderen Analyseverfahren gefunden werden konnten, kamen neben TXRF, GF-AAS und Photometrie auch radiochemische Methoden zum Einsatz. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst das Adsorptionsverhalten des Mangans auf der Silicium (100)-Oberfläche in verdünnter ammoniakalischer Wasserstoffperoxid- Lösung (SC1) untersucht. Zwischen der Mangan-Konzentration in der SC1-Lösung und der Oberflächenbelegung auf den Siliciumscheiben besteht ein deutlicher Zusammenhang. Mit zunehmender Konzentration in der Lösung steigen die mit TXRF ermittelten Oberflächenbelegungen an. Eine Sättigung der Manganbelegung war im untersuchten Konzentrationsbereich nicht nachweisbar. XPS-Spektren zufolge handelt es sich bei der adsorbierten Mn-Spezies um Mn(III)- und/oder Mn(IV)-Oxide. Winkelabhängige TXRF-Untersuchungen dokumentieren die Filmeigenschaften der Mn- Kontaminationen der aus SC1-Lösungen präparierten Siliciumscheiben. Erst ab hohen Mangankonzentrationen von 15 ppmw im SC1-Bad sinkt der Filmanteil der Adsorption auf 42 %. Auch die aus wässrigen sauren Mn-Lösungen kontaminierten Proben zeigen überwiegend einen filmartigen Charakter der Metalladsorption. VPD-TXRF Analysen wurden zunächst mit SC1 behandelten Siliciumscheiben durchgeführt, deren Mn-Oberflächenbelegungen im Bereich von 1 10 x 1012 Atomen/cm2 lagen. Die ermittelten Mn-TRR-Werte (TRR (totale Wiederfindungsrate) = CE X RR) zeigten deutliche Differenzen zum Maximalwert von 1 und dehnten sich über einen Bereich von 0,55 0,68 aus. Durch den Vergleich mit AAS und TXRF (Gerät EXTRA IIA) konnten die Ursachen für die Minderbefunde der TRR-Werte u.a. auf die direkten TXRF-Messungen (Gerät 8010) zurückgeführt werden, welche die Mn-Ausgangsbelegungen um etwa 20 % überbewerten. Wie sich herausstellte, führt die Quantifizierung von filmartigen Oberflächenbelegungen mit Hilfe eines externen Partikelstandards zu einer Überbewertung der Kontamination. Diese Feststellung wird durch den Vergleich zwischen TXRF 8010 und radiochemischen Messmethoden untermauert. Generell kann es bei der Quantifizierung der Oberflächenbelegungen mittels TXRF 8010 zu Fehlinterpretationen kommen, wenn der Analyt und der Standard ein unterschiedliches Fluoreszenzverhalten in Abhängigkeit des Einfallswinkels aufweisen. Es kommt dadurch zu einer Unterbewertung von partikelartigen Mangan- und Eisenkontaminationen, die nach eigenen Einschätzungen 10 % betragen kann. Weiterhin dokumentieren die Mn-TRR-Werte deutlich die Unterschiede zwischen externer und interner TXRF-8010 Kalibrierung. Die Differenzen der TRR-Werte von durchschnittlich 0,35 ergeben sich aus der verminderten Fluoreszenzstrahlung des internen Standards Rubidium. Die aus den TXRF-Spektren entnommenen Netto-counts des Rubidiums liegen deutlich unterhalb des Erwartungswertes der 1 ng entsprechenden Menge. Die TRR-Werte des Mangans von TXRF (Gerät EXTRA IIA) und AAS liefern vergleichbare und vor allem reproduzierbare Ergebnisse. Die Übereinstimmung der Ergebnisse zeigt deutlich, dass die beiden Analysemethoden als Vergleichsmethoden zu TXRF 8010 geeignet sind. Die Zuverlässigkeit der beiden Methoden dokumentiert sich auch in den übereinstimmenden Ergebnissen der Mn- und Fe-Wiederfindungsraten. Für diesen Vergleich wurden unterschiedlich konzentrierte Mn- und Fe-Lösungen in verschiedenen Matrices angesetzt. Die im Vergleich zu AAS und TXRF EXTRA IIA niedrigeren Wiederfindungsraten von TXRF 8010 sind u.a. auf die Kalibrierung mit dem 1 ng Ni-Standard zurückzuführen. Weiterhin konnte festgestellt werden, dass die TXRF-Messungen der in Siliciummatrix vorliegenden Mn- und Eisenproben noch deutlichere Minderbefunde aufweisen. Die Ursachen dafür sind Streueffekte, die durch die Siliciummatrix im Rückstand hervorgerufen werden (s.u.). Wie aus den radioaktiven Tracer-Experimenten hervorgeht, kann der überwiegende Teil der Gesamtkontamination des Mangans und des Eisens auf der Siliciumscheibe durch den ersten Abrollvorgang eingesammelt werden. Anhand der Mangan- und Eisenmengen, die im ersten DSE-Tropfen mittels ³-Messung detektiert werden, errechnen sich die durchschnittlichen Collecting Efficiencies von Mangan und Eisen zu 96,5 bzw. 98,5 %. Die Einsammelraten sind in dem untersuchten Konzentrationsbereich unabhängig von der Ausgangsbelegung. Collecting Efficiencies können auch ohne Kenntnis der Ausgangsbelegung bestimmt werden, wenn die Gesamtmenge der Kontamination durch die Analyse der VPD-Rückstände und der Restbelegung auf der Siliciumscheibe ermittelt wird. Die Bestimmung der Collecting Efficiency nach dieser Methode ist sinnvoll, da eine fehlerhafte Analyse der Ausgangsbelegung - wie am Beispiel der direkten TXRF-Messung gezeigt - zu verfälschten Resultaten führt. Die Anwendbarkeit beschränkt sich jedoch nur auf nichtflüchtige Analyten. Im Vergleich zur ³-Analyse zeigen die Mn-Wiederfindungsraten von TXRF 8010 deutliche Minderbefunde. Auch in diesem Beispiel liegen die Ursachen für die Unstimmigkeiten u.a. in der Kalibrierung durch den 1 ng Ni-Standard begründet. Beim Eisen deutet sich ein konzentrationsabhängiger Trend an. Die höchsten Fe-Wiederfindungsraten erhält man von den Proben mit den niedrigsten Ausgangsbelegungen. Ein Erklärungsansatz beruht auf der Annahme, dass hohe Konzentrationen an Kationen (>1015 Fe-Atome pro Siliciumscheibe) die Verflüchtigung des Siliciums als SiF4 verstärkt unterbinden und somit zu einer massiven Siliciummatrix im VPD-Rückstand führen. Daraus resultieren Streueffekte durch die Matrix, die ein vermindertes Fluoreszenzsignal des Analyten zur Folge haben. VPD-Experimente an SC1-gereinigten Siliciumscheiben belegen, dass der eingetrocknete Rückstand im Wesentlichen aus Silicium besteht. Die Summe der Metallverunreinigungen der SC1- gereinigten Proben liegt deutlich unterhalb 1015 Atomen pro Siliciumscheibe. Wie am Beispiel des Mangans und des Eisens gezeigt werden konnte, liegt die Zuverlässigkeit des VPD-Verfahrens in den hohen und vor allem reproduzierbaren Einsammelraten. Die festgestellten Differenzen der TRR-Ergebnisse sind ausschließlich auf die unterschiedlichen Wiederfindungsraten der eingesetzten Analysemethoden zurückzuführen. Radiochemische Messmethoden wurden bis auf wenige Ausnahmen für derartige Untersuchungen noch nicht angewendet. Die übereinstimmenden Ergebnisse mit den etablierten Analysemethoden und die hohe Empfindlichkeit der ²- und ³-Analyse zeigen ihr Potenzial als Ergänzungsmethode auf diesem Anwendungsgebiet. Die chemischen Wechselwirkungen zwischen Flusssäure und der SiO2-Schicht während des Ätzprozesses im VPD-Reaktor sind abhängig von der relativen Luftfeuchtigkeit. Anhand der Siliciummengen, die nach dem Ätzprozess mit Hilfe unterschiedlicher DSE-Lösungen eingesammelt wurden, konnten viele neue Informationen erarbeitet werden. Das entwickelte qualitative Modell beschreibt in Abhängigkeit von der relativen Luftfeuchtigkeit, in welcher Phase (fest/flüssig/gasförmig) das aus der SiO2-Schicht geätzte Silicium vorliegt.
Mit einer immer weiter steigenden Lebenserwartung, steigt auch die Anzahl der an Alzheimer erkrankten Patienten stetig an. Die Kosten für die Versorgung dieser Patienten sind für das Gesundheitssystem weltweit immens.
Bislang führten alle Therapiebemühungen zu mangelhaften Erfolgen. Ein medikamentöses Eingreifen in den Krankheitsverlauf und die Beeinflussung der auslösenden Faktoren konnte, trotz eines hohen Forschungsaufwandes bislang nicht realisiert werden.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der quantitativen analytischen Charakterisierung zweier Substanzen, die sich auf drei relevante Bereiche auswirken, die für die Entwicklung und das Fortschreiten der Alzheimer Krankheit verantwortlich gemacht werden. Die γ-Sekretase, die an der Entstehung der toxischen Aβ-Peptide beteiligt ist, die dann durch Agglomerisierung zu den charakteristischen pathologischen Aβ-Plaques führen. Der nukleäre Rezeptor PPARγ, welcher an der Genexpression vor allem inflammatorischer Faktoren im Gehirn beteiligt ist und weitere AD relevante Vorgänge wie den Abbau der Aβ-Peptide beeinflusst. Und schließlich die mitochondriale Dysfunktion, die zur verringerten Energieversorgung und schließlich zum Untergang von Synapsen und ganzer Neuronen führen kann. Diese drei Bereiche konnten in vitro durch die zwei untersuchten Substanzen MH84, einem Pirinixinsäurederivat und MH163, einem Zimstsäurederivat, positiv beeinflusst werden.
Aus diesem Grund wurden in vivo Studien zu beiden Verbindungen an Mäusen geplant, die die pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften der Substanzen untersuchen sollten.
Im Vorfeld dieser Studien wurden analytische Methoden entwickelt um die Substanzen aus den biologischen Proben bestimmen zu können. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf einer besonders hohen Empfindlichkeit um auch sehr kleine Konzentrationen, die sich bei den Studien im Hirngewebe der Tiere ergeben können, bestimmen zu können.
Die Validierung der Methoden sollte nach Guideline der FDA (Food and Drug Administration) für bioanalytische Methodenentwicklung erfolgen.
Die Validierung stellt die Grundlage dar, um die Gehalte der Verbindungen aus biologischen Matrices wie Plasma und Hirn einwandfrei quantifizieren zu können und somit auch die Bioverfügbarkeit im ZNS nachzuweisen.
Für MH84 konnte eine empfindliche LC/MS-Methode entwickelt und validiert werden. Dabei wurde eine MultoHigh 100 RP 18-5µ, 125 x 4 mm HPLC Säule und ein MicrOTOF-QII Massenspektrometer der Firma Bruker® mit einer APCI-Quelle für die Ionsierung verwendet.
Es konnten alle Forderungen der FDA Guideline zur analytischen Methode erfüllt werden und die Stabilität der Substanz zweifelsfrei bewiesen werden.
Die validierte Methode wurde anschließend für die Auswertung einer Pharmakokinetik-Studie an gesunden Mäusen verwendet. Der zeitliche Konzentrationsverlauf von MH84 im Plasma und Hirngewebe, sowie die ZNS-Bioverfügbarkeit der Substanz, konnten mit Hilfe der analytischen Methode bestimmt werden.
Zusätzlich wurden eine Akkumulationsstudie und zwei pharmakodynamische Studien durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass sich MH84 nach 21-tägiger, oraler Gabe von 12_mg/Kg nicht im Gehirn gesunder Mäuse anreichert.
Die Wirkung von MH84 auf transgene Tiere, die das Krankheitsmodell beschreiben, wurde ebenfalls nach 21 Tagen oraler Gabe untersucht. Die Tiere waren deutlich vitaler im Vergleich zu den transgenen Kontrolltieren.
Es konnten vor allem Verbesserungen der mitochondrialen Dysfunktion festgestellt werden, die zu einer vollständigen Wiederherstellung der Parameter im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrolltieren führten. Die Aβ-Spiegel konnten vermutlich aufgrund der kurzen Behandlungsdauer nur leicht gesenkt werden.
Für MH163 wurde ebenfalls eine empfindliche Analysenmethode entwickelt. Dabei konnte die gleiche HPLC-Säule wie bei MH84 verwendet werden. Die chromatographischen Bedingungen und die APCI-Parameter wurden für diese Verbindung neu optimiert.
Im Verlauf der Methodenentwicklung wurden jedoch verschiedene Instabilitäten der Substanz sichtbar. Dabei handelte es sich licht- und zeitabhängige Vorgänge.
Es kam infolge einer E/Z-Isomerisierung an der Doppelbindung der Zimtsäuregruppe zu einem zweiten analytischen Signal, welches bei der Anwendung der entwickelten LC/MS- Methode sichtbar wurde. Die Gesamtfläche beider Signale von MH163 zeigte zusätzlich eine ebenfalls zeitabhängige Abnahme. Durch eine Strukturaufklärung konnte ein Coumarin-Derivat als mögliches Umlagerungsprodukt identifiziert werden.
Da durch die Umlagerungsprozesse nicht sichergestellt ist, welche Verbindung die Aktivität in den in vitro Testsystemen ausgelöst hat und eine einwandfreie quantitative Bestimmung von MH163 in einem für die Analytik aus den Matrices benötigten Zeitraum nicht möglich ist, wurden die Tierstudien zu MH163 abgesagt.
Es konnte mit der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass die 2- dimensionale Fusion von kompletten EBT- und PET- Bilddatensätzen möglich ist. Die Bildüberlagerung kann wichtige Hinweise zur Lage und zum Ausmaß des veränderten kardialen Glukosestoffwechsels liefern. Es konnten direkte Lage-beziehungen des Metabolismus zu morphologischen Strukturen wie den Papillar-muskeln, den Insertionen sowie zu den den Insertionen anliegenden Segmenten und dem annulären Myokard aufgezeigt werden, die in der Entstehung der postischämischen Mitralinsuffizienz von entscheidender Bedeutung sind. Die bisherig eingesetzten diagnostischen Methoden analysieren überwiegend einzelne Komponenten der ablaufenden pathogenetischen Mechanismen der postischämischen Mitralinsuffizienz, wobei die Komplexität pathologischer Veränderungen noch nicht komplett bildlich erfasst werden kann. Mit der Bildüberlagerung können entscheidende Zusatzinformationen im Vergleich zu den Aussagen der einzelnen Modalitäten gewonnen werden, wie dies in der vorliegenden Untersuchung bei 12 von 25 Patienten nachweisbar war. Dies gilt nicht nur für die Bildfusion, sondern auch für die Datenfusion mit Einbringen semiquantitativer und quantitativer Daten in ein einheitlich klassifiziertes System wie die Polar maps. Hier ist mittels Datenfusion die exakte segmentbezogene Zuordnung verschiedenster Parameter von Echokardiographie, EBT und PET möglich. Die Kombination morphologischer und funktioneller Daten erlaubt die kongruente Erfassung pathologischer Veränderungen der heute in der präoperativen Diagnostik überwiegend eingesetzten Echokardiographie und der Vitalitätsdiagnostik mittels FDG- PET, wodurch die Ausdehnung narbiger Veränderungen oder hibernierenden Myokards bei sonographischen Wandbewegungsstörungen bzw. Akinesien und der Nachweis revaskularisationswürdigen Myokards verbessert werden kann. Der endgültige Stellenwert der semiquantitativen EBT-Diagnostik bleibt anhand der erhobenen Daten noch offen. Abzuwarten ist, ob neue technologische Konzepte wie z.B. die Multidetektor- CT- Generation durch die Kombination von morphologischen und funktionellen Daten, möglich durch retrospektive EKG-Triggerung, weitere diagnostische Verbesserungen ermöglichen. Für den Routineeinsatz von Datenfusionsmodellen ist eine softwaregestützte automatische Kodierung semiquantitativer und quantitativer Daten erforderlich (z.B. als Farbkodierung in polar maps für die im Echo bzw. EBT erfassten Daten). Weitere Analysen zu uni- bzw. multifaktoriellen Zusammenhängen der Genese der postischämischen Mitralinsuffizienz sind erforderlich, um die auslösenden Determinanten in der Entstehung der Regurgitation exakt definieren zu können, was wiederum die Grundlage für neue Therapiekonzepte darstellt. Eine weitere interessante Anwendungsmöglichkeit ergibt sich, in dem aus Datensätzen in jeweils unterschiedlichen Ebenen eine 3D-Präsentation erzeugt wird, auf der es in Zukunft möglich sein wird, additive und komplementäre Informationen räumlich abzubilden. Bereits heute ist die 3-dimensionale Darstellung, sei es z.B. als Oberflächendarstellung (SSD- shaded surface display) oder Volumen- Rendering- Methode (VRT) bei tomographischen Modalitäten technisch realisierbar (siehe die folgende SSD-Rekonstruktion des kardialen Glukosemetabolismus anhand von FDG- PET- Daten). Diese 3D- Darstellungen sind derzeit noch Mittel zur Präsentation und dienen nur in wenigen Fällen der primären Befunderhebung und - erstellung. Mit zunehmender "Bildflut" in den Schnittbildverfahren wird eine Beurteilung der angefertigten Bilddatenvolumina in den kommenden Jahren nicht in der bisherigen Form effektiv durchführbar sein. 3-dimensionale Abbildungsverfahren einschliesslich der multimodalen Bildintegration werden mit hoher Wahrscheinlichkeit künftig ihren angemessenen Stellenwert finden.
Viele physiologische Prozesse, wie zum Beispiel der Schlaf-Wach-Rhythmus, die Nahrungsaufnahme, die Aktivität, sowie unbewusstes Verhalten unterliegen circadianen Rhythmen. Diese Rhythmen werden durch die circadiane Uhr erzeugt, deren Sitz der SCN im Hypothalamus ist. Der SCN übermittelt das circadiane Signal in viele verschiedene Gehirnregionen (Reuss 1996). Die circadianen Rhythmen werden einerseits durch Umweltreize, wie Licht oder Nahrungsverfügbarkeit, eingestellt. Diese externen Signale beeinflussen direkt den SCN oder andere hypothalamische Nuclei, wie den lateralen Hypothalamus oder den N. arcuatus. Andererseits werden die circadianen Rhythmen jedoch auch an die physiologischen Parameter des Individuums angepasst. Diese externen und internen Signale werden durch den Signalaustausch zwischen den hypothalamischen Nuclei integriert. Zur Untersuchung dieser gegenseitigen Verbindungen wurden immunzytochemische Studien an Gehirnschnitten von Maus und Ratte durchgeführt, um das Vorkommen verschiedener Neuropeptide in Zellkörpern und Fortsätzen der Neurone in den entsprechenden hypothalamischen Gebieten aufzuzeigen. Untersucht wurden Vasopressin und VIP, die im SCN selbst synthetisiert werden, sowie Orexin A und MCH, die in den Zielgebieten des SCN vorkommen. Die Verteilungen der Neuropeptide bei Ratten und Mäusen stimmten weitgehend überein. Lediglich die Vasopressin-Expression im SCN weist Abweichungen im Vergleich der beiden Spezies auf. Weiterhin gibt es unterschiedliche Verbindungen zwischen den hypothalamischen Kerngebieten: Im SCN der Ratte, jedoch nicht im SCN der Maus, innervieren Orexin A-enthaltende Fasern VIP-exprimierende Zellen, sowie MCH-positive Fortsätze Vasopressin-enthaltende Neurone. Demzufolge variiert die Signalübertragung im Hypothalamus der Maus und der Ratte. GABA und Glyzin sind wichtige hemmende Neurotransmitter im ZNS. Daher wurden die transgenen Mauslinien GAD67-GFP knock-in und GlyT2-EGFP als Marker für GAD67-positive beziehungsweise Glyzin-positive Zellen verwendet. Gehirnschnitte dieser Mauslinien wurden immunzytochemisch gegen die oben genannten Neuropeptide gefärbt, um die Neuronenpopulationen in den hypothalamischen Kerngebieten zusätzlich zu charakterisieren. Viele Vasopressin- oder VIP-exprimierende Zellen im SCN sind GAD67-positiv. Im lateralen Hypothalamus sind einige MCH-positive Zellen GAD67-positiv. Orexin A enthaltende Zellen sind nicht positiv für GAD67. Orexin A-positive und GAD67-positiv Zellen sind miteinander durch direkte Kontakte verbunden. Der hemmende Neurotransmitter Glyzin wird von wenigen Zellen im lateralen Hypothalamus gebildet. Glyzin ist dort weder mit Orexin A, MCH oder Vasopressin kolokalisiert. Der gesamte Hypothalamus ist von einem dichten Netz stark verzweigter, Glyzin-enthaltender Fasern überzogen, deren Ursprung im Rahmen dieser Arbeit nicht eindeutig geklärt werden konnte. Die glyzinergen Fasern innervieren im lateralen Hypothalamus Orexin A-, Vasopressin- und MCH-exprimierende Neurone. Glyzinerge Fasern projizieren im lateralen Hypothalamus auf VIP-positive Fortsätze und im SCN auf Vasopressinenthaltende Fortsätze. Der hemmende Neurotransmitter Glyzin spielt vermutlich eine bedeutende Rolle bei der Signalübertragung zwischen Hypothalamus und anderen Gehirnbereichen. Damit wirkt Glyzin vermutlich auf diverse physiologische Abläufe ein, die durch hypothalamische Kerngebiete gesteuert und reguliert werden. Neben der Untersuchung der hypothalamischen Nuclei in Gehirnschnitten wurden die Zellen dieser Kerngebiete in histiotypischen primären Zellkulturen charakterisiert. Die Neuropeptid-Expressionen sowie synaptische Verbindungen wurden an den kultivierten Zellen untersucht. Der Vergleich der Neuropeptid-Expression bei Gehirnschnitten und bei Zellkulturen bestätigte, dass histiotypische Zellkulturen ein geeignetes Modell für Studien von Einzelzell- und Netzwerkeigenschaften sind. Die Ausbildung von zahlreichen Synapsen innerhalb nur weniger Tage bestätigt, dass die Signalübertragung in den Zellkulturen wie vermutlich auch im Hypothalamus überwiegend synaptischer Natur ist.
as Locus coeruleus-noradrenerge System ist die primäre Quelle für zentrales corticales und subcorticales Noradrenalin. Die noradrenergen Projektionen des LC sind an der Modulation einer Vielzahl von funktionellen zentralen Abläufen beteiligt, u.a. an Aufmerksamkeitsprozessen, der Vermittlung von Stress und der Schlaf-Wach-Koordination, aber auch an der Koordination spezifischerer kognitiver Funktionen im Rahmen von Belohnungs-orientiertem Verhalten.
Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit im anatomisch-topographischen Teil durchgeführten Experimente belegen eine dichte noradrenerge Innervation des präfrontalen Cortex, des dorsalen und ventralen Hippocampus, und des Kleinhirns durch Neurone des Locus coeruleus. Innerhalb des LC sind die nach präfrontal und hippocampal projizierenden Neurone vorwiegend im dorsalen Anschnitt über die gesamte rostro-caudale Achse zu finden. Der Anteil ipsilateral gelabelter Zellen überwiegt deutlich. Coeruleocerebelläre Neurone sind innerhalb des LC sowohl in den dorsalen als auch ventralen Abschnitten, ebenfalls über die gesamte rostro-caudale Achse, zu finden. Der Anteil kontralateral gelabelter Zellen ist relativ höher als bei den anderen Projektionen.
Die im ersten elektrophysiologischen Teil der Arbeit durchgeführten Experimente belegen ein in den Grundeigenschaften ähnliches Feuerungsmuster selektiv identifizierter coeruleo-präfrontaler und coeruleo-hippocampaler Nervenzellen. Einzelne Aktionspotential-Parameter waren signifikant unterschiedlich, hinweisend auf unterschiedliche hyperpolarisierende Ströme in beiden Populationen. Eine Überprüfung des a2-Autorezeptor-Status im zweiten elektrophysiologischen Teil der Arbeit ergab ein fehlendes Ansprechen der coeruleo-präfrontalen Neurone auf a2-Blockade (im Gegensatz zu den coeruleo-hippocampalen Neuronen); dieser Befund ist vereinbar am ehesten mit fehlenden oder funktionell down-regulierten a2-Rezeptoren selektiv in nach präfrontal projizierenden Neuronen des Locus coeruleus. Hierbei handelt es sich um einen in der Literatur nicht vorbeschriebenen Befund.
Der A. carotis interna (ACI)-Bulbus ist eine Prädilektionsstelle für atherosklerotische Gefäßwandveränderungen. Allerdings erklären konventionelle vaskuläre Risikofaktoren nicht vollständig das Atherosklerosevorkommen im Bereich der Karotisbifurkation. Darüber hinaus ist bekannt, dass auch lokale anatomische und hämodynamische Faktoren die Initiierung des atherosklerotischen Prozesses beeinflussen können. In der vorliegenden Arbeit wurden die wechselseitigen Beziehungen zwischen vaskulären Risikofaktoren, atherosklerotischen Frühveränderungen und anatomischen Varianten des Karotissystems in einer bevölkerungsbasierten Studie untersucht. Die Studienpopulation bestand aus 1300 Personen im Alter zwischen 40 und 70 Jahren, die eine Subgruppe einer großen Querschnittstudie darstellten und frei von klinisch-relevanten Manifestationen einer fortgeschrittenen Atherosklerose waren. Die Prävalenz vaskulärer Risikofaktoren wurde mit einem standardisierten und computergestützten Interviewverfahren ermittelt. Hochauflösender Ultraschall wurde sowohl zur Visualisierung der Karotis-IMT an drei Arterienstellen (A. carotis communis, Karotisbifurkation, ACI-Bulbus) als auch zur Identifikation von atherosklerotischen Plaquebildungen innerhalb des ACI-Bulbus auf beiden Seiten eingesetzt. Die Karotis-IMT wurde quantifiziert, indem die mittlere Intima Media-Dicke der schallkopffernen Gefäßwand mit Hilfe eines digitalen Auswertprogramms gemessen wurde. Um die anatomische Variabilität der Karotisbifurkation zu bestimmen, wurde eine standardisierte transversale Insonation verwendet und der Winkel des ACI-Abgangs, der als Rotationswinkel in Relation zur A. carotis externa ausgedrückt wurde, gemessen. Nach Adjustierung für Alter und Geschlecht zeigten sich starke Beziehungen zwischen der Karotis-IMT und Risikofaktoren wie “Arterielle Hypertonie”, “Rauchen” und “Body Mass Index”, während die Korrelation mit dem “Gesamtcholesterin” schwach war. Die Karotis-IMT ist um so dicker, je stärker der einzelne Risikofaktor ausgeprägt ist. Keinerlei Beziehungen ergaben sich zwischen dem Risikofaktor “Diabetes mellitus” und der Karotis-IMT, was darauf zurückzuführen ist, dass die Prävalenz dieser Erkrankung in der untersuchten Population sehr niedrig war. Als positive Prädiktoren für ACI-Plaquebildungen erwiesen sich nach Alters- und Geschlechtsadjustierung der Bluthochdruck und der Nikotinkonsum. Der Winkel des ACI-Abgangs war positiv mit der IMT des ACI-Bulbus, jedoch nicht mit der IMT der anderen Arteriensegmente assoziiert. Nach Adjustierung für Alter, Geschlecht und vaskuläre Risikofaktoren erhöhte ein dorsal/dorsomedialer ACI-Abgang (Rotationswinkel ≥60°) das Risiko, eine Bulbus-IMT im höchsten Quartil aufzuweisen, um das dreifache (OR: 2.99; 95%-KI: 1.86-4.83; p<0.001) auf der linken und um das zweifache (OR: 2.01; 95%-KI: 1.31-3.09; p=0.001) auf der rechten Seite. Eine ähnliche Beziehung fand sich für Plaquebildungen, die “Odds Ratios” betrugen nach multivariater Analyse 3.67 (95%-KI: 1.49-9.03) auf der linken und 2.07 (95%-KI: 1.10-4.83) auf der rechten Seite (p=0.035 beidseits). Der ACI-Abgangswinkel hat somit auch einen unabhängigen, positiv-prädiktiven Wert zur Vorhersage von Plaquebildungen des ACI-Bulbus. Eine unabhängige Beziehung der konventionellen vaskulären Risikofaktoren mit dem ACI-Abgangswinkel lag dagegen nicht vor. Die Verwendung der standardmäßigen, schräg anterioren Einschallrichtung hatte keinen Einfluss auf die IMT-Messungen im ACI-Bulbus. Die vorliegenden Ergebnisse sind vereinbar mit vorherigen epidemiologischen Studien, die zeigen, dass die Frühatherosklerose des Karotissystems bei klinisch gesunden Personen durch die meisten traditionellen Risikofaktoren moduliert wird. Außerdem wurde festgestellt, dass die Variabilität der Gefäßanatomie einen unabhängigen Einfluss auf die Atherogenese haben könnte. Die Tatsache, dass diese Beziehung spezifisch für den ACI-Bulbus ist, indiziert, dass ein größerer ACI-Abgangswinkel zu lokalen hämodynamischen Veränderungen führt, die ihrerseits das Atheroskleroserisiko erhöhen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der ACI-Abgangswinkel ein neuer Risikofaktor für die Karotisatherosklerose sein könnte. Ob es sich hierbei jedoch um eine kausale Beziehung handelt, kann nicht im Rahmen einer Querschnittstudie bewiesen werden. Diese Hypothese sollte nun in prospektiven Studien geprüft werden.
Da die Implantologie ein fester Bestandteil der modernen Zahnheilkunde geworden ist, wird auch die Evaluation des Kieferknochens immer relevanter. Diese hohe Bedeutung des Kieferknochens ist damit zu begründen, dass für den Langzeiterfolg eines Implantates die knöcherne Einheilung im Rahmen der Osseointegration die Grundvoraussetzung bildet. Zudem erfordern verschiedene Knochenqualitäten des Kieferknochens unterschiedliche Implantatdurchmesser und Bohrprotokolle. Schon hier zeigt sich, wie relevant weitreichende Kenntnisse über den Kieferknochen sind.
Auch im Rahmen der Implantatforschung und -entwicklung ist es von großer Bedeutung, Knochen zu evaluieren und damit kalibrieren und kategorisieren zu können, um vergleichbare Versuchswerte generieren zu können. In der aktuellen Literatur liegen zahlreiche Studien zu der Knochendichte, -qualität und -quantität des Kieferknochens vor, Evaluationsmethoden des Kieferknochens sind jedoch rar. Aufgrund dessen befasst sich diese Arbeit mit der Neuentwicklung einer Evaluationsmethode von Knochen.
Zu diesem Zweck wurde in dieser Arbeit der an ein inseriertes Implantat-Dummy angrenzende Knochen mit einem Bone-Evaluation Tool bewertet und geprüft, ob eine Korrelation zwischen dem Eindrehmoment des Implantat-Dummys, der Kompaktadicke und dem Eindrehmoment des nachfolgenden Bone-Evaluation-Tools besteht. Eine bestehende Korrelation würde bedeuten, dass dieses Evaluation-Tool in der Lage ist, Knochen bezüglich seiner Güte zu bewerten und zu kalibrieren.
Durchgeführt wurden die Versuche an dem distalen Ende von bovinen Rippensegmenten sowie an Segmenten des bovinen Femurkopfes. Beide sollten den Kieferknochen der humanen Mandibula simulieren. Es wurden zwei im Durchmesser differierende Bohrprotokolle angewendet, welche als „Hard Bone Small“ (HBS) und „Hard Bone Large“ (HBL) bezeichnet wurden. Als erstes erfolgte jeweils eine Vorbohrung (ø HBS: 3,3 mm; ø HBL: 4,0 mm), gefolgt von der Insertion des Implantat-Dummys (ø HBS: 3,5 mm; ø HBL: 4,2 mm). Als nächstes erfolgte die Entfernung (Aufbohrung) der Gewindeimpressionen, die durch den Implantat-Dummy generiert wurden (ø HBS: 3,8 mm; ø HBL: 4,5 mm). Anschließend wurde das Bone-Evaluation-Tool inseriert (ø HBS: 4,0 mm; ø HBL: 4,7 mm). Zum Schluss wurden die Rippensegmente mittig der Insertionsstelle aufgehackt und an beiden Hälften jeweils median der Insertionsstelle die Kompaktadicke gemessen und die Werte gemittelt.
Anhand der Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass beide Bohrprotolle (HBS und HBL) verwendet werden können, um bovinen Rippenknochen zu evaluieren (p<0,001), da eine statistisch signifikante Korrelation zwischen Drehmoment ID mit Drehmoment BET und der Kompaktadicke bewiesen wurde (p<0,001). In Folgearbeiten wird geprüft, ob sich diese Bohrprotokolle auch auf menschlichen Kadaverknochen übertragen lassen.
Schlusswort Ziel der Arbeit war es, mit Hilfe des gegenstandsbezogenen Ansatzes der Grounded Theory ein Modell zu entwickeln, das die konstitutiven bzw. essentiellen Momente und Dimensionen der Berufswahlberatung darzu-stellen vermag und das als Systematik für Praktiken zur der Umsetzung dienen kann. Durch die mikroanalytische Untersuchung konnten vielfältige Aktivitäten der Akteure erfasst werden, die auf spezifische Anforderungen der Berufswahlberatung und auf Kunstfertigkeiten der Professionellen schließen ließen. Die untersuchten Berufsberatungsgespräche brachten zum Vorschein, welche Schwierigkeiten ein autonomes Berufswahlentscheiden für den Heranwachsenden bedeuten kann. Diese Schwierigkeiten, aber auch die Fraktionierung des Klientels sowie der produktive Umgang mit involvierten Pädagogisch-Professionellen können als die zentralen Herausforderungen, die das Handlungsfeld Berufswahlberatung an die professionellen Berater stellt, angesehen werden. In Anbetracht der gesellschaftlichen Bedeutung von Berufswahl und der diffizilen Aufgabe, eine produktive Berufsberatung hervorzubringen, mutet die gegenwärtige begriffliche Verfremdung der Berufswahlberatung als sog. Vermittlungsgespräch abstrus und unverständlich an. Die damit zum Ausdruck kommende Missachtung des bei der Realisierung einer Berufslaufbahn zentralen Aspekts des autonomen Berufswahlentscheidens muss wohl auf die zunehmende Knappheit von adäquaten Arbeits- und Ausbildungsplätzen zurückgeführt werden, die nicht nur objektiv den Entscheidungsspielraum vieler Heranwachsenden einschränkt, sondern auch antiliberale Stimmung hervorruft. Um so wichtiger erscheint es, dass durch erziehungswissenschaftliche Forschung pädagogisch arbeitende Professionelle unterstützt werden, damit diese sich im Rahmen ihrer Spielräume autonom, d.h. entsprechend den gesellschaftlich verankerten Wertvorstellungen und Grundsätzen sowie bezogen auf die Sachhaltigkeit des jeweiligen Einzelfalls rational verhalten können. Der hier praktizierte Ansatz, systematisch auf der Grundlage der Feldforschung Anforderungen zu rekonstruieren, die die Berufswahlberatung an deren Akteure stellt, und darüber hinaus passende Praktiken zu konstruieren, könnte, so meine ich, ein gangbarer Weg dafür sein, um für die Praktiker im o.g. Sinn relevantes Wissen hervorzubringen, werden hierbei doch begriffliche Vorstellungen darüber gewonnen, welche Anforderungen bei der Durchführung einer Berufswahlberatung unter bestimmten gesellschaftlich verankerten Wertsetzungen gestellt werden und welche Mittel (Praktiken) dafür in der Praxis verwendet werden können. Auch wenn das in der Arbeit entworfene Theoretische Modell empirisch fundiert und gesättigt ist, muss doch schon aufgrund des begrenzten Korpus eingeräumt werden, dass dem Modell eher grundlegender Charakter zukommt. Offen bleibt eine weitergehende, gezielte und differenzierte Auseinandersetzung mit einzelnen Anforderungen und Praktiken der Berufswahlberatung. Dazu können weitere Forschungsanstrengungen unternommen werden, um weitere Gesprächsprotokolle zu erhalten und das Modell weiter auszudifferenzieren. Es können aber auch gedankenexperimentelle Überlegungen angestrengt werden, etwa um weitere entsprechend den Anforderungen geeignete Praktiken zu entwerfen.
Diese Arbeit trägt dazu bei, die Lutherdarstellung in Lehr- und Schulbüchern der ersten Schulbuchgeneration systematisch zu erschließen. Sie stellt sich der Herausforderung den jeweils spezifischen Akzent der Lutherdarstellung und -konzeption, welcher in den Lehrtexten des Lehrbuchs transportiert wird, herauszuarbeiten und weitergehend im Verbund mit den anderen untersuchten Lehrbüchern auf übergreifende, verbindende und trennende Elemente zu untersuchen. Diese Forschungsarbeit leistet einen Beitrag zur Erschließung Luthers sowie ihrer Art und Intensität in dem Medium des Schulbuchs im Kontext der Aufklärung. Insgesamt werden zehn Werke von acht Autoren im Zeitraum von 1780 bis 1817 untersucht, darunter Schulbücher von Johann Matthias Schröckh, Lorenz von Westenrieder und Jakob Brand.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Reaktionsmikroskop (REMI) nach dem Messprinzip COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectrometry) neu konstruiert und aufgebaut. Die Leistungsfähigkeit des Experimentaufbaus konnte sowohl in diversen Testreihen als auch anschließend unter realen Messbedingungen an der Synchrotronstrahlungsanlage SOLEIL und am endgültigen Bestimmungsort SQS-Instrument (Small Quantum Systems) des Freie-Elektronen-Lasers European XFEL (X-ray free-electron laser) eindrucksvoll unter Beweis gestellt werden.
Mit der Experimentiertechnik COLTRIMS ist es möglich, alle geladenen Fragmente einer Wechselwirkung eines Projektilteilchens mit einem Targetteilchen mittels zweier orts- und zeitauflösender Detektoren nachzuweisen. In einem Vakuumrezipienten wird die als Molekularstrahl präparierte Targetsubstanz inmitten der Hauptkammer zentral mit einem Projektilstrahl (z.B. des XFEL) zum Überlapp gebracht, sodass dort eine Wechselwirkung stattfinden kann. Bei den entstehenden Fragmenten handelt es sich um positiv geladene Ionen sowie negative geladene Elektronen. Elektrische Felder, erzeugt durch eine Spektrometer-Einheit, sowie durch Helmholtz-Spulen erzeugte magnetische Felder ermöglichen es, die geladenen Fragmente in Richtung der Detektoren zu lenken. Die Orts- und Zeitmessung eines einzelnen Teilchens (z.B. eines Ions) findet in Koinzidenz mit den anderen Teilchen (z.B. weiteren Ionen bzw. Elektronen) statt. Mit dieser Messmethode können die Impulsvektoren und Ladungszustände aller geladenen Fragmente in Koinzidenz gemessen werden. Da hierbei die geometrische Anordnung der einzelnen Komponenten für die Leistungsfähigkeit des Experiments eine entscheidende Rolle spielt, mussten bei der Neukonstruktion des COLTRIMS-Apparates für den Einsatz an einem Freie-Elektronen-Laser (FEL) einige Rahmenbedingungen erfüllt werden. Besonders wurden die hohen Vakuumvoraussetzungen an den Experimentaufbau aufgrund der enormen Lichtintensität eines FEL beachtet. Das Zusammenspiel der vielen Einzelkomponenten konnte zunächst in mehreren Testreihen überprüft werden. Unter anderem durch Variation der Vakuumbauteile in Material und Beschaffenheit konnten die zuvor ermittelten Vorgaben schließlich erreicht werden. Das neu konstruierte Target-Präparationssystem zur Erzeugung molekularer Gasstrahlen erlaubt nun den Einsatz von bis zu vier unterschiedlich dimensionierten, differentiell gepumpten Stufen. Zudem wurden hochpräzise Piezo-Aktuatoren verbaut, welche die Bewegung von Blenden im Vakuum erlauben, wodurch eine variable Einstellung des lokalen Targetdrucks ermöglicht wird. Die Anpassung der elektrischen Felder des Spektrometers für ein jeweiliges Experiment wurde mittels Simulationen der Teilchentrajektorien, Teilchenflugzeiten sowie der Detektorauflösung durchgeführt.
Da die in dieser Arbeit besprochenen Messungen und Ergebnisse die Wechselwirkungsprozesse von Röntgenstrahlung bzw. Synchrotronstrahlung mit Materie thematisieren, wird die Erzeugung von Synchrotronstrahlung sowohl in Kreisbeschleunigern als auch in den modernen Freie-Elektronen-Lasern (FEL) erklärt und hergeleitet. Der im Röntgenbereich arbeitende Freie-Elektronen-Laser European XFEL, welcher u.A. als Strahlungsquelle für die hier gezeigten Experimente diente, ist eine von derzeit noch wenigen Anlagen ihrer Art weltweit. Seine Lichtintensität in diesem Wellenlängenbereich liegt bis zu acht Größenordnungen über den bisher verwendeten Anlagen für Synchrotronstrahlung.
Beim ersten Einsatz der neuen Apparatur an der Synchrotronstrahlungsanlage SOLEIL wurde der ultraschnelle Dissoziationsprozess von Chlormethan (CH3Cl) untersucht. Während des Zerfallsprozesses nach Anregung durch Röntgenstrahlung werden hochenergetische Auger-Elektronen emittiert, welche in Koinzidenz mit verschiedenen Molekülfragmenten nachgewiesen wurden. Durch den Zerfallsmechanismus der ultraschnellen Dissoziation wird die Auger-Elektronenemission nach resonanter Molekülanregung während der Dissoziation des Moleküls beschrieben. Die kinetische Energie des Auger-Elektrons ist dabei abhängig von seinem Emissionszeitpunkt. Somit können die gemessenen Auger-Elektronen ein „Standbild“ der zeitlichen Abfolge des Dissoziationsprozesses liefern.
Es wird eine detaillierte Beschreibung der Datenanalyse vorgenommen, welche aus Kalibrationsmessungen und einer Interpretation der Messdaten besteht. Die abschließende Betrachtung besteht in der Darstellung der Elektronenemissionswinkelverteilungen im molekülfesten Koordinatensystem. Die Winkelverteilung der Auger-Elektronen wird am Anfang der Dissoziation vom umgebenden Molekül- potential beeinflusst und zeigt deutliche Strukturen entlang der Bindungsachse. Entfernen sich die Bindungspartner voneinander und das Auger-Elektron wird währenddessen emittiert, so verschwinden diese Strukturen zunehmend und eine Vorzugsemissionsrichtung senkrecht zur Molekülachse wird sichtbar.
Die Analyse der Messdaten zur Untersuchung von Multiphotonen-Ionisation an Sauerstoff-Molekülen am Freie-Elektronen-Laser European XFEL ermöglichte unter anderem die Beobachtung „hohler Moleküle“, also Systemen mit Doppelinnerschalen- Vakanzen. Solche Zustände können vor allem durch die sequentielle Absorption zweier Photonen entstehen, wobei die hierbei nötige Photonendichte nur von FEL- Anlagen bereit gestellt werden kann. Hier konnte das Ziel erreicht werden, erstmalig die Emissionswinkelverteilungen der Photoelektronen von mehrfach ionisierten Sauerstoff-Molekülen (O+/O3+-Aufbruchskanal) als Folge der ablaufenden Mechanismen femtosekundengenau zu beobachten. Hierzu wurde ein vereinfachtes Schema der verschiedenen Zerfallsschritte erstellt und schließlich ermittelt, dass der Zerfall durch eine PAPA-Sequenz beschrieben werden kann. Bei dieser handelt es sich um die zweimalige Abfolge von Photoionisation und Auger-Zerfall. Somit werden vier positive Ladungen im Molekül erzeugt. Das zweite Photon des XFEL wird dabei während der Dissoziation der sich Coulomb-abstoßenden Fragmente absorbiert, weshalb es sich um einen zweistufigen Prozess aus Anrege- und Abfrage- Schritt (Pump-Probe) handelt. Schlussendlich gelang zudem der Nachweis von Doppelinnerschalen-Vakanzen im Sauerstoff-Molekül nach Selektion des O2+/O2+- Aufbruchkanals. Hierfür konnten die beiden Möglichkeiten einer zweiseitigen oder einseitigen Doppelinnerschalen-Vakanz getrennt betrachtet werden und ebenfalls erstmalig das Verhalten der Elektronenemission dieser beiden Zustände verglichen werden.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es die computergestützte, lichtoptometrische Gesichtsscannung ‚Primos body‘ zur dreidimensionalen Weichteilvermessung des Gesichts gegenüber der althergebrachten, manuellen Gesichtvermessung durch das ‚Clinometer nach Dr. Behrend‘ für den Bereich der Kieferorthopädie zu evaluieren. An dieser Untersuchung haben insgesamt 42 gesunde Erwachsene im Alter zwischen 24 und 51 Jahren teilgenommen. Um die optimalen Versuchsanordnungen sowie die Untersucher-Intervariabilität der Geräte festzustellen sind Voruntersuchungen durchgeführt worden. Bestandteil der Hauptuntersuchungen ist es mittels beider Apparaturen definierte Winkel zu vermessen und vergleichend auszuwerten. Für beide Messreihen kommen Landmarken im Bereich der Gesichtsmitte (Glabella, Nasenspitze und Hauptpogonion) zur Anwendung. Bezüglich Primos body werden zusätzlich die Abbildungen lächelnder sowie nicht lächelnder Gesichter (l- und nl- Messreihe) softwaregestützt nach definierten Winkeln ausgewertet. Die Voruntersuchungen ergeben, dass für das Clinometer die Methode „Fläche – Kopfhalterung“ als die sicherste Variante bezüglich der Reproduzierbarkeit der Messwerte einzustufen ist. Zur zusätzlichen Fixierung des Clinometers sollte daher zukünftig eine Kopfhalterung eingesetzt werden. Ferner sollte es auf eine Fläche aufgelegt werden. Abgesehen davon besagen die statistischen Auswertungen, dass das Clinometer nach Dr. Behrend einer häheren Untersucher-Intervariabilität unterliegt, als das Primos body. Die Untersucher-Intervariabilität des Clinometers liegt aber in einer klinisch wenig relevanten Größenordnung (<1°).
Für die Messungen der Hauptuntersuchungen mittels des Primos bodys sind folgende Winkel gewählt worden: Die erste Halbgerade stellt immer die Bipupillarlinie dar, die zweiten Halbgeraden werden gebildet aus den Verbindungslinien zwischen 1) Glabella und Nasenspitze (BN); 2) Glabella und Hauptpogonion (BK); 3) den beiden äußeren Augenwinkeln (BäA); 4) den bei-den Mundwinkeln (BM); 5) den beiden inneren Augenwinkeln (BiA); 6) Glabella und dem Interincisalpunkt (BI) sowie 7) den beiden Eckzahnspitzen (BE).
Der Winkel BN hat in den l- und nl-Messreihen die größte Distanz zur Symmetrieebene, beim Lächeln verändert er sich am stärksten und bezüglich der Standardabweichung unterliegt er der größten Streuung. Der Winkel BäA unterliegt der kleinsten Distanz zur 0°-Ebene, verändert sich beim Lächeln am wenigsten und weist bezüglich der Standardabweichung die geringste Streuung auf. Der Winkel BK konnte vom Untersucher am präzisesten bestimmt werden, dem Winkel BE wird hingegen die größte Ungenauigkeit zugeschrieben. Die Gesichter der Probanden dieser Studie werden beim Lächeln nicht symmetrischer oder asymmetrischer. Vielmehr nähert sich die Veränderung einer Gauß`schen Normalverteilung an. Der Winkel BK verändert sich beim Lächeln signifikant stärker, wenn er in nicht lächelnder Stellung weit von der Symmetrieebene entfernt ist (Spearman-Rho-Test: p=0,015). Für alle anderen Winkel sind keine Signifikanzen diesbezüglich festzustellen. Auch gilt für BK: Die Gesichter der Frauen der Studie sind sowohl in der nl- als auch l-Messreihe bezüglich des Winkels BK signifikant symmetrischer als die der Männer (Wilcoxon-Mann-Whitney-U-Tests: p<0,05). Der Bland-Altman-Test ergibt, dass der Winkel BK eher mit dem Ästhetikwinkel vergleichbar ist als der Winkel BN. Für zukünftige Vermessungen mit dem Clinometer sollte die Gesichtsmitte daher eher durch Hinzuziehen der Kinnmitte, als der Nasenachse zur Bestimmung des Ästhetikwinkels miteinbezogen werden. Weiterführend ist die softwaregestützte Gesichtsvermessungsmethode mit Primos body bezüglich der Messgenauigkeit dem Clinometer überlegen. Die vorliegende Dissertation kann somit ein neues bildgebendes Verfahren im Bereich der dreidimensionalen Gesichtsvermessung spe-ziell für das kieferorthopädische und kieferchirurgische Gebiet vorstellen, mit Hilfe jener zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten in Diagnostik, Planung, Therapie und Nachsorge bestehen. Zusätzlich sollen die Ergebnisse Anstoß für weitere Forschungen im Bereich der dreidimensionalen Gesichtsvermessung sein um zukünftig invasive bildgebende Verfahren ersetzten zu können.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Großteil aller nuklearen Proteine annotiert und klassifiziert. Aus Literatur, Proteinsequenz- und Domänendatenbanken wurden bekannte nukleare Domänen ermittelt, ihre Grenzen unter Zuhilfenahme von Tertiärstrukturen oder Sekundärstrukturvorhersagen bestimmt und multiple Sequenzalignments erstellt. Die handgerfertigten Aligments wurden zur Anfertigung von Hidden Markov Models herangezogen und in das Domänenvorhersageprogramm Simple Modular Architecture Research Tool (Schultz et al. 1998, Schultz et al. 2000) (http://smart.embl-heidelberg.de/) implementiert. Hier sind umfassend Informationen über Literatur, phylogentische Verteilung, Anzahl beteiligter Proteine und Funktion für 164 Domänen (118 entstammen dieser Arbeit) mehr als 35000 Proteine abdeckend zusammengefasst. Aufbauend auf der vollständigen Kollektion nuklearer Proteine wurden ausgewählte nukleare und nicht-nukleare Proteine auf der Grundlage homologiebasierender Sequenzanalyseverfahren untersucht. Die Arbeit führte zur Entdeckung von vier biologisch relevanten neuen Domänen: - L27, eine neue Hetero-Dimer bildende Domäne in den Rezeptor-Targeting-Proteins Lin-2 and Lin-7 (Doerks et al. 2000) - GRAM, eine neue Domäne in Glucosyltransferasen, Myotubularinen und anderen Membran-assoziierten Proteinen (Doerks et al. 2000) - DDT, eine neue DNA-bindende Domäne in unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren, Chromosom-assoziierten und anderen nuklearen Proteinen (Doerks et al. 2001) - BSD, eine neue putativ DNA-bindende Domäne in Transkriptionsfaktoren, Synapsen-assozierten und anderen hypothetischen Proteinen (Doerks et al. submitted) Abschliessend erfolgte die automatische Analyse von 24000 nuklearen Proteinen, aus denen 550 hypothetisch neue Domänen hervorgingen. Die intensive Aufarbeitung dieser 550 konservierten Sequenzbereiche erbrachte die Entdeckung von 28 neuen nuklearen oder teilweise nuklearen Domänen unterschiedlicher Speziesverbreitung, Funktion und biologischer Relevanz (Doerks et al. accepted).
Um Wissen in einer Form abzulegen, in der es automatisiert verarbeitet werden kann, werden unter anderem Ontologien verwendet. Ontologien erlauben über einen als Inferenz bezeichneten Prozess die Ableitung neuen Wissens. Bei inhaltlichen Überschneidungen werden Ontologien über Ontologie-Alignments miteinander verbunden, die Entitäten aus den verschiedenen Ontologien in Beziehung zueinander setzen. Üblicherweise werden diese Alignments als Mengen von Äquivalenzen formuliert, die beschreiben, welche Konzepte aus einer Ontologie Konzepten aus einer anderen Ontologie entsprechen. Ebenfalls verbreitet sind Ober- und Unterklassenbeziehungen in Alignments.
Diese Ontologie-Alignments werden zum Beispiel in der Biomedizin in Forschungsdatenbanken verwendet, da durch Alignments Informationen aus verschiedenen Bereichen zusammengeführt werden können. Der manuelle Aufwand, um große Ontologien und Alignments zu erstellen, ist sehr hoch. Dementsprechend wäre es wünschenswert, bei einer Veränderung von Ontologien nicht wieder von vorne beginnen und eine neue Ontologie erstellen zu müssen und möglichst viel aus der veränderten Ontologie und den die Ontologie betreffenden Alignments wiederverwenden zu können. Daher sollten möglichst automatisierte Verfahren verwendet werden. Diese Arbeit untersucht vier Ansätze, um die Anpassung von Alignments an Veränderungen in Ontologien zu automatisieren.
Der erste Ansatz bezieht Inferenzen in den Prozess zur Vorhersage von Alignment-Änderungen mit ein. Dazu werden die Inferenzen vor und nach der Änderung der Ontologien berechnet und auf Basis der Unterschiede mit einem regelbasierten Algorithmus bestimmt, wie sich das Alignment ändern soll. Der zweite Ansatz, wie auch die weiteren Ansätze, hat nicht zum Ziel das Alignment direkt anzupassen. Stattdessen soll vorhergesagt werden, welche Teile des Alignments angepasst werden müssen. Dazu werden die Ontologien und das Alignment als Wissensgraph-Embeddings repräsentiert. Diese Embeddings bilden Knoten aus den Ontologien in einen Raum mit 300-1000 Dimensionen so ab, dass in dem Raum auch die Beziehungen zwischen den Entitäten der Ontologien repräsentiert werden können. Diese Embeddings werden dann verwendet, um verschiedene Klassifikationsalgorithmen zu trainieren. Auf diese Weise wird vorhergesagt, welche Teile des Alignments sich verändern werden. Der dritte Ansatz verbindet Embeddings mit einem Veränderungsmodell. Das Veränderungsmodell kategorisiert die an den Ontologien vorgenommenen Veränderungen. Auf diese Kategorisierung und das Embedding werden dann Klassifikationsalgorithmen angewandt. Der vierte Ansatz verwendet eine speziell auf Wissensgraphen ausgerichtete Architektur für neuronale Netze, sogenannte Graph Convolutional Networks, um Veränderungen an Alignments vorher zu sagen.
Diese Ansätze werden auf ihre jeweiligen Vor- und Nachteile untersucht. Dazu werden die Verfahren an zwei Anwendungsfällen untersucht. Der Ansatz zur regelbasierten Einbeziehung von Inferenzen wird anhand eines Anwendungsbeispiels aus dem Bereich der Interweaving Systems betrachtet. In dem Beispiel wird eine allgemeine Methode für Interweaving Systems angewandt um das Selbstmanagement von Ampelsteuerungen zu ermöglichen. Die auf maschinellem Lernen aufbauenden Ansätze werden auf einem Auszug aus der biomedizinischen Forschungsdatenbank UMLS evaluiert.
Dabei konnte festgestellt werden, dass die betrachteten Ansätze grundsätzlich zur Anpassung von Alignments an Ontologie-Veränderungen eingesetzt werden können. Der Ansatz zur regelbasierten Einbeziehung von Inferenzen kann dabei vor allem auf sehr kleinen Datensätzen eingesetzt werden, bei denen alle Gesetzmäßigkeiten der Veränderungen grundsätzlich bekannt sind. Diese Anwendbarkeit ergibt sich aus dem Entwurf der Problemstellung für den ersten Ansatz. Die auf maschinellem Lernen aufbauenden Ansätze eignen sich besonders für große Datensätze und bieten den Vorteil, dass auch ohne ein vollständiges Verständnis des Veränderungsprozesses Vorhersagen getroffen werden können.
Unter den Ansätzen, die maschinelles Lernen einsetzen, zeigte die Einbeziehung von Veränderungsmodellen keine Vorteile gegenüber den anderen Ansätzen. Auf einem etwas
kleineren Datensatz waren die Ergebnisse des Embedding-basierten Ansatzes und der Relational Graph Convolutional Networks vergleichbar, während auf einem größeren Datensatz
die Graph Convolutional Networks etwas bessere Ergebnisse erreichen konnten.
Weitere Ergebnisse dieser Arbeit stellen eine Formalisierung der Problemstellung der Anpassung von Ontologie-Alignments an Veränderungen sowie eine formale Darstellung der Ansätze dar. Ein weiterer Beitrag der Arbeit ist die Vorstellung eines Anwendungsfalls aus dem Bereich der Interweaving Systems für Ontologie-Alignments. Außerdem wurde das Problem der Anpassung von Alignments an Veränderungen so formuliert, dass es mithilfe von
maschinellem Lernen betrachtet werden kann.
Es gibt zwei Leitmotive, die sich konsequent in der Rhetorik der Forschungsliteratur zu Anselm Kiefer beobachten lassen: zum einen die Auseinandersetzung des Künstlers mit dem Nationalsozialismus und in der Folge mit der nordisch-germanischen Mythologie und zum anderen die Beschäftigung mit dem Judentum und der jüdischen Mystik. Innerhalb des Gesamtoeuvres sind jedoch diejenigen Arbeiten, die sich augenscheinlich und sehr offensichtlich mit dem Nationalsozialismus beschäftigen nur eine sehr kleine Gruppe. In seiner 50 Jahre umfassenden künstlerischen Laufbahn hat er lediglich in den ersten Jahren eine offensive Auseinandersetzung mit der NS-Vergangenheit Deutschlands gesucht. Sie bildet gleichsam den Startpunkt seiner künstlerischen Karriere. Mittlerweile ist der Künstler Anselm Kiefer mit der Aufarbeitung des Nationalsozialismus und den Begrifflichkeiten Vergangenheitsbewältigung, Erinnerungsarbeit und Trauerarbeit kanonisiert. Doch je länger der Schaffensprozess von Kiefer andauert und je weiter man auf sein produktives Œuvre zurückblicken kann, umso deutlicher erkennt man nachweisbar zwei ganz andere bildimmanente Leitkategorien in diversen Facetten und Nuancen, die in ihrer Überordnung eine völlig neue Dimension einschlagen: die Dimension von Zeit und Raum respektive Zeitlichkeit und Räumlichkeit in Kiefers gesamtem Werkkomplex.
Insistent beschäftigt sich Kiefer mit allgemeingültigen Themen der Vergangenheit, Gegenwart und Zukunft oder diskutiert zeitlose und damit verbunden auch schwer zugängliche Inhalte. Zeitlos meint in diesem Fall, dass er sich nicht mehr mit den ihm vorher typischen Referenzen der Historie und Geschichte (wie eben dem Nationalsozialismus) beschäftigt, sondern vielmehr auch mit zeitlichen Dimensionen wie der kosmologischen, geologischen oder Lebens-Zeit. Zunehmens treten ab Mitte der achtziger Jahre Raumbezogene Kosmos- und Genesisthemen aus dem Alten Testament oder der Kabbala in den Mittelpunkt. Raum und Zeit als zwei Leitkategorien breiten sich wie eine Art Dach über Kiefers gesamtes Œuvre und über die üblichen ikonografischen Interpretationsmodelle aus. Sie werden von mir als alternative Lesart der Forschung empfohlen.
Jedes Bildwerk besitzt neben seiner räumlichen Gestalt und seinem kompositorischen Bildaufbau auch eine implizite Bildzeit. Beide Determinanten bedingen als Ordnungsraster nicht nur die jeweilige formale Bildgestalt, sondern auch den strukturellen Bildgehalt in Form eines zeitlich-räumlichen Ausdrucks. Raum und Zeit sind als normativ zu verstehen, im Sinne eines Standards, gleichsam als eine Regel, die grundsätzlich für die Annäherung und Interpretation der Kieferschen Arbeiten angewendet werden kann. Die Wahrnehmung von Raum und Zeit bei Kiefer kann gleichsam übergreifend in die folgenden drei Kategorien eingeteilt werden: 1.) die thematische Referenz auf die beiden Dimensionen, 2.) der tatsächlich motivische Bezug oder 3.) die faktische Umsetzung anhand der Dimension des Bildträgers oder der Entstehungszeit des Werkes. Raum und Zeit liegen zudem ganz grundsätzlich dem kosmologischen Weltentwurf zugrunde, da Alles in Zeit und Raum ist. Die beiden Dimensionen sind dem Kieferschen Sternenbild qua seiner Existenz daher schon anhaftig.
Kiefer hat in den Jahren 1995 bis 2010 eine beachtliche Anzahl an Sternenbildern geschaffen. Er fertigt die Bilder vor allem seriell an, so dass diese Fülle auf Basis diverser formaler Bildanlagen von mir in zwei Gruppen unterteilt wurde.
Die erste Gruppe folgt einer traditionellen Bildform, indem sie grundsätzlich den Bildträger kompositorisch in eine irdische und eine stellare räumliche Zone unterteilen. Der nächtliche Sternenhimmel breitet sich darin geschlossen über einer Landschaft oder einem Innenraum aus. Der Betrachter wird gleichsam von seinem irdischen Standpunkt aus auf den Blick gen Sternenhimmel gelenkt. Die Sternenbilder aus irdischer Perspektive versammeln philosophisches und literarisches Gedankengut der historischen Personen Immanuel Kant, Ingeborg Bachmann und Pierre Corneille. Die zweite Gruppe umfasst jene Arbeiten, die den irdischen Standpunkt verlassen und keine Horizontlinie mehr aufweisen. Bei diesen Arbeiten begreift Kiefer den Bildträger in seiner kompletten Dimensionalität als rein stellaren Bildraum. In den Werken wird als Konsequenz eine für Kiefers Sternenbilder neue bildräumliche Perspektive obligat.
Die Sternenbilder Kiefers fokussieren grundsätzlich kosmologische Fragestellungen, seien sie philosophisch, literaturwissenschaftlich, naturphilosophisch, naturwissenschaftlich oder religiös konnotiert. Damit folgen sie der Tradition vorangegangener Künstlergenerationen. In einem Einführungskapitel, welches für die Verortung Kiefers in die Tradition des Sternenbildes wichtig ist, wird aufgezeigt, dass das Bild der Sterne stets in enger Verbindung mit den eben genannten Disziplinen steht, durch diese maßgeblich beeinflusst wurde und weiterhin wird. Den Künstlern ist die Tatsache gemein, dass sie mit ihrer Darstellung des Sternenhimmels der Frage nach einer räumlichen und zeitlichen Ordnung der Welt, gleichsam als Kosmos verstanden, sowie ihrer Entstehungsursache und des „Bauplans“ nachgehen. Den Sternenbildern scheint gemein zu sein, dass sie realiter durch Beobachtungen, Erkenntnisse und Ergebnisse Wissensräume sichtbar machen, determinieren und das jeweilige Wissen transportieren.
Kiefers kosmologischer Diskurs verläuft in dem großen Bereich des Nicht-Wissens, mit dem Versuch einen ontologischen Sinn herzustellen. Die Arbeiten, die auf Kant referenzieren, auf Bachmann und auf Corneille zeugen von Kiefers kosmologischer Auseinandersetzung, seiner Frage nach Gott, seiner Verortung im Kosmos, seiner Beschäftigung mit dem Darstellbaren und Un-Darstellbaren und einer damit verbundenen Sinnsuche.
In dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Ansätze zur Korrektur/Eliminierung von Punktmutationen in Nukleinsäuren untersucht. Im ersten Ansatz wurden chimäre RNA/DNA-Hybride zur Korrektur von einer Punktmutation im p22phox-Gen ausgetestet, während im zweiten Ansatz ein „Hammerhead“-Ribozym zur Eliminierung von mutierter N-ras-RNA untersucht wurde.
Abdominale Aortenaneurysmen sind in Industrienationen eine häufige Erkrankung der Personengruppe über 65 Jahre. Diese Dilatationen der abdominalen Aorta zeichnen sich durch eine lokale Inflammation aus, die mit der Infiltration von Immunzellen, dem Verlust von glatten vaskulären Muskelzellen und der Degeneration der extrazellulären Matrix einhergeht. Ursprünglich als Symptom einer Atherosklerose angesehen, sind die Ursachen dieser progressiv verlaufenden Erkrankung nach wie vor nicht vollständig verstanden; obwohl steigendes Alter, männliches Geschlecht, genetische Prädisposition, Rauchen und ein zuvor erlittener Myocardinfarkt als Risikofaktoren identifiziert werden konnten. Der lange Zeit asymptomatische Krankheitsverlauf, die Gefahr einer Ruptur mit häufig letalen Folgen und der Mangel einer effizienten pharmakologischen Therapie machen eine weitere Untersuchung dieser Erkrankung unabdingbar.
Diltiazem ist ein Inhibitor spannungssensitiver L Typ-Calciumkanäle, der seit über 25 Jahren zur Behandlung von arterieller Hypertonie, verschiedener Arrhythmien und Angina pectoris verwendet wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob Diltiazem auch einen antianeurysmatischen Effekt besitzt. Eine vierwöchige subcutane Infusion des blutdrucksteigernden Hormons Angiotensin II führte nach vier Wochen zur Bildung abdominaler Aortenaneurysmen, sowie zu atherosklerotischen Gefäßveränderungen der thorakalen Aorta Apolipoprotein E (ApoE)-defizienter Mäuse. Eine parallele Therapie mit Diltiazem über das Trinkwasser konnte diese Entwicklung unabhängig vom arteriellen Blutdruck und damit unabhängig von der antihypertensiven Wirkung verhindern. Im Aortenbogen Diltiazem-behandelter Tiere konnte im Rahmen dieses in vivo-Modells nach sechs Tagen eine deutlich geringere lokale Expression proinflammatorischer Cytokine, wie Tumornekrosefaktor-a, Interleukin-1ß (IL1B) und Interleukin-6 (IL6), Chemokine, wie CCL2, und degenerativer Proteasen, wie der Matrix-Metalloprotease 9 (MMP9), festgestellt werden. Dies war die Folge einer reduzierten Anzahl von Macrophagen in der Gefäßwand. Zirkulierende proinflammatorische Cytokine, wie CCL12, konnten im Serum teilweise ebenfalls vermindert nachgewiesen werden.
Obwohl die antihypertensive Wirkung von Diltiazem in glatten vaskulären Muskelzellen vermittelt wird, war es nicht möglich, die Angiotensin II-induzierte Produktion von promigratorischem CCL2 und proinflammatorischem IL6 in isolierten Aortenringen ApoE-defizienter Mäuse oder in glatten vaskulären Muskelzellen der Ratte zu reduzieren. Diltiazem war zudem nicht in der Lage, die CCL2-induzierte Migration proinflammatorischer Ly6C+-Monocyten in vivo zu unterbinden. In isolierten peritonealen Macrophagen ApoE-defizienter Mäuse dagegen, konnte die IL6 induzierte Expression von IL1B- und CCL12-mRNA durch eine Inkubation mit Diltiazem verhindert werden. In der RAW264.7-Zelllinie, die morphologische und funktionelle Merkmale von Monocyten und Macrophagen aufweist, konnte die Dilitiazem-sensitive IL6-induzierte Expression von IL1B-mRNA in vitro ebenfalls nachgewiesen werden. Eine Stimulation mit IL6 war in diesen Zellen jedoch nicht ausreichend, um die Sekretion von IL1B-Protein auszulösen.
Thorakales Aortengewebe wies im Vergleich mit RAW264.7-Zellen eine veränderte Ausstattung spannungssensitiver Calciumkanäle auf. In letzteren fanden sich keine muskelzellspezifischen L-Typ-Calciumkanäle (CACNA1C), aber eine relevante Expression neuronaler P/Q-Typ-Calciumkanäle (CACNA1A). Mittels fluorimetrischer Bestimmung mit Fura-2AM konnte jedoch festgestellt werden, dass die intrazelluläre Calciumkonzentration Diltiazem-behandelter RAW264.7-Zellen unverändert war und der antiinflammatorische Effekt somit calciumunabhängig vermittelt wurde.
Diltiazem war nicht in der Lage, eine Lipopolysaccharid (LPS)-bedingte Inflammation in RAW264.7-Zellen zu unterbinden. Weder die LPS-induzierte Sekretion von IL1B Protein, noch die nucleäre Translokation des Transkriptionsfaktors NF-?B oder die Aktivierung des NF-?B-Promotors konnten durch eine Inkubation der Zellen mit Diltiazem verhindert werden. Diltiazem reduzierte jedoch, die IL6-induzierte Aktivierung des AP 1-Promotors unabhängig von der MAPK1-Phosphorylierung oder der Phosphorylierung und nucleären Translokation des Transkriptionsfaktors STAT3 zu unterbinden. Eine Unterdrückung von c-Jun N-terminale Kinase JNK- oder p38 Proteinkinase-vermittelten Signalwegen ist damit wahrscheinlich.
Das Pirinixinsäurederivat LP105 ist ein neuer Inhibitor der Arachidonat-5-Lipoxygenase (LOX5), der im Rahmen dieser Arbeit erstmals in vivo auf seine antianeurysmatischen Eigenschaften hin untersucht wurde. LOX5 katalysiert die Reaktion von Arachidonsäure zu Leukotrien A4 und kontrolliert damit einen wichtigen Schritt in der Synthese proinflammatorischer Leukotriene. LP105 war im Tiermodell nicht in der Lage die Angiotensin II-induzierte Bildung abdominaler Aortenaneurysmen in ApoE-defizienten Mäusen komplett zu unterbinden, führte aber über die Reduktion der vaskulären Inflammation zu einer deutlich verringerten Krankheitslast. LP105 selbst beeinflusste die mRNA-Expression verschiedener Enzyme des Arachidonsäuremetabolismus nicht, verstärkte jedoch durch die Blockade von LOX5 die Metabolisierung von Arachidonsäure über Arachidonat-15-Lipoxygenase und Cytochrom P450-Enzyme.
Anthropogene Landnutzung in ariden Savannen verändert die strukturelle Diversität der Vegetation und bedroht damit die Artenvielfalt der Flora und Fauna von etwa 20% der Landoberfläche der Erde. Ziel meiner Dissertation war es, den Einfluss von Landnutzung auf die Abundanz und Diversität von Kleinkarnivoren und ihrer Beutetiere zu untersuchen. Dabei sollten Bioindikatoren identifiziert werden, die eine Einschätzung der Diversität im Farmmosaik der südlichen Kalahari ermöglichen. Entlang eines Weideintensitätsgradienten analysierte ich mit Hilfe freilandökologischer Methoden die komplexen Zusammenhänge zwischen Beweidungsintensität, struktureller Diversität der Vegetation, Beuteverfügbarkeit und Diversität von Kleinkarnivoren. Nach den Ergebnissen dieser Studie in der südlichen Kalahari kann ich folgende Aussagen über die anthropogene Störung der Integrität von ariden Savannensystemen durch Beweidung treffen: 1. Eine Steigerung der Bestockungsdichten von Weidetieren führte zu drastischen Veränderungen der Zusammensetzung und strukturellen Diversität der Vegetation. Dabei sank mit zunehmendem Beweidungsdruck der Anteil an Gräsern an der Vegetationsbedeckung bei gleichzeitigem Anstieg der Strauchvegetation. Die Heterogenität des Habitats, gemessen in Anzahl von Strauchpatches (ø>4m) pro Hektar, zeigte einen unimodalen Verlauf bei steigender Strauchbedeckung und damit bei steigender Weideintensität. Maximale Habitatheterogenität wurde bei einer Strauchbedeckung von ca. 20% festgestellt. 2. Die beobachteten Veränderungen der Vegetation wirkten sich sowohl auf Tierarten aus, die sich direkt von pflanzlicher Kost ernähren als auch auf solche am Ende einer Nahrungskette: Die Effekte zunehmender Strauchbedeckung (und damit steigender Beweidungsintensität) auf die relative Häufigkeit der wichtigsten Beutetiere von Kleinkarnivoren unterschieden sich zwischen den einzelnen Gruppen. Es bestand eine lineare negative Korrelation für Orthopteren, während unimodale Antwortmuster für Käfer mit maximaler Abundanz bei einer Strauchbedeckung von ca. 15% und für Nagetiere bei ca. 12,5% festgestellt wurden, wohingegen keine Korrelation für Termiten ermittelt werden konnte. 3. Am Beispiel der Nagetiergemeinschaft konnte die wesentliche Bedeutung der räumlichen Skala für das Auflösungsvermögen von Abundanz- und Diversitätsmuster gezeigt werden. Ihre Muster und damit die Auswirkungen von Beweidung wurden ausschließlich auf einer großen räumlichen Skala (250ha) identifiziert, nicht jedoch auf der Skala des mittleren Aktionsraums (1ha). Ein wichtiges Fazit dieser Ergebnisse ist, dass zuerst diejenige räumliche Skala identifiziert werden muss, auf der ein Organismus mit Habitatstrukturen (Z.B. geeigneten Nahrungsplätzen) interagiert, um die Effekte von Veränderungen der strukturellen Zusammensetzung von Habitaten verstehen zu können. Dabei führte steigende Grasbedeckung zu einer exponentiellen Sättigung der Gesamtabundanz sowie der Diversität der Nagetiere. Dagegen wurde bei Zunahme der Strauchbedeckung ein unimodales Muster für Gesamtabundanz und Diversität festgestellt. 4. Obwohl ein hoher Strauchanteil sich durchgehend negativ auf die Beuteverfügbarkeit auswirkte, haben Sträucher eine besondere Bedeutung für die Artenvielfalt in diesem Lebensraum, da sie als Schutz- und Nistplatz wichtige Funktionen erfüllen. Am Beispiel von Fuchsmangusten (Cynictis penicillata) konnte ich exemplarisch die zentralen Funktionen von Sträuchern und ihren Einfluss auf den Reproduktionserfolg dieser Art zeigen. Interessanterweise waren die Auswirkungen von Sträuchern inkonsistent für unterschiedliche räumliche Skalen. Im Mikrohabitat haben Strauchstrukturen positive Eigenschaften (Schutzfunktionen). Fuchsmangusten legten ihre Bauten meistens unter Sträuchern an, um ein Einstürzen durch Huftrampeln zu verhindern und ihr Prädationsrisiko durch Greifvögel zu reduzieren. Für die Anlage ihrer Reproduktionsbauten wählten sie Strauchstrukturen mit einem Durchmesser von mindestens sechs Metern (bevorzugt der Art Acacia hebeclada) und außerdem, wenn sich im Umkreis von 10 Metern kein weiterer Strauchpatch befand. Auf einer größeren räumlichen Skala (im Umfeld von einem Hektar um Reproduktionsbauten) wurden Flächen mit einer Strauchbedeckung präferiert, die geringer war, als zufällige Flächen im Habitat. Dabei wirkte sich zunehmende Strauchbedeckung auch negativ auf die Gruppengröße und den Reproduktionserfolg dieser Art aus. Für eine erfolgreiche Reproduktion bei Fuchsmangusten scheint die Strauchbedeckung im Umfeld von einem Hektar um die Reproduktionsbauten einen Schwellenwert zwischen 10 und 15% nicht überschreiten zu dürfen. Dies ist mit der sinkenden Beuteverfügbarkeit (Nagetiere und Arthropoden) bei zunehmender Strauchbedeckung zu begründen. 5. Aufgrund der dramatischen Auswirkungen von Verbuschung auf die Beuteverfügbarkeit von Kleinkarnivoren unterschieden sich die Abundanzen der einzelnen Kleinkarnivoren deutlich zwischen diesen Farmen. Die Abundanz der jeweiligen Einzelarten konnte über Regressionsmodelle mit Vegetationsparameter oder Beutetierverfügbarkeit erklärt werden. Im Gegensatz dazu war die Strauchbedeckung die beste erklärende Variable für Gesamtabundanz und Diversität der Gilde. Sie integriert habitatspezifische Eigenschaften, wie die Verfügbarkeit von vier Beutetiergruppen, die Konnektivität von Nahrungspatches mit hoher Qualität, das Prädationsrisiko durch Greifvögel sowie das Nistplatzangebot. Dabei sank mit zunehmender Strauchbedeckung die Gesamtabundanz, während für die Diversität ein unimodales Muster mit maximaler Diversität bei einer Strauchbedeckung von ca. 12,5% festgestellt wurde. Für eine Einschätzung der Diversität von Kleinkarnivoren eignet sich die Ginsterkatze (Genetta genetta) als Indikatorart. Interessanterweise war die Strauchbedeckung ein noch besserer Bioindikator für die Einschätzung der Diversität von Kleinkarnivoren. 6. Die Schlussfolgerung meiner Ergebnisse ist, dass die Diversität der Kleinkarnivoren einen Großteil der Biodiversität der Untersuchungsflächen in der südlichen Kalahari widerspiegelt. Dabei integriert die Kleinkarnivorengilde als Indikatorvariable neben der zoologischen Diversität (i) auch die strukturelle Diversität der Vegetation (ii) sowie die strukturelle Organisation im Nahrungsnetz (iii). Kleinkarnivoren erhalten dadurch einen Status einer Indikatorgilde und eignen sich damit sehr gut zur Beurteilung der südlichen Kalahari oder einer anderen Weidelandschaft arider Savannen. 7. Das für den Naturschutz wichtigste Ergebnis meiner Arbeit ist, dass höchste Diversität aller Untersuchungsorganismen bei einer Strauchbedeckung zwischen 10 und 15%, also einer mittleren Beweidungsintensität von ca. 3,5 LSU/ l00ha, festgestellt wurde. Daher wirken sich mäßige Bestockungsdichten durchaus positiv auf die Diversität aus, während eine Überbeweidung einen dramatischen Rückgang der Artenvielfalt in diesem Lebensraum verursacht.
1. Hintergrund und Ziel der Studie: Bei der Thrombolysetherapie des akuten ischämischen Schlaganfalls ist die Dosierung des Thrombolytikums strikt an das Körpergewicht des Patienten gebunden. Dies ist notwendig um die Effektivität der Therapie zu gewährleisten und um das Auftreten von Blutungskomplikationen weitestgehend zu verhindern. Aufgrund unterschiedlichster Faktoren, wie beispielsweise Einschränkungen des Bewusstseinszustands, oder aber Aphasie und Dysarthrie, sind viele potentielle Lyse-Patienten jedoch nicht in der Lage, ihr Körpergewicht dem behandelnden Arzt mitzuteilen. In vielen Fällen fehlen in der Akutsituation die Zeit, sowie die entsprechenden technischen Möglichkeiten, insbesondere bettlägerige Patienten zu wiegen. Folglich wird das Körpergewicht oftmals vom Arzt nach Augenmaß abgeschätzt, was erwiesenermaßen mit Ungenauigkeiten verbunden ist. Ziel der Studie war es, Approximationsmethoden zu entwickeln, die das Körpergewicht des Patienten anhand einfach erhältlicher anthropometrischer Maße zuverlässig zu bestimmen vermögen. 2. Methoden: Auf Grundlage anthropometrischer Daten einer bevölkerungsbasierten Population von 6.954 erwachsenen Probanden wurden, mittels linearer Regression, Approximationsformeln zur Abschätzung des Körpergewichts erstellt. Diese Formeln beinhalteten die Parameter „Körpergröße“, „Bauchumfang“ und „Hüftumfang“, sowie teilweise das Lebensalter der Person. Die verwendeten Parameter stellten allesamt unabhängige Prädiktoren des Körpergewichts dar. Die geschlechtsspezifischen Formeln wurden anschließend anhand einer unabhängigen Gruppe von 178 Patienten (90 Männer, 88 Frauen, Durchschnittsalter: 67,3 Jahre [±15,6 Jahre]) validiert. Einschlusskriterium war hierbei die Verdachtsdiagnose eines Schlaganfalls bei einer notfälligen stationären Aufnahme in die neurologischen Klinik des Klinikums der Johann-Wolfgang Goethe Universität Frankfurt am Main im Zeitraum April bis August 2006. Unter Verwendung des Goldstandards „Wiegung“, wurde die Genauigkeit der anthropometrischen Gewichtsapproximationen mit der Genauigkeit von jeweils zwei unabhängigen visuellen Schätzungen von in der Schlaganfall-Thrombolyse erfahrenen Ärzten verglichen. Für die klinische Nutzung wurden Approximationshilfen (ein Internet-Rechner und Nomogramme) entwickelt, die den Gebrauch der anthropometrischen Approximationsformeln erleichtern sollen. 3. Ergebnisse: Unter Verwendung der anthropometrischen Approximationsformeln konnten genauere Abschätzungen des wahren Körpergewichts erzielt werden, als durch rein visuelle Schätzung. Für die einfachsten und gleichzeitig genauesten Approximationsformeln (Approximationsmodell 1) betrug die durchschnittliche absolute Abweichung vom gewogenem Körpergewicht 3,1 kg (± 2,6 kg). Die Formeln waren somit signifikant genauer als die beiden Schätzungen durch Ärzte (Schätzung 1: 6,5 kg [± 5,2 kg], Schätzung 2: 7,4 kg [± 5,7 kg]; p < 0,001 für die Genauigkeitsvergleiche zwischen der jeweiligen Schätzung und der Approximation). Die Verwendung der Approximationsformeln reduzierte den Anteil aller Schätzungen, die mehr als 10% vom wahren Körpergewicht abwichen, von 31,5% (Schätzung 1) bzw. 40,4% (Schätzung 2) auf 6,2% (Approximationsmodell 1). In lediglich einem Fall (0,6%) wich das approximierte Gewicht mehr als 20% vom wahren Körpergewicht ab, wohingegen dies in 4,6% (Schätzung 1), respektive 8,5% (Schätzung 2) der Fälle für die Schätzungen zutraf. Die Benutzung der auf den Approximationsformeln basierenden Nomogramme führte zu keiner relevanten Verschlechterung der Schätzgenauigkeit (durchschnittliche absolute Abweichung vom gewogenen Körpergewicht 3,11 kg [± 2,69 kg], Anteil der Fehlschätzungen > 10% des Körpergewichts: 7,3%). Mit einer durchschnittlichen absoluten Abweichung vom wahren Körpergewicht von 2,7 kg (± 2,4 kg) und einem Anteil von 3,4% der Gewichtsschätzungen mit einer Abweichung von mehr als 10% vom wahren Gewicht, waren lediglich die Gewichtsangaben der Patienten selbst genauer als die anthropometrischen Approximationen. Die Messung der anthropometrischen Parameter dauerte durchschnittlich 99,5 Sekunden (± 36,7 s), für die Berechnung des Körpergewichts mittels Nomogramm wurden im Durchschnitt 56,7 Sekunden (± 15,3 s) benötigt. Die Übereinstimmung der Messergebnisse zwischen verschiedenen Untersuchern war hoch (Intraclass correlation Coefficients [ICC] für Körperlänge: 0,9978 [95% Konfidenzintervall 0,9954 - 0,9991], ICC für Bauchumfang: 0,9891 [0,9771 - 0,9953], ICC für Hüftumfang: 0,9921 [0,9836 - 0,9966]). 4. Schlussfolgerung: Durch die Verwendung von Approximationsformeln, basierend auf einfach bestimmbaren anthropometrischen Messgrößen (Körperlänge, Bauch- und Hüftumfang) ist es möglich, innerhalb kurzer Zeit eine relativ genaue Abschätzung des Körpergewichts von Schlaganfallpatienten zu erhalten. In Situationen, in denen das Körpergewicht des Patienten nicht umgehend erfragbar oder durch Wiegung bestimmbar ist, kann die vorgeschlagene Approximationsmethode helfen, grobe Schätzfehler und in der Folge Dosierungsfehler bei dosiskritischen Medikamenten zu minimieren.
Zwei flavonoidhaltige Pflanzenextrakte, der neuartige Extrakt WS1261, sowie der standardisierte Ginkgo biloba L.-Extrakt EGb761 wurden auf antidepressive Wirkungsmechanismen untersucht, zusätzlich als chemisch definierte Einzelsubstanz das in beiden enthaltene Flavonoid Isorhamnetin. Methodisch wurden hierzu Effekte auf Transporter und Enzyme des Monoaminstoffwechsels, depressionsrelevante Stresshormone neurotrophe Eigenschaften untersucht.
WS1261 hemmte in höheren Konzentrationen in vitro die (Wieder-) Aufnahmetransportmechanismen von NA und 5-HT. Ex vivo war ein Effekt auf die Aufnahme von NA und 5-HT weder nach 1 h, noch 4 h nach Akutbehandlungen zu sehen, sondern erst nach (14-taegiger) subchronischer Behandlung, und dann auch nur Ufer 5-HT zu messen. Nach subchronischer Behandlung konnte eine ebenfalls in vitro festgestellte Hemmung der MAO-A durch WS1261 ebenfalls ex vivo gezeigt werden.
EGb761 hemmte in vitro die Wiederaufnahme von NA, 5-HT und DA. Ex vivo war dieser Effekt weder 1 h, noch 4 h nach einer Akutgabe, allerdings nach 14-taegiger Dauerbehandlung im Bezug auf eine Hemmung der NA-Aufnahme messbar, ohne dass MAO-A oder MAO-B-Aktivitaet beeinflusst wurden.
WS1261 erhoehte nach 14-taegiger Behandlung konzentrationsabhaengig die Plasma-Corticosteronspiegel. WS1261 war in der Lage, die Ausdifferenzierung von PC12-Zellen konzentrationsabhaengig zu fördern, wodurch auf eine Wirkung ähnlich dem neurotrophen Wachstumsfaktor NGF geschlossen werden kann. Die Konzentration des Wachstumsfaktor BDNF wurde in zwei relevanten Hirnregionen durch WS1261 nicht, in einer jedoch durch Isorhamnetin allein erhoeht.
Zusammengefasst ergaben sich Hinweise darauf, dass eine mögliche antidepressive Wirkung von WS1261 durch eine Wirkung auf eine Beeinflussung des Monoaminstoffwechsels, oder die Erhöhung depressionsrelevanter Stresshormonlevel erklärbar sein koennte, insbesondere nach subchronischer Behandlung. Es ergaben sich ausserdem Hinweise auf wachstumsfaktoraehnliche Wirkungsweisen. Eine Wirkung ueber eine Erhšhung zentraler BDNF-Konzentrationen konnte durch die vorliegende Untersuchung im Beobachtungszeitrum nicht festgestellt werden.
Die literaturbekannte kognitionsverbessernde Wirkung des Ginkgo biloba-Extraktes EGb761 koennte erklärbar sein durch eine nach subchronischer Behandlung feststellbare Hemmung des Noradrenalintransporters NET, da im frontalen Cortex vor allem ueber diesen die synaptische Elimination des hier mit Aufmerksamkeit und Lernprozessen im Zusammenhang stehenden Neurotransmitters Dopamin erfolgt.
Das in beiden Extrakten enthaltene Flavonoid Isorhamnetin kann hšchstens mit einem Teil dieser festgestellten Effekte in Verbindung stehen, da die Extrakte sich in ihrer Wirkungsweise unterschieden, und Isorhamnetin alleine teilweise andere Effekte zeigte, als die isorhamnetinhaltigen Extrakte WS1261 und EGb761. Dies koennte jedoch auch durch die unterschiedlichen in den Extrakten enthaltenen Mengen erklärbar sein.
Die Motivation dieser Arbeit lag in der Formulierungsentwicklung eines nanopartikulären Systems auf Basis von Poly(D,L Milch-co-Glykolsäure) (PLGA) zum Transport eines antiangiogenen Antikörpers zur spezifischen Anreicherung in malignen Tumoren. Durch das partikuläre System soll eine optimierte Therapie mit erhöhten pharmazeutischen Wirkkonzentrationen am Wirkort bei gleichzeitig reduzierten Nebenwirkungen erreicht werden. In der Literatur wurden schon mehrfach unterschiedliche Herstellungsmethoden sowie diverse Untersuchungen der PLGA-Nanopartikel (NP) beschrieben. Dennoch fehlen bisher von Antikörperbeladenen PLGA-NP zur Tumortherapie systematische Untersuchungen der Herstellung, der Charakterisierung physikochemischer Eigenschaften, der Lagerstabilität und der Wirkung in biologischen Systemen. Diese Untersuchungen wurden in dieser Arbeit durchgeführt und die Ergebnisse in vier Teilbereiche gegliedert. Im ersten Teilbereich wurde die Herstellung und Charakterisierung der PLGA-NP etabliert. Dabei wurde zunächst der Einfluss unterschiedlicher Herstellungsparameter und Formulierungen auf unbeladene und Proteinbeladene PLGA-NP untersucht. Charakterisiert wurden die Nanopartikel anhand der Partikelgröße und Polydispersität, dem Zetapotential und den bildgebenden Verfahren TEM und SEM. Neben der Reproduzierbarkeit der physikochemischen Eigenschaften ist für die Entwicklung nanopartikulärer Systeme die exakte Bestimmung der Einbettungseffizienz hochpotenter Proteine von größter Bedeutung. Da an dieser Stelle keine normierten Methoden zur Verfügung standen, wurden drei Bestimmungsmethoden bewertet und die Einbettungseffizienzen untersucht. Im zweiten Teilbereich wurden die Lyophilisation und die Lagerstabilität der PLGA-NP untersucht. Um die kritischen Faktoren wie Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung bis zur Applikation gewährleisten zu können, wurde die Lyophilisation der entwickelten PLGA-NP anhand unterschiedlicher Kriterien analysiert. Die Stabilität des erhaltenen Lyophilisats wurde durch eine anschließende Lagerstabilitätsstudie bei unterschiedlichen Klimabedingungen bewertet. Die Charakterisierung der Partikelgrößen und Partikelgrößenverteilungen mittels PCS, AUZ und TEM der PLGA-NP in Gegenwart unterschiedlicher Stabilisatoren erfolgte vor und nach der Lyophilisation sowie nach 4, 8 und 13 Wochen Lagerung bei Klimabedingungen von 4°C, 25°C/60rF und 40°C/75rF. Im dritten Teilbereich der Arbeit werden Ergebnisse zum Freisetzungsverhalten der Proteine aus den PLGA-NP dargestellt. Für die kontrollierte Freigabe der Proteine aus den Nanopartikeln spielt der Abbaumechanismus der Partikel und damit des Polymers eine bedeutende Rolle. Das Abbauverhalten der PLGA-NP wurde daher zunächst über die Veränderung der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung mittels PCS und AUZ untersucht. Dafür wurden PLGA-NP unterschiedlichster Formulierungen bis zu 100 Tage beobachtet und analysiert. Ein wichtiges Ziel dieser nanopartikulären Systeme ist die Freisetzung des Antikörpers über die gewünschte Zeit, damit eine pharmakologische Wirkung erzielt werden kann. Dafür wurden ebenso PLGA-NP unterschiedlichster Formulierungen in einem geeigneten Freisetzungsmedium mittels verschiedener Freisetzungsmodelle und analytischer Methoden untersucht. Neben unterschiedlichen Proteinen wurde auch der Proteinzustand, das Polymer sowie der Zusatz von Hilfsstoffen variiert. Im letzten Teil der Arbeit wurde die biologische Wirkung der Antikörperbeladenen PLGA-NP in Zellkulturversuchen ermittelt. Die Nanopartikel wurden hier auf ihren antiangiogenen Effekt mittels „Attachment- und Detachment-Assay“ sowie auf zellspezifische Bindung und Zellaufnahme mittels FACS und CLSM untersucht. Des Weiteren wurde ein präklinischer Transwell-Versuch entwickelt, um einen biologischen Nachweis des „sustained release“-Effektes der PLGA-NP zu erbringen. Auf Basis dieser Arbeit und der Erkenntnisse vorangegangener Studien scheint es möglich, gut charakterisierte Antikörper-beladene PLGA-NP zur Tumortherapie mit einer pharmakologischen Wirkung zu etablieren und für weiterführende präklinische Untersuchungen einzusetzen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Nanopartikeln als Trägersysteme für nukleosidische Arzneistoffe. Ihr Einsatz verhindert z.B. die Degradierung der Nukleoside und verbessert ihre Aufnahme in Zellen. Die Partikel wurden aus humanem Serumalbumin (HSA) durch Desolvatation hergestellt und mittels Glutaraldehyd stabilisiert. Durch die Kopplung von Trastuzumab an die Partikeloberfläche können HER2-überexprimierende Brustkrebszellen spezifisch erreicht werden. Bindet der Antikörper an den HER2-Rezeptor, kommt es zu einer Internalisierung des Ligand-ezeptorkomplexes und an den Liganden gebundene Partikel werden zusammen mit dem Komplex in die Zellen aufgenommen. Die Kopplung von Trastuzumab an die Oberfläche der HSA-Nanopartikel über eine Thioetherbindung war sehr effizient und stabil.Die Stabilität von Partikelsystemen über lange Lagerzeiten kann durch Gefriertrocknung erhöht werden. Zur Gefriertrocknung trastuzumabmodifizierter Partikel wurden Trehalose, Sucrose und Mannitol in Konzentrationen bis 5% als Hilfsstoffe eingesetzt. Trehalose und Sucrose waren bereits in einer Konzentration von 3% in der Lage, die physikochemischen Eigenschaften der Partikel direkt nach der Gefriertrocknung zu erhalten, die Partikel waren aber nicht lagerfähig. Mit Mannitol war dies direkt nach der Gefriertrocknung auch bei einer Konzentration von 5% nicht in gleichem Umfang möglich, die Partikel konnten aber am besten gelagert werden. Als nukleosidische Wirkstoffe wurden In die Matrix von HSA-Nanopartikeln unter anderem Antisenseoligonukleotide (ASOs) eingebettet. Das inkorporierte ASO P12 gehört zur Gruppe der Phosphorothioate (PTOs) und bewirkt eine Reduktion der Polo-like Kinase 1 (Plk1) auf mRNA- und Proteinebene. Plk1 ist wesentlich an der Zellteilung beteiligt und wird in vielen Tumoren überexprimiert, eine Hemmung von Plk1 führt zur Apoptose der Zellen. Damit das PTO eine Wirkung zeigen kann, muss es intrazellulär aus den Partikeln freigesetzt werden. Deshalb wurden die Partikel enzymatisch abgebaut. Die Wiederfindung der PTOs aus der abgebauten Partikelmatrix betrug maximal 30% und war von der Menge des zur Partikelstabilisierung verwendeten Glutaraldehyds abhängig. Je mehr Glutaraldehyd verwendet worden war, desto schlechter war die Wiederfindung. Eventuell werden die PTOs durch Glutaraldehyd inaktiviert, indem es zu einer Quervernetzung untereinander oder mit Albuminmolekülen kommt. Dennoch konnte in Brustkrebszelllinien eine biologische Wirkung der PTO-beladenen Partikelsysteme gezeigt werden. P12-beladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt HER2-überexprimierende Zellen aufgenommen. Die Partikel reduzierten die Menge der Plk1-mRNA signifikant. Dies ging mit einer ebenfalls signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge einher. Die Folge der Plk1-Reduktion war eine Aktivierung der Caspasen 3 und 7, die die Induktion der Apopotose zeigte. Plk1 kann nicht nur durch PTOs, sondern auch durch Plasmid-DNA, die small hairpin RNA (shRNA) gegen Plk1 exprimiert, gehemmt werden. Die Plasmide blieben bei der Einbettung in die Partikelmatrix intakt, allerdings trat eine Umformung von der supercoiled in die lineare und zirkuläre Form auf. Auch plasmidbeladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt in HER2-überexprimierende Zelllinien aufgenommen und führten dort zu einer signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge. Als weiterer nukleosidischer Wirkstoff wurde noch eine siRNA gegen Plk1 in die HSA-Partikel inkorporiert. Mit siRNA-beladenen Nanopartikeln konnte ebenfalls eine signifikante Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge beobachtet werden. Partikel aus HSA können nicht nur durch den Einsatz von Glutaraldehyd stabilisiert werden, eine thermische Quervernetzung der Partikelmatrix ist ebenfalls möglich. Die besten physikochemischen Eigenschaften PTO-beladener Partikel wurden bei einer Quervernetzungstemperatur von 105°C über 10 min erzielt. Wurden diese Partikel enzymatisch abgebaut und das PTO aus der Partikelmatrix bestimmt, so konnten bis zu 80% des eingebetteten PTOs intakt detektiert werden. Allerdings waren die Partikel weniger stabil als chemisch quervernetzte Partikel. Bei einer Einlagerung über 6 Wochen stieg der Partikeldurchmesser an, 25% des eingebetteten P12s wurden aus der Matrix freigesetzt und bis zu 20% des Trastuzumabs wurden von der Oberfläche abgelöst. Dennoch war die Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge in der Zellkultur signifikant und mit der von chemisch stabilisierten Partikeln vergleichbar. Trastuzumabmodifizierte HSA-Nanopartikel stellen somit ein geeignetes Trägersystem für nukleosidische Arzneistoffe dar und führen zu einer spezifischen Wirkung in HER2-überexprimierenden Brustkrebszellen.
In dieser Studie wurden drei Patientenkollektive der pädiatrischen Gerinnungsambulanz der Uniklinik Frankfurt auf das Vorhandensein von Antiphospholipid-Antikörpern (APA) untersucht: 1.) Kinder mit verlängerter PTT (n=121) 2.) Kinder mit Z.n. cerebralen Infarkten (n=20) 3.) Kinder mit Z.n. venösen Thrombosen (n=29) Diese drei Kollektive wurden mit drei dem jeweiligen Patientenkollektiv alters- und geschlechtsentsprechenden Kontrollkollektiven verglichen: 1.) Kontrollgruppe A: das dem Kollektiv mit Kindern mit verlängerter PTT entsprechende Kontrollkollektiv (n=25) 2.) Kontrollgruppe B: das dem Kollektiv mit Kindern mit cerebralen Infarkten entsprechende Kontrollkollektiv (n=20) 3.) Kontrollgruppe C: das dem Kollektiv mit Kindern mit Thrombosen entsprechende Kontrollkollektiv (n=29) Der statistische Vergleich zwischen den Patientenkollektiven und dem jeweils entsprechenden Kontrollkollektiv erfolgte mit dem Fisher´s exact Test oder dem Wilcoxon-Mann-Whitney-UTest. Es wurden folgende Parameter bestimmt, um die Patienten und die Kontrollen als „Antiphospholipid-Antikörper-positiv“ bzw. „Antiphospholipid-Antikörper-negativ“ zu klassifizieren: Die Anticardiolipine (ACL) IgG und IgM, die Anti-ß2-Glykoproteine I (Anti-ß2GP I) IgG, IgM und IgA, Lupus Screen, Lupus Ratio und die PTT. Bei einzelnen Patienten konnten als weitere Bestätigungstests ebenfalls KCT und ICA herangezogen werden. Als „APA-positiv“ wurden diejenigen Kinder eingestuft, die erhöhte mittels ELISA bestimmte ACL oder Anti-ß2GP I hatten und/oder die positive, über die PTT als Screeningtest und den Lupus Screen und die Lupus Ratio als Bestätigungstests ermittelte Lupusantikoagulantien (LA) hatten. Als Grenzwerte wurden für die ACL und die Anti-ß2GP I die 95. Percentilen der drei Kontrollkollektive berechnet, wobei diese Werte, mit Ausnahme der Anti-ß2GP I, deutlich unter den Grenzwerten des Testherstellers lagen. Für die PTT, den Lupus Screen, die Lupus Ratio, die KCT und den ICA wurden als Grenzwerte die Testherstellerangaben übernommen. APA wurden bei 53/121 Kindern mit verlängerter PTT, bei 13/20 Kindern mit cerebralen Infarkten und bei 16/29 Kindern mit Thrombosen diagnostiziert und traten in allen drei Patientenkollektiven signifikant häufiger (p<0,05) als in dem jeweils entsprechenden Kontrollkollektiv auf. Es wurde eine Odds Ratio von 7,43 errechnet, bei positiven APA einen cerebralen Infarkt zu erleiden und eine Odds Ratio von 7,38, bei positiven APA eine venöse Thrombose zu bekommen. Die Titer der ACL IgG lagen bei den Kindern mit verlängerter PTT und bei den Kindern mit Thrombosen signifikant höher als in der Kontrollgruppe A bzw. C (p=0,002; p<0,001). Erhöht waren die ACL IgG signifikant häufiger bei den Kindern mit cerebralen Infarkten und bei den Kindern mit Thrombosen als in der Kontrollgruppe B bzw. C (p=0,044; p=0,002). Die Titer der ACL IgM lagen in allen drei Patientenkollektiven signifikant höher als in den drei Kontrollgruppen (p<0,05), und bei den Kindern mit cerebralen Infarkten waren die ACL IgM signifikant häufiger erhöht als in der Kontrollgruppe B (p=0,008). Die Titerhöhe der Anti-ß2GP I IgG, IgM und IgA war in keinem der Patientenkollektive signifikant höher als in den Kontrollgruppen. Auch waren Anti-ß2GP I IgG, IgM und IgA in keinem der Patientenkollektive signifikant häufiger erhöht als in der entsprechenden Kontrollgruppe. Die Werte des Lupus Screens lagen in keinem der Patientenkollektive signifikant über denen des entsprechenden Kontrollkollektivs, jedoch wurde bei den Kontrollen im Gegensatz zu den Patienten kein einziger positiver Lupus Screen durch eine erhöhte Lupus Ratio bestätigt, sodass, auch unter Berücksichtigung der PTT, der KCT und des ICA, bei den Kindern mit verlängerter PTT signifikant häufiger LA nachgewiesen wurden als in der Kontrollgruppe A (p=0,003). Bei den Kindern mit Thrombosen waren LA häufiger positiv als in dem Kontrollkollektiv C, aber ohne Signifikanz (p=0,068). APA scheinen eine wichtige Rolle in der Thrombophilie-Diagnostik zu spielen, wobei wir einen statistischen Zusammenhang zwischen ACL und Thrombosen sowie zwischen ACL und cerebralen Infarkten fanden. Auch können vermutlich APA in vielen Fällen für eine verlängerte PTT bei ansonsten klinisch unauffälligen Kindern verantwortlich gemacht werden. Ob es von Bedeutung ist, bei einem Thrombophilie-Screening bzw. zur Abklärung einer TTVerlängerung die Anti-ß2GP I zu bestimmen, wird durch unsere Studie in Frage gestellt.
Antiproliferative und proapoptotische Mechanismen des Morphins - Konsequenzen für die Krebstherapie
(2008)
Im Rahmen dieser Arbeit sollte geprüft werden, ob Morphin in der Prostatakarzinomtherapie eingesetzt werden kann. Prostatakrebs ist bei Menschen eine der vier häufigsten aber kaum therapierbare Krebserkrankung. Nach dem Wiederauftreten des Karzinoms weist diese eine extrem hohe Mortalitätsrate auf. Morphin hemmt in MCF7-Zellen, die wie Prostatakarzinome zu den Adenokarzinomen gehören, das Tumorwachstum bei klinisch relevanten Plasmakonzentrationen und weist einen scheinbar μ-Opioid-Rezeptor unabhängigen antiproliferativen Effekt auf. In Kombination mit Naloxon kann dieser Effekt noch gesteigert werden. Somit könnte in Patienten das Tumorwachstum gehemmt werden, ohne die klassischen Nebenwirkungen hervorzurufen. Für den antiproliferativen Effekt ist die Stabilisierung von p53 notwendig. Prostatakarzinome schienen für eine Therapie mit Morphin prädestiniert, da p53 nur sehr selten in diesen Karzinomen mutiert ist. Für die Experimente wurde die LNCAP Prostatakarzinomzelllinie eingesetzt. Da Morphin weder das Tumorwachstum, noch die Zellproliferation in LNCAP-Zellen hemmte, scheint Morphin für die Behandlung von Prostatakarzinomen nicht geeignet zu sein. Durch Untersuchung der Angiogenese in LNCAP Tumoren konnte gezeigt werden, dass eine geringere Vaskularisierung keine verminderte Tumormasse zur Folge hat. Für eine erfolgreiche Krebstherapie scheint es im Gegenteil wichtig zu sein, eine normale Vaskularisierung in Tumoren wiederherzustellen. Die unterschiedlichen Morphinsensitivitäten der beiden Adenokarzinomzelllinien führte zu der Hypothese, dass der μ-Opioid-Rezeptor - zumindest partiell - doch an der Vermittlung des antiproliferativen Effekts des Morphins beteiligt sein könnte. Morphin induziert verschiedene Effekte in MCF7-Zellen, während LNCAP-Zellen kaum auf Morphin reagierten. Es sollte daher untersucht werden, warum MCF7-Zellen sensitiver auf Morphin ansprechen. Durch Überlebenstests mit MCF7-Zellen konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung der Zellen mit Morphin in Kombination mit exogenem Glutathion das Überleben der MCF7-Zellen im Vergleich zu morphinbehandelten Zellen signifikant steigern konnte. Dies war ein Hinweis, dass Morphin erstens die Bildung von ROS induziert und dies zweitens in einem Ausmaß geschieht, dass die Überlebensrate der MCF7-Zellen konzentrationsabhängig gehemmt wurde. In weiteren Experimenten zeigte sich, dass die Inkubation der MCF7-Zellen mit Morphin weder die endogene Glutathionkonzentration noch die Expressionsraten der detoxifizierenden Enzyme SOD1 und P5 moduliert. Morphin induziert bei Konzentrationen von 100 μM und 1000 μM in MCF7-Zellen eine signifikant gesteigerte Superoxidanionenbildung. Wie bei den MCF7 Überlebenstests konnte exogen gegebenes Glutathion die durch 100 μM Morphin induzierte Superoxidanionenbildung unterdrücken. Die verstärkte Bildung der Superoxidanionen ist auf Morphin beschränkt, da sie nicht durch die Gabe von Fentanyl, Levomethadon oder Oxycodon induziert werden konnte. Die Bildung der Superoxidanionen könnte Morphin durch die Modulation einer plasmamembranständigen NADH Oxidase hervorrufen. Weiterhin wurden die Folgen einer chronischen Morphingabe im Rückenmark untersucht. Es wird vermutet, dass Morphin im Rahmen einer chronischen Behandlung Apoptose in GABAergen Neuronen auslöst. Für die neuronenspezifische Apoptose nach chronischer Morphingabe konnten durch FACS-Analysen ebenfalls Hinweise gefunden werden. Mittels vergleichender Proteomanalyse konnte festgestellt werden, dass VDAC1 im Rückenmärkgewebe von Tieren, die eine beginnende Morphintoleranz aufweisen, verstärkt exprimiert wurde. Neue Untersuchungen zeigen, dass VDAC1 in der Plasmamembran als Redoxenzym fungieren kann. Dort ist es mit einer NADH Oxidase in den PMOR Komplex eingebunden, der eine wichtige Rolle in der Regeneration von NAD+ aus NADH spielt und so Überleben und Zellwachstum ermöglicht. Eine Störung des PMOR Komplexes hat die Bildung von Radikalen zur Folge. In dieser Arbeit wird die Hypothese aufgestellt, dass Morphin durch Modulation der plasmamembranstädnigen NADH Oxidase in MCF7-Zellen die Bildung von Superoxidanionen induziert. Als Konsequenz könnte VDAC1 verstärkt phosphoryliert werden, um die NAD+/NADH Homöostase aufrecht zu erhalten. Im Laufe der chronischen Morphingabe wird postuliert, dass sich derart viele Superoxidanionen akkumulieren, dass schwerwiegende Schäden an den Makromolekülen vorliegen und die Zelle daher in die Apoptose geht.
Bei dieser Studie wurde die antivirale Effektivität, sowie die Verträglichkeit von einem selektiven NS3/4A Protease-Inhibitor als Monotherapie und in Kombination mit Peginterferon alfa-2a über einen Behandlungszeitraum von 14 Tagen evaluiert. Bezüglich der Hepatitis unvorbehandelte Patienten mit einer Genotyp 1 Infektion wurden in unterschiedliche Therapiearme randomisiert: (i) Placebo und Peginterferon alfa-2a (n=4), (ii) Telaprevir Monotherapie (n=8) oder (iii) Telaprevir in Kombination mit Peginterferon alfa-2a (n=8). Telaprevir wurde in oraler Tablettenform mit jeweils 750 mg alle 8 Stunden verabreicht und Peginterferon alfa-2a wurde einmal wöchentlich 180 μg subkutan injiziert. Bei der Studie zeigte sich ein medianer Abfall der HCV RNA von Beginn der Therapie bis zu letztem Behandlungstag 15 von -1.09 log10 (Bereich: -2.08 log10 und -0.46 log10) in der Placebo und Peginterferon alfa-2a-Gruppe; -3.99-log10 (Bereich: -5.28 und -1.26) in der Telaprevir-Gruppe, und -5.49-log10 (Bereich: -6.54 und -4.30) in der Kombinations- Gruppe mit Telaprevir plus Peginterferon alfa-2a. Bei 4 Patienten, die mit Telaprevir und Peginterferon alfa-2a behandelt wurden, war die HCV RNA an Tag 15 nicht mehr nachweisbar und bei einem Patienten, der initial mit Telaprevir behandelt wurde. Insgesamt kam es unter der Therapie zu keinem viralen Durchbruch unter der Kombination mit Telaprevir und Peginterferon alfa-2a während der 14-tägigen Behandlung innerhalb der Studie. Die meisten Nebenwirkungen waren von milder Intensität und es kam zu keinen schwerwiegenden Nebenwirkungen oder vorzeitigen Therapieabbrüchen. Die Studie zeigte eine potente antivirale Wirksamkeit von Telaprevir als Monotherapie und bei der Kombination mit Peginterferon alfa-2a kam es zu einer gesteigerten antiviralen Aktivität. Bereits aufgrund dieser Ergebnisse initiierte, größere Studien werden nun evaluieren, ob Telaprevir in Kombination mit Peginterferon alfa und Ribavirin die dauerhaften antiviralen Ansprechraten verbessern kann.
Die Entwicklung von Wirkstoffträgern für Antisense-Oligdesoxyonukleotide auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln stellt einen interessanten Ansatz für antivirale Strategien dar. So konnte gezeigt werden, dass bereits ab einem 1,5-fachen Massenüberschuss an Protamin eine spontane Komplexbildung mit Antisense-Wirkstoffen stattfindet, die einen Größenbereich von etwa 200 nm aufweisen und durch eine Oberflächenladung von ca. + 20 mV charakterisiert sind. Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften besitzen diese Nanopartikel nahezu ideale Eigenschaften, die intrazelluläre Verfügbarkeit von Antisense-Wirkstoffen entscheidend zu verbessern. Eine sehr gute zelluläre Aufnahme von Protamin/Antisense-Nanopartikeln konnte entsprechend in primären humanen Makrophagen als auch in lymphozytären T-Zellen gezeigt werden. Die Anwendung dieser Wirkstoffträger in den beschriebenen Zellen erwies sich dabei als sehr gut verträglich und zeigte keine toxischen Wirkungen in insgesamt drei unterschiedlichen Testverfahren zur Bestimmung der Zelltoxizität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Protamin/Antisense-Nanopartikel mit unmodifizierten Antisense-Oligodesoxynukleotiden ein sehr günstiges intrazelluläres Auflösungsverhalten besitzen, was zu einer kontinuierlichen Freisetzung des inkorporierten Antisense- Wirkstoffs führte. Dabei wurde deutlich, dass nach spätestens 72 Stunden ein vollständiger Zerfall des Nanopartikels stattfand und der Wirkstoff sich gleichmäßig in intrazellulären Kompartimenten verteilte. Im Gegensatz dazu stellen Protamin/Antisense-Nanopartikel mit modifizierten Phosphorothioat-Wirkstoffen ein äußerst stabiles System dar, das zu keiner merklichen intrazellulären Wirkstofffreisetzung selbst nach 72 Stunden führte. Es konnte gezeigt werden, dass Protamin/AS-ODN-Nanopartikel die Expression eines von einem lentiviralen Vektor exprimierten Reportergens konzentrationsabhängig in primären humanen Makrophagen inhibieren konnte. Die antivirale Wirksamkeit dieser Wirkstoffträger konnte auch gegen das HIV-1-spezifische Transaktivatorprotein Tat in transient transfizierten Zielzellen der HIV-1-Infektion spezifisch demonstriert werden. Hier wurde eine selektive Inhibition der Tat-vermittelten Transaktivierung von 35 % bei einer Konzentration von 2 MikroM in Jurkat-Zellen nachgewiesen. Auch in primären Makrophagen, die mit einem HIV-1-Wildtypisolat infiziert wurden, führte die Anwendung von Protamin/AS-ODN-Nanopartikeln mit spezifischen Sequenzen gegen ein HIV-1-Gen zu einer deutliche Reduktion der Virusausbreitung in der Kultur. Bei einer wiederholten Behandlung von HIV-1-infizierten Makrophagen mit Protamin/AS-ODN-Nanopartikel in einer Konzentration von 2 MikroM zeigten nur einige wenige Zellen eine Infektion mit dem Virus, während sich in unbehandelten Zellen eine komplett durchinfizierte Kultur manifestiert hatte. Entsprechend der ungünstigen Bioverfügbarkeit von AS-PTO-Wirkstoffen nach intrazellulärem Transport in Form von Protamin-Nanopartikeln konnte für diese Formulierungen keine biologische Wirkung in Zellkultursystemen nachgewiesen werden. Die Inkorporation von destabilisierenden Zusätzen in die Nanopartikelmatrix bietet hier Möglichkeiten, die intrazelluläre Dekomplexierung dieser Wirkstoffträger günstig zu beeinflussen. Als Neuentwicklung konnte ein kolloidales Trägersystem für siRNA-Wirkstoffe auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln entwickelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Protaminbase als auch Protaminsulfat siRNA-Wirkstoffe ab einem 2,5-fachen Massenüberschuss komplexieren. Protamin basierte Nanopartikel für siRNA-Wirkstoffe waren durch ein sehr günstiges Zellaufnahmeverhalten und fehlende zytotoxische Wirkung in primären humanen Makrophagen gekennzeichnet. Trotz dieser idealen Ausgangsbedingungen zeigten biologische Wirksamkeitstestungen sowohl gegen das endogene Protein Lamin A/C als auch virale Hemmversuche in HIV-1- infizierten primären Makrophagen nur marginale Effekte. Eine weitere Optimierung der Nanopartikelzusammensetzung und Untersuchungen zur intrazellulären Stabilität sind nötig, um die biologische Aktivität dieser Formulierungen entscheidend zu verbessern. Oberflächenmodifizierte Nanopartikel auf der Basis von Gelatine erwiesen sich in den durchgeführten Experimente als besonders vielversprechend. Hier konnte gezeigt werden, dass ein spezifisches Targeting von T-Zellen mit CD3-Gelatine-Nanopartikel realisiert werden kann, die auf ihrer Oberfläche kovalent einen anti-CD3-Antikörper tragen, der gegen die T-Zell spezifische Zeta-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes gerichtet ist. Untersuchungen mit konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie zeigten, dass dabei die Zellaufnahme dieser Wirkstoffträger von der Expression des durch den Antikörper erkannten Zielantigens auf der Oberfläche der Zielzellen ist. In Zellen mit besonders starker Expression des CD3-Epitops wurden Gelatine-Nanopartikel mit oberflächengebundenem anti-CD3-Antikörper zu einem sehr bedeutendem Ausmaß selektiv aufgenommen. In Kompetitionsexperimenten mit freiem anti-CD3-Antikörper konnte diese Aufnahme deutlich reduziert werden, was für die selektive Bindung und Internalisierung der CD3-Gelatine- Nanopartikel über den oberflächengebundenen Antikörper schließen läßt. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD3-Gelatine-Nanopartikel das Potential besitzen, als selektives Wirkstoffträgersystem für T-Zellen eingesetzt zu werden.
Die zunehmende Resistenzentwicklung bei der Therapie gegen Herpes Simplex Viren vom Typ-1, besonders bei immundefizienten Patienten, erfordert die Entwicklung von Therapie-Alternativen. In Anlehnung an die Erkenntnisse der Traditionellen Chinesischen Medizin, die sich die Wirksamkeit von Heilpflanzen zu Nutze macht, wurde in dieser Arbeit das antivirale Potential von Extrakten aus Rheum Spezies gegen HSV-1 untersucht. Rheum oder Rhabarber gehört zur Familie der Polygonaceae. Die hier verwendeten Extrakte stammen aus den Wurzeln und Rhizomen von Rheum palmatum L. und Rheum rhaponticum, welche ursprünglich aus Asien stammende Heilpflanzen sind. Rheum ist reich an polyphenolen Inhaltsstoffen der Gruppe der Flavonoide und Tannine, welche Gegenstand der Forschung sind und denen schon vielfache pharmakologische Wirkungen zugesprochen wurden. Die antivirale Wirksamkeit von Rheum wurde bislang nur in der chinesischen Literatur veröffentlicht, wo bestimmte Untersuchungen mit HBV und HSV vorgenommen wurden. Hier wurde in einem Zellkulturmodell mit Vero-Zellen eine antivirale Testung vorgenommen. Die Auswirkungen der Rheum Extrakte auf den durch HSV-1 verursachten zytopathischen Effekt wurden untersucht. Eine Verminderung oder das Fehlen des CPE wurde als antivirale Wirksamkeit gewertet. In zwei Versuchsreihen, einmal mit simultaner Beimpfung der Vero-Zellen mit Virus in einer MOI von 0,01 und Extrakten in Konzentrationen von 500µg/ml bis 4µg/ml und dann mit viraler Vorinkubation von 1, 6 und 24 Stunden wurde das Verhalten der Zellen beobachtet. Unter dem Auflichtmikroskop wurde das Ausmaß des CPE beurteilt und anschließend mit Hilfe des Computerprogramms CalcuSyn die IC50 Werte berechnet. Der Wert der 50% inhibitorischen Konzentration sagt aus, bei welcher Extraktkonzentration 50% der Zellen einen CPE aufweisen und ist somit Maß für die antivirale Wirksamkeit. Weiterhin wurden die Rheum Extrakte mittels MTT-Assay auf ihre Zytotoxizität hin untersucht und der TC50 Wert als Maß der Toxizität berechnet. Der aus IC50 und TC50 berechnete Therapeutische Index setzt Wirksamkeit und Toxizität in Relation und ist ein Wert für die mögliche Validität einer Substanz. Je höher dieser Wert, desto viel versprechender die Substanz. Besonders Extrakte 9, 10 und 17 bedürfen der genaueren Betrachtung, da sie in der vorliegenden Untersuchung Therapeutische Indexe von >12, >9,8 und >17,9 gezeigt haben. Dies deutet auf ein antivirales Potential, bei keiner nachweisbaren Zytotoxizität in verwendeten Konzentrationen, hin. Im Vergleich zeigte Aciclovir einen TI von 22. Mit diesen drei Substanzen wurde der Versuch dann mit viraler Vorinkubation von 1, 6 und 24 Stunden wiederholt. Vor Allem Extrakt Nr. 17 zeigte auch bei Vorinkubation von einer und sechs Stunden mit einem IC50 von 80µg/ml und 95,5 µg/ml eine signifikante Reduktion des CPE. Dies gibt einen Hinweis auf die mögliche Art des Wirkmechanismus, denn Zeichen der Wirksamkeit trotz Vorinkubation sprichen für eine Intervention im späteren Stadium des viralen Replikationszyklus. Problematisch ist die Übertragung der hier ermittelten in vitro Ergebnisse auf in vivo Verhältnisse. Allerdings sind die Ergebnisse vielversprechend und eine weiterführende Untersuchung erscheint lohnenswert. Hier ist vor Allem die genaue Charakterisierung und Isolierung der Inhaltsstoffe der wirksamen Extrakte notwendig. Nachfolgend könnte die Wirksamkeit der ermittelten Polyphenole in einem Tierversuch verifiziert werden.
Trotz einer fast 30-jährigen Forschungs- und Umsetzungshistorie stellen Projekte zum Aufbau integrierter Datenhaushalte (Data Warehouses) für Unternehmen immer noch eine große Herausforderung dar. Gerade in Data Warehouse-Projekten bei Finanzdienstleistern führt eine hohe semantische Komplexität häufig zu Projektverzögerungen oder zum Scheitern der Vorhaben. Dies zeigt die Arbeit anhand von explorativen Fallstudien auf und fragt nach den Gründen für diesen typischen Verlauf. Eine mögliche Ursache liegt in einer unzureichenden Kommunikation zwischen den Projektbeteiligten, was zu Missverständnissen in der Konzeption und somit zu Fehlimplementierungen führt, die – gerade wenn sie spät erkannt werden – deutliche Verzögerungen und Budgetüberschreitungen zur Folge haben. Ausgehend von diesen beobachteten Praxisproblemen sucht die vorliegende Arbeit auf der Grundlage des Design-Science-Research nach Lösungsansätzen: unter Übertragung der Erkenntnisse der Kommunikationstheorie wurden drei Artefakte entwickelt, sukzessive verbessert und validiert. Die Paper zeigen auf, dass sich durch den Einsatz formalisierter Templates, eines verbesserten Vorgehensmodells in Verbindung mit einem korrespondieren Softwaretool das Kommunikationsverhalten in den Projekten verbessern lässt und somit eine höhere Projekt-Performance erreicht wird. Hierzu wurden insgesamt sechs Projekte zum Aufbau von Data Warehouses im Finanzdienstleistungsumfeld in Fallstudien analysiert und zudem Experten-Interviews mit den Projektbeteiligten durchgeführt, die im Ergebnis die positive Wirkung der Artefakte unterstützen.
Die Induzierte Polarisation (IP) ist ein geoelektrisches Verfahren und wurde ursprünglich zur Exploration von Erzvorkommen entwickelt. Neben metallischen Leitern, tragen auch Tonminerale, der Porenraum und die chemische Zusammensetzung der Porenlösung zur Polarisierbarkeit eines Unter-grundes bei. Die spektrale Induzierte Polarisation (SIP) untersucht die Polarisierbarkeit in einem Frequenzbereich von 1 mHz bis 1 kHz und nutzt diese aufgezeichneten Spektren zur Unterscheidung von Materialien. Früher mit einem enormen messtechnischen Aufwand verbunden, führte der gerätetechnische Fort-schritt in den letzten beiden Jahrzehnten dazu, dass die SIP vermehrt in der Umweltgeophysik zum Einsatz kommt. Zu den Fragestellungen gehören die Detektion von Altlasten und der Grundwasser-schutz. In der Archäologie ist die Induzierte Polarisation bislang ein kaum verwendetes Verfahren. Im Rahmen des Graduiertenkollegs „Archäologische Analytik“ der J. W. Goethe- Universität wurde die Entwicklung einer Multielektroden-Apparatur SIP-256 begonnen. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Fortführung dieser Entwicklung. Da sich die wissenschaftliche Fragestellung während dieser Promotion auf die Erkundung archäologischer Objekte beschränkt, galt es zunächst automatisierte Messabläufe zu realisieren, die es erlauben, die komplexe elektrische Leitfähigkeit kleinräumiger 2D- bzw. 3D-Strukturen zu erfassen. Die Verwendung der SIP-256 führte zu einer erheblichen Ver-kürzung der Messzeit und war entscheidend für die Realisierung dieser Arbeit. Den zweiten Schwerpunkt der Arbeit bildet die Suche nach Anwendungsgebieten für die SIP innerhalb der archäologischen Prospektion. Basierend auf den Ursachen von Polarisationseffekten werden im Rahmen dieser Arbeit drei Anwendungsgebiete vorgestellt. Das erste Anwendungsgebiet nutzt die Vorteile der SIP bei der Prospektion von Erzen. Auf einem mittelalterlicher Verhüttungsplatz bei Seesen am Harz konnten im Vergleich zu einer konventionellen Widerstandsmessung mehr Schlackegruben lokalisiert werden. Während einer deutsch-bulgarischen Grabungskampagne in Pliska (Bulgarien) 1999 gelang es, durch eine flächenhafte Anwendung der IP einen Siedlungshorizont über Lehmablagerungen nachzuweisen. Die Überreste eines Gebäudes erzeugten einen messbaren Polarisationseffekt. Die frühmittelalterlichen Siedlungsreste befinden sich mit 2 bis 3 m in relativ großer Tiefe und konnten bei einer anschließenden Ausgrabung freigelegt werden. Eine Kernfrage war, ob Holzobjekte mit Hilfe der SIP zu detektieren sind. Mit Hilfe von Labormessungen an der TU Clausthal konnte geklärt werden, dass Holz ein polarisierbares Material ist. Zu den untersuchten Proben gehören Hölzer aus einem bronzezeitlichen Bohlenweg, die von Ausgrabungen im Federseemoor (Kreis Biberach) stammen. Durch die Untersuchungen im Labor motiviert, folgte eine Feldmessung über dem Bohlenweg. Es gelang, erstmals ein Holzobjekt mit spektraler Induzierter Polarisation zu detektieren. Holz spielt durch die dendrochronologische Datierung von Fundstellen eine wichtige Rolle, konnte aber bislang noch mit keiner geophysikalischen Methode zufriedenstellend prospektiert werden. Abschließend kann gesagt werden, dass sich die spektrale Induzierte Polarisation als wertvolle Methode in der archäologischen Prospektion etablierte. Strukturen, welche mit einer konventionellen Widerstandsmessung nicht zu erkennen waren, konnten durch die SIP eindeutig identifiziert werden. Natürlich müssen die vorliegenden Ergebnisse noch durch weitere Messungen bestätigt werden, jedoch zeichnet sich ab, dass sich mit der fortschreitenden gerätetechnischen Entwicklung, welche zu schnelleren Messabläufen führt, wichtige Zusatzinformationen durch die spektrale Induzierte Polarisation gewinnen lassen.
Arzneistoffe sind mit einer Vielzahl an anorganischen Elementen im Spurenbereich kontaminiert. Die Elementspuren finden durch Korrosion der Werkstoffoberflächen, durch Emaillierfehler sowie durch die eingesetzten Chemikalien Eintrag in das Produkt und können durch TXRF- Messungen quantifiziert werden. Über eine Bestimmung der anorganischen Elemente durch TXRF (fingerprint- Analyse) können anhand einer Mustererkennung Arzneistoffchargen unterschieden oder gar entsprechenden Validierungen zugeordnet werden. Die experimentellen Untersuchungen zeigen, daß eine Erfassung von anorganischen Elementspuren in Arzneistoffen durch TXRF nur nach einem Abbau der organischen Matrixanteile in niedermolekulare und leicht flüchtige Verbindungen erfolgen kann. Eine Quantifizierung der anorganischen Spurenbestandteile durch ein direktes Vermessen der Proben ist nicht möglich. Die organischen Matrixanteile führen auf dem Probenträger zu starken Trocknungsrückständen und hohen Comptonstreuquerschnitten. Die durch den Comptoneffekt verursachte Streustrahlung begrenzt die Erfassung von anorganischen Elementen auf Nebenbestandteile. Eine Erfassung von anorganischen Elementen im Nanogramm- Bereich kann nicht erfolgen. Nebengruppenelemente und Elemente mit hohen Ordnungszahlen zeigen dabei gegenüber leichten Elementen aufgrund ihrer größeren Fluoreszenzintensität und energiereichen sekundären Röntgenstrahlung eine höhere Nachweisempfindlichkeit. Aufgrund der hohen Reichweite von harten Röntgenstrahlen in Materie konnte zudem ein Einfluß organischer Matrixanteile auf die Wiederfindungsrate von schweren Elementen nicht beobachtet werden. Leichte Elemente können dagegen aufgrund ihrer weichen sekundären Emissionsstrahlung und die damit verbundenen Absorptionseffekte in organischen Matrices nur unbefriedigend quantifiziert werden. Das Abtrennen der organischen Matrixanteile kann durch einen Naßaufschluß mit Salpetersäure in einem geschlossenen System unter konventioneller und mikrowellenunterstützter Wärmezufuhr sowie durch ein Sauerstoffplasma erfolgen. Die Effizienz eines Naßaufschlusses mit Salpetersäure in einem geschlossenen Gefäß ist dabei abhängig von dem Kohlenstoff- Grundgerüst der Verbindungen. Aliphatische Kohlenwassertsoffe sowie alicyclische und aromatische Heterocyclen werden nahezu vollständig mineralisiert. Aromatische Verbindungen zeigen dagegen einen geringen Kohlenstoff umsatz. Es entstehen aromatische Nitrosoverbindungen, die unter den gegeben Bedingungen nicht weiter abgebaut werden können. Eine Erhöhung des Mineralisierungsgrades konnte auch durch die Bildung von angeregtem Sauerstoff durch Zusatz von geringen Mengen an Wasserstoffperoxid nicht beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen zudem, daß eine Quantifizierung von leicht flüchtigen Elementen in Gegenwart von Stickoxiden aufgrund von Elementverflüchtigungen nicht erfolgen kann. Sauerstoffplasmen führen unabhängig vom Kohlenstoff- Grundgerüst zu einer vollständigen Mineralisierung der organischen Matrixanteile. Infolge des hohen Oxidationspotentials von angeregtem Sauerstoff ist bei dieser Aufschlußtechnik eine quantitative Erfassung von leicht flüchtigen Elementen und Verbindungen nicht möglich.
Es wurde das Leitfähigkeitsverhalten von reinem, lufthaltigem Wasser bei kontinuierlicher und impulsgetasteter Röntgenbestrahlung (60 kV8) untersucht. Hierbei ergaben sich zwei einander überlagerte Effekte: 1. Ein der Röntgen-Dosisleistung proportionaler irreversibler Leitfähigkeitsanstieg, der vermutlich auf eine Strahlenreaktion des gelösten CO2 zurückzuführen ist, 2. eine reversible Leitfähigkeitserhöhung während der Bestrahlung, die sich mit der Entstehung einer Ionenart mit einer mittleren Lebensdauer von ca. 0,15 sec erklären läßt. Es wird angenommen, daß es sich dabei um Radikalionen O2⊖ handelt, welche durch die Reaktion der als Strahlungsprodukt entstehenden Η-Radikale mit dem gelösten Sauerstoff gebildet werden. Ein möglicher chemischer Reaktionsmechanismus wird angegeben, der zu befriedigender quantitativer Übereinstimmung der Versuchsergebnisse mit Ausbeutewerten und Reaktionskonstanten aus der Literatur führt.
Aortale Partikelfiltration zur Reduktion von neurologischen Komplikationen in der Koronarchirurgie
(2006)
Eine verminderte Neuropathogenität nach kardialen Eingriffen, die durch technischen Fortschritt erreicht werden könnte, wird durch das alternde Patientenkollektiv mit steigender Inzidenz für Arteriosklerose und erhöhtem Risiko zerebraler Komplikationen ausgeglichen. Zerebrale Dysfunktionen bleiben die häufigste Ursache für postoperative Morbidität und Mortalität. Als wichtigste Quelle partikulärer Embolien gilt die aortale Verkalkung. Der Zusammenhang zwischen partikulären Embolien und konsekutiver zerebraler Dysfunktion ist bekannt. Kritischer Zeitpunkt für die Embolisation der Gewebspartikel in das Gehirn ist die Öffnung der Aortenklemme. Es konnte gezeigt werden, dass die Platzierung eines intraaortalen Filters kurz vor Öffnung der Aortenklemme, die Inzidenz der neurologischen und neuropsychologischen Komplikationen in einer Hochrisiko-Patientengruppe reduzierte. Die vorliegende prospektiv randomisierte Studie untersuchte 50 Patienten mit niedrigem Risikoprofil, die sich im Zeitraum August 1999 bis Februar 2001 einer aortokoronaren Bypassoperation mit kardiopulmonalem Bypass, unterzogen. Bei 25 Patienten wurde der intraaortale Filter (Embol-X Inc, Mountain View, CA) eingesetzt. Zur Beurteilung der Effizienz der intraaortalen Filtration wurden neuropsychologische Untersuchungen (Mosaik-Test, Benton-Test, Zahlenverbindungs-Test, Zahlennachsprech-Test, d2-Test, Beck-Depressions-Inventar) erhoben und als laborchemisches Korrelat das S-100B-Protein und die NSE bestimmt. Die neuropsychologischen Untersuchungen wurden präoperativ, 5 Tage und 2 Monate postoperativ durchgeführt. Die Laborparameter wurden zu fünf Abnahmezeitpunkten bestimmt (vor Narkoseeinleitung, nach Beginn der extrakorporalen Zirkulation, 10 Minuten nach Öffnen der Aortenklemme, eine Stunde und 24 Stunden postoperativ) bestimmt. Die Patientengruppen zeigten hinsichtlich der demografischen und intraoperativen Daten keine statistisch signifikanten Unterschiede.Neurologische Komplikationen fanden sich in keiner der Gruppen. Die Ergebnisse der neuropsychologischen Untersuchungen zeigten im Gruppenvergleich für keinen Zeitpunkt einen signifikanten Gruppenunterschied. Die Mittelwerte des S-100B-Protein-Konzentration der Gruppe mit Filter waren zu allen Abnahmezeitpunkten niedriger als in der Gruppe ohne Filter, das Signifikanzniveau von 5% wurde nur zum Abnahmezeitpunkt nach Beginn der EKZ erreicht; es handelte sich hierbei also nicht um einen methoden-, sondern wahrscheinlich patientenbedingten Unterschied. Die Mittelwerte der NSE-Konzentration unterschieden sich im Gruppenvergleich nicht. Die Tatsache, dass sich weder aus den neuropsychologischen Untersuchungen, noch der NSE-Konzentration pathologische Werte ergaben, sehen wir im niedrigen Risikoprofil des Patientenkollektivs begründet. Bei sonst homogener Risikofaktorverteilung wurden bei 7 von 50 Patienten palpatorisch aortale Plaques oder Verkalkungen nachgewiesen (14%). Die Daten der zwei Patienten aus der Gruppe ohne Filter und der 5 Patienten aus der Gruppe mit Filter wurden gesondert ausgewertet. Trotz des erhöhten Risikos zeigte sich bezüglich der postoperativen Ergebnisse kein Unterschied. Ob dieser Risikoausgleich der intraaortalen Filtration zuzuschreiben ist, bleibt zum jetzigen Zeitpunkt eine Annahme. Zusammenfassend konnten wir in dieser Patientengruppe mit niedrigem Risikoprofil bezüglich der neurologischen und neuropsychologischen Ergebnisse keinen Behandlungsvorteil der intraaortalen Filtration feststellen. Weitere Untersuchungen von Patientengruppen mit aortaler Verkalkung oder Plaquebildung werden notwendig sein, um den Nutzen der aortalen Filtration beurteilen zu können.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Apolipoproteine des Liquors untersucht, um bestehende Zusammenhänge nachzuweisen, die eventuell später bei der Diagnose von Erkrankungen eingesetzt werden könnten. Das ApoE aller Proben wurde phänotypisiert. Die Konzentrationen des ApoJ und Apo(a) wurden mit Hilfe selbst- bzw. in der Arbeitsgruppe entwickelter ELISAs bestimmt. Durch Kombination der existierenden ELISAs konnte der von Borghini et al. 1995 beschriebene LpE-Partikel und ein bisher nicht bekannter Apolipoprotein-Partikel aus Apo(a) und ApoE nachgewiesen werden. Die relative Konzentration dieses Apo(a)/E- und des ApoJ/E-Partikels wurde bestimmt. Mit Hilfe der Kreuzimmunelektrophorese konnte nachgewiesen werden, daß die Apolipoproteine Bestandteil eines Partikels sind. Aufgrund der gefundenen Informationen wurde die These postuliert, daß es sich bei diesen Partikeln um einen gemeinsamen Partikel aus ApoE, ApoJ und Apo(a) handelt. Detaillierte Daten über den Aufbau und die Zusammensetzung des Partikels konnten bisher nicht gewonnen werden. Im Liquor wurden die Konzentrationen von ApoE, Apo(a) und ApoJ gemessen. Diese Konzentrationen wurden in Zusammenhang zu dem ApoE-Phänotyp der entsprechenden Probe gesetzt. Wo möglich wurde ApoE und Apo(a) auch im Serum der entsprechenden Patienten bestimmt. Auch diese Konzentrationen wurden in Beziehung zu ihrem ApoE-Phänotyp gesetzt. Zuletzt wurden für die Apolipoproteine E und (a) die Liquor- und Serumkonzentration in Beziehung zueinander gesetzt. Außer für das ApoE und den ApoJ/E-Partikel konnte für keines der untersuchten Apolipoproteine weder im Liquor noch im Serum ein offensichtlicher Zusammenhang zwischen der Konzentration des Apolipoproteins und dem ApoE-Phänotyp gefunden werden. Zusätzlich zu den Apolipoproteinen des Liquors wurde in Zusammenarbeit mit der Universität Dresden das Tau-Protein gemessen. Die Ergebnisse bestätigen die diagnostische Wertigkeit der Bestimmung von Protein Tau bei degenerativen Erkrankungen des ZNS. Eine Differenzierung zwischen verschiedenen degenerativen Erkrankungen des ZNS ist jedoch nicht möglich. Ein weiterer Teil dieser Arbeit untersuchte die Rolle des ApoE im Gehirn. Dabei zeigte sich, daß die Synthese des ApoE durch die Astrozyten ein sehr komplexer Vorgang sein muß. Eine weitere Untersuchung des ApoE wies die stärkere Glykolisierung im Liquor im Vergleich zum Serum nach.
Apoptose ist ein gemeinsamer Pathomechanismus vieler Autoimmunerkrankungen, so auch im Rahmen der Schilddrüsenautoimmunerkrankungen, deren häufigste Hashimoto Thyreoiditis und Morbus Basedow (Graves’ disease) darstellen. Während eine gesteigerte Apoptoserate der Schilddrüsenzellen bei Hashimoto Thyreoiditis zur Entwicklung einer Hypothyreose führt, sind es bei Morbus Basedow die infiltrierenden Lymphozyten, die durch Apoptose zu Grunde gehen, während die Schilddrüsenzellen unter dem protektiven Einfluß anti-apoptotischer Signale proliferieren können. Der zu Grunde liegende Pathomechanismus wird in der Reifung und Aktivierung des Immunsystems angenommen. Einige potentielle Ursachen sind eine insuffiziente systemische Elimination autoreaktiver Lymphozyten im Rahmen der positiven und negativen Selektion im Thymus, ein Versagen der peripheren immunological ignorance, oder eine inadäquate Aktivierung von Lymphozyten in einem pro-inflammatorischen Milieu. All diese Mechanismen können durch eine inadäquate Apoptose ausgelöst oder verstärkt werden. Die Fas/FasL-induzierte Kaskade ist einer der Haupt-Signalwege in der Apoptose-Induktion. Seine Bedeutung im Rahmen von Autoimmunerkrankungen ist vielfach untersucht, und eine Assoziation genetischer Polymorphismen in Fas und seinem Liganden wurde bereits für einige organspezifische und generalisierte Erkrankungen gezeigt (Typ I Diabetes, Multiple Sklerose, Rheumatoide Arthritis u.a.). Das genetisch vermittelte Risiko dieser Erkrankungen wird bisher vor allem der HLA DQ-Region und Polymorphismen im CTLA-4-Gen zugeschrieben. Aufgrund der funktionellen Relevanz der Fas/FasL-vermittelten Apoptose im Rahmen autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen wurden im Rahmen dieser Arbeit Kandidatengene untersucht, die von funktioneller Relevanz für die Entstehung autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen sind: die Apoptose-regulierenden Faktoren Fas, FasL und Bcl-2. 209 Familien kaukasischen Ursprungs mit insgesamt 730 Individuen, bei denen mindestens eines der Kinder an Hashimoto Thyreoiditis (n = 100) oder an Morbus Basedow (n = 109) erkrankt war, wurden genotypisiert auf zwei Polymorphismen des Fas-Gens (g-670 G-A in der Promotorregion, g-154 C-T in Exon 7), drei FasL Genpolymorphismen (C -843 T und EBP im Promotor, A IVS2nt-124 G in Intron 2) und einen Polymorphismus im Bcl-2-Gen. Nach Durchführung einer indirekten Haplotypisierung, Chi2- und Extended Transmission Disequilibrium-Test waren weder einzelne Fas- bzw. FasL-Polymorphismen noch kombinierte Haplotypen mit Hashimoto Thyreoiditis oder Morbus Basedow assoziiert. Bei der Analyse des Bcl-2 Polymorphismus ergab sich eine Tendenz zu einer Assoziation des G-Allels mit beiden Thyreopathien. Subgruppen-Analysen (männliche vs. weibliche Patienten, CTLA-4-Genotypen, DQ-Haplotypen) ergaben keinen weiteren Informationsgehalt, die Daten italienischer und deutscher Familien unterschieden sich ebenfalls nicht. Zusammenfassend ergeben die Daten keinen signifikanten Beitrag der untersuchten Varianten in Bcl-2, Fas oder FasL zum genetischen Risiko autoimmuner Schilddrüsenerkrankungen. Zur Entwicklung möglicher diagnostischer und therapeutischer Optionen für autoimmune Schilddrüsenerkrankungen wird die Untersuchung weiterer funktionell bedeutsamer Regulatoren der apoptotischen Signaltransduktionswege von Bedeutung sein.
Der Behandlungserfolg maligner Erkrankungen mit konventionellen Chemotherapeutika wird durch hohe Morbiditäts- und Mortalitätsraten infolge schwerer Nebenwirkungen aufgrund der unselektiven Wirkung auf den proliferierenden Zellpool und durch zunehmende Resistenzentwicklungen gegen das jeweils eingesetzte Therapeutikum limitiert. Zusätzlich wirken konventionelle Chemotherapeutika bei niedrig-malignen Tumoren mit geringer Proliferationsrate nur unzureichend. Intensive Forschungen beschäftigen sich deshalb mit der Entwicklung spezifischer Therapeutika, die ausschließlich den entarteten Zellklon angreifen, indem sie den zur Transformation der Zelle führenden molekularen Mechanismus, der zur Störung der Induktion oder des Ablauf des programmierten Zelltodes (Apoptose) oder zur gesteigerten Zellprogression führt, gezielt antagonisieren. SRC-Kinase-Inhibitoren gehören zu diesen innovativen Substanzen der so genannten „Molecular Targeted Therapy“. Sie hemmen selektiv SRC-Kinasen, die zur Gruppe der intrazellulären Nicht-Rezeptor-Tyrosinkinasen zählen und an der Pathogenese verschiedener malignen Erkrankungen beteiligt sind. Ihr antiproliferatives Potential konnte in vitro sowohl in der Therapie solider Tumoren, als auch der CML und CLL nachgewiesen werden. In dieser Dissertation wurde gezeigt, dass die neuen SRC-Kinase-Inhibitoren AZD0424, AZD0530 und AZM559756 bei Einsatz mikromolarer Konzentrationen in der Lage sind, in Bcr-Abl-, c-Kit- und PDGF-negativen B-Zell-Lymphomzelllinien Apoptose zu induzieren und die Zellprogression durch Beeinflussung des Zellzykluses zu unterdrücken. Dabei erwies sich die Substanz AZD0424 als der am stärksten wirksame Apoptose-Induktor. Durch umfangreiche Untersuchungen der Responder- (DOHH-2 und WSU-NHL) und Nonresponderzellen (Jurkat und Raji) zur Apoptosekaskade konnten die Schlüsselmoleküle des durch die neuen SRC-Kinase-Inhibitoren induzierten programmierten Zelltodes identifiziert werden. So lies sich die Aktivierung des extrinsischen und intrinsischen Apoptoseweges nachweisen. In Responderzellen erfolgten eine Aktivierung von Initiator- (-8 und -9) und Exekutorcaspasen (-3, -6 und -7), die Zerstörung des mitochondrialen Membranpotentials sowie die Spaltung von Bid, Rb und PARP. Des Weiteren konnten in den Responderzellen eine Downregulation von antiapoptotischen Bcl-xl und eine Downregulation der Apoptoseinhibitoren Survivin, cIAP-1 und c-Flip als apoptosevorantreibene Schritte identifiziert werden. Ebenso lies sich ausschließlich in den behandelten Responderzellen eine Downregulation der c-Abl-Kinase und eine Verminderung der Akt-Phosphorylierung nachweisen. Die Untersuchung der basalen Expression der SRC-Kinasen in den getesteten Lymphomzelllinien bestätigte, dass SRC-Kinasen in unterschiedlichen malignen Erkrankungen fehlgesteuert sind und sich durch ein vom Normalzustand abweichendes Expressionsmuster auszeichnen. Des Weiteren konnten Lyn, Fyn und Lck als Haupteffektor-SRC-Kinasen der neuen SRC-Kinase-Inhibitoren identifiziert werden: so lies sich in allen behandelten Zellen eine Downregulation der SRC-Kinase Lck sowie der phosphorylierten Isoformen p-Lck-Tyr505 und p-Lyn-Tyr507 nachweisen. Durch vergleichende Western Blot Analysen zwischen Responder- und Nonresponderzelllinien gelang es, Charakteristika der Zellen zu identifizieren, die Erklärungen für das unterschiedliche Ansprechen der Zellen auf SRC-Kinase-Inhibitoren anbieten. So wurde gezeigt, dass sich Responderzellen im Gegensatz zu Nonresponderzellen durch eine deutlich geringere c-Myc Expression auszeichnen. Somit deckt diese Arbeit die molekularen Mechanismen der durch SRC-Kinase-Inhibitoren induzierten Apoptosekaskade in B-Zell-Lymphomzellen auf, zeigt wesentliche Schlüsselmoleküle der SRC-vermittelten intrazellulären Signaltransduktion auf, die letztendlich zur Initiierung des programmierten Zelltodes und der Inhibition der Zellzyklusprogression führen und identifiziert entscheidende, für das Ansprechend der Zellen verantwortliche Proteine. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass die neuen SRC-Kinase- Inhibitoren großes antiproliferatives Potential in B-Zell-Lymphomzellen besitzen. Damit stellen sie eine neue, aussichtsreiche Therapieoption in der Behandlung der Lymphomerkrankungen dar. Insbesondere für die Therapie der niedrig-malignen Non-Hodgkin-Lymphome, für die es trotz zahlreicher Forschungsbestrebungen bis heute keine kurativen Behandlungsmöglichkeiten gibt, könnten mit diesen Substanzen verbesserte Heilungschancen erzielt werden. Durch die Aufdeckung der molekularen Mechanismen der durch SRC-Kinase-Inhibitoren induzierten Apoptose, die sich in der Tat von denen der konventionellen Zytostatika unterscheiden, ergibt sich ferner die Möglichkeit, durch eine Kombination beider Chemotherapeutika synergistische Erfolge in der Behandlung maligner Erkrankungen zu erreichen. So könnten zum einen durch Einsatz niedriger Wirkstoffdosen die Nebenwirkungen für den Patienten reduziert werden. Zum anderen könnten mittels der neuen SRC-Kinase-Inhibitoren Resistenzen gegen konventionelle Zytostatika überwunden werden. Somit liefert diese Arbeit wesentliche Grundlagen für weitere, aussichtsreiche in vivo Untersuchungen der SRC-Kinase-Inhibitoren bezüglich einer Optimierung der Therapie der Lymphomerkrankungen.
Die Wandreliefs aus dem Nordwest-Palast Aššurnasirpals II. (883-859 v. Chr.) in Nimrud zählen zu den forschungsgeschichtlich frühesten und bedeutendsten Funden des Alten Orients. Sie befinden sich heutzutage in zahlreichen Sammlungen weltweit und bieten durch ihre Darstellungen einen tiefgreifenden Einblick in die assyrische Kultur. Insbesondere Kontext und Position der Reliefs bieten Hinweise zur Bedeutung der dort angebrachten Figuren. Zwar ist eine "Schutzfunktion" vergleichbarer Repräsentationen textlich bezeugt – jedoch bisher nur unter Vorbehalt auf die Reliefdarstellungen zu übertragen. An dieser Stelle kann die Systematisierung ikonographischer Details in Abhängigkeit von ihrem Anbringungsort konzeptionelle Aspekte erkennbar machen.
Durch eine relationale Datenbank und dreidimensionale Visualisierungstechniken wird geprüft, ob die stilistische Variationsbreite ikonographischer Details eine potentielle Systematik aufweist; ebenso, bis zu welchem Grad die jeweilige Form eines bestimmten Zeichnungsdetails einem intentionalen Anbringungskonzept entspricht. Als Teil dieser Vorgehensweise fungiert die in diesem Zusammenhang generierte 3D-Rekonstruktion als methodisch unterstützende Maßnahme. Sie ermöglicht sowohl eine moderne Zusammenführung ehemals benachbarter Reliefplatten unabhängig ihres gegenwärtigen Aufbewahrungsortes als auch die Wiederherstellung heute kaum noch sichtbarer Gewandverzierungen und Pigmentreste. Anhand der Ergebnisse wird deutlich, dass eine Systematisierung der Reliefdetails mittels 3D-Modell einen erweiterten Erkenntnisfortschritt impliziert und – nicht zuletzt aufgrund der zurückliegenden Zerstörungen der Palastruine und der damit verbundenen unwiederbringlichen Verluste – auch weitere Untersuchungen unterstützen können.
Die Wandreliefs aus dem Nordwest-Palast Aššurnasirpals II. (883-859 v. Chr.) in Nimrud zählen zu den forschungsgeschichtlich frühesten und bedeutendsten Funden des Alten Orients. Sie befinden sich heutzutage in zahlreichen Sammlungen weltweit und bieten durch ihre Darstellungen einen tiefgreifenden Einblick in die assyrische Kultur. Insbesondere Kontext und Position der Reliefs bieten Hinweise zur Bedeutung der dort angebrachten Figuren. Zwar ist eine ‚Schutzfunktion‘ vergleichbarer Repräsentationen textlich bezeugt – jedoch bisher nur unter Vorbehalt auf die Reliefdarstellungen zu übertragen. An dieser Stelle kann die Systematisierung ikonographischer Details in Abhängigkeit von ihrem Anbringungsort konzeptionelle Aspekte erkennbar machen.
Durch eine relationale Datenbank und dreidimensionale Visualisierungstechniken wird geprüft, ob die stilistische Variationsbreite ikonographischer Details eine potentielle Systematik aufweist; ebenso, bis zu welchem Grad die jeweilige Form eines bestimmten Zeichnungsdetails einem intentionalen Anbringungskonzept entspricht. Als Teil dieser Vorgehensweise fungiert die in diesem Zusammenhang generierte 3D-Rekonstruktion als methodisch unterstützende Maßnahme. Sie ermöglicht sowohl eine moderne Zusammenführung ehemals benachbarter Reliefplatten unabhängig ihres gegenwärtigen Aufbewahrungsortes als auch die Wiederherstellung heute kaum noch sichtbarer Gewandverzierungen und Pigmentreste.
Anhand der Ergebnisse wird deutlich, dass eine Systematisierung der Reliefdetails mittels 3D-Modell einen erweiterten Erkenntnisfortschritt impliziert und – nicht zuletzt aufgrund der zurückliegenden Zerstörungen der Palastruine und der damit verbundenen unwiederbringlichen Verluste – auch weitere Untersuchungen unterstützen können.
In der so umfangreichen wie differenzierten Bruegelforschung dominieren religiöse und moralische Deutungen, die auf eine pessimistische Weltsicht des Künstlers schließen. Dem gegenüber priorisiert die vorliegende Arbeit säkulare und materielle Optionen, die einer optimistischen Weltsicht den Boden bereiten konnten. Diese ambitionierte Akzentsetzung ist anhand des zeitgenössischen Kontexts prinzipiell legitimiert und anhand von Bildbelegen praktisch veranschaulicht.
Eine konkretisierte kunstgeschichtliche Positionsbestimmung Bruegels seine systematische Abgrenzung von der romanistischen Konkurrenz ebenso heraus wie den originären Beitrag zur Weiterentwicklung der nicht-romanistischen Malerei seiner Zeit. Für seine innovativen Bildkonzepte gibt es einen gemeinsamen Nenner. Das ist die erweiterte Einbeziehung des Betrachters, der vom passiven Rezipienten zum aktiven Interpreten aufgewertet ist, nicht zuletzt mit dem Ziel, zeitgenössische Wirklichkeit und deren Widersprüche, Defizite und Alternativen diskutierbar zu machen.
Eine modifizierte sozialgeschichtliche Positionsbestimmung Bruegels geht vom Doppelcharakter der zeitgenössischen Transformationsprozesse in den spanischen Niederlanden aus. In der Regel rückt man religiöse Kontroversen und politische Konflikte in den Vordergrund, die destruktiven Potenziale des gesellschaftlichen Wandels und deren Wiederspiegelung im Bruegelwerk. Danach wird der Künstler tendenziell als religiöser Dissident und politischer Opponent qualifiziert. Stattdessen wird hier die ökonomische Expansion, die wirtschaftliche Dynamik als vorrangig angesehen, welche die Heimat Bruegels, die Metropole Antwerpen und ihr Umland, zu einer europäischen Vorsprungsregion werden ließ. Das lenkt den Blick auf die Reflexion des sozialökonomischen Kontexts im Bruegel-Oeuvre, die der Entwicklung der gesellschaftlichen Produktivkraft und die Rolle nicht nur der agrarischen Arbeit erkennbar werden lässt.
Damit ist der Boden bereitet für die Frage nach säkularer Kritik und sozialer Utopie in den Gemälden, denen die beiden folgenden Hauptteile der Arbeit gewidmet sind, dem „Sturz des Ikarus“ (Teil B) und dem „Turmbau zu Babel“ (Teil C). Beide Kapitel setzten sich intensiv mit Referenztexten und Referenzbildern sowie mit der Rezeptionsgeschichte auseinander und münden jeweils in den Entwurf einer konkurrierenden Deutung zu den traditionellen Thesen von der Bestrafung menschlicher Hybris ein:
Die konkurrierende Deutung des „Ikarussturzes“ kommt zu dem Ergebnis, dass die sozialgeschichtliche Substanz des Gemäldes in der Überbietung antiker durch frühneuzeitliche Arbeits- und Verkehrsformen zu entdecken ist. Eine latente sozialutopische Perspektive klingt in den dabei imaginierten Indizien für Arbeits- und Techniklob an.
Die konkurrierende Deutung der Turmbaugemälde gipfelt in dem Vorschlag, die sozialutopischen Potenziale aus dem Übergang vom „Wiener Turmbau“ zum Rotterdamer Turmbau“ abzuleiten. Sie kommt zu dem Ergebnis, dass die Bruegelsche Turmbau-Folge die Entwicklung einer Arbeitsutopie und einer Architekturutopie sowie deren Zusammenfassung zu einer Gesellschaftsutopie vorstellbar macht. Dabei ist der Optimismus keineswegs ungebrochen, das Konstrukt nicht frei von Skepsis, weil Bedrohungen des Projekts von innen und außen Teil des Bildgeschehens sind.
Die vorgelegte Arbeit setzt sich aus drei Veröffentlichungsstücken zusammen. Im ersten Teil zeigten Michalczyk und Hasselhorn (2010) einen Überblick über die Vielfalt der Modellvorstellungen des Arbeitsgedächtnisses. Dabei wurde insbesondere das Baddeley Modell (1986) hervorgehoben. Dieses steht für eine ganze Klasse komponentenbasierter, meist dem experimentellen oder dem Ansatz interindividueller Differenzen zugehöriger, Modellvorstellungen und ist zudem maßgeblich im pädagogischentwicklungspsychologischen Kontext für Theorie und Praxis von Bedeutung. Die Ergebnisse der ersten empirischen Vertiefung der hier vorgelegten Arbeit bestätigten die Gültigkeit der Dreikomponentenstruktur (Baddeley, 1986) und deren weitestgehende Altersinvarianz hinsichtlich der funktionalen Interdependenz der Komponenten phonologische Schleife, visuell-räumlicher Notizblock und zentrale Exekutive im Laufe der kindlichen Entwicklung. Lediglich bei Kindern jünger als 7 Jahre war der Zusammenhang der phonologischen Schleife und der zentralen Exekutive weniger stark ausgeprägt als bei älteren Kindern. In der zweiten empirischen Untersuchung wurden Subkapazitäten des Arbeitsgedächtnisses und die phonologische Bewusstheit zur Entwicklung früher numerischer Kompetenzen (Krajewski, 2008; Krajewski & Schneider 2009a,b) in Beziehung gesetzt. Es zeigte sich, dass die phonologische Bewusstheit auf die phonologische Schleife, den episodischen Puffer und phonologische, zentral-exekutive Prozesse zurückgreift. Zudem beeinflusste die phonologische Bewusstheit frühe numerische Basisfertigkeiten (QNC Level I), nicht aber (höhere) Mengen-Zahlen Kompetenzen (QNC Level II), was die „isolated number words“-Hypothese (Krajewski & Schneider, 2009a) bestätigte. Diese Zusammenhangsmuster, bei denen die phonologische Bewusstheit eine mediierende Rolle zwischen Arbeitsgedächtnissubkapazitäten und frühen numerischen Kompetenzen einnimmt, galten gleichermaßen für Kinder mit und ohne sprachlichem Migrationshintergrund.
Auf dem Martberg, einem Bergplateau über dem Unterlauf der Mosel zwischen den Orten Pommern und Karden (Landkreis Cochem-Zell), befand sich nahe einer spätkeltischen Siedlung der Treverer ein gallo-römisches ländliches Heiligtum, eines der bedeutendsten archäologischen Denkmäler im westlichen Mitteleuropa. Seine vollständige Freilegung in den Jahren 1994 bis 2002 ergab neben Erkenntnissen zur Jahrhunderte langen mehrphasigen Baugeschichte des Tempelareals von der Spätlatènezeit bis zum Ende des 4. Jhs. n.Chr. auch eine Fülle an Funden, insbesondere von Münzen, Fibeln, Keramiken und Kleinfunden aus Metall wie Waffen, Amulette, Schmuck, Statuetten und anderes mehr. Viele dieser Funde sind wohl rituell im Tempelbezirk niedergelegt worden, insbesondere für Münzen, Fibeln und Waffen ist dies aus anderen gallo-römischen Heiligtümern bekannt. Weitere Funde wurden möglicherweise während des Betriebs der Tempelanlage verloren, weggeräumt oder kamen bei den häufigen Umbaumaßnahmen in die Erde.
An Hand der Datenbanken der Funde vom Martberg wurde eine systematische Analyse der Fundlagen aller Artefaktgruppen durchgeführt und ihnen mit Hilfe der gut datierbaren Münzen ein zeitliches Gerüst gegeben. Damit konnten die sich im Laufe der Zeit verändernden rituellen Gepflogenheiten anhand der Funde quantifiziert werden. Durch einen Vergleich mit der zeitabhängigen räumlichen Verteilung der Münzen wurden mit Hilfe von Cluster- und Hauptkomponentenanalysen rituell deponierte Artefaktgruppen identifiziert und von nicht rituell deponierten Artefaktgruppen unterschieden. Dazu wurden zunächst die zahlreichen Münzen (über 10.000 Münzen, darunter über 2000 keltische und gallo-römische Münzen) aus archäologischen Befunden im Tempelbezirk und von Lese/Streufunden als Funktion der Zeit vorgestellt beginnend mit den keltischen Münzen aus dem 1. Jh. v.Chr. bis zu den Münzen aus theodosianischer Zeit gegen Ende des 4. Jhs. n.Chr. Dabei wurden auch Besonderheiten unter den Münzen wie Münzen mit Einhieben, Halbierungen/Viertelungen, Imitationen, Gegenstempel, Prägeorte etc. quantitativ erfasst. Die räumlichen Verteilungen der Münzen zeigten deutliche zeitabhängige Unterschiede. Die sich zeitlich und räumlich verändernden kultischen Praktiken verliefen zudem völlig parallel, was die Deponierung von intakten Münzen, Imitationen, Halbierungen und Viertelungen sowie insbesondere Münzen mit Einhieben anging. Im Gegensatz zu den deutlich erkennbaren räumlichen Verschiebungen in den Münzhäufigkeiten bis zur Mitte des 2. Jhs. n.Chr. änderten sich die Verteilungen von Münzen im Tempelbezirk aus den folgenden Jahrhunderten nur wenig.
Diese sich zeitlich verändernden aber gut datierbaren lokalen Fundmünzhäufigkeiten wurden zu einer wenn auch groben Datierung vieler anderer Kleinfundgattungen herangezogen. Mithilfe von statistischen Verfahren (Clusteranalysen bzw. Hauptkomponentenanalysen) konnten zeitliche und räumliche Beziehungen zwischen den einzelnen Fundgattungen identifiziert und teilweise auch datiert werden. Außerdem konnte zwischen absichtlich niedergelegten, geopferten Gegenständen wie Münzen, Schmuck oder Waffenbestandteilen und wohl als Abfall entsorgten Keramik-Waren, Metallteilen oder auch Produkten von Metall-, Keramik- oder anderen Werkstätten unterschieden werden. So waren Lanzenspitzen, keltische Fibeln aus der zweiten Hälfte des 1. Jhs. v.Chr., Statuetten, Spiegel und Phallusamulette ähnlich wie die entsprechenden zeitgleichen keltischen und frühkaiserzeitlichen Münzen verteilt, konnten dadurch auch datiert werden und wurden wohl ähnlich wie die Münzen als Weihegaben deponiert. Frühe keltische Fibeln bildeten zusammen mit Funden aus Blei (Bleiplättchen, Bleibleche, Gussreste) sowie mit Schlacken, Fingerringen und Perlen aus Bronze oder Glas einen eigenen Cluster. Die anderen metallenen Kleinteile waren ähnlich wie die Münzen aus dem 2.-3. Jh. gleichmäßig über das Tempelareal verteilt, wohl weil in dieser Zeit Umbaumaßnahmen zu einer großflächigen Zerstreuung dieser Funde führten. Zusammen mit den Resten der Keramik wurden dabei offensichtlich auch viele metallene Kleinfunde entsorgt, die an Hand der ähnlich verteilten Keramik wiederum zum Teil datiert werden konnten.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, dem Phänomen der sogenannten „claudischen Imitationen“ anhand von Untersuchungen der physikalischen, typologischen und physikochemischen Eigenschaften dieser Münzen sowie von Provenienzstudien des für die Münzen verwendeten Kupfers näher zu kommen. Aus den Ergebnissen von Bleiisotopenanalysen (Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma, ICP-MC-MS) an insgesamt 115 claudischen Imitationen ließ sich schließen, dass das Kupfer für die Imitationen mit claudischen und augusteischen Münzbildern ebenso wie die offiziellen claudischen Münzen wohl aus zwei verschiedenen Lagerstätten in Spanien, der Zentralen Iberischen Zone (Kupferminen der Sierra Morena) und aus dem Gebiet des Rio Tinto (Iberischerer Pyrit-Gürtel), stammte. Ob dieses Kupfer (möglicherweise aus verhandelten Barren) direkt zur Herstellung der Imitationen verwendet wurde oder über den Umweg einer Umprägung von offiziellen Münzen, konnte jedoch nur durch eine Analyse der Spurenelementverteilung in den Imitationen selbst im Vergleich zu ähnlichen Messungen an offiziellen Münzen herausgefunden werden. Die Ergebnisse der Spurenelementanalysen (Elektronenstrahlmikrosonde) an über 110 claudischen Imitationen vom Martberg im Vergleich zu früher publizierten Ergebnissen an über 200 offiziellen Kupfermünzen von Augustus bis Claudius haben gezeigt, dass viele der Imitationen mit claudischen Münzbildern sehr stark offiziellen Münzen ähneln, die unter Augustus, Tiberius und Claudius geprägt wurden. Ähnliches gilt für Imitationen mit augusteischen und tiberischen Münzbildern. Etwa ein Drittel der Imitationen enthielten Zink in unterschiedlichen Konzentrationen und unterschieden sich bereits dadurch von den offiziellen Münzen. Man muss aus diesen Ergebnissen den Schluss ziehen, dass die große Mehrheit der Imitationen mit augusteischen oder tiberischen Münzbildern erst in claudischer Zeit aus denselben Münzmetallen wie die Imitationen mit den claudischen Münzbildern hergestellt wurden: aus den in dieser Zeit zur Verfügung stehenden Münzen der vorangehenden Kaiser und/oder den offiziellen Münzen des Claudius.
Da auch an eine Verwendung von Kupfer aus verhandelten Kupferbarren zur Herstellung vieler der Imitationen möglich ist, wurden ähnliche Vergleiche auch mit publizierten Daten von Kupferbarren durchgeführt, die in römischen Schiffswracks im westlichen Mittelmeer gefunden wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass für die Herstellung von Imitationen auch die Verwendung von handelsüblichen Kupferbarren denkbar ist.
Im dritten Teil der Arbeit wurde anhand der Münzfunde vom Martberg untersucht, ob Münzen mit bestimmten Rückseitentypen für eine Weihung im sakralen Bereich selektiert oder auch gemieden worden sein könnten. Dazu wurde die Verteilung der Rückseitentypen der auf dem Martberg gefundenen Antoniniane mit Münzreihen verglichen, die in einem zweiten sakralen Kontext, dem Tempelbezirk des Castellberg gefunden wurden, außerdem mit zwei Einzelfundreihen aus zivilen Kontexten und zwei Schatzfunden von Antoninianen. Die sechs Fundkomplexe zeigten eine ähnliche Struktur, da sie aus dem Pool der umlaufenden Münzen zusammengesetzt waren. Die Unterschiede innerhalb der beiden Münzreihen desselben Kontextes waren jedoch erheblich geringer als die zwischen den Münzreihen aus unterschiedlichen Kontexten. Die Ergebnisse einer Hauptkomponentenanalyse zeigten zunächst, dass die beiden Heiligtümer in ganz ähnlicher Weise von der „Referenzkurve“ des Vicus Castellberg abwichen. Die in allen Fundkomplexen am häufigsten vorkommenden Münzbilder Pax, Salus und Spes waren verglichen mit dem Vicus in beiden Heiligtümern deutlich überrepräsentiert. Eine „positive Selektion“ dieser Rückseitentypen, d.h. ihre bewusste Niederlegung, war aber eher unwahrscheinlich. Für die in beiden Heiligtümern unterrepräsentierten Typen wie Laetitia, Fides, Sol, Mars und Jupiter, vielleicht auch Tiere/Fabelwesen, Uberitas und Fortuna war eine bewusste Vermeidung der Niederlegung eher anzunehmen. Neben der eindeutig nachweisbaren Tendenz der Niederlegung von eher geringwertigen Münzen ist davon auszugehen, dass bei der rituellen Niederlegung von Münzen im sakralen Kontext auch die Bilder auf den Rückseiten dieser Münzen eine wie auch immer geartete Rolle gespielt haben müssen. Damit zeigt sich die Funktion der Münzen im rituellen Kontext nicht nur als Wertmesser, als Geld, sondern auch als ein Informationsträger, mit dessen Hilfe möglicherweise auch Zwiesprache mit den Göttern gehalten wurde.
Ziele der vorliegenden Arbeit waren einerseits die Inventarisierung der Neo- und Archäophyten, die im Stadtgebiet von Frankfurt am Main im Zeitraum 1700-2006 nachweisbar sind, und die Analyse der Veränderungen während dieses Zeitraumes, andererseits die Untersuchung möglicher Auswirkungen von Neo- und Archäophyten auf die Biodiversität am Beispiel von Brachestandorten. Zur Inventarisierung wurde eine Kombination aus Literatur- und Herbarrecherche im Herbarium Senckenbergianum (FR) mit Feldarbeit in Form einer Rasterkartierung zwischen September 2002 und September 2005 mit Nachträgen aus dem Jahr 2006 durchgeführt. 609 Arten (unter Berücksichtigung von Unterarten/Varietäten 634 Sippen) aus 84 Familien wurden über den Gesamtzeitraum nachgewiesen, wobei mehr als 75 % der Sippen zu 20 Familien gehören. Die erfassten Sippen wurden nach ihrer Einwanderungsgeschichte, Einwanderungsweise und ihrem Einbürgerungsgrad bewertet. 54 % aller Sippen erwiesen sich als Ergasiophygophyten. Aktuell wurden 462 anthropochore Sippen nachgewiesen. Die Familie mit den meisten anthropochoren Vertretern sind sowohl aktuell als auch im Gesamtzeitraum die Asteraceae, die auch auf Brachen eine heruasragende Stellung einnehmen. Der gesamte Untersuchungszeitraum wurde in neun Abschnitte untergliedert. Die Häufigkeit jeder Sippe wurde für die einzelnen Abschnitte in einer sechsstufigen Skala, die sich an die Ergebnisse der Rasterkartierung anlehnt, eingeschätzt. Dadurch wurde es erstmals möglich die starke Zunahme der Neophyten in der Stadtflora sowie den Rückgang von Archäophyten für einen Zeitraum von 300 Jahren quantitativ darzustellen. Untersuchungen zur Diversität erfolgten auf Brachestandorten im Stadtgebiet. Dazu wurden 2003 und 2004 insgesamt 220 Vegetationsaufnahmen nach Braun-Blanquet durchgeführt. Die Probeflächen wurden nach geschätztem Alter in vier Kategorien unterteilt und mit Hilfe von Diversitätsindizes (Evenness, Simpsonund Shannon-Index) verglichen. Es zeigte sich, dass die Diversität auf jungen, d.h. 1-2 Jahre alten Brachen, am höchsten ist und mit zunehmendem Alter abnimmt. Brachen, die erst im Untersuchungsjahr angelegt worden waren, zeigten die größte Variabilität. Auf nährstoffreichen Böden war die Diversität besonders hoch, auf nährstoffarmen Böden extrem niedrig. Brachen, die älter als 5 Jahre waren, zeigten die geringste Diversität und die niedrigsten Zahlen von Archäo- und Neophytenarten. Die höchste Gesamtartenzahl auf 25 m² betrug 58, wobei maximal 16 Archäophyten- und 19 Neophytenarten, im Mittel jedoch nur drei Archäophyten- und vier Neophytenarten, nachgewiesen wurden. Zwischen der Gesamtartenzahl auf Brachen und der Artenzahl von Neo- und Archäophyten ließ sich kein signifikanter Zusammenhang feststellen. Allerdings sind Neophyten auf Brachen aller Altersklassen gleich erfolgreich, während Archäophyten ihren Schwerpunkt auf jungen Brachen haben und mit zunehmendem Brachealter zurückgehen. Die beiden am häufigsten auf Brachen gefundenen Sippen sind die indigenen Hypericum perforatum und Artemisia vulagris. Der Neophyt Fallopia x bohemica und das einheimische Calamagrostis epigejos sind als einzige im Untersuchungsgebiet in der Lage Einart-Bestände zu bilden. Andere, auf den ersten Blick von einer Art (z.B. Solidago canadensis) dominierte Flächen, wiesen bei näherer Untersuchung eine für Brachen durchschnittliche Diversität auf. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass jungen Brachen bis zum 3. Jahr eine besondere Bedeutung in der Stadtökologie zukommt. Sie bieten z.B. Segetalarten Lebens- und Rückzugsraum. Die Diversität alter Brachen beruht auf ihrem Mosaik verschiedener Lebensräume, die mit dieser Untersuchung nicht erfasst werden konnten.
Are books different? : Die Auswirkungen des Falls der Buchpreisbindung in Großbritannien 1995 - 2006
(2013)
Sicherlich gibt es im Buchhandel wie in jeder anderen Branche Zeiten der Krise und des Umsatzrückgangs, aber grundsätzlich legen die Zahlen nicht nah, dass das Ende bevorsteht. Es stellt sich also die Frage, ob zutrifft, was Richter Buckley in seinem zum geflügelten Wort gewordenen Urteil feststellte: Sind Bücher wirklich anders, oder anders gefragt, braucht der Buchhandel den Schutz des Staates, um seine Funktion erfüllen zu können?
Um eine Antwort auf diese Fragen zu finden, soll in dieser Arbeit das Hauptaugenmerk auf die Entwicklung des britischen Buchhandels im Zeitraum von 1995 (dem Jahr der faktischen Abschaffung des Net Book Agreement bis 2006 gelegt werden. Nach dem beinahe hundertjährigen Bestehen der Buchpreisbindung waren diese Jahre richtungweisend für die Neuorientierung des britischen Buchhandels auf die Bedingungen eines freien Marktes, und es soll untersucht werden, welche Umwälzungen sich daraus für die Branche ergeben haben.
Ziel der durchgeführten Experimente war es, die Zerfallsmechanismen Van-der-Waals gebundener Argon- und Neon Di- und Trimere in intensiven Laserfeldern zu untersuchen, um mehr über den Einfluss der schwachen Van-der-Waals Bindung auf die Dynamik des Ionisationsprozesses zu erfahren. Da Dimere aufgrund ihrer elektronischen Struktur sehr stark zwei separaten benachbarten Atomen gleichen, vereinen sie atomare und molekulare Eigenschaften in sich und ihre Untersuchung verspricht ein tieferes Verständnis der Wechselwirkungsmechanismen in starken Laserfeldern. Die Verwendung der Impulsspektroskopie Methode COLTRIMS ermöglichte die koinzidente Messung aller beim Aufbruch entstandener ionischer Fragmente sowie eines elektronischen Impulsvektors. Für die beidseitige Einfachionisation des Argon Dimers, konnten bei der gewählten Intensität (etwa 3.3E14W/cm2) drei unterschiedliche Ionisationsprozesse identifiziert werden, von denen zwei zu einer überraschend hohen kinetischen Gesamtenergie der Ionen führen. Aufgrund der Messung der Winkelverteilung der ionischen Fragmente und eines der emittierten Elektronen für lineare und zirkulare Polarisation gelang es, die den drei Prozessen zugrunde liegende Dynamik im Laserfeld zu entschlüsseln. Der dominierende Zerfallskanal stellt demzufolge eine schnelle sequentielle Doppelionisation des Argon Dimers dar, die noch am Gleichgewichtsabstand des Dimers stattfindet. Für den zweithäufigsten Ionisationsprozess ergaben sich zwei mögliche Erklärungsansätze: Entweder wird das Dimer zunächst einseitig doppelionisiert, so dass es auf einer attraktiven Potentialkurve zusammenläuft, bevor es zu einem späteren Zeitpunkt – wenn das Laserfeld bereits abgeklungen ist – durch eine Umverteilung seiner Ladungen in einer Coulomb Explosion fragmentiert, oder das Dimer wird bei einer beidseitigen Tunnelionisation zugleich angeregt, so dass die Coulomb Explosion von einer Potentialkurve erfolgt, die wesentlich steiler als 1/R verläuft. Der schwächste Zerfallskanal, der sich durch die höchste Gesamtenergie auszeichnet, ist auf eine "Frustrated Triple Tunnel Ionization" zurückzuführen, bei der ein hoch angeregter Rydberg Zustand erzeugt wird. Bei der Untersuchung des Neon Dimers konnte bei der gewählten Intensität (etwa 6.3E14W/cm2) nur die sequentielle beidseitige Einfachionisation identifiziert werden, obwohl die Daten Hinweise auf einen weitern Ionisationsprozess mit sehr geringer Statistik aufweisen. Zudem wurde in dieser Arbeit nach der Methode des Coulomb-Explosion-Imaging aus den in Koinzidenz gemessenen Impulsvektoren aller einfachgeladenen ionischen Fragmente eines Aufbruchs die geometrische Struktur der Cluster im Orts-und Impulsraum rekonstruiert. Die ermittelte Grundzustandswellenfunktion des Argon und Neon Dimers zeigt eine gute Übereinstimmung mit quantenmechanischen Berechnungen. Für das Argon und Neon Trimer konnten aus den gemessenen Impulsvektoren mittels einer numerischen Simulation die Bindungswinkel im Ortsraum bestimmt werden, so dass erstmals gezeigt werden konnte, dass diese Trimere gleichseitige Dreieckskonfigurationen aufweisen. Vergleiche mit theoretischen Berechnungen zeigen für die breite Winkelverteilung des Neon Trimers eine hervorragende Übereinstimmung, während die gemessene Winkelverteilung des Argon Trimers etwas breiter als die berechnete ist.
Einführung: Die höchste Offenheitsrate in der arteriellen Bypasschirurgie der unteren Extremitäten wird mit einem Segment der Vena saphena magna (VSM) von ausreichender Länge und Durchmesser erreicht. Dabei ist der Venendurchmesser der einzige signifikant korrelierende Faktor für das Auftreten einer Transplantatsstenose und damit der beste Prädiktor für die primäre und die sekundäre 2-Jahre-Durchgängigkeitsrates. In 20-40% der Patienten fehlt ein bzgl. des Lumens geeignetes Segment der Vena saphena magna zur Herstellung eines Bypasses bei der primären Operation. Daher wurde eine Technik entwickelt, kleinlumige Vena saphena magna Segmente mittels einer Valvulotomie zu erweitern.
Ziel: Eine zu kleinlumige Vena saphena magna soll VSM für eine spätere Verwendung als autologes Bypassmaterial der unteren Extremität konditioniert werden. Die häufigsten Indikationen für eine derartige Konditionierung sind die Bypassverwendung bei der operativen Therapie der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (pAVK) und beim Aneurysma der Arteria poplitea (PA).
Methoden: Diese prospektive Pilotstudie würde zwischen Juni 2007 und November 2011 durchgeführt. 25 Patienten (26 Fälle) mit einem VSM Durchmesser zwischen 2 und 3mm erhielten eine in situ VSM-Valvulotomie. Die Zerstörung der suffizienten Venenklappen ermöglicht einen retrograden Blutstrom in die Vena saphena magna. Der hierdurch erzeugte Wachstumsreiz soll zu einer Durchmesserzunahme der Vene führen. Nach Erreichen eines Durchmessers von > 3mm für infragenuale Rekonstruktionen und von > 3,5 mm für supragenuale Rekonstruktion wurden die konditionierten Venensegmente als Bypass implantiert. Bei 23 Patienten war die Bypassindikation eine nicht kritische pAVK. Bei 2 Patienten war ein Aneurysma der Arteria poplitea die Indikation. Einschlusskriterium für Teilnahme an der Studie war eine nicht variköse VSM mit einem Querdurchmesser zwischen 2 und 3 mm. Die Venenevaluation erfolgte duplexsonografisch im Stehen durch eine Beurteilung der epifaszialen Vena saphena magna von der Leiste bis zum Innenknöchel. Messpunkte waren: 10 cm unterhalb des Hiatus saphenus, 10 cm oberhalb des Knies, 10 cm unterhalb des Knies und 10 cm oberhalb des Innenknöchels. Um das Venenwachstum zu ermitteln, diente als Messpunkt der kleinste ermittelte Durchmesser über einem Messbereich von 10 mm.
Drei Patienten, bei denen ein femoropoplitealer Bypass oberhalb des Kniegelenkes implantiert wurde, hatten bei der Implantation einen Durchmesser der konditionierten VSM > 3.5 mm. Bei 13 Patienten mit Bypassimplantation unterhalb des Kniegelenkes war die konditionierte VSM > 3mm. Eine Wiederholung der Valvulotomie war in keinem der Patienten nötwendig. Die valvulotomierte VSM wurde bei allen Bypassoperationen offen chirurgisch entnommen. Zur postoperativen Kontrolle erfolgten eine Duplexuntersuchung und eine ABI-Messung 1,3,6,12,18 und 24 Monate nach der Implantation.
Ergebnisse: Durchschnittlich vergrößerte sich der VSM-Durchmesser von initial 2,5±0,18 mm vor Valvulotomie auf 2,8±0,2 mm, 3,0±0,3mm und 3,2±0,4 mm jeweils 30, 60 und 90 Tage nach Valvolutomie. Bei der Entnahme betrug der durchschnittliche Bypassdurchmesser 3.7±0.6 mm. Die primäre 1-Jahres-Offenheitsrate mit der valvulotomierten VSM war 81±9,8% im Vergleich zu in der Literatur publizierten 58,0%±8,4% für alloplastische Transplantate, 51% für kleinkalibrige VSM und 81,6%±3,6% für Armvenentransplantate. Die sekundäre 1-Jahres-Offenheitsrate mit der Valvulotomietechnik betrug 87%±8,3% verglichen mit 82,6% für in der Literatur angegebene Transplantationen mit kleinkalibriger VSM. Die primäre 2-Jahres-Offenheitsrate mit der Valvulotomietechnik betrug 69%±11,8%, verglichen mit 50% in der Literatur angegebener Transplantationen von kleinkalibrige VSM benutzt wurden und 72%, falls Armvenentransplantate benutzt wurden. Die sekundäre 2-Jahres-Offenheitsrate mit der Valvulotomietechnik lag bei 75%±11%.
Fazit: Die Valvulotomie kann zur Zunahme des Venendurchmessers vor Anlage eines femoro-distalen Bypasses verwendet werden, weil sie regelhaft zum Reflux in der valvulotomierten Vene führt und dadurch ein relevantes Venenwachstum verursacht. Zwischen 60 und 90 Tagen nach Valvulotomie wird ein Venenduchmesser > 3.5 mm erreicht und die valvulotomierte VSM kann als femoropoplitealer Bypass oberhalb des Kniegelenkes implantiert werden. Für eine Anastomose unterhalb des Kniegelenkes genügt ein Wachstum bis > 3 mm. Wenn die valvulotomierte Vene einen entsprechenden Durchmesser erreicht, kann die konditionierte VSM benutzt werden, um einen Bypass mit guter Offenheitsprognose zu konstruieren oder einen nicht funktionierenden Bypass zu ersetzen.
Millionen von Menschen weltweit leiden unter Kniegelenksarthrose. Ursachen hierfür sind nicht nur die altersbedingte Abnutzung des Knorpels, sondern auch erhöhte Beanspruchung durch Sport und Arbeit, verschiedene Gelenkserkrankungen, entzündliche oder rheumatische Ursachen, aber auch verschiedene Kniegelenksverletzungen. Zu den Therapieansätzen gehören als biologische Defektfüllung die Knorpelinduktionsverfahren, wie das Debridement, die Abrasionsarthroplastik, die Pridiebohrung, die darauf bauende Microfracture, die autologe Chondrozytentransplantation und die Transplantation chondrogener Materialien. Die künstliche Defektfüllung ist der Einsatz von Teil- und Totalprothesen. Ziel dieser Arbeit ist es gewesen, Patienten mit hochgradigen Kniegelenksarthrosen klinisch vor und nach der Microfracture zu erfassen, wobei der Schmerzverlauf im Vordergrund gestanden hat. Ausserdem ist die Schmerzsypmptomatik und die operativen Ergebnisse mit einem bestehendem Knochenmarksödem korreliert worden. In dieser retrospektiven klinischen Studie sind 59 Patienten mit einem arthroskopisch gesicherten Knorpelschaden von mindestens Grad III nach Outerbridge der Microfracture durch denselben Operateur unterzogen worden. Bei 26 Patienten ist präoperativ ein MRT durchgeführt worden. Zur klinischen Auswertung ist von allen Patienten ein Fragebogen beantwortet worden, der zum einen allgemeine Fragen, wie Symptomdauer, auslösende Faktoren für die Beschwerden und subjektive Besserung beinhaltet, zum anderen Fragen nach dem Score von Insall et al. enthält. Der Score nach Insall et al. setzt sich aus Knie- und Funktionsscore zusammen; es können jeweils 0 bis 100 Punkte erreicht werden. Ausserdem werden alle Patienten prä- und postoperativ untersucht. Präoperativ haben 98,3% der Patienten Schmerzen gehabt; 86,4% weisen Einschränkungen in ihrem täglichen Aktivitäten auf und 1,7% der Patienten haben ein instabiles Knie. Postoperativ sind 42,4% der Patienten schmerzfrei geworden; weitere 30,5% haben nur noch milde Schmerzen angegeben. Im Bereich ihrer täglichen Aktivität geben 49,2% der Patienten noch Probleme beim Treppenlaufen an. Insgesamt haben 78% der Patienten eine allgemeine subjektive postoperative Besserung angegeben. Im MRT sind bei 17 Patienten eine Grad-IV-Läsion vor allem am medialen Femur und korrelierend am medialen Femur und an der medialen Tibia gesehen worden. Ausserdem sind bei 15 Patienten Meniskusverletzungen und bei 6 Patienten Bandverletzungen diagnostiziert worden. Von den 26 Patienten mit einem präoperativen MRT sind bei 17 Patienten ein Knochenödem gefunden worden. In der Arthroskopie sind bei 57 von 59 Patienten ein Knorpelschaden des Grades IV, am häufigsten am medialen Femur gesehen worden. Arthroskopisch sind bei 34 Patienten Meniskusverletzungen und bei 5 Patienten Bandverletzungen diagnostiziert worden. Zur Verwertung des Knie- und Funktionsscores sind statistische Tests erhoben und die jeweiligen Medianwerte ermittelt worden. Der Medianwert des Kniescore liegt präoperativ bei 55 Punkten, postoperativ bei 95 Punkten. Der Medianwert des Funktionsscore liegt präoperativ bei 80 Punkten, postoperativ bei 90 Punkten. Die Patienten weisen im Kniescore eine deutlichere Besserung als im Funktionsscore auf, da die prä- und postoperative Differenz grösser gewesen ist. Somit haben wir uns auf den Schmerzverlauf der Patienten konzentriert und haben den Schmerzverlauf der Patienten mit Knochenödem nochmals hervorgehoben. Wir sind zu dem Schluss gekommen, dass das klinische Outcome von Faktoren, wie Alter des Patienten, Symptomdauer und Aktivitätsgrad abhängt. Begleitverletzungen, wie Meniskus- und/oder Bandverletzungen, oder Erkrankungen, wie Morbus Ahlbäck oder Osteochondrosis dissecans stellen kein Hindernis im Heilungsprozess dar. Ebenso zeigt ein Knochenmarksödem assoziiert mit einem Trauma keine Signifikanz in der allgemeinen Besserung.
Fossile Rohstoffe dienen in unserer heutigen Gesellschaft als Energiequelle und als Rohstofflieferant für Grund-, Feinchemikalien und Pharmazeutika. Sie tragen jedoch zum Klimawandel und Umweltverschmutzung bei. Lignocellulosische Biomasse ist eine erneuerbare und nachhaltige Alternative, die durch biotechnologische Prozesse erschlossen werden kann. Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae ist ein sehr gut untersuchter Modellorganismus, für den es zahlreiche genetische Werkzeuge und Analysemethoden gibt. Zudem wird S. cerevisiae häufig in biotechnologischen Prozessen eingesetzt, da diese Hefe robust gegenüber industriellen Bedingungen wie niedrigen pH-Werten, toxischen Chemikalien, osmotischem und mechanischem Stress ist. Die Pentose D-Xylose ist ein wesentlicher Bestandteil von lignocellulosischer Biomasse, die aber nicht natürlicherweise von der Bäckerhefe verwerten werden kann. Für eine kommerzielle Herstellung von Produkten aus lignocellulosischer Biomasse muss S. cerevisiae D-Xylose effektiv verwerten. Für die Bäckerhefe konnten heterologe Stoffwechselwege etabliert werden, damit diese D-Xylose verwerten kann. Für eine effiziente Xyloseverwertung bleiben dennoch zahlreiche Herausforderungen bestehen. Unter anderem nehmen die Zellen D-Xylose über ihre endogenen Hexosetransporter nur langsam auf. Die heterologe Xylose-Isomerase (XI) besitzt in S. cerevisiae eine geringe Aktivität für die Isomerisierung von D-Xylose. Unspezifische Aldosereduktasen konkurrieren mit der Xylose-Isomerase um das gleiche Substrat und produzieren Xylitol, ein starker Inhibitor der Xylose-Isomerase. Eine Möglichkeit die Umsatzrate von Enzymen zu steigern und Substrate vor Nebenreaktionen zu schützen, ist die Anwendung von Substrate Channeling Strategien. Bei Substrate Channeling befinden sich die beteiligten Enzyme in einem Komplex, wodurch die Substrate lokal angereichert werden und von einem aktiven Zentrum zum nächsten weitergeleitet werden, ohne Diffusion in den restlichen Reaktionsraum. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob ein Komplex zwischen einem membranständigen Transporter und einem löslichen Enzym konstruiert werden kann, um durch Substrate Channeling eine verbesserte Substrat-Verwertung zu erreichen. Die Xylose-Isomerase aus C. phytofermentans und die endogene Hexose-Permease Gal2 sollten in dieser Arbeit als Modellproteine in S. cerevisiae-Zellen mit Hilfe von Protein-Protein-Interaktionsmodulen (PPIM) in räumliche Nähe zueinander gebracht werden.
Die Expression verschiedener PPIM konnte in S. cerevisiae mittels Western Blot nachgewiesen werden. Auch Fusionsproteine aus unterschiedlichen PPIM wurden in dieser Hefe exprimiert. Die PPIM binden komplementäre PPIM oder kurze Peptidliganden, welche an die Xylose-Isomerase und an den Gal2-Transporter fusioniert wurden. Die Funktionalität beider Proteine wurde mittels in vivo und in vitro Tests untersucht. Die Xylose-Isomerase mit N-terminalen Liganden des WH1-Protein-Protein-Interaktionsmoduls (WH1L-XI) und der Gal2-Transporter mit N-terminalen SYNZIP2-Protein-Protein-Interaktionsmodul (SZ2-Gal2) erwiesen sich als geeignete Kandidaten für weitere Untersuchungen. Mittels indirekter Immunfluoreszenz konnte die Ko-Lokalisierung von SZ2-Gal2 und WH1L-XI, die einander über ein Scaffold-Protein binden, nachgewiesen werden.
Transformanten, in denen ein Komplex aus Transporter, Scaffold-Protein und Xylose-Isomerase gebildet wurde, zeigten bessere Fermentationseigenschaften gegenüber der Scaffold-freien Kontrolle und dem Wildtyp: Sie verwerteten Xylose schneller, bildeten weniger vom unerwünschten Nebenprodukt Xylitol, produzierten mehr Ethanol und wiesen eine höhere Ethanolausbeute auf. Der beobachtete Substrate Channeling Effekt kompensierte die geringere Enzymaktivität der WH1L-XI im Vergleich zum Wildtyp-Protein. Die Wirksamkeit des Substrate Channeling wurde verringert, wenn die Bildung des Komplexes aus Transporter, Scaffold-Protein und Xylose-Isomerase gestört wurde, indem ein getaggtes GFP mit dem Scaffold-Protein um die Bindungsstelle an Gal2 konkurrierte. Dies zeigt, dass die positive Wirkung auf die Komplex-Bildung zwischen XI und Gal2 zurück zu führen ist. Die Fermentationseigenschaften konnten gesteigert werden, indem der zuvor zwischen SZ2-Zipper und Gal2-Transporter verwendete Linker, der aus zehn Aminosäuren von Glycin, Arginin und Prolin (GRP10) bestand, durch einen aus Glycin und Alanin (GA10) ersetzt wurde. Die verbesserten Fermentationseigenschaften beruhten auf einem Substrate Channeling Effekt und einer gesteigerten Aufnahmerate des SZ2-GA10-Gal2-Transporters. Ein Vergleich der Strukturvorhersagen von SZ2-GRP10-Gal2 und SZ2-GA10-Gal2 zeigte, dass der GRP10-Linker einen unstrukturierten, flexiblen Linker ausbildet, während der GA10-Linker eine starre α-Helix ausbildet. Die Struktur und der Transportprozess von Gal2 sind nicht aufgeklärt. Bei verwandten Transportern geht man davon aus, dass Substrate durch Konformationsänderungen ins Innere der Zelle transportiert werden, indem die beiden Domänen gegeneinander klappen. Die α-Helix könnte die Geschwindigkeit der Konformationsänderungen begünstigen.
Durch Kontrollexperimente konnte ausgeschlossen werden, dass die gesteigerten Fermentationseigenschaften eine Folge der Stabilisierung der XI- und Gal2-Fusionsproteine durch das Anfügen des Liganden oder durch Komplexbildung mit dem Scaffold-Protein waren. Substrate Channeling zwischen Gal2 und XI entsteht durch die Komplexbildung mit dem Scaffold-Protein, wodurch sich Gal2 und XI in räumlicher Nähe zueinander befinden. Dieser Effekt beruht möglicherweise zusätzlich aufgrund einer hohen örtlichen Ansammlung dieser Proteine, da die tetramere XI weitere Scaffold-Proteine binden könnte, welche weitere Gal2-Transporter binden könnte. Darüber hinaus sammeln sich Transporter an bestimmten Orten der Membran an und Transporter mit ähnlicher oder gleicher Transmembransequenz tendieren dazu zu ko-lokalisieren. Hierdurch könnten Gal2-XI-Agglomerate entstehen und Xylose wird mit hoher Wahrscheinlichkeit von einer der vielen Xylose-Isomerasen umgesetzt.
Im Zentrum dieser Arbeit stand die Umsetzung der Thematik Arzneimittel für den Chemieunterricht an allgemein bildenden Schulen. Ein Hauptziel war es, die wichtigsten Bereiche des Themenkomplexes Arzneimittel für den Chemieunterricht zu strukturieren und für einen problemorientierten sowie alltags- und lebensweltbezogenen Experimentalunterricht zu erschließen. Dabei sollten Versuche entwickelt werden, die einerseits grundlegende Aspekte des Themas Arzneimittel exemplarisch behandeln und mit deren Hilfe sich andererseits fachliche Inhalte der Schulchemie anwendungsorientiert erarbeiten lassen. Dazu wurden geeignete Modellversuche entwickelt und die oft sehr komplexen fachlichen Inhalte entsprechend didaktisch reduziert. ...
1.) Zahlreiche Medikamente werden nach Einnahme nahezu unverändert wieder ausgeschieden und gelangen über Abwasser und Kläranlagen in die aquatische Umwelt. 2.) Die gemessenen Konzentrationen erscheinen gegenüber anderen Kontaminantengruppen vergleichsweise niedrig, sind jedoch angesichts der Tatsache, dass Medikamente biologisch hoch aktive Substanzen sind, besorgniserregend. Das Beispiel Ethinylöstradiol zeigt, dass bereits im ng/l-Bereich Effekte auftreten. Abgesehen vom Beispiel Ethinylöstradiol lagen bislang keine Erkenntnisse über chronische Effekte von Medikamenten bei umweltrelevanten Konzentrationen vor. 3.) Die in der Umwelt festgestellten Arzneimittelwirkstoffe werden fast ausschließlich in Ab-, Oberflächen- und Grundwasser detektiert. Angaben über Medikamentanreicherungen in Sedimenten liegen nur vereinzelt vor. 4.) Angaben über die Ökotoxizität von Medikamenten beruhen bislang fast ausschließlich auf bei sehr hohen Substanzkonzentrationen durchgeführten Akuttests. Die Übertragung auf umweltrelevante Verhältnisse erfolgte durch Einbeziehung hoher Sicherheitsfaktoren. 5.) Die vorliegende Arbeit zeigt, dass in komplexeren Tests bereits bei sehr viel niedrigeren Konzentrationen Effekte auftreten. Diese Effekte sind nicht unmittelbar toxisch, beeinträchtigen jedoch die Entwicklung und Fortpflanzung der Versuchsorganismen nachhaltig. 6.) Als Modellsubstanzen für die in Oberflächengewässern nachgewiesenen Pharmaka wurden das Antiepileptikum Carbamazepin, Clofibrinsäure als Metabolit zahlreicher Lipidsenker, das Antibiotikum Ciprofloxacin und das Antidepressivum Fluoxetin ausgewählt. Sämtliche Pharmaka werden in der Umwelt weit verbreitet nachgewiesen. 7.) Als Testorganismen dienten die Zuckmücke Chironomus riparius, die Zwergdeckelschnecke Potamopyrgus antipodarum und der aquatische Annelide Lumbriculus variegatus. C. riparius ist ein bereits standardisierter Versuchsorganismus, L. variegatus ist zur Zeit im Standardisierungsverfahren (OECD 2004B) und für ökotoxikologische Untersuchungen empfohlen (ASTM 1995). Außerdem wurde mit den Einzellern Blepharisma japonicum und Tetrahymena thermophila ein Destruentenmikrokosmos entwickelt. Beide Einzeller sind ebenfalls erprobte Versuchsorganismen (PAULI 1996, FOX & MORIN 2001). 8.) Von den vier untersuchten Pharmaka erwiesen sich im getesteten Konzentrationsbereich Carbamazepin und Fluoxetin für jeweils einen der Testorganismen als schädlich. Carbamazepin blockierte ab einer Sedimentkonzentration von 234 µg/kg Sediment (Trockengewicht) die Entwicklung von C. riparius. Fluoxetin führte ab einer Testkonzentration von 2 µg/l zu einer Reduzierung der Embryonenzahl bei P. antipodarum. Die EC10 für Carbamazepin wurde zu 113 µg/kg Sediment berechnet, die EC10 für Fluoxetin zu 0,81 µg/l. Beide Konzentrationen sind bei Berücksichtigung der im TGD vorgesehenen Sicherheitsfaktoren umweltrelevant (PEC/PNEC > 1). Als Grundlage dieser Berechnung dienten gemessene Umweltkonzentrationen im Sediment beziehungsweise Wasser. Ein negativer Effekt von Ciprofloxacin auf L. variegatus erschien anhand der Daten zwar möglich, konnte jedoch nicht statistisch belegt werden. Für Clofibrinsäure ergaben sich keine Hinweise auf negative Effekte im getesteten Konzentrationsbereich. 9.) Die vorliegenden Berechnungen sind weitaus tragfähiger als bisher vorliegende, da sie auf chronischen Toxizitätsdaten und gemessenen Umweltkonzentrationen beruhen, statt auf Akutdaten und geschätzten Umweltkonzentrationen. 10.) Die in den Versuchen festgestellten, sehr niedrigen Effektkonzentrationen lassen Effekte auch bei umweltrelevanten Konzentrationen als wahrscheinlich erscheinen. Indirekte Effekte wie vermindertes Futterangebot für Prädatoren oder Verschiebungen im Artenspektrum sind denkbar. 11.) Der Destruentenmikrokosmos erwies sich als prinzipiell geeignet, Effekte von Xenobiotika auf Einzeller zu untersuchen, da die Positivkontrolle funktionierte. Die Daten aus den Versuchsansätzen zeigen jedoch, dass Versuchsdesign und Haltung der Testorganismen weiter entwickelt werden müssen. 12.) Die vorliegenden Daten zeigen, dass Pharmaka bei umweltrelevanten Konzentrationen ein ökologisches Risiko darstellen können. Maßnahmen zur Risikominderung sind dringend erforderlich. Angesichts des therapeutischen Nutzens der Substanzen erscheinen Verbote nicht durchsetzbar.
Ziel der vorliegenden Arbeit war, Arzneistoffformulierungen, wie kationische Nanopartikel, Liposomen und virale Hüllkapside, für den Transport von Antisense-Oligonukleotiden in Zellen zu untersuchen. Der Schwerpunkt lag hierbei auf der in vitro Testung in der Zellkultur. Als Zielstruktur wurde der NMDA-Rezeptor gewählt, dessen Expression durch die Gabe von Antisense-Oligonukleotiden gehemmt wurde. Testobjekt waren murine Fibroblasten, die in einer Vorgängerarbeit von Ralf Steinmetz mit der cDNA für die entsprechenden NMDA-Rezeptorsubtypen transfiziert worden sind und deren Eignung für die Testung von Rezeptorantagonisten schon gezeigt worden ist. Beim NMDA-Rezeptor handelt es sich um einen ligandgesteuerten Ionenkanal, der normalerweise nur in neuronalem Gewebe zu finden ist. Eine Überexpression und anschließende Stimulation des Rezeptors führt über einen massiven Ca2+-Einstrom zum Absterben der Zellen. Dieses Modell erlaubte die Auswertung der Antisense-Wirkung in einem funktionellen Assay über ein reduziertes Absterbeverhalten der Zellen. Die spezifischen Reduktion des Zielproteins wurde mittels Western-Blot-Technik gezeigt. Alle eingesetzten Trägersysteme wurden hinsichtilich ihrer physiko-chemischen Eigenschaften untersucht. Im Mittelpunkt standen dabei die Bestimmung von Größe und Oberflächenladung (Zetapotential), die mit Hilfe der dynamischen Lichtstreuung (DLS) bestimmt wurden. Der Schwerpunkt bei der Untersuchung der Drug-Delivery-Systeme lag auf den biodegradierbaren Nanopartikeln auf Basis von Protamin. Im Anschluß an diese physikochemische Charakterisierung wurden diese Partikel in der Zellkultur im Vergleich zu freien, d.h. nicht an ein Trägersystem gebundenen, und zu liposomal (DOTAP) verpackten Oligonukleotiden getestet. Es zeigt sich, dass die Albumin-Protamin-Oligokukleotid-Formulierung gegenüber den freien Oligonukleotiden eine um den Faktor 12 verbesserte zelluläre Aufnahme aufweisen, was mit der liposomen Formulierung vergleichbar ist. Mit Hilfe der konfokalen Laser-Scan-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass 100 % der Zellen transfiziert worden sind. Es wurde sowohl im funktionellen Modell über Zelltod, als auch auf Proteinebene (Western-Blot) eine Reduktion des NMDA-Rezeptors von etwa 35 % 24 Stunden nach der Gabe des Oligonukleotide gefunden. Dieses Ergebnis spricht für eine intrazelluläre Freigabe der Oligonukleotide aus den Partikeln. Im Gegensatz zur liposomalen Zubereitung wurden keine zytotoxischen Nebenwirkungen der Nanopartikel gefunden. In einem abschließenden Vergleich wurden rekombinant hergestellte virale Hüllkapside (VP1 Kapside), zwei kationische liposomale Zubereitungen (DOTAP/Lipofectin), zwei kationische Alkylcyanoacrylat Nanopartikelpräparationen (PBCA/PHCA) und zwei auf Protamin basierende Nanopartikelsystme (mit/ohne Albumin-Zusatz) in der Zellkultur getestet. Untersucht wurde die Transfereffizienz für Oligonukleotide mittels einer Fluoreszenzmethode, die intrazelluäre Verteilung wurde im konfokalen Laser-Scan-Mikroskop dargestellt, es wurde eine Antisense-Wirkung im Vergleich zu einer Kontrollsequenz bestimmt (sowohl im funktionellen System, als auch im Western-Blot) und es wurden die zytotoxischen Nebenwirkungen betrachtet. Zusammenfassend ergaben diese Ergebnisse eine um das 2- bis 18-fache Erhöhung der Zellaufnahme im Vergleich zu freien Oligonukleotiden. Die protamin-basierten Nanopartikel zeigten keine nennenswerten zytotoxischen Nebenwirkungen.
Hintergrund: In der allgemeinmedizinischen Versorgung ist die Einbindung von Arzthelferinnen in der Betreuung depressiver Patienten ein innovatives Vorgehen. Jedoch ist wenig darüber bekannt, wie Arzthelferinnen ihre neue Aufgabe erleben. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Sichtweise und Erfahrungen von Arzthelferinnen, die ein Case Management für depressive Patienten in deutschen Hausarztpraxen durchgeführt haben. Methodik: Es handelt sich um eine qualitative Studie, die im Rahmen der PRoMPT-Studie (Primary Care Monitoring for Depressive Patients Trial) durchgeführt wurde. Mithilfe eines semistrukturierten Interviewleitfadens wurden 26 Arzthelferinnen interviewt und anschließend eine Inhaltsanalyse durchgeführt. Der Fokus lag dabei auf drei Schlüsselthemen: Rollenverständnis, Belastungsfaktoren und Krankheitskonzept. Ergebnisse: Die meisten Arzthelferinnen empfanden ihre neue Rolle als Bereicherung auf einer persönlichen und beruflichen Ebene. Sie sahen Ihre Hauptaufgabe in der direkten Interaktion mit den Patienten, während die Unterstützung der Hausärzte für sie von untergeordneter Bedeutung war. Belastende Faktoren durch die neue Arbeitsaufgabe betrafen die Arbeitsbelastung, die Arbeitsbedingungen und die Interaktion mit depressiven Patienten. Es zeigte sich ein sehr heterogenes Krankheitsverständnis bezüglich der Erkrankung Depression. Schlussfolgerung: Arzthelferinnen sind bereit, ihren Aufgabenbereich von Verwaltungsarbeiten auf mehr patientenzentrierte Tätigkeiten auszudehnen. Auch wenn Arzthelferinnen dabei verstärkt protokollierende Aufgaben übernehmen, ist die sich daraus ergebende Mehrbelastung nicht zu unterschätzen.
Arten von Aschersonia Mont. (Anamorphe von Hypocrella spp., Clavicipitaceae, Hypocreales, Sordariomycetidae, Askomycota) parasitieren Weiße Fliegen und Schildläuse. Petch (1921) stellte eine Monographie über Hypocrella und Aschersonia vor. Seit dieser Zeit wurden einige Arten neu beschrieben und vereinzelte Artkomplexe revidiert. Die vorgestellte Arbeit ist seit rund 80 Jahren das umfassendste Werk über die Gattung Aschersonia. Hierfür wurden Proben in Kuba, Malaysia, Mexico, Panama, Taiwan und Thailand gesammelt und z.T. kultiviert. Es werden 20 Arten detailliert vorgestellt und illustriert. Die Arten sind: A. acutispora, A. aurantiaca, A. australiensis, A. badia, A. basicystis, A. blumenaviensis, A. caespiticia [A. insperata, syn. nov.], A. columnifera, A. crenulata, A. duplex, A. hypocreoidea [A. goldiana, syn. nov.; A. confluens, syn. nov.], A. marginata, A. oxystoma, A. philippinensis, die Anamorphe von H. rhombispora, A. samoensis, A. taitensis [A. aleyrodis, syn. nov.; A. placenta, syn. nov.; A. tamurai, syn. nov.], die Anamorphe von H. tubulata, A. turbinata [A. coffeae, syn. nov.] und A. viridans. Hierzu wurden auch wichtige Merkmale wie Stromataform und Konidiengröße in situ und in vitro charakterisiert. Mit anderen gültigen Beschreibungen von Arten, die nicht untersucht werden konnten, gibt es 32 Arten. Zum ersten Mal wurden ausführliche Daten über die Wirtsinsekten sowie die Trägerpflanzen berücksichtigt. Erstmals wurde die Verbreitung der Aschersonia-Arten kritisch beleuchtet. Die Funde von A. acutispora, A. basicystis, A. hypocreoidea, A. oxystoma, A. turbinata und A. viridans sind Erstnachweise für Panama. Die Funde von A. australiensis, A. hypocreoidea, A. marginata und A. tubulata sind Erstnachweise für Taiwan. Zum ersten Mal wird für Arten der Gattung Aschersonia ein dichotomer Bestimmungsschlüssel vorgestellt. Es werden drei Hypothesen zur Phylogenie der Aschersonia spp. vorgestellt: 1. Die Stellung der Aschersonia spp. innerhalb der Clavicipitaceae basierend auf Sequenzdaten des LSU-Gens: Aschersonia bildet eine schwach unterstützte Paraphylie, dabei steht A. badia basaler als die übrigen Aschersonia-Arten. 2. Die Beziehung der Aschersonia spp. zueinander: A. badia und eng verwandte Arten parasitieren ausschließlich Weiße Fliegen und stehen basal. Arten einer zweiten Gruppe parasitieren Arten der Aleurodidae und Coccidae und Arten einer dritten Gruppe parasitieren ausschließlich Arten der Coccidae. 3. Eine phylogenetische Hypothese basierend auf Sequenzdaten der ITS: Es gibt noch zu wenig Sequenzen um eine eindeutige Aussage treffen zu können.
Medizinisch-technische Innovationen haben oftmals ihren Ursprung außerhalb des medizinischen Bereichs. Trotzdem werden diese Innovationen erstaunlich positiv aufgenommen, wobei durch sie ein sozialer Wandel, sowohl in der Medizin als auch in der Gesellschaft, in Gang gebracht wird. Dass eine anfangs unbekannte Technologie, die nicht dem ärztlichen Umfeld entstammt, eine große Euphorie auslöst – und nicht Skepsis – ist erstaunlich und bietet sich für Untersuchungen an. Dies ist umso bedeutender, da immer mehr Technologien von außerhalb in der Medizin Einfluss gewinnen. Die Auswirkungen sind hierbei äußerst langfristig. Die Radiologie bietet hierfür interessante Beispiele: Die Röntgenstrahlen wurden vor 110 Jahren entdeckt und haben unverzichtbare Verfahren der diagnostischen Radiologie ermöglicht. Der Computertomograph existiert seit 33 Jahren und hat in dieser Zeit deutliche Fortentwicklungen vollzogen. Die digitalen Bilder des Computertomographen haben heute eine Qualität erreicht, die damals undenkbar war. An das Internet oder die Teleradiologiewurde bei Erfindung des Computertomographen nicht gedacht, dennoch bilden digitale Bilder die Grundlage für weitere Verknüpfungen zwischen Informationstechnik und der Medizin. Die Computertomographie ist daher Ausgangspunkt für eine Digitalisierung in der Medizin. Die Diffusionsforschung technischer Innovationen kann nur unzureichend den extrem raschen Diffusionsverlauf der Computertomographen erklären. Es werden dort nur unzureichend Gründe berücksichtigt, die aus der Medizin kommen. Ein näherer Blick, welche Einflüsse bei der Einbettung medizinisch-technischer Innovationen gegeben sind, die in nichtmedizinischen Bereichen nicht existieren, lohnt sich. Ein Erkenntnisfortschritt kann nur erzielt werden, wenn diese Gründe untersucht werden. Oft wird der allgemeine medizinisch-technische Fortschritt als Erklärungsmuster für vielfältige Veränderungen in der Medizin genommen, lohnend ist jedoch eine Fokussierung auf eine konkrete Technologie. Der medizinisch-technische Fortschritt ist insgesamt für die Erstellung eines Erklärungsmusters zu diffus, um hinreichende Aussagekraft zu liefern. Die Dimensionen des medizinischen und des technischen Fortschrittsunterscheiden sich. Der medizinische Fortschritt bezieht sich auf die Gesundheit, während der technische Fortschritt Produktivitätssteigerungen bezweckt. Obwohl sich durch den Technikeinsatz Änderungen für Ärzte und Gesellschaft ergeben, und Technik in der Medizin an Einfluss gewonnen hat, hat die theoretische Verknüpfung nicht in dem Maß stattgefunden, wie die Technik Einfluss in der Medizin gefunden hat. Theorien, die für Innovationen eine allgemeine Gültigkeit besitzen, werden für die Medizin unzureichend angepasst, daher besteht nur eine oberflächliche Verbindung beider Bereiche. Die Besonderheiten der Medizin bleiben dadurch unbeobachtet oder gehen verloren. Ob ein generalisierender Ansatz das Entstehen und Verbreiten medizinisch-technischer Innovationen richtig erfassen kann, ist zweifelhaft. Soziotechnische Allianzen zwischen Radiologen und Industrie ermöglichen die Einführung einer Innovation. Die teuere Entwicklung der Technologie stellt für den Unternehmer ein Wagnis dar. Die gegenseitigen Beziehungen zwischen Industrie und Radiologen reduzieren das Risiko des Unternehmers und erhöhen die Chance des Arztes ein neues brauchbares Hilfsmittel zu erhalten. Teuere Geräte werden so möglich, da die Akzeptanz in der Medizin signalisiert wurde, dennoch stehen die Auswirkungen des Technikeinsatzes in der Medizin und für die Gesellschaft zu diesem Zeitpunkt noch gar nicht fest. Der medizinische Nutzen ist u. U. ebenfalls noch ungeklärt.
Die Analyse von DNA-Sequenzen steht spätestens seit der Feststellung ihrer tragenden Rolle in der Vererbung organismischer Eigenschaften im Fokus biologischer Fragestellungen. Seit Kurzem wird mit modernsten Methoden die Untersuchung von kompletten Genomen ermöglicht. Dies eröffnet den Zugang zu genomweiten Informationen gegenüber begrenzt aussagekräftigen markerbasierten Analysen. Eine Genomsequenz ist die ultimative Quelle an organismischer Information. Allerdings sind diese Informationen oft aufgrund technischer und biologischer Gründe komplex und werfen meist mehr Fragen auf, als sie beantworten.
Die Rekonstruktion einer bislang unbekannten Genomsequenz aus kurzen Sequenzen stellt eine technische Herausforderung dar, die mit grundlegenden, aber in der Realität nicht zwingend zutreffenden Annahmen verbunden ist. Außerdem können biologische Faktoren, wie Repeatgehalt oder Heterozygotie, die Fehlerrate einer Assemblierung stark beeinflussen. Die Beurteilung der Qualität einer de novo Assemblierung ist herausfordernd, aber zugleich äußerst notwendig. Anschließend ist eine strukturelle und funktionale Annotation von Genen, kodierenden Bereichen und repeats nötig, um umfangreiche biologische Fragestellungen beantworten zu können. Ein qualitativ hochwertiges und annotiertes assembly ermöglicht genomweite Analysen von Individuen und Populationen. Diese Arbeit beinhaltet die Assemblierung und Annotation des Genoms der Süßwasserschnecke Radix auricularia und eine Studie vergleichender Genomik von fünf Individuen aus verschiedenen molekularen Gruppen (MOTUs).
Mollusken beherbergen nach den Insekten die größte Artenvielfalt innerhalb der Tierstämme und besiedeln verschiedenste, teils extreme, Habitate. Trotz der großen Bedeutung für die Biodiversitätsforschung sind verhältnismäßig wenige genomische Daten öffentlich verfügbar. Zudem sind Arten der Gattung Radix auch aufgrund ihrer großen geografischen Verbreitung in diversen biologischen Disziplinen als Modellorganismen etabliert. Eine annotierte Genomsequenz ermöglicht über bereits untersuchte Felder hinaus die Forschung an grundlegenden biologischen Fragestellungen, wie z.B. die Funktionsweise von Hybridisierung und Artbildung. Durch Assemblierung und scaffolding von sechs whole genome shotgun Bibliotheken verschiedener insert sizes und einem transkriptbasiertem scaffolding konnte trotz des hohen Repeatgehalts ein vergleichsweise kontinuierliches assembly erhalten werden. Die erhebliche Differenz zwischen der Gesamtlänge der Assemblierung und der geschätzten Genomgröße konnte zum Großteil auf kollabierte repeats zurückgeführt werden.
Die strukturelle Annotation basierend auf Transkriptomen, Proteinen einer Datenbank und artspezifisch trainierten Genvorhersagemodellen resultierte in 17.338 proteinkodierenden Genen, die etwa 12,5% der geschätzten Genomgröße abdecken. Der Annotation wird u.a. aufgrund beinhaltender Kernrthologen, konservierter Proteindomänenarrangements und der Übereinstimmung mit de novo sequenzierten Peptiden eine hohe Qualität zugesprochen.
Das mapping der Sequenzen von fünf Radix MOTUs gegen die R. auricularia Assemblierung zeigte stark verringerte coverage außerhalb kodierender Bereiche der nicht-Referenz MOTUs aufgrund hoher Nukleotiddiversität. Für 16.039 Gene konnten Topologien berechnet werden und ein Test auf positive Selektion ausgeführt werden. Insgesamt konnte über alle MOTUs hinweg in 678 verschiedenen Genen positive Selektion detektiert werden, wobei jede MOTU ein nahezu einzigartiges Set positiv selektierter Gene beinhaltet. Von allen 16.039 untersuchten Genen konnten 56,4% funktional annotiert werden. Diese niedrige Rate wird vermutlich durch Mangel an genomischer Information in Mollusken verursacht. Anschließende Analysen auf Anreicherungen von Funktionen sind deshalb nur bedingt repräsentativ.
Neben den biologischen Ergebnissen wurden Methoden und Optimierungen genomischer Analysen von Nichtmodellorganismen entwickelt. Dazu zählen eigens angefertigte Skripte, um beispielsweise Transkriptomalignments zu filtern, Trainings eines Genvorhersagemodells automatisiert und parallelisiert auszuführen und Orthogruppen bestimmter Arten aus einer Orthologievorhersage zu extrahieren. Zusätzlich wurden Abläufe entwickelt, um möglichst viele vorhandene Daten in die Assemblierung und Annotation zu integrieren. Etwa wurde ein zusätzliches scaffolding mit eigens assemblierten Transkripten mehrerer MOTUs sequenziell und phylogenetisch begründet ausgeführt.
Insgesamt wird eine umfassende und qualitativ hochwertige Genomsequenz eines Süßwassermollusken präsentiert, welche eine Grundlage für zukünftige Forschungsprojekte z.B. im Bereich der Biodiversität, Populationsgenomik und molekularen Ökologie bietet. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen einen Wissenszuwachs in der Genomik von Mollusken dar, welche bisher trotz ihrer Artenvielfalt deutlich unterrepräsentiert bezüglich assemblierter und annotierter Genome auffallen.
Hypoglykämien stellen in der Behandlung des Typ 1-Diabetes Mellitus ein zentrales Problem dar. Mit dem Ziel, eine möglichst physiologische Insulinsubstitution zu erreichen, um diabetische Folgeschäden zu vermeiden, steigt auch die Gefahr von Hypoglykämien deutlich an. Werden diese Hypoglykämien von den Typ-1-Diabetikern als solche erkannt, können sie durch Kohlenhydratzufuhr sehr einfach behandelt werden. Problematischer ist es, wenn die Unterzuckerung asymptomatisch bleibt und in schweren Fällen bis zum Krampfanfall oder zur Bewusstlosigkeit führt. Dies stellt eine hohe psychische Belastung für die Betroffenen und deren Umfeld dar. Man weiss, dass mit steigender Erkrankungsdauer auch die Wahrscheinlichkeit steigt, eine Hypoglykämiewahrnehmungsstörung zu entwickeln. Jedoch scheinen nicht alle Typ-1-Diabetiker im Laufe ihrer Erkrankung eine Hypoglykämiewahrnehmungsstörung zu entwickeln, so dass hier von einer zusätzlichen genetischen Genese dieses Krankheitsbildes ausgegangen werden kann. Hierzu untersuchte die dänische Arbeitsgruppe um Pedersen-Bjergaard 171 Typ-1-Diabetiker hinsichtlich ihrer Hypoglykämiewahrnehmung und der Enzymaktivität beziehungsweise dem Genpolymorphismus des Angiotensin-Converting-Enzyms (ACE). Es wurde festgestellt, dass Typ-1-Diabetiker mit einer hohen Enzymaktivität, beziehungsweise dem Genpolymorphismus D/D (Deletionsallel) des ACE, ein 2.5-fach höheres Risiko haben eine Hypoglykämiewahrnehmungsstörung zu entwickeln als Typ-1-Diabetiker mit einer niedrigen Enzymaktivität beziehungsweise dem Genpolymorphismus I/I (Insertionsallel) des ACE. Sollten sich diese Daten in weiteren Studien bestätigen, könnte man mittels relativ einfacher Blutuntersuchung Voraussagen treffen, ob ein Typ-1-Diabetiker im Laufe der Erkrankung eine Hypoglykämiewahrnehmungsstörung entwickeln wird oder nicht. Dies hätte direkten Einfluss auf die individuelle Behandlungsstrategie. Diese mittels Fragebogen und Blutentnahme (zur Enzymbestimmung) erhobenen Daten wollten wir in dieser Studie experimentell verifizieren. Wir verwendeten die in der Hypoglykämieforschung etablierte hypoglykämische Glukose-Clamp-Technik. 26 Typ-1-Diabetiker wurden mittels experimentell induzierter und kontrollierter Hypoglykämie hinsichtlich ihrer Hypoglykämiewahrnehmung auf endokriner, symptomatischer und neuropsychologischer Ebene untersucht. Dazu wuden die jeweiligen Blutglukose-Spiegel mittels intravenös appliziertem Insulin auf 90 mg/dl (Euglykämie), 60 mg/dl (milde Hypoglykämie) und 45 mg/dl (moderate Hypoglykämie) stabilisiert, um auf diesen Blutglukose-Niveaus Blutbestimmungen vorzunehmen, Symptome abzufragen und Reaktionstests durchzuführen. Die Enzymaktivitäten des ACE sowie der jeweilige Genpolymorphismus dieses Enzyms wurden aus venösem Vollblut bestimmt. Es wurden zwei Gruppen mit je 13 Probanden mit hoher versus niedriger ACE-Aktivität am Median der absoluten Enzymaktivität des Angiotensin-Converting-Enzyms gebildet. Die Auswertung unserer Daten zeigte eine qualitativ gut durchgeführte Untersuchung, die angestrebten Blutzuckerspiegel wurden erreicht und alle Probanden haben die geforderten Tests beziehungsweise Fragebögen absolviert. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied der Typ-1-Diabetiker mit einer hohen ACE-Aktivität hinsichtlich ihrer Hypoglykämiewahrnehmung auf endokriner, symptomatischer und neuropsychologischer Ebene gegenüber der Vergleichsgruppe mit niedriger ACE-Aktivität. Die von Pedersen-Bjergaard veröffentlichten Daten konnten in dieser Arbeit experimentell nicht nachgewiesen werden. Es ist allerdings zu bedenken dass die von Pedersen-Bjergaard publizierten Arbeiten anhand retrospektiv ermittelter Daten entstanden sind, wohingegen in dieser vorgelegten Arbeit die Daten in einer experimentellen klinischen Studie erhoben worden sind. Als entscheidenden Nachteil dieser Arbeit darf man das geringe Probandenkollektiv sehen, was die statistische Aussagekraft verringert. Weitere klinische Studien mit einer größeren Anzahl an Probanden sollten folgen, um nach genetischen Ursachen für die Entstehung einer Hypoglykämiewahrnehmungsstörung zu suchen.
HINTERGRUND: Asthma ist die häufigste chronische Krankheit bei Kindern und Jugendlichen, wobei bei einem Großteil bereits erste Exazerbationen im Vorschulalter auftreten. Diese sind meist mit stationären Aufenthalten verbunden, jedoch gibt es nur wenige detaillierte zeitliche und demografische Untersuchungen dieser besonders schweren Asthmakohorte. Ebenso gibt es kaum Untersuchungen über die Verteilung der Asthmaphänotypen in dieser Altersgruppe.
METHODEN: Es erfolgte eine retrospektive Analyse von 572 Krankenhausaufenthalten im Universitätsklinikum für Kinder- und Jugendmedizin Frankfurt mit der ICD Diagnose Asthma (J.45) zwischen dem 1. Januar 2008 und dem 31. Dezember 2017 bei Kindern im Alter 1-5 Jahren. Die Aufteilung erfolgte in drei Phänotypen. Allergisches Asthma (RAST und/oder Prick-Test positiv), eosinophiles Asthma (Eosinophilie >300/µl und RAST/Prick-Test negativ) und nicht-allergisches Asthma (Eosinophilie ≤300/µl und RAST/Prick-Test negativ). Akut schweres Asthma wurde definiert als akute Dyspnoe, Tachypnoe, Sauerstoffbedarf und/oder systemische Steroidtherapie. Analysiert wurden u.a. Alter, Geschlecht, Liegezeit, Therapie und Re-Hospitalisierungsrate.
ERGEBNISSE: Von 572 Krankenhausaufenthalten mit der Diagnose Asthma erfüllten 205 Patienten die Definition eines akut schweren Asthmas. Von diesen 205 Kindern wurden bereits n=55 (26,8%) vor der stationären Aufnahme mit einem inhalativen Steroid (ICS) behandelt. Die phänotypische Charakterisierung ergab folgende Verteilung: 49% wiesen Allergisches Asthma, 15% Asthma mit atopischer Dermatitis, 10% eosinophiles nicht-allergisches Asthma und 26% nicht-allergisches Asthma. Von diesen Patienten wurden 71.7% mit ICS und 15,1% mit Montelukast als Monotherapie entlassen. Die Rate der Notfallvorstellung (Notfallambulanz und Re-Hospitalisierung) innerhalb von 12 Monaten nach Entlassung war mit n=42 (20,5%) hoch. Die Zahl der Eosinophilen (> 300 µl) hatte keinen Einfluss auf die Re-Hospitalisierung. Es zeigte sich eine hohe Verschreibung von Antibiotika bei Asthma-Patienten (143 (69,8%) der 205 Patienten) während des stationären Aufenthalts, wobei nur 42 Patienten (20,5%) einen CRP-Wert über 2 mg/dl aufwiesen.
Schlussfolgerung: Obwohl die Asthmaprävalenz bei Schulkindern höher ist, leiden Vorschulkinder im Alter von 1-5 Jahren häufiger an schweren Asthma-Exazerbationen mit Hospitalisierung. Trotz protektiver Therapie mit ICS oder Montelukast ist die Re-Hospitalisierungsrate hoch. Die bisherigen Therapiekonzepte reichen in dieser Altersgruppe anscheinend nicht aus, um Patienten mit schwerem Asthma im Vorschulalter ausreichend zu kontrollieren. Neue Therapiekonzepte wie die Triple-Therapie mit Zugabe des Long-Acting Muscarin Rezeptors (Tiotropium) sollten dringend evaluiert werden.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von neuen enantioselektiven und diastereoselektiven Brønsted-Säure katalysierten Reaktionen. Das Aktivierungsprinzip entspricht dabei einer klassischen Säure-Base-Reaktion, in der eine Brønsted-Säure einen Elektronenpaar-Donor protoniert, woraus die Bildung eines Ionenpaares resultiert. Erweitert man dieses Konzept durch den Einsatz einer chiralen Protonenquelle und verwendet als Base ein prochirales Substrat, wie ein Imin, so entsteht durch dessen Protonierung ein chirales Ionenpaar, wodurch das Substrat einerseits aktiviert wird und anderseits asymmetrische Induktion über das chirale Anion erfährt. Greift in dem darauf folgenden Schritt ein Nucleophil selektiv über eine Seite des positiv geladenen Elektrophils an, so bildet sich enantioselektiv ein neues Stereozentrum. Die Natur nutzt dieses Prinzip zum Aufbau von optisch reinen α-Aminosäuren. So katalysiert die Glutamatdehydrogenase (GDH) die Darstellung von Glutaminsäure durch Protonierung des entsprechenden α-Iminoglutarats, wodurch der nachfolgende Hydrid-Angriff mittels Nicotinamidadenindinukleotid (NADH) selektiv die (L)-Aminosäure liefert. Dieses Konzept konnte während der eigenen Diplomarbeit auf die enantioselektive Brønsted-Säure katalysierte Transferhydrierung von Ketiminen übertragen werden. Dabei simuliert eine chirale Protonenquelle 1 das Enzym (GDH) und das Reduktionsmittel NADH wird durch ein synthetisches Analogon, das Hantzsch Dihydropyridin 8a ersetzt ... Die vorliegende Arbeit ist kumulativ verfasst. Der größte Teil der hier vorgestellten Ergebnisse ist bereits veröffentlicht oder zur Publikation eingereicht. Die experimentellen Daten sind Bestandteil der in Kapitel 10 aufgeführten Publikationen und werden nicht gesondert diskutiert. Folgende Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Highly Enantioselective Organocatalytic Carbonyl-Ene Reaction with strongly Acid, Chiral Brønsted Acids as Efficient Catalysts Rueping M., Theissmann T., Kuenkel A., Koenigs R.M., Angewandte Chemie International Edition 2008, 47, 6798, Angewandte Chemie 2008, 120, 6903. Asymmetric counterion pair catalysis: An enantioselective Brønsted acid-catalyzed protonation Rueping M., Theissmann T., Raja S., Bats J.W., Advanced Synthesis & Catalysis 2008, 350, 1001. An enantioselective chiral brønsted acid catalyzed imino-azaenamine reaction Rueping M., Sugiono E., Theissmann T., Kuenkel A., Köckritz A., Pews-Davtyan A., Nemati N., Beller M., Organic Letters 2007, 9, 1065. Remarkably low catalyst loading in Brønsted acid catalyzed transfer hydrogenations: Enantioselective reduction of benzoxazines, benzothiazines, and benzoxazinones Rueping M., Antonchick A.P., Theissmann T., Angewandte Chemie International Edition 2006, 45, 6751, Angewandte Chemie 2006, 118, 6903. A highly enantioselective brønsted acid catalyzed cascade reaction: Organocatalytic transfer hydrogenation of quinolines and their application in the synthesis of alkaloids Rueping M., Antonchick A.P., Theissmann T., Angewandte Chemie International Edition 2006, 45, 3683, Angewandte Chemie 2006, 118, 3765. Metal-free Brønsted acid catalyzed transfer hydrogenation - New organocatalytic reduction of quinolines Rueping M., Theissmann, T., Atonchick A.P., Synlett 2006, 1071. The twinned crystal structure of diiodobis(triphenylphosphine) palladium(II) dichloromethane disolvate at 173 K Theissmann T., Bolte M., Acta Crystallographica Section E, 2006, E62, 1056. Folgende Manuskripte wurden zur Veröffentlichung eingereicht: First Enantioselective Chiral Brønsted Acid Catalyzed Synthesis of 4´-Substituted Tetrahydroquinolines Rueping M., Theissmann T., Stoeckel M., Atonchick A.P. Asymmetric Organocatalytic Reductions in the Enantioselective Synthesis of Fluoroquinolones, Flumiquine and Levofloxacin Rueping M, Stoeckel M., Theissmann T., Haack K. Synthesis and Structural Investigations of H8-BINOL-derived N-triflylphosphoramides Rueping M., Nachtsheim B.J., Koenigs R., Ieawsuwan W., Theissmann T. Buchbeitrag: Metal-free Brønsted Acid Catalyzed Transfer-Hydrogenation: Enantioselective Synthesis of Tetrahydroquinolines Rueping M., Theissmann T., Atonchick A.P., Catalysts for Fine Chemical Industry, Vol. 5, 2006
Über Dihydropyrazine vom Typ 13 sind nach Deprotonierung mit KHMDS in Position C-2' und Umsetzung mit Elektrophilen Dihydropyrazine des Typs 41 zu 74-80 % mit Diastereoselektivitäten von 57-67 % d.e. zugänglich. Dihydropyrazine vom Typ 41 sind Vorstufen für ce-Alkyl-Carbonsäuren und liefern bei der Hydrolyse mit Kallum-rert.-Butanolat/Wasser Carbonsäuren 42 zu 90 %. Die Hydrolyse verläuft racemisierungsfrei. Der chirale Hilfsstoff 3a kann zurückgewonnen werden. Die Q-silylgeschlitzten Dihydropyrazine 68a,b sind hochdiastereoselektiv baseninduziert zu Dihydropyrazinen der Typen 70, 71 alkylierbar. Die Dihydropyrazine 74 liefern über eine Retro-Aldolreaktion bei der Umsetzung mit Kalium-tert-Butanolat unter Selbstreproduktion des stereogenen Zentrums an C-2 diastereoselektiv die Dihydropyrazine 77 in Ausbeuten von 55 - 60 % (d.e.= 56 75 %).
Wir führen eine neue Unterklasse der Fourier Hyperfunktionen mit polynomialen Wachstumsbedingungen ein mit dem Ziel, asymptotische Entwicklungen von Hyperfunktionen studieren zu wollen, wie sie für gewisse Distributionenklassen bekannt sind. Wir entwickeln zuerst die Theorie analytischer Funktionale auf Räumen integrabler Funktionen bezüglich Maßen mit Wachstum O(|Re z|^gamma), wobei gamma in R ist, im Unendlichen. Ein an das berühmte Phragmén-Lindelöf-Prinzip erinnerndes, einfaches analytisches Resultat bildet die Basis der Dualitätstheorie dieser Räume zu Funktionen mit festgelegtem Wachstumstyp. Wir studieren diese Dualität analytischer Funktionale mit Wachstumsbedingungen und unbeschränkten Trägern gründlich in einer Dimension unter Verwendung des von den Fourier Hyperfunktionen her bekannten exponentiell abfallenden Cauchy-Hilbert-Kerns. Daraus ergeben sich Analoga zu den Theoremen von Runge und Mittag-Leffler, die die Grundlage für die Garbentheorie der Hyperfunktionen mit polynomialen Wachstumsbedingungen sind, die wir sodann entwickeln. Die für uns wichtigsten neuen Klassen von Fourier Hyperfunktionen sind die von unendlichem Typ, das heißt solche, die wie eine beliebige Potenz wachsen beziehungsweise schneller als jede Potenz abfallen. In n Dimensionen benutzen wir die Fouriertransformation und Dualität um das Verhältnis dieser temperierten beziehungsweise asymptotischen Hyperfunktionen zu bekannten Distributionenräumen zu studieren. Wir leiten Theoreme vom Paley-Wiener-Typ her, die es uns erlauben, unsere Hyperfunktionen in ein Schema zu ordnen, das Wachstumsordnung und Singularität gegenüberstellt. Wir zeigen, daß dieses Schema eine sinvolle Erweiterung des von Gelfand und Shilow zur Charakterisierung von Testfunktionenräumen eingeführten Schemas der Räume S(alpha,beta) um verallgemeinerte Funktionen ist. Schließlich zeigen wir die Nuklearität der temperierten und asymptotischen Hyperfunktionen. Wir zeigen, daß die asymptotischen Hyperfunktionen genau die Klasse bilden, die Moment-asymptotische Entwicklungen erlauben, wie sie von Estrada et al. für Distributionen betrachtet wurden. Estradas Theorie ist damit ein Spezialfall der unsrigen. Für Hyperfunktionen lassen sich aber dank des Konzeptes der standard definierenden Funktionen die Moment-asymptotischen Entwicklungen als klassische asymptotische Entwicklungen von analytischen Funktionen verstehen. Wir zeigen die einfache Beziehung zwischen der Moment-asymptotischen Entwicklung und der Taylorentwicklung der Fouriertransformierten und benutzen dann ein Resultat von Estrada, um die Vollständigkeit unseres Moment-asymptotischen Schemas abzuleiten. Wir geben genaue Bedingungen für die Moment-Folgen von Hyperfunktionen mit kompaktem Träger an, die kürzlich von Kim et al. gefunden wurden. Die asymptotischen Entwicklungen übertragen wir auf den höherdimensionalen Fall, indem wir die von Kaneko und Takiguchi eingeführte Radontransformation für Hyperfunktionen verwenden. Die wohlbekannte Beziehung zwischen Radon- und Fouriertransformation zeigt wiederum das enge Verhältnis von asymptotischer Entwicklung zur Taylorentwicklung der Fouriertransformierten. Wir benutzen Kims Resultate, um die Moment-Folgen von Hyperfunktionen zu charakterisieren, die von Kugeln mit endlichem Radius getragen werden. Schließlich verwenden wir das Träger-Theorem der Radontransformation, um ein Resultat über das Singularitätenspektrum aus Bedingungen an die Radontransformierte abzuleiten.
Nichtmethan-Kohlenwasserstoffe sind in Gegenwart von Stickstoffoxiden (NO, NO2) wichtige Vorläufersubstanzen von troposphärischen Photooxidantien (z. B. Ozon), die beim photochemischen Metabolismus gasförmiger organischer Verbindungen durch Hydroxylradikale (OH) unter Einwirkung von Sonnenlicht gebildet werden. Experimenteller Beitrag dieser Arbeit ist die Charakterisierung, Modifizierung, Optimierung und Qualitätssicherung des zur Messung von leichtflüchtigen atmosphärischen C2-C10 Kohlenwasserstoffen verwendeten mobilen Gaschromatographen (GC) mit Flammenionisationsdetektor (AirmoVOC HC2010). Im Rahmen des vom BIvIBF geförderten Berlin Ozonexperiments BERLIOZ, das im Sommer 1998 im Großraum Berlin/Brandenburg stattfand, wurden an einer ländlichen Bodenstation in Blossin, 40 km südöstlich Berlins, in situ Messungen von 69 Nichtmethan-Kohlenwasserstoffen durchgeführt. im Vorfeld der Feldkampagne wurde der GC einer umfangreichen Qualitätssicherung unterzogen. Bei einer Immissionsvergleichsmessung, die unter Beteiligung aller Arbeitsgruppen stattfand, ergab sich eine mittlere konzentrationsabhängige Abweichung des HC-2010 von ± 16% und ein konstanter Offset (Bias) von 0,71 nmol/m3 (16 pptv) vom Referenzmeßverfahren des Forschungszentrums Jülich. Die Geräteblindwerte waren für die meisten Analyten kleiner 0,3 nmol/m3 (6 pptv). Aus der dreifachen Standardabweichung der Blindwerte ergaben sich die für Außenluftuntersuchungen geforderten Nachweisgrenzen um 0,4 nmol/m3 (10 pptv). Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der BERLIOZ-Datensatz hinsichtlich einer Bestandsaufnahme ausgewertet. Die beobachteten Konzentrationen der einzelnen Kohlenwasserstoffe wiesen jeweils eine logarithmische Normalverteilung auf, die Charakterisierung des Datensatzes erfolgte deshalb nicht anhand von arithmetischem Mittelwert und Standardabweichung, sondern mit geometrischem Mittelwert und multiplikativer Standardabweichung. Anhand der OH-Verlustrate wurde der Einfluß der verschiedenen Kohlenwasserstoffe auf die lokale Bildung von Photooxidantien untersucht. Der natürliche Kohlenwasserstoff Isopren lieferte mit 70% den weitaus größten mittleren Beitrag zur Photooxidantienproduktion am Boden. In der Grenzschicht verlor isopren allerdings seine dominante Rolle. Sein Beitrag schrumpfte mit zunehmender Höhe auf 20-40%. in der in 200 m Höhe beobachteten Abluftfahne Berlins verursachten anthropogene Kohlenwasserstoffe rund 2/3 der OH-Verlustrate, wobei die reaktiven C3/C4-Alkene alleine bereits 50% beitrugen.
1.) Die A1AO-ATP-Synthase wurde aus Membranen von P. furiosus unter Erhalt der Struktur isoliert. Das Enzym wurde durch PEG-Fällung, Dichtegradientenzentrifugation, Anionenaustausch-Chromatographie und Gelfiltration zur Homogenität gereinigt. 2.) Die neun aus dem Gencluster vorhergesagten Untereinheiten konnten durch Maldi-TOF-Analysen oder MS/MS identifiziert werden. Die molekulare Masse der A1AO-ATP-Synthase wurde durch LILBID-Analysen zu 730+/-10 kDa bestimmt. 3.) Die funktionelle Kopplung der A1- und AO-Domäne wurde durch Studien mit dem Inhibitor DCCD und TBT nachgewiesen. Weitere ATP-Synthase spezifische Inhibitoren wie DES, Dienestrol und Hexestrol waren in der Lage, das Enzym zu inhibieren. Die I50-Werte betrugen für DES 0,36 mM, für Dienestrol 0,52 mM und für Hexestrol 0,59 mM. 4.) Die ATPase-Aktivität war bei 100°C und pH 6 optimal. Das Enzym hydrolysierte Mg-ATP als bevorzugtes Substrat mit einer maximalen Geschwindigkeit von 1,7 U/mg und einem KM von 0,63 mM. 5.) Die ATPase-Aktivität war Na+-abhängig. Der KM-Wert betrug 0,6 mM. Li+ konnte Na+ substituieren, K+ war dazu nicht in der Lage. Die Wirkung des Inhibitors DCCD (I50 100 μM) konnte durch Zugabe von 5 mM NaCl bis zu einer Konzentration von 0,25 mM aufgehoben werden. Dies war der erste Nachweis einer Na+-abhängigen A1AO-ATP-Synthase. 6.) Das für die c-Untereinheit kodierende Gen wurde aus chromosomaler DNA amplifiziert und sequenziert. Die Genverdopplung konnte bestätigt werden, ebenso die Vorhersage nur einer Ionenbindestelle (Helix 4). Durch LILBIDAnalysen wurde eine Verdopplung der c-Untereinheit aufgrund der molekularen Masse (15,8 kDa) im gereinigten Komplex nachgewiesen. 7.) Die Bildrekonstruktion aus 7400 Einzelbildern zeigte einen Komplex aus zwei Domänen, die durch einen zentralen und zwei periphere Stiele miteinander verbunden sind. Ausgehend von den Summenbildern wurde erstmals eine D-Rekonstruktonsmappe einer A1AO-ATP-Synthase generiert, mit einer Auflösung von 23 Å. In diese 3D-Rekonstruktionsmappe wurden Untereinheiten gelöster Struktur modelliert. Mit Hilfe dieser Daten konnte die voraussichtliche Stöchiometrie der A1AO-ATP-Synthase von P. furiosus zu A3B3CDFE2H2ac10 bestimmt werden. 8.) Durch LILBID-Analysen mit erhöhter Laserintensität wurde ein Subkomplex mit einer molekularen Masse von 233-236 kDa detektiert. Biochemische Daten weisen auf einen Komplex aus einer Kopie der Untereinheit a und 10 Kopien der Untereinheit c hin. Zusammen mit der 3D-Rekonstruktion wurden unabhängige Evidenzien für einen c-Ring bestehend aus 10 Kopien des Monomers mit je 4 transmembranenen Helices und nur einer Ionenbindestelle erhalten. Dies würde eine Na+/ATP-Stöchiometrie von 3,3 ergeben und erklären, warum die A1AO-ATP-Synthase von P. furiosus trotz der V-Typ artigen c-Untereinheit ATP synthetisiert. 9.) Mit dem gereinigten Enyzm wurde eine 3D-Kristallisation durchgeführt. Die resultierenden Kristalle hatten tetraedrische Gestalt, waren 10 x 5 nm groß und wuchsen über einen Zeitraum von 30 Tagen. Die Kristalle beugten Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von 15 Å. 10.) Zum Nachweis einer möglichen Na+-Abhängigkeit der ATP-Synthase von M. jannaschii wurde ein Na+-armer Puffer mit Sulfit hergestellt, da bereits eine Sulfitabhängigkeit der ATPase-Aktivität nachgewiesen wurde. Es konnte für die A1AO-ATP-Synthase keine Na+-Abhängigkeit der ATPase- Aktivität zwischen 0,07-400 mM nachgewiesen werden. 11.) Ein Subkomplex konnte durch mehrmaliges Auftauen und Einfrieren der A1AO-ATP-Synthase-haltigen Proteinlösung erhalten werden. Der Komplex enthielt die Untereinheiten ABFDacx. Die Untereinheiten C, E und H fehlten dem Komplex, was zu einem Zerfall in hydrophile und hydrophobe Domäne während der Präparation führte. Es konnten in der elektronenmikroskopischen Untersuchung nur Kopfteile detektiert werden. 12.) Die heterolog produzierte A1AO-ATP-Synthase aus M. mazei Gö1 wurde durch das Detergenz Dodecylmaltosid am besten aus der Cytoplasmamembran von E. coli solubilisiert. 13.) TBT ist ein potenter Inhibitor der heterolog produzierten A1AO-ATP-Synthase (I50=60 μM). Der Wirkort konnte durch Vergleichsmessung mit der heterolog produzierten A1-Domäne identifiziert werden. TBT interagiert mit der AODomäne archäeller ATP-Synthasen und ist daher geeignet, die Kopplung der heterolog produzierten A1AO-ATP-Synthase nachzuweisen.