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Background: Costly structures need to represent an adaptive advantage in order to be maintained over evolutionary times. Contrary to many other conspicuous shell ornamentations of gastropods, the haired shells of several Stylommatophoran land snails still lack a convincing adaptive explanation. In the present study, we analysed the correlation between the presence/absence of hairs and habitat conditions in the genus Trochulus in a Bayesian framework of character evolution. Results: Haired shells appeared to be the ancestral character state, a feature most probably lost three times independently. These losses were correlated with a shift from humid to dry habitats, indicating an adaptive function of hairs in moist environments. It had been previously hypothesised that these costly protein structures of the outer shell layer facilitate the locomotion in moist habitats. Our experiments, on the contrary, showed an increased adherence of haired shells to wet surfaces. Conclusion: We propose the hypothesis that the possession of hairs facilitates the adherence of the snails to their herbaceous food plants during foraging when humidity levels are high. The absence of hairs in some Trochulus species could thus be explained as a loss of the potential adaptive function linked to habitat shifts.
Unter humanbiologischen, geschichtlichen und soziokulturellen Aspekten wird eine umfangreiche Sammlung von Röntgen- und Patientenbildern des Annastifts Hannover (ehemals ”Krüppelheim“) aus der Zeit von Oktober 1908 bis September 1942 analysiert. Einige der häufigsten Erkrankungen dieser Sammlung (Hüftluxation, Infektionskrankheiten, Rachitis und Skoliose) werden beschrieben, ausgewertet und im Kontext der Epoche diskutiert. Dabei wird folgender Arbeitshypothese nachgegangen: Wenn das frühe 20. Jahrhundert als entscheidende Phase des Übergangs von einer hohen zu einer niedrigen Mortalität gilt, so müsste sich das auch in der Sammlung des Annastifts nachweisen lassen. Auch wäre zu erwarten, dass in der frühen Phase ein hoher Morbiditäsindex, welcher über die Anzahl von Harris-Linien ermittelt werden kann, festgestellt werden müsste. Patientenbilder (Fotografien) Von 6519 Patientenbildern konnten 6047 mit einer Diagnose erfasst werden. Für den Zeitraum Oktober 1908 bis 1.Oktober 1934 sind dies 3275 und für den Zeitraum 2. Oktober 1934 bis 1. September 1942 sind es 2772 Diagnosen. Die genannten Zeitrüume unterscheiden sich deutlich hinsichtlich der Häufigkeit der einzelnen Krankheitsbilder. Besonders auffällig: • Die Zahl fotografierter Patienten mit Infektionserkrankungen (u. a. Osteomyelitis und Tuberkulose) reduzierte sich im Untersuchungszeitraum. Maßgeblichen Einfluss hatten dafür vorteilhaftere Lebensbedingungen. Die therapeutischen Möglichkeiten waren zu dieser Zeit noch vergleichsweise gering. • Es wird eine Vervielfachung der Diagnosen Skoliose und Rundrücken in der Zeit des Nationalsozialismus’ beobachtet. Dass dies einen Anstieg der Pathologien widerspiegelt, ist unwahrscheinlich, eher zeigt es das besondere Augenmerk, welches im Nationalsozialismus der ”Haltung“ entgegengebracht wurde. Röntgenbilder Die 1894 Röntgenbilder stammen von 1063 Patienten, die zwischen dem 21. 07. 1909 und dem 18. 08. 1925 geröntgt wurden. Das Durchschnittsalter der Patienten lag bei zehn Jahren. In der Sammlung der Röntgenbilder gab es folgende Auffälligkeiten: • Der Anteil von Hüftluxationen lag bei über 21%. Dieser hohe Wert ist als Resultat einer fehlenden Frühdiagnose zu werten, so dass aufwendige orthopädische Behandlungen notwendig wurden. Mit Dr. Peter Bade stand dem Annastift ein anerkannter Spezialist auf dem Gebiet der Behandlung von Hüftluxationen vor, so dass das Annastift für diese Erkrankung als Schwerpunktklinik zu betrachten ist. • Bei dem Stressmarker ”Harris-Linien“ (in der Literatur auch meist als Wachstumsstillstandslinien“ bezeichnet) zeigt sich ein Paradoxon: Entgegen der Erwartung im Untersuchungszeitraum, aufgrund der zahlreichen und schweren Infektionserkrankungen und Hungersnöte, ein gehäuftes Auftreten der Harris-Linien als unspezifisches Zeichen von Stress vorzufinden, zeigten sich diese nur bei 15% der Patienten. Sie signalisieren mit der insgesamt geringen Anzahl einen vermeintlich niedrigen Morbiditäts-Index (= 0,32), welcher gemäß Literatur [z. B. Blanco et al. (1974); Nowak & Piontek (2002)] auf günstige Lebensbedingungen schließen ließe. Das Phänomen der Harris-Linien ist hier so zu erklären, dass allein eine Veränderung der Ernährungsbedingungen eine Ausbildung von Harris-Linien hervorrufen kann. In diesem Fall wird eine schlechte Grundsituation abgelöst durch eine optimale Versorgung im Annastift. Die Bezeichnung ”Wachstumsstillstandslinien“ ist für diese Serie somit wahrscheinlich unzutreffend, ”Wachstumslinie“, als Ausdruck für einen Wachstumsschub, würde das Phänomen besser erklären. Der Begriff ”Gesundheitsveränderungslinie“, sei es Ernährungs- oder Krankheitsbedingt, trüge dem Umstand Rechnung, dass eine einmalige Krankheit oder einmalige Hungerperiode bei einer allgemein guten Lebenssituation genauso eine Linie erzeugt, wie eine Periode des Wohlbefindens bei einer allgemein schlechten Lebenssituation. Im Ganzen zeigt diese Sammlung deutliche Indizien für nahezu katastrophale Lebensumstände im frühen 20. Jahrhundert: Infektions- und Mangelerkrankungen sind weit verbreitet. Es ist aber auch zu konstatieren, dass sich diese Bedingungen mit der Zeit besserten, was zu einer Reduzierung der Mortalität geführt haben dürfte.
Rafts: Rafts sind spezialisierte Domänen biologischer Membranen, die sich durch ihre spezifische Lipid- und Proteinzusammensetzung auszeichnen (zur Übersicht siehe Simons und Toomre, 2000). Die am besten beschriebenen Rafts sind die Caveolae, doch es gibt noch weitere weniger gut charakterisierte Rafttypen. Rafts werden verschiedene zelluläre Funktionen zugeschrieben wie z.B. gerichteter Transport von Membranproteinen, Endozytose und Signaltransduktion. Diese Funktionen erfüllen sie vornehmlich, indem sie verschiedene Proteine und Lipide bedingt durch ihre biophysikalischen Eigenschaften selektiv aufnehmen oder ausschließen. Viele Raftproteine sind über gesättigte Acylketten, wie Myristat oder Palmitat, oder einen GPIAnker mit der Membran assoziiert. Transmembranproteine, wie z.B. der EGFRezeptor, können jedoch auch in Rafts angereichert sein. Besonders an der Plasmamembran dienen Rafts als Signaltransduktionszentren, indem sie beteiligte Rezeptoren und Signalmoleküle konzentrieren.
Reggie-Proteine: Bei der Suche nach Proteinen, die bei der Regeneration von verletzten Sehnerven von Fischen hochreguliert werden, wurden Reggie-1 und Reggie-2 entdeckt (Schulte et al., 1997). Gleichzeitig wurden diese Proteine bei der Suche nach neuen Raftproteinen gefunden und als Flotillin-1 (=Reggie-2) und Flotillin-2 (=Reggie-1) bezeichnet (Bickel et al., 1997). Reggie-1 und -2 haben ein Molekulargewicht von 47 kDa und sind auf Aminosäuren-Basis zu 44% identisch. Homologe zu Reggie-1 wurden bislang in Mensch, Maus, Ratte und Fisch, wie auch in D. melanogaster gefunden. Die evolutionäre Konservierung der Reggies ist, mit beispielsweise 80% zwischen Ratte und Goldfisch, sehr hoch und weist auf eine wichtige Funktion hin, die Sequenzkonservierung verlangt. Reggie-1 wird ubiquitär exprimiert, wogegen Reggie-2 ein weniger verbreitetes Expressionsmuster aufweist. Reggie-1 ist vornehmlich an der Plasmamembran und an Endosomen lokalisiert. Die subzelluläre Lokalisation von Reggie-2 hängt vom Zelltyp ab...
Mit der vorliegenden Arbeit wird für den südöstlichen Taunus und sein Vorland erstmals eine umfassende monographische Bearbeitung von Flora und Vegetation des Grünlands auf Basis umfangreicher Geländeerhebungen und Literaturrecherchen vorgelegt. Die wesentlichen Ziele der Untersuchung sind: • Darstellung der aktuellen und historischen Vorkommen und räumlichen Verbreitung von Pflanzenarten, Pflanzengesellschaften und Nutzungsintensitäten des Grünlands. • Darstellung der historischen Entwicklung des Grünlands und der sozioökonomischen Situation der Landwirtschaft. • Gefärdungseinstufung der Pflanzenarten und -gesellschaften (Rote Liste). • Kritische Bewertung des derzeitigen Stands der floristisch-vegetationskundlichen Landesforschung. • Bereitstellung von fachlichen Grundlagen für den praktischen Naturschutz, für Naturschutzbehörden, Planungsbüros, regionale Naturschutzforschung und die interessierte Öffentlichkeit. Das 1105 km2 große Untersuchungsgebiet liegt in nordwestlichen Rhein-Main-Gebiet und erstreckt sich von Wiesbaden im Südwesten und Bad Nauheim im Nordosten bzw. Schmitten im Nordwesten und Frankfurt im Südosten. Es umfasst mit dem Hebungsgebiet des Taunus (größte Höhe 878,5 m ü. NN) und dem Senkungsgebiet des Rhein-Main-Tieflands (tiefster Punkt 84 m ü. NN) zwei sehr unterschiedliche geowissenschaftliche Landschaftstypen, die im einzelnen 33 verschiedene naturräumliche Teileinheiten umfassen...
Since its recognition as an endothelium-derived relaxing factor, the control and consequences of nitric oxide (NO) production have been investigated intensely. We know now that NO is not simply a vasodilator or regulator of smooth muscle tone but is a potent anti-platelet agent, neuromodulator and regulator of gene expression. NO is synthesized from the amino acid Larginine by a family of enzymes termed NO synthases (NOS). The ‘endothelial’ (eNOS or NOS III) and ‘neuronal’ (nNOS, NOS I or bNOS) NOS isoforms, which were named after the tissues in which they were first identified, are expressed constitutively and are generally regulated by Ca2+/calmodulin (CaM). Endothelium-derived NO is thought to be responsible for maintaining the vasculature in an anti-atherosclerotic state and a decrease in the bioavailability of NO (a state generally referred to as endothelial dysfunction) results in “proatherosclerotic” alterations in vascular gene expression. Recently it has become clear that the activity of eNOS is largely determined by its association with regulatory proteins as well as by the phosphorylation of the enzyme on serine, threonine and possibly tyrosine residues. Moreover, the enzyme can be “uncoupled” i.e. transformed from a NO generating to a superoxide (O2-)-generating enzyme, which would be expected to attenuate vasodilator responses and enhance vascular inflammation. The aim of this thesis was to study the consequences of phosphorylation on specific serine, threonine and tyrosine residues on the activity and intracellular localisation of eNOS and in particular to determine whether a phospho-switch for eNOS uncoupling exists. eNOS is phosphorylated under basal conditions and its serine phosphorylation can be enhanced following cell stimulation with hemodynamic stimuli such as cyclic stretch and fluid shear stress as well as by hormonal stimuli such as histamine and bradykinin. Our group has previously demonstrated the importance of Ser1177 in the activation of eNOS and here I set out to determine the relative importance of phosphorylation on Ser633 and Ser114. By generating point mutants in which serine was replaced by either alanine (nonphosphorylatable mutants) or aspartate (phosphomimetic mutants) it was observed that the activity of the S633D and S114A eNOS mutants exhibited an 2-fold increase over the activity of the wild-type enzyme or either of the S633/634A or S114D eNOS mutants as determined by monitoring the conversion of L-arginine to L-citrulline. eNOS is basally phosphorylated on Thr495 and stimulation of endothelial cells with Ca2+-elevating agonists generally results in the transient dephosphorylation of this residue. The latter is essential to allow the binding of calmodulin to the enzyme and is the actually initiating step in the generation of NO. Correspondingly, the T495A eNOS mutant can be activated at lower Ca2+ and calmodulin concentrations than the T495D mutant. However, some eNOS mutants (T494A/S1177D and T495A) showed an enhanced ability to generate O2- in a NOS inhibitor-sensitive manner suggesting that the phosphorylation of the enzyme may also play a role in the uncoupling process. To determine the physiological relevance of eNOS dephosphorylation on Thr495 we assessed the consequences of treating cells with oxidised low-density lipoprotein (ox-LDL) on eNOS phosphorylation as well as on the eNOS-dependent generation of NO and O2-. Oxidised LDL concentration- and time-dependently decreased phosphorylation of eNOS on Thr495 and led to a concomitant decrease in cellular levels of cyclic GMP and an enhanced production of O2 - compared to cells treated with native LDL. Alterations in the activity of protein kinase C (PKC) were related to the change in eNOS Thr495 phosphorylation. There was not only the basal activity of PKCα inhibited by ox-LDL but the PKC activator phorbol-12-myristate-13-acetate also failed to elicit the phosphorylation of Thr495 in ox-LDL-treated endothelial cells. The dephosphorylation of eNOS on Thr495 in response to the addition of ox-LDL was not associated with an increase in the binding of calmodulin to eNOS, an association usually necessary for the activation of eNOS. Moreover, following treatment with ox-LDL for 24 hours eNOS was no longer detected at the plasma membrane but was redistributed to the cytosol indicating that ox-LDL may disrupt the eNOS signalling complex or signalosome. To date the role played by the tyrosine phosphorylation of eNOS in the regulation of its activity or intracellular association is controversial. However, during the preparation of this thesis we have been able to demonstrate a link between the tyrosine phosphorylation of eNO and the activation of the tyrosine kinases Src and PYK2. The application of fluid shear stress to endothelial cells resulted in the activation of Src and PYK2 as well as in the association of PYK2 with eNOS. Co-expression of eNOS and PYK2 led to the putative identification of Tyr657 as a potential modulatory site. Mutating eNOS at Tyr657 to Asp or Glu resulted in the localisation of the mutant eNOS predominantly in the cytoskeleton and also in a complete inactivation of the enzyme. The Y657F mutants, on the other hand, did not demonstrate any marked alteration in the activity when compared with the wild-type eNOS. However, the In conclusion, the results describe in this thesis indicate that eNOS is regulated by phosphorylation at multiple sites. Depending on the phosphorylation site involved phosphorylation can inhibit or activate NO production or even uncouple the enzyme so that it generates O2-. While the phosphor-status of eNOS on Ser114 and Ser633 influenced NO release they did not contribute to O2 - production and the dephosphorylation of Thr495 seems sufficient to uncouple eNOS. Cell treatment with ox-LDL, which is known to increase eNOS-derived O2- output was correlated with a dephosphorylation of Thr495 as well as a decrease in the activity of the kinase that phosphorylates this site i.e., PKCα. The phosphorylation status of all the eNOS serine and threonine residues studied however did not influence the ability of the enzyme to dimerise, indicating that contrary to previously published reports the eNOS dimer is highly stable in endothelial cells. The tyrosine phosphorylation of eNOS was not initially expected to play a determinant role in the regulation but rather to facilitate the docking of associated regulatory proteins. However, Tyr657 seems to play a critical role in the generation of NO as its mutation resulted in the generation of a completely inactive enzyme as well as in an apparent intracellular mislocalisation of the protein. The physiological relevance of these findings remain to be further elucidated.
Studies in particular of the last decade showed that active neurogenesis continuously takes place in the subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles of the adult rodent brain. Neurogenesis in the SVZ leads to migration of neuroblasts within the rostral migratory stream (RMS) and mature neuron formation mainly in the olfactory bulb (OB). According to present understanding, glial cells with astrocytic properties represent the actual adult neural stem cells. The cell types representing the various cellular transition states leading to the formation of mature neurons as well as the mechanisms controlling adult neurogenesis and neuroblast migration are poorly understood. A previous study from this laboratory demonstrated that the ATP-hydrolyzing enzyme nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2 (NTPDase2) is associated with type B cells, the presumptive neural stem cells. NTPDase2 is a protein of the plasma membrane with its catalytic site facing the extracellular space. It hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates to their respective nucleoside diphosphates. This raises the possibility that the signaling pathway via extracellular nucleotides is involved in the control of adult neurogenesis. Neurons as well as glial cells express several subtypes of receptors (P2 receptors) that are responsive to the nucleotides ATP, ADP, UTP, or UDP. P2X receptors are ATP-gated Na+, K+ and Ca2+ permeable ion channels, P2Y receptors are coupled to trimeric G-proteins. In order to probe for a functional role of nucleotides in adult neurogenesis, the present study referred to an in vitro system (neurospheres). Neurospheres produced from isolates of the mouse SVZ and cultured in the presence of EGF and bFGF expressed the neural stem cell marker nestin and also GFAP, S100β, NTPDase2 and tissue non-specific alkaline phosphatase. Neurospheres generated from the cells of the subventricular zone were multipotenital. This was revealed by immunostaining of differentiated cells with markers for astrocytes, neurons and oligodendrocytes. The presence of ecto-nucleotidase was verified by analyzing the free phosphate released from nucleotides. The tissue non-specific form of alkaline phosphatase was the predominant enzyme. Both NTPDase2 and TNAP could be identified by immunocytochemistry and Western blotting. Hydrolysis was not observed for p-nitrophenyl thymidine monophosphate, a substrate of members of the ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase family (NPP1 to NPP3). Since ecto-nucleotidases control the availability of extracellular nucleotide agonists, neurospheres were studied for the potential expression and functional role of nucleotide receptors. Neurospheres responded to extracellular nucleotides with a transient rise in Ca2+ (ATP = ADP > UTP). The rise in Ca2+ was due to P2Y receptors. The Ca2+ response was unaltered in the absence of extracellular Ca2+ and strongly reduced by thapsigargin, a blocker of internal Ca2+ stores. The P2Y1 antagonist MRS2179 strongly reduced the ATP- or ADP-induced increase in Ca2+, suggesting the involvement of a P2Y1 receptor. In addition, suramin and PPADS, non-selective antagonists for P2 receptors, inhibited most of the Ca2+ response. The agonistic activity of UTP and the lack of response to UDP implied the additional presence of a P2Y2 and/or a P2Y4 receptors and the absence of a functional P2Y6 receptor. RT-PCR experiments demonstrated that neurospheres expressed P2Y1 and P2Y2 receptors but not P2Y4 receptor. That the majority of the Ca2+ response to ATP was mediated via P2Y1 receptors was also confirmed by analysis of P2Y1 knockout mice and by application of the P2Y1 receptor-specific antagonist MRS2179. In addition, agonists of P2Y1 and P2Y2 receptors and low concentrations of adenosine augmented cell proliferation inspite of the presence of mitogenic growth factors. Neurosphere cell proliferation was attenuated after application of MRS2179 and in neurospheres from P2Y1 receptor knockout mice. These results infer a nucleotide receptor-mediated synergism that augments growth factor-mediated cell proliferation. Taken together these results suggest that P2Y-mediated nucleotidergic signalling is involved in neurosphere function and possibly also in adult neurogenesis in situ.
BACKGROUND: The identification of beta-barrel membrane proteins out of a genomic/proteomic background is one of the rapidly developing fields in bioinformatics. Our main goal is the prediction of such proteins in genome/proteome wide analyses.
RESULTS: For the prediction of beta-barrel membrane proteins within prokaryotic proteomes a set of parameters was developed. We have focused on a procedure with a low false positive rate beside a procedure with lowest false prediction rate to obtain a high certainty for the predicted sequences. We demonstrate that the discrimination between beta-barrel membrane proteins and other proteins is improved by analyzing a length limited region. The developed set of parameters is applied to the proteome of E. coli and the results are compared to four other described procedures.
CONCLUSION: Analyzing the beta-barrel membrane proteins revealed the presence of a defined membrane inserted beta-barrel region. This information can now be used to refine other prediction programs as well. So far, all tested programs fail to predict outer membrane proteins in the proteome of the prokaryote E. coli with high reliability. However, the reliability of the prediction is improved significantly by a combinatory approach of several programs. The consequences and usability of the developed scores are discussed.
Humanpharmaka stellen eine permanente Belastung von Gewässern dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gemäß dem von der Europäischen Arzneimittelagentur EMEA entwickelten Konzept zur Durchführung von Umweltrisikobewertungen von Humanpharmaka mit mehreren ausgewählten Substanzen Umweltrisikobewertungen durchgeführt. Die hierfür ausgewählten Pharmaka sind das Antiepileptikum Carbamazepin (CBZ), das Antibiotikum Sulfamethoxazol (SMX) und das synthetische Östrogen 17a-Ethinylöstradiol (EE2). Als Vertreter der Inhaltsstoffe von Körperpflegeprodukten wurde der polyzyklische Moschusduftstoff Tonalid (AHTN) in die Untersuchungen mit einbezogen. Mit Hilfe von Literaturrecherchen wurde die Datengrundlage für Expositions- und Wirkungsabschätzungen bereitgestellt. Der vorhandene recherchierte Datensatz wurde mit entsprechenden Kurz- und Langzeitstudien ergänzt. Die mit den Ergebnissen der Expositions- und Wirkungsabschätzungen vorgenommenen Umweltrisikobewertungen ergaben im ersten Schritt basierend auf Kurzzeitstudien unter den ausgewählten Substanzen lediglich für den Moschusduftstoff AHTN ein erhöhtes Umweltrisiko für Oberflächengewässer. Basierend auf weiterführenden Langzeitstudien konnte das zunächst erkannte, durch AHTN indizierte Umweltrisiko entkräftet werden, jedoch ergaben die Risikocharakterisierungen für EE2 und SMX ein erhöhtes Risiko für das aquatische Kompartiment. Auf Grund der erhöhten Adsorptionspotenziale von CBZ, EE2 und AHTN wurden für diese Substanzen kompartimentspezifische Umweltrisikocharakterisierungen durchgeführt. Dabei wurde ein erhöhtes Umweltrisiko durch CBZ für das Kompartiment Sediment angezeigt. Basierend auf den Ergebnissen einer Sediment-Bioakkumulationsstudie mit dem endobenthischen Oligochaeten Lumbriculus variegatus, welche in einen unerwartet hohen Akkumulationsfaktor resultierte, und aus der Literatur verfügbaren Fisch-Biokonzentrationsfaktoren wurde anhand der Nahrungskette Wasser-Sediment-Wurm-Fisch die Möglichkeit des ‚secondary poisonings’ durch EE2 bei wurmfressenden Fischen unter natürlichen Bedingungen aufgezeigt. Zur Verwendung dieses Ergebnisses in einer Umweltrisikobewertung zum Zwecke der Zulassung von Pharmaka sollten weitergehende Untersuchungen zur Bestätigung durchgeführt werden. Bezugnehmend auf die Resultate der eigenen Studien und auf die besonderen Eigenschaften von Humanpharmaka wurde der EMEA-Richtlinienentwurf diskutiert und Verbesserungsvorschläge erarbeitet. Bis auf wenige Anpassungen geht das EMEA-Bewertungsschema nicht auf die Besonderheiten und spezifischen Eigenschaften von Humanpharmaka ein. Hauptkritikpunkte bezogen sich auf (1) die Anwendung eines konzentrationsabhängigen Schwellenwertes als Entscheidungsgrundlage zur Durchführung einer Risikocharakterisierung, (2) das stufenweise Vorgehen bei der Wirkungsabschätzung mit zuerst ausschließlich auf Kurzzeitstudien basierenden Effektdaten, und (3) unzureichende Angaben zu Vorgehensweisen in der höheren Stufe des Bewertungsschemas, vor allem bei Substanzen mit außergewöhnlichem ökotoxikologischen Potenzial. Trotz der zur Zeit intensiven internationalen Diskussion über mögliche Auswirkungen durch endokrine Disruptoren auf Mensch und Umwelt sieht der EMEA-Richtlinienentwurf nicht ausdrücklich vor, die Umweltgefährdung durch potenziell endokrin wirksame Substanzen mit spezifischen Testmethoden festzustellen und zu bewerten. Die Erkenntnis, dass spezifische Wirkmechanismen bei Chemikalien, speziell bei Arzneimitteln und Bioziden, auch in sehr niedrigen Konzentrationen zu Wirkungen in der Umwelt führen können, bleibt im EMEA-Richtlinienentwurf auf Grund der Einführung eines expositionsbezogenen Schwellenwertes und der Wirkungsabschätzung mittels Akutstudien nur unzureichend berücksichtigt. Zur Schließung dieser Lücke, die durch Untersuchungen zu endokrinen Wirkungen in der Umwelt offensichtlich wurde, müssen neue und bessere ökotoxikologische Instrumente entwickelt werden und das Umweltrisikobewertungsschema entsprechend erweitert und angepasst werden.
Identifizierung potentieller Schlüsselgene für die Pathogenese des myelodysplastischen Syndroms
(2005)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung von potentiellen Pathogeneserelevanten Genen in differenzierenden, hämatopoetischen Zellen von Patienten mit myelodysplastischem Syndrom. Grundlage für diese Arbeit war die Etablierung eines in vitro Systems zur Differenzierung primärer, hämatopoetischer Stammzellen. Durch globale Genexpressionsanalyse mit Oligonukleotid Mikroarrays sollten enexpressionsmuster gefunden werden, die die normale Hämatopoese charakterisieren und darüber hinaus zur Identifizierung relevanter Gene für die einzelnen Risikotypen des MDS beitragen. Die Ergebnisse können in Anlehnung an die einzelnen Fragestellungen (Kapitel 1.4.) wie folgt zusammengefasst werden: 1. Welche Gene werden im Verlauf der normalen hämatopoetischen Differenzierung angeschaltet? Bei der Differenzierung normaler hämatopoetischer Stammzellen werden im Verlauf der Erythro-, Granulo- und Megakaryopoese hochdifferentielle transkriptionelle Programme initiiert. Die Betrachtung von Genen mit einem sich kontinuierlich verändernden Expressionsniveau zeigte eine ansteigende Expression linienspezifischer Markergene mit zunehmender Differenzierung der Zellen. Darüberhinaus lassen sich differentielle Gene definieren, die für die einzelnen hämatopoetischen Linien und den Zeitpunkt der Expression im untersuchten Zeitrahmen spezifisch sind. Die Anzahl zellreihenübergreifender „Schlüsselgene“ im Verlauf der normalen hämatopoetischen Differenzierung ist stark begrenzt. Lediglich ein Gen (CD86) wird in allen drei hämatopoetischen Linien exprimiert. 2. Gibt es spezifische Genexpressionsmuster, die für die Differenzierung der unterschiedlichen hämatopoetischen Zellreihen charakteristisch sind? Mit Hilfe der „Class membership prediction“ konnte ein Set von 53 Genen identifiziert werden, deren Expression zu unterschiedlichen Zeitpunkten in den einzelnen hämatopoetischen Linien eine Klassifizierung der Einzelproben gemäß dem determinierenden Stimulus zulassen. Diese prädiktiven Gene haben ein spezifisches Expressionsmuster, das Zellen der Erythro-, Granulo- oder Megakaryopoese charakterisieren kann. 3. Ist eine Differenzierung von CD34+ Stammzellen im in vitro Modell möglich? Lassen sich normale Stammzellen und Stammzellen von Patienten mit MDS unterscheiden? Es wurde ein in vitro Modell zur Untersuchung von differenzierenden hämatopoetischen Stammzellen etabliert und eine liniendeterminierte Differenzierung normaler Stammzellen durch Morphologie und Immunophänotyp bestätigt. Die Untersuchungen zeigen, dass die Differenzierung und Proliferation in vitro differenzierter Zellen bei Patienten mit MDS im Vergleich zu normalen Zellen vermindert ist. Diese in vitro Daten korrelieren gut mit klinischen Befunden des MDS, wonach die veränderte Proliferation und Differenzierung der Stammzellen die Insuffizienz der Hämatopoese beim MDS nach sich zieht. 4. Gibt es Gene, welche die differenzierende myelodysplastische Stammzelle charakterisieren können ? Mittels globaler Genexpressionsanalyse differenzierender CD34+ Zellen ist es möglich, zwischen der Gruppe der low risk MDS, der Gruppe der high risk MDS sowie normalen CD34+ Zellen zu unterscheiden. Diese Ergebnisse könnten für die Einschätzung des Krankheitsrisikos beim MDS herangezogen werden. Die vergleichende Analyse der Genexpression in differenzierenden CD34+ Zellen von gesunden Spendern und MDS-Patienten zeigt, dass die Regulation der Differenzierung beim MDS bereits in CD34+ Zellen und nicht erst auf der Ebene späterer Entwicklungsstufen (wie bisher angenommen) gestört ist. Es konnten eine Reihe von Schlüsselgenen (z.B. DLK1, RAP1GA1, BNIP3L, API5), die in differenzierenden CD34+ Zellen differentiell exprimiert sind, gefunden werden. 5. Welchen Einfluss haben demethylierende und hyperacetylierende Substanzen auf die Genexpression hämatopoetischer Stammzellen? Nur eine relativ begrenzte Anzahl von Genen werden sowohl in normalen als auch in MDS-Zellen durch eine Behandlung mit Decitabine und SAHA induziert bzw. reprimiert. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Induktion bzw. Repression der Genexpression in einer gerichteten und spezifischen Art und Weise erfolgen muss. Eine Induktion der Expression konnte in allen verwendeten Stammzelltypen nachvollzogen werden, was zeigt, dass die verwendeten demethylierenden und hyperacetylierenden Substanzen nicht ausschließlich tumorzellspezifisch wirken. Die verstärkte Suppression der Expression von Transkriptionsregulatoren in MDS-Zellen deutet darauf hin, dass eine Verbesserung der Hämatopoese in MDS-Patienten durch Behandlung mit Decitabine und SAHA möglicherweise primär durch die Blockierung von Signalkaskaden und nicht durch die Aktivierung von Tumorsuppressorgenen erreicht wird. 6. Unterscheiden sich die Genexpressionsprofile von low und high risk MDS-Zellen nach Behandlung mit Decitabine und Suberoylanilidhydroxaminsäure? Die veränderte Genexpression in high und low risk MDS-Zellen zeigen nach einer Behandlung mit Decitabine und SAHA unterschiedliche Profile. Die Anzahl von induzierten Genen in high risk MDS-Zellen ist höher als in low risk MDS-Zellen. Nur wenige Gene lassen sich in beiden Zelltypen induzieren (2 Gene). Der Effekt der Behandlung auf das Genexpressionslevel ausgewählter Gene zeigt einen graduellen Verlauf, wobei z.B. die Genexpression in normalen Zellen, hin zu Zellen von low risk MDS und schließlich zu high risk MDS-Zellen abnimmt (Methylierung). Diese Resultate lassen vermuten, dass in normalen und MDS-Zellen zwar die gleichen Gene durch eine Behandlung induziert werden, das Maß der Induktion aber vom Subtyp und möglicherweise von der Schädigung der Zelle abhängt. 7. Welche Hinweise zum Pathomechanismus des MDS können mit Hilfe globaler Genexpressionsanalysen gesammelt werden? Mit Hilfe der Genexpressionsanalysen konnte bestätigt werden, dass Zellen von MDSPatienten bereits auf Ebene der Stammzelle Defekte aufweisen und dass diese alterierten Stammzellen ein transkriptionelles Programm determinieren, das massive Alterationen zum transkriptionelles Programm normaler Zellen aufweist. Eine gestörte Expression essentieller linienspezifischer Markergene der Erythro-, Granulo- und Megakaryopoese konnte identifiziert werden und bestätigt die klinischen Befunde. Im Zuge dieser Untersuchungen sind darüber hinaus neue Kandidatengene, die an der Pathogenese des MDS beteiligt sein könnten erstmals durch eine massiv gestörte Expression im Vergleich zu normalen Zellen gefunden worden.
Die mechanische Streckung hat einen großen Einfluss auf Keratinozyten und bei der Transduktion dieses Reizes nehmen ßl-integrine, E-Cadherine und EGF-Rezeptoren eine zentrale Rolle ein: Eine einfache mechanische Dehnung von HaCaT-Zellen um 10% fuhrt innerhalb von 5min zu einer schnellen Umorientierung der ßl-Integrine auf der Zellmembran, ohne dass sich dabei die Menge dieser Oberflächenrezeptoren ändert. Die Integrine sammeln sich in der basalen Membran zu größeren Adhäsionskomplexen. Dies hat Auswirkungen auf das Adhäsionsverhalten der Zellen. Eine Streckung bewirkt, dass die mechanisch stimulierten Zellen gegenüber den Kontrollzellen sowohl schneller an das Substrat anheften als auch eine stärkere Zell-Matrix-Adhäsion aufweisen. Das unterschiedliche Adhäsionsverhalten auf den verschiedenen Substraten (Arginin+Serum, Fibronektin, Kollagen) und Experimente mit funktionsblockierenden Antikörpern gegen ßl-Integrine sind Beweise für die Beteiligung dieser Oberflächenrezeptoren an diesem Vorgang. Da adhärente Zellen, wie Keratinozyten. neben Wachstumsfaktoren den Zell-Matrix-Kontakt benötigen, um in die S-Phase eintreten zu können, hat das unterschiedliche Adhäsionsverhalten von gestreckten und ungestreckten Zellen wiederum Einfluss auf die Proliferation. Diese ist bei den mechanisch gereizten Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen gesteigert und zwar im direkten Verhältnis zu der mechanisch induzierten Steigerung der Adhäsion. Im Rahmen einer Rezeptor-Transaktivierung (siehe vorne) kooperieren ßl-Integrine und E- Cadherine sowohl räumlich als auch funktionell mit dem EGF-Rezeptor bei der Übermittlung des Dehnungsreizes: Räumliche Interaktionen: Eine Koclusterung von ßl-Integrinen mit dem EGF-Rezeptor tritt bereits nach 5minütiger mechanischer Reizung an den Zell-Zell-Grenzen und den Fokalkontakten auf. Eine Kolokalisation zwischen E-Cadherinen und EGF-Rezeptoren besteht ebenfalls, wobei sich allerdings Kontrolle und Streckung nicht unterscheiden. Funktionelle Interaktionen: Eine mechanische Stimulation führt zu einer transienten Aktivierung des EGF-Rezeptors (Aktivitätsmaximum: 5min) und der MAP-Kinase ERK1/2 (Aktivitätsmaximum: 15min). Diese streckungsinduzierte Aktivierung von ERK1/2 wird sowohl durch die Blockierung der ßl-Integrine und E-Cadherine als auch durch die Inhibition des EGF-Rezeptors unterbunden. Weiterhin hemmt die Blockierung der Adhäsionsmoleküle die Aktivierung des EGF-Rezeptors. Dies spricht für die Transaktivierungs-Theorie des EGF- Rezeptors durch die ß1-Integrine und E-Cadherine. Die Zellstrukturen und viele zelluläre Prozesse werden durch eine zellintern erzeugte Grundspannung im Zytoskelett aufrechterhalten. Ohne eine Verankerung der Zelle an der ECM oder den Nachbarzellen, was durch die Blockierung der ßl-Integrine und E-Cadherine erreicht wird, bricht dieses fein ausbalancierte System zusammen; die Zytoskelett-Elemente F-Aktin, Intermediär-Filamente und Mikrotubuli zerfallen. Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit wird ersichtlich, welche enorme Bedeutung den Adhäsionsrezerptoren - ßl-Integrine und E-Cadherine - für die Formstabilität und die funktionellen Eigenschaften der Zelle zukommt. Ein Ausfall dieser Adhäsionsmoleküle beeinträchtigt sowohl die Form der Zelle (Adhäsionsvorgänge und Tensigrity-Modell) als auch die Transduktion von Umweltreizen durch die Plasmamembran, z.B. einer mechanischen Stimulation, die letztendlich das Überleben der Zelle und die Proliferation bestimmt. Daher wäre denkbar, das die Ergebnisse dieser Grundlagenforschung in Zukunft zur Behandlung von Hautkrankheiten herangezogen werden können.
Rezensionen zu: Erhard Oeser : Geschichte der Hirnforschung : Von der Antike zur Gegenwart. Wissenschaftliche Buchgesellschaft, Darmstadt, 2002, ISBN 3534149823, 288 Seiten, 24,90 Euro. Michael Hagner : Geniale Gehirne : Zur Geschichte der Elitegehirnforschung ; Wallstein-Verlag, Göttingen, 2004, ISBN 3892446490, 384 Seiten, 38 Euro.
An die Signalübertragung im ZNS werden in bestimmten Entwicklungsstadien sehr unterschiedliche Anforderungen gestellt. Im adulten Gehirn dient sie nicht nur der Nachrichtenübermittlung, sondern auch der aktivitätsbasierten Umgestaltung neuronaler Verbindungen bei Lernprozessen und der regenerativen Umgestaltung nach Verletzungen. Im sich entwickelnden Gehirn werden schon frühzeitig Nervenzellen elektrisch erregbar und spontan aktiv. Diese elektrische Aktivität und die dadurch verursachte Transmitterausschüttung spielen bei der selektiven Stabilisierung von Synapsen und damit bei der Ausgestaltung des neuronalen Netzwerks eine große Rolle. Im ZNS von Vertebraten beruht die Wirkung des Neurotransmitters und Neuromodulators Acetylcholin auf den nikotinischen und muskarinischen Acetylcholinrezeptoren. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChRen) koppeln, abhängig von den fünf identifizierten Rezeptorsubtypen (M1- M5), an unterschiedliche intrazelluläre Signalketten an. Dabei interagieren für gewöhnlich die M1, M3 und M5 Rezeptoren mit einem G-Protein des Typs Gq/11, während M2 und M4 ein G-Protein des Typs Gi/o aktivieren. Der Colliculus inferior (IC) ist eine wichtige Verschaltungsstation im auditorischen Mittelhirn von Säugetieren. Inhibitorische und exzitatorische Eingänge werden dort während der Entwicklung mit großer Präzision angelegt und konvergieren auf einzelne ICNeurone. Die physiologische Bedeutung von mAChRen im IC ist weitgehend unerforscht und die Subtypen die im juvenilen IC eine Rolle spielen wurden noch nicht charakterisiert. Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit mittels elektrophysiologischer Untersuchungen im IC der juvenilen Ratte (P5-P12) folgende Fragen zu klären: i) Gibt es im IC der jungen Ratte eine Modulation der GABAergen Transmission durch muskarinische Acetylcholinrezeptoren? ii) Welcher muskarinische Rezeptorsubtyp spielt dabei eine Rolle? iii) Welcher intrazelluläre Signalmechanismus ist der Aktivierung des muskarinischen Acetylcholinrezeptors nachgeschaltet? Unter Wirkung von Muskarin kam es bei 41,2% der untersuchten Neurone des Colliculus inferior zu einer Erhöhung der Frequenz der spontanen IPSCs. Die sIPSCs wurden durch Bicucullin blockiert, somit handelt es sich um GABAerge IPSCs. Die Wirkung von Muskarin nahm zu, wenn die Tiere älter als 9 Tage waren. Es wurde gezeigt, dass nAChRen keine Rolle spielen bei der Erhöhung der sIPSC-Frequenz, während eine selektive Blockade der M3-(M5-) mAChRen durch 4-DAMP die Muskarinwirkung blockierte. In der Regel sind die M3-Rezeptoren über folgende Signalkaskade aktiv: Phospholipase C, Kalzium-Calmodulin, NO-Synthase, Guanylatzyklase, die NO-Konzentration und cGMP. Alle Glieder dieser Kaskade wurden untersucht, sie hatten aber keinen Einfluss auf die Muskarinwirkung. Im Gegensatz dazu führte die Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels zu einer vergleichbaren Frequenzsteigerung der sIPSCs wie sie unter der Wirkung von Muskarin gemessen wurde. Weiterhin ließ sich die Erhöhung der sIPSC-Frequenz durch Muskarin vollständig aufheben, wenn die intrazelluläre Adenylatzyklase blockiert wurde. Es ist bekannt, dass der M3-(M5-) mAChR über verschiedenste Signalwege den intrazellulären cAMP-Spiegel verringern oder erhöhen kann und dass die Spezifizierung des Rezeptors vom Grad der Rezeptorexpression, dem Zelltyp und der Kombination der Effektormoleküle abhängig ist. Die Abweichung der juvenilen Kaskade vom im erwachsenen Tier üblichen Signalweg hat dabei den Vorteil, dass eine Aufgabentrennung zwischen Netzwerkbildung und Synapsenstabilisierung einerseits und Signalweiterleitung andererseits erfolgt. Beim juvenilen Tier steht die Netzwerkbildung im Vordergrund, beim erwachsenen Tier wird die Signalweiterleitung moduliert. Der sekundäre Botenstoff NO, der weit diffundieren kann, spielt beim juvenilen Signalweg keine Rolle und dies ermöglicht eine klare Trennung der aktivierten von den umgebenden Synapsen. Dadurch wird eine starke Selektion innerhalb der vorhandenen Synapsen ermöglicht und eine aktivitätsbasierte Netzwerkbildung vereinfacht. Die Etablierung funktioneller GABAerger Synapsen ist ausschlaggebend für die Entwicklung des neuronalen Netzwerks. Innerhalb der ersten postnatalen Wochen führt die Aktivierung von GABAA-Rezeptoren zur Depolarisierung der IC-Neurone und zu einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Acetylcholin potenziert also letztlich den GABA-aktivierten Einstrom von Ca2+ und führt damit zur Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration im postsynaptischen Neuron des IC. Diese modulatorische Wirkung von Acetylcholin könnten damit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Stabilisierung von inhibitorischen Synapsen im sich entwickelnden IC der Ratte spielen.
The 5'-terminal cloverleaf (CL)-like RNA structures are essential for the initiation of positive- and negative-strand RNA synthesis of entero- and rhinoviruses. SLD is the cognate RNA ligand of the viral proteinase 3C (3Cpro), which is an indispensable component of the viral replication initiation complex. The structure of an 18mer RNA representing the apical stem and the cGUUAg D-loop of SLD from the first 5'-CL of BEV1 was determined in solution to a root-mean-square deviation (r.m.s.d.) (all heavy atoms) of 0.59 A (PDB 1Z30). The first (antiG) and last (synA) nucleotide of the D-loop forms a novel ‘pseudo base pair’ without direct hydrogen bonds. The backbone conformation and the base-stacking pattern of the cGUUAg-loop, however, are highly similar to that of the coxsackieviral uCACGg D-loop (PDB 1RFR) and of the stable cUUCGg tetraloop (PDB 1F7Y) but surprisingly dissimilar to the structure of a cGUAAg stable tetraloop (PDB 1MSY), even though the cGUUAg BEV D-loop and the cGUAAg tetraloop differ by 1 nt only. Together with the presented binding data, these findings provide independent experimental evidence for our model [O. Ohlenschläger, J. Wöhnert, E. Bucci, S. Seitz, S. Häfner, R. Ramachandran, R. Zell and M. Görlach (2004) Structure, 12, 237–248] that the proteinase 3Cpro recognizes structure rather than sequence.
Holzkohlen aus archäologischen Grabungen im Sahel von Burkina Faso belegen die regionale Geschichte der Gehölzvegetation über die letzten 2000 Jahre. Der Bodenbau, den die sesshaft lebende Bevölkerung seit Beginn unserer Zeitrechnung intensiv betreibt, veränderte die Zusammensetzung der Gehölzvegetation vor allem auf den Dünen der Region. Im Vergleich mit der heutigen Vegetation lassen sich zudem klimatische Veränderungen nachweisen. Untersucht wurden über 9000 Fragmente aus sieben verschiedenen archäologischen Grabungen. Sechs Inventare stammen aus Siedlungshügeln. Bei einem Fundplatz handelt es sich um einen Hausgrundriss. Insgesamt wurden 37 Holzkohletypen erkannt und dokumentiert. Die untersuchten Inventare der Siedlungshügel zeigen, dass vor allem die Gehölzvegetation der Dünen und der Galeriewälder zur Brennholzentnahme genutzt wurde. Je nach Lage der Siedlung und dem Schwerpunkt der Wirtschaftsweise können verschiedene Taxa mit höheren Anteilen vertreten sein, möglicherweise zusätzlich verstärkt durch die anthropogene Auswahl von verfügbarem Brennholz. Im Vergleich der Holzkohleinventare lassen sich für die Eisenzeit regionale Entwicklungen erkennen. Die natürlichen Gehölzbestände auf den Dünen, unter anderem aus verschiedenen Akazienarten, wurden, zumindest in der Umgebung der Siedlungen, verdrängt. Stattdessen nahmen aufgrund der selektiven Förderung durch den Menschen die Anteile der Gehölze der Kulturbaumparks, Vitellaria paradoxa und Faidherbia albida zu. Die Landwechselwirtschaft förderte zudem Brachearten insbesondere aus der Familie der Combretaceae. In der späten Eisenzeit nahm Guiera senegalensis zu, die von starker Beweidung der Brachen profitiert. Der Unterwuchs der Galeriewälder an den mares und Wasserläufen wurde mit zunehmender Besiedlungsdauer in der Umgebung der einzelnen Fundplätze aufgelichtet, die Anteile von Combretum micranthum gehen in den Inventaren der einzelnen Siedlungsplätzen jeweils zurück. Klima und Vegetation waren während der Eisenzeit sudano-sahelisch. Auf feuchteres Klima verweisen Vitellaria paradoxa und Detarium microcarpum, die deutlich höhere Niederschläge benötigen, als sie die Region heute erhält. Der hohe Anteil von Taxa, die heute weiter südlich verbreitet sind, belegt zudem den sudanischen Aspekt der Gehölzvegetation. Der Vergleich der anthrakologischen mit den palynologischen und karpologischen Ergebnissen zeigt, dass die Gehölzvegetation sich unter zunehmend arideren Bedingungen in den letzen 2000 Jahren anthropozoogen stark verändert hat. Das Klima scheint aber während der Eisenzeit von 0-1500 AD vergleichsweise stabil gewesen zu sein. Erst danach haben die Niederschläge sich soweit verringert, dass in den letzten 500 Jahren einige sudanische Taxa aus der Region verschwanden, die noch während der Eisenzeit zur regionalen Flora gehört hatten, zum Beispiel Vitellaria paradoxa, Detarium microcarpum und Lannea sp. Der Vergleich der eisenzeitlichen Holzkohleflora mit der rezenten Dynamik der Vegetation und mit der Verbreitung einiger Arten um die Mitte des 20. Jahrhunderts zeigt, dass einige Taxa, wie Terminalia sp. möglicherweise erst in den letzten fünfzig Jahren aus der Region verschwunden sind.
We have isolated the human protein SNEV as downregulated in replicatively senescent cells. Sequence homology to the yeast splicing factor Prp19 suggested that SNEV might be the orthologue of Prp19 and therefore might also be involved in pre-mRNA splicing. We have used various approaches including gene complementation studies in yeast using a temperature sensitive mutant with a pleiotropic phenotype and SNEV immunodepletion from human HeLa nuclear extracts to determine its function. A human–yeast chimera was indeed capable of restoring the wild-type phenotype of the yeast mutant strain. In addition, immunodepletion of SNEV from human nuclear extracts resulted in a decrease of in vitro pre-mRNA splicing efficiency. Furthermore, as part of our analysis of protein–protein interactions within the CDC5L complex, we found that SNEV interacts with itself. The self-interaction domain was mapped to amino acids 56–74 in the protein's sequence and synthetic peptides derived from this region inhibit in vitro splicing by surprisingly interfering with spliceosome formation and stability. These results indicate that SNEV is the human orthologue of yeast PRP19, functions in splicing and that homo-oligomerization of SNEV in HeLa nuclear extract is essential for spliceosome assembly and that it might also be important for spliceosome stability.
Herman P. Schwan [1915–2005] was a distinguished scientist and engineer, and a founding father of the field of biomedical engineering. A man of integrity, Schwan influenced the lives of many, including his wife and children, and his many students and colleagues. Active in science until nearly the end of his life, he will be very much missed by his family and many colleagues.
Der derzeitige Stand der Gentherapie bedarf der Entwicklung neuer Systeme zur Selektion bislang unbekannter Proteine und zur Verbesserung der Gentransfereffizienz viraler Vektorsysteme. Bisher verwendete Systeme wie Phagen display bergen erhebliche Nachteile, die alle auf die Verwendung von Prokaryonten zurückzuführen sind. Deswegen wurde in der vorliegenden Arbeit ein System entwickelt, welches eine Selektion und Produktion von Proteinen im stets eukaryonten Kontext ermöglicht. Dazu wurde ein ein replikationskompetenter retroviraler Vektor entwickelt durch den eine erhebliche Steigerung der Gentransfereffizienz möglich ist. Beide Teilaspekte meiner Arbeit beruhen auf Modifikationen unterschiedlicher Stämme des Maus Leukämie Virus (MLV). Zur Selektion von Proteinen im eukaryonten Kontext wurde erstmalig eine retrovirale display Bibliothek etabliert, wobei ecotropes MLV varible Antikörper-Fragmente (scFv´s) auf der Oberfläche präsentiert. Eine Modellselektion mit dem Antigen Laminin, simuliert durch das Mischen von zwei erstellten Virusvarianten (7A5 Xa Mo/ L36 Xa Mo) in unterschiedlichen Konzentrationen, konnte die Selektion der Laminin-bindenen Variante L36 Xa Mo aus einem Überschuß von 10 hoch -4 nicht bindender 7A5 Xa Mo zeigen. Die Anreicherung der bindenden L36 Xa Mo Variante konnte ebenfalls aus dem Kontext einer erstellten retroviralen alphaHUVEC Bibliothek erzielt werden. Die Anwendbarkeit des Systems wurde durch diese Modellselektionen sowie durch die Selektion der alphaHUVEC Bibliothek auf VEGFR-1 als Antigen demonstriert. Derart selektionierte Proteine konnten im nächsten Schritt, unter Verwendung einer Furinspaltstelle im Hüllprotein des amphotropen MLV, in verschiedenen Zelllinien produziert werden. Gezeigt werden konnte eine effiziente Produktion und Sezernierung der verwendeten scFv´s bis zu einer Konzentration von 6µg/ml im Zellkulturüberstand, wobei der Tropismus des amphotropen MLVs nicht beeinflußt wurde. Die biologische Aktivität derart hergestellter Proteine, konnte mittels FACS und ELISA nachgewiesen werden. Eine Abtrennung von den viralen Bestandteilen kann durch Filtration mit molekularer Ausschlußgrenze erzielt werden. Besonders hervorzuheben ist die genomische Stabilität derart mordifizierter Viren. Trotz des zusätzlichen Leserahmens war das auf die beschriebene Weise modifizierte MLV über 12 Infektionszyklen genetisch stabil und gewährleistete so erstmalig eine stetige Produktion der gewünschten Proteine. Die erfolgreiche Anwendung dieses Vektorsystems zur Tumortherapie erwies sich bereits in weiterführenden Arbeiten.
Ein gentherapeutischer Ansatz für die Behandlung der HIV-Infektion ist die "intrazelluläre Immunisierung" von CD4+-Zellen die den Hauptangriffspunkt des HI-Virus darstellen. Potentiell therapeutische Gene zur Hemmung der HIV-Replikation sind in großer Zahl und für praktisch jeden schritt des Replikationszyklus des Virus publiziert. Ein Problem war allerdings bisher das Fehlen eines einheitlichen und reproduzierbaren Vergleichssystems zur Identifizierung erfolgversprechender Gene für Studien im Tiermodell und in der Klinik. In dieser Arbeit wurde ein solches auf die Gentherapie abgestimmtes Zellkultursystem entwickelt, das auf stabilem Transfer von HIV-inhibitorischen Genen durch retrovirale Transduktion von T-Zellen und Belastungsversuchen mit replikationsfähigen Viren beruht. Dazu wurden auf Basis der humanen T-Zellinie PM1 Zellinien etabliert, die das Markergen egfp sowie ein therapeutisches Gen stabil exprimieren. Für den Gentransfer wurden [MLV(GaLV)]-Vektoren verwendet, die sich für die Transduktion von hämatopoetischen Zellen besonders eignen. Mit Hilfe der etablierten HIV-inhibitorischen Gene RevM10 und STHM (membrangebundenes T20) wurden Methoden zur Generierung dieser stabilen Zellinien optimiert. Um eine höchstmögliche Vergleichbarkeit zu erreichen, müssen die Voraussetzungen für eine HIV-Replikation in allen Zellinien in gleicher Weise gegeben sein. Deshalb wurden Zellinien bei mit praktisch gleicher Zellteilungsrate und HIV-Rezeptorexpression etabliert. Die untrschiedliche Hemmwirkung der Kontrollgene konnte so in Belastungsexperimenten mit drei verschiedenen, repräsentativen HIV-1-Laborstämmen reproduzierbar gezeigt werden. Das erarbeitete Zellkultursystem wurde dann zur Evaluierung verschiedener Gene eingesetzt. Zunächst wurden zwei neue Ansätze für die HIV-Gentherapie getestet. Die hohe Wirksamkeit von APOBEC3Gagm gegen HIV-1, die zuvor in einem "single-round"-Infektionssystem gezeigt worden war, konnte bestätigt werden. Der Versuch, das als natürlicher HIV-Inhibitor in humanem Hämofiltrat gefundene Peptild VIRIP auf der Zelloberfläche zu exprimieren, bewirkte hingegen keine HIV-Hemmung. Zusätzlich wurden mehrere potentiell therapeutische Gene getestet, die von Kooperationspartnern im Rahmen eines HIV-Netzwerkes entwickelt worden waren. Für die humanisierte transdominant-negative Gag-Mutante TDsg Delta 2 konnte eine HIV-Hemmwirkung nachgewiesen werden, während weder die Wildtyp-Mutante TDwt Delta 2 noch das minimale GAG-Fragment L2GAL2-V3 eine signifikante Wirkung zeigten. Für die beiden HIV-1 p6-Konstrukte L4 und L6 war eine HIV-Hemmung ebensowenig wie für die gp41 c-tail-Konstrukte 9/1 und 9/2 feststellbar. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, daß sich die Hemmwirkung der unterschiedlichen Gene gegen HIV-1-Primärisolate im wesentlichen der gegen die Laborstämme entspricht. Nach Infektion der Zellinien mit HIV-2 wurde wie erwartet die Virusreplikation nur durch STHM und TDsg Delta 2 gehemmt. Schließlich wurde getestet, ob sich die Hemmeffekte auch in primären humanen Lymphozyten nachvollziehen lassen. Obwohl aufgrund der in diesen Zellen niedrigen erreichbaren Transduktionseffizienzen und einer starken Donorabhängigkeit keine Standardisierung möglich war, konnte gezeigt werden, daß es prinzipiell möglich ist, Hemmeffekte sichtbar zu machen.