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Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des in der Membran des Endoplasmatischen Retikulum lokalisierten Proteins Gsf2 der Hefe Saccharomyces cerevisiae näher charakterisiert. Gsf2 ist ein 46 kDa großes ER-Transmembran-Protein mit zwei membrandurchspannenden Domänen, wobei C- und N-Terminus cytosolisch orientiert sind. Zudem besitzt Gsf2 C-terminal ein klassisches Dilysin-Motiv. Dies deutet daraufhin, dass Gsf2 über den retrograden Transportweg mittels COPI-Vesikel recycelt wird. Dies impliziert auch einen Transport von Gsf2 über den anterograden Transportweg [COPII]. Bisherige Befunde deuteten darauf hin, dass Gsf2 in das sekretorische System involviert ist. Eine Deletion des GSF2-Gens resultiert in einer Retention der Hexosetransporter Hxt1, Hxt3 und Gal2 im ER. Für die Identifikation von potentiellen Interaktionspartnern von Gsf2 im sekretorischen System wurden Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems [SUS] durchgeführt. Dabei konnten Interaktionen zwischen den Proteinen Sar1, Sec12, Hxt1 und dem Sec61-Translokations-Komplex mit dem vermeintlichen Verpackungschaperon Gsf2 identifiziert werden. Zusätzlich konnte unter Anwendung einer Pull-Down-Analyse die Interaktion zwischen Gsf2 und Hxt1 biochemisch bestätigt werden. Zur Aufklärung von funktionellen Domänen, wurde ein in Gsf2 identifiziertes potentielles ER-Export-Motiv [RR](F)[RR] durch den Austausch durch fünf Alanine modifiziert. Die Veränderung der Aminosäuresequenz [RR](F)[RR] (354-358 AS) in Gsf2 bewirkte einen partiellen Funktionsverlust bei einer restriktiver Temperatur von 37°C. Des Weiteren deuteten mehrere Anhaltspunkte darauf hin, dass Gsf2 mit Hxt1 in COPII Vesikel verpackt wird. Eine Aufreinigung von konstitutiven COPII-Vesikel aus in vivo erwies sich experimentell als nicht durchführbar. Deshalb wurde ein in vitro Ansatz [COPII vesicle budding assay] ausgewählt. Dafür wurden die für die Vesikelbildung benötigten Komponenten aufgereinigt und mit ER-Donormembranen inkubiert. Mittels Western-Blot-Analyse konnte Gsf2 in COPII Vesikeln nachgewiesen werden. Das Vorhandensein eines klassischen Rücktransport-Motivs (KKSN) am C-Terminus von Gsf2 weist zudem daraufhin, dass das Protein über den retrograden Transportweg [COPI] zurück zum ER transportiert wird. Durch die Blockade des retrograden Transportweges mit anschließender Lokalisationsuntersuchungen mittels Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation und Fluoreszenzmikroskopie konnte eine Fehlverteilung von Gsf2 an der Plasmamembran festgestellt werden. Somit wird Gsf2 möglicherweise über den retrograden Transportweg recycelt. Postuliert wird ein Modell bei dem Gsf2 für die Aufkonzentration spezifischer Cargomoleküle [Hxt1] an ER-Exit-Sites zuständig ist und deren Verpackung in COPII Vesikel gewährleistet. Anschließend wird es über den retrograden Transportweg zurück zu ER transportiert.
Protein S-100B als Serummarker der zerebralen Schädigung bei pädiatrischen Schädel-Hirn-Verletzungen
(2009)
Protein S-100 ist ein Calcium-bindendes Protein, das die Aktivität seiner Zielproteine moduliert. Der Aufgabenbereich umfasst die Regulation von Zellwachstum und Zellstrukturbildung. Entdeckt wurde es im Jahre 1965 von B.W. Moore, der es erstmals aus Rinderhirn isolierte. Seinen Namen erhielt es aufgrund seiner Löslichkeit in 100% gesättigtem Ammoniumsulfat bei neutralem ph-Wert. Protein S-100 besteht aus mehreren Untereinheiten, von denen S-100B nur im Hirngewebe vorkommt, hauptsächlich im Zytosol von Gliazellen. Bei astroglialer Zerstörung und konsekutiver Störung der Blut-Hirn-Schranke können erhöhte Konzentrationen von Protein S-100B im Serum gemessen werden. Durch seine spezifische Herkunft besitzt Protein S-100B einen potentiellen Wert als biochemischer Marker einer strukturellen Hirnschädigung. Ziel dieser Studie ist die Überprüfung des posttraumatischen Protein S-100B Serumspiegels bezüglich seiner Korrelation mit dem Schweregrad kindlicher Schädel-Hirn-Verletzungen und deren Prognose. In Form einer prospektiven Studie wurden insgesamt 45 Kinder (23 Jungen und 22 Mädchen) zwischen 4 Monaten und 17 Jahren (Mittelwert 7,64 Jahre) mit Hirnverletzungen unterschiedlicher Schweregrade untersucht, bei denen innerhalb der ersten 20 posttraumatischen Stunden mittels eines immunoluminometrischen Assays die Protein S-100B Serumkonzentration bestimmt wurde. Der Normalbereich für Protein S-100B liegt bei < 0,15 µg/l. Werte zwischen 0,15 und 0,5 µg/l gelten als leichtgradig erhöht, Werte über 0,5 µg/l als deutlich erhöht. Die S-100B-Werte wurden mit den klinischen Daten und dem posttraumatischen Outcome (Nachbeobachtungszeit mindestens 6 Monate) korreliert. Die statistischen Signifikanzberechnungen erfolgten mittels des Fisher-Exact-Tests.Die gemessenen S-100B Werte lagen zwischen 0,05 und 3,05 µg/l (Mittelwert 0,46 µg/l). Die mittlere Latenzzeit der posttraumatischen Protein S-100B Bestimmung betrug 5 Stunden. 38 % der Kinder zeigten leichtgradige Erhöhungen (>= 0,2-0,5 µg/l), 29 % deutliche Erhöhungen (> 0,5 µg/l). Niedrige Punktwerte in der initialen Glasgow-Coma-Scale (GCS) bedeuteten im Mittel höhere Werte für Protein S-100B. Ein initialer GCS-Wert von unter 8 ging in allen Fällen mit S-100B Werten über 0,5 µg/l einher (p=0,005). In Fällen ohne Verlust des Bewusstseins, bzw. maximal einer leichten Eintrübung des Bewusstseins (Lange-Cosack I-II) lagen die S-100B Werte im Mittel niedriger als bei Vorliegen eines Bewusstseinsverlustes (III-IV). Ein Bewusstseinsverlust ging immer mit einem S-100B Wert von mindestens 0,2 µg/l einher (p=0,04), meist lag der Wert über 0,5 µg/l (p=0,015). 25 Kinder erhielten eine Computer- und /oder Magnetresonanztomographie. Hier zeigten sich erhöhte S-100B Werte vor allem bei schweren Kontusionen und Subduralblutungen. Den höchsten Wert (3,05 µg/l) wies ein Kind mit ausgedehnten diffusen axonalen Verletzungen auf. Bei 38 der 45 Patienten konnte nach einer durchschnittlichen Nachbeobachtungszeit von 27,5 Monaten das neurologische Outcome (Glasgow Outcome Scale, GOS) erhoben werden. 8 Kinder (21 %) wiesen neurologische Residuen auf, vor allem Koordinationsstörungen und Verlangsamungen im Sinne eines Psychosyndroms, 1 Kind verstarb im Akutverlauf an einem malignen Hirnödem. Die Kinder mit posttraumatischen Residuen / Behinderungen wiesen im Mittel tendenziell höhere Werte für Protein S-100B auf. Die unterschiedlichen Beschwerdebilder und Residualzustände nach leichten und schweren Schädel-Hirn-Verletzungen lassen sich anhand der etablierten klinischen, neurophysiologischen und neuroradiologischen Prognosemarker bislang nur bedingt vorhersagen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen gute Korrelation des Serum S-100B Wertes mit der Schwere und Dauer der initialen Bewusstseinsstörung sowie dem Ausmaß der hirnparenchymatösen Läsionen. Die Aussagekraft bezüglich des posttraumatischen Outcomes ist aufgrund der Fallzahl und der zu einem großen Teil einbezogenen leichten Schädel-Hirn-Verletzungen begrenzt. Die Untersuchungsergebnisse unterstützen die bei Erwachsenen erhobenen Daten und zeigen, dass Protein S-100B auch im Kindesalter einen viel versprechenden Parameter zur Objektivierung einer akuten Hirnschädigung darstellt und bereits zu einem frühen posttraumatischen Zeitpunkt einen Beitrag zur Beurteilung des Schweregrades und der Prognose von Schädel-Hirn-Verletzungen leisten kann. Der posttraumatische Protein S-100B Serumwert bringt hier als biochemischer Marker eine zusätzliche Information und kann so bei der Einschätzung und Initiierung von diagnostischen, therapeutischen, rehabilitativen und Follow-up-Maßnahmen hilfreich sein.
Benzodiazepine stehen in den Medikamentenmissbrauchslisten an erster Stelle und sind deswegen auch von Interesse in der Kriminalistik. Grundlage der vorliegenden Arbeit war die Analyse sämtlicher Benzodiazepin-Fälle, die in den Jahren 1998 bis 2003 im Institut für Forensische Toxikologie, Zentrum der Rechtsmedizin der Johann Wolfgang Goethe Universität in Frankfurt am Main untersucht wurden. Zur Auswertung kamen insgesamt 2695 Fälle, wobei das Hauptaugenmerk auf die 410 Personen gelegt wurde, bei denen Flunitrazepam nachgewiesen werden konnte. Anhand der gesammelten Daten war es möglich, Flunitrazepam unter verschiedenen Gesichtspunkten zu betrachten: 1. Welche Bedeutung hat Flunitrazepam in der Gruppe der Benzodiazepine und kann man im Laufe der Jahre Änderungen im Konsummuster feststellen? 2. Wie ist die Geschlechtsverteilung? 3. Gibt es im Untersuchungszeitraum monokausale Flunitrazepam – Todesfälle? 4. Lassen sich anhand des Vergleichs zwischen Flunitrazepam und Diazepam Unterschiede im Beigebrauch feststellen? 5. Lassen sich anhand des Vergleichs zwischen Flunitrazepam und Benzodiazepinen-Gesamt Unterschiede in der Deliktart feststellen? 6. Gibt es einen Zusammenhang zwischen Konzentration und Deliktart? 7. Welche Bedeutung hat Flunitrazepam in der Drogenszene? Die Auswertung der Daten erbrachte folgende Resultate: 1. Der Pharmakonzern Hofmann La-Roche führte an seinem Produkt Rohypnol® einige Veränderungen durch, um den zunehmenden Missbrauch zu verhindern. 1994 wurde die Darreichungsform von 2 mg auf 1 mg reduziert und 1998 wurde der Farbstoff Indigocarmin hinzugefügt. Von Interesse bei der Analyse der Daten war, ob sich diese Änderungen auf den Konsum von Flunitrazepam auswirkten. Aus diesem Grund wurde zusätzlich noch eine Auswertung über die Benzodiazepinverteilung der Jahre 1993 bis 1997, in denen insgesamt 1630 Benzodiazepin-Fälle registriert wurden, durchgeführt. Bei der Analyse der Benzodiazepinverteilung konnte in den Jahren 1993 bis 1997 und 1998 bis 2003 ein ständiger Zuwachs der Gesamtbenzodiazepin-Fälle festgestellt werden. Dieser Zuwachs ist auf den Anstieg der Untersuchungszahlen im Institut zurückzuführen. Jedoch ließen sich bei den Flunitrazepam-Fällen, gerade in den Jahren 1994 und 1998, Abweichungen im Konsumverlauf feststellen, welche auf die Veränderungen des Pharmakonzerns zurückzuführen sein könnten. Bei den Fragebögen, die mit 15 Schwerstabhängigen aus der Frankfurter Drogenszene durchgeführt wurden, kam es zu folgenden Ergebnissen: nach 1994 wurde der Konsum erhöht, nach 1998 gab es bei den meisten entweder gar keine Veränderung oder die Tabletten wurden anfangs vermehrt oral konsumiert. 2. Aufgrund der Kriminalitätsrate mit überwiegend männlicher Beteiligung lag der Frauenanteil der erfassten Personen bei nur etwa 1/5 (Benzodiazepine-Gesamt: 21,8%, Flunitrazepam: 15,9%). 3. Während des Untersuchungszeitraums konnten keine „reinen“ Flunitrazepam –Todesfälle festgestellt werden. 4. Im Vergleich der Cobefunde waren die Substanzen THC, Morphin, Codein und Methadon in der Diazepam-Gruppe häufiger anzutreffen als in der Flunitrazepam-Gruppe. Lediglich Kokain wurde in der Flunitrazepam-Gruppe vermehrt konsumiert. 5. Als führende Deliktart konnten in der Flunitrazepam-Gruppe die Eigentumsdelikte ermittelt werden. In der Benzodiazepin-Gruppe kam es am häufigsten zu Verkehrsdelikten. 6. Die höchsten Flunitrazepam - Konzentrationen im Blut wurden ebenfalls bei den Eigentumsdelikten gefunden. 7. Aufgrund seiner stärkeren euphorisierenden und hypnotischen Wirksamkeit steht Flunitrazepam in der Frankfurter Drogenszene an erster Stelle unter den Benzodiazepinen. Das Erleben eines Rauschzustandes als Euphorie, als ein unendliches und allumfassendes Glücksgefühl, ist ein - vorrangig bei uns Menschen - bestehendes Phänomen. Den Drang dieses Gefühl zu erleben und beizubehalten gab es seit jeher und wird es auch immer geben werden. Übermäßiges Verlangen und das Nachgeben dieses Impulses führen zu Abhängigkeit und Sucht. Die aus diesem Zustand resultierenden sozialen Auswirkungen äußern sich in Dissozialität und Kriminalität. „Ein süchtig gewordener hat nur eine fixe Idee: das Gift! Seine Sucht treibt ihn zur Unehrlichkeit und zu Verbrechen“ (Georg Siegmund, 1962). Sucht und Abhängigkeit sind Tatsachen die sich nicht verleugnen lassen. Um den Missbrauch eines Medikamentes verhindern zu können, genügt es nicht, nur seine Form zu verändern, es bedarf vielmehr einer umfangreicheren Aufklärung und einer generell bewussteren Umgangsweise mit potentiell suchterzeugenden Substanzen.
Asthma bronchiale bezeichnet eine chronisch entzündliche Erkrankung der Atemwege, wobei die milden Verlaufsformen die höchsten Prävalenzen haben. Außer den antiinflammatorisch wirksamen Substanzgruppen (Glucocorticoide, Leukotrien-Rezeptor-Antagonisten) stellt eine Nahrungsergänzung mit n3-PUFA eine interessante Behandlungsalternative dar. Ziel dieser Studie war es, den Einfluss von n3-PUFA speziell auf die allergische Entzündung von milden Asthmatikern (n=23) zu untersuchen. Als primärer Wirkparameter wurde das eNO, ein spezifischer und sensibler Marker der allergischen Entzündung in den Atemwegen allergischer Asthmatiker untersucht. Die Patienten bekamen fünf Wochen lang entweder n3-PUFA (450 mg EPA und 180 mg DHA pro Tag) oder Plazebo als Nahrungsergänzung. Nach einer dreiwöchigen Aufsättigungsphase wurden die Patienten zwei Wochen lang mit einer niedrigen Dosis Hausstaubmilbenallergen provoziert, an jedem Termin wurde die Konzentration des eNO gemessen. Es war deutlich zu erkennen, das in der n3-PUFA-Gruppe die Entzündung weniger stark ausgeprägt war (Visite 6 Mittelwert Plazebo 153,7±21,1 ppb, n3-PUFA 91,8±16,7 ppb; p= 0,03 und Visite 7 Mittelwert Plazebo 117,4±18,8 ppb, n3-PUFA 68,1±11,4 ppb p=0,03). In der zweiten Provokationswoche kam es in beiden Gruppen zu einem weiteren Anstieg des eNO, in der n3-PUFAGruppe waren dir Werte jedoch durchweg niedriger. In der Studie konnte gezeigt werden, dass auch niedrig dosierte n3-PUFA einen positiven Effekt auf die allergische Entzündung in den Atemwegen allergischer Asthmatiker hat. Die eNO Werte waren in der n3-PUFA-Gruppe Studie durchgehend niedriger als in der Plazebo-Gruppe. Die Einnahme von n3-PUFA könnte bei milden Asthmatikern durchaus einen Therapie-Unterstützenden Effekt aufweisen, so dass unter Therapie mit den gängigen Asthma-Medikamenten, diese durchaus in einem gewissen Maße eingespart werden könnten.
Asthma bronchiale ist eine obstruktive Lungenerkrankung, die mit einer Hyperreagibilität der Atemwege verbunden ist, ausgelöst durch eine Vielzahl von Stimuli. Es stellt die häufigste chronische Erkrankung im Kindesalter dar, ist jedoch bei Säuglingen und Kleinkindern nur schwer zu diagnostizieren. In diesem Alter stellen sehr häufig rezidivierende, teilweise durch (Virus-) Infekte ausgelöste obstruktive Bronchitiden die ersten Symptome eines Asthma bronchiale dar. In der vorliegenden Arbeit wurde an einem Patientenkollektiv von 172 Säuglingen und Kleinkindern (m:w = 115:57; Alter in Monaten = 13,1+/-11) mittels Bodyplethysmographie und Metacholin-Provokation untersucht, wie häufig einer rezidivierend obstruktiven Symptomatik eine bronchiale Hyperreagibilität (BHR) zugrunde liegt, und ob Kinder mit Risikofaktoren für ein Asthma bronchiale Unterschiede in der Lungenfunktion oder in der Reaktion auf eine Metacholin-Provokation zeigen im Vergleich zu Kindern ohne vorbestehende Risikofaktoren. Als Risikofaktoren galten Atopie, Allergie (erhöhte eosinophile Leukozyten, erhöhte IgE-Werte, positiver RAST) sowie eine Passivrauch-Exposition durch Tabakrauch der Eltern, die anhand eines Fragebogens ermittelt wurden. Insgesamt reagierten 26 der 108 Kinder mit RAST (24,1%) leicht- bis hochgradig, aber nur 14 der 108 Kinder (13,0%) mittel- bis hochgradig hyperreagibel, wobei ein Anstieg des Atemwegswiderstandes von mindestens 80% des Ausgangswertes, ein Abfall der Sauerstoffsättigung unter 95% sO2 oder eine klinische Symptomatik in Form von Husten und / oder Giemen, bzw. die Erfüllung mehrerer Kriterien als positive Reaktion gewertet wurde, gemäß den PD20-Leitlinien abhängig von der verabreichten Metacholin-Dosis. Hierbei zeigten Kinder mit atopischer Dermatitis tendenziell häufiger eine mittel- bis hochgradige BHR als das Vergleichskollektiv (mittel- bis hochgradige BHR: Kinder ohne Risikofaktoren= 14,1%; Kinder mit Atopie= 20,8%). Weitere Zusammenhänge zwischen Risikofaktoren für ein Asthma bronchiale und eine BHR konnten nicht festgestellt werden. Auch fand sich zwischen Tabakrauch-Exposition (exponierte Kinder: n=36; nicht exponierte Kinder: n=102) und der BHR keine Beziehung. Unsere Untersuchungen belegen, dass eine mittel- bis hochgradige Hyperreagibilität im Sinne eines Asthmasyndroms nur bei einem geringen Anteil (13,0%) der Kinder mit obstruktiven Bronchitiden nachweisbar ist. Entsprechend kritisch sollte der Einsatz von inhalativen Steroiden bei Kindern mit obstruktiven Zeichen gestellt werden.
Das Ziel dieser Studie war die Etablierung von Grenzwerten für die bronchiale Methacholinprovokation durch Vergleich des Aerosol Provokation Systems (APS-SC) mit einem ATS Standard (five-breath dosimeter method, SDM). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die APS-SC Methode unter Verwendung eines Kurzprotokolls und des Systems der Firma Cardinal Health eine sichere, schnelle und verlässliche Methode der bronchialen MCP darstellt. Im Schnitt erspart dieses Verfahren acht Minuten gegenüber der klassischen SDM gemäß dem von der ATS empfohlenen „short five breath dosimeter protocol“. Zudem entfallen in der Vorbereitung das Herstellen und die Lagerung mehrerer unterschiedlich konzentrierter Methacholinlösungen; während der Untersuchung existiert daher auch kein Verwechslungsrisiko. Der Test selbst ist für Untersucher und Patient weniger belastend. Die Verwendung einer Konzentration von 16,00 mg/ml für die Methacholin-Testlösung stellt einen guten Mittelweg zwischen akzeptablen Inhalationszeiten innerhalb der Stufen und einer nicht zu aggressiven Konzentration dar, mit der vom Anfang eines Tests bis zu seinem Ende gearbeitet werden kann. Zwischen den Kategorien der BHR für die SDM- und die APS-SC Methode besteht ein enger Zusammenhang. Als Grenzwert für die Annahme einer BHR – definiert als diejenige Methacholindosis bzw. -konzentration, die zu einem Abfall der FEV1 um 20 % vom Ausgangswert führt – stimmt der bestehende und von der ATS publizierte Grenzwert von 8,00 mg/ml am besten mit einer Dosis von 1,00 mg Methacholin in der APS-SC Methode überein.
Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde zunächst eine sensitive Nachweismethode für HPV aus Biopsien etabliert. Auch der Nachweis aus Abstrichen ist möglich, hierbei muss aber darauf geachtet werden, dass genügend Zellmaterial gewonnen wird. Hierzu eignen sich Bürstenabstriche, von Abstrichen mit Wattetupfern sollte Abstand genommen werden, da die Zellausbeute zu gering ist (siehe 4.1). Des Weiteren wurde das Vorkommen von HPV bei Tonsillitis, Tonsillen-CA und klinisch unauffälligen Tonsillen in unserem Patientengut verglichen. Aufgrund der geringen Patientenzahlen ist eine statistische Aussage nicht möglich, es zeigt sich aber, dass in jeder der Gruppen HPV nachgewiesen werden kann. Vergleicht man die beurteilbaren Ergebnisse der Gelelektrophorese, so zeigen sich 33% der Tumorproben HPV-positiv, bei den klinisch unauffälligen Tonsillen sind 60% positiv, bei den Tonsillitiden sogar fast 70%. Diese Ergebnisse zeigen, dass HPV nicht erst in Tumoren nachweisbar ist, sondern bereits in klinisch unauffälligen Geweben. Auch deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Infektion mit HPV wohl schon im Kindesalter erfolgt.
In jüngster Zeit werden vom humanen Immundefizienzvirus-1-abgeleitete lentivirale Vektoren auch in der Gentherapie eingesetzt. Obwohl diese Vektoren nicht-mitotische Zellen transduzieren können, sind sie für einen Gentransfer in primäre ruhende Zellen oft nicht geeignet. In der Abteilung „Medizinische Biotechnologie“ des Paul-Ehrlich-Insituts wurde ein vom simianen Immundefizienzvirus SIVsmmPBj-abgeleiteter lentiviraler Vektor entwickelt, welcher im Gegensatz zu HIV-1-abgeleiteten Vektoren effizient in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte humane Fibroblasten und humane primäre Monozyten transduzieren kann (Mühlebach et al., 2005). Im dieser Arbeit wurde das Potenzial dieses neuen Vektors für mögliche Anwendungen in der Gentherapie untersucht, indem seine Transduktionsfähigkeit für weitere primäre Zellen bestimmt wurde. Dabei waren humane hämatopoetische Stammzellen von besonderem Interesse, da sie die Vorläuferzellen aller Zellen des Blutes sind und die Eigenschaft zur Selbsterneuerung besitzen. Die Effizienz des Gentransfers in unstimulierten Stammzellen mit dem SIVsmmPBj-Vektor war jedoch nicht höher als mit anderen lentiviralen Vektoren. Interessanterweise konnte aber ein Einfluss der lentiviralen Vektoren auf das in vitro-Differenzierungspotenzial der transduzierten Stammzellen in die verschiedenen Vorläuferzellen beobachtet werden: Nach Transduktion mit dem SIVsmmPBj- und einem HIV-2-abgeleiteten Vektor differenzierten die Stammzellen bevorzugt in granulozytäre Vorläuferzellen, während die Transduktion mit einem HIV-1-abgeleiteten Vektor die Anzahl aller Vorläuferzellen deutlich reduzierte und insbesonders die Differenzierung in Makrophagenvorläuferzellen verminderte. Zur Untersuchung ihres Differenzierungs-potenzials in vivo wurden transduzierte hämatopoetische Stammzellen zur Repopulierung des Knochenmarks von NOD/SCID-Mäusen eingesetzt. Hierbei wurde jedoch kein Einfluss der verschiedenen lentiviralen Vektoren auf die Differenzierung der Stammzellen beobachtet. Allerdings konnte nur in einem sehr geringen Anteil der transplantierten Zellen eine Expression des übertragenen Gens nachgewiesen werden, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass die transduzierten Zellen die Fähigkeit zur Repopulierung verloren hatten. Insgesamt ist jedoch zu sagen, dass entgegen der Erwartungen der neue Vektor keinen Vorteil gegenüber HIV-1-Vektoren zur Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen aufweist. Weiter wurde die Transduktionsfähigkeit des SIVsmmPBj-Vekors für humanen B-Lymphozyten, Makrophagen und dendritische Zellen untersucht. Auf ruhenden B-Lymphozyten besaß der SIVsmmPBj-Vektor keinen Transduktionsvorteil gegenüber einem HIV-1-abgeleiteten Vektor, während Makrophagen und dendritische Zellen mit signifikant höherer Effizienz transduziert werden konnten. Die hohe Transduktionseffizienz des SIVsmmPBj-Vektors für Monozyten und dendritische Zellen eröffnet die Möglichkeit einer Anwendung in der Immuntherapie, da dendritische Zellen die professionellsten und effektivsten Antigen-präsentierenden Zellen sind. Daher wurde die generelle Eignung des SIVsmmPBj-Vektors für immuntherapeutische Anwendungen untersucht. Ein Tumor-assoziiertes Antigen (Mart-1) wurde in Monozyten übertragen und die transduzierten Zellen zu reifen dendritischen Zellen maturiert. Diese Zellen besaßen die Fähigkeit, Antigen-spezifische zytotoxische T-Zellen zu generieren, deren Funktion durch Sekretion von Zytokinen, in Einzelfällen auch durch spezifische Lyse von Mart-exprimierenden Tumorzellen nachgewiesen wurde. Weiterhin wurde gezeigt, dass nach Transduktion von Monozyten und deren Differenzierung zu Makrophagen auch diese prinzipiell in der Lage sind, Antigen-spezifische zytotoxische T-Zellen zu generieren. Obwohl hier keine vergleichenden Untersuchungen zur Effizienz des T-Zell-Primings durchgeführt werden konnten, ist die prinzipielle Eignung des SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektors für eine Immuntherapie damit nachgewiesen. Schließlich wurde untersucht, ob die Maus oder nicht-menschliche Primaten als Tiermodelle für eine mögliche Weiterentwicklung des Vektors in Frage kommen. Murine Monozyten konnten jedoch nicht effizient transduziert werden. Hingegen erwies sich der SIVsmmPBj-Vektor als gut geeignet zur Transduktion von simianen Monozyten, so dass ein Affenmodell für Anwendungen des SIVsmmPBj-Vektors, wie beispielsweise zur Tumor-Immuntherapie oder für Vakzinierungsstudien, in Frage kommt.
Humane endogene Retroviren (HERVs) sind Relikte von Infektionen der Keimzellen von Primatenvorläufern mit exogenen Retroviren vor 40 Millionen Jahren. Die meisten HERV Elemente sind defekt durch die Akkumulation von Mutationen, Deletionen und Rearrangements. Lediglich einige Proviren der HERV-K/HML-2 Familie enthalte noch offenen Leserahmen für alle retroviralen Proteine. Die Expression repetitiver endogener Elemente wird in somatischen Zellen unterdrückt. Transkription und Translation von HERV-K Genprodukten tritt in Keimzelltumoren, Melanomen und Eierstockkrebs auf. In der vorliegenden Arbeit wurde die HERV-K exprimierende Melanomlinie UKRV Mel 2-C9 etabliert und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die HERV-K Expressionen durch die dominante Aktivität des Provirus 108 bedingt ist. Die Expression und korrekte Prozessierung der viralen Proteine konnte nachgewiesen werden. Durch Elektronenmikroskopie wurde bestätigt, dass HERV-K 108 virale Partikel mit charakteristischen Strukturen der Hüllproteine produziert. Diese Partikel enthalten virale Volllängen RNA-Genome. Da HERV-K 108 in der Linie UKRV Mel 2-C9 eine Mutation im aktiven Zentrum der Reversen Transkriptase zeigt, sind die Partikel nicht infektiös. Um Einblicke in die der HERV-K Expression in Keimzelltumoren und Melanomen zu Grunde liegenden transkriptionellen Regulationsmechanismen zu erhalten, wurden mittels 5’ und 3’ RACE (rapid amplification of cDNA ends) der Transkriptionsstart und die Terminationsstelle bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass der HERV-K Promotor in den untersuchten Zelllinien TATA-unabhängig agiert obwohl die HERV-K LTR (long terminal repeat) ein TATA-Motiv aufweist. Die transkriptionelle Aktivität des HERV-K Promotors ist abhängig von einer GC-Box in unmittelbarer Nähe zu einem Initiatorelement am Startpunkt der Transkription. Das GC-Sequenzmotiv ist die Bindestelle für die Transkriptionsfaktoren SP1 (specific protein) und SP3. Mutationen des Bindemotivs führten zu einem drastischen Abfall der Promotoraktivität im Luziferaseassay. Durch Proteinknockdown mittels spezifischer siRNA gegen SP1 und SP3 konnte die Promotoraktivität ebenso deutlich reduziert werden. Elektrophoretic mobility shift assays und Chromatinimmunopräzipitationen bestätigten eine Bindung von SP1 und SP3 an die HERV-K LTR. Die Transkriptionsfaktoren SP1 und SP3 sind an der Initiation der basalen Transkription von HERV-K maßgeblich beteiligt.
The pictorial art of the Church, as a spiritual product of the Christian civilisation, has continually received great influences from its ecclesiastical tradition and it was defined by its formal aesthetical standards and its iconographic preferences. A more nuanced reading of the parallels can be attained by placing the images in their visual context, which would allow a better appreciation of the meanings within. The biblical story of Adam and Eve, which is the theme of the following thesis, reflects the differentiation between the Eastern and the Western understanding of the events of the history of the holy Oikonomia, a point, which is the major ground for the development of the relative pictorial motifs. The protoplasts are the protagonists from their creation and life in paradise, the fall and expulsion until their resurrection through Christ. Their story is visualised in a number of scenes and episodes, having thus their original sin and resurrection for specific reasons centralised. This doctoral thesis attempts to collect as many parallels of the scenes is possible, trying to collate the Eastern with the Western visual approach in a deductive way, in order to reach our constructive conclusions and make available the combination of the art, theology and liturgy in the scenes of Adam and Eve in Genesis and in Resurrection (Anastasis). The reading we tried to perform was based upon the specific iconographical elements, which were worth to be commented. Our aim was to detect the direct bond between the production of art and the relevant patristic and apocryphal writings or even the theological theories, by quoting texts from the ecclesiastical literature, as well as the liturgical praxis.
Streptomyces coelicolor ist der Modellorganismus der GC reichen, Gram+ Actinomyceten, die mehr als zwei Drittel aller bekannten Antibiotika produzieren. Phänotypisch zeichnet er sich durch die Bildung eines Substrat- und eines Luftmyzels aus, welches im Laufe der weiteren Differenzierung Sporen bildet. Streptomyceten produzieren neben Antibiotika noch eine Vielzahl biotechnologisch interessanter Metaboliten. Der komplexe Lebenszyklus und Stoffwechsel erfordern eine genaue Regulation der Genexpression. Die letzten Jahre haben gezeigt, dass neben Proteinen auch die RNA eine regulatorische Funktion hat. Verschiedene regulatorisch aktive RNA Elemente wie Riboswitche, RNA-Thermometer und kleine nicht kodierende RNAs (small noncoding RNAs – sRNAs) wurden identifiziert. sRNAs wirken meist als antisense Riboregulatoren, indem sie ihre Ziel-mRNA binden und dadurch die Translation hemmen oder fördern. In dieser Arbeit wurden verschiedene bioinformatische Methoden verwendet, um sRNAs im Genom von S. coelicolor vorherzusagen. Es wurden Terminatorstrukturen und konservierte Sekundärstrukturen in den intergenen Regionen vorhergesagt, die keinem Gen zuzuordnen waren. In einem weiteren Ansatz wurden Bindestellen des Regulatorproteins DasR vorhergesagt, um DasR kontrollierte sRNAs zu identifizieren. Zusätzlich wurde mittels 454 Sequenzierung erstmalig das Transkriptom von S. coeliocolor analysiert. Auf diese Weise konnten etwa 500 sRNAs vorhergesagt werden. Eine der beiden charakterisierten sRNAs, sc32, ist 139 nt lang. Ihr Promoter liegt im kodierenden Bereich des Gens bldC und sie wird spezifisch durch Kälteschock induziert. Die zweite charakterisierte sRNA, sc1, ist 159 nt lang und in allen sequenzierten Streptomyceten konserviert. Ihre Expression wird nur bei Stickstoffmangel in der Stationärphase reprimiert. Durch molekularbiologische Analysen konnte ein Zielgen von sc1 identifiziert werden, die extrazelluläre Agarase DagA. Es konnte gezeigt werden, dass sc1 an die dagA-mRNA bindet und dadurch die Translation inhibiert. Als zweites mögliches Ziel von sc1 konnte die Histidinkinase SCO5239 identifiziert werden. Hier wurde gezeigt, dass Koexpression von sc1 die Expression einer SCO5239 Reportergenfusion um den Faktor acht steigert. Durch Analyse des Proteoms von sc1 Mutanten, konnte die differenzierte Expression von elf weiteren Proteinen gezeigt werden. Sc1 scheint als Regulator zu agieren, indem es auf die Stickstoffversorgung der Zelle reagiert und den Sekundärmetabolismus deaktiviert.
In Deutschland sind humane Hantavirusinfektionen bereits seit den 1980er Jahren bekannt. Hantaviren werden von persistent infizierten Nagetieren auf den Menschen übertragen und verursachen das Hämorrhagische Fieber mit Renalem Syndrom (HFRS). Das Puumala Virus (PUUV) ist für die Mehrzahl der Hantavirusinfektionen in Deutschland verantwortlich und verursacht eine mildere Form des HFRS, die als Nephropathia Epidemica (NE) bezeichnet wird. Bekannte Endemiegebiete sind die Schwäbische Alb (Baden-Württemberg) und Unterfranken (Bayern). Während in den Jahren 2001-2004 und 2006 die Zahl der registrierten Fälle in Deutschland bei 70-240 lag, gab es in den Jahren 2005 und 2007 einen dramatischen Anstieg der Hantavirusinfektionen auf 448 (2005) und 1688 (2007) Fälle. Die am meisten betroffenen Regionen lagen in den Gebieten Bayerischer Wald, Schwäbische Alb, Spessart, dem Münsterland sowie im Süden und Westen Deutschlands. Um die verursachende Mäusespezies zu identifizieren, wurden im Rahmen unserer Studie 108 Kleinsäuger in Unterfranken und der Eifel gefangen. Durch serologische und genetische Untersuchungen konnte bestätigt werden, dass das PUUV in den untersuchten Nagetierpopulationen das dominante Virus darstellt. Ein weiteres Ziel dieser Studie war es, die RNA-Sequenzen der Hantaviren zu identifizieren und zu charakterisieren, die für die zunehmende Zahl der Infektionen mit "Nephropathia epidemica" in Unterfranken und der Eifel verantwortlich waren. Es zeigt sich, dass PUUV-S-Segment-Sequenzen von Nagetieren aus einer Region nur geringe Divergenzen untereinander zeigen (bis zu 6%). Im Gegensatz dazu weisen die untersuchten Sequenzen eine hohe Divergenz von 17-18% zu Sequenzen aus Belgien oder Schweden auf. Interessanterweise unterscheiden sich die identifizierten Sequenzen aus Unterfranken (Laufach) auch deutlich von anderen deutschen Sequenzen wie zum Beispiel Sequenzen aus Bayern (Divergenz von 9%). Die identifizierten Sequenzen clustern somit deutlich als eigene PUUV-Sublinie, die wahrscheinlich für den massiven Anstieg der Hantavirusinfektionen im Jahr 2007 verantwortlich war.
Zahlreiche prognostische und prädiktive Multigensignaturen sind bisher für Mammakarzinom-Patientinnen generiert worden. Die Einschätzung der individuellen Prognose ist für eine optimale Therapieentscheidung wesentlich. Die Auswahl einer spezifischen Therapie ist grundsätzlich durch die empirische Datenlage bestimmt, obwohl bereits zahlreiche prädiktive Gensignaturen existent sind. In diesem Zusammenhang wäre es hilfreich, wenn spezifische Signaturen sowohl zur Abschätzung der Prognose als auch zur Prädiktion des Therapieansprechens gleichzeitig genutzt werden könnten. Um die prognostische und prädiktive Wertigkeit bereits publizierter Gensignaturen an einem unabhängigen, einheitlich behandelten Kollektiv zu untersuchen, wurden von 111 tiefgefrorenen Tumorproben, die an der Uniklinik Frankfurt im Rahmen des Mammakarzinom-Primäreingriffes gewonnen wurden, n=48 Proben in die Analyse eingebracht, da alle eine adjuvante anthrazyklinhaltige Chemotherapie erhalten haben, und eine ausreichende RNA-Menge vorlag, um eine Genexpressionsanalyse durchführen zu können. Für die Genexpressionsanalyse wurde der Affymetrix HgU133 Genchip (22.500 probe sets) verwendet. Von diesen Patientinnen wurde der postoperative Krankheitsverlauf (Ereignisstatus) sowie das Profil an histopathologischen Standardparametern ermittelt. Der mediane Nachbeobachtungszeitraum betrug 37 Monate (Range 5 - 87 Monate). Bei 23 % der Patientinnen wurde nach Therapie ein Rezidiv festgestellt. Dieses Kollektiv unterschied sich hinsichtlich des Outcome und des Profils an histopathologischen Markern nicht signifikant vom Gesamtkollektiv. Zur Kontrolle der Messergebnisse wurden die Genexpressionswerte für ER-, PR- und Her-2-Status mit den entsprechenden immunhistochemisch bestimmten Status verglichen. Der Genexpressionsstatus des Proliferationsmarkers Ki67 wurde mit dem immunhistochemischen ER-Status und pathohistologischen Grading korreliert. Dabei zeigten die Genexpressionswerte bezüglich ER, PR und Her-2 im Vergleich zur immunhistochemisch bestimmten Proteinexpression eine hohe Konkordanz. Die Bestimmung des Proliferationszustands mittels Genexpression von Ki67 wies eine signifikante Korrelation mit dem ER-Status (p = 0,040, Mann-Whitney-U-Test) und dem pathohistologischem Grading auf (p = 0,005, Kruskal-Wallis-Test). Die Tumorproben wurden entsprechend ihrer Expressionsmuster nach 4 prognostischen und 2 prädiktiven bereits publizierten Gensignaturen eingeteilt und mit Standardparametern wie histologischer Subtyp, Tumorgröße, Nodalstatus, histopathologisches Grading, sowie dem Östrogenrezeptorstatus und Her-2-Status verglichen. Die einzelnen histopathologischen Marker und die Expressionsmuster der prognostischen und prädiktiven Gensignaturen wurden mit dem postoperativen Krankheitsverlauf der Patientinnen korreliert. Der Ereignisstatus der Patientinnen korrelierte mit dem T-Stadium (p = 0,04), dem Alter bei OP (p = 0,05) und dem Lymphknotenstatus (p = 0,016). Keine der 6 verschiedenen Signaturen war in der Lage, den Ereignisstatus der Patienten ausreichend vorherzusagen. Die hauptsächlich diskriminierenden Eigenschaften der Signaturen basieren auf dem ER-Status und zu einem gewissen Maße auf dem pathohistologischen Grading. Beim Vergleich der Expressionsmuster der Gensignaturen untereinander zeigte sich eine Korrelation der prognostischen Amsterdam- sowie Rotterdam-Signaturen, als auch der prädiktiven Signaturen von Rody et al und Hess et al mit der Genomic Grade-Signatur, welche den Proliferationsstatus von Mammakarzinomgewebe charakterisiert. In dieser Arbeit konnte schließlich an einem kleinen, einheitlich behandelten Patientenkollektiv gezeigt werden, dass prognostische und prädiktive Gensignaturen nicht in der Lage sind, den Krankheitsverlauf ausreichend vorherzusagen. Die wesentlichen Einflussgrößen für alle Signaturen sind der ER-Status und die Proliferation. Die Wertigkeit der jeweiligen Signaturen ist offenbar ausschließlich auf die spezifische therapeutische Situation beschränkt, für die sie identifiziert wurden.
Mechanistische Untersuchungen zur Modulation der zytosolischen Phospholipase A2 durch Hyperforin
(2009)
Aus der Familie der Phospholipasen A2 nimmt die zytosolische Phospholipase A2 (cPLA2) in der Bereitstellung von Arachidonsäure (AA) für die Produktion von entzündungsfördernden Eikosanoiden und Lysophospholipiden eine Schlüsselrolle ein. Inwieweit die Modulation dieses Enzyms zum antientzündlichen Wirkspektrum von Hyperforin beiträgt, war Gegenstand dieser Arbeit. Hyperforin als Bestandteil des Johanniskrauts greift auf vielfältige Art und Weise in Entzündungsprozesse ein und hemmt unter anderem die Aktivität der 5-Lipoxygenase und Cyclooxygenase-1 in mikromolaren Konzentrationen. Zur Erforschung der cPLA2 als weitere potentielle Zielstruktur wurden die Effekte Hyperforins auf frisch isolierte humane polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) und Thrombozyten untersucht. Dabei ergaben sich erstaunlich widersprüchliche Ergebnisse. Während in PMNL die A23187- und Thapsigargin-induzierte AA-Freisetzung potent unterdrückt wurde (IC50 = 1,5 bis 1,9 µM), konnte Hyperforin die cPLA2-Aktivität in Thrombozyten nach A23187-Stimulation nicht und nach Thrombin-Induktion nur leicht beeinträchtigen. Hingegen resultierte aus der Behandlung von Thrombozyten mit 10 µM Hyperforin eine 2,6- bzw. 8,1-fache Steigerung der AA-Freisetzung und 12-Hydro(pero)xyeikosatetraensäure(H(P)ETE)-Produktion, die von einer Translokation der cPLA2 an die Plasmamembran begleitet war. In PMNL wurde eine Aktivierung der cPLA2 nicht beobachtet. Diese widersprüchlichen Befunde führten zu näheren mechanistischen Untersuchungen. Insbesondere der Einstrom von Ca2+, wie auch die Aktivierung von mitogenaktivierten Proteinkinasen (MAPK) tragen in PMNL und Thrombozyten zur cPLA2-Aktivierung bei. Allerdings konnte eine Beeinträchtigung dieser Signaltransduktionswege durch Hyperforin ausgeschlossen werden. In PMNL wird der durch A23187- oder Thapsigargin-induzierte Ca2+-Einstrom nicht inhibiert und die Aktivierung der entsprechenden MAPK konnte durch Hyperforin (bis zu 10 µM) nicht vermindert werden. In Thrombozyten wurde die Translokation der cPLA2 sowie die AA- und 12-H(P)ETE-Produktion durch die Chelatierung von extra- und intrazellulärem Ca2+ nicht gehemmt. Auch die Unterbindung der Phosphorylierung der cPLA2 durch Hemmung der MAPK-Aktivierung konnte die Aktivierung der cPLA2 nicht verhindern. In zellfreien Untersuchungen an aufgereinigtem Enzym zeigte Hyperforin weder hemmende noch aktivierende Effekte, wenn Liposomen aus 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylcholin (PAPC) eingesetzt wurden. Nach Einbau von Dipalmitoylphosphatidylinositol-4,5-diphosphat, 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycerol und Cholesterol in PAPC-Liposomen sowie gegenüber Lipid-Raft-Adaptionen (PAPC/Sphingomyelin/Cholesterol 1:1:1) zeigte Hyperforin allerdings inhibitorisches Potential (IC50 = 13,2 µM, 7,6 µM, 5,5 µM und 4,4 µM). Aktivierende Effekte des Hyperforins konnten in Abwesenheit von Ca2+ beobachtet werden, wenn cholesterolhaltige, Lipid-Raft-artige- oder 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phospatidylethanolamin(PAPE)-Vesikel eingesetzt wurden. 10 bis 30 µM Hyperforin erhöhten die AA-Freisetzung 3,3- bis 7,3-fach, wobei die Bindung des Enzyms an Liposomen mit Cholesterol und Lipid-Raft-Strukturen, aber nicht gegenüber dem PAPE-Substrat verstärkt war. Alle Effekte konnten durch die Zerstörung der Membranoberfläche und –struktur nach Zugabe von Triton-X-100 aufgehoben werden, wodurch die Bedeutung der Struktur der Lipidaggregate für die Hyperforinwirkung in den Vordergrund tritt. Darüber hinaus konnte die essentielle Rolle der vinylogen Carbonsäurestruktur des Hyperforins gezeigt werden, da ein O-Methylester des Hyperforins weder die Hemmung der cPLA2 in PMNL noch deren Aktivierung in Thrombozyten reproduzieren konnte und im Liposomenassay nur eine unspezifische Aktivierung der cPLA2 unabhängig von der Membranstruktur bewirkte. Neben der cPLA2-Aktivität wurde auch die Dichte der Liposomen abhängig von der Membranstruktur durch Hyperforin moduliert, allerdings konnten Änderungen der Membrandichte nicht mit Einflüssen auf die Enzymaktivität korreliert werden. Weiterhin wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Prof. Glaubitz, Universität Frankfurt, 1H-MAS-NMR-NOESY-Spektren von Liposomen aus 1-Palmitoyl(D31)-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholin mit integriertem Hyperforin aufgenommen. Das sich aus der Analyse der Spektren ergebende Modell postuliert die Lokalisation des sauerstoffreichen Bizyklus des Hyperforins im Kopfgruppenbereich der Lipide und eine Penetration der Isoprenylgruppen in die hydrophobe Schicht der Membranen. Die Ergebnisse dieser Arbeit in intakten Zellen und zellfreien Systemen verweisen somit auf komplexe Zusammenhänge, bei denen Interkalationen von Hyperforin mit speziellen Membranstrukturen im Vordergrund stehen. Die unspezifische Einlagerung der lipophilen Substanz Hyperforin in zelluläre Membrankompartimente könnte somit unter Umgehung der regulären Signaltransduktionswege zelltypabhängig die cPLA2-Aktivität modulieren.
In den Neurowissenschaften führt die Erforschung des vegetativen Nervensystem (VNS) immer noch ein Schattendasein. Einer der wichtigsten Teile des VNS, der Hirnstamm, ist dabei besonders schlecht erforscht, obwohl er die Steuerzentren für Herzschlag, Blutdruckregulation, Atmung, Verdauung, und viele weitere lebenswichtige Funktionen beherbergt. Ein wichtiger Grund für diesen Umstand ist, dass die funktionelle Kernspintomographie (fMRT) sich in ihrer bisherigen Form nur bedingt für Messungen im Hirnstamm eignet. Ziel dieser Arbeit war es daher, neue Ansätze zur fMRT-Messung vegetativer Zentren im menschlichen Hirnstamm zu entwickeln. Nach einer Einführung in die Neuroanatomie sowie die physikalischen und physiologischen Grundlagen der strukturellen und funktionellen MRT werden im mittleren Teil der Arbeit die Entwicklung sowie der Test neuer Ansätze zur Hirnstamm-fMRT beschrieben. Dabei untersucht der Autor zunächst, welche grundlegenden Probleme einer konventionellen fMRT-Messung im Hirnstamm entgegenstehen. Es stellt sich heraus, dass alle hirnstamm-spezifischen Störquellen direkt oder indirekt auf den Herzschlag zurückzuführen sind. Aus den vorhandenen Ansätzen zur Korrektur solcher Störungen wird die Herzschlag-Taktung ausgewählt. Bei diesem Verfahren erfolgt die Aufnahme der fMRT-Bilder zeitlich gekoppelt an dem Herzschlag des Probanden, um sämtliche kardiogenen Rauschquellen zu unterdrücken. Anstelle des häufig verwendeten, aber statistisch problematischen Guimaraes-Verfahrens zur Korrektur der durch die Herzfrequenzvariabilität bedingten Schwankungen des MR-Signals wird in der vorliegenden Arbeit der die sog. Dual-Echo-Bildgebung verwendet. Dabei wird die konventionelle EPI-Sequenz (echo-planar imaging) dahingehend erweitert, dass pro Bild anstelle eines Echos zwei aufgenommen werden. Durch Quotientenbildung der beiden Bilder kann so der fluktuierende Teil des Signals entfernt werden. Beim Vergleich verschiedener Varianten der Quotientenbildung stellt sich ein neu entwickelter, exponentieller Ansatz als überlegen heraus. Danach werden die Auswirkungen verschiedener Methoden der Bewegungskorrektur und Schichtorientierung verglichen, um das Optimum für Messungen im Hirnstamm zu ermitteln. Nach Tests des neuen Verfahrens an verschiedenen fMRT-Datensätzen werden Empfehlungen für die Kombination der verschiedenen Parameter gegeben. Es zeigt sich, dass die Standardabweichung der fMRT-Bilder mit der neuen Methode im unteren Hirnstamm um 13% - 33% reduziert werden kann. Ein Sensitivitätstest an motorischen Hirnstammkernen, welche durch ein motorisches Paradigma aktiviert werden, zeigt, dass die jeweiligen Kerne in 85% - 95% der Fälle eindeutig identifiziert werden können. Im dritten Teil der Arbeit erfolgt die Anwendung der neuen Methode auf die Messung von Aktivierungen vegetativer Zentren. Hier wird als unkonventionellen Stimulus des vegetativen Nervensystems die Akupunktur verwendet. Dies geschieht u.a. mit der Zielsetzung, zur Aufdeckung des noch immer unbekannten Wirkmechanismus dieser Therapieform beizutragen. Als Akupunkturpunkt wird Pc6 am Handgelenk gewählt, da die Studienlage eindeutig dessen Effektivität bei der Behandlung von Übelkeit und Erbrechen sowie eine Beeinflussung der Magen-Peristaltik zeigt und die neuralen Zentren hierfür größtenteils im Hirnstamm lokalisiert sind. Der Autor stellt daher die Hypothese auf, dass die Akupunkturwirkung in diesem Fall über den Vagusnerv und dessen Hirnstammkern, den Nucleus dorsalis nervi vagi, vermittelt wird. Vor der Überprüfung dieser Hypothese erfolgt zunächst eine Methodenkritik der bisherigen Akupunktur-fMRT-Forschung. Anhand einer Gruppe von Studien, welche über Aktivierungen der Sehrinde bei Akupunktur visuell relevanter Punkte berichten, weist der Autor eine Reihe methodischer Probleme nach. Anhand einer eigenen Studie kann er mittels Independent Component Analysis (ICA) zeigen, dass die von den bisherigen Studien berichteten, visuellen Aktivierungen höchstwahrscheinlich nicht auf die Wirkung der Akupunktur zurückzuführen sind. Um einige der Probleme dieser Studien zu umgehen, entwickelt der Autor ein neues psychophysikalisches Verfahren, bei dem die Probanden während der Akupunktur kontinuierlich die Stärke der Nadelempfindung („DeQi“) auf einer visuellen Analogskala bewerten. Mit Hilfe dieses Verfahrens gelingt schließlich der Nachweis einer Hirnstamm-Aktivierung unter Akupunktur-Stimulation, deren Lokalisation mit der des Nucleus dorsalis nervi vagi vereinbar ist. Dies bestätigt die ursprüngliche Hypothese und zeigt gleichzeitig die Eignung des neuen Verfahrens für die Bildgebung vegetativer Hirnstammzentren.
Macrophages show a remarkable functional plasticity, which enables them to change their phenotype in response to environmental signals. They are key players during infection by initiating inflammation through the release of proinflammatory mediators. Furthermore, macrophages contribute to the resolution of inflammation by phagocytosis of apoptotic granulocytes. Phagocytosis of apoptotic cells (AC) induces an anti-inflammatory phenotype in macrophages and protects them against apoptosis. However, mechanistic details provoking these phenotype alterations are incompletely understood. Therefore, the aim of my Ph.D. thesis was to investigate the molecular basis of anti-inflammatory macrophage polarization. In the first part of my studies, I investigated the expression of heme oxygenase (HO)-1 in macrophages following treatment with supernatants from AC. HO-1 catalyzes the first and rate-limiting step of heme degradation and potentially bears anti-inflammatory as well as anti-apoptotic potential. I was able to show biphasic upregulation of HO-1 by AC supernatants. The first phase of HO-1 induction at 6 h required activation of p38 MAPK and was accomplished by the bioactive lipid sphingosine-1-phosphate (S1P) engaging S1P receptor 1 (S1P1). However, the second wave of HO-1 induction at 24 h was attributed to autocrine signaling of vascular endothelial growth factor (VEGF) A, whose expression was facilitated by S1P. The release of VEGFA from macrophages was STAT1-dependent, whereas VEGFA itself acted on the macrophage HO-1 promoter via STAT1/STAT3 heterodimer binding. Knockdown of HO-1 revealed its relevance in promoting enhanced expression of the anti-apoptotic proteins B cell leukemia/lymphoma-2 (Bcl-2) and B cell leukaemia/lymphoma-x long (Bcl-XL), as well as the anti-inflammatory adenosine receptor A2A. MHC II and indoleamine 2,3-dioxygenase expression were also affected by ACsupernanatants, but were not HO-1 dependent. Unexpectedly, S1P1 was also upregulated following treatment with AC supernatants. Thus, I considered whether S1P1 induction could specifically be mediated by alternative macrophage activating factors. The expression of S1P1 was enhanced in the presence of the alternative activation stimuli IL-4 as well as IL-10, whereas it was unchanged following incubations with LPS, interferon-g or S1P. My next aim was to investigate the expression of the different S1P receptor isoforms in macrophages following treatment with supernatants form AC. While the expressions of S1P1 as well as S1P3 were induced by exposure to supernatants from AC, S1P2 expression was unaffected. As S1P1/3 and S1P2 are conflictively involved in the regulation of cell migration, I asked for a correlation between increased S1P receptor expression and enhanced migration rate. Indeed, macrophages showed enhanced motility following treatment with supernatants form AC, which was inhibited in S1P1 knockout macrophages. In summary, my findings indicate that HO-1, which is induced by AC-derived S1P, is critically involved in macrophage polarization towards an alternatively activated macrophage phenotype. S1P1 seems to represent a central checkpoint during macrophage activation. On the one hand, S1P1 is induced by supernatants form AC and promotes migration of macrophages. On the other hand, it mediates the induction of HO-1, which is accompanied by antiinflammatory as well as anti-apoptotic signaling. Furthermore, my studies provide evidence that upregulation of HO-1 and S1P1 in macrophages may contribute to the resolution of inflammation by establishing an anti-inflammatory macrophage phenotype and provoking macrophage migration along the vascular S1P gradient out of an inflammatory environment into the lymph.
Die Zellwand von Arabidopsis thaliana enthält große Menge an Hemicellulosen und Pektinen, deren Bestandteile sich hauptsächlich von UDP-Glucuronsäure ableiten. Die Bildung von UDP-Glucuronsäure wird in Pflanzen überwiegend durch die UDP-Glucose Dehydrogenase (UGD) katalysiert, die UDP-Glucose unter der Bildung von NADH in UDP-Glucuronsäure umwandelt. Arabidopsis thaliana besitzt vier UGD-Gene und ein Pseudogen, welche starke Homologien zu Genen anderer bekannter pflanzlicher UDP-Glucose Dehydrogenasen zeigen. Mit Hilfe von Promotor::GUS-Reportergenpflanzen und real time-PCR-Analysen konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die vier UGD-Gene nicht nur in verschiedenen Geweben und zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Morphogenese exprimiert werden, sondern auch in unterschiedlicher Stärke. Dabei scheint jedoch zu jedem Zeitpunkt der Morphogenese, bis auf die Samenentwicklung, eine der vier UGD-Isoformen in Arabidopsis thaliana exprimiert zu werden. Eine biochemische Charakterisierung der verschiedenen Isoformen zeigte einen sehr ähnlichen Km-Wert von ca. 43 µM für NAD+, während sich die Km-Werte für UDP-Glucose deutlich voneinander unterschieden (123 - 335µM). Alle Isoformen unterlagen einer feedback-Hemmung durch UDP-Xylose. Dabei war eine starke Hemmung durch UDP-Xylose korreliert mit einer hohen Affinität zu UDP-Glucose. Neben NAD+ konnten alle untersuchten Isoformen in geringem Maße auch NADP+ als Cofaktor verwenden. Allerdings verringerte sich die Enzymaktivität dadurch um etwa 80%. Alternative Zuckersubstrate konnten dagegen nicht umgesetzt werden. Die biochemischen Unterschiede zwischen den UGD-Isoformen und die differentielle Expression ihrer entsprechenden Genekönnten eine wichtige Rolle bei der Regulation der Zellwandbiosynthese spielen. Denn die irreversible Oxidation von UDP-Glucose zu UDP-Glucuronsäure durch UGD fungiert als eine der Schaltstellen, an welcher der Kohlenstofffluss derpflanzlichen Zelle in Richtung Zellwandbiosynthese gesteuert werden kann. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen von Einfach-oder Doppel-knock out-Mutanten, bei denen durch eine T-DNA-Insertion ein oder zwei UGD-Gene ausgeschaltet waren, zeigte dementsprechend auch eine veränderte Zellwandzusammensetzung bei den Mutanten deltaUGD2, deltaUGD3 und deltaUGD1x deltaUGD4 und eine veränderte Funktion der Stomata bei deltaUGD1x deltaUGD4. Insgesamt waren die Phänotypänderungen gegenüber dem Wildtyp bei der Doppelmutante deltaUGD1x deltaUGD4 wesentlich ausgeprägter als bei den Einfachmutanten, was daran liegen könnte, dass der Ausfall eines UGD-Gens durch ein anderes kompensiert wird. Dafür sprechen auch die Ergebnisse der real time-PCR-Analyse, in der die Expression von UGD1, 2, 3 und 4 in sechs Tage alten Keimlingen des Wildtyps und der knock out-Mutanten untersucht wurde. Dort konnte nachgewiesen werden, dass sich das Ausschalten eines oder mehrerer UGD-Gene auf die Expression der übrigen UGD-Gene auswirkt.
Hintergrund: In den letzten Jahren wurde die Relevanz des oxidativen Stress als maßgebliche Ursache der männlichen Infertilität zunehmend erkannt. Dabei wird der Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies im Ejakulat oft als Marker für eine oxidative Schädigung herangezogen. Diese Nachweismethode hat den großen Nachteil, dass kontaminierende Leukozyten das Meßergebnis entscheidend beeinflussen. Ziel: Es sollte festgestellt werden, ob der spezifische Nachweis von Malondialdehyd (MDA), einem Lipidperoxidationsprodukt, in der Fraktion motiler Spermatozoen bzw. im Seminalplasma als Marker für oxidativen Stress gelingt, welches Substrat besser geeignet ist und, ob der MDA-Nachweis von einer Leukozytenkontamination beeinflusst wird. Material und Methode: Untersucht wurden Ejakulate von 77 Patienten mit unerfülltem Kinderwunsch. Bei allen wurde ein Routinespermiogramm nach WHO (1999) durchgeführt. Als Kontrolle dienten die Ejakulate von 6 Probanden mit unauffälligen Spermiogrammen. Es erfolgte eine Separation der beweglichen Spermien mittels „Swim-up“ vom Samen. Die Proben wurden in Aliquots à 5 Millionen Spermien bei -80°C bis zur Messung aufbewahrt. Das restliche Ejakulat wurde von den weiteren Bestandteilen mittels Zentrifugation getrennt, das Seminalplasma schockgefroren und ebenfalls bei -80°C aufbewahrt. Der MDA-Nachweis erfolgte durch eine HPLC-Methode (Fa. Beckman Instruments CA 92634-3100 USA / System Gold 125) mit Fluoreszenzdetektion (Shimadzu / DATA Recorder DR3/ Spectrofluorophotometer RF-540), basierend auf einem isokratischen Verfahren mittels Trennung in einer „reversed Phase“ Säule. Die hierdurch entstandene Fragmentierung der Proben ermöglichte eine Messung des MDA, das zuvor mit einer Derivatisierungslösung eine fluoreszierende Verbindung eingegangen war. Eingesetzt wurden jeweils 5 Millionen Zellen. Ergebnis: MDA ließ sich in allen Proben nachweisen (Min. 0,26 – Max. 14,27 nmol MDA/10 Mill. Spermatozoen, im Seminalplasma 0,96 – 6,9 μmol/l). Die mindestens dafür erforderliche Zellzahl lag bei 2 Millionen Zellen. Die mittlere MDA-Konzentration betrug in der Kontrollgruppe 2,71± 1,25 nmol MDA/10 Mill. Spermatozoen (MW ± SD), bei den Patienten bei 2,94 ± 2,12 (n.s.). Die intrazelluläre MDA-Konzentration korrelierte negativ mit der Spermienkonzentration (r=0,1 p=0,004). Mit steigender Spermienkonzentration nahmen die MDA-Konzentrationen somit ab. Die MDA-Konzentrationen im Seminalplasma korrelierte nicht mit der Spermienzahl (r= 0,06 p=0,13). Ein deutlicher Zusammenhang bestand zwischen der Progressivmotilität und der intrazellulärem MDA-konzentration insofern, als bei Motilitätszunahme die MDA-Werte abnahmen (r=0,08 p=0,01). Demgegenüber waren die MDA-Konzentrationen umso höher, je mehr immotile Spermatozoen vorhanden waren (Motilitätskategorie d: r=0,093 p=0,005). Das MDA im Seminalplasma korrelierte nicht mit der Spermienmotilität. Es bestand kein Zusammenhang zwischen der intrazellulären MDA-Konzentration und dem Leukozytennachweis. Eine Subgruppenanalyse Patienten zeigte, dass einzelne Patienten (n= 8/77 [~ 10%] mit unauffälligen Spermiogrammen deutlich erhöhte MDA-Konzentrationen aufwiesen. Diese Gruppe würde bei einer Routineuntersuchung unerkannt bleiben. Schlussfolgerung: MDA ist reproduzierbar in der motilen Spermatozoenfraktion nachweisbar. Der Nachweis wurde durch kontaminierende Leukozyten nicht beeinflusst. Die MDA-Bestimmung im Seminalplasma war für den Nachweis des oxidativen Stress ungeeignet. Die MDA-Messung stellt einen Marker zur Erfassung einer oxidativen Belastung des Ejakulats dar, der mittels des Routine-Spermiogramms nicht erfasst wird. Bei ca. 10 % der Patienten könnte eine derartige Schädigung vorliegen und eine antioxidative Behandlung versucht werden.
Die schwere Sepsis ist trotz verbesserter Therapiemethoden der modernen Intensivmedizin mit einer erheblichen Mortalität behaftet und septische Erkrankungen verursachen in Deutschland Schätzungen zufolge ca. 60.000 Todesfälle pro Jahr. Im Falle der gram-negativen Sepsis wird durch die Freisetzung von bakteriellen Zellwandbestandteilen wie LPS über die Bindung an Toll-like Rezeptoren, insbesondere TLR-4, eine systemische Immunreaktion ausgelöst. Diese kann dann über verschiedene Mechanismen zu systemischer Hypotension, Organversagen und schließlich zum Tod im Zuge der schweren Sepsis führen. Es hat sich allerdings herausgestellt, dass LPS auch in der Lage ist protektive Effekte auszulösen. So schützt die Gabe einer niedrigen Dosis LPS den Organismus vor verschiedenen Schädigungen, die in einem späteren Zeitintervall folgen. Beschrieben sind protektive Effekte in Modellen von Ischämie/Reperfusion, direktzellschädigenden Agenzien und auch gegenüber hochdosierter LPS-Gabe. In letztgenanntem Fall wird der gezeigte Effekt als LPS-Toleranz bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit sollte nun untersucht werden, ob niedrige Dosen von LPS einen protektiven Effekt bei einem folgenden LPS-Schock vermitteln können, wobei insbesondere Effekte auf die Leber, mit ihrer herausragenden Rolle in der Elimination von LPS aus dem Organismus, im Fokus der Experimente standen. Des Weiteren sollte eine mögliche Rolle der Häm-Oxygenase 1 (HO-1) im Zuge dieser Protektion untersucht werden, da verschiedene Arbeiten der letzten Jahre gezeigt haben, dass HO-1 in der Lage ist eine Protektion gegen verschiedene Arten der Zellschädigung zu vermitteln. Für die Untersuchungen wurde ein Tiermodell an der Ratte gewählt. Als wesentliche Ergebnisse sind festzuhalten, dass die Gabe von 1 mg / kg KG LPS (intraperitoneal) 24h vor Auslösen eines LPS-Schocks mit 6 mg / kg KG (intravenös) zu einer signifikanten Verbesserung der Kreislaufparameter und zu einer Verringerung der Leberzellschäden führt, gemessen am mittleren arteriellen Blutdruck bzw. an GOT und GPT im Serum der Tiere. Außerdem zeigt sich, dass die Gabe von niedrig dosiertem LPS zu einem Anstieg der HO-1 Konzentration der Leber im 24h Zeitverlauf führt und dass in den Lebern der Tiere, die eine Protektion durch LPS-Vorbehandlung erfahren haben, die HO-1 Menge signifikant gegenüber den nicht vorbehandelten Tieren erhöht ist. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die HO-1 eine wichtige Rolle in der Leberprotektion im Rahmen der LPS-Toleranz durch Vorbehandlung mit niedrig dosiertem LPS spielt. Das in dieser Arbeit verwendete Modell des LPS-Schocks stimmt dabei in vielen Bereichen mit den pathophysiologischen Veränderungen während einer gramnegativen Sepsis überein. Die Ergebnisse dieser Arbeit im Einklang mit den Untersuchungen anderer Arbeitsgruppen zeigen also, dass durch eine gezielte Modulation der Immunantwort, z.B. über eine Induktion der HO-1 Produktion, eine Protektion des Organismus gegen einen im Intervall folgenden septischen Schock möglich sein könnte. Eine zeitlich abgestimmte und gezielte Modulation der inflammatorischen Prozesse bei Hochrisikopatienten, z.B. vor geplanten großen operativen Eingriffen oder Organtransplantationen, könnte daher in Zukunft helfen das Überleben dieser Patienten zu verbessern.
Die Nieren von COX-2-/--Mäusen zeigen um den Tag P21 u.a. einen verminderten Quotienten aus Nierengewicht zu Körpergewicht, zu kleine Glomeruli, einen schmalen Kortex und zystische Veränderungen, sowie hyperplastische Glomeruli in rindenfernen Bereichen. Die Befunde an den Nieren von COX-1-/- und COX-2-/- Mäusen lassen vermuten, dass es sich um COX-2 abhängige Effekte handelt, die erst im postnatalen Abschnitt der Nephrogenese in Erscheinung treten. Da COX-1-/--Mäuse keine Pathologien der Nieren aufweisen und es zwischen Wildtyp-Mäusen und COX-2-/--Mäusen an den ersten Tagen bis etwa Tag P10 keine Unterschiede des Phänotypes der Nieren gibt. Nach Gabe von Indomethacin während des letzten Trimenons der Schwangerschaft wurde auch bei Menschen über eine gestörte Nierenfunktion mit Oligohydramnion sowie histologischen Veränderungen berichtet. Bisher war allerdings unklar, inwiefern die unterschiedlich klinisch eingesetzten Coxibe sich in ihrer Wirkung auf die Nierenentwicklung unterscheiden und ob sie die Nephrogenese in gleichem Maße stören können. In der vorliegenden Arbeit wurde der postnatale Abschnitt der Nephrogenese von Mäusen unter Gabe der experimentellen COX-2 Inhibitoren SC-236 und SC-791, der selektiven COX-2-Inhibitoren Celecoxib, Etoricoxib, Lumiracoxib, Rofecoxib und Valdecoxib, der klassischen NSAIDs Diclofenac und Naproxen, der experimentelle COX-1 Inhibitor SC-560 und das Celecoxib-Derivat DMC untersucht. Zunächst wurden die Tiere von Tag P1 bis Tag P21 mit den oben genannten Substanzen nach einem festen Schema behandelt, anschließend wurden die Nieren präpariert und histologisch aufgearbeitet. Als Parameter der Untersuchung der Nierenentwicklung wurde die Reduktion der Nierenquotienten, der mittleren Durchmesser der Glomeruli und der kortikalen Dicke, sowie der Anteil an Glomeruli im Rindenbereich und einer Verschiebung der Verteilung der Glomeruli, hin zu kleineren Durchmessern herangezogen. Verglichen mit der Referenzgruppe, die keine Veränderungen der Nephrogenese gezeigt hatte, zeigte sich ein Effekt auf die Morphologie der Nieren in unterschiedlichem Ausmaß, bei allen selektiven COX-2-Inhibitoren, sowie den klassischen NSAIDs. Weder SC-560, noch DMC zeigten bei dieser Studie einen Effekt auf die Nephrogenese. Des weiteren wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht ob und an welchen postnatalen Tagen die COX-2-Expression erhöht ist. Dazu wurden an den Tagen P2, P4, P6 und P8, sowie an Tag P21 unbehandelte C57/BL6-Mäuse getötet und deren Nieren entnommen. Sowohl auf mRNA, als auch auf Proteinebene konnte an Tag P4 in den TaqMan-Analysen, bzw. an Tag P6 in den Western Blot-Analysen eine signifikant erhöhte Expression der COX-2, verglichen mit Tag P21 festgestellt werden. Daraus ergab sich nun die Frage, ob die Inhibition der COX-2 an diesen Tagen ausreicht, eine Veränderung im Sinne der oben genannten Veränderungen an der Niere zu zeigen. Dazu wurde eine Gruppe von Tieren nur von Tag P1 bis Tag P6 mit dem experimentellen COX-2-Inhibitor SC-236 behandelt und an Tag P21 mit Tieren verglichen, die entweder von Tag P1 bis Tag P21 SC-236 erhielten oder das Lösungsmittel DMSO. Die Nieren zeigten ebenfalls signifikante Unterschiede zu den Nieren aus der Referenzgruppe. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass es sich um einen Gruppeneffekt der NSAIDs auf die COX-2 abhängige Nephrogenese handelt. Des weiteren zeigte sich, dass die COX-2-Expression in den Nieren an den ersten Lebenstagen der Maus erhöht ist und die COX-2 Inhibition an diesen Tagen eine irreversible Störung der Nephrogenese nach sich zieht. Die Konsequenz aus diesen Ergebnissen sollte sein, dass NSAIDs nicht mehr in der Spätschwangerschaft, z.B. zur Tokolyse oder zur Behandlung des Polyhydramnions eingesetzt werden. Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Tatsache, dass auch bei AT1-/-- und ACE-/--Mäusen über eine veränderte Morphologie der Nieren berichtet wurde. Des weiteren sind beide Systeme, COX-2 und RAAS, an der Regulation der Nierenphysiologie beteiligt und verknüpft. In der vorliegenden Arbeit wurde nun die Wirkung des ACE-Inhibitors Enalapril und des AT1-Antagonisten Telmisartan auf Parallelen zur COX-2 abhängigen Nephrogenese untersucht. Lediglich die Nierenquotienten waren bei beiden Substanzen vermindert. Es zeigten sich bei der Behandlung mit Enalapril verminderte Volumina der Glomeruli, eine verminderte kortikale Dicke und ein erhöhter Anteil von Glomeruli im Rindenbereich.
Anliegen: Der hausärztlich-ambulanten Versorgung von depressiven Patienten kommt eine zentrale Bedeutung zu. Ein wichtiges Symptom von Depressionen ist Suizidalität. Suizidgedanken bleiben im Hausarztkontakt jedoch oftmals unerkannt. Eine verbesserte Kenntnis von Prädiktoren für Suizidgedanken speziell bei depressiven Patienten in der Primärversorgung kann dazu beitragen, die Erkennung von Suizidgedanken durch den Hausarzt zu verbessern und dadurch eine rechtzeitige Intervention zu ermöglichen. Mit Prädiktoren für Suizidgedanken explizit bei depressiven Patienten in der Primärversorgung haben sich bislang nur wenige Studien befasst, mit teilweise heterogenen Ergebnissen. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, an einer großen Stichprobe von Patienten mit Major Depression aus der Hausarztversorgung Prädiktoren für Suizidgedanken zu untersuchen. ...
Na+/H+ antiporters are ubiquitous membrane proteins involved in ion homeostasis and pH sensing. The amino acid sequence of one such antiporter, MjNhaP1, from Methanococcus jannaschii, shows a significant homology to eukaryotic sodium proton exchangers like NHE1 from Homo sapiens and SOS1 of Arabidopsis thaliana than to the well-characterized Escherichia coli NhaA or NhaB. MjNhaP1 shows activity at acidic pH unlike NhaA, which is active at basic pH. 13 transmembrane helices have been predicted to be present in NhaP1. A projection map, calculated by Cryo-EM of 2D crystals of MjNhaP1 grown at pH 4, showed it to be a dimer containing elongated densities in the centre of the dimer and a cluster of density peaks on either side of the dimer core (Vinothkumar et al., 2005). Incubation of 2D crystals at pH 8 on the EM grid resulted in well-defined conformational changes, clearly evident in a difference map as a major change in density distribution within the helix bundle (Vinothkumar et al., 2005). The aim of this dissertation is to understand the working mechanism of MjNhaP1 by determining its three-dimensional structure. The aim was initially approached by structure determination by X-ray crystallography. The limitation for this method was the low expression yield, which was 0.5–0.7mg/ml (Vinothkumar et al., 2005). After various optimization trials, the expression yield of the recombinant protein could be elevated to 2-2.5mg of pure protein per litre of culture by the method of autoinduction (Studier et al., 2005). To obtain well diffracting 3D crystals, purification conditions (Vinothkumar et al., 2005) were modified. 3D crystals were obtained under various conditions, which has so far not diffracted X-Ray beyond 8Å. Parallely, optimization of parameters (Vinothkumar et al., 2005) for 2D crystals formation was carried out. A combination of 1% DDM used for lipid solubilization, and 1% OG in the buffer of the purified protein produced 1-2 μm wide tubular 2D crystals of NhaP1. This batch of crystal proved to be the optimal for data collection at higher tilt angle with the electron microscope. A 3D map showed p22121 symmetry and revealed a tight dimer with an oval shape. The region in the central part of the dimer is composed of several tilted helices forming an interface between both monomers. On either side of the dimer interface, a group of six tightly packed helices form a bundle. This bundle contains three straight helices in the centre of the monomer and three helices in the periphery. Comparison of the structures of E.coli NhaA and M. jannaschii NhaP1 show substantial differences in length and slope of corresponding helices between both antiporters. A 3D model of NhaP1 based on the 3D map revealed 13 helices, which has been named as A-M to distinguish it from the NhaA helices. Overlaying the X-ray structure onto the 3D map revealed that the disrupted helices IV and XI of NhaA superimpose two central helices at similar position in the 3D map of NhaP1. The disrupted helices IV and XI in the X-ray structure of NhaA have been proposed as the putative ion-binding and translocation site (Hunte C et al, 2005; Arkin IT et al, 2007; Screpanti & Hunte (2007). This motif appears to be present also in NhaP1, as suggested by the close fit of NhaA helices IV and XI on the putative helices E and L of the NhaP1 model. These two putative helices E and L in NhaP1 contain the highly conserved TDP and GPRVVP motif, which are crucial for antiporter activity (Hellmer et al., 2002, Hellmer et al., 2003). In the overlay, helix V of NhaA containing the two essential, conserved aspartates D163 and D164 fits the density of the putative helix F of NhaP1, which contains the conserved motif FNDP. The homologous D161 in the FNDP motif of NhaP1 is essential for transport activity as show by mutagenesis (Hellmer at al., 2003). Significant differences are visible in the region of the dimer interface of the 3D map of NhaP1 occupied by helices VI, VII, and VIII in NhaA. This region shows an extra helical density (A) in the 3D map of NhaP1. By alignment of MjNhaP1 sequence with the amino acid sequences of several Na+/H+ exchangers, it was evident that the additional helix (A) is located in the N terminus of NhaP1. In our sequence alignment, a putative hydrophobic segment corresponding to this additional helix A is present in other archaeal and eukaryotic antiporters but not in any of the bacterial ones. The N-terminus of the human Na+/H+ exchanger NHE1 has been predicted to contain a highly hydrophobic signal peptide. This indicates the probability of the N-terminal helix A of NhaP1 to be an uncleaved signal peptide. Besides being a signal sequence targeting NhaP1 to the membrane, the map suggests that this helix might be involved in the formation of dimer contacts between both monomers. A gene duplication event is evident in the 3D map of NhaP1, as not only the helices D, E, F and K, L, M are related by an inverted repeat but also the helices B, C and I, J are related. We present here the three-dimensional architecture of a Na+/H+ antiporter from archaea. The presence of the 13th helix suggests the location of the N-terminus to be located in the cytosol and the C-terminus in the periplasm. This would orient NhaP1 in an inverted manner in the membrane in comparison to NhaA. Further structural information at higher resolution and biochemical and biophysical investigations are required to confirm the topology.
T-Lymphozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathophysiologie der Rheumatoiden Arthritis. Sie fördern einerseits die perpetuierende Entzündung innerhalb der Membran und besitzen andererseits die Fähigkeit auf die Inflammationen regulativ bzw. suppressiv zu wirken. In der hier vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob entzündungsfördernde T-Zellprodukte und regulatorische T-Zellpopulationen innerhalb der Synovialmembran nachweisbar sind, und wie unstimulierte periphere TZellen auf Synovialmembranzellen "in vitro" reagieren. Innerhalb der Synovialmembran konnte eine Population von CD4(+)CD25(+) regulatorischen T-Zellen (Tregs) durchflusszytometrisch nachgewiesen werden. Immunhistochemische Analysen des Gewebes konnten eine Akkumulation dieser Zellen innerhalb von Sekundärfollikeln des Synovialmembrans nachweisen. Die ELISPOT-Analyse ausgewählter Zytokine resultierte in der Detektion immunsuppressiver (IL-10) und immunstimulatorischer Zytokine in Synovialmembranzellkultur. Hier konnte erstmalig eine autologe IFN-gamma Produktion auf Proteinebene nachgewiesen werden. Klinische Betrachtungen der IFN-gamma Produktion zeigten eine starke Assoziation mit dem Rheumafaktor. Zusätzlich findet sich eine tendenzielle Abnahme der immunstimulatorischen Kapazität mit der Dauer der Erkrankung. Eine Betrachtung der intrasynovialen IL-10 Produktion unter Berücksichtigung des klinischen Entzündungsparameter CRP, zeigt einen starken Zusammenhang zwischen den beiden Parametern. ELISPOT Analysen einer Co-Kultur zwischen autologen CD4(+) und CD8(+) PBMCs und Synovialmembranzellen ergaben eine Abnahme der autologen IFN-gamma Produktion ohne Zunahme der Interleukin- 10 Produktion. Eine Aktivierung der Zellkultur lässt diesen Effekt verschwinden. Durch Aufreinigung der PBMCs konnte der stärkste suppressive Effekt innerhalb der CD4(+)CD25(+) T-Zellfraktion nachgewiesen werden, welcher marginal durch Aktivierung der Zellkultur unterbrochen werden konnte. Regulatorische Effekte konnten auch innerhalb der CD8(+) T-Zellfraktion dokumentiert werden, welche sich aber durch spezifische anti-CD3 Ab und anti-CD28 Ab Aktivierung verliert. Die Beeinflussung der suppressiven Eigenschaften von T-Zellen bzw. ihrer spezialisierten T-Zellpopulationen könnte in Zukunft zu einer besseren Therapie der Rheumatoiden Arthritis führen.
In einer retrospektiven Analyse wurden Patienten mit akuter myeloischer Leukämie, die in der Abteilung Hämatologie in der Universitätsklinik in Frankfurt am Main zwischen 1996 bis 1999 behandelt wurden und im Rahmen dieser Behandlung fieberhafte Infektionen entwickelt hatten, ausgewertet. Es wurden insgesamt 402 Episoden von 135 Patienten (76 Frauen und 59 Männer) mit AML auf geschlechtsspezifische Unterschiede im Infektionsverlauf untersucht. Hierbei wurde neben den Patientencharakteristika die Inzidenz der verschiedenen Infektionsklassifikationen, das Erregerspektrum (gram-positiv, gram-negativ, Pilzinfektion), die Therapie und das Therapieergebnis analysiert. Als Erfolgskriterien wurden die Entfieberung, sowie die Rückbildung von Infektionslokalisationen definiert. Die Therapieerfolge wurden eingeteilt in komplettes, partielles und fehlendes Ansprechen. In der vorliegenden Analyse wurden für den Infektionsverlauf wichtige Faktoren wie der Remissionsstand der Grunderkrankung, antibiotische Prophylaxe, G-CSF und die Neutropeniedauer untersucht, wobei sich hierbei keine signifikanten Unterschiede ergaben. Bei den Infektionsklassifikationen fiel auf, dass Männer signifikant mehr Pneumonien hatten und dass bei Frauen häufiger primäre Bakteriämien nachweisbar waren. Gram-positive Erreger traten insgesamt signifikant mehr bei Männern, gram-negative Erreger signifikant mehr bei Frauen auf. Nachgewiesene invasive Pilzinfektionen waren bei beiden Geschlechtern in ähnlichen Anteilen zu finden. Wegen der höheren Rate an Pneumonien bei männlichen Patienten (32,6 % versus. 18,1 %) haben diese mehr Amphotericin B und 5-Flucytosin erhalten, da bei Pneumonien ein hohes Risiko für Fadenpilzinfektionen besteht und dieses entsprechend in der empirischen Therapie berücksichtigt wurde. Eine endgültige Entfieberung trat bei insgesamt 95,5 % aller Episoden auf, wobei es keinen Unterschied zwischen männlichen und weiblichen Patienten gab. Der Anteil bei den weiblichen Patienten, die einen Rückgang der Infektlokalisation hatten, war signifikant höher verglichen mit den männlichen (90,9 % versus 52,5 %, p < 0,0001). Auch ein kompletter Rückgang der Infektlokalisation war in höherem Anteil bei Frauen als bei Männern zu verzeichnen (41 % vs 20,3 %). Insgesamt 12,7 % aller Infektepisoden führte zu einer Verlegung auf die Intensivstation, ein geschlechtsspezifischer Unterschied wurde nicht gefunden. In der Gesamtbeurteilung des Verlaufs der Infektionsepisoden war das komplette Ansprechen (82,3% vs 67,4%; p < 0,001) sowie die Ansprechrate insgesamt (komplett und partiell; 93% vs 79%; p < 0,0005) bei den weiblichen Patienten signifikant höher.
Die Allgemeinanästhesie ermöglicht die zahnärztliche Sanierung bei Patienten, deren Behandlung unter konventionellen Bedingungen nicht erfolgen kann. In der vorliegenden retrospektiven Studie wurden die Daten zu 430 im Zeitraum von 1997 bis 2006 im Zahnärztlichen Universitätsinstitut Carolinum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main bei 382 Patienten durchgeführten ambulanten zahnärztlichen Vollnarkosen (Gruppe 3G) erfasst und ausgewertet. Ziele der Arbeit waren die Untersuchung der Eingriffe in Bezug auf Organisation, Patientencharakteristika, Therapiekonzepte und therapeutische Maßnahmen sowie die Evaluation des Bedarfs nach Veränderungen. Die Sanierungen erfolgten bei Patienten aller Altersgruppen und unterschiedlicher Morbiditätsgrade. In 84,4 % der Fälle waren die Patienten älter als 6 Jahre. Der Altersdurchschnitt beim untersuchten Kollektiv betrug 25 Jahre. Die Mehrzahl der Patienten hatte schwere Allgemeinerkrankungen, geistige Behinderungen und motorische Störungen. Hauptindikation für die Behandlung in Vollnarkose war die unzureichende Kooperationsfähigkeit der Patienten für die Behandlung in Lokalanästhesie und ein hoher Sanierungsbedarf. An 10,5 % der Termine erfolgte die Therapie bei kooperationsunwilligen Kleinkindern. Gruppe 3G umfasste die chirurgischen (Gruppe 3C), konservierenden (Gruppe 3K) und kombiniert konservierenden und chirurgischen Sanierungen (Gruppe 3K + C). Es erfolgte eine gesonderte Auswertung der Behandlungen in der jeweiligen Subgruppe und die Gesamtauswertung in der Gruppe 3G. Das untersuchte Patientenkollektiv hatte einen niedrigen Sanierungsgrad und einenhohen Sanierungsbedarf. Infolgedessen wurde in allen Gruppen eine umfangreiche Therapie durchgeführt. Die häufigsten therapeutischen Maßnahmen waren die Restauration mittels plastischer Füllungsmaterialien und die Zahnextraktion. An einzelnen Terminen erfolgten prothetische und parodontologische Behandlungen. In der Gruppe 3G wurden pro Intervention durchschnittlich 5,6 Zahnflächen mittels 2,9 Füllungen restauriert und 6,5 Zähne extrahiert. Bei der Kohorte der Kinder im Alter von bis zu 6 Jahren waren 3,8 Füllungen an 7,5 Zahnflächen und 7,6 Extraktionen pro Patient festzustellen. Aus der jährlichen Verteilung der Füllungswerkstoffe werden ein Rückgang in der Anwendung des Amalgams und der Trend zur Verwendung adhäsiver Materialien deutlich. Die prä- und intraoperative Befunderhebung hat sich bei dem untersuchten Patientengut als sehr schwierig herausgestellt. Aufgrund fehlender Mitarbeit der Patienten konnte die röntgenologische Untersuchung in 35,6 % der Fälle nicht durchgeführt werden. Durch Einrichtung einer intraoperativen Röntgenmöglichkeit könnte eine genauere Diagnostik und Therapieplanung erzielt werden. Abschließend werden Therapiekonzepte für die Behandlung in Vollnarkose, die Compliance der Patienten für präventive Maßnahmen, die Inzidenz der Mehrfachbehandlungen in Allgemeinanästhesie und die Einführung eines strukturierten Recalls diskutiert.
In der heutigen Zeit ist der Konsum von Drogen wie THC und Amphetaminen insbe-sondere unter Jugendlichen weit verbreitet. Vor allem durch die aufputschende Wirkung der Amphetamine und deren Ruf als Partydroge kommt es gehäuft an Wochenenden zu vermehrten Autofahrten unter Drogeneinfluss. Die vorliegende Arbeit untersucht die Auswirkungen von THC- und Amphetaminkon-sum auf verschiedene Sehleistungen. Zu diesem Zweck wurde eine Gruppe von Kraft-fahrzeugführern, die unter Drogeneinfluss standen, mit einem nicht beeinflussten Kol-lektiv verglichen. Es zeigten sich signifikante Unterschiede im Bereich der Testzeit sowie des Stereose-hens, wobei die Gruppe der Drogenkonsumenten und hier vorrangig die Amphetamin-konsumenten deutlich schlechter abschnitten. Die Beeinträchtigungen im Bereich der Testzeit dürften auf eine deutlich eingeschränkte Konzentrationsfähigkeit unter Amphetamin- und THC- Konsum zurück zu führen sein, vermutlich hervorgerufen durch Wirkungen im Bereich des Hypothalamus und Hippo-campus, welche im Bereich der Aufmerksamkeit sowie des Lernverhaltens eine wich-tige Rolle spielen. Verbindungen dieser beiden Hirnareale zur Sehbahn könnten eine Erklärung für die Einschränkungen im Bereich des Stereosehens vor allem der Amphetamingruppe sein, da diese Substanzgruppe sowohl Hippocampus, Hypothalamus als auch die Mandel-kerne beeinflusst, THC hingegen nur den Hippocampus. Insgesamt muss anhand der vorliegenden Ergebnisse von einer Beeinträchtigung der Fahrtüchtigkeit unter THC und Amphetaminen unabhängig von der konsumierten Dro-genmenge ausgegangen werden. Hieraus lässt sich ableiten, dass die Einführung eines Grenzwertes aufgrund der sehr individuellen Beeinträchtigungen auf die kognitiven und optischen Fähigkeiten einer einzelnen Person als äußerst problematisch zu bewerten ist und somit die Fahrsicherheit und Fahreignung nur bei einem völligen Verzicht auf jeg-lichen Cannabis- oder Amphetaminkonsum gewährleistet ist.
Prädiktion der Prognose von Patienten mit ischämischer Kardiomyopathie anhand der Spiroergometrie
(2009)
Hintergrund: Es ist ein wichtiges klinisches Ziel, Hochrisikopatienten unter den Patienten mit Herzinsuffizienz herauszufinden, da sie eine besonders intensive Therapie und engmaschige Kontrollen benötigen. Das Ziel dieser Arbeit war, bei Patienten mit Herzinsuffizienz infolge eines Myokardinfarktes Zuordnungen der klinischen Herzinsuffizienzmarker und Belastungsparameter hinsichtlich ihrer prognostischen Kraft zu definieren. Die Patienten erhielten alle eine optimale medikamentöse Behandlung mit sowohl Betablockern als auch ACE-Inhibitoren. Methoden: Bei 103 Patienten mit abgelaufenem Herzinfarkt wurde eine Spiroergometrie durchgeführt. Die von der Spiroergometrie abgeleiteten Parameter beinhalteten den peak O2, VO2 an der anaeroben Schwelle, den peak O2-Puls, die minimalen CO2 - und O2 -Äquivalente, VE/VCO2 und s1, ein submaximaler Parameter, der die initiale Steigung der VO2/VCO2-Kurve repräsentiert. s1 wurde bis dahin noch nie bei Patienten mit Herzinsuffizienz beschrieben. Ergebnisse: Das mediane Follow-up betrug 668 Tage. Bei 14 Patienten trat der kombinierte Endpunkt des kardiovaskulären Todes oder der Einweisung in das Krankenhaus auf Grund einer Verschlechterung der Herzinsuffizienz auf. Patienten mit und ohne Ereignis unterschieden sich hinsichtlich ihres Alters, der NYHA-Klasse, der LVEF und der NT-proBNP Serumspiegel signifikant. Die Patienten mit Ereignis hatten signifikant niedrigere peak VO2- und niedrigere s1-Werte. Der NT-proBNP-Serumspiegel, die NYHA-Klasse und die LVEF korrelierten signifikant mit peak VO2 , aber nicht mit s1. Nur NT-proBNP, peak VO2 und s1 waren jedoch statistisch unabhängige Prädiktoren von nachteiligen Ereignissen. Bei der multivariaten Analyse war s1 eine starke und unabhängige prognostische Variable mit insgesamt guter Sensitivität und Spezifität, vergleichbar mit dem NT-proBNP-Serumspiegel. Schlussfolgerung: Zusätzlich zu peak VO2, der eine entscheidende Rolle als spiroergometrischer Parameter auch bei Patienten unter Betablockertherapie spielt, ist der submaximale Parameter s1 ein wertvoller Prädiktor bei Patienten mit Herzinsuffizienz ischämischer Genese. Da s1 unabhängig von der maximal erreichten Belastungskapazität ist, könnte es für die Evaluation von Herzinsuffizienzpatienten, die entweder nicht an ihre maximale Belastungsschwelle gehen können oder wollen, von Nutzen sein.
Diese nach den Richtlinien der Good Clinical Practice durchgeführte, multizentrische, randomisierte Phase III Studie wurde am 1. September 2003 initiiert. Die hohe Teilnahme, sowohl bei der Anzahl der Studienpatienten als auch bei den teilnehmenden Zentren, zeigen das rege Interesse, das an dieser Untersuchung besteht. Die Studie „Bendamustin plus Rituximab versus CHOP plus Rituximab“ baut auf den Ergebnissen einer in-vitro Studie und einer Phase II Studie der gleichen Arbeitsgruppe auf, die synergistische Effekte der beiden Substanzen bei gleichzeitig sehr guter Verträglichkeit des Regimes zeigen konnten [7,8]. In die vorliegende Auswertung gingen in den Therapiearm mit Bendamustin plus Rituximab 104 Patienten und in den mit CHOP plus Rituximab 103 Patienten ein. Bei einem ausgeglichenen Risikoprofil der beiden Patientenkollektive stellen sich Therapieerfolge und Komplikationen als gut miteinander vergleichbar dar. Mit einer ORR von 96% bei B-R gegenüber 94% bei CHOP-R unterschied sich das Gesamtansprechen in den beiden Therapiearmen nur geringfügig. Auffällig war je doch eine signifikant höhere Rate an kompletten Remissionen im Bendamustin-Arm (55% vs. 38%; p=0,0180). Die Beobachtung, dass mit der Kombination von Bendamustin und Rituximab, bei vergleichbarem Gesamtansprechen, ein höherer Anteil an kompletten Remissionen erreicht wurde, lässt sich bei ausreichenden Fallzahlen auch innerhalb der einzelnen Entitäten nachvollziehen. Bei den 22 Patienten mit Mantelzell Lymphom im Bendamustin-Arm wurde ein Gesamtansprechen von 91% erreicht, eine komplette Remission erreichten 50% der Patienten. Auch bei dieser prognostisch ungünstigeren Untergruppe ließen sich mit dem Bendamustin-Rituximab Regime also ausgezeichnete Ergebnisse erzielen. Die in zahlreichen Untersuchungen beschriebene gute Verträglichkeit der Substanz Bendamustin konnten wir mit unserer Studie für die Kombination mit Rituximab bestätigen. Die Anzahl der an die Studienzentrale gemeldeten Severe Adverse Events unterschied sich mit 32 bei CHOP-R versus 13 bei B-R signifikant (p=0.0013). Außer einem Patienten mit anaphylaktischem Schock nach Rituximab-Erstgabe traten keine lebensbedrohlichen Komplikationen im Studienkollektiv mit Bendamustin auf. In einigen wenigen Fällen wurde die Dosis reduziert, nur in einem Fall musste die Therapie ganz abgebrochen werden. Bei diesem Patienten bestand nach dem 1. Zyklus der Verdacht auf eine medikamentös-toxische Alveolitis. Der Patient erholte sich im Verlauf und wurde mit CHOP-R weiterbehandelt. Die Haupttoxizität im B-R-Arm bestand in der Leukozytopenie mit 12 % Ereignissen mit WHO Grad 3 und 4 (41% bei CHOP-R). Annähernd parallel dazu verhielten sich die Werte für die Granulozyten. Der Unterschied der beiden Therapiearme in der Anzahl der Zyklen mit höhergradiger Leukozytopenie ist von statistischer Signifikanz (p<0,0001). Diese deutliche Überlegenheit von Bendamustin im Bereich der Hämatotoxizität wirkte sich auf die Anzahl und Schwere der infektiösen Komplikationen aus, die im Therapiearm mit CHOP-R deutlich höher lag als im Prüfarm. Die „typischen“ Nebenwirkungen einer Chemotherapie wie gastrointestinale Beschwerden, Stomatitis, Abgeschlagenheit ect. wurden unter B-R ebenfalls, jedoch in geringerem Ausmaß beobachtet. Gelegentlich kam es zu milder bis mäßiger Alopezie. Häufiger als im Kontrollarm kamen unter Bendamustin allergische Reaktionen vor, die auch für andere Kombinationen und die Monotherapie bereits beschrieben wurden [41,53]. Die Zusammenschau der Daten unserer Studie zur Therapietoxizität zeigt klar, dass Bendamustin in Kombination mit Rituximab die besser verträgliche und sicherere Therapieoption darstellt. Es gab keine therapieassoziierten Todesfälle im Prüfarm, schwerwiegende Komplikationen und Hospitalisationen waren seltener und bei signifikant weniger hochgradigen Leukozytopenien kam es seltener zu Infektionen. Für die Untersuchungsbereiche Remissionsausmaß und Therapietoxizität lässt sich damit in unserer Studie nicht nur eine Gleichwertigkeit des Bendamustin-Rituximab Regimes gegenüber dem Polychemotherapieregime CHOP-R feststellen, sondern partiell eine Überlegenheit, die für den Anteil an kompletten Remissionen, die Anzahl der Zyklen mit höhergradiger Leukozytopenie und die Anzahl der gemeldeten SAE Signifikanzniveau erreicht. Auch der Vergleich mit Ergebnissen anderer Chemotherapieregimes, die Rituximab enthalten, lässt die bei uns mit dieser Kombination erzielten Resultate durchaus in einem vorteilhaften Licht erscheinen [4,5,29,44,48,50]. Das Fehlen des Anthrazyklins, das in den meisten Polychemotherapie-Regimen enthalten ist, scheint keine Nachteile mit sich zu bringen. Es fällt damit eine nebenwirkungsreiche Medikamentengruppe weg, die unter anderem in hohem Maß für die kardiotoxischen Komplikationen verantwortlich ist. Ob durch die Ergänzung eines Anthrazyklins noch bessere Ansprechraten oder eine längere Remissionsdauer erzielt werden könnte ist fraglich. Andere klinische Studien lassen Zweifel daran aufkommen und auch der antagonistische Effekt der zwischen Bendamustin und Doxocyclin bzw. Mitoxantron in in-vitro Studien beobachtet wurde legt eine solche Kombination nicht nahe [38,52]. Die wesentliche Frage, die sich angesichts der ausgesprochen guten Therapieergebnisse im B-R-Arm stellt, ist die nach der Qualität der Remission, also der Remissiondauer und den eventuellen Auswirkungen auf das Gesamtüberleben. Das mediane ereignisfreie bzw. progressionsfreie Überleben ist in beiden Armen bisher nicht erreicht. In der unserer Untersuchung zugrunde liegenden Pilotstudie verzeichneten Rummel et al. eine mediane PFS von 24 Monaten [8]. Zu erwarten ist, dass diese in unserer Phase III Studie, mit einem nicht vorbehandelten Patientenkollektiv, deutlich überschritten wird. Aktuell leben im Bendamustin-Arm noch 82% der Patienten in Remission, während es im CHOP-Arm nur noch 71% sind. Das Overall Survival lag bei 95% mit B-R und bei 93% mit CHOP-R. Die zum Auswertungszeitpunkt verfügbaren Daten deuten also auch hier auf eine Gleichwertigkeit, für die remissionsfreie Überlebenszeit möglicherweise sogar auf eine Überlegenheit des B-R-Regimes hin. Da die mediane Nachbeobachtungszeit mit 29 Monaten kurz und der Anteil der Patienten mit Erkrankungsprogredienz relativ zu klein ist, kann man von mehr als einer Tendenz jedoch bisher noch nicht sprechen. Eine Auswertung zu einem späteren Zeitpunkt mit längeren Follow-up Zeiten und der kompletten – mehr als doppelt so hohen – Patientenzahl, wird zeigen, ob sich die ersten optimistisch stimmenden Ergebnisse bestätigen. Die Resultate dieser weiteren Auswertungen werden mit Spannung erwartet. Eine Gleichwertigkeit in Bezug auf das Gesamtüberleben wäre ein Ergebnis von hoher klinischer Relevanz, da der Einsatz von CHOP-R als Standardtherapie in diesem Fall in Frage gestellt werden müsste.
Die Wirbelkörperfraktur stellt eine der Hauptkomplikationen bei Osteoporose dar, welche die Kosten der Erkrankung um ein Vielfaches steigen lassen. Hinzukommen neurologische Defizite, sowie akute und chronische Schmerzen bei Belastung und in Ruhe, welche die Mobilität des Patienten deutlich einschränken und eine fortführende, bewegungsfördernde Behandlung erschweren. Die Perkutane Vertebroplastie stellt hier eine kostengünstige Behandlungsform dar, betroffene Wirbelkörper in minimal invasiver Technik zu versorgen. Über einen para- oder transpedikulären Zugang wird der frakturierte Wirbelkörper wird mit PMMA-Zement aufgefüllt, sodass ein intravertebraler Zementbolus den Wirbelkörper gleichmäßig stützt. Der Zugang zum intravertebralen Raum wird entweder ein- oder beidseitig mittels zweier Hohlnadeln gewählt, welche von dorsal transpedikulär eingebracht werden. Die Position der Vertebroplastiekanülen wurde während der gesamten Intervention mittels Computertomografie und Fluoroskopie kontrolliert. Die angestrebte Endposition der Kanülen wurde entsprechend den aktuellen Untersuchungen angestrebt. Ausgewertet wurden das Auftreten von Zementleckagen, sowie die intravertebrale Verteilung des applizierten Zementes. Im Zeitraum vom 01.01.2004 bis zum 01.08.2008 wurden dazu 92 Patienten an insgesamt 117 Wirbelkörpern behandelt. In insgesamt 44 Fällen traten Zementleckagen auf, welche klinisch asymptomatisch blieben und keine weitere Intervention erforderten. In den Kontrolluntersuchungen wurden davon 35 Leckagen als diskret, 8 Leckagen als mittelgradig und eine Leckage als deutlich klassifiziert. Die allgemeine Zementleckagerate betrug 37,6 %. Es zeigte sich jedoch, dass bei erfolgreicher Platzierung der Vertebroplastiekanülen entsprechend der angestrebten Lage, die Leckagerate um bis zu 5 % zunimmt. Unabhängig von Hinterkantenbeteiligung, Ausgangshöhe des frakturierten Wirbelkörpers oder Positionierung der Vertebroplastiekanülen zeigte sich eine Häufung der Typ-S-Zementleckagen über die Segmentvenen. An zweiter Stelle trat die Typ-C-Zement-leckage in Erscheinung. Eine Typ-B-Zementleckage konnte nur in wenigen Einzelfällen nachgewiesen werden. Die angestrebte gleichmäßige intravertebrale Verteilung des Zementbolus wiederum zeigte eine Abhängigkeit von der Platzierung der Vertebroplastiekanülen. Bei korrekter Positionierung der Vertebroplastiekanülen konnte in 87,1 % der Fälle eine seitengleiche Verteilung des Zementbolus erreicht werden. Im Gegensatz dazu konnte in nur 70,8 % der Fälle bei abweichender Kanülenlage eine entsprechende seitengleiche Zementapplikation nachgewiesen werden. Die Perkutane Vertebroplastie ist ein sicheres Verfahren, um die osteoporotisch bedingte, sowie die pathologische Wirbelkörperfraktur minimal invasiv zu versorgen. Bei Platzierung der Vertebroplastiekanülen am Kreuzungspunkt zwischen ventralem und medialem, sowie lateralem und medialem Wirbelkörperdrittel wird eine seitengleiche Verteilung des intravertebralen Zementbolus erreicht. Die Abstützfunktion des Zementbolus im frakturierten Wirbelkörper kann auf diese Weise verbessert werden. Im Gegensatz dazu hat sich die Leckagerate bei korrekter Kanülenpositionierung um 5 % erhöht. Bezug nehmend auf die Abstützfunktion sollte nun überprüft werden, ob das Auftreten von Anschlußfrakturen durch die konsequente genaue Platzierung der Vertebroplastiekanülen unter computertomografischer Kontrolle gemindert werden kann.
Die Arbeit beschreibt in ihrer komparatistischen Anlage die sozialpädagogische Betreuung in den Bewährungshilfeorganisationen der Niederlande, Österreichs und der Bundesrepublik. Neben einer umfassenden Beschreibung der Organisations-strukturen werden auch Handlungsabläufe in der Bewährungshilfearbeit dargelegt, wobei qualitative Aspekte der sozialpädagogischen Tätigkeit fokussiert werden. In einem weiteren Kapitel findet sich die begriffliche Eingrenzung der Bewährungshilfe als soziale Dienstleistung. Die beschriebenen Bewährungshilfeinstitutionen werden anschließend in ihren Struk-tur-, Prozess- und Ergebnisqualitäten abgebildet und einem direkten Vergleich zuge-führt. Die abschließende Diskussion stellt aus dem Vergleich der Systeme Anregungen für eine Weiterentwicklung der deutschen Bewährungshilfe, im Sinne einer Verbesse-rung der Dienstleistungsqualität, vor.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein CtaG aus Paracoccus denitrificans eingehend charakterisiert. Es wurde überprüft, ob dieses 21 kDa große Membranprotein als Kupferchaperon und Assemblierungsfaktor für die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase, das heißt für die Biogenese des CuB-Zentrums, in Frage kommt. Eine bioinformatische Analyse zeigte zunächst, dass CtaG, ein Homolog des eukaryotischen Proteins Cox11, zu den am stärksten konservierten Assemblierungsfaktoren der Cytochrom c Oxidase gehört. Interessanterweise sind diese Proteine alle an der Biogenese der redoxaktiven Metallzentren beteiligt, und nur sie sind auch in Paracoccus denitrificans konserviert. Somit stellt Paracoccus ein ideales Modellsystem dar, um die essentiellen Schritte der Biogenese der Cytochrom c Oxidase zu untersuchen. Ein lösliches Fragment von CtaG (CtaGLF) wurde heterolog in E. coli exprimiert und mit Hilfe eines spaltbaren His6-tags aufgereinigt. Es wurde ein Protokoll entwickelt, mit dessen Hilfe die Aggregation des löslichen Fragments minimiert und das Protein in hochreiner, aggregatfreier Form isoliert werden kann. Rekonstitutionsversuche zeigten, dass CtaGLF ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist. Nach der heterologen Expression in E. coli ist CtaGLF kofaktorfrei. Ein Protokoll zur in vitro Rekonstitution mit Kupferionen wurde entwickelt, mit welchem ein stöchiometrisches Kupfer/Protein-Verhältnis erreicht wird. Gelfiltrations- und ICP-MS-Analysen zeigten, dass CtaGLF Kupferionen ausschließlich als Dimer bindet. Rekonstitutionen bei denen Cu(I), Cu(II), Co(II), Fe(II), Mn(II), Mg(II) und Ni(II) sowohl einzeln als auch simultan angeboten wurden, führten zwar zu wenig reproduzierbaren absoluten Stöchiometrien, bestätigten aber, dass CtaGLF bevorzugt Cu(I) bindet. Mutagenesestudien bewiesen einerseits, dass drei Cysteinreste maßgeblich für die Kupferbindung verantwortlich sind und deuteten andererseits darauf hin, dass zwei identische, punktsymmetrische Bindungsstellen des CtaGLF-Dimers die Kupferionen koordinieren. Mit Hilfe einer Multiseq-Analyse wurden zunächst hochkonservierte Oberflächenreste von CtaG identifiziert. Eine Auswahl dieser Aminosäuren wurde per gerichteter Mutagenese ersetzt und der Effekt dieser Mutationen auf Stöchiometrie, Affinität und Dimerisierung von CtaGLF wurde untersucht. Die Affinitäten wurden dabei mit Hilfe von Kompetitionsexperimenten mit dem Cu(I)-spezifischen Chelator BCA analysiert. Insgesamt vier mögliche Szenarien für die Kupferbindung von CtaG wurden postuliert und anhand der Datenlage diskutiert. Das Szenario III, welches die Datenlage am besten zu erklären vermag, sieht eine trigonale Koordination der Kupferionen vor, an welcher die Cysteine des hochkonservierten CFCF-Motivs einer Polypeptidkette ein gemeinsames Koordinationsfeld mit dem nahe der Transmembranhelix gelegenen Cystein 38 der jeweils anderen Polypeptidkette bilden. Mit Hilfe von UV/Vis-spektroskopischen Messungen wurde gezeigt, dass die Bindung von Kupferionen an CtaGLF zu einer Absorption bei 358 nm führt. Diese kann mit einem Extinktionskoeffizienten von E delta 358 nm = 936 M-1cm-1 zur Beobachtung des Kupfertransfers von CtaGLF auf einen Akzeptor verwendet werden. Um eine Beteiligung von CtaG bei der Insertion des CuB-Ions in die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase (UE I) zu beweisen, wurden zwei Arbeitshypothesen aufgestellt und empirisch untersucht: Die erste Hypothese geht von einer posttranslationalen Kupferinsertion aus. Die UE I wird laut dieser Hypothese zunächst vollständig exprimiert und in die Membran inseriert, bevor das Kupferion über einen Kanal in das 13 Å unterhalb der Membranoberfläche gelegene aktive Zentrum der Oxidase inseriert wird. Drei Ansätze wurden zur empirischen Überprüfung dieser Hypothese verfolgt: Erstens wurde ein in vitro Transferassay etabliert, bei dem heterolog exprimierte, kofaktorfreie UE I als Akzeptor für Kupferionen von CtaGLF diente. Zweitens wurden bioinformatische Analysen durchgeführt um potentielle Interaktionsflächen zwischen CtaG und UE I zu identifizieren. Und drittens wurde mit Hilfe koaffinitätschromatographischer Versuche eine Interaktion zwischen CtaG und kofaktorfreier UE I untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sprechen allesamt gegen eine posttranslationale CtaG-vermittelte Insertion von Kupferionen in die UE I der Cytochrom c Oxidase. Die zweite Hypothese geht davon aus, dass die prosthetischen Häm- und Kupfergruppen bereits vor der vollständigen Membraninsertion, das heißt kotranslational auf die UE I übertragen werden. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden ebenfalls mehrere Ansätze verfolgt: Erstens wurde die UE I in Gegenwart und Abwesenheit von CtaG heterolog in E. coli exprimiert und anschließend aufgereinigt. In Abwesenheit weiterer Assemblierungsfaktoren ist CtaG in diesem System nicht dazu in der Lage den Kupfergehalt der UE I zu erhöhen. Zweitens wurde mit Hilfe von Blau-Nativ Gelen und Crosslinking-Versuchen im nativen Wirt Paracoccus denitrificans nach einer Wechselwirkung zwischen CtaG und UE I gesucht. Insbesondere die Ergebnisse der Crosslinking-Versuche deuten auf einen Assemblierungskomplex hin, der sowohl CtaG als auch die UE I der Cytochrom c Oxidase enthält. In einem dritten Ansatz wurde ein zellfreies Expressionssystem etabliert, welches direkten Zugang zu naszierenden Ketten der UE I ermöglicht. Dieses System erscheint vielversprechend und dient derzeit als Basis für weitere Biogenesestudien. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass CtaG ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist, das im Zuge der Kupferbindung dimerisiert und in Paraoccus denitrificans in einem hochmolekularen Komplex gemeinsam mit UE I vorliegt. Die gegenwärtige Datenlage spricht dafür, dass CtaG als Kupferchaperon an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt ist und das CuB-Ion in einem kotranslationalen Mechanismus in die UE I der Cytochrom c Oxidase inseriert.
Tumoren epithelialen Ursprungs weisen häufig eine vermehrte Expression und/oder Mutationen des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR) auf. Durch die übermäßig starke bzw. permanente Vermittlung von Überlebens- und Proliferationssignalen an die betroffene Zelle trägt dies direkt zum Voranschreiten der Tumorerkrankung bei. Für eine Reihe von Tumorentitäten ist bekannt, dass eine abnorme Expression von EGFR mit einer schlechteren Prognose für den Krankheitsverlauf und die mittlere Überlebenszeit betroffener Krebspatienten korreliert. Begleitend zur systemischen Chemotherapie solcher Tumoren wird eine gerichtete Therapie zur Eindämmung der EGFR-vermittelten Signaltransduktion durch den Einsatz von Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI) oder EGFR-spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb) erzielt. Bei der therapeutischen Anwendung monoklonaler anti-EGFR Antikörper wurden in einigen Fällen lediglich milde Nebenwirkungen wie z.B. Hautausschläge beobachtet, wobei das Auftreten dieser Effekte mit dem Therapieerfolg korrelierte. Eine Reihe von monoklonalen Antikörpern, die gegen ErbB Rezeptor-Tyrosinkinasen gerichtet sind, sind mittlerweile zur Tumortherapie zugelassen, darunter der chimäre anti-EGFR Antikörper Cetuximab (Erbitux®, ImClone/BMS/Merck) zur Behandlung von metastasierenden Kolonkarzinomen sowie Karzinomen des Kopf- und Halsbereichs, der humane anti-EGFR Antikörper Panitumumab (Vectibix®, Amgen) bei metastasierenden Kolonkarzinomen, und der humanisierte anti-ErbB2 Antikörper Trastuzumab (Herceptin®, Genentech/Roche) bei Brustkrebs. Weitere Antikörper befinden sich derzeit in fortgeschrittenen Phasen der klinischen Entwicklung, darunter der humanisierte anti-EGFR Antikörper Matuzumab (Merck/Takeda). Klinische Daten zeigen, dass Patienten mit EGFR positiven Tumoren, die gegenüber etablierter Chemotherapie resistent sind, von der Behandlung mit anti-EGFR Antikörpern profitieren. Durch aktivierte EGF-Rezeptoren induzierte mitogene Signale werden vermindert bzw. blockiert, indem die Antikörper mit hoher Affinität an ErbB Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden und die Ligandenbindung bzw. die Dimerisierung verhindern, die zur Bildung aktivierter Rezeptor Dimere nötig ist. Auf diese Weise wird die mitogene Signalübertragung aktivierter ErbB-Rezeptor Dimere verhindert und die Proliferation der Tumorzelle wird verlangsamt oder kommt zum Stillstand. Es gibt Hinweise, dass darüber hinaus sekundäre Effektormechanismen des Immunsystems wie die antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) oder die komplementabhängige Zytotoxizität (CDC) gegen Antikörper-markierte Tumorzellen die anti-tumorale Wirksamkeit dieser Antikörper noch verstärken. Die lebensverlängernde Wirkung der Behandlung mit diesen Antikörpern ist ein Beispiel für die erfolgreiche Anwendung einer zielgerichteten Krebstherapie durch passive Immuntherapie. Zu Beginn dieser Arbeit waren die genauen Bindungsstellen der therapeutischen anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab noch unbekannt. Die Kenntnis der Lage der Epitope auf dem EGFR Molekül könnte wichtige Hinweise zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen dieser Antikörper liefern und Ansätze zur weiteren Optimierung dieser Therapeutika aufzeigen. Aus vorangegangenen Experimenten war bekannt, dass Cetuximab und Matuzumab Epitope auf dem EGFR erkennen, die eine intakte Raumstruktur des Rezeptors voraussetzen. Diese Beobachtungen konnten in dieser Arbeit bestätigt werden, ferner konnte die Lage der Epitope auf die EGFR Ektodomäne III/L2 eingegrenzt werden. Da sowohl Cetuximab als auch Matuzumab nicht-lineare, konformationelle Epitope erkennen, wurde eine Variante der Phage Display Methode zur Identifizierung von Peptiden gewählt, die mit den hypervariablen Regionen (CDR) dieser Antikörper interagieren, welche die Bindungsspezifität der Antikörper vermitteln. Ziel dieser Experimente war die Identifizierung von Peptiden, welche die konformationellen Epitope von Cetuximab bzw. Matuzumab in linearer bzw. zyklisch restringierter Form nachbilden. Die Aminosäuresequenzen solcher sogenannter Mimotope könnten zur Identifizierung entsprechender Oberflächenstrukturen am EGFR Molekül herangezogen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden aus kommerziell erhältlichen Bibliotheken genetisch modifizierter M13 Bakteriophagen, die randomisierte lineare bzw. zyklische Peptide als N-terminale Fusion am Oberflächenprotein pIII exponieren (M13KE), unter Anwendung der „Delayed Infectivity Panning“ (DIP) Methode Peptide angereichert, die von Cetuximab bzw. Maztuzumab erkannt werden. Zur Anreicherung von M13KE Bakteriophagen mit CDR-spezifischen Fusionspeptiden mittels DIP wurde zunächst ein „single-chain“ Antikörperfragment aus der cDNA von Matuzumab konstruiert und in den bakteriellen Expressionsvektor pIB-Tx kloniert. Mit dem resultierenden Konstrukt pIB-Tx-scFv(E72K) bzw. dem bereits vorhandenen analogen Konstrukt pIB-Tx-scFv(225), welches das „single-chain“ Antikörperfragment von Cetuximab enthält, wurden E. coli HB101 Bakterien transformiert, um die bakterielle Oberflächenexpression dieser Antikörperfragmente zum Einsatz in DIP Experimenten zu erreichen. In alternierenden positiven und negativen Selektionsrunden wurden unter Einsatz dieser scFv-exprimierenden E. coli HB101 Bakterien in Biopanning Experimenten Phagen mit solchen Fusionspeptiden angereichert, die selektiv an die „single-chain“ Antikörperfragmente von Cetuximab bzw. Matuzumab binden. Phagen ELISA Experimente mit M13KE Einzelklonen zeigten, dass aus allen eingesetzten Bibliotheken Phagen mit Fusionspeptiden isoliert werden konnten, die an den jeweiligen parentalen Antikörper des zur Selektion eingesetzten „single-chain“ Antikörperfragmentes binden. Ein Teil der Phagenklone wies eine zumindest partielle Kreuzreaktivität zu dem entsprechenden anderen anti-EGFR Antikörper auf, obwohl sie auf Bindung an diesen nicht selektioniert worden waren. Die Sequenzanalyse der Fusionspeptide lieferte keine gemeinsame Consensus Sequenz, es konnten jedoch kurze, gemeinsame Sequenzmotive identifiziert werden. In MTT-Zytotoxizitätsassays wurden diese Klone als mögliche Kompetitoren der Bindung des gegen EGFR gerichteten Immuntoxins scFv(225)-ETA in MTT-Zytotoxizitätsassays eingesetzt. Ein Teil der selektionierten Fusionspeptide war in der Lage, die Bindung der aus dem „single-chain“ Antikörperfragment von Cetuximab scFv(225) bestehenden Zellbindungsdomäne des Immuntoxins scFv(225)-ETA an EGFR exprimierende Zellen zu kompetieren. Auch für einige Fusionspeptide, die zunächst nur auf Bindung an Matuzumab selektioniert worden waren, wurde dies beobachtet. Peptide, welche die Bindung des Immuntoxins an EGFR kompetieren, weisen in ihren pIII-Fusionspeptiden laut Sequenzanalyse die gemeinsamen Sequenzmotive KTL bzw. YPLG auf. Nach einem Abgleich der Sequenzen der kompetierenden, kreuzreaktiven Peptide mit KTL bzw. YPLG Motiven wurden zwei Peptide ausgewählt und zur Immunisierung von Kaninchen eingesetzt. In MTT-Zytotoxizitätsassays wurde zunächst bestätigt, dass die synthetischen Peptide in der Lage sind, durch Kompetition spezifisch die Bindung des gegen EGFR gerichteten Immuntoxins scFv(225)-ETA und dessen zytotoxische Wirkung auf EGFR exprimierende Zellen zu verhindern. Kaninchenseren und aus diesen affinitätsgereinigte anti-Peptid Antikörper zeigten in ELISA Experimenten konzentrationsabhängige Bindung an die immobilisierten synthetischen Peptide. Die Bindung der anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab an die synthetischen Peptide konnte ebenfalls bestätigt werden. In einer Reihe von Experimenten wurde untersucht, ob die Immunisierung mit potentiellen Mimotopen der anti-EGFR Antikörper eine endogene humorale Immunantwort gegen den humanen EGFR bewirkt hatte. Die Bindung der affinitätsgereinigten anti-Peptid Antikörper an den Rezeptor auf der Oberfläche EGFR-exprimierender Tumorzellen wurde zunächst in Durchflusszytometrie (FACS) Experimenten analysiert. Für die gereinigten anti-Peptid Antikörper wurde spezifische Bindung an murine Renca-lacZ/EGFR Zellen sowie an humane A431 Vulvakarzinomzellen detektiert, die den humanen EGFR auf der Oberfläche exprimieren. Die Bindung an A431 konnte durch Vorinkubation der Antikörper mit einem Überschuss der entsprechenden synthetischen Peptide vollständig verhindert werden. In einer weiteren Serie von FACS Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Bindung der Antikörper Cetuximab und Matuzumab an EGFR durch eine Vorinkubation von Renca-lacZ/EGFR Zellen mit den gereinigten anti-Peptid Antikörpern deutlich reduziert werden konnte. Dies ist ein Beweis für die Fähigkeit der in Immunisierungsexperimenten generierten anti-Peptid Antikörper, die Bindungsstellen von Cetuximab und Matuzumab am EGFR zumindest teilweise zu besetzen. Diese Beobachtungen zeigen, dass durch Immunisierung mit den hier ausgewählten synthetischen Peptiden in Versuchstieren die Bildung von Antikörpern mit ähnlichen Eigenschaften wie Cetuximab bzw. Matuzumab und somit eine endogene Immunantwort gegen den humanen EGFR ausgelöst werden konnte. In Immunfluoreszenz Experimenten wurde die Bindung der anti-Peptid Antikörper an Renca-lacZ/EGFR Zellen erneut überprüft und mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) visualisiert. In diesen Experimenten wurde für gereinigte anti-Peptid Antikörper (KTL Motiv bzw. YPLG Motiv) Bindung an die Zelloberfläche bzw. membrannahe intrazelluläre Strukturen beobachtet, die der Lokalisierung der Bindungssignale der parallel getesteten anti-EGFR Antikörper Cetuximab, Matuzumab und dem murinen anti-EGFR Antikörper R-1 entsprach. Die Bindung der anti-Peptid Antikörper konnte durch Zugabe eines Überschusses der jeweiligen synthetischen Peptide verhindet werden. In einer weiteren Serie von Immunfluoreszenz Experimenten wurde der humane EGFR auf Renca-lacZ/EGFR Zellen gleichzeitig mit anti-KTL bzw. anti-YPLG Peptid Antikörpern aus Kaninchen sowie dem murinen anti-EGFR Antikörper R-1 detektiert. Durch eine Überlagerung der Signale konnte eindeutig eine Kolokalisation nachgewiesen werden. Dies ist ein Beweis dafür, dass es sich bei der Bindung der anti-Peptid Antikörper an die Oberfläche von Renca-lacZ/EGFR um Bindung an den humanen EGFR handelt. In Lysaten von EGFR exprimierenden Zelllinien konnte mit gereinigten anti-Peptid Antikörpern ein Protein detektiert werden, dessen Größe dem humanen EGFR entspricht. Die durch Stimulation des humanen EGFR mit dem natürlichen Peptidliganden EGF hervorgerufene Autophosphorylierung des Rezeptors in A431 Zellen konnte durch Zugabe von anti-Peptid Antikörpern teilweise inhibiert werden, allerdings nicht in dem gleichen Ausmaß, wie dies für die als Positivkontrollen eingesetzten anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab beobachtet wurde. In MTT-Zytotoxizitätsassays konnte darüber hinaus eine teilweise Kompetition der Bindung des rekombinanten Toxins TGF!-ETA an EGFR-exprimierende A431 Zellen, und somit eine teilweise Kompetition des natürlichen Peptidliganden TGF! an EGFR durch Vorinkubation mit anti-Peptid Antikörpern nachgewiesen werden. Zur näherungsweisen Quantifizierung der Affinitäten der anti-Peptid Antikörper und der anti-EGFR Antikörper Cetuximab und Matuzumab für die synthetischen Peptide (KTL Motiv und YPLG Motiv) bzw. für die gereinigte extrazelluläre Domäne des humanen EGFR (sEGFR) wurden ELISA Bindungstests durchgeführt. Die aus den Bindungskurven berechneten Affinitätswerte zeigen, dass die anti-Peptid Antikörper an sEGFR im nanomolaren Bereich binden und damit ca. 200-fach niedrigere Affinitäten für den Rezeptor besitzen als die affinitätsoptimierten anti-EGFR Antikörper Cetuximab bzw. Matuzumab. Die Affinitäten der anti- Peptid Antikörper für die synthetischen Peptide liegen ebenfalls im nanomolaren Bereich, während Cetuximab und Matuzumab lediglich mikromolare Affinitäten für die Peptide besitzen. Durch „Epitope Mapping“ in silico vorhergesagte mögliche Oberflächenstrukturen auf EGFR, welche die Peptidmimotope mit KTL bzw. YPLG Motiven nachbilden, sind direkt benachbart zu den mittlerweile publizierten Bindungsstellen von Matuzumab und Cetuximab bzw. EGF in der Ektodomäne III/L2 von EGFR (Li et al., 2005; Schmiedel et al., 2008) und zeigten im Falle des Peptides mit KTL Motiv Übereinstimungen mit Teilen beider Epitope. Möglicherweise ist dieses Peptid in der Lage, alternative Strukturen mit KTL bzw. KTI Motiven an der Oberfläche von EGFR nachzubilden, die Gemeinsamkeiten mit beiden Epitopen von Cetuximab bzw. Matuzumab besitzen und daher von beiden Antikörpern erkannt werden können. Eine endgültige Klärung der Bindung der hier identifizierten Peptide an Cetuximab bzw. Matuzumab bzw. der Bindung der anti-Peptid Antikörper an EGFR könnte in nachfolgenden Untersuchungen mittels Röntgenkristallographie bzw. NMR strukturell aufgeklärt werden – die hierzu nötigen Peptide bzw. Proteine liegen bereits in gereinigter Form vor. Eine Optimierung der hier identifizierten Mimotope zur Steigerung der Affinitäten der induzierten anti-Peptid Antikörper für EGFR könnte zur Entwickung von Vakzinen führen, die eine Alternative zur wiederholten, kostenintensiven passiven Immunisierung von Patienten mit EGFR-exprimierenden Tumoren mit monoklonalen Antikörpern darstellen könnte.
Mechanismus der Inhibition APOBEC3-vermittelter Restriktion durch das Bet Protein der Foamyviren
(2009)
Der Selektionsdruck seitens der Pathogene führte im Laufe der Evolution zur Entwicklung verschiedener Abwehrmechanismen. Neben der angeborenen und adaptiven Immunabwehr rückte in den letzten Jahren ein neuer Immunitätszweig in den Fokus der Wissenschaft, die sogenannte intrinsische Immunität. Dieser Begriff geht einher mit der Entdeckung zellulärer, antiviral wirkender Deaminasen aus der Familie der APOBEC3 Proteine (A3A, -B, -C, -DE, -F, -G und -H). Diese Proteine übten einen starken Selektionsdruck aus, so dass nur die Viren überleben konnten, die einen Weg gefunden haben diesen zellulären Replikationsblock zu umgehen. Die komplexen Retroviren, wie Lenti- und Foamyviren, haben dazu Proteine entwickelt, welche in der Lage sind die A3 vermittelte, zelluläre Abwehr auszuhebeln. Während das Vif Protein des HI-Virus, das den proteasomalen Abbau des Zielproteins induziert, intensiv erforscht wurde, ist die Wirkungsweise des foamyviralen Bet noch unbekannt und Gegenstand dieser Arbeit. Die Aufklärung der Wirkungsweise des Bet Proteins erforderte zunächst die Etablierung eines experimentellen Systems, das die Messung antiviraler Aktivität verschiedener A3 Proteine, sowie deren Neutralisation durch Bet erlaubt. Bet zeigt sich aktiv gegen die meisten Deaminasen der Primaten, nicht aber gegen die Deaminasen der Katze und der Maus. Da die Aktivität sowohl im homologen (PFV), als auch heterologen (SIV) System bestimmt wurde, wird eine Beteiligung anderer viraler Komponenten ausgeschlossen. Aus dem breiten Spektrum sensitiver A3 Proteine wurden das humane A3B, -C und –G für weitere Untersuchungen verwendet. Durch Titrationsexperimente mit huA3C und –G zeigte sich, dass Bet dosisabhängig agiert und unterschiedliche A3 Proteine unterschiedlich empfänglich sind. Die mittels Immunopräzipitation untersuchte Bindung zwischen Bet und den empfänglichen A3 Proteinen korreliert mit deren Neutralisierung. Die Bindungsstudie mit in vitro hergestelltem huA3C deutet auf eine direkte, RNase unabhängige Interaktion hin. Die Bet-bedingte Inhibition der Dimerisierung von huA3C und -G konnte mittels Immunopräzipitation und chemischer Quervernetzung gezeigt, sowie die Bet-Bindestelle mithilfe eines Rekombinationsansatzes innerhalb der Dimerisierungsfläche von huA3C lokalisiert werden. Fraktionierungen der Proteine nach Löslichkeit bzw. Dichte, sowie Immunofluoreszenzstudien und FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) zeigten Bet-abhängige Änderungen der Lokalisierung, Komplexbildung und zytoplasmatischen Beweglichkeit von huA3B, -C und –G. Als Resultat dieser veränderten Eigenschaften Bet-sensitiver A3 Proteine wird ihre Inkorporation in Virionen verhindert, was zum Verlust der antiviralen Aktivität führt. Damit beschreiben die Ergebnisse dieser Arbeit einen neuen Weg, den Viren beschreiten um die A3 vermittelte Immunität auszuschalten.
1. Fab co-complexes of proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) Fab fragments suitable for co-crystallization with complex I were generated using an immobilized papainbased protocol. The binding of the antibody fragments to complex I was verified using Surface Plasmon Resonance and size exclusion chromatography. The binding constants of the antibodies and their respective Fab fragments were found to be in the nanomolar range. This work presents the first report on successful crystallization of complex I (proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase) from Yarrowia lipolytica with proteolytic Fab fragments. The quality of the crystals was significantly improved when compared to the initial experiments and the best crystals diffracted X-rays to a resolution of ~7 Å. The activity of complex I remained uninfluenced by antibody fragment binding. The initial diffraction data suggest that the complex I/Fab co-complex crystals represent a space group different to the one observed for the native protein. Ongoing experiments are aimed at further enhancements of the diffraction quality of the crystals. Providing a different space group the CI/Fab co-complexes may become a very useful approach for structure determination of the enzyme. Moreover, the bound Fab offers an additional possibility to generate phase information. The antibody-mediated crystallization represents a valuable tool in structural characterization of the NADH:oxidoreductase subcomplexes or even single subunits. 2. UDP-glucose pyrophosphorylase UDP-glucose pyrophosphorylase from Yarrowia lipolytica displays affinity towards Ni2+ NTA and was first detected in a contaminated sample of complex I. Following, separation from complex I, Ugp1p was purified using anion exchange chromatography. Sequence similarity studies revealed high identity to other known pyrophosphorylases. As indicated by laser-based mass spectrometry method (LILBID) Ugp1p from Y. lipolytica builds octamers similarly to the enzyme from Saccharomyces cerevisiae. The initial crystals grew as thin needles favorably in sitting drop setups. The size of the crystals was increased by employment of a micro batch technique. The improved crystals diffracted X-rays to a resolution of 3.2 Å at the synchrotron beamline. Structural characterization is under way using a molecular replacement approach based on the published structure of baker’s yeast UGPase.
P2X receptors represent the third superfamily of ligand gated ion channels with ATP as their natural ligand. Most of the mammalian P2X receptors are non-selective cation channels, which upon activation, mediate membrane depolarization and have physiological roles ranging from fast excitatory synaptic transmission, modulation of pain-sensation, LTP to apoptosis etc. In spite of them being an attractive drug target, their potential as a drug target is limited by the lack of basic understanding of the structure-function relationship of these receptors. In my thesis, I have investigated the behavior of homomeric P2X receptor subunits with the help of photolabeling and fluorescence techniques coupled to electrophysiological measurements using Xenopus laevis oocytes heterologous expression system. Concurrent photolabeling by BzATP and current recordings from the same set of receptors in real time has revealed that the gating process in homomeric P2X receptors is contributed individually by each subunit in an additive manner. Our study for the first time describes the agonist potency of Alexa-ATP (a fluorescent ATP analog) on P2X1 receptors. The use of Alexa-ATP in our experiments elucidated that receptor subunits are not independent but interacting with each other in a cooperative manner. The type of cooperativity, however, depended on the type and concentrations of allosteric/competing ligands. Based on our results, in my thesis we propose an allosteric model for ligand-receptor interactions in P2X receptors. When simulated, the model could replicate our experimental findings thus, further validating our model. Further, correlation between occupancy of P2X1 receptors (determined using binding curve for Alexa-ATP) with the steady-state desensitization suggests that binding of three agonist molecules per receptor are required to desensitize P2X1 receptors. We further extended the approach of fluorescence with electrophysiological measurement to assign the role for different domains in P2X1 receptors with the help of environmental sensitive, cysteine reactive fluorophore (TMRM). Cysteine rich domain-1 of P2X1 receptors (C117-C165) was found to be involved in structural rearrangements after agonist and antagonist binding. In contrast to the present understanding, that the binding of an antagonist cannot induce desensitization in P2X1 receptors and the receptors need to open first before undergoing desensitization, we propose based on our results that a competitive antagonist can also induce desensitization in P2X1 receptors by bypassing the open state. We have attempted to answer few intriguing questions in the field of P2X receptor research and we think that our answers provide many avenues to the basic understanding of functioning of P2X receptors.
Lentiviral vectors mediate gene transfer into dividing and most non-dividing cells. Thereby, they stably integrate the transgene into the host cell genome. For this reason, lentiviral vectors are a promising tool for gene therapy. However, safety and efficiency of lentiviral mediated gene transfer still needs to be optimised. Ideally, cell entry should be restricted to the cell population relevant for a particular therapeutic application. Furthermore, lentiviral vectors able to transduce quiescent lymphocytes are desirable. Although many approaches were followed to engineer retroviral envelope proteins, an effective and universally applicable system for retargeting of lentiviral cell entry is still not available. Just before the experimental work of this thesis was started, retargeting of measles virus (MV) cell entry was achieved. This virus has two types of envelope glycoproteins, the hemagglutinin (H) protein responsible for receptor recognition and the fusion (F) protein mediating membrane fusion. For retargeting, the H protein was mutated in its interaction sites for the native MV receptors and a ligand or a single-chain antibody (scAb) was fused to its ectodomain. It was hypothesised that the retargeting system of MV can be transferred to lentiviral vectors by pseudotyping human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) derived vector particles with the MV glycoproteins. As the unmodified MV glycoproteins did not pseudotype HIV vectors, two F and 15 H protein variants carrying stepwise truncations or amino acid (aa) exchanges in their cytoplasmic tails were screened for their ability to form MV-HIV pseudotypes. The combinations Hcd18/Fcd30, Hcd19/Fcd30 and Hcd24+4A/Fcd30 led to most efficient pseudotype formation with titers above 10exp6 transducing units /ml, using concentrated particles. The F cytoplasmic tail was truncated by 30 aa and the H cytoplasmic tail was truncated by 18, 19 or 24 residues with four added alanines after the start methionine in the latter case. Western blot analysis indicated that particle incorporation of the MV glycoproteins was enhanced upon truncation of their cytoplasmic tails. With the MV-HIV vectors high titers on different cell lines expressing one or both MV receptors were obtained, whereas MV receptor-negative cells remained untransduced. Titers were enhanced using an optimal H to F plasmid ratio (1:7) during vector particle production. Based on the described pseudotyping with the MV glycoprotein variants, HIV vectors retargeted to the epidermal growth factor receptor (EGFR) or the B cell surface marker CD20 were generated. For the production of the retargeted vectors MVaEGFR-HIV and MVaCD20-HIV, Fcd30 together with a native receptor blind Hcd18 protein, displaying at its ectodomain either the ligand EGF or a scAb directed against CD20 were used. With these vectors, gene transfer into target receptor-positive cells was several orders of magnitude more efficient than into control cells. The almost complete absence of background transduction of non-target cells was e.g. demonstrated in mixed cell populations, where the CD20-targeting vector selectively eliminated CD20-positive cells upon suicide gene transfer. Remarkably, transduction of activated primary human CD20-positive B cells was much more efficient with the MVaCD20-HIV vector than with the standard pseudotype vector VSV-G-HIV. Even more surprisingly, MVaCD20-HIV vectors were able to transduce quiescent primary human B cells, which until then had been resistant towards lentiviral gene transfer. The most critical step during the production of MV-HIV pseudotypes was the identification of H cytoplasmic tail mutants that allowed pseudotyping while retaining the fusion helper function. In contrast to previously inefficient targeting strategies, the reason for the success of this novel targeting system must be based on the separation of the receptor recognition and fusion functions onto two different proteins. Furthermore, with the CD20-targeting vector transduction of quiescent B cells was demonstrated for the first time. Own data and literature data suggest that CD20 binding and hyper-cross-linking by the vector particles results in calcium influx and thus activation of quiescent B cells. Alternatively this feature may be based on a residual binding activity of the MV glycoproteins to the native MV receptors that is insufficient for entry but induces cytoskeleton rearrangements dissolving the post-entry block of HIV vectors. Hence, in this thesis efficient retargeting of lentiviral vectors and transduction of quiescent cells was combined. This novel targeting strategy should be easily adaptable to many other target molecules by extending the modified MV H protein with appropriate specific domains or scAbs. It should now be possible to tailor lentiviral vectors for highly selective gene transfer into any desired target cell population with an unprecedented degree of efficiency.
Large amplitude intramolecular motions in non-rigid molecules are a fundamental issue in chemistry and biology. The conventional approaches for study these motions by far-infrared and microwave spectroscopy are not applicable when the molecule is non-polar. Therefore, in the current thesis an alternative approach for the investigation of large amplitude intramolecular motions was developed and tested. This new method is based on femtosecond rotational degenerate four-wave mixing spectroscopy (fs DFWM), which is a particular implementation of rotational coherence spectroscopy. The method was successfully applied for the investigation of pseudorotation in pyrrolidine and the ring-puckering vibration in cyclopentene. Another important subject is the photophysics of molecules and molecular clusters which have an ultrashort lifetime of their electronically excited state (photoreactivity). These ultrashort lifetimes often represent a protective mechanism causing photostability. The photoreactivity is usually the manifestation either of an “elementary” reaction, such as proton or electron transfer, which occurs in the excited state or of a fast non-radiative deactivation processes, such as internal conversion via conical intersection of the electronically excited and ground state. Due to a short-lived excited state, the conventional vibrational spectroscopic methods, such as IR depletion detected by resonance two-photon ionization spectroscopy (IR/R2PI), are not applicable for the structural investigation of these systems. Therefore, new approach, termed IR depletion detected by multiphoton ionization with femtosecond laser pulses (IR/fsMPI), was developed for studying the structure of photoreactive microsolvated molecules. The IR/fsMPI technique was applied for investigating the clusters of 1H-pyrrolo[3,2-h]quinoline with water/methanol as well as adenine- and 9-methyl-adenine-hydrates. In addition, the excited state dynamics of bifunctional azaaromatic molecule 7-(2'-pyridyl)indole (7PyIn) was studied by femtosecond pump-probe resonance excitation multiphoton ionization technique (fs REMPI). Under electronic excitation of this molecule a fast proton transfer (phototautomerization) takes place, which is followed by radiationless excited state deactivation process. The fs REMPI spectra lead to the conclusion that the phototautomerization in 7PyIn is coupled with a twisting of the molecule, and that the twisting provides an efficient channel for ultrafast radiationless excited state deactivation. This pattern of excited-state tautomerization/deactivation might be quite general.
Mit ihren so genannten Linsenkästen gelang Mary Bauermeister Anfang der 1960er-Jahre der Durchbruch auf dem New Yorker Kunstmarkt. Bis heute sind die fragilen, leuchtenden Objekte aus Holz, Glas, Leinwand und Papier das Alleinstellungsmerkmal der Künstlerin. Die hier vorliegende Dissertationsschrift erläutert die konsequente Entwicklung der Linsenkästen aus dem Frühwerk und unternimmt erstmals eine stilistische Einordnung in den Kunstkontext der 1960er-Jahre. Dabei wird deutlich, dass Bauermeister mehr den Künstlern der Klassischen Moderne (Duchamp, Schwitters, Klee, Kandinsky) verpflichtet ist denn ihren Zeitgenossen im Rheinland oder in der Kunstmetropole New York.
This study analyses five British translations of Bertolt Brecht's 'Mutter Courage und ihre Kinder'. Two of these translations were written by speakers of German, and three by well-known British playwrights with no knowledge of the source text language. Four have been produced in mainstream British theatres in the past twenty-five years. The study applies translation studies methodology to a textual analysis which focuses on the translation of techniques of linguistic "Verfremdung", as well as linguistic expression of the comedy and of the political dimension in the work. It thus closes the gap in current Brecht research in examining the importance of his idiosyncratic use of language to the translation and reception of his work in the UK. The study assesses the ways in which the translator and director are influenced by Brecht's legacy in the UK and in turn, what image of Brecht they mediate through the production on stage. To this end, the study throws light on the formation of Brecht's problematic reputation in the UK, and it also highlights the social and political circumstances in early twentieth century Germany which prompted Brecht to develop his theory of an epic theatre. The focus on a linguistic examination allows the translator's contribution to the production process to be isolated. Together with an investigation of the reception of each performance text, this in turn facilitates a more accurate assessment of the translator and director's respective influence in the process of transforming a foreign-language text onto a local stage. The analysis also sheds light on the different approaches taken by speakers of German, and playwrights creating an English version from a literal translation. It pinpoints losses in translation and adaptation, and suggests how future versions may avoid these.
In wissenschaftlichen als auch administrativen Kontexten ist die Überzeugung weit verbreitet, es müssten neue Steuerungsmodelle und Steuerungsinstrumente im Schulwesen implementiert werden. Die Einführung neuer Steuerungsmodelle und Steuerungsinstrumente wird dabei entweder am Vorbild anderer Länder ausgerichtet, so
z. B. bei der Einrichtung von Qualitätsagenturen, oder es wird an Steuerungsinstrumente angeknüpft, die auch in Deutschland eine Tradition haben, wie bspw. das Zentralabitur. Für diese unterschiedlichen Maßnahmen hat sich in den letzten Jahren der Begriff der Qualitätssicherung bzw. Qualitätsentwicklung eingebürgert. Man kann die im Schulwesen ergriffenen Maßnahmen aber auch in einen weiteren Kontext stellen und neue Steuerungsmodelle im Zusammenhang mit allgemeinen Modernisierungsbestrebungen im Staats- und Verwaltungswesen betrachten. Diese Theorieansätze, die unter dem Oberbegriff New Public Management populär geworden sind, eröffnen den begrifflich-analytischen Rahmen, der institutionelle Wandlungsprozesse verständlich macht. Die vorliegende Arbeit geht der Frage nach, ob und wie sich ein Funktionswandel der (unteren) staatlichen Schulaufsicht von einem bürokratischen Steuerungssystem zu einem schulischen Unterstützungssystem abzeichnet. Dabei geht die vorliegende Arbeit von der Grundannahme aus, dass die staatliche Schulaufsicht als Teil des Staats- und Verwaltungswesens betrachtet werden muss, wenn man eine realistische Einschätzung darüber gewinnen möchte, welche institutionellen Veränderungsprozesse sich aktuell vollziehen und welche Entwicklungsspielräume in Zukunft bestehen. Dieser Frage soll nicht nur theoretisch, sondern auch empirisch nachgegangen werden. Um dem Forschungsgegenstand gerecht zu werden, wird ein akteursorientierter Ansatz gewählt. Da man es bei vielen Reformen im öffentlichen Sektor mit einer Gemengelage von Interessen unterschiedlichster Akteure zu tun hat, bietet eine akteursorientierte Perspektive den Vorteil, institutionelle Wandlungsprozesse in einem gesellschaftlichen
System auf makro- und mikropolitischer Ebene greifbar zu machen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit werden die Modernisierungsansätze vorgestellt, die unter dem Begriff New Public Management firmieren. Ergänzend dazu wird der aktuelle wissenschaftliche Diskussionsstand in Politik- und Sozialwissenschaft skizziert. Es folgt eine Beschreibung erster Wirkungen neuer Steuerungsformen in
Deutschland und im anglo-amerikanischen Raum sowie konkret am Fallbeispiel der Schulaufsichtsbehörden in England. Abschließend wird der Diskurswechsel von New Public Management zu New Public Governance beschrieben. Der Diskurs zu New Public Governance betont die Rolle von Akteuren in Modernisierungsprozessen. Der zweite Teil stellt überblicksartig die Institutionalgeschichte der staatlichen
Schulaufsicht dar, die als wichtigste Determinante für weitergehende Reformbestrebungen gelten kann. Es folgt die Darstellung aktueller Entwicklungstendenzen im schulischen Steuerungssystem. Dabei können die Neu-Gründung von Qualitätsagenturen, die Einführung von Schulinspektionen, die Bestimmung strategischer Ziele im Schulsystem und die Etablierung von Berichtssystemen als ein Lernen aus internationalen Entwicklungen beschrieben werden. Die anschließende vertiefte Diskussion von Managementansätzen macht deutlich, dass die Möglichkeiten, die untere Schulaufsicht zu einem schulischen Unterstützungssystem zu entwickeln, noch nicht ausgeschöpft sind. Es wird dahingehend argumentiert, dass die Managementansätze als ein Professionalisierungsimpuls für das Steuerungssystem gelten können: Anspruchsvolle Aufgaben im system monitoring und im Bereich der Schulentwicklung kann die untere Schulaufsicht nur auf der Basis breiten, sozialwissenschaftlichen Wissens gerecht werden. Im dritten Teil wird konkret am Beispiel der unteren Schulaufsicht in Hessen
herausgearbeitet, welche Funktionen die staatliche Schulaufsicht wahrnimmt und wie sich ein möglicher Funktionswandel auf die Arbeit der unteren Schulaufsichtsebene auswirkt. Dazu wird Interviewmaterial genutzt, dass in Gruppendiskussionen mit fachlichen Schulaufsichtsbeamten in Hessen gewonnen wurde. Um einen umfassenderen Überblick über aktuelle Entwicklungstendenzen zu erhalten, wird ergänzend dazu Material aus Experteninterviews mit Vertretern der oberen Schulaufsicht hinzugezogen. Im Rückgriff auf die Daten eines Evaluationsprojekts am Deutschen Institut für Internationale Pädagogische Forschung(DIPF), werden Leistungen und Funktionalität der unteren Schulaufsicht aus der Perspektive der fachlichen Schulaufsichtsbeamten bewertet: Zum einen aus der Binnensicht interner Organisation und zum anderen in der Außendimension als Steuerungsinstanz im Schulsystem. Der zusätzliche Vergleich mit den Schulleiterdaten soll Auskunft darüber geben, inwieweit die Bewertungen hinsichtlich derzeitiger und zukünftiger Funktionen konvergent bzw. divergent sind. Im vierten Teil werden die Ergebnisse der Untersuchung mit den theoretischen Vorüberlegungen aus den ersten beiden Kapiteln verknüpft. Es werden Entwicklungsmöglichkeiten des schulischen Steuerungssystems aufgezeigt und weitergehende Evaluationsansätze nach Maßgabe der Grundlagentheorien diskutiert.
Während des Alterungsprozesses kommt es u.a. im Gehirn zu einem signifikanten Verlust
postmitotischer Zellen, was zu Hirnleistungsstörungen im Alter führen kann.
Der Grund für diesen Zellverlust durch Apoptose könnte sein, dass es im Alter zu erhöhtem
oxidativen Streß und zu einer Veränderung in der Konzentration der an der Apoptose beteiligten
Proteine und Faktoren kommt. Diese Studie befaßt sich mit der neuronalen Apoptose und den daran
beteiligten Proteinen und Regulatoren. Ziel war es, herauszufinden, ob es im Alter zu einer
gesteigerten Apoptoserate im Hippokampus und zu einer Veränderung der Konzentration von
Proteinen kommt, die das Auftreten bzw. die Hemmung der Apoptose begünstigen könnte.
Untersucht wurden die Hippokampi von Pavianen als mögliches Primaten-Modell für altersbedingte
Pathologien, die das menschliche Gehirn betreffen können.
Um apoptotische Zellen im Hippokampus der Paviane nachzuweisen, wurde mit der TUNEL-Methode
gearbeitet und mittels Immunhistochemie untersucht, welchen Effekt das Alter auf die Verteilung der
Immunreaktivität von Cytochrom C, AIF, Bax, Bcl-2, Caspase-3 sowie von XIAP, einem Inhibitor der
Apoptose, hat. Auch die Immunreaktivität der Enzyme PARP und ICAD wurde dargestellt. Die
Ergebnisse zeigen, dass in den Hippokampi der gealterten Paviane das anti-apoptotische Protein Bcl-2
in unveränderter Reaktivität vorlag und das pro-apoptotische Protein Bax hochreguliert war. Es gab
eine Umverteilung und möglicherweise Freisetzung von Cytochrom C, jedoch aber keine Aktivierung
von Caspase-3. Diese Ergebnisse zeigen eine gewebepezifische Änderung des Bcl-2/Bax-
Verhältnisses in den Hippokampi der alten Primaten, die zur Beeinflussung der Cytochrom CFreisetzung
beitragen, ohne jedoch zur Apoptose der Zelle zu führen. Apoptotische Zellen konnten
mittels TUNEL-Färbung nicht nachgewiesen werden. Das könnte damit zusammenhängen, dass
XIAP, ein inhibitorisches Regulatorprotein der Apoptose, bei den gealterten Pavianen hochreguliert
war, ebenso wie das DNA-Reparaturenzym PARP. Auch das Enzym ICAD, welches in aktivierter
Form während der Apoptose wesentlich zum Chromatinabbau beiträgt zeigte im Alter eine erhöhte
Aktivität. Da in einer Studie über Tau-Pathologie im Hippokampus von Pavianen für das Auftreten
dieser Pathologie ein Zusammenhang mit dem Alter nachgewiesen werden konnte, und man weiß,
dass Zellen in der Nähe der β-Amyloidablagerung bei M.Alzheimer durch Apoptose absterben, wurde
mit Hilfe der Immunfloureszenz die Reaktivität des Enzyms Neprelysin untersucht, welches für den
β-Amyloidablagerung zuständig ist. Dieses war in seiner Reaktivität in den Hippokampi
der älteren Paviane im Gegensatz zu der in den Hippokampi der jüngeren Primaten erniedrigt, was auf
eine altersbedingte Disposition zu diesen Plaques hinweist.
Um die kontinuierlich auf uns einströmende Menge an Reizen zu verarbeiten, ist es wichtig, die Informationen genau zu selektieren. Ein hilfreicher Mechanismus ist hierbei die Aufmerksamkeit gezielt nur auf eine Informationsquelle zu richten und zu verarbeiten.
So ist es möglich, selbst in komplexen Situationen, wie zum Beispiel einer Feier mit vielen verschiedenen Gesprächen, ganz gezielt ein einzelnes herauszufiltern.
Der Effekt von Aufmerksamkeit auf auditory steady-state Responses (aSSR) wurde in der Vergangenheit schon in verschiedenen Studien mit unterschiedlichen Messverfahren und Stimuli untersucht. Dabei wurden teils widersprüchliche Ergebnisse gefunden, die entweder gar keine oder auf sehr kleine Frequenzbereiche beschränkte Aufmerksamkeitseffekte fanden.
Das Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen von Aufmerksamkeit auf die aSSR innerhalb eines größeren Frequenzspektrums (11 Hz, 23 Hz, 41 Hz, 73 Hz und 97 Hz) zu analysieren. Für diesen Zweck wurden den Probanden nach Instruktion der zu beachtenden Seite jeweils zwei benachbarte Modulationsfrequenzen während vier aufeinander folgenden Blöcken dichotisch präsentiert. Die Probanden wurden angewiesen, Trägerfrequenzänderungen auf der zu beachtenden Seite durch Betätigen einer Maustaste anzugeben. Die Registrierung der aSSR-Antworten geschah mittels Elektroenzephalogramm (EEG). Auch die durch die Stimulation hervorgerufene P300 wurde dargestellt.
Bezüglich des Effekts von Aufmerksamkeit auf die aSSRs zeigte sich nach Analyse der gewonnenen Daten im Frequenzbereich von 23 Hz eine Auswirkung. Diese stellte sich in Form einer Amplitudensteigerung auf der jeweils durch den Probanden beachteten Präsentationsseite dar. Bei einer Modulationsfrequenz von 41 Hz kam es bei Präsentation auf der rechten Seite zu höheren Amplituden als bei Präsentation auf der linken Seite. Bei 73 Hz und 97 Hz konnte keinerlei Auswirkung weder der Aufmerksamkeit noch der Präsentationsseite registriert werden. Auffällig war bei den präsentierten Tönen im 20 Hz und 70 Hz Bereich auch eine im Vergleich zu den anderen Frequenzbereichen (11 Hz, 41 Hz und 97 Hz) verlängerte Reaktionszeit der Probanden. In Kombination mit der Modulation der aSSR-Amplitude durch Aufmerksamkeit bei 23 Hz könnte dies ein Hinweis auf einen förderlichen Einfluss der Aufgabenschwierigkeit auf die Detektierbarkeit von Aufmerksamkeitseffekten sein.
Im Gegensatz hierzu zeigte die dargestellte P300 in allen präsentierten Blöcken einen deutlichen Effekt der Aufmerksamkeit. Dieser äußerte sich ebenfalls in einer Steigerung der Amplitude.
Es scheint also zumindest ein moderater Einfluss von Aufmerksamkeit auf die aSSRs zu existieren. Gleichzeitig wirkt dieser allerdings stark abhängig von gewähltem Stimulus und Messmethode. Der Effekt von Aufmerksamkeit auf die P300 konnte dagegen gut repliziert werden und scheint daher bei dichotischer Stimulation ein deutlicher Marker für Aufmerksamkeit zu sein.
Als Nadelstichverletzungen (NSV) bezeichnet man jede Stich-, Schnitt- und Kratzverletzung der Haut durch Kanülen, Skalpelle oder andere medizinische Instrumente, die mit Patientenmaterial verunreinigt sind. Davon unabhängig ist, ob die Wunde geblutet hat oder nicht. Die beinhaltet auch den direkten Kontakt mit der Schleimhaut von Mund, Nase oder Augen. Die größte Gefahr geht hierbei von einer Infektion mit Hepatitis B, C sowie dem humanem-Immundefizients- Virus (HIV) aus. In der vorliegenden Arbeit wurden Häufigkeit und Ursachen von NSV bei Beschäftigten von fünf verschiedenen medizinischen Fachkliniken der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main, mithilfe eines anonymisierten Fragebogens ermittelt. Dabei handelte es sich um die Zentren für Anästhesie, Dermatologie, Chirurgie, Gynäkologie und Pädiatrie. Alle Befragten hatten in den 12 Monaten vor dieser Erhebung Kontakt mit Patienten- oder Untersuchungsmaterial. Die Ergebnisse wurden zwischen den jeweiligen Fachkliniken und den einzelnen Berufsgruppen, wie Ärzten, Pflege- und Reinigungspersonal, verglichen. Es sollte geklärt werden, womit und wobei sich NSV am häufigsten ereigneten. Weiterhin wurde untersucht, wie Health Care Worker (HCW) eine erlittene NSV einschätzen, welche Schutzmaßnahmen sie gegen Verletzungen ergriffen haben und ob eine erlittene NSV Einfluss auf ihr künftiges Verhalten hatte. Anhand dieser Daten wurde klassifiziert, ob und gegebenenfalls wie viel NSV vermeidbar gewesen wären. Anschließend wurde diskutiert, wie das Risiko von NSV verringert werden kann. An der Erhebung nahmen 720 von 919 in den Zentren beschäftigten Personen teil (Rücklaufrate 78,3%). 71,6% der Ärzte, 76,4% des Pflegepersonals, 75% der Laborangestellten sowie 100% von denen, die als “Sonstige“ klassifiziert wurden als auch vom Reinigungspersonal, sandten den Fragebogen zurück. Von den 226 HCW (31,4%), die in den letzten 12 Monaten mindestens eine NSV erlitten hatten, waren Ärzte mit 55,1% signifikant häufiger betroffen als das Pflegepersonal mit 22%. Von allen 561 stattgefundenen NSV im letzten Jahr ist es in der Chirurgie am 10 häufigsten zu einer NSV gekommen (59,9%), am seltensten in der Dermatologie (6,4%). Dabei waren die Ärzte der Chirurgie, Pädiatrie, Dermatologie und Gynäkologie signifikant häufiger betroffen als das Pflegepersonal, in der Anästhesie waren jedoch nicht mehr signifikant mehr Betroffene. In der Anästhesie gaben 75% aller Mitarbeiter an, mehr als 20 Eingriffe mit Verletzungsrisiko pro Woche vorzunehmen, in der Chirurgie nur 53,8%. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Häufigkeit verletzungsträchtiger Eingriffe nicht mit der Zahl der Verletzungen korreliert. Abgesehen von der Angabe „Sonstiges“, die mehrere Ereignisse repräsentiert, ereigneten sich NSV am häufigsten beim Nähen (23%) und bei Blutabnahmen (13%), also an den Instrumenten, die in den meisten Fachkliniken auch am häufigsten verwendet wird. Nur 5% aller NSV wurden von den HCW als schwer bezeichnet. Ein ungenügendes Sicherheitsbewusstsein bei den Mitarbeitern zeigte sich zum einen dadurch, dass insgesamt bei fast einem Drittel (27,9%) der NSV auf das Tragen von Handschuhen verzichtet wurde. Dabei unterschieden sich die Kliniken untereinander signifikant, wobei in der Chirurgie und Anästhesie mit 85,7% bzw. 81,3% im Gegensatz zu der Pädiatrie mit 35,8%, am häufigsten Handschuhe getragen wurden. Auch waren sich zwar insgesamt 78,2% der HCW sicher über einen suffizienten Hepatitis-B-Impfschutz, wobei die Ärzte signifikant besser in Kenntnis darüber waren als das Pflegepersonal, jedoch wussten über ein Viertel (25,8) der Angestellten in der Pädiatrie nicht darüber Bescheid. Beim Arbeiten mit scharfen Gegenständen am Krankenbett nahmen nur 29,4% der Befragten einen Abwurfbehälter mit und über die Hälfte (50,4%) gaben an, keine NSV dem D-Arzt gemeldet zu haben. Das Pflegepersonal hatte signifikant häufiger gemeldet als die Ärzte. Ihr Verhalten nach einer NSV nicht geändert zu haben, gaben 53,1% der Betroffenen an. Insgesamt hätten 36,7% aller NSV durch Instrumente mit Sicherheitsvorkehrungen sicher vermieden werden können, in der Pädiatrie und der Gynäkologie sogar mehr als 80%.
Manual development of deep linguistic resources is time-consuming and costly and therefore often described as a bottleneck for traditional rule-based NLP. In my PhD thesis I present a treebank-based method for the automatic acquisition of LFG resources for German. The method automatically creates deep and rich linguistic presentations from labelled data (treebanks) and can be applied to large data sets. My research is based on and substantially extends previous work on automatically acquiring wide-coverage, deep, constraint-based grammatical resources from the English Penn-II treebank (Cahill et al.,2002; Burke et al., 2004; Cahill, 2004). Best results for English show a dependency f-score of 82.73% (Cahill et al., 2008) against the PARC 700 dependency bank, outperforming the best hand-crafted grammar of Kaplan et al. (2004). Preliminary work has been carried out to test the approach on languages other than English, providing proof of concept for the applicability of the method (Cahill et al., 2003; Cahill, 2004; Cahill et al., 2005). While first results have been promising, a number of important research questions have been raised. The original approach presented first in Cahill et al. (2002) is strongly tailored to English and the datastructures provided by the Penn-II treebank (Marcus et al., 1993). English is configurational and rather poor in inflectional forms. German, by contrast, features semi-free word order and a much richer morphology. Furthermore, treebanks for German differ considerably from the Penn-II treebank as regards data structures and encoding schemes underlying the grammar acquisition task. In my thesis I examine the impact of language-specific properties of German as well as linguistically motivated treebank design decisions on PCFG parsing and LFG grammar acquisition. I present experiments investigating the influence of treebank design on PCFG parsing and show which type of representations are useful for the PCFG and LFG grammar acquisition tasks. Furthermore, I present a novel approach to cross-treebank comparison, measuring the effect of controlled error insertion on treebank trees and parser output from different treebanks. I complement the cross-treebank comparison by providing a human evaluation using TePaCoC, a new testsuite for testing parser performance on complex grammatical constructions. Manual evaluation on TePaCoC data provides new insights on the impact of flat vs. hierarchical annotation schemes on data-driven parsing. I present treebank-based LFG acquisition methodologies for two German treebanks. An extensive evaluation along different dimensions complements the investigation and provides valuable insights for the future development of treebanks.
‘The whole is more than the sum of its parts.’ This idea has been brought forward by psychologists such as Max Wertheimer who formulated Gestalt laws that describe our perception. One law is that of collinearity: elements that correspond in their local orientation to their global axis of alignment form a collinear line, compared to a noncollinear line where local and global orientations are orthogonal. Psychophysical studies revealed a perceptual advantage for collinear over non-collinear stimulus context. It was suggested that this behavioral finding could be related to underlying neuronal mechanisms already in the primary visual cortex (V1). Studies have shown that neurons in V1 are linked according to a common fate: cells responding to collinearly aligned contours are predominantly interconnected by anisotropic long-range lateral connections. In the cat, the same holds true for visual interhemispheric connections. In the present study we aimed to test how the perceptual advantage of a collinear line is reflected in the anatomical properties within or between the two primary visual cortices. We applied two neurophysiological methods, electrode and optical recording, and reversibly deactivated the topographically corresponding contralateral region by cooling in eight anesthetized cats. In electrophysiology experiments our results revealed that influences by stimulus context significantly depend on a unit’s orientation preference. Vertical preferring units had on average a higher spike rate for collinear over non-collinear context. Horizontal preferring units showed the opposite result. Optical imaging experiments confirmed these findings for cortical areas assigned to vertical orientation preference. Further, when deactivating the contralateral region the spike rate for horizontal preferring units in the intact hemisphere significantly decreased in response to a collinear stimulus context. Most of the optical imaging experiments revealed a decrease in cortical activity in response to either stimulus context crossing the vertical midline. In conclusion, our results support the notion that modulating influences from stimulus context can be quite variable. We suggest that the kind of influence may depend on a cell’s orientation preference. The perceptual advantage of a collinear line as one of the Gestalt laws proposes is not uniformly represented in the activity of individual cells in V1. However, it is likely that the combined activity of many V1 neurons serves to activate neurons further up the processing stream which eventually leads to the perceptual phenomenon.
Risikoabschätzung für das Auftreten Thrombolyse-assoziierter intrazerebraler Blutungen mittels MRT
(2009)
Symptomatische intrazerebrale Blutungen (sICH) stellen die wichtigste Komplikation der Thrombolyse akuter ischämischer Schlaganfälle dar. Sie sind mit einer erhöhten Mortalität und sehr schlechten Langzeitergebnissen verbunden. Die Identifikation von Patienten mit einem erhöhten Blutungsrisiko stellt daher ein wesentliches Ziel aktueller Forschungsbemühungen dar.
In der vorliegenden Studie wurde die Bedeutung ausgewählter MR-Parameter (Leukoaraiosis, Mikroblutungen, Ausmaß der DWI-Läsion) als mögliche Prädiktoren für Thrombolyse-assoziierte sICH untersucht.
In die retrospektive, multizentrische Studie wurden prospektiv erhobene Daten von 475 Patienten aus sechs deutschen und zwei internationalen anerkannten Schlaganfallzentren eingeschlossen, die im Zeitfenster von <6 Stunden mit einem akuten ischämischen Schlaganfallereignis im Bereich der vorderen Zirkulation mit einer i.v. (n=367; 77%), i.a. (n=74; 16%) oder i.v./i.a. (n=34; 7%) Thrombolyse behandelt worden.
Alle Patienten wurden mit einem Schlaganfall-MR-Protokoll untersucht, welches neben Diffusions- und FLAIR-Sequenzen auch T2*-gewichtete Sequenzen enthielt.
Für die Analyse wurden die Patienten jeweils in eine Gruppe ohne und eine Gruppe mit schwerer LA (Fazekas 0-1 vs. 2-3) und je eine Gruppe mit kleinem (<1/3 des A. cerebri media-Stromgebietes (MCA)) und großem (>1/3 MCA) DWI-Läsionsausmaß dichotomisiert. T2*-Wichtungen wurden auf das Vorliegen und die Anzahl von zerebralen Mikroblutungen (CMB) untersucht und Patienten in eine Gruppe mit ≥1 CMB und ohne CMB dichotomisiert.
Eine sICH wurde als eine in der Verlaufsbildgebung (cCT oder MRT) dokumentierte (≥10 ml) Blutung definiert, die innerhalb von 36 Stunden nach Thrombolysebeginn mit einer klinischen Verschlechterung des Patienten (≥1 Punkt auf der NIHSS-Skale) einherging.
Insgesamt entwickelten 28 (5,9%) Patienten eine sICH. SICH waren signifikant häufiger in der Gruppe mit LA (Fazekas 2-3) (n=12/114; 10,5%) als in der Gruppe ohne LA (Fazekas 0-1) (n=13/335; 3,5%) zu finden. In einer logistischen Regressionsanalyse (Alter, National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) bei Aufnahme, Art der Thrombolyse) blieb LA ein unabhängiger Risikofaktor (Odds ratio 2,7 (95% KI, 1,29-6,59), p=0,015).
Die Anzahl der sICH konnte auch in der Gruppe mit großen (>1/3 MCA) (n=6/32; 18,8%) signifikant häufiger als in der Gruppe mit kleinen DWI-Läsionen (<1/3 MCA) (n=12/319; 3,8%) erhoben werden, was umgerechnet einem 5,9 fachen Risiko (Odds ratio 5,9 (95% KI, 2,048-17,017, p=0,003) einer sICH für Patienten mit großen DWI-Läsionen im Vergleich zu Patienten mit kleinen DWI-Läsionen entspricht. Das Ausmaß der DWI-Läsion bleibt in einer multivariaten Regressionsanalyse (s.o.) ein unabhängiger Risikofaktor für sICH.
Die Ergebnisse einer großen Subgruppenanalyse der i.v.-behandelten Patienten (n=367/376, 77%) waren hinsichtlich der Bedeutung für LA und Ausmaß der DWI-Läsion vergleichbar mit den Ergebnisse der Gesamtmenge.
Die Anzahl der sICH unterschied sich nicht signifikant zwischen der Gruppe mit ≥1 CMB (n=7/79, 9%) und der Gruppe ohne CMB (n=20/367, 5%, p=0,295).
Zusammenfassend konnte die vorliegende Arbeit die MR-Parameter Leukoaraiose und das Ausmaß der initialen DWI-Läsion als unabhängige Risikofaktoren hinsichtlich der Enwicklung Thrombolyse-assoziierter sICH nachweisen. Hiermit kann einerseits die Sicherheit der Thrombolyse im 3h-Zeitfenster erhöht und der Behandlungzeitraum hoffentlich zukünftig erweitert werden. Der potentielle Behandlungsgewinn einer Thrombolyse sollte bei Einschluss in Betracht kommender Schlaganfallpatienten sorgfältig gegen das mit zunehmender LA und DWI-Läsionlast ansteigende Blutungsrisiko abgewogen werden. Eine unabhängige Assoziation zwischen sICH und CMB konnte nicht gezeigt werden, so dass das Blutungsrisiko bei Patienten mit CMB’s den Behandlungsvorteil wahrscheinlich nicht übersteigt.
Seit jüngster Vergangenheit erleben dentale Implantate aus Keramik eine Renaissance, da durch die mit Yttrium verstärkte Zirkoniumdioxid-Keramik erstmals stark verbesserte Materialeigenschaften für einen keramischen Werkstoff erreicht wurden. In dieser Studie wurde das vollkeramische Implantatsystem „Z-Look“ der Firma ZSystems ® (Oensingen, Schweiz) hinsichtlich verschiedener klinischer Parameter untersucht. Dazu zählten Basisparameter wie der Approximalraumplaqueindex (API), der Sulkusblutungsindex (SBI) und die Ermittlung der Parameter Sondierungstiefe, Attachmentlevel und Creeping/Rezession an Implantaten und Zähnen. Außerdem erfolgte zur Beschreibung der periimplantären Morphologie der Papillen die Erhebung eines Papillenindex. Um dislozierende Wirkungen des periimplantären Weichgewebes auf das Implantat auszuschließen, wurde die Breite der keratinisierten Gingiva ebenfalls dokumentiert. Unter Verwendung des Periotest-Verfahrens konnte die Festigkeit der Implantate in ihrer knöchernen Umgebung bestimmt werden. Darüber hinaus wurden bei jedem Patienten mikrobiologische Proben mit einer sterilen Papierspitze aus dem Sulkus der Implantate und der natürlichen Zähne entnommen und ausgewertet. Nach Auswertung der bakteriellen Proben konnte die Bakterienmenge für 20 verschiedene Arten als relative Zahl (SNR-Wert) angegeben und zwischen Implantaten und Zähnen verglichen werden. Jeder Patient wurde gebeten, einen speziell für diese Studie konzipierten Fragebogen auszufüllen. Dieser beinhaltete Fragen zur Ästhetik der prothetischen Versorgung und der Handhabung und Ästhetik der für die Ruhigstellung der Implantate während der Einheilphase notwendigen Schutzschiene. Außerdem wurden Fragen zum chirurgischen Eingriff und der Patientenzufriedenheit gestellt. Insgesamt wurden 106 Implantate bei insgesamt 38 allgemeinanamnestisch unauffälligen Patienten untersucht. Der jüngste Patient war 33 Jahre, der älteste Patient 74 Jahre alt. Das Durchschnittsalter betrug 56 Jahre und 3 Monate. Von den 38 untersuchten Patienten waren 18 männlich und 20 weiblich. Ziel dieser Studie war es, anhand der beschriebenen Parameter die Eigenschaften eines vollkeramischen Implantat-Systems zu beschreiben. Von einem vollkeramischen Implantat-System versprach man sich durch die bisherigen Kenntnisse der Literatur bereits im Vorfeld eine sehr geringe Plaqueanlagerung, was ein besonders gutes Weichgewebsmanagement und geringe periimplantäre Entzündungszeichen versprach. Es sollte gezeigt werden, dass Zirkoniumdioxid-Implantate eine ähnliche Festigkeit im Knochen aufweisen können, wie Implantat aus Titan dieses vermögen. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf den Vergleich von aus dem Sulkus der Implantate und der natürlichen Zähne gewonnen Bakterienproben und die Patientenzufriedenheit gelegt. Es galt unter anderem zu klären, ob die während der Einheilphase der Implantate zu tragende Schutzschiene die Patienten hinsichtlich der Ästhetik oder der Handhabung stört. Die Auswertung der Ergebnisse zeigte, dass der Plaquebefall an den Keramik-Implantaten statistisch signifikant geringer war, als an den natürlichen Zähnen. Das Bluten auf Sondieren trat jedoch im Vergleich mit dem natürlichen Zahn vermehrt am Implantat auf. Allerdings war in diesem Fall keine statistische Signifikanz nachweisbar. Die Implantate dieser Studie wiesen überwiegend geringe, nicht pathologische Sondierungstiefen im Bereich von 2 und 3 mm auf, was auf eine stabile periimplantäre Situation hindeutete. Ein Creeping der Gingiva an den Implantaten konnte nur selten beobachtet werden. Die Implantate wiesen durchschnittlich neun Monate nach prothetischer Versorgung in lediglich 13,2 % der Fälle eine optimale Papillenmorphologie (Index-Wert 3) auf. Allerdings sei darauf hingewiesen, dass vor der Abdrucknahme für die prothetische Versorgung regelmäßig eine Freilegung des Implantats mittels Gingivektomie erfolgen musste. Das Implantatmaterial ist also nicht allein für die ästhetische Morphologie der Gingiva verantwortlich, vielmehr spielen hier andere Faktoren, wie beispielsweise der Abstand zum benachbarten Implantat oder Zahn, sowie der Abstand des Kontaktpunktes der prothetischen Versorgung zum Kieferknochen eine wichtige Rolle. Bei 87 % der Implantate betrug die Breite der keratinisierten Gingiva 2 mm oder mehr, was für eine stabile periimplantäre Situation der Implantate sorgte. Die keramischen Implantate aus Zirkoniumdioxid wiesen unter Verwendung des Periotest-Verfahrens ähnliche Festigkeitswerte auf, wie herkömmliche Implantate aus Titan. Die Verwendung einer Schutzschiene für den Zeitraum der Einheilphase wurde vom überwiegenden Teil der Patienten hinsichtlich Ästhetik und Handhabung problemlos akzeptiert. Der Großteil der Probanden trug die Schutzschiene wie empfohlen. Trotz der vermeintlichen Nachteile, wie die transgingivale Einheilung und dem damit verbundenem Tragen der Schutzschiene, waren die Patienten insgesamt mit dem Behandlungskonzept zufrieden und würden diese sogar weiterempfehlen. Obwohl die Implantate einen deutlich geringeren Plaqueindex als die natürlichen Zähne aufwiesen, war die bakterielle Belastung an den untersuchten Implantaten hinsichtlich der Bakterienmenge (SNR-Wert) im Durchschnitt höher als an den natürlichen Zähnen. Ein vollkeramisches Implantat-System vermag es also nicht, trotz einer geringeren Plaqueakkumulation, eine dem natürlichen Zahn vergleichbare Bakterienlast aufzuweisen. Man kann basierend auf den Ergebnissen dieser Studie aber auch sagen, dass die untersuchten Zähne und Implantate keine grundlegend verschiedene Mikroflora aufwiesen. Das Ziel von ergänzenden oder sich anschließenden Studien könnte es sein, die Mikrobiologie von Titan-Implantaten mit der mikrobiologischen Flora der natürlichen Zähne zu vergleichen. So ließe sich feststellen, ob sich dentale Implantate aus Titan hinsichtlich der mikrobiologischen Flora ähnlich verhalten, wie das hier untersuchte vollkeramische System. Besonders interessant wäre diese Untersuchung im Split-Mouth-Verfahren. Außerdem sollten anschließende Untersuchungen klären, ob zweiteilige Systeme aus Zirkoniumdioxid bereits ähnliche Erfolgsquoten aufweisen, wie das hier untersuchte einteilige System.
Konuskronen verankerter Zahnersatz hat sich seit mehreren Jahrzehnten als hervorragende Therapieform zur Versorgung des reduzierten Restgebisses bewährt und verbindet zahlreiche Vorteile des festsitzenden mit denjenigen des herausnehmbaren Zahnersatzes. Vor dem Hintergrund einer steigenden Relevanz ästhetischer Versorgungen sowie einer größer werdenden Ablehnung der Patienten hinsichtlich der Verwendung metallischer Werkstoffe, gewann das Ziel, auch kombiniert festsitzend-herausnehmbaren Zahnersatz metallfrei zu fertigen, zunehmend an Bedeutung. Ziel der vorliegenden prospektiven klinischen Studie war die Evaluation des klinischen Langzeitverhaltens von keramischen Primärkronen aus IPS Empress 2® kombiniert mit Sekundärkronen und Prothesengerüsten aus faserverstärktem Kunststoff (Vectris®) sowie die Untersuchung der Patientenzufriedenheit. Als Kontrollgruppe dienten keramische Primärkronen mit Sekundärkronen aus Galvanogold und metallischen Gerüsten. Dazu wurden 29 Patienten mit insgesamt 37 Konusprothesen auf 165 keramischen Primärkronen versorgt, 27 (73%) Prothesen entfielen auf die Kontrollgruppe und 10 (27%) Prothesen auf die Testgruppe. Eingebunden in ein Recall-System, wurden die Patienten in halbjährigen Abständen über einen Zeitraum von 5 Jahren nachuntersucht. Zur Evaluation der Patientenzufriedenheit erhielten die Studienteilnehmer jeweils vor Therapiebeginn, nach Fertigstellung der Konusprothesen und im einjährigen Abstand einen Fragebogen. Die Zeit unter Risiko betrug durchschnittlich 59 ± 22 Monate (min. 16, max. 96 Monate), Befragungen hinsichtlich der Patientenzufriedenheit wurden über 46 ± 18 Monate durchgeführt (min. 15, max. 66 Monate). Beide Gruppen zeigten eine vergleichbar hohe Reparaturanfälligkeit. 88,9% der Restaurationen in der Kontrollgruppe, sowie 90% der Restaurationen in der Testgruppe mussten mindestens einmal instand gesetzt werden (Mann-Whitney-U-Test, p = 0,121). Auch das Schadensrisiko der vollkeramischen Primärkronen zeigte keine statistischen Unterschiede (Testgruppe: 10,81%; Kontrollgruppe: 10,16%; exakter Fisher-Test, p > 0,05). Die Häufigkeit einer Neuanfertigung der Konusprothese war bei der Test-Gruppe (40%) höher als bei der Kontroll-Gruppe (14,8%), ein statistisch signifikanter Unterschied war zwischen beiden Gruppen nicht nachzuweisen (exakter Fisher-Test, p = 0,16). Die Erfolgsrate zeigte in Abhängigkeit der Zeit unter Risiko jedoch ab 2,5 Jahren schlechtere Werte bei metallfreien Prothesen als bei der Kontrollgruppe, nach etwa 5 Jahren nahm dieser Unterschied deutlich zu (Kontrollgruppe: 86%, Testgruppe: 24%) und unterschied sich statistisch signifikant (Log-Rank-Test, p=0,041). Bei drei der 128 Galvano-Matrizen kam es zu einer Beschädigung an den Sekundärstrukturen, bei 9 von 37 Matrizen aus glasfaserverstärktem Kunststoff trat ein Schaden auf. Dieser Unterschied war statistisch hochsignifikant und belegt, dass Vectris®-Mesostrukturen eher zum Versagen neigen als Galvano-Sekundärkronen (exakter Fisher-Test, p = 0,00008). Im Gegensatz zu den durchaus unterschiedlichen klinischen Ergebnissen und den unbefriedigend hohen Reparaturzahlen war die Patientenzufriedenheit mit den jeweiligen Studienprothesen für beide Gruppen vergleichbar gut. Zu keinem Zeitpunkt zeigte sich eine relevante Personenzahl in einer der Gruppen mit dem erhaltenen Zahnersatz unzufrieden. So war in der Testgruppe initial lediglich eine Person unzufrieden, änderte diese Einstellung jedoch im Rahmen der weiteren Kontrollen. Eine weitere Person war anfangs zufrieden, dann vorübergehend unzufrieden, um im Weiteren erneut ihre Zufriedenheit zu äußern. Für die Metallgruppe ergab sich lediglich in der letzten Nachkontrolle eine Person, die unzufrieden mit dem Zahnersatz war. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen waren somit zu keinem Zeitpunkt nachzuweisen (exakter Fisher-Test, alle p > 0,05). Die vorliegende Untersuchung bestätigt, dass sich die Verwendung keramischer Primärkronen in Doppelkronenrestaurationen prinzipiell bewährt und die Anforderungen an die gestellten Parameter wie Haftkraftstabilität, Biokompatibilität und Ästhetik erfüllt. Jedoch weist die Lithiumdisilikat-Glaskeramik IPS Empress 2® eine unzureichende Stabilität auf, für diesen Indikationsbereich sind daher ausschließlich hochfeste Zirkoniumdioxid-Keramiken zu empfehlen. Mit diesem Material ist ein wesentlich geringeres Reparaturrisiko zu erwarten. Als Matrizenwerkstoff zeigten galvanogeformte Sekundärkappen sehr gute klinische Ergebnisse. Die hohe Passungspräzision, welches durch die intraorale Fügung erreicht wird, gewährleistet eine ideale Lagerung des Zahnersatzes und reduziert kinetikbedingte Schäden auf ein Minimum. Das Ziel der Untersuchung, die dauerhafte klinische Bewährung metallfreier Konusprothesen aus dem Glasfaserverbundmaterial Vectris® nachzuweisen, konnte nicht erreicht werden. Die Ergebnisse dieser prospektiven klinischen Studie belegen eine Überlegenheit der metallischen Konusprothese. Somit bedarf die Realisation einer klinisch verlässlichen metallfreien Konusprothese noch erheblichen Forschungs- und Entwicklungsbedarf. Insbesondere die Substitution von galvanogeformten Feingoldmatrizen stellt eine große Herausforderung dar.
In this study, I investigate the crustal and upper mantle velocity structure beneath the Rwenzori Mountains in western Uganda. This mountain range is situated within the western branch of the East African Rift and reaches altitudes of more than 5000 m. I use four different approaches that belong to the travel-time tomography method. The first approach is based on the isotropic tomographic inversion of local data, which contain information about 2053 earthquakes recorded by a network of up to 35 stations covering an area of 140×90 km2. The LOTOS-09 algorithm described here is used to realize this approach. The second approach is based on the anisotropic tomographic inversion of the same local dataset. This method employs the tomographic code ANITA, developed with my participation, which provides 3D anisotropic P and isotropic S velocity distributions based on P and S travel-times from local seismicity. For the P anisotropic model, four parameters for each parameterization cell are determined. This represents an orthorhombic anisotropy with one vertically-oriented predefined direction. Three of the parameters describe slowness variations along three horizontal orientations with azimuths of 0°, 60° and 120°, and one is a perturbation along the vertical axis. The third approach is based on tomographic inversion of the teleseismic data, which contain information about the traveltimes of P-waves coming from 284 teleseismic events recorded by the seismic network stations. The TELELOTOS code, which is my own modification of the LOTOS-09 algorithm, is used in this approach. The TELELOTOS code is designed to iteratively invert the local and/or teleseismic datasets. Finally, I present the results of the new tomographic approach, which is based on the simultaneous inversion of the joint local and teleseismic data. The simultaneous use of these datasets for the tomographic inversion has several advantages. In this case, the velocity structure in the study area can be resolved as deep as in the teleseismic approach. At the same time, in the upper part of the study volume, the resolution of the obtained models is as good as in the local tomography. The TELELOTOS algorithm is used to perform the joint tomographic inversion. Special attention is paid in this work to synthetic testing. A number of different synthetic and real data tests are performed to estimate the resolution ability and robustness of the obtained models. In particular, synthetic tests have shown that the results of the anisotropic tomographic inversion of the local data have to be considered as unsatisfactory. For all approaches used in this study, I present synthetic models that reproduce the same pattern of anomalies as that obtained by inverting the real data. These models are used to interpret the results and estimate the real amplitudes of the obtained anomalies. The obtained models exhibit a relatively strong negative P anomaly (up to -10%) beneath the Rwenzori Mountains. Low velocities are found in the northeastern part of the array at shallower depths and are most likely related to sedimentary deposits, while higher velocities are found beneath the eastern rift shoulder and are thought to be related to old cratonic crust. The presence of low velocities in the northwestern part of the array may be caused by a magmatic intrusion beneath the Buranga hot springs. Relatively low velocities were observed within the lower crust and upper mantle in the western and southern parts of the study area (beneath the rift valley and the entire length of the Rwenzori range). The higher amplitude of the low-velocity anomaly in the south can be related to the thinner lithosphere in the southern part of the Albertine rift. In the center of the study area, a small negative anomaly is observed, with the intensity increasing with depth. This anomaly is presumably related to a fluids rising up from a plume branch in the deeper part of the mantle. According to the interpretation of the local earthquake distribution, the Rwenzori Mountains are located between two rift valleys with flanks marked by normal faults. The Rwenzori block is bounded by thrust faults that are probably due to compression.