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Da zwischen der bakteriellen und der archaeellen Selenoprotein-Biosynthese deutliche Unterschiede existieren, sollten in dieser Arbeit trans-aktive Faktoren der Selenoprotein-Biosynthese von M. maripaludis molekulargenetisch analysiert werden um weitere Einblicke in die archaeelle Selenocystein-Biosynthesestrategie zu gewinnen. Die folgenden Ergebnisse wurden durch diese Arbeit erhalten: In Archaeen muss der Selen-Donor wie in Bakterien zu Selenophosphat phosphoryliert werden. Ohne die Aktivierung des Selen-Donors sind Archaeen nicht in der Lage Selenoproteine zu synthetisieren. Das für die Phosphorylierung des Selen-Donors verantwortliche Protein stellt in M. maripaludis interessanterweise selbst ein Selenoprotein dar. M. maripaludis ist nicht zwingend auf die Synthese von Selenocystein in einer Zwei-Schritt-Methode ausgehend von Seryl-tRNAsec, durch die Enzyme PSTK und SepSecS, angewiesen. Das Einbringen des bakteriellen Enzyms Selenocystein-Synthase in M. maripaludis, welches die gleiche Reaktion in einem Schritt durchführt, ohne Bildung des Intermediats O-Phosphoseryl-tRNAsec, ermöglicht es dem Organismus ebenfalls Selenoproteine zu bilden. Dies zeigt, dass das Intermediat O-Phosphoseryl-tRNAsec der archaeellen Selenoprotein-Biosynthese-Strategie für M. maripaludis nicht essentiell ist. Durch die Disruption eines notwendigen Faktors in der Selenoprotein-Biosynthese wird in M. maripaludis eine Veränderung der mRNA-Mengen, der für Selenoproteine und deren Cystein-haltigen Isoformen codierenden Gene ausgelöst. Diese Regulation ist unter bestimmten Bedingungen nicht reversibel. Ein Unterschied hinsichtlich der Essentialität des selenierenden Systems konnte zwischen den Stämmen M. maripaludis JJ und M. maripaludis S2 festgestellt werden. In M. maripaludis S2 ist das selenierende System essentiell. M. maripaludis JJ hingegen ist nicht auf Selenoproteine angewiesen. Weder die physiologische noch die molekulare Grundlage konnten im Rahmen dieser Arbeit aufgeklärt werden, allerdings kann das neu identifizierte HesB-ähnliche Selenoprotein als verursachender Faktor ausgeschlossen werden.
Einleitung: Glioblastome, die aggressivsten malignen Gehirntumore, gehören zu den menschlichen Karzinomen mit der schlechtesten Prognose. Ihre Therapie stellt eine große Herausforderung dar. Eine komplette chirurgische Entfernung des Tumors ist auf Grund des infiltrativen Wachstums in gesundes Hirngewebe meist nicht möglich, und trotz der Standardtherapie, die Operation, Chemo- und Radiotherapie umfasst, sind die Behandlungserfolge nicht zufriedenstellend. Erschwerend kommt hinzu, dass das Gehirn vom übrigen Organismus durch die hochselektive Blut-Hirn-Schranke abgegrenzt ist, welche für viele potentiell wirksame therapeutische Substanzen eine Permeabilitätsbarriere darstellt. Somit stehen viele Zytostatika für die systemische Glioblastomtherapie nicht zur Verfügung und eine relative Therapieresistenz ist zu verzeichnen.
Nicht nur die Neuentwicklung von Arzneistoffen für die Pharmakotherapie von Erkrankungen des zentralen Nervensystems, wie den Gehirntumoren, sondern auch die Etablierung neuer Arzneiformen zur kontrollierten, gewebsspezifischen Arzneistoffapplikation gewinnt immer mehr an Bedeutung.
Ein Ansatz, der in der Vergangenheit vielversprechende Erfolge erzielte, ist die Einbettung von Arzneistoffen in kolloidale Trägersysteme wie polymere Nanopartikel oder Liposome. Diese Carrier sind in der Lage verschiedene Arzneistoffe über die Blut-Hirn-Schranke zu transportieren, damit diese im zentralen Nervensystem ihre Wirkung ausüben können. Der Grund für diesen Erfolg ist offensichtlich begründet in der nanopartikulären Größe und der besonderen Oberflächenstruktur dieser Träger. Zusätzlich geht mit der vermehrten Anreicherung der Wirkstoffe im Zentralnervensystem eine Verminderung der unerwünschten Arzneimittelwirkungen in peripheren Organen einher, was die Therapie positiv beeinflusst.
In der vorliegenden Arbeit wird die antitumorale Effizienz nanopartikulärer Formulierungen, die den Wirkstoff Doxorubicin enthalten, eingehend untersucht. Hierbei liegt der Schwerpunkt auf der histologischen und immunhistochemischen Analyse der Gehirntumore, die eine genaue
Differenzierung zwischen den Zubereitungen und eine aussagekräftige Effizienzbeurteilung erlaubt. Weiterhin wird der Fokus dieser Arbeit auf die Quantifizierung der Doxorubicinmenge gerichtet, die nach Applikation der nanopartikulären Formulierungen im Gehirn vorliegt.
Enthält u.a. die Publikationen:
Publikation 1:
Transport of drugs across the blood-brain barrier by nanoparticles – A review
Journal of Controlled Release – Special Issue: Drug delivery research in Europe
Status: accepted, geplantes Erscheinungsdatum: 01.2012
Publikation 2:
Increased numbers of injections of doxorubicin bound to nanoparticles lead to enhanced efficacy against rat glioblastoma 101/8
Wohlfart et al. 2009, Journal of Nanoneuroscience, Volume 1, Number 2, December 2009, pp. 144-151 (8)
Publikation 3:
Treatment of glioblastoma with poly (isohexyl cyanoacrylate) nanoparticles
Wohlfart et al. 2011, International Journal of Pharmaceutics 415 (2011) 244-251
Publikation 4:
Drug delivery to the brain using surfactant-coated poly (lactide-co-glycolide)
nanoparticles: Influence of the formulation parameters
Gelperina et al. 2010, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 74 (2010) 157–163
Publikation 5:
Efficient chemotherapy of rat glioblastoma using doxorubicin-loaded PLGA nanoparticles with different stabilizers
Wohlfart et al. 2011, PloS One May 2011, Volume 6, Issue 5, e 19121
Publikation 6:
Kinetics of transport of doxorubicin bound to nanoaprticles across the blood-brain barrier
Wohlfart et al. 2011, Journal of Controlled Release (2011),
doi:10.1016/j.jconrel.2011.05.010, in press
In weiten Teilen zentraleuropäischer Mittelgebirge wird das anstehende Gestein durch periglaziäre Lagen verhüllt. Diese polygenetisch entwickelten Lockergesteinsdecken sind Schichten im geologisch-sedimentologischen Sinne und das Ausgangsmaterial der Bodenbildung. Ihre Substrateigenschaften, die durch pedogenetische Prozesse lediglich modifiziert werden, beeinflussen maßgeblich die ökologischen Standortbedingungen. Bisher waren nur sehr wenige Informationen zum Aufbau des oberflächennahen Untergrundes und der Böden des hessischen Spessarts vorhanden. Deswegen wurden im Rahmen dieser Arbeit in fünf Untersuchungsgebieten die Verbreitung und Eigenschaften der periglaziären Lagen und Böden mit Hilfe von umfangreichen Geländeuntersuchungen, Laboranalysen und mikromorphologischen Analysen erfasst. Die Ergebnisse belegen die Koppelung verschiedener Bodentypen mit bestimmten Schichtungskombinationen periglaziärer Lagen. Mit Hilfe von Dünnschliffanalysen wird die Wirksamkeit unterschiedlicher bodenbildender Prozesse in den Substraten näher beleuchtet. In lösslehmreichen, lithologisch dreigeteilten Lockergesteinsdecken sind Parabraunerden entwickelt. Die Untersuchung der Bodendünnschliffe offenbart jedoch, dass ein Teil der Tongehaltsdifferenz auf Sedimenteigenschaften der Deckschichten zurückzuführen ist: In der Mittellage finden sich Reste einer Paläobodenbildung in Form von Toncutanbruchstücken und tonigen Aggregaten. Teilweise wurde dieses Material auch bei der Formung der Hauptlage aufgearbeitet und als tonige Aggregate in die schluffige Matrix inkorporiert. Rezente Lessivierungsprozesse maskieren lediglich den schichtungsbedingten Tongehaltsunterschied und damit auch den Einfluss der Paläobodenreste auf die heutige Profilgestalt. In den höher gelegenen Gebieten des Gebirges stellen Braunerden aus Hauptlage über Basislage den am weitesten verbreiteten Bodentyp. Der Lösslehmanteil in der Hauptlage ist gegenüber den Profilen am Westrand des Spessarts deutlich geringer, lösslehmreiche Mittellagen kommen kaum vor. Mikromorphologische Analysen bestätigen Geländebefunde, nach denen sich die Verbraunung auf die lösslehmhaltigen Sedimente (Hauptlage, in die Basislage eingemischtes Hauptlagenmaterial) beschränkt. Lessivierungsprozesse dagegen sind nicht an bestimmte Schichten oder Substrate gebunden: Toneinspülungen sind in allen periglaziären Lagen nachweisbar und die Verlagerung findet schichtübergreifend statt. Sehr viele Bodenprofile zeigen Podsolierungstendenzen, trotzdem bleibt der Braunerdecharakter der Profile bestimmend. Stärkere Podsolierung beschränkt sich auf durch den Menschen in der Vergangenheit stark veränderte Substrate. Weitere Fragestellungen für die Dünnschliffuntersuchungen waren die qualitative Bewertung der Überformungsintensität periglaziärer Lagen durch bioturbate Prozesse sowie die Identifikation von Solumsedimenten, die granulometrisch kaum vom liegenden Hauptlagenmaterial zu unterscheiden sind.
Die Osteopathia striata mit Schädelsklerosierung (OSCS) ist eine seltene Knochendysplasie, die durch die namensgebende lineare Streifung der langen Röhrenknochen, eine Sklerose des Schädels und seltenere Fehlbildungen anderer Organsysteme charakterisiert ist.
In der vorliegenden Arbeit wurden 3 Familien mit 9 betroffenen Familienmitgliedern untersucht und die Verläufe über teilweise 20 Jahre dokumentiert. Die Symptome wurden mit 55 gut dokumentierten Patienten aus der Literatur verglichen. Typisch sind ein Makrocephalus mit prominenter Stirn und Hypertelorismus, Hörstörungen, LKG-Spalten, und Herzfehler. Seltener sind Syndaktylie, Klinodaktylie, Polydaktylie und Kamptodaktylie, Klumpfüße und Spina bifida occulta.
Fehlbildungen im Bereich der Luftwege und des Verdauungstraktes wurden vereinzelt beschrieben.
Hirnnervenausfälle in Form von Facialisparesen oder partiellen Trigeminusparesen wurden nur in der Literatur beschrieben,
aber bei keinem unserer Patienten.
Ein besonderer Schwerpunkt der Arbeit lag in der Dokumentation von Zahn- und Kieferfehlbildungen, Dysplasien sowie in Therapiemöglichkeiten. So hatten 66 % unserer Patienten dentale Positionsanomalien, 55 % eine Hypodontie durch fehlende oder verlagerte Zähne, während diese nur bei 18 % der Patienten aus der Literatur aufgeführt waren. Alle eigenen Patienten hatten einen gestörten physiologischen Zahnwechsel, so dass häufig Zähne extrahiert werden mussten, um einen Durchbruch, bzw. eine korrekte Einstellung der bleibenden Zähne zu erreichen. Neonatale Zähne und ein Mesiodens als Schwachform einer Holoprosenzephalie erweitern das bisherige dentale Spektrum der OSCS. Kieferorthopädische und kieferchirurgische Behandlungsmöglichkeiten werden diskutiert, wobei auch auf die Erfahrungen bei der Dysostosis cleidocranialis zurückgegriffen wurde, weil es bisher keine Konzepte zur Behandlung der OSCS gab. Mit Kieferdehiszensen nach kieferchirurgischer Behandlung muss aufgrund einer möglicherweise verminderten Osteogenese im sklerosierten Knochen gerechnet werden. Hypodontie, Zahnfehlstellungen und Zahndurchbruchsstörungen sind erste Symptome, die differentialdiagnostisch an eine OSCS denken lassen. Nur durch einen frühzeitigen und multidisziplinären Therapieansatz, der Kinderzahnarzt, Hauszahnarzt, Kieferorthopäde und Kieferchirurg umfasst, lassen sich die vielfältigen Probleme bei Patienten mit OSCS zufriedenstellend behandeln. Wegen der langen Behandlungsdauer ist es notwendig, früh, konsequent und eng Patienten und Eltern in die Behandlungsplanung mit einzubeziehen.
Die OSCS wird X-gekoppelt dominant vererbt. Männer sind zumeist deutlich schwerer betroffen als Frauen. Ursache sind Mutationen im WTX-Gen (Wilms tumor gene on the X-chromosome; Locus: Xq11.1), die zu einer Haploinsuffizienz des Gens führen. WTX supprimiert direkt, bzw. indirekt über Axin den Wnt/ß-catenin Signalweg, der eine große Rolle bei verschiedenen Tumoren und Entwicklungsstörungen spielt. In die regel- und zeitgerechte Zahnentwicklung greift Wnt in mehreren Entwicklungsstufen ein. Die bei der OSCS vorliegenden Zahnfehlbildungen und Dysplasien können dadurch pathogenetisch erklärt werden.
Das Antiprotonen-Experiment PANDA an der zukünftigen Beschleunigeranlage FAIR wird unter anderem Charmonium-Zustände mit einer bis dato unerreichten Genauigkeit messen können. Um dieses Ziel zu erreichen, wird eine sehr gute Teilchenidentifikationsfähigkeit verlangt. Eine gute Trennung zwischen Pionen und Kaonen wird durch den Einsatz eines Cherenkovdetektors erreicht. Die Leistungsfähigkeit eines DIRC hängt von dessen Radiatorgüte ab. Um die Qualität der Radiatorstäbe spezifizieren zu können, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit eine optische Messapparatur entwickelt. Dieser Aufbau erlaubt es die Transmission sowie die Oberflächenrauheit der Stäbe zu messen. Es wurden mehrere Radiatorstäbe aus synthetischem Quarzglas und Acrylglas untersucht. Die Messgenauigkeit bei hochqualitativen Stäben liegt für die Transmissionsmessung bei etwa 1 Promille und für die Rauheit bei 1-2 Angström. Die Messergebnisse bei verschiedenen Wellenlängen zeigen eine gute Übereinstimmung mit der skalaren Streutheorie, die den Zusammenhang zwischen Reflexionskoeffizienten und Rauheit beschreibt. Bei einer Strahlzeit an der GSI mit einem 2 GeV Protonenstrahl wurde ein erster Prototyp für den Barrel-DIRC mit einem Stab aus synthetischem Quarzglas als Radiator getestet. Durch Variation des Einfallswinkels und der Position des Protonenstrahls auf dem Radiator konnten Cherenkovringe eindeutig nachgewiesen werden. Zudem wurde der Cherenkovwinkel und die Einzelphotonauflösung in guter Übereinstimmung mit dem Erwartetem und der Simulation bestimmt.
Mittels fragebogenbasierendem Screeningverfahren konnte bei 15,3% der
Patienten der pädiatrisch gastroenterologischen Ambulanz der
Darmstädter Kinderkliniken Prinzessin Margaret ein psychologischer bzw.
psychosomatischer Beratungs- und Behandlungsbedarf ermittelt werden.
Bei 40,3% der Patienten wurden grenzwertige Befunde erhoben, 44,4 %
blieben unauffällig. Im Vergleich zwischen einer Klinik der I. bis II.
Versorgungsstufe und einer universitären Klinik der III. Versorgungsstufe
besteht ein gering signifikanter Unterschied, dabei ist der Anteil
unauffälliger Ergebnisse mit 45,8% etwa gleich, es sind mit 21,4% jedoch
wesentlich mehr Auffälligkeiten und mit 32,8% weniger grenzwertige
Befunde zu verzeichnen. Begründet ist diese Differenz in der
Stichprobenstruktur und den unterschiedlichen Versorgungsspektrum der
Kliniken. Im Vergleich analoger Gruppen von Patienten mit chronisch
entzündlichen Darmerkrankungen und chronischen Bauchschmerzen
konnten keine signifikanten Unterschiede gemessen werden. Der größten
Beratungsbedarf konnte in der Gruppe Patienten mit Adipositas ermittelt
werden, in der universitären Klinik liegt der bei den Patienten mit
Lebererkrankungen. Einen überdurchschnittlich hohen Beratungsbedarf
findet man bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und bei
Kindern- und Jugendlichen mit chronischen Bauchschmerzen mit und
ohne Nachweis einer Kohlenhydratmalabsorption.
Signifikante Unterschiede bestehen zwischen der Fremdbeurteilung durch
die Eltern und Selbstbeurteilung der Jugendlichen im Strengths and
Difficulties Questionnaire. In der Selbstbeurteilung finden sich 88,8%
unauffällige, 6,4% grenzwertige und 4,8% auffällige Ergebnisse. In der
Elternbeurteilung werden jeweils 14,4% der Kinder- und Jugendlichen als
auffällig und grenzwertig bezüglich des Verhaltens bewertet, 71,2%
erreichen Normwerte. Hinweise auf emotionale und
Verhaltensauffälligkeiten fanden sich insbesondere bei adipösen
Patienten, bei Kohlenhydratmalabsorptionen und bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. In der Gruppe der adipösen
Jugendlichen fällt eine ausgesprochen negative Selbstbewertung auf.
Die gesundheitsbezogenen Lebensqualität wird durch die Eltern in 50,7%
der Fälle als eingeschränkt beurteilt. Nur 13,9% der Jugendlichen geben
eine Einschränkung der subjektiven Gesundheit an. Führend in Fremdund
Selbstbeurteilung sind Erkrankungen die eine spezifische Diät
notwendig machen wie Nahrungsmittelunverträglichkeiten und Zöliakie. In
der Selbstbeurteilung geben Patientin mit Adipositas und chronisch
entzündlichen Darmerkrankungen Einschränkung der subjektiven
Gesundheit an, auffällig ist die wesentlich positivere Einschätzung der
Situation durch die Eltern in diesen Gruppen. Schmerzen,
Krankheitsaktivität, jugendliches Alter und später Zeitpunkt der
Diagnosestellung beeinflussen die subjektive Gesundheit negativ.
In der Behandlung chronisch kranker Kinder- und Jugendlicher in der
pädiatrischen Gastroenterologie ist nicht nur bei Patienten mit
funktionellen Bauchschmerzen oder Ausscheidungsstörung die
interdisziplinäre Zusammenarbeit zwischen Kindergastroenterologie und
Psychosomatik bzw. Kinder- und Jugendpsychologie notwendig. Ein
besonderes Augenmerk muss, neben den Patienten die stark durch
Krankheitsaktivität oder Therapiemaßnahmen eingeschränkt sind, den
übergewichtigen Jugendlichen gelten. Bei Fragebögen müssen Elternund
Selbstbeurteilung beachtet werden, weitere Fremdbeurteilung durch
die behandelnden Ärzte oder Lehrer können hilfreich sein. Neben dem
kurativen Ziel bzw. der Remission muss die Therapie das Ziel haben, eine
möglichst uneingeschränktes alltägliches Leben zu gewährleisen, das
dem gleichaltriger, gesunder Kinder und Jugendlichen entspricht.
Ausgehend von dem sprachsystematischen und entwicklungsorientierten Therapiean-satz nach Reuter-Liehr (1993, 2008) wurde aufbauend auf der Definition der Lauttreue ein Entwicklungsstufenmodell formuliert. Dessen Gültigkeit wurde in der vorliegenden Arbeit an einer Stichprobe von 367 Haupt- und Gymnasialschülern der 5., 6. und 7. Klasse untersucht. Die Überprüfung der Validität erfolgte über zwei Messebenen. Zum einen wurde jede einzel-ne Laut-Buchstabenverbindung als eigenes Item betrachtet. Gemessen wurde, wie viele Laut-Buchstabenverbindungen einer bestimmten Entwicklungsstufe der Schüler korrekt geschrie-ben hat. Zum anderen erfolgte die Entwicklungsstufenanalyse auf Basis der Wortebene über die Auswertung der richtig und falsch geschriebenen Wörter. Hier bestimmt die hierarchie-schwierigste Stelle im Wort, welcher Entwicklungsstufe das Wort zugeordnet wird.
Das Entwicklungsstufenmodell gemäß der Definition der Lauttreue nach Reuter-Liehr hat sich mit Ausnahme einer Subskala ( <ie> am Ende einer Silbe, <ß> zu Beginn der Silbe) auf der Laut-Buchstabenebene als hoch valide erwiesen. Mit Hilfe der Häufigkeit des Vor-kommens des Buchstabens in der deutschen Schriftsprache sowie der Komplexität der Silben-struktur kann der Schwierigkeitsgrad eines Buchstabens oder einer Buchstabenkombination vorhergesagt werden. Eine Zusammenschau der Ergebnisse legt für die Laut-Buchstabenebene ein vierfaktorielles hierarchisches Leistungsprofil nahe, indem zwischen den Grundlegenden Phonemanalytischen Kompetenzen (GPhK), den Fortgeschrittenen Phonemanalytischen Kompetenzen (FPhK) sowie den Regel- und Speicherkompetenzen un-terschieden wird. Das mitsprechbare <ie> sowie das <ß> sind in ihrer Schwierigkeit eher mit den Regel- als mit den Phonemstellen vergleichbar. Die Ergebnisse auf Wortebene sprechen für ein Zwei-Faktoren-Modell, indem zwischen den Phonemanalytischen- (PhK = GPhK + FPhK) und den Fortgeschrittenen Rechtschreibkompetenzen (FRK = RK + SK) unterschieden wird.
Im Hinblick auf die Praxis liegt mit der Testauswertung auf der Laut-Buchstabenebene ein geeignetes Instrument für förderdiagnostische Zwecke vor. Die Entwicklungsstufenanaly-se auf Basis der korrekt und falsch geschriebenen Wörter hat sich als hoch ökonomisches und prognostisch valides Kurzauswertungsverfahren zur Identifikation von basal gestörten Recht-schreibern erwiesen.
Das Ziel meiner Arbeit ist die zuverlässige quantenchemische Beschreibung der Absorptionsspektren von mittelgroßen Molekülen und das Studium von photoaktiven Pigmenten. Nach einer kurzen Einführung in das Thema "elektronisch angeregte Zustände und Photoreaktionen" beschreibe ich die Formalismen, die den verwendeten Rechenmethoden zu Grunde liegen und diskutiere die Anwendbarkeit auf größere Moleküle. Hierbei liegt ein Hauptaugenmerk auf den dichtefunktionaltheoriebasierten Methoden (DFT-Methoden), vor allem auf den Eigenschaften der zeitabhängigen Dichtefunktionaltheorie (engl.: time dependent density functional theory, TDDFT). Anschließend erfolgt eine Zusammenfassung der im Laufe dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse.
Die moderne Quantenchemie befasst sich mit der Anwendung der in den 20er und 30er Jahren des 20. Jahrhunderts entwickelten Quantenmechanik auf chemische Probleme. Zum theoretischen Studium von Molekülen gibt es verschiedene Ansätze. Zum einen gibt es die hochgenauen ab initio Methoden, die Näherungsverfahren zur elektronischen Schrödingergleichung sind. Sie haben den Vorteil systematisch verbesserbar und auf einem sehr soliden theoretischen Gerüst aufgebaut zu sein. Die Genauigkeit der Rechnungen kann die von experimentellen Ergebnissen erreichen, allerdings beschränkt der hohe Rechenaufwand die Anwendung solcher ab initio Methoden auf kleine Moleküle wie Wasser, Methan oder Benzol.
Am anderen Ende des Spektrums der quantenchemischen Methoden sind die "semiempirischen Methoden" angesiedelt. Sie erfordern nur einen sehr geringen Rechenaufwand, wodurch es möglich ist, sehr große Systeme mit mehr als 1000 Atomen zu beschreiben. Allerdings führt der Ansatz, verschiedene Terme der Schrödingergleichung durch an experimentelle Daten gefittete Parameter zu ersetzen, zu einer geringen Genauigkeit und unvorhersehbaren Fehlern. Dies schränkt die standardmäßige Anwendung dieser Methoden stark ein, und eine Verifizierung durch genauere Methoden ist oftmals erforderlich.
Zwischen diesen beiden Polen (hoch genau aber sehr hoher Rechenaufwand und geringer Rechenaufwand, dafür aber ungenau) stehen die auf der Dichtefunktionaltheorie (DFT) basierenden Methoden. Sie zeichnen sich durch eine gute Genauigkeit bei vergleichsweise geringem Rechenaufwand aus. Dadurch hat sich die DFT in den letzten Jahren zur beliebtesten Methode für das Studium mittelgroßer Moleküle mit bis zu 400 Atomen entwickelt. DFT ist eine formal exakte Methode, bei der die berechneten Größen aus der Elektronendichte des Systems abgeleitet werden. Elektronenaustausch- und Korrelationseffekte werden durch Funktionale, den sogenannten Austauschkorrelationsfunktionalen (engl.: exchange correlation functionals, xc-functionals) beschrieben.
Die zeitabhängige Dichtefunktionaltheorie (time dependent DFT, TDDFT) ermöglicht die Beschreibung elektronisch angeregter Zustände mit einer guten Genauigkeit, aber zu einem Bruchteil des Rechenaufwands von ab initio Methoden, was TDDFT zur Methode der Wahl für das Studium der Photochemie mittelgroßer Moleküle macht. Die Fehler in den Anregungsenergien sind in der Regel systematischer Natur und den verwendeten xc-funktionalen geschuldet. Dennoch kann TDDFT nicht als "black box" Methode verwendet werden, da nicht alle elektronischen Zustände gleich gut beschrieben werden. Während energetisch niedrig liegende, lokale π -> π* und n -> π* Zustände oftmals in sehr guter Übereinstimmung mit dem Experiment sind, können Rydberg und Ladungstransferzustände (engl.: charge transfer states, ct-states) Fehler von mehreren Elektronenvolt in der Anregungsenergie haben. Doppelt oder höher angeregte Zustände können mit standard TDDFT Methoden nicht beschrieben werden. Dies kann zu Problemen bei ausgedehnten π-Systemen führen, da z.B. die angeregten Zustände von Polyenen einen hohen Doppelanregungscharakter besitzen. Trotz alledem ist TDDFT eine sinnvolle Methode zum Studium elektronisch angeregter Zustände, da ihre Probleme bekannt sind und vor allem ihr Ursprung in der Theorie gut verstanden ist. Die meisten Probleme können durch die intelligente Wahl der verwendeten xc-Funktionale vermieden werden. Kombiniert man TDDFT mit der Konfigurationswechselwirkungsmethode mit Einfachanregungen (engl.: configuration ineraction singles, CIS) erhält man sehr zuverlässig und mit vergleichbar geringem Rechenaufwand die richtige Energiereihenfolge der angeregten Zustände. Mit dieser Methode war es in dieser Arbeit möglich, die komplexe Photochemie von Bisazomethinpigmenten zu untersuchen und die experimentellen statischen und zeitaufgelösten Spektren auf molekularer Ebene zu interpretieren. Es konnte sowohl der Mechanismus aufgeklärt werden, der für die Fluoreszenzlöschung in den nicht-fluoreszierenden Derivaten verantwortlich ist, als auch die unerwartet komplizierte Photochemie der fluoreszierenden Moleküle schlüssig erklärt werden. Auch die Photoisomerisierung von Z-Hemithioindigo-Hemistilbene (HTI) zu seine E-Form wurde mit dieser Methode untersucht.
In der vorliegenden Arbeit wurde der tageszeitkorrelierte Serotonin-Gehalt des SCO, sowie die Expression der 5-HT1A- und 5-HT2A-Rezeptoren und die Synthese- bzw. Sekretionsleistung des SCO bei Goldhamstern untersucht. Serotonin entfaltet im SCO des Goldhamsters eine inhibitorische Wirkung und hemmt die Sezernierungsrate von Glykoproteinen, die den RF formen. Dies bestätigt die Tatsache, dass mit steigender Rezeptorausprägung die Immunreaktivität für AFRU abnimmt. Ob Serotonin beim Hamster auch auf die Synthese von Glykoproteinen wirkt, muss nachfolgend geklärt werden, da in unserem Versuchsaufbau lediglich die Glykoprotein-Sezernierung untersucht wurde. Aussagen bezüglich der Auswirkung von Serotonin auf die Synthese und Sezernierung von löslichen Komponenten des SCO konnten bei dem von uns verwendeten Versuchsaufbau nicht gemacht werden. Deren mögliche Funktionen bleiben noch fraglich und eröffnen neue Optionen. Geklärt ist nun auch die quantitative Relation von 5-HT1A- und 5-HT2A-Rezeptoren im SCO. Es sind deutlich mehr 5-HT1A-Rezeptoren exprimiert. Dies lässt darauf schließen, dass Serotonin im SCO einen entscheidenden Einfluss auf die Glykoprotein-Synthese oder -Sekretion hat. Die tageszeitkorrelierte Rezeptorausprägung muss diskutiert werden. Sie ist tageszeitkorreliert relativ konstant, fraglich bleibt jedoch, wieso die Rezeptorausprägung im zweiten Abschnitt der Tiefschlafphase der Tiere abnimmt, obwohl hier der serotonerge Input weiterhin hoch sein müsste, um in der Aktivitätsphase wieder abzunehmen. Wahrscheinlich ist die Erklärung hierfür in den Expressionsmechanismen der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren selbst zu finden. Welche Proteine die geschwindigkeitsbestimmenden Faktoren der 5-HT1A- und 5-HT2A-Rezeptorexpression sind, bleibt zu klären und auch ob sich der Verdacht bestätigt, dass die 5-HT1A-Rezeptorausprägung deutlich schneller voran geht als die der 5-HT2A-Rezeptoren und damit mehr 5-HT1A--Rezeptoren zur Prezeption von Serotonin zur Verfügung stehen. Mit dieser tageszeitkorrelierten Ausprägung schützt sich das SCO unter Umständen vor einer völligen Entleerung der Glykoprotein-Speicher unter erheblichem Serotonin-Einfluss während der Schlafphase. Dieser Aspekt und dessen mögliche Folgen müssen weiter untersucht werden. Weiterhin bleibt fraglich, wie die relative Konstanz in der Glykoprotein-Ausschüttung am Tag und in der Nacht etabliert werden kann, da die Serotonin-Ausschüttung der Raphe-Kerne am SCO nachweislich einer periodischen Rhythmik unterworfen ist. Neben dem Nucleus raphe dorsalis und dem Nucleus raphe medianus ist der Einfluss weiterer Aktivitätszentren auf das SCO denkbar. Auch eine Co-Stimulation der ependymalen und hypendymalen SCO-Zellen mit anderen Transmitterklassen ist möglich und teilweise auch bewiesen. Beide genannten Aspekte könnten Teil eines Feedback-Mechanismus sein, der das SCO vor vollständiger Entspeicherung schützt.
Real time 3D - Ultraschallsimulation in der Akutmedizin : Entwicklung einer neuen Technologie
(2011)
In der vorliegenden Arbeit wurde die real time 3D - Ultraschallsimulation für den Einsatz in der Akutmedizin untersucht und weiterentwickelt.
Hintergrund: Die Ultraschallsimulation stellt eine neue Lernmethode für die Ultraschalluntersuchung dar. Es kann die korrekte Anlotung, die Interpretation und die Durchführung der Untersuchung patientenunabhängig trainiert werden. Damit eignet sich die Ultraschallsimulation besonders für den Bereich der Notfallsonographie, da hier aufgrund der akuten Erkrankungen nur eingeschränkte Lehrmöglichkeiten zur Verfügung stehen. Dieses Projekt setzt sich aus vier Teilen zusammen. Es sollten Module zum Training des fokussierten Assessments mit Sonographie bei Traumapatienten (FAST) und der Sonographie peripherer Nerven und Gefäße entwickelt werden. Der dritte Bereich bestand aus der technischen Integration des Ultraschallsimulators in eine herkömmliche ALS-Trainingspuppe, um dann im vierten Abschnitt die Auswirkungen der fokussierten echokardiographischen Evaluation während der Reanimation auf deren Qualität mit dem kombinierten Ultraschall-ALS-Simulator zu überprüfen.
Methodik: Zur Entwicklung der Module für die fokussierte abdominelle Sonographie bei Traumapatienten wurde das Freihandaufnahmesystem des Ultraschallsimulators mit einem high-end Ultraschallgerät gekoppelt. Die 3D-Ultraschallvolumen wurden durch Transversalanlotungen an gesunden Probanden und Patienten mit kontinuierlicher Peritonealdialyse aufgenommen und Multivolumina in einen Schaumstofftorso mithilfe eines elektromagnetischen Trackingsystems positioniert. Die Anwendbarkeit des Ultraschallsimulators wurde jeweils während eines studentischen Ultraschallseminares und eines Ultraschallkurses für Postgraduierte überprüft. Für die Module zum Training der Sonographie peripherer Nerven und Gefäße wurde mit dem oben genannten System Volumen von verschiedenen Körperregionen gesunder Patienten aufgenommen, innerhalb des Torsos positioniert und durch einen erfahrenen Ultraschallanwender mit Originalultraschallaufnahmen verglichen. Zur Integration des Ultraschallsimulators in einen ALS-Simulator musste die elektromagnetische Lokalisationseinheit des Ultraschallsimulators innerhalb des ALS Simulators so positioniert werden, dass Thoraxkompressionen weiterhin problemlos möglich sind und die Funktion des Ultraschallsimulators nicht gestört wird. Für die Überprüfung der Auswirkungen einer fokussierten Echokardiographie auf die Qualität der Reanimation führten in der Studie Rettungsassistenten, Rettungssanitäter und Studenten in 2er Teams jeweils zwei Reanimationsabläufe durch. Der FEEL Algorithmus wurde von einem in FEEL eingewiesenen Notarzt unangekündigt während der CPR angewendet. Die Variablen Eindringtiefe der Thoraxkompressionen, Frequenz der Thoraxkompressionen und das Volumen pro Maskenbeatmung wurden als Güte der CPR angesehen und ausgewertet.
Ergebnisse: Für das Training der FAST Untersuchung konnten mehrere Module mit pathologischen und normalen Sonographiebefunden des Abdomens erstellt und von Studenten sowie Ärzten am Simulator richtig interpretiert werden. Die Entwicklung von nahezu originalgetreuen Aufnahmen peripherer Nerven und Gefäße stellt eine vollkommen neue Methode zum Training der ultraschallgestützten Regionalanästhesie dar. Erstmals wurde ein Ultraschallsimulator in einen ALS-Simulator integriert und evaluiert. Beide Geräte können als Einheit komplikationslos genutzt werden. Bei der Untersuchung der Auswirkungen des FEEL Algorithmus auf die Qualität der Reanimation zeigten sich keine Unterschiede bei den analysierten Variablen.
Schlussfolgerung: Durch das Projekt konnte der Ultraschallsimulator als neue Lernmethode im Bereich der Notfallsonographie weiterentwickelt und etabliert werden. Der Simulator wird nun regelmäßig in Ultraschallkursen für Studenten und Ärzte eingesetzt, ohne das Training am realen Patienten zu ersetzen. Neben der Ausbildung kann der Ultraschallsimulator auch zur Überprüfung der Kenntnisse von Notfallsonographieanwendern im Sinne einer Qualitätssicherung und Re-Zertifizierung genutzt werden. Die Kombination aus ALS- und Ultraschallsimulator eignet sich, um eine ALS-konforme Echokardiographie zu trainieren.
Die 5-Lipoxygenase ist das Schlüsselenzym der Bildung proentzündlicher Leukotriene. Diese Mediatoren sind assoziiert mit Erkrankungen des entzündlichen Formenkreises wie beispielsweise Arteriosklerose [6]. Durch die Veröffentlichungen von Qiu et. al. [248] und Gredmark-Russ et. al. [650] konnte gezeigt werden, dass die Infektion mit humanen Cytomegalovirus in vitro und in vivo zur Induktion der 5-LO in HPASMCs und SMCs (smooth muscle cells) führt. HCMV ist ein ß-Herpesvirus, welches nach einer zumeist asymptomatischen Primärinfektion, dauerhaft im Wirt persisiert und bei Schwächung des Immunsystems oder entzündliche Prozessen reaktiviert werden kann [256]. Geht das Virus in die lytische Replikationsphase über, werden Entzündungsprozesse gefördert, die zur Ausprägung von Krankheitsbildern wie Retinitis, rheumatoider Arthritis oder auch Psoriasis führen. Es besteht demnach ein Zusammenhang zwischen der aktiven HCMV-Infektion und Erkrankungen des entzündlichen Formenkreises, welche unter anderem durch die Induktion der 5-LO vermittelt wurden.
Ziel der Arbeit war es, den molekularen Mechanismus der viral induzierten 5-LO-Promotoraktivierung aufzuklären. Dazu wurde zunächst überprüft, ob die Infektion mit HCMV in HFF, einer Zelllinie die äußerst permissiv für die Infektion ist und daher zumeist als Testsystem für HCMV herangezogen wird, eine verstärkte 5-LO-Expression hervorruft, oder ob es sich um einen zelltypspezifischen Effekt der smooth muscle cells handelt. Es konnte gezeigt werden, dass es nach Infektion zu einer verstärkten Promotoraktivierung, mRNS- sowie Proteinexpression der 5-LO kam (Abb. 19, 23, 24). Weitere Untersuchungen charakterisierten, welches virale Protein die Effektvermittlung bedingte. Aufgrund der sequentiellen Genexpression des Virus unterscheidet man nach Zeitpunkt der Expression in Immediate Early, Early und Late Proteine, wobei letztere erst nach Replikation des viralen Genoms exprimiert werden. Der Zusatz von Foscavir als Replikationsinhibitor verdeutlichte, dass ein Immediate Early oder Early Protein die Induktion hervorruft (Abb. 16). Reportergenassay-Experimente unter Überexpression einzelner viraler Proteine zeigten, dass Immediate Early 1 essentiell an der Erhöhung der 5-LO-Promotoraktivität beteiligt ist (Abb. 18). Weitergehende Versuche unter Verwendung des IE1-Deletionsvirus CR208 bestätigten, dass die Induktion der 5-LO-Promotoraktivität sowie der mRNS-Expression durch dieses virale Protein vermittelt wird (Abb. 18, 20-22). Auf Proteinebene konnte ebenfalls nach IE1-Überexpression beziehungsweise nach Infektion mit HCMV eine erhöhte 5-LO-Expression detektiert werden (Abb. 23 und 24). Aktivitätsuntersuchungen, bei denen die Konzentration der 5-LO-Produkte LTB4 und 5-HETE gemessen wurden, bestätigten, dass das Enzym funktionsfähig ist (Abb. 25). Nach Infektion mit HCMV kommt es demnach zur IE1-vermittelten Induktion der 5-LO auf mRNS- und Proteinebene sowie nachgeordnet zur verstärkten Produktion von inflammatorischen Leukotrienen, die an der Ausbildung der entzündlichen Symptomatik einer lytischen Infektion beteiligt sind.
Immediate Early 1 ist ein potenter Transaktivator, der sowohl virale als auch zelluläre Promotorstrukturen aktivieren kann [387]. Funktionell wird dies reguliert über die Förderung der Transkriptionsfaktor-Expression, aber auch durch Beeinflussung histonmodifizierender Enzyme wie Histondeacetylasen [464]. Für den 5-LO-Promotor ist bekannt, dass dessen Aktivität über Bindung von Sp1, sowie durch HDAC-Inhibition beeinflusst werden kann [9, 171]. Diese beiden Regulationsmechanismen stellen demnach mögliche Verknüpfungspunkte in der viral induzierten Induktion des 5-LO-Promotors dar. Zunächst wurde die Expression von Transkriptionsfaktoren, welche charakterisierte Bindungsstellen im 5-LO-Promotor besitzen, nach IE1-Überexpression untersucht. Es zeigte sich, dass der zelluläre Sp1-mRNS-Spiegel durch IE1 80fach induziert werden kann (Abb. 27). Im Reportergenassay mit 5-LO-Promotordeletionskonstrukten, bei denen gezielt einzelne Sp1-Bindungsstellen, sogenannte GC-Boxen, mutiert wurden, konnte bestätigt werden, dass die IE1-vermittelte Induktion essentiell von Sp1-abhängt, da die Mutation der GC4-Box die Aktivierung nahezu komplett inhibiert (Abb. 30, 31). Auch der Zusatz von Mithramycin, einem DNS-Interkalator, welcher die Bindung von Sp1 an die DNS unterdrückt, ist in der Lage die Induktion abzuschwächen (Abb. 33) [651]. Um die direkte Sp1-Bindung an den 5-LO-Promotor nachzuweisen wurden sowohl EMSA- als auch ChIP-Experimente durchgeführt. Es zeigte sich, dass in vitro und in vivo die Sp1-Bindung an den proximalen 5-LO-Promotor nach IE1-Überexpression beziehungsweise nach Infektion zunimmt (Abb. 49, 50). Interessanterweise wird dieser Effekt nicht durch Immediate Early 2, einer Spleißvariante von IE1, welche eine große strukturelle Ähnlichkeit aufweist, hervorgerufen. Da Veröffentlichungen gezeigt haben, dass beide Immediate Early Proteine in der Lage sind, Sp1 auf mRNS-Level zu induzieren, muss ein weiterer regulatorischer Mechanismus in die Sp1-Promotorbindung involviert sein [410]. In Co-Immunopräzipitations Versuchen zeigten beide IEPs eine Interaktion mit Sp1 (Abb. 38), wonach der Unterschied in der transaktivierenden Fähigkeit des 5-LO-Promotors nicht durch Protein-Protein-Bindung mit Sp1 bedingt wird. Strukturell unterscheiden sich die beiden Proteine in ihrer carboxyterminalen Sequenz. Für IE1 ist hier eine intrinsische Kinaseaktivität beschrieben, die zur Autophosphorylierung, aber auch zur Phosphorylierung von Bindungsproteinen führen kann. Western Blot Analysen auf den zellulären phospho-Sp1-Gehalt nach viraler Überexpression konnten zeigen, dass IE1, nicht aber IE2 die posttranslationale Modifikation des Transkriptionsfaktors fördert (Abb. 39). Auch die Testung viraler Deletionsmutanten, denen einzelne Exons beziehungsweise die ATP-Bindungsstelle der Kinasedomäne fehlen, bestätigten die Schlüsselfunktion dieses Strukturelements (Abb. 37). Ob es sich um eine direkte oder indirekte Phosphorylierung von Sp1 durch IE1 handelt wurde durch in vitro Kinase-Assays und die Testung unterschiedlicher Proteinkinase-Inhibitoren bestimmt (Abb. 40, 42, 45). Obwohl die beiden Proteine miteinander interagieren können, kam es nicht zu einer direkten Phosphorylierung, sondern zelluläre Kinasen wie Tyrosinkinasen und nachgeordnet die Mitglieder des MAPK-Signalweges sind in die Phosphorylierung von Sp1 involviert. Die finale Bestätigung der essentiellen Funktion von Sp1 in der IE1-vermittelten Aktivierung des 5-LO-Promotors lieferte ein Reportergenassay-Experiment mit Sp1-Knock-down Zellen, welche nach viraler Überexpression keine 5-LO-Promotoraktivität und mRNS-Expression mehr zeigten (Abb. 47, 48). Für die Vermittlung der IE1-induzierten 5-LO-Promotoraktivierung sind dessen transaktivatorische Fähigkeiten demnach essentiell, durch Erhöhung der Sp1-mRNS-Expression und nachfolgender Phosphorylierung wird die DNS-Bindung des Transkriptionsfaktors an die GC4-Box des 5-LO-Promotors erhöht und dieser damit transkriptionell aktiviert.
Neben der Regulation über verstärkte phospho-Sp1-Bindung an die GC4-Box Region muss die Induktion von 5-LO durch IE1 noch über weitere Interaktionen vermittelt werden, da die reine Sp1-Überexpression ohne IE1 keine Promotoraktivierung hervorrufen konnte (Abb. 34). Überprüft wurde daher die HDAC-inhibitorische Fähigkeit von IE1, da der 5-LO-Promotor über diese epigenetischen Mechanismen reguliert werden kann. Pull-down-Experimente zeigten zunächst eine Protein-Protein-Interaktion zwischen IE1 und HDAC1/2/3 (Abb. 51). Nachfolgend konnte in einem HDAC-Aktivitätsassay gezeigt werden, dass diese Interaktion die Enzymaktivität der HDACs drastisch reduziert (Abb. 52). Durch HDAC-Inhibition liegen Promotorstrukturen zunehmend acetyliert vor und sind damit transkriptionell aktiv. Für den funktionellen Nachweis auf den 5-LO-Promotor diente ein Reportergenassay-Experiment in dem IE1 und in steigenden Mengen HDAC überexprimiert wurde (Abb. 53). Die Überexpression von HDAC1 und HDAC3 konnten den aktivierenden Einfluss von IE1 auf den 5-LO-Promotor teilweise konzentrationsabhängig revertieren und scheinen damit an der Effektvermittlung beteiligt zu sein. Die Charakterisierung der HDAC-vermittelten 5-LO-Promotorregulation von Pufahl et. al. bestätigte durch Knock-down Experimente, dass HDAC3 entscheidenden Einfluss auf den 5-LO-Promotor hat [172]. HDAC1 dagegen reguliert über die verstärkte Deacetylierung von Sp1 dessen DNS-Bindungsaffinität. Eine Hemmung dieser beiden Histondeacetylasen durch das virale Protein erhöht damit die Aktivität des 5-LO-Promotors.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Ziel der Arbeit erreicht wurde und ein detaillierter Mechanismus der 5-LO-Promotoraktivierung durch HCMV aufgeklärt wurde. Immediate Early 1 induziert dabei zunächst die Expression und Phosphorylierung von Sp1. Ebenso interagiert das virale Protein mit HDAC1/2/3 und hemmt deren Aktivität, wodurch es zur Öffnung der 5-LO-Promotorstruktur kommt. Entscheiden ist hierbei vor allem die Hemmung von HDAC3. HDAC1 Inhibition sorgt im getesteten Zellsystem zusätzlich für verstärkte Acetylierung des Transkripti-onsfaktors Sp1, welcher aufgrund der dadurch erhöhten DNS-Bindungsaffinität an die GC4-Box-Region binden und so die Transkription fördern kann. Interessanterweise ist die Bindung an andere beschriebene GC-Boxen des 5-LO-Promotors nicht induktiv, was die Annahme nahelegt, dass nicht Sp1 alleine, sondern ein transaktivatorischer Komplex an diese Region bindet. Die Aktivierung des Promotors führt nachfolgend zur mRNS- und Proteinexpression, welche eine verstärkte Leukotrienbildung zur Folge hat. Diese Mediatoren sind in die Entstehung der entzündlichen Charakteristik einer aktiven HCMV involviert. Das Virus macht sich demnach generelle Prinzipien der Transaktivierung zu Nutze und fördert so zum einen seine Reaktivierung aus der Latenz, zum anderen die produktive Verbreitung der Infektion.
Nukleäre Rezeptoren regulieren eine Vielzahl von Genen durch Bindung an bestimmte DNA-Sequenzen im Promotor dieser Gene. Sie fungieren als Transkriptionsfaktoren, die nach Bindung ihres Ligandendie Transkription aktivieren oder supprimieren. In ihrer Funktion werden sie weiterhin durch verschiedene Signale moduliert, beispielsweise durch posttranslationale Veränderungen. Aufgrund der Möglichkeit, durch Liganden, in der Regel kleine lipophile Moleküle, die Aktivität nukleärer Rezeptoren und in der Folge die Transkription definierter Gene zu beeinflussen, sind nukleäre Rezeptoren gute Zielstrukturen für Arzneistoffe und stehen im Zentrum intensiver Forschungsbemühungen. ROR alpha und RevErb alpha sind nukleäre Rezeptoren aus der Gruppe der sogenannten Orphan-Rezeptoren. Die Angehörigen dieser Gruppe wurden als Waisen bezeichnet, da ihr Ligand zum Zeitpunkt ihrer Charakterisierung unbekannt war. 2007 gelang es zwei Gruppen unabhängig voneinander Häm als den Liganden des RevErb alpha zu identifizieren, für ROR alpha werden verschiedene potentielle Liganden diskutiert, wobei bisher keiner allgemein anerkannt wurde. ROR alpha und RevErb alpha steuern die Expression ihrer Zielgene über ein gemeinsames Response-Element, wobei ROR alpha die Expression dieser Gene aktiviert und RevErb alpha sie inhibiert. Gemeinsam nehmen sie eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung zirkadianer Rhythmen und an der Integration dieser in metabolische Prozesse ein. ROR alpha ist weiterhin beteiligt an der Reifung der Cerebellums sowie an der Steuerung der Immunabwehr. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Regulation der beiden Rezeptoren auf molekularer Ebene aufzuklären. Hierfür wurden Untersuchungen auf Ebene der Transkription ebenso wie auf posttranslationaler Ebene durchgeführt. Es zeigte sich, dass ROR alpha - hnRNA in vitro extrem stabile Sekundärstrukturen ausbildet und somit bei der reversen Transkription den Transkriptionsstart selbst initiieren kann. Im Zuge der durchgeführten Untersuchungen konnte nicht nachgewiesen werden, welche Auswirkung diese Sekundärstrukturen in vivo zeigen. Studien anderer Gruppen hatten aber gezeigt, dass die Ausbildung von RNA-Doppelsträngen an vielen Stellen in die Regulationen von Genen eingreift, sei es durch Veränderungen des Spleißmusters, RNA-Editierung oder durch Herabregulierung der Transkriptmenge. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass sowohl RevErb alpha als auch ROR alpha einer intensiven Regulation durch posttranslationale Veränderungen unterliegen, im Speziellen durch Phosphorylierung. Vorangegangene Studien hatten Hinweisegeliefert, dass ROR alpha durch ERK-2 phosphoryliert werden kann. In meinen Studien war ich in der Lage nachzuweisen, dass auch RevErb alpha Ziel dieser Kinase ist. Im Gegensatz zu ROR alpha wird RevErb alpha jedoch gleichzeitig an mehreren Stellen phosphoryliert, wobei die physiologische Funktion dieser Phosphorylierungen Gegenstand weiterer Untersuchungen ist. Die Aktivität von ROR alpha am Response-Element wird durch eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels stark stimuliert. Im Zuge meiner Untersuchungen konnte eine Beteiligung sowohl des cAMP-Response-Elementbindenden Proteins CREBals auch des PPAR gamma - Coaktivators 1a an der Vermittlung dieser Aktivitätssteigerung ausgeschlossen werden. Es zeigte sich jedoch, dass der Effekt durch eine Hemmung der Proteinkinase A dosisabhängig aufgehoben werden konnte. In weiteren Untersuchen konnte ich eine direkte Phosphorylierung von ROR alpha, nicht aber von RevErb alpha durch PKA nachweisen und die Phosphorylierungsstelle als Serin 99 des ROR alpha 4 identifizieren. Da eine Mutation der in der C-terminalen Verlängerung der DNA-bindenden Domäne des Rezeptors gelegenen Aminosäure jedoch nicht in der Lage war, die Aktivitätssteigerung zu verhindern, sind auch noch weitere Faktoren, vermutlich zelluläre Coaktivatoren an deren Vermittlung beteiligt. Bereits in früheren Untersuchungen war beschrieben worden, dass die Aktivität von ROR alpha durch eine Erhöhung des intrazellulären Calciumspiegels stark stimuliert wird. Weiterhin fanden sich Hinweise, dass die Calcium/-Calmodulin-abhängige Kinase IV an der Vermittlung dieser Stimulation beteiligt ist, jedoch ohne direkte Phosphorylierung von ROR alpha durch CaMKIV. Es konnte allerdings nicht aufgeklärt werden, über welchen Mechanismus die Signaltransduktion stattdessen erfolgt. In meinen Untersuchungen konnte ich zeigen, dass eine Inhibition durch Proteinkinase A aktivierter Signalwege auch die Aktivierung von ROR alpha durch CaMKIV dosisabhängig hemmte. Zusammengenommen lieferten meine Untersuchungen weitere Hinweise auf eine wichtige Rolle von ROR alpha in der Regulation metabolischer Prozesse wie des Glycogen- und Lipidstoffwechsels. Außerdem deuten meine Ergebnisse auf eine Verknüpfung der Signalwege von CaMKIV und Proteinkinase A hin und etablieren ROR alpha als gemeinsame Zielstruktur
Die Bildung aller Blutzellen ist ein vielschichtiger Prozess aus Proliferation und Differenzierung der pluripotenten Stammzellen. Die Regulation der hämatopoietischen Differenzierung wird unter anderem durch ein Zusammenspiel von zelltypspezifischen Transkriptionsfaktoren gewährleistet (Barreda & Belosevic, 2001). Der Transkriptionsfaktor RUNX1 spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von hämatopoietischen Stammzellen und eine funktionelle Veränderung von RUNX1 führt zur Ausbildung von Leukämien. In humanen Leukämien ist RUNX1 ein häufiges Ziel von chromosomalen Translokationen. Außerdem ist die Haploinsuffizienz von RUNX1 beim Menschen ursächlich für familiäre Thrombozytopenien (FPD) mit reduzierten Thrombozytenzahlen (Luddy et al., 1978; Gerrard et al., 1991). Ein knock out von RUNX1 in adulten Mäusen zu einem Defekt in der Megakaryozytendifferenzierung und zu Myelodysplasien (Growney et al., 2005; Ichikawa et al., 2004). Die Funktion von RUNX1 wird unter anderem durch die Interaktion mit anderen Transkriptionsfaktoren und Cofaktoren reguliert. Dabei kann RUNX1 die Expression von Zielgenen aktivieren oder reprimieren, abhängig davon welche Cofaktoren rekrutiert werden. Die Rekrutierung von Chromatin-modifizierenden Cofaktoren durch RUNX1 führt zur Veränderung der Chromatinstruktur und leitet epigenetische Regulationsprozesse ein. Bekannte Histon-modifizierende Interaktionspartner von RUNX1 sind p300 und HDAC1. p300 besitzt Histon-Aceyltransferase-Aktivität und führt zur Ausbildung offener Chromatinstrukturen, welche dann Transkriptionsfaktoren erlaubt an die DNA zu binden und somit zur Aktivierung der Expression von Zielgenen beiträgt (Vogelauer et al., 2000). Der Gegenspieler von Acetyltransferasen sind Histon Deacetylasen (z.B. HDAC1), welche Acetylgruppen entfernen und somit reprimierend auf die Genexpression wirken (Berger, 2007). Bestimmte Zelltypen unterscheiden sich stark voneinander trotz eines gemeinsamen genetischen Codes. Die Expression von zelllinienspezifischen Genen muss daher zelltypspezifisch kontrolliert werden. Dies geschieht durch epigenetische Regulationsvorgänge, welche stammzell-spezifische Gene abschalten, wohingegen zelllinienspezifische Gene angeschaltet werden. Neben der Acetylierung von Histonen ist die Methylierung eine häufige posttranslationale Modifikation, die im Histone Code eine wichtige Rolle spielt. Diese Histonmarkierung wird von Methyltransferasen katalysiert. Die epigenetische Regulation von RUNX1-Zielgenen während der Differenzierung von Vorläufer-/Stammzellen wurde bislang noch nicht näher aufgeklärt. Aus diesem Grund sollten neue Interaktionspartner von RUNX1 mit epigenetischer Funktion identifiziert werden. In dieser Arbeit konnte eine Interaktion von RUNX1 mit der Protein Arginin Methyltransferase 6 (PRMT6) gezeigt werden. Expressionsanalysen wiesen eine Expression von RUNX1 und PRMT6 in Stamm-/Vorläuferzellen nach. Während der Megakaryozytendifferenzierung verhielt sich das Expressionsmuster von PRMT6 gegensätzlich zu der RUNX1-Expression. Zur Überprüfung der Auswirkung von PRMT6 auf die Megakaryozytendifferenzierung, wurden ein knock down sowie eine Überexpression von PRMT6 durchgeführt. Die veränderte CD41-Expression einer Beeinflussung des PRMT6-Levels deutet auf einen reprimierenden Effekt von PRMT6 auf die Megakaryopoiese hin. Das daran anschließende Ziel bestand in dem Nachweis der kooperativen Regulation von differenzierungsspezifischen Genen durch PRMT6 und RUNX1. PRMT6 konnte als Teil eines RUNX1-Corepressorkomplexes mit Sin3a und HDAC1 auf dem Promotorbereich von RUNX1-Zielgenen in hämatopoietischen Vorläuferzellen nachgewiesen werden. Ein in vitro Methyltransferaseassay lieferte Hinweise darauf, dass RUNX1 am Arginin 307 von PRMT6 methyliert wird, was zu einer verstärkten Interaktion beider Faktoren, einer verminderten Aktivierungsfähigkeit und einer erhöhten DNA-Bindungskapazität von RUNX1 führt. Außerdem konnte eine Methylierung des H3R2 am Promotor von megakaryozytären Genen durch PRMT6 gezeigt werden, welche die Bindung des WDR5/MLL-Komplexes an die H3K4me2 Markierung verhindert und somit eine Trimethylierung von H3K4 inhibiert (Hyllus et al., 2007). Auf dem Promotorbereich ist neben den reprimierenden Histonmodifikationen H3R2me2 und H3K27me3 die aktivierende H3K4me2+/me3-Histonmodifikation, sowie die initiierende RNA-Polymerase II vorhanden. Die Gene befinden sich in einem Zwischenzustand (intermediary state) und werden basal transkribiert. Während der Differenzierung in Richtung Megakaryozyten konnte ein Austausch des Corepressorkomplexes gegen einen Coaktivatorkomplex mit p300, PCAF, WDR5, PRMT1 und GATA1/FOG1 beobachtet werden. Ein Verlust von PRMT6 führte zu einer Verringerung der H3R2me2 Markierung. Dadurch konnte WDR5 an den Promotor binden und die H3K4-Trimethylierung wurde durch den WDR5/MLL-Komplex katalysiert. Zusätzlich konnte eine Acetylierung des Promotorbereiches und die Belegung des Promotorbereiches mit der elongierenden RNA-Polymerase II, phosphoryliert am Serin 2, nachgewiesen werden, was zur Induktion der Expression der megakaryozytären Gene führte. Zusammenfassend konnte PRMT6 als neuer Interaktionspartner von RUNX1 identifiziert werden, welcher durch die H3R2-Methylierung differenzierungsspezifische Gene in einem Zwischenzustand hält und reprimierend auf die Megakaryozytendifferenzierung wirkt. Die Expression der intermediary state Gene kann während der Differenzierung schnell aktiviert werden. Zusätzlich konnte eine Methylierung von RUNX1 durch PRMT6 gezeigt werden.
In der vorliegenden Dissertation stand die Aufklärung der Funktion und Regulation von p21 in der Mitose im Mittelpunkt. p21 ist als Cdk-Inhibitor und Schlüsselregulator bekannt, der in viele fundamentale zelluläre Prozesse involviert ist: Zellzyklusregulation, Apoptose, Seneszenz, Zellmigration und Dynamik des Zytoskeletts, Transkription, Differenzierung sowie DNA-Reparatur, aber auch in die Umprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen (Besson et al. 2008; Abbas und Dutta 2009; Jung et al. 2010).
Die unkontrollierte Proliferation von Zellen ist mit der Tumorgenese assoziiert und wird unter anderem durch die Fehlregulation von p21, aber auch durch die wichtigen mitotischen Kinasen Cdk1, im Komplex mit ihrer regulatorischen Untereinheit Cyclin B1, sowie Plk1 bedingt. Zudem ist das Fehlen von p21 oder die Fehllokalisation in das Zytoplasma mit einer schlechteren Prognose für den Patienten und Chemotherapie-Resistenz von Tumoren verbunden (Abukhdeir und Park 2008). Aufgrund der zunehmenden Inzidenz und Mortalität von Krebserkrankungen ist es daher von besonderem klinischem Interesse, die molekularen Ursachen für die Entstehung maligner Tumorerkrankungen aufzuklären. Bislang existieren kaum Studien über welche molekularen Mechanismen die Funktionen von p21, dem wichtigsten Cdk-Inhibitor, der zum Beispiel durch die Anwendung niedermolekularer Inhibitoren wie BI 2536, das sich bereits in klinischen Phase II Studien befindet (Strebhardt 2010), beeinflusst wird, während der Mitose reguliert werden.
In der vorliegenden Dissertation wurde daher die physiologische Rolle des Cdk-Inhibitors bzw. Regulators p21 während der Mitose untersucht und mit der Kinaseaktivität von Cdk1/Cyclin B1, wie auch Plk1 korreliert. Es konnte gezeigt werden, dass p21 während der Mitose stark exprimiert wird und dass mitotisches p21 in verschiedenen Krebszelllinien unabhängig von dem p53-Status in einer phosphorylierten Form vorkommt, welche mit der Aktivität von Cdk1 und weniger mit der von Cdk2 assoziiert ist. Durch Untersuchungen der isogenen HCT116-Zelllinien mit und ohne p21 wurde aufgezeigt, wie wichtig p21 für den ordnungsgemäßen Ablauf der Mitose ist. Ohne p21 sind sowohl die Anaphase wie auch die Zytokinese verlängert, die Zellen ordnen die Chromosomen fehlerhaft in der Metaphaseplatte an (congression Fehler), besitzen weitaus mehr lagging Chromosomen und fast 20 % der Zellen weisen im Versuchsverlauf Polyploidie auf. Durch den Verlust des Cdk-Regulators p21 kommt es zur Fehlregulation von Cdk1 und seiner Substrate (wie MCAK) und es treten die oben beschriebenen Probleme auf.
Weiterhin phosphoryliert Cdk1/Cyclin B1 p21 an Ser-130 in vitro und ex vivo in der frühen Phase der Mitose, der Prophase bzw. Prometaphase. Die nicht phosphorylierbare p21 Form S130A befindet sich hauptsächlich im Zellkern und führt zu vermehrtem Auftreten von congression Fehlern, während die S130D-Mutante, die die Phosphorylierung durch Cdk1 vortäuscht, schneller degradiert wird und zudem den Phänotyp der HCT116 p21-/- Zellen verstärkt. Zellen, die S130D exprimieren, benötigen mehr Zeit für das Durchlaufen der Mitose. Hier ist vor allem die Metaphase stark verlängert, aber auch Anaphase und Zytokinese. Dies führt zu congression Fehlern und zu Polyploidie. Diese Ergebnisse bestätigen, wie wichtig die zeitlich korrekte Phosphorylierung von p21 und die dadurch vermittelte Aktivierung von Cdk1/Cyclin B1 ist.
Darüber hinaus stabilisiert die Suppression von Plk1 das p21 Protein, was darauf hinweist, dass die Degradation von p21 während der Prometaphase von Plk1 kontrolliert wird. Dies wird von der Tatsache unterstützt, dass Ser-114, wie auch Ser116 von Plk1 in vitro phosphoryliert wird. Die Deregulation von p21 durch Plk1, SS114/116AA bzw. SS114/116DD induziert Chromosomenfehler, wodurch die molekularen Mechanismen, warum fehlreguliertes Plk1 die Tumorgenese fördert, hervorgehoben werden.
Nach Abschluss der bisherigen Untersuchungen steht fest, dass man sich von der starren Rolle von p21 als Tumorsuppressor und Akteur während der G1/S-Phase lösen muss. Der Cdk-Inhibitor p21 trägt entscheidend zur mitotischen Progression bei, vor allem bedingt durch die zeitlich ordnungsgemäße Inaktivierung bzw. Aktivierung von Cdk1/Cyclin B1, der Kinase, die wiederum zahlreiche für die Mitose essentielle Proteine reguliert. In Zukunft muss zum besseren Verständnis der Rolle von p21 in der Mitose die genaue Abfolge der Ereignisse unter Einbeziehung der Degradationsmechanismen eingehender untersucht werden.
Das Gleichgewicht zwischen den Sphingolipiden Ceramid und Sphingosin-1-Phosphat (S1P) spielt eine entscheidende Rolle für das Schicksal einer Zelle. Es ist bekannt, dass Ceramid proapoptotisch wirkt, wohingegen S1P antiapoptotische und entzündungshemmende Signalwege induziert [6]. Eine Beeinflussung der Sphingolipid-metabolisierenden Enzyme sowie eine daraus resultierende gestörte Balance zwischen Ceramid und S1P ist somit ein Merkmal diverser entzündlicher Krankheiten wie der Asthma bronchiale, der Colitis ulcerosa [148] oder auch verschiedenen Arten von Tumoren [199]. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung der Ceramid-abbauenden neutralen Ceramidase (NCDase) und der S1P-synthetisierenden Sphingosinkinase 1 (SK1) in verschiedenen Nierenzellen. Ein Fokus wurde dabei auf die Regulierung dieser Enzyme durch entzündungshemmende Corticosteroide in Ratten Mesangiumzellen gelegt, wobei diese Zellen entscheidend in der Entstehung entzündlicher Nierenerkrankungen wie einer Glomerulonephritis sind. Weiterhin wurde der Einfluss der Mutation putativer Phosphorylierungsstellen der NCDase auf die Regulierung dieses Enzyms in HEK293 Zellen untersucht und in einem dritten Teil der Arbeit schließlich die Expression und die Funktion der SK1 in der humanen Niere im Vergleich zum Nierenzellkarzinom analysiert.
Es konnte gezeigt werden, dass Glucocorticoide (GCs) Mesangiumzellen durch eine Steigerung der intrazellulären S1P-Konzentrationen vor durch Stress induzierter Apoptose schützen. Diese Beeinflussung des Sphingolipid-Rheostats beruhte auf einer gesteigerten mRNA- und Proteinexpression der Sphingosinkinase 1 (SK1) und der neutralen Ceramidase (NCDase). Außerdem wurde nachgewiesen, dass der Promotor der NCDase durch GCs aktivierbar ist und dass zwei Glucocorticoid-responsive-Elemente (GREs) innerhalb der Promotorsequenz durch die Bindung von Glucocorticoidrezeptoren (GRs) diese Aktivierung bewirken. In vivo Experimente mit isolierten Glomeruli, die aus mit Dexamethason behandelten Mäusen gewonnen wurden, zeigten ebenfalls eine Erhöhung der mRNA-Expression und Aktivität der SK1 sowie eine gesteigerte Proteinexpression der NCDase. Somit wurde erstmals ein direkter Einfluss von GCs auf den Sphingolipidmetabolismus in Mesangiumzellen beschrieben.
In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine Mutation zweier putativer Proteinkinase C (PKC)-Phosphorylierungsstellen (T253A und T420/23A) in der Sequenz der murinen NCDase zu einem verlangsamten Reifungsprozess dieses Enzyms führt. Western Blot-Analysen ergaben, dass der überexprimierte NCDase-WT zwei unterschiedlich glykosylierte Isoformen mit einem Molekulargewicht von 120 und 130 kDa exprimiert, welche stetig durch einen aktiven Prozess sezerniert werden. Im Gegensatz dazu war in den Mutanten ausschließlich die 130 kDa-Form im Zellkulturüberstand und die 120 kDa-Form im Lysat zu finden. Im Gegensatz zum WT lokalisierten die Mutanten lediglich an intrazellulären Membranen und nicht zusätzlich an der Plasmamembran. In Lysaten von Zellen die die Mutanten exprimierten, konnte eine verringerte relative Aktivität gemessen werden, die der sezernierten mutierten Formen hingegen war erhöht. Daher wurde vermutet, dass die 130 kDa-Form die reife Plasmamembran-gebundene und anschließend sezernierte, aktivere Isoform der NCDase darstellt. Die Inkubation von Mesangiumzellen mit Zellkulturüberständen, die den sezernierten NCDase-WT enthielten, führte zum Schutz vor durch Stress induzierter Apoptose. Somit kann eine auto- bzw. parakrine Funktion der sezernierten NCDase angenommen werden.
Dem dritten Teil der Arbeit lag die erstmalige Beschreibung der SK1-Expression in der gesunden humanen Niere zugrunde. Es konnte gezeigt werden, dass diese im Zytoplasma sowie an Membranen von Zellen des proximalen Tubulus sowie in geringerem Maße in Podozyten und Mesangiumzellen des Glomerulus exprimiert wird. Im Gegensatz dazu wurde die SK1 in Biopsien von Patienten mit Nierentumor im Nukleus gefunden. Die Untersuchung der SK1-Expression in 5 verschiedenen Nierentumorzelllinien im Vergleich zu Epithelzellen des proximalen Tubulus (Human Kidney 2 - HK2-Zellen) ergaben, dass sowohl die Protein- als auch die mRNA-Expression der SK1 in Föhn-Zellen stark erhöht, in ACHN3-Zellen hingegen signifikant niedriger war. Zudem konnte auch in den Föhn-Zellen eine nukleäre Expression der SK1 nachgewiesen werden. Die Behandlung von HK2-, ACHN3- und Föhn-Zellen mit dem Transforming Growth Factor-ß2 (TGF-ß2) resultierte in einer transkriptionellen Steigerung der SK1-Expression. Die Herunterregulierung der SK1 in diesen Zellen führte zu einem Arrest der Zellen in der S Phase, wohingegen die Überexpression der SK1 in den ACHN3-Zellen zu einem signifikanten Schutz vor Apoptose führte.
Zusammenfassend sind die Sphingolipid-metabolisierenden Enzyme NCDase und SK-1 ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt zur Behandlung von Krankheiten, die mit pathologischen Prozessen wie Entzündung, Apoptose und Proliferation einhergehen, wie es bei Glomerulonephritiden und bei Nierentumoren der Fall ist.
Die vorliegende Studie untersucht elf PatientInnen mit manischen Episoden in der Vorgeschichte. Keiner war bisher wegen einer depressiven Episode stationär behandelt worden (ICD 10 F31.8). Der Untersuchungszeitpunkt liegt im krankheitsfreien Intervall. Dieser psychiatrischen Gruppe gegenübergestellt werden 11 bzw. 22 stationäre, somatisch erkrankte PatientInnen (gematcht nach Alter und Geschlecht). Als Meßinstrumente dienen das idiografische Verfahren der Repertory Grid-Technik und der standardisierte Gießen-Test, zusätzlich ein halbstandardisiertes Interview zur Erfassung der anamnestischen Daten.
Mit dem Gruppenvergleich und dem hypothesengenerierenden Ansatz aus den Kasuistiken werden für das Selbstkonzept und die interpersonelle Bewältigung der Erkrankung bedeutsame Persönlichkeitsdimensionen erfasst. In der Literatur ist der „Typus manicus“ (V. ZERSSEN, 1986, HECHT ET AL, 1997), die hypomanische Grundstimmung und der Bezug auf soziale Normen und Konventionen (KRÖBER, 1988) beschrieben.
SAUER, RICHTER ET AL (1997) erarbeiteten einen höheren Wert für Extraversion und geringere Rigidität bei manisch Erkrankten gegenüber unipolar Depressiven, aber mehr Rigidität und Isolationstendenz und weniger Normorientiertheit als bei Gesunden. Ebenso werden Bipolar I Erkrankten mehr Persönlichkeitsanteile, wie emotionale Stärke/Stabilität, Gelassenheit, Selbstvertrauen, Ich-Kontrolle, aber auch mehr hysterische Züge und Neurotizismus als psychisch Gesunden zugeschrieben (SOLOMON ET AL., 1996).
Unter Berücksichtigung dieser Ergebnisse aus der Literatur wird angenommen, dass sich die unipolar manischen PatientInnen durch verschiedene Persönlichkeitsdimensionen und auffällige interpersonelle Objektbeziehungen von der somatisch erkrankten Gruppe unterscheiden. Es werden prägnant mehr und häufiger Charakterzüge des „Typus manicus“ (höheres Selbstwertgefühl, unabhängig, unkonventionell, geringere Normorientiertheit, phantasievoll, leichtfertig, extravertiert) in der psychiatrischen Gruppe vermutet. Ebenso wird ein idealisiertes, hochambivalentes Vaterbild erwartet, als Zeichen des eher väterlichen Über-Ichs (MENTZOS, 1995). Darüber hinaus wird eine problematische Paarbeziehung zur Stabilisierung der eigenen intrapsychischen Anteile erwartet. Auf der Basis eines objektbeziehungstheoretischen Modells der Depression und Manie wird ein dynamischer Zusammenhang zwischen der Regulation des Selbstwertgefühls und den interpersonellen Beziehungsmustern postuliert.
Um das Selbstwertgefühl zu erfassen, werden in der Repertory Grid-Technik die Selbstelemente (Selbst, Ideal-Selbst, normatives Selbst) vorgegeben. Zur Beurteilung der Objektbeziehungen werden die Elemente Mutter, Vater und PartnerIn hinzugefügt. Die gleichen Selbst- und Fremdbilder werden mit dem Gießen-Test erfragt. Das Konstruktsystem der psychiatrischen PatientInnen ist weder eingeengt noch zeigt es eine Denkstörung. Der Aufbau, untersucht an der Verteilung auf die Hauptkomponenten, ist vergleichbar mit dem der Kontrollgruppe.
Deutlich wird ein höheres Selbstwertgefühl in der psychiatrischen Gruppe gegenüber der somatischen Kontrollgruppe durch eine geringere mittlere Distanz zwischen dem Selbst und Ideal-Selbst in der Repertory Grid-Technik. Es kann ein relativ hohes Selbstwertgefühl einer zum Befragungszeitpunkt symptomfreien Gruppe zugeordnet werden. Dies kann aber nicht durch die mittlere Distanz zwischen Selbst und normativem Selbst gestützt werden. In den Einzelfällen zeigt keine ProbandIn ein niedriges, neun ein normales und zwei ein hohes Selbstwertgefühl. Dieses zu den Charakterzügen des „Typus manicus“ passende höhere Selbstwertgefühl lässt sich durch den Gießen-Test nicht bestätigen. Die erwartete hypomanischere Grundstimmung der untersuchten Gruppe bestätigt sich nicht. Im Gegenteil, die psychiatrischen ProbandInnen schätzen sich depressiver ein als die Kontrollgruppe.
Die Eigenschaften „unkonventionell“ und „weniger Normorientiertheit“ lassen sich durch eine größere mittlere Distanz in der Repertory Grid-Technik zwischen Ideal-Selbst und normativem Selbst beweisen. Dies zeigt sich auch im Gießen-Test. Leider sind insgesamt im Mittel keine prägnanten Ergebnisse, sondern nur Tendenzen zu erkennen. Die Hypothesen zum Selbstwertgefühl lassen sich in der Repertory Grid-Technik lediglich durch Tendenzen bestätigen, die sich im Gießen-Test nicht zeigen. Aber es wird zum ersten Mal für ein zur Zeit symptomfreies Kollektiv ein relativ hohes Selbstwertgefühl im Repertory Grid nachgewiesen. Bei der Betrachtung der Objektbeziehungen fällt eine große Varianzaufklärung des phasenspezifischen Selbst unter den manisch Erkrankten in Repertory Grid-Technik auf. Andere Elemente werden dadurch schwer interpretierbar. Wichtige Bezugspersonen scheinen außer den Eltern FreundInnen und Bekannte zu sein. Die Mutter wird am häufigsten als Konfliktperson genannt.
Die mittleren Distanzen zwischen den Selbstelementen und den Eltern im Repertory Grid zeigen eine größere Nähe zum Vater. Dies deutet auf ein eher väterliches Introjekt, bei hochambivalenter Beziehung (Distanz Ideal-Selbst zum Vater entweder auffällig klein oder auffällig groß). Durch den Gießen-Test bestätigt sich die größere Nähe des Ideal-Selbst und des normativen Selbst zum Vater, leider nicht die erwartete Nähe des Selbst zum Vater.
Die Ergebnisse zu den Selbst-Objekt-Beziehungen sind deutlich und können meist durch den Gießen-Test bestätigt werden.
Die Repertory Grid-Technik eignet sich als individuumzentriertes, idiografisches Testinstrument, um individuelle Beziehungsstrukturen auf kognitiver Ebene zu erfassen. Dies wird anhand der Kasuistiken deutlich. Die Operationalisierung des Selbstwertgefühls und der Selbst-Objekt-Beziehungen über die Mittelwerte bleibt schwierig.
Einzelne, für die Studie wichtige Elemente, sind aufgrund der geringen Varianzverteilung schwer interpretierbar. Die zum Teil nicht übereinstimmenden Ergebnisse zum Selbstwertgefühl aus beiden Testinstrumenten könnten durch die unterschiedlichen für sie aktuellen Konstrukträume der Untersuchten bedingt sein. Eventuell ist der standardisierte Raum des Gießen-Testes für viele manisch Erkrankte für intrapersonale Strukturen nicht relevant. Sie haben sich, wie KRÖBER (1988) ausführt, im Verlauf ihrer Erkrankung zu weit von dem Normalen entfernt.
Leider konnte aufgrund der schwer erreichbaren und sehr seltenen Erkrankung keine größere Stichprobe untersucht werden. Es bietet sich an, die Ergebnisse auch mit Hilfe anderer Testinstrumente an größeren Stichproben zu validieren.
Durch die Kombination aus Gruppenauswertung und Einzelfallbetrachtung wird deutlich, dass auffällige Einzelbefunde oft nivelliert werden. Auch dies sollte an größeren Stichproben mit der Möglichkeit von Untergruppierungen überprüft werden.
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht der humane β2-adrenerge Rezeptor, ein intrinsisches Membranprotein und Mitglied der Superfamilie G Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs).
Es wurden im Wesentlichen zwei Themenschwerpunkte bearbeitet. Den ersten Schwerpunkt bildeten die heterologe Produktion des β2-adrenergen Rezeptors in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris sowie dessen chromatographische Reinigung und Charakterisierung. Hierbei konnten in allen wesentlichen Punkten signifikante Verbesserungen im Vergleich zu früheren Arbeiten erzielt werden: Die Ausbeute an heterolog produziertem, funktionellem Rezeptor konnte um das bis zu Fünffache gesteigert werden; Die Gesamtausbeute nach chromatographischer Reinigung wurde um 60% erhöht; Es gelang die Darstellung reiner, monodisperser Rezeptorpräparationen mit einer spezifischen Ligandenbindungsaktivität von 94% und einer Halbwertszeit der Ligandenbindungsaktivität von >50 Tagen bei 4 °C. Eine pharmakologische Charakterisierung des Rezeptors erfolgte sowohl in Membranen als auch in solubilisiert-gereinigter Form. Ferner konnte die in vitro-Interaktion des solubilisiert-gereinigten Rezeptors mit einer konstitutiv aktiven β-Arrestin Variante nachgewiesen werden.
Ziel des zweiten Themenschwerpunkts der vorliegenden Arbeit war die Auffindung und Charakterisierung von rezeptorspezifischen, nicht auf Immunglobulinen basierenden Bindeproteinen, um diese später vorrangig zur Kokristallisation einsetzen zu können. Mit der zellfreien Selektionsmethode des ribosome display ist es hierbei gelungen, aus einer naiven, auf Ubiquitin als Gerüstprotein basierenden Bibliothek hochaffine, spezifische Bindeproteine gegen den β2-adrenergen Rezeptor zu isolieren. Für Monomere dieser sog. Affiline® wurden Dissoziationskonstanten bis etwa 450 nM gefunden, die durch Homodimerisierung auf etwa 70 nM verringert werden konnten. Zusätzlich wurde mit einer Affinitätsmaturierung ausgewählter Varianten begonnen.
Die Superfamilie der G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bildet die größte und auch diverseste der vier Hauptgruppen membranständiger Rezeptoren. Im Rahmen der Signaltransduktion vermitteln diese die Umwandlung eines extrazellulären Signals in eine spezifische intrazelluläre Reaktion und nehmen so eine Schlüsselposition bei der Kommunikation zwischen Zellen ein. Bei GPCRs erfolgt die Weitergabe der ligandeninduzierten Konformationsänderung vorwiegend über Kopplung an und Aktivierung von Guanin-Nukleotidebindenden Proteinen (G Proteine), die dann ihrerseits mit verschiedenen Effektorsystemen in Wechselwirkung treten. Da ein Großteil aller zurzeit auf dem Markt befindlichen Medikamente ihre Wirkung durch Bindung an einen GPCR entfaltet, ist diese Proteinfamilie von besonders großem pharmakologischem Interesse. Auch der humane β2-adrenerge Rezeptor (β2AR) zählt zu den kommerziell wichtigen drug targets und ist zudem nach bovinem Rhodopsin der erste GPCR, für dessen Struktur experimentell bestimmte, atomare Modelle vorgelegt werden konnten.
Zur funktionellen Überproduktion des β2AR hatte sich bereits die methylotrophe Hefe Pichia pastoris bewährt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch Anwendung hier erarbeiteter, optimierter Bedingungen das Produktionsniveau aller acht für dieses Expressionssystem zur Verfügung stehenden bzw. in dieser Arbeit hergestellten Konstrukte gegenüber früheren Ergebnissen deutlich gesteigert werden konnte. Hierbei wurde, je nach Konstrukt, eine Verdopplung bis Verfünffachung der Produktion an aktivem, bindungsfähigem Rezeptor erzielt. Bei drei der acht Konstrukte konnte das Produktionsniveau auf ≥ 50 pmol/mg Membranprotein gesteigert werden, was bis zu 1,1 mg aktivem Rezeptor in Membranen pro Liter Schüttelkultur entspricht. Die im Rahmen der Produktionsoptimierung der verschiedenen Konstrukte gewonnenen Erkenntnisse über den Einfluss sowohl von Art als auch Lokalisation eines bestimmten Anhängsels innerhalb der Expressionskassette auf das zu erwartende Produktionsniveau konnten genutzt werden, um bei einem mit bestimmten Eigenschaften neu zu erstellenden Konstrukt – einem Baukastensystem gleich – jene Anhängsel mit den gewünschten (und bekannten) Auswirkungen zu kombinieren. Auf dies Weise konnten auf Anhieb sehr gute Produktionsniveaus für neu erstellte Konstrukte erzielt werden.
Durch Optimierung einer zweischrittigen affinitätschromatographischen Reinigung konnte zum einen die Gesamtausbeute an gereinigtem β2AR um 60% gegenüber früheren Ergebnissen gesteigert werden. Zum anderen gelang es, für derartige, nach SDS-PAGE und analytischer Gelfiltration als homogen und frei von jeglichen Aggregationen befundenen Präparationen, die spezifische Aktivität (Radioligandenbindung) auf 94 ± 4% zu steigern. Die Halbwertszeit der spezifischen Aktivität derartiger Präparationen bei 4 °C lag bei über 50 Tagen. Im Rahmen einer alternativen Reinigungsstrategie konnte der praktische Nutzen proteolytisch abspaltbarer Affinitätsanhängsel in Fällen mit inhomogener posttranslationaler Prozessierung des rekombinanten Proteins durch das Expressionssystem nachgewiesen werden.
Durch Integration einer inversen Affinitätschromatographie in das Reinigungsschema konnte bei bestimmten Konstrukten die Homogenität und Dispersität der Präparation verbessert werden, bei gleichzeitiger vollständiger Entfernung sowohl der abgetrennten Anhängsel als auch der verwendeten Protease.
Die Ligandenbindung des β2AR wurde sowohl in Membranen als auch in solubilisiertgereinigter Form charakterisiert. Die hierbei für den Rezeptor in Membranen mit dem tritiierten Liganden [5,7-3H]-(-)-CGP-12177 erhaltene Dissoziationskonstante (KD) von 4,1 ± 0,2 nM befindet sich in guter Übereinstimmung mit den Literaturwerten für dieses Expressionssystem.
Bei der Charakterisierung der Ligandenbindung des β2AR in solubilisiert-gereinigter Form wurde ein stark modulierender Effekt von Lipiden auf die KD beobachtet: Die Dissoziationskonstante des soubilisiert-gereinigten Rezeptors wurde zu 8 ± 0,6 nM bestimmt, ließ sich jedoch durch gleichzeitige Verwendung von solubilisiertem Phosphatidylcholin und Cholesterinhemisuccinat im Bindungstest auf ein Viertel (2,13 ± 0,2 nM) diese Wertes reduzieren. Der Effekt der Affinitätsmodulation war voll reversibel und die Gesamtmenge (Bmax) an bindungsfähigem Rezeptor blieb praktisch unbeeinflusst.
Des weiteren konnte die spezifische Interaktion des solubilisiert-gereinigten β2AR mit rekombinantem, konstitutiv aktivem β-Arrestin in vitro nachgewiesen werden. Dies ist sowohl für die Etablierung etwaiger funktioneller Assays als auch für Ansätze zur Kokristallisation des β2AR mit einem physiologischen Bindungspartner für von Interesse.
Im Rahmen des zweiten Themenkomplexes wurde die Methode des ribosome display (RD) erfolgreich eingesetzt, um Bindeproteine gegen den β2AR zu selektieren. Ziel war es hier, diese später zur Kokristallisation mit dem Zielprotein einsetzen zu können. Das RD als zellfreie (in vitro) Selektionsmethode findet für lösliche Proteine bereits seit längerem breite Anwendung.
Für Membranproteine wurde es bisher hingegen nur sehr selten erfolgreich verwendet und der Einsatz bei GPCRs ist als neu zu bezeichnen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine hochdiverse (theoretische Diversität: 1013, funktionelle Größe 1010 – 1011), naive Bibliothek verwendet, die auf Ubiquitin als Gerüstprotein basiert und von SCIL Proteins, Halle unter der Bezeichnung Affilin® entwickelt wurde. Es handelt sich somit um alternative, d. h. nicht auf Antikörpern oder deren Fragmenten beruhenden Bindeproteine. Zielprotein der in dieser Arbeit durchgeführten Selektionen war solubilisiert-gereinigter β2AR. Sämtliche Arbeiten unter Beteiligung des Zielproteins fanden zur Bewahrung dessen Aktivität in Anwesenheit von Detergenz statt. Die verschiedenen Schritte des RD mussten daher zunächst an die speziellen Erfordernisse des Zielproteins angepasst und geeignete Bedingungen zur Durchführung einer Selektion gefunden werden. Durch entsprechende Vorversuche wurde dann verifiziert, dass der Rezeptor unter den gewählten Selektions- und Immobilisierungsbedingungen seine Ligandenbindugsaktivität beibehält. Es wurden insgesamt sechs RD-Selektionsrunden durchgeführt und der abschließend vorliegende Bindeprotein-Subpool war noch divers (keine Reduktion auf eine Konsensus-Sequenz). Zur Charakterisierung der angereicherten Varianten wurde eine Abfolge von Hochdurchsatzverfahren sowie abschließenden Einzelanalysen eingesetzt. Hierbei gelang es, hochaffine, spezifische Bindeproteine gegen den β2AR zu isolieren. Die beobachteten Dissoziationskonstanten (KD) der detailliert charakterisierten Affilin-Monomere reichen von etwa 15 μM bis hin zu 450 nM. Nach Homodimerisierung ausgewählter, zuvor charakterisierter Varianten wurde eine Verringerung der Dissoziationskonstanten bis auf etwa 70 nM beobachtet. Damit decken die selektierten Bindeproteine einen Affinitätsbereich ab, der verschiedenartige Anwendungsgebiete eröffnet: Vom Einsatz zur affinitätschromatographischen Reinigung des Zielproteins, über dessen immunologischen Nachweis bzw. dem Einsatz in Assaysystemen bis hin zur Kokristallisation mit dem Zielprotein. Die Spezifität der Bindeproteine wurde gegenüber verschiedenen Negativkontrollen wie etwa dem verwendeten Immobilisierungssystem aber auch gegenüber anderen GPCRs mit homologer Auswahl an Affinitätsanhängseln verifiziert. Durch geeignete Konditionierung (prepanning) der in den eigentlichen Selektionsprozess eingehenden ternären Komplexe war es gelungen, die Anreicherung unerwünschter, gegen das zur Immobilisierung verwendete Biotin/Streptavidin-System gerichteter Varianten wirkungsvoll zu verhindern.
Die selektierten Bindeproteine konnten in verschiedenen Maßstäben (von 1 ml bis 1 l) mit sehr hohen Ausbeuten in E. coli produziert werden. Nach Affinitätschromatographie und präparativer Gelfiltration wurden hochreine, monodisperse Präparationen erhalten. Die Gesamtausbeuten an gereinigtem Bindeprotein lagen bei etwa 15 mg/l Kulturvolumen.
Neben der Affinitätsbestimmung wurde die Bindung einzelner Affilin-Varianten an den β2AR sowohl mittels pull-down Assay als auch analytischer Gelfiltration verifiziert. Parallel zur Homo- und Hetero-Dimerisierung wurde eine Affinitätsmaturierung ausgewählter Varianten begonnen. Diese Affinitätsmaturierung der Monomere erfolgte in einem evolutiven Ansatz bestehend aus Zufallsmutagenese zuvor charakterisierter Varianten und anschließender Selektion im Rahmen eines erneuten RD.
Systematische Ansätze zur Kokristallisation des β2AR mit mehreren der aus der Selektion hervorgegangenen alternativen Bindeproteine wurden durchgeführt.
This thesis deals with the simulation, optimization and realization of quasi-optical scanning systems for active THz cameras. Active THz cameras are sensitive in the THz regime of the electromagnetic spectrum and are suitable for the detection of metal objects such as weapons behind clothing or fabrics (maybe for security applications) or material investigation. An advantage of active THz-systems is the possibility to measure the phase of the THz-radiation and thus to reconstruct the surface topography of the objects under test. Due to the coherent illumination and the required system parameters (like image field size, working distance and lateral resolution) the optical systems (in the THz region often called quasi-optical systems) must be optimized. Specifically, the active illumination systems require highly optimized quasioptical systems to achieve a good image quality. Since currently no suitable multi-pixel detectors are available, the object has to be scanned in one or two dimensions in order to cover a full field of view. This further reinforces the occurring aberrations. The dissertation covers, alongside the underlying theory, the simulation, optimisation and realisation of three different active THz systems. The subdivision of the chapters is as follows: Chapter 1 deals with a motivation. Chapter 2 develops the underlying theory and it is demonstrated that the geometrical optics is an adequate and powerful description of the image field optimization. It also addresses the developed analytic on-axis and the off-axis image field optimization routine. Chapter 3, 4 and 5 are about the basis of various active THz cameras, each presented a major system aspect. Chapter 3 shows how active THz-cameras with very high system dynamics range can be realised. Within this chapter it could although be demonstrated how very high depth resolution can be achieved due to the coherent and active illumination and how high refresh rate can be implemented. Chapter 4 shows how absolute distance data of the objects under test can be obtained. Therefore it is possible to reconstruct the entire object topography up to a fraction of the wavelength. Chapter 5 shows how off-axis quasi-optical systems must be optimized. It is also shown how the illumination geometry of the active THz systems must be changed to allow for real-time frame rates. The developed widened multi-directional lighting approach also fixes the still existing problem of phase ambiguity of the single phase measurement. Within this chapter, the world’s first active real-time camera with very high frame rates around 10 Hz is presented. This could be only realized with the highly optimised quasioptical system and the multi-directional lighting approach. The paper concludes with a summary and an outlook for future work. Within the outlook some results regarding the simulation of synthetic aperture radar systems and metamaterials are shown.
Im Zuge der Arbeitsbeschaffung, der Aufrüstung und der nachfolgenden Kriegsfinanzierung stand der nationalsozialistischen Regierung ein Bündel prinzipieller Finanzierungsalternativen zur Verfügung. Bei der Finanzierung der Arbeitsbeschaffungsmaßnahmen griff das Regime auf das vorhandene Instrumentarium der Vorgängerregierungen zurück. Insofern war das Prinzip der Wechselfinanzierung zur kurzfristigen Mobilisierung von Liquidität keine Innovation der NS-Regierung, sondern lediglich die Fortsetzung einer bereits praktizierten Finanzierungsmethode. In Hinblick auf die Faktoren „Ergiebigkeit“ und „zeitlicher Verfügbarkeit“ musste im Rahmen der Kriegsfinanzierung primär auf die kurzfristige Verschuldung zurückgegriffen werden. Keine andere Finanzierungsalternative hätte – unter Berücksichtigung der „Blitzkriegstrategie“ und dem damit verbundenen außerordentlichen Mittelbedarf - in solch kurzer Zeit die erforderliche Finanzkraft ohne Reibungsverluste und zeitliche Verzögerungen garantieren können. In steuerpolitischer Hinsicht schöpfte die Regierung zwar ansteigende Einkommen und Gewinne ab, doch fand die Steuergesetzgebung ihre Grenze in der gesellschaftlichen Akzeptanz sowie bei der Berücksichtigung distributionspolitischer Motive. Pläne zur weiteren Steuererhöhung oder gar zur Einführung neuer Steuern wurden zu Gunsten der Zustimmung in der Bevölkerung zur Regimepolitik verworfen. Das Primat der Fundierung kurzfristiger Kreditaufnahme wurde mit Fortdauer des Krieges aufgegeben. Die Konsolidierung der schwebenden Schulden hinkte dem Tempo des kurzfristigen staatlichen Kreditbedarfs mit Fortdauer des Krieges hinterher. Große Teile des Finanzierungsbedarfs wurden durch Enteignung und Kontribution gedeckt. Die übermäßige Beanspruchung ausländischer Volkseinkommen und – vermögen glich jedoch nur einen Teil des inländischen Geld-Gütermarkt-Ungleichgewichtes aus. Darüber hinaus waren mit der Besetzung ausländischer Territorien aber auch Kosten für die Versorgung der Bevölkerung verbunden. Selbst unter Missachtung jeglicher Humanität gegenüber der ausländischen Bevölkerung waren die Ressourcenbeiträge der besetzten Länder begrenzt. Bei der sog. „geräuschlosen Kriegsfinanzierung“ kamen verschiedene Instrumente zur Absorption überschüssiger Kaufkraft zum Einsatz. Langfristige Schuldpapiere wurden überwiegend nicht am freien Kapitalmarkt begeben, sondern direkt den Kapitalsammelstellen zugeteilt. Gesetzlich definierte Grenzen der Lohn- und Preisbildung sowie die Beschränkungen des Kapital- und Gütermarktes flankierten die Bemühungen um die Stilllegung überschüssiger Einkommen. Mit dem kriegsbedingten Ausufern des Mittelbedarfs schwand jede Rücksichtnahme auf die gesetzlichen und ökonomischen Grenzen. Die langfristige Verschuldung konnte fortan der kurzfristigen Kreditaufnahme nicht mehr folgen. Die Sparkassen stellten aufgrund ihrer Nähe zum Einzelkunden und ihres organisatorischen Aufbaues eine idealtypische Konstruktion für die Absorption von Spargeldern dar. Darüber hinaus hatten sie eine dominierende Stellung auf dem Spareinlagenmarkt.