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Ziel dieser Arbeit ist es, Art, Häufigkeit und Dauer der Komplikationen nach sekundärer Kieferspaltosteoplastik mit Beckenkammtransplantation bei Patienten mit Lippen-, Kiefer-, Gaumenspalten aufzuzeigen. Dazu wurden in dieser retrospektiven Studie die Daten von 236 Patienten, die im Zeitraum zwischen Juli 1986 und August 1997 im Klinikum „Rechts der Isar“ der Technischen Universität München eine Spanentnahme am vorderen Beckenkamm zur autologen Transplantation im Mund-Kiefer-Gesichtsbereich erhielten, ausgewertet. Die Datenerhebung erfolgte durch Analyse der OP-Berichte, Krankenblätter, persönliche Befragung und körperliche Untersuchung aller 236 Patienten. Der Focus dieser Arbeit liegt bei der Darstellung der Ergebnisse der 182 LKG-Patienten, welche mit den anderen Indikationsgruppen verglichen wurden. Das durchschnittliche OP-Alter der LKGPatienten betrug 13,8 Jahre, die Daten wurden im Mittel 5,3 Jahre nach der Entnahme-OP erfasst. Chirurgische Frühkomplikationen konnten bei 15 LKG-Patienten (8,2 %) beobachtet werden, die bei zwei Patienten (1,1 %) einer chirurgischen Nachbehandlung (Hämatomausräumung) bedurften. Die Komplikationsrate war bei den Patienten mit der Diagnose LKG (8,2 %) geringer als bei den übrigen Indikationsgruppen zur Knochenentnahme. Diese reichte von 11 % bei Tumorpatienten bis 26 % bei Patienten mit Dysgnathie. Eine Gehbehinderung war mit 91,7 % die häufigste nichtchirurgische Komplikation. Die Gehbehinderung war bei 13,7 % der LKG-Patienten so stark, dass sie auf Gehhilfen angewiesen waren. 78 % waren ebenfalls gehbehindert, benötigten jedoch keine Gehhilfe. Starke postoperative Schmerzen in der Entnahmeregion nannten 48,4 %. Über postoperative Sensibilitätsstörungen klagten 28,6 % der LKG-Patienten. Zum Untersuchungszeitpunkt, im Durchschnitt 5,3 Jahre nach dem operativen Eingriff, wurden immerhin noch bei 6,0 % der LKG-Patienten persistierende Schmerzen als Spätfolge gefunden. Sensibilitätsstörungen persistierten bei 9,9 % aller Spalt-Patienten. Bei der subjektiven Bewertung fanden sich desweiteren bei 7,8 % nichtschmerzhafte bleibende Beschwerden wie Wetterfühligkeit. Mit der Ästhetik der Narbe im Entnahmebereich waren 86,3 % zufrieden, unzufrieden nur 7,1 %. Bei entsprechender Indikation würden sich 91,8% der LKG-Patienten wieder für die gleiche Therapieform (Beckenkammtransplantation) entscheiden, immerhin 14 Patienten (7,9 %) würden diesen Eingriff unter keinen Umständen wiederholen bzw. nur Fremdmaterial als Augmentat verwenden, als sich erneut einer Entnahme-OP zu unterziehen. Beim isolierten Vergleich der Schmerzhaftigkeit werteten 60,4% die Becken-Operation und 18,1 % die Operation im Mund-Kiefer-Gesichtsbereich als schmerzhafter. Beim Vergleich der Gesamtbefindlichkeit des postoperativen Zustandes hingegen wurden der Mund-Kiefer-Gesichtsbereich von 56,0 % und der Beckenbereich nur von 19,8 % als der insgesamt unangenehmere Befund bezeichnet. Für 29,7 % war die Entnahme-Operation schlimmer als erwartet, für 25,3 % deckte sich die Erfahrung durch die Operation mit ihrer Erwartungshaltung und 13,7 % erwarteten stärkere Beschwerden, als sie letztendlich auftraten. 31,3 % hatten keine Erwartungshaltung oder machten keine Angabe. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass mit der autologen Beckenkammtransplantation für Patienten mit Lippen-Kiefer-Gaumenspalten eine Therapieform zur Verfügung steht, die ästhetisch und funktionell sehr gute Ergebnisse ermöglicht. Dennoch sind mit der Entnahmeoperation Komplikationen und Langzeitschäden verbunden, über die der Patient aufgeklärt werden muss und die insgesamt das Operationsergebnis schmälern. Um zukünftig die Entnahme von Beckenkammspongiosa zu umgehen, sollten zukünftig vermehrt Knochenersatzstoffe zur Defektauffüllung zum Einsatz kommen. Dies ist Inhalt momentan laufender, intensiver Forschung.
Kutane T-Zell-Lymphome (CTCL) stellen eine heterogene Gruppe von Lymphomen dar, die durch maligne, die Haut infiltrierende T-Zellen gekennzeichnet sind. Die häufigsten CTCL sind Mycosis Fungoides (MF) und die leukämische Variante das Sézary Syndrom (SS). Bei MF kommt es zur Ausbildung von sogenannten Patches, Plaques und kutanen Tumoren und in späteren Stadien kann es auch zu einem Befall des Blutes kommen. Bei SS handelt es sich um eines der aggressivsten CTCL, das durch das Auftreten von Erythroderma und einer hohen Zahl im Blut zirkulierender maligner Zellen gekennzeichnet ist. Die genauen molekularen Ursachen für die Entartung sind bis heute nicht aufgeklärt. Bestehende Therapien können nur die Symptome lindern, aber die Krankheit nicht vollständig heilen. Daher ist die Entwicklung neuer Therapien unerlässlich, was durch die Erforschung der molekularen Signalwege in den malignen Zellen möglich wird. So kann die Ursache der Entartung aufgeklärt werden und neue Angriffspunkte für Therapien identifiziert werden. Die Charakterisierung verschiedener CTCL Zelllinien in dieser Arbeit bestätigte den Phänotyp der Tumorzellen als aktivierte T-Helferzellen und lieferte auch Hinweise auf einen Phänotyp regulatorischer T-Zellen. Es konnte eine Aktivierung des NF-κB- und Interferon-Signalweges, AP-1- und cAMP-vermittelter Signalwege, sowie der MAPKinase p38 und STAT5 beobachtet werden. Diese Moleküle zeichnen sich daher als mögliche Angriffspunkte für die Entwicklung einer neuen Therapie ab. Der Nachweis einer VEGF Expression, sowie von RANTES und TIMP-1, lieferte Hinweise auf die Aktivierung Angiogenese-vermittelnder Signalwege. Die Charakterisierung des PI3K/Akt- und mTOR-Signalweges in CTCL durch Versuche mit dem mTOR Inhibitor Rapamycin bestätigte die Bedeutung von Angiogenese bei CTCL. Rapamycin zeigte sowohl in vitro als auch in vivo in einem Mausmodell für MF einen antitumoralen Effekt, was seine Anwendbarkeit als neues Therapeutikum für CTCL zeigt. Ein weiterer Ansatzpunkt ist der Apoptose Signalweg, der in CTCL gestört ist, wodurch es zu einer Resistenz gegenüber Apoptose-induzierender Stimuli kommt. Bei Versuchen mit dem Immunmodulator AS101 wurde die Produktion intrazellulärer freier Sauerstoffradikale (ROS) erhöht, wodurch Apoptose in den malignen Zellen induziert werden konnte. In vivo Versuche bestätigten einen antitumoralen Effekt von AS101 und identifizierten es als potentielles neues Therapeutikum für CTCL. Ziel bei der Entwicklung neuer Therapien ist es, eine möglichst spezifische Wirkung auf die Tumorzellen zu erhalten, wodurch Immuntherapien in den letzten Jahren immer mehr an Bedeutung gewannen. Daher wurden auch zwei immuntherapeutische Ansätze für eine Behandlung von CTCL untersucht. Zytotoxische T-Zellen mit einem chimären CD30-spezifischen T-Zellrezeptor (TCR) zeigen in vitro eine zytotoxische Aktivität gegen CTCL Zellen, der aber in vivo nicht bestätigt werden konnte. Ein weiterer unspezifischer immuntherapeutischer Ansatz basiert auf der Natürlichen Killer (NK) – Zelllinie NK-92, die alle Eigenschaften aktivierter NK-Zellen aufweist und eine generelle antitumorale Aktivität besitzt. Diese Zellen zeigten eine hohe zytotoxische Aktivität gegen CTCL Zellen, die unabhängig von den drei aktivierenden Rezeptoren NKp30, NKp46 und NKG2D ist. Die Versuche zeigten somit, dass sich NK-92 Zellen für eine Therapie von CTCL eignen. Zusammenfassend wurden Signalwege identifiziert, deren Inhibition einen therapeutischen Effekt erwarten lassen würden und zwei bereits für andere Indikationen zugelassene Substanzen als potentielle Therapeutika für CTCL identifiziert. Zusätzlich wurde auch ein Immuntherapeutikum in vitro als erfolgversprechend getestet.
Brustkrebs repräsentiert die häufigste Krebserkrankung bei Frauen. Der Estrogen Rezeptor α (ERα) ist hier als ein wichtiger prognostischer Marker für Mammakarzinome etabliert, der die Homonsensitivität des Tumors determiniert. Dieser impliziert den Einsatz von Anti-Estrogenen, die die wachstumsfördenden Funktionen von ERα blockieren können. Übergewicht erhöht deutlich das Risiko einer Brustkrebserkrankung bei postmenopausalen Frauen. Übergewicht geht generell mit einem erhöhten Serumleptinspiegel einher. Das Zytokinhormon Leptin ist ein zentraler humoraler Faktor bei der Wahrnehmung und Steuerung der körpereigenen Energiereserven im Gehirn, das darüber hinaus auch pleiotrope Funktionen in der Angiogenese, Hämatopoese, Reproduktion und im Immunsystem ausübt. Leptin bindet an den Transmembranrezeptor Ob-RL (Obese-Rezeptor, lange Isoform) und aktiviert unter anderem den Januskinase (Jak)- „signal transducer and activator of transcription“ (Stat)-Signalweg, der mit neoplastischen Veränderungen assoziiert ist. Weil der kausale Zusammenhang zwischen Übergewicht und Krebserkrankungen gut belegt ist, während die molekularen Mechanismen jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt sind, sollte daher in der vorliegenden Arbeit die mögliche Wechselwirkung des leptininduzierten Jak-Stat-Signalwegs und des ERα´s untersucht werden. Ein Zusammenspiel der Ob-RL- und ERα-abhängigen Signalwege wurde einerseits mit Luziferase-Reporter-Konstrukten untersucht, die unter der Kontrolle eines Stat3-responsiven Elements standen. Dabei konnten zelltyp-spezifsche Unterschiede in der leptinabhängigen Stat3-Aktivierung beobachtet werden. Die endogen ERα-exprimierenden Brustkrebszellen MCF-7 wiesen eine wesentlich stärkere Stat3-Aktiverung und Phosphorylierung nach Leptinapplikation auf, als ERα-negative HeLa Zervixkarzinomzellen oder die Brustkrebslinie MDA-MB-231. Dieser Effekt konnte durch die Hemmung der ERα-Expression mittels siRNA in MCF-7 Zellen revertiert werden. Die ERα Überexpression in HeLa Zellen resultierte in einer verstärkten Stat3-Transaktiverung nach Leptinbehandlung. Diese Zunahme in der Stat3-Aktivierung konnte nicht durch eine Kostimulation der Zellen mit einem ERα-Agonisten oder Antagonisten beeinflusstwerden. Weiterhin konnte eine gesteigerte Zellviabilität nach Leptinstimulation in ERα-positiven Zellen detektiert werden. Durch Koimmunpräzipitationsstudien konnte direkte Interaktion von ERα, Jak2 und Stat3 nachgewiesen werden, was auf einen zytoplasmatisch lokalisierten Komplex hindeutet. Eine Mikroarray-Analyse von leptinstimulierten Zellen ergab eine differentielle Regulation von 133 Genen in Abhängigkeit ihres ERα-Expressionstatus. Von den 133 Zielgene sind 42 in der Literatur bereits in Zusammenhang mit malignem Wachstum beschrieben und könnten somit die erhöhte Viabilität der ERα-exprimierenden Zellen in Reaktion auf Leptin erklären. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse deuten auf eine entscheidende Rolle des ERα´s in der Verstärkung der leptininduzierten Stat3-Aktiverung hin. Diese Daten zur Interaktion von ERα mit einem wachstumsfördernden Signalweg können zur Entwicklung neuartiger Behandlungsmöglichkeiten in der Brustkrebstherapie von übergewichtigen Patientinnen beitragen.
Die vaskuläre NADPH-Oxidase ist eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS). Viele dieser Daten wurden unter Verwendung des Inhibitors Apocynin (4'-Hydroxy-3' methoxyacetophenon) erhoben, dessen Wirkungsweise jedoch nicht bekannt war. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Hemmung der vaskulären NADPH-Oxidase näher untersucht, sowie nach weiteren Inhibitoren gesucht. In HEK293-Zellen wurden die NADPH-Oxidase-Isoformen Nox1, Nox2, Nox4, Duox1 oder Duox2 überexprimiert und die von den Zellen produzierten Radikale durch verstärkte Chemilumineszenz gemessen. Hierbei wurde festgestellt, dass Apocynin die Produktion von Superoxidanionen nicht hemmt, aber die Detektion von Wasserstoffperoxid- oder Hydroxylradikalen beeinflusst. Wenn die Radikale durch Xanthin/Xanthin-Oxidase oder nicht-enzymatische Systeme generiert wurden, beeinflusste Apocynin direkt die Peroxid-, aber nicht die Superoxid-Detektion. In Leukozyten ist Apocynin ein Pro-Pharmakon, das durch Myeloperoxidase (MPO) aktiviert werden kann. Dieser Prozess führt zur Bildung eines Apocyninradikals, das zu einem Dimer umgewandelt wird. Allerdings kann man aufgrund der hohen Reaktivität des Radikals nur das Dimer nachweisen. Endothelzellen und glatte Muskelzellen sind nicht in der Lage dieses Dimer zu bilden und können daher Apocynin nicht aktivieren. In Nox-überexprimierenden HEK293-Zellen konnte die Dimer-Bildung gezeigt werden, wenn MPO zugegeben wurde. Apocynin kann ohne MPO-Zugabe nur die NADPH-Oxidase in Leukozyten hemmen und wirkt in vaskulären Zellen als Antioxidans. Tatsächlich wurde in vaskulären glatten Muskelzellen die Aktivierung der redoxsensitiven Kinasen p38-MAP-Kinase, Akt und Erk1/2 durch Wasserstoffperoxid und durch den intrazellulären Radikal-Generator Menadion in Anwesenheit von Apocynin verhindert. Des Weiteren wurde untersucht, ob Cyclooxygenase 2 (COX-2), die eine ähnliche Peroxidase-Domäne wie MPO besitzt, mit Apocynin interagiert. Die COX-2-Aktivität wurde durch Apocynin gehemmt. In COX-2 überexprimierenden HEK293- Zellen wurden die Superoxidanion- sowie die Wasserstoffperoxid-Bildung durch Apocynin völlig gehemmt. Allerdings konnte durch die Peroxidaseaktivität von COX-2 Apocynin nicht aktiviert und somit kein Dimer nachgewiesen werden. Diese Beobachtung unterstützt ferner die unspezifische Natur der Nox-Hemmung durch Apocynin.Intravenös appliziertes Apocynin in Mäusen und Schweinen führte zu einer Aktivierung von Apocynin. In vivo wirkt Apocynin somit als möglicher Nox2-Inhibitor und als Antioxidans. Flavonoide, insbesondere die des Katechol-Typs, in dem der B-Ring monomethyliert ist, haben eine ähnliche Struktur wie Apocynin. Daher wurde in dieser Arbeit auch das Potenzial der Flavonoide Epicatechin, 3'-O-Methyl-Epicatechin, Procyanidin B2 und Isorhamnetin als Inhibitoren der NADPH-Oxidase analysiert. Nox-überexprimierende HEK293-Zellen (Nox1, Nox2 sowie Nox4) wurden mit verschiedenen Flavonoiden inkubiert und die ROS-Bildung mittels verstärkter Chemilumineszenz gemessen. Epicatechin und Procyanidin B2 hemmten die Radikal-Detektion der verschiedenen Nox-Isoformen in allen Detektionssystemen. Isorhamnetin hemmte die Radikal-Detektion durch Nox1 nur leicht, allerdings wurde die Bildung der Radikale durch Nox4 und Nox2 fast komplett blockiert. 3'-O-Methyl-Epicatechin wies die schwächste antioxidative Wirkung auf. Es hemmte zwar die Wasserstoffperoxidbildung, jedoch kaum die Nox1- und Nox2-abhängige Superoxidanion-Bildung. Keine der getesteten Substanzen konnte den „respiratorischen Burst“ in mit Phorbolmyristatacetat stimulierten Leukozyten blockieren. Diese Daten deuten darauf hin, dass Apocynin und Katechine potente Antioxidantien für Wasserstoffperoxid, aber keine spezifischen NADPH-Oxidase- Hemmer in vaskulären Systemen sind.
Vasculogenesis as well as angiogenesis are important for postnatal development of blood vessels. Peripheral blood or bone marrow-derived endothelial precursor cells are used in clinical trials for therapeutic enhancement of postnatal neovascularization in patients suffering from coronary artery diseases. The vasculogenic potential of the precursor cell population depends on the appropriate retention of the infused cells to the ischemic tissue. However, cell-autonomous mechanisms regulating the attraction and retention of circulating cells in inflammatory tissue are not well understood. Caspases belong to a family of pro-apoptotic enzymes. Beyond cell death signals, caspase proteases additionally regulate non-apoptotic processes like cell morphology and migration in many cell types. The isoform Caspase-8 is essential for embryonal vasculogenesis in conditional knockout mice. In this study, we identified a novel apoptosis-unrelated role of Caspase-8 in circulating and bone marrow-derived cells for vascular repair. Caspase-8-specific inhibition abrogated the ex vivo formation of EPC from human peripheral blood. Moreover, Caspase-8 inhibition disables EPC migration and adhesion to different matrices and decreases the cell surface expression of the fibronectin receptor subunit integrin alpha 5 and the chemokine receptor CXCR4. In vitro and in vivo studies using bone marrow mononuclear cells derived from inducible Caspase-8- deficient mice revealed an essential role of Caspase-8 for EPC formation and neovascularization enhancing capacities of progenitor cells. Caspase-8 activity appears to be required for maintaining responses to matrix interaction and chemoattractants of EPC. Additional studies showed that the E3 ubiquitin ligase Cbl-b, a negative regulator of cell adhesion molecules including integrin alpha 5, is present in EPC at low protein levels under basal conditions, but markedly increases upon Caspase-8 inhibition. In vitro assays and overexpression studies in intact cells confirmed Caspase-8-dependent degradation of Cbl-b, providing a potential requirement for Caspase-8-regulated adhesion. Indeed, neovascularization of matrigel plugs was enhanced in mice lacking Cbl-b. Moreover, Cbl-b degradation in the presence of active Caspase-8 prevents the down-regulation of integrin alpha 5 and is associated with an enhanced vasculogenic activity of progenitor cells in hind limb ischemia. The identified upstream regulation of caspase-8 by cytokine IL-6 is only one possibility for fine-tuning the non-apoptotic enzymatic activity. In summary, this study shows a novel essential role of Caspase-8 for proper EPC adhesion-related signaling. Caspase-8 is involved in the function of adhesion molecules by regulation the E3 ubiquitin ligase Cbl-b. Strategies to improve survival of therapeutic injected progenitor cells by using caspase inhibitors should be addressed with caution. Because of the broad spectrum of activity of caspase-8, downstream targets of this caspase isoform and Cbl-b should be in more focus for therapeutic pretreatment to improve neovascularization of myocardial and ischemic tissue.
In der Neurochirurgie sind temporäre externe Ableitungen von Liquor cerebrospinalis häufige Eingriffe zur Behandlung von Liquorabflußstörungen. Besonders bei externen Ableitungen besteht eine unmittelbare Kommunikation zwischen Liquorraum und Hautoberfläche. Infektionen durch den Katheterweg sind häufige Komplikationen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Wirksamkeit silberhaltiger EVD Katheter in vivo zu objektivieren. Dazu wurde die Infektionshäufigkeit konventioneller unbeschichteter EVD Katheter mit dem seit 2004 eingeführten antimikrobiellen silberhaltigen EVD Katheter verglichen. Mit einer statistischen Erfassung der Infektionsparameter aller Patienten die im Studienzeitraum eine externe Ventrikel-Drainage erhielten, wurde überprüft ob eine signifikante bzw. klinisch relevante Senkung der Infektionshäufigkeit vorlag. Hierzu wurden 231 Patienten in der Klinik für Neurochirurgie der Johann Wolfgang Goethe-Universitätsklinik retrospektiv untersucht. Von 231 Patienten wurden nach Anwendung der Ausschlußkriterien 164 in die statistische Analyse aufgenommen. In der Studiengruppe mit silberhaltigen EVD Kathetern befanden sich 74 Patienten, 90 in der Kontrollgruppe. In beiden Patientenkollektiven bestanden keine statistisch relevanten Unterschiede bezüglich der klinischen Charakteristika. Besonders die Verteilung von Antibiotika und Glukokortikoiden war annähernd gleich in beiden Gruppen. In unserer Studie ist der Einsatz silberhaltiger EVD Katheter zur Behandlung chronischer oder akuter Liquorabflußstörungen hinsichtlich des primären Endpunktes positive Liquorkulturen, Katheterkolonisierungen oder erhöhten Zellzahlen im Liquor, mit einer statistisch signifikanten Abnahme der Häufigkeit von positiven Infektionsparametern gegenüber herkömmlichen EVD Kathetern assoziiert (18,9 verglichen mit 33,7%; p=0,04 Chi-Quadrat-Test). Da externe Ventrikeldrainagen die Eintrittspforte für fakultativ pathogene Keime sein können, ist die Anwendung silberhaltiger EVD Katheter im Sinne einer lokalen Infektionsbarriere sinnvoll. Das Risiko katheterassoziierter Infektionen bei neurochirurgischen Patienten kann so gesenkt werden.
By adopting a variety of shapes, proteins can perform a wide number of functions in the cell, from being structural elements or enabling communication with the environment to performing complex enzymatic reactions needed to sustain metabolism. The number of proteins in the cell is limited by the number of genes encoding them. However, several mechanisms exist to increase the overall number of protein functions. One of them are post-translational modifications, i.e. covalent attachment of various molecules onto proteins. Ubiquitin was the first protein to be found to modify other proteins, and, faithful to its evocative name, it is involved in nearly all the activities of a cell. Ubiquitylation of proteins was believed for a long time only to be responsible for proteasomal degradation of modified proteins. However, with the discovery of various types of ubiquitylation, such as mono-, multiple- or poly-ubiquitylation, new functions of this post-translational modification emerged. Mono-ubiquitylation has been implicated in endocytosis, chromatin remodelling and DNA repair, while poly-ubiquitylation influences the half-life of proteins or modulates signal transduction pathways. DNA damage repair and tolerance are example of pathways extensively regulated by ubiquitylation. PCNA, a protein involved in nearly all types of DNA transaction, can undergo both mono- and poly-ubiquitylation. These modifications are believed to change the spectrum of proteins that interact with PCNA. Monoubiquitylation of PCNA is induced by stalling of replication forks when replicative polymerases (pols) encounter an obstacle, such as DNA damage or tight DNA-protein complexes. It is believed that monoubiquitylation of PCNA stimulates the exchange between replicative pols to one of polymerases that can synthesize DNA across various lesions, a mechanism of damage tolerance known as translesion synthesis (TLS). Our work has helped to understand why monoubiqutylation of PCNA favours this polymerase switch. We have identified two novel domains with the ability to bind Ub non-covalently. These domains are present in all the members of Y polymerases performing TLS, and were named Ub-binding zinc finger (UBZ) (in polη and polκ) and Ub-binding motif (UBM) (in polι and Rev1). We have shown that these domains enable Y polymerases to preferentially gain access to PCNA upon stalling of replication, when the action of translesion polymerases is required. While the region of direct interaction between Y pols and PCNA had been known (BRCT domain in Rev1 and PIP box motif (PIP) in three others members), we propose that Ub-binding domains (UBDs) in translesion Y pols enhance the PIP- or BRCT-domain-mediated interaction between these polymerases and PCNA by binding to the Ub moiety attached onto PCNA. Following these initial studies, we have also discovered that Y polymerases themselves undergo monoubiquitylation and that their UBDs mediate this modification. This auto-ubiquitylation is believed to lead to an intramolecular interaction between UBD and Ub attached in cis onto the UBD-containing protein. We have mapped monoubiquitylation sites in polη in the C-terminal portion of the protein containing the nuclear localization signal (NLS) and the PIP box. Beside PIP, the NLS motif is also involved in direct interaction of polη with PCNA. Based on these findings, we propose that monoubiquitylation of either NLS or PIP masks them from potential interaction with PCNA. Lastly, using several functional assays, we have demonstrated the importance of all these three motifs in the C-terminus of polη (UBZ, NLS and PIP) for efficient TLS. We have also constructed a mimic of monoubiquitylated polη by genetically fusing polη with Ub. Interestingly, this chimera is deficient in TLS as compared to the wild-type protein. Altogether, these studies demonstrate that the C-terminus of polη constitutes a regulatory module involved in multiple-site interaction with monoubiquitylated PCNA, and that monoubiquitylation of this region inhibits the interaction between polη and PCNA. Our work has also revealed that the UBDs of Y pols as well as of other proteins implicated in DNA damage repair and tolerance, such as the Werner helicase-interacting protein 1 (Wrnip1), are required for their proper sub-nuclear localization. All these proteins localize to discrete focal structures inside the nucleus and mutation of their UBDs results in inability to accumulate in these foci. Interestingly, by exchanging UBDs between different proteins we have learned that each UBD seems to have a distinct functional role, surprisingly not limited to Ubbinding ability. In fact, swapping the UBZ of Wrnip1 with the UBM of polι abolished the localization of Wrnip1 to foci despite preserving the Ub-binding ability of the chimeric protein. In summary, this work provides an overview of how post-translation modification of proteins by Ub can regulate several DNA transactions. Firstly, key regulators (e.g. PCNA) can be differentially modified by Ub. Secondly, specialized UBDs (e.g. UBM, UBZ) embedded only in a subset of proteins act as modules able to recognize these modifications. Thirdly, by means of mediating auto-ubiquitylation, UBDs can modulate the behaviour of host proteins by allowing for either in cis or in trans Ub-UBD interactions.
In der Arbeit wird Fuzzy-Regression als mögliche ökonometrische Analysemethode bei fehlerbehafteten Daten modelliert und erprobt. Dazu ist die interpretatorische Lücke zu schließen, die einerseits zwischen den Datenproblemen in empirischen Datensätzen und ihrer Modellierung als Fuzzy-Daten und andererseits zwischen der Modellierung der Fehlereinflüsse in den Fuzzy-Daten und den Aussagen und Analysen besteht, die auf der Basis einer Fuzzy-Regression über die vorliegenden Daten getroffen werden können. Da bereits eine Vielzahl von Ansätzen zur Fuzzy-Regression entwickelt wurden, wird als das Hauptproblem nicht die Modellierung der Fuzzy-Methoden als solcher gesehen, sondern vielmehr die fehlende Vorstellung über die mögliche Bedeutung der Fuzzy-Modellierungen im konkreten Anwendungsfall. Die Arbeit vollzieht deshalb im Sinne einer Machbarkeitsstudie die verschiedenen Schritte von den Fehlereinflüssen in wirtschaftsbezogenen Datensätzen und deren Modellierung als Fuzzy-Daten bis hin zur explorativen Analyse mit Fuzzy-Regression nach. Dabei werden für jeden der Schritte exemplarische Beispiele ausgewählt, um die Denkweise der Fuzzy-Modellierung auszuarbeiten und die Möglichkeiten und Grenzen der Methoden aufzuzeigen. Die Untersuchungen zeigen, dass vor allem die Fuzzy-Modellierung von Fehlereinflüssen in den Merkmalsdaten und die Beschreibung von gleichförmigen Strukturen in den Fehlereinflüssen durch Fehlerszenarien als Analyseinstrumente geeignet sind, da sie eine Grundlage für eine weitergehende Untersuchung der Fehlereinflüsse bilden. Als Ausblick auf ein Schätzmodell für Fuzzy-Regression bei Fehlern in den Daten werden abschließend einige Ansätze für die Einbettung des Regressionsproblems für Fuzzy-Merkmalsvariablen in die Verteilungsmodelle für Fuzzy-Zufallsvariablen vorgestellt, die auf der Konstruktion der Fehlerszenarien basieren.
Ein zentrales Ergebnis dieser Studie war, dass viele Patienten ein hohes Maß an Lebens-qualität zeigten. Verglichen mit anderen hämatologisch-onkologischen Kollektiven lag die Lebensqualität der Patienten dieser Studie deutlich näher bei den Werten der gesunden Normalbevölkerung. Als signifikant negative Einflussfaktoren auf die verschiedenen Dimensionen der Lebensqualität zeigte sich die allogene Stammzelltransplantation und ein Alter > 55 Jahren. Stammzelltransplantierte und ältere Patienten waren nicht nur häufiger durch Begleiterkrankungen belastet, sondern auch signifikant stärker in ihrer körperlichen und Rollen-Funktion eingeschränkt. In beiden Gruppen fanden sich zudem eine signifikant stärkere Fatigue-Ausprägung und größere finanzielle Schwierigkeiten. Während die globale Lebensqualität älterer Patienten signifikant schlechter war, hatte die Stammzelltransplantation interessanterweise keinen negativen Einfluss auf die Lebensqualität. Die Lebensqualität von SZT-Patienten korreliert also anscheinend nicht zwingend mit einem schlechteren Gesundheitszustand. Der individuelle Umgang mit der Erkrankung (Coping), sowie neue Sinn- und Wertevorstellungen scheinen somit unabhängig vom Gesundheitszustand eine zentrale Rolle in der Bewertung der eigenen Lebensqualität zu spielen. Dies zeigte sich auch im gesamten Kollektiv, z.B. bei in Freitextkommentaren der Patienten. Die Erfahrung der potenziell tödlichen Erkrankung schien für viele Patienten den Blick auf die Gegenwart verändert zu haben (intensiveres Leben, kleine Ziele, stärkere Wahrnehmung von Glück, Erkennen von wichtig und unwichtig). Sehr viele Patienten waren der Meinung, dass das Verhältnis zu Freunden und Familie durch die Erkrankung an Bedeutung gewonnen habe. Als negativ wurde überwiegend die verminderte körperliche und vor allem geistige Leistungsfähigkeit genannt. Einige körperliche Einschränkungen wurden mit Spätfolgen der Leukämieerkrankung bzw. –therapie in Verbindung gebracht (z. B. Gelenknekrosen, Haarausfall). Andere Erkrankungen, wie z.B. Hypertonus, Diabetes und kardiopulmonale Erkrankungen konnten dagegen nicht im Zusammenhang mit der Erkrankung gebracht werden und waren - verglichen mit der Normalbevölkerung - auch nicht häufiger. Bei rund der Hälfte aller Patienten mit Kinderwunsch konnte dieser auch erfüllt werden. Allerdings galt dies nur für Patienten nach Chemotherapie. Patienten nach allogener Stammzelltransplantation waren nahezu alle infertil. Insgesamt zeigten die meisten Patienten trotz oft Schwerbehinderung ein hohes Maß an beruflicher Reintegration. Ein dauerhaft hoher Grad an Behinderung (> 50%) ging jedoch deutlich häufiger mit Arbeitslosigkeit oder (Früh-)Berentungen einher. Ein wichtiges Ziel für die Zukunft ist die systematische, prospektive Erfassung von Lebensqualität und medizinischen Spätfolgen bei Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie im Rahmen der GMALL-Studien. Neben der Lebensqualität soll auch ein systematisches Nachsorgeprogramm - analog den bereits existierenden Programmen für Kinder (z. B. LESS ) entwickelt werden. Dabei sollte besonders die Gruppe der älteren Patienten > 55 Jahren, und die allogen stammzelltransplantierten Patienten berücksichtigt werden. Für prospektive Untersuchungen ist zudem eine gezielte Untersuchung der Fatigue-Symptomatik geplant. Für prospektive Studien ist es essenziell, die erhobenen Daten - insbesondere während der Therapie - zeitnah auszuwerten. So kann ein Verlauf erfasst werden und es besteht die Möglichkeit, bereits während Therapie Hilfsangebote - z. B. psychosoziale Unterstützung - anzubieten. Ebenso können die Daten zur Lebensqualität genutzt werden, um in Therapieentscheidungen - z. B. vor Transplantation - miteinbezogen zu werden. Patienten kann zudem ein realistischer Ausblick auf das Leben nach der Therapie gegeben werden.
Algorithms and data structures constitute the theoretical foundations of computer science and are an integral part of any classical computer science curriculum. Due to their high level of abstraction, the understanding of algorithms is of crucial concern to the vast majority of novice students. To facilitate the understanding and teaching of algorithms, a new research field termed "algorithm visualisation" evolved in the early 1980's. This field is concerned with innovating techniques and concepts for the development of effective algorithm visualisations for teaching, study, and research purposes. Due to the large number of requirements that high-quality algorithm visualisations need to meet, developing and deploying effective algorithm visualisations from scratch is often deemed to be an arduous, time-consuming task, which necessitates high-level skills in didactics, design, programming and evaluation. A substantial part of this thesis is devoted to the problems and solutions related to the automation of three-dimensional visual simulation of algorithms. The scientific contribution of the research presented in this work lies in addressing three concerns: - Identifying and investigating the issues related to the full automation of visual simulations. - Developing an automation-based approach to minimising the effort required for creating effective visual simulations. - Designing and implementing a rich environment for the visualisation of arbitrary algorithms and data structures in 3D. The presented research in this thesis is of considerable interest to (1) researchers anxious to facilitate the development process of algorithm visualisations, (2) educators concerned with adopting algorithm visualisations as a teaching aid and (3) students interested in developing their own algorithm animations.
Es ist gelungen, self-assembled Monolayers auf Wasserstoff-terminierten Germaniumoberflächen zu präparieren. Für die Charakterisierung wurden unterschiedliche Methoden herangezogen. Neben der Oberflächentopographie, die mit dem AFM untersucht wurde, konnten die Proben durch röntgenspektroskopische Methoden qualitativ und quantitativ vor, während und nach der Präparation analysiert werden. Im Zusammenspiel dieser Methoden war eine umfassende Interpretation der Ergebnisse möglich, die viele neue Erkenntnisse im Bereich der Grundlagenforschung auf dem Halbleitersubstrat Germanium (Ge) ermöglichten. Motivation für diese Arbeit war das Interesse, Ge als Substrat im Bereich der Halbleitertechnologie zu verwenden. Ge hat eine bessere Ladungsträgerbeweglichkeit und andere Vorteile gegenüber Silicium (Si). Der Einsatz scheitert momentan, da das ca. 1-2 nm dicke native Oxid auf der Oberfläche des Ge anders als beim Si wasserlöslich ist. Daher ist eine Renaissance der Grundlagenforschung auf diesem Gebiet zu verzeichnen. Auf der Suche nach einer definierten und passivierten Oberfläche lag der Gedanke nah, dieses Ziel durch das Self-Assembly thiolischer Alkane zu erreichen. Diese Methode ist auf Goldoberflächen sehr gut erforscht und man erhält aus einer entsprechenden Lösung durch einfachste nasschemische Präparation eine bei Laborbedingungen stabile Monolage. Um das Konzept der self-assembled Monolayers auf Ge zu übertragen, war es zunächst notwenig, die Oxidschicht des Substrats so zu entfernen, so dass eine Wasserstoff-terminierte Oberfläche zurückbleibt, die eine möglichst geringe Rauheit aufweist. Dies gelang letztendlich mit einem Tauchbad in verdünnter oder konzentrierter Fluorwasserstoffsäure (Flusssäure, HF) für 5 min bzw. 40 s. Die Rauheit der Proben wurde durch AFM-Aufnahmen bestimmt und liegt bei RMS=0,34 nm. Die chemische Beschaffenheit wurde durch XPS und Totalreflexionsröntgenfluoreszenz am Synchrotron (Sr-TXRF) untersucht. Die referenzfreie Quantifizierung zeigte, dass sich auf der Oberfläche noch Sauerstoff befand, der durch XPS auch dem auf der Oberfläche verbliebenem Wasser zugeordnet werden konnte. Durch Untersuchungen an der Absorptionskante des Sauerstoffs mit NEXAFS konnte diese These untermauert werden. In einem nächsten Schritt gelang die Präparation der SAMs mit Molekülen mit unterschiedlichen Kopfgruppen. Diese definierten die neuen Eigenschaften der Substratoberfläche und sind auch für die Verwendung des Substrats von großer Bedeutung. Es wurden die Kopfgruppen so gewählt, dass eine Detektion durch röntgeninduzierte Fluoreszenz möglich war. Daher fiel die Wahl auf ein fluoriertes Acetat und eine Phosphorsäure als Kopfgruppe jeweils eines Mercaptoundecans. Als Lösemittel diente schließlich wasserfreies Dichlorethan. Für die Abbildung der zunächst in Inseln wachsenden Monolage durch das AFM war die Kopfgruppe zwar unerheblich. Mit dieser Methode ließ sich der Einfluss der Kopfgruppe auf die Anordnung dokumentieren. Es war bei ausgewählten Proben möglich, eine Bedeckung der Oberfläche mit den Thiolen per AFM zu vermessen. Diese lag bei ca. 50 %. Ein Nachweis der Moleküle erfolgte unter anderem durch XPS. Durch diese Methode konnte allerdings noch nicht nachgewiesen werden, ob die Moleküle nur ungeordnet auf der Oberfläche adsorbiert sind, oder tatsächlich chemisch gebunden und aufgerichtet sind. Dies erfolgte durch Messungen an der Synchrotronstrahlenquelle. Durch referenzfreie TXRF konnte die Belegung des Substrats mit Fluor analysiert werden. Da das Fluor jedoch auch ein Rückstand des HF-Tauchbades hätte sein können, wurde durch NEXAFS nachgewiesen, dass bei den Proben, die lange in thiolischer Lösung waren, die Fluorspezies, die bei den frisch HF-getauchten Proben vorhanden ist, praktisch nicht mehr existiert. Im Umkehrschluss wurde auch eine auf Gold präparierte Monolage des gleichen Moleküls mit NEXAFS vermessen. Die Fluorspektren ähnelten sich trotz des unterschiedlichen Substrats. Bei der Röntgenfluoreszenz am Glanzwinkel (GIXRF) können Intensitätsmaxima ein stehendes Wellenfelds oberhalb des Substrats abhängig vom Winkel des einfallenden Strahls verändert werden. Diese Methode kam zum Einsatz um nachzuweisen, dass sich die Moleküle der Kopfgruppe oberhalb des Schwefels und oberhalb des Ge befinden. Durch mathematische Berechnungen ist man in der Lage, die Höhe der Monolage und den Verkippungswinkel der Moleküle zu ermitteln. Dieser lag bei ca. 45° und einer 1,4 nm hohen Monolage. Diese Aussagen wiederum stimmen mit den am AFM erzielten Ergebnissen in erster Näherung überein. Durch das Zusammenspiel fünf unterschiedlicher Methoden war es möglich, diese vielfältigen Erkenntnisse in dem Forschungsfeld der Ge-Oberflächen zu generieren.
Mixed volumes, mixed Ehrhart theory and applications to tropical geometry and linkage configurations
(2009)
The aim of this thesis is the discussion of mixed volumes, their interplay with algebraic geometry, discrete geometry and tropical geometry and their use in applications such as linkage configuration problems. Namely we present new technical tools for mixed volume computation, a novel approach to Ehrhart theory that links mixed volumes with counting integer points in Minkowski sums, new expressions in terms of mixed volumes of combinatorial quantities in tropical geometry and furthermore we employ mixed volume techniques to obtain bounds in certain graph embedding problems.
Tropical geometry is the geometry of the tropical semiring \[\mathbb{T}:=(\mathbb{R}\cup\{\infty\},\min,+).\] Classical algebraic structures correspond to tropical structures. If $I\lhd K[x_1,\ldots,x_n]$ is an ideal in a polynomial ring over a field $K$ with valuation $v$, then the classical algebraic variety correspond to the tropical variety $T(I)$. It is the set of all points $w$, such that the minimum $\min\{v(c_\alpha)+w\cdot\alpha\}$ is achieved twice for all $f=\sum_\alpha c_\alpha x^\alpha\in I$. So tropical geometry relates algebraic geometric problems with discrete geometric problems. In this thesis we obtain a tropical version of the Eisenbud-Evans Theorem which states that every algebraic variety in $\mathbb{R}^n$ is the intersection of $n$ hypersurfaces. We find out that in the tropical setting every tropical variety $T(I)$ can be written as an intersection of only $(n+1)$ tropical hypersurfaces. So we get a finite generating system of $I$ such that the corresponding tropical hypersurfaces intersect to the tropical variety, a so-called tropical basis. Let $I \lhd K[x_1,\ldots,x_n]$ be a prime ideal generated by the polynomials $f_1, \ldots, f_r$. Then there exist $g_0,\ldots,g_{n} \in I$ such that \[ T(I) \ = \ \bigcap_{i=0}^{n}T(g_i)\] and thus $\mathcal{G} := \{f_1, \ldots, f_r, g_0, \ldots, g_{n}\}$ is a tropical basis for $I$ of cardinality $r+n+1$. Tropical bases are discussed by Bogart, Jensen, Speyer, Sturmfels and Thomas where it is shown that tropical bases of linear polynomials of a linear ideal have to be very large. We do not restrict the tropical basis to consist of linear polynomials and therefore we get a shorter tropical basis. But the degrees of our polynomials can be very large. The main ingredient to get a short tropical basis is the use of projections, in particular geometrically regular projections. Together with the fact that preimages of projections of tropical varieties are themselves tropical varieties of a certain elimination ideal we get the desired result. Let $I \lhd K[x_1, \ldots, x_n]$ be an $m$-dimensional prime ideal and $\pi : \mathbb{R}^n \to \mathbb{R}^{m+1}$ be a rational projection. Then $\pi^{-1}(\pi(T(I)))$ is a tropical variety, namely \[ \pi^{-1}(\pi(T(I))) \ = \ T(J \cap K[x_1, \ldots, x_n]) \,\] Here $J$ is an ideal in $K[x_1,\ldots,x_n,\lambda_1,\ldots,\lambda_{n-m-1}]$ derived from the ideal $I$. We show that this elimination ideal is a principal ideal which yields a polynomial in our tropical basis. The advantage of our method is that we find our polynomials by projections and therefore we can use the results of Gelfand, Kapranov and Zelevinsky , of Esterov and Khovanskii , and of Sturmfels, Tevelev and Yu. With mixed fiber polytopes we get the structure and combinatorics of the image of a tropical variety and therefore the structure of the polynomials in our tropical basis. Let $I=\lhd K[x_1,\ldots,x_n]$ an $m$-dimensional ideal, generated by generic polynomials $f_1,\ldots, f_{n-m}$, $\pi:\mathbb{R}^n\to\mathbb{R}^{m+1}$ a projection and $\psi$ a projection presented by a matrix with a rowspace equal to the kernel of $\pi$. Then up to affine isomorphisms, the cells of the dual subdivision of $\pi^{-1} \pi T(I)$ are of the form \[ \sum_{i=1}^p \Sigma_{\psi} (C_{i1}^{\vee}, \ldots, C_{i{k}}^{\vee}) \] for some $p\in\mathbb{N}$ and faces $F_1, \ldots, F_p$ of $T(f_1)\cap\ldots\cap T(f_k)$ and the dual cell of $F_i\subseteq U = T(f_1)\cup\ldots\cup T(f_k)$ is given by $F_i^\vee=C_{i1}^{\vee}+ \ldots+ C_{ik}^{\vee}$ with faces $C_{i1}, \ldots, C_{i k}$ of $T(f_1), \ldots, T(f_{k})$. In case that we project a tropical curve we want to find the number of $(n-1)$-cells of the above form with $p>1$, i.e. the cells which are dual to vertices of $\pi(T(I))$ which are the intersection of the images of two non-adjacent $1$-cells of $T(I)$. Vertices of this type are called selfintersection points. We show that there exist a tropcal line $L_n\subset\mathbb{R}^n$ and a projection $\pi:\mathbb{R}^n\to\mathbb{R}^2$, such that $L_n$ has $\sum_{i=1}^{n-2}i$ selfintersection points. Furthermore we find tropical curves $\mathcal{C}\subset\mathbb{R}^n$, which are transversal intersections of $n-1$ tropical hypersurfaces of degrees $d_1,\ldots,d_{n-1}$ and a projection $\pi:\mathbb{R}^n\to\mathbb{R}^2$, such that $\mathcal{C}$ has at least $(d_1\cdot\ldots\cdot d_{n-1})^2\cdot \sum_{i=1}^{n-2}i) $ selfintersection points. A caterpillar is a certain simple type of a tropical line and for this type we show that it can have at most $\sum_{i=1}^{n-2}i$ selfintersection points.
Diese Arbeit untersuchte die Epidemiologie und den Einfluss verschiedener Faktoren (Grunderkrankung, empirische Therapie, Schweregrad der Sepsis und Erreger mit Resistenz) auf das Überleben von Patienten mit Septikämien. Die häufigsten Grunderkrankungen dieses Kollektivs waren Leukämien (33%), solide Neoplasien (14%) sowie kardiale Vorerkrankungen (14%). Knapp die Hälfte der Patienten erwarb die Septikämie im Krankenhaus (47%). ...
Das Nierenzellkarzinom (NZK) ist der häufigste maligne Tumor der Niere. In vielen Fällen sind bereits bei der Erstdiagnose Metastasen vorhanden oder entstehen im Verlauf der Therapie. Die Behandlungsmöglichkeiten für diese NZK-Patienten sind äußerst limitiert. Nahezu 2/3 der Betroffenen versterben an ihrer Erkrankung. Die Etablierung neuer Therapieansätze zur Behandlung des NZK ist dringend gefordert. Es wird postuliert, dass ein Therapiekonzept basierend auf dem Histondeacetylase (HDAC)-Inhibitor Valproat (VPA) kombiniert mit niedrig dosiertem Interferon (IFN)-alpha eine innovative und effiziente Behandlungsoption für austherapierte NZK-Patienten eröffnen könnte. In der vorliegenden Studie wurde der Einfluss einer VPA-Mono- versus VPA/IFN-alpha-Kombinationstherapie auf die malignen Eigenschaften verschiedener NZK-Zelllinien evaluiert. Mittels funktioneller Untersuchungen wurden Proliferations- und Adhäsionsphänomene unter den entsprechenden Therapien näher betrachtet. Fluorimetrische und molekularbiologische Studien dienten der detaillierten Aufklärung der den Veränderungen zugrunde liegenden Wirkmechanismen. Zur translationalen Gestaltung wurden zusätzlich tierexperimentelle Untersuchungen durchgeführt. VPA induzierte eine signifikante Reduktion der Proliferation von NZK-Zellen, die durch die additive Gabe von IFN-alpha weiter verstärkt wurde. Die anti-proliferativen Effekte korrelierten mit einer Zunahme der Zellen in der G0/G1-Phase und einer damit einhergehenden verminderten Anzahl an Zellen in der S-Phase. Die Verschiebung der Zellzyklusphasen war mit einer deutlichen Modulation relevanter regulatorischer Zellzyklusproteine assoziiert. Des Weiteren resultierte VPA und die korrespondierende Kombination mit IFN-alpha in einer signifikanten Inhibition der Adhäsion an Endothel und die extrazellulären Matrixproteine. VPA und die VPA/IFN-alpha-Kombination übten ihren Einfluss dabei offensichtlich über eine Modulation von Adhäsionsrezeptoren, implizit Integrine und CD44-Varianten, aus. Die antiproliferative und –adhäsive Wirkung war in der Regel nach längerer Inkubationszeit von 5 Tagen deutlich stärker als nach 3 Tagen. In analog behandelten normalen Nierenzellen zeigten sich im Vergleich keine solchen Effekte. Die Behandlung mit VPA und IFN-alpha scheint somit spezifisch maligne Zellen zu beeinflussen. VPA induzierte in den NZK-Zellen ferner die Reduktion von Protoonkogenen und MAP-Kinasen sowie die Zunahme von Tumorsuppressoren. Die zusätzliche Gabe von IFN-alpha resultierte in einer weiteren Wirkungsverstärkung gegenüber VPA allein. VPA und die Kombination mit IFN-alpha inhibierten zudem signifikant die HDAC6-Aktivität und -Proteinexpression der NZK-Zellen. Diese Hemmung ging mit einer Hyperacetylierung der Histone einher. Die epigenetische Modulation führte zur veränderten Genregulation und Transkription. So nahmen VPA und die korrespondierende Kombination neben den genannten funktionellen und molekularbiologischen Veränderungen maßgeblich Einfluss auf das Genexpressionsprofil der Tumorzellen. Die Expression negativer Regulatoren der Proliferation, Migration und Adhäsion sowie von Genen involviert in Differenzierung und Immunantwort wurden erhöht, wohingegen die Anzahl der Transkripte von Genen mitverantwortlich für die Ausbildung von Resistenzen und die Nährstoffversorgung der Tumoren reduziert wurde. Translationale tierexperimentelle Studien bestätigten die klinische Relevanz der VPA- und VPA/IFN-alpha-Behandlung, die in einer signifikanten Hemmung des Tumorwachstums resultierten. Die Wachstums-Inhibition war mit einer starken Modulation regulatorischer Proteine des Zellzyklus, der Apoptose und des HDAC-Systems assoziiert. Die vorliegenden Ergebnisse demonstrieren das viel versprechende Wirkungspotential von VPA und der korrespondierenden Kombination mit niedrig dosiertem IFN-alpha. VPAs anti-proliferative und -adhäsive Effekte in vitro und in vivo eröffnen die Perspektive für eine innovative Strategie in der Behandlung des NZK. Aufgrund der präsentierten Daten lässt sich postulieren, dass VPA und IFN-alpha die Grundlage für ein neues, effizientes Therapiekonzept bei austherapierten NZK-Patienten darstellen könnte.
Signal-dependent regulation of actin dynamics is essential for many cellular processes, including directional cell migration. In particular, cell migration is initiated by lamellipodia, actin-based protrusions of the plasma membrane. The formation of these protruding structures require incessant assembly and disassembly of actin filaments. The Arp2/3 complex and WAVE proteins are essential for both lamellipodium formation and its dynamics. WAVEs mediate the activation of the Arp2/3 complex downstream of the small GTPase Rac, thus being critical for Rac- and RTK-induced actin polymerization and cell migration. The WAVE-family proteins are always found associated with multiprotein complexes. The most abundant WAVE-based complex is referred to as the WANP (WAVE2-Abi-1-Nap1-PIR121) complex. IQGAP1 is a huge scaffolding protein with multiple protein-interacting domains. IQGAP1 participates in many fundamental activities, including regulation of the actin cytoskeleton, mitogenic, adhesive and migratory responses, as well as in cell polarity and cellular trafficking. IQGAP1 binds to N-WASP, thus raising the possibility that it might control actin nucleation by the Arp2/3 complex. In this study, IQGAP1 was found co-immunoprecipitated not only with WAVE, but also with the endogenous WANP-complex subunits. Correspondingly, IQGAP1 associated to both anti-WAVE and anti-Abi-1 immuno-complexes. Pull-down experiments proved that IQGAP1 binds directly to the WANP-complex subunits. Physical interaction between IQGAP1 and the reconstituted WANP complex could also be demonstrated. Together, these data indicate that IQGAP1 is an accessory component of the WANP complex. Interestingly, the IQGAP-WANP complex disassembled after either EGF stimulation or transfection with constitutively active Cdc42 and Rac1. HeLa cells devoid of IQGAP1 showed diminished and less persistent ruffling upon EGF, but not HGF, stimulation in comparison with the control. This phenotype was accompanied by a strong reduction in chemotaxis towards both growth factors, which was as dramatic as in WANP-complex knockdown (KD) cells. Moreover, GM130 and Giantin showed a polarized and flat ribbon-like pattern in control cells, as it is expected for cis- and cis/medial-Golgi markers. Conversely, small and dispersed vesicular structures were found in both IQGAP1 KD and WANP-complex KD cells. Importantly, Arp2/3-complex silencing resulted in the same phenotypes. Consistently, Brefeldin A-induced disassembly of the Golgi strongly inhibited the IQGAP1-WANP-complex interaction and chemotaxis towards EGF in wild-type cells. The re-expression of an RNAi-resistant wild-type IQGAP1 in IQGAP1 KD cells fully rescued both the ruffling abilities and Golgi structure. A constitutively active mutant, unable to bind to neither Rac1 /Cdc42 nor the WANP complex, could reconstitute only the former defect. Hence, this study shows that actin dynamics regulated by the IQGAP1-WANP complex controls Golgi-apparatus architecture and its contribution to cell chemotaxis. The working model here proposes that at the Golgi apparatus, recruitment of the WANP complex by IQGAP1 leads to the assembly of actin filaments required to maintain the appropriated Golgi morphology. The dissociation of the complex may be required to allow the remodeling of the Golgi membranes in order to respond following a chemoattractant gradient.
Zielsetzung: Schizophrenie ist eine psychische Erkrankung, die mit den strukturellen und funktionellen Veränderungen in Gehirn zusammen hängt. Die Mehrheit der kernspintomographischen Studien konnte hippocampale Veränderungen bei den schizophrenen Patienten finden, obgleich diese Veränderungen nicht immer bei der Early-Onset Schizophrenie repliziert werden konnten. Frühere Studien weisen jedoch darauf hin, dass Volumenreduktion der Hippocampi entweder während der Adoleszenz oder während des Übergangs zu einer akuten Phase auftritt. Außerdem bleibt das funktionelle Korrelat hippocampaler Struktur unklar. Das Ziel unserer Arbeit besteht darin, zu überprüfen, ob strukturelle Veränderungen bereits bei den Patienten mit einer Early-Onset Schizophrenie nachzuweisen sind und ob ein Zusammenhang zwischen dem Volumen der Hippocampi und den neurokognitiven Funktionen und der Psychopathologie besteht. Methode: Mittels Magnetresonanztomographie wurden die Volumina des rechten und des linken Hippocampus, der grauen und weißen Substanz sowie der zerebrospinalen Flüssigkeit bei 26 Patienten mit einer Early-Onset Schizophrenie und 26 gematchten gesunden Probanden untersucht. Es wurden 1mm dicke MRT Schnitte angefertigt. Die neurokognitive Funktionstüchtigkeit wurde in beiden Gruppen mit Wisconsin Card Sorting Test (WSCT), Trail Making Test-A (TMT-A), Trail Making Test-B (TMT-B) und Mehrfach Wortschatz Intelligenztest–B (MWT-B) verglichen. Die Beurteilung der psychopathologischen Symptomatik erfolgte mit dem Structured Clinical Interview: Positive and Negative Syndrom Scale (PANSS). Zudem wurde mittels Korrelationsanalysen berechnet, inwieweit eine Übereinstimmung zwischen neurokognitivem Funktionsniveau, der Psychopathologie und Volumengröße von Hippocampi gegeben ist. Ergebnisse: Jugendliche mit einer Early-Onset Schizophrenie wiesen im Vergleich zu gesunden Kontrollprobanden signifikant kleinere Hippocampi rechts auf und zeigten eine tendenzielle Verkleinerung der Hippocampi links. Das Volumen der grauen Substanz war bei Patienten ebenfalls signifikant reduziert und das CSF Volumen signifikant erhöht. Das Volumen der weißen Substanz zeigte in beiden Gruppen keine signifikanten Unterschiede. Bei Patienten zeigte sich eine signifikant bedeutsame höhere Perseverationsrate (WSCT) im Vergleich zu gesunden Probanden. Es fand sich eine signifikant negative Korrelation zwischen den negativen Symptomen und dem Volumen des rechten Hippocampus. Die Volumengröße der Hippocampi korrelierte jedoch nicht mit dem neuropsychologischen Funktionsniveau, dem Alter bei der Untersuchung, dem Alter bei Erkrankungsbeginn und Erkrankungsdauer. Schlussfolgerung: Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass hirnstrukturelle Veränderungen bereits bei den Patienten mit einer Early-Onset Schizophrenie nachweisbar sind. Sie unterstützen somit die Hypothese der gestörten Hirnentwicklung.
Nahrungsmittelallergikern steht aufgrund inakzeptabler Nebenwirkungen bei der spezifischen Immuntherapie zurzeit noch keine kausale Therapie dieser Erkrankung zur Verfügung. Demzufolge bleibt die Vermeidung der entsprechenden Lebensmittel für Nahrungsmittelallergiker der einzige Weg möglicherweise lebensbedrohlichen allergischen Reaktionen zu entgehen. Ziel dieser Arbeit war es, das Potential eines viralen Vektors für die Verwendung bei der spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie zu untersuchen. Die Überlegung dahinter war, das Risiko eines anaphylaktischen Schocks, der bei Injektion eines Allergens immer gegeben ist, durch intrazelluläre Expression des Proteins über das rekombinante Virus zu verringern. Zusätzlich dazu bringt das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) ideale Voraussetzungen für eine Allergievakzine mit: Die Infektion mit MVA führt zu einer stark Th1-gerichteten Immunantwort gegen die viral exprimierte Proteine, die möglicherweise die allergische Th2-gerichtete Immunantwort modulieren kann. Die prophylaktische Immunisierung mit MVA-OVA im Mausmodell der systemischen Sensibilisierung gegen Ovalbumin (OVA) führte dosisabhängig zur Suppression der spezifischen IgE-Antwort und somit zum Schutz vor allergischer Sensibilisierung. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die Vakzinierung mit MVA-OVA eine dauerhafte spezifische IgG-Antwort induziert. Diese Daten unterstützen das Konzept einer Modulation der Sensibilisierung durch MVA-Vakzine. Weiterhin wurden zwei rekombinante Vakzinen generiert, mittels derer entweder das Tropomyosin aus Garnelen (Pen a 1) oder das Lipid-Transfer-Protein aus Haselnuss (Cor a 8) intrazellulär exprimiert werden konnte. Dass die Sensibilisierung gegen diese Allergene häufig mit schweren allergischen Reaktionen korreliert, unterstreicht die Notwendigkeit einer verbesserten Immuntherapie in diesem Bereich. Während MVA-Pen a 1 in ausreichender Menge und Qualität für die Verwendung im Mausmodell hergestellt werden konnte, gelang es nicht, eine homogene Population von MVA-Cor a 8 zu gewinnen, in der das Selektionsgen K1L nicht mehr vorhanden war. Parallel zur Virusherstellung wurden Mausmodelle der Sensibilisierung gegen Cor a 8 und Pen a 1 entwickelt. Vergleiche unterschiedlicher Mausstämme ergaben, dass sich Mäuse des Stammes CBA/J am empfänglichsten für eine systemische Sensibilisierung mit Cor a 8 sind. Aufgrund von Erfahrungen zur Sensibilisierung gegen Pen a 1 wurden Mäuse des Stammes C3H/HeJ bei der Etablierung eines Garnelenallergiemodells verwendet. Es zeigte sich, dass durch die intragastrale Applikation von 0,1 mg Pen a 1 sowie Choleratoxin als Adjuvanz (drei Gaben in dreiwöchigem Abstand), gefolgt von einer systemischen Gabe des Allergens mit Aluminiumhydroxid eine spezifische Sensibilisierung hervorgerufen werden konnte, die nach Exposition mit Pen a 1 zu allergischen Symptomen führte. Auch in diesem Modell bot die prophylaktische Immunisierung mit MVA-Pen a 1 Schutz vor Pen a 1spezifischer Sensibilisierung. Um die therapeutische Effektivität der Vakzine ermitteln zu können, muss die begonnene Etablierung eines Allergiemodells mit symptomauslösenden Provokationen und immunologischen Analysen weitergeführt werden. Der in dieser Studie beobachtete starke schützende Effekt einer Vakzinierung mit MVA vor allergischer Sensibilisierung und das sehr gute Sicherheitsprofil dieses Vektors in klinischen Studien zu anderen Erkrankungen belegt die Möglichkeit einer Verwendung von MVA zur erfolgreichen spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein weit verbreitetes Humanpathogen, welches den menschlichen Magen besiedelt und zu schwerwiegenden entzündlichen Erkrankungen des gastralen Traktes führen kann. Bereits 1994 wurde das Bakterium als ein Klasse 1 Karzinogen deklariert, da H. pylori im erwiesenen Maße mit der Entstehung von hochinvasivem Magenkrebs in Verbindung gebracht wird. In vitro induziert H. pylori eine starke Migration der infizierten Epithelzellen, die unter anderem mit der Auflösung der Zellkontakte einhergeht. Die zugrunde liegenden molekularen Zusammenhänge konnten bisher noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Die Mechanismen der Auflösung der Zelladhäsion wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht, um einen tieferen Einblick in die H. pylori vermittelten Virulenz zu erhalten. So konnte eine H. pylori-induzierte Dissoziation des E-Cadherin Komplexes, bestehend aus p120, 􀄮- und 􀈕-Catenin beobachtet werden, der in einem Verlust der Zelladhäsion resultierte. Es konnte darüber hinaus eine Spaltung der extrazellulären Domäne von ECadherin detektiert werden, die wahrscheinlich zu einer Destabilisierung und somit zur Auflösung des gesamten E-Cadherin Komplexes führte. Durch den Zerfall der Adhärenzverbindungen wurden Catenine in den zytoplasmatischen Pool freigegeben, von denen p120 in den Zellkern translozierte und die Transaktivierung von Zielgenen auslöste, die in diesem Zusammenhang mit Hilfe von Reportergenanalysen quantifiziert wurden. Diese Prozesse zeigten sich von dem Pathogenitätsfaktor CagA (cytotoxin associated gene A) unabhängig, der über das bakterielle Typ IV Sekretionssystem in die Wirtszellen transloziert wird und krebsassoziierte Signaltransduktionswege aktivieren kann. In weiteren Untersuchungen wurden deshalb die Auswirkungen löslicher H. pylori Faktoren auf die Spaltung von E-Cadherin und folglich auf die Zellmotilität und Morphologie epithelialer Zellen analysiert. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden in weiteren Experimenten proteolytische Aktivitäten von H. pylori untersucht. Dabei konnte erstmalig die hypothetische Protease HtrA (high temperature requirement protein A) von H. pylori durch massenspektrometrischen Analysen als eine caseinolytisch aktive Protease gefunden werden. Nach der Klonierung und Aufreinigung von HtrA konnte darüber hinaus auch E-Cadherin als spezifisches biologisches Substrat der Wirtszellen für HtrA identifiziert werden. Diese selektive Fragmentierung von E-Cadherin durch HtrA fügt sich als ein neues Element in das Modell der H. pylori Pathogenese, die einen initialen Schritt in der frühen Phase der Infektion darstellen könnte.
Delthyridoid spiriferids are characterized by a global abundance and fast evolution during Silurian and Devonian, and, therefore, are used as important biostratigraphical and palaeobiogeographical tools. In this work, delthyridoid brachiopod faunas from different regions of today’s world, resp., of different palaeobiogeographical units, are compared side-by-side to investigate their phylogenetic relationships and to improve, in a second step, the palaeobiogeography from Late Silurian to Early Eifelian time. A new systematics of Delthyridoidae is established which is more complicated than hitherto assumed. The results of this study are mainly based on direct comparison of articulated and isolated brachiopod shells, external and internal moulds, as well as latex casts and serial sections. The computer supported cladistic analyses have turned out not to be useful due to different kinds of preservation resulting in an incomplete matrix which is insufficient for reliable cladograms. A further problem in terms of cladistical analyses are various convergences during the evolution of spiriferids. Many characters evolved independently from each other at different times in each lineage so that autapomorphies are hardly or not at all recognizable. As a result, families and genera are only definable by a combination of characters rather than by a single or a few autapomorphies. As a new method, 3D reconstruction from serial sections is introduced which made it possible for the first time to compare directly mouldic and shelly material. Preliminary results are presented herein. Statistical analyses of measurements taken from new taxa are made but regarded as a descriptive argument rather than a deciding factor for taxonmy due to incomplete preservation and/or tectonic deformation. Brachiopods, especially type material, from collections of different institutions and museums are studied as well as personal material, whenever possible collected from topotype outcrops. Emended diagnoses, if necessary, from family to species level are given. During this work several new taxa have been erected: 7 new families: Australospiriferidae, Murchisonispiriferidae, Orientospiriferidae, Otospiriferidae, Patriaspiriferidae, Rostrospiriferidae, and Trigonospiriferidae; 6 new genera, 1 of these in open nomenclature: Cyclopterospirifer, Hallispirifer, Parlinispirifer, Murchisonispirifer, Shujiapingensispirifer, and gen. nov. B; and 3 new species: Patriaspirifer merriami, Patriaspirifer johnsoni, and Murchisonispirifer feldmani; 1 taxon is defined as nomen novum: Orientospirifer nakaolingensis wani. In the framework of this project, 2 families: Filispiriferidae and Multispiriferidae; 1 subfamily: Multiplicatispiriferinae, 6 genera, 1 of them in open nomenclature: Frequentispirifer, Leonispirifer, Multiplicatispirifer, Ovetensispirifer, Turcispirifer, and Gen. A; and 9 new species, 3 of them in open nomenclature: Filispirifer hamadae, Leonispirifer leonensis, Multiplicatispirifer foumzguidensis, Oventensispirifer novascotianus, Quiringites arensentiae, Turcispirifer turciae, Multiplicatispirifer cf. foumzguidensis, Quiringites cf. arensentiae, and ?Turcispirifer sp. A which have already been established are also described in this work. The brachiopod faunas studied consist of externally very similar spiriferids which have been identified as same genera, species, or even subspecies in earlier times. These forms are considered as 6 distinct morphotypes Howellella-, Arduspirifer-, Acrospirifer-, Euryspirifer-, Paraspirifer-, and Multiplicatispirifer-like morphotypes, which are briefly introduced. The new systematics is characterized by different clades, the European/North African delthyridoid spiriferid clade, the North American delthyridoid spiriferid clade, the Asian delthyridoid spiriferid clade, the Malvinokaffric delthyridoid spiriferid clade, and the delthyridoid multiplicated spiriferid clade. Each of them is described in a cladistic and in a phylogenetic way. Their phylogenetic relationship sheds new light on palaeobiogeographical interpretations for the different stages from Late Silurian to early Middle Devonian time. A tendency for increasing endemicity is seen until the end of the Early Emsian, which is interrupted by short term regional faunal exchange within a province or within a realm, followed by a loss of endemicity resulting in global distribution of brachiopod genera until the end of Givetian time. The Old World Realm is re-defined due to the lack of phylogenetic relationship between its faunas and subdivided into the European Realm, consisting of the Gondwanan and Avalonian provinces, and the Asian Realm, consisting of the Siberian, Sino, and Mongolian provinces. A reconstruction of Lower Devonian palaeobiographical map is introduced.
Die Entwicklung neuer und Verbesserung bestehender Methoden zur theoretischen Beschreibung molekularer Systeme ist eine der wichtigsten Aufgaben der theoretischen Chemie, vor allem zur Berechnung elektronisch angeregter Zustände zur Simulation von Spektren. Das Ziel dieser Arbeit ist in diesem Zusammenhang die Weiterentwicklung des algebraisch-diagrammatischen Konstuktionsverfahrens (ADC), einer Methode zur Berechnung elektronisch angeregter Zustände, und die Bereitstellung effizienter Computerprogramme zum theoretischen Studium optischer Eigenschaften von "open-shell" Molekülen. Im Vordergrund stehen hierbei die physikalisch richtige Beschreibung von ladungsgetrennten Zuständen und solchen mit hohem Doppeltanregungscharakter. Verbesserte theoretische Methoden sind notwendig, da die zu berechnenden Systeme häufig für eine Beschreibung mit vorhandenen hochgenauen ab initio Methoden zu groß sind. Einfachere, durchführbare Methoden wie z.B. semi-empirische oder DFT-basierte Methoden, die es erlauben, sehr große Molekülsysteme mit mehr als 100 Atomen zu beschreiben, weisen häufig große, nicht vorhersagbare Fehler auf. Experimente im Forschungsgebiet angeregter Zustände von Molekülen finden spektroskopisch statt und erfordern auf der anderen Seite eine Unterstützung durch zuverlässige theoretische Voraussagen. Die Weiterentwicklung der Theorie ist also auch im allgemeinen Interesse der Chemie, Biologie und der anderen Naturwissenschaften. Teil 1 dieser Arbeit umfasst die Theorie, während in Teil 2 deren Anwendung auf ausgewählte Systeme zu finden ist. Nach einer allgemeinen Einführung in die Problematik und grundlegenden Methoden der Quantenchemie in Kapitel 1, wurde im ersten Teil von Kapitel 2 die Methode zur Berechnung angeregter Zustände und ihrer Eigenschaften vorgestellt, auf der diese Arbeit basiert, nämlich das algebraisch-diagrammatische Konstruktionsverfahren (ADC). Dabei sind Eigenschaften von ADC zu betonen, die es von den anderen Methoden unterscheidet. Zum einen werden in ADC alle angeregten Zustände energetisch zuverlässig beschrieben, das heißt Rydberg-, Ladungstransfer- und doppelt angeregte Zustände findet man im Anregungsspektrum an der richtigen Position. Andererseits ist die Methode eine der schnellsten zur Beschreibung doppelt angeregter Zustände (z.B. bei Polyenen) und eignet sich, deren Relevanz im Spektrum zu ermitteln. Denn die beiden Schemata ADC(2)-s und ADC(2)-x unterscheiden sich in der störungstheoretischen Behandlung doppelt angeregter Zustände um eine Ordnung, ADC(2)-s beschreibt sie in nullter Ordnung, ADC(2)-x in erster. Im folgenden Abschnitt stehen die ausführlichen Gleichungen des ADC-Verfahrens für unseren Computercode. Kapitel 2 wurde abgeschlossen durch die Gleichungen der Erweiterung von ADC zur Behandlung von "open-shell" Molekülen auf UADC. Kapitel 3 umfasst die Beschreibung der "intermediate state representation" (ISR), die zur Berechnung von Eigenschaften angeregter Zustände dient und die theoretische Herleitung des UADC-Verfahrens erlaubt. Am Anfang von Teil 2 in Kapitel 4 steht die Untersuchung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit des neu entwickelten UADC-Verfahrens. Dabei wurden elf verschiedene, mittelgroße, aromatische Moleküle ausgewählt, zu denen in der Literatur auch experimentelle Daten zu Vergleichszwecken zu finden waren. Das Ergebnis ist sehr überzeugend und nur minimal aufwändiger als ADC. Kapitel 5 zeigt eine erste Anwendung von UADC auf größere Moleküle und stellt die Eigenschaft der Bestimmung von doppelt angeregten Zuständen von ADC und UADC noch einmal heraus. Der Vergleich der Polyene mit ihren "open-shell" Partnern, den Polyen-Radikalkationen und den neutralen Polyenylradikalen, zeigte, dass der Einfluss der Doppeltanregungen in den Radikalen kleiner ist, für eine exakte Beschreibung der angeregten Zustände ist er jedoch nicht zu vernachlässigen. Danach wurde eine Extraplation der angeregten Zustände von langkettigen Polyenen, Polyenradikalkationen und Polyenylradikalen vorgenommen, die den konjugierten pi-Systemen von Karotinoiden als Modellsysteme dienen. Die Beschreibung der Polyene bestätigte die experimentellen Vorhersagen zu Karotinoiden. Eine erste Anwendung der ISR bezüglich der Berechnung von Eigenschaften angeregter Zustände ist mit der Berechnung von Dipolmomenten angeregter Zustände in Kapitel 6 durchgeführt worden. Die Ergebnisse zeigen eine gute Übereinstimmung mit anderen Methoden und Messergebnissen. Eine weitere Anwendung der ISR ist die Berechnung von resonanten Zwei-Photonen-Absorptionsspektren, mit deren Hilfe spektroskopisch "dunkle" Zustände detektiert werden können. Die zur Berechnung notwendigen Übergangsdipolmomente zwischen angeregten Zuständen aus der ISR wurden dazu in einer sogenannten "sum-over-states" Näherung verwendet. Eine mögliche andere Berechnung über einen geschlossenen Ausdruck mit Hilfe der ADC-Näherung ist noch nicht implementiert.
Photo-initiated processes, like photo-excitation and -deexcitation, internal conversion, excitation energy transfer and electron transfer, are of importance in many areas of physics, chemistry and biology. For the understanding of such processes, detailed knowledge of excitation energies, potential energy surfaces and excited state properties of the involved molecules is an essential prerequisite. To obtain these informations, quantum chemical calculations are required. Several quantum chemical methods exist which allow for the calculation of excited states. Most of these methods are computationally costly what makes them only applicable to small molecules. However, many biological systems where photo-processes are of interest like light-harvesting complexes in photosynthesis or the reception of light in the human eye by rhodopsin are quite large. For large systems, however, only few theoretical methods remain applicable. The currently most widely used method is time-dependent density functional theory (TD-DFT), which can treat systems of up to 200–300 atoms with the excitation energies of some excited states exhibiting errors of less than 0.5 eV. Yet, TD-DFT has several drawbacks. The most severe failure of TD-DFT is the false description of charge transfer states which is particularly problematic in case of larger systems where it yields a multitude of artificially low-lying charge transfer states. But also Rydberg states and states with large double excitation character are not described correctly. Still, if these deficiencies are kept in mind during the interpretation of results, TD-DFT is a useful tool for the calculation of excited states. In my thesis, TD-DFT is applied in investigations of excitation energy and electron transfer processes in light-harvesting complexes. Since light-harvesting complexes, which consist of thousands of atoms, are by far too large to be calculated, model complexes for the processes of interest are constructed from available crystal structures. The model complexes are used to calculate potential energy curves along meaningful reaction coordinates. Artificial charge transfer states are corrected with the help of the so-called ∆DFT method. The resulting potential energy curves are then interpreted by comparison with experimental results. For the light-harvesting complex LH2 from purple bacteria the experimentally observed formation of carotenoid radical cations is studied. It is shown that the carotenoid radical cation is formed most likely via the optically forbidden S1 state of the carotenoid. In light-harvesting complex LHC-II of green plants the fast component of the so-called non-photochemical quenching (NPQ) is investigated. Two of several different hypotheses on the mechanism of NPQ, which have been proposed recently, are studied in detail. The first one suggests that NPQ proceeds via simple replacement of violaxanthin by zeaxanthin in the binding pocket in LHC-II. However, the calculated potential energy curves exhibit no difference between violaxanthin and zeaxanthin in the binding pocket. In combination with experimental results it is thus shown that simple replacement alone does not mediate NPQ in LHC-II. The second hypothesis proposes conformational changes of LHC-II that lead to quenching at the central lutein and chlorophyll molecules during NPQ. My TD-DFT calculations demonstrate that if this mechanism is operative, only the lutein 1 which is one of two central luteins present in LHC-II can take part in the quenching process. This is corroborated by recent experiments. Though several conclusions can be drawn from the investigations using TD-DFT, the interpretability of the results is limited due to the deficiencies of the method and of the models. To overcome the methodological deficiencies, more accurate methods have to be employed. Therefore, the so-called algebraic diagrammatic construction scheme (ADC) is implemented. ADC is a widely overlooked ab initio method for the calculation of excited states, which is based on propagator theory. Its theoretical derivation proceeds via perturbation expansion of the polarization propagator, which describes electronic excitations. This yields separate schemes for every order of perturbation theory. The second order scheme ADC(2), which is employed here, is the equivalent to the Møller-Plesset ground state method MP(2), but for excited states. It represents the computationally cheapest excited state method which can correctly describe doubly excited states, as well as Rydberg and charge transfer states. The quality of ADC(2) results is demonstrated in calculations on linear polyenes which serve as model systems for the larger carotenoid molecules. The calculations show that ADC(2) describes the three lowest excited states of polyenes sufficiently well, particularly the optically forbidden S1 state which is known to possess large double excitation character. Yet, the applicability of the method is limited compared to TD-DFT due to the much larger computational requirements. To facilitate the calculation of larger systems with ADC(2) a new variant of the method is developed and implemented. The variant employs the short-range behavior of electron correlation to reduce the computational effort. As a first step, the working equations of ADC(2) are transformed into a basis of local orbitals. In this basis negligible contributions of the equations which are due to electron correlation can be identified based on the distances of local orbitals. A so-called “bumping” scheme is implemented which removes the negligible parts during a calculation. This way, the computation times as well as the disk space requirements can be reduced. With the “bumping” scheme several new parameters are introduced that regulate the amount of “bumping” and thereby the speed and the accuracy of computations. To determine useful values for the parameters an evaluation is performed using the linear polyene octatetraene as test molecule. From the evaluation an optimal set of parameter values is obtained, so that the computation times become minimal, while the errors in the excitation energies due to the “bumping” do not exceed 0.15 eV. With further calculations on various molecules of different sizes it is tested if these parameter values are universal, i.e. if they can be used for all molecules. The test calculations show that the errors in the excitation energies are below 0.15 eV for all test systems. Additionally, no trend is visible for the errors that their magnitude might depend on the system. In contrast, the amount of disregarded contributions in the calculations increases drastically with growing system size. Thus, the local variant of ADC(2) can be used in future to reliably calculate excited states of systems which are not accessible with conventional ADC(2).
Ziel dieser Arbeit war es, zu prüfen, in welcher Art und Weise Kinder mentale Repräsentationen beim Lesen von Texten konstruieren. Ausgangspunkt der Konzeption dieser Arbeit war das Konstruktions-Integrations-Modell von Kintsch, das zu den am meisten rezipierten Textverstehensmodellen zählt. Ein zentraler Aspekt dieses Modells ist die Annahme der simultanen Speicherung von Textmaterial auf drei hierarchisch voneinander verschiedenen Ebenen mentaler Repräsentation. Genauer sind dies eine Oberflächenrepräsentation, in welcher der genaue Wortlaut und die exakte Struktur eines Textes abgebildet wird, eine propositionale Repräsentation, welche die im Text enthaltene Bedeutung wiedergibt, und schließlich die tiefste Art der Verarbeitung, das Situationsmodell. Hier wird die Textinformation mit relevantem Weltwissen verknüpft wird. Trotz der großen Akzeptanz des Modells und seiner Bedeutung im Bereich auch schulischer Textverstehensforschung, liegen Aussagen zu differentiellen Effekten nur in sehr begrenztem Umfang vor. Erste Hinweise auf entwicklungsabhängige Unterschiede, wie auch Unterschiede in Abhängigkeit von Eigenschaften der Person oder des Textes selbst liegen vor, bedürfen aber einer Erweiterung und erneuter Prüfung um zu einem stabilen und kohärenten Bild interindividueller Unterschiede zu gelangen. Die vorliegende Arbeit untersuchte drei Fragestellungen. Die erste Fragestellung bezog sich auf eine entwicklungsabhängige Veränderung in der relativen Nutzung der einzelnen Ebenen. Die zweite Fragestellung umfasste angenommene Effekte eines Zeitverlaufs auf die Stärke der Repräsentationen sowie die Möglichkeit einer Beeinflussung dieser Veränderungen durch den Einsatz einer behaltensfördernden Instruktion. Die dritte Fragestellung bezog sich auf den Effekt einer Auswahl personenbezogener Variablen auf die Ausprägung der Repräsentationsebenen. Insgesamt wurden die Fragestellungen mit zwei unterschiedlichen Textsorten, einem narrativen Text und einem Sachtext geprüft, um Unterschiede aufzudecken, die sich aus der Verarbeitung unterschiedlicher Textgenres ergeben. Die Fragestellungen wurden in einer Hauptuntersuchung geprüft. Zwei Vorstudien (Vorstudie 1: N = 56; Vorstudie 2: N = 133) dienten der Materialentwicklung und Erprobung erster Zusammenhänge. An der Hauptstudie nahmen 418 Schüler dritter, vierter und fünfter Jahrgangsstufen teil. Die Ergebnisse zeigten insgesamt eine Präferenz der situativen Repräsentation mit nur geringen altersabhängige Veränderungen. Auf eine Oberflächenrepräsentation ließ sich aufgrund der Ergebnisse nur bei einer Teilstichprobe der Viertklässler schließen. Insgesamt fiel es den Schülern erwartungsgemäß leichter, ein Situationsmodell für den narrativen Text im Vergleich zum Sachtext aufzubauen. Dieser Vorteil blieb auch über Zeitintervalle von 20 Minuten bzw. drei Tagen stabil, während sich eine erwartete Veränderung innerhalb der Ebenen nicht abbildete. Von erneutem Lesen konnten die Kinder kurzfristig für den Aufbau aller Ebenen beim Bearbeiten des Sachtextes profitieren. Als ein Prädiktor, der die Ausprägung der situationalen Ebene neben der Textsorte vorhersagen konnte, war der Wortschatz der Kinder. Allgemeine Leseverständiskompetenz zeigte positive Zusammenhänge zur propositionalen Verarbeitungsebene.
In Philadelphia Chromosome (Ph) positive ALL and CML the fusion between BCR and ABL leads to the BCR/ABL fusion proteins, which induces the leukemic phenotype because of the constitutive activation of multiple signaling pathways down-stream to the aberrant BCR/ABL fusion tyrosine kinase. Targeted inhibition of BCR/ABL by ABL-kinase inhibitors induces apoptosis in BCR/ABL transformed cells and leads to complete remission in Ph positive leukemia patients. However, a large portion of patients with advanced Ph+ leukemia relapse and acquire resistance. Kinase domain (KD) mutations interfering with inhibitor binding represent the major mechanism of acquired resistance in patients with Ph+ leukemia. Tetramerization of BCR/ABL through the N-terminal coiled-coil region (CC) of BCR is essential for the ABL-kinase activation. Targeting the CC-domain forces BCR/ABL into a monomeric conformation, reduces its kinase activity and increases the sensitivity for Imatinib. Here we show that i.) targeting the tetramerization by a peptide representing the Helix-2 of the CC efficiently reduced the autophosphorylation of both WT BCR/ABL and its mutants; ii.) Helix-2 inhibited the transformation potential of BCR/ABL independently of the presence of mutations; iii.) Helix-2 efficiently cooperated with Imatinib as revealed by their effects on the transformation potential and the factor-independence related to BCR/ABL with the exception of mutant T315I. These findings suggest that BCR/ABL harboring the T315I mutation have a transformation potential which is at least partially independent from its kinase activity. Targeted inhibition of BCR/ABL by small molecule inhibitors reverses the transformation potential of BCR/ABL. We definitively proved that targeting the tetramerization of BCR/ABL mediated by the N-terminal coiled-coil domain (CC) using competitive peptides, representing the Helix-2 of the CC, represents a valid therapeutic approach for treating Ph+ leukemia. To further develop competitive peptides for targeting BCR/ABL, we created a membrane permeable Helix-2 peptide (MPH-2) by fusing the Helix-2 peptide with a peptide transduction tag. In this study, we report that the MPH-2: (i) interacted with BCR/ABL in vivo; (ii) efficiently inhibited the autophosphorylation of BCR/ABL; (iii) suppressed the growth and viability of Ph+ leukemic cells; and (iv) was efficiently transduced into mononuclear cells (MNC) in an in vivo mouse model. The T315I mutation confers resistance against all actually approved ABL-kinase inhibitors and competitive peptides. It seems not only to decrease affinity for kinase inhibitors but to confer additional features to the leukemogenic potential of BCR/ABL. To determine the role of T315I in resistance to the inhibition of oligomerization and in the leukemogenic potential of BCR/ABL, we investigated its influence on loss-of-function mutants with regard to the capacity to mediate factor-independence. Thus we studied the effects of T315I on BCR/ABL mutants lacking functional domains in the BCR portion indispensable for the oncogenic activity of BCR/ABL such as the N-terminal coiled coil (CC), the tyrosine phosphorylation site Y177 and the serine/threonine kinase domain (ST), as well as on the ABL portion of BCR/ABL (#ABL-T315I) with or without the inhibitory SH3 (delta SH3-ABL) domain. Here we report that i.) T315I restored the capacity to mediate factor independence of oligomerization_deficient p185BCR/ABL; ii.) resistance of p185-T315I against inhibition of the oligomerization depends on the phosphorylation at Y177; iii.) autophosphorylation at Y177 is not affected by the oligomerization inhibition, but phosphorylation at Y177 of endogenous BCR parallels the effects of T315I; iv.) the effects of T315I are associated with an intact ABL_kinase activity; v.) the presence of T315I is associated with an increased ABL_kinase activity also in mutants unable to induce Y177 phosphorylation of endogenous BCR; vi.) there is no direct relationship between the ABL-kinase activity and the capacity to mediate factor_independence induced by T315I as revealed by the #ABL-T315I mutant, which was unable to induce Y177 phosphorylation of BCR only in the presence of the SH3 domain. In contrast to its physiological counterpart c-ABL, the BCR/ABL kinase is constitutively activated, inducing the leukemic phenotype. The N-terminus of c-ABL (Cap region) contributes to the regulation of its kinase function. It is myristoylated, and the myristate residue binds to a hydrophobic pocket in the kinase domain known as the myristoyl binding pocket in a process called “capping”, which results in an auto-inhibited conformation. Because the cap region is replaced by the N-terminus of BCR, BCR/ABL “escapes” this auto-inhibition. Allosteric inhibition by myristate “mimics”, such as GNF-2, is able to inhibit unmutated BCR/ABL, but not the BCR/ABL that harbors the “gatekeeper” mutation T315I. Here we investigated the possibility of increasing the efficacy of allosteric inhibition by blocking BCR/ABL oligomerization. We demonstrate that inhibition of oligomerization was able not only to increase the efficacy of GNF-2 on unmutated BCR/ABL, but also to overcome the resistance of BCR/ABL-T315I to allosteric inhibition. These results strongly suggest that the response to allosteric inhibition by GNF-2 is inversely related to the degree of oligomerization of BCR/ABL. Taken together these data suggest that the inhibition of tetramerization inhibits BCR/ABL-mediated transformation and can contribute to overcome Imatinib-resistance. The study provides the first evidence that an efficient peptide transduction system facilitates the employ-ment of competitive peptides to target the oligomerization interface of BCR/ABL in vivo. Further the data show that T315I confers additional leukemogenic activity to BCR/ABL, which might explain the clinical behavior of patients with BCR/ABL -T315I-positive blasts. In summary, our observations establish a new approach for the molecular targeting of BCR/ABL and its resistant mutants represented by the combination of oligomerization and allosteric inhibitors.
Untersuchung hochmolekularer Proteinkomplexe in menschlichen Leukämien mittels Proteomics-Werkzeugen
(2009)
Funktionelle Multiproteinkomplexe stellen im Sinne von Proteomics das kleinste isolierbare Proteom dar. Die Untersuchung von Proteinkomplexen gibt uns die Möglichkeit, Funktionen innerhalb der Zelle oder des Zellkompartiments genauer zu verstehen. Erst durch das Verständnis der einzelnen kleinen Zusammenspiele innerhalb einer Zelle, können wir die Auswirkungen auf ein betreffendes Organ und damit auf den Körper betrachten. Wir erhalten dadurch auch Informationen über die Funktion von spezifischen Genen und können so Erklärungsansätze für Gendefekte finden und über mögliche Therapieansätze nachdenken. Neben den Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen und dem Nachweis von Protein-Interaktionen mittels Immunopräzipitationsexperimenten stellt die Massenspektrometrie seit den 90er Jahren ein essentielles Werkzeug der Proteom-Forschung dar. Sie entwickelte sich zu einem etablierten Verfahren für die Charakterisierung von Biomolekülen und ermöglicht die Identifizierung unbekannter Proteine eines Komplexes. Das MLL-Gen auf Chromosom 11 Bande q23 ist in zahlreiche, reziproke chromosomale Translokationen verwickelt, die mit der Entstehung von akuten Leukämien assoziiert sind. Chromosomale Translokationen des MLL-Gens werden aufgrund ihrer sehr schlechten Prognose und Therapierbarkeit als Hochrisiko-Leukämien eingestuft. Bis heute konnten 64 Translokations-Partnergene identifiziert werden, wobei das AF4-Gen mit 42% bei allen untersuchten Leukämien und mit ca. 66% bei ALL (akute lymphatische Leukämie) den größten Prozentsatz ausmacht. Bei der Translokation t(4;11) sind das MLL-Gen auf Chromosom 11 und das AF4-Gen auf Chromosom 4 beteiligt. Akute Leukämien mit einer t(4;11)-Translokation treten häufig bei Säuglingen und Kleinkindern auf und betreffen vorwiegend den lymphatischen Zweig des blutbildenden Systems. Durch die Translokation entstehen zwei neue Derivatchromosomen – Derivat 11 (MLL•AF4, der11) und Derivat 4 (AF4•MLL, der4). Beide Fusionsgene verfügen über einen intakten Leserahmen und führen zur Expression der zwei Fusionsproteine MLL•AF4 (der11) und AF4•MLL (der4). Der pathomolekulare Mechanismus der t(4;11)-vermittelten ALL ist bis heute noch nicht hinreichend geklärt. Funktionen des der11-Fusionsproteins werden zwar schon intensiv erforscht, aber es gibt noch keine Erkenntnisse über die Funktion des der4-Fusionsproteins. Ähnlich sah die Situation zu Beginn dieser Arbeit für das AF4-Protein aus. Während schon einige Daten zur Funktion des MLL-Multiproteinkomplexes vorlagen, gab es nur wenige Informationen über die Funktion von AF4. Im Zuge dieser Arbeit wurden der AF4- und der der4-Multiproteinkomplex mittels affinitätschromatographischer Methoden aus transient transfizierten 293T-Zellen erfolgreich isoliert. Eine Größenbestimmung der Komplexe über eine Größenausschlusschromatographiesäule ergab für beide Komplexe eine Größe von ca. 2 MDa. Die Charakterisierung der beteiligten Interaktionspartner erfolgte mittels nLC-MALDI-MS/MS, Western Blot Analyse und Immunopräzipitation. Es konnte gezeigt werden, dass AF4 zusammen mit den Proteinen ENL/AF9, CDK9, CCNT1, AF10, DOT1L und der RNA-Polymerase II in einem Komplex vorliegt. Bereits 2007 konnte dieser Komplex in einem Mausmodell isoliert werden. Damit fungiert der AF4-Komplex auch in humanen Zellen als Stimulator der RNA-Polymerase-II-abhängigen transkriptionellen Elongation und vermittelt eine DOT1L-abhängige H3K79-Methylierung, die einen aktiven Transkriptionsstatus aufrechterhält. Zusätzlich konnten 6 neue Interaktionspartner identifiziert werden (AF5q31, BDR4, DDX6, HEXIM1, NFkB1/RELA und NPM1). Die Anwesenheit von BRD4 und HEXIM1 lässt vermuten, dass der AF4-Komplex in einem aktiven und einem inaktiven Zustand vorliegen kann. Außerdem wird der AF4-Komplex möglicherweise über den NFkB-Signalweg reguliert bzw. durch die Anwesenheit von NFkB1 an dessen Zielgene rekrutiert. Die Untersuchung des der4-Komplexes zeigte, dass er sich aus Mitgliedern der beiden Wildtyp-Proteinkomplexe zusammensetzt. So wurden die Proteine P-TEFb, HEXIM1, NFkB1, NPM1, DDX6 und das AF4 selbst aus dem AF4-Komplex sowie ASH2L, RBBP5, WDR5, DPY-30, CBP, HCF-1 und HCF-2 aus dem MLL-Komplex identifiziert. Der der4-Komplex weist somit partielle Eigenschaften des AF4- und MLL-Wildtyp-Proteins auf. Diese Eigenschaften sind ausreichend für eine kompetitive Situation zwischen dem der4-Komplex und den beiden AF4- und MLL-Wildtyp-Komplexen. Die Gleichgewichte dieser Wildtyp-Komplexe werden vermutlich gestört. Für beide Komplexe wurde mit Hilfe eines in vitro Histon-Methyltransferase-Assays eine Histon-Methyltransferase-Aktivität nachgewiesen. Für den AF4-Komplex muss zusätzlich eine bisher noch unbekannte Methyltransferase-Aktivität angenommen werden, da eine Methylierung des Histons H3 in den ersten 46 Aminosäuren gezeigt werden konnte, die sich nicht auf die Methyltransferase-Aktivität des DOT1L-Proteins im AF4-Komplex zurückführen lässt. Die H3K4-Methyltransferase-Aktivität des der4-Komplexes wird auf die Anwesenheit des SET-Domänen-Komplexes (ASH2L, WDR5, RBBP5 und DPY-30) zurückgeführt. Im Zusammenhang mit dem AF4-Protein wurde auch der ENL-Komplex untersucht. Mittels Western Blot konnten die Interaktionspartner AF4, CDK9, CCNT1, RNA-Polymerase II, NFkB1 und RING1 identifiziert werden. Damit ist auch das ENL mit dem globalen positiven transkriptionellen Elongationsfaktor P-TEFb assoziiert und beeinflusst die RNA-Polymerase-II-abhängige transkriptionelle Elongation.
Die monosynaptische Projektion vom primärmotorischen Kortex zu den a-Motoneuronen im Vorderhorn des Rückenmarks wird als kortikomotoneuronales System bezeichnet. Unter allen Säugern ist es beim Menschen am besten entwickelt. Es gibt starke Belege dafür, dass das kortikomotoneuronale System von entscheidender Bedeutung für die Befähigung zur Durchführung von geschickten separaten Fingerbewegungen ist. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, ob das Ausmaß dieses kortikalen Inputs an spinalen Motoneuronen für die drei kleinen Handmuskeln M. interosseus dorsalis I (IOD 1), M. abductor digiti minimi (ADM) und M. abductor pollicis brevis (APB) entsprechend ihrer verschiedenen funktionellen Bedeutung unterschiedlich ist. In Experiment I wurde die Exzitation der drei kleinen Handmuskeln bei gesunden Probanden durch die neue Penta-Stimulations-Technik (PST) gemessen. Die PST ist eine Ausweitung der Triple-Stimulations-Technik (TST). Die TST wurde entwickelt, um denjenigen Anteil von a-Motoneuronen quantifizieren zu können, der durch transkranielle magnetische Stimulation (TMS) des primärmotorischen Kortex zur Entladung gebracht wird. Die Technik löst das Problem der Desynchronisation von motorisch evozierten Potentialen (MEP) durch zwei Kollisionen im Verlauf des peripheren Nervs. Dadurch koppelt sie die zentrale an die periphere Erregungsleitung. Zusätzlich zu den drei Reizungen in der TST werden in der PST zwei weitere Stimulationen appliziert: Der „nicht interessierende Nerv“ (d.h. N. medianus für die Zielmuskeln IOD 1 und ADM; N. ulnaris für den APB) wird zweimalig am Handgelenk stimuliert. Daraus resultiert eine vollständige Kollision der im „nicht interessierenden Nerv“ deszendierenden durch TMS und die elektrische Plexusreizung aus gelösten Erregungen. Das erlaubt die Elimination der Volumenleitung von benachbarten Muskeln, die von diesem Nerv innerviert werden. Dies ist insbesondere dann von großer Bedeutung, wenn Thenarmuskeln untersucht werden, weil dort von N. medianus und N. ulnaris versorgte Muskeln eng benachbart lokalisiert sind. Das wesentliche Ergebnis des PST Experiments war eine signifikant gößere PST Antwort für den IOD 1 im Vergleich zum ADM und APB. In Experiment II wurden single motor unit Ableitungen durchgeführt. Diese Technik ermöglicht es, die Amplitude der an spinalen Motoneuronen durch TMS und elektrische Stimulation der Muskelspindelafferenzen (Ia Fasern) evozierten mittleren zusammengesetzten exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (cEPSP) abzuschätzen. Die single motor unit Ableitungen ergaben eine höhere durchschnittliche Amplitude des TMS induzierten cEPSP für den IOD 1 im Vergleich zum APB und ADM. Schließlich wurde die maximale Frequenz von verschiedenen willkürlichen aktiven Fingerbewegungen in Experiment III gemessen. Die durchschnittliche maximale Frequenz war höher für die Zeigefingerabduktion (überwiegend vermittelt durch IOD 1), als für Daumenabduktion (APB) und Kleinfingerabduktion (ADM). Die individuellen Unterschiede in der maximalen Frequenz der drei Bewegungen korrelierten mit den individuellen Unterschieden in den PST-Untersuchungen. Die erhobenen Ergebnisse zeigen, dass die Stärke des ortikomotoneuronalen Systems für die drei untersuchten kleinen Handmuskeln unterschiedlich ist und weisen darauf hin, dass sich daraus direkte funktionelle Konsequenzen für die Fähigkeit zur Durchführung von separaten Fingerbewegungen ergeben.
Osteoporotische Frakturen sind mit erheblichen medizinischen, psychosozialen und ökonomischen Folgen belastet. Für die Betroffenen resultieren in einem hohen Maße Einbußen an Lebensqualität, Folgemorbidität, Pflegebedürftigkeit und erhöhte Mortalität. Osteoporotische Frakturen entstehen durch ein inadäquates Trauma und können jeden Knochen betreffen, am häufigsten sind das Hüftgelenk, die Wirbelkörper und der distale Radius betroffen. Es ist von großer Bedeutung Patienten mit einem hohen Osteoporoserisiko frühzeitig zu identifizieren, über Präventionsmaßnahmen aufzuklären und bereits Erkrankte rechtzeitig zu diagnostizieren und zu therapieren, da eine bereits stattgehabte Fraktur das größte Risiko für eine Folgefraktur ist. Trotz der Verfügbarkeit einer Anzahl von effektiven diagnostischen und therapeutischen Möglichkeiten ist die Osteoporose weiterhin unterdiagnostiziert und unterbehandelt, vor allem in der Hochrisikogruppe von Patienten mit einer früheren Fraktur. Zahlreiche Untersuchungen aus Europa, den USA, Australien und Neuseeland zeigten dass im Mittel nur 17% der Patienten die aufgrund einer osteoporotischen Fraktur stationär aufgenommen wurden eine spezifische antiosteoporotische Therapie erhielten. Die bisher in Deutschland durchgeführten Studien bezüglich der Versorgungssituation von Patienten mit osteoporotischer Fraktur beruhen zumeist auf Krankenkassendaten. Es werden daher nur diagnostizierte Erkrankungen erfasst. Hierbei ergibt sich das Problem dass eine mögliche Dunkelziffer von nicht als osteoporotisch erkannten Frakturen nicht in die Berechnung einbezogen werden. Ziel dieser Studie war es daher, die Dunkelziffer an nicht bezüglich Osteoporose diagnostizierten Patienten zu erfassen, aber auch die Einleitung von Diagnostik und Therapie nach osteoporotischen Frakturen im Allgemeinen und unter dem Einfluß von Risikofaktoren zu analysieren. In einer retrospektiven Beobachtungsstudie an orthopädischen und unfallchirurgischen Abteilungen im Rhein-Main-Gebiet wurde eine Analyse der Jahre 2003 und 2004 durchgeführt. Eingeschlossen wurden Patienten im Alter von >50 Jahren mit einer ICD-verschlüsselten Fraktur als Aufnahmediagnose. Die in der Krankenakte enthaltenden Daten wurden nach zuvor erlittenen Frakturen, nach für den Knochen-Stoffwechsel und für die Knochen-Stabilität relevanten Grunderkrankungen, einer vorbekannten Osteoporose, durchgeführter Diagnostik zur Sicherung oder Widerlegung der Diagnose einer Osteoporose , der Diagnosestellung einer Osteoporose und ggf. erfolgter Therapieeinleitung und -empfehlung nach einem vorliegenden Erhebungsbogen systematisch ausgewertet. Insgesamt wurden 2142 Patienten älter als 50 Jahre mit einer Fraktur ausgewertet. 1544 (72,1%) waren weiblich und 598 (27,9%) männlich. Davon wurde bei 1460 (68,2%) der Patienten die Fraktur als osteoporotisch eingestuft, 1215 (83,2%) waren weiblich und 245 (16,8%) männlich. 80,3% der Patienten mit osteoporotischer Fraktur waren älter als 70 Jahre. Die häufigste Traumaursache war der Sturz aus dem Stand. Die Hüftfraktur (55,2%) war die häufigste Frakturlokalisation, gefolgt von der Wirbelkörperfraktur (14%). 79,4% erhielten eine operative Therapie. Eine frühere Fraktur gaben 14% (n=205) in der Anamnese an, dies waren vor allem Patienten mit einer neuen Wirbelkörperfraktur. Von diesen Patienten mit einer Fraktur in der Vorgeschichte war bei 20% (n=41) eine Osteoporose bereits bei Aufnahme bekannt, aber nur 9,8% (n=20) erhielten zu diesem Zeitpunkt eine antiosteoporotische Therapie. Insgesamt nur bei 29,9% der Patienten wurde eine Osteoporose als Ursache der Fraktur diagnostiziert. Ein geschlechtsspezifischer Unterschied lag nicht vor, allerdings erfolgte die Diagnosestellung bei Patienten älter als 85 Jahre deutlich seltener. Bei 67,2% der osteoporotischen Wirbelkörperfrakturen wurde die Osteoporose erkannt, jedoch nur bei 16,3% der osteoporotischen Hüftfrakturen. Zum Zeitpunkt der Entlassung wurden 6,6% der Patienten mit einem antiosteoporotischen Medikament therapiert und bei 5,1% wurde diesbezüglich eine Empfehlung im Entlassungsbrief ausgesprochen. In den meisten Fällen war die Therapie eine Kombination aus Bisphosphonaten, Vitamin D und Calcium. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass bei 70% der Patienten die Diagnosestellung einer Osteoporose versäumt und dass 88,3% der Patienten ohne eine spezifische antiosteoporotische Therapie oder einer Therapieempfehlung aus dem Krankenhaus entlassen wurden. Somit zeigt sich eine deutliche Versorgungslücke zwischen evidenzbasierter Medizin und alltäglicher Praxis. Frakturen bei älteren Menschen führen selten zur einer Diagnostik oder Therapie bezüglich Osteoporose. Ein möglicher Weg zur Therapieoptimierung könnten strukturierte Weiterbildungsprogrammen für den behandelnden Arzt sein, im Sinne von Fachartikeln, Internetlernprogrammen und Seminaren. Zusätzlich sollten klinische Leitpfade zur Erkennung und Behandlung von Patienten mit Frakturen etabliert werden. Von Seiten des Patienten können Informationsbroschüren und Aufklärungsprogramme helfen, die Compliance zu verbessern. Die umfangreichen Möglichkeiten für verbesserte diagnostische und therapeutische Interventionen sollten genutzt werden um Frakturraten, Krankheit, Sterblichkeit und Gesundheitskosten zu senken.
Die Analyse der Phosphorylierung mittels Massenspektrometrie stellt in vielerlei Hinsicht große Anforderungen an die Analysenmethoden, die eingesetzt werden. Durch die substöchiometrische Modifzierung einer Aminosäure mit einem Phosphatrest ist die grundlegende Herausforderung der Sensitivtät an anzuwendende Analysetechniken gegeben. Die Biomassenspektrometrie hat mit den weichen Ionisierungmethoden ESI und MALDI zwar die Techniken zur Verfügung gestellt, die eine routinemäßige Identifzierung von vorher per MS nicht zugänglichen Proteinen über die Untersuchung der enzymatischen Spaltpeptides ermöglicht, gleichwohl ist der Aufwand, der für die massenspektrometrische Charakterisierung eines bestimmten Proteins besteht, um ein vielfaches höher. Wegen des in vivo variablen und potentiell sehr geringen Phosphorylierungsgrades ist die genaue Identifizierung der Phosphorylierungstelle allein durch das Vermessen der Probe in einem modernen Massenspektrometer nicht zu bewerkstelligen. Die sich in der Probe befindlichen Phosphopeptide stehen nach einem Verdau des entsprechenden Proteins einer mengenmäßig großen Zahl unphosphorylierter Peptide gegenüber. Auch die hohe Sensitivität von modernen Massenspektrometern reicht in der Regel nicht aus, um das entsprechende Phosphopeptid zu analysieren. Soll die exakte Phosphorylierungstelle des untersuchten Phosphopeptids bestimmt werden, so müssen ausreichende Mengen an Analyten für eine MS/MS-Analyse generiert werden. Bei realen Proben kann der Phosphorlyierungsgrad nicht erhöht werden, somit ist auch die Menge an vorhandenen Phosphopeptiden begrenzt. Somit kommt man an eine Anreicherung von Phosphopeptiden bzw. Abreicherung von unmodifzierten Peptiden nicht vorbei. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Anreicherungstechniken für Phosphopeptide hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität untersucht. Hierfür wurden verschiedene Affinitätstechniken (Graphit, IMAC und TiO¬¬2) hinsichtlich Empfindlichkeit und Selektivität untersucht. Von diesen drei Methoden zeigte sich Graphit aufgrund zu geringer Wechselwirkung zwischen Analyt und Medium als ungeeigneteste Methode. IMAC zeigt bei verbesserter Sensitvität eine höhere Spezifität, gleichwohl saure Peptide nicht von Phosphopeptiden zu trennen sind. Von den drei genannten Methoden zeigte TiO¬¬2 die höchste Sensitivität und Selektivität. Da das TiO¬¬2 als Goldstandard in der Anreicherung von Phosphopeptiden angesehen wird, sollte im Rahmen dieser Dissertation eine neuartige Methode entwickelt werden, die dieser Technik sowohl im Hinblick auf Spezifität und Selektivität überlegen sein sollte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden MALDI-Probenteller erstmals mit Hilfe von SAMs (Self Assembled Monolayers) mit Phosphonatgruppen modifiziert, aus denen durch Beladen mit vierwertigem Zirkonium eine neue funktionelle Oberfläche für die Anreicherung von Phoshopeptiden hergestellt werden kann, die der Titandioxid-Methode überlegen ist. Anhand von reproduzierbaren Modellsystemen von bekannten Phosphoproteinverdaus (z.B. Ovalbumin) konnte gezeigt werden, dass diese neue Technik Analyten im niedrigen Femtomol-Bereich auch vor einem großen nicht-phosphorlyierten Hintegrund selektiv anreichern kann. Um zu demonstrieren, dass die Phosphonat-Oberfläche auch bei realen Proben die massenspektrometrische Phosphorylierungsanalyse ermöglicht, wurden in der vorliegenden Arbeit zum einen die Mitogen Activated Protein Kinase 1 (MAPK-1) aus einem in-Lösungs-Verdau und das Heat Shock Protein (HSP), welches aus einem 2-D-Gel stammt, untersucht. Mit der neu etablierten Phosphonat-Oberfäche konnten die Phosphopeptide aus den Proben angereichert und mittels MALDI-MS/MS die Phosphatgruppe eindeutig der modifizierten Aminosäure zugeordnet werden. Neben dem Komplex der Anreicherungstechniken wurden im Rahmen dieser Dissertation noch andere relevante Fragestellungen für die Phosphoproteomanalytik untersucht. So konnte gezeigt werden, dass für phosphorylierte Peptide keine Suppression der Signale im MALDI-Gerät stattfindet, was eine noch weit verbreitete Meinung in vielen Arbeitsgruppen ist. Auch Versuche zur MALDI-Matrix und deren Kombination mit der Säurekomponente wurden durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass es neben DHB in Kombination mit Phosphorsäure momentan keine bessere Matrix-Kombination gibt. Im Hinblick auf die Quantifizierung der Phosphorlyierung eines Proteins konnte exemplarisch am Ovalbumin als Modellsystem eine einfache und valide Quantifizierungsmethode mit Hilfe der Dephosphorylierung entwickelt werden, die nicht die Nachteile von sonst häufig eingesetzten Derivatisierungsreagenzien besitzt.
Im Jahr 2006 kam es in Deutschland lt. der Polizeilichen Kriminalstatistik zu 4584 illegalen Schusswaffeneinsätzen. Daher ist die Entwicklung verbesserter technischer Untersuchungsverfahren die zu einer Aufklärung dieser Straftaten beitragen könnten vordringlich. Mikrosensorsysteme wie der DL 1000 bieten die Möglichkeit die Abbrandgase/Schmauchgase verschiedener Munitionstypen zu analysieren und mit Hilfe eines neuronalen Netzes zu unterscheiden. Zunächst wurden 2000 Treibsätze von 10 verschiedenen Munitionstypen verbrannt und die Profile in dem neuronalen Netz gespeichert. In einem zweiten Schritt wurden mit jedem Munitionstyp je 2 relative Nahschüsse auf Schweinefüße abgegeben und das olfaktorische Profil des Waffenlaufs und der Einschusswunden analysiert. Bei Analyse der Abbrandgase unbekannter Treibsätze konnte der entsprechende Muntionstyp in ca. 84 % der Fälle identifiziert werden. Während auch die olfaktorische Analyse des Gases im Waffenlauf wenige Minuten nach der Schussabgabe noch zu sehr hohen Wiedererkennungsraten führte, sanken diese an der Einschusswunde deutlich ab. Die Ergebnisse zeigen, dass die Abbrandgase von verschiedenen Munitionstypen mit dem verwendeten Analysesystem mit hoher Sicherheit identifiziert werden können. Der Überlagerung der Abbrandgase durch Körper- oder Fäulnisgasgerüche wird vor allem durch eine Erweiterung der Datenbasis des neuronalen Netzes zu begegnen sein.
The utilization of Ginkgo biloba in medicinal practice dates back to 1505 A.D. Ironically, the mechanisms of action of Ginkgo are not fully clarified till now. Nowadays, Ginkgo biloba leaf extracts are mainly indicated for mild to moderate cerebrovascular insufficiency and different forms of dementia. The fact that it is an herbal extract composed of several different components indeed adds to the intricacy of finding its mechanisms of actions. Indisputably, many scientists tried to elucidate the mechanisms of actions of Ginkgo. The first step to achieve this goal was to standardize the leaf extract. The standardized Ginkgo leaf extract contains 22-27 % flavonol glycosides, 2.8-3.4 % of ginkgolide A, B and C, as well as approximately 2.6-3.2 % bilobalide and below 5 ppm ginkgolic acids. A widespread standardized Ginkgo extract is the EGb 761, which was utilized in the current work. One of the earliest proposed mechanisms is the ability of the Ginkgo extract to act as an anti-oxidant, which could be explained by its high flavonoid contents. However, without doubt EGb 761 encompasses other characteristics which distinguish it from other herbal extracts that are also rich in flavonoids. Since free radicals and reactive oxygen species are highly associated with the mitochondrial functions, examination of the effect of EGb 761 on mitochondrial functions was lately addressed. Moreover, this was encouraged as the link between Alzheimer’s disease [AD] and the mitochondria started to emerge. Previously, our group observed mitochondrial protective actions of EGb 761 on cell culture in vitro. Furthermore, anti-apoptotic effects were previously described for EGb 761. However, only very few studies addressed the single constituents and their effect on mitochondrial functions. Flavonoids were studied in several other plant extracts and their radical scavenging activity is unquestionable, but EGb 761 has anti-apoptotic actions which may be attributed to its terpenoid fraction. Exclusively found in the Ginkgo plant, are the ginkgolides and therefore their actions are not yet fully elucidated. Moreover, those who attempted to address these constituents concentrated on one or two candidates, for example bilobalide or ginkgolide B and ignored the rest. Unfortunately, this led to incomplete results, and one couldn’t compare the relative activities of all EGb 761 components in order to state whether all the components are effective or not. ...
In der vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass Hyperforin wichtige Funktionnen von Keratinozyten beeinflusst. Hyperforin triggert die Ausdifferenzierung der epidermalen Zellen und inhibiert gleichzeitig ihre Proliferation. Diese Ergebnisse zeigen die physiologische Relevanz der Hyperforin-vermittelten Effekte, da diese beiden Prozesse in der Haut normalerweise gegenläufig ablaufen. Weiterhin war die von Hyperforin ausgeübte Ausdifferenzierungs-Zunahme und Proliferationshemmung vergleichbar mit den Effekten einer hohen [Ca2+]ex, die in vivo die Funktionen von Keratinozyten steuert. Die Frage, die aus diesen Ergebnissen resultierte, war, über welchen Mechanismus Hyperforin die Effekte in Keratinozyten beeinflusst. Die Untersuchung des Mechanismus der Hyperforin-induzierten Effekte zeigte, dass Hyperforin über die Aktivierung des TRPC6-Kanals einen Calcium-Influx in Keratinozyten bewirkt und resultierend daraus die Ausdifferenzierung von Keratinozyten anregt. Auch hier ergeben sich Parallelen zu der durch hohes [Ca2+]ex -induzierten Ausdifferenzierung, die ebenfalls einen Calcium-Einstrom in Keratinozyten auslöst. Eine Microarray-Analyse von Hyperforin-inkubierten Keratinozyten und anschließende Experimente mit selektiven Inhibitoren zeigte die Beteiligung der PKC/Ras/MEK/ERK-Signalkaskade. Interessanterweise gibt es hier ebenfalls Ähnlichkeiten zwischen Hyperforin und einer hohen [Ca2+]ex, da bekannt ist, dass eine hohe [Ca2+]ex die Ausdifferenzierung zumindest teilweise über diesen Signatransduktions-Weg steuert. Aufgrund der Parallelen zwischen der Hyperforin- und Ca2+-induzierten Ausdifferenzierung und den vermehrten Hinweisen auf die wichtige Rolle von TRPC-Kanälen in Keratinozyten, stellte sich die Frage, ob eine hohe [Ca2+]ex ebenfalls zur Aktivierung von TRPC-Kanälen führt. Tatsächlich konnten wir in dieser Arbeit zeigen, dass Calcium in Keratinozyten mehrere TRPC-Kanäle aktiviert und so einer Erhöhung der [Ca2+]i führt. Hierdurch konnte zum ersten Mal auch die Beteiligung von DAG-aktivierten TRPC-Kanälen an der Ca2+-induzierten Ausdifferenzierung gezeigt werden. Bei der Untersuchung von Psoriasis-Keratinozyten, die eine Hyperproliferation und erniedrigte Ausdifferenzierung in vivo aufweisen, konnte in der vorliegenden Dissertation eine grundlegende Störung des Calcium-Haushaltes festgestellt werden. Dabei zeigten die Psoriasis-Keratinozyten im Vergleich zu gesunden hPKs eine abnorme Antwort auf unterschiedliche Stimuli, die zu einer Erhöhung der [Ca2+]i führen. Sowohl eine hohe [Ca2+]ex, als auch Hyperforin führte zu einem deutlich erniedrigten Calcium-Einstrom in den Keratinozyten der Psoriasis-Patienten. Aus diesen Ergebnissen resultiert die Frage nach den Ursachen dieser Störungen. Da in dieser Arbeit bereits gezeigt werden konnte, dass Hyperforin und eine hohe [Ca2+]ex über TRPC-Kanäle die Ausdifferenzierung in Ketatinozyten beeinflussen, untersuchten wir die Expression von TRPC-Kanälen in Psoriasis-Keratinozyten. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression aller TRPC-Kanäle signifikant erniedrigt war. Vor dem Hintergrund der wichtigen Rolle der TRPC-Kanäle für die Calcium-Homöostase und Ausdifferenzierung von epidermalen Zellen, ist dies durchaus eine denkbare und plausible Erklärung für die Defekte der Psoriasis-Keratinozyten. Weiterhin zeigten unsere Ergebnisse, dass der CaR in Psoriasis-Keratinozyten vermindert exprimiert wird. Da dem CaR eine wichtige Rolle in der Regulation der [Ca2+]i als Antwort auf eine Änderung der [Ca2+]ex zugeschrieben wird, könnte dies eine weitere mögliche Erklärung für die gefundenen Störungen der Psoriasis-Keratinozyten sein.
Die adoptive Immuntherapie mit hochaufgereinigten NK-Zellen bei pädiatrischen Patienten mit malignen Erkrankungen nach haploidenter SZT ist eine mögliche Therapieoption, um einen verstärkten GvL/GvT-Effekt zu bewirken und möglicherweise die Immunregeneration zu fördern. Als schwerwiegende Nebenwirkung ist bisher noch nicht eindeutig belegt, ob neben T-Zellen auch NK-Zellen in der Lage sind, eine GvHD auszulösen. In der Frankfurter Universitätskinderklinik wurden 7 Patienten (4xALL, 1xAML, 1xRMS IV und 1xM. Hodgkin) mit hochaufgereinigten unstimulierten NK-Zellen und 3 Patienten (3xNB IV) mit IL-2 stimulierten NK-Zellen nach haploidenter SZT behandelt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde in vitro untersucht, ob NK-Zellen durch die Stimulierung mit IL-2 einen gesteigerten GvL/T-Effekt aufweisen. Es wurden NK-Zellen von 5 verschiedenen gesunden Spendern (2 im Rahmen von Validierungsläufen und 3 zur Behandlung der 3 Patienten mit NB) zunächst immunomagnetisch im klinischen Maßstab mittels CD3-Depletion und darauffolgender CD56-Selektion aufgereinigt. Danach erfolgte die Aktivierung mit IL-2 (Proleukin®S) über 14 Tage unter GMP. Während sich die NK-Zellen aller Spender nach Aufreinigung in eine kleine Population CD56+CD16- immunregulatorischer NK-Zellen (2,3 bis 7,1 %) und eine große Population zytotoxischer CD56+CD16+ NK-Zellen (92,9 bis 97,7 %) unterteilen ließen, zeigte sich nach IL-2 Stimulierung ein heterogenes Bild von CD16+ zu CD16- NK-Zellen. Durch die 9-tägige IL-2 Stimulierung vergrößerte sich der Anteil KIRnegativer NK-Zellen. Es konnte auf den NK-Zellen aller Spender gezeigt werden, dass durch die IL-2 Stimulierung wichtige Rezeptoren (NKG2D, NCR), die für ein hohes zytotoxisches Potential stehen, verstärkt auf der NK-Zelloberfläche exprimiert wurden. Die gesteigerte Zytokinproduktion der IL-2 stimulierten NK-Zellen untermauerte die Funktionalität der ex vivo stimulierten NK-Zellen und dies konnte in funktionalen Assays, die die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen belegen, bewiesen werden. Durch die IL-2 Stimulierung der NK-Zellen konnte die Killing Aktivität gleichmäßig auf über 90 % gesteigert werden. Interessanterweise wies Spender A bei den funktionellen und phänotypischen Analysen eine Sonderrolle auf. Die NK-Zellen dieses Spenders zeigten bereits vor IL-2 Stimulierung eine hohe Zytotoxizität gegenüber malignen Zellen, welches auf eine Voraktivierung, gemessen an der Expression von Aktivierungsmarker CD69, schließen lässt. Die in vivo Untersuchungen zeigten, dass bei einer verabreichten T-Zell-Dosis unter 50 x 103/KG, nur milde GvHDs (Grad I/II) auftraten. Bis zu 60 x 106 NK-Zellen/KG wurden gut toleriert. Nebenwirkungen wie Fieber und Schüttelfrost waren transient und gingen einher mit erhöhten Zytokinspiegeln von inflammatorischen Zytokinen (IL-6, IL-8, IFN-γ) im Serum der Patienten. Ein engmaschiges Monitoring nach der NK-Zell-Applikation der IL-2 stimulierten NK-Zellen zeigte, dass die NK-Zellen in 5/6 Applikationen aus der peripheren Blutbahn abwanderten, einhergehend mit der Migration von Antigen-präsentierenden Zellen. Bei der Untersuchung des langfristigen Einflusses von adoptiver NK-Zell-Immuntherapie auf die Immunrekonstitution bei Patienten nach haploidenter SZT wurde vorausgehend eine Normwertstudie zu verschiedenen Leukozytensubpopulationen von 100 gesunden Kinder und Erwachsenen vorgenommen. Nach der Entwicklung eines stufenlosen, nicht-linearen Regressionsmodells konnte der Einfluss auf die Immunrekonstitution der Patienten nach SZT altersgerecht beurteilt werden. Weiterhin wurden Patientengruppen, die ebenfalls haploident transplantiert wurden, den NK-Zell-Studienpatienten gegenübergestellt. Eine signifikante Verbesserung durch die Gabe von NK-Zellen konnte nicht beobachtet werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass die NK-Zellzahl innerhalb des ersten Monats nach SZT Normwerte erreichte, gefolgt von den zytotoxischen CD3+CD8+ T-Zellen 5-6 Monate nach haploidenter SZT, den THelfer Zellen und den B-Zellen nach über einem Jahr nach haploidenter SZT. Die allogene additive NK-Zell-Immuntherapie ist eine vielversprechende Therapieoption bei Patienten mit malignen Erkrankungen wie bspw. dem NB. Die NK-Zell-Aktivierung mit IL-2 bewies den Erhalt der Immunkompetenz. Dies war erkennbar an der gesteigerten zytotoxischen Funktionalität, der Zytokinproduktion und der Hochregulierung von zytotoxisch aktiven Rezeptoren. Eine verbesserte Immunrekonstitution kann durch das neue altersgerechte Lymphozyten-Norm-Modell besser beurteilt werden. Allerdings ist die Patientenanzahl und die Beobachtungszeit bisher zu gering, um in vivo ein verbessertes Überleben mit additiver NK-Zell-Immuntherapie wirklich abschätzen zu können.
The aim of the study was to investigate the role of the CX3C chemokine FKN in the role of platelet adhesion. The presence of the FKN receptor CX3CR1 in platelets is demonstrated and G-protein dependent activation of platelets with soluble FKN results in the increased adhesion of platelets to collagen and fibrinogen under flow 228 and adhesion of leucocytes to firmly attached platelets 231. Whether membrane-bound FKN is capable to promote the direct adhesion of platelets in flowing blood analogue to leucocytes was completely unknown. The adhesion mechanisms of FKN in mediating the adhesion of leucocytes under flow are well characterised and represent a novel unique mechanism of leucocyte capture and firm adhesion: FKN is responsible for immediate arrest of flowing CX3CR1 expressing leucocytes without the participation of additional adhesion receptors and ligands. This is in contrast to the classical leucocyte adhesion pathways, which are multistep processes involving leucocyte arrest, rolling and subsequent cell activation prior to firm arrest. In leucocytes, the FKN – CX3CR1 axis is sufficient to allow rapid arrest of leucocytes at low shear flow conditions 67, 101, 115, 122, 261. The set of data from this study demonstrates that immobilised FKN was capable to mediate the adhesion of platelets under low shear conditions, whereas there was no interaction in the absence of shear flow. In the presence of vWf in the adhesion matrix, FKN mediated the potent increased adhesion of platelets. This was in parts due to the activation of flowing platelets via CX3CR1 and the augmented translocation of platelets on FKN via the vWf receptor GPIbα. With respect to platelet activation, the function of endothelial FKN was comparable to leucocytes: in both cell types, the FKN dependent activation is mediated by its cognate receptor CX3CR1. This is in contrast to the adhesive capacity: in leucocytes, FKN dependent adhesion is mediated by CX3CR1, whereas in platelets, the adhesive capacity was mostly mediated by the vWf receptor GPIbα with only minor contribution from CX3CR1. In platelets, activation and adhesion by FKN were mediated by two distinct receptors, whereas in leucocytes, CX3CR1 is solely responsible for FKN dependent activation and adhesion. The presented results point out to a role of platelets in early stage of atherosclerosis. The in vivo expression of both, FKN and vWf is regulated by TNF-α, which is released in early stages of inflammation. The presence of vWf and FKN in the endothelial lining of blood vessels during these conditions is sufficient to initiate the capturing and translocation of platelets on the tunica interna. The rolling of platelets on the endothelium can induce endothelial damage and inflammation of the vessel, which might advance to the generation of clinically significant atherosclerotic plaques and fibrous atheroma.
Die supratentorielle dekompressive Kraniektomie mit Eröffnung und Erweiterungsplastik der Dura mater ist heutzutage eine wichtige Therapiemaßnahme in der Behandlung des konservativ nicht kontrollierbaren Hirndrucks. Unter Kranioplastik versteht man den chirurgischen Verschluss des entstandenen Knochendefekts zum Schutz des direkt unter der Kopfhaut liegenden Gehirns, zur ästhetischen Wiederherstellung der Konturen sowie zur Verbesserung einer neurologischen Symptomatik („syndrome of the trephined“).
In der vorliegenden Arbeit werden die Daten von insgesamt 242 Patienten, die einer Kranioplastik unterzogen worden waren, retrospektiv analysiert. Die Patienten wurden im Zeitraum 2001-2008 in der neurochirurgischen Abteilung der Städtischen Kliniken Frankfurt am Main-Höchst operiert. Um Aufschluss über das postoperative, funktionelle und kosmetische Ergebnis zu erhalten, wurde im Anschluss an die Aktenauswertung bei diesen Patienten eine telefonische Befragung durchgeführt.
Ziel der Arbeit war es, die bisherigen Erfahrungen der Kalottenplastik und insbesondere der autogenen orthotopen Knochendeckelreimplantation im Hinblick auf die verschiedenen Kranioplastik Zeitpunkte zu untersuchen und unter klinischen Aspekten zu bewerten.
Die Frage des Kranioplastik Zeitpunktes ist essentiell für die Therapieplanung.
Das autologe Schädelknochentransplantat hat bessere Eigenschaften und Qualitäten als alle anderen alloplastischen Materialien. In Anbetracht der perfekten Histokompatibilität, der optimalen biomechanischen Eigenschaften, der guten anatomischen Fusion mit dem umgebenden Knochen und der Möglichkeit der partiellen oder totalen Revitalisation des Transplantats, besteht kein Zweifel, dass der autologe Knochen immer zu verwenden ist, wenn die Möglichkeit dazu besteht.
Die Analyse der Patientengruppen ergab, dass die ultra frühe Kranioplastik der Patienten mit großen Defekten nach dekompressiver Kraniektomie ein besseres Outcome im langfristigen Follow-up hat. Diese Patienten hatten keine gesteigerte Infektions- oder andere Komplikationsraten. Das Timing der Kranioplastik spielt eine Rolle in der Komplikationsrate nur bei den Patienten, die sekundär eine Komplikation erlitten haben. Patienten, die nach der Kraniektomie eine Nachblutung, einen Infarkt oder eine Infektion erlitten haben, hatten eine signifikant höhere Infektionsrate bei ultra früher Kranioplastik. Insbesondere soll betont werden, dass der Trend einer Häufung von Wundheilungsstörungen und Infektionen mit der Folge einer erneuten Explantation des Knochendeckels bei Patienten nach autogener Knochendeckelreimplantation mit mehr als 2 Risikofaktoren und bei Patienten mit kompliziertem Verlauf nach Kraniektomie festgestellt wurde.
Gemäß den Ergebnissen dieser Patientenserie kann die ultra frühe Kranioplastik bei ausgewählten Patienten mittels Reimplantation des Eigenknochens als ein sicheres und hilfreiches Verfahren für die schnellere Rehabilitation und Besserung der neurologischen Funktion und der Prognose bewertet werden. Ähnlich gute Ergebnisse zeigten die Pantienten in der Gruppe 1 der ultra frühen Kranioplastik die aufgrund einer Liquorzirkulationsstörung ein VP Shunt System als kombinierte Therapie in der gleichen Sitzung erhalten haben.
Somit kann zusammenfassend festgehalten werden:
Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen, dass die Kranioplastik nach einer supratentoriellen dekompressiven Kraniektomie mit Reimplantation des eigenen Schädelknochens zum frühesten möglichen Zeitpunkt ein sicheres und effektives Verfahren darstellt und bei ausgewählten Patienten sogar bessere Ergebnisse als die späte Kranioplastik haben kann. Eine mögliche Erklärung dafür könnte das Auftreten und die Persistenz von neurologischen Defiziten im Rahmen des „syndrome of the trephined“ bei Patienten bieten, bei denen eine späte Kranioplastik durchgeführt wurde. In diesem Patientengut hatten die Patienten mit ultra-früher Kranioplastik das beste neurologische Outcome, die Komplikationsrate war in allen Gruppen vergleichbar.
Um Komplikationen zu vermeiden, sollten Patienten mit einer vorausgegangenen lokalen Infektion spät kranioplastiert werden.
Das neurologische Outcome der Patienten, bei denen ein kombiniertes Verfahren Kranioplastik –VP Shunt durchgeführt wurde, war vergleichbar mit anderen Patientengruppen. Somit ist eine Kranioplastik bei Patienten mit konvexen, über Kalottenniveau prolabierten Kraniektomielappen aufgrund eines Hydrocephalus keine Kontraindikation.
It has been shown that stem and progenitor cells are therapeutically effective after i.v application. Yet, many aspects regarding intracellular signaling pathways which are involved in the homing and local action of these cells still have to be elucidated. In this work, it was aimed to investigate the role of the small GTPase Rap1 in adhesion activation in Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSC/HPC) and in Mesenchymal Stem Cells (MSC). The potential role of Rap1 was assessed in, mice which were homozygote negative for the expression of the Rap1a gene. Peripheral blood lymphocyte counts as well as numbers of HPCs in the blood were decreased in Rap1a-/- mice compared to wild-type controls. Additionally the adhesion capability of HPCs from Rap1a-/- to the endothelial ligand, Vascular Cell Adhesion Molecule – 1 under shear stress was decreased. The hematopoietic repopulation potential of Rap1a-/- HPC was however not decreased in a competitive bone marrow transplantation model, indicating that deficiency of Rap1a in HSC/HPC does not negatively affect their ability to interact with the bone marrow microenvironment. In contrast, the isolation of MSC was not possible from Rap1a-/- bone marrow, indicating an altered situation in the bone marrow niche through changed stromal cell behaviour. Instead, Rap1a+/- MSC could be isolated and showed an adhesion deficit under shear stress. In contrast, no differences were noted in their differentiation potential. In a mouse homing model, the overall ability of the Rap1a+/- MSC to home to different tissues was found preserved. Finally, in a murine subcutaneous carcinoma model, cells with an HPC phenotype were observed to be present in the tumor microenvironment, and it was shown that they home directly to tumors. Since HPC isolated from bone marrow were able to differentiate into cells with a pro-angiogenic phenotype in vitro, HPC may be of relevance for neovascularization, as tumor-infiltrating progenitor cells. The results of the study should contribute to the understanding of the regulation of progenitor cell homing behaviour in situations simulating cell therapy approaches in preclinical situations.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Erkenntnisse über die Beeinflussung der Überlebensraten von Patienten mit Nierenzellkarzinom durch verschiedene Faktoren wie Tumorstadium und Tumorgröße, Differenzierungsgrad, Metastasierung und histologischer Subtyp zu gewinnen. Insbesondere soll die Frage geklärt werden, inwiefern die Prognose der Patienten von der Art der Diagnosestellung, also inzidentell oder symptomatisch, abhängt. Zu diesem Zweck wurden die Daten aller Patienten, die zwischen dem 01.01.1997 und dem 31.12.2005 in der urologischen Universitätsklinik in Frankfurt am Main mit der Verdachtsdiagnose eines Nierenzellkarzinoms radikal nephrektomiert bzw. teilreseziert worden sind, retrospektiv erhoben und analysiert. Die Patienten wurden entweder der asymptomatischen Gruppe zugeteilt, bei denen der Nierentumor zufällig diagnostiziert werden konnte oder der Gruppe bei der die Diagnose erst aufgrund einer auf den Nierentumor oder seine Metastasen hinweisenden Symptomatik gefunden werden konnte. Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug 50 Monate (1 bis 112 Monate). Insgesamt konnte die Diagnose Nierenzellkarzinom bei 246 (68,72 %) Patienten zufällig gestellt, nur 112 (31,28 %) präsentierten sich mit darauf hinweisender Symptomatik. Inzidentelle Tumoren waren signifikant kleiner als Symptomatische (4,8cm versus 6,8cm) und wiesen signifikant häufiger ein niedriges Tumorstadium (p<0,001) und eine günstigere Differenzierung auf (p<0,001). Zusätzlich kam es seltener zu Fernmetastasen sowie zum Befall regionaler Lymphknoten. Hinsichtlich der Verteilung von Alter und Geschlecht ergaben sich keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Therapeutisch ergaben sich in bezug auf die durchführbare Operationsart signifikante Unterschiede. Während bei immerhin 36,18% aller Patienten mit inzidentellen Tumoren eine Teilresektion durchgeführt werden konnte, war solch ein nierenerhaltendes Vorgehen nur bei 6,25% aller Patienten mit symptomatischen Tumoren möglich. Die Überlebenswahrscheinlichkeit erwies sich als signifikant besser für Patienten mit inzidentell diagnostizierten Tumoren (p<0,001), genauso wie für Tumoren mit besserem Differenzierungsgrad (p<0,001), günstigerem Staging (p<0,001) sowie geringerer Größe (p<0,001). In multivariater Analyse bestätigten sich nur Diagnoseart, Differenzierungsgrad und das Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein von Metastasen als unabhängige prognostische Variablen. Patienten, bei denen der Tumor zufällig anhand einer Routineuntersuchung in völlig asymptomatischem Stadium gefunden werden kann, haben demnach eine signifikant bessere Überlebenswahrscheinlichkeit. Aus diesem Grund sowie aus der Tatsache heraus, dass bisherige Ergebnisse systemischer Therapien die Langzeitüberlebensrate der Patienten mit fortgeschrittenen Nierenzellkarzinomen meist nicht verbessern können, bleibt die Frage der Notwendigkeit einer Screeninguntersuchung weiter bestehen. Jede Möglichkeit einer frühzeitigen Diagnose sollte genutzt werden. Hier bietet sich insbesondere die Sonographie als kostengünstigstes und nicht invasives Verfahren an. Inwieweit die Empfehlung einer generellen und flächendeckenden Screeningmaßnahme sinnvoll ist, wird allerdings weiterhin anhand ihrer Kosteneffizienz beurteilt und kann deshalb beim Nierenzellkarzinom aufgrund der doch vergleichsweise geringen Prävalenz nicht ausgesprochen werden. Doch erscheint die Forderung sinnvoll, die Nieren im Rahmen abdominaler Sonographien aus nichturologischen Gründen immer mit zu untersuchen. Die kurze Zeit, die dies für den geübten Untersucher in Anspruch nimmt, ist tolerierbar; vor allem im Hinblick auf den Benefit, den diese Untersuchung für den Patienten haben kann. Ebenso sinnvoll und realistisch erscheint, dass jeder Urologe zumindest bei seinen Patienten in regelmäßigen Abständen die Nieren schallt oder es Ihnen zumindest als entgeltliche IGeL Leistung anbietet. Die Entdeckung eines Nierentumors in einem frühen asymptomatischen Stadium erscheint sowohl hinsichtlich der Therapie als auch ihrer Prognose am günstigsten zu sein.
Neurosphären-bildende Zellen mit dem Potential zur Selbsterneuerung, sowie zur vielseitigen Differenzierung, wurden bereits aus diversen peripheren und zentralen Geweben isoliert. Auch von der Neuralleiste abstammende NCSCs wurden in verschiedenen embryonalen und adulten, peripheren Geweben im Nager-Modell identifiziert und als Neurosphären (NS) kultiviert. In der vorliegenden Arbeit konnten nun erstmals auch aus Zellen des peripheren Nervensystems von Huhn-Embryonen NS gebildet werden. Zudem wurde das Selbsterneuerungspotential der NS-bildenden Zellen analysiert und über 10 Passagen, beziehungsweise mehrere Monate hinweg quantifiziert. Durch eine selektive Isolierung O4-positiver Gliazellen aus Huhn DRGs, konnte der Anteil NS-generierender Zellen gegenüber unsortierten DRG-Zellen signifikant erhöht werden. Aufgrund dieser Beobachtung können im Gewebe verbliebener NCSCs als Ursprung NS-generierender Zellen ausgeschlossen werden. Die von Gliazellen abstammenden NS-Zellen wurden im Weiteren auf ihr Entwicklungspotential hin untersucht. Sowohl über Antikörperfärbungen, als auch auf Nukleinsäurebasis in RT-PCR-Analysen, konnte für die NS-Zellen ein oligopotentes Differenzierungspotential nachgewiesen werden. Auch in klonalen NS-Kulturen wurde die Differenzierung zu Neuronen, Gliazellen und Melanozyte bestätigt. Aufgrund des Selbsterneuerungspotentials, sowie des oligopotenten Entwicklungspotentials O4-sortierter NS-generierender Zellen, wurden die in dieser Arbeit identifizierten und charakterisierten NS-bildende Zellen GDSCs (glial-derived stem cells) benannt. Die im Huhn-Modell beschriebenen NS-bildenden PNS-Zellen wurden anschließend auch im Nager-Modell nachgewiesen. NS-generierende Zellen sind in prä- und postnatalen Maus-DRGs vorhanden und zeigen ein Selbsterneuerungspotential, das für Stammzellen charakteristisch ist. In Zusammenarbeit mit Dr. Verdon Taylor (Freiburg) konnten die aus DRGs von transgenen EGFP-Mäusen gewonnene NS-Zellen in utero in die Hirnventrikel von E10.5 Mausembryonen injiziert werden. Die implantierten, grünfluoreszierenden Zellen wurden noch 5 Monate nach dem Eingriff in großer Zahl im Hirngewebe nachgewiesen und konnten als Neurone, Astrozyten und OLPs/Oligodendrozyten identifiziert werden. Die Entstehung neuraler ZNS-Zelltypen beruht hierbei vermutlich auf einer Änderung der regionalen Identität der Zellen durch die NS-Kultivierung. Obwohl sich einige implantierte Zellen auch 5 Monate nach dem Eingriff noch im Zellzyklus befanden, konnte in keinem der analysierten Gehirne hyperplastisches Gewebe oder tumorassoziiertes Wachstum beobachtet werden. Die in dieser Arbeit nachgewiesene Möglichkeit NS-bildende Zellen aus dem PNS zu gewinnen und durch eine selektive Sortierung für O4-positive Gliazellen zusätzlich anzureichern, stellt einen wichtigen Schritt in Richtung gezielter Generation diverser neuronaler und glialer Subtypen des peripheren Nervensystems dar. Zusammen mit der durch die Neurosphären-Kultivierung erzielten Änderung der regionalen Identität muriner NS-Zellen, könnte diese Arbeit außerdem einen wichtigen Grundstein für weiterführende Arbeiten in Richtung Stammzell-Therapien, z.B. in Multiple-Sklerose-Modellen darstellen.
Durch die Lebensbedingungen moderner Gesellschaften ist das hohe Alter eine Lebensphase, welche die meisten Menschen erreichen werden. Mit der Zunahme des Anteil salter Menschen an der Bevölkerung ist untrennbar auch die Zunahme der typischen Erkrankungen des Alters und im Besonderen die Zunahme von Demenzerkrankungen verbunden. Die Alzheimer-Demenz (AD) ist die häufigste Form der senilen Demenzen. Typische Symptome der AD sind Gedächtnisstörungen, Störungen der Orientierung sowie gestörte Werkzeugfunktionen (insbesondere aphasische, agnostische und apraktische Störungen). Die AD ist neuropathologisch charakterisiert durch extrazelluläre Amyloidplaques, intrazelluläre Neurofibrillen sowie Synapsen- und Nervenzellverlust. Da der Verlust von Lernen und Gedächtnis ein Leitsymptom der AD ist, ist die Untersuchung der zellulären Grundlagen von Lern- und Gedächtnisprozessen, besonders in der Hippokampusformation, von grundlegender Bedeutung. Als zelluläre Grundlage dieser kognitiven Prozesse werden funktionelle und strukturelle Veränderungen im Bereich der Synapsen angesehen (synaptische Plastizität). Ein Grossteil der exzitatorischen Synapsen wird durch dendritische Dornen gebildet, hoch spezialisierten Membrankompartimenten neuronaler Dendriten, die in Form und Größe variabel sind und durch neuronale Aktivität, hormonale Stimuli und Umwelteinflüsse beeinflusst werden. Sowohl bei der AD als auch im Verlauf des physiologischen Alterungsprozesses wurden Veränderungen in der Zahl und der Morphologie dendritischer Dornen beschrieben. Ein Strukturmolekül dendritischer Dornen und ein essentieller Bestandteil des Dornapparats, einer Organelle, die sich in einer Untergruppe funktionell wichtiger Dornen nachweisen lässt, ist das Molekül Synaptopodin. Synaptopodin-defiziente Mäuse bilden keinen Dornapparat und zeigen Störungen in zellulären Gedächtnisprozessen des Hippokampus sowie im hippokampusabhängigen räumlichen Lernen. Da Synaptopodin und der Dornapparat für die synaptische Plastizität sowie für Lern- und Gedächtnisprozesse von Bedeutung sind und beide Vorgänge durch physiologisches Altern und AD beeinflusst werden, formulierten wir die Arbeitshypothese, dass Störungen der Expression von Synaptopodin an altersbedingten Veränderungen der synaptischen Plastizität oder Lern- und Gedächtnisstörungen bei der AD beteiligt sein könnten. Ein erster Hinweis, der diese Hypothese stützen könnte, wäre der Nachweis einer Änderung der Synaptopodinexpression in geeigneten Mausmodellen. Hierzu untersuchten wir zuerst immunhistochemisch gefärbte Hippokampusschnitte von C57/Bl6-Mäusen unterschiedlicher Altersstufen und von APP23 transgenen Mäusen, einem etablierten transgenen Tiermodell der AD, und verglichen sie mit geeigneten Kontrollen. Hierbei konnte kein Unterschied in der Synaptopodinverteilung auf Proteinebene nachgewiesen werden. In einem zweiten Schritt bestimmten wir mittels quantitativer RT-PCR die Expression von Synaptopodin mRNA in durch Lasermikrodissektion isolierten Hippokampusregionen Granularzellschicht und CA1-Region) von C57Bl/6-Mäusen unterschiedlicher Altersstufen (0 Tage - 24 Monate) und im transgenen Tiermodell (APP23 transgene Maus). Auch in diesen Untersuchungen zeigte sich, dass der Alterungsprozess und eine fortschreitende Amyloid-Pathologie die Genexpression von Synaptopodin mRNA nicht signifikant beeinflusst. Damit konnte die Arbeitshypothese, dass steigendes Alter bzw. eine zunehmende Amyloidablagerung zu einer Reduktion der Synaptopodin mRNA-Expression führen, widerlegt werden.
Die Magnetresonanzspektroskopie (MRS) ist eine nicht-invasive Methode zur Quantifizierung metabolischer Änderungen des Gehirnstoffwechsels. Einige dieser Metaboliten wie N-Acetyl-Aspartat (tNAA), Myo-Insoitol (mI), Kreatin (tCr) und Cholin (Cho) können auch als Marker für neurodegenerative Erkrankungen (z.B. Morbus Alzheimer) dienen. Bislang haben nur wenige Studien MR-spektroskopische Veränderungen bei Patienten mit der Diagnose einer „leichten kognitiven Beeinträchtigung“ (Mild Cognitive Impairment = MCI) untersucht. Entsprechend sollten in dieser Untersuchung MR-spektroskopische Veränderungen bei MCI-Patienten erfasst und in Abhängigkeit vom klinischen Verlauf in einer Längsschnittstudie analysiert werden. Fünfzehn MCI-Probanden und zwölf gesunde ältere Kontrollpersonen wurden jeweils zweimal innerhalb eines Zeitraumes von ca. 40 Monaten klinisch, neuropsychologisch sowie MR-spektroskopisch untersucht. Die MR-Spektroskopie wurde als Einzelvolumenspektroskopie (SVS) mit kurzer Echozeit (TE = 30 ms) durchgeführt. Als VOI wurde ein Bereich im Parietallappen ausgewählt, der den Gyrus cinguli mit einschloss. Der Anteil an CSF wurde aus der Dekonvolution der T2-Dephasierung des Wassersignals ermittelt. Die Auswertung der Spektren erfolgte mit dem Programm LCModel, das eine Analyse des Spektrums mittels einer Linearkombination von Modellspektren durchführt. Die ermittelten Werte für die Signalintensitäten wurden in absolute Metabolitenkonzentrationen (mmol/l) unter Berücksichtigung entsprechender Korrekturen umgerechnet. Der Mittelwert des MMSE-Scores der MCI-Patienten lag zum Zeitpunkt der Erstuntersuchung bei 26,4 (Bereich 20 - 30) und fiel im Verlauf auf 23,3 (Bereich 14 - 28) ab. Sechs der MCI-Patienten entwickelten im zeitlichen Intervall ein dementielles Syndrom (MCIKonverter). Alle Kontrollpersonen hatten einen MMSE-Score von mehr als 29 in beiden Untersuchungen. Bei den MRS-Untersuchungen wurde bei Erstuntersuchung ein signifikanter Unterschied für den CSF-Anteil des Messvolumens im Vergleich der Patientengruppe und der Probanden festgestellt. Für die MR-spektroskopisch erhobenen Metabolitenkonzentrationen ergaben sich bei der Erstuntersuchung keine signifikanten Unterschiede. Bei der zweiten Untersuchung zeigte sich dagegen eine signifikante Erniedrigung der Konzentrationen von tCr und tNAA der Gruppe der MCIKonverter im Vergleich zu den entsprechenden Konzentrationen der anderen Gruppen. In der MCI-Gruppe war eine Abnahme der tNAA-Konzentgration signifikant mit einer Abnahme der kognitiven Leistung korreliert. Dieser Effekt war im Wesentlichen auf metabolische Änderungen in der Gruppe der MCIKonverter zurückzuführen. Für die Metaboliten Cho und mI konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Diese Pilotstudie zeigt, dass MR-spektroskopisch gemessene Metaboliten (insbesondere tNAA) bei der MCI als Surrogatmarker eines (in Richtung Demenz) fortschreitenden neurodegenerativen Krankheitsprozesses eingesetzt werden können. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie sind mit anderen Publikationen (Ackl et al., 2005; Adalsteinsson et al, 2000; Chao et al, 2005; Kantarci et al., 2000) in Einklang zu bringen. Da auch die tCr-Konzentration im Verlauf Schwankungen unterliegt, wird klar, dass eine Quantifizierung in absoluten Konzentrationen einem relativen Vergleich von tNAA zu tCr vorzuziehen ist.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gram-negatives, mikroaerophiles Bakterium. Es kolonisiert die menschliche Magenschleimhaut, wobei mehr als 50% der Menschheit befallen sind. Als Pathogen begünstigt es die Entstehung von Magengeschwüren und –krebs. Experimentelle Befunde deuten darauf hin, dass H. pylori während der Infektion Kontakt zu Membranproteinen der Wirtszellen aufnimmt, um ein Typ IV Sekretionssystem aufzubauen und den primären Virulenzfaktor CagA (Cytotoxin Associated Antigen A) in die Wirtszelle zu translokieren. Diese Integrine genannten Membranproteine werden bei polaren Epithelzellen allerdings bevorzugt basolateral expremiert. Außerdem können extrazellulär geschnittene E-Cadherinfragmente im Medium mit H. pylori infizierter Zellkulturen nachgewiesen werden. Beide Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass eine Protease von H. pylori sekretiert wird und die Zell-Zell-Kontakte degradiert, um H. pylori den Zugang zur basolateralen Seite der Wirtszellen zu ermöglichen. Das vom Gen hp1019 des Stammes H. pylori 26695 codierte Protein HtrA konnte im Rahmen einer Kooperation mit dem Paul-Ehrlich-Institut in Langen im Überstand von H. pylori mit proteolytischer Aktivität nachgewiesen werden. Um den Einfluss dieser extrazellulären Protease auf die Infektion von Kulturzellen mir H. pylori zu untersuchen, sollte ein niedermolekularer Inhibitor für HtrA gefunden werden. Ein Homologiemodell als Grundlage für ein strukturbasiertes virtuelles Screening wurde berechnet, wobei die aktive Konformation der Protease DegP von Escherichia coli als Vorlage diente (PDB Identifikation 3cs0). Für einen neue, im Rahmen dieser Untersuchung entwickelten Methode wurde PocketPicker eingesetzt, um Größe und Form der die Bindetaschen auf der Proteinoberfläche vorherzusagen. Durch die komplementäre Projektion von Proteinatomtypen auf diese definierte Volumen kann so für eine von PocketPicker vorgesagte Bindetasche ein potentielles Pharmakophormodell berechnet und für Datenbanksuchen eingesetzt werden. In retrospektiven Studien konnte die Funktion dieser Berechungen für eine Auswahl an pharmakologisch wichtigen Proteinen aus verschiedenen Strukturklassen validiert werden. Dabei stellte sich vor allem eine Abhängigkeit der Güte der Modelle von der Güte der Vorhersage von PocketPicker heraus, was den Schluss zulässt, dass eine möglichst genaue Definition der Bindetasche für das Gelingen eines strukturbasierten virtuellen Screening unerlässlich ist. Für die Protease HtrA von H. pylori konnten erfolgreich drei strukturabgeleitete Pharmakophormodelle berechnet werden, wobei jeweils verschiedene von PocketPicker vorhergesagte Bindetaschen einbezogen wurden. Die Molekülkataloge der Firmen Asinex und Specs wurden nach Ähnlichkeit zu diesen Modellen sortiert und nach Begutachtung der jeweils ähnlichsten 100 Substanzen wurden 26 Substanzen ausgewählt und bestellt. In einem in vitro Assay mit der rekombinanten Protease HtrA inhibierten 6 Substanzen den Verdau eines rekombinanten Substrats. Die beste Verbindung erreichte in dem Assay eine maximale Inhibition von ca. 77 % bei einer mittleren inhibitorischen Konzentration bei halbmaximaler Inhibition (IC50) von ca. 26 µM.
We investigate the utility of modern kernel-based machine learning methods for ligand-based virtual screening. In particular, we introduce a new graph kernel based on iterative graph similarity and optimal assignments, apply kernel principle component analysis to projection error-based novelty detection, and discover a new selective agonist of the peroxisome proliferator-activated receptor gamma using Gaussian process regression. Virtual screening, the computational ranking of compounds with respect to a predicted property, is a cheminformatics problem relevant to the hit generation phase of drug development. Its ligand-based variant relies on the similarity principle, which states that (structurally) similar compounds tend to have similar properties. We describe the kernel-based machine learning approach to ligand-based virtual screening; in this, we stress the role of molecular representations, including the (dis)similarity measures defined on them, investigate effects in high-dimensional chemical descriptor spaces and their consequences for similarity-based approaches, review literature recommendations on retrospective virtual screening, and present an example workflow. Graph kernels are formal similarity measures that are defined directly on graphs, such as the annotated molecular structure graph, and correspond to inner products. We review graph kernels, in particular those based on random walks, subgraphs, and optimal vertex assignments. Combining the latter with an iterative graph similarity scheme, we develop the iterative similarity optimal assignment graph kernel, give an iterative algorithm for its computation, prove convergence of the algorithm and the uniqueness of the solution, and provide an upper bound on the number of iterations necessary to achieve a desired precision. In a retrospective virtual screening study, our kernel consistently improved performance over chemical descriptors as well as other optimal assignment graph kernels. Chemical data sets often lie on manifolds of lower dimensionality than the embedding chemical descriptor space. Dimensionality reduction methods try to identify these manifolds, effectively providing descriptive models of the data. For spectral methods based on kernel principle component analysis, the projection error is a quantitative measure of how well new samples are described by such models. This can be used for the identification of compounds structurally dissimilar to the training samples, leading to projection error-based novelty detection for virtual screening using only positive samples. We provide proof of principle by using principle component analysis to learn the concept of fatty acids. The peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) is a nuclear transcription factor that regulates lipid and glucose metabolism, playing a crucial role in the development of type 2 diabetes and dyslipidemia. We establish a Gaussian process regression model for PPAR gamma agonists using a combination of chemical descriptors and the iterative similarity optimal assignment kernel via multiple kernel learning. Screening of a vendor library and subsequent testing of 15 selected compounds in a cell-based transactivation assay resulted in 4 active compounds. One compound, a natural product with cyclobutane scaffold, is a full selective PPAR gamma agonist (EC50 = 10 +/- 0.2 muM, inactive on PPAR alpha and PPAR beta/delta at 10 muM). The study delivered a novel PPAR gamma agonist, de-orphanized a natural bioactive product, and, hints at the natural product origins of pharmacophore patterns in synthetic ligands.
Identifizierung und Charakterisierung neuartiger 5-Lipoxygenase-Inhibitoren – in silico und in vitro
(2009)
Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung neuer potenter 5-LO-Inhibitoren unter Verwendung sowohl computergestützter als auch experimenteller Methoden. Ausgangspunkt war ein ligandenbasiertes virtuelles Screening unter Verwendung der ladungsbasierten Deskriptoren Charge3D und TripleCharge3D. Hierbei konnten zwei neue direkte 5-LO-Inhibitoren identifiziert werden. Jede dieser beiden Substanzen diente als Startpunkt weiterer virtueller Screenings mit dem Ziel, die Potenz der Substanzen zu verbessern bzw. eine SAR der Substanzklasse zu erhalten. Dabei zeigte sich für die Klasse der Thiazolinone, dass eine hohe Toleranz gegenüber unterschiedlichen Substituenten am Grundgerüst bezüglich der Auswirkung auf die Aktivität vorliegt: insbesondere werden relativ große Substituenten toleriert. Des Weiteren scheint der 2-Phenylsubstituent für die 5-LO-inhibitorische Aktivität essentiell zu sein, da Derivate, die einen Heterozyklus an dieser Position aufweisen, inaktiv sind. Eines der aktivsten Derivate dieser Klasse, C06 (Substanz 12), konnte weiter molekular-pharmakologisch charakterisiert werden. Die Substanz zeigt keine offensichtlichen zytotoxischen Effekte, ist unabhängig vom Stimulus der 5-LO-Aktivierung und zeigt nanomolare inhibitorische Aktivität sowohl in intakten PMNL (IC50-Wert 0,65 ;M) als auch in PMNL-Homogenaten (IC50-Wert 0,66 ;M) sowie in zellfreiem PMNL-S100 (IC50-Wert 0,26 ;M) und am gereinigten Enzym (IC50-Wert 0,3 ;M). C06 ist selektiv für die 5-LO, da andere arachidonsäurebindende Proteine (PPARs, cPLA2 und 12- und 15-LO) nicht beeinflusst werden. Auch Nager-5-LO (aus der Ratte und der Maus) wird inhibiert mit IC50-Werten im nanomolaren Bereich. Allerdings zeigte sich die Substanz inaktiv in einem menschlichen Vollblutassay in Gegenwart von Serum. C06 scheint nicht an die für die Interaktion der 5-LO mit der Membran verantwortliche C2-ähnliche Domäne der 5-LO zu binden. Ebenso hat der Membranbestandteil Phosphatidylcholin keinen bzw. nur geringen Einfluss auf das inhibitorische Potential von C06. Aktivitätstests mit steigender Substratkonzentration deuten auf einen allosterischen Bindemodus von C06 hin. Diese experimentellen Daten flossen in die Identifizierung des putativen Bindemodus an der 5-LO ein. Hierzu wurde zunächst ein Homologie-Modell der 5-LO unter Verwendung der kürzlich neu veröffentlichten Daten der Röntgenkristallstruktur der Kaninchen-15-LO (PDB-Code: 2p0m [Choi et al., 2008]) erstellt. Durch eine Bindetaschenvorhersage mit dem Programm PocketPicker und einer pseudorezptorbasierten Auswahl der potentiellen Bindetasche mit anschliessendem Liganden-Docking konnten zwei Bindebereiche postuliert werden, beide an einer Oberflächenbindetasche der 5-LO ausserhalb des aktiven Zentrums. Dies ist im Einklang mit der SAR der Substanzklasse, die zeigt, dass relativ große Substituenten toleriert werden. Erste Mutationsstudien deuten darauf hin, dass die Bindung von C06 in einer Bindetasche um die Aminosäure Y558 erfolgt. In der zweiten postulierten Bindetasche konnten zwei Aminosäuren identifiziert werden, die für die Aktivität der 5-LO essentiell sind: Mutationen von F169 und F177 zu Alanin führten zu einer abgeschwächten Produktivität der 5-LO (12% bzw. 32% der Aktivität der wt-5-LO) sowie zu einem veränderten Produktspektrum. Bei der zweiten Klasse der 5-LO-Inhibitoren, die in der ersten virtuellen Screeningrunde mit den Deskriptoren Charge3D und TripleCharge3D identifiziert werden konnten, handelt es sich um Pyridin-Imidazole. In einem dreistufigen virtuellen Screening konnte die Potenz dieser Substanzklasse von 10 ;M (Substanz 10) in PMNL-S100 auf 0,3 ;M (Substanz 80) verbessert werden. Bei einer der aktivsten Substanzen aus der zweiten Screeningrunde, B02 (Substanz 68), die weiter charakterisiert wurde, handelt es sich um einen direkten 5-LO-Inhibitor mit nanomolarer inhibitorischer Aktivität, der an die C2-ähnliche Domäne bindet. Es wurde ein Bindemodus durch Bindetaschenvorhersage, pseudorezeptorbasierte Bindetaschenlokalisierung und Liganden-Docking postuliert. Ein Problem dieser Substanzklasse ist jedoch ihre Zytotoxizität. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde durch ein Protein-Protein-Docking eine mögliche Konformation eines Dimers der 5-LO modelliert. Die postulierten Modelle zeigen bevorzugt eine Konformation, bei der beide Untereinheiten des Dimers eine „head-to-tail“-Orientierung einnehmen. Diese Dimer-Modelle können als Startpunkt genutzt werden, um Modulatoren der Protein-Protein-Interaktion als neuartige Inhibitoren der 5-LO zu entwerfen.
Identifizierung und Charakterisierung neuartiger 5-Lipoxygenase-Inhibitoren – in silico und in vitro
(2009)
Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung neuer potenter 5-LO-Inhibitoren unter Verwendung sowohl computergestützter als auch experimenteller Methoden. Ausgangspunkt war ein ligandenbasiertes virtuelles Screening unter Verwendung der ladungsbasierten Deskriptoren Charge 3D und TripleCharge3D. Hierbei konnten zwei neue direkte 5-LO-Inhibitoren identifiziert werden. Jede dieser beiden Substanzen diente als Startpunkt weiterer virtueller Screenings mit dem Ziel, die Potenz der Substanzen zu verbessern bzw. eine SAR der Substanzklasse zu erhalten. Dabei zeigte sich für die Klasse der Thiazolinone, dass eine hohe Toleranz gegenüber unterschiedlichen Substituenten am Grundgerüst bezüglich der Auswirkung auf die Aktivität vorliegt: insbesondere werden relativ große Substituenten toleriert. Des Weiteren scheint der 2-Phenylsubstituent für die 5-LO-inhibitorische Aktivität essentiell zu sein, da Derivate, die einen Heterozyklus an dieser Position aufweisen, inaktiv sind. Eines der aktivsten Derivate dieser Klasse, C06 (Substanz 12), konnte weiter molekular-pharmakologisch charakterisiert werden. Die Substanz zeigt keine offensichtlichen zytotoxischen Effekte, ist unabhängig vom Stimulus der 5-LO-Aktivierung und zeigt nanomolare inhibitorische Aktivität sowohl in intakten PMNL (IC50-Wert 0,65 =M) als auch in PMNL-Homogenaten (IC50-Wert 0,66 =M) sowie in zellfreiem PMNL-S100 (IC50-Wert 0,26 =M) und am gereinigten Enzym (IC50-Wert 0,3 =M). C06 ist selektiv für die 5-LO, da andere arachidonsäurebindende Proteine (PPARs, cPLA2 und 12- und 15-LO) nicht beeinflusst werden. Auch Nager-5-LO (aus der Ratte und der Maus) wird inhibiert mit IC50-Werten im nanomolaren Bereich. Allerdings zeigte sich die Substanz inaktiv in einem menschlichen Vollblutassay in Gegenwart von Serum. C06 scheint nicht an die für die Interaktion der 5-LO mit der Membran verantwortliche C2-ähnliche Domäne der 5-LO zu binden. Ebenso hat der Membranbestandteil Phosphatidylcholin keinen bzw. nur geringen Einfluss auf das inhibitorische Potential von C06. Aktivitätstests mit steigender Substratkonzentration deuten auf einen allosterischen Bindemodus von C06 hin. Diese experimentellen Daten flossen in die Identifizierung des putativen putativen Bindemodus an der 5-LO ein. Hierzu wurde zunächst ein Homologie- Modell der 5-LO unter Verwendung der kürzlich neu veröffentlichten Daten der Röntgenkristallstruktur der Kaninchen-15-LO (PDB-Code: 2p0m [Choi et al., 2008]) erstellt. Durch eine Bindetaschenvorhersage mit dem Programm PocketPicker und einer pseudorezptorbasierten Auswahl der potentiellen Bindetasche mit anschliessendem Liganden-Docking konnten zwei Bindebereiche postuliert werden, beide an einer Oberflächenbindetasche der 5-LO ausserhalb des aktiven Zentrums. .....
Kenntnisse über die dreidimensionale Struktur therapeutisch relevanter Zielproteine bieten wertvolle Informationen für den rationalen Wirkstoffentwurf. Die stetig wachsende Zahl aufgeklärter Kristallstrukturen von Proteinen ermöglicht eine qualitative und quantitative rechnergestützte Untersuchung von spezifischen Protein-Liganden Wechselwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neue Algorithmen für die Identifikation und den Ähnlichkeitsvergleich von Proteinbindetaschen und ihren Eigenschaften entwickelt und in dem Programm PocketomePicker zusammengefasst. Die Software gliedert sich in die Routinen PocketPicker, PocketShapelets und PocketGraph. Ferner wurde in dieser Arbeit die Methode ReverseLIQUID reimplementiert und im Rahmen einer Kooperation für das strukturbasierte Virtuelle Screening angewendet. Die genannten Methoden und ihre wissenschaftliche Anwendungen sollte hier zusammengefasst werden: Die Methode PocketPicker ermöglicht die Vorhersage potentieller Bindetaschen auf Proteinoberflächen. Diese Technik implementiert einen geometrischen Ansatz auf Basis „künstlicher Gitter“ zur Identifikation zusammenhängender vergrabener Bereiche der Proteinoberfläche als Orte möglicher Ligandenbindestellen. Die Methode erreicht eine korrekte Vorhersage der tatsächlichen Bindetasche für 73 % der Einträge eines repräsentativen Datensatzes von Proteinstrukturen. Für 90 % der Proteinstrukturen wird die tatsächlich Ligandenbindestelle unter den drei wahrscheinlichsten vorhergesagten Taschen gefunden. PocketPicker übertrifft die Vorhersagequalität anderer etablierter Algorithmen und ermöglicht Taschenidentifikationen auf apo-Strukturen ohne signifikante Einbußen des Vorhersageerfolges. Andere Verfahren weisen deutlich eingeschränkte Ergebnisse bei der Anwendung auf apo-Strukturen auf. PocketPicker erlaubt den alignmentfreien Ähnlichkeitsvergleich von Bindetaschenfor-men durch die Kodierung berechneter Bindevolumen als Korrelationsdeskriptoren. Dieser Ansatz wurde erfolgreich für Funktionsvorhersage von Bindetaschen aus Homologiemodellen von APOBEC3C und Glutamat Dehydrogenase des Malariaerregers Plasmodium falciparum angewendet. Diese beiden Projekte wurden in Zusammenarbeit mit Kollaborationspartnern durchgeführt. Zudem wurden PocketPicker Korrelationsdeskriptoren erfolgreich für die automatisierte Konformationsanalyse der enzymatischen Tasche von Aldose Reduktase angewendet. Für detaillierte Analysen der Form und der physikochemischen Eigenschaften von Proteinbindetaschen wurde in dieser Arbeit die Methode PocketShapelets entwickelt. Diese Technik ermöglicht strukturelle Alignments von extrahierten Bindevolumen durch Zerlegungen der Oberfläche von Proteinbindetaschen. Die Überlagerung gelingt durch die Identifikation strukturell ähnlicher Oberflächenkurvaturen zweier Taschen. PocketShapelets wurde erfolgreich zur Analyse funktioneller Ähnlichkeit von Bindetaschen verwendet, die auf Betrachtungen physikochemischer Eigenschaften basiert. Zur Analyse der topologischen Vielfalt von Bindetaschengeometrien wurde in dieser Arbeit die Methode PocketGraph entwickelt. Dieser Ansatz nutzt das Konzept des sog. „Wachsenden Neuronalen Gases“ aus dem Bereich des maschinellen Lernens für eine automatische Extraktion des strukturellen Aufbaus von Bindetaschen. Ferner ermöglicht diese Methode die Zerlegung einer Bindestelle in ihre Subtaschen. Die von PocketPicker charakterisierten Taschenvolumen bilden die Grundlage für die Methode ReverseLIQUID. Dieses Programm wurde in dieser Arbeit weiterentwickelt und im Rahmen einer Kooperation zur Identifikation eines Inhibitors der Serinprotease HtrA des Erregers Helicobacter pylori verwendet. Mit ReverseLIQUID konnte ein strukturbasiertes Pharmakophormodell für das Virtuelle Screening erstellt werden. Dieser Ansatz ermöglichte die Identifikation einer Substanz mit niedrig mikromolarer Affinität gegenüber der Zielstruktur.
Die vorliegende, in kumulativer Schreibweise verfasste Arbeit erläutert die Entwicklung, Charakterisierung und Optimierung zweier unterschiedlicher Leitstrukturen, die als Agonisten von Peroxisomen Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) und gleichsam als duale Inhibitoren der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO) wirken. Chemisch betrachtet sind dies zum ersten die Gruppe der alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate und zum zweiten die Gruppe der 2-(Phenylthio)-hexansäurederivate. Die Publikation zur Synthese und in vitro-pharmakologischen Charakterisierung der alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate an PPAR (Zettl et al., QSAR & Combinatorial Science, 28:576–586, 2009) enthält einerseits die strukturelle Optimierung durch Variation der Aryl-Substitution des zentralen Pyrimidinringes der Leitstruktur und andererseits die durch Docking-Verfahren gestützte Untersuchung des Einflusses der Stereochemie auf die PPAR-Aktivierung. Letztlich konnte durch die Einführung von Biphenyl-Substituenten eine Verbesserung insbesondere der PPARalpha-Aktivität gegenüber der als strukturellen Referenz dienenden alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäure (Rau et al., Archiv der Pharmazie, 341:191–195, 2008) erreicht werden. Mit Hilfe von präparativer enantioselektiver HPLC wurde eine ausgewählte Verbindung in ihre beiden Enantiomere getrennt. Deren in vitro-pharmakologische Charakterisierung ergab, dass das (R)-Enantiomer insbesondere bei PPARalpha als Eutomer fungiert. Dieses Ergebnis konnte mit Hilfe von Docking-Studien weiter untermauert werden. Hierbei wurde deutlich, dass die Besetzung der linken proximalen Bindetasche der PPARalpha-Liganden-Bindungs-Domäne durch den alpha-n-Hexyl-Rest lediglich im Fall einer (R)-Konfiguration optimal erfolgen kann. Die Synthese und die in vitro-pharmakologische Charakterisierung der Substanzklasse der 2-(Phenylthio)-hexansäurederivate an PPAR sind in Zettl et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 19: 4421-4426, 2009 zusammengefasst. Bei der Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen erwies sich die Leitstruktur als hochaktiv und sehr robust. Je nach Substitutionsmuster des lipophilen Molekülteils wurden potente selektive PPARalpha-Agonisten wie auch PPARalpha-präferenzielle duale PPARalpha/gamma-Agonisten dargestellt. Durch die Synthese von Kohlenstoff-Analoga und alpha-unsubstituierten Verbindungen wurde des Weiteren der Einfluss des Schwefelatoms und des n-Butylrestes in alpha-Position zur Carbonsäure auf die PPAR-Aktivität untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass beide Strukturelemente einen großen Beitrag zur hohen PPARalpha-Aktivität der Leitstruktur leisten. Wie auch bei den alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivaten wurde eine ausgewählte Verbindung in ihre Enantiomere getrennt und der Einfluss des Stereozentrums in alpha-Position zur Carbonsäure untersucht. Das Ergebnis bestätigte die Resultate der vorangegangenen Studie: Das (R)-Enantiomer wirkte als Eutomer, wobei der stereochemische Einfluss bei PPARalpha besonders deutlich war. Ausgewählte Synthesen und die in vitro-pharmakologische Charakterisierung von Pirinixinsäurederivaten an mPGES-1, 5-LO sowie der Cyclooxygenase (COX) sind in Koeberle und Zettl et al., Journal of Medicinal Chemistry, 51:8068–8076, 2009 publiziert. Die Arbeit beinhaltet eine umfassende Reihe an Pirinixinsäurederivaten mit Strukturvariationen in alpha-Position zur Carbonsäure und im Aryl-Substitutionsmuster des Pyrimidinringes. Hinsichtlich der alpha-Substitution zeigte sich, dass für Alkylreste eine Kettenlänge von mindestens 6 Kohlenstoffatomen für einen dualen Wirkmechanismus erforderlich ist. Als Leitstruktur für duale mPGES-1/5-LO-Inhibitoren ergab sich somit alpha-n-Hexyl-substituierte Pirinixinsäure, deren Aryl-Substitutionsmuster am zentralen Pyrimidin weiter optimiert wurde. Als vorteilhaft erwies sich die Substitution mit Biphenylresten, wodurch die Darstellung von niedrig mikromolar aktiven dualen mPGES-1/5-LO-Inhibitoren gelang. Bei der Analyse der Strukur-Wirkungs-Beziehungen von unterschiedlichen Biphenylresten zeigte sich eine hohe strukturelle Toleranz hinsichtlich der dualen inhibitorischen Aktivität an der mPGES-1 und der 5-LO. Somit stellen die alpha-n-Hexyl-Pirinixinsäurederivate die ersten publizierten dualen mPGES-1/5-LO-Inhibitoren dar.
This study focuses on structural features of a particular GPCR type, the family C GPCRs. Structure- and ligand-based approaches were adopted for prediction of novel mGluR5 binding ligand and their binding modes. The objectives of this study were: 1. An analysis of function and structural implication of amino acids in the TM region of family C GPCRs. 2. The prediction of the TM domain structure of mGluR5. 3. The discovery of novel selective allosteric modulators of mGluR5 by virtual screening. 4. The prediction of a ligand binding mode for the allosteric binding site in mGluR5. GPCRs are a super-family of structurally related proteins although their primary amino acid sequence can be diverse. Using sequence information a conservation analysis of family C GPCRs should be applied to reveal characteristic differences and similarities with respect function, folding and ligand binding. Using experimental data and conservation analysis the allosteric binding site of mGluR5 should be characterized regarding NAM and PAM and selective ligand binding. For further evaluation experimental knowledge about family A GPCRs as well as conservation between vertebrate rhodopsins was planned to be compared to results obtained for family C GPCRs (Section 4.1 Conservation analysis of family C GPCRs). Since no receptor structure is available for any family C GPCR, discussion of conserved sequence positions between family A and C GPCRs requires the prediction of a receptor structure for mGluR5 using a family A receptor as template. In order to predict the mGluR5 structure a sequence alignment to a GPCR template protein will have to be proposed and GPCR specific features considered in structure calculation (Section 4.1.4 Structure prediction of mGluR5). The obtained structure was intended to be involved in ligand binding mode prediction of newly discovered active molecules. For discovery of novel selective mGluR modulators several ligand-based virtual screening protocols were adapted and evaluated. Prediction models were derived for selection of possibly active molecules using a diverse collection of known mGluR binding ligands. For that purpose a data collection of known mGluR binding ligands should be established and this reference collection analyzed with respect to different ligand activity classes, NAM or PAM and selective modulators. The prediction of novel NAMs and PAMs using several combinations of 2D-, 3D-, pharmacophore or molecule shape encoding methods with machine learning techniques and similarity determining methods should be tested in a prospective manner (Section 4.2 Virtual screening for novel mGluR modulators). In collaboration with Merz Pharmaceuticals (Merz GmbH & Co. KGaA, Frankfurt am Main, Germany) the modulating effect of a few hundred molecules should be approved in a functional cell-based assay. With the objective to predict a binding mode of the discovered active molecules, molecule docking should be applied using the allosteric binding site of the modeled mGluR5 structure (Section 4.2.4 Modeling of binding modes). Predicted ligand binding modes are to be correlated to conservation profiles that had resulted from the sequence-based entropy analysis and information from mutation experiments, and shall be compared to known ligand binding poses from crystal structures of family A GPCRs.
Die Identifizierung neuartiger Verbindungsklassen für ein pharmakologisches Zielsystem ist eine fordernde Aufgabe für die frühe präklinische Forschung, insbesondere wenn bereits vorherige umfangreiche Studien durchgeführt und viele Leitstrukturserien gefunden wurden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Scaffold Hopping durch Methoden des Virtual Screenings auch für Systeme möglich ist, für die bereits eine Vielzahl von Referenzsubstanzen beschrieben ist und somit wenig freier chemischer Raum für Innovation zur Verfügung steht. Als Beispielsystem wurde die GlycinB-Bindungsstelle der NR1-Untereinheit des NMDA-Rezeptors betrachtet. Verschiedene zwei- und dreidimensionale Techniken des Virtual Screenings wurden einer umfangreichen retrospektiven Validierung unterworfen. Zur Durchführung der prospektiven Virtual-Screening-Studie wurde eine automatisierte in silico Plattform entwickelt, die 8,9 Millionen käufliche Substanzen aus 46 Substanzkatalogen von 33 verschiedenen Anbietern sammelte, um etwa 5 Millionen unterschiedliche Moleküle in zweidimensionaler Darstellung aufzuarbeiten. Diese Menge an Substanzen stellt den größten Teil der zurzeit kommerziell verfügbaren chemischen Verbindungen, also den „verfügbaren chemischen Raum“ dar. Anhand der retrospektiv validierten Virtual Screening Techniken konnten in einer prospektiven Suche 21 GlycinB-Antagonisten mit neuartigen, d.h. für GlycinB noch unbeschriebenen Scaffolds gefunden werden. Ausgehend von drei dieser Virtual Screening Hits wurden 53 weitere Verbindungen mit insgesamt fünf unterschiedlichen neuartigen Scaffolds und einem gemeinsamen Azo-Motiv identifiziert. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen dieser fünf chemischen Serien wurden charakterisiert. Das Ergebnis dieser Arbeit zeigt eindeutig, dass es lohnend ist, alle vorhandenen Methoden auszuschöpfen, da sich die validierten Methoden komplementär zueinander verhielten und kein Virtual Screening Hit von mehr als einer Technik gefunden wurde. Die Flexibilität von Proteinen als Antwort auf die Bindung unterschiedlicher Liganden stellt ein bislang ungelöstes chemieinformatisches Problem dar, welches auch grundlegende pharmakologische Bedeutung hat. So verursachen z.B. bei NMDA/GlycinB agonistische Liganden eine Konformationsänderung des Rezeptors. Diese ruft dann eine direkte funktionale Antwort in Form der Öffnung des Ionenkanals hervor. Auch der Bindungsmodus der Antagonisten von GlycinB ist trotz Vorhandenseins von zwei Kristallstrukturen und mehreren Hundert zum Teil hochaffiner Referenzstrukturen zum großen Teil ungeklärt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein auf Moleküldynamiksimulationen basierendes Verfahren entwickelt, welches flexible Aminosäurereste im Rezeptor und damit induzierbare Bewegungen des Proteinrückgrates bestimmt. Die so identifizierten Reste wurden dann in einem erweiterten Verfahren des Induced-Fit-Dockings als explizit flexibel betrachtet. Hierdurch war die Berechnung verschiedener Bindungsmodi von Antagonisten möglich, die aufgrund ihrer Form und Größe nicht in die verfügbaren Kristallstrukturen von GlycinB passten. Diese benötigten somit einen Induced-Fit-Effekt des Rezeptors, um eine Bindung einzugehen. Für die im ersten Teil dieser Arbeit identifizierten Azo-Liganden wurde auf Basis dieser Methode ein gemeinsamer Bindungsmodus vorgeschlagen. Ebenso konnte anhand der Methodik eine Aussage über die funktionale Auswirkung der Proteinflexibilität beim Übergang vom antagonistischen zum agonistischen Rezeptorzustand von GlycinB getroffen werden. Ein großes Problem aktueller Dockingverfahren ist die mangelnde Verfügbarkeit von Scoringfunktionen, welche die tatsächliche biologische Bindungsaffinität eines Liganden berechnen. Hier wurde ein Verfahren für das Zielsystem GlycinB gezeigt, welches aufgrund der Berechnung des thermodynamischen Entropie- und Enthalpiegewinns durch Verdrängung von hydrophob eingeschlossenen Wasser aus der Bindungsstelle durch den Liganden eine Aussage über dessen zu erwartende Bindungsaffinität trifft. Dieses neuartige Scoringsystem wurde auf die im Virtual Screening identifizierten Serie von Azo-Liganden angewandt und verfügte über eine im Vergleich zu klassischen Scoringfunktionen des Molecular Dockings verbesserte Vorhersagekraft der biologischen Bindungsaffinität.
A generic drug product (World Health Organization (WHO) terminology: multisource product) is usually marketed and manufactured after the expiry date of the innovator’s patent. Generic drugs are less expensive than the innovator products because generic manufacturers do not have to amortize the investment costs of research, development, marketing, and promotion. Multisource products must contain the same active pharmaceutical ingredients (APIs) as the original formulation and have to be shown to be interchangeable with the original formulation. Multisource products have to be shown bioequivalent to the innovator counterpart with respect to pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Multisource products are therefore identical in dose, strength, route of administration, safety, efficacy, and intended use. Bioequivalence can be demonstrated by in vitro dissolution, pharmacokinetic, pharmacodynamic or clinical studies. Since 2000, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) allows the approval of certain multisource products solely on the basis of in vitro studies, i.e. by waiving in vivo studies in humans (“Biowaiver”), based on the Biopharmaceutics Classification Scheme (BCS). The BCS characterizes APIs by their solubility and permeability in the gastrointestinal tract (GIT). The different BCS Classes I-IV (Class I: high solubility, high permeability; Class II: low solubility, high permeability; Class III: high solubility, low permeability and Class IV: low solubility, low permeability) result from all possible combinations of high and low solubility with high and low permeability. Since the adoption of the BCS by the FDA in 1995, the BCS criteria have been under continuous development. In 2006, the WHO has released the most recent bioequivalence guidance including relaxed criteria for bioequivalence studies based on modified BCS criteria. According to this guidance, APIs belonging to the BCS classes I – and under defined conditions - II and III – are eligible for a biowaiver-based approval. The principal objective of this work was to characterize the first-line anti tuberculosis APIs, isoniazid, pyrazinamide, ethambutol dihydrochloride and rifampicin, according to their physicochemical, biopharmaceutical, pharmacokinetic and pharmacological properties and to classify them according to the BCS. Ethambutol dihydrochloride and isoniazid were classified as borderline BCS class I/III APIs. Pyrazinamide was classified as a BCS class III and rifampicin as a BCS class II API. Based on the BCS classification and the additional criteria defined in the WHO bioequivalence guidance, the possibility of biowaiver-based approval for immediate release (immediate release) solid oral dosage forms containing the first-line antituberculosis drugs was evaluated. A biowaiver-based approval with defined constraints was recommended for immediate release solid oral dosage forms containing isoniazid (interaction with reducing sugars), pyrazinamide and ethambutol dihydrochloride (relative narrow therapeutic index). Rifampicin was classified as a BCS class II API, and it was concluded that rifampicin containing solid oral immediate release drug products as well as Scale-Up and Post-Approval Changes (SUPAC) changes should not be approved by a biowaiver on the following basis: (i) its solubility and dissolution are highly variable due to polymorphism and instability, (ii) concomitant intake of food and antacids reduces its absorption and bioavailability, (iii) no in vitro predictive dissolution test has been found which correlates to in vivo absorption and (iv) several publications reporting cases of non-bioequivalent and bioinequivalent rifampicin products have been located in the literature. Thus, it is recommended that bioequivalence of rifampicin containing solid oral immediate release drug products should be established by in vivo pharmacokinetic studies in humans. This risk-benefit benefit assessment of a biowaiver-based approval was presented as a poster at the American Association of Pharmaceutical Scientists (AAPS) 2005 and subsequently published as “Biowaiver Monographs” in the Journal of Pharmaceutical Sciences. Based on the assessment of the dissolution properties of the antituberculosis drugs for a biowaiver approval, quality control dissolution methodologies for the International Pharmacopoeia (Pharm. Int.) were developed, presented at the WHO expert meeting and adopted in the Pharm. Int. (http://www.who.int/medicines/publications/pharmprep/OMS_TRS_948.pdf). Additionally, preliminary biowaiver recommendations were also developed for four firstline antimalarial drugs listed on the WHO Essential Medicines List (EML): Quinine, as both the hydrochloride and sulphate, and proguanil hydrochloride were classified as borderline BCS class I/III APIs. Since quinine is a narrow therapeutic index drug and many cases of non-bioequivalence have been reported in the literature, a biowaiverbased approval was not recommended. For solid oral immediate release dosage forms containing proguanil a biowaiver-based approval was recommended under the condition that they dissolve very rapidly. Primaquine phosphate was classified as a BCS class I API. Therefore, a biowaiver-based approval was recommended for immediate release solid oral dosage forms containing primaquine phosphate. Mefloquine hydrochloride was classified as a basic, BCS class IV/II API, making it ineligible for the biowaiver. Additionally, reports of non-bioequivalence and a narrow therapeutic index were found in the scientific literature. Consequently, bioequivalence of solid oral immediate release dosage forms containing mefloquine hydrochloride should be established by in vivo pharmacokinetic studies. The results for quinine hydrochloride and sulphate, proguanil hydrochloride, primaquine diphosphate and mefloquine hydrochloride were presented as a poster at the Pharmaceutical Sciences World Congress (PSWC) 2007 and published as a WHO Collaborating Center Report in June 2006. The aim of this project was to collect, evaluate, generate and publish relevant information for a biowaiver-based approval of essential medicines in order to provide a summary to local regulatory authorities. This information complements the selected list of essential medicines by providing information about the biopharmaceutical properties and pharmaceutical quality of solid oral immediate release dosage forms containing these APIs. The aim of the biowaiver project, inspired by the WHO and brought in life by the International Pharmaceutical Federation (FIP), is to enable access to essential medicines in standardized quality at an affordable price. In this work, a significant contribution to this aim in the form of four biowaiver monographs for the antituberculosis drugs and several reports on the antimalarials has been achieved.
Understanding the dynamics of recurrent neural networks is crucial for explaining how the brain processes information. In the neocortex, a range of different plasticity mechanisms are shaping recurrent networks into effective information processing circuits that learn appropriate representations for time-varying sensory stimuli. However, it has been difficult to mimic these abilities in artificial neural models. In the present thesis, we introduce several recurrent network models of threshold units that combine spike timing dependent plasticity with homeostatic plasticity mechanisms like intrinsic plasticity or synaptic normalization. We investigate how these different forms of plasticity shape the dynamics and computational properties of recurrent networks. The networks receive input sequences composed of different symbols and learn the structure embedded in these sequences in an unsupervised manner. Information is encoded in the form of trajectories through a high-dimensional state space reminiscent of recent biological findings on cortical coding. We find that these self-organizing plastic networks are able to represent and "understand" the spatio-temporal patterns in their inputs while maintaining their dynamics in a healthy regime suitable for learning. The emergent properties are not easily predictable on the basis of the individual plasticity mechanisms at work. Our results underscore the importance of studying the interaction of different forms of plasticity on network behavior.
Die primär – und sekundärprophylaktische Versorgung durch einen plötzlichen Herztod bedrohter Patienten mittels Implantierbarer Cardioverter Defibrillatoren hat sich in mehreren groß angelegten Studien einer rein konservativ-medikamentösen Behandlung gegenüber als überlegen erwiesen. Ein Hauptproblem dieser Therapieform ist jedoch die mit 25 – 40% berichtete hohe Inzidenz inadäquater Therapieabgaben. Bisher weitgehend ungeklärt blieben die prognostische Bedeutung, eventuelle Risikofaktoren sowie die daraus abzuleitenden therapeutischen Implikationen des Auftretens inadäquater Therapieabgaben. Die vorliegende Arbeit analysiert die Daten 783 (630 Männer, 153 Frauen. Medianes Alter 65 Jahre) konsekutiv im Zeitraum von 1993 bis 2005 in der Medizinischen Klinik III – Kardiologie und Angiologie – Abteilung für Elektrophysiologie der Universitätsklinik der Johann Wolfgang Goethe-Universität implantierter Patienten über einen medianen Nachbeobachtungszeitraum von 37 Monaten. Implantiert wurden nach allgemein anerkannter Indikationsstellung Cardioverter Defibrillatoren der Firmen CPI/Guidant, Ela-Medical, Medtronic Inc. und St. Jude Medical. Zum Einsatz kamen hierbei Ein – Zwei – und Dreikammergeräte (Einkammer = 511, Zweikammer = 239, Dreikammer = 33). Die Sachkontrolluntersuchungen fanden im ersten Jahr nach Implantation dreimonatig, danach halbjährlich sowie bei Notwendigkeit außerplanmäßig statt. Hierbei wurden jeweils alle stattgehabten, von den Implantierbaren Cardioverter Defibrillatoren registrierten Ereignisse ausgedruckt und auf Speichermedien gesichert. Die archivierten Elektrogramme der in diesem Zeitraum aufgetretenen 11.942 tachykarden Ereignisse bilden die Grundlage der Analyse der vorliegenden Arbeit. Hierbei wurden alle aufgetreten inadäquaten Therapiegaben an Hand der Elektrogramme einer von neun ätiologischen Kategorien zugeordnet. Der aktuelle Status aller 783 Patienten wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit, soweit unbekannt und somit notwendig, telefonisch oder per Briefkontakt mit den weiterbehandelnden Ärzten und Zentren eruiert. Im Rahmen der Untersuchung wurden Parameter betreffend der Erkrankungen der Patienten (Herzinsuffizienz, Koronare Herzerkrankung, Dilatative Cardiomyopathie, Klappenvitien und vorbekannte atriale Tachykardien) sowie zu ihrer zum jeweiligen Untersuchungszeitpunkt aktuellen Medikation (Klasse-I-Antiarrhythmika, Sotalol, Amiodaron, Beta-Blocker, Klasse-IV-Antiarrhythmika, Digitalisglykoside, ACE-Inhibitoren/AT1-Antagonisten, Aldosteronantagonisten, Diuretika und CSE-Inhibitoren ) erfasst. Die statistische Auswertung bezüglich des Auftretens inadäquater Therapien sowie ihrer Ätiologie, der Versterbenshäufigkeit, der Überlebensdauer, des gefährdeten Auftretenszeitraums inadäquater Therapien, eines eventuellen prädilektiven Risikoalters, des Einflusses der verschieden Ätiologien und der Anzahl inadäquater Therapiegaben auf Überlebensdauer und Versterbenshäufigkeit, des Einflusses der Begleitmedikation, des Einflusses der Begleiterkrankungen, der Differenzen zwischen Ein – Zwei – und Dreikammergeräten, der Differenzen der Geräte der verschiedenen Hersteller sowie der erfolgten Programmierung der Implantierbaren Cardioverter Defibrillatoren erfolgte mittels des Leevene-Tests, des Kolmogoroff-Smirnoff-Tests, des Zweistichproben-t-Tests sowie Fisher’s exaktem Test. Im nachbeobachteten Zeitraum wurden 11.942 tachykarde Ereignisse registriert, deren Auswertung 2806 (23,5%) inadäquate Therapien ergab. Davon waren 27,9% Defibrillationen, 72,1% antitachykarde Überstimulationen. 200 der 783 Patienten (25,5%) erlitten inadäquate Therapieabgaben während der Nachbeobachtungsperiode. 29,1% der implantierten CPI/Guidant-Geräte waren von inadäquaten Therapien betroffen, 40,8% der Ela90 Geräte, 21,2% der Medtronic-Geräte und 25% der St. Jude-Geräte. Tachykard übergeleitetes Vorhofflimmern machte 45,6% der inadäquaten Therapien aus, Sinustachykardien 11,3%, Vorhofflattern 9,1%, supraventrikuläre Tachykardien 16,1%, Sondendefekte 14,1%, Muskelpotentialfehlwahrnehmungen 0,8%, T-Wellen-Fehlwahrnehmungen 1,6%, R-Wellen-Doppelwahrnehmungen 0,4% und nicht anhaltende Ventrikuläre Tachykardien 0,9%. Die Analyse der Differenzen der Patienten, welche inadäquate Therapien erlitten und der Patienten, welche keine inadäquaten Therapien erlitten, ergab signifikante Unterschiede. Die Nachbeobachtungsperiode der Patienten mit inadäquaten Therapien war mit 54,2 Monaten im Median länger als die der Patienten ohne inadäquate Therapien (Median hier 30 Monate, p<0,000001). Gleiches gilt für die Überlebensdauer der Patienten mit inadäquaten Therapien (mediane Überlebenszeit 56,9 Monate versus 33,4 Monate, p<0,0001). Weder das generelle Auftreten inadäquater Therapien noch die Zahl der erlittenen inadäquaten Therapien reduzierten die Überlebensdauer. Auch konnte keine Form von inadäquater Therapie identifiziert werden, die mit einer Übersterblichkeit einherging. Das Auftreten inadäquater Therapien an sich jedoch ging in einer Subgruppenanalyse der Patienten mit inadäquaten Therapien, der Patienten mit nur adäquaten Therapien und der Patienten ohne jegliche Therapien mit einer erhöhten Versterbenswahrscheinlichkeit einher (p<0,000003 bzw. p<0,01). Insofern kann an dieser Stelle ein negativer Einfluss inadäquater Therapien in der Zusammenschau der Befunde nur gemutmaßt, nicht aber eindeutig nachgewiesen werden. Bezüglich der Risikofaktoren für das Auftreten inadäquater Therapien ergab sich ein gefährdeter Zeitraum innerhalb der ersten sechs Monate nach Implantation, was auf die zu diesem Zeitpunkt noch nicht individuell optimierte Programmierung zurückzuführen ist. Patienten jeden Alters wiesen ein vergleichbares Risiko auf, inadäquate Therapien zu erleiden. Insofern konnte kein Risikoalter identifiziert werden. Mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung inadäquater Therapien gingen eine insuffiziente Versorgung mit Betablockern oder Amiodaron (p<0,000001 bzw. p<0,04) sowie vor der Implantation bekannte atriale Tachykardien (p<0,001) einher. Beide Umstände erklären sich mit der Dominanz atrialer Rhythmusstörungen als auslösende Ursache inadäquater Therapien (82,1% aller inadäquaten Therapien wurden durch atriale Rhythmusstörungen ausgelöst) sowie durch den reduzierenden Effekt der beiden Antiarrhythmika auf die Inzidenz dieser atrialen Rhythmusstörungen. Die restlichen Begleiterkrankungen blieben ohne nachweisbaren Einfluss auf das Auftreten inadäquater Therapieabgaben. Zwei- und Dreikammergeräte konnten, entgegen der Erwartungen, die Inzidenz inadäquater Therapieabgaben gegenüber den Einkammergeräten nicht signifikant reduzieren (p<0,1). Am ehesten zu erklären ist dies mit den bei Zwei- und Dreikammergeräten vermehrt auftretenden Wahrnehmungsproblemen sowie den zusätzlich benötigten, defektanfälligen Sonden. Die vorliegende Arbeit konnte die berichtete hohe Inzidenz inadäquater Therapiegaben sowie deren dominierende Ätiologien in einem breiten, den klinischen Routinebedingungen entsprechenden Patientenkollektiv innerhalb eines langen Zeitverlaufes bestätigen und eventuelle Risikofaktoren identifizieren. Weiterhin konnten Erkenntnisse bezüglich der prognostischen Bedeutung inadäquater Therapieabgaben gewonnen werden. Die Kenntnis der Risikofaktoren könnte dazu beitragen helfen, gefährdete Patienten frühzeitig zu identifizieren sowie durch prophylaktische Maßnahmen die Inzidenz inadäquater Therapiegaben zu mindern. Weiterhin können die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse als Grundlage der Hypothesengenerierung und Planung weiterer klinischer Studien dienen.