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Ziel der vorliegenden Dissertation war es, die initialen Bewegungsparameter von Ionen bei matrixunterstützter Laserdesorption zu bestimmen, um mit deren Kenntnis das Verständnis des Desorptions und Ionisationsprozesses bei MALDI zu verbessern. Die Etablierung einer Meßmethode der initialen Geschwindigkeit von Analytionen sowie die Überprüfung verschiedener experimenteller Parameter führten zur Bestimmung einer großen Zahl von Meßwerten der Startgeschwindigkeit von Ionen unterschiedlicher Masse, Ladung und Substanzklasse bei verschiedenen Matrizes und Präparationsbedingungen (siehe Kapitel 5 und 7). Durch Vergleich dieser Meßwerte ist eine Charakterisierung des Desorptions und Ionisationsprozesses bei MALDI möglich. Aufbauend auf diesen Untersuchungen der Startgeschwindigkeit von Ionen wurde ein Desorptions/Ionisationmodell für MALDI entwickelt (siehe Kapitel 6 und 8). Aus der festen Matrix/Analytpräparation werden durch den Laserimpuls oberhalb einer kritischen Laserbestrahlung geladene Bruchstücke ("Cluster") freigesetzt. Aus diesen Clustern resultiert nach Abdampfen von ungeladenenen Teilchen, wie zum Beispiel Matrixmolekülen, die Freisetzung von Ionen in der Gasphase. Hierbei kann das Modell der Clusterbildung sehr gut mit dem Desorptionsmodell nach Zhigilei (siehe Kapitel 2.4.1.5) verknüpft werden [Zhi97]. Die Cluster verschiedener Größe werden in der sich ausdehnenden Teilchenwolke transportiert. Sie bewegen sich mit der initialen Geschwindigkeit der expandierenden Teilchenwolke. Dieser Vorgang kann mit dem "Mitgerissen werden" der Biomoleküle (entrainment) [Bea91] bei MALDI korreliert werden: So wird beispielsweise beobachtet, daß die mittlere initiale Geschwindigkeit v 0 der Analytmoleküle im Mittel nie höher ist als die der Matrixmoleküle. Die Schwellbestrahlungsabhängigkeit der Ionisation kann weiterhin mit der Schwellbestrahlung der Ablation, d.h. der kollektiven Ablation von großen Partikeln aus der Matrix/Analytpräparation, wie sie von Zhigilei in molekulardynamischen Simulationen gefunden wurde, verknüpft werden. Desorption und Ionisation sind somit nicht getrennt voneinander zu betrachten, da während der Desorption die Freisetzung von Ionen erfolgt. Wenn Peptide und Proteine aus Clustern stammen, besitzen die freigesetzten Biomolekülionen die gleiche mittlere Analytionengeschwindigkeit wie die Matrixneutralen [Dre94]. Für kleine Oligosaccharide werden niedrigere Startgeschwindigkeiten detektiert als für Peptide und Proteine. Das kann darauf zurückgeführt werden, daß diese Ionen nicht als vorgeformte Ionen aus Clustern freigesetzt werden. Da die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten neutralen Oligosaccharide kationisiert und (im wesentlichen) nicht protoniert im MALDIMassenspektrum auftreten und bei höheren Verzögerungszeiten eine verstärkte Kationisierung von Oligosacchariden zu beobachten ist, werden diese Teilchen voraussichtlich nach der Desorption in der Gasphase ionisiert (siehe Kapitel 7 und 8). Da Oligosaccharide in die Matrix DHB eingebaut werden, jedoch Kationen zur Ionisation nicht in den Matrixkristallen zur Verfügung stehen, ist anzunehmen, daß neutrale Oligosaccharide aus Clustern mit der gleichen Startgeschwindigkeit wie Peptide und Proteine in der desorbierten Teilchenwolke vorkommen; ihre Ionisation und damit ihre Detektion ist aufgrund der fehlenden Ladung jedoch nicht möglich. Die Ergebnisse der Startgeschwindigkeit von Ionen bei verschiedenen Präparationen verdeutlichen, daß Gasphasenionisation einer der möglichen Wege der Ionisation neben der Freisetzung von Analytionen aus geladenen Clustern ist. Da auch für Peptide und Proteine Kationisierung in der Gasphase auftreten kann, lassen sich auch langsame Molekülionenspezies experimentell feststellen, was mehrere initiale Geschwindigkeits komponenten und damit auch ein Ionensignal mit unterschiedlichen Komponenten der Startgeschwindigkeit zur Folge hat. Weiterhin sollte auch unterhalb der Schwelle des Analytionennachweises (und damit der kollektiven Ablationsschwelle gemäß dem breathing sphereModell) bei MALDI aufgrund von Verdampfung einzelner Moleküle gefolgt von Ionisation in der Gasphase ein Ionensignal feststellbar sein. Die beobachtete mittlere Startgeschwindigkeit von Analytionen wäre somit eine Mischung aus schnellen, aus Clustern stammenden, und aus langsamen, in der Gasphase ionisierten Teilchen. Eine Komponente kann als prompt ionisierte Komponente mit im wesentlichen massenunabhängiger, konstanter (hoher) initialer Geschwindigkeit verstanden werden. Die zweite Komponente kann durch verzögert auftretende Gasphasenionisation innerhalb des expandierenden Materials erklärt werden, wobei die Analytionen eine geringere Startgeschwindigkeit zeigen. Zusammenfassend (siehe Kapitel 8) wird eine kollektive Ablation von Partikeln und vorgeformten Ionen beim MALDIDesorptionsprozeß gefolgt von Sekundärreaktionen innerhalb der dichten Teilchenwolke in der Gasphase in der selvedgeRegion durch Ionen Molekülreaktionen vorgeschlagen, wie es bereits bei dem precursorModell für Sekundärionenmassenspektrometrie formuliert wurde [Sun88], [Pac85], [Ben83]. Bezogen auf die Auswahl potentieller Matrizes besitzt das Modell nach wie vor nur eine geringe "Voraussagekraft": Ob eine Substanz als Matrix geeignet ist oder ob sie einen hohen bzw. geringen Grad an metastabiler Fragmentierung für zum Beispiel Peptide oder Proteine zeigt, kann weiterhin nur experimentell bestimmt werden, wobei jedoch eine Charakterisierung mit Hilfe der Startgeschwindigkeit möglich ist. Der Zusammenhang eines ClusterDesorptions/Ionisationsmodells mit molekulardynamischen Simulationen nach Zhigilei ermöglicht jedoch eine Beschreibung vieler experimenteller Ergebnisse bei MALDI. Weiterführende Experimente sollen die Verifikation des "ClusterModells" der Ionisation zum Ziel haben. Hier ist insbesondere die Untersuchung des Ladungszustandes von Analytmolekülen in festen Matrix/Analytpräparationen von Bedeutung. Weitere Untersuchungen zur Spektrenqualität bei Matrizes, die keinen Einbau der Analytmoleküle in die Matrixkristalle zeigen, sowie eine eingehende Untersuchung der verschiedenen alternativen Präparationstechniken aus Kapitel 7 sind hierbei geplant.
In der vorliegenden Arbeit wurden neue Methoden für die hochauflösende NMR Spektroskopie entwickelt, um damit native und denaturierte Proteine charakterisieren zu können. Neue Mess- und Anwendungsmethoden für dipolare Kopplungen bilden den Schwerpunkt der Doktorarbeit. Durch die Verwendung von flüssigkristallinen Medien ist es in NMR in Lösung möglich geworden dipolare Kopplungen zu bestimmen. Durch die Projektionen der einzelnen so bestimmten Vektoren auf andere Vektoren im Protein, welche beliebig weit entfernt sein können, kann weitreichende Orientierungsinformationen für die Strukturrechnung von Biomakromolekülen genutzt werden. Dies ist an den Beispielen Ubiquitin, Triggerfaktor und Raffinose in der Arbeit dargestellt. Durch diese Orientierungsinformation kann man auch Teile von Proteinen, wie zum Beispiel Domänen, gegeneinander ausrichten oder die relative Orientierung von Sekundärstrukturelementen nutzen um eine 3D Homologiesuche durchzuführen. Auch dies ist in der Arbeit beschrieben. Die neuen Messmethoden erlauben erstmals die Bestimmung von 1H-1H dipolaren Kopplungen mit Größe und Vorzeichen (JHH-NOESY) und von allen drei dipolaren Kopplungen in einer Seitenkettenmethylgruppe (SPITZE-HSQC). Ein weiterer wichtiger Punkt war die Extraktion dynamischer Parameter aus dipolaren Kopplungen. Der Vektor, der die wechselwirkenden Dipole verbindet, wird von der Dynamik des Proteins beeinflusst. Dadurch ist eine Analyse der Dynamik auf einer Zeitskala bis ca. 10ms möglich (bisher nur bis in den Bereich von ns). Besonders µs Dynamik, welche vorher nicht mittels NMR Methoden sichtbar, kann so dargestellt werden. Aus den dipolaren Kopplungen, welche in 11 verschiedenen Orientierungsmedien gemessen wurden, konnten modellfreie dipolare Ordnungsparameter extrahiert werden. Erstmals konnte zwischen axialsymmetrischen und anisotropen Bewegungen der NH Vektoren unterschieden werden. Unsere experimentellen Daten zeigen, dass Ubiquitin auf einer Zeitskala oberhalb der Korrelationszeit ähnlich viel Bewegung zeigt wie unterhalb der Korrelationszeit. Der mittlere Ordnungsparameter sinkt von 0.8 für Bewegungen bis zur Korrelationszeit auf 0.6 für alle Bewegungszeiten. Auch sieht man, dass viele Bewegungen bis zu 60% Anisotropie beinhalten. TOCSY-Sequenzen sind wichtige Bausteine für Moleküle jeder Größenordnung. Hierfür wurden neue adiabatische TOCSY Sequenzen entwickelt, welche TOCSY Spektroskopie bei allen Magnetfeldern mit höherer Intensität erlauben. Wichtig ist auch noch die viel größere Robustheit gegen B1-Inhomogenitäten und Pulsmisskalibrierung. Dipolare TOCSY Sequenzen (MOCCA) erlauben besseren Transfer mittels den zuvor schon erwähnten dipolaren Kopplungen. Durch die Analyse denaturierter Proteine wollte man ein besseres Verständnis dieses Zustandes erzielen. Hierfür wurden Kopplungskonstanten, kreuzkorrelierte und autokorrelierte Raten und chemische Verschiebungen gemessen und mit einem Modell, dem sogenannten Random Coil Modell verglichen. Mit Hilfe dieser experimentellen Daten sieht man erstmals direkt, dass Proteine im denaturiertem Zustand den Winkel zwischen 60° ( -Helix) und 120° ( -Faltblatt) absuchen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von kleinen, nicht isotopenmarkierten Proteinen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie. Ziel ist die Aufklärung der Struktur und der biologisch relevanten Wechselwirkung mit anderen Molekülen. Konkret wird die strukturelle Aufklärung der zweiten KunitzDomäne des Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI), TFPI2 beschrieben. Dieses Molekül spielt eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung (Kapitel 2.2) in Säugetieren, in dem es bei kleinsten Verletzungen die Gerinnung unterbindet und so die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen des betroffenen Bezirks aufrecht erhält (Kapitel 2.3). Die untersuchte zweite Domäne des TFPI lagert sich direkt und spezifisch an ein zentrales Molekül der Gerinnungskaskade, den Faktor Xa, an. Neben dieser bio logischen Funktion trägt die Entdeckung des TFPI dazu bei, die strikte Trennung der Gerinnung in zwei voneinander unabhängige Reaktionswege bis zur Bildung des Fibrinpolymers aufzuheben. Zur Bestimmung der Struktur des unmarkierten Proteins wurden NMRSpektren aufgenommen. Neben den im Kapitel 3 beschriebenen Standardexperimenten wur den im Rahmen der Untersuchungen das TACSYExperiment in neuer Art und Weise genutzt (Kapitel 4.2), da die Probe ein ungünstige Relaxationseigenschaften auf wies. Mit dem entwickelten Experimenten ist ein neuer Ansatz zur Bestimmung von Kopplungskonstanten in nichtmarkierten Molekülen nun auch in solchen Proben möglich, da die Güte der abgelesenen Konstanten nicht mehr von der Signalbreite beeinflußt wird. Ausgehend von diesen Untersuchungen wurde ein neues Experiment zur Bestim mung von 3 J(HNH)Kopplungskonstanten entwickelt. Das SIAMTACSY (Kapitel 4.3), ermöglicht die Bestimmung der Kopplungskonstanten nach der DISCOMe thode, für die bislang die Aufnahme von wenigstens zwei Spektren mit unter schiedlichen Methoden nötig war, mit nur einem einzigen Spektrum. Beide Methoden, SIAM--TACSY als auch die in dieser Arbeit näher beschriebene Me thode, umgehen die Notwendigkeit der Aufnahme verschiedener Spektren mit un terschiedlichen Pulssequenzen und Aufnahmebedingungen. Während SIAM--TACSY mit nur einem Experiment auskommt, dessen Daten durch unterschiedliches Post-Processing alle Kopplungskonstanten liefern, müssen mit der in Kapitel 4.2.2 be schriebenen Methode mehrere Spektren desselben Typs aufgenommen werden. Im Verlauf der Arbeit wurden die Resonanzen von 52 von 58 Aminosäuren eindeu tig und vollständig zugeordnet (Kapitel 3.4). Die Spektren liefern die für die Struk turrechnungen notwendigen Parameter (Kapitel 5). Die berechnete Struktur basiert auf 762 DistanzRestraints, 20 DihedralWinkel des ProteinRückgrats und 15 Wasserstoffbrückenbindungen. Diese Parameter wurden zunächst in Distance-Geometry-Berechnungen (Kapitel 6.2) eingesetzt. Zur Verfeinerung der Struktur wurde in den späteren Rechnungen das SimulatedAnnealingVerfahren (Kapitel 6.1) genutzt. In einem iterativen Ver fahren werden die gewonnenen Strukturen -- es wurden immer 100 Strukturen gleichzeitig aus einem Parametersatz berechnet -- analysiert und die korrigierten und überprüften Parameter wieder in die Berechnungen eingesetzt (Kapitel 6.3). Die Struktur der zweiten Domäne des Tissue Factor Pathway Inhibitor ist durch dieses Verfahren sehr gut definiert, was sich in den Werten der Standardabwei chung für die 10 besten Strukturen für den Backbone (1,4 Å) niederschlägt (Kapitel 6.4). Die so bestimmte Struktur beweist die Annahme, daß es sich bei der zweiten Do mäne des TFPI auch strukturell um einen typischen KunitzInhibitor (Kapitel 2.1) handelt, was durch punktuelle Mutationen im Bereich der reactive site bereits funktionell bewiesen war. Die Stabilität der ProteaseInhibitoren gegenüber Verdau und Entfaltung begründet sich in der kompakten Struktur, die durch 3 Disul fidbrücken stabilisiert wird. Die sechs stets 1 gleichweit voneinander in der Sequenz entfernten Cysteine verbinden N und CTerminus (Cys5 -- Cys55 in der BPTI Numerierung), stabilisieren die reactive site (Cys14 -- Cys38) und binden das zentrale Faltblatt an den Rest des Moleküls. Die für KunitzInhibitoren typische Struktur ist im untersuchten Protein bewahrt; weniger gut definiert ist die in eini gen Inhibitoren dieses Typs zu findenden N-terminale AlphaHelix, sie ist in den Struk turen des TFPI2 lediglich angedeutet. Ein Vergleich der Struktur des TFPI2, so wie es in dieser Arbeit untersucht wurde, und der Struktur eines Homologen findet in Kapitel 6.4.3 statt. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß die strukturelle Untersuchung des kleinen, un markierten Proteins erfolgreich durchgeführt werden kann. Die Struktur des phar makologisch interessanten Moleküls sollte ein Hilfsmittel bei der Auffindung von neuen, den körpereigenen ähnlichen und damit besser verträglichen Gerinnungs inhibitoren sein. Die neuen NMRMethoden bieten ein innovatives Werkzeug zur Gewinnung von skalaren Kopplungskonstanten mit hoher Effizienz und unter Umgehung der Probleme, die in COSYSpektren mit hohen Linienbreiten auftreten.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die folgenden fünf biochemischen Fragestellungen zu Enzymen und deren Wechselwirkungen mit ihren Substraten mit NMR spektroskopischen Methoden untersucht: (1) Die spontane Bildungsrate von NCarboxymethanofuran (Carbamat) aus CO 2 und Methanofuran im Gleichgewicht und die Beeinflussung der Geschwindigkeit durch FormylmethanofuranDehydrogenase aus Methanosarcina barkeri wurden über 2D ProtonenaustauschSpektroskopie (EXSY) bestimmt. Mit Hilfe der berechneten Geschwindigkeitskonstanten und der bekannten physiologischen Konzentrationen von CO 2 und Methanofuran konnte erstmals gezeigt werden, daß die spontane Carbamatbildungsrate ausreicht, um die in vivoCO 2 Reduktionsraten in methanogenen Archaea erklären zu können. (2) Die Konformation von N 5 ,N 10 Methylentetrahydromethanopterin (Methylen H 4 MPT) in Anwesenheit und in Abwesenheit H 2 bildender MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methanothermobacter marburgensis wurde über TransferNOEMessungen bestimmt. Es wurde nachgewiesen, daß die Bindung zu einer Konformationsänderung des Substrats führt, welche die ReSeitenStereospezifität des Enzyms erklären kann. (3) Die Stereospezifität des Hydridtransfers von MethylenH 4 MPT auf NADP , katalysiert von NADPabhängiger MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methylobacterium extorquens AM1, wurde NMRspektroskopisch untersucht. In Übereinstimmung mit der unter (2) entwickelten Theorie zum Übergangszustand des Hydridtranfers wurde gefunden, daß auch der Transfer auf NADP ReSeitenspezifisch in Bezug auf MethylenH 4 MPT verläuft. Zusätzlich wurde gezeigt, daß das Enzym das Hydrid auf die ReSeite von NADPH überträgt. (4) Die spontane Rate der Kondensationsreaktion von Glutathion und Formaldehyd zu SHydroxymethylglutathion wurde mit EXSYMessungen bestimmt. In Zellextrakten des methylotrophen Proteobakteriums Paracoccus denitrificans wurde eine Enzymaktivität nachgewiesen, die diese Reaktion beschleunigt. Bislang wurde vermutet, daß es eine solche Enzymaktivität nicht gibt. Mit EXSYMessungen konnte nicht nur diese Enzymaktivität nachgewiesen werden, sondern es gelang auch das verantwortliche Enzym, das Glutathion abhängiges FormaldehydaktivierendesEnzym (Gfa) genannt wurde, erstmals zu reinigen und das kodierende Gen zu identifizieren. (5) Die Anzahl der UbichinonBindungsstellen des Cytochrom bc 1 Komplexes aus Bos bovis wurde bestimmt. Dafür wurde eine NMRMethode entwickelt, die es ermöglicht, Bindungsstudien von wasserunlöslichen Cofaktoren an membranständigen Proteinen durchzuführen. Über die Aufnahme und Integration von 1 H, 13 CHSQCSpektren unter Verwendung von HRMASNMR konnte die Konzentration des Ubichinons, das in der Proteoliposomenmembran frei beweglich ist, quantifiziert werden. Verdrängungsstudien mit spezifischen Inhibitoren ermöglichten es dann, durch den Vergleich der freigesetzten Ubichinonkonzentrationen relativ zu der Cytochrom bc 1 Komplexkonzentration nachzuweisen, daß insgesamt drei Ubichinone spezifisch an den Cytochrom bc 1 Komplex binden. Die Ergebnisse werden in 5 Abschnitten beschrieben. Im Anhang zu jedem Abschnitt finden sich die Abdrucke der bereits erschienenen Veröffentlichungen (Abschnitte 1 bis 3) und ein zur Veröffentlichung akzeptiertes Manuskript (Abschnitt 5). In der Einleitung werden die Möglichkeiten aufgezeigt, mit modernen NMRspektroskopischen Methoden Protein LigandWechselwirkung zu studieren. In der Diskussion werden anhand der Ergebnisse die Limitierung, aber auch das noch nicht ausgeschöpfte Potential dieser Methoden erläutert. Während der Doktorarbeit wurden auch Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften einer energiekonservierenden Hydrogenase aus M. barkeri durchgeführt. Die daraus entstandene Publikation ist im Anhang zu finden.
Obwohl die Kristallstrukturen der CytochromcOxidase aus RinderherzMitochondrien und dem Bodenbakterium P. denitrificans bekannt sind und die Funktionsweise des Enzyms mit Hilfe zahlreicher Methoden bereits intensiv untersucht wurde, wird nach wie vor kontrovers diskutiert, an welcher Stelle im katalytischen Zyklus wieviele Protonen aufgenommen bzw. gepumpt werden und über welchen der beiden Protoneneintrittspfade dies geschieht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, diesen Fragestellungen mit Hilfe von elektrischen Messungen nachzugehen, um dann ein genaueres Bild von der mechanistischen Funktionsweise des Enzyms zu erhalten. Hierzu wurden Teilschritte des katalytischen Zyklus der CytochromcOxidase aus P. denitrificans genauer untersucht. Dies gelang durch Spannungsmessungen an der schwarzen Lipidmembran mit Ru II (2,2'bipyridyl) 3 Cl 2 (Rubpy) als lichtinduzierbarem Einelektronendonor. Es konnte gezeigt werden, daß ausgehend vom vollständig oxidierten Zustand O nach Lichtanregung ein Elektron von Rubpy auf die Oxidase übertragen und anschließend vom CuA zum Häm a mit einer Zeitkonstanten von » 20 µs transportiert wird. Zeitaufgelöste spektroskopi sche Messungen deuten darauf hin, daß das Elektron auf dem Häm a verbleibt. Die Reduktion dieses Kofaktors führt zu einer Protonenaufnahme über den KWeg mit einer Zeitkonstanten von » 175 µs. Nimmt man an, daß sich Häm a in der Mitte des Dielektrikums befindet (Hinkle und Mitchell, 1970), so deuten die relativen Amplituden der beiden Phasen an, daß etwa 0.8 Protonen aufgenommen werden, in sehr guter Übereinstimmung mit (Capitanio et al., 2000). Aus MehrfachblitzExperimenten unter anaeroben Bedingungen, ausgehend vom OZustand, konnten erste Erkenntnisse über den E ® R Übergang gewonnen werden, nämlich daß hierbei ein Prozeß mit einer Zeitkonstanten von ca. 1.1 ms auftritt und daß sowohl K als auch DWeg an diesem Teilschritt des katalytischen Zyklus beteiligt sind. Da mit der MehrfachblitzMethode aber immer ein Gemisch aus verschiedenen Zuständen entsteht, war es nicht möglich, quantitative Aussagen über die Zahl der transportierten Ladungen zu treffen. Aus diesem Grund wurde eine Möglichkeit gesucht, den EZustand in hoher Ausbeute mit ausreichender Stabilität herzustellen, um dann ein Elektron zu übertragen. Dies gelang durch Darstellung des OxoferrylZustandes F mit Hilfe von H 2 O 2 und anschließende Zweielektronenreduktion durch CO. Die Übertragung von einem Elektron auf den so gebildeten EZustand lieferte 3 Phasen im Spannungssignal mit Zeitkonstanten von » 25 µs, » 200 µs und » 1.5 ms. Die relativen Amplituden dieser Phasen und die Ergebnisse von K und DWegMutanten legen nahe, daß nach Aufnahme des 2. Elektrons vermutlich ein Proton über den KWeg aufgenommen und anschließend 1 Proton über den DWeg gepumpt wird. Es konnte somit zum ersten Mal gezeigt werden, daß bereits während des reduktiven Teils (O ® R) des katalytischen Zyklus ein Proton von der intrazellulären zur extrazellulären Seite transportiert wird und zwar ohne daß unmittelbar vorher die Sauerstoffreduktion stattgefunden haben muß. Erste Experimente zum P ® F Übergang lassen sich so deuten, daß mit Aufnahme des 3. Elektrons ein Proton zum binuklearen Zentrum transportiert und mindestens 1, wenn nicht gar 2 Protonen durch das Enzym gepumpt werden. Hier sind noch weitere Experimente nötig, um die genaue Zahl der transportierten Ladungen und die für die einzelnen Protonenbewegungen verwendeten Protoneneintrittspfade zu bestimmen. Messungen zum F ® O Übergang schließlich zeigten, daß nach dem CuA ® Häm a Elektro nentransfer mit einer Zeitkonstanten von ca. 25 µs vermutlich 1 Proton über den DWeg bis zu den Hämen transportiert (t » 270 µs) und anschließend ein Proton ebenfalls über den DWeg gepumpt wird (t » 1.5 ms). Aus den gewonnenen Daten wurde ein neuer Mechanismus für die Sauerstoffreduktion in der ParacoccusCOX entwickelt. Dieser beruht auf dem von Mitchell und Rich postulierten Elektroneutralitätsprinzip (Mitchell und Rich, 1994) und ist stark an das von Michel vorgeschlagene Modell (Michel, 1998; Michel, 1999) angelehnt. Zur Klärung der Fragen, ob sich bakterielles und RinderzEnzym eventuell in ihrem Mechanismus unterscheiden oder ob nicht eventuell ein Proton während des O ® E Übergangs gepumpt wird (allerdings nur, wenn unmittelbar vorher die Sauerstoffreduktion durchlaufen wurde), sind u.a. noch intensivere Untersuchungen des P ® F Teilschrittes notwendig. Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin 2 verschiedene Kobaltkomplexe auf ihre Eignung als lichtinduzierbare Sauerstoffdonatoren (cagedSauerstoff) für die COX untersucht. Hierbei stellte sich heraus, daß beide Verbindungen ungeeignet sind, da sie entweder instabil sind ((µsuperoxo)bis[pentaammincobalt(III)]) oder Nebenreaktionen mit dem Protein eingehen ((µperoxo)(µhydroxo)bis[bis(bipyridyl)cobalt(III)]). Abschließend wurde der Einfluß von Zn 2 Ionen auf elektrogene Schritte im katalytischen Zyklus genauer erforscht. Es wurde deutlich, daß Zn 2 bakterielle COX von beiden Seiten inhibieren kann, wobei die Bindestelle(n) auf der intrazellulären Seite im Gegensatz zur extrazellulären Seite hochaffin ist/sind. Die elektrischen Messungen deuten darauf hin, daß hierbei sowohl D als auch KWeg blockiert werden, wobei die exakte Position der Metallbindestelle(n) noch zu klären ist.
Zur Untersuchung der Zusammensetzung und Diversität von Bambusameisengemeinschaften (Hymenoptera, Formicidae) sowie ausgewählten Nischenparametern der beteiligten Ameisenarten, wurden auf dem Gelände des Gombak Field Studies Centre (University Malaya, Selangor, Westmalaysia) fünf Haine von Riesenbambusarten (Gigantochloa scortechinii, G. thoii, Bambusoidea) gefällt und abgesammelt. Es wurden Hinweise auf deterministische oder stochastische Strukturierungsmechanismen der Ameisengemeinschaften gesucht. Hierzu wurden verschiedene Fragestellungen anhand der Multiplen Regression untersucht. Zusätzlich wurden Stichproben von Bambusschößlingen und jungen Bambushalmen hinsichtlich der Nutzungsweise und Besiedlung durch Ameisen studiert. In der vorliegenden Arbeit werden die Ergebnisse der Auswertung auf Hainebene, d. h. der Bambusameisenzönosen als Ganzes betrachtet, vorgestellt. 1. In fünf Bambushainen wurden bisher 66 nistende Ameisenarten aus 21 Gattungen und 6 Unterfamilien identifiziert. Die drei gattungs
Alignment, characterization and application of polyfluorene in polarized light-emitting devices
(2001)
Ziel im Rahmen der vorliegenden Dissertation war die Realisierung der polarisierten Elektrolumineszenz blau emittierender flüssigkristalliner Polyfluorene. Polymere Leuchtdioden, die aufgrund hoher Orientierung der Moleküle in der aktiven Schicht polarisiert emittieren, sind für eine Anwendung beispielsweise als Hintergrundbeleuchtung in Flüssigkristallanzeigen (LCDs) von Interesse. Es wurde gezeigt, dass sich mit der Ausrichtung von Polyfluoren auf Ori entierungsschichten auf der Basis von geriebenem Polyimid hohe Ordnungsgrade erzielen lassen. Die Dotierung mit lochleitenden Materialien erlaubte erstmals den Einbau solcher Orientierungsschichten in Leuchtdioden und ermöglichte die Realisierung polarisierter Elektrolumineszenz. Die Morphologie und Struktur sowohl der hoch orientierten Polyfluoren filme als auch lochleitender Orientierungsschichten wurden eingehend untersucht. Die ElektrolumineszenzEigenschaften von isotropen sowie polarisierten Leuchtdioden wurden ausführlich analysiert und anschließend durch chemische Modifizierung des Polyfluorens entscheidend verbessert. Zusätzlich wurde Polyfluoren mit fluoreszierenden Farbstoffen dotiert, um ausgehend von blauem Licht grüne und rote Emission zu erhalten. Hierbei wurde unter sucht, in welchem Maß FörsterEnergietransfer sowie Ladungsträgereinfang für die Emission der eingemischten Farbstoffe verantwortlich sind. Eine Einführung in die Grundlagen der Elektrolumineszenz konjugierter Polymere findet sich in Kapitel 2 dieser Arbeit. Da polarisierte Elektrolumineszenz ein hohes Maß an Anistotropie der emittierenden Schicht erfordert, werden anschließend verschiedene Methoden zur Ausrichtung von Polymeren besprochen, wobei besondere Betonung auf der Orientierung flüssigkristalliner Polymere liegt. Kapitel 3 behandelt die signifikanten Eigenschaften der Polymere sowie die experimentel len Methoden, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden. Neben Polyfluoren wird ein weiteres blau emittierendes Polymer, Polyphenylenethynylen (PPE), eingeführt. Bei der Cha rakterisierung der Polyfluorene wird im Anschluss an die Beschreibung der reinen Polymere insbesondere der positive Einfluss des Anbringens von lochleitende Endgruppen an die Hauptkettenenden auf wesentliche Eigenschaften bezüglich der Elektrolumineszenz aufgezeigt. Außerdem werden die wesentlichen Merkmale von Polyimid, welches die Matrix der Orientierungsschicht bildet, sowie von verschiedenen Polymeren, die der Lochleitung und der Lochinjektion dienen, besprochen. Die Beschreibung der Methoden zur Präparation isotroper und polarisierter Leuchtdioden sowie zur Untersuchung der optischen, elektrischen und mor phologischen Eigenschaften der Polymerfilme bilden den Abschluss dieses Abschnitts. Im vierten Kapitel dieser Arbeit werden unterschiedliche Verfahren zur Ausrichtung der Polymermoleküle auf Polyfluoren sowie auf PPE angewandt und hinsichtlich der erreichbaren Ordnungsgrade verglichen und beurteilt. Im Falle von Polyfluoren wurde gezeigt, dass eine Orientierung im flüssigkristallinen Zustand mit Hilfe zusätzlicher Orientierungsschichten, welche auf geriebenem Polyimid basieren, die einzige geeignete Methode zur Orientierung dieses Po lymers ist. Durch den Zusatz von niedrigmolekularen lochleitenden Materialien in geeigneter Konzentration in die PolyimidMatrix konnte das nichtleitende Polyimid so modifiziert wer den, dass es sich in Leuchtdioden einbinden ließ, ohne dass die Orientierungseigenschaften der Schichten verloren gingen. Vergleiche unterschiedlicher Polyfluorene ergaben, dass die Länge und Struktur der AlkylSeitenketten das Orientierungsverhalten entscheiden beeinflussen. Hierbei wurde gezeigt, dass sich für verzweigte Seitenketten deutlich höhere Orientierungsgrade erreichen lassen als für solche mit linearen Seitenketten. Dies wurde mit dem vergrößerten Verhältnis aus Persistenzlänge und Polymerdurchmesser erklärt, was gemäß der Theorie der flüssigkristallinen Polymere zu einer Zunahme des erreichbaren Ordnungsparameter führt. Außerdem wiesen die Absorptionsspektren der Polyfluorene mit langen Seitenketten auf eine planare Konformation der Polymerrückgrate hin, welche aufgrund der starken Wechselwirkung zwischen den einzelnen Ketten eine Orientierung im flüssigkristallinen Zustand verhindert. Von allen untersuchten Polyfluorenen ließ sich Poly(diethylhexylfluoren) (PF2/6) am besten orientieren. Im Gegensatz zu Polyfluoren scheiterte der Versuch, PPE im flüssigkristallinen Zustand auf Orientierungsschichten auszurichten. Kalorimetrische DSCUntersuchungen machten deutlich, dass sich die Struktur von PPE in flüssigkristalliner und kristalliner Phase nur unwesentlich voneinander unterscheiden. In beiden Phasen deuteten Absorptionsuntersuchungen auf eine planare Konformation der PPERückgrate. Die Viskosität des als sehr steif bekannten Polymers PPE ist daher auch in flüssigkristallinem Zustand zu hoch, um eine Umordnung der Moleküle zu verursachen, welche allein durch Wechselwirkung mit einer Orientierungsschicht hervorgerufen wird. PPE konnte jedoch im kristallinen Zustand orientiert werden, indem anstatt einer zusätzlichen Orientierungsschicht der Polymerfilm selbst gerieben wurde. Die hohe Steifigkeit von PPE erlaubte die Übertragung der Kräfte, die durch das Reiben verursacht werden, auf das starre Polymerrückgrat und ermöglichte eine homogene Ausrichtung der Moleküle. Mit Hilfe dieser Methode konnten Leuchtdioden mit PPE in der aktiven Schicht verwirklicht werden, die polarisiert emittierten. Die bestmöglichen Methoden zur Ausrichtung der Moleküle unterschie den sich demnach für die beiden flüssigkristallinen Polymere Polyfluoren und PPE, und für beide Polymere wurden Verfahren gefunden, die die Herstellung von polarisierten Leuchtdioden ermöglichten. In Kapitel 5 dieser Arbeit werden die Morphologie, die Struktur sowie weitere wesentliche Eigenschaften sowohl orientierter Polyfluorenfilme als auch der zur Ausrichtung benötigten lochleitenden Orientierungsschichten aus dotiertem Polyimid besprochen. Hierfür wurden die Filme mit Hilfe von Licht und Elektronenmikroskopie sowie von Elektronen und Röntgen beugungsexperimenten untersucht. Im ersten Teil wird die beobachtete Abnahme der Orien tierbarkeit von Polyfluoren mit zunehmendem Molekulargewicht durch Elektronenbeugungs untersuchungen näher beschrieben. Ergebnisse aus TransmissionsElektronenmikroskopie Untersuchungen zeigten, dass sich die Morphologie orientierter PF2/6Filme durch hochgeordnete Lamellen auszeichnet, welche in regelmäßigen Abständen von ungeordneten Regionen unterbrochen werden. Innerhalb der orientierten Lamellen sortieren sich die Moleküle nach ähnlicher Kettenlänge, wohingegen in den ungeordneten Gebieten vornehmlich die Endgruppen der Ketten vorzufinden sind. Strukturuntersuchungen ergaben, dass die einzelnen Polymerketten von PF2/6 zylindrisch sind und eine hexagonale Packung aufweisen, wobei die Polymerrück grate eine 5/2Helixstruktur bilden. Das wurmähnliche Rückgrat ist dabei zylinderförmig von einer Hülle aus ungeordneten Seitenketten umgeben, die ähnlich wie ein Lösungsmittel zwi schen den einzelnen Ketten wirken. Die hieraus folgende geringe Viskosität des Polymers dient als Erklärung für die beobachtete bessere Orientierbarkeit von PF2/6 im Vergleich zu Polyfluoren mit linearen OktylSeitenketten oder zu PPE. Im zweiten Teil des fünften Kapitels werden Ergebnisse von Untersuchungen der lochlei tenden Orientierungsschichten vorgestellt. Der Einfluss der Zugabe von lochleitenden Materialien zu Polyimid auf mechanische sowie auf elektrische Eigenschaften wurde untersucht. Bei moderater LochleiterKonzentration war die mechanische Stabilität der Filme ausreichend, um nach dem Reiben keine merklichen Unterschiede zu undotierten geriebene Filmen aufzuweisen. Vergleiche entsprechender Filme hinsichtlich Ladungsinjektion und transport zeigten, dass erst durch die Dotierung eine Verwendung von PolyimidOrientierungsschichten in Leuchtdioden ermöglicht wird. Sowohl polymere als auch niedrigmolekulare lochleitende Materialien wur den hinsichtlich der erreichbaren Orientierungsgrade sowie der resultierenden ElektrolumineszenzEigenschaften verglichen, wobei nur letztere in beiden Belangen zugleich zu vorteilhaften Ergebnissen führten. Es wurde gezeigt, dass sich die besten Resultate mit polarisierten Leuchtdioden erzielen ließen, bei denen die emittierende Schicht auf eine DoppelschichtStruktur aufgebracht war, die der Lochinjektion und der Orientierung dienten. Hierbei befand sich oberhalb einer LochinjektionsSchicht aus reinem Lochleitermaterial eine weitere lochleitende Orientie rungsSchicht aus dotiertem Polyimid. Variation der Lochleiterkonzentrationen in Polyimid er gaben, dass die Helligkeit mit zunehmender Konzentration zunahm, wohingegen die erreichten Polarisationsverhältnisse gleichzeitig abnahmen. SEM und AFMUntersuchungen über den Einfluss der Lochleiterkonzentration auf die Schichtmorphologie ergaben, dass diese Beobachtungen durch Phasenseparation und mechanische Beschädigung der Filme zu erklären ist, welche bei Konzentrationen oberhalb 20 Gewichtsprozent eintreten. Im Kapitel 6 wird schließlich die Elektrolumineszenz von Leuchtdioden mit Polyfluoren als emittierende Schicht diskutiert. Zuerst wurde in isotropen Leuchtdioden die günstigste Diodenarchitektur ermittelt sowie die Optimierung der verwendeten Schichten vorgenommen. Die Ergebnisse wurden mit den Kenntnissen kombiniert, die im Rahmen der oben beschriebenen Untersuchungen erworben wurden, um die Herstellung von Leuchtdioden mit hochpolarisierter Emission zu verwirklichen. Blaue Elektrolumineszenz mit einem Emissionsmaximum von 450 nm und einem Polarisationsverhältnis von 21 wurden erzielt, wobei die Leuchtdichte bei einer angelegten Spannung von 18 V etwa 100 cd/m 2 betrug, was der typischen Helligkeit eines Computermonitors entspricht. Alle ElektrolumineszenzEigenschaften ließen sich durch End funktionalisierung des Polyfluorens weiter deutlich verbessern, indem lochleitende TriarylaminDerivate an die Enden der Hauptketten angebracht wurden ('Endcapping'). Der unerwünschte Beitrag zur Emission bei höheren Wellenlängen, welcher im Falle des reinen Polyfluoren beo bachtet wurde und gemeinhin aggregierten Polymermolekülen zugeschrieben wird, wurde durch das Konzept der Endfunktionalisierung wirksam unterdrückt. Außerdem war die Farbstabilität wesentlich verbessert und die Effizienz der Leuchtdioden um mehr als eine Größenordnung höher als bei der Verwendung des reinen Polyfluorens. Diese Beobachtungen wurden mit den elektrochemischen Eigenschaften der Endgruppen erklärt. Letztere wirken als anziehende Fallen für Ladungsträger, was dazu führt, dass die Erzeugung von Exzitonen und die anschließende Rekombination vorwiegend in der Nähe der Kettenenden stattfindet, anstatt wie im Falle des reinen Polyfluorens an weniger effizienten Aggregaten oder Exzimererzeugenden Stellen. Es wurde gezeigt, dass die Endfunktionalisierung weder das Verhalten des Polymers im flüssig-kristallinen Zustand, noch dessen Orientierbarkeit beeinträchtigte. Die Verwendung des modifizierten Polyfluorens erlaubte die Herstellung von polarisierten Leuchtdioden mit einem Polarisationsverhältnis von 22 und einer Leuchtdichte von 200 cd/m 2 bei 19 V, wobei die Schwellspannung auf 7,5 V gesenkt wurde. Dioden mit einem Anisotropiefaktor von 15 er reichten Leuchtdichten von bis zu 800 cd/m 2 . Die Effizienz dieser Leuchtdioden war mit 0,25 cd/A bei ähnlichem Polarisationsverhältnis und Leuchtdichte um mehr als doppelt so hoch wie die bisher berichteten Werte. Die Veränderung der eigentlich blauen Emissionsfarbe durch die Zugabe von Materialien mit niedrigerer Bandlücke in eine Polyfluorenmatrix wird im Kapitel 7 beschrieben. Es wurde gezeigt, dass der Zusatz bereits geringer Konzentrationen eines grün emittierenden Thiophen Farbstoffes das Emissionsspektrum des Polyfluorens entscheidend veränderte und die Realisierung grüner Emission ermöglichte. Genau wie im Falle der nichtemittierenden Lochleiter, die für die Endfunktionalisierung des Polyfluoren verwendet wurden, wirken auch die ThiophenFarbstoffe als effektive Ladungsträgerfallen, was neben der Farbveränderung eine drastische Verbesserung der Leuchtdiodeneffizienzen zur Folge hatte. Darüber hinaus konnte mit Hilfe des dotierten Polyfluorens polarisierte grüne Elektrolumineszenz verwirklicht werden, wobei die Polarisationsverhältnisse Werte von bis zu 30 erreichten, bei einer Leuchtdichte von 600 cd/m 2 und einer Effizienz von 0,3 cd/A. Im Hinblick auf rote Elektrolumineszenz wurden Leuchtdioden mit dendronisierten Pery lenfarbstoffen in der emittierenden Schicht untersucht, zum einen in reiner Form und zum an deren in Mischungen mit Polyfluoren. Hierfür wurden zwei Generationen von Dendrimeren, bestehend aus zentralem PerylendiimidChromophor und PolyphenylenGerüst, mit einer nichtdendronisierten Modellverbindung verglichen. Leuchtdioden mit reinen Filmen der ersten und zweiten Dendrimergeneration emittierten rotes Licht mit CIEKoordinaten (0,627/0,372) und einer Leuchtdichte von bis zu 120 cd/m 2 bei 11 V, wobei die Effizienz allerdings nur 0,03 cd/A betrug. Um die unterschiedlichen Mechanismen zu klären, die zur Emission der Farbstoffmoleküle führen, wurden die Farbstoffe in Polyfluoren beigemischt, und der Einfluss der Dendronisierung auf die Emissionsfarbe und die Intensität der Elektrolumineszenz wurde untersucht. In Photolumineszenz wurde mit zunehmender Dendronisierung eine Abnahme des Förster Energieübertrags vom PolyfluorenWirt zu dem PerylenfarbstoffGast verzeichnet, was zu einen höheren blauen Anteil im Emissionsspektrum führte. Hingegen wurde gezeigt, dass in Elektrolumineszenz die Farbstoffe als Elektronenfallen wirken und die Rekombination der Ladungsträger zu Exzitonen somit vorwiegend auf den Farbstoff anstatt auf den Polyfluorenmolekülen statt findet. Aus diesem Grund war die Betonung der roten Emission in Elektrolumineszenz ungleich stärker als in Photolumineszenz, bei der die rote Emission ausschließlich durch Energieübertrag via Förstertransfer zu Stande kommt. Die Verstärkung einer Farbverschiebung von rot nach blau, die mit zunehmender Dendronisierung und ansteigender Betriebsspannung beo bachtet wurde, konnte qualitativ mit der kinetischen Beeinträchtigung des Elektronenübertrags vom PolyfluorenWirt auf den PerylendiimidChromophor erklärt werden. Der bestmögliche Kompromiss aus roter Farbtiefe und Helligkeit wurde für die Mischung aus Polyfluoren und dem Farbstoff der ersten Dendrimergeneration erzielt. Bei angelegter Spannung von 6,5 V lag die Leuchtdichte bei 100 cd/m 2 und bei 11 V bei 700 cd/m 2 , wobei das Emission bei 600 nm ihr Maximum hatte.
In der vorliegenden Arbeit werden Verfahren der Mathematik und Informatik entwickelt und eingesetzt, um Struktur, Dynamik und biologische Aktivität aus NMR spektroskopischen und empirischen Parametern zu bestimmen. Dolastatin 10 und Epothilon A sind potentielle Wirkstoffe gegen Krebs, da sie durch Wechselwirkung mit Tubulin die Zellteilung unterbinden. Die 3D Struktur beider Wirkstoffe in Lösung und die Struktur von an Tubulin gebundenem Epothilon A wird aus NMR spektroskopischen Parametern bestimmt. Dolastatin 10 liegt in einem konformationellen Gleichgewicht zwischen der cis -- und trans -- Konformation in der ungewöhnlichen Aminosäure DAP vor. Beide Konformationen des flexiblen Pentapeptids können bestimmt werden mit RMSD = 1.423 Å für das cis -- Konformer und RMSD = 1.488 Å für das trans -- Konformer. Während das trans -- Konformer gestreckt vorliegt, faltet das cis -- Konformer am DAP zurück. Epothilone A ist durch einen Makrozyklus weniger flexibel und sowohl die an Tubulin gebundene Struktur (RMSD = 0.537 Å) als auch freie Form (RMSD = 0.497 Å) kann mit geringen RMSD -- Werten bestimmt werden. Die Struktur der freien Form, welche in Lösung hauptsächlich vorliegt, ist mit der Röntgenstruktur weitgehend identisch. In der an Tubulin gebundenen Form wird eine essentielle Umorientierung der Seitenkette beobachtet, die für die Wechselwirkung mit Tubulin entscheidend ist. Dipolare Kopplungen eines Proteins sind geeignet, eine 3D Homologiesuche in der PDB durchzuführen, da die relative Orientierung von Sekundärstrukturelementen und Domänen durch sie beschrieben wird 85 . Die frühe Erkennung 3D homologer Proteinfaltungen eröffnet die Möglichkeit, die Bestimmung von Proteinstrukturen zu beschleunigen. Eine Homolgiesuche unter Nutzung dipolarer Kopplungen ist in der Lage, Proteine oder zumindest Fragmente mit ähnlicher 3D Struktur zu finden, auch wenn die Primärsequenzhomologie gering ist. Darüber hinaus wird eine Transformation für experimentelle dipolare Kopplungen entwickelt, die die indirekte Orientierungsinformation eines Vektors relativ zu einem externen Tensor in den möglichen Bereich für den Projektionswinkel zwischen zwei Vektoren und somit in eine intramolekulare Strukturinformation übersetzt. Diese Einschränkungen können in der Strukturbestimmung von Proteinen mittels Molekulardynamik genutzt werden 92 . Im Gegensatz zu allen existierenden Implementierungen wird die Konvergenz der Rechnung durch die auf diese Weise eingeführten dipolare Kopplungsinformation kaum beeinflusst. Die dipolaren Kopplungen werden trotzdem von den errechneten Strukturen erfüllt. Auch ohne die Nutzung bereits bekannter Protein oder Fragmentstrukturen kann so ein erheblicher Teil der NOE -- Information substituiert werden. Die Dynamik des Vektors, der die beiden wechselwirkenden Dipole verbindet, beeinflusst den Messwert der dipolaren Kopplung. Dadurch wird Information über die Dynamik von Molekülen auf der µsZeitskala zugänglich, die bisher nur schwer untersucht werden konnte. Die Messung dipolarer Kopplungen für einen Vektor in verschiedenen Orientierungen erlaubt die Analyse seiner Bewegung 89 . Im besonderen ist die Ableitung eines modellfreien Ordnungsparameters 2 S möglich. Weiterhin lassen sich ebenso modellfrei eine mittlere Orientierung des Vektors, axialsymmetrische Anteile und nichtaxialsymmetrische Anteile der Dynamik ableiten und auswerten. Die Anwendung der so entwickelten Protokolle auf experimentelle Daten 90 lässt Proteine deutlich dynamischer erscheinen als auf der Zeitskala der Relaxationsexperimente zu erkennen ist. Der mittlere Ordnungsparameter sinkt von 0.8 auf 0.6. Dies entspricht einer Erhöhung des Öffnungswinkels der Bewegung von ca. 22 ° auf ca. 33°. Die Bewegungen weichen teilweise bis zu 40% und im Mittel 15% von der Axialsymmetrie ab. Neuronale Netze erlauben eine schnelle (ca. 5000 chemische Verschiebungen pro Sekunde) und exakte (mittleren Abweichung von 1.6 ppm) Berechnung der 13 C NMR chemischen Verschiebung 115 . Dabei kombinieren sie die Vorteile bisher bekannter Datenbankabschätzungen (hohe Genauigkeit) und Inkrementverfahren (hohe Geschwindigkeit). Das 13 C NMR Spektrum einer organischen Verbindung stellt eine detaillierte Beschreibung seiner Struktur dar. Resultate des Strukturgenerators COCON können durch den Vergleich des experimentellen mit den berechneten 13 C NMR Spektren auf ca. 1 o/oo der vorgeschlagenen Strukturen eingeschränkt werden, die eine geringe Abweichung zum experimentellen Spektrum haben 122 . Die Kombination mit einer Substrukturanalyse erlaubt weiterhin die Erkennung wahrscheinlicher, geschlossener Ringsysteme und gibt einen Überblick über die Struktur des generierten Konstitutionssubraumes. Genetische Algorithmen können die Struktur organischer Moleküle ausgehend von derer Summenformel auf eine Übereinstimmung mit dem experimentellen 13 C NMR Spektrum optimieren. Die Konstitution von Molekülen wird dafür durch einen Vektor der Bindungszustände zwischen allen Atom -- Atom Paaren beschrieben. Selbige Vektoren sind geeignet, in einem genetischen Algorithmus als genetischer Code von Konstitutionen betrachtet zu werden. Diese Methode erlaubt die automatisierte Bestimmung der Konstitution von Molekülen mit 10 bis 20 Nichtwasserstoffatomen 123 . Symmetrische neuronale Netze können fünf bzw. sieben dimensionale, heterogene Parameterrepräsentationen der 20 proteinogenen Aminosäuren unter Erhalt der wesentlichen Information in den dreidimensionalen Raum projizieren 134 . Die niederdimensionalen Projektionen ermöglichen eine Visualisierung der Beziehungen der Aminosäuren untereinander. Die reduzierten Parameterrepräsentationen sind geeignet, als Eingabe für ein neuronales Netz zu dienen, welches die Sekundärstruktur eines Proteins mit einer Genauigkeit von 66 % im Q 3 -- Wert berechnet. Neuronale Netzte sind aufgrund ihrer flexiblen Struktur besonders geeignet, quantitative Beziehungen zwischen Struktur und Aktivität zu beschreiben, da hier hochgradig nichtlineare, komplexe Zusammenhänge vorliegen. Eine numerische Codierung der über 200 in der Literatur beschriebenen Epothilonderivate erlaubt es, Modelle zur Berechnung der Induktion der Tubulin Polymerisation (R = 0.73) und der Inhibierung des Krebszellenwachstums (R = 0.94) zu erstellen 136 . Die trainierten neuronalen Netze können in einer Sensitivitätsanalyse genutzt werden, um die Bindungsstellen des Moleküls zu identifizieren. Aus der Berechnung der Aktivität für alle Moleküle des durch die Parameter definierten Strukturraums ergeben sich Vorschläge für Epothilonderivate, die bis zu 1 000 mal aktiver als die bisher synthetisierten sein könnten.
Molekulare Charakterisierung und immunologischer Nachweis von porcinen endogenen Retroviren (PERV)
(2001)
GProteingekoppelte Rezeptoren (GPCRs) stellen eine der größten in der Natur vorkommenden Proteinfamilien dar (Watson and Arkinstall, 1994). GPCRs sind plasmamembranständige Proteine, die mit heterotrimären GProteinen interagieren und eine Vielzahl an Signaltransduktionswegen aktivieren. Trotz der strukturellen Vielfalt der an GPCRs angreifenden Liganden stimulieren die meisten GPCRs nur eine begrenzte Anzahl strukturell sehr ähnlicher GProteine (Hedin et al., 1993; Conklin and Bourne, 1993). Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die dieser Rezeptor/GProteinKopplungsselektivität zugrunde liegen, ist von fundamentaler Wichtigkeit für das Verständnis zellulärer Signaltransduktion. Ausführliche StrukturFunktionsanalysen verschiedener Neurotransmitter rezeptoren, einschließlich der Muskarinrezeptoren (Wess, 1996) und adrenergen Rezeptoren (Dohlman et al., 1991; Savarese and Fraser, 1992; Strader et al., 1994), haben einen beträchtlichen Beitrag zur Identifizierung der strukturellen Elemente, die für die GProteinKopplungsselektivität dieser Rezeptorgruppe verantwortlich sind, geleistet. Im Gegensatz dazu ist bisher noch weitgehend ungeklärt, welche molekularen Mechanismen der Kopplungsselektivität von GPCRs, die durch Peptidliganden aktiviert werden, zugrunde liegen. Das Ziel dieser Arbeit war daher, molekulare Grundlagen der GProtein Kopplungsselektivität von PeptidGPCRs näher zu untersuchen und aufzuklären. Die Vasopressinrezeptorfamilie unterscheidet sich von nahezu allen anderen PeptidGPCRs darin, daß die einzelnen Rezeptorsubtypen deutlich unterschiedliche GProtein Kopplungspräferenzen aufweisen. Die V1a und V1bVasopressinrezeptoren stimulieren selektiv GProteine der Gq/11 Familie, was zur Aktivierung von PhospholipaseCbeta-Isomeren führt. Im Gegensatz dazu koppelt der V2Vasopressinrezeptor vornehmlich an das GProtein G s , was in einem Anstieg an intrazellulärem cAMP resultiert. Daher stellen die Vasopressinrezeptorsubtypen ein attraktives Modellsystem zum Studium der Peptid GPCRRezeptordomänen, die für die selektive GProteinAktivierung verantwortlich sind, dar. Als Modellsystem für diese Arbeit diente primär der V2Vasopressinrezeptor. Molekulare Faktoren, die die Gs Kopplungsselektivität des V2 Vasopressinrezeptors bestimmen. Eine frühere Studie zeigte, daß die Gegenwart der V1aRezeptorsequenz in der zweiten intrazellulären (i2) Schleife notwendig war, um den Wildtyp V1a und V1a/V2 Rezeptorchimären effizient an Gq/11 Proteine zu koppeln (Liu and Wess, 1996). Effiziente Interaktionen zwischen Wildtyp V2 oder V1a/V2Rezeptorchimären und dem GProtein G s waren hingegen hauptsächlich von V2Rezeptorsequenzen in der dritten intrazellulären (i3) Schleife abhängig. Um die molekularen Grundlagen der Gs Kopplungsselektivität des V2Rezeptors näher zu untersuchen, wurden zunächst klassische Mutagenesetechniken (zielgerichtete Mutagenese'') angewandt. Definierte V2Rezeptorsegmente (oder einzelne Aminosäuren) wurden in den V1aRezeptor transferiert, und die resultierenden HybridVasopressinrezeptoren wurden anschließend in funktionellen Studien auf ihre Fähigkeit, hormonabhängig intrazelluläre cAMP Konzentrationen zu steigern (G s vermittelt), getestet. Diese Strategie schien besonders geeignet, da die Aktivierung des V1aWildtyprezeptors nahezu keine Auswirkungen auf intrazelluläre cAMPSpiegel hat. Wie bereits erwähnt, ist die effiziente Kopplung des V2Rezeptors an das Gs Protein vornehmlich von V2Rezeptorsequenzen in der i3Schleife abhängig (Liu and Wess, 1996). Eine V1aRezeptormutante, deren i3Schleife durch die homologe V2 Rezeptorsequenz ersetzt worden war, war in der Lage, effizient mit Gs zu interagieren. Die Fähigkeit dieser Rezeptormutante, Gs zu aktivieren, war jedoch im Vergleich zum V2Wildtyprezeptor vermindert. Diese Beobachtung ließ die Vermutung zu, daß noch andere intrazelluläre V2Rezeptordomänen zur optimalen Gs Kopplung notwendig sind. Daher wurde zunächst eine Reihe von V1a/V2Rezeptorchimären erzeugt, die den Beitrag der zweiten (i2) und vierten intrazellulären (i4) Rezeptordomäne zur V2 Rezeptor/G s Kopplungsselektivität klären sollten. Funktionelle Untersuchungen der resultierenden HybridRezeptormutanten in Säugetierzellen (COS7) zeigten, daß ein kurzes Segment im Nterminalen Abschnitt der i4Domäne einen deutlichen Beitrag zur V2Rezeptor/G s Kopplungsselektivität leistet. Eine V1aRezeptormutante, welche in der i3Schleife und dem Nterminalen Segment der i4Domäne (Ni4) homologe V2 Rezeptorsequenzen enthielt, zeigte ein funktionelles Profil (EC 50 und E max ), welches mit dem V2Wildtyprezeptor nahezu deckungsgleich war. Anschließend wurden strukturelle Elemente innerhalb der i3Schleife näher untersucht. Funktionelle Analysen zeigten, daß der Nterminale Abschnitt der i3Schleife weitgehend das GProteinKopplungsprofil des V2Rezeptors bestimmt. Eine Reihe von V1aRezeptormutanten wurde erzeugt, in denen kurze Segmente des Nterminalen Bereichs der i3Schleife mit der entsprechenden V2Rezeptorsequenz ausgetauscht wurden. Funktionelle Untersuchungen ergaben, daß ein Aminosäurepaar (Gln225, Val226) und triplet (Phe229, Arg 230, Glu231) am Beginn der i3Schleife des V2 Rezeptors für die effiziente Aktivierung von Gs von entscheidender Bedeutung sind. Durch Punktmutationen in diesem Bereich wurden zwei polare Aminosäuren, Gln225 und Glu231, identifiziert, die für die effiziente V2Rezeptor/G s Interaktion essentiell sind. Untersuchungen mit anderen GPCRKlassen (Dohlman et al., 1991; Savarese and Fraser, 1992; Strader et al., 1994; Wess, 1996) haben ebenfalls gezeigt, daß dem N Terminus der i3Schleife eine besondere Rolle im Rezeptor/GProteinKopplungsprozeß zukommt. In diesen Studien wird berichtet, daß vornehmlich hydrophobe und ungeladene Aminosäuren Schlüsselrollen in der rezeptorvermittelten GProteinAktivierung einnehmen. Die hier beschriebenen Untersuchungen hingegen ergaben, daß zwei polare/geladene Aminosäuren, Gln225 und Glu231, für die V2Rezeptor/G s Kopplung von besonderer Wichtigkeit sind und zeigen daher, daß die Rezeptor/GProtein Kopplungsselektivität nicht auf ausschließlich hydrophoben Wechselwirkungen beruht. Desweiteren konnte beobachtet werden, daß die Länge der i3Schleife die Effizienz, mit der der V2Rezeptor GProteine der Gs Klasse zu aktivieren vermag, beeinflußen kann. Die V1a und V2Rezeptoren weisen unterschiedlich lange i3 Schleifen auf (die i3Schleife des V2Rezeptors ist 13 Aminosäuren kürzer als die des V1aRezeptors). Eine V1aRezeptormutante, deren Nterminaler Abschnitt der i3 Schleife durch homologe V2Rezeptorsequenz ersetzt wurde, konnte deutlich effizienter mit Gs interagieren, wenn der mittlere Abschnitt der i3Schleife um elf Aminosäuren verkürzt wurde. Gleichermaßen konnte die effiziente Kopplung bestimmter V1a/V2Hybridrezeptoren an Gs durch Einfügen von elf Aminosäuren in den zentralen Bereich der i3Schleife deutlich gehemmt werden. Diese Ergebnisse legen nahe, daß der zentrale Bereich der i3Schleife die Rezeptor/GProteinKopplungsselektivität beeinflussen kann, obgleich diese Rezeptordomäne vermutlich nicht direkt mit dem GProtein interagiert. Es ist denkbar, daß die Länge der i3Schleife den Zugang des GProteins zu funktionell wichtigen Rezeptordomänen, z.B. Aminosäuren im Bereich der fünften Transmembrandomäne (TM V) und der i3Schleife, reguliert. Identifizierung einzelner Aminosäuresubstitutionen und Aminosäuredeletionen, die die GProteinKopplungsselektivität des V2Rezeptors beeinflussen: Einsatz von Hefeexpressionstechnologie und zufallsgerichteter Mutagenese (random mutagenesis'') Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Hefe(Saccharomyces cerevisiae) Expressionstechnologien angewandt, um StrukturFunktionsanalysen des V2Rezeptors zu erleichtern und Beschränkungen klassischer Mutagenesetechniken zu überwinden. Der V2Wildtyprezeptor und verschiedene GProteinchimären aus Hefe und SäugetierGalpha Untereinheiten wurden in genetisch modifizierten Hefelinien, deren Zellwachstum von effizienter Rezeptor/GProteinKopplung abhängig war, coexprimiert. In diesem System aktiviert produktive Rezeptor/GProteinKopplung den HefeMAPKinase/Pheromon Signaltransduktionsweg. Dies führt zur Transkription des FUS1HIS3Reportergens und somit zur Expression von His3Protein, was den Histidinauxotrophen (his3) Hefelinien ermöglicht, in histidinfreiem Medium zu wachsen (Pausch et al., 1998). Es konnte gezeigt werden, daß heterolog exprimierte V2Rezeptoren weder mit der HefeGProtein alphaUntereinheit (Gpa1p) noch mit einem mutierten Gpa1Protein, in dem die Cterminalen fünf Aminosäuren gegen homologe Galpha q Sequenz ausgetauscht worden waren (Gq5), effizient interagierten. Im Gegensatz dazu erwies sich die Interaktion zwischen dem V2 Rezeptor und einem mutierten Gpa1Protein, dessen Cterminale fünf Aminosäuren die homologe Galpha s Sequenz enthielten (Gs5), als hocheffizient. Diese Beobachtungen zeigten, daß der V2Rezeptor im Hefesystem sein physiologisches Kopplungsprofil beibehielt. Zur weiteren Validierung des Hefeexpressionssystems wurden die G q/11 gekoppelten M 1 , M 3 und M 5 Muskarinrezeptoren und verschiedene mutierte Vasopressin und M 3 Muskarinrezeptoren mit veränderten funktionellen Eigenschaften heterolog in Hefe exprimiert. Funktionelle Analysen zeigten, daß die Wildtyprezeptoren und die verschiedenen Rezeptormutanten in Hefe und Säugetierzellen ähnliche Phänotypen aufwiesen. Um zu untersuchen, weshalb der V2Rezeptor nicht effizient an GProteine der Gq/11 Familie koppelt, sollte der in Hefe exprimierte V2Rezeptor zufallsgerichteter Mutagenese (random mutagenesis'') unterzogen und Mutanten mit veränderten G ProteinKopplungeigenschaften isoliert werden. Im speziellen wurde die i2Schleife untersucht, da eine frühere Studie gezeigt hatte, daß vornehmlich die i2Schleife des V1a Rezeptors für die V1aRezeptor/G q/11 Kopplungsselektivität verantwortlich ist (Liu and Wess, 1996). Mittels zufallsgerichteter Mutagenesetechnik wurde in Hefe eine Bibliothek von V2Rezeptormutanten erzeugt, deren i2Schleife Mutationen mit einer Mutageneserate von ungefähr 10% (auf der Nukleotidebene) enthielt. Anschließend wurden in einem Selektionsverfahren (screen'') 30 000 V2Rezeptormutanten auf ihre Fähigkeit, mit Gq5 zu interagieren, überprüft. Es konnten vier V2Rezeptormutanten isoliert werden, welche effizient an Gq5 (jedoch nicht an HefeGpa1p) koppelten. Funktionelle Untersuchungen mit diesen und anderen mittels zielgerichteter Mutagenese erzeugter V2Rezeptormutanten zeigten, daß die Substitution einer einzigen Aminosäure (Met145) im zentralen Bereich der i2Schleife beträchtliche Auswirkungen auf die Rezeptor/GProteinKopplungsselektivität hatte. Die Fähigkeit des V2Rezeptors, produktiv mit Gq5 zu interagieren, war von der Anwesenheit relativ großer, hydrophober Aminosäuren wie Leucin und Tryptophan abhängig. Austausch von Met145 mit kleinen Aminosäuren wie Glycin oder Alanin erlaubte dem V2Rezeptor nicht, Gq5 zu aktivieren. Interessanterweise interagierten alle V2Rezeptormutanten, die eine Met145 Punktmutation aufwiesen, mit Gs5 ähnlich effizient wie der V2Wildtyprezeptor. Die Unfähigkeit der V2(Met145Gly) und V2(Met145Ala)Rezeptoren, Gq5 zu aktivieren, beruht daher nicht auf einem Faltungsdefizit. Gleichermaßen basierte die Fähigkeit der V2(Met145Trp) und V2(Met145Leu)Rezeptoren, produktiv an Gq5 zu koppeln, nicht auf der Überexpression von Rezeptorprotein. Diese Ergebnisse zeigen, daß die chemische Eigenschaft der Aminosäure an Position 145 die V2Rezeptor/GProtein Kopplungsselektivität reguliert. Interessanterweise befindet sich in allen anderen Subtypen der Vasopressin/OxytocinRezeptorfamilie (V1a, V1b, und Oxytocin Rezeptoren), welche selektiv an GProteine der G q/11 Klasse gekoppelt sind, ein Leucin an der Stelle, die zu Met145 (V2Rezeptorsequenz) homolog ist. Eine der vier ursprünglich isolierten V2Rezeptormutanten enthielt neben verschiedenen Punktmutationen eine Deletion in Position Met145. In detaillierteren zielgerichteten MutageneseStudien wurden zwei V2Rezeptormutanten erzeugt, die alle drei GProteine (Gq5, Gs5 und Gpa1p) aktivieren konnten. Um zu untersuchen, ob ein generelles Verkürzen der i2Schleife um eine Aminosäure der Grund für die beobachtete Rezeptor/GProteinPromiskuität ist, wurden verschiedene V2Rezeptormutanten erzeugt, in denen einzelne Aminosäuren unmittelbar N und Cterminal von Met145 deletiert worden waren. Funktionelle Untersuchungen ergaben, daß die Deletion einzelner Aminosäuren Nterminal von Met145 (Ile141delta, Cys142delta, Arg143delta oder Pro144delta) in V2Rezeptormutanten resultierte, die nicht mit GProteinen interagieren konnten. RadioligandBindungsstudien zeigten, daß diese V2Rezeptormutanten keine V2Liganden binden konnten, was darauf schließen läßt, daß Deletionen einzelner Aminosäuren Nterminal von Met145 zu mißgefalteten Rezeptoren führen. Die Aminosäuren Ile141Pro144 befinden sich am Beginn der i2Schleife, unmittelbar neben der alphahelikalen zytoplasmatischen Verlängerung der dritten Transmembrandomäne (TM III) in der Nähe des hochkonservierten DRY(H)Motivs. Es ist denkbar, daß Aminosäuren innerhalb des Ile141Pro144Segments mit den zytoplasmatischen Abschnitten von TM III und/oder TM V interagieren und diese Wechselwirkungen die Rezeptorstruktur stabilisieren. Im Gegensatz dazu hatten Deletionen unmittelbar C terminal von Met145 (Leu146delta, Ala147delta, Tyr148delta oder Arg149delta) keinerlei Auswirkungen auf die Funktion des V2Rezeptors. Diese Aminosäuren befinden sich im zentralen Bereich der i2Schleife, der nicht mit den transmembranären Domänen des Rezeptorproteins interagieren kann.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Apolipoproteine des Liquors untersucht, um bestehende Zusammenhänge nachzuweisen, die eventuell später bei der Diagnose von Erkrankungen eingesetzt werden könnten. Das ApoE aller Proben wurde phänotypisiert. Die Konzentrationen des ApoJ und Apo(a) wurden mit Hilfe selbst- bzw. in der Arbeitsgruppe entwickelter ELISAs bestimmt. Durch Kombination der existierenden ELISAs konnte der von Borghini et al. 1995 beschriebene LpE-Partikel und ein bisher nicht bekannter Apolipoprotein-Partikel aus Apo(a) und ApoE nachgewiesen werden. Die relative Konzentration dieses Apo(a)/E- und des ApoJ/E-Partikels wurde bestimmt. Mit Hilfe der Kreuzimmunelektrophorese konnte nachgewiesen werden, daß die Apolipoproteine Bestandteil eines Partikels sind. Aufgrund der gefundenen Informationen wurde die These postuliert, daß es sich bei diesen Partikeln um einen gemeinsamen Partikel aus ApoE, ApoJ und Apo(a) handelt. Detaillierte Daten über den Aufbau und die Zusammensetzung des Partikels konnten bisher nicht gewonnen werden. Im Liquor wurden die Konzentrationen von ApoE, Apo(a) und ApoJ gemessen. Diese Konzentrationen wurden in Zusammenhang zu dem ApoE-Phänotyp der entsprechenden Probe gesetzt. Wo möglich wurde ApoE und Apo(a) auch im Serum der entsprechenden Patienten bestimmt. Auch diese Konzentrationen wurden in Beziehung zu ihrem ApoE-Phänotyp gesetzt. Zuletzt wurden für die Apolipoproteine E und (a) die Liquor- und Serumkonzentration in Beziehung zueinander gesetzt. Außer für das ApoE und den ApoJ/E-Partikel konnte für keines der untersuchten Apolipoproteine weder im Liquor noch im Serum ein offensichtlicher Zusammenhang zwischen der Konzentration des Apolipoproteins und dem ApoE-Phänotyp gefunden werden. Zusätzlich zu den Apolipoproteinen des Liquors wurde in Zusammenarbeit mit der Universität Dresden das Tau-Protein gemessen. Die Ergebnisse bestätigen die diagnostische Wertigkeit der Bestimmung von Protein Tau bei degenerativen Erkrankungen des ZNS. Eine Differenzierung zwischen verschiedenen degenerativen Erkrankungen des ZNS ist jedoch nicht möglich. Ein weiterer Teil dieser Arbeit untersuchte die Rolle des ApoE im Gehirn. Dabei zeigte sich, daß die Synthese des ApoE durch die Astrozyten ein sehr komplexer Vorgang sein muß. Eine weitere Untersuchung des ApoE wies die stärkere Glykolisierung im Liquor im Vergleich zum Serum nach.
Die immer länger werdende Verweildauer der türkischen Migranten und die bis vor einigen Jahren ständig ansteigende Anzahl nachgeholter älterer Kinder deuteten schon seit Mitte der achtziger Jahre darauf hin, daß die aufgrund des Anwerbevertrages nach Deutschland eingereisten türkischen Arbeitskräfte nicht mehr zurückkehren werden. Die Hessische Schule reagiert darauf, indem sie die Ziele des MU veränderte und als ein wesentliches Ziel neben der Sprachen und Wissensvermittlung über die Kultur des Herkunftslandes auch das Verstehen der eigenen Situation im Einwanderungsland, die Erschließung des eigenen Umfeldes und die Fähigkeit, darin zu handeln, angibt. (s.a. Kap.IV, 2.) Einer so bedeutsamen Aufgabe gerecht zu werden, ist nur dann möglich, wenn sowohl der Muttersprache der Kinder, als auch dem Lernbereich überhaupt, von Seiten der Administration, den Institutionen und der darin Handelnden, also Schülern und Lehrern, Bedeutung und Wert beigemessen werden und sie Teil der Hessischen Schule sind. Kinder ausländischer Eltern wachsen in der Regel zweisprachig auf. Zweisprachig zu sein, ist ein Faktum, das für das Individuum einen hohen Wert darstellt. In Deutschland wird Zweisprachigkeit nicht immer als etwas Positives gesehen. (Selbst dann nicht, wenn es um eine im eigenen Land gesprochene Sprache geht, wie z.B. das Ostfriesische. Obwohl das Ostfriesische in Ostfriesland die dominierende Sprache ist, sprechen die Eltern mit den Kindern, die in die Schule kommen sollen, zunächst Hochdeutsch, um ihnen den Schulanfang zu erleichtern.) Das Ansehen einer Sprache ist weitgehend davon abhängig, welches 'Prestige' die Sprache hat, aber auch welches soziales Prestige ihre Sprecher haben. Türkisch steht in der Sprachenhierarchie nicht besonders hoch, es gilt als Gastarbeitersprache, ebenso wie das Wort 'Türke' noch immer den typischen 'Gastarbeiter' assoziiert. Dabei wird nicht zur Kenntnis genommen, daß die Zahl derjenigen, die dem Mittelstand zuzurechnen und zu Arbeitgebern auch für Deutsche oder andere Nationen geworden sind, ständig im Steigen begriffen ist. (s.a.Kap.VII, 5.3) Alle Muttersprachlehrer in Hessen sind seit 1970 aus dem Zuwandererpotential eingestellt worden, seit 1972 gibt es keine 'Regierungslehrer' mehr. Der Muttersprachliche Unterricht gewinnt an Wert, wenn seine Bedeutung nicht in Frage gestellt und seine Erteilung als 'normal' angesehen wird. Es war daher wichtig zu erfahren, welchen Wert ihm die Interviewten beimessen. Bei allen Interviewten hat der Muttersprachenunterricht Türkisch einen hohen Stellenwert. Die Anzahl der Schüler, die ihn in Hessen besuchen, übersteigt 70% und liegt damit höher, als in jedem anderen deutschen Bundesland und auch EUStaat. Diese hohe Teilnehmerzahl würde nicht erreicht werden, wenn die Türkei den Unterricht in eigener Verantwortung durchführen müßte, wie es zeitweise im HKM überlegt wird. Die Türkei ist an einer stark nationalbewußten Ethnie in Deutschland interessiert, da diese leichter zu kontrollieren und zu reglementieren ist, und auch weiterhin mit einem Geldtransfer zu rechnen ist. Die türkische Ethnie, so wie der Erziehungsattaché (s.a. Kap.VII, 1.1) sie sich vorstellt, würde Sitten und Bräuche bewahren und durch die soziale Kontrolle würde weniger Zündstoff für die Türkei entstehen. Viele Ereignisse, die die Türkei beunruhigen, haben ihren Ursprung in oder erhalten Unterstützung aus Deutschland. (z.B. das Selbstbewußtsein, das die Kurden und andere Minderheiten entwickelt haben, das Sichbekennen der Aleviten und anderer religiöser Gruppen und das Wiedererwachen unterschiedlicher muslimischer Glaubensrichtungen.) In einer Zeit der Globalisierung und des immer lauter werdenden Rufens nach einem frühen Angebot von Fremdsprachenunterricht, möglichst schon in der Grundschule, ist die Zweisprachigkeit der Kinder ausländischer Eltern neben dem Einfluß, den die Herkunftssprache bei der Identitätsfindung hat, auch eine ökonomische Ressource, die nicht ungenutzt bleiben sollte. Zweisprachigkeit darf allerdings nicht zu einer 'doppelten Halbsprachigkeit' führen, daher müssen die zu erreichenden Ziele in den einzelnen Jahrgängen, klar zu erkennen, die Lehrer kompetent sein, und der Unterricht nicht zur 'Kuschelecke' der Schüler werden. Da der Muttersprachliche Unterricht eine so wichtige Aufgabe hat, muß man sich der Ziele bewußt sein, die vorgegeben werden müssen bei Schülern, die vermehrt deutsche Staatsbürger sein werden. Es kann dann nicht mehr so unterrichtet werden, als sei die Türkei die 'Heimat'. Sie kann nur noch Herkunftsland sein, während das Aufnahmeland zur Heimat werden muß, wenn es das noch nicht ist. Dabei sollen die Bindungen zu dem Teil der Familie, der in der Türkei geblieben ist, erhalten bleiben. Schon jetzt haben die meisten Grundschulkinder ihre Großeltern nicht mehr in der Türkei, sondern in Deutschland. Für die zukünftigen Generationen wird die Türkei zwar immer noch das Land ihrer Herkunft, ein Traumland oder Ferienland sein, aber kaum mehr. Türkische Eltern halten den Besuch des MU für erforderlich, da sie befürchten, daß mit dem Verlorengehen der Sprache auch der Familienzusammenhalt leiden würde, daß Sitten und Gebräuche, auf die sie großen Wert legen, verloren gehen könnten. Sie befürchten, daß durch den Besuch der Schule die Kinder einem gewissen Akkulturationsdruck ausgesetzt sind und daher mehr oder weniger Kulturmuster der Mehrheitsgesellschaft übernehmen. Aus diesem Grunde setzten sich vor allem türkische Mütter für die Einrichtung des Türkischunterrichts auch an Schulen ein, an denen es noch keinen Unterricht gab. (Heute würde es die Aufgabe des Türkischen Elternvereins sein, der sich seit ungefähr vier Jahren gebildet hat.) Diese Sorge führt aber auch dazu, daß türkische Eltern, der zweiten Generation ihre Kinder noch so sozialisieren, wie auch sie selbst sozialisiert worden sind. (s.a. Kap. IV) Sie machen aber insoweit Zugeständnisse, als sie es dulden, daß die Kinder untereinander Deutsch sprechen. Die gleichen Argumente, wie sie von den Eltern für ein Festhalten am MU genannt werden, gelten auch für die Lehrer. Zum einen sind sie selber Eltern und haben damit die gleichen Ängste wie diese, zum anderen ist es ihr Beruf, die Sprache zu lehren und ihrer Meinung nach, die nationale türkische Kultur und damit die entsprechenden Sitten und Bräuche zu vermitteln. Ihre Interessensphäre ist die Erhaltung des Istzustands. Obwohl sie sich bewußt sind, daß nur wenige Schüler in die Türkei zurückkehren werden, vermitteln sie Inhalte in der Regel so, wie sie es gelernt haben und es für die Türkei vielleicht heute noch stimmig ist, jedoch hier nicht ungeprüft weiter gegeben werden sollte. Kultur und Bräuche sind nicht statisch, sondern wandeln sich und passen sich den Gegebenheiten an. "Die Kultur von Migranten unterscheidet sich also von der Kultur des Herkunftslandes, Migranten vollziehen eine kulturelle Transformation, die insgesamt auf die Flexibilität und Veränderbarkeit kultureller Ori entierung hinweist." (Sting,1995: 127) Nur ein einziger Lehrer stellt die Überlegung an, ob es nicht wichtiger sei, sich ab der siebenten Klasse, auf die Sprache Deutsch zu konzentrieren. Wenn Türkisch unbedingt weiter gelernt werden soll, dann im Fremdsprachenunterricht. Während der Erhalt von Sprache, Sitten und Bräuchen immer wieder angesprochen wird, wird die Religion, die bei in der Fremde wohnenden Ethnien meist einen hohen Stellenwert erhält, nur am Rande erwähnt. Nur wenige Lehrer setzen sich für einen Religionsunterricht in der Muttersprache ein, die meisten sind der Meinung, daß man diesen Unterricht auf Deutsch erteilen sollte. Das kann darauf hindeuten, daß man den Unannehmlichkeiten aus dem Wege gehen will, die man beim Erteilen Religionsunterricht in den Vorbereitungsklassen hatte. Denn obwohl der Koran die Grundlage des Glaubens aller Muslime ist, haben doch die verschiedenen sunnitischen Moscheenvereine ihre eigene Ausprägung. Für Aleviten käme ein sunnitischer Religionsunterricht sowieso nicht in Frage. Die Ablehnung des Erteilens könnte aber auch in der laizistischkemalistischen Lehrerausbildung begründet sein, deren Auftrag es ist, die Nation als verbindendes Element darzustellen und nicht den Glauben wie im Osmanischen Reich. (S.a. Schiffbauer, 2000, 47ff) Die Studentin Nurgül stellte erstaunt fest, daß im Muttersprachlichen Unterricht Religionsbücher ausgeteilt wurden. Die hohe Wertschätzung und die Unverzichtbarkeit, die auch auf deutscher Seite der Muttersprache Türkisch zugestanden wird, hat nicht dazu geführt, den MU wie ein 'normales' Fach zu behandeln. Den Schulleitern ist es bisher nur selten gelungen, den Unterricht so in die Stundentafel zu integrieren, daß er nicht als Anhängsel oder gar als eigenständige Schule empfunden wird. Schulleiter und Kollegien haben es auch nicht erreicht, dem türkischen Lehrer das Gefühl von Zweitrangigkeit zu nehmen. Am besten ist die Einbindung der Lehrer noch in den Grundschulen gelungen, wenn versucht wird, den Unterricht der ersten beiden Schuljahre in den Vormittag zu legen. Aber schon im dritten und vierten Jahrgang wandert er in der Regel wieder in den Nachmittag. Es gibt auch immer noch Schulen, in denen nicht einmal die Raumfrage so gelöst worden ist, daß türkische Lehrer sich nicht diskriminiert fühlen müssen. (s.a. Kap. VIII, 5.4) Wiederum ist es die Grundschule, deren Schulleiter die meisten Kenntnisse über die Inhalte haben, die im MU vermittelt werden, z. T. weil an einigen Schulen das Projekt KOALA durchgeführt wird, z.T. durch die Beschwerden von Eltern über die vermittel ten Inhalte. Selbst da, wo deutsche Lehrer zu den am Vormittag unterrichtenden türkischen Kollegen ein freundschaftliches Verhalten entwickelt haben, kennen eher die türkischen Lehrer die im Regelunterricht durchgenommen Inhalte, als umgekehrt. Dabei wäre für beide Lehrergruppen die Informationsbeschaffung mit wenig Mühe verbunden, da es für jedes Fach Rahmenpläne gibt und jeder Lehrer, auch der türkische, daraus den Stoffverteilungsplan in deutscher Sprache für das laufende Schuljahr erstellen muß. Beide Lehrergruppen würden die Effizienz des Unterrichts steigern können und mehr von einander erfahren, was zum Abbau von Vorurteilen und zur besseren Einsicht in die Vorhaben des anderen führen würde und vielleicht zu gemeinsamen Projekten. Aufgrund der Rahmen und Stoffverteilungspläne müßten aber eigentlich auch die Schulleiter wissen, was im MU gelehrt wird, denn sie erhalten diese Pläne. Man braucht also nicht erst bei Prüfungen zu erfahren, daß die Inhalte sehr national sind und somit nicht unserem Verständnis von Unterricht entsprechen. Die meisten Schulen werden zwar von einer Vielzahl ausländischer Nationalitäten besucht, in der Grundschule im Ostend sind es über hundert, nicht alle erhalten aber Muttersprachlichen Unterricht. Nach dem Zerfall von Jugoslawien dürften es inzwischen fünfzehn verschiedene Nationen sein, die Muttersprachlichen Unterricht als Fach erhalten. (Den anderen Ethnien werden nur die Räume zur Verfügung gestellt, für den Unterricht hat die eigene 'community' zu sorgen.) Das heißt, die Klassenlehrerin müßte zu so vielen Muttersprachlehrern Kontakt aufnehmen, wie sie Kinder aus den Anwerbeländern in ihrer Klasse hat. Daher kennt zwar jeder Klassenlehrer die Fachlehrer, die Lehrer des Muttersprachenunterrichts sind an Schulen, die keine Stammschulen sind, aber nur wenig bekannt. Ich habe mit Lehrern des Regelunterrichts gesprochen, die nicht wußten, ob es an ihrer Schule überhaupt Muttersprachenunterricht gibt. Man sieht die Lehrer höchstens bei den Notenkonferenzen, die zweimal im Jahr stattfinden. Dabei sind die Noten des MU versetzungsrelevant, d.h. sie tragen zur Versetzung des Schülers bei. Muttersprachlehrer hingegen unterrichten wiederum mehrere Klassen an verschiedenen Schulen und kennen daher auch nicht alle Klassenlehrer. Die Interviews mit den vierundzwanzig Schülern und Studenten zum Muttersprachlichen Unterricht ergibt, daß die meisten Schüler den Unterricht wie ein Fach unter anderen empfinden, ein bißchen unbequemer, weil er am Nachmittag stattfindet und in einer anderen Schule, aber oft mit dem Vorteil, keine Aufgaben machen zu müssen. Nur die Realschulgruppe empfindet die Atmosphäre des MU anders und angenehmer als diejenige im Regelunterricht. Sie rechnet dies nicht nur der Tatsache zu, daß der MU nur von Schülern gleicher Nationalität und Mentalität besucht wird, sondern findet, daß auch die Gruppengröße dabei eine Rolle spielt. Die interviewten Schüler sind sich dessen bewußt, daß sie, allein aufgrund der anders verlaufenden Familiensozialisation, einen beträchtlichen Anteil mehr an Leistungen erbringen müssen als die anderen Schüler, um den Anforderungen der Schule gerecht zu werden. Es ist ihnen aber auch bewußt, daß sie der sozialen Kontrolle, gleich ob sie von der Familie, den Verwandten oder der eigenen Ethnie ausgeübt wird, am besten durch eine gute Bildung begegnen können. Eine gute Bildung und Ausbildung macht sie in ihrem Verhalten freier und sicherer und die Kontrollorgane toleranter. Sie können leichter selbst bestimmen, was sie tun und wie sie handeln wollen. Eine entscheidende Rolle spielt im Leben eines jeden Kindes der Schulanfang, der daher auch ein Schwerpunkt meiner Befragung war. In jeder Gesellschaft besteht das Leben eines Individuums aus verschiedenen zeitlichen Abschnitten, die durchlaufen werden. Die Übergänge von einem Lebensabschnitt zum anderen werden von besonderen Riten begleitet. Sie kennzeichnen das Verlassen der einen Gruppe, eine Zeit der Diffusion und die Aufnahme in die neue Gruppe. So werden aus den Kindergartenkindern nach dem fünften Lebensjahr die Vorschulkinder, denen besondere Rechte eingeräumt werden. In dieser Zeit dürfen sie schon einmal allein und ohne Aufsicht in einem Raum spielen und besuchen besondere Kurse, an denen die jüngeren Kinder nicht teilnehmen dürfen. Aus den Vorschulkindern werden die Schulkinder, die mit einer Schultüte begrüßt, langsam an das Leben in der Schulgruppe gewöhnt werden. (s.a. v. Gennep,1986) Schulanfänger müssen die eigenen Vorstellungen mit den Ansprüchen, Erwartungen und Forderungen des Lehrers und der gleichaltrigen Gruppe in Einklang bringen. (Petillon, 1984: 3) Die Erfahrung der Außenbestimmung durch eine neue Zeiteinteilung, neue Anforderungen an Konzentration und Feinmotorik ist zwar für alle neu, für Kinder aber, die aus Familien mit anderen Sozialisationsvorstellungen und ohne Kindergartenerfahrung in die Schule kommen, besonders bedeutend. Ich nahm daher an, daß in dieser Phase der Muttersprachliche Unterricht bei der Integration besonders hilfreich sein würde, was nur von ganz wenigen Schülern bejaht wurde.. Obwohl die Gymnasialschüler berichten, daß die türkische Familie nicht auf die Schule vorbereiten würde, sprechen nur zwei Schüler davon, daß sie den MU in dieser Zeit als hilfreich empfunden hätten. Fatime erinnert sich daran, ihn als beschützend und warm, Mohammed als integrierend und anerkennend empfunden zu haben. Die anderen können sich an nichts Besonderes erinnern. Die meisten haben den MU von Anfang an besucht und halten ihn eher für diejenigen türkischen Kinder wichtig, die erst kurz vor Schulbeginn nach Deutschland kommen. Kinder, die in der Türkei mit der Schule begonnen haben und hier die Klasse wiederholen mußten, weil sie kein Deutsch konnten, empfanden diese Maßnahme als diskriminierend. Diejenigen, die hier aufgewachsen sind, halten den Besuch eines Kindergartens für sich persönlich, aber auch für die anderen türkischen Kinder für wesentlich und bringen ihren Schulerfolg damit in Zusammenhang. Dabei erwähnen sie auch die Vorklasse, die bei fehlendem Besuch des Kindergartens, wegen der späten Einreise, besucht werden sollte. (Leider halten türkische Eltern oft nicht viel vom Kindergarten und noch weniger von der Vorklasse. (s.a. Kap. II, 2.5) und wehren sich dagegen. Eine wichtige Funktion haben die im MU vermittelten Inhalte. Vielen Probanden sind neben Liedern und Spielen die gemeinsamen Feiern in Erinnerung geblieben. Es werden vor allem die nationalen türkischen Feste begangen, obwohl im Rahmenplan für die Grundschule nur die religiösen Feiertage: das Opferfest (Kurban Bayrami) und das Zuckerfest (Seker oder Ramazan Bayrami) und als nationaler Feiertag der 23. April, das Kinderfest, vorgesehen sind. Bei den nationalen Feiern haben sich die Eltern sehr engagiert, sowohl die Eltern als auch Schüler erwähnen dies in ihren Interviews. Man schmückte die Klasse und richtete eine AtatürkEcke ein mit Bildern, Sprüchen und Fähnchen. Eine türkische Lehrerin bedauert, daß jetzt an den Feiertagen für die Kinder schulfrei ist und man nicht mehr zusammen feiern kann. Weil die Eltern arbeiten, verlieren die Tage für die Kinder viel von ihrer Bedeutung. An die folgenden nationalen Feiertage erinnern sich alle: An den 23. April, die Eröffnung der Nationalversammlung, diesen Tag hat Atatürk den Kindern zugedacht, den 19. Mai, den Beginn des Widerstands gegen Engländer, Franzosen, Italiener und Griechen und den 29. Oktober, den Tag, an dem die Republik ausgerufen wurde. Analysiert man den Inhalt der Interviews, so stößt man immer wieder auf folgende Aussagen: Wir haben die Geschichte der Republik Türkei kennengelernt (milli tarih) mit den Befreiungskämpfen, den nationalen Feiertagen, die daraus resultieren, die Reformen Atatürks, seine Aussprüche, die Nationalhymne, den Schülereid (s. Fußnote 26) und zwar von der ersten Klasse an. Selbst die Achtung, die dem Lehrer gezollt wird, wird durch die nationale türkische Erziehung verstärkt, denn die Lehrer stehen anstelle von Atatürk, dem Oberlehrer der Nation. Die interviewten, aber auch andere türkische Lehrer, mit denen ich gesprochen habe, unterrichten diese Inhalte ohne zu überlegen, daß sie Schüler unterrichten, deren Eltern zum Teil schon nicht mehr in der Türkei geboren sind und die wahrscheinlich nicht mehr in der Türkei leben werden. Die Lehrer nehmen es den Schulleitern übel, wenn diese sie darauf hinweisen, daß keine Fahne und kein Atatürkbild aufgehängt werden soll, weil dies nicht gewollt und Ähnliches in der Regelklasse auch nicht praktiziert wird. Der Politologiestudent weiß, daß die Deutschen die Verehrung von Atatürk als Personenkult abtun, er versteht es jedoch als etwas anderes und ist stolz auf die türkische Geschichte, die auch ein Teil seiner Geschichte ist und mit der er sich identifiziert, obwohl er, von den Ferien abgesehen, sein Leben in Deutschland verbracht hat. Ähnlich drücken es auch die Realschüler aus, die ebenso stolz auf ihre nationale Geschichte und das türkische Militär sind. Der Student meint zudem, daß deutsche und türkische Lehrer voneinander lernen können. Vor allem sollen die deutschen Lehrer die Achtung der Schüler einfordern, die auch den türkischen Lehrern entgegengebracht wird. Sie hätten ebenso ein Recht darauf, denn sie geben ihr Wissen den Schülern und dafür schulden ihnen die Schüler 'Achtung'. Die Achtung, die die Schüler ihren türkischen Lehrern entgegenbringen, indem sie sich diszipliniert verhalten, fällt der Lehrerin der Integrierten Gesamtschule wie auch dem Realschulrektor auf, der von einem sehr ordentlichen Unterricht spricht und damit auch einen störungsfreien meint. Wie unterschiedlich auch der Unterricht von den einzelnen Schülern empfunden wurde, alle sagen, daß sie ohne ihn nicht ein so gutes Türkisch sprechen und schreiben würden. Das Türkisch, das zu Hause gesprochen wird, beschränkt sich im wesentlichen auf die Alltagssprache und ist dazu oft ein Dialekt. Der Politologiestudent bedauert, daß es ihm trotz MU nicht möglich ist, die Zeitung ohne Wörterbuch zu lesen, und daß er nicht in die neuere Literatur eingeführt worden ist. In der Sekundarstufe I wird kaum zeitgenössische Literatur vermittelt, weil sie nicht mehr unkritisch ist und daher in die türkischen Schulbücher der Oberstufe nur selten Eingang gefunden hat. Bis in den achtziger Jahren sagt Sprache auch etwas über die politische Richtung aus, der man angehört. Wer von den Lehrern als links und progressiv gelten will benutzt vorwiegend den vom 'Türk Dil Kurumu' erarbeiteten Wortschatz, während die Konservativen sich auch der osmanischen Wörter bedienen. So gibt es oft lang anhaltende Streitigkeiten, welches Wort in die Unterrichtsmaterialien Eingang finden soll. Die politischen Richtungskämpfe, die sich in der Türkei abspielten, reichten also bis in den Muttersprachlichen Unterricht in Hessen. Heute gebrauchen die meisten Türken und damit auch die türkischen Lehrer die Sprache viel unbekümmerter und lassen sowohl das eine als auch das andere Wort gelten. Da vor allem die Zeitungen wieder osmanische Wörter verwenden, werden die Angehörigen der jüngeren Schülergeneration sie auch wieder lernen. Den älteren Schülergenerationen aber sind sie nicht so geläufig. Auffallend ist, daß die Schüler nur ganz selten den Ausdruck Muttersprachlicher Unterricht benutzen und eher vom Fach Türkisch spreche, die Gymnasialschüler sogar von der 'Fremdsprache' Türkisch, für die sie genauso hart arbeiten müssen, wie für jede andere Fremdsprache. In den Augen der Schüler hat der Muttersprachliche Unterricht Türkisch den gleichen Stellenwert wie jede andere Fremdsprache. Die IGS Lehrerin spricht davon, daß der MU an Wert gewonnen habe, seitdem der Modellversuch 'Türkisch anstelle der zweiten Fremdsprache' an ihrer Schule eingerichtet wurde. Die Frage, ob im MU auch die Situation der türkischen Eltern und ihrer Kinder in Deutschland angesprochen worden ist, wird nur von einer einzigen Schülerin bejaht. Sie sagt, daß ihr MULehrer auch Vergleiche zwischen der Türkei und Deutschland gezogen habe. Türkische Lehrer meinen, daß es schwierig sei, die hiesigen türkischen Kinder zu unterrichten, weil sie aus den unterschiedlichsten Gegenden der Türkei stammen und damit auch unterschiedliche Sitten und Gebräuche mitbrächten. Sie sprechen aber nicht davon, daß sie im Unterricht auch die hiesigen Sitten und Gebräuche thematisiert haben. Eine Ausnahme bildet dabei der Nikolauskult. Der Hlg. Nikolaus, der im vierten Jahrhundert Bischof von Myra, dem heutigen Demre (Türkei) war, schlägt eine Brücke zwischen der Türkei und dem Christentum und nimmt so heute eine Art Alibifunktion im MU für die deutschen Feste wahr. Dabei gäbe es keine Schwierigkeiten, türkischen Schülern auch andere deutsche Feste vom Koran her zu erklären. Den Berichten der interviewten Lehrer und Schüler zufolge kann darauf geschlossen werden, daß die eingangs zitierte Aufgabenstellung des MU, die Erschließung des Umfeldes, in dem die Schüler leben, das Verstehen der eigenen Situation und die Fähigkeit darin zu handeln, nur ansatzweise oder wenig beachtet wird. Ein weiterer Punkt, der über die Integration Auskunft geben kann, ist die Frage nach Freunden und Freundinnen der Probanden. Nur eine einzige Probandin hat noch und alleinigen Kontakt zu den Mitschülerinnen des MU. Eine andere steht in lockerem Kontakt zu einer ebenfalls studierenden Mitschülerin aus dem MU, wobei die Tatsache, daß beide das Abitur gemacht haben und sie zusammen zum Gymnasium fuhren, eine wesentliche Rolle spielen dürfte. Alle anderen haben keine Verbindung mehr zu ihren früheren Schulkameraden des Muttersprachlichen Unterrichts. Selbst die beiden Brüder, die den MU noch besuchen, haben außerhalb des Unterrichts keinen Kontakt diesen Mitschülern. Aus dem Rahmen fallen nur die Realschüler, sie haben wesentlich mehr Kontakt untereinander, zu ihren türkischen Mitschülern und anderen türkischen Jugendlichen als die anderen Interviewten. Zwei Mädchen haben fast nur türkische Freundinnen, eines bewußt, da sie sich von ihnen am besten verstanden glaubt, während das andere meint, daß es sich 'so' ergibt. Zwei andere dagegen sprechen von 'besten' Freundinnen, die keine Türkinnen sind und die sie schon vom Kindergarten und von der Schule her kennen. Die Interviews haben gezeigt, daß eine Integration der Probanden in die Hessische Schule, zwar unterschiedlich, aber im allgemeinen erfolgt ist. Dies ist allerdings nicht ein besonderes Verdienst des Muttersprachlichen Unterrichts. Am sichtbarsten wird die Integration bei den Gymnasialschülern und Studenten. Der Grad von Integration läßt sich auch aus den Kurzfragebögen erkennen. Von den sechzehn Schülern beider Gruppen bezeichnen sich vierzehn als Türken aus Deutschland, nur zwei bezeichnen sich nur als Türken. Beide Gruppen fühlen sich in ihrer Klasse und Schule wohl. Dabei ist die Aussage der Gymnasialschüler höher zu bewerten als die de Realschüler, da sie aus drei verschiedenen Schulen kommen. Acht von neun Schülern wollen ihre Ausbildung in Deutschland machen, nur einer in der Türkei. Wobei noch zu bedenken ist, daß eine Ausbildung, z.B. ein Studium in der Türkei kürzer und billiger ist. Durch die Neuregelung des Staatsangehörigkeitsrechtes zum 1.1.2000 erhalten alle in Deutschland geborenen ausländischen Kinder zu der Staatsangehörigkeit ihrer Eltern auch die deutsche bis zu ihrer eigenen Entscheidung für eine der beiden, spätestens im 23. Lebensjahr. Bis dahin sind sie Deutschtürken oder türkische Deutsche. Das heißt, in sechs Jahren kommen die Kinder türkischer Eltern, als Deutsche in unsere Schulen. Kann dann der MU oder das Fach Türkisch, von allen als notwendig angesehen und auch gewünscht, in der gleichen Art und unter den gleichen Bedingungen unterrichtet werden wie bisher? Wenn dem nicht so ist, muß damit begonnen werden, Lehrer mit einer anderen Ausbildung einzustellen, bzw. diejenigen, bei denen es möglich ist, weiterzubilden. Die Veränderung der Einstellungspraxis ist bereits überfällig. Zu Beginn der neunziger Jahre, aber spätestens bei Einrichtung des Modellversuchs 'Türkisch anstelle der zweiten Fremdsprache' hätten nur noch türkische Lehrer mit einer Universitätsausbildung eingestellt werden dürfen. Die Lehrer, die das alte Grundschullehrerdiplom der Türkei haben, können in Deutschland nicht an der Universität weitergebildet werden, da ihre Gesamtausbildungszeit kürzer ist, als hier die Zeit bis zum Abitur. Türkische Lehrer mit Universitätsausbildung dagegen könnten ein Zusatzstudium absolvieren. Für die deutschen Schulanfänger türkischer Herkunft braucht man Lehrer, mit einer Ausbildung, die derjenigen der Lehrer im Regelunterricht entspricht, d.h. daß sie mindestens für zwei Fächer ausgebildet sein müssen. Ein Lehrer, der zwei Fächer studiert hat, braucht nicht mehr an verschiedene Schulen zu gehen, da er außer Türkisch das zweite Fach in den Regelklassen unterrichten kann. Die Situation für eine entsprechende Lehrereinstellung ist in der nächsten Zeit recht gut, da im Laufe von zehn Jahren der größte Teil der bis 1980 eingestellten Lehrer in Rente geht. Die Fachberaterin für den MU Türkisch verlangt, daß für das Fach Türkisch gut Deutsch sprechende Lehrer, nach Möglichkeit mit einem Studienabschluß einer deutschen Universität, einzustellen sind. Es gibt bereits jetzt Lehrer und Diplompädagogen türkischer Herkunft, die zweisprachig sind. Beide Gruppen brauchten nur ein relativ kurzes Zusatzstudium, um den oben genannten Bedingungen zu entsprechen. Daneben gibt es seit 1998 die Absolventen der Gesamthochschule Essen, die ein entsprechendes Lehrerstudium mit dem Fach Türkisch durchlaufen haben. Schon jetzt gibt es eine Anzahl von Schulen, die, bedingt durch die Globalisierung, der Forderung nach früher Zweisprachigkeit durch Einführung nach Frühenglisch oder Frühfranzösisch nachgekommen sind. Im Laufe der Zeit wird die Einführung sicherlich flächendeckend erfolgen. In der Grundschule könnte dann die Sprache Türkisch entsprechend dem erteilten Frühenglisch oder Frühfranzösisch im Stundenplan stehen. Lehrerin B. sagt: "Warum sollen diese Kinder Frühenglisch lernen, wenn sie doch schon eine andere Sprache mitbringen". Der Ministerialrat spricht davon, daß die fremde Herkunftssprache auch einen ökonomischen Wert habe, man muß also nur den vorhandenen Wert nutzen. In den Ballungsgebieten ist Frühtürkisch, das die mitgebrachten Sprachkenntnisse berücksichtigt, anstelle des bisherigen MU durchaus denkbar. Unter Umständen muß man dabei auch eine Art Mittelpunktschulen einplanen. An diesen Schulen könnte mit der Alphabetisierung z. B. nach dem KOALAModell (s.a. Kap.VII, 2.) gearbeitet werden. In der Sekundarstufe sollte man schon jetzt überlegen, in welcher Weise auch der Computer für den Muttersprachlichen Unterricht zu nutzen ist. Gerade in Gegenden, in denen nur wenige türkische Kinder wohnen, bietet sich sein Einsatz an. Die in Hessen vorgeschriebene Sprachenfolge, daß Englisch, wenn nicht erste, so doch mindestens zweite Fremdsprache sein muß, wird durch das Frühtürkisch nicht tangiert, denn als nächste Fremdsprache müßte dann Englisch gelernt werden. Es wäre gut, wenn die Institution Schule auf dem Gebiet der Einbeziehung der Minderheitensprache Türkisch feste Vorstellungen hätte, ehe alle Schüler türkischer Abstammung bei Schuleintritt die deutsche Staatsangehörigkeit besitzen. Die dargelegten Überlegungen haben den Vorteil, daß Türkisch als ein den anderen Fächern gleichwertiges Fach der Hessischen Schule angesehen würde, in den Stundenplan integriert und nicht mehr Anhängsel oder Schule des Herkunftslandes. Die Lehrer wären hessische Lehrer, was sie formal schon seit fast 30 Jahren sind, in Deutschland ausgebildet, im Kollegium integriert und als gleichwertig akzeptiert. Mit einem Unterricht in der genannten Form würde der Sprache Türkisch, deren Sprecher zu der größten Minderheit in Deutschland zählen, der Raum und die Bedeutung zuerkannt, die ihr aufgrund ihrer Größe zustehen. Es gibt auch keinen Zweifel daran, daß die Zahl der Einwohner türkischer Abstammung in den nächsten Jahren, vielleicht Jahrzehnten, allein aufgrund der heutigen demographischen Daten noch steigen wird. Wie schon erwähnt, reisen jedes Jahr 30.000 türkische Ehepartner in Deutschland ein, ist die Geburtenrate höher und die Anzahl der jüngeren Frauen im reproduktiven Alter prozentual größer als bei der deutschen Bevölkerung. Mit einem Unterricht, der sich an die Rahmenrichtlinien hält und mit Hilfe der in diesem Sinne ausgebildeten Lehrer werden die Deutschtürken nicht nur von den Verdiensten ihrer Vorfahren in der Türkei erfahren, sondern auch von denen ihrer Elterngeneration, die, sei es als Arbeitnehmer, Arbeitgeber, Künstler, Schriftsteller oder Politiker hierher gekommen sind. Es sollen junge Menschen heranwachsen, die sich "nicht vom türkischen Ministerpräsidenten erklären lassen, wen wir in Deutschland wählen sollen oder nicht". (Özdemir, 1999: 13). Sie werden "Bürgerpflichten und Grundstrukturen und Prinzipien wahrnehmen (Wahlrecht, Zivildienst, Wehrdienst). Erst wenn sich der Einzelne als Teil der Gesellschaft empfindet, können sie angemessen ihren Beitrag leisten."
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, ausgewählte Gruppen der Dekapoden (brachyure Krabben, Einsiedler und Porzellankrebse) des PersischArabischen Golfes und des Golfes von Oman taxo nomischfaunistisch zu erfassen, eine Abschätzung des Artenreichtums und der Faunenzusam mensetzung vorzunehmen und die zoogeographischen Beziehungen innerhalb der Golfregion und zu anderen Teilen des westlichen Indischen Ozeans zu analysieren. Die Dekapodenfauna der Golfregion war -- im Gegensatz zur sehr viel besser untersuchten des Roten Meeres -- bislang Gegenstand vergleichsweise weniger wissenschaftlicher Arbeiten, und der faunistischtaxonomische Kenntnisstand stellte sich als entsprechend lückenhaft dar. Dies erwies sich einerseits als Problem bei der Beurteilung des Zustands von Lebensgemeinschaften und Folgeschäden nach der Ölkatastrophe von 1991, andererseits als Hindernis für Faunen vergleiche und zoogeographische Studien. Um vor allem die bislang wenig bearbeiteten eulitoralen Lebensräume wie Watten und Man groven, aber auch Korallenriffe, intensiv zu beproben, wurden Sammelreisen in verschiedene Teile des PersischArabischen Golfes und den Golf von Oman durchgeführt. Daneben wurde umfangreiches Museumsmaterial der bedeutenden Sammlungen aus der Golfregion taxonomisch untersucht, mit Material aus anderen Regionen verglichen und neu bewertet. Insgesamt konnte für den PersischArabischen Golf das Vorkommen von 188 Arten brachy urer Krabben, 20 Pagurideen (Einsiedlerkrebse) und 18 Porcellaniden (Porzellankrebse) eindeutig belegt werden; 43 Arten (37 Brachyuren, 4 Pagurideen und 2 Porcellaniden) wurden erstmals für den Golf nachgewiesen. Bei 11 dieser Neunachweise handelt es sich um bislang unbeschriebene Arten. Ein faunistischer Vergleich zu anderen Teilen des Indischen Ozeans zeigt, daß der Golf für die untersuchten Taxa insgesamt deutlich artenärmer als das Rote Meer oder die ostafrikanische Küste ist. Dies ist vor allem auf die geringere Ausdehnung und schlechtere Entwicklung von Korallenriffen sowie das Fehlen von Tiefwasserhabitaten, aber auch auf das Vorherrschen extre mer ökologischer Bedingungen in weiten Teilen des Golfes zurückzuführen. Zwischen verschie denen systematischen und ökologischen Gruppen bestehen allerdings große Unterschiede hinsichtlich des Artenreichtums. Während hartboden und korallenassoziierte Gruppen im Golf deutlich unterrepräsentiert sind, findet sich bei weichbodenbewohnenden Taxa eine vergleichs weise artenreiche Fauna. Besonders auffallend ist dabei der Artenreichtum der eulitoralen Ocypodidae, die mit 23 Arten im Golf eine weitaus höhere Artendiversität erreichen als im Roten Meer oder an der ostafrikanischen Küste und gemeinsam mit den ebenfalls vorwiegend in der Gezeitenzone leben den Grapsiden einen Schwerpunkt der Arbeit bildeten. Innerhalb der Golfregion zeigten sich für diese Familien große Unterschiede hinsichtlich des Artenreichtums und der Faunenzusammen setzung. Die Wattgebiete und Mangroven des nördlichen und des südöstlichen PersischArabi schen Golfes sowie des Golfes von Oman fallen dabei durch ihre sehr diverse Fauna auf. Stark verarmt ist dagegen die eulitorale Fauna des südwestlichen und westlichen Teils des Persisch Arabischen Golfes. Der Grund für diese Verarmung ist dabei vor allem im hohen Salzgehalt des küstennahen Wasserkörpers zu sehen. Die Ergebnisse der faunistischtaxonomischen Auswertungen ermöglichten eine zoogeogra phische Analyse, bei der die Dekapodenfauna sowohl auf ihre Homogenität innerhalb der Golf region, als auch auf ihre Beziehungen zu der aus anderen Teilen des Indischen Ozeans untersucht wurde. Hierzu wurden Endemismusraten und Verbreitungsmuster der aus dem Golf nachgewie senen Arten betrachtet sowie Faunenähnlichkeiten mit Hilfe multivariater statistischer Methoden analysiert. Zoogeographisch stellt sich die Dekapodenfauna der Golfregion als Mischung unterschied licher zoogeographischer Elemente dar. Dies reflektiert die Lage des Golfes am Übergang zwischen westlichem Indischen Ozean und indischer bzw. indomalaiischer Region. Die Endemis musraten liegen bei 6 % für Porcellaniden, 7 % für Brachyuren und rund 10 % für Pagurideen. Für keine der Gruppen läßt sich daraus eine Begründung für eine eigene Faunenprovinz oder ein Endemismuszentrum ableiten. Neben den Endemiten beinhaltet die Fauna Arten unterschied licher geographischer Beziehungen. Den größten Anteil stellen weit verbreitete Arten, die je nach Gruppe zwischen der Hälfte und zwei Dritteln der im Golf vorkommenden Arten ausmachen. Für die Einsiedlerkrebse sind daneben vor allem Arten aus dem Roten Meer und dem Golf von Aden von Bedeutung, was auf eine enge Beziehung der Pagurideenfauna zu diesen Gebieten hin weist. Dagegen sind für die Brachyuren indopakistanische und indomalaiische Arten von weit aus größerer Bedeutung, was eine größere Ähnlichkeit der Krabbenfauna zu der Pakistans und Indiens andeutet. Innerhalb der Golfregion ergaben sich für die Brachyurenfauna, insbesondere für Ocypodi den, deutliche Unterschiede hinsichtlich der zoogeographischen Beziehungen. Während der von östlichen Faunenelementen dominierte nördliche und östliche Golf kaum westliche Faunen elemente aufweist, stellen diese im südlichen Golf und vor allem im westlichen Teil des Golfes von Oman einen erheblichen Anteil an der Gesamtfauna. Getrennt werden diese beiden Gebiete durch die Bereiche des südlichen und westlichen Golfes, in denen die extrem hohen Salzgehalte eine wirksame Verbreitungsbarriere darstellen. Zumindest für einige Taxa ist demnach die Golf region nicht als einheitliche faunistischzoogeographische Region zu betrachten. Während der nördliche und östliche Teil des PersischArabischen Golfes zoogeographisch eng mit Pakistan verbunden sind, zeigen sein südlicher Teil und der westliche Golf von Oman engere Beziehungen zum Golf von Aden und dem Roten Meer. Aufgrund der vergleichsweise guten Dokumentation der Faunenzusammensetzung in ver schiedenen Teilen des Indischen Ozeans ließ sich für Ocypodiden und Grapsiden ein überregio naler Faunenvergleich mit Hilfe multivariater Analysenmethoden durchführen und eine zoogeo graphische Unterteilung des Indischen Ozeans vornehmen. Innerhalb des westlichen Teils des Indischen Ozeans lassen sich dabei drei Regionen aufgrund ihrer Faunenähnlichkeit voneinander abgrenzen. Dies sind -- eine ost/südostafrikanische Region, die von der Nordostküste Südafrikas bis nach Somalia reicht -- eine west/südarabische Region bestehend aus Rotem Meer, Golf von Aden, der südarabi schen Küste und dem westlichen Golf von Oman, die auch in den südöstlichen Persisch Arabischen Golf hineinzieht -- eine ostarabischpakistanische oder iranischpakistanische Region, die den nördlichen und östlichen Teil des PersischArabischen Golfes, den östlichen Golf von Oman sowie Pakistan und Nordwestindien umfaßt Hinsichtlich der Besiedlungsgeschichte des PersischArabischen Golfes zeigen die Ergebnisse, daß eine Besiedlung durch eulitorale Krabben zum größten Teil von der indischen Seite aus entlang der iranischen Küste stattgefunden haben muß, während später eingewanderte westliche Elemente aufgrund der massiven Salinitätsbarriere und der Strömungsverhältnisse auf den süd östlichsten Teil beschränkt blieben. Vor allem die Gezeitenzonen des PersischArabischen Golfes weisen teilweise sehr diverse Lebensgemeinschaften auf, deren Artenzusammensetzung in ihrer Mischung unterschiedlicher zoogeographischer Elemente einzigartig ist und den Einfluß verschiedener Wasserkörper auf den Golf anzeigt. Für die Ocypodiden führt dies zu einer hohen regionalen oder gammaDiversität sowie einer über reine Artendiversität hinausgehenden Diversität der Lebensgemeinschaften. Während sich die Folgen des Golfkriegs als weniger gravierend als ursprünglich befürchtet erwiesen haben, könnten Habitatzerstörung und schleichende Verschmutzung die Lebensgemein schaften des PersischArabischen Golfes irreparabel schädigen.
Zyklotronresonanzen von Ionen im hochfrequenz-modulierten magnetisch fokussierten Elektronenstrahl
(2000)
Ein Prototyp einer Kombination aus Penningfalle und EBIS/T wurde im Rahmen dieser Arbeit entwickelt. Dazu wurde ein Standard NMRMagnet erfolgreich so umgebaut, daß er in Bezug auf Vakuum, Temperatur und Temperaturbeständigkeit den Erfordernissen einer EBIS/T als Ionenfalle entspricht. Diese Apparatur ermöglicht nun die Untersuchung der in der EBIS/T erzeugten Ionen mit den Methoden der 'Fallenphysik'. Die Anregung der Ionen in der Falle wurde hier erstmals durch Hochfrequenzmodulation des Elektronenstroms über die Wehneltelektrode der Elektronenkanone durchgeführt. Messungen haben gezeigt, daß man in der EBIS/T erzeugte Ionen selektiv nach ihrem Verhältnis von Masse zu Ladung mit der Modulation in Resonanz bringen kann, bis sie den Elektronenstrahl verlassen. Die Ionen besitzen auch im dichten Elektronenstrahl eine charakteristische Eigenfrequenz, die zwar von der Raumladung in der Falle abhängt, mit der jedoch trotzdem eine Resonanzanregung durchgeführt werden kann. Im Experiment bestätigte sich die Vorhersage für die Mindestdauer der Anregung in der Größenordnung von Mikrosekunden und für Relaxionszeiten der kohärenten Ionenbewegungen im Bereich von Millisekunden, was eine grundsätzliche Voraussetzung für eine resonante Separation verschiedener Ionensorten darstellt. Die auftretenden Eigenfrequenzen der unterschiedlichen Ionen lassen sich theoretisch und im Einklang mit numerischen Simulationen beschreiben. Die Anregung der Eigenfrequenzen von Ionen über den Elektronenstrahl funktioniert bis zu so hohen Ionendichten, wie sie in einer EBIS vorkommen. Ionenmanipulationen, wie man sie von den Penningfallen her kennt, lassen sich auf ein Ionenensemble mit bis zu 10 10 Ionen pro cm 3 übertragen. Die gemessenen Verschiebungen der Eigenfrequenzen gegenüber der Zyklotronfrequenz geben darüber hinaus Aufschluß über den Kompensationsgrad des Elektronenstrahls in der EBIS/T und können damit als wichtiges Diagnosehilfsmittel für die Optimierung von ElektronenstrahlIonenquellen verwendet werden. Läßt man die Resonanzanregung kontinuierlich einwirken, so tritt überraschenderweise eine Erhöhung des Anteils an hochgeladenen Ionen in der EBIS/T auf. Darüberhinaus konnte experimentell gezeigt werden, daß die hochgeladenen Ionen auf der Achse des Elektronenstrahls konzentriert werden, während niedrig geladene Ionenen dort verschwinden und bevorzugt den äußeren Strahlbereich bevölkern. Die Erklärung dafür ist, daß durch kontinuierliches Entfernen dieser niedrig geladenen Ionen aus dem Elektronenstrahl eine vollständige Kompensation der Raumladung des Elektronenstrahls verhindert wird. Dadurch lassen sich Ionen in der Ionenquelle über einen längeren Zeitraum züchten. Vorteilhafterweise drängt die Anregung über eine Modulation des Elektronenstrahls im Gegensatz zu der normalen Dipolanregung bevorzugt niedrig geladenen Ionen, mit größerer Aufenthaltswahrscheinlichkeit am Rand, aus dem Elektronenstrahl. Dies führt zu einer verstärkten CoulombKühlung der hochgeladenen Ionen und konzentriert diese in der Mitte des Strahls, wo die Anregung fast unwirksam ist. Diese Kühlkraft wirkt als Zusammenspiel der attraktiven radialen Kraft des nicht vollständig raumladungskompensierten Elektronenstrahls und der Coulombstöße der Ionen untereinander. Durch diese Methode der Kühlung der Ionen untereinander können verstärkt Ionen hoher Ladungszustände in der Ionenquelle konzentriert werden. Der Vorgang der Kühlung durch Coulombstöße konnte mit einem Modell beschrieben werden, bei dem die thermische Verteilung aller Ionen im Elektronenstrahl einer Boltzmann Verteilung folgt. Das Modell benutzt vier Kräfte: die magnetische Kraft, die elektrische Haltekraft des Elektronenstrahls, die periodische elektrische Anregungskraft und die Reibung der Ionen proportional zu ihrer Geschwindigkeit und ihres Ladungszustandes bzw. die Stöße der Ionen untereinander. Die Resonanzanregung im Raumladungspotential sowie die Aufenthaltsverteilung der Ionen im Elektronenstrahl konnten damit dargestellt werden. Für Präzisionsexperimente an hochgeladenen Ionen bietet sich die Kombination aus einer EBIS/T mit integrierter Penningfalle an. Die Experimente haben gezeigt, daß es möglich ist, Ionenspektren mit einem eingekoppelten Wechselfeld in dem Ionisationsraum der EBIS/T zu separieren und zu reinigen. Für die Zukunft wünscht man sich aber eine größere Effektivität für das vollständige Entfernen bestimmter Ionensorten. Dies kann man erreichen, indem man den Elektronenstrahl noch dichter mit der Ionisationsröhre umschließt. Durch die kontinuierliche Resonanzanregung profitiert man von einer längeren Einschlußzeit für die stufenweise Ionisierung zu höheren Ladungszuständen und/oder eröffnet ElektronenstrahlIonenquellen neue Einsatzmöglichkeiten unter schlechteren Vakuumbedingungen. Die verstärkte Kühlung und Zentrierung der Ionen auf der Achse während dieses Betriebsmodus verbessert die Emmitanz von ElektronenstrahlIonenquellen. Für die Zukunft kann man sich eine EBIS mit moduliertem Elektronenstrahl auch im Strahlweg niederenergetischer hochgeladener Ionen zum Verbessern deren Emittanz vorstellen. Die im Elektronenstrahl erzeugten und sich selbst kühlenden Ionen wirken durch Coulombstöße als Kühlmedium ohne die Gefahr der Umladung wie bei gasgefüllten hfQuadrupolen.
Für Elektronenstrahlionenquellen sind die Stromdichte und die Energie die ausschlag gebenden Größen zum Erreichen hoher Ladungszustände. Herkömmliche EBIS/T verwenden ein externes magnetisches Feld zur Kompression des Elektronenstrahls. Im Rahmen dieser Dissertation wurde eine ''magnetfeldfreie" EBIS/T realisiert, mit der die Selbstkompression eines teilrelativistischen Elektronenstrahls nachgewiesen werden konnte, womit ein vielversprechender Meilenstein auf dem Weg zu einer SuperEBIS/T mit Energien im Bereich von 300 - 500 keV erreicht wurde. Es wurde eine Apparatur aufgebaut, die es ermöglichte, einen Elektronenstrahl unter verschiedenen Winkeln in die Ionenfalle einzuschießen. Durch numerische Simulationen wurde die Elektronenkanone mit dem Ziel einer möglichst kleinen rückwärtig projizierten Kathode optimiert, um die fokussierbare Stromdichte zu erhöhen. Um sphärische Aberrationen des abbildenden Linsensystems zu korrigieren, wurde die Driftstrecke zwischen Elektronenkanone und Ionenfalle mit ''clearing" Elektroden versehen, die es ermöglichten, einen definierten Kompensationsgrad im Elektronenstrahl einzustellen. Im Anschluß an den Kollektor wurden die Ionen mit einem Sektormagneten analysiert. Zunächst wurde experimentell bestätigt, daß sich sphärische Aberrationen korrigieren lassen, wenn der Elektronenstrahl im Bereich des Linsensystems gezielt partiell kompensiert wird. Mit dem nichtlinearen Kompensationsgrad konnte die defokussierende Kraft der Raumladung gerade so angepaßt werden, daß sie die radial zunehmende Fokussierung der Linse (sphärische Aberration) korrigiert. ''clearing" Elektroden sorgten dafür, daß im Außenbereich des Elektronenstrahls gebildete Ionen den Strahl verließen. Nur der innere Bereich konnte nach Maßgabe der Potentialdifferenz kompensieren. Messungen der Verlustströme an den Elektroden der Ionenfalle zeigten, daß nur mit dieser Kompensation der Elektronenstrahl bei hohen Strahlströmen durch die Ionenfalle transportiert werden konnte. Bei kontinuierlicher Ionenextraktion konnte bei Erhöhung des Gasdrucks in der Ionenquelle ein überproportionales Ansteigen des Ionenstroms gemessen werden. Mit der Annahme konstanter Stromdichte sollte der Ionenstrom lediglich linear steigen. Zusammen mit der gleichzeitigen Reduktion der Verlustströme auf die Fallenelektroden war dies ein erster Hinweis für die Erhöhung der Stromdichte durch zunehmende Kompensation der elektronischen Raumladung im Fallenbereich. Eine genaueres Bild über die Entwicklung der Stromdichte wurde aus Spektren abgeleitet, die bei gepulster Extraktion aufgenommen wurden. In einer Elektronenstrahlionenquelle werden Ionen durch sukzessive Ionisation gebildet. Die Ladungszustandsverteilung der gebildeten Ionen ist proportional zur Dichte der ionisierenden Elektronen und zur Einschlußzeit, der die Ionen dem Elektronenbeschuß ausgesetzt sind. Bei konstanter Stromdichte erreichen aufeinanderfolgende Ladungszustände maximale relative Häufigkeit ungefähr bei einer Verdopplung der Einschlußzeit. Die aufgenommenen Spektren wichen deutlich von diesem Schema ab. Anstelle einer regulären Ladungszustandsentwicklung wiesen die Spektren nach 20ms Einschlußzeit zwei Verteilungen auf. Die erste Verteilung hatte ein Maximum bei Ar 2 , während die zweite ihr Maximum bei Ar 8 hatte. Die höher geladene Verteilung war mit dem Auftreten hoher Ladungszustände bis Ar 12 verbunden. Bei einer weiteren Erhöhung der Einschlußzeit ging die niedrig geladene Verteilung in die hoch geladene über, bis bei 160ms nur noch ein hoch geladenes Spektrum vorhanden war. Ein Vergleich mit Modellrechnungen ergab für niedrig geladene Ionen (3Acm 2 für Ar 2 bei 20ms Einschluß) eine geringe Stromdichte und einen kontinuierlichen Übergang zu hohen Stromdichten (300Acm 2 für Ar 12 bei 20ms Einschluß) bei hoch geladenen Ionen. Aufgrund des ''evaporative cooling" sammeln sich hoch geladene Ionen in der Mitte des Elektronenstrahls. Da der Elektronenstrahl von innen nach außen kompensiert, setzt die Selbstkompression innen ein und führt dort zu hohen Stromdichten. Man erhält eine während der Einschlußzeit variierende Stromdichteverteilung im Elektronenstrahl. Eine Aussage über die Häufigkeitsverteilung der Stromdichtewerte gelang über die Wichtung der berechneten Stromdichte mit der Menge an ionischer Ladung, die in den Ladungszuständen vorhanden war. Mit diesen Werten konnten mittlere Stromdichtewerte für den Elektronenstrahl berechnet werden. Es wurde die mittlere Stromdichte für den gesamten Elektronenstrahl und für die beiden Ladungszustandsverteilungen berechnet. Dabei begann die mittlere Stromdichte des Elektronenstrahls mit der Stromdichte der niedrig geladenen Verteilung (13Acm 2 ; 5ms) und ging bei Erhöhung der Einschlußzeit in die mittlere Stromdichte der hoch geladenen Verteilung über (110Acm 2 ; 80ms). Das Maximum der mittleren Stromdichte für die hoch geladene Verteilung lag bei 170Acm 2 für 40ms Einschlußzeit. Nachdem der Elektronenstrahl bei 40ms kompensiert wurde, sanken die mittleren Stromdichten. Dies lag an der nun dominierenden Heizung durch Coulombstöße der Strahlelektronen an den eingeschlossenen Ionen, wodurch deren Ausbeute verringert wurde. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit numerischen Integrationen der Randstrahlgleichung. Dazu wurden Berechnungen für verschiedene Kompensationsgrade und Elektronenstrahlemittanzen durchgeführt. Für Emittanzwerte um 2×10 3 cm mrad ergab sich eine gute Übereinstimmung mit den gemessenen Stromdichten. Die Rechnungen bestätigten, daß die Emittanz und der Einschuß des Elektronenstrahls in die Ionenfalle die kritischen Größen sind, um eine Selbstkompression des Elektronenstrahls bei einer Energie von 22keV und 30mA Strahlstrom beobachten zu können. Die in dieser Arbeit untersuchte Selbstkompression des Elektronenstrahls kann genutzt werden, um bei einer XEBIS/T mit Elektronenstrahlenergien größer als 200keV deutlich höhere Stromdichten zu erzielen, als bei heute üblichen EBIS/T. Sie eignet sich deshalb besonders für die Erzeugung höchst geladener schwerer Ionen, weil die angewandte Technik bei kommerziellen ElektronenstrahlSchweißanlagen industriell ausgereift ist, wohingegen die herkömmlichen EBIS/T weltweit (Livermore, Dubna, Tokio, Freiburg) die gesetzten Erwartungen hinsichtlich der erreichbaren Elektronenenergien bisher verfehlen. Auch für den stets problematischen Einschuß niedrig geladener Ionen, die außerhalb der EBIS/T erzeugt werden, kann die Selbstkompression genutzt werden. Der Elektronenstrahl weist zu Beginn der Ionisierung einen großen Durchmesser auf, wodurch der Einschuß in den Strahl erleichtert wird. Während der Höherionisierung der eingefangenen Ionen komprimiert sich der Elektronenstrahl zu der zum Erreichen höchster Ladungszustände notwendigen Stromdichte dann von selbst.
In dieser Arbeit wurde der neuronale Glutamattransporter EAAC1 (Excitatory Amino Acid Carrier 1), kloniert aus Rattenretina, in HEK (Human Embryonic Kidney) Zellen transient exprimiert und mit Hilfe der patch clampTechnik elektrophysiologisch untersucht. Der Glutamattransport ist gekoppelt an den Kotransport von drei Natriumionen und einem Proton und den Gegentransport von einem Kaliumion. Damit werden pro Transportzyklus zwei positive Nettoladungen in die Zelle verschoben. Zusätzlich zum Glutamattransport verfügt der EAAC1 über eine Glutamatinduzierte Anionenleitfähigkeit, die nicht thermodynamisch an den Glutamattransport gekoppelt ist und besonders deutlich bei chaotropen Anionen (wie SCN ) in Erscheinung tritt. Eine weitere Funktion des Transporters ist seine Glutamatunabhängige Leckleitfähigkeit. Mit Hilfe von Ganzzellableitungen unter definierten ionalen extra und intrazellulären Bedingungen und bestimmtem Haltepotenzial erfolgte die Charakterisierung des Glutamattransporters von der extrazellulären Seite. Eine hohe Überexpression von EAAC1 in den HEKZellen, mit einer durchschnittlichen Dichte von # 4#10 3 Transporter pro µm 2 Zellmembran, erlaubte zudem die Beschreibung des Transporters von der intrazellulären Seite, durch Messungen am insideout patch. Stationäre Messungen an EAAC1 unter kontrollierten Spannungs und ionalen Bedingungen ließen verschiedene Aussagen zu über 1) die Bindungsreihenfolge von Glutamat und den kotransportierten Ionen an den Transporter, 2) den Anteil der Anionenleitfähigkeit am Glutamatinduzierten Gesamtstrom 3) die Abhängigkeit der Glutamatunabhängigen Leckleitfähigkeit und der Glutamatabhängigen Anionenleitfähigkeit von der Protonen und Natriumkonzentration und 4) die Identifikation des Ladungsträgers beim EAAC1assoziierten Leckstrom. Bei den durchgeführten vorstationären Messungen handelte es sich meist um SubstratsprungExperimente mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse von #CNBcaged Glutamat. Damit konnte 1) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt im Transportzyklus ermittelt werden, 2) Geschwindigkeitskonstanten verschiedener Teilreaktion im Transportzyklus von EAAC1 abgeschätzt werden und 3) die Spannungsabhängigkeit von Teilreaktionen identifiziert werden. Die Kombination von stationären und vorstationären Messungen mit Hilfe der LaserpulsPhotolyse sowie die Kombination von Ganzzellableitungen und insideout patches ermöglichte damit eine umfassende kinetische Untersuchung der verschiedenen Funktionen von EAAC1 und führten zu dem im folgenden beschriebenen Transportmodell. EAAC1 bindet auf der extrazellulären Seite zunächst ein Natriumion, wobei die Natriumbindungsstelle im elektrischen Feld der Membran liegt (# 25#30 %). Dieser Na beladene Transporterzustand ist assoziiert mit einem Glutamatunabhängigen Leckstrom, der von Anionen getragen ist. Der Na Bindungsreaktion schließt sich eine elektroneutrale Protonenbindung an. Der apparente pKWert des Protonakzeptors in EAAC1 liegt bei # 8, sodass unter physiologischen Bedingungen EAAC1 hauptsächlich in seiner protonierten Form vorliegt. Die nachfolgende Glutamatbindung (KD # 50 µM) ist ebenfalls spannungsunabhängig und erfolgt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 2#10 7 M #1 s #1 . Sie löst eine elektroneutrale Konformationsänderung aus, die in einem Zeitbereich von 0,5#1 Millisekunde stattfindet und damit langsam ist im Vergleich zu den anschließenden elektrogenen Na Bindungsreaktionen. Der vollständig beladene Transporters transloziert in einem spannungsabhängigen Prozess (# 60#65 % des elektrischen Felds) Glutamat über die Membran mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 800 s #1 bei einem physiologischen Membranpotenzial von #80 mV. Der GlutamatTransportprozess ist mit der Glutamatinduzierten Anionenleitfähigkeit assoziiert, wobei sich beim GlutamatEinwärtstransport ein Verhältnis zwischen Transport und Anionenstrom (von SCN # ) von 1 zu 4 ergab, während es beim GlutamatAuswärtstransport bei 1 zu 1,5 lag. Die Dissoziationsfolge auf der intrazellulären Seite wurde nur für den Protonen-GlutamatKotransport bestimmt und war in umgekehrter Reihenfolge zur extrazellulären Seite. Verschiedene Mechanismen fördern auf der zytosolischen Seite die Dissoziation des Glutamates, bzw. verhindern den GlutamatAuswärtstransport. So führt die Änderung der Zugänglichkeit des Protonakzeptors zur zytosolischen Seite zu einer Verschiebung des apparenten pKWertes zu # 6,5. Damit liegt EAAC1 unter physiologischen Bedingungen auf der intrazellulären Seite hauptsächlich deprotoniert vor, was die Glutamatdissoziation fördert. Ebenso ist die Affinität mit einem 45fach erhöhten K M Wert im Vergleich zur extrazellulären Seite stark herabgesetzt. Die Relokation des Transporters erfolgt nach der Bindung eines Kaliumions und stellt mit einer Geschwindigkeitskonstanten von # 100 s #1 (bei einem Membranpotenzial von #80 mV) den hauptsächlich geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Transportzyklus dar. Bei der Relokation handelt es sich um einen elektrogenen Prozess (# 70#75 % des elektrischen Felds), wobei negative Ladungsträger über die Membran verschoben werden. Daher muss der Transporter über eine Eigenladung von < #1 verfügen. Daraus ergibt sich, dass die zu transportierende Nettoladung von zwei positiven Ladungen pro Transportzyklus auf zwei Reaktionsschritte verteilt ist. Der neuronale Glutamattransporter EAAC1 verfügt damit über verschiedene Mechanismen, den Transportprozess in Richtung Glutamataufnahme in die postsynaptische Nervenzelle zu fördern, entsprechend seiner physiologischen Aufgabe, die Glutamatkonzentration im synaptischen Spalt gering zu halten.
Die vorliegende Arbeit gliederte sich in 3 Teilbereiche. Der erste Teilbereich beschäftigte sich mit der antiviralen in vitro Wirkung von EDDS (Ethylendiamindinbernsteinsäure), sowie mit der Wirkung von EDDS, DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure) und DFO (Desferrioxamin) im Tiermodell. EDDS zeigte in vitro eine vielversprechende Wirkung gegenüber verschiedenen HCMV Stämmen. Hierunter befanden sich GCV und HPMPCresistente Stämme. Dies ist von großer Bedeutung für die Entwicklung neuer Wirkstoffe, da die Therapie von HCMVbedingten Erkrankungen mit hohen Nebenwirkungen verbunden ist und zudem durch vermehrtes Auftreten von Resistenzen gegenüber den etablierten Therapeutika GCV, HPMPC und Foscarnet erschwert wird. Die invitroDaten legen einen ähnlichen antiviralen Wirkmechanismus des EDDS verglichen mit DTPA nahe. Diese Ähnlichkeit wird durch die enge strukturelle Verwandschaft der Stoffe noch unterstrichen. Im Mausmodell zeigte jedoch keiner der 3 untersuchten Chelatoren eine erfolgversprechende protektive Wirkung gegenüber MCMVInfektionen. Damit wurden vorangegangene Untersuchungen im Rattenmodell bestätigt. Trotz vielversprechender anderslautender Ergebnisse, die auf eine invivoWirkung von DFO gegenüber CMVInfektionen hinwiesen, scheint damit der Einsatz der Chelatoren aufgrund ihrer sehr kurzen Halbwertszeit im Körper stark limitiert. Der zweite Teil der Dissertation befaßt sich mit der Entwicklung und Untersuchung von peptidischen Wirkstoffträgersystemen für DTPA. Hierbei ließen sich reproduzierbar lösliche HSADTPA und GelBDTPAKonjugate, sowie HSADTPA und GelBDTPANP herstellen. Die antivirale und die antitumorale Wirkung dieser Konjugate wurde in vitro untersucht. Da für die antitumorale Wirkung von DTPA bisher keine Daten vorlagen, wurde zunächst die Cytotoxizität in einer NBZellinie und in 3 BrustkrebsZellinien bestimmt. Als Vergleich dienten HFF. Es zeigte sich, daß DTPA in unterschiedlichen Konzentrationen gegenüber den untersuchten Zellinien cytotoxisch war, eine Tumorspezifität konnte jedoch nicht festgestellt werden. Die Cytotoxizität und die antivirale Wirkung des DTPA wurden in vitro durch Bindung an die unterschiedlichen peptidischen Trägersysteme deutlich erhöht. Dies führte jedoch nicht zu einer Erhöhung der therapeutischen Breite, da HFF in gleichem Maße stärker geschädigt wurden. Trotzdem bieten die Trägersystem Zubereitungen im Hinblick auf eine invivoAnwendung einige Vorteile. Es könnten geringere Mengen DTPA eingesetzt werden, was eine verringerte Ausschwemmung von Metallionen zur Folge hätte. Neben einer verlängerten Zirkulationszeit im Organismus könnte die veränderte Körperverteilung zu Verbesserungen führen. Im Falle der antitumoralen Anwendung wäre dies eine Anreicherung im Tumor aufgrund des EPREffektes. Für die antivirale Anwendung wären die Anreicherung in entzündeten Geweben, sowie die Anreicherung in Monozyten und Makrophagen von großem Interesse, da diesen Zellen ein entscheidender Anteil an dem durch CMV verursachten Multiorganbefall zugerechnet wird. Trotzdem bedarf der invivoEinsatz einer eingehenden Evaluierung und erscheint aufgrund der geringen therapeutische Breite insbesondere im Hinblick auf die Therapie von Tumoren stark eingeschränkt. Bezüglich des cytotoxischen Mechanismus weist die Wirkung der DTPAKonjugate darauf hin, daß DTPA den Zellzyklus und die Virusreplikation durch Wechselwirkung mit der Zellmembran und dadurch Veränderung der Signaltransduktion beeinflußt. Da eine geringere DTPAMenge größere Effekte verursacht, erscheint es unwahrscheinlich, daß die Komplexierung von Metallionen für die Wirkungen verantwortlich war. Im dritten Teil dieser Dissertation wurde eine PLANPTrägersystem für das antitumoral wirksame Enzym BSRNase entwickelt. BSRNase zeigte in vitro und bei intratumoraler Applikation sehr vielversprechende, selektive antitumorale Effekte gegenüber proliferierenden und ruhenden Tumorzellen. Die systemische Applikation war jedoch nicht erfolgreich. Dieses Scheitern wurde auf hohe Antigenität, kurze Halbwertszeit der Substanz im Körper und auf eine ungenügende Körperverteilung zurückgeführt. NP sind geeignet die Zirkulation im Körper zu verlängern und reichern sich in Tumoren aufgrund des EPREffektes an. PLANP wurden ausgewählt, da sie BSRNase in ausreichendem Maß binden und da PLA ein bioabbaubares und bioverträgliches Material ist. In vitro unterschied sich die nanopartikuläre Zubereitung bei der Wirkung gegenüber normalen, Lymphom und Leukämiezellen nicht. Beide BSRNaseZubereitungen induzierten Apoptose in parentalen und chemoresistenten Krebszellen. Normale Zellen wurden nicht in ihrer Viabilität beeinträchtigt. Die aspermatogenen und antiembryonalen Wirkungen von BSRNaseZubereitungen weisen auf ihre antitumoralen Eigenschaften hin. In diesen beiden Testsystemen übertraf die nanopartikuläre Zubereitung die Wirkung der BSRNaseLösung. InvivoVersuche müssen nun den tatsächlichen Stellenwert der BSRNasePLANP zeigen.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Porcinen Endogenen Retroviren (PERV) erstmals ausführlich biochemisch und biologisch charakterisiert sowie ihr Wirtsspektrum und ihre Expression in vitro näher analysiert. Es wurden sensitive immunologische Nachweismethoden entwickelt, die in experimentellen, präklinischen und ersten klinischen Studien zur Xenotransplantation angewandt wurden. Die Charakterisierung der Viren ergab, daß es sich um TypCRetroviren handelt, wobei ein Teil der Partikel nicht gereift ist. In hoch gereinigten Viruspräparationen aus Überständen produzierender porciner und PERVinfizierter, humaner Zellen konnten alle Strukturproteine identifiziert werden. Dazu wurden neben Elektrophoresen Western BlotAnalysen eingesetzt, wobei kreuzreaktive Antiseren gegen verwandte Viren und neu entwickelte, erstmals gegen PERVProteine gerichtete Antiseren benutzt wurden. Bei der Untersuchung der biologischen Eigenschaften wurde gezeigt, daß PERV in vitro ein mit anderen Retroviren vergleichbares immunsuppressives Potential besitzt. Mit diesen neuen Antiseren und den hoch gereinigten Viruspräparationen wurden sehr sensitive Western BlotVerfahren sowie ELISAs auf der Basis synthetischer Peptide als Nachweissysteme etabliert und validiert. Zuerst wurden Seren gesunder Blutspender mit diesen Tests untersucht. Dann wurden Seren von Schlachtern und von Patienten nach Xenotransplantationen getestet. Erstmals wurden auch Seren von Pavianen, denen u.a. auch ganze Schweineorganen transplantiert wurden und die eine profunde, für zukünftige Anwendungen typische, pharmakologische Immunsuppression erhielten, auf Antikörper gegen PERV untersucht. Bei Seren einiger Patienten und gesunder Blutspendern wurden zwar Kreuzreaktionen mit viralen Proteinen gefunden, es lagen aber keinerlei Anzeichen für eine PERVInfektion vor. Um das Wirtspektrum von PERV zu analysieren, wurden Zellinien und erstmals auch primäre Zellen verschiedener Spezies einschließlich Ratte und Maus mit PERV inokuliert. Dabei wurden erstmals Hinweise auf die Suszeptibilität von humanen Blutzellen erhalten. Es konnte gezeigt werden, daß mitogenstimulierte porcine PBMC PERV freisetzen können, wobei alle drei Subtypen der Hüllproteine nachgewiesen wurden. Eine nähere Analyse ergab daß verschiedene Schweinerassen aber auch einzelne Individuen der gleichen Rasse unterschiedliche Mengen an Virus freisetzen. Unter bestimmten Stimulationsbedingungen wurde PERV von adhärenten Zellen produziert, die nicht näher charakterisiert werden konnten. Eine endgültige Beurteilung des Infektionsrisikos bei Xenotransplantationen ist nach Abschluß dieser Studie noch nicht möglich. Mit der Charakterisierung von PERV und den immunologischen Nachweismethoden wurden die Voraussetzung für die Analyse weiterer experimenteller und klinischer Xenotransplantationen gelegt.