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Hintergrund: Die kardiale Magnetresonanztomographie (CMR) gilt als Referenzstandard für die Beurteilung der linksventrikulären Funktion und des Volumens des linken Ventrikels (LV). Neuartige Echtzeittechniken versprechen eine schnelle Bildgebung bei freier Atmung mit ähnlicher Qualität. Ziel dieser Studie war es, die Genauigkeit der standardmäßigen Steady-State-Free-Precession (SSFP)-Cine-Bildgebung bei angehaltenem Atem mit der gleichen Sequenz unter Verwendung von drei Signalmittelungen, während freier Atmung sowie mit einer Compressed-Sensing (Cs)- Echtzeittechnik während der freien Atmung zur Beurteilung von LV-Volumen und Masse zu vergleichen.
Methoden: 24 Probanden wurden mit einer Standard-SSFP-Technik bei angehaltenem Atem (BH), mit derselben Technik bei freier Atmung unter Verwendung von drei durchschnittlichen Herzzyklen (SA-FB) sowie mit einem CS-Echtzeitprotokoll bei freier Atmung (CS-FB) untersucht. Verglichen wurden die Erfassungsdauer, die Genauigkeit sowie die Inter- und Intraobserver-Variabilität von LV-Funktion, Volumen und Masse.
Ergebnisse: Die Echtzeit-Bildgebung war erheblich schneller als die freie Atmung mit drei Signalmittelwerten (p<0.001). Die Korrelation zwischen dem Referenzstandard (BH) und den beiden anderen Techniken war ausgezeichnet mit einem r2 für SA-FB vs. BH zwischen 0.74 - 0.89 und einem r2 für CS-FB vs. BH zwischen 0.81 und 0.94. SA-FB ergab mittlere Fehler zwischen 5.9% und 15% für verschiedene LV-Parameter, während CS-FB zu mittleren Fehlern von 6.5%bis 13% führte. Die Inter- und Intraobserver-Variabilität war bei der Echtzeit-Bildgebung ausgezeichnet und bei der SSFP-Bildgebung (SA-FB und BH) gut.
Schlussfolgerung: Sowohl ein Standardprotokoll mit 3 Signalmittelungen, während der freien Atmung als auch die Compressed Sensing liefern genaue und reproduzierbare Messungen des LV, während die Echtzeit-Bildgebung wesentlich schneller ist.
Cytochrome P450 enzymes are a large superfamily of membrane-bound heme-containing monooxygenases. They are essential for the oxidative metabolism of endogenous substrates such as steroids and fatty acids, and biotransformation of xenobiotic substrates such as pollutants and drugs. Although the highest expression of CYPs is found in the liver, their cardiovascular expression is not negligible with CYP450 subfamilies being responsible for the production of vasoactive lipids. Of importance, the enzymatic activity of all microsomal CYP450 isoenzymes is dependent on the cytochrome P450 reductase (POR), an electron donor.
In the first part of this work, the role of cytochrome P450 monooxygenases on the biotransformation of organic nitrates was investigated. Recombinant SupersomesTM were selected and incubated with NTG and PETN, where nitrite release was measured as a nitric oxide (NO) footprint. The capacity of the recombinant POR/CYP450 system to release nitrite from NO prodrugs was shown to be CYP-specific and dose-dependent. To study the involvement of CYP450 enzymes in the vascular biotransformation of organic nitrates in vivo, a smooth muscle-cell specific, inducible knockout model of POR (smcPOR-/-) was generated. Organ chamber experiments revealed that the vascular POR/CYP450 system had no impact on the dilator response of NTG and PETN. In line with previous publications, inhibition of ALDH2, known as the main enzyme responsible for the activation of NTG and PETN, and/or abolishment of the endogenous NO production did not reveal a contribution of the POR/CYP450 system to the dilator response of NTG and PETN. To better understand these results, we looked at the expression of the hepatic and vascular expression of the POR/CYP450 system where the hepatic was increased by 10- to 40-fold as shown by Western blot analysis. We concluded that due to insufficient vascular expression of CYP450 enzymes their contribution to the bioactivation of NTG and PETN is only minor.
The second part of this work focused on the cardiac relevance of endothelial isoenzymes. For that purpose, an endothelial cell-specific, tamoxifen-inducible knockout model of POR was generated and characterized in the present study. RNA-sequencing of the heart of healthy mice revealed that the CYP450 expression is cell-specific with cardiac endothelial cells (ECs) exhibiting an enrichment in the expression of the Cyp4 family (ω-oxidation of fatty acids) and of the Cyp2 family (production of EETs). Under non-stredded conditions (i.e. 30 days after inducing the knockout by tamoxifen feeding), endothelial deletion of POR was associated with cardiac remodelling as observed by an increase in the ratio of heart weight to body weight and an increase in the cardiomyocyte area. RNA-sequencing of cardiac ECs suggested that loss of POR might alter ribosomal biogenesis and protein synthesis, which could potentially affect the cardiac contractility in ecPOR-/- mice. Metabolomics from cardiac tissue of CTL and ecPOR-/- mice were not indicative for an important metabolic function of the endothelial POR/CYP450 system in the heart. The combination of transverse aortic constriction (TAC) with endothelial deletion of POR accelerates the development of heart failure in mice as detected by a reduction in cardiac output and stroke volume. These effects were mediated most likely by a reduction in vascular EETs production, which increases vascular stiffness, resulting in cardiac remodeling.
Sphingolipids are not only structural components of cell membranes but can also act as signalling molecules in different pathways. Sphingolipid precursors, Ceramides (Cer), are synthesized de novo by six different synthases (CerS1-6) which generate Cer of different chain lengths. Cer can be further synthesized to glycosphingolipids and sphingomyelin. Cell membrane parts that are enriched in glycosphingolipids are so-called lipid rafts and can function as signalling platforms for different receptors, such like the T cell receptor (TCR). CD4+ T cells play a crucial role in the development of ulcerative colitis, a chronic inflammatory disease of the colon. As CerS3 expression was increased in the white blood cells of human colitis patients, the role of CerS3 in the TCR signalling and colitis was investigated in this dissertation. By lenti-viral transduction of a CerS3-shRNA into a CD4+ Jurkat cell line, it was shown that CerS3 has an impact on activated T cells. A decrease of different sphingolipids after T cell activation via CD2/3/28 activation beads and IL2 treatment was observed that was accompanied by an inhibition of Zap70 phosphorylation, an important protein of the TCR signalling. The impaired TCR signalling led to a diminished NFAT1 translocation into the nucleus which subsequently led to a reduced NFAT1- dependent TNFα release. Downregulation of CerS3 in primary CD4+ T cells, obtained from the blood of healthy volunteers, also showed a reduced release of pro-inflammatory cytokines after activation. This dissertation demonstrates a pivotal role for CerS3 in T cell function and highlights CerS3 as potential new target for T cell driven colitis.
Subject of this thesis was the investigation of the actin-interacting and glucocorticoid-sensitive Protein DRR1 (or Fam107a) and its role in promoting stress resilience in the murine hippocampus.
We proposed the hypothesis that DRR1 through its actin-binding properties specifically modulates neuronal actin dynamics and promotes resilience through synaptic plasticity leading to subsequently improvement of cognitive performance and social behavior. The accompanied AMPA-receptor transport could create an efficient way regulating neural function and complex behavior during stress episodes.
By utilizing fluorescent immunohistochemistry, we showed basal expression of DRR1 primarily in the murine cerebellum and hippocampal CA3 and CA1 area. Co-staining with different cell marker proteins showed DRR1 expression in neurons, microglia and especially in astrocytic end-feet, which create contact to the brain vasculature.
To test whether DRR1 and AMPA receptor function correlate to modulate stress-associated consequences, primary hippocampal neuron cultures were transduced with adeno-associated virus (AAV) for overexpression or suppression of the protein. Western Blot analysis showed a positive correlation between the AMPA-receptor subunit GluR2 and DRR1 amounts. Further the application of the proximity ligation assay (PLA) in untreated neural cultures indicated interaction between DRR1 and the AMPA receptor subunit GluR2. To address whether DRR1 even affects AMPAR trafficking we performed the “newly inserted assay” after AAV-treatment of primary hippocampal neuron cultures. Suppression of DRR1 revealed less newly inserted GluR2 subunits as compared to controls. Inconclusive were the results upon DRR1 overexpression, however they point to no changes.
In the second part we correlated behavioral phenotypes originating from in vivo overexpression and suppression of DRR1 in the murine hippocampus with potential alterations in neuronal morphology. Therefore, in vitro analysis was performed utilizing AAV transduced primary hippocampal cultures overexpressing or suppressing DRR1. Synchronously the viral vector included a green fluorescent protein (GFP) being expressed throughout the complete neural cell. GFP staining was used to verify successful transfection and for reconstruction of dendritic arbors and dendritic stretches for spine classification. DRR1 suppression showed reduced total spine numbers especially evoked by reduced numbers of immature spine classes – namely long thin spines and filopodia. Whereas mature mushroom spines and stubby spines were unaffected. By overexpressing DRR1, tendencies inclined against higher total dendritic lengths, branch points and increased dendritic arbors in comparison to controls. In regard of spines, total numbers were unaffected. However, mature mushroom spines were significantly declined in numbers, but compensated by increased numbers of immature long thin spines and filopodia.
Chronic social defeat stress (CSDS) is widely used in mouse models to study the effects of stress and resilience. We exposed C57Bl/6J mice expressing GFP under the Thy1 promoter CSDS and categorized them into resilient (R+/-), susceptible (R-/-) and non-learning (R+/+) mice following a modified social interaction test (MSIT). We found alterations in CA1 spine compositions with resilient animals resembling the untreated phenotype. Stress susceptible and non-learning animals displayed reduced numbers in stubby spines with simultaneous increases in mature mushroom spines. In addition, we could detect a tendency towards more immature spines in susceptible animals and non-learners, mirroring our in vitro results.
Finally, we present a different investigative approach in this thesis. Sequenced acute stress was previously found to compromise cognition including spine loss.
We aimed to investigate the implication of acute stress on DRR1 levels and its occurrence in diverse cell types of the brain. We subjected one group of C57Bl/6J mice to acute stress and injected another group with the artificial glucocorticoid DEX. Six hours post stress, animals were perfused and brains were subsequently immunobiologically analyzed. We found DRR1 protein levels elevated in the hippocampus of stressed and DEX-treated animals compared to controls. Interestingly, DRR1 seemed was especially elevated in endothelial cells. This coincides with our investigations finding DRR1 present in astrocytic end-feet under basal conditions and might claim a participation of DRR1 in the blood-brain-barrier integrity.
Our results show DRR1 as actin-interacting and glucocorticoid-sensitive gene affecting structural plasticity of hippocampal spines. Moreover, DRR1 directly interacts with AMPA glutamate receptors and presumably is involved in AMPA trafficking to the postsynaptic membrane. In addition, this study could demonstrate that DRR1 is expressed by other cell types of the brain. Of special interest is DRR1’s occurrence in astrocytic end-feet and endothelial cells suggesting a role as integrator of cell-cell communication and to this end also acting as modifier of stress-induced consequences at the neurovascular unit.
In vivo data of chronically stressed mice displayed no phenotypic differences in hippocampal pyramidal neurons of resilient animals as compared to unstressed mice. Morphological alterations of spine structures were particularly visible in stress susceptible and non-learning animals. Integrating our findings with existing behavioral data, we can conclude that DRR1 plays a role in stress resilience whereby it needs to be expressed in a tightly managed homeostatic equilibrium.
Die vorliegende Dissertation hat die Evaluation der Instruktionssensitivität von Testitems unter Berücksichtigung individueller Lernvoraussetzungen von Schülerinnen und Schülern zum Thema. Die Instruktionssensitivität von Items bzw. Testaufgaben erfasst, ob diese in der Lage sind, Effekte von Unterricht auf die Leistungen der Schülerinnen und Schüler abzubilden. Der Begriff der individuellen Lernvoraussetzungen wird im Rahmen dieser Arbeit sehr breit gefasst und subsumiert unter anderem kognitive, metakognitive, motivationale und volitionale Merkmale (Brühwiler, 2014; Brühwiler et al., 2017). Ausgehend von den Lernvoraussetzungen, welche im Zusammenhang von Angebots-Nutzungs-Modellen (u.a. Brühwiler, 2014; Fend, 1981) konzeptionell aufgegriffen werden, wird in den daran anschließenden quantitativen Analysen ein besonderer Fokus auf die Qualität der Lernmotivation (Ryan & Deci, 2000) gelegt. Das empirische Ziel der Arbeit besteht in der exemplarischen Überprüfung, inwiefern Indikatoren der Instruktionssensitivität von Testitems durch die Qualität der Lernmotivation der Schülerinnen und Schüler beeinflusst werden.
Vor dem Hintergrund dieses Erkenntnisinteresses werden Parameterschätzungen aus längsschnittlichen Mehrebenen-Item-Response-Modellen mit unterschiedlichen Modellspezifikationen gegenübergestellt. Analysiert werden Daten von 832 Fünftklässlerinnen und Fünftklässlern aus dem Schweizer Kanton St. Gallen, die wiederholt an Schulleistungstests im Fach Mathematik teilgenommen haben. Unterscheiden sich die Parameterschätzungen zwischen den Spezifikationen, spricht dies dafür, dass die Qualität der Lernmotivation einen Einfluss auf die Schätzung der Instruktionssensitivität der Mathematikitems nimmt. Als Indikatoren der Instruktionssensitivität werden die differenzielle (Naumann et al., 2016) und die spezifische Sensitivität herangezogen. Angenommen wird, dass die Einbeziehung der Qualität der Lernmotivation als Kovariate die Schätzung dieser beiden Indikatoren beeinflusst.
Das Ergebnis der Analysen ist eindeutig: Keine der aufgestellten Hypothesen kann angenommen werden. Die Resultate sprechen dafür, dass die Parameterschätzungen zur Evaluation der Instruktionssensitivität von der Qualität der Lernmotivation nicht wesentlich beeinflusst werden. Diese Befundlage überrascht, da zahlreiche Studien darauf hindeuten, dass motivationale Merkmale von Schülerinnen und Schülern einen Einfluss auf deren schulische Leistungen nehmen (u.a. Kriegbaum et al., 2015; Taylor et al., 2014) und für die Schätzung der Indikatoren der Instruktionssensitivität auf Daten von Schulleistungstests zurückgegriffen wurde. Die Ergebnisse werden aus inhaltlicher und methodischer Perspektive diskutiert.
Atmospheric particles play an important role in the radiative balance of the Earth, as well as they affect human health and air quality. Hence, the chemical characterization constitutes a crucial task to determinate their properties, sources and fate. Particularly, the analysis of nanoparticles (d<100 nm) represents an analytical challenge, since these particles are abundant in number but have very little mass.
This accumulative thesis focuses on the chemical characterization of nanoparticles, performed in both laboratory and field studies. Here, I present four manuscripts, two of which are my main project as a lead author.
The first manuscript (Caudillo et al., 2021) focuses on the gas and the particle phase originated from biogenic precursor gases (α-pinene and isoprene). The experiments were performed in the CLOUD chamber at CERN to simulate pure biogenic new particle formation. Both gas and particle phases are measured with a nitrate CI-APi-TOF mass spectrometer, while the TD-DMA is coupled to it for particle-phase measurements, this setup allows a direct comparison as both measurements use the identical chemical ionization and detector. This study demonstrates the suitability of the TD-DMA for measuring newly formed nanoparticles and it confirms that isoprene suppresses new particle formation but contributes to the growth of newly formed particles.
The second manuscript (Caudillo et al., 2022) presents an intercomparison of four different techniques (including the TD-DMA) for measuring the chemical composition of SOA nanoparticles. The measurements were conducted in the CLOUD chamber. The intercomparison was done by contrasting the observed chemical composition, the calculated volatility, and the thermal desorption behavior (for the thermal desorption techniques). The methods generally agreed on the most important compounds that are found in the nanoparticles. However, they did see different parts of the organic spectrum. Potential explanations for these differences are suggested.
The third manuscript (Ungeheuer al., 2022) presents both laboratory and ambient measurements to investigate the ability of lubricant oil to form new particles. These new particles are an important source of ultrafine particles in the areas nearby large airports. The ambient measurements were performed downwind of Frankfurt International Airport, and it was found that the fraction of lubricant oil is largest in the smallest particles. In the laboratory, the main finding was that evaporated lubricant oil nucleates and forms new particles rapidly. The results suggest that nucleation of lubricant oil and subsequent particle growth can occur in the cooling exhaust plumes of aircraft-turbofans.
The fourth manuscript (Wang et al., 2022) is a new particle formation study in the CLOUD chamber at CERN. This study shows that nitric acid, sulfuric acid, and ammonia interact synergistically and rapidly form particles under upper free tropospheric conditions. These particles can grow by condensation (driven by the availability of ammonia) up to CCN sizes and INP particles. The ability of these particles to act as a CCN and INP was also investigated and it was found to be as efficient as for desert dust. This mechanism constitutes an important finding and it can account for previous observations of high concentrations of ammonia and ammonium nitrate over the Asia monsoon region.
Bei den meisten erwachsenen Säugetieren führt ein Herzinfarkt zu Fibrose und Verlust von funktionellem Herzgewebe. Einige Wirbeltiere, wie der Zebrabärbling, besitzen jedoch die bemerkenswerte Fähigkeit, nach einer Schädigung ihres Herzgewebes verlorenes Gewebe zu regenerieren und so schädliche Folgen zu verhindern. Die lokale Immunantwort auf eine Verletzung wird zunehmend als eine wichtige Determinante für das regenerative Potential eines Gewebes gesehen. Das Komplementsystem ist Teil des humoralen Immunsystems. Historisch ist es als eine Sammlung von Protein bekannt, den Komplementkomponenten, die in der Leber synthetisiert werden und im Blutkreislauf zirkulieren. Bei Exposition gegenüber einem Auslöser, wie z. B. einem Pathogen, wird eine Komplementkomponentproteinspaltungskaskade initiiert, die dazu führen kann, dass Immunzellen rekrutiert werden, und, dass die Phagozytose erleichtert, ggf. die Zielzelle lysiert wird. Studien legen nahe, dass das Komplementsystem an zellulären Prozessen beteiligt sei, die für Entwicklungs- und Krankheitsprozesse entscheidend sind, wie etwa Proliferation und Dedifferenzierung. Es gibt Hinweise, dass das Komplementsystem eine Rolle bei Krebserkrankungen und bei regenerativen Prozessen spielen könnte. In verschiedenen Arten wurde eine lokale verletzungsinduzierte Expression von komplementkomponentkodierenden Genen in regenerierendem Gewebe beobachtet.
Einzelne Studien legen nahe, dass Funktionsverlust einzelner Komplementkomponenten regenerative Prozesse beeinträchtigt.
Offene Fragen bleiben jedoch: Ist die lokale Expression von mehreren komplementkomponentkodierenden Genen ein Merkmal von regenerierendem Gewebe, das sie von Geweben unterscheidet, welchem die Fähigkeit zur Regeneration fehlt? Und welche Rolle könnte das Komplementsystem und seine Komponenten während des regenerativen Prozesses spielen? Um diesen Fragen nachzugehen, wurde eine Expressionsanalyse von Zebrabärblingsgewebe nach Verletzung mittels RT-qPCR und in situ Hybridisierung durchgeführt: kardiale Kryoverletzung, Larvenrumpfamputation und Schwanzflossenamputation. Ich beobachtete, dass mehrere komplementkomponentkodierende Gene in diesen Geweben nach Verletzung induziert wurden. Die Interpretation veröffentlichter single cell RNAseq Datensätze legt nahe, dass diese komplementkomponentenkodierenden Gene von verschiedenen Zelltypen exprimiert werden, darunter Immunzellen, Epikardzellen und Fibroblasten. Um transkriptionelle Unterschiede zwischen regenerierendem und nicht regenerierendem Gewebe zu identifizieren, verwendete ich ein nicht regeneratives Zebrabärblingmodell, die il11ra- Mutante. Dieser Mutante fehlt die Fähigkeit, verschiedene Organe zu regenerieren, das ist der Fall beim Herzen, dem larvalen Rumpf, und der Schwanzflosse. Ich stellte fest, dass die Mehrheit der verletzungsinduzierten komplementkomponentkodierenden Gene il11ra nachgeschaltet war. Darüber hinaus zeigten Experimente unter Verwendung chemischer Inhibitoren, dass speziell die Expression der komplementkomponentkodierenden Gene c3a.1,
c4b und c7a im Larvenrumpfamputationsmodell durch den Il11-Stat3-Signalweg moduliert wird.
Zur Klärung der Frage, ob das Komplementsystem und/ oder seine Komponenten eine Rolle während der Regeneration spielen, wurden verschiede Funktionsverlustmodelle generiert und im larvalen Rumpfamputationsmodell auf mögliche Aberrationen getestet. Zum einen generierte ich Überexpressionslinien von endogenen Inhibitoren der Komplementproteinspaltungskaskade. Überexpression eines etablierten Komplementsysteminhibitors rca2.1/ tecrem führte zu einer im Vergleich zu Wildtyp- Geschwistern verringerten Regeneration des larvalen Rumpfs. Zum anderen generierte ich Funktionsverlustmutanten von individuellen Komplementkomponenten durch CRISPR/Cas9 vermittelter Mutagenese, und zwar für masp1, masp2, cfd, c1s, c4b, c5 und c9. Die larvale Rumpfregeneration war in diesen Mutanten unauffällig. Allerdings zeigten c4b Mutanten eine verringerte Kardiomyozytenproliferation und eine differenzielle Expression von einigen Markergenen, einschließlich einer erhöhten Expression von inflammatorischen Zytokinen.
Meine Studien führten zu neuen Einblicken in das Komplementsystem im Kontext der Regeneration. Ich fand heraus, dass mehrere komplementkomponentenkodierenden Gene in regenerierendem Zebrabärblinggewebe exprimiert werden, und zwar im Herzgewebe, im larvalen Rumpf und in der adulten Flosse. Darüber hinaus zeige ich, dass die verletzungsinduzierte Expression von komplementkodierenden Genen in regenerierendem Gewebe dem Regenerationsmasterregulator il11ra nachgeschaltet ist. Speziell c3a.1, c4b und c7a wurden durch il11/ stat3 reguliert...
Auf Grund einer hohen Inzidenz und Mortalität, welche in den nächsten Jahren voraussichtlich eine deutliche Zunahme erfahren wird, stellt die Behandlung eines HCC an alle beteiligten Fächer der Medizin, sowie an den Patienten und die Patientin, eine enorme Herausforderung dar. In der klinischen Routine hat sich die TACE, nicht nur bei Patienten im intermediären Stadium der Erkrankung, etabliert, sodass im Laufe der Erkrankung nahezu jeder zweite Patient mindestens eine TACE-Behandlung bekommt.
Der mit Radiomics betitelte, im medizinischen Bereich relativ junge, Forschungszweig beschäftigt sich mit der Idee, dass in den Schnittbildern eine für das menschliche Auge nicht sichtbare Ebene von Informationen vorliegt, welche mit den richtigen Mitteln extrahiert, relevante Daten und Informationen zur Genetik, Phänotypie und Pathophysiologie des Tumors liefern kann.
Hier greift der Ansatz dieser Arbeit an. In dieser Arbeit wird die Hypothese postuliert, dass durch die Auswertung und Integration von Lipiodolablagerungen in der Zielläsion nach der ersten durchgeführten TACE eine zuverlässigere Prognose zum Therapieansprechen und Gesamtüberleben mit Hilfe von Radiomics möglich ist, als dies klinische Scores alleine erlauben.
Dazu wurde in dieser Arbeit ein Patientenstamm von 61 Patienten untersucht. Alle Patienten litten an einem histologisch gesicherten HCC. Bei allen Patienten wurden innerhalb eines Zeitintervalls von 6 Monaten drei TACE durchgeführt mit einer nachfolgenden Verlaufskontrolle mittels kontrastmittelgestützter MRT oder CT.
In einem dezidierten, mehrstufigen Verfahren wurden aus der nativen 24 Stunden postinterventionellen CT-Kontrolle die Lipiodol anreichernden HCC-Herde segmentiert. Aus diesem segmentierten 3-D Bilddatensatz wurde eine Vielzahl von bildgebenden Biomarkern, Features, extrahiert. Die Features wurden im weiteren Prozess selektiert, redundante und nicht reproduzierbare Features wurden für das weitere Vorgehen verworfen.
Aus den vorliegenden Daten der Patienten wurden Informationen selektiert, mit welchen insgesamt 5 klinische Scores berechnet wurden, diese Scores wurden im weiteren Verfahren ebenfalls als Features angesehen.
Mehrere Machine Learning-Algorithmen wurden mit der Zielvariable: Größenregredienz des Tumors nach TACE als Folge eines annehmbaren Therapieansprechens, angelernt.
Das beste Ergebnis lieferte ein ML-Algorithmus mit einem Random Forrest Klassifikator auf der Grundlage des kombinierten, aus Radiomics-Features und klinischem Score-Features bestehendem Featuresets.
Um die initial aufgestellte Hypothese zu überprüfen wurde die Zielvariable von Größenregredienz der TL auf OS verändert. Die Performance des ML-Algorithmus in Bezug auf die neu definierte Zielvariable OS wurde hierbei mit dem C-index bewertet. Im Test-Set liegt ein C-Index von 0,67 vor. Das kombinierte Modell aus klinischem Score und Radiomics zeigt hierbei eine Überlegenheit gegenüber dem klinischen Score allein (C-Index 0,58) und dem Radiomics score (C-Index 0,60). Dies bestätigt die aufgestellte Hypothese. Das kombinierte Modell hat die Fähigkeit, anhand der Lipiodolanreicherung in der 24 Stunden postinterventionell durchgeführten CT, zur Prädiktion eines Gesamtüberlebens von HCC-Patienten nach einer TACE.
Die Patienten mit der kürzesten und längsten Überlebenszeit innerhalb der Studienpopulation dienten als Grundlage für eine Kaplan-Meier-Schätzung und Berechnung eines Risiko-Scores (siehe Abbildung 37). Dabei zeigt sich eine signifikante Differenz zwischen den Risiko-Scores. Eine Kurve dieser Art könnte zukünftig theoretisch als Schätzung zur Überprüfung der Indikation einer TACE- Wiederholung für einzelne Patienten dienen. Für eine entsprechende Generalisierbarkeit sind weiterführende Studien zur Validierung nötig. Unsere Studie liefert hier erste vielversprechende Hinweise, wobei unsere Limitationen nicht zu vernachlässigen sind, wie im Detail diskutiert.
Zusammenfassend zeigt unsere Arbeit, dass ein von uns definierter kombinierter Score, bestehend aus bildgebenden Biomarkern (Radiomics) und einem klinischen Score (m- HAP-II-Score), eine Prognose zum Gesamtüberleben nach der ersten TACE- Behandlung liefern kann. Mit Hilfe dieses kombinierten Scores war es in unserer Studienkohorte möglich abzuschätzen, ob ein Patient von weiteren TACE-Prozeduren profitieren würde. Der Behandlungsalgorithmus könnte auf dieser Basis individuell angepasst werden.
Der kombinierte Score hätte somit nicht nur das Potenzial Nebenwirkungen zu verhindern und Kosten im System einzusparen, sondern ebenfalls den Patienten potentiell individuell effektiveren Therapiealternativen zuzuführen.
Die kongenitale Zytomegalievirus Infektion (cCMV-Infektion) ist die häufigste kongenitale Infektionskrankheit weltweit und ist der häufigste Grund für angeborene nicht-genetische Hörstörungen und eine häufige Ursache neurologische Entwicklungsstörungen. Die Inzidenz der cCMV-Infektion liegt in Deutschland zwischen 0,2 % – 0,5 %. Bei retroviral-exponierten Neugeborenen wird die Inzidenz mit 2,7 % – 11,4 % angegeben. Mit der erhöhten Inzidenz der cCMV-Infektion bei retroviral-exponierten Neugeborenen ergibt sich für diese Kinder ebenfalls ein erhöhtes Risiko für Langzeitfolgen. Die genaue Inzidenz der cCMV-Infektion variiert je nach untersuchter Population. Für Deutschland existiert eine retrospektive Studie, welche eine Inzidenz von 2,7 % für cCMV-Infektionen bei retroviral-exponierten Neugeborenen ermittelte. In der vorliegenden Studie wurde diese Inzidenz in einem prospektiven multizentrischem Studiendesign in Deutschland ermittelt.
Zur Ermittlung der Inzidenz der cCMV-Infektion bei retroviral-exponierten Neugeborenen und Beurteilung der Umsetzbarkeit eines cCMV-Neugeborenen-Screenings wurde ein selektives cCMV-Neugeborenen-Screening für retroviral-exponierte Neugeborene mittels PCR-Untersuchung auf CMV aus einem Mundschleimhautabstrich innerhalb der ersten 21 Lebenstage an drei Studienstandorten innerhalb Deutschlands, Mannheim, München und Frankfurt am Main, durchgeführt. Bei positivem Ergebnis der PCR auf CMV-DNA erfolgte eine Bestätigungsdiagnostik mittels erweiterter Urin- und Blutuntersuchung auf CMV. Zur Diagnostik von cCMV-assoziierten Symptomen erfolgte eine Sonographie des Abdomens und des Schädels sowie eine ausführliche körperliche Untersuchung, eine augenärztliche Evaluation und erweiterte Testungen der Gehörfunktion. Nachuntersuchungen und Therapien wurden den betroffenen Familien außerhalb der Studie angeboten.
122 / 184 (66,3 %) HIV-exponierte Neugeborene von 111 Müttern wurden im Studienzeitraum zwischen dem 24.11.2017 und dem 31.03.2021 eingeschlossen. Eine cCMV-Infektion wurde bei einem Neugeborenen nachgewiesen, sodass die Inzidenz der cCMV-Infektion bei retroviral-exponierten Neugeborenen in dieser Studie 0,8 % beträgt. Eine HIV-Mutter-Kind-Transmission wurde nicht detektiert. Die Seroprävalenz für CMV bei den HIV-positiven Frauen lag in diesem Kollektiv bei 96,1 %.
Das Neugeborene mit nachgewiesener cCMV-Infektion zeigte eine zerebrale Beteiligung mit ependymalen Zysten und einer thalamostriatalen Vaskulopathie und erhielt außerhalb der Studie eine zeitgerechte antivirale Therapie mit Beginn in der Neonatalper-ode. Im Verlauf zeigten sich trotz der antiviralen Therapie Entwicklungsstörungen mit autistischen Verhaltensweisen. Die cCMV-Infektion wäre ohne ein routinemäßiges Screening mit großer Wahrscheinlichkeit nicht nachgewiesen worden.
Die frühzeitige Untersuchung der Probanden auf eine cCMV-Infektion hat sich in dieser Studie als vorteilhaft gezeigt, da bei Nachweis einer cCMV-Infektion zeitnah weiterführende Diagnostik und Therapien angeboten werden konnten. Auch die relativ große Anzahl an rekrutierten retroviral-exponierten Neugeborenen im prospektiven Studiendesign in Zusammenarbeit mit mehreren Studienzentren in Deutschland spricht für die Validität dieser Studie. Als Limitation ist zu nennen, dass ein statistisch signifikantes Ergebnis nicht erzielt werden konnte. Aufgrund der Corona-Pandemie kam es organisationbedingt zu einer relativ hohen Anzahl an nicht eingeschlossenen Patienten. Auch die geplante Rekrutierung einer Vergleichsgruppe in Südafrika konnte aufgrund der Pandemie nicht umgesetzt werden. Falsch negative Befunde wurden im Sinne der Familie nicht mittels Goldstandardmethode überprüft, sodass eine Unterschätzung der Rate an cCMV-Infektionen möglich ist.
Insgesamt konnte diese Studie neben der Ermittlung der cCMV-Inzidenz bei retroviral-exponierten Neugeborenen in Deutschland von 0,8 % aufgezeigt werden, dass selbst symptomatische cCMV-Infektionen ohne ein systematisches cCMV-Neugeborenen-Screening nicht sicher nachgewiesen werden konnte. Zudem konnte gezeigt werden, dass ein systematisches cCMV-Neugeborenen-Screening mittels Mundschleimhautabstrich in Deutschland praktikabel ist und bei den Sorgeberechtigten Akzeptanz findet. Den erhobenen Daten zur Folge könnte ein Screening aller Neugeborener oder zumindest ein risikoadaptiertes Screening auf das Vorliegen einer cCMV-Infektion dazu beitragen, dass mehr Kinder mit asymptomatischer oder unentdeckter symptomatischer cCMV-Infektion diagnostiziert werden und so eine entsprechende Behandlung ermöglicht sowie ggf. Langzeitfolgen möglichst verringert werden.
Weitere Studien zum Effekt der verfügbaren antiviralen Therapie bei cCMV-Infektionen und regelmäßiger Kontrolluntersuchungen nach stattgehabter cCMV-Infektion sind zu empfehlen, um die Auswirkungen dieser Maßnahmen auf den Krankheitsverlauf zu evaluieren.
The Nodular lymphocyte-predominant Hodgkin lymphoma (NLPHL) as well as the T-cell/histiocyte-rich large B-cell lymphoma (THRLBCL) are rare types of malignant lymphomas. Both NLPHL and THRLBCL are frequently observed in middle-aged men with THRLBCL presenting frequently with an advanced Ann-Arbor stage with B-symptoms and associated with more aggressive courses.3 However, due to the limited number of tumor cells in the tissue of both NLPHL and THRLBCL, limited numbers of studies have been conducted on these lymphomas and current results are mainly based on general molecular genetic studies.
In order to obtain a better understanding for these disease forms as well as possible changes in their nuclear and cytoplasmatic sizes, the following study relied on the comparison of the different NLPHL forms and THRLBCL in terms of nuclear size and nuclear volume. This was carried out using both 2D and 3D analysis. During the 2D analysis of nuclear size and nuclear volume no significant differences could be presented between those groups. However, the 3D analysis of NLPHL and THRLBCL pointed out a slightly enlarged nuclear volume in THRLBCL. Furthermore, the analysis indicated a significantly increased cytoplasmatic size of THRLBCL compared to NLPHL forms. Nevertheless, differences occurred not only between the tumor cells of both disease forms, but also the T cells presented a larger nuclear volume in THRLBCL. B cells, which were considered as the control group, did not demonstrate any significant differences between the different groups. The presented results suggest an increased activity of T cells in THRLBCL, which is most likely to be interpreted as a response against the surrounding tumor cells and probably limits the proliferation of the tumor cells. Based on these results, the importance of 3D analysis is also evident due to the fact that it is clearly superior to 2D analysis. For a better understanding of both disease forms, it is therefore recommended to use the 3D technique in combination with molecular genetic analysis in future research.
Ziel dieser Arbeit ist die Identifikation des Einflusses klassischer Labormaterialien und alternativer Experimentiermaterialien auf fachdidaktische Anforderungen an ein gelungenes Experiment im Chemieunterricht. Dabei umfassen alternative Experimentiermaterialien sowohl Materialien aus der alltäglichen Lebenswelt von Schülerinnen und Schülern als auch Materialien aus dem Bereich der Medizintechnik, die anstelle von Materialien des gängigen Laborbetriebs im Chemieunterricht eingesetzt werden. Um den Einfluss des Experimentiermaterials auf entsprechende Anforderungen untersuchen zu können, wurden im Rahmen eines Mixed-Method-Designs zwei aufeinander aufbauende Studien durchgeführt. Bei Studie I handelt es sich um eine qualitative Interviewstudie unter N = 13 Chemielehrkräften, mit denen vor dem theoretischen Hintergrund fachdidaktischer Anforderungen an ein gelungenes Schulexperiment problemorientierte, leit-fadengestützte Interviews zu Vor- und Nachteilen beim Einsatz alternativer Experimentiermaterialien und klassischer Labormaterialien im Chemieunterricht geführt wurden. Anhand des gewonnenen Interviewmaterials wurden anschließend zunächst Eigenschaften identifiziert, in denen sich beide Materialpools voneinander unterscheiden, um davon ausgehend ein Kategoriensystem aufstellen zu können, das in Form einer Matrix den Einfluss dieser Materialeigenschaften auf organisatorische, experimentelle und affektive Anforderungen an ein Schulexperiment im Chemieunterricht darstellt. Dabei konnte in Bezug auf organisatorische Anforderungen insbesondere ein Einfluss des Experimentiermaterials auf zeitliche und finanzielle Rahmenbedingungen sowie auf Anforderungen zur Sicherheit beim Experimentieren im Chemieunterricht festgestellt werden. Ergebnisse zum Einfluss des Experimentiermaterials auf affektive und experimentelle Anforderungen an ein Schulexperiment wurden wiederum genutzt, um anschließend Hypothesen zum Einfluss des Experimentiermaterials auf entsprechende Anforderungen an gelungene Experimente im Chemieunterricht zu generieren, dabei an gelungene Schülerexperimente im Speziellen. Diese Hypothesen wurden in einer zweiten Studie quantitativ getestet. Innerhalb eines experimentellen Untersuchungsdesigns führten dazu insgesamt N = 293 Schülerinnen und Schüler eines von insgesamt fünf betrachteten Schülerexperimenten mit jeweils klassischem Labormaterial oder in einer jeweiligen Variante aus alternativem Experimentiermaterial durch. Im Anschluss beurteilten N = 237 Schülerinnen und Schüler im Rahmen einer Fragebogenerhebung ihre subjektive Wahrnehmung der Experimentiersituation bezüglich der Variablen Grad der Herausforderung, Beobachtbarkeit, Autonomieerleben, Anspannung/ Druck, Kompetenzerleben und Interesse/ Vergnügen. Mit Ausnahme des Kompetenzerlebens und der Beobachtbarkeit konnte zu allen betrachteten Variablen ein signifikanter Einfluss des Experimentiermaterials festgestellt werden. Um diese Ergebnisse der Hypothesentests näher beschreiben und differenzierter erläutern zu können, beantworteten die 237 Schülerinnen und Schüler zusätzlich offene Fragen zu den von ihnen verwendeten Experimentiermaterialien; mit N = 56 weiteren Schülerinnen und Schülern wurden aus diesem Grund außerdem leitfadengestützte Gruppeninterviews geführt. Um folglich auch aus Schülerperspektive möglichst allgemeingültige Einflüsse beider Materialpools auf fachdidaktische Anforderungen an ein gelungenes Schulexperiment zusammenfassen zu können, werden die Ergebnisse dieser qualitativen Datenerhebung ebenfalls in Form einer entsprechenden Matrix dargestellt und dabei von den konkret durchgeführten Experimenten abstrahiert. Neben dem bereits genannten Einfluss des Experimentiermaterials auf den von Schülerinnen und Schülern wahrgenommenen Grad der Herausforderung, das wahrgenommene Autonomieerleben, die/ den wahrgenommene/n Anspannung/ Druck beim Experimentieren sowie das wahrgenommene Interesse/ Vergnügen an der Experimentiersituation konnte dadurch insbesondere ein Materialeinfluss auf die Durchschaubarkeit eines Versuchsaufbaus und deren einzelner Bestandteile sowie auf die wahrgenommene Authentizität einer Experimentiersituation identifiziert werden. Dadurch zeigt die Gesamtuntersuchung auf theoretischer Ebene die Bedeutsamkeit des konkreten Experimentiermaterials als Qualitätsmerkmal des Chemieunterrichts und gibt Lehrkräften auf unterrichtspraktischer Ebene einen Überblick zu Potentialen und Grenzen alternativer Experimentiermaterialien im Vergleich zu etabliertem klassischem Labormaterial.
Die Auswirkungen der syrischen Flüchtlingskrise auf den zivilgesellschaftlichen Sektor im Libanon
(2021)
Die vorliegende Dissertation analysiert die Auswirkungen der syrischen Flüchtlingskrise auf den zivilgesellschaftlichen Sektor im Libanon, in Anbetracht einer historisch engverwurzelten Beziehung zwischen dem Libanon und Syrien. Die Dissertation wird von dem Interesse geleitet, die Rolle der lokalen zivilgesellschaftlichen NROs zu erforschen, die sich mit syrischen Flüchtlingen im Libanon befassen, und versuchen, die Leere des schwachen bzw. minimalistischen libaneischen Staatensystems zu füllen.Es wird untersucht, welche Effekte der syrische Konflikt auf die zivilgesellschaftliche Landschaft im Libanon gehabt hat und wie sich der Zufluss von internationaler Gelder auf die Aktivitäten dieser lokalen NROs sowie auf ihrer Beziehungen zu den libanesischen Staatsbehörden auf nationaler und lokaler Ebene ausgewirkt hat.
Background and Aim: Genome-wide association studies revealed a strong association between cardiovascular diseases (CVD) and clonal hematopoiesis of indeterminate potential (CHIP), highlighting one of its most common CHIP-driving mutations-TET2 (ten-eleven translocation 2), as a target for CHIP related CVD research. Our lab has established the generation of self-organizing cardiac organoids (SCO), which demonstrate the cellular composition and organization of the native human heart, and mimics human myocardial responses to stress stimulation. This project aims to examine whether SCOs would be an appropriate CHIP model and decipher promising drugs for cardiovascular CHIP treatment.
Methods: To study TET2-mutant cardiovascular CHIP, we set up the TET2 cardiac-CHIP model through a knockdown (KD) of TET2 in myeloid cells that infiltrated our lab-made SCO. Immunofluorescence and qPCR were performed to ascertain TET2-KD myeloid cell infiltration, SCO fibrosis, and apoptosis assessments. SCO fibrosis was further analyzed by immunofluorescence staining, and cardiac contractile frequency and amplitude were determined by calcium flux analysis. Finally, RNAseq was performed to analyze transcriptomic changes in drug/vehicle-treated TET2-KD myeloid cells and the TET2 cardiac-CHIP model.
Results: The TET2 cardiac-CHIP model resulted in significantly increased inflammation in SCO, accompanied by fibrosis and more cleaved Caspase-3, causing cardiomyocytes apoptosis and promoting the release of cTNT. The shortlisted drugs revealed a reduction of proliferation in TET2-KD myeloid cells, decreased pro-inflammatory cytokines, and a higher apoptosis level. Furthermore, the TET2 cardiac-CHIP model treated with selected drugs showed a remarkable decline in TET2-KD myeloid cell infiltration and pro-inflammation cytokines, cardiomyocyte apoptosis, fibrosis, and lowered cTNT levels, while drug control groups were not affected. Moreover, the drug treatment groups improved the heartbeat frequency and amplitude accessed by the calcium transient assay. RNAseq data also validated the above findings.
Conclusions & Discussion: Our results indicate that SCOs are an efficient pre-clinical model for studying and validating CHIP genes and drug interactions. Our data revealed that TET2-KD myeloid cells invade SCO and secrete pro-inflammatory cytokines, which promote apoptosis of cardiomyocytes and the release of cTNT. In this regard, our TET2 cardiac-CHIP model matches the inflammatory phenotype previously characterized in CHIP patients. Nevertheless, this phenotype could be rescued using positive drug candidates (Clopidogrel, R406, and Lanatoside C) selected by this project, emphasizing the significant value of our TET2 cardiac-CHIP model for drug screens and pre-clinical validation studies. Furthermore, among these three drug candidates, we found Lancatoside C, as proved by FDA/EMA, showed an unmet possibility for clinical therapeutic demand, insinuating potential benefit in repurposing Lanatoside C for the treatment of TET2-mutant cardiovascular CHIP.
The functional and molecular role of transglutaminase 2 in hematopoietic stem and progenitor cells
(2023)
Long-term repopulating hematopoietic stem cells (LT-HSCs) that reside in the bone marrow (BM) give rise to all blood cell types including erythrocytes, leukocytes and platelets. LT-HSCs are mainly quiescent during steady state hematopoiesis. LT-HSCs can process self-renewal to expand and maintain stemness, or commit to differentiation into short-term (ST) repopulating HSC and multipotent progenitors (MPPs). MPPs differentiate into oligopotent lineagerestricted progenitors which eventually produce all mature blood cell lineages, and thereby regenerate hematopoietic system.
Previous studies have shown in transcription profiles and quantitative PCR (qPCR) analysis that transglutaminase 2 (Tgm2) is one of the most upregulated genes in quiescent LT-HSCs in comparison to active HSCs, mobilized HSCs, ST-HSCs, MPPs, as well as leukemic stem cells (LSC). However, the reason why Tgm2 is strongly upregulated in dormant mouse LTHSCs and what the role of Tgm2 is in LT-HSCs has not been investigated yet.
Tgm2, encoded by the Tgm2 gene, is a multi-functional protein within the transglutaminase family. It has been found to be widely expressed inside and outside the cells. It consists of four domains and two functionally exclusive forms that are regulated by the Ca2+ and GTP concentration. Besides the most well-known transglutaminase enzymatic activity for transamidation, deamidation and crosslinking, Tgm2 acts also as a GTPase/ATPase, kinase, adhesion/scaffold protein, as well as disulfide isomerase. The role of Tgm2 in hematopoiesis remains elusive. Accordingly, the aim of this dissertation is to investigate the role of Tgm2 in murine hematopoiesis, especially in murine LT-HSCs.
Firstly, the expression of Tgm2 was analyzed in highly purified murine hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) populations. Low input label-free mass spectrometric proteomics and WES protein analysis confirmed the highly specific expression of Tgm2 in LT-HSCs at protein level. Already at the state of MPPs, Tgm2 protein was almost absent with further decline towards oligopotent progenitors. These results indicated Tgm2 as a specific protein marker for LT-HSCs, justifying the future generation of a fluorescent reporter mouse line based on endogenous Tgm2 tagging.
To delineate the functional and molecular role of Tgm2 in LT-HSCs, a conditional Tgm2 knockout mouse model was generated using the Mx1-Cre/loxP system, with the loxP sites flanking the coding exons of the catalytic domain of Tgm2. After PolyIC-mediated induction, a more than 95% knockout efficiency was observed in purified LT-HSCs and the protein expression of Tgm2 was confirmed to be vanished in the purified LT-HSCs from conditional Tgm2-KO mice. Conditional knockout mice are viable and show no aberrant organ functions.
In steady state condition, the distribution of mature blood cell lineages and immunophenotypically-defined HSPC populations within the BM, the mitochondrial potential of HSPCs reflected by the non-invasive cationic dye JC-1, as well as the cell cycle status of HSPCs mirrored by the intracellular Ki67 staining did not show any significant variations upon loss of Tgm2. However, the in vitro continuous observation of prospectivly isolated LT-HSCs by time-lapse microscopy-based cell tracking revealed a delayed entry into cell cycle with a two fold increased apoptosis rate after knocking out Tgm2, indicating Tgm2 expression might be essential for survival of LT-HSCs. Moreover, while the absence of Tgm2 in LT-HSCs did not influence differentiation and lineage choice in vitro, overexpression of Tgm2 in LT-HSCs resulted in an increase of the most immature subpopulation upon cultivation. All these features were not observed in Tgm2-deleted MPPs, suggesting Tgm2 playing a specific function at the level of LT-HSCs. Upon stress hematopoiesis, induced by the administration of 5-fluorouracil (5-FU), there was a trend towards delayed recovery of LT-HSCs lacking Tgm2. Although Tgm2 express specificly in LT-HSCs, two rounds of competitive BM serial transplantation displayed an equal overall engraftment and multi-lineage reconstitution of LT-HSCs from Tgm2-WT and Tgm2-KO mice in peripheral blood (PB), BM and spleens. Interestingly, LT-HSCs from Tgm2-KO mice reconstituted to more myeloid cells and fewer B cells in the first four weeks after primary transplantation, which disappeared at later time points.
Gene expression profiling and simultaneous single cell proteo-genomic profiling indicated that HSPCs and LT-HSCs from Tgm2-KO mice were transcriptionally more active. A heterogeneity of Tgm2 expression within Tgm2-WT LT-HSCs was revealed by single cell data. Commonly up-regulated genes in Tgm2-KO LT-HSCs and MPPs were significantly involved in regulation of transcription from RNA polymerase II promoter in response to stress, positive regulation of cell death as well as negative regulation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways. In Tgm2-KO LT-HSCs, 136 up-regulated genes demonstrated an enrichment of genes involved in apoptosis, as well as negative regulation of MAPK signaling pathway.
Taken together, this dissertation shows that Tgm2 protein is highly specifically expressed in LT-HSCs, but not in subsequent progenitor populations. However, Tgm2 is not essential for differentiation and maturation of myeloid lineages, the proliferation and the long-term multilineage reconstitution potential of LT-HSCs after transplantation. Tgm2 might be involved in accurate stress response of LT-HSCs and the transition from LT-HSCs into MPPs, meaning that the absence of Tgm2 results in poor survival, myeloid bias upon transplantation, as well as slower recovery upon chemotherapeutic treatment.
Nanoarzneimittel haben in den letzten Jahren in der Therapie verschiedener Erkrankungen immer mehr an Bedeutung gewonnen. Dadurch hat auch die Anzahl zugelassener Arzneimittel mit an Arzneistoffträgern wie Liposomen gebundenen Wirkstoffen zugenommen. Weil für die Zulassung, neben der Wirksamkeit und Unbedenklichkeit, auch die Qualität der neuen Arzneimittel gewährleistet sein muss, spielen die verschiedenen Eigenschaften der Arzneistoffträger eine wichtige Rolle in der Qualitätskontrolle. Neben der Partikelgröße, der Partikelgrößenverteilung und der Oberflächenladung spielt die (Rest-)Kristallinität des Wirkstoffs und die Wirkstofffreisetzung eine wesentliche Rolle für die erfolgreiche in vivo-Performance von Nanoarzneimitteln. Zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus kolloidalen Arzneistoffträgern wie Liposomen, Nanopartikeln oder Mizellen gibt es bis heute keine Standardmethoden. In der Forschung und der pharmazeutischen Industrie werden folglich verschiedene Methoden wie Filtration, Zentrifugation oder Dialyse verwendet, um den freigesetzten Wirkstoff zu bestimmen. Dabei ist die Wahl der Separationsmethode auf die Eigenschaften der Arzneistoffträger abzustimmen.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine dialysebasierte Apparatur, der Dispersion Releaser (DR), zur Untersuchung der in vitro Wirkstofffreisetzung aus kolloidalen Trägersystemen eingesetzt. Diese kann direkt mit den Apparaturen I/II der Arzneibücher der Europäischen Union (Ph. Eur.) und der Vereinigten Staaten (USP) gekoppelt werden. Zur Untersuchung der Wirkstofffreisetzung wird die Formulierung in das Donorkompartiment gegeben, sodass der freigesetzte Wirkstoff infolge über die Dialysemembran in das Akzeptorkompartiment permeiert. Dort kann dieser mittels HPLC analysiert werden. Besonders hervorzuheben ist das synchrone Rühren in beiden Kompartimenten des DR, worüber andere dialysebasierte Apparaturen nicht verfügen.
Die Entwicklung und Patentierung eines funktionsfähigen Prototyps des DR erfolgte an der Goethe Universität, Frankfurt am Main und wurde im Rahmen dieser Arbeit gemeinsam mit der Pharma Test Apparatebau AG (Hainburg, Deutschland) zu einer kommerziell erwerbbaren Apparatur (Pharma Test Dispersion Releaser, PTDR) weiterentwickelt. Innerhalb dieser Kollaboration wurde der Prototyp des DR unter Einbezug der Anforderungen der pharmazeutischen Industrie rekonstruiert. Eine erleichterte Anwendung für den Nutzer wurde dabei mitberücksichtigt.
Die finale Apparatur wurde zuletzt einer ausgiebigen Validierung unterzogen, bei der Diclofenac und Hydrocortison als Modellarzneistoffe dienten. Neben Untersuchungen zur Hydrodynamik und dem Einfluss der Umdrehungszahl auf die Membranpermeationsrate kM wurde eine Methode mit Gold-Nanopartikeln zur Bestimmung der Dichtigkeit des Systems entwickelt. Hierbei wurden Messungen mit einer UV/Vis-Methode und mit dynamischer Lichtstreuung durchgeführt, um die Abwesenheit der Goldpartikel im Akzeptorkompartiment nachzuweisen. Der Einfluss von Proteinen im Freisetzungsmedium auf die Membran-permeation wurde ebenfalls untersucht.
Der DR wurde ursprünglich zur Untersuchung von parenteralen Nanoformulierungen entwickelt. Aufgrund der bisher noch nicht erfolgten Untersuchung von halbfesten Zubereitungen im DR, wurde die Apparatur im Rahmen dieser Forschungsarbeit für zwei verschiedene Diclofenac-Gele (Voltaren® Emulgel, Olfen® Gel) unter verschiedenen Bedingungen evaluiert. Dabei konnte unter non-sink-Bedingungen der Einfluss der lipophilen Phase des Voltaren® Emulgels (GlaxoSmithKline Consumer Healthcare GmbH & Co. KG, München, Deutschland) gezeigt werden. Im Vergleich zum fettfreien Olfen® Gel (Mepha Pharma AG, Basel, Schweiz) zeigte Voltaren® Emulgel eine vollständige Freisetzung unter den erschwerten Löslichkeitsbedingungen.
Mit Hydrocortison als Modellsubstanz wurden vier verschiedene Proliposomen zur vaginalen An¬wendung formuliert. Neben der Charakterisierung der Partikelgröße und der Verkapselungs¬effizienz wurden Messungen mit dynamischer Differenzkalorimetrie durch-geführt und Aufnahmen zur morphologischen Charakterisierung mittels Transmissions-elektronen¬mikroskopie der Liposomen erstellt. Die Wirkstofffreisetzung des Hydrocortisons aus dem rekonstituierten liposomalen Gel sowie die Permeabilität über eine Zellmonoschicht wurde vergleichend untersucht. Dabei wurden Zelllinien aus humanem Cervixkarzinom beziehungsweise Endometriumkarzinom eingesetzt. Die Unterschiede der Formulierungen konnten vom DR sensitiver erfasst werden und die Verkapselungseffizienz als relevanter Faktor für die in vivo-Performance festgelegt werden.
Weil die tatsächliche Wirkstofffreisetzung durch die Permeation über die Dialysemembran überlagert werden kann, wurde neben der Standardisierung der Konstruktion die Auswertung mit Hilfe eines neuen mathematischen Modells, das auf dem Fick’schen Diffusionsgesetz basiert, verbessert. Das Normalisieren des Freisetzungsprofils mit Hilfe des mathematischen Modells dient dazu, die tatsächliche Wirkstofffreisetzung zu berechnen und den Vergleich verschiedener Freisetzungen ohne den Einfluss der Membranpermeation zu ermöglichen. Im Zuge der Validierung des DR wurde das mathematische Modell ebenfalls erfolgreich validiert.
In der vorliegenden Forschungsarbeit wurde eine neue Konstruktion des DR für die kommerzielle Anwendung entwickelt und validiert. Nebenbei wurde der Auswerteprozess zur Berechnung der diffusionsbereinigten Wirkstofffreisetzung vereinheitlicht und validiert. Zuletzt wurde das Anwendungsgebiet des DR von parenteralen Nanoformulierungen auf halbfeste Arzneiformen erweitert.
Der erste Teil der vorliegenden Arbeit beinhaltet die funktionelle Analyse von fünf Oberflächenproteinen von B. recurrentis die die Fähigkeit besitzen, die Aktivierung von humanen Komplement zu inhibieren und Borrelien vor Bakteriolyse zu schützen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zwei immunologische Testverfahren mit hoher Sensitivität sowie Spezifität entwickelt und mit zahlreichen Patientenseren evaluiert. Die entwickelten Tests könnten in Zukunft als zuverlässige Instrumente für eine gesicherte Diagnose von LRF eingesetzt werden.
Eine Sequenzanalyse führte zur Identifizierung eines neuen Proteinclusters, welches die fünf untersuchten Komplement-inhibierenden Proteine als „Cluster of Complement-targeting and Host-interacting Proteins“ oder „Chi-Gencluster“, zusammenfasst. Diese Oberflächenproteine wurden als ChiA, ChiB, ChiC, ChiD und ChiE bezeichnet. Weiterführende Sequenzanalysen ergaben, dass das Chi-Gencluster extrem hoch konserviert ist und sowohl in den ersten B. recurrentis-Isolaten aus den 1990er Jahren als auch in B. recurrentis-Stämmen nachgewiesen werden konnte, die 2015 aus Patienten isoliert wurden.
Durch funktionelle Analysen konnte gezeigt werden, dass alle fünf Chi-Proteine in der Lage sind den alternativen und terminalen Komplementweg zu inhibieren. Ebenfalls konnte für die Proteine ChiB, ChiD sowie ChiE nachgewiesen werden, dass die Interaktion mit der Komplementkomponente C5 dosisabhängig verläuft.
Die strukturelle Aufklärung des Proteins ChiB ermöglichte es Aminosäuren zu identifizieren, von denen angenommen wurde, dass sie für die Interaktion mit Komplement eine Rolle spielen könnten. Durch in vitro Mutagenese konnten insgesamt fünf verschiedene Varianten von ChiB generiert werden, die jedoch keine Veränderungen in ihrem Komplement-inhibierenden Potential gegenüber dem unveränderten ChiB-Protein aufwiesen. Weder in der Inhibition des alternativen oder des terminalen Komplementweges, noch in der Interaktion mit den untersuchten Komplementkomponenten C3b, C5 und C9.
Weiter konnte gezeigt werden, dass die lytische Aktivität von Humanserum durch Vorinkubation mit ChiB, ChiC, ChiD und ChiE drastisch reduziert werden konnte, sodass Serum-sensible Borrelienzellen in Gegenwart von Komplement überlebten. „Gain-of-function“ B. garinii-Transformanten, welche mit dem entsprechendem Chi-kodierenden Gen transformiert wurden, bestätigten die mit den gereinigten Proteinen erhobenen Ergebnisse.So konnte nachgewiesen werden, dass ChiB-, ChiC- oder ChiD-produzierende „Gain-of-function“ B. garinii Transformanten, nicht jedoch ChiE- produzierende Zellen, in der Lage waren einen Serum-resistenten Phänotypen auszubilden. Für Transformanten, die zwei-, drei- oder vier Chi-Proteine in verschiedenen Kombinationen gleichzeitig produzierten, konnte allerdings die Fähigkeit in Gegenwart von Humanserum zu überleben nicht bestätigt werden.
Molekulare Analysen mit verschiedenen RF-Borrelienstämmen führten zum Nachweis, dass die fünf Chi-kodierenden Gene bei allen Isolaten vorhanden sind und unter in vitro Bedingungen exprimiert werden. Im Gegensatz zu B. recurrentis PAbJ, ließ sich das HcpA kodierende Gen in B. duttonii LAI nicht nachweisen, jedoch alle dem Chi-Cluster zugehörigen Gene. Bei B. duttoni V fehlte das gesamte Chi-Cluster sowie die für CihC- und HcpA-kodierenden Gene. Durch eine Western Blot-Analyse konnte mit spezifischen Antikörpern bestätigt werden, dass die Proteine CihC, HcpA und ChiB in B. recurrentis A17 unter in vitro Bedingungen produziert wurden.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden durch die Analyse der IgM- und IgG-Immunreaktivitäten der LRF-Patientenseren zwei Proteine identifiziert, CihC und GlpQ, die als potenzielle Antigene für die Serodiagnostik des LRF evaluiert wurden. Eine initiale Evaluierung des IgM Lineblot-Immmunoassays zeigte jedoch nur eine geringe Sensitivität für die beiden Antigene, während der IgG Lineblot-Immunoassay eine sehr hohe Sensitivität aufwies. Der ELISA hingegen zeigte bei einer Kombination beider Antigene sehr gute Sensitivitäten und Spezifitäten. Um die starke Hintergrundfärbung bei den Lineblot-Immunoassays, welche eine korrekte Bewertung der Reaktivitäten gegenüber CihC erheblich erschwerten, zu minimieren, wurde ein „Epitop-Mapping“ durchgeführt, um immunogene Regionen innerhalb des CihC-Proteins zu lokalisieren. Eine zweite Evaluierung mit dem immunreaktiven N-terminalen CihC-Fragment CihC-N führte zu einer deutlichen Verbesserung der IgG Lineblot-Immunoassays mit einer Sensitivität von 100 % und einer starken Reduktion der Hintergrundfärbung. Zusätzlich konnte die Sensitivität der IgM-ELISA deutlich verbessert werden. Die Verwendung von CihC-N führte beim IgG-ELISA zur Herabsetzung des Cut-off-Wertes und zu einer besseren Unterscheidung zwischen den positiven LRF-Seren und den verwendeten Kontrollseren. Im Rahmen dieser Arbeit konnten somit zwei serologische in vitro Diagnostika entwickelt werden, die als zuverlässige Point-of-Care-Diagnostik in klinischen Studien eingesetzt werden könnten. Zur Steigerung der Sensitivität des IgM-Lineblot-Immunoassays sollten allerdings weiterführende Untersuchungen mit weiteren immunreaktiven Antigenen, wie z.B. den Vmp-Proteinen von B. recurrentis, angestrebt werden.
S100A12 ist ein Entzündungsmarker, der inflammatorische Prozesse präzise anzeigt. Entzündungsprozesse mit erhöhten S100A12 Konzentrationen spielen vor allem bei Autoimmunerkrankungen wie der der rheumatischen Arthritis (RA), autoinflammatorischen Erkrankungen wie der juvenilen idiopathische Arthritis (JIA) oder weiteren Erkrankungen wie dem familiären Mittelmeerfieber (FMF) eine wichtige Rolle. Das S100A12 Protein besitzt drei verschiedene Konformationen: das Dimer, das Tetramer und das Hexamer. In verschiedenen Studien konnte gezeigt werde, dass das Hexamer an proinflammatorische Rezeptoren wie dem Toll-like Rezeptor-4 (TLR-4) und dem „receptor for the advanced glycation end products“ (RAGE) bindet und so die Produktion von weiteren Entzündungsmediatoren stimuliert. Daher besitzt die S100A12 Hexamerkonformation eine entscheidende Rolle in Entzündungsprozessen. Das Ziel bestand somit in der Selektion von Peptiden oder „single chain variable fragment“ (scFv)-Konstrukten, die exklusiv an die hexamere Konformation von S100A12 binden.
Mittels Biopanning von Peptid- und scFv-Phagen Bibliotheken konnten Peptide und scFvs selektiert werden. Die selektierten Peptide und die selektierten scFvs wurden in ELISAs weiter auf ihre Bindungseigenschaften charakterisiert. Durch Umklonierung in einen Fc-Konstrukt Vektor konnten die scFvs als vollständige scFv-Fc-Konstrukte exprimiert werden. Die Bindung der selektierten Peptide bestätigte sich als Biotin-Fusion im anschließenden ELISA. Es zeigte sich eine sehr hohe Bindungsspezifität der Peptide und der produzierten scFv-Fc-Konstrukte an das S100A12 Hexamer.
Mit den selektierten Liganden ist es gelungen einen Test zu entwickeln: an Streptavidin immobilisierte Peptide binden spezifisch das S100A12 Hexamer aus dem Testmedium und mittels selektiertem scFv-Fc-Konstrukten lassen sich die gebundenen S100A12 Proteine detektieren. Ein Detektionsantikörper ermöglichte die Visualisierung der gebundenen scFv-Fc-Konstrukte mittels Farbreaktion. Das S100A12 Hexamer konnte durch den Testaufbau auch im Plasma spezifisch detekiert werden.
Dieser Test könnte es ermöglichen, die exakte Diagnose und vor allem das Überwachung von Patienten mit steigenden Entzündungsmarkern, wie im Rahmen der autoinflammtorischen Erkrankung JIA oder einer Erkrankung wie dem FMF, zu verbessern. Mit einem verbessertem Krankheitsmonitoring könnte ebenfalls die Therapie im frühen Stadium optimiert werden.
Zusätzlich könnte ein mögliches therapeutische Potential der S100A12 Hexamer Liganden getestet werden. Sollten die hexamerspezifischen Liganden die Interaktion von S100A12 mit ihren Rezeptoren wie TLR-4 oder RAGE blockieren, ist eine therapeutische Verwendung in der Behandlung von Autoimmun- und autoinflammatorischen Erkrankungen möglich.
Precise tune determination and split beam emittance reconstruction at the CERN PS synchrotron
(2023)
In accelerator physics, the need to improve the performance and better control the operating point of an accelerator has become, year after year, an increasingly important need in order to achieve higher energies and brightness, as well as point-like particle beams. If this involves increasingly advanced technological developments (in terms, for example, of materials for more intense superconducting magnets), it can not take place in the absence of targeted studies of linear and non-linear beam dynamics. In the context of this Ph.D. thesis in physics, linear and non-linear dynamics of charged particles in circular accelerators is the topic that will be discussed and treated in detail. In particular, the presentation and discussion of the results will be divided in two main topics: the need to know the physical properties of a proton beam; and the development of innovative methods to determine and study the accelerator’s working point. With regard to the first topic, an innovative procedure will be presented to determine the transverse size of the PS beam in the beam extraction phase. Among the different ways the extraction occurs at the PS, the analysed one is based on the transverse splitting of the beam by means of non-linear fields. Thus, the knowledge of the transverse beam size is not trivial since resonant linear and non-linear beam structures (namely, core and islands) arise and, for each of them, the beam size has to be quantified. This parameter is crucial for two main reasons: the accelerator that will receive the beam exiting the upstream accelerator may have restrictions (physical or magnetic) that involve a partial or total loss of the incoming beam; and any experiments located downstream of the considered accelerator may need a beam with a transversal size as constant as possible; consequently, its monitoring and control are essential. The second topic concerns the accurate determination of the working point of an accelerator, defined as the number of transverse oscillations the particle beam travels per unit of accelerator circumference, both horizontally and vertically. This quantity is called horizontal and vertical tune, respectively. Their knowledge is also crucial to understand whether the beam will be stable or unstable. In fact, not all tune values are acceptable, as there are particular values that bring the beam into resonance. In this configuration, the amplitude of the transverse oscillations of the particles increases in an uncontrolled manner and leads to the loss of all or part of the beam. Note that, in particular operating conditions, the resonant conditions are sought and desired to model, in a suitable way, the transversal shape of the beam, such as the above mentioned PS extraction scheme. It is even clearer how much the determination of the machine working point is essential to determine the operating conditions of an accelerator. In this context, several methods (also taken from the field of applied mathematics) to calculate the tune will be demonstrated and tested numerically on different types of synthetic signals. At the end of this description, the use of experimental data will allow to obtain the benchmark of a new method for the direct calculation of some characteristic quantities of non-linear beam dynamics (namely, the amplitude detuning, i.e. the variation of tune as a function of intensity of the perturbation provided to the beam.
This thesis presents the experimental and numerical analysis of seismic waves that are produced by wind farms. With the aim to develop renewable energies rapidly, the number of wind turbines has been increased in recent years. Ground motions induced by their operation can be observed by seismometers several kilometers away. Hence, the seismic noise level can be significantly increased at the seismic station. Therefore, this study combines long-term experiments and numerical simulations to improve the understanding of the seismic wavefields emitted by complete wind farms and to advance the prediction of signal amplitudes.
Firstly, wind-turbine induced signals that are measured at a small wind farm close to Würzburg (Germany) are correlated with the operational data of the turbines. The frequency-dependent decay of signal amplitudes with distance from the wind farm is modeled using an analytical method including the complex effects of interferences of the wavefields produced by the multiple wind turbines. Specific interference patterns significantly affect the wave propagation and therefore the signal amplitude in the far field of a wind farm. Since measurements inside the wind turbines show that the assumption of in-phase vibrating wind turbines is inappropriate, an approach to calculate representative seismic radiation patterns from multiple wind turbines, which allows the prediction of amplitudes in the far field of a complete wind farm, is proposed.
In a second study, signals with a frequency of 1.15 Hz, produced by the Weilrod wind farm (north of Frankfurt, Germany) are observed at the seismological observatory TNS (Taunus), which is located at a distance of 11 km from the wind farm. The propagation of the wavefield emitted by the wind farm is numerically modeled in 3D, using the spectral element method. It is shown that topographic effects can cause local signal amplitude reductions, but also signal amplification along the travel path of the seismic wave. The comparison of simulations with and without topography reveals that the reduction and amplification are spatially linked to the shape of the topography, which could be an explanation for the relatively high signal amplitude observed at TNS.
Finally, the reduction of the impact of wind turbines on seismic measurements using borehole installations is studied using 2D numerical models. Possible effects of the seismic velocity, attenuation, and layering of the subsurface are demonstrated. Results show that a borehole can be very effective in reducing the observed high-frequency signals emitted by wind turbines. However, a borehole might not be beneficial if signals with frequencies of about 1 Hz (or lower) are of interest, due significant wavelength-dependent effects. The estimations of depth-dependent amplitudes with a layered subsurface are validated with existing data from wind-turbine-induced signals measured at the top and bottom of two boreholes.
The experimental analysis of measurements conducted at wind farms and the advances of modeling such signals improve the understanding of the propagation of wind-farm induced seismic wave fields. Furthermore, the methods developed in this work have a high potential of universal application to the prediction of signal amplitudes at seismometers close to wind farms with arbitrary layout and geographic location.
Chronisch-entzündliche Dermatosen sind in Deutschland weit verbreitet und haben einen enormen Einfluss auf die Lebensqualität der Erkrankten. Das umfassende Verständnis der molekularen Prozesse und Signalwege bildet die Basis, um mögliche Beziehungen zwischen den Hauterkrankungen aufzudecken. Der Nachweis von Ähnlichkeit und Übereinstimmung in den Signalwegen bietet die Aussicht, dass etablierte Therapien auch bei anderen Erkrankungen helfen können.
Der Zweck dieser Arbeit ist der Nachweis der Expression von IL-1β, IL-17A, IL-22, IL-23 und TNF-α in drei chronisch-entzündlichen Dermatosen: Acne inversa (AI), Sinus pilondalis (SP) und Perifolliculitis capitis abscedens et suffodiens (PCAS). Bei allen untersuchten Diagnosen handelt es sich um potentiell verwandte Erkrankungen der Haarfollikel, die durch Verlegung der Ausführungsgänge zu ausgedehnten Entzündungsreaktionen mit Bildung von Knoten, Abszessen und Fisteln führen. Bereits nachgewiesen ist, dass IL-1β, IL-17A, IL-22, IL-23 und TNF-α eine wichtige Rolle in der Pathogenese von Acne inversa spielen und Antikörpertherapien an einigen dieser Zielproteine spezifisch angreifen, um den Verlauf der Erkrankung zu verbessern.
Die Expression der Proteine wurde in Läsionen von Patienten mit den drei Indikationen immunhistochemisch an paraffiniertem Gewebe untersucht. Wie erwartet, zeigten sich in der überwiegenden Anzahl der Proben große entzündliche Infiltrate und hier wurde die Expression aller untersuchten Zytokine in unterschiedlicher Intensität nachgewiesen. Vielversprechend war insbesondere die Expression von IL-17A und IL-23 in SP und PCAS. Die Expression von IL-1β war insgesamt eher gering ausgeprägt; bei AI noch etwas höher als in SP und PCAS. Die Färbungen auf IL-22 zeigten sich kräftig in allen untersuchten Dermatosen. Allerdings gibt es bisher keine zugelassene Therapie zur Modulation dieses speziellen Zytokins. IL-22 scheint eine zentrale Rolle in
der Pathogenese der AI zu spielen. Mit TNF-α-Blockern wurden schon gute therapeutische Ergebnisse bei AI und PCAS erzielt. Deshalb ist der Nachweis von TNF-α in den entzündlichen Läsionen zu erwarten gewesen. Auch bei den SP-Proben fanden sich deutlich erhöhte Protein-Level, sodass auch hier eine gezielte Therapie von Vorteil sein könnte. Wegen des geringen Probenumfangs und der Methodik sind weitere gezielte Untersuchungen notwendig. Dennoch konnten viele Gemeinsamkeiten der Zytokinexpression ausgemacht werden, was vielversprechende Hinweise auf mögliche Behandlungsansätze bei AI, SP und PCAS zulässt. Diese Arbeit bietet einen ersten Blick auf den immunologischen Phänotyp der verwandten Dermatosen.