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Modern computational molecular quantum chemical studies, such as the present one, typically employ a wide range of theoretical techniques. The latter are often rather complicated and one should not generally expect that an experimental scientist in the area of physical chemistry, a potential reader of this work, should be familiar with all these techniques. To simplify the reading of the Thesis and to make it self-sufficient, it is supplied with an overview of the employed theoretical methodologies (Chapter 1). The overview explains basic quantum-chemical terminology referred to throughout the Thesis, introduces theoretical foundations of the methods and outlines their properties and limitations. In Part 1.1 of Chapter 1, methods for the solution of the molecular Schrödinger equation are introduced, while in the subsequent Parts 1.2 and 1.3 methods for the solution of the electronic Schrödinger equation are presented to find the ground and excited states, respectively. Part 1.4 is dedicated to basis-set effects which are omnipresent in electronic-structure calculations. It contains a number of unusual insights and concepts proposed by the author and, thus, may be insightful also to experts in quantum chemistry.
In Chapter 2, the phenomenon of acetone-water proton exchange catalyzed by tubular as well as amorphous aggregates of calix[4]hydroquinone (CHQ) macromolecules, which has been observed previously in NMR experiments (Ref. D1D), is investigated by means of correlated quantum-chemical methods. The first part of the study (Section 2.3-2.7) considers concerted proton transfer, assisted by several initially neutral OH-groups in the hydrogen-bonded networks of CHQ aggregates. The second part of the study (Section 2.8-2.13) is dedicated to a second mechanism of proton exchange: step-wise proton transfer via formation of ionic intermediates resulting from CHQ pre-dissociation. CHQ application-specific as well as general conclusions, relevant to the main topic of the Thesis (i.e. influence of specific microsolvation on the considered proton transfer processes), are presented in Section 2.14.
The phenomenon of dual fluorescence observed in clusters of methyl 4-N,N-dimethylaminobenzoate ester (DMABME) and two water molecules in the gas phase, is studied in Chapter 3. Experimentally, the dual fluorescence was detected in experiments combining optical and ground-state ion-depletion infrared spectroscopies in ultracold molecular beams (Ref. D2D). In Section 3.3, calculated ground-state infrared spectra are presented that allow to identify the structures of those isomers, which are present in the gas-phase, as well as the structure of the isomer responsible for dual fluorescence. To further understand the reaction mechanism of dual fluorescence, excited-state potential energy surfaces of the identified isomers were computed along the relevant twisted intermolecular charge-transfer formation coordinate and the mechanism of energy dissipation in these complexes was investigated (Section 3.4-3.5) (Ref. D3D). A brief summary of the main results of this chapter and conclusions are given in Section 3.6. Finally, in Section 3.7 a complementary benchmark study of the quality of ground-state potential energy surfaces of prototypical hydrogen-bonded systems (ammonia-water and formic acid-water dimers) obtained at the level of BSSE-corrected MP2 combined with moderate basis sets, has been conducted. The quality of potential energy surfaces was tested with respect to basis-set size, level of electron correlation and anharmonicity effects and the applied methodology to identify the IR spectrum of hydrated DMABME complexes (Section 3.3) has been found to be sufficient to uniquely assign the IR spectra.
Alzheimer’s disease (AD), which was first reported more than a century ago by Alhzeimer, is one of the commonest forms of dementia which affects >30 million people globally (>8 million in Europe). The origin and pathogenesis of AD is poorly understood and there is no cure available for the disease. AD is characterized by the accumulation of senile plaques composed of amyloid beta peptides (Ab 37-43) which is formed by the gamma secretase (GS) complex by cleaving amyloid precursor protein. Therefore GS can be an attractive drug target. Since GS processes several other substrates like Notch, CD44 and Cadherins, nonspecific inhibition of GS has many side effects. Due to the lack of crystal structure of GS, which is attributed to the extreme difficulties in purifying it, molecular modeling can be useful to understand its architecture. So far only low resolution cryoEM structures of the complex has been solved which only provides a rough structure of the complex at low 12-15 A resolution Furthermore the activity of GS in vitro can be achieved by means of cell-free (CF) expression.
GS comprises catalytic subunits namely presenilins and supporting elements containing Pen-2, Aph-1 and Nicastrin. The origin of AD is hidden in the regulated intramembrnae proteolysis (RIP) which is involved in various physiological processes and also in leukemia. So far growth factors, cytokines, receptors, viral proteins, cell adhesion proteins, signal peptides and GS has been shown to undergo RIP. During RIP, the target proteins undergo extracellular shredding and intramembrane proteolysis.
This thesis is based on molecular modeling, molecular dynamics (MD) simulations, cell-free (CF) expression, mass spectrometry, NMR, crystallization, activity assay etc of the components of GS complex and G-protein coupled receptors (GPCRs).
First I validated the NMR structure of PS1 CTF in detergent micelles and lipid bilayers using coarse-grained MD simulations using MARTINI forcefield implemented in Gromacs. CTF was simulated in DPC micelles, DPPC and DLPC lipid bilayer. Starting from random configuration of detergent and lipids, micelle and lipid bilyer were formed respectively in presence of CTF and it was oriented properly to the micelle and bilyer during the simulation. Around DPC molecules formed micelle around CTF in agreement of the experimental results in which 80-85 DPC molecules are required to form micelles. The structure obtained in DPC was similar to that of NMR structure but differed in bilayer simulations showed the possibility of substrate docking in the conserved PAL motif. Simulations of CTF in implicit membrane (IMM1) in CHAMM yielded similar structure to that from coarse grained MD.
I performed cell-free expression optimization, crystallization and NMR spectroscopy of Pen-2 in various detergent micelles. Additionally Pen-2 was modeled by a combination of rosetta membrane ab-initio method, HHPred distant homology modeling and incorporating NMR constraints. The models were validated by all atom and coarse grained MD simulations both in detergent micelles and POPC/DPPC lipid bilayers using MARTINI forcefield.
GS operon consisting of all four subunits was co-expressed in CF and purified. The presence of of GS subunits after pull-down with Aph-1 was determined by western blotting (Pen-2) and mass spectrometry (Presenilin-1 and Aph-1). I also studied interactions of especially PS1 CTF, APP and NTF by docking and MD.
I also made models and interfaces of Pen-2 with PS1 NTF and checked their stability by MD simulations and compared with experimental results. The goal is to model the interfaces between GS subunits using molecular modeling approaches based on available experimental data like cross-linking, mutations and NMR structure of C-terminal fragment of PS1 and transmembrane part of APP. The obtained interfaces of GS subunits may explain its catalysis mechanism which can be exploited for novel lead design. Due to lack of crystal/NMR structure of the GS subunits except the PS1 CTF, it is not possible to predict the effect of mutations in terms of APP cleavage. So I also developed a sequence based approach based on machine learning using support vector machine to predict the effect of PS1 CTF L383 mutations in terms of Aβ40/Aβ42 ratio with 88% accuracy. Mutational data derived from the Molgen database of Presenilin 1 mutations was using for training.
GPCRs (also called 7TM receptors) form a large superfamily of membrane proteins, which can be activated by small molecules, lipids, hormones, peptides, light, pain, taste and smell etc. Although 50% of the drugs in market target GPCRs , only few are targeted therapeutically. Such wide range of targets is due to involvement of GPCRs in signaling pathways related to many diseases i.e. dementia (like Alzheimer's disease), metabolic (like diabetes) including endocrinological disorders, immunological including viral infections, cardiovascular, inflammatory, senses disorders, pain and cancer.
Cannabinoid and adrenergic receptors belong to the class A (similar to rhodopsin) GPCRs. Docking of agonists and antagonists to CB1 and CB2 cannabinoid receptors revealed the importance of a centrally located rotamer toggle switch, and its possible role in the mechanism of agonist/antagonist recognition. The switch is composed of two residues, F3.36 and W6.48, located on opposite transmembrane helices TM3 and TM6 in the central part of the membranous domain of cannabinoid receptors. The CB1 and CB2 receptor models were constructed based on the adenosine A2A receptor template. The two best scored conformations of each receptor were used for the docking procedure. In all poses (ligand-receptor conformations) characterized by the lowest ligand-receptor intermolecular energy and free energy of binding the ligand type matched the state of the rotamer toggle switch: antagonists maintained an inactive state of the switch, whereas agonists changed it. In case of agonists of β2AR, the (R,R) and (S,S) stereoisomers of fenoterol, the molecular dynamics simulations provided evidence of different binding modes while preserving the same average position of ligands in the binding site. The (S,S) isomer was much more labile in the binding site and only one stable hydrogen bond was created. Such dynamical binding modes may also be valid for ligands of cannabinoid receptors because of the hydrophobic nature of their ligand-receptor interactions. However, only very long molecular dynamics simulations could verify the validity of such binding modes and how they affect the process of activation.
Human N-formyl peptide receptors (FPRs) are G protein-coupled receptors (GPCRs) involved in many physiological processes, including host defense against bacterial infection and resolving inflammation. The three human FPRs (FPR1, FPR2 and FPR3) share significant sequence homology and perform their action via coupling to Gi protein. Activation of FPRs induces a variety of responses, which are dependent on the agonist, cell type, receptor subtype, and also species involved. FPRs are expressed mainly by phagocytic leukocytes. Together, these receptors bind a large number of structurally diverse groups of agonistic ligands, including N-formyl and nonformyl peptides of different composition, that chemoattract and activate phagocytes. For example, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLF), an FPR1 agonist, activates human phagocyte inflammatory responses, such as intracellular calcium mobilization, production of cytokines, generation of reactive oxygen species, and chemotaxis. This ligand can efficiently activate the major bactericidal neutrophil functions and it was one of the first characterized bacterial chemotactic peptides. Whereas fMLF is by far the most frequently used chemotactic peptide in studies of neutrophil functions, atomistic descriptions for fMLF-FPR1 binding mode are still scarce mainly because of the absence of a crystal structure of this receptor. Elucidating the binding modes may contribute to designing novel and more efficient non-peptide FPR1 drug candidates. Molecular modeling of FPR1, on the other hand, can provide an efficient way to reveal details of ligand binding and activation of the receptor. However, recent modelings of FPRs were confined only to bovine rhodopsin as a template.
To locate specific ligand-receptor interactions based on a more appropriate template than rhodopsin we generated the homology models of FPR1 using the crystal structure of the chemokine receptor CXCR4, which shares over 30% sequence identity with FPR1 and is located in the same γ branch of phylogenetic tree of GPCRs (rhodopsin is located in α branch). Docking and model refinement procedures were pursued afterward. Finally, 40 ns full-atom MD simulations were conducted for the Apo form as well as for complexes of fMLF (agonist) and tBocMLF (antagonist) with FPR1 in the membrane. Based on locations of the N- and C-termini of the ligand the FPR1 extracellular pocket can be divided into two zones, namely, the anchor and activation regions. The formylated M1 residue of fMLF bound to the activation region led to a series of conformational changes of conserved residues. Internal water molecules participating in extended hydrogen bond networks were found to play a crucial role in transmitting the agonist-receptor interactions. A mechanism of initial steps of the activation concurrent with ligand binding is proposed.
I accurately predicted the structure and ligand binding pose of dopamine receptor 3 (RMSD to the crystal structure: 2.13 Å) and chemokine receptor 4 (CXCR4, RMSD to the crystal structure 3.21 Å) in GPCR-Dock 2010 competition. The homology model of the dopamine receptor 3 was 8 th best overall in the competition.
Analyse und Vorhersage von Kristallstrukturen tetraederförmiger Moleküle und fehlgeordneter Phasen
(2012)
Die Kristallstrukturen tetraederförmiger EX4-Moleküle mit E = C, Si, Ge, Sn, Pb und X = F, Cl, Br, I konnten in sieben Strukturtypen eingeteilt werden. In fast allen Verbindungen nehmen die Halogenatome eine verzerrte Kugelpackung (ccp, hcp, bcc, cp) ein. Die E-Atome besetzen in den dichtesten Kugelpackungen 1/8 aller Tetraederlücken, wobei sich für diese Atome ebenfalls eine Anordnung wie für verzerrte Kugelpackungen ergibt (cp, ccp, hcp). In den anderen Fällen (bcc, cp für die Anordnung der Halogenatome) ergibt sich für die Anordnung der E-Atome selbst ebenfalls eine verzerrte Kugelpackung (bcc, s). Dabei steht s für die Anordnung der E-Atome analog der Schwefelatome im Pyrit (FeS2). Jeder Strukturtyp unterscheidet sich in der Art der kürzesten Halogen-Halogen-Wechselwirkungen. Die in der Literatur für halogenierte organische Verbindungen beschriebenen Typen der Wechselwirkung lassen sich auch bei den EX4-Verbindungen finden. Die E-X-X-Winkel liegen in einem Bereich von 80-100° und 130-160° und sind damit etwas kleiner als für die halogenierten organischen Verbindungen. Mit Hilfe von Gitterenergieminimierungen konnten diverse potentielle Polymorphe für die EX4-Verbindungen vorhergesagt werden.
Eine vollständige Kristallstrukturvorhersage wurde für SiBr4 durchgeführt. Für diese Vorhersage wurden die Van-der-Waals-Parameter neu bestimmt. Dazu wurde das Br-Br-Potential mit Hilfe von Vergleichsrechnungen an den beiden experimentellen Strukturen des GeBr4 in den Raumgruppentypen Pa3, Z = 8 (s/ccp), und P21/c, Z = 4 (hcp/hcp), optimiert. Für die Vorhersage des SiBr4 konnten zwei der vorhergesagten Strukturen durch extern durchgeführte Kristallisationsexperimente bestätigt werden. Eine Hochtemperaturmodifikation kristallisiert oberhalb von 168K im Raumgruppentyp Pa3, Z = 8 im Strukturtyp s/ccp. Diese Struktur konnte bei der Vorhersage auf Rang 9 gefunden werden. Die Tieftemperaturmodifikation, die unterhalb von 168K vorliegt, kristallisiert im Raumgruppentyp P21/c, Z = 4 (Strukturtyp hcp/hcp). Diese Struktur hat Rang 4 der Vorhersage. Die vorhergesagten und experimentellen Strukturen zeigen nur geringe Abweichungen voneinander.
Für die tetraederförmigen E(CH3)4-Moleküle wurden für Tetramethylsilan und Tetramethylgerman vollständige Kristallstrukturvorhersagen durchgeführt. Die energetisch günstigste Struktur ist für beide Verbindungen im Raumgruppentyp Pa3 mit Z = 8 zu finden. Die energetisch zweitgünstigste Struktur hat den Raumgruppentyp Pnma mit Z = 4. Für Tetramethylsilan konnten die Strukturen mit Rang 1 und 2 experimentell bestätigt werden. Eine Hochdruckmodifikation des Tetramethylsilans kristallisiert im Raumgruppentyp Pa3 mit Z = 8. Diese Struktur entspricht der berechneten energetisch günstigsten Struktur auf Rang eins. Ihr konnte der Strukturtyp s/ccp zugeordnet werden. Mit Tieftemperatur-Röntgenpulverbeugungsexperimenten konnte eine Tieftemperaturmodifikation bei T = 100 K im Raumgruppentyp Pnma, Z = 4, mit Strukturtyp ccp/hcp gefunden werden.
Gitterenergieberechnungen wurden für die Strukturanalysen von drei fehlgeordneten Phasen eingesetzt. Experimentell bestimmte Kristallstrukturen von Azulen und Pigment Red 194 haben den Raumgruppentyp P21/c, Z = 2. Die Moleküle befinden sich dabei auf einer Punktlage mit Inversionssymmetrie. Da beide Moleküle kein Inversionszentrum aufweisen, kommt es zu einer Orientierungsfehlordnung. Für die rechnerische Analyse der Fehlordnung wurden jeweils sechs geordnete Modelle ausgehend von den fehlgeordneten Strukturen erstellt, die möglichst wenige Moleküle pro Elemenarzelle aufweisen sollten. Gitterenergieberechnungen und die Auswertung der Boltzmann-Verteilung zeigten, dass in bei beiden Kristallstrukturen eine statistische Fehlordnung der Moleküle vorliegt, die sich aus mehreren geordneten Modellen aufbauen lässt. Bei Azulen ist eine geordnete Struktur im Raumgruppentyp Pa, Z = 4, energetisch etwas günstiger als die anderen Modell. Für Pigment Red 194 zeigte sich, dass die Fehlordnung unter der Annahme, dass nur die berechneten Modelle die fehlgeordnete Struktur bilden, mit über 99%iger Wahrscheinlichkeit aus den vier energetisch günstigsten Modellen Pc, Z = 2, P21, Z = 2, P21/c, Z = 4 und Pc, Z = 4 besteht.
Die dritte untersuchte fehlgeordnete Struktur ist die des Natrium-p-chlorphenylsulfonat-Monohydrats. Die Fehlordnung bezieht sich hier nur auf die Phenylringe, die dort mit einer Besetzung von 50% zueinander senkrecht stehen. Mit Hilfe der Order-Disorder-Theorie konnten zwei geordnete Modelle im Raumgruppentyp P21/c und ein weiteres geordnetes Modell im Raumgruppentyp C1c1 (Z = 16, Z'= 2) aufgestellt werden. Gitterenergieminimierungen dieser Modelle zeigten, dass sich die Fehlordnung statistisch aus allen drei Modellen zusammensetzt. Das energetisch günstigste geordnete Modell im Raumgruppentyp P21/c, Z = 8 (Z' = 2), konnte als verzwillingte Struktur aus Einkristalldaten bestätigt werden.
Pulsed electron–electron double resonance (PELDOR) spectroscopy is a powerful tool for measuring nanometer distances in spin-labeled systems and recently is increasingly applied to membrane proteins. However, after reconstitution of labeled proteins into liposomes, spin labels often exhibit a much faster transversal relaxation (Tm) than in detergent micelles, thus limiting application of the method in lipid bilayers. In the first part of the thesis, optimization of transversal relaxation in phospholipid membranes was systematically investigated by use of spin-labeled derivatives of stearic acid and phosphatidylcholine as well as spin-labeled derivatives of the channel-forming peptide gramicidin A under the conditions typically employed for PELDOR distance measurements. Our results clearly show that dephasing due to instantaneous diffusion that depends on dipolar interaction among electron spins is an important contributor to the fast echo decay in cases of high local concentrations of spin labels in membranes. The main difference between spin labels in detergent micelles and membranes is their local concentration. Consequently, avoiding spin aggregation and suppressing instantaneous diffusion is the key step for maximizing PELDOR sensitivity in lipid membranes. Even though proton spin diffusion is an important relaxation mechanism, only in samples with low local concentrations does deuteration of acyl chains and buffer significantly prolong Tm. In these cases, values of up to 7 μs have been achieved. Furthermore, our study revealed that membrane composition and labeling position in the membrane can also affect Tm, either by promoting the segregation of spin-labeled species or by altering their exposure to matrix protons. Effects of other experimental parameters including temperature (<50 K), presence of oxygen, and cryoprotectant type are negligible under our experimental conditions.
In the second part of the thesis, inhomogeneous distribution of spin-labels in detergent micelles has been studied. A common approach in PELDOR is measuring the distance between two covalently attached spin labels in a macromolecule or singly-labeled components of an oligomer. This situation has been described as a spin-cluster. The PELDOR signal, however, does not only contain the desired dipolar coupling between the spin-labels of the molecule or cluster under study. In samples of finite concentration the dipolar coupling between the spin-labels of the randomly distributed molecules or spin-clusters also contributes significantly. In homogeneous frozen solutions or lipid vesicle membranes this second contribution can be considered to be an exponential or stretched exponential decay, respectively. In this study, it is shown that this assumption is not valid in detergent micelles. Spin-labeled fatty acids that are randomly partitioned into different detergent micelles give rise to PELDOR time traces which clearly deviate from stretched exponential decays. As a main conclusion a PELDOR signal deviating from a stretched exponential decay does not necessarily prove the observation of specific distance information on the molecule or cluster. These results are important for the interpretation of PELDOR experiments on membrane proteins or lipophilic peptides solubilized in detergent micelles or small vesicles, which often do not show pronounced dipolar oscillations in their time traces.
In the third part, PELDOR has been utilized to study the structural flexibility of the Toc34 GTPase homodimer, a preprotein receptor of the translocon of the outer envelope of chloroplasts (TOC). Toc34 belongs to GAD subfamily of G-proteins that are regulated and activated by nucleotide-dependent dimerization. However, the function of Toc34 dimerization is not yet fully understood. Previous structural investigations of the Toc34 dimer yielded only marginal structural changes in response to different nucleotide loads. PELDOR revealed a nucleotide-dependent transition of the dimer flexibility from a tight GDP to a flexible GTP-loaded state. Substrate-binding stabilizes the dimer in the transition state mimicked by GDP-AlFx, but induces an opening in the GDP or GTP-loaded state. Thus, the structural dynamics of bona fide GTPases induced by GTP hydrolysis is replaced by substrate-dependent dimer flexibility, which represents the regulatory mode for dimerizing GTPases.
In the fourth part of the thesis, conformational flexibility and relative orientation of the N-terminal POTRA domains of a cyanobacterial Omp85 from Anabaena sp. PCC 7120, a key component of the outer membrane protein assembly machinery, were investigated by PELDOR spectroscopy. Membrane proteins of the Omp85-TpsB superfamily are composed of a C-terminal β-barrel and a different number of N-terminal POTRA domains, three in the case of cyanobacterial Omp85. It has been suggested that the N-terminal POTRA domains (P1 and P2) might have functions in substrate recognition. Molecular dynamics (MD) simulations predicted a fixed orientation for P2 and P3 and a flexible hinge between P1 and P2. The PELDOR distances measured between the P2 and P3 POTRA domains are in good agreement with the structure determined by X-ray, and compatible with the MD simulations suggesting a fixed orientation between these domains. PELDOR constraints between the P1 and P2 POTRA domains imply a rather rigid structure with a slightly different relative orientation of these domains compared with the X-ray structure. Moreover, the large mobility predicted from MD is not observed in the frozen solution. The PELDOR results further highlight the restricted relative orientation of the POTRA domains of the Omp85-TpsB proteins as a conserved characteristic feature that might be important for the processive sliding of the unfolded substrate towards the membrane.
Hepatitis C virus (HCV) assembly and production is closely linked to lipid metabolism. Indeed, lipid droplets (LD) have been shown to serve as a platform for HCV assembly. To investigate the effect of HCV on the host cell proteome, 2D-gelelectrophoresis with subsequent MALDI-TOF mass spectrometry of HCV replicating and the corresponding control cells were done. Based on this analysis, it was found out that HCV-replicating Huh7.5 cells revealed lower amounts of TIP47 (tail interacting protein of 47kD) compared to HCV-negative cells. TIP47, a cytoplasmic sorting factor, has been shown to be associated with lipid droplets. As it is known that HCV-replication and assembly takes place at the so called ”membranous web” that is composed of LDs and rearranged ER-derived membranes, it was tempting to investigate the role of TIP47 in HCV life-cycle. Western blot analysis did reveal that overexpression of TIP47 in HCV replicating Huh7.5 cells leads to decreased amounts of the HCV core protein while the levels of non-structural protein (NS)5A and intracellular HCVgenomes are increased. Moreover, in TIP47 overproducing cells higher amounts of infectious HCV particles are secreted. Vice versa, inhibition of TIP47 expression by siRNA results in a decreased level of intracellular NS5A, increased amounts of intracellular core and less infectious viral particles in the supernatant. In addition, complete silencing of TIP47 by lentiviral transduction abolishes HCV replication that can be restored by transfection of these cells with a TIP47 expression construct. It has been shown recently that apoE binds to NS5A and that this interaction plays an important role for the HCV life cycle (Benga et al., 2010). The C-terminal part of TIP47 harbours a 4 helix bundle motif and displays high homology to the N-terminus of apoE. Therefore, we investigated the interaction of NS5A and TIP47. Confocal double immunofluorescence microscopy revealed that a fraction of NS5A colocalizes with TIP47. Coimmunoprecipitation experiments and a yeast-two-hybrid screening confirmed the interaction between NS5A and TIP47 and deletion of the N-terminal-TIP47-PAT domain abolishes this interaction. From this we conclude that the TIP47-NS5A interaction is required for virus morphogenesis. Moreover, TIP47 can bind to Rab9 and this is relevant for targeting the viral particle out of the cell. In accordance to this, TIP47 was identified to be associated to the viral particle. Mutants of TIP47 that fail to bind Rab9 reveal lower amounts and a changed distribution of the HCV core protein. Furthermore, we could see that the core staining colocalizes with subcellular structures that were identified as autophagosomes using a p62-specific antibody which is a specific autophagosome-marker. Based on this, we hypothized that destruction of the Rab9 binding domain misdirects the viral particle towards the lysosomal compartment.
For the first time it could be shown that TIP47 interacts with NS5A and is associated to the viral particle, therefore plays a crucial role for the virus morphogenesis and secretion of the viral article.
Taken together, these results indicate that TIP47 is an essential cellular factor for the life cycle of HCV Abstract and might be used as target for antiviral treatment, e.g. by targeting the NS5A-TIP47 interaction, based on small molecules that mimic the NS5A-specific sequence that binds to TIP47 which might result in a competition of the TIP47/NS5A interaction.
The universal biological energy currency adenosine triphosphate (ATP) is synthesized by the F1Fo-ATP synthase in most living organisms. The overall structure and function of F-type ATPases is conserved in the different organisms. The F1Fo-ATP synthase consist of two domains; the soluble F1 complex has the subunit stoichiometry α3β3γδε and the membrane embedded Fo complex consists of subunits ab2c10-15 in its simplest form found in bacteria. F1 and Fo both function as reversible rotary motors that are connected by a central stalk (γε) and a peripheral stalk (b2δ).
For ATP synthesis, the electrochemical energy formed by a proton or sodium ion gradient is required. The ion translocation across the Fo subcomplex induces torque in the motor part of the enzyme (cnγε), which causes conformational changes in the α3β3 domain leading to ATP synthesis from ADP and inorganic phosphate (Pi) catalyzed in the β-subunits. ATP hydrolysis causes a reverse torque in the Fo subcomplex triggering uphill ion translocation from cytoplasm to periplasm, and the enzyme functions as an ion pump.
The ATP synthesis mechanism is well understood, since several high-resolution structures of F1 are available. In contrast, the ion translocation mechanism across the membrane, mediated by the Fo subcomplex, is not understood in its structural detail.
Subunit a and the c-ring form an ion pathway, but subunit b is needed to form an active ion translocation pathway in both H+- and Na+-dependent systems. Several high-resolution structures of c-rings have provided insights in the ion translocation mechanism. The different ion translocation models based on biochemical, biophysical and structural analysis are in agreement in the fact that ions are translocated through a periplasmic ion access pathway in subunit a to the middle of the membrane and there to the binding site of a c-subunit. After almost a whole rotation of the c-ring the ion returns into the a-c interface, where it can be released to the cytoplasm. In the different models the cytoplasmic access pathway has been proposed to be located in subunit a, at the a-c interface or within the c-ring. The driving force of torque generation has been proposed to be the pH gradient or membrane potential. Several biochemical studies show that a conserved arginine in helix four of subunit a (R226 in Ilyobacter tartaricus or R210 in Escherichia coli)plays a critical role in the ion translocation. The arginine has been proposed to function as an electrostatic separator between the cytoplasmic and periplasmic pathways and as a mediator of the ion exchange into the c-ring ion-binding site.
Structural data of a related enzyme (V1Vo-ATPase from Thermus thermophilus) has provided insight into the helical arrangement of the ion translocating subunits I and Lring (related to subunit a and the c-ring). These structures indicated a small interface between subunit I and the L-ring, and two four-helix bundles in the N-terminal domain of subunit I were proposed to build the periplasmic and cytoplasmic ion pathways. To comprehend the ion-translocation and torque generation mechanism in F1Fo-ATP synthase, structural data of an intact a-c complex is needed.
The goal of this work was to obtain structural data of subunit a, most preferably in a complex with the c-ring or additionally with subunit b. Therefore, a new purification procedure for the I. tartaricus Fo-subcomplex, heterologously expressed in E. coli cells, was established. The purified Fo was characterized biochemically and by Laserinduced liquid bead ion desorption mass spectrometry (LILBID-MS). These analyses showed that pure and completely assembled Fo containing all its subunits in the correct stoichiometry (ab2c11) was obtained. The purified Fo complex was stable at 4°C for several months and at room temperature in the presence of lipids for several weeks. A lipid analysis was performed by thin-layer chromatography (TLC) to investigate the qualitative lipid composition of I. tartaricus whole lipid extract and various I. tartaricus F1Fo isolates. The whole lipid extract contained PC, PG and PE lipids and probably cardiolipin. PC, PG and PE lipids were bound to wild type I. tartaricus F1Fo, whereas recombinant I. tartaricus F1Fo did not have any bound lipids, but was able to bind the synthetic lipids POPC and POPG if they were provided during the purification.
For subsequent structural studies the purified Fo was subjected to two-dimensional (2D) crystallization trials. Vesicles and sheets tightly packed with protein and crystals with a rare plane group for I. tartaricus c11 (p121) were obtained. The c-ring was visible in the CCD images, and immunogold-labeling revealed the presence of the His-tagged a-subunit in the reconstituted vesicles. Furthermore, atomic force microscopy (AFM) imaging showed protein densities next to the c-rings, which protruded less from the membrane (0.4±0.1 nm) than the c-ring (0.7±0.1 nm). These protein densities presumably belonged to subunit a.
Cryo-electronmicroscopy (cryo-EM) was used to collect data of the p121 crystals and a merged projection density map was calculated to 7.0 Å resolution. The unit cell of the crystals (81 × 252 Å) contained two asymmetric units with three c-rings in each and next to the c11-rings new prominent densities were visible. In each extra density up to 7 transmembrane helices were visible, belonging to the stator subunit a and/or subunit b. To elucidate whether there are conserved elements in the three extra densities non-crystallographic averaging was applied using a single-particle approach.
Six possible arrangements for the c-rings and the extra densities were identified and used for the averaging. The extra densities were enhanced only in one of the possible arrangements. The average showed a four-helix bundle and a fifth helix in close proximity to the c-ring. Two more helices were present in each position but their position was ambivalent. The data obtained in this work provides the first insight in the helical arrangement in the a-c interface of F1Fo-ATP synthase.
Lewis-azide Organoborverbindungen finden Verwendung als Anionensensoren und als (Co)katalysatoren in der Metallocen-vermittelten Olefinpolymerisation bzw. in elektrocyclischen Reaktionen. Mit Lewis-Basen, die sterisch anspruchsvolle Reste tragen, können sie keine stabilen Addukte ausbilden. Solche Systeme werden als „frustrierte Lewispaare“ (FLPs) bezeichnet. Diese zeigen eine besondere kooperative Reaktivität gegenüber kleinen Molekülen und haben sich insbesondere in der metallfreien Aktivierung molekularen Wasserstoffs bewährt. Ein Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer kostengünstigen, ungefährlichen und einfachen Synthese von (C6F5)2BH („Piers' Boran“). Dieses stark elektrophile Reagenz wird in der FLP-Chemie eingesetzt und monohydroboriert selektiv terminale C≡C-Funktionen. Die literaturbekannten Darstellungsmethoden dieses Borans sind präparativ aufwendig oder erfordern kostspielige Startmaterialien. Die Hydrid-Abstraktion aus dem [(C6F5)2BH2]−-Anion, welches aus einer Eintopfreaktion zwischen BH3·SMe2, C6F5MgBr und ClSiMe3 erhalten wurde und je nach Aufarbeitung in der Zusammensetzung [Mg2(Et2O)3Br2Cl][(C6F5)2BH2] bzw. [Mg(Et2O)2][(C6F5)2BH2]2 kristallisiert, bietet eine Methode zur insitu-Präparation von Piers' Boran. Es kann mit terminalen Alkinen als Monohydroborierungsprodukt oder mit Dimethylsulfid als Lewis-Säure-Base-Addukt abgefangen werden (Abbildung 1). Zusätzlich sind sowohl das Salz [Mg2(Et2O)3Br2Cl][(C6F5)2BH2] als auch das Addukt (C6F5)2BH·SMe2 geeignete Präkursoren für die literaturbekannten FLPs I und II...Mit dem Ziel der Synthese eines Methylen-verbrückten Boran-Phosphans zur H2-Aktivierung wurde der Borinsäureester (C6F5)2BOEt mit dem Lithiumorganyl LiCH2PtBu2 umgesetzt. Dies lieferte nicht die Zielverbindung (C6F5)2BCH2PtBu2, sondern in sehr selektiver Reaktion das bicyclische Phosphoniumborat (EtO)(C6F5)B(CH2)(C6F4)PtBu2 ((III)OEt), welches mit HCl quantitativ zum Chlorid-Addukt (III)Cl reagiert (Abbildung 2). Dadurch wird am (chiralen) Borzentrum eine bessere Abgangsgruppe eingeführt und die luftund wasserstabile Spezies (III)OEt aktiviert. Der Fluorierungsgrad in (III)Cl kann durch Austausch des exocyclischen C6F5-Restes gegen eine Phenylgruppe oder durch eine F/H- bzw. F/tBu-Substitution am verbrückenden C6F4-Ring variiert werden. Nach Ersatz einer tBu-Funktion am Phosphoratom gegen eine Methylgruppe wurde ein zweites Chiralitätszentrum in das Molekülgerüst des Phosphoniumborats eingeführt. Mit Silbersalzen schwach koordinierender Anionen (AgA) reagiert (III)Cl quantitativ zu den entsprechenden Addukten (III)A (A = Acetat, Trifluoracetat, Nitrat, Tosylat, Triflat). Ungeladene Donoren (Do) verdrängen den Triflat-Rest in (III)OTf und führen zu den Salzen [(III)Do]+[OTf]− (Do = OPEt3, Pyridin, H2O)...Das freie Boran [III]+ existiert nur in Gegenwart des sehr schwach koordinierenden Anions [Al[OC(CF3)3]4]–. Mit einer Gutmann-Akzeptornummer (AN) von AN = 87.3 ist es eine stärkere Lewis-Säure als die ungeladene Verbindung (C6F5)3B (AN = 80.0). Auch die – im Vergleich zu (C6F5)3B·Do – kürzeren B–O/N-Bindungslängen in [(III)Do][OTf] (Do = OPEt3, Pyridin, H2O) bestätigen diese Beobachtung. Sowohl die freie Lewis-Säure [III]+ als auch ihr Triflat-Addukt (III)OTf katalysieren die Diels-Alder-Reaktion zwischen Cyclopentadien und 2,5-Dimethyl-,4-benzochinon. Die Reaktion läuft in Gegenwart von [III]+ schneller ab als in Anwesenheit von (III)OTf. Dennoch hat das Triflat-Addukt gegenüber [III]+ den Vorteil, dass im Laufe der Cycloaddition keine konkurrierende Polymerisation des Cyclopentadiens auftritt.
In the absence of apparent mutations, alteration of gene expression patterns represents the key mechanism by which normal cells evolve to cancer cells.
Gene expression is tightly regulated by posttranscriptional processes. Within this context, RNA-binding proteins (RBPs) represent fundamental factors, since they control mechanisms, such as mRNA-stabilization, -translation and -degradation. Human antigen R (HuR) was among the first RBPs that have been directly associated to carcinogenesis. HuR modulates the stability and translation of mRNAs which encode proteins facilitating various ‘hallmarks of cancer’, namely proliferation, evasion of growth suppression, angiogenesis, cell death resistance, invasion and metastasis. Furthermore, it is well established that tumor-promoting inflammation contributes to tumorigenesis. In this process, monocytes are attracted to the site of the tumor and educated towards a tumor-promoting macrophage phenotype. While HuR has been extensively studied in various tumor cell types, little is known about HuR in hepatocellular carcinoma (HCC). Thus, the aim of my work was to characterize the contribution of HuR to the development of cancer characteristics in HCC. I was particularly interested to investigate if HuR facilitates tumor-promoting inflammation, since a role for HuR has not been described in this context. To this end, I depleted HuR in HepG2 cells (HuR k/d) and used a co-culture model of HepG2 tumor spheroids and infiltrating monocytes to study the impact of HuR on the tumor microenvironment. I could show that depletion of HuR resulted in the reduction of cell numbers. Additionally, the expression of proliferation marker KI-67 and proto-oncogene c-Myc was reduced, supporting a proliferative role of HuR. Furthermore, exposure to cytotoxic staurosporine elevated apoptosis in HuR k/d cells compared to control cells. Concomitantly, the expression of the anti-apoptotic mediator B-cell lymphoma protein-2 (Bcl-2) was markedly reduced in the HuR k/d cells, pointing to an involvement of HuR in cell survival processes.
Accordingly, a pro-survival function of HuR was also observed in tumor spheroids, since HuR k/d spheroids exhibited a larger necrotic core region at earlier time points and showed elevated numbers of dead cells compared to control (Ctr.) spheroids. Interestingly, HuR k/d spheroids isplayed reduced numbers of infiltrated macrophages, suggesting that HuR contributes to a tumor-promoting, inflammatory microenvironment by recruiting monocytes/macrophages to the tumor site. Aiming at identifying HuR-regulated factors responsible for the recruitment of monocytes, I found reduced levels of the chemokine interleukin 8 (IL-8) in supernatants of HuR k/d spheroids, supporting a critical involvement of HuR in the chemoattraction of monocytes. Analyzing supernatants of co-cultures of macrophages and HuR k/d or Ctr. spheroids revealed additional differences in chemokine secretion patterns. Interestingly, protein levels of many chemokines were elevated in co-cultures of HuR k/d spheroids compared to control co-cultures. Albeit enhanced chemokine secretion was observed, less monocytes are recruited into HuR k/d spheroids, further underlining the necessity of HuR in cancer related monocyte/macrophage attraction and infiltration. Differences between chemokine profiles of mono- and co-cultured spheroids could be attributable to changes in spheroid-derived chemokines as a result of the crosstalk with the immune cells. Provided the chemokines originate from monocytes/macrophages, the different secretion patterns suggest that HuR contributes to the modulation of the functional phenotype of infiltrated macrophages, since the tumorenvironment is critically involved in the shaping of macrophage phenotypes. Regions of low-oxygen (hypoxia) represent another critical feature of tumors. Therefore, I next analyzed the impact of HuR on the hypoxic response. Loss of HuR attenuated hypoxia-inducible factor (HIF) 2α expression after exposure to hypoxia, while HIF-1α protein levels remained unaltered. Considering previous results of our group, showing that HIF-2α depletion (HIF-2α k/d) resulted in the enhanced expression of HIF-1α protein, I aimed to determine the involvement of HuR in the compensatory upregulation of HIF-1α protein in HIF-2α k/d cells. I could demonstrate that not only total HuR protein levels, but specifically cytoplasmic HuR was elevated in HIF-2α depleted cells pointing to enhanced HuR activity. Silencing HuR in HIF-2α deficient cells attenuated enhanced HIF-1α protein expression, thus confirming a direct role of HuR in the compensatory upregulation of HIF-1α. This as also reflected on HIF-1α target gene expression. I further investigated the mechanism underlying the compensatory HIF-1α expression in HIF-2α deficient cells. Analyzing HIF-1α mRNA expression, I excluded enhanced HIF1-α transcription and stability to account for elevated HIF-1α expression in HIF-2α k/d cells. HIF-1α promoter activity assays confirmed the mRNA data. Furthermore, HIF-1α protein half-life was not elevated in HIF-2α k/d cells compared to control cells, indicating that HIF-1α protein stability is not altered in HIF-2α k/d cells. Analysis of the association of HIF-1α with the translational machinery using polysomal fractionation finally revealed an increased istribution of HIF-1α mRNA in the heavier polysomal fractions in HIF-2α k/d cells compared to control cells. Since augmented ribosome occupancy is an indicator for more efficient translation, I propose enhanced HIF-1α translation as underlying principle of the compensatory increase in HIF-1α protein levels in HIF-2α k/d cells. In summary, my results demonstrate that HuR is critical for the development of cancer characteristics in HCC. Future work analyzing the impact of HuR on tumor-promoting inflammation, specifically macrophage attraction and activation could provide new trategies to inhibit macrophage-driven tumor progression. Furthermore, I provide evidence that HuR contributes to the hypoxic response by regulating the expression of HIF-1α and HIF-2α. Targeting single HIF-isoforms for tumor therapy should be carefully considered, because of their compensatory regulation when one α-subunit is depleted. Thus, therapeutic strategies targeting factors such as HuR that control both α-subunits and at the same time prevent compensation might be more promising.
Es wurde die Photodynamik freier kolloidaler CdSe Quantenpunkte sowie die Elektronentransfer(ET)-Dynamik im System bestehend aus CdSe Quantenpunkten und adsorbiertem Methylviologen mit Hilfe der Femtosekunden-Laserspektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. Die freien CdSe Quantenpunkte wiesen eine multiphasische Rekombinationsdynamik der photoinduzierten Exzitonen auf, was durch das Vorhandensein von Quantenpunkten mit unterschiedlichem Passivierungsgrad innerhalb einer Quantenpunktprobe erklärt wurde. Sowohl die Rekombinationsdynamik des Exzitons als auch die Intraband-Relaxation von Elektron und Loch besaßen eine Abhängigkeit von der Partikelgröße. Die 1P-1S-Relaxationzeit des Elektrons betrug in Partikeln mit Durchmessern von 3 nm und 6,3 nm 0,12 ps bzw. 0,24 ps, woraus sich Energieverlustraten von 1,0 eV/ps und 3,8 eV/ps berechnen ließen. Die sehr schnelle Natur der 1P-1S-Relaxation und die gefundene Größenabhängigkeit stehen im Einklang mit dem vermuteten Auger-artigen Energietransfer vom hochangeregten Elektron auf das Loch. Durch diesen Prozess kann das theoretisch vorhergesagte „phonon bottleneck“ effizient umgangen werden. Zudem konnte eine größenabhängige Biexziton-Bindungsenergie zwischen 40 meV und 28 meV ermittelt werden. Die Untersuchung von Multiexzitonen in CdSe Quantenpunkten zeigte einen schnellen Zerfallskanal. Es handelt es sich um die Auger-Rekombination. Die Rekombination nach 1P-Anregung wurde in Form von sequenziellen Schritten N, N-1, N-2,..., 1 interpretiert. Für das System bestehend aus CdSe Quantenpunkten und adsorbiertem Methylviologen wurde war eine Zunahme der ET-Rate bei steigender Akzeptorkonzentration zu beobachten, die mit der Zunahme von Akzeptorzuständen erklärt werden kann. Ferner wurde eine maximale ET-Rate erreicht, die bei einer weiteren Erhöhung der Akzeptorkonzentration nicht überschritten wird. In weiteren Versuchsreihen konnte gezeigt werden, dass die Größe der Partikel einen Einfluss auf den ET-Prozess zwischen Quantenpunkt und Methylviologen hat. Eine kombinierte Studie, in der sowohl das Quantenpunkt/Methylviologen-Verhältnis als auch die Quantenpunktgröße variiert wurde, verdeutlichte, dass eine Verkleinerung der Partikel zu einem Anstieg der ET-Rate führt. Die Variation der Partikelgröße geht mit einer Veränderung der Triebkraft der ET-Reaktion im gekoppelten System einher. Der gefundene Zusammenhang zwischen der Triebkraft der Reaktion und der ET-Rate ist gut mit der Marcus-Theorie vereinbar. In einer Serie von Experimenten am Quantenpunkt/Methylviologen ET-System wurde die Anregpulsenergie variiert, um den Einfluss von Multiexzitonen auf den Elektronentransfer zu untersuchen. Es zeigte sich, dass nach Mehrfachanregung der Quantenpunkte die Separation von bis zu vier Elektron-Loch-Paaren möglich ist. Für den Elektronentransfer im untersuchten ET-System wurde eine ET-Zeit von ca. 200 fs ermittelt. Diese ist deutlich kürzer als die gefundenen Auger-Rekombinationszeiten, die sich zwischen 1,5 ps und 5 ps bewegen. In einer Studie an CdSe/CdS Kern/Schale Partikeln wurde der Einfluss einer passivierenden anorganischen Schale auf den ET-Prozess untersucht. Bei der gewählten Heterostruktur handelte es sich um Typ I Kern/Schale Partikel, in denen sowohl Elektron und Loch hauptsächlich im Kern eingeschlossen sind. Es wurde ein exponentieller Abfall der ET-Rate mit wachsender Schalendicke beobachtet, weshalb davon auszugehen ist, dass die CdS-Schale als elektronische Barriere wirkt, durch die das photoangeregte Elektron tunneln muss, um mit dem Akzeptor reagieren zu können. Schließlich wurde der Einfluss des Elektronentransfers im ET-System auf die Entstehung von Phononen untersucht. Sowohl in freien Quantenpunkten als auch im gekoppelten System konnte das LO sowie das LA Phonon beobachtet werden, wobei das LA Phonon im gekoppelten System stark unterdrückt ist. Im Falle der freien Quantenpunkte sind die beobachteten Oszillationen eine Folge der Frequenzmodulation der Absorption des angeregten Zustandes. Mit Hilfe des Huang-Rhys-Parameters ließ sich ermitteln, wie stark in freien Quantenpunkten das LO Phonon an das Exziton gekoppelt ist. Der berechnete Huang-Rhys-Parameter betrug 0,012. Im Falle des gekoppelten Systems weist die spektrale Signatur der kohärenten Oszillationen darauf hin, dass diese durch die Frequenzmodulation der linearen QP-Absorption verursacht werden. Im Falle des gekoppelten Systems sind die beobachteten Phononen nicht an das Exziton sondern an die ET-Reaktion gekoppelt, d. h. der ET selbst induziert Gitterschwingungen im Reaktionsprodukt. Der berechnete Huang-Rhys-Parameter, der die ET-Phonon-Kopplung beschreibt, berechnete sich ebenfalls zu 0,012, was verdeutlicht, dass die ET-Phonon-Kopplung ähnlich stark wie die Exziton-Phonon-Kopplung ist. Mit Hilfe der spektralen Abhängigkeit der Oszillationen in freien Quantenpunkten und im gekoppelten System ließ sich eine Biexziton-Bindungsenergie von 35 meV berechnen.
The tumor suppressor programmed cell death 4 (Pdcd4) exerts its function by inhibiting protein translation initiation. Specifically, it displaces the scaffold protein eukaryotic initiation factor 4G (eIF4G) from its binding to the eukaryotic initiation factor 4A (eIF4A). Thereby, Pdcd4 inhibits the helicase activity of eIF4A, which is necessary for the unwinding of highly structured 5’ untranslated regions (UTRs) of messenger RNAs (mRNAs) often found in oncogenes like c-myc to make them accessible for the translation machinery and subsequent protein production. Overexpression of Pdcd4 inhibits tumorigenesis in vitro and in vivo and inversely, Pdcd4 knockout mice show enhanced tumor formation. In line, Pdcd4 is lost in various tumor types and proposed as prognostic factor in colon carcinomas. Unlike most other tumor suppressors that are rendered nonfunctional by mutations (e.g., p53), Pdcd4 loss is not attributable to mutational inactivation. It is regulated via translational repression by microRNAs and increased degradation of the protein under tumor promoting, inflammatory conditions and mitogens. Specifically, proteasomal degradation of Pdcd4 is controlled by p70 S6 Kinase (p70S6K)-mediated phosphorylation in its degron sequence (serines 67, 71 and 76). Stimulation of the PI3K-AKT-mTOR pathway by growth factors, hormones and cytokines initiates p70S6K activity. Phosphorylated Pdcd4 is subsequently recognized by the E3 ubiquitin ligase beta-transducin repeats-containing protein (β-TrCP) and marked with a polyubiquitin tail to be detected by the 26S proteasome for degradation. β-TrCP represents the substrate specific recognition subunit of the ubiquitin ligase complex responsible for protein-protein interaction with Pdcd4 as substrate for ubiquitin transfer and subsequent proteasomal disassembly.
The first part of the present work aimed at identifying novel stabilizers of the tumor suppressor Pdcd4 in a high throughput screen (HTS). As assay design, a fragment of Pdcd4 from amino acid 39 to 91, containing the phosphorylation sensitive degron sequence, was fused to a luciferase reporter gene construct. Stable expression of this Pdcd4(39-91)luciferase (Pdcd4(39-91)luc) fusion protein in HEK 293 cells served as read-out for the Pdcd4 protein amount to be detected in a high throughput compatible cell-based assay. Loss of Pdcd4(39-91)luc was induced by treatment with 12-O-
tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA), a phorbolester, which activates the PI3K signaling cascade leading to degradation of Pdcd4. The cut-off for hit definition was set at >50% activity in rescuing the Pdcd4(39-91)luc signal from TPA-induced degradation. Activity was calculated relative to the difference of DMSO- and TPA-treated cells (ΔDMSO-TPA = RLUDMSO-RLUTPA). Initial screening of a protein kinase inhibitor library (PKI) revealed hit substances expected to show Pdcd4 stabilizing activity by inhibition of kinases involved in Pdcd4 downregulation, e.g., the mTOR inhibitor rapamycin, the PI3K inhibitors wortmannin and LY294002 and the PKC inhibitors GF 109203X and Ro 31-8220.
The Molecular Targets Laboratory (MTL) of the National Cancer Institute (NCI) in Frederick, USA, hosts one of the largest collections of crude natural product extracts as well as a big substance libraries from pure synthetic sources. Screening of over 15 000 pure compounds and over 135 000 natural product extracts identified 46 pure and 42 extract hits as Pdcd4 stabilizers. For nine synthetic and six natural product derived compounds (after bioassay-guided fractionation), dose-dependent activities for recovering the TPA-induced Pdcd4(39-91)luc loss defined IC50s in the low micromolar range. Most importantly, these compounds were confirmed to stabilize endogenous Pdcd4 protein levels from forced degradation as well. This result proved the assay design to be highly representative for endogenous cellular mechanisms regulating Pdcd4 protein stability. The next step was to stratify the hit substances according to their likely mechanism of action to be located either up- or downstream of the p70S6K-mediated phosphorylation of Pdcd4. Therefore, phosphorylation of S6, as proto-typical p70S6K target, was analyzed and uncovered two natural derived compounds to influence p70S6K activity. Four substances did not affect p70S6K phosphorylation activity and were therefore considered to stabilize Pdcd4 by acting downstream, i.e. on the β-TrCP-mediated proteasomal degradation.
In the second part of this work, one of these compounds, namely the sesquiterpene lactone erioflorin, isolated by bioassay-guided fraction from the active extract of Eriophyllum lanatum, Asteraceae, was further characterized in detail with respect to its molecular mechanism of action. Erioflorin dose-dependently protected both Pdcd4(39-91)luc and endogenous Pdcd4 protein from TPA-induced degradation with IC50s of 1.28 and 2.64 μM, respectively. Pdcd4 stabilizing activity was maximal at 5 μM erioflorin. Up to this concentration, erioflorin was verified not to inhibit p70S6K activity. In addition, it was observed that erioflorin rescued Pdcd4(39-91)luc from both, wild type and constitutively active p70S6K-mediated downregulation. Only wild type p70S6K was inhibitable by the mTOR inhibitor rapamycin which served as an upstream acting control. To study the next section of Pdcd4 regulation, i.e. recognition by the E3 ubiquitin ligase β-TrCP, Pdcd4(39-91)luc and endogenous Pdcd4 were immunoprecipitated from whole cell extracts with the corresponding antibodies. In this key experiment, treatment with TPA increased overexpressed β-TrCP binding to both and this coimmunoprecipitation could be strongly reduced by erioflorin treatment. This result strongly pointed to an inhibitory mechanism of the β-TrCP specific binding to Pdcd4 by erioflorin. In addition, erioflorin disrupted the binding of in vitro transcribed/translated β-TrCP to Pdcd4 in an in vitro interaction assay to exclude nonspecific intracellular signals. Furthermore, polyubiquitination of Pdcd4 was decreased by erioflorin treatment as well. To clarify questions regarding specificity of erioflorin for the E3 ubiquitin ligase β-TrCP, stability of another important β-TrCP target was explored, i.e. the tumor suppressor inhibitor of kappa B alpha (IκBα). Indeed, the tumor necrosis factor alpha (TNFα)-mediated loss of IκBα could be prevented by erioflorin cotreatment. On the other hand, the E3 ubiquitin ligase von Hippel Lindau protein (pVHL) was left unaffected as its target hypoxia inducible factor 1 alpha (HIF-1α) could not be stabilized from oxygen-dependent degradation by erioflorin treatment. These results argued strongly for erioflorin being a specific inhibitor of β-TrCP-mediated protein degradation. Functional consequences of erioflorin treatment were investigated by observing its influence on the transcriptional activities of the transformation marker activator protein 1 (AP-1, an indirect downstream target of Pdcd4) and nuclear factor κB (NF-κB which is directly inhibited by IκBα). Indeed, erioflorin showed significant inhibition of AP-1 and NF-κB reporter constructs at 5 μM, a concentration for which an impact on cell viability was excluded. Finally to characterize the significance of erioflorin in a cell-based tumorigenesis assay, the highly invasive colon carcinoma cell line RKO was tested in a two dimensional migration assay. Erioflorin was discovered to significantly lower cell migration in a wound closure assay.
In conclusion, development of a high throughput compatible cell-based reporter assay successfully identified novel substances from pure synthetic and natural product derived background as potent stabilizers of the tumor suppressor Pdcd4. In addition, this work aimed at elucidating the detailed mechanism of action of the sesquiterpene lactone erioflorin from Eriophyllum lanatum, Asteraceae. Erioflorin was discovered to inhibit the E3 ubiquitin ligase β-TrCP, thereby preventing protein degradation of tumor suppressors like Pdcd4 and IκBα. This may offer the possibility to more specifically target protein degradation and generate less adverse side effects by blocking a particular E3 ubiquitin ligase compared to general proteasome inhibition.
Das Gleichgewicht zwischen den Sphingolipiden Ceramid und Sphingosin-1-Phosphat (S1P) spielt eine entscheidende Rolle für das Schicksal einer Zelle. Es ist bekannt, dass Ceramid proapoptotisch wirkt, wohingegen S1P antiapoptotische und entzündungshemmende Signalwege induziert [6]. Eine Beeinflussung der Sphingolipid-metabolisierenden Enzyme sowie eine daraus resultierende gestörte Balance zwischen Ceramid und S1P ist somit ein Merkmal diverser entzündlicher Krankheiten wie der Asthma bronchiale, der Colitis ulcerosa [148] oder auch verschiedenen Arten von Tumoren [199]. Das Hauptziel dieser Arbeit lag in der Untersuchung der Ceramid-abbauenden neutralen Ceramidase (NCDase) und der S1P-synthetisierenden Sphingosinkinase 1 (SK1) in verschiedenen Nierenzellen. Ein Fokus wurde dabei auf die Regulierung dieser Enzyme durch entzündungshemmende Corticosteroide in Ratten Mesangiumzellen gelegt, wobei diese Zellen entscheidend in der Entstehung entzündlicher Nierenerkrankungen wie einer Glomerulonephritis sind. Weiterhin wurde der Einfluss der Mutation putativer Phosphorylierungsstellen der NCDase auf die Regulierung dieses Enzyms in HEK293 Zellen untersucht und in einem dritten Teil der Arbeit schließlich die Expression und die Funktion der SK1 in der humanen Niere im Vergleich zum Nierenzellkarzinom analysiert.
Es konnte gezeigt werden, dass Glucocorticoide (GCs) Mesangiumzellen durch eine Steigerung der intrazellulären S1P-Konzentrationen vor durch Stress induzierter Apoptose schützen. Diese Beeinflussung des Sphingolipid-Rheostats beruhte auf einer gesteigerten mRNA- und Proteinexpression der Sphingosinkinase 1 (SK1) und der neutralen Ceramidase (NCDase). Außerdem wurde nachgewiesen, dass der Promotor der NCDase durch GCs aktivierbar ist und dass zwei Glucocorticoid-responsive-Elemente (GREs) innerhalb der Promotorsequenz durch die Bindung von Glucocorticoidrezeptoren (GRs) diese Aktivierung bewirken. In vivo Experimente mit isolierten Glomeruli, die aus mit Dexamethason behandelten Mäusen gewonnen wurden, zeigten ebenfalls eine Erhöhung der mRNA-Expression und Aktivität der SK1 sowie eine gesteigerte Proteinexpression der NCDase. Somit wurde erstmals ein direkter Einfluss von GCs auf den Sphingolipidmetabolismus in Mesangiumzellen beschrieben.
In einem zweiten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, dass eine Mutation zweier putativer Proteinkinase C (PKC)-Phosphorylierungsstellen (T253A und T420/23A) in der Sequenz der murinen NCDase zu einem verlangsamten Reifungsprozess dieses Enzyms führt. Western Blot-Analysen ergaben, dass der überexprimierte NCDase-WT zwei unterschiedlich glykosylierte Isoformen mit einem Molekulargewicht von 120 und 130 kDa exprimiert, welche stetig durch einen aktiven Prozess sezerniert werden. Im Gegensatz dazu war in den Mutanten ausschließlich die 130 kDa-Form im Zellkulturüberstand und die 120 kDa-Form im Lysat zu finden. Im Gegensatz zum WT lokalisierten die Mutanten lediglich an intrazellulären Membranen und nicht zusätzlich an der Plasmamembran. In Lysaten von Zellen die die Mutanten exprimierten, konnte eine verringerte relative Aktivität gemessen werden, die der sezernierten mutierten Formen hingegen war erhöht. Daher wurde vermutet, dass die 130 kDa-Form die reife Plasmamembran-gebundene und anschließend sezernierte, aktivere Isoform der NCDase darstellt. Die Inkubation von Mesangiumzellen mit Zellkulturüberständen, die den sezernierten NCDase-WT enthielten, führte zum Schutz vor durch Stress induzierter Apoptose. Somit kann eine auto- bzw. parakrine Funktion der sezernierten NCDase angenommen werden.
Dem dritten Teil der Arbeit lag die erstmalige Beschreibung der SK1-Expression in der gesunden humanen Niere zugrunde. Es konnte gezeigt werden, dass diese im Zytoplasma sowie an Membranen von Zellen des proximalen Tubulus sowie in geringerem Maße in Podozyten und Mesangiumzellen des Glomerulus exprimiert wird. Im Gegensatz dazu wurde die SK1 in Biopsien von Patienten mit Nierentumor im Nukleus gefunden. Die Untersuchung der SK1-Expression in 5 verschiedenen Nierentumorzelllinien im Vergleich zu Epithelzellen des proximalen Tubulus (Human Kidney 2 - HK2-Zellen) ergaben, dass sowohl die Protein- als auch die mRNA-Expression der SK1 in Föhn-Zellen stark erhöht, in ACHN3-Zellen hingegen signifikant niedriger war. Zudem konnte auch in den Föhn-Zellen eine nukleäre Expression der SK1 nachgewiesen werden. Die Behandlung von HK2-, ACHN3- und Föhn-Zellen mit dem Transforming Growth Factor-ß2 (TGF-ß2) resultierte in einer transkriptionellen Steigerung der SK1-Expression. Die Herunterregulierung der SK1 in diesen Zellen führte zu einem Arrest der Zellen in der S Phase, wohingegen die Überexpression der SK1 in den ACHN3-Zellen zu einem signifikanten Schutz vor Apoptose führte.
Zusammenfassend sind die Sphingolipid-metabolisierenden Enzyme NCDase und SK-1 ein interessanter therapeutischer Ansatzpunkt zur Behandlung von Krankheiten, die mit pathologischen Prozessen wie Entzündung, Apoptose und Proliferation einhergehen, wie es bei Glomerulonephritiden und bei Nierentumoren der Fall ist.
Die vorliegende Arbeit hat die Charakterisierung und Untersuchung des Stabilitätsverhaltens von
Parvulustat (PL), einem Homologen des α-Amylase-Inhibitors Tendamistat, zum Inhalt. Zur
weitreichenden Charakterisierung wurden verschiedene Proteinregionen des Parvulustats der CTerminus,
das hydrophobe Cluster, die Disulfidbrücken sowie die Proline auf ihren jeweiligen
Einfluss auf die Struktur und die thermodynamische Stabilität untersucht. In der vorliegenden
Zusammenfassung werden die Ergebnisse dieser Studien komprimiert präsentiert:
· Charakterisierung des Parvulustat-Wildtyps
Es galt vorweg herauszufinden, wie sich der Inhibitor unter nativen und denaturierten
Bedingungen verhält, um Rückschlüsse auf seine Merkmale und Strukturen zu ziehen. Die
erzielten Ausbeuten und die hohe Reinheit des isolierten Parvulustats erlaubten eine umfassende
Charakterisierung, einschließlich zahlreicher Kristallisationsexperimente, die vermuten lassen,
dass eine Kristallisation möglich sein sollte. Aufgrund der Tatsache, dass die Struktur des
Parvulustats bis 2009 unbekannt war, wurde die sekundäre Struktur mittels Circulardichroismus
und Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Die Analyse des fernen UV-CD-Spektrums bei pH 7,0
und 25°C offenbarte eine „all-b-sheet“ Protein-Struktur. Mittels Fluoreszenzspektroskopie wurde
deutlich, dass die aromatischen Aminosäuren exponiert vorliegen. Um zunächst einen Einblick in
die Strukturveränderungen und die thermodynamische Stabilität zu erhalten, wurde der
temperaturinduzierte Entfaltungsübergang mittels CD-Spektroskopie verfolgt. Das Angleichen der
bei 230 nm gemessenen CD-Daten nach der linearen Extrapolations-Methode für eine
Zweizustands-Faltung ergab einen Tm-Wert von 82°C und D H(Tm) von 201,6 kJ/mol. Die
beträchtlichen Werte veranschaulichen die hohe Stabilität des Parvulustats. Eine aus den CDMessungen
bei 50° ergebende Übergangskurve zeigte, dass sich die Sekundärstruktur mit einem
Übergangsmittelpunkt bei 5,62 M GdnHCl kooperativ und reversibel entfaltet. Das Protein
entfaltet sogar infolge einer pH-Wert-Senkung bis auf pH 1 nicht vollständig, sondern es wechselt
direkt in einen Säure-Zustand („acid-state“). Dieser Zustand zeigt spektroskopisch die gleichen
Eigenschaften wie das native Protein, wobei die volle Inhibierungs-Aktivität nicht erhalten bleibt.
In sehr basischem Milieu bei pH 14 nimmt Parvulustat einen alkalisch denaturierten
Zwischenzustand IB an, der sich erheblich von dem GdnHCl-denaturierten, dem säurebehandelten
oder vom „molten globule“ Zustand unterscheidet. Allgemein behielt Parvulustat
über ein breites pH-Wert Spektrum (1,0-10,0) die native Struktur, bzw. eine „native like“ Struktur,
was erneut auf die enorme Stabilität des Proteins hindeutet. Die von Rehm et al. (Rehm et al.,
Theoretischer Teil
-4-
2009) aufgeworfene Hypothese des „induced fit“ Inhibierungsmechanismus des Parvulustats
konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bekräftigt werden. Mittels
Sekundärstrukturbestimmungen des Parvulustats unter Komplexbildung mit der a-Amylase
konnte eindeutig gezeigt werden, dass strukturelle Veränderungen am Inhibitor im Komplex
vorliegen. Durch zahlreiche Tests konnte festgestellt werden, dass die WRY-Region des
Parvulustats sich der Struktur der a-Amylase anpasst. Die Komplexierung des Parvulustats
bewirkte aber eine thermodynamische Destabilisierung der Inhibitor-Struktur.
· Einfluss des C-Terminus auf die Stabilität des Parvulustats
Um die Ursachen für die hohe Stabilität des Parvulustats auch im Vergleich zu Tendamistat (Tm:
79°C) zu finden, wurde der Einfluss des hoch flexiblen C-Terminus untersucht. Die Derivate mit
um zwei (PL-2AA), vier (PL-4AA) und sieben (PL-7AA) Aminosäuren verkürztem C-Terminus
wurden isoliert und analysiert. Die Entfaltungstemperaturen der verkürzten Derivate des
Parvulustats sinken mit abnehmender Zahl der Aminosäuren. Die Ergebnisse suggerieren, dass
der C-Terminus des Parvulustats eine entscheidende Rolle in der strukturellen Vollständigkeit des
Proteins während der thermischen Entfaltung spielt und damit auch in der Faltung (Tab.: 2.1). Der
Vergleich der Inhibitoraktivitäten der verkürzten Proteine mit dem nativen Parvulustat ergibt für
die Varianten PL-2AA und PL-4AA eine dem Wildtyp ähnliche Aktivität. Die Variante PL-7AA
weist eine leicht verringerte Aktivität auf.
Tabelle 2.1: ...
Einfluss hydrophober Oberflächenclustern auf Stabilität und Faltung
des Parvulustats
Parvulustat besitzt in der Mitte des ersten b-Faltblatts, um die Position 22 liegend, einen
hydrophoben Oberflächencluster. Wie mit Hilfe von Substitutionsexperimenten in dieser Region
gezeigt werden konnte, ist die thermodynamische Stabilität des Parvulustats in hohem Maße von
der Bildung dieses kleinen aber wichtigen hydrophoben Kerns bestimmt. Demnach muss das b-
Faltblatt I und das b-Hairpin I eine entscheidende Rolle in der Faltung von Parvulustat spielen.
Position 22 ist in zweierlei Hinsicht für die Stabilität des Parvulustats wichtig: einerseits durch die
energetisch wichtigen Wasserstoffbrückenbindungen und zum zweiten steuert die Stelle zur
Formation des hydrophoben Kerns bei. Die Daten suggerieren, dass es auch eine
thermodynamische Kopplung zwischen dem hydrophoben Effekt und der Präsenz von
Wasserstoffbrückenbindungen geben könnte. Zumindest aus der Sicht der Stabilität ist es
eindeutig, dass interatomare Interaktionen wie Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waalsund
Dipol-Dipol-Wechselwirkungen notwendig sind, um eine stabile Bildung von b-Faltblättern
in Parvulustat und seinen Derivaten zu verwirklichen.
· Der Effekt der Proline auf die Stabilität des Parvulustats
Der Effekt der Substitution des Prolins durch Alanin an verschiedenen Positionen des Parvulustats
wurde ebenfalls untersucht. Im Ganzen betrachtet führt auch die Mehrfachsubstitution von Prolin
zu keiner nennenswerten strukturellen Veränderung im Parvulustat. Die durchgeführten
thermischen Entfaltungsexperimente bestätigen diese Beobachtungen. Alle Einzelmutanten (P5A,
P42A, P48A, P72A) zeigten eine höhere thermische Stabilität als der Wildtyp (Abb. 2.1).
Abbildung 2.1: Tm-Werte des Parvulustat-Wildtyps und seinen Prolin Mutanten.
Theoretischer Teil
-6-
Die fast gleich bleibenden Tm-Werte bzw. die Erhöhung der Stabilität des Parvulustats sind durch
die strukturelle Fluktuationen zu erklären, denn die rigide XAS-Pro-Bindung wurde durch die
flexible XAS-Ala-Bindung ersetzt.
· Der Einfluss der Disulfidbindung auf die Stabilität des Parvulustats
Der Einfluss der zwei Disulfidbrücken des Parvulustats wurde bezüglich Aktivität, spektraler
Eigenschaften sowie Stabilität untersucht. Hierfür wurden 25 Inhibitorvarianten mittels gezielter
Mutagenese gewonnen, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im natürlich vorkommenden
Parvulustat Disulfidbrücken bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Die Ergebnisse
zeigten, dass die Faltung Parvulustats ein zwei Zustand Verhalten besitzt, das außer in
Tendamistat in keinem anderen disulfid-verknüpftem Protein gefunden wurde. Dieses Verhalten
wurde durch die Entfernung von Disulfidbrücken nicht beeinflusst. Wie durch die CD- und
fluoreszenzspektroskopischen Experimente belegt werden konnte, ist die native Struktur des
Parvulustats durch die Entfernung der C43-C70-Disulfidbindung tiefgreifend verändert worden.
Passend zu den Veränderungen der Struktur haben die Mutationen schwerwiegende
Destabilisierungseffekte auf das Protein verursacht, was auch an der Erniedrigung der Freien
Gibbs Energie der Denaturierung und der Tm-Werte zu erkennen ist. Die Untersuchung des
Einflusses der Aminosäure-Substitution in den Positionen 43 und 70 auf die thermodynamische
Stabilität des Parvulustats führt zum Ergebnis, dass die Hydrophobizität und Polarität des Restes
70 einen bedeutenden Effekt auf die Stabilität des Proteins besitzt. Die Betrachtung der
thermodynamischen Daten macht deutlich, dass der Beitrag der freien Energie zur Stabilisierung
nicht nur abhängig von der eingeführten Aminosäure ist, sondern zum Teil auch von dem
strukturellen Kontext abhängt. Die Daten zeigen, dass die Substitution des Alanins an der Stelle
70 durch Leucin oder Threonin die Struktur um 0,3 bzw. 1,7 kJ/mol stabilisieren. Zusätzliche
Beiträge zum Unterschied bezüglich des ΔG°-Werts zwischen den Varianten C43AC70L/T und
C43L/TC70A können sich auch durch die unterschiedliche lokale Umgebung, wie z.B. die
Seitenketten von benachbarten Aminosäuren um die zwei Mutationsstellen ergeben. Der Tm-Wert
des Wildtyp-Proteins beträgt 82°C. Die Vergleiche dieser Größe mit der von der stabilsten
Cystein-defizitären Doppelmutante C43AC70T (47,3°C) ergibt eine Differenz von 34,7°C. Dieses
Ergebnis untermauert, dass die Disulfidbindung 2 eine extrem wichtige strukturelle Komponente
in der ungewöhnlich hohen Stabilität des Parvulustats darstellt.
Das Ziel der Arbeit war es dennoch die Daten der Stabilitäten einzelner Disulfidmutanten zu
sammeln und zu erfassen, um dadurch allgemeine Grundregeln für eine rationale Gestaltung der
Elimination beider Disulfidbrücken im Sinne einer vorhersagbaren Auswirkung auf die
Proteinstabilität zu bekommen.
Theoretischer Teil
-7-
Der Versuch ein disulfidfreies Protein in großen Mengen aus S. lividans zu isolieren, stellte sich
aber als extrem schwierig dar. Nach der Änderung des Stamms des Wirtsorganismus
(Streptomyces lividans TK23), Erhöhung der Qualität der Protoplasten und der Expressions-
Bedingungen (19°C, 150 rpm) konnten auf dem SDS-Gel stärkere Banden des Derivats
C9AC25TC43AC70T-4AA beobachtet werden. Die Expression der Mutante
C9AC25TC43AC70L-4AA konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die anschließende
Reinigung des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA des Parvulustats mittels Gelfiltration und RPHPLC
bzw. Isolierung des Proteins aus dem SDS-Gel brachte das erwünschte Produkt. Dieses
konnte mit der MALDI-Massenspektroskopie eindeutig nachgewiesen werden. Das aktive
Cystein-freie Derivat C9AC25TC43AC70T-4AA konnte auch auf dem a-Amylase Plattentest
nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Expression und der Nachweis einer
cystein-freien Variante möglich sind, dennoch haben die Ausbeuten dieses Proteins für
weiterreichende Analytik nicht ausgereicht. Demnach sind die Disulfidbrücken für die Stabilität
und Struktur des Parvulustats von enormer Bedeutung dennoch sind sie nicht zwingend
erforderlich für die Aktivität und die Expression in S. lividans.
Das humane endogene Retrovirus-K: Grundlagenforschung und Nutzen als Tumor-assoziiertes Antigen
(2011)
Fast die Hälfte des humanen Genoms besteht aus Retroelementen, die während der evolutiven Entwicklung des Menschen im Genom fixiert wurden. Im Wesentlichen kann man diese Retroelemente in DNA-Transposons, LINEs, SINEs und humane endogene Retroviren unterteilen, dabei nehmen die humanen endogenen Retroviren (HERV) 8% des humanen Genoms ein. Bei einer Unterfamilie, der HERV-K Familie, sind bis heute alle offenen Leserahmen erhalten geblieben. Nach heutigem Erkenntnisstand wird eine Expression dieser Elemente in somatischen Zellen jedoch strikt unterdrückt, denn eine Expression von Retroelementen könnte zu Insertionsmutagenesen führen und letztlich dem Organismus erheblichen Schaden zufügen.
Im Gegensatz dazu wird eine reaktivierte Expression von HERV-K häufig in einigen Tumorarten beobachtet: allen voran Keimzelltumore, Melanome und Brustkrebs. Außerdem können in Patienten, die an solchen Tumoren erkranken, häufig HERV-K spezifische Antikörper und mitunter auch gegen HERV-K-gerichtete T-Zellen nachgewiesen werden. Die strikte Unterdrückung der HERV-K Expression in gesunden, somatischen und eine reaktivierte Expression in entarteten Zellen machen HERV-K Proteine daher zu idealen Tumor-assoziierten Antigenen.
Auf Grundlage dieser Untersuchungen wurden, in dieser Arbeit, zwei potentielle Tumorvakzine, basierend auf dem hoch attenuierten Modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) hergestellt. Durch homologe Rekombination wurde ein HERV-K gag-pro-pol transgenes MVAHKcon und ein HERV-K env transgenes MVAHKEnv hergestellt und charakterisiert. Darüber hinaus wurden die rekombinanten Viren in einem neu etablierten, syngenen Maus-Tumor-Modell untersucht. MVAHKcon immunisierte Mäuse zeigten eine starke humorale Immunantwort und waren in der Lage subkutane, HERV-K Gag positive Tumore fast vollständig zu eliminieren. MVAHKEnv immunisierte Mäuse zeigten dagegen eine moderate humorale Immunantwort und eine starke T-Zellantwort. Nach therapeutischer Immunisierung mit MVAHKEnv konnte im Mausmodell eine signifikante Reduktion an HERV-K Env positiven Lungenmetasten beobachtet werden. Außerdem konnte durch eine prophylaktische Immunisierung mit MVAHKEnv ein vollständiger Schutz der Mäuse vor der Ansiedlung HERV-K Env-exprimierender Tumore erreicht werden. Die hier vorgestellten HERV-K rekombinanten MVA könnten daher der erste Schritt zu einer Immuntherapie gegen reaktivierte Retroelemente in malignen Tumoren darstellen.
MVAHKcon infizierte Zellen produzieren und sekretieren große Mengen HERV-K Virus-ähnlicher Partikel (VLP) somit konnten auch grundlegende Fragestellungen der HERV-K Biologie geklärt
Zusammenfassung
123
werden. Durch die Kombination massenspektrometrischer Analysen und N-terminaler Sequenzierungen konnten, die noch nicht bekannten Schnittstellen der retroviralen Protease im HERV-K Gag Protein identifiziert werden. Zudem wurde eine späte Domäne von HERV-K identifiziert und darüber hinaus Wechselwirkungen von HERV-K VLPs mit zellulären Restriktionsfaktoren wie APOBEC3G und CD317 studiert.
Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung, Synthese und
Charakterisierung neuartiger redoxaktiver Liganden und deren Metallkomplexen. Basierend
auf dem para- und ortho-Hydrochinon / Benzochinon-Redoxsystem wurden 13 neue
Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden (28 – 36 und 67 – 70; Schema 47) synthetisiert und
vollständig charakterisiert. Ein Schwerpunkt lag auf der Einführung von Substituenten am
Bis(pyrazol-1-yl)methan-Donor, um deren Einfluss auf das N,N′-Koordinationsverhalten
gegenüber Metallionen zu untersuchen. In Analogie zu den klassichen Skorpionaten sind
Substituenten in Position 3 der Pyrazolringe in der Lage, koordinativ ungesättigte
Metallzentren kinetisch zu stabilisieren, was für potentielle Anwendungen in der Katalyse
essentiell ist. Bei den ortho-chinoiden Liganden (67 – 70; Schema 47) erfüllt die redoxaktive
Gruppe eine zweite Funktion, nämlich als Chelatdonor gegenüber Metallzentren, was die
Synthese und Untersuchung (hetero-)dinuklearer Komplexe erlaubt.
Schema 47: In dieser Arbeit synthetisierte und charakterisierte redoxaktive Bis(pyrazol-1-yl)methan-
Liganden.
Die kristallographische Charakterisierung von 10 dieser Liganden (28 – 33, 67 – 70) zeigte
größtenteils sehr ähnliche strukturelle Parameter. Ein steigender sterischer Anspruch der
Substituenten am Bis(pyrazol-1-yl)methan führte zu einer leichten Streckung der
Chinon–Bis(pyrazol-1-yl)methan-Bindung und zu kurzen Kontakten zwischen Substituenten
am zentralen Methin-Kohlenstoffatom und den ipso- (HQ-C1) bzw. ortho-Kohlenstoffatomen
(HQ-C2) am sechsgliedrigen Ring. Diese kurzen Kontakte spielten in der oxidativen
Demethylierung von 32 eine Rolle. Während alle anderen para-chinoiden Liganden mit
Cerammoniumnitrat (CAN) zu den erwarteten para-Benzochinon-Derivaten reagierten
(Schema 48), wurde im Zuge der Oxidation von 32 ein zusätzliches Sauerstoffatom am
sechsgliedrigen Ring eingeführt (47; Schema 48). Im Gegenzug wurde die sterisch am
stärksten abgeschirmte Methoxygruppe nicht oxidativ demethyliert. Letztendlich konnte
gezeigt werden, dass (i) das neu eingeführte Sauerstoffatom von atmosphärischem Sauerstoff
stammt und (ii) alle fünf Methylgruppen und beide Methoxygruppen in 32 für die Oxidation
essentiell sind.
Zusammenfassung
72
Schema 48: Oxidation der para-chinoiden Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden mit CAN.
Die Cyclovoltammogramme der ortho-chinoiden Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden
(untersucht am Beispiel von 67, 68 und 70) zeigten irreversible Redoxwellen, da im Zuge der
Oxidation OH-Protonen abgespalten wurden; die Redoxpotentiale liegen in einem mit
chemischen Oxidationsmitteln gut zugänglichen Bereich. 70 wurde von CAN erfolgreich
oxidiert, das Produkt 71 zersetzte sich unter den Reaktionsbedingungen allerdings sehr
schnell und konnte nicht isoliert, sondern lediglich als Additionsprodukt von 4-tert-
Butylpyridin abgefangen werden. Unter optimierten Reaktionsbedingungen und mit DDQ als
Oxidationsmittel ließen sich 70 und 68 in ihre oxidierte Form überführen und in Reinform
gewinnen. Die für ortho-Benzochinone typische Neigung zur Zersetzung wurde auch bei 71
und 73 beobachtet, wobei letzteres sich wesentlich schneller zersetzte (innerhalb von
Stunden) als 71 (innerhalb eines Tages).
Abb. 36: N,N′-Cobalt- und Palladium-Komplexe 59, 60, 74 und 75.
Die Koordinationschemie repräsentativer Vertreter der 13 redoxaktiven Bis(pyrazol-1-
yl)methan-Liganden wurde untersucht. Bereits der sterisch nur mäßig anspruchsvolle parachinoide
Ligand 29 ist in der Lage, koordinativ ungesättigte CoII-Ionen kinetisch gegenüber
der Bildung von 1:2 Komplexen zu stabilisieren. Im Festkörper liegen ausschließlich
Verbindungen mit einer 1:1 Zusammensetzung von Ligand zu CoII vor (59 und 60; Abb. 36).
In Lösung scheinen hingegen Gleichgewichte zu existieren, in denen auch die koordinativ
abgesättigten oktaedrischen 2:1 Komplexe auftreten. Die ortho-chinoiden Liganden 67 und 68
bildeten selektiv entsprechende N,N′-koordinierte PdCl2-Komplexe, ohne dass das ortho-
Hydrochinonat (Catecholat) als konkurrierender O,O′-Donor wirkte (74 und 75).
Zusammenfassung
73
Es zeigte sich jedoch auch, dass sterisch sehr anspruchsvolle Substituenten am
Bis(pyrazol-1-yl)methan-Fragment in Reaktionen mit Übergangsmetallen zu einer Zersetzung
des Ligandengerüsts führen können. So reagierte der para-chinoide tert-Butyl-substituierte
Ligand 31 mit [Co(NO3)2] zu [(HpztBu,H)2Co(NO3)2] (63). Eine analoge Zersetzung zu trans-
[(HpzR,H)2PdCl2] (76: R = Ph und 77: R = tBu) wurde nach der Reaktion der ortho-chinoiden
Liganden 69 bzw. 70 mit [PdCl2]-Quellen beobachtet.
Schema 49: Synthese von O,O′-Koordinationskomplexen der ortho-chinoiden Bis(pyrazol-1-
yl)methan-Liganden 68, 69 und 70.
Die ortho-chinoiden Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden (67 – 70) besitzen mit ihrem
Catecholat-O,O′-Donor eine zweite Koordinationsstelle, was diese Liganden für die Synthese
von dinuklearen Komplexen interessant macht. Da gezeigt werden konnte, dass [PdCl2]
selektiv an den Bis(pyrazol-1-yl)methan-Donor koordiniert (vgl. 59, 60, 74 und 75; Abb. 36),
galt es als nächstes zu evaluieren, ob eine ähnlich selektive Bindung anderer Metallionen an
den O,O′-Donor möglich ist.
Abb. 37: Molekulare Strukturen ausgewählter O,O′-Koordinationskomplexe ortho-chinoider
Bis(pyrazol-1-yl)methan-Komplexe 82 (links), 83 (Mitte) und 85 (rechts).
In der Tat konnten in sehr guten Ausbeuten O,O′-gebundene [(p-cym)Ru]-, [(Phpy)2Ir]-
und [(Cp*)Ir]-Komplexe ausgewählter redoxaktiver ortho-chinoider Liganden dargestellt
werden. Vorteilhaft war die Verwendung der kristallinen, nicht-flüchtigen Base TlOtBu zum
Abfangen der im Zuge der Komplexierung freiwerdenden Protonen (Schema 49, Abb. 37).
Die Eliminierung von TlCl sorgt für eine irreversible Reaktion zu den entsprechenden
Zusammenfassung
74
Komplexen. Besonders interessant ist die Koordinationschemie des Liganden 68 im chiralen,
anionischen IrIII-Komplex 83 (Abb. 37 Mitte), der in der Synthese als Thallium-Salz anfiel
und im Festkörper TlI-verbrückte Dimere bildete.
Eine elektrochemische Charakterisierung wurde mit 85 durchgeführt. Wie erwartet, zeigte
der komplexierte Bis(dimethylpyrazol-1-yl)methan-Ligand im Gegensatz zu freiem 68 eine
reversible Oxidationswelle. Die Potentialdifferenz zwischen Liganden-Oxidation und Iridium-
Reduktion beträgt fast 2 V, was in diesem Zusammenhang bedeutet, dass sich 68 als
unschuldiger Ligand verhält und man Iridium zweifelsfrei die Oxidationsstufe +III zuweisen
kann. Mit Komplexen von 68 und leichter reduzierbaren Übergangsmetallen sollte es
hingegen möglich sein, in den Bereich des nicht-unschuldigen Verhaltens vorzudringen und
z.B. Valenz-Tautomerie zu beobachten.
Mit effizienten Synthesewegen zu N,N′-Komplexen einerseits (74 und 75; Abb. 36) und
O,O′-Komplexen andererseits (u.a. 83 und 85; Abb. 37) wurde als nächstes ein heterodinuklearer
Komplex synthetisiert (87; Schema 50). 68 erwies sich als am besten geeigneter
Ligand, da er, wie bereits erwähnt, eine gute Löslichkeit bei moderatem sterischen Anspruch
besitzt und der N,N′-Donor auch in Gegenwart von Lewis-sauren Metallionen beständig ist.
Die Wannenform des Bis(pyrazol-1-yl)methan-PdII-Chelatrings in 87 bringt das Palladium-
Ion in räumliche Nähe zum ortho-Hydrochinonat π-System. In früheren Studien dieser
Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass ein solches Arrangement Elektronenübertragungen
zwischen dem Chinon und dem koordinierten Palladium-Zentrum erlaubt.
Durch die direkte konjugative Wechselwirkung des zweiten Metallzentrums (IrIII) mit der
redoxaktiven Gruppe über die Sauerstoffatome in 87 sollte eine effektive elektronische
Ligand ↔ Metall- und Metall ↔ Metall-Kommunikation möglich sein. Die elektrochemische
Charakterisierung zeigte allerdings, dass im vorliegenden Fall die Potentiale der drei
Komponenten Chinon / PdII / IrIII mit jeweils ca. einem Volt zu weit auseinander liegen.
Schema 50: Synthese eines hetero-dinuklearen IrIII/PdII-Komplexes.
Im letzten Teilgebiet dieser Arbeit wurde die Eignung der ortho-chinoiden Liganden 67
und 70 für den Aufbau höhermolekularer Koordinationsverbindungen und oligonuklearer
Aggregate untersucht.
Zusammenfassung
75
Schema 51: Synthese der oktaedrischen Komplexliganden 89 – 96.
Dafür wurden Komplexliganden synthetisiert, die aus einem Zentralmetall bestehen, das
oktaedrisch von je drei O,O′-koordinierenden Liganden 67 bzw. 70 umgeben ist (Schema 51).
Mit den freien Bis(pyrazol-1-yl)methan-Donorgruppen vermag jeder dieser Komplexliganden
drei weitere Metallzentren zu koordinieren. Derartige Verbindungen könnten aufgrund ihrer
dreidimensionalen Struktur z.B. Anwendung im Aufbau von redoxaktiven metallorganischen
Netzwerken oder elektrisch leitfähigen Koordinationspolymeren finden. Als Zentralmetalle
dienten FeIII- und AlIII-Ionen; erstere, weil sie selbst redoxaktiv sind, und letztere, weil sie
eine im Vergleich zu FeIII ähnliche Koordinationschemie besitzen, aber wegen ihres
Diamagnetismus‘ eine NMR-spektroskopische Charakterisierung ermöglichen. Je nach
verwendeter Base wurden die dreifach anionischen Komplexliganden als Lithium- bzw.
Thallium-Salze isoliert. Die NMR-Spektren von 89, 90, 93 und 94 zeigten jeweils nur einen
Signalsatz, obwohl sich, bedingt durch die Asymmetrie des Liganden und die Chiralität des
oktaedrischen Metallzentrums, fac- und mer-Isomere bilden können. Es konnte nicht
abschließend geklärt werden, ob sich exklusiv das höhersymmetrische fac-Isomer bildet, oder
ob ein Mechanismus aktiv ist, der alle Isomere auf der NMR-Zeitskala schnell ineinander
überführt, sodass die Gegenwart lediglich einer Spezies vorgetäuscht wird. In
elektrochemischen Untersuchungen zeigten die Komplexliganden mehrere irreversible
Oxidationswellen. Ob dieses Verhalten auf eine intramolekulare Kommunikation der
einzelnen redoxaktiven Gruppen zurückzuführen ist, müssen weitergehende Studien zeigen.
Als prinzipieller Beleg für die präparative Anwendbarkeit der Komplexliganden und
Grundlage für die Untersuchung der Koordinationschemie der oktaedrischen
Komplexliganden, wurden PdII-Komplexe von 89 und 93 synthetisiert.
The adaptive immune system protects against daily infections and malignant transformation. In this, the translocation of antigenic peptides by the transporter associated with antigen processing (TAP) into the ER lumen is an essential step in the antigen presentation by MHC I molecules. The heterodimeric ATP-binding cassette transporter (ABC) TAP consist of the two halftransporters TAP1 and TAP2. Each monomer contains an N-terminal transmembrane domain (TMD) and a conserved C-terminal nucleotide-binding domain (NBD). Together, the TMDs build the translocation core and the NBDs bind and hydrolyze ATP, energizing the peptide transport. TAP features an asymmetry in the two ATP-binding sites that are built of several conserved motifs. One motif is the D-loop with the consensus sequence SALD. The highly conserved aspartate of the D-loop of TAP1 reaches into the canonic ATP-binding site and contacts the Walker A motif and the H-loop of the opposite NBD, while the Asp of D-loop of TAP2 is part of the non-canonic ATP-binding site.
To examine this ABC transport complex in mechanistic detail, a purification and reconstitution procedure was established with the function of TAP being preserved. The heterodimeric TAP complex was purified via a His10-tag at TAP1 in a 1:1 ratio of the subunits. Nucleotide binding to the purified transporter was elucidated by tryptophan quenching assays and the affinity constants for MgADP and MgATP were determined to be 1.0 μM and 0.7 μM, respectevely. In addition, the TAP complex shows strict coupling between peptide binding and ATP hydrolysis, revealing no basal ATPase activity in the absence of peptides. Furthermore, TAP was reconstituted into proteoliposomes and the activity was tested by peptide transport and ATP hydrolysis. Interestingly, the kinetic parameters of the transporter in the reconstituted state are comparable to the data gained for TAP in microsomes.
To characterize the functional importance of the D-loop, D-loop mutants of either TAP1 or TAP2 were analyzed. Strikingly, TAP containing a mutated D-loop in TAP1 (D674A) shows an ATP-hydrolysis independent peptide translocation. Accordingly, the MHC I surface expression is similar to the wildtype situation. However, the same mutation in TAP2 (D638A) results in an ATPase dependent peptide transport similar to wildtype, whereas TAP containing mutations in both subunits leads to an inactive transporter. Although all D-loop mutants showed no altered peptide binding activity, the TAP1 mutant is inactive in peptide-stimulated ATPase activity. Strikingly, ATP or ADP binding is strictly required for the peptide translocation. Experiments carried out in proteoliposomes demonstrate that wildtype TAP can export peptides against their gradient when low peptide concentrations are offered. In contrast, the D674A mutant can facilitate peptide translocation along their concentration gradient in the two directions. At high peptide concentrations, TAP is trapped in a transport incompetent state induced by trans-inhibition. In conclusion, a TAP mutant that uncouples solute translocation from ATP hydrolysis was created. Since this passive substrate movement is strictly dependent on binding of ATP or ADP, an active transporter was turned into a “nucleotide-gated facilitator”.
In a cysteine cross-linking approach the conformational changes of TAP during peptide transport and the flexibility of the nucleotide binding domains were examined. Single cysteines were introduced in the D-loops of TAP1 and TAP2. Cross-linking by copper-phenantroline (CuPhe) was possible for all combinations. However, by adding ATP, ADP or peptide to the TAP complex no differences in the cross-linking efficiency were detected. By CuPhe cross-linking TAP was trapped in a conformation, in which the peptide binding site was not accessible. To complete a transport cycle, a flexibility of at least 17.8 Å of the NBDs is needed, since TAP cross-linked by CuPhe (2.0 Å) or bismaleimidoethane (BMOE, 8.0 Å) was transport inactive but when TAP was cross-linked by 1,11-bismaleimido-triethyleneglycol (BM[PEG]3, 17.8 Å) transport activity was preserved.
5-Lipoxygenase (5-LO) catalyzes the two initial steps in the biosynthesis of leukotrienes, a group of inflammatory lipid mediators derived from arachidonic acid. Here, the regulation of 5-LO mRNA expression by alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay (NMD) was investigated. In the present study, the identification of two truncated transcripts and four novel 5-LO splice variants containing premature termination codons (PTC) was reported. The characterization of one of the splice variants, 5-LOΔ3, revealed that it is a target for NMD since knockdown of the NMD factors UPF1, UPF2 and UPF3b in the human monocytic cell line Mono Mac 6 (MM6) altered the expression of 5-LOΔ3 mRNA up to 2-fold in a cell differentiation-dependent manner suggesting that cell differentiation alters the composition or function of the NMD complex. In contrast, the mature 5-LO mRNA transcript was not affected by UPF knockdown. Thus, the data suggest that the coupling of alternative splicing and NMD is involved in the regulation of 5-LO gene expression.
RT-PCR analysis of different cell types revealed the existence of a large number of 5-LO splice variants. The most interesting splice variants were observed in BL41-E95A cells, which give a raise to novel 5-LO protein isoforms. This leads to the hypothesis of a novel regulatory mechanism in which the dimerization of 5-LO with 5-LO isoforms might regulate the 5-LO activity.
The 5-LO protein expression was reduced on translational level in UPF1 knock down cells, suggesting that UPF1 has a positive influence on 5-LO translation. Therefore, a mass spectrometry based proteomics study was started to identify compartment specific protein expression changes upon UPF1 knockdown in differentiated and undifferentiated MM6 cells. The proteomics analysis demonstrated that the knockdown of UPF1 results in numerous protein changes in the microsomal fraction (~ 21%) but not in the soluble fraction (< 1%). Western blot data confirmed the trend of the proteomics analysis. This data suggest that UPF1 is a critical gene expression regulator in a compartment specific way. During differentiation by TGFβ and calcitriol the majority of UPF1 regulated proteins was adjusted to normal level. It appears that that not only the NMD mechanism alters its composition during differentiation. Also the gene expression regulation on translational level by UPF1 seems to be also cell differentiation dependent. An interesting group of UPF1 target genes represent the downregulated proteins. qRT-PCR analysis of randomly chosen genes revealed no effect on mRNA expression upon UPF1 knockdown, suggesting that UPF1 positively influences the translation of these genes. Computational sequence analysis identified a conserved C-rich sequence which might be a hnRNP E2-binding site. hnRNP E2 has been characterized as a translational repressor in myeloid cells. Western blot analysis revealed a differentiation independent up regulation of hnRNP E2 by UPF1 knockdown. Additionally, microRNA-328 (miR-328) has been described as an RNA decoy modulating hnRNP E2 regulation. Due to this, stem loop qRT-PCR showed an up regulation of miR-328 in TGFβ and calcitriol differentiated MM6 cells. Based on this data we suggest a model in which downregulation of UPF1 increases hnRNP E2 expression, leading to translation inhibition. During differentiation, miRNA-328 is upregulated thereby competing with hnRNP E2 leading to an efficient translation
Ziel dieser Arbeit war es zum einen Informationen über den Mechanismus in Dodecinproteinen zu gewinnen, der zu der effizienten Fluoreszenzlöschung von gebundenem Riboflavin und einer deutlichen Verlängerung der Lebendsdauer des Chromophors unter Lichteinwirkung führt. Zum anderen sollte mit Hilfe eines kurzen Modellpeptids, das eine Azobenzoleinheit als Photoschalter in seinem Peptidrückgrat enthielt, erste Schritte der Peptidfaltung untersucht werden.
Die Untersuchungen an Dodecinproteinen konzentrierten sich hauptsächlich auf archaeales Dodecin aus Halobacterium salinarum (HsDod). Eine Besonderheit der Dodecinproteine ist, dass sie im Gegensatz zu anderen Flavinbindeproteinen zwei Flavinmoleküle in jeder ihrer sechs identischen Bindetaschen einbauen können. Kurzzeitspektroskopische Untersuchungen im UV/vis-Spektralbereich zeigen, dass nach Photoanregung eines gebundenen Riboflavinmoleküls nach etwa 10 ps der Ausgangszustand wieder erreicht wird. Weiterhin zeigt das Fehlen der stimulierten Emission in den transienten Daten, dass bereits innerhalb der Zeitauflösung des Experiments, in weniger als 150 fs, der erste angeregte Zustand des Riboflavins entvölkert wird. Dies verhindert unerwünschte Reaktionen des Riboflavins und stellt eine Versorgung der Zelle mit diesem wichtigen Baustein für die Biosynthese von FMN und FAD sicher. Die Ergebnisse zeigen außerdem, dass zwei Spezies mit unterschiedlichen spektralen Signaturen und Lebensdauern an dem Löschungsmechanismus und der Wiedererlangung des Ausgangszustands beteiligt sind. Der Vergleich von HsDod-Proteinen in nicht-deuteriertem und deuteriertem Lösungsmittel sowie die spektrale Signatur der Spezies, die mit einer Zeitkonstante von etwa 800 fs zerfällt deuten an, dass ein Elektronen- sowie ein Protonentransfer Teil des Mechanismus sind. Mit Hilfe von HsDod-Proteinen, bei denen der Asparaginsäurerest unterhalb der Bindetasche, der für das Binden eines wasserkoordinierten Magnesiumions verantwortlich ist, gegen Serin (D41S) oder Glutaminsäure (D41E) ausgetauscht war, konnte gezeigt werden, dass das wasserkoordinierte Magnesiumion nicht relevant für den Löschungsmechanismus ist. Dennoch konnte eine Beteiligung von Wassermolekülen nicht ausgeschlossen werden. Die Beteiligung eines Elektronentransfers von einem Tryptophanrest in der Bindetasche auf das photoangeregte Flavin konnte durch Messungen an Dodecinproteinen mit Tryptophan-Derivaten mit unterschiedlichen Ionisationsenergien bestätigt werden.
Die Spezies, die mit einer Zeitkonstante von etwa 5 ps zerfällt, die ebenfalls zu einer Wiederbesetzung des Ausgangszustands führt, konnte nicht eindeutig identifiziert werden. Die spektrale Signatur des zerfallassoziierten Spektrums könnte neben einer neutralen Tryptophanspezies und einem kationischen Riboflavinradikal auch durch schwingungsangeregte Riboflavinmoleküle verursacht werden.
Eine Beteiligung der Ribitylkette am Mechanismus kann aufgrund der Ergebnisse von HsDod-gebundenem Lumiflavin ausgeschlossen werden. Weiterhin konnte anhand der Ergebnisse für HsDod-gebundenes FAD, das in seiner geschlossenen Konformation gebunden wird, wobei der Adeninrest die zweite Position in der Bindetasche besetzt, eine Beteiligung des zweiten Flavins in der Bindetasche am Löschungsmechanismus sowie ein Beitrag zu den Differenzspektren ausgeschlossen werden. Somit dient die Besetzung einer Bindetasche mit zwei Flavinmolekülen vermutlich lediglich der Maximierung der Flavinbeladung. Nicht eindeutig geklärt werden konnte die Frage, ob es sich um einen sequentiellen oder parallelen Mechanismus handelt.
Neben archaealem wurde auch bakterielles Dodecin mittels transienter UV/vis-Spektroskopie untersucht. Für Dodecin aus Halorhodospira halophila (HhDod) konnte ebenfalls eine sehr schnelle Wiedererlangung des Ausgangszustands nach Photoanregung des gebundenen Riboflavins beobachtet werden. Allerdings spiegeln einige Unterschiede in den transienten Daten die Unterschiede in den Bindetaschen von archaealem und bakteriellem Dodecin wider und geben Hinweise darauf, dass die Funktionen in der Zelle für die Dodecine unterschiedlich sind. Diese Hypothese wird durch verschiedene Cofaktoren, Riboflavin und Lumichrom für HsDod und FMN für HhDod, in vivo unterstützt. Die ermittelten Zeitkonstanten sind für das bakterielle Dodecin etwas länger als für das archaeale und die transienten Daten weisen in den spektralen Signaturen der Differenzsignale sowohl Unterschiede als auch Gemeinsamkeiten auf.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden erste Schritte der Peptidfaltung mit Hilfe eines wasserlöslichen bizyklischen Modellpeptids, das den Photoschalter 4(4’-Aminomethylphenylazo)benzoesäure (AMPB) enthält, untersucht. Hierfür wurden Kurzzeitspektroskopische Messungen im mittleren infraroten Spektralbereich für den Schaltvorgang von der cis-Form des Azopeptids in die trans-Form durchgeführt. Diese Methode erlaubt es, transiente Konformationsänderungen des Peptidrückgrats zu verfolgen. In der cis-Form kann das Peptid mehrere unterschiedliche Konformationen einnehmen, während der Konformationsraum für die trans-Form deutlich eingeschränkt ist. Nach der Photoanregung im Bereich der n-pi*-Bande der Azobenzoleinheit finden die grundlegenden konformationellen Änderungen innerhalb der ersten 10-20 ps statt. Dies wurde durch polarisationsabhängige Messungen bestätigt.
Auf dieser Zeitskala finden die größten Änderungen in den transienten Differenzspektren statt, die auf Konformationsänderungen sowie Kühlprozesse zurückzuführen sind. Diese Prozesse konnten mit einer Zeitkonstanten von 5 ps zusammengefasst werden. Auf längeren Zeitskalen finden weitere Reorganisationsprozesse statt, die mit einer Zeitkonstante von 300 ps zusammengefasst werden können. Bei maximaler Verzögerungszeit des Experiments (1,8 ns) ist der Gleichgewichtszustand noch nicht erreicht und es finden weitere Prozesse auf längeren Zeitskalen statt. Im Vergleich zu einem ähnlichen bereits untersuchten DMSOlöslichen bizyklischen AMPB-Peptid konnte keine schnellere Dynamik durch den Einsatz von Wasser als Lösemittel festgestellt werden, wie es vorangegangene transiente Experimente im UV/vis-Spektralbereich an wasser- und DMSO-löslichen bizyklischen Azopeptiden angedeutet hatten. Die Ergebnisse der transienten Messungen zeigen gute Übereinstimmungen mit molekulardynamischen Rechnungen. Das so gewonnene Modell von den Prozessen nach der Isomerisierung des Photoschalters erlaubt Einblicke in erste Schritte bei der Faltung von Peptiden in ihrem natürlichen Lösungsmittel Wasser und die Zeitskalen der entsprechenden Prozesse.
Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen an GXG Modellpeptiden konnten eindeutig zeigen, dass diese Peptide, auch ohne das Vorhandensein von langreichweitigen Wechselwirkungen, bestimmte Sekundärstrukturen präferieren. Ein Teil der beobachteten, auftretenden Strukturmotive lässt sich hierbei über den sterischen Anspruch der Seitenkette erklären, ein anderer Teil über die Ladung der Seitenkette. In Kombination mit anderen Spektroskopischen Methoden konnten zehn dieser Peptide genauestens untersucht werden. Hierbei zeigte sich, dass diese Peptide nicht nur die favorisierten Regionen des Ramachandran-Diagramms besetzen. Ein Vergleich mit dem Vorkommen bestimmter Aminosäuren, beispielsweise in loop Regionen von Proteinen, zeigt dass die Sequenz dieser loops nicht zufällig ist. Tatsächlich besitzt ein Teil der Aminosäuren, die besonders häufig an bestimmten loop Positionen vorkommen, bereits die intrinsische Vorliebe, die notwendige Konformation einzunehmen. Diese Aminosäuren und die umgebenden loops sind somit eventuell nicht nur das simple Verbindungsglied zwischen zwei Sekundärstrukturen, sondern kommen selbst als Ausgangspunkte für Peptid- bzw. Proteinfaltung in Frage.
Ein weiteres Augenmerk der Arbeit lag auf der Messung von skalaren und dipolaren Kopplungen an isotopenmarkierter RNA. Es wurden vier Pulssequenzen entwickelt, die es ermöglichen, 1J skalare bzw. dipolare Kopplungen in der Zuckerregion von 13C- markierter RNA mit hoher Präzision zu messen. Die entwickelten J-modulierten Experimente ermöglichen die Messung von 1J(H2’C2’), 1J(C1’C2’) sowie 1J(C2’C3’) Kopplungen selbst für größere RNA Moleküle. Die Detektion erfolgt hierbei auf den C1’H1’ Signalen, die Zuordnung der Kerne, deren Kopplung gemessen wird, ist nicht einmal erforderlich. Die Anwendbarkeit konnte für verschiedene Systeme mit 14 bis 70 Nukleotiden demonstriert werden. Die erreichte Präzision ermöglichte es außerdem auch sehr kleine Effekte, wie beispielsweise die Ausrichtung von RNA im Magnetfeld zu detektieren.
Diese Arbeit zeigt außerdem zwei Beispiele für die gezielte Modifikation, um Lanthanid Bindungsstellen einführen zu können. Auf chemischen und biochemischen Weg konnte isotopenmarkierte, in vitro transkribierte RNA modifiziert werden. Die Ergebnisse zeigen eindeutig eine Bindung von Lanthanid-Ionen an die modifizierte RNA. Die auftretenden, eher kleinen Effekte, sind vermutlich auf die noch zu hohe Flexibilität der eingeführten Modifikationen. Vor allem bei der chemischen Modifikation besteht hier noch Potential zur Optimierung, nachdem die generelle Anwendbarkeit der Methode demonstriert wurde.
Der letzte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse von Kopplungsmustern zur Analyse und zum Vergleichen von Naturstoffen. Hier konnten aus einer Reihe von Derivaten eindeutig die identifiziert werden, die verglichen mit der Ausgangsstruktur, die gleiche Konformation besitzen. Die gewonnenen Ergebnisse decken sich hier mit durchgeführten biologischen Tests, die ebenfalls dasselbe Derivat als aktiv identifizieren konnten, was klar für eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung spricht.
In der vorliegenden Arbeit werden Methoden und Anwendungen gezeigt, um skalare und dipolare Kopplungen im Bereich von Peptiden, Nukleinsäuren und kleinen Molekülen zu nutzen. Die durchgeführten Arbeiten reichen dabei von der speziellen Probenpräparation zur Messung von dipolaren Kopplungen bis hin zur Entwicklung neuer NMR-spektroskopischer Methoden zur Messung von Kopplungen mit höherer Präzision und an größeren Systemen als bisher.
Seit einigen Jahrzehnten ist Lysozym eines der am meisten erforschten Proteine in der Literatur und wird hauptsächlich als Modell Protein zur Aufklärung der Faltungs- und Entfaltungsprozesse genutzt. Da die Frage nach Fehlfaltung und deren Verknüpfung mit neurodegenerativen Krankheiten bis zum heutigen Tag nicht vollständig geklärt ist, besteht hier ein großer Spielraum für weitere Forschungsansätze. In der vorliegenden Arbeit wurden daher zwei Modellsysteme verwendet, Hühereiweiß-Lysozym und menschliches Lysozym, jeweils in ihrem nicht-nativen ungefalteten Zustand. Diese ungefalteten Ensembles wurden mit Hilfe NMR spektroskopischer Methoden untersucht und ergaben sehr detaillierte, zum Teil auch überraschende neue Einblicke in Struktur und Dynamik der beiden Proteine und liefern somit wichtige Erkenntnisse zu Faltungs- und Aggregationsprozessen. ...
The display of foreign polypeptides and proteins on the surface of viruses or cells provides an important tool for the engineering of biomolecules and the analysis of their interactions with binding partners. The most extensively used display platform is the coat protein of the filamentous bacteriophage (Smith, 1985). Phage display libraries have often been selected for polypeptides, e.g. single chain (sc) antibodies that bind to a protein of interest, but in vivo selection could only be demonstrated for peptides so far. An alternative display platform is the retrovirus murine leukemia virus (MLV). Here, polypeptides are displayed at the N-terminus of the viral envelope glycoprotein. Proof of principle for this platform was demonstrated for protease substrate libraries, which can be selected through coupling proteolytic activation with viral infectivity (Buchholz et al., 1998). Selection of the library CX4A on living cells resulted in viruses with more than three orders of magnitude improved spreading efficiency through tumor cells (Hartl et al., 2005). Also scAb libraries have recently been displayed and selected using retroviruses (Urban et al., 2005). The library scFvlibxMo displays the repertoire of phage display preselected sc antibodies for laminin-1 binding. The retrovirus based selection process resulted in laminin-specific sc antibodies with improved expression levels in mammalian cells.
This thesis describes the in vivo (i.e. in mouse tumor models) selection of the C-X4-A and scFvlibxMo for tumor homing upon systemic delivery.
For selection of the protease substrate library C-X4-A a subcutaneous tumor was induced in SCID mice followed by three systemic injections of the library. The selection process was monitored over a period of 34 days. After the incubation period mice were sacrificed and virus load in organs and tumor determined. PCR analysis after 34 days showed that virus from the library had preferentially infected the tumor. Sequence analysis showed the selection of protease substrates with the most prominent one with a frequency of over 65%. The four most prominent protease substrate variants where reconstituted into the original viral backbone for further investigation (C-SK-A, C-HI-A, C-HM-A and C-HS-A). Interestingly, these viruses exhibited a reduced spreading capacity in vitro on HT1080 cells as compared to the C-AK-A virus, which had previously been selected on HT1080 cells. When assayed for tumor homing, however, viruses C-HI-A and C-HS-A had clearly improved in comparison to C-AK-A. Tumor tissue had been infected at rates of over 55% while virus load of extratumoral organs was very low (infection rates <0.7 for C-HS-A and <0.02 for C-HI-A). Tumor targeting capacity had thus been improved over 10-fold by the in vivo selection of the C-X4-A library.
The experimental set up for the in vivo selection of the scFvlibxMo library was performed according to that of the C-X4-A library. Fingerprint analysis of the selected viruses that infected tumor tissue resulted in the identification of seven antibody variants showing unique CDR3 sequences. Two prominent clones (M49T-A and M49T-B) were cloned back into the MoMLV genome for further analysis of the reconstituted viruses. While variant B bound laminin-1 efficiently, variant A was unable to do so, although it was selected at highest frequency (76%). Both reconstituted viruses were equally well infectious and spread through HT1080rec1 cells at a similar efficiency as MoMLV. In an in vivo competition experiment the selected viruses clearly out-competed a laminin-1 binding reference virus L36xMo for tumor homing. To understand the molecular driving forces behind the in vivo selection process the epitope of the selected scFv M49T-A was identified using a phage peptide library approach. In silico analysis led to the identification of a small group of possible antigens, including tenascin, fibronectin and collagen.
The data described in this thesis demonstrate that the retrovirus display platform is capable of allowing the in vivo selection of protease substrates and scFvs. Notably, the replication competence of the system introduced an additional level of complexity to the library. The performed in vivo selections significantly enhanced tumor tropism. Selective infection of tumor cells combined with transfer of anti-tumoral genes is an attractive strategy for cancer therapy being in focus of current research. The viruses selected in this thesis build prime candidates for targeted retrovirus based tumor therapy.
Nuclear Magnetic Resonance ("NMR") is a powerful and versatile technique relying on nuclei that posses a spin. Since its discovery more than 6 decades ago, NMR and related techniques has become a tool with innumerable applications throughout the fields of Physics, Chemistry, Biology and Medicine. Numerous Nobel Prizes have been awarded for work in the field and a multi billion dollar industry has developed on its basis.
One of NMR's major shortcomings is its inherent lack of sensitivity. Because it relies on the Boltzmann populations of spin states with a minuscule Zeeman splitting, this is particularly true for room temperature experiments.
As a result, in an enormous technological effort to enlarge the Zeeman splitting NMR magnets have been moving to higher and higher magnetic fields. However, even for proton spins possessing the largest magnetic moment of all nuclei, the degree of polarization that can be achieved in the strongest spectroscopic magnets available today (~24 T) at room temperature is merely ~ 8*(10 exp (-5)). In other words, this low polarization theoretically allows a sensitivity enhancement of 104 towards full polarization.
Since Magnetic Resonance Imaging ("MRI") is based on the same principle, it shares this problem with NMR. Furthermore, for technical and physiological reasons full body MRI tomographs do not reach the magnetic field strengths of spectroscopic NMR magnets, making this even more of an issue for MRI.
In consequence, MRI is chiefly restricted to detecting protons, while both MRI and NMR detection of 13C (or other low nuclei) under physiological conditions, i.e. low natural abundance of 13C and a low concentration of the respective substance, suffer from long acquisitions times that are necessary to obtain adequate signal to noise ratios ("SNR").
However, this drawb of NMR can be overcome. The enormous potential sensitivity increase of four orders of magnitude can - at least partially - be exploited by several hyperpolarization techniques, creating entirely new applications and fields of research.
These hyperpolarization techniques comprise chemical approaches like Parahydrogen Induced Polarization ("PHIP") or Photochemically Induced Dynamic Nuclear Polarization ("Photo-CIDNP"), as well as physical techniques like optically pumped (noble) gases13, 14 or Dynamic Nuclear Polarization ("DNP"), which will be the focus of this work. A hyperpolarized substance will render a larger signal without being physically or chemically altered in any other way. It is therefore "marked" without any marker, making it an agent free contrast agent for MRI.
DNP is a technique, in which hyperpolarization of nuclear spins is achieved by microwave (\MW") irradiation of unpaired electron spins in radicals, which are coupled to these nuclei, e.g. 1H, 13C or 15N. The electron spin population is perturbed if the microwave irradiation is resonant with the electron spin transition, which affects the polarization of hyperfine-coupled close nuclei. For large microwave power (i.e. saturating the electron spin transition) the orders of magnitude larger thermal electron spin polarization is effectively transferred to these nuclear spins in the sample. For proton spins the maximum polarization gain amounts to 660, whereas for 13C the sensitivity gain can be as large as 2600. In contrast to e.g. PHIP, which is restricted to specific reaction precursors, DNP is not limited to specific nuclei or hyperpolarization target molecules, making it a very versatile technique. DNP has been first proposed by Overhauser in 1953,15 and experimentally observed shortly thereafter in metals16 and liquids,17 both being systems with mobile electrons. In the 1960s and 70s, DNP was used as a spectroscopic tool in liquids, thoroughly mapping the effect in the low field regime. As well, several other transfer mechanisms were discovered, which are active in the solid state with localized electrons, namely the solid effect the cross effect and thermal mixing. The theory for all three of these mechanisms predicts reduced transfer efficiencies at higher magnetic fields. This fact and the lack of high frequency microwave sources to excite electron spins at magnetic field strengths above 1 T, effectively relegated DNP to a position of an interesting scientifi curiosity.
In the early 1990s, DNP came to a renaissance, when DNP was performed at high field in solid state magic angle spinning ("MAS") experiments using high power gyrotron microwave sources. This pioneering work sparked a surge of new developments and applications.
As well, this success triggered attempts to investigate also the potential of DNP in the liquid state at high magnetic fields, e.g. at 3.4 T35{38 and 9.2 T. To date, DNP can be considered one of the "hot topics" in the field of magnetic resonance, bringing about special issue in magnetic resonance journals and DNP sections on magnetic resonance conferences.
This thesis deals with the development of an in-bore liquid state DNP polarizer for MRI applications operating in ow through mode at a magnetic field strength of 1.5 T. Following this introductory chapter, the theoretical background necessary to understand and interpret the experimental results is explained in chapter 2. Subsequently, chapter 3 deals with the issue of performing liquid state DNP at high magnetic fields and its challenges. The chapter comprises a quick overview of the necessary hardware, the experimental findings for various samples and the interpretation of these findings. along with the ramifications for the aim of this work. Chapter 4 deals with the issue of increasing sensitivity and contrast in MRI, in particular by means of DNP. The chapter illustrates the development of our polarizer by presenting the hardware that was developed and demonstrating its performance under various conditions. As well, several alternative approaches are introduced and compared to our approach. Finally, chapter 5 summarizes the findings and gives an outlook on further developments.
Die Untersuchung von RNA mittels NMR-Spektroskopie hat in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, weil die Zahl der neu entdeckten RNA-Funktionen, wie z.B. RNA-Schalter in Bakterien, stark gestiegen ist. Ziel dieser Arbeit war es, mithilfe der NMR-Spektroskopie einen Beitrag zum besseren Verständnis der biochemischen Prozesse, in die RNA-Moleküle involviert sein können, zu leisten.
Im ersten Teil dieser Arbeit (Kapitel 2, 3 und 4) werden zum einen die Entwicklung neuer Methoden für die RNA-Strukturbestimmung vorgestellt und zum anderen die Leistungsfähigkeit der modernen NMR-spektroskopischen Strukturaufklärung demonstriert.
Im zweiten Teil dieser Arbeit (Kapitel 5) wird die NMR-Spektroskopie zur Untersuchung der RNA-Schalter-Funktion eingesetzt. Die biologische Funktion von RNA oder Proteinen setzt oftmals eine dynamische Struktur voraus und involviert Konformationsänderungen infolge biochemischer Signalweiterleitung. Für die Charakterisierung solcher Prozesse eignet sich die NMR-Spektroskopie insbesondere gut, weil sie in Lösung unter verschiedenen Reaktionsbedingungen angewandt wer-den kann. Durch den direkten NMR-spektroskopischen Nachweis von Basenpaarungen können wichtige strukturelle Eigenschaften (Faltung, Strukturhomogenität und Dynamik) entschlüsselt und in einen Zusammenhang mit der Funktion gebracht werden.
Im Folgenden werden die einzelnen Kapitel vorgestellt.
Nachdem das erste Kapitel eine allgemeine Einleitung in die NMR-Spektroskopie, RNA-Struktur und Funktion der RNA-Schalter darstellt, folgt im Kapitel 2 die Einführung einer neuen Methode, die eine quantitative Bestimmung der Torsionswinkel alpha und zeta in RNA/DNA mittels NMR-Spektroskopie ermöglicht (Abb. 1). Sie basiert auf der Wechselwirkung zwischen dem CH-Dipol und der 31P-CSA, die von der relativen Orientierung abhängig ist. Die Methode wurde für die CH- und CH2-Gruppen in Form von zwei Pulssequenzen (2D- und 3D-G-HCP) zur Messung von insgesamt fünf kreuz-korrelierten Relaxationsraten entlang des RNA/DNA-Rückgrats optimiert. Die Funktionsfähigkeit der Methode wurde zunächst an der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA getestet und zur Bestimmung der Torsionswinkel alpha und zeta genutzt. Die Ergebnisse flossen in die Strukturrechnung der 14mer RNA, die im Kapitel 3 vorgestellt wird, mit ein. Des Weiteren gelang es die Anwendbarkeit der Experimente an einer größeren 27mer RNA zu demonstrieren. Die neue Methode ist deswegen von Bedeutung, weil die Winkel alpha und zeta nicht über 3J-Kopplungskonstanten gemessen werden können.
(Nozinovic, S., Richter, C., Rinnenthal, J., Fürtig, B., Duchardt-Ferner, E., Weigand, J. E., Schwalbe, H. (2010), J. Am. Chem. Soc. 132, 10318-10329.)
Im Kapitel 3 wird die NMR-spektroskopische Bestimmung der Struktur einer Model-RNA, der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA, vorgestellt. Die Strukturrechung wurde mit verschiedenen NMR-Datensätzen, die in der Arbeitsgruppe einschließlich dieser Doktorarbeit gesammelt wurden, durchgeführt. Zusammen mit den Ergebnissen aus dem Kapitel 2 konnte eine sehr präzise Struktur mit einem RMSD von 0,37 Å (20 Strukturen) in sehr guter Übereinstimmung mit experimentellen Daten ermittelt werden. Die gerechnete Struktur repräsentiert eine der gegenwärtig genauesten und umfassendsten Strukturbestimmungen einer RNA, bei der jeder Torsionswinkel quantitativ bestimmt wurde. Einen besonderen Höhepunkt stellt die strukturelle Analyse der 2’OH-Gruppen dar, die im anschließenden Kapitel 4 weiter vertieft wurde.
(Nozinovic, S., Fürtig, B., Jonker, H. R. A., Richter, C., Schwalbe, H. (2010), Nucleic Acids Res. 38, 683-694)
Über Jahre war bekannt, dass die Größe der 1J(C1’,H1’)- und 1J(C2’,H2’)-Kopplungskonstanten innerhalb der Ribonukleotide von der lokalen Struktur des Zuckers und der Orientierung der Nukleobase beeinflusst wird. In dieser Arbeit (Kapitel 4) wurde zum ersten Mal ein systematischer Vergleich zwischen NMR-Messungen und DFT-Rechnungen durchgeführt, der eine eindeutige Zuordnung der Hauptkonformationen des Zuckers (C3’- oder C2’-endo) und der Nukleobase (anti oder syn) anhand der 1J(C,H)-Kopplungskonstanten erlaubt. Die beschriebene Methode wurde an einer größeren 27mer RNA erfolgreich erprobt. Weiterhin wurde erstmalig entdeckt, dass zudem die Orientierung der 2’OH-Gruppe einen signifikanten Einfluss auf die 1J(C,H)-Kopplungen hat (Abb. 3). Mithilfe von NMR-Messungen und DFT-Rechnungen konnte aus 1J(C,H)-Kopplungskonstanten die Orientierung von allen 2’OH-Gruppen in der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA bestimmt werden. Die Methode hat den großen Vorteil, dass 2’OH-Gruppen, die aufgrund des schnellen Austauschs mit Wasser oder D2O keine NMR-Signale liefern, analysiert werden kön-nen.
(Nozinovic, S., Gupta, P., Fürtig, B., Richter, C., Tüllmann, S., Duchardt-Ferner, E., Holthausen, M. C., Schwalbe, H. (2011), Angew. Chem. Int. Ed. 50, 5397-5400)
Im Kapitel 5 wird eine NMR-spektroskopische Untersuchung an der Aptamerdomäne des Adenin-bindenden RNA-Schalters (pbuE) vorgestellt. Im Fokus der Forschung stand die Frage: Welchen Einfluss hat die Länge der P1-Helix auf die Struktur und die Ligandbindung der freien Aptamer-domäne?
Durch den Vergleich von zwei Konstrukten mit unterschiedlich langer P1-Helix war es möglich, intrinsische Scherkräfte, die durch die Ausbildung der P1-Helix in der freien Aptamerdomäne entstehen, festzustellen. Es hat sich im Konstrukt mit der verlängerten P1-Helix gezeigt, dass diese zur Destabilisierung der P3-Helix und des Schlaufenkontakts führen. Diese strukturellen Änderungen haben außerdem zur Folge, dass die Bindungsstärke des Liganden reduziert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass ein strukturelles Gleichgewicht zwischen Sekundärstrukturelementen die tertiäre Faltung beeinflusst und die Funktion moduliert.
(Nozinovic, S., Reining, A., Noeske, J., Wöhnert, J., Schwalbe, H. (2011), in Vorbereitung)
In der vorliegenden Dissertation stand die Aufklärung der Funktion und Regulation von p21 in der Mitose im Mittelpunkt. p21 ist als Cdk-Inhibitor und Schlüsselregulator bekannt, der in viele fundamentale zelluläre Prozesse involviert ist: Zellzyklusregulation, Apoptose, Seneszenz, Zellmigration und Dynamik des Zytoskeletts, Transkription, Differenzierung sowie DNA-Reparatur, aber auch in die Umprogrammierung induzierter pluripotenter Stammzellen (Besson et al. 2008; Abbas und Dutta 2009; Jung et al. 2010).
Die unkontrollierte Proliferation von Zellen ist mit der Tumorgenese assoziiert und wird unter anderem durch die Fehlregulation von p21, aber auch durch die wichtigen mitotischen Kinasen Cdk1, im Komplex mit ihrer regulatorischen Untereinheit Cyclin B1, sowie Plk1 bedingt. Zudem ist das Fehlen von p21 oder die Fehllokalisation in das Zytoplasma mit einer schlechteren Prognose für den Patienten und Chemotherapie-Resistenz von Tumoren verbunden (Abukhdeir und Park 2008). Aufgrund der zunehmenden Inzidenz und Mortalität von Krebserkrankungen ist es daher von besonderem klinischem Interesse, die molekularen Ursachen für die Entstehung maligner Tumorerkrankungen aufzuklären. Bislang existieren kaum Studien über welche molekularen Mechanismen die Funktionen von p21, dem wichtigsten Cdk-Inhibitor, der zum Beispiel durch die Anwendung niedermolekularer Inhibitoren wie BI 2536, das sich bereits in klinischen Phase II Studien befindet (Strebhardt 2010), beeinflusst wird, während der Mitose reguliert werden.
In der vorliegenden Dissertation wurde daher die physiologische Rolle des Cdk-Inhibitors bzw. Regulators p21 während der Mitose untersucht und mit der Kinaseaktivität von Cdk1/Cyclin B1, wie auch Plk1 korreliert. Es konnte gezeigt werden, dass p21 während der Mitose stark exprimiert wird und dass mitotisches p21 in verschiedenen Krebszelllinien unabhängig von dem p53-Status in einer phosphorylierten Form vorkommt, welche mit der Aktivität von Cdk1 und weniger mit der von Cdk2 assoziiert ist. Durch Untersuchungen der isogenen HCT116-Zelllinien mit und ohne p21 wurde aufgezeigt, wie wichtig p21 für den ordnungsgemäßen Ablauf der Mitose ist. Ohne p21 sind sowohl die Anaphase wie auch die Zytokinese verlängert, die Zellen ordnen die Chromosomen fehlerhaft in der Metaphaseplatte an (congression Fehler), besitzen weitaus mehr lagging Chromosomen und fast 20 % der Zellen weisen im Versuchsverlauf Polyploidie auf. Durch den Verlust des Cdk-Regulators p21 kommt es zur Fehlregulation von Cdk1 und seiner Substrate (wie MCAK) und es treten die oben beschriebenen Probleme auf.
Weiterhin phosphoryliert Cdk1/Cyclin B1 p21 an Ser-130 in vitro und ex vivo in der frühen Phase der Mitose, der Prophase bzw. Prometaphase. Die nicht phosphorylierbare p21 Form S130A befindet sich hauptsächlich im Zellkern und führt zu vermehrtem Auftreten von congression Fehlern, während die S130D-Mutante, die die Phosphorylierung durch Cdk1 vortäuscht, schneller degradiert wird und zudem den Phänotyp der HCT116 p21-/- Zellen verstärkt. Zellen, die S130D exprimieren, benötigen mehr Zeit für das Durchlaufen der Mitose. Hier ist vor allem die Metaphase stark verlängert, aber auch Anaphase und Zytokinese. Dies führt zu congression Fehlern und zu Polyploidie. Diese Ergebnisse bestätigen, wie wichtig die zeitlich korrekte Phosphorylierung von p21 und die dadurch vermittelte Aktivierung von Cdk1/Cyclin B1 ist.
Darüber hinaus stabilisiert die Suppression von Plk1 das p21 Protein, was darauf hinweist, dass die Degradation von p21 während der Prometaphase von Plk1 kontrolliert wird. Dies wird von der Tatsache unterstützt, dass Ser-114, wie auch Ser116 von Plk1 in vitro phosphoryliert wird. Die Deregulation von p21 durch Plk1, SS114/116AA bzw. SS114/116DD induziert Chromosomenfehler, wodurch die molekularen Mechanismen, warum fehlreguliertes Plk1 die Tumorgenese fördert, hervorgehoben werden.
Nach Abschluss der bisherigen Untersuchungen steht fest, dass man sich von der starren Rolle von p21 als Tumorsuppressor und Akteur während der G1/S-Phase lösen muss. Der Cdk-Inhibitor p21 trägt entscheidend zur mitotischen Progression bei, vor allem bedingt durch die zeitlich ordnungsgemäße Inaktivierung bzw. Aktivierung von Cdk1/Cyclin B1, der Kinase, die wiederum zahlreiche für die Mitose essentielle Proteine reguliert. In Zukunft muss zum besseren Verständnis der Rolle von p21 in der Mitose die genaue Abfolge der Ereignisse unter Einbeziehung der Degradationsmechanismen eingehender untersucht werden.
Parvulustat ist ein kleines Protein (8,2 kDA), das aus dem Bodenbakterium Streptomyces
parvulus sekretiert wird. Es ist ein saures Polypeptid mit einem isoelektrischen Punkt von 4,49
und inhibiert spezifisch α-Amylasen (Ki = 9 x 10-12).
In der vorliegenden Arbeit sollen neben der Isotopenmarkierung des Parvulustats PL-Mutanten
mittels PCR-Mutagenese und DNA Rekombinationstechnick hergestellt werden.
Zur Charakterisierung und Strukturbestimmung der Mutanten werden größere Mengen des
jeweiligen Proteins benötigt, wofür wiederum ein effektives Expressionssystem bereitstehen
muß. Ein Expressionssystem besteht aus einem Wirtsorganismus der seinen Protein-Biosynthese-
Apparat zur Verfügung stellt und einem Vektor (Plasmid) der das Zielgen trägt. Im Falle des
Parvulustats und seiner Mutanten bietet sich der gut charakterisierte Stamm Streptomyces
lividans TK 24 (Hopwood et al, 1985) als Wirtsorganismus an. Der Inhibitor wird in ihm als
Vorläuferprotein mit Signalpeptid als Transportsignal (Leader) gebildet. Da dieses Bakterium
keine äußere Membran besitzt, wird der Inhibitor direkt ins Kulturmedium ausgeschleust. Dabei
wird das Signalpeptid durch die Signalpeptidase abgespalten.
Das Strukturgen wird zuerst im Klonierungsplasmid pSH09 in E. coli vervielfältigt, bevor es mit
den Enzymen EcoRI und SpeI geschnitten wird, um in den Expressionsvektor pSH017 integriert
zu werden. Dieser Shuttlevektor trägt genauso die gewünschten Restriktionsschnittstellen, SpeI
und EcoRI, die die paßgenaue Ligation des rekombinanten Strukturgens mit den funktionellen
Elementen erlauben.
Nach erfolgtem Einbau des Zielgens in das neue Vektorkonstrukt kann dieser Expressionsvektor
leicht in den Wirtsorganismus eingebracht werden und sich dort vermehren. Nach Klonierung der
mutierten Parvulustatsgene in den Expressionsvektor werden die damit transformierten Zellen auf
R2YE-Platten aufgebracht und bei einer Temperatur zwischen 20 und 28°C je nach PL-Mutanten
inkubiert. Zur Selektion wird Thiostrepton verwendet. Nach Transformation und Vermehrung
geeigneter Wirtszellen wird das klonierte Gen transkribiert. Durch anschließende Translation der
gebildeten mRNA in der Wirtszelle entsteht das gewünschte Protein in großen Mengen. Zur
Überprüfung der Aktivität der einzelnen Mutanten steht der qualitative α-Amylase-Plattentest zur
Verfügung, wobei die aktiven Mutanten einen blauen Hemmhof bilden (siehe Abbildung 24). Der
blaue Jod-Stärke-Komplex weist, bei gleichzeitigem Vorhandensein von α-Amylase, auf nicht
abgebaute Stärke und damit indirekt auf die Produktion des α-Amylase-Inhibitors hin.
Da das Parvulustat von den Bakterien ins Medium abgegeben wird, besteht die Abtrennung der
Zellen durch Zentrifugation des Kulturmediums. Es folgen Ammoniumsulfatfällung des
Überstandes, Auftragung auf PAGE und präparative HPLC, nach der reines, einheitliches Protein
isoliert werden konnte.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist eines der Schlüsselenzyme der Leukotrienbiosynthese. Sie katalysiert zunächst die Umsetzung der freigesetzten Arachidonsäure(AA) zu 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HpETE), in einem zweiten Reaktionsschritt wandelt sie diese in Leukotrien A4 (LTA4) um. Leukotriene sind potente Entzündungsmediatoren und spielen eine wichtige Rolle bei entzündlichen und allergischen Reaktionen. Außerdem wird die Beteiligung an verschiedenen Krebsarten kontrovers diskutiert.
Sie besteht aus 673AS, ist 78 kDa schwer und gliedert sich wie alle bisher bekannten Lipoxygenasen in eine N-terminale C2-ähnliche, regulatorische Domäne(AS 1–114) (C2ld), die für die Membran- und Calciumbindung sowie die Interaktion mit dem Coactosin-like Protein (CLP) verantwortlich ist, und in eine C-terminale, katalytische Domäne (AS 121–673), die das Nicht-Häm-gebundene Eisen im aktiven Zentrum trägt. Ein weiteres Strukturmerkmal sind zwei ATP-Bindungsregionen, eine befindet sich in der C2ld (AS 73–83), die andere auf der katalytischen Domäne (AS 193–209), das molare Verhältnis von 5-LO zu ATP konnte dabei auf 1:1 festgelegt werden [167].
Bereits 1982 wurde in einer Veröffentlichung von Parker et al. beschrieben, dass 5-LO aus Rattenzellen in Gegenwart von Calcium auf einer Gelfiltration dimerisieren kann [204], 2008 schließlich wurde von Aleem et al. publiziert, dass humane 12-LO aus Thrombozyten Dimere bilden kann [219]. Somit konnte es möglich sein, dass auch die humane 5-LO zur Dimerisierung fähig ist.
Zunächst wurde aufgereinigtes Enzym mit nativer Gelelektrophorese und anschließender Coomassiefärbung oder Western Blot untersucht, dabei konnten mehrere Banden pro Bahn detektiert werden. Um dieses Phänomen weiter zu untersuchen, wurde im Anschluss eine Gelfiltration etabliert; da die C2ld der 5-LO recht hydrophob ist, war es nötig, 0,5% T20 zum Elutionspuffer PBS/EDTA zuzusetzen, da das Enzym ansonsten unspezifisch mit dem Säulenmaterial interagiert und für seine Größe zu spät eluiert hätte. In Anwesenheit von T20 eluierte 5-LO in zwei getrennten Peaks, die exakt zu den vorher mit Referenzproteinen bestimmten Elutionsvolumina des Monomers und Dimers passten. Weiter wurde getestet, ob niedermolekulare Substanzen einen Einfluss auf das Dimerisierungsverhalten haben, allerdings konnte weder durch Ca2+noch durch ATP eine Verstärkung der Dimerisierung beobachtet werden. Dahingegen konnte, nach Vorinkubation mit GSH und Diamid, das alleinige Monomer auf der Gelfiltration nachgewiesen werden, nach Vorinkubation nur mit Diamid, lag das gesamte Protein ausschließlich als Dimer vor. Durch Gelelektrophorese mit oder ohne Zusatz von ß-Mercaptoethanol und LILBID-MS konnte die Ausbildung von intermolekularen Disulfidbrücken bestätigt werden. Ein Bindungsassay mit radioaktivem 35S-GSH konnte die kovalente Bindung des GSH an die 5-LO bestätigen. Quantifizierungsstudien mit Ellmans Reagens zeigten, dass mindestens eins der Oberflächencysteine mit GSH modifiziert wurde. Die von der Gelfiltration erhaltenen Fraktionen wurden auf enzymatische Aktivität getestet und in allen 5-LO-haltigen Fraktionen konnte Aktivität gefunden werden. Leider war es nicht möglich, eine Aussage darüber zu treffen, ob das Mono- oder das Dimer aktiver war. Es liegt offenbar in einem Fließgleichgewicht vor, da erneute Injektion des Monomerpeaks im bekannten Elutionsprofil aus zwei Peaks resultierte. Außerdem führt die Anwesenheit von 0,5% T20 während des Aktivitätstests zu einer Hemmung des Enzyms und weniger detektierbaren 5-LO-Produkten; es fiel vor allem auf, dass so gut wie keinerlei trans- und epitrans-LTB4, die nicht-enzymatischen Zerfallprodukte der 5-HpETE, nachzuweisen waren. Betrachtet man die Struktur der 5-LO, so findet man zehn Cysteine an der Oberfläche; die Cysteine 159, 300, 416 und 418 liegen dabei in einem Interface. Mutiert man diese Cysteine zu Serinen, so verschwindet der Dimer-induzierende Effekt des Diamids, wohingegen die Mutante weiterhin glutathionylierbar bleibt. Interessanterweise zeigt diese Mutante auch eine wesentlich weniger ausgeprägte Hemmung durch T20. Um eine Aussage treffen zu können, ob auch 5-LO aus humanen Zellen Dimere bilden kann, wurde 5-LO-haltiger S100 aus polymorphkernigen Leukozyten (PMNL) untersucht. Dabei konnte mit Western Blot und einem Aktivitätsnachweis gezeigt werden, dass die 5-LO in einem breiten Bereich von der Gelfiltration eluiert. Das deutet darauf hin, dass sie in PMNL ebenfalls dimerisiert vorliegen kann. In Gegenwart von Ca2+kam es zu einer Verschiebung der 5-LO zu höhermolekularen Gewichten, wobei dieses Phänomen nicht bei S100 aus transformierten E.coli auftrat, was auf einen gerichteten Komplex nach Calciuminduktion in PMNL hindeutet.
Außerdem wurde im Rahmen dieser Arbeit der Bindemodus von Sulindac an die 5-LO mittels Crosslinking untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass konzentrationsabhängig der einfache Komplex aus 5-LO und CLP abnimmt, dafür aber ein hochmolekularer Komplex, der beide Enzyme enthält, entsteht. Weder das Prodrug Sulindac noch der weitere Metabolit Sulindacsulfon oder andere Inhibitoren, die ebenfalls an der C2ld angreifen sollen, zeigten diesen Effekt. Leider konnte nicht weiter geklärt werden, was diesen Effekt verursacht, allerdings liegt die Vermutung nahe, dass es zu einer Aggregation kommt. Weitere Untersuchungen könnten wichtige Hinweise auf das Design von neuen Arzneistoffen bringen, um selektivere und damit nebenwirkungsärmere Inhibitoren zu finden.
The adaptive immune system of jawed vertebrates is based on recognition and elimination of cells that are either invaded by intracellular pathogens or malignantly transformed. One essential component of these processes is the cell surface presentation of antigenic peptides via major histocompatibility complex (MHC) class I molecules to cytotoxic T-cells (CTLs). Cells degrade defective ribosomal products and misfolded or unwanted proteins by the ubiquitin-proteasome pathway. The resulting degradation products are recognized and translocated by the transporter associated with antigen processing (TAP) into the endoplasmic reticulum (ER) lumen, where they are loaded onto MHC I molecules. Assembled peptide-MHC complexes are then shuttled by the secretory pathway to the cell surface for antigen presentation to CTLs, leading in the case of viral infection or malignant transformation to lysis and apoptosis of the target cell. Due to the fact that the TAP complex represents a key control point within the antigen presentation pathway, several viruses have evolved sophisticated strategies to evade immune surveillance by interfering with TAP function.
Detailed studies of the TAP mechanism or its viral inhibition have been severely impeded by difficulties in expressing sufficient amounts of functional heterodimeric TAP complex. Thus, the overexpression of TAP in the methylotrophic yeast Pichia pastoris was established for functional analysis of this important ABC complex. Biomass production was scaled up by fermentation using classical batch and feed methods. Extensive screening of optimal solubilization and purification conditions allowed the isolation of the heterodimeric transport complex. Notably, only the very mild detergent digitonin preserved TAP function. Hereby, the optimal solubilization and purification strategy yielded in 30 mg TAP transporter per liter culture. Remarkably, the protein amount was 50-fold increased compared to previously described expression/purification in cultured insect cells.
The high yield and quality of TAP produced in P. pastoris allowed an extensive analysis of substrate binding and transport kinetics of the transport complex in the membrane, its solubilized and purified state, as well as the reconstituted state. Thereby, a strong and direct effect of the lipid bilayer on ATP hydrolysis and peptide transport was discovered. These important results were extended further by successful functional reconstitution of the antigen translocation machinery in different lipid environments. For the first time, a stimulation of the transport activity by phosphatidylinositol (PI) and phosphatidylethanolamine (PE) was observed, whereas cholesterol was identified as an inhibitor of TAP activity.
Purification of TAP and subsequent thin-layer chromatography (TLC)/liquid chromatography Fourier transform-mass spectrometry (LC FT-MS) fingerprinting of residual lipids exhibited specifically associated glycerophospholipids; mainly PC, PE, and PI species. Strikingly, these lipids not only represent the primary class of phospholipids of the ER but were also shown to be essential for functional reactivation of delipidated, and thus inactive, TAP. The results demonstrate that transport of antigenic peptides by the ABC transporter TAP strictly requires specific glycerophospholipids.
In addition to the biochemical characterization of heterologous produced TAP, the soluble domain of the viral inhibitor US6 from human cytomegalovirus was expressed in E. coli. Optimization of the purification and refolding strategy yielded in functional protein, with a 35-fold increased protein amount compared to previous purification procedures. Protein activity was analyzed by specific inhibition of ATP binding to TAP. Furthermore, high protein yields allowed detailed investigation of TAP-dependent spatial and mechanistic separation of MHC I restricted cross-presentation in professional antigen presenting cells (pAPC).
Das onkogene Fusionsprotein AML1/ETO entsteht durch die chromosomale Translokation t(8;21), die in etwa 12 % aller primären akuten myeloischen Leukämien (AML) auftritt. Die DNA-Bindedomäne des hämatopoetischen Transkriptionsfaktors AML1 wird hierbei mit fast dem gesamten ETO-Protein fusioniert, das als transkriptioneller Repressor wirkt. In den transformierten Zellen kommt es somit zur Blockierung der myeloischen Differenzierung und zur verstärkten Proliferation. Entscheidend für das leukämische Potential von AML1/ETO ist die Fähigkeit zur Oligomerisierung, die durch die Nervy-Homologie-Region-2 (NHR2)-Domäne im ETO-Anteil vermittelt wird.
Durch lentivirale Transduktion konnte bereits gezeigt werden, dass Proteine, welche die NHR2-Domäne enthalten, die Oligomerisierung von AML1/ETO inhibieren und damit den leukämischen Phänotyp AML1/ETO-exprimierender myeloischer Zellen aufheben. In der vorliegenden Arbeit sollten nun alternative Wege zur Einbringung der therapeutischen Proteine in t(8;21)-positive AML-Zellen untersucht werden. Dafür wurde sowohl die Möglichkeit der Proteintransduktion als auch die Verwendung nicht-integrierender viraler Vektoren analysiert.
Im ersten Projekt wurden durch Fusion mit der HIV-1 TAT-Domäne zellpermeable NHR2-Proteine generiert. Zunächst wurde ein Protokoll zur Expression und Reinigung der rekombinanten Proteine etabliert. Durch eine ausführliche biochemische Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass die aus Bakterien aufgereinigten NHR2-Proteine funktionell und sehr rein waren. Sie wiesen den erwarteten hohen alpha-helikalen Anteil auf und behielten ihre Fähigkeit zur Bildung von Tetrameren in vitro bei. Die TAT-NHR2-Fusionsproteine sind in der Lage, in humane Zellen einzudringen und konnten erfolgreich in den Lysaten nachgewiesen werden. Mikroskopische Studien zeigten, dass der Großteil der internalisierten Proteine in Endosomen-ähnlichen Vesikeln lokalisiert war. Die Zugabe des Endosomeninhibitors Chloroquin oder eines endosomolytischen, zellpermeablen Peptides ermöglichte eine erhöhte intrazelluläre Stabilität der zellpenetrierenden Proteine. Co-Immunpräzipitations-Experimente konnten bestätigen, dass die aufgenommenen NHR2-Proteine spezifisch an das ETO-Protein in transfizierten, adhärenten Zellen binden können. Die Proteintransduktion in die myeloische, AML1/ETO-wachstumsabhängige Zelllinie Kasumi-1 ist unter serumfreien Bedingungen ebenfalls möglich. Die konsekutive Behandlung der AML-Zellen mit den TAT-NHR2-Fusionsproteinen führte zu einer Reduktion der Expression des Stammzellmarkers c-kit (CD117) in 26 % der behandelten Zellen. Die Anwendung zellpermeabler NHR2-Proteine ist demnach prinzipiell möglich, bedarf aber weiterer Optimierung, um die notwendige hohe Bioverfügbarkeit zu erreichen.
In einem zweiten Projekt wurden Adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren verwendet, um die NHR2-Proteine in den hämatopoetischen Zellen zu exprimieren. Mit Hilfe mehrerer Methoden konnte gezeigt werden, dass sich mit den generierten Vektoren, die auf dem AAV-Serotyp 2 basierten, erfolgreich eine transiente Genexpression induzieren ließ. Der CMV-Promoter vermittelte jedoch nur eine schwache Expression in den hämatopoetischen Zellen. Unter Verwendung des stärkeren SFFV-Promoters konnte die Expressionsstärke deutlich gesteigert werden. Die von den optimierten AAV-Vektoren vermittelte Expression der NHR2-Proteine führte in den beiden AML1/ETO-positiven Zelllinien Kasumi-1 und SKNO-1 zu den erwarteten, spezifischen Effekten. So wurde das Wachstum verlangsamt und gleichzeitig die Apoptoserate erhöht. AML1/ETO-unabhängige Zellen wurden dagegen von den AAV-NHR2-Vektoren nicht beeinflusst. Obwohl die Proteinexpression in SKNO-1 Zellen stärker war, zeigten die Kasumi-1 Zellen deutlichere Effekte. Die NHR2-Proteine bewirkten in den transduzierten t(8;21)-positiven Zellen außerdem eine Reduktion der Expression der Stammzellmarker CD34 bzw. c-kit. Dies deutet auf eine partielle Differenzierung der beiden AML1/ETO-abhängigen Zelllinien hin. Damit ließen sich durch AAV-vermittelte Transduktion in den AML-Zellen dieselbe Wirkung in Hinblick auf Wachstum, Differenzierbarkeit und Apoptoserate erzielen wie dies mit den lentiviralen Vektoren zuvor beschrieben wurde. In einem abschließenden Vergleich wurde aber deutlich, dass nicht-integrierende Vektorsysteme generell eine schwächere NHR2-Proteinexpression induzieren und demzufolge auch schwächere Effekte als integrierende Vektoren in den AML1/ETO-positiven Zellen auslösen.
Proteomic analysis is the large-scale identification and characterization of proteins including post translational modifications. Proteomics encompasses a number of approaches including bottom-up and top-down workflows which are widely used independently and complementary as tools for the successful study of protein species. However, up to the present day these techniques have not been able to overcome every analytical limitation. Mass spectrometry has played a vital role alongside proteomics in providing the required analytical means of detecting protein amounts down to the atomole range. Soft ionization methods such as matrix assisted laser desorption/ionization (MALDI) and electrospray ionization (ESI) have permitted the transfer of peptides and intact proteins into the gas phase without extensive degradation. The introduction of recent developments in MALDI technology such as the highly sensitive 4-chloro-alpha-cyanocinnamic acid matrix (Cl-CCA) as well as the commercial availability of a MALDI-LTQ-Orbitrap which boosts peptide mass accuracy below 3 parts per million (ppm), have offered new prospective in protein analysis. The aim of the current study is to incorporate these new aspects and provide further advancements in gel-based as well as gel-free proteomic workflows.
Peptides of proteolytically digested proteins are routinely analyzed by means of peptide mass fingerprinting (PMF) often combined with MS/MS analyses to complement and substantiate PMF results by peptide sequence information. The most widely used protease for enzymatic digestion is trypsin, since it exhibits a very specific cleavage behavior limited to C-terminal hydrolyses after basic amino acids. However, less specific enzymes such as chymotrypsin, elastase and pepsin have emerged as useful tools in the analysis of particular protein classes e.g. membrane, cereal, and phosphorylated proteins. In this work a comprehensive bottom-up proteomic investigation including in-solution and in-gel protein digestions of analytes covering small to large, acidic to basic, and hydrophobic to hydrophilic proteins in combination with a series of less specific enzymes are presented in order to show the superiority of the novel MALDI matrix Cl-CCA. The Cl-CCA matrix proved to be highly superior compared to standard α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) since an average detection of more than 2- to 3-fold peptide amount was possible depending on the used protease and, therefore, resulting in strongly increased sequence coverage. Additionally, protein identification of chymotrypsin and elastase in-gel digested protein standards was evaluated. The MALDI-LTQ-Orbitrap providing peptide mass accuracy below and up to 3 ppm in combination with Cl-CCA as matrix and newly optimized digestion conditions led to unambiguous protein identifications of all chymotryptic digests outperforming its tryptic counterparts in the case of hydrophobic bacteriorhodopsin and α-globin from hemoglobin A (α-HgbA). In addition, significantly higher sequence coverage and increased number of detected peptides was acquired. Moreover, a proposed workaround for elastase digestions was capable of providing a solution for successful identification results.
Apart from digestions of singly separated proteins, solution isoelectic focusing (sIEF) was evaluated. OFFGEL fractionation is an efficient means of fractionating peptides and proteins according to their isoelectric point (pI) values through immobilized pH gel (IPG) strips after which samples are recovered in solution. Consequently, an issue of peptide recovery arises as a category of peptides relatively insoluble to the recovery solution should be present. A method was developed including the scraping of gel matrix from the IPG strips and peptide extraction using acetonitrile as organic solvent in combination with analytical techniques such as nLC-MALDI-MS/MS for peptide identification. The nature of the peptide species remaining in-gel was analysed and attributed to peptide solubility. A general trend in which a high percentage of neutral and hydrophobic peptides remaining entrapped in the IPG gel strip was observed.
The present work also examines a new top-down proteomic workflow involving protein elution from cleavable gels containing the labile crosslinker ethylene-glycol-diacrylate (EDA). Protein amounts of as low as 100 ng loaded onto EDA gels were detected using MALDI-TOF MS in the linear acquisition mode. Proteins from 8.5 up to 78 kDa were successfully measured including a hydrophobic 15 kDa core protein attaining a GRAVY score of +0.079. Additionally, the method was compatible with one dimensional protein separation as well as for 2-D IEF/SDS-PAGE. Lastly, two methods for protein identification were tested and found to be compatible to the proposed technique.
Clathrin-mediated endocytosis (CME) involves spatially and temporally restricted molecular dynamics.
Although protein kinases and the actin cytoskeleton contribute to the process, whether and how
functions of kinases and actin are integrated remains unknown. Here, we demonstrate that neural
Wiskott-Aldrich syndrome protein (N-WASP) and protein kinase CK2 form a complex and localize on
clathrin-coated vesicles (CCVs). N-WASP binds to and is phosphorylated by CK2, thereby reducing the
kinase activity of CK2. By contrast, N-WASP-promoted actin polymerization is decreased upon both
phosphorylation and binding of CK2. Knockdown of N-WASP and CK2, alone or in combination, results
in impaired endocytosis of epidermal growth factor (EGF) and increased cell-surface levels of EGF
receptor (EGFR). In order to rescue the phenotype of N-WASP-CK2 knockdown cells, both N-WASP and
CK2 activities and abilities to assemble in a complex are required. In summary, this study shows that the
N-WASP-CK2 complex integrates in a single circuit different activities contributing to CME of EGFR and
that the interplay between the two proteins optimizes this process.
Diese Arbeit beschäftigt sich mit den Strukturen supramolekularer Komplexe, die aus einem Wirkstoff und einem Modellrezeptor bestehen. Um die spezifische Bindung durch H-Brückenbildung nachzuahmen, wurden Co-Kristallkomponenten ausgesucht, die komplementäre Bindungsstellen besitzen. Die Strukturen der erhaltenen Komplexe sowie einiger (pseudo)polymorpher Formen wurden mit Hilfe der Einkristallstrukturanalyse bestimmt. Ein Vergleich mit Kristallstrukturen ähnlicher Verbindungen ergab Hinweise auf die bevorzugten Konformationen sowie die am häufigsten gebildeten H-Brückenmotive. Theoretische Berechnungen mit den Programmen MOMO und GAUSSIAN wurden bei der Einstufung der Stabilität der Konformere und Tautomere sowie bei der Abschätzung der Komplexbildungsenergien eingesetzt.
Zunächst wurden Co-Kristalle synthetisiert, deren Komponenten ausschließlich fixierte H-Brücken-bindungsstellen besitzen. Die Co-Kristallisationsversuche des Antimalariamittels Pyrimethamin mit Orotsäure führten zur Bildung einer neuen polymorphen Form, zwei Solvaten sowie dem gewünschten Co-Kristall.
In dem ADA/DAD-Komplex zwischen dem Antibiotikum Nitrofurantoin und 2,6-Diacetamidopyridin werden die Co-Kristallkomponenten durch drei H-Brücken verbunden. In den Kristallstrukturen wird die energetisch ungünstigere sp-Konformation von Nitrofurantoin bevorzugt. In dieser Konfomation besitzt das Molekül eine positive und eine negative Seite; dies ermöglicht eine dichtere Kristallpackung.
Aufgrund der Elektronegativitäten der O- und S-Atome sollte das Watson-Crick-Basenpaar zwischen den Nucleosiden 2-Thiouridin und Adenin, das durch eine N-H•••O-Brücke verbunden ist, stabiler sein als das entsprechende Wobble-Basenpaar mit einer N-H•••S-Brücke. Um die Stabilitäten der beiden H-Brücken zu untersuchen, wurden Co-Kristallisationsversuche mit dem Thyreostatikum 6-Propyl-2-thiouracil durchgeführt. Im Co-Kristall mit 2-Aminopyrimidin wird das R_2^2(8)-Heterodimer durch eine N-H•••N- und eine N-H•••S-Brücke verbunden, während N-H•••O-Brücken die 6-Propyl-2-thiouracilmoleküle zu Ketten verknüpfen. Aufgrund der ungünstigen intramolekularen Donor/Akzeptor-Abstände wird im Co-Kristall mit 2,6-Diacetamidopyridin der gewünschte ADA/DAD-Komplex nicht beobachtet. Stattdessen bildet 6-Propyl-2-thiouracil mit Hilfe zweier N-H•••S-Brücken R_2^2(8)-Homodimere, mit denen 2,6-Diacetamidopyridin nur durch eine N-H•••O-Brücke verbunden ist. Die Mitwirkung der N-H•••S-Brücke bei der „Basenpaarung“ kann dadurch erklärt werden, dass bei der Beteiligung der N-H•••O-Brücken an dem R_2^2(8)-Motiv N-H•••S-Brücken für die Kettenbildung zuständig wären; dieses Strukturmotiv wird jedoch in Kristallstrukturen selten beobachtet. Insgesamt zeigen diese Untersuchungen, dass C-O- und C-S-Gruppen konkurrenzfähige H-Brückenakzeptoren sind.
Anschließend wurden mehrere Co-Kristalle des Antimykotikums 5-Fluorcytosin synthetisiert. Im Co-Kristall mit 2-Aminopyrimidin wird das gewünschte AD/DA-Heterodimer beobachtet. Ein ähnliches R_2^2(8)-Heterodimer könnte zwischen 5-Fluorcytosin und N-Acetylkreatinin gebildet werden, jedoch werden die Komponenten lediglich durch eine H-Brücke miteinander verknüpft. Energieberechnungen machen dies plausibel. Trotz der komplementären AAD/DDA-Bindungsstellen wird im Co-Kristall mit 6-Aminouracil das Heterodimer nur durch zwei H-Brücken verbunden. Die dadurch gewonnene Energie reicht offenbar aus, um den Energieunterschied zum AAD/DDA-Heterodimer zu kompensieren. Die Co-Kristalle des 5-Fluorcytosins mit 6-Aminoisocytosin sowie der Co-Kristall mit dem antiviralen Wirkstoff Aciclovir bestätigen die Stabilität des AAD/DDA-H-Brückenmusters, welches dem Watson-Crick-Basenpaar C-G ähnelt.
Es gelang auch, das Konformations- und das Tautomerengleichgewicht durch eine spezifische Bindung zu beeinflussen. In den Co-Kristallen von 5-Fluorcytosin mit den beiden konformationell flexiblen Molekülen Biuret und 6-Acetamidouracil wird nur diejenige Konformation gefunden, die zur Bildung des gewünschten AAD/DDA-Heterodimers führt. Dabei liegt Biuret in der energetisch günstigeren trans-Form, 6-Acetamidouracil jedoch in der ungünstigeren cis-Form vor. Die drei AAD/DDA-Komplexe von 6-Methylisocytosin zeigen, dass durch die Bildung komplementärer H-Brückeninteraktionen Tautomere getrennt kristallisiert werden können: in den Co-Kristallen mit 5-Fluorcytosin findet man ausschließlich die 3H-Form, während in dem Komplex mit 6-Aminoisocytosin lediglich die 1H-Form vorliegt.
In dieser Studie werden somit neue Einblicke in die Anwendung von Co-Kristallen als Modellsysteme für die Untersuchung von Wirkstoff/Rezeptor-Wechselwirkungen gewonnen. Um Wirkstoff/Rezeptor-Komplexe noch besser nachzuahmen, sollten zukünftig Co-Kristallisationsversuche mit größeren und flexibleren Modellrezeptoren vorgenommen werden. Weiterhin wäre die Berücksichtigung schwacher Wechselwirkungen bei der Synthese von Co-Kristallen von Interesse.
Im Zuge dieser Dissertation wurden verschiedene Methoden zur besseren Identifikation von Proteinen aus unspezifischen Proteinverdauen entwickelt und auf ihre Einsatzmöglichkeiten hin untersucht. In diesem Rahmen wurde vorrangig die Protease Thermitase in ihrer Spezifität und ihrem Temperaturverhalten genauer definiert und ihre proteolytische Verwendbarkeit bewertet.
Aufgrund der durchgeführten Untersuchungen konnte mit Thermitase eine weitere, für die massenspektrometrische Analytik verwendbare Protease, erfolgreich etabliert werden. Als wichtigstes Merkmal dieser Protease muss ihr erfolgreicher proteomischer Einsatz, auch in Kombination mit starken organischen Lösungsmittel und Detergenzien, hervorgehoben werden. Außerdem konnten in Anwesenheit von SDS Verdaue massenspektrometrisch erfolgreich untersucht werden. Die Möglichkeiten dieser Methode sind vor allem für die Membran-Proteomik interessant. Mittels Thermitase können Membranproteine direkt in einem hydrophoben Puffer denaturiert, verdaut und ohne vorheriges Ausfällen analysiert werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden mehrere Ansätze für die Verbesserung der Auswertbarkeit von unspezifischen Proteinverdauen verfolgt und teilweise erfolgreich umgesetzt. Mittels der bioinformatischen Auswertung von theoretischen Verdauen ganzer Datenbanken wurden die Unterschiede bei der Identifikation von spezifischen und unspezifischen Verdauen verdeutlicht. Anhand der beobachteten Vergrößerung des Suchraums um den Faktor 10 bis 100 von unspezifischen gegenüber spezifischen Proteolysen konnte nachgewiesen werden, dass bei Verwendung der heute gebräuchlichen Suchalgorithmen erst eine Steigerung der Massengenauigkeit um mindestens den Faktor 20 zu Ergebnissen führt, die mit denen spezifischer Verdaue vergleichbar sind. Einen Schritt in diese Richtung kann durch die Verwendung der MALDI-Orbitrap (Papasotiriou 2010), die eine durchschnittliche Massengenauigkeit von 5 ppm bietet, vollzogen werden. Jedoch wäre nach einer Abschätzung auf der Basis der gewonnenen Ergebnisse eine routinemäßige Massengenauigkeit von unter 1 ppm nötig, um bei der Identifikation mittels PMF für unspezifische und tryptische Verdaue die gleichen Erfolgsquoten zu erhalten. Wird dies erreicht, bieten unspezifische Proteasen, wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, zahlreiche Vorteile gegenüber spezifischen Proteasen.
Ausgehend von der Verwendung aktueller Suchalgorithmen konnte der Einfluss unterschiedlicher Protein- und Peptidkriterien auf die Proteinidentifikation eindeutig gezeigt werden. Zur Verbesserung der Identifikation bei unspezifischen Verdauen wurden mehrere spezifische Kriterien erarbeitet. Eine PMF-Suche unter deren Einbezug führte zu einer 4fach höheren Identifikationsrate gegenüber einer normalen Suche mittels MOWSE. Mit der iterativen sowie der kombinatorischen Suche wurden zwei einfache bioinformatische Methoden entwickelt, die die Suche von unspezifischen Verdauen erleichtern und in Zukunft verbessern werden.
Die Identifikation von Modifikationen mittels der spezifischen Delta-Massen und die Identifikation von unspezifischen Verdauen durch Bewertung der charakteristisch auftretenden Cluster stellen zwei gänzlich neue Ansätze in der Proteinidentifikation dar. Ihr Einsatz ermöglicht neue Verwendungsmöglichkeiten von unspezifischen Verdauen, die über die klassische Proteinidentifikation hinausgehen, und versucht, spezielle Fragen in der Proteinanalytik zu beantworten. Der Einbezug zusätzlicher Informationen, die der Verdau neben der reinen Gewinnung von Peptidmassen bietet, sollte bei unspezifischen Verdauen fokussiert angegangen werden. Durch die mehrfache Überlappung der Peptide liegen diese Informationen, anders als bei tryptischen Verdauen, redundant vor. Sie können sich also bei entsprechender Auswertung in ihrer Bewertung selbst stützen.
Die in dieser Promotionsarbeit vorgestellten Ansätze zur besseren Identifikation von unspezifischen Proteinverdauen zeigen vielversprechende Möglichkeiten auf.
Realistisch betrachtet, stellt jeder dieser Ansätze eine positive Abweichung von der bislang vorherrschenden routinemäßigen Behandlung der Proteinidentifikation dieser Verdaue dar und bieten die Möglichkeiten qualitativ bessere Untersuchungsergebnisse im Bereich der Massenspektrometrie zu erzielen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle retinaler Perizyten nach einer Infektion mit dem Humanen Zytomegalievirus und deren mögliche Beteiligung an einer HCMV-Retinitis untersucht. Zunächst wurde die Isolation, Kultivierung und Vermehrung von humanen retinalen Perizyten (HRP) etabliert. Eine erfolgreiche Isolation der HRP ist abhängig vom Alter des Spenders, welches unter 50 Jahren liegen sollte, als auch vom Zeitpunkt der Entnahme des Auges. Dabei sollten die Retinae spätestens nach 48 h post mortem aus den Augen präpariert werden. Nach Aufschluss mit einem Dispase/Kollagenase-Gemisch und Separation über ein Zellnetz wurden die isolierten Perizyten auf mit Fibronektin oder ECM (extrazelluläre Matrix) beschichtete Kulturflaschen ausgebracht. Aufgrund der Optimierung des Mediums war es zum ersten Mal möglich, humane retinale Perizyten über 12-15 Passagen zu kultivieren. Somit standen genügend Zellen zur Analyse der Infizierbarkeit mit HCMV und für die Reportergenanalyse zu Verfügung.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Zellen mit HCMV infizierbar sind, jedoch keine lytische Infektion stattfindet und nur wenige Zellen einen zytopathischen Effekt zeigen. Mithilfe von Titerbestimmungen und elektronenmikroskopischen Aufnahmen infizierter Perizyten konnte die Virusreplikation und die Bildung reifer bzw. funktioneller Viruspartikel nachgewiesen werden. Zusätzlich wurde die Expression der viralen IE- und late-Proteine in HCMV-infizierten Perizyten mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und quantitativer RealTime-PCR nachgewiesen. Während einer HCMV-Infektion werden unterschiedliche inflammatorische Prozesse induziert. Dazu gehört z. B. die Aktivierung zellulärer Transkriptionsfaktoren, welche durch ihre Bindung an Promotorregionen die Transkription verschiedener Gene die für Zytokine und Adhäsionsmoleküle kodieren, und andere Transkriptionsfaktoren beeinflussen (Pahl, 1999). Der Transkriptionsfaktor NF-κB wird als Hauptregulator für die HCMV-Replikation beschrieben, in retinalen Perizyten wird NF-κB jedoch nicht aktiviert. Mittels Immunfluoreszenzfärbung und Genexpressionsstudien konnte ein weiterer proinflammatorischer Prozess, die Überexpression von ICAM-1, in infizierten Perizyten nachgewiesen werden. ICAM-1 bewirkt die Infiltration und Anhaftung von Leukozyten an infizierten Zellen. Durch Adhäsionsstudien wurde eine 4,6-fach gesteigerte Anhaftung an HCMV-infizierten Perizyten nachgewiesen, welche durch blockierende Antikörper wieder aufgehoben werden konnte. Durch Expressionanalysen von Chemokin- und Interleukingenen mittels qRT-PCR und ELISA-Analysen konnten erhöhte Sekretionen von CCL2, CCL5, CXCL10 und IL-8 in HCMV-infizierten HRP nachgewiesen werden. Die Resultate einer Infektion mit Vollvirus wurden durch die Transfektion mit Expressionsplasmiden für die viralen Proteine IE1/2 bestätigt. Eine gesteigerte Expression der Zytokine wurde vor allem durch die Überexpression von IE2 und synergistisch durch IE1/2 nachgewiesen. Eine durch IE1 induzierte Expression wurde nur für CCL2 detektiert. Die viralen IE-Proteine sind potentielle Transaktivatoren viraler und zellulärer Promotoren. Ziel war es, den Einfluss auf die Promotoren der Zytokingene (von -3000bp bis 100 bp) durch Koexpression der viralen IE1/IE2-Proteine mittels Luciferase-Reportergenassays in HRP zu untersuchen. Nur der CCL2-Promotor (-1355/+55) zeigte eine erhöhte basale Promotor-aktivität. Um den Einfluss der IE-Proteine auf die Promotoren zu untersuchen, wurden Kotransfektionen mit den Expressionsplasmiden für IE1/2 und den Reportergen-konstrukten der Zytokingene durchgeführt. Dabei zeigten die Analysen mit den Minimalpromotoren (TATA-Box/NF-κB Bindungsstellen) keine erhöhten Luciferaseaktivitäten. NF-κB wurde durch eine HCMV-Infektion nicht aktiviert, somit ist die Transaktivierung der Promotoren von CCL2, CCL5, CXCL10, IL-8 und ICAM-1 in infizierten Perizyten vermutlich NF-κB unabhängig. Die Transaktivierung dieser Promotoren könnte durch AP-1 vermittelt sein, da die höchsten Luciferaseaktivitäten durch die Kotransfektion mit strangabwärts gelegenen Promotorbereichen erhalten wurden, in diesen Bereichen befinden sich potentielle Bindungsstellen für AP-1, SP-1 und anderer Transkriptionsfaktoren. Mittels Western Blot-Analyse wurde eine Induktion der Expression von AP-1 durch HCMV nachgewiesen, somit wird die HCMV-Replikation in HRP vermutlich über AP-1 vermittelt.
In der vorliegenden Arbeit wurden primäre humane Perizyten isoliert und erstmals mit HCMV infiziert. Es konnte gezeigt werden, dass diese Zellen als Modellsystem zur Untersuchung einer HCMV-Retinitis von großer Bedeutung sind. Aufgrund ihres hohen Anteils in der Retina, ihrer schützenden Funktion für die Blut-Retina Schranke sowie ihrer Beteiligung an der HCMV-Retinitis spielen diese bisher nur wenig untersuchten Zellen, offensichtlich eine große Rolle im immunpriviligiertem Auge. Für die Etablierung neuer Therapieansätze für eine HCMV-Retinitis könnten detailliertere Untersuchungen retinaler Perizyten Aufschluss über den Replikationsmechanismus von HCMV und die damit verbundenen inflammatorischen Prozesse während einer HCMV-Retinits bieten.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Regiospezifität und Spaltungsausbeute von 5’-modifizierten Trisbenzimidazolkonjugaten wie 53 unter Verwendung von Helfer-Sequenzen verbessert werden (S.74 ff). Mit dieser Technik gelang es, Turnover zu erzielen und so eine echte katalytische Aktivität der DNA-Konjugate nachzuweisen. Die verwendeten Helfer-DNA-Sequenzen sind günstig zu erwerben oder mit einem DNA-Synthesizer leicht selbst herzustellen und können so der jeweiligen Aufgabe perfekt angepasst werden.
Weiterhin wurden verschiedene Versuche unternommen, ein 5’-modifiziertes Konjugat maßzuschneidern, so dass es durch interne bulge-Bildung mit seinem Substrat ebenfalls Turnover erreichen könnte und so katalytische Aktivität zeigte (S.59 ff). Diese Projekte wurden in Anlehnung an Arbeiten von Häner [91] durchgeführt, der damit Turnover erzielte, da das Konjugat nach Spaltung des bulges wieder in den katalytischen Zyklus eingegliedert werden konnte. Leider waren diese Versuche nicht von Erfolg gekrönt, obwohl man sich bei der Konzipierung der Substrat-Konjugat-Hybriden an die Sequenzen von Häner et.al. hielt. Statt dessen beobachtete man im Falle von Konjugat 51 bei der Hybridisierung die Ausbildung einer Helix; ein bulge konnte nicht erhalten werden (S. 61). Dieser Unterschied könnte auf die große, planare Spaltereinheit mit Europium(III) von Häner et. al. zurück zu führen sein, die im Falle der von uns untersuchten Konjugat-Substrat-Hybride fehlte, denn die 2-Aminobenzimidazol-Einheiten von Trisbenzimidazol 15 waren im Vergleich als klein anzusehen.
Diese Vermutung führte schließlich zu zwei unterschiedlichen Ansätzen. Einer davon war es, eine größere intercalationsfähige Teilstruktur in das Konjugat einzuführen. Man versuchte deshalb ein Konjugat zu synthetisieren, welches zwischen der katalytischen Einheit und dem sequenzerkennenden Teil die Pyrenaminosäure 56 von Dr. M. Suhartono trug (S. 69 ff).
Dieses sollte den großen, Häner’schen Rest imitieren und so einen bulge erzeugen. Leider gelang die Synthese dieses Konjugates nicht. Wie sich heraus stellte, war das kommerziell erworbene DNA-Material nicht geeignet für die angewendete Synthese. Eine Basen-Schutzgruppe bzw. das Anhydrid derselben, welches bei der Festphasensynthese als Capping-Reagenz verwendet wurde, führte zu einer irreversiblen Reaktion mit der 5'-NH2-Funktion an der DNA und machten das Material daher für eine Kupplung unbrauchbar.
Eine andere Herangehensweise war es, die Faltung des Konjugat-Substrat-Hybrides voraus zu berechnen und so ein Hybrid zu erhalten, welches einen bulge ausbildete (S. 65 ff). Konjugat 55 und Substrat 54 wurden nach dieser Strukturvorhersage synthetisiert bzw. erworben und entsprachen genau den Erwartungen, ein interner bulge wurde ausgebildet. Dennoch konnte man auch mit diesem System keinen Turnover erreichen.
Ein weiteres großes Teilgebiet dieser Arbeit war die Untersuchung kleiner Moleküle als unspezifische RNA-Spalter. Im Rahmen dieser Arbeit wurden speziell Guanidiniumanaloga auf ihre RNA-Spaltungsfähigkeit untersucht. In der Vergangenheit hatte man als Gütekriterium dieser Verbindungen das Augenmerk auf ihre pKa-Werte gerichtet. Sofern sich diese annähernd im physiologischen Bereich befanden, konnten häufig gute bis sehr gute RNA-Spaltungsausbeuten erzielt werden.
Erstmals kam das Konzept der Energiedifferenz zwischen den tautomeren Formen eines guanidiniumtragenden Moleküls als Werkzeug zur Vorhersage der Güte eines RNA-Spalters zum Einsatz (S.113 ff). Sofern die beiden Strukturen (Amino- und Iminotautomer) sehr geringe Energieunterschiede aufwiesen, sollten sie sich besser als „Protonen-Shuttle“ eignen und so die Phosphosäuretransesterifikation katalytisch besser unterstützen. Zusammen mit dem pKa-Wert der Verbindungen wurde untersucht, ob dieses Konzept als Vorhersagemethode tragfähig ist.
Unter den mit diesen Methoden gefundenen sowie kommerziell erhältlichen Molekülen konnte 2-Aminoperimidin 67 als sehr guter Spalter identifiziert werden. Verglichen mit Trisbenzimidazol 15 erreichte es ebenso gute Spaltungsraten wie letzteres, wobei 67 nur über eine einzige Guanidiniumeinheit verfügt. Dieser so identifizierte neue Kandidat für den Einbau in DNA-Konjugate enttäuschte auch nach Untersuchungen seines N-Methyl-Aminoderivates 80 nicht: Das Derivat zeigte eine ausreichend hohe Spaltungsaktivität, um es in Zukunft als Baustein für antisense-Konjugate in Frage kommen zu lassen.
Es gab allerdings auch Schwierigkeiten bei der Untersuchung der kleinen Moleküle. Problematisch gestaltete sich ihre Löslichkeit in hohen Konzentrationen. Man ging deshalb dazu über, Co-Solventien wie Methanol oder DMSO zu verwenden, um auch während des Experimentes eine ausreichende Löslichkeit der Verbindungen zu gewährleisten. Ein Volumenanteil von 20% Co-Solvens stellte sich als ideal heraus, das Experiment wurde dadurch nicht negativ beeinflusst.
Außerdem kam es zu Präzipitation einiger Substanzen (u.a. 2-Aminoperimidin 67) beim Auftragen auf das Sequenzierergel, welche die Auswertbarkeit dieser Experimente einschränkte. Die Verwendung eines neuen Harnstoffladepuffers beim Auftragen der Proben auf das Gel und das Senken der Substanzkonzentration (von mM auf μM) im Experiment verbesserten diese Situation deutlich. Häufig beobachtete Präzipitationseffekte waren danach größtenteils verschwunden, was die Auswertung der Spaltungsexperimente mit kleinen Molekülen erleichterte (S. 129 ff). Einige Verbindungen konnten mit der Kombination von ΔHf-Wertbestimmung und pKa-Wert-Bestimmung als schlechte RNA-Spalter korrekt vorhergesagt werden (z.B. 2-Aminopyridin 69, 2- Aminopyrimidin 68).
Nicht ganz klar ist das mittelmäßige Abschneiden von Imidazoimidazol 71 als RNA-Spalter (S.136 ff). Durch seine Symmetrie liegt sein ΔHf-Wert bei 0 und auch sein pKa-Wert liegt mit 7.4 perfekt im physiologischen Bereich. Dennoch konnte es nur Spaltungsausbeuten von unter 10% bei Konzentrationen im höheren mM-Bereich erreichen. Es ist aber auch die einzige untersuchte Verbindung, die signifikant RNA schneidet, ohne diese gleichzeitig zu aggregieren oder zu denaturieren.
Untersuchungen des Aggregationsverhaltens der kleinen Moleküle mittels FCS-Messungen (S. 139 ff) zeigten, dass fast alle bei hohen Konzentrationen – etwa im mM- oder hohem μMBereich – Aggregate bilden, und das auch bei Verwendung von Co-Solventien, wie es im Rahmen dieser Arbeit etabliert wurde. Man kann also bei den kleinen Katalysatoren nicht davon ausgehen, dass isolierte Moleküle für die beobachteten Effekte verantwortlich sind. Vielmehr agieren diese Moleküle bei solchen Konzentrationen als große oder kleine Aggregate, die durch die Vielzahl ihrer katalytischen Einheiten an der Oberfläche ihr Potential vervielfachen. Erst bei niedrigen Konzentrationen lösen sich die Aggregate auf, man kann hier wieder von einem Ein-Molekül-ein-Substrat-Mechanismus ausgehen (s. Schema 3 S. 110).
Dies wird allerdings nicht als Ausschlusskriterium gesehen, diese Moleküle auch weiterhin als potentielle Kandidaten für antisense-Konjugatbausteine zu betrachten. In Konjugaten verhalten sie sich wie Einzelmoleküle, bei denen man streng mechanistische Betrachtungen anstellen kann und darf.
In dieser Arbeit geht es um Kristallstrukturbestimmung und -modellierung ausgewählter organischer Pigmente sowie metallorganischer Polymere. Der feste – und insbesondere kristalline – Zustand der Materie ist von (im wahrsten Sinne des Wortes) tragender und weitreichender Bedeutung für die moderne Wissenschaft, Technologie, den Alltag überhaupt.
Die Kenntnis über den inneren (mikroskopischen)Aufbau des Festkörpers ermöglicht es zunächst, seine (makroskopischen) Eigenschaften zu verstehen. Genannt seien z. B. nicht-lineare optische Eigenschaften, die in der typischen anisotropen Struktur des kristallinen Festkörpers begründet liegen, mechanische Stabilität von Werkstoffen wie Metallen oder Legierungen, aber auch die Eigenschaften von Pigmenten: Was macht eine Substanz zu einem Pigment? Wann ist ein Pigment ein gutes, wann ein weniger gutes Pigment? Die Antworten auf diese Fragen finden sich u. a. in der Kristallstruktur: Packungsdichte, (Schwer-)löslichkeit, etc.
Die Eigenschaften von Substanzen mit sichtbaren Low-Spin–High-Spin-Übergängen lassen sich auch nur verstehen, wenn der innere Aufbau, die Kristallstruktur, bekannt ist. Was geht im Inneren vor, wenn solche Substanzen einem äußeren Einfluss wie beispielsweise Temperaturänderung ausgesetzt werden? Ist es nicht so, dass z. B. ein High-Spin-Fe2+-Ion einen größeren effektiven Radius als ein Low-Spin-Fe2+-Ion hat? Dehnt sich die Kristallstruktur aus, „atmet“ sie?
Die Kenntnis der Kristallstruktur ermöglicht es nicht nur, die Eigenschaften zu verstehen. Umgekehrt ist es auch möglich, diese Eigenschaften gezielt zu manipulieren: Verbesserung der Pigmenteigenschaften durch Herabsetzen der Löslichkeit, Veränderung der elektronischen und magnetischen Kopplungen in niedrig-dimensionalen Polymerketten, um nur zwei zu nennen.
Zum Leidwesen des Chemikers, des Physikers und des Kristallographen besteht in den Eigenschaften, die z. B. Pigmente als „gut“ auszeichnen, das größte Problem: die mangelnde Löslichkeit der Verbindung. Es ist genau diese Eigenschaft, die dafür sorgt, meist keine Einkristalle züchten zu können, massive Schwierigkeiten beim Umkristallisieren zu haben und letztendlich – wenn keine Einkristalle vorliegen – bei der Strukturbestimmung aus Pulverdaten breite, überlappende Reflexe separieren zu müssen.
Dennoch gibt es nützliche und bewährte Methoden, auch aus (sogar nur mäßigen) Pulverdaten eine Kristallstruktur zu lösen. Genannt seien hier quantenchemische Rechnungen, die unter Umständen sehr rechen- und zeitintensiv sein können, oder Kraftfeld-Methoden, die zwar nicht sehr exakte, aber immerhin doch brauchbare Ergebnisse mit vertretbarem Zeit- und Rechenaufwand liefern. Diese Methoden sind insbesondere dann zur Vorhersage von Kristallstrukturen geeignet, wenn das Pulverdiagramm nicht indizierbar ist.
Wenn die Struktur erst gelöst ist, ist die bewährte Methode der Strukturverfeinerung die Rietveld-Methode. Obwohl oder gerade weil die Methode mittlerweile zu einer „Black- Box“-Methode geworden ist, ist die genaue Analyse und Interpretation der Ergebnisse unabdingbar.
Es gibt genügend Beispiele, in denen vermeintlich gute Ergebnisse (struktur-)chemisch sinnlos sind.
Themenstellung
Pigmente spielen in der Industrie eine wesentliche Rolle. Im Gegensatz zu Farbstoffen sind Pigmente im Anwendungsmedium unlöslich, sie werden feinkristallin dispergiert, um z. B. in Autolacken oder Kunststoffen eingesetzt zu werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Kristallstrukturen von 13 Pigmenten bestimmt.
Zu den genannten Kristallstrukturbestimmungen kommt ein Kapitel mit einer grundsätzlichen Fragestellung: Wo sind die Grenzen der Strukturbestimmung aus Pulverdaten? Wann ist eine Kristallstruktur „richtig“ oder „falsch“?
Ein letztes Pigment verknüpft die beiden vorangehenden Punkte.
Das letzte Kapitel behandelt die Erstellung von 5 Modellstrukturen aus zwei Substanzklassen für niedrig-dimensionale metall-organische Festkörper.
Beide Substanzklassen wurden im Rahmen der Forschergruppe 412 („Spin- und Ladungsträgerkorrelationen in niedrigdimensionalenmetallorganischen Festkörpern“)der DFG hinsichtlich elektronischer und magnetischer Eigenschaften untersucht.
Übergeordnetes Ziel der Arbeit war die Synthese von Molekülen, die zur gezielten Funktionalisierung von Oberflächen dienen sollten. Dazu mussten jeweils Synthesewege inklusive geeigneter Schutzgruppenchemie sowie Reinigungsstrategien entwickelt werden. Im Rahmen dieser Zielsetzung wurde zunächst eine Anlage zur Gradientensublimation aufgebaut, mit der sich die Substanzen in sehr hoher Reinheit erhalten ließen.
During the last years, chemopreventive activity of NSAIDs against a great variety of tumors was highly investigated. COX-2 seemingly plays a major part in tumorigensis and tumor development, underlined by several studies in animals and humans. At first, NSAIDs were thought to accomplish chemoprevention by inhibition of COX-2 as their so far known mode of action comprises unselective inhbition of COX-enzymes. However, further studies revealed COX-independent mechanisms. Sulindac is known as a well established drug used to treat inflammation and pain exerting the most prominent chemopreventive action, mainly in colorectal cancer or FAP and can be classified into the group of NSAIDs inhibting both COX-isoformes. As interference with the AA metabolism is evident, it was speculated whether Ssi has targets other than COX-enzymes providing evidence and explanation of its beneficial side effect profile and its ability to reduce tumor growth. 5-LO is another master enzyme in the AA cascade which produces inflammatory lipid mediators (LTs) upon stimulation in inflamed tissues. The present work should answer the question if Ssi targets the 5-LO pathway and should examine the molecular mechanisms behind Ssi-mediated 5-LO inhibiton. As COX-2 is upregulated during carcinogenesis and is inhibited by Ssi, further investigations should show regulatory effects of Ssi on 5-LO gene expression in MM6-cells and whether Sp1 as a common transcriptional factor is involved in such a regulation. As the use of NO-NSAIDs seem to be a promising strategy concerning their chemopreventive and gastroprotective effects compared to the parent NSAIDs, a possible interaction with the 5-LO pathway as a second, potent target should additionally be elucidated. In the first section it was demonstrated that the pharmacologically active metabolite of sulindac, Ssi, targets 5-LO. Ssi inhibited 5-LO in ionophore A23187- and LPS/fMLP-stimulated human PMNL (IC50 ≈ 8 -10 μM). Importantly, Ssi efficiently suppressed 5-LO in human whole blood at clinically relevant plasma levels (IC50 = 18.7 μM). Ssi was 5-LO-selective as no inhibition of related lipoxygenases (12-LO, 15-LO) was observed. The sulindac prodrug and the other metabolite, sulindac sulfone, failed to inhibit 5-LO. Mechanistic analysis demonstrated that Ssi directly suppresses 5-LO with an IC50 of 20 μM. Together, these findings may provide a novel molecular basis to explain the COX-independent pharmacological effects of sulindac under therapy. In the second part of the work dealing with the analysis of Ssi’s inhibitory mechanism on 5-LO it was presented that Ssi shows a lack of potency in cellular systems where membrane constituents are existent. The addition of microsomal fractions of PMNLto crude 5-LO enzyme were able to recover enzyme activity to ~ 100 %. Selectively 5-LO activity stimulating lipids like PC, participating in 5-LO membrane interactions within the regulatory C2-like domain of 5-LO, counteracted the Ssimediated inhibition on 5-LO-wt in a concentration-dependent manner. Lastly, a protein mutant lacking three trp resudies essential for linking the enzyme to nuclear membranes and deploying catalytic activity was not influenced by Ssi and shows enzyme activity in a cell-free assay. Ssi displays the first 5-LO inhibitor on the market interacting with the C2-like domain of the enzyme and therfore can stand for a novel lead structure of 5-LO inhibitors. An influence on 5-LO gene expression by Ssi could be detected in differentiated MM6-cells, described in the results chapter 3 (4.3). Ssi downregulated the 5-LO mRNA level after 72 hrs of incubation in differentiated MM6-cells to ~ 20 % of output control at concentrations of 10 μM. Concomitantly, mRNA levels of Sp1 were suppressed. Reporter gene studies revealed Sp1 most probably as a regulating agent involved in the Ssi-mediated 5-LO mRNA downregulation as co-transfection of increasing amounts of Sp1 could abrogate the effect. A ChIP assay could identify Sp1 as a critical transcriptional factor as Sp1 binding to the 5-LO promoter decreased in presence of Ssi. Lastly, three NO-NSADIs (NO-sulindac, NOnaproxen, NO-aspirin) were tested for the ability of 5-LO product inhibition. In intact PMNL, all compounds showed effective inhibition of 5-LO activity and NO-sulindac was most potent with an IC50 value of ~ 3 μM. NO-ASA inhibited 5-LO with IC50 values of ~ 30 μM and showed a non-competitive mode of action in cell-based assays. On human recombinant 5-LO all compounds again showed inhibitory potency whereas NO-sulindac again suppressed LT biosynthesis with an IC50 vaue comparable to intact cellular systems. Unfortunately, all inhibitors showed a loss of potency when tested for inhibition of 5-LO product synthesis in human whole blood as higher concentrations up to 100 μM were needed to reach at least 55 % enzyme inhibition. However, this strategy of 5-LO inhibition seems promising and needs further experimental approaches to gain more insight into the mechanism of 5-LO inhibition by NONSAIDs.
5-lipoxygenase (5-LO) catalyzes the first two steps in leukotriene (LT) biosynthesis. In a two step reaction the enzyme oxygenates arachidonic acid (AA) to form the highly unstable epoxide leukotriene A4 (LTA4) in dehydrating a hydroperoxide intermediate (20). LTA4 can then be further metabolized by two terminal synthases yielding either the potent chemoattractant leukotriene B4 (LTB4) or the cysteinyl leukotrienes (CysLTs). 5-LO enzyme expression is primarily found in mature leukocytes (22) where it can either reside in the cytoplasm or in the nucleus associated with euchromatin (29). Its enzymatic activity is embedded in a complicated network in intact cells regulating LT synthesis by various factors dependent on the cell type and nature of stimulus. Factors such as the amount of free AA released by phospholipase A2 enzymes, levels of enzymes involved, catalytic activity per enzyme molecule and availability of different small molecules influence 5-LO activity (36).
The 5-LO derived LTs are lipid mediators which were shown to primarily mediate inflammatory and allergic reactions and their role in the pathogenesis of asthma is well defined. CysLTs are among the most potent bronchoconstrictors yet studied in man and play an important role in airway remodeling. LTB4 has no bronchoconstrictory effects in healthy and asthmatic humans but displays potent chemoattractant properties on neutrophils and increases leukocyte adhesion to the vessel wall endothelium (22). Therefore, LTB4 enhances the capacity of macrophages and neutrophils to ingest and kill microbes. In concert with LTB4, histamine and prostaglandin E2 (PGE2) CysLTs are thought to maintain the tone of the human airways (82).
Besides their well studied role in asthma, 5-LO derived LTs have also been implicated to play a role in cardiovascular diseases and cancer. In contrast to healthy tissues, LT pathway enzymes and receptors were found to be abundantly expressed in cancer tissues, atherosclerotic lesions in the aorta, heart and carotid artery (86). Pharmacological inhibition of 5-LO potently suppressed tumour cell growth by inducing cell cycle arrest and triggering cell death via the intrinsic apoptotic pathway (92, 93). In several studies LTs were found to exhibit cardiovascular actions by promotion of plasma leakage in postcapillary venules, coronary artery vasoconstriction and impaired ventricular contraction leading to reduced coronary blood flow and cardiac output (24). Unfortunately, the precise molecular mechanisms through which LTs influence carcinogenesis and cardiovascular diseases are still incompletely understood.
In contrast, an increasing number of studies questions the correlation between 5-LO and cancer (95-97) since extreme LT concentrations were applied to induce proliferative effects in the majority of the publications. A few studies exist which show susceptibility towards 5-LO products in physiological concentrations or achieve anti-proliferation by applying low concentrations of 5-LO inhibitors (98) ...
Die 5-Lipoxygenase ist das Schlüsselenzym der Bildung proentzündlicher Leukotriene. Diese Mediatoren sind assoziiert mit Erkrankungen des entzündlichen Formenkreises wie beispielsweise Arteriosklerose [6]. Durch die Veröffentlichungen von Qiu et. al. [248] und Gredmark-Russ et. al. [650] konnte gezeigt werden, dass die Infektion mit humanen Cytomegalovirus in vitro und in vivo zur Induktion der 5-LO in HPASMCs und SMCs (smooth muscle cells) führt. HCMV ist ein ß-Herpesvirus, welches nach einer zumeist asymptomatischen Primärinfektion, dauerhaft im Wirt persisiert und bei Schwächung des Immunsystems oder entzündliche Prozessen reaktiviert werden kann [256]. Geht das Virus in die lytische Replikationsphase über, werden Entzündungsprozesse gefördert, die zur Ausprägung von Krankheitsbildern wie Retinitis, rheumatoider Arthritis oder auch Psoriasis führen. Es besteht demnach ein Zusammenhang zwischen der aktiven HCMV-Infektion und Erkrankungen des entzündlichen Formenkreises, welche unter anderem durch die Induktion der 5-LO vermittelt wurden.
Ziel der Arbeit war es, den molekularen Mechanismus der viral induzierten 5-LO-Promotoraktivierung aufzuklären. Dazu wurde zunächst überprüft, ob die Infektion mit HCMV in HFF, einer Zelllinie die äußerst permissiv für die Infektion ist und daher zumeist als Testsystem für HCMV herangezogen wird, eine verstärkte 5-LO-Expression hervorruft, oder ob es sich um einen zelltypspezifischen Effekt der smooth muscle cells handelt. Es konnte gezeigt werden, dass es nach Infektion zu einer verstärkten Promotoraktivierung, mRNS- sowie Proteinexpression der 5-LO kam (Abb. 19, 23, 24). Weitere Untersuchungen charakterisierten, welches virale Protein die Effektvermittlung bedingte. Aufgrund der sequentiellen Genexpression des Virus unterscheidet man nach Zeitpunkt der Expression in Immediate Early, Early und Late Proteine, wobei letztere erst nach Replikation des viralen Genoms exprimiert werden. Der Zusatz von Foscavir als Replikationsinhibitor verdeutlichte, dass ein Immediate Early oder Early Protein die Induktion hervorruft (Abb. 16). Reportergenassay-Experimente unter Überexpression einzelner viraler Proteine zeigten, dass Immediate Early 1 essentiell an der Erhöhung der 5-LO-Promotoraktivität beteiligt ist (Abb. 18). Weitergehende Versuche unter Verwendung des IE1-Deletionsvirus CR208 bestätigten, dass die Induktion der 5-LO-Promotoraktivität sowie der mRNS-Expression durch dieses virale Protein vermittelt wird (Abb. 18, 20-22). Auf Proteinebene konnte ebenfalls nach IE1-Überexpression beziehungsweise nach Infektion mit HCMV eine erhöhte 5-LO-Expression detektiert werden (Abb. 23 und 24). Aktivitätsuntersuchungen, bei denen die Konzentration der 5-LO-Produkte LTB4 und 5-HETE gemessen wurden, bestätigten, dass das Enzym funktionsfähig ist (Abb. 25). Nach Infektion mit HCMV kommt es demnach zur IE1-vermittelten Induktion der 5-LO auf mRNS- und Proteinebene sowie nachgeordnet zur verstärkten Produktion von inflammatorischen Leukotrienen, die an der Ausbildung der entzündlichen Symptomatik einer lytischen Infektion beteiligt sind.
Immediate Early 1 ist ein potenter Transaktivator, der sowohl virale als auch zelluläre Promotorstrukturen aktivieren kann [387]. Funktionell wird dies reguliert über die Förderung der Transkriptionsfaktor-Expression, aber auch durch Beeinflussung histonmodifizierender Enzyme wie Histondeacetylasen [464]. Für den 5-LO-Promotor ist bekannt, dass dessen Aktivität über Bindung von Sp1, sowie durch HDAC-Inhibition beeinflusst werden kann [9, 171]. Diese beiden Regulationsmechanismen stellen demnach mögliche Verknüpfungspunkte in der viral induzierten Induktion des 5-LO-Promotors dar. Zunächst wurde die Expression von Transkriptionsfaktoren, welche charakterisierte Bindungsstellen im 5-LO-Promotor besitzen, nach IE1-Überexpression untersucht. Es zeigte sich, dass der zelluläre Sp1-mRNS-Spiegel durch IE1 80fach induziert werden kann (Abb. 27). Im Reportergenassay mit 5-LO-Promotordeletionskonstrukten, bei denen gezielt einzelne Sp1-Bindungsstellen, sogenannte GC-Boxen, mutiert wurden, konnte bestätigt werden, dass die IE1-vermittelte Induktion essentiell von Sp1-abhängt, da die Mutation der GC4-Box die Aktivierung nahezu komplett inhibiert (Abb. 30, 31). Auch der Zusatz von Mithramycin, einem DNS-Interkalator, welcher die Bindung von Sp1 an die DNS unterdrückt, ist in der Lage die Induktion abzuschwächen (Abb. 33) [651]. Um die direkte Sp1-Bindung an den 5-LO-Promotor nachzuweisen wurden sowohl EMSA- als auch ChIP-Experimente durchgeführt. Es zeigte sich, dass in vitro und in vivo die Sp1-Bindung an den proximalen 5-LO-Promotor nach IE1-Überexpression beziehungsweise nach Infektion zunimmt (Abb. 49, 50). Interessanterweise wird dieser Effekt nicht durch Immediate Early 2, einer Spleißvariante von IE1, welche eine große strukturelle Ähnlichkeit aufweist, hervorgerufen. Da Veröffentlichungen gezeigt haben, dass beide Immediate Early Proteine in der Lage sind, Sp1 auf mRNS-Level zu induzieren, muss ein weiterer regulatorischer Mechanismus in die Sp1-Promotorbindung involviert sein [410]. In Co-Immunopräzipitations Versuchen zeigten beide IEPs eine Interaktion mit Sp1 (Abb. 38), wonach der Unterschied in der transaktivierenden Fähigkeit des 5-LO-Promotors nicht durch Protein-Protein-Bindung mit Sp1 bedingt wird. Strukturell unterscheiden sich die beiden Proteine in ihrer carboxyterminalen Sequenz. Für IE1 ist hier eine intrinsische Kinaseaktivität beschrieben, die zur Autophosphorylierung, aber auch zur Phosphorylierung von Bindungsproteinen führen kann. Western Blot Analysen auf den zellulären phospho-Sp1-Gehalt nach viraler Überexpression konnten zeigen, dass IE1, nicht aber IE2 die posttranslationale Modifikation des Transkriptionsfaktors fördert (Abb. 39). Auch die Testung viraler Deletionsmutanten, denen einzelne Exons beziehungsweise die ATP-Bindungsstelle der Kinasedomäne fehlen, bestätigten die Schlüsselfunktion dieses Strukturelements (Abb. 37). Ob es sich um eine direkte oder indirekte Phosphorylierung von Sp1 durch IE1 handelt wurde durch in vitro Kinase-Assays und die Testung unterschiedlicher Proteinkinase-Inhibitoren bestimmt (Abb. 40, 42, 45). Obwohl die beiden Proteine miteinander interagieren können, kam es nicht zu einer direkten Phosphorylierung, sondern zelluläre Kinasen wie Tyrosinkinasen und nachgeordnet die Mitglieder des MAPK-Signalweges sind in die Phosphorylierung von Sp1 involviert. Die finale Bestätigung der essentiellen Funktion von Sp1 in der IE1-vermittelten Aktivierung des 5-LO-Promotors lieferte ein Reportergenassay-Experiment mit Sp1-Knock-down Zellen, welche nach viraler Überexpression keine 5-LO-Promotoraktivität und mRNS-Expression mehr zeigten (Abb. 47, 48). Für die Vermittlung der IE1-induzierten 5-LO-Promotoraktivierung sind dessen transaktivatorische Fähigkeiten demnach essentiell, durch Erhöhung der Sp1-mRNS-Expression und nachfolgender Phosphorylierung wird die DNS-Bindung des Transkriptionsfaktors an die GC4-Box des 5-LO-Promotors erhöht und dieser damit transkriptionell aktiviert.
Neben der Regulation über verstärkte phospho-Sp1-Bindung an die GC4-Box Region muss die Induktion von 5-LO durch IE1 noch über weitere Interaktionen vermittelt werden, da die reine Sp1-Überexpression ohne IE1 keine Promotoraktivierung hervorrufen konnte (Abb. 34). Überprüft wurde daher die HDAC-inhibitorische Fähigkeit von IE1, da der 5-LO-Promotor über diese epigenetischen Mechanismen reguliert werden kann. Pull-down-Experimente zeigten zunächst eine Protein-Protein-Interaktion zwischen IE1 und HDAC1/2/3 (Abb. 51). Nachfolgend konnte in einem HDAC-Aktivitätsassay gezeigt werden, dass diese Interaktion die Enzymaktivität der HDACs drastisch reduziert (Abb. 52). Durch HDAC-Inhibition liegen Promotorstrukturen zunehmend acetyliert vor und sind damit transkriptionell aktiv. Für den funktionellen Nachweis auf den 5-LO-Promotor diente ein Reportergenassay-Experiment in dem IE1 und in steigenden Mengen HDAC überexprimiert wurde (Abb. 53). Die Überexpression von HDAC1 und HDAC3 konnten den aktivierenden Einfluss von IE1 auf den 5-LO-Promotor teilweise konzentrationsabhängig revertieren und scheinen damit an der Effektvermittlung beteiligt zu sein. Die Charakterisierung der HDAC-vermittelten 5-LO-Promotorregulation von Pufahl et. al. bestätigte durch Knock-down Experimente, dass HDAC3 entscheidenden Einfluss auf den 5-LO-Promotor hat [172]. HDAC1 dagegen reguliert über die verstärkte Deacetylierung von Sp1 dessen DNS-Bindungsaffinität. Eine Hemmung dieser beiden Histondeacetylasen durch das virale Protein erhöht damit die Aktivität des 5-LO-Promotors.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Ziel der Arbeit erreicht wurde und ein detaillierter Mechanismus der 5-LO-Promotoraktivierung durch HCMV aufgeklärt wurde. Immediate Early 1 induziert dabei zunächst die Expression und Phosphorylierung von Sp1. Ebenso interagiert das virale Protein mit HDAC1/2/3 und hemmt deren Aktivität, wodurch es zur Öffnung der 5-LO-Promotorstruktur kommt. Entscheiden ist hierbei vor allem die Hemmung von HDAC3. HDAC1 Inhibition sorgt im getesteten Zellsystem zusätzlich für verstärkte Acetylierung des Transkripti-onsfaktors Sp1, welcher aufgrund der dadurch erhöhten DNS-Bindungsaffinität an die GC4-Box-Region binden und so die Transkription fördern kann. Interessanterweise ist die Bindung an andere beschriebene GC-Boxen des 5-LO-Promotors nicht induktiv, was die Annahme nahelegt, dass nicht Sp1 alleine, sondern ein transaktivatorischer Komplex an diese Region bindet. Die Aktivierung des Promotors führt nachfolgend zur mRNS- und Proteinexpression, welche eine verstärkte Leukotrienbildung zur Folge hat. Diese Mediatoren sind in die Entstehung der entzündlichen Charakteristik einer aktiven HCMV involviert. Das Virus macht sich demnach generelle Prinzipien der Transaktivierung zu Nutze und fördert so zum einen seine Reaktivierung aus der Latenz, zum anderen die produktive Verbreitung der Infektion.
According to the World Health Organization (WHO) bacterial resistance to antibiotic drug therapy is emerging as a major public health problem around the world. Infectious diseases seriously threaten the health and economy of all countries. Hence, the preservation of the effectiveness of antibiotics is a world wide priority. The key to preserving the power of antibiotics lies in maintaining their diversity. Many microorganisms are capable of producing these bioactive products, the so called antibiotics. Specifically in microorganisms, polyketide synthases (PKS) and non-ribosomal peptide synthases (NRPS) produce these natural bioactive compounds. Besides being used as antibiotics these non-ribosomal peptides and polyketides display an even broader spectrum of biological activities, e.g. as antivirals, immunosuppressants or in antitumor therapy. The wide functional spectrum of the peptides and ketides is due to their structural diversity. Mostly they are cyclic or branched cyclic compounds, containing non-proteinogenic amino acids, small heterocyclic rings and other unusual modifications such as epimerization, methylation, N‐formylation or heterocyclization. It is has been shown that these modifications are important for biological activity, but little is known about their biosynthetic origin.
PKS and NRPS are multidomain protein assembly lines which function by sequentially elongating a growing polyketide or peptide chain by incorporating acyl units or amino acids, respectively. The growing product is attached via a thioester linkage to the 4’-phosphopantetheine (4’-Ppant) arm of a holo acyl carrier protein (ACP) in PKSs or holo peptidyl carrier protein (PCP) in NRPSs and is passed from one module to another along the chain of reaction centers. The modular arrangement makes PKS and NRPS systems an interesting target for protein engineering. More than 200 novel polyketide compounds have already been created by module swapping, gene deletion or other specific manipulations. Unfortunately, however, engineered PKS often fail to produce significant amounts of the desired products. Structural studies may faciliate yield improvement from engineered systems by providing a more complete understanding of the interface between the different domains. While some information about domain-domain interactions, involving the most common enzymatic modules, ketosynthase and acyltransferase, is starting to emerge, little is known about the interaction of ACP domains with other modifying enzymes such as methyltransferases, epimerases or halogenases.
To further improve the understanding of domain-domain interactions this work focuses on the curacin A assembly line. Curacin A, which exhibits anti-mitotic activity, is from the marine cyanobacterium Lyngbya majuscula. This outstanding natural product contains a cyclopropane ring, a thiazoline ring, an internal cis double bond and a terminal alkene. The biosynthesis of curacin A is performed by a 2.2 Mega Dalton (MDa) hybrid PKS-NRPS cluster. A 10-enzyme assembly catalyzes the formation of the cyclopropane moiety as the first building block of the final product. Interestingly, for these enzymes the substrate is presented by an unusual cluster of three consecutive ACPs (ACPI,II,III). Little is known about the function of multiple ACPs which are supposed to increase the overall flux for enhanced production of secondary metabolites.
The first task in this work was to elucidate the structural effect of the triplet ACP repetition by nuclear magnetic resonance (NMR). The initial data show that the excised ACPI, ACPII or ACPIII proteins resulted in [15N, 1H]-TROSY spectra with strong chemical shift perturbations (CSPs), suggesting an effect on the structure. The triplet ACP domains display a high sequence identity (93- 100%) making structural investigation using usual NMR techniques due to high peak overlap impossible. To enable the investigation of the triplet ACP in its native composition we developed a powerful method, the three fragment ligation. Segmental labeling allows incorporating isotopes into one single domain in its multidomain context. As a result we could prepare the triplet ACP with only one domain isotopically labeled and therefore assign the full length protein. In this way our method paved the way to study the structural effects of the triplet ACP repetition. We could show unexpectedly, that, despite the fact that the triplet repeat of CurA ACPI,II,III has a synergistic effect in the biosynthesis of CurA, the domains are structurally independent.
In the second part of this work, we studied the structure of the isolated ACPI domain. Our results show that the CurA ACPI undergoes no major conformational changes upon activation via phosphopantetheinylation and therefore contradicts the conformational switching model which has been proposed for PCPs. Further we report the NMR solution structures of holo-ACPI and 3-hydroxyl-3-methylglutaryl (HMG)-ACPI. Data obtained from filtered nuclear overhauser effect (NOE) experiments indicate that the substrate HMG is not sequestered but presented on the ACP surface.
In the third part of this work we focussed on the protein-protein interactions of the isolated ACPI with its cognate interaction partners. We were especially interested in the interaction with the halogenase (Cur Hal), the first enzyme within the curacin A sub-cluster, acting on the initial hydroxyl-methyl-glutaryl (HMG) attached to ACPI. Primarily we studied the interaction using NMR titration and fluorescence anisotropy measurements. Surprisingly no complex between ACPI and Cur Hal could be detected. The combination of an activity assay using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectroscopy and mutational analysis revealed several amino acids of ACPI that strongly decrease the activity of CurA Hal. Mapping these mutations according to their effect on the Cur Hal activity onto the structure of HMG-ACPI displays that these amino acids surround the substrate and form a consecutive surface. These results suggest that this surface is important for Cur Hal recognition and selectivity. Our research presented herein is an excellent example for protein-protein interactions in PKS systems underlying a specific recognition process.
Membrane proteins (MPs) constitute about 30% of the genome and are essential in many cellular processes. In particular structural characterisation of MPs is challenged by their hydrophobic nature resulting in expression difficulties and structural instability upon extraction from the membrane. Despite these challenges, progress in sample preparation and the techniques to solve MP structures has led to 281 unique MP structures as of January 2011. Through the combination of a cell-free expression system and selective labelling strategies, this thesis aimed to advance the structure determination of α-helical MPs by NMR spectroscopy and resulted in the structure determination of a seven-ransmembrane-helix protein. Results were obtained for the 5-lipoxygenase-activating protein (FLAP) and proteorhodopsin (PR). The detergent-based cell-free expression mode proved most efficient for production of both targets, but optimisation of FLAP and PR followed different routes. The presence of a retinal cofactor in PR greatly facilitated the search for an appropriate hydrophobic environment. For structural studies, NMR spectra of FLAP indicated favourable properties of the lysolipid LPPG. In contrast, PR was stable and homogenous in the short-chain lipid diC7PC. As NMR spectra of α-helical MPs are generally characterised by broad lines and signal overlap, selective labelling strategies were essential in the assignment process of both targets. For the backbone assignment of FLAP the transmembrane segment-enhanced (TMS) labelling was developed, employing the six amino acids AFGILV. These residues cluster predominantly in transmembrane helices and form long stretches allowing a large extent of backbone assignment. Besides that, the combinatorial labelling enables identification of unique pairs in the sequence based on a mixture of 15N and 1-13C-labelled amino acids. To find the optimal labelling pattern for a given primary structure, the UPLABEL algorithm has been made available and successfully applied in the backbone assignment of PR. Both selective labelling approaches greatly benefitted from the use of a cell-free expression system to reduce isotope scrambling. Additionally, the de novo structure of PR was determined with an average backbone rmsd of 1.2 Å based on TALOS-derived backbone torsion angles, intrahelical hydrogen bond restraints and distance restraints from the NOE and paramagnetic relaxation enhancement (PRE). A major bottleneck in the NMR structure determination of MPs concerns the number of long-range distances which are often limited. In PR, side chain assignment was enabled by stereo-array isotope labelling as well as selective labelling which provided 33 long-range NOEs. These NOEs stabilised the symmetry of the seven helix bundle. With a total number of 1031, the majority of long-range distances were derived from PREs. The structure of PR reveals differences to its homologues such as the absence of an anti-parallel β-sheet between helices B and C and allows conclusions towards the mechanism of colour tuning.
Ubiquitin is a highly conserved protein involved in several cellular processes like protein degradation, endocytosis, signal transduction and DNA repair. The discovery of ubiquitin-like proteins (UBL) and ubiquitin-like domains (ULD) increases the number of regulation pathways where the property of the ubiquitin-fold is profitable.
Autophagy is the catabolic pathway used in cells to deliver cytosolic components and dysfunctional organelles to the lysosome for degradation. MAP1LC3 proteins are ubiquitin-like proteins involved in one hand for the expansion of the autophagosome, which sequesters cytosolic substrates. In the other hand, these proteins (LC3- and GABARAP- subfamilies) bind to autophagic receptors linked to polyubiquitinated proteins aggregates. For this project, the 3D structure of the GABARAPL-1/NBR1-LIR complex was determined and confirmed that GABARAPL-1 belongs to the MAP1LC3 proteins family, structurally characterized by an ubiquitin-fold, consisting of a central beta-sheet formed by four beta-strands and two alpha-helices on one side of the beta-sheet, preceded N terminally by two alpha-helices, resulting in the formation of two hydrophobic pockets, hp1 and hp2. The autophagic receptor NBR1 interacts with GABARAPL-1 through the hp1 and hp2 with its LIR motif taking an extended beta conformation upon binding, forming an intermolecular beta-sheet with the second beta-strand of GABARAPL 1. This LC3- interacting region (LIR) consists of an Theta XX Gamma sequence preceded by acidic amino acids, with Theta and Gamma represented by any aromatic and hydrophobic residues, respectively. Interaction studies of the LIR domains of p62, Nix and NBR1 with different members of the MAP1LC3 proteins family indicate that the presence of a tryptophan in the LIR motif increases the binding affinity. Substitution to other aromatic amino acids or increasing the number of negatively charged residues at the N-terminus of the LIR motif, however, has little effect on the binding affinity due to enthalpy-entropy compensation, suggesting that effector proteins can interact with a wide variety of different sequences with similar and moderate binding affinities.
Additionally to be present in proteins dealing with protein folding and degradation, ubiquitin-like domain were found protein involved in the regulation of signal transduction like TBK1, a serine/threonine kinase responsible for induction of immune response. In this second project, based on the NMR chemical shifts of the TBK1 domain contained between amino acids 302 and 383, secondary structure prediction programs (TALOS and CSI) confirmed the presence of an Ubiquitin-like domain in TBK1 by identifying one alpha-helix and four beta-strands sequentially aligned like following beta-beta-alpha-beta-beta. This alignment corresponds perfectly with the secondary structure elements of Ubiquitin and proved that TBK1_ULD belongs to the UBL protein superfamily. The similarity to ubiquitin was even bigger by the presence in addition of a small beta-strand and a short helix, which are observed as the beta 5-strand and a 310-helix in Ubiquitin, respectively. The first attempts on the 3D structure determination confirmed the Ub-fold but due to the lack of assignment in TBK1_ULD, only a structure based on ubiquitin as a model was determined. Interaction studies of TBK1_ULD with the IAD-SRR domain of IRF3 showed that both side of the molecule seems involved and that the TBK1/IRF3 interaction is more complex than a one to one binding process. Unfortunately, the instability of TBK1_ULD associated to the difficulty in the purification of IAD-SRR did not allow to further study this interaction more precisely.
Finally, to overcome the difficulty encountered in NMR experiments because of low expression and/or poor solubility, an expression vector using the intrinsic property of ubiquitin was designed. Fused to proteins or peptides targets, this construct produced proteins and peptides in a larger amount than with traditional expression vectors and also with a less cost than chemical synthesis for pure labeled peptides for NMR structural studies. The presence of a hexa histidine tag was useful for the isolation and the purification of the constructs. The existence of a TEV cleavage site was created to keep the possibility of releasing the ubiquitin moiety from the expressed protein or peptide. Moreover, the ubiquitin-tag could also still be attached to the protein/peptide of interest when biophysical methods like NMR, ITC or CD spectroscopy are applied, providing the same results than for the protein/peptide moiety alone.
Time-resolved spectroscopic analysis of fucoxanthin-chlorophyll proteins and isolated carotenoids
(2011)
The aim of this thesis was to elucidate the excitation energy transfer in the fucoxanthin-chlorophyll proteins (FCPs) isolated from the diatom Cyclotella meneghiniana in detail and to clarify the role of the different pigments contained. In a first step the excited state dynamics of the free pigments were studied by means of time-resolved absorption spectroscopy. The FCPs contain three different carotenoid species. Besides the main light-harvesting carotenoid fucoxanthin (fx) the xanthophyll cycle pigments diadinoxanthin (ddx) and diatoxanthin (dtx) are found in substoichiometric amounts. Fx is contained in an unusual carotenoid-to-chlorophyll ratio of about one. In case of ddx and dtx, changing the solvent polarity showed no significant effects on the absorption spectrum and the excited state dynamics were hardly influenced. In contrast, a solvent dependence is observed in the absorption spectrum and excited state dynamics of fx. The S1 lifetime depends strongly on the solvent polarity and an additional broad excited state absorption band red shifted compared to the S1 excited state absorption appears. The occurrence of the described features can be explained with an intramolecular charge transfer state, which is stabilized in a polar environment and appears only in carotenoids with a conjugated carbonyl group. Despite its rather short excited state lifetimes of less than 200 fs (S2) and 30-60 ps (S1), fx acts as a very efficient energy donor in the FCPs. The ultrafast energy transfer dynamics of the isolated proteins FCPa and FCPb were investigated in a comprehensive study using transient absorption in the visible and NIR spectral region complemented with polarized transient absorption spectroscopy. The excitation energy transfer was not influenced significantly by changing the light conditions during the growth, which yields an altered amount of ddx and dtx. It can be concluded that the contribution of the xanthophyll cycle pigments to the energy transfer is not significant. The altered oligomerization state results in a more efficient energy transfer for the trimeric FCPa, which is also reflected in different Chl a fluorescence quantum yields. Thus, an increased quenching in the higher oligomers of FCPb can be assumed. The observed dynamics change drastically for two different excitation wavelengths λ = 500 nm and λ = 550 nm, which both lead to the population of the S2 excited state of individual carotenoids, namely blue and red absorbing fx molecules. The differing absorption maxima result from distinct microenvironments within the protein. For FCPa an additional slow time constant of 25 ps was found after excitation at 500 nm. By means of polarized transient absorption spectroscopy applied to FCPa different transition dipole moments for the S1 and the ICT state of fx could be identified. Based on the presented studies a detailed model explaining the excitation energy transfer pathways could be developed. In agreement with the faster overall transfer rate which is also evident in the anisotropy data in case of 550 nm excitation, upon excitation at 500 nm one slow transfer channel is active. It can be attributed to a blue absorbing fx not strongly associated with a Chl a molecule. Most likely excitation energy transfer takes place between the S1/ICT states of two different fx molecules before the energy is transferred to Chl a. Additional transient absorption experiments with an improved time resolution were performed to investigate the oscillations observed. These coherent effects superimposed the kinetics of isolated carotenoids as well as FCPs within the first 500 fs. The oscillations showed a very unusual damping behavior and vanished already after two oscillation periods. In case of fx, the solvent environment as well as the excitation wavelengths had an influence on the oscillations. The frequencies of the oscillations were 70-100 cm^-1 for fx in solvents with varying polarity and 50-80 cm^-1 for the FCPs. These results could further confirm the assumption that the red absorbing fx molecules are located in a more polar environment within the protein compared to the blue absorbing fx. To clarify the origin of the oscillations in more detail, further experiments with a controlled chirp of the applied pulses and comparison between different carotenoids in various solvents are required. This approach promises to give further insight in the excited state dynamics and to answer the question whether dark states are involved. Right now, the coherent excitation of the strongly coupled excited states 1Bu+ (S2) and 1Bu- resulting in electronic quantum beats and the existence of an additional short lived excited state absorption (S2-SN2) in the visible spectral region are the most reasonable explanations for the occurrence of the coherent effects in the transient absorption spectra of carotenoids.
Since combinatorial chemistry and high throughput screening have become a common technique in the drug discovery phase the number of compounds being considered has increased frequently. These structures are often characterized by high molecular weight, high lipophilicity and low solubility in aqueous and physiological media. Due to the generally poor bioavailability, new in vitro techniques were needed for screening of pharmacokinetic properties. An important parameter for these screening methods is the implementation at an early state of drug discovery phase, to find potential lead structures, before investment costs become significant. The established in vitro methods for the prediction of membrane interaction are not reliable especially for poorly soluble compounds. A new method that is fast and easy to use, requires only small amounts of NCE and which can provide more reliable predictions is needed. In this study, a new screening technique based on surface activity profiling for the prediction of oral drug absorption was evaluated with special emphasis on the predictability of biological membrane interaction of poorly soluble drug compounds. It was demonstrated that drug absorption through a bilayer membrane can be modeled by the orientation of compounds at the air/water interface. Thus amphilicity of a drug is generally related to both oral absorption and blood brain barrier penetration. In turn, amphiphilicity is influenced by the lipophilicity, size and charge distribution of a drug. Surface activity profiling was determined by analysis of surface pressure profiles using the Gibbs adsorption isotherm. The surface activity measurements were carried out using a multichannel tensiometer Delta 8, which was developed by Kibron to be utilized in conjugation high throughput screening in early drug discovery processes. For this study two test sets were analyzed, one for the prediction of gastrointestinal wall interaction and the second for the prediction of the penetration behavior at the blood brain barrier. Both test sets consist of drug compounds with a wide range of absorption properties and consist mainly of compounds with poor water solubility. Since the drugs characteristics varied, they were classified according to water solubility and surface activity and a sample preparation method for each group was established. For the prediction of oral drug absorption, three different methods were established to model the interaction of compound and gastrointestinal wall. For drug compounds with solubility above 1mmol/L the traditional shake-flask method enabled the determination of the amphiphilic properties of drug compounds in pure aqueous media. Compounds with solubility below 1mmol/L tend to not to exhibit any increase in surface activity. Thus surface tension measurements of compounds, which exhibited a limited surface activity due to poor aqueous solubility, were conducted from stock solutions prepared with various organic solvents. Mainly polar organic solvents were used. A mixture of DMSO and DMF resulted in the best combination of properties: the intensive solubility enhancing effect of DMF and the lower intrinsic surface activity of DMSO. The polar solvent ruptured the water clusters, so that highly lipophilic structures had a higher affinity to the solvent and higher concentrations could be obtained. For these compounds higher maximum surface pressure were generated than was possible in pure aqueous media. The surface pressure data were correlated with the fraction absorbed values in vivo. However it was found that poor water solubility is not the only limiting step to exhibiting any surface activity. Some compounds were showed no surface activity in either solvent system. Therefore a micelle vehicle method was established using short chain phospholipids to mimic the gastrointestinal wall. It could be concluded from the results, that non surface active drugs can interact with the phospholipids micelle vehicle in a way analogous to their interaction with the membrane bilayer. The relative critical micelle concentration was correlated with the fraction absorbed of this test set. A sample preparation schema based on the three types of drugs was established. This schema enabled us to predict the absorbance of slightly soluble and poorly soluble drugs with acceptable reliability for early compound screening. For the prediction of blood brain barrier penetration using surface activity profiling as analyzing method, a test set with very poorly soluble characteristics was chosen. The sample preparation method was based on a strictly aqueous approach using the ‘shake flask’ method. The surface tension measurements enabled correlation of the amphiphilic properties of the very poorly soluble drug compounds with BBB uptake. From the aqueous surface pressure profiles and the determination of physicochemical parameters, it was found that blood brain barrier is more likely when a drug provides a small cross-sectional area, As, at the interface. The cross-sectional area is the only parameter which is independent from the maximal concentration in aqueous media and it is particularly suitable for lower solubility compounds. In summary, it was shown that amphilicity is related to biological membrane interaction in the human body and that surface activity profiling with appropriate sample preparation can be used as a reliable screening tool for the prediction of oral drug absorption of poorly soluble drugs. Furthermore an in vitro screening method of blood-brain-barrier penetration was established.
Die Atmungskette ist für aerob lebende Organismen die wichtigste Quelle zur Erzeugung von Energie. Der Cytochrom c Oxidase (COX) kommt hierbei als letztem Enzym innerhalb der Elektronentransportkette eine besondere Bedeutung zu. Im mitochondrialen Fall besteht die Oxidase aus bis zu 13 Untereinheiten, deren Assemblierung in einem gerichteten und strikt regulierten Prozess von statten geht. Defekte innerhalb des Assemblierungsprozesses führen zu schweren respiratorischen Defiziten, die die Ursache für neurodegenerative und myopathische Erkrankungen sind. Der Assemblierungsprozess wird bei der Hefe von mehr als 30 verschiedenen Proteinfaktoren begleitet, die sich letztlich nicht als Untereinheiten im COX Holoenzym finden. Die Cytochrom c Oxidase des Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans weist nicht nur eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zu den Haupt-Untereinheiten I-III der mitochondrialen Oxidase auf, sondern das Bakterium kodiert ebenfalls für eine Reihe von Assemblierungsfaktoren, die am Einbau der Häm a- und Kupfer-Kofaktoren beteiligt sind. Beispiele hierfür sind die Biogenesefaktoren Häm a Synthase (CtaA) und die Surf1-Proteine (Surf1c und Surf1q), deren biochemische Charakterisierung das vorrangige Ziel dieser Arbeit war.
In diesem Sinne wurden für CtaA Expressions- und Aufreinigungsprotokolle entwickelt, die es erlaubten, das Enzym in drei spektroskopisch unterscheidbaren, mit verschiedenen Häm-Typen beladenen Formen zu isolieren. Mit Hilfe einer Mutationsstudie konnten sowohl für Surf1c als auch für Surf1q an einer Häm a-Bindung beteiligte Aminosäurereste identifiziert werden. Hierbei erlaubte insbesondere die Charakterisierung eines konservierten Tryptophanrestes die Entwicklung eines Bindungsmodells von Häm a an Surf1. Die Etablierung eines in vitro Häm-Transfer Assays wies zum ersten Mal eine direkte Interaktion zwischen CtaA und Surf1 nach, in deren Verlauf spezifisch Häm a von CtaA auf Surf1 übertragen wird. Expressionsstudien von CtaA in Paracoccus zeigten zweifelsfrei, dass die Synthese von Häm a auf Ebene des Vorläufermoleküls Häm b reguliert ist und eine Synthese des Kofaktors an eine Abgabe an Untereinheit I im Rahmen der COX-Biogenese gekoppelt ist. Eine nähere Charakterisierung der durch Deletion von surf1c hervorgerufenen Defekte der COX erwies, dass die Oxidase neben einer bereits beschriebenen Reduktion des Häm a-Gehalts überraschenderweise auch in Form von Häm b einen unphysiologischen Häm-Typ bindet.
Zusammengenommen erhärten die gewonnen Erkenntnisse die These, dass Surf1 direkt an der Inkorporation der Häm a-Kofaktoren in die Untereinheit I der Oxidase beteiligt ist. Dabei wirkt das Protein möglicherweise als molekularer Filter, der für den Einbau des physiologisch bedeutsamen Häm-Typs (Häm a) verantwortlich ist. Darüber hinaus stabilisiert es als vermittelnder Faktor die Interaktion von CtaA und Untereinheit I und sorgt somit für einen erleichterten und koordinierten Einbau des Häms in die Oxidase. Die in dieser Arbeit am bakteriellen Modellsystem gewonnen Erkenntnisse sollten aufgrund der hohen Ähnlichkeit sowohl der Cytochrom c Oxidase als auch der beteiligten Biogenesefaktoren direkte Rückschlüsse auf die Geschehnisse im humanen System erlauben.
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit steht der humane β2-adrenerge Rezeptor, ein intrinsisches Membranprotein und Mitglied der Superfamilie G Protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs).
Es wurden im Wesentlichen zwei Themenschwerpunkte bearbeitet. Den ersten Schwerpunkt bildeten die heterologe Produktion des β2-adrenergen Rezeptors in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris sowie dessen chromatographische Reinigung und Charakterisierung. Hierbei konnten in allen wesentlichen Punkten signifikante Verbesserungen im Vergleich zu früheren Arbeiten erzielt werden: Die Ausbeute an heterolog produziertem, funktionellem Rezeptor konnte um das bis zu Fünffache gesteigert werden; Die Gesamtausbeute nach chromatographischer Reinigung wurde um 60% erhöht; Es gelang die Darstellung reiner, monodisperser Rezeptorpräparationen mit einer spezifischen Ligandenbindungsaktivität von 94% und einer Halbwertszeit der Ligandenbindungsaktivität von >50 Tagen bei 4 °C. Eine pharmakologische Charakterisierung des Rezeptors erfolgte sowohl in Membranen als auch in solubilisiert-gereinigter Form. Ferner konnte die in vitro-Interaktion des solubilisiert-gereinigten Rezeptors mit einer konstitutiv aktiven β-Arrestin Variante nachgewiesen werden.
Ziel des zweiten Themenschwerpunkts der vorliegenden Arbeit war die Auffindung und Charakterisierung von rezeptorspezifischen, nicht auf Immunglobulinen basierenden Bindeproteinen, um diese später vorrangig zur Kokristallisation einsetzen zu können. Mit der zellfreien Selektionsmethode des ribosome display ist es hierbei gelungen, aus einer naiven, auf Ubiquitin als Gerüstprotein basierenden Bibliothek hochaffine, spezifische Bindeproteine gegen den β2-adrenergen Rezeptor zu isolieren. Für Monomere dieser sog. Affiline® wurden Dissoziationskonstanten bis etwa 450 nM gefunden, die durch Homodimerisierung auf etwa 70 nM verringert werden konnten. Zusätzlich wurde mit einer Affinitätsmaturierung ausgewählter Varianten begonnen.
Die Superfamilie der G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) bildet die größte und auch diverseste der vier Hauptgruppen membranständiger Rezeptoren. Im Rahmen der Signaltransduktion vermitteln diese die Umwandlung eines extrazellulären Signals in eine spezifische intrazelluläre Reaktion und nehmen so eine Schlüsselposition bei der Kommunikation zwischen Zellen ein. Bei GPCRs erfolgt die Weitergabe der ligandeninduzierten Konformationsänderung vorwiegend über Kopplung an und Aktivierung von Guanin-Nukleotidebindenden Proteinen (G Proteine), die dann ihrerseits mit verschiedenen Effektorsystemen in Wechselwirkung treten. Da ein Großteil aller zurzeit auf dem Markt befindlichen Medikamente ihre Wirkung durch Bindung an einen GPCR entfaltet, ist diese Proteinfamilie von besonders großem pharmakologischem Interesse. Auch der humane β2-adrenerge Rezeptor (β2AR) zählt zu den kommerziell wichtigen drug targets und ist zudem nach bovinem Rhodopsin der erste GPCR, für dessen Struktur experimentell bestimmte, atomare Modelle vorgelegt werden konnten.
Zur funktionellen Überproduktion des β2AR hatte sich bereits die methylotrophe Hefe Pichia pastoris bewährt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch Anwendung hier erarbeiteter, optimierter Bedingungen das Produktionsniveau aller acht für dieses Expressionssystem zur Verfügung stehenden bzw. in dieser Arbeit hergestellten Konstrukte gegenüber früheren Ergebnissen deutlich gesteigert werden konnte. Hierbei wurde, je nach Konstrukt, eine Verdopplung bis Verfünffachung der Produktion an aktivem, bindungsfähigem Rezeptor erzielt. Bei drei der acht Konstrukte konnte das Produktionsniveau auf ≥ 50 pmol/mg Membranprotein gesteigert werden, was bis zu 1,1 mg aktivem Rezeptor in Membranen pro Liter Schüttelkultur entspricht. Die im Rahmen der Produktionsoptimierung der verschiedenen Konstrukte gewonnenen Erkenntnisse über den Einfluss sowohl von Art als auch Lokalisation eines bestimmten Anhängsels innerhalb der Expressionskassette auf das zu erwartende Produktionsniveau konnten genutzt werden, um bei einem mit bestimmten Eigenschaften neu zu erstellenden Konstrukt – einem Baukastensystem gleich – jene Anhängsel mit den gewünschten (und bekannten) Auswirkungen zu kombinieren. Auf dies Weise konnten auf Anhieb sehr gute Produktionsniveaus für neu erstellte Konstrukte erzielt werden.
Durch Optimierung einer zweischrittigen affinitätschromatographischen Reinigung konnte zum einen die Gesamtausbeute an gereinigtem β2AR um 60% gegenüber früheren Ergebnissen gesteigert werden. Zum anderen gelang es, für derartige, nach SDS-PAGE und analytischer Gelfiltration als homogen und frei von jeglichen Aggregationen befundenen Präparationen, die spezifische Aktivität (Radioligandenbindung) auf 94 ± 4% zu steigern. Die Halbwertszeit der spezifischen Aktivität derartiger Präparationen bei 4 °C lag bei über 50 Tagen. Im Rahmen einer alternativen Reinigungsstrategie konnte der praktische Nutzen proteolytisch abspaltbarer Affinitätsanhängsel in Fällen mit inhomogener posttranslationaler Prozessierung des rekombinanten Proteins durch das Expressionssystem nachgewiesen werden.
Durch Integration einer inversen Affinitätschromatographie in das Reinigungsschema konnte bei bestimmten Konstrukten die Homogenität und Dispersität der Präparation verbessert werden, bei gleichzeitiger vollständiger Entfernung sowohl der abgetrennten Anhängsel als auch der verwendeten Protease.
Die Ligandenbindung des β2AR wurde sowohl in Membranen als auch in solubilisiertgereinigter Form charakterisiert. Die hierbei für den Rezeptor in Membranen mit dem tritiierten Liganden [5,7-3H]-(-)-CGP-12177 erhaltene Dissoziationskonstante (KD) von 4,1 ± 0,2 nM befindet sich in guter Übereinstimmung mit den Literaturwerten für dieses Expressionssystem.
Bei der Charakterisierung der Ligandenbindung des β2AR in solubilisiert-gereinigter Form wurde ein stark modulierender Effekt von Lipiden auf die KD beobachtet: Die Dissoziationskonstante des soubilisiert-gereinigten Rezeptors wurde zu 8 ± 0,6 nM bestimmt, ließ sich jedoch durch gleichzeitige Verwendung von solubilisiertem Phosphatidylcholin und Cholesterinhemisuccinat im Bindungstest auf ein Viertel (2,13 ± 0,2 nM) diese Wertes reduzieren. Der Effekt der Affinitätsmodulation war voll reversibel und die Gesamtmenge (Bmax) an bindungsfähigem Rezeptor blieb praktisch unbeeinflusst.
Des weiteren konnte die spezifische Interaktion des solubilisiert-gereinigten β2AR mit rekombinantem, konstitutiv aktivem β-Arrestin in vitro nachgewiesen werden. Dies ist sowohl für die Etablierung etwaiger funktioneller Assays als auch für Ansätze zur Kokristallisation des β2AR mit einem physiologischen Bindungspartner für von Interesse.
Im Rahmen des zweiten Themenkomplexes wurde die Methode des ribosome display (RD) erfolgreich eingesetzt, um Bindeproteine gegen den β2AR zu selektieren. Ziel war es hier, diese später zur Kokristallisation mit dem Zielprotein einsetzen zu können. Das RD als zellfreie (in vitro) Selektionsmethode findet für lösliche Proteine bereits seit längerem breite Anwendung.
Für Membranproteine wurde es bisher hingegen nur sehr selten erfolgreich verwendet und der Einsatz bei GPCRs ist als neu zu bezeichnen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine hochdiverse (theoretische Diversität: 1013, funktionelle Größe 1010 – 1011), naive Bibliothek verwendet, die auf Ubiquitin als Gerüstprotein basiert und von SCIL Proteins, Halle unter der Bezeichnung Affilin® entwickelt wurde. Es handelt sich somit um alternative, d. h. nicht auf Antikörpern oder deren Fragmenten beruhenden Bindeproteine. Zielprotein der in dieser Arbeit durchgeführten Selektionen war solubilisiert-gereinigter β2AR. Sämtliche Arbeiten unter Beteiligung des Zielproteins fanden zur Bewahrung dessen Aktivität in Anwesenheit von Detergenz statt. Die verschiedenen Schritte des RD mussten daher zunächst an die speziellen Erfordernisse des Zielproteins angepasst und geeignete Bedingungen zur Durchführung einer Selektion gefunden werden. Durch entsprechende Vorversuche wurde dann verifiziert, dass der Rezeptor unter den gewählten Selektions- und Immobilisierungsbedingungen seine Ligandenbindugsaktivität beibehält. Es wurden insgesamt sechs RD-Selektionsrunden durchgeführt und der abschließend vorliegende Bindeprotein-Subpool war noch divers (keine Reduktion auf eine Konsensus-Sequenz). Zur Charakterisierung der angereicherten Varianten wurde eine Abfolge von Hochdurchsatzverfahren sowie abschließenden Einzelanalysen eingesetzt. Hierbei gelang es, hochaffine, spezifische Bindeproteine gegen den β2AR zu isolieren. Die beobachteten Dissoziationskonstanten (KD) der detailliert charakterisierten Affilin-Monomere reichen von etwa 15 μM bis hin zu 450 nM. Nach Homodimerisierung ausgewählter, zuvor charakterisierter Varianten wurde eine Verringerung der Dissoziationskonstanten bis auf etwa 70 nM beobachtet. Damit decken die selektierten Bindeproteine einen Affinitätsbereich ab, der verschiedenartige Anwendungsgebiete eröffnet: Vom Einsatz zur affinitätschromatographischen Reinigung des Zielproteins, über dessen immunologischen Nachweis bzw. dem Einsatz in Assaysystemen bis hin zur Kokristallisation mit dem Zielprotein. Die Spezifität der Bindeproteine wurde gegenüber verschiedenen Negativkontrollen wie etwa dem verwendeten Immobilisierungssystem aber auch gegenüber anderen GPCRs mit homologer Auswahl an Affinitätsanhängseln verifiziert. Durch geeignete Konditionierung (prepanning) der in den eigentlichen Selektionsprozess eingehenden ternären Komplexe war es gelungen, die Anreicherung unerwünschter, gegen das zur Immobilisierung verwendete Biotin/Streptavidin-System gerichteter Varianten wirkungsvoll zu verhindern.
Die selektierten Bindeproteine konnten in verschiedenen Maßstäben (von 1 ml bis 1 l) mit sehr hohen Ausbeuten in E. coli produziert werden. Nach Affinitätschromatographie und präparativer Gelfiltration wurden hochreine, monodisperse Präparationen erhalten. Die Gesamtausbeuten an gereinigtem Bindeprotein lagen bei etwa 15 mg/l Kulturvolumen.
Neben der Affinitätsbestimmung wurde die Bindung einzelner Affilin-Varianten an den β2AR sowohl mittels pull-down Assay als auch analytischer Gelfiltration verifiziert. Parallel zur Homo- und Hetero-Dimerisierung wurde eine Affinitätsmaturierung ausgewählter Varianten begonnen. Diese Affinitätsmaturierung der Monomere erfolgte in einem evolutiven Ansatz bestehend aus Zufallsmutagenese zuvor charakterisierter Varianten und anschließender Selektion im Rahmen eines erneuten RD.
Systematische Ansätze zur Kokristallisation des β2AR mit mehreren der aus der Selektion hervorgegangenen alternativen Bindeproteine wurden durchgeführt.
Das extrem thermophile Eubakterium Thermus thermophilus ist in den letzten Jahren zu einem Modell für thermophile Organismen geworden und verdankt seinen Statuszum Teil seiner hohe Wachstumsrate, den guten Zellerträgen und der konstitutivenExpression eines natürlichen Kompetenzapparates, der seine genetische Manipulation ermöglicht. Die Verfügbarkeit von kompatiblen Plasmiden und bis zu vier thermostabilen Antibiotikaresistenzmarkern konnten den Wert des Organismus in Hinblick auf biotechnologische Anwendungen noch weiter steigern und tatsächlich besteht nach wie vor ein ungebrochenes Interesse an der Struktur- und Funktionsaufklärung thermophiler Proteine. Der Focus der hier vorliegenden Arbeit richtete sich auf eine der insgesamt zwei terminalen Oxidasen der Atmungskette von T. thermophilus, die Cytochrom ba3 Oxidase. Es wurden verschiedene rekombinante Varianten des Proteins, die sich hinsichtlich der Position und Länge des verwendeten Histidin-Tags unterschieden, kloniert, exprimiert und aufgereinigt. Das Einfügen eines internen His12-Tags in einen periplasmatischen Loop zwischen den Transmembranhelices IV und V führte zu einer rekombinanten Version der Oxidase, die in ihren Eigenschaften dem nativen Wildtyp entsprach und sich durch die in dieser Arbeit etablierte Aufreinigungsstrategie relativ schnell, in guten Ausbeuten und hoher Reinheit aufreinigen ließ. Weiterhin konnten verschiedene Punktmutationen von möglicherweise am Elektronentransfer beteiligten Aminosäureresten generiert und die resultierenden Proteine aufgereinigt und über ihre enzymatische Aktivität charakterisiert werden. Eine weiterführende Charakterisierung der Mutanten erfolgte im Rahmen einer Kooperation und ist bisher noch nicht abgeschlossen. Das Herzstück dieser Arbeit machte jedoch die Definition der Transkriptionseinheit der Cytochrom ba3 Oxidase und die sich daraus ergebenden Fragestellungen aus. So konnte gezeigt werden, dass das ba3 Operon zusätzlich zu den Strukturgenen der dort kodierten Untereinheiten noch mindestens ein, höchst wahrscheinlich jedoch zwei zusätzliche Gene enthält: cbaX und cbaY. Bioinformatische Charakterisierungen ordneten CbaY der diversen Gruppe von sekundären Transportern zu, und es konnte experimentell gezeigt werden, dass seine Anwesenheit für die Expression der Cytochrom ba3 Oxidase förderlich ist. CbaX hingegen konnte über die durchgeführte Homologiesuche keine Funktion zugeordnet werden; uncharakterisierte Homologe waren einzig in der Thermaceae Gruppe zu finden. Durch Deletions- und Komplementationsstudien konnte dem Protein eine entscheidende Rolle in der Assemblierung der ba3 Oxidase bescheinigt werden. CbaX scheint eine zentrale Aufgabe bei der Häm a Insertion in Untereinheit I zu spielen und könnte, ohne Sequenzhomologie aufzuweisen, die Rolle des Surf1-Proteins übernehmen, welches in den sequenzierten Organismen der Thermaceae Gruppe nicht konserviert ist. Die homologe Expression und Aufreinigung von CbaX führte nicht zur erwarteten Ausbeute und Reinheit des Proteins, konnte aber durch immunologische Experimente eine potentielle Interaktion von CbaX und der Cytochrom ba3 Oxidase nachweisen.
Die Atmungskette in der inneren Membran der Mitochondrien besteht aus fünf großen Enzymkomplexen. Die NADH-Dehydrogenase (I), Succinat-Dehydrogenase (II, indirekt), Cytochrom c-Reduktase (III) und Cytochrom c-Oxidase (IV) nutzen die Energie aus Elektronentransfers zum Aufbau eines Protonengradienten über die innere Mitochondrienmembran. Dieser wird anschließend von der FOF1-ATP-Synthase (V) als Energiequelle zur Phospho-rylierung von ADP verwendet. Für lange Zeit bestand eine Kontroverse, wie diese Proteine in der Membran organisiert sind. Nach dem „random collision“-Modell diffundieren sie frei als Einzelmoleküle und treffen sich nur zufällig, während sie nach dem „solid state“-Modell größere funktionelle Einheiten bilden. In den letzten Jahren gab es vermehrt Hinweise darauf, dass das letztere Modell das zutreffendere ist, da tatsächlich sogenannte Superkomplexe der Atmungskette in aktiver Form isoliert werden konnten. Schließlich konnte 2007 die erste drei-dimensionale Rekonstruktion eines Superkomplexes, bestehend aus Komplex I, dimerem Komplex III und Komplex IV publiziert werden. Aufgrund der Einschränkungen der verwendeten Negativkontrasttechnik hatte dieses Modell allerdings nur eine niedrige Auflösung und repräsentierte durch die Dehydrierung keinen nativen Zustand. Dadurch ließen sich die Strukturen der einzelnen Komplexe nur ungenau einpassen. Um diese Probleme zu umgehen, sollte eine Struktur unter Kryo-Bedingungen rekonstruiert werden. Um die für Kryo-EM benötigte größere Ausbeute und höhere Konzentration zu erzielen, wurde ein neues Reinigungsprotokoll für die Superkomplexe etabliert. Die wesentlichen Punkte darin sind der Austausch des für die Solubilisierung verwendeten Digitonins durch Amphipol A8-35 mittels ?-Cyclodextrin und eine anschließende Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Im BN-PAGE zeigten die auf diese Art gereinigten Superkomplexe das gleiche Banden- und Aktivitätsmuster wie Proben in Digitonin. Auch bei einer Einzelpartikelanalyse nach Negativ-kontrastfärbung konnten keine Unterschiede festgestellt werden und die Partikel zeigten ähnliche Orientierungen wie in der vorherigen Studie. Einige neue Ansichten ließen sich jedoch nicht zuordnen und stellten eventuell eine Verunreinigung mit größeren Superkomplexen dar. Da auch bei der Reinigung mit Amphipol die Proteinkonzentration letztlich nicht wesentlich erhöht werden konnte und sich die Superkomplexe nicht wie für Kryo-EM erforderlich in einen löchrigen Kohlefilm einlagerten, wurden die Proteine auf einem durchgehenden Kohlefilm in einer dünnen Pufferschicht vitrifiziert. Die dabei zu beobachtenden bevorzugten Orientierungen, sollten auch die Unterscheidung von verschiedenen Populationen von Superkomplexen erleichtern. Eine erste 3D-Rekonstruktion wurde mit Hilfe der „random conical tilt“-Methode errechnet. Dieses Modell wurde durch „projection matching“ bis zu einer Auflösung von 19 Å verfeinert, womit die Auflösung fast doppelt so hoch ist, wie bei der Rekonstruktion aus Negativ-kontrastfärbung (36 Å). Die Struktur repräsentiert einen natürlichen Zustand des Proteins und zeigt Details wie einzelne Domänen, Spalten zwischen Domänen und eine starke Krümmung des Membranarms von Komplex I, die zuvor nicht erkenn-bar waren. Die Amphipole bilden einen Gürtel um den Transmembranbereich. Die Röntgenstrukturen von Komplex I, III2 und IV konnten mit großer Präzision in die Dichtekarte eingepasst werden. Die wenigen kleinen Unterschiede zwischen Röntgenstrukturen und EM-Dichtekarte sind auf leichte Konformations-änderungen zurückzuführen. Die Kryo-EM-Rekonstruktion ist erheblich größer als die Rekonstruktion aus Negativfärbung, wodurch die enthaltenen Komplexe nur noch wenige punktuelle Kontakte haben. In den Zwischenräumen könnte eine spezielle Lipidumgebung die kleinen Elektronenüberträger Ubichinon und Cytochrom c in den Superkomplex integrieren. Ihre Bindestellen sind jeweils zueinander orientiert und die geringen Abstände, die zum ersten Mal bestimmt werden konnten, stützen die Hypothese eines gerichteten Substrattransfers über kurze Entfernungen. Von den möglichen Übertragungswegen scheint der kürzere mit weniger Transferreaktionen bevorzugt zu werden. Während der Entwicklung des neuen Reinigungsprotokolls für die Superkomplexe konnte zusätzlich eine neue Methode zur Rekonstitution von Membranproteinen entwickelt werden. Die solubilisierten Proteine werden dabei in Dichtegradienten mit steigenden Konzentrationen von ansolubilisierten Liposomen und Cyclodextrin zentrifugiert, wodurch ihnen langsam das Detergens entzogen und durch Lipid ersetzt wird. Proteoliposomen werden gleichzeitig von überschüssigem Lipid und Cyclodextrin-Detergens-Komplexen getrennt.
Almost two decades ago, microRNAs were discovered as novel posttranscriptional regulators of gene expression. Since then, research efforts have uncovered their involvement in the control of various cellular processes including migration, proliferation and cell survival. Even more complex events, such as the formation of new blood vessels or organ development, have been shown to be tightly regulated and orchestrated by microRNAs. Due to their crucial regulatory role in tissue homeostasis in vertebrates, it does not come as a big surprise that dysregulated microRNA ex-pression is associated with pathology of diverse diseases. In this regard, the miR-17-92 cluster is a prime example since it has become famous for its amplified expression in tumours and its on-cogenic potential. Our lab demonstrated the expression of the members of the miR-17-92 cluster, namely miR-17, -18a, -19a, -20a, -19b and -92a, in endothelial cells and provided evidence for the anti-angiogenic activity of miR-92a in ECs as well as its important regulatory role in tissue re-covery after ischemia. In this work we addressed the function of the remaining members of the miR-17-92 cluster, i.e. miR-17, miR-18a, miR-19a and miR-20a, in endothelial cells and angiogenesis. Surprisingly, the individual members all displayed anti-angiogenic properties in endothelial cells in vitro, although overexpression of the whole cluster in transformed colonocytes was shown to promote tumour angiogenesis in a mouse model. In this context, we provide evidence that the individual miRs differentially affect the paracrine angiogenic activity of endothelial and tumour cells. Moreover, Antagomir-mediated inhibition of miR-17/20 in a mouse tumour model did not affect tumour angi-ogenesis, although miR-17/20 inhibition profoundly increased vascularization of Matrigel plugs. Thus, our research efforts suggest a differential involvement of the members of the miR-17-92 cluster in physiological and tumour angiogenesis. Additionally, we identified Janus kinase (JAK) 1 as a novel miR-17 target in endothelial cells and demonstrated the involvement of JAK1 in angio-genesis and in the phosphorylation of STAT3 in response to different cytokines in vitro. Overall, inhibition of specific members of the miR-17-92 cluster might represent an attractive therapeutic strategy to enhance angiogenesis in ischemic diseases. In the second part of the present work we investigated the therapeutic value of Antagomir-mediated microRNA inhibition in animal models of pulmonary arterial hypertension. Collectively, inhibition of miR-17 by the respective Antagomir revealed a significant improvement of pulmonary hemodynamics and cardiac function in both the chronic hypoxia mouse model and the mono-crotaline-induced lung injury rat model. Histomorphometric analysis of the lungs of the pulmonary hypertensive mice and rats uncovered a significant reduction of disease associated musculariza-tion of pulmonary arteries in Antagomir-17 treated animals compared to the control animals indicating interference with smooth muscle cell proliferation or survival. Probing of lung tissue of the pulmonary hypertensive rats for selected miR-17 targets uncovered a profound increase in the expression of the cyclin dependent kinase inhibitor p21 in the Antagomir-17 treated rats suggest-ing that inhibition of miR-17 impairs proliferation by impeding cell cycle progression. Analysis of miR-17 function in human smooth muscle cells in vitro corroborated the results from the animal experiments by demonstrating pro-proliferative activity of miR-17 and decreased levels of p21 in these cells. Collectively, our results indicate that Antagomir-17 improves pulmonary hemodyna-mics and cardiac function by interfering with vascular remodelling within the lung. Hence, inhibi-tion of miR-17 might be of therapeutic value to ameliorate the disease pattern in pulmonary arte-rial hypertension. In summary, the present work provides insights into the regulatory functions of members of the miR-17-92 cluster, especially miR-17, in blood vessels and suggests that specific inhibition of members of the miR-17-92 cluster might be a novel option to treat vascular diseases.
The enzyme quinol:fumarate reductase (QFR) from the anaerobic epsilon-proteobacterium Wolinella succinogenes is a membrane protein complex that couples the catalysis of the oxidation of menaquinol to menaquinone to that of the reduction of fumarate to succinate. This is the terminal step in fumarate respiration, a form of anaerobic respiration in which oxygen is replaced by fumarate as the terminal electron acceptor in many anaerobic microorganisms. In QFR, both the heme groups (low-potential distal and high-potential proximal heme b group in transmembrane subunit C) are part of the electron transport chain between the two catalytic sites of the redox enzyme. Although the reduction of fumarate by menaquinol is exergonic, it is not exergonic enough to support the generation of a transmembrane electrochemical proton potential delta p. Evidence has previously shown that this reaction is catalysed by a novel mechanism, involving the facilitation of transmembrane electron transfer by transmembrane proton transfer via an essential compensatory transmembrane proton transfer pathway ("E-pathway") which is inactive in the oxidized state of the enzyme. The two key constitutents of the the pathway are the amino acid residue Glu C180 of the transmembrane helix V (located in subunit C) and the ring C propionate of the distal heme bD. The aim of the project was to obtain, by employing a combination of time-resolved as well as static spectroscopic approaches, a detailed insight of the transmembrane electron coupled proton transfer mechanism. Minute changes in both the oxidized and reduced states of a redox protein system can be selectively and sensitively monitored by static Fourier Transformed Infrared (FTIR) difference spectroscopy. The technique employed in this context, electrochemically induced FTIR difference spectroscopy, is complemented by computer-based electrostatic calculations. In order to elucidate the catalytic mechanism of the important reactions in QFR, it is necessary to investigate these in a time-resolved manner. Rapid scan FTIR difference spectroscopy is a suitable technique that allows the course of the reaction to be monitored in a time dependent fashion. The techniques employed in this context are time-resolved (tr-FTIR) and transient absorption spectroscopy. In the following, the details of individual sub-projects are discussed in brief. ...
The ubiquinol:cytochrome c oxidoreductase is a key component of several aerobic respiratory chains in different organisms. It is an integral membrane protein complex, made up of three catalytic subunits (cytochrome b, cytochrome c1 and Rieske iron sulphur protein) and up to eight additional subunits in mitochondria. The complex oxidizes one quinol molecules and reduces two cytochrome c during the Q cycle, originally described by Peter Mitchell. Electrons are split between the low and the high potential chain and protons are released on the positive side of the membrane, increasing the protonmotive force needed by the ATP-synthase for energy transduction. The cytochrome bc1 complex from P. denitrificans is a perfect model for structural and functional studies. Bacteria are easy to grow and the genetic material is readily accessible for genetic manipulation. Moreover, the P. denitrificans aerobic respiratory chain is very close to the mitochondrial one: the complexes involved in electron transfer resemble the ones found in mitochondria, but lack most of the additional subunits. As a unique feature, P. denitrificans has a strongly acidic domain at the N-terminal region of the cytochrome c1, a sequence of 150 aminoacids which does not correlate with any known protein. An analogous composition can be found in the eukaryotic cytochrome bc1 complex as a part of an accessory subunit, proposed to be involved in facilitating electron transfer between the complex and the electron acceptor cytochrome c. In order to study the function of this domain in the P. denitrificans cytochrome bc1 complex, a deletion mutant has been previously cloned and modified with an affinity tag as a C-terminal extension of cytochrome b. The complex is purified by affinity chromatography and characterized by steady-state kinetics using not only horse heart cytochrome c but also the endogenous electron acceptor, the membrane bound cytochrome c552, employed here as a soluble fragment. Steady–state kinetics indicate that the deletion of the long acidic domain had effects neither on the turnover rate nor on the apparent affinity for the substrate. To understand wether the deletion affects the reaction between the cytochrome bc1 complex and the substrate, laser flash photolysis experiments are performed, showing that the interaction observed was not changed in the complex missing the acidic domain. The results presented in this work confirm the ones previously obtained by Julia Janzon using soluble fragments of the same interaction partners. The deletion, however, affected the oligomerization state of the complex, as shown by LILBID (Laser Induced Liquid Bead Ion Desorption) analysis. The wild type complex has a tetrameric structure, better described as a “dimer of dimers”. The deletion of the acidic domain on the cytochrome c1 results in the separation of the two dimers, yielding the canonical dimer. Therefore, the complex deleted in the acidic domain is used for cloning and expression of a heterodimeric complex, containing an inactivating mutation in the quinol oxidation site in only one monomer, thus allowing a selective switch-off for half the complex. Such a complex is needed for the verification of an internal regulation mechanism, the half-of-the-sites reactivity. According to it, the dimeric structure of the cytochrome bc1 complex has functional implications, since the two monomers can communicate and work in a coordinated manner. This approach confirms that substrate oxidation does effectively take place only in one of the two monomers constituting the dimer, and that the binding of substrate at the Qo and Qi site regulates the switch between active and inactive monomer. Moreover, this mechanism works also as an effective protection against the reaction of quinone intermediates with oxygen and the formation of reactive oxygen species (ROS), responsable for cellular aging. The motion of the ISP head domain is also addressed in this work; in particular the mechanism which regulates the movements towards the cytochrome c1 and the electron bifurcation at the quinol oxidation site. Laser flash kinetics in presence of several inhibitors and the substrate allow studying the response of the ISP to the binding of different species at the quinol oxidation site. The binding of ligand at the Qo site in the complex triggers the conformational switch in the ISP head domain, supporting the mechanism proposed in the literature according to which the Qo site is able to “sense” the presence of substrate and transfer the information to the ISP, regulating its mobility. The internal electron pathway between the ISP and the cytochrome c1 has been analyzed also by stopped-flow kinetics, in presence and absence of inhibitors. The results indicate that two kinetic phases describe the reduction of cytochrome c1 by the ISP, and a model for the simulation of the data is proposed.
Pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) is a pulsed EPR method that can reliably and precisely provide structural information regarding duplex RNAs and DNAs by measuring long-range distances (1.5-7 nm) utilizing distance-dependent magnetic dipole-dipole interaction between two nitroxide spin labels. In this thesis the application field of PELDOR spectroscopy has been expanded. For the first time the global architecture of tertiary folded RNA has been mapped in vitro. Moreover, the first application of PELDOR for determining structural aspects of RNA and DNA molecules inside cells has been presented. RNA has the central role in cellular processes and gene regulation. It can adopt complex three dimensional structures, which in combination with its conformational dynamics is essential for its function as biological catalyst, structural scaffold and regulator of gene expression. Riboswitches are cis-acting RNA segments that modulate gene expression by direct binding of small molecules with high affinity and specificity. Neomycin-responsive riboswitch is an engineered riboswitch developed by combination of in vitro selection and in vivo screening. Upon insertion into the 5‟ untranslated region of mRNA and binding the cognate ligand it is able to inhibit translational initiation in yeast. Using enzymatic probing the secondary structure had been postulated comprising global stem-loop architecture with a terminal and an internal loop. In the first part of this thesis, the global conformational arrangement of this 27 nucleotides long RNA element has been studied by means of site-directed spin labeling and PELDOR spectroscopy. Spin-labeled neomycin-responsive riboswitch mutants were synthesized via a Sonogashira cross-coupling reaction between 5-membered pyrroline ring based nitroxide radical (TPA) and 5-iodo-uridine. The labeling positions were chosen outside of the binding pocket and UV melting curves revealed that spin-labeling neither disturbs the secondary structure nor interferes with ligand binding. Efficient ligand binding was proven by thermal stabilization of 20.3±3.3 oC upon addition of neomycin, as well as by cw EPR spectra. PELDOR time traces with long observation time windows and with good signal to noise ratio and modulation depth were recorded for all double-labeled samples allowing a reliable data analysis. The fact that there were no shifts in the measured distances upon addition of neomycin implied the existence of a prearranged tertiary structure of the neomycin-sensing riboswitch without a significant global conformational change induced by ligand binding. Measured distances were in very good agreement with the NMR structure of the ligand-bound state of the riboswitch indicating the intrinsic propensity of the global RNA architecture toward its energetically favored ligand-bound form at low temperature. The results harvested in this work represent the first application of PELDOR for mapping the global structure of a tertiary folded RNA. In the second part of this thesis the possibility of applying PELDOR on nucleic acids (NAs) in cellular environment has been investigated. It was shown before that global NA structure depends on matrix conditions, such as concentration of ions and small molecules, molecular crowding, viscosity and interactions with proteins. Therefore, PELDOR spectroscopy on a double-labeled 12-base pair DNA duplex, the 14-mer cUUCGg tetraloop hairpin RNA and the 27-mer neomycin-sensing riboswitch has been used to obtain long-range distance constraints on such systems in Xenopus laevis oocytes and to compare them with in vitro measurements. The reduced lifetime of nitroxide spin labels under cellular conditions has been a major challenge in these measurements. Investigation of nitroxide reduction kinetics in-cell has revealed that the 5-membered pyrrolidine and pyrroline rings are significantly slower reduced compared to 6-membered piperidine ring based nitroxides. Due to prolonged lifetime of the TPA nitroxides covalently attached to NA molecules PELDOR signals could be measured with good signal-to-noise ratios up to 70 minutes of incubation time. The partial loss of coupled spin labels due to nitroxide reduction only led to a decrease in the modulation depth upon increasing the incubation time. No alterations in the measured distances between in vitro and in-cell experiments implies the existence of stable overall conformations of the 14-mer cUUCGg tetraloop hairpin RNA and the 27-mer neomycin-sensing riboswitch, whereas the 12-bp duplex DNA experiences stacking in-cell but retaining the secondary structure. Thus, for the first time nanometer distance measurements were performed inside cells, clearly laying a foundation for the application of PELDOR spectroscopy to study biological processes in cells, such as diffusion, interaction with proteins and other factors or chemical reactions.
Employing NMR spectroscopy, it is not only possible to calculate the three dimensional structures of single proteins, but also to study dynamics and conformational changes of protein-complexes. In fact that is an important aspect, since the protein function depends on dynamics and interactions with other molecules. Therefore the study of protein-protein interactions is of highest importance for a better understanding of biological processes. Based on NMR methods, in this thesis we were able to determine protein-protein interactions within the enterobacterial Rcs signalling complex which is regulated via a phosphorelay. Originally identified as regulator of capsule synthesis, the Rcs phosphorelay is now considered to be implicated in stress response caused by disturbances in the peptidoglycan layer. Beyond that the Rcs system is involved in multiplex transcriptional networks including cell division, motility, biofilm formation and virulence. Because of such global nature and its extraordinary structural organisation involving membrane integrated sensor proteins (RcsC, RcsD), coactivators (RcsF, RcsA) and a transcription factor (RcsB), the Rcs system is one of the most remarkable phosphorelays in the family of enterobacteriacaea. During the complex phosphotransfer the histidine phosphotransferase (HPt) domain of the intermediary RcsD protein mediates the phosphotransfer between RcsC and RcsB, and probably modulates the phosphorylation state of the response regulator RcsB. Therefore the present work has been focused on the interface between RcsD and RcsB in more detail. In the first part of the thesis a new domain within the RcsD protein has been identified and structurally analysed by liquid NMR spectroscopy. RcsD is an inner membrane bound hybrid sensor like-kinase composed of a periplasmic sensor domain and a cytoplasmic portion. The cytoplasmic part contains the histidine like-kinase (HK) domain and the histidine phosphotransferase (HPt) domain. By analysis of the secondary structure in more detail, it was shown here that the two domains are intermitted by an additional 13.3 kDa domain. Corresponding to the position of the ABL (α−β−loop) domain of RcsC, located C-terminal to the RcsC-HK domain, the new identified domain was named RcsD-ABL. The central structural element of RcsD-ABL is a β-sheet composed of six strands with a β1−β2−β3−β4−β6−β5 topology and surrounded by two α-helices α1 and α2. In the second part of the thesis, RcsD-ABL is identified as a binding domain for the response regulator RcsB by NMR titration experiments. Such a binding domain for a response regulator has so far only been described for the histidine kinase CheA. In reportergene assays with β-galactosidase and ONPG as substrate it was shown that overexpression of RcsD-ABL in high amounts inhibited binding of RcsB to its target promoter. The β-galactosidase activity was reduced by 80 % with respect to cells carrying no plasmid encoding RcsD-ABL. The mapping of the binding interface was successfully achieved by chemical shift perturbations, a fast mapping protocol and selective labelling. It was shown that the interaction between RcsD-ABL and RcsB takes place via a binding interface comprising mainly the two α-helices of RcsD-ABL and the α-helices α7, α8 and α10 in the effector domain of RcsB. In the third part of the thesis, the interaction of RcsB with RcsD-ABL was related to that with RcsD-HPt. Using NMR titration experiments and ITC measurements, a comparison of the binding constants (Kd) of RcsB interacting either with the isolated RcsD-ABL (2 PM) or the isolated RcsDHPt domain (40 PM) revealed a higher affinity of RcsD-ABL to RcsB. A conjugate of RcsD-ABL-HPt interacting with RcsB decreased the Kd in the one-site fitting mode to 10 PM. However, the two-site fitting mode applied for RcsD-ABL-HPt/RcsB interaction resulted in a Kd (RcsD-ABL) of 2 PM and a Kd (RcsD-HPt) of 8 PM, indicating that RcsD-ABL enhances the binding of RcsD-HPt to RcsB. In the last part of the thesis, it was partly possible together with the data obtained from NMR titration experiments, PRE measurements and a HADDOCK protocol to develop a geometrical model for the interaction of RcsD with RcsB. In this model the receiver domain of RcsB interacts with the RcsD-HPt domain and the RcsB effector domain interacts with the RcsD-ABL domain. These results lead to surprising insights on the regulation of phosphorelays, since normally the effector domain binds to DNA. Here the effector domain is recognized by the newly identified RcsD-ABL domain. Prospectively, further investigations of phosphorylation affects and mutational studies will be of great interest.
Neue Synthesestrategien als Thema des Chemieunterrichts - Experimente zur Kombinatorischen Chemie
(2010)
In der vorliegenden Dissertation wurde die experimentelle Umsetzung der Thematik Kombinatorische Chemie für den Chemieunterricht in der Sekundarstufe II ausgearbeitet. Dazu wurden geeignete Experimente erarbeitet, die einen Einblick in die Kombinatorische Chemie und somit in die neuen Arbeitmethoden der heutigen Chemie schaffen. Mit deren Hilfe gängige Synthesemethoden wie die Split and Combine-Synthese, Teabag-Methode, Spot-Methode und Pin-Methode aufgezeigt werden können und von den Schülern selbst durchgeführt werden. Als ein vorteilhaftes Modell zum Aufzeigen der Arbeitsweise der Kombinatorischen Chemie haben sich Farbstoffe erwiesen, da sie schnell darstellbar sind und keiner aufwendigen Detektion der entstandenen Produkte bedürfen. Als erstes Farbstoffsystem wurden Azofarbstoffe ausgewählt, da sie auch im fakultativen Themenbereich „Farben“ im Chemieunterricht thematisiert werden. Die Übertragung der normalerweise in Lösung hergestellten Azofarbstoffe auf die Festphasenchemie musste zuerst eine geeignete und kostengünstige Festphase gefunden werden. Hierbei haben sich im Handel erhältliche Ionenaustauscher (Harze ohne Linker), die auch zur Wasseraufbereitung verwendet werden, als geeignet herausgestellt. Die erforderlichen Reaktionsbedingungen der Lösungsreaktionen wurden erprobt, optimiert und auf die Festphasenchemie übertragen. Eine Übertragung der Syntheseprinzipien auf drei weitere Farbstoffsysteme wie der Fluoreszenzfarbstoffe der Pyrydin- und Pyrylium-Reihe sowie der Oxidationsfarbstoffe schloß sich an. Nunmehr stehen für den schulischen Einsatz, aber auch für die Ausbildung, einfache Systeme zur Verfügung, die anhand schnell und problemlos durchzuführender Experimente einen Zugang zu unterschiedlichen Methoden der Kombinatorischen Chemie vermitteln können. Dabei bieten die Experimente Anregungen für weitere Arbeiten. Als problematisch stellte sich jedoch der Zugang zu mehrstufigen kombinatorischen Synthesen auf dem Gebiet der Farbstoffe dar. Hier stößt man mit den aus didaktischen Überlegungen sehr einfach gewählten Beispielen an eine Grenze. Ergänzend wurde die Thematik Kombinatorische Chemie mit hochbegabten Schülern der Internatsschule Schloß Hansenberg und interessierten Schülern aus dem Raum Frankfurt, die an dem Projekt Science Camp teilnahmen, erprobt und das Verständnis für diese Thematik mittels eines Fragebogens untersucht. Ein direkter Vergleich beider Schülergruppen konnte aufgrund unterschiedlicher schulischer Bildung nicht vorgenommen werden, weshalb die Auswertung lediglich erste Eindrücke vermittelt. Danach ist das bisher ausgearbeitete Konzept in Lerngruppen mit hochbegabten Schülern gut einsetzbar. Ein Vergleich mit durchschnittlich leistungsstarken Lerngruppen steht noch aus. Eine wünschenswerte Erweiterung und ein Ausbau der Thematik aus Sicht der Schulchemie sollte anorganische Systeme mit einbeziehen und Strategien der Dekonvolution.
Qualität und Qualitätsmanagement in der universitären naturwissenschaftlichen Lehrerfortbildung
(2010)
Vor dem Hintergrund der politischen Entwicklungen in Hessen und der allgemeinen Debatte über Qualität im Bildungsbereich sollte im Lehrerfortbildungszentrum Chemie (lfbz-Chemie) der Universität Frankfurt am Main eine systematische Qualitätsentwicklung etabliert und dieses Vorhaben wissenschatflich begleitet werden. Die wissenschaftliche Arbeit besteht aus drei Säulen: - Eine erste, qualitative Studie sollte Qualitätskriterien und -indikatoren liefern. - In einer Fallstudie am lfbz-Chemie Frankfurt sollte die Einführung von Instrumenten des Qualitätsmanagements aus dem gewerblichen Weiterbildungsbereich beobachtet und bewertet werden. - Eine bundesweite Umfrage unter universitären Fortbildungsanbietern im naturwissenschaftlichen Bereich sollte sowohl die Struktur der anbietenden Institutionen als auch die allgemeine Einstellung der Befragten zum professionellen Qualitätsmanagement (QM) nach einem im gewerblichen Bereich geläufigen Modell (LQW) beleuchten. Die Qualitätsindikatoren und -kriterien fielen sehr spezifisch für die naturwissenschaftliche Lehrerfortbildung aus. Allein die drei folgenden Bereiche erfassen zwei Drittel aller Nennungen: die „Qualität der Teamer bzw. Moderatoren“, die „Fortbildungsgestaltung“ und die „Zielgruppenorientierung (Schulbezug)“. Nimmt man die Anzahl der Indikatoren und Kriterien pro Bereich als Maßstab, fokussieren die Befragten sehr stark auf Anforderungen, die die Professionalität des Personals betreffen. Zur Orientierung für die Qualitätsarbeit am lfbz-Chemie (Fallstudie) wurde das QM-Modell LQW 2 gewählt; als kleinere Instrumente kamen die Tabellen nach dem Vorbild der Balanced Scorecard (BSC) nach Kaplan und Norton sowie die Stärken-Schwächen-Analyse zum Einsatz. Als erstes Ergebnis der Fallstudie kristallisierten sich drei Arbeitsbereiche heraus: Personalorganisation, Evaluation und Innovationen. Diese Arbeitsfelder ergänzten die identifizierten Anforderungen an Fortbildung somit um Bereiche, die eher der organisatorischen Ebene zuzuordnen sind. Es ließ sich in der Fallstudie feststellen, dass ein ganzes Qualitätsmanagementmodell wie LQW 2 nur als Anregung für den einen oder anderen, als wichtig erachteten Bereich dienen konnte, während sich kleinere Instrumente eher als handhabbar erwiesen. Außerdem konnte postuliert werden, dass - ein persönlicheres Eingehen auf die Ziele und Aufgaben der einzelnen Personen im Sinne eines Total Quality Managements vermutlich zu besseren Ergebnissen geführt hätte als die Konzentration auf allgemeine Themen und die Orientierung am eher abstrakten Modell, - Erfolge sehr nachdrücklich kommuniziert werden müssen und - möglichst eine Person aus dem Stammpersonal für den Bereich Qualität verantwortlich sein sollte. Um ergänzend zur Fallstudie zu allgemeineren Schlüssen gelangen zu können, wurde eine Charakterisierung der universitären Fortbildungsanbieter mittels Clusteranalyse mit Daten der bundesweiten Umfrage durchgeführt. Sie zeigte vier Typen von Anbietern auf. Insgesamt fanden sich neben der Gruppe der großen Anbieter, zu denen auch das lfbz-Chemie gehört, nur vergleichsweise kleine Anbieter. Die in der Fallstudie erhaltenen Ergebnisse können somit nur eingeschränkt auf die meisten Anbieter übertragen werden. Insgesamt konnten Stärken und Schwächen der universitären Anbieter identifiziert werden, mit denen sich die universitäre naturwissenschaftliche Lehrerfortbildung von der gewerblichen Weiterbildung abhebt. Stärken lagen vor allem in den besonderen Kompetenzen, die an der Hochschule anzutreffen sind. Problemfelder lagen ausgerechnet hauptsächlich im Personalbereich. Als spezifische Schwächen der universitären Anbieter im Personalbereich kann z. B. die Stellung der Fortbildung als Nebenaufgabe oder der Verlust von Know-how durch die Fluktuation des Personals gelten. Auch allgemein kann ein Modell wie LQW 2 als Anregung für die Qualitätsarbeit in der universitären Lehrerfortbildung dienen, nicht jedoch umfassend umgesetzt werden. Die „kleineren“ Instrumente können dagegen eher als allgemein geeignet betrachtet werden. Während die „großen“ Anbieter durch verbesserte personelle Ressourcen für Aufgaben wie die Qualitätsarbeit unterstützt werden könnten, bietet sich für die „kleinen“ Anbieter eher die Unterstützung durch eine zentrale Stelle der Universität an, um die Fortbildungsanbieter doch noch in ein professionelles Qualitätsmanagement einbinden zu können.
Die Familie der Proteorhodopsine (PR) besteht aus Hunderten von PR Molekülen, die unter Lichteinwirkung Protonen pumpen und somit eine bedeutende Rolle für die Energiegewinnung spielen könnten. Da der pKa Wert des Proton Akzeptors der Schiff‘schen Base (SB) (~7.2) dem pH Wertes der Ozeane (~7.9) ähnelt, wird auch über eine regulatorische Funktion spekuliert. Wird in Erwägung gezogen, dass 24 000 PR Moleküle pro SAR86 Zelle vorhanden sind (Beja et al. 2001) und dass 13% der Bakterien der Meeresoberfläche PR besitzen (Sabehi et al. 2005) liefert dieses Protein wahrscheinlich einen bedeutenden Energiebeitrag neben der Photosynthese. Einblicke in den Mechanismus der Energieumwandlung erfordern sowohl die Untersuchung des Chromophores, welches die Lichtenergie absorbiert als auch der Struktur des Apoproteins, das durch die Generierung eines Protonengradienten zur Energiegewinnung beiträgt. Der Fokus der Doktorarbeit liegt auf dem Chromophor und seiner Umgebung. Eine erste Charakterisierung der SB und des Retinals erfolgt durch UV/VIS und NMR Messungen (Pfleger et al. 2008). Die 13C chemische Verschiebungen von 10,11-13C2 Retinal und die 15N chemische Verschiebung der protonierten SB, gebildet durch K231, zeigt eindeutig, dass im Grundzustand nur eine Konformation der Retinals, all-trans, vorliegt. Die 15N chemische Verschiebung weist außerdem auf eine starke Wechselwirkung der SB mit ihren Gegenionen hin. Desweiteren kann durch Messungen der 15N chemischen Verschiebung der SB bei verschiedenen pH Werten der pKa Wert der SB abgeschätzt werden, auf ~12. Diese Stabilisierung der positiv geladenen protonierten Form der SB weist auf die Existenz eines Wasserclusters hin, das durch die hohe Dielektrizitätskonstante die protonierte Form der SB stabilisieren könnte. Um zu überprüfen, ob Wasser an der SB gebunden ist, wird ein sogenanntes 15N-1H HETCOR Experiment durchgeführt. Der Bereich der 15N chemischen Verschiebung der SB korreliert mit einer Protonenresonanz bei ~5 ppm, welche im Bereich einer Wasserresonanz liegt und die durch D2O austauschbar ist. Dies indiziert eine wichtige Bedeutung von Wasser in der Nähe der SB für die Funktion von PR. Der Einfluss von Mutationen des Histidins H75 und des Aspartats D97 auf die 15N chemische Verschiebung der SB sowie die Auswirkung von Histidinmutationen auf das Chromophor deuten eine direkte Wechselwirkung von Aspartat 97 und der SB an, nicht aber eine direkte Wechselwirkung von H75 und der SB. Neben dem Chromophor ist außerdem das Signalpeptid Gegenstand der Untersuchung der Doktorarbeit. Motivation für die Untersuchung war die Inhomogenität der Proben, die im Zusammenhang mit ungleich prozessiertem PR stehen könnten. Ein zweiter Teil beschäftigt sich mit neuen Konzepten der Datenaufnahme, da das S/R in der Festkörper NMR ein limitierender Faktor darstellt. Diese beinhalten Verstärkung der Relaxation (RELOAD) sowie die Refokussierung von T2 bei Verwendung eines Prozessierungsschrittes, der „half echo alternating transformation“ (HEAT).
Die Etablierung eines HIV-1 Tiermodells ist ein großes Ziel auf dem Weg zur Entwicklung antiretroviraler Medikamente und Impfstoffe gegen HIV-1. Speziesspezifische Restriktionsfaktoren und fehlende Kofaktoren verhindern jedoch die Replikation von HIV-1 in Tieren. Restriktionsfaktoren sind Bestandteil der intrinsischen Immunität und entwickelten sich im Laufe der Evolution als Abwehrmechanismus gegen diverse Pathogene. Dazu gehören die Proteine der APOBEC3-Familie, TRIM5􀀁 und Tetherin, welche die Virusreplikation von HIV-1 an verschiedenen Punkten seines Lebenszyklus inhibieren. Koevolutionär entwickelten Retroviren Antagonisten, um die restriktive Funktion ihrer Wirtsproteine zu umgehen. Um ein replikationskompetentes, simiantropes HIV zu generieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit die Sequenzen vifHIV-1 und vpuHIV-1 gegen vifagm.tan aus SIVagm.tan und vpugsn/den aus den Immundefizienzviren SIVgsn und SIVden substituiert, um die Restriktion gegen A3G und Tetherin in Zellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze zu umgehen. Die TRIM5 vermittelte Restriktion wurde über eine Mutation in der Cyclophilin A Bindedomäne des Kapsids verhindert. Die Analyse der Vifagm.tan Funktion bestätigte den geänderten Tropismus des chimären HIV-1 bezüglich der APOBEC3G vermittelten Restriktion. Denn nach Austausch des vifHIV-1 Gens war das Virus nicht mehr in der Lage, die Aktivität des humanen APOBEC3G zu unterbinden und initiierte stattdessen die Degradation des Analogons aus der Afrikanischen Grünen Meerkatze. Weiterhin konnte die erfolgreiche Klonierung des vpugsn/den Gens in HIV-1 die Aktivität der SHIV-Konstrukte gegen Tetherin der Afrikanischen Grünen Meerkatze und der Rhesusaffen ändern, wohingegen humanes Tetherin nicht mehr abgebaut werden konnte. Trotz der erfolgreichen Aktivität der konstruierten SHIVs gegen die zellulären Restriktionsfaktoren der Afrikanischen Grünen Meerkatze, replizierten die generierten chimären Viren in einer AGM Zelllinie, nicht aber in periphären mononuklearen Blutzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze. Ein Indiz, das für weitere strukturelle Anpassungen der Viren gegenüber ihren Wirten spricht, die zur Bildung der Spezies-Barriere beitragen und Zoonosen erschweren. Im zweiten Teil der Dissertation wurden die Aktivitäten der Proteine der APOBEC3-Familie und VifHIV-1 auf ihre Regulation durch Phosphorylierung untersucht. Proteinphosphorylierungen gehören zu den wichtigsten posttranslationalen Proteinmodifikationen, um diverse Funktionen wie die Enzymaktivität, Proteininteraktionen und die zelluläre Lokalisation zu steuern. Dabei konnte die durch Yang et al. postulierte Phosphorylierung von VifHIV-1 nicht bestätigt werden. Analysen der mutmaßlichen VifHIV-1 Phosphomutanten enthüllten, dass die Funktion von VifHIV-1, die Infektiosität von HIV-1 zu gewährleisten, durch Substitution der mutmaßlichen Phosphoaminosäuren nicht beeinträchtigt wird und ebenso sämtliche Phosphomutanten die Degradation von A3G initiierten, wenn auch in unterschiedlichem Maße. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass A3C entweder in einem phosphorylierten Protein-Komplex vorliegt oder ein phosphoryliertes Protein bindet. Zudem konnte ermittelt werden, dass APOBEC3A als einziges Protein der APOBEC3-Familie nach TPA- und cAMP-Stimulation phosphoryliert wird. In vitro Kinase Studien konnten zeigen, dass die Phosphorylierung unter anderem durch ERK2 erfolgt. Es konnte jedoch kein Zusammenhang zwischen der Phosphorylierung von A3A und dessen zellulärer Lokalisation, Aktivität gegen HIV-1 als auch gegen die Retrotranspositionselemente IAP und LINE-1 hergestellt werden. Dies lässt den Schluss zu, dass die Phosphorylierung die untersuchten Aktivitäten von APOBEC3A nicht beeinflusst oder APOBEC3A eine bisher unbekannte durch Phosphorylierung regulierte Funktion besitzt.
In mitochondrial respiration, the soluble protein cytochrome c accepts an electron from the membrane bound cytochrome bc1. The interaction between cytochrome bc1 and cytochrome c is highly transient in nature, enabling turnover numbers greater than 160 s-1. Yeast cytochrome bc1 has been successfully crystallised with bound cytochrome c with the help of an antibody fragment (Lange and Hunte 2002; Solmaz and Hunte 2008). In all crystal structures of the complex, the homodimeric cytochrome bc1 binds only one cytochrome c, with the binding site located on subunit cytochrome c1. Univalent cytochrome c binding is correlated with conformational changes of the Rieske protein head domain and subunit QCR6p. The interface of the complex is small. The haem moieties are centrally located in a mainly non-polar contact site that includes a cation–! interaction and is surrounded by complementary charged residues. The crystal structure is in agreement with the general architecture of the interfaces of transient redox complexes and also reveals several interesting features unique to the cytochrome bc1. On the basis of the crystal structures, an extensive thermodynamic and kinetic characterisation of the interaction was carried out in this work to challenge the static snapshot of the bound proteins in the crystal structure as the relevant physiological electron transfer. The thermodynamic parameters of the interaction between the redox partners were determined using isothermal titration calorimetry (ITC). The association constant for cytochrome bc1 and cytochrome c in oxidised state under physiological ionic strength of 120 mM at 25 °C, was determined to be 5 " 103 M-1 by direct ITC titration. So, the partners interact with an affinity of 200 #M. In spite of the low affinity the complex has a life time ($ = 1/koff) of 5 #second, sufficiently long to enable the theoretically calculated electron transfer rates of 1.0 " 106 to 2.6 " 107 s%1 with a lifetime ($ = 1/rate) of 1-0.04 μseconds and experimentally determined rate of 7.7 " 104 s%1 with a lifetime of 13 μseconds. The low affinity makes it difficult to ascertain the stoichiometry of binding. The enthalpy of the interaction is endothermic, which is consistent with the nature of an interface where hydrophobic interactions are dominant. The enthalpy and entropy is 3.6 kJmol-1 and 83 kJmol-1K-1, respectively. The importance of key interface residues was also investigated. The role of the interface residue G89 of cytochrome c which might have a role in the dissociation of the complex has been probed by site-directed mutagenesis. The interface contains a cation-! interaction between F230 of cytochrome bc1 and R19 of cytochrome c, which is thought to provide the specificity to the interaction between the otherwise promiscuous partners. To analyse the role of this interaction pair in electron transfer, F230L and F230W mutants were used to measure direct electron transfer rates by flash photolysis and steady state kinetics. The findings indicate that another ! system can work as functional substitution of F230, while deleting the ! system has a deleterious effect on the complex formation. The inability of F230L to achieve the transient and steady state turnover rates as wild type protein indicates a scenario where the variant achieves an altered bound state with inefficient electron transfer pathways and higher edge-to-edge distance. The role of supernumerary subunit QCR6p in complex formation was investigated by steady state kinetics measurements. Subunit QCR6p does not interact directly with cytochrome c but is positioned in such a way that it could electrostatically steer cytochrome c in a reactive ensemble. The highly acidic and disordered N-terminus of QCR6p could interact with a patch of conserved lysine residues on cytochrome c. The role of subunit QCR6p has been assessed using QCR6p deleted cytochrome bc1 and a lysine variant of cytochrome c. The results show that QCR6p not only affects the kinetics of the interaction but is also important for the stability of cytochrome bc1. The kinetic and thermodynamic data obtained during this study provide evidence for the functional importance of non-catalytic cytochrome bc1 subunit QCR6p, show that the entropy driven interaction is indeed of low affinity and highly transient in nature and indicate that the interface is well suited to ensure the high turnover of the electron transfer chain where cytochrome c interacts with multiple partners using overlapping interfaces. The suggested role of the cation-! interaction as a highly specific interaction has been validated.
Die Translokation von gelösten Stoffen über zelluläre Membranen ist ein essentieller biologischer Prozess, der durch eine Vielfalt an integralen Membranproteinen vermittelt wird. Diese sind in den selektiven Austausch verschiedenster Stoffe bzw. Teilchen involviert und ermöglichen somit die Kommunikation zwischen den einzelnen Zellkompartimenten untereinander bzw. mit der extrazellulären Umgebung. Eine der größten Familien paraloger Proteine, die den vektoriellen Transport von Substanzen über Zellmembranen katalysieren, stellen die ATP‐binding cassette (ABC)‐Transporter dar. Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen bisher untersuchten Organismen von Prokaryoten bis hin zu höheren Eukaryoten vertreten und übernehmen essentielle Funktionen in einer Vielzahl von zellulären Abläufen. ABC‐Transporter zeichnen sich durch eine breite Substratdiversität aus, d.h. sie energetisieren unter ATP‐Verbrauch die Translokation zahlreicher, strukturell und chemisch unterschiedlicher Substanzen wie Zucker, Lipide, Ionen, Aminosäuren, Proteine oder auch zelltoxische Stoffe. In Bakterien können sie sowohl als Importproteine fungieren, welche hauptsächlich die Aufnahme von Nährstoffen vermitteln, als auch als Exportproteine, deren Hauptaufgabe es ist, zelltoxische Substanzen aus der Zelle heraus zu schleusen. Eukaryotische ABC‐Transporter sind sowohl in der Plasmamembran als auch in den intrazellulären Membranen zu finden – beispielsweise in denen des Endoplasmatischen Retikulums, des Golgi Apparats, der Lysosomen, der Peroxisomen und der Mitochondrien. Sie fungieren als Exportproteine und sind z.B. an der Ionen‐Homöostase, der Antigenprozessierung, der Insulinfreisetzung oder am Cholesterol‐ und Lipidtransport beteiligt. ...
The analysis of biomolecular macrocomplexes requires certain preconditions to be fulfilled. The preparation of biomolecular samples usually results in low yields. Due to this constraint of low availability any method should provide a sufficient sensitivity to cope with typical sample amounts. Biomolecules also often show a reduced stability, i.e. a propensity for fragmentation upon ionisation, which requires reasonable soft methods for the investigation. Furthermore macromolecular complexes usually are composed by means of non-covalent interactions presenting additional demands on the softness. This holds true for specific complexes like protein-ligand or DNA double strand binding. For the formation of non-covalent, specific complexes the biomolecules’ native structure and environment are a basic prerequisite and hence crucial. Therefore it is desirable during analysis to keep the biomolecules in a native environment to preserve their structure and weak interactions. One suitable method for analysing biomolecules is mass spectrometry. Mass spectrometry is capable of high throughput screening as well as determining masses with high accuracy and high sensitivity. Especially since the availability of MALDI-MS and ESI-MS mass spectrometry evolved to a versatile tool to investigate biomolecular complexes. Both, MALDI- and ESI-MS are sufficiently soft methods to observe fragile biomolecules. Yet both methods have their advantages and disadvantages. During the recent years an alternative mass spectrometric approach has been developed in our group, termed LILBID-MS (Laser Induced Liquid Bead Ionisation/Desorption). In LILBID microdroplets of aqueous solution containing buffer, salt and further additives among the analyte molecules are injected into vacuum and irradiated one-by-one by mid-IR laser pulses. The absorption of the energy by the water leads to a rapid ablation of the preformed analyte ions. LILBID is highly tolerant for the addition of salts and detergents allowing to study biomolecular complexes in a native environment. As LILBID-MS is soft enough to avoid fragmentation, specific non-covalent complexes can be analysed directly from their native environment by this method. In addition dissociation can be induced on demand by increasing the laser intensity which allows for the study of subunit compositions. A further prominent property of LILBID is the possibility to study hydrophobic membrane proteins due to the tolerated use of detergents. During the course of this work, several instrumental improvements mostly concerning ion focussing and beam steering were introduced. Together with refinements of different modes of measurement the result is a significantly improved signal-to-noise ratio as well as a further improvement in sensitivity. In addition the accessible m/z range for a given flight time has been vastly increased. The new possibilities that LILBID now offers for the study of biomolecular complexes were investigated. The ability to detect specific binding in LILBID-MS was investigated by means of nucleic acids and their interaction with proteins. It could be shown that the stability of a 16bp dsDNA corresponds to that in solution phase regarding the dependency on concentration and type of the salts used. In addition a competitive experiment with the well-known transcription factor p50 was used to demonstrate the detection of sequence-specific binding with LILBID. The improved sensitivity allowed to detect single stranded DNA at nanomolar concentrations and even the 2686bp plasmid pUC19 could be easily detected without fragmentation using a concentration of only 80nM. In case of the transcription factor p63 the mass spectrometric analysis could help to identify a new model of activation and inhibition. For the first time known quarternary structures of membrane proteins like the light-driven proton pump bacteriorhodopsin and the potassium channel KcsA could be detected with mass spectrometry. For the light-driven proton pump proteorhodopsin the type and the concentration of the used detergents significantly influenced the stability of this protein as well as the preferred quarternary structure.
Die Hämophile ist eine X-chromosomal vererbbare Blutungserkrankung, die durch einen funktionellen Mangel der Gerinnungsaktoren Faktor VIII oder Faktor IX im Fall der Hämo-philie A oder Hämophilie B hervorgerufen wird. Der niedrige therapeutische Schwellenwert in der Behandlung der Hämophilie (Faktorenspiegel >1%) macht diese Krankheit zu einem idealen Zielobjekt in der Gentherapie. Eine schwerwiegende Komplikation in der Behandlung der Hämophilen besteht in der Entwicklung von neutralisierenden Antikörpern gegen das the-rapeutisch substituierte Protein. Akute Blutungen in solchen Hemmkörper-Patienten werden derzeit durch FVIII- und FIX-unabhängigen Bypass-Agenzien kontrolliert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nach einer erfolgten Optimierung eines nicht-viralen Ansatzes zur Transgenex-pression von FIX in der Leber der Maus dieses Gentransfersystem dazu verwendet, um eine Entwicklung von neuen, auf FIX basierenden, FVIII-Bypass-Strategien in vivo zu ermöglichen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Plasmidvektoren und Vektorrückgrat-freie Minicircle-Konstrukte auf ihre Effizienz zur Expression des FIX-Transgens nach hydrodyna-misch basiertem Gentransfer in die Leber der Maus untersucht. Der Gentransfer der Mini-circle führte hierbei zu einer höheren Transgenexpression und einem geringeren Abfall der FIX-Antigen-Spiegel über die Zeit. Darüber hinaus war das FIX-Protein selbst bei den höchs-ten Expressionsleveln (700% des physiologischen Levels) völlig funktional aktiv. Der Abfall der Transgenexpression über die Zeit konnte größtenteils auf den Verlust des Vektors zurück-geführt werden. Ein signifikanter Silencing-Effekt konnte nur in den Plasmidvektor- und nicht in den Minicircle-behandelten Gruppen beobachtet werden. Diesbezüglich wurde nach 100 Tagen Persistenz der nicht-viralen Vektoren in der Mausleber eine signifikante Akkumulation an CpG-Methylierungen in regulatorischen Sequenzen des hAAT-Promoters im Plasmidvek-tor gegenüber den Minicirclen ermittelt. Außerdem konnte ebenfalls eine Demethylierung von Cytosin-Nukleotiden in bakteriellen Dcm-Sequenzmotiven über die Zeit beobachtet werden, die eine signifikant höhere Rate für das Minicircle-Konstrukt im hAAT-Promoter aufwies. Die erprobten nicht-viralen Vektoren versprechen somit eine ausreichende Effizienz, um eine Translation in den Menschen, z. B. über eine spezifische Behandlung von Lebersegmenten, möglich erscheinen zu lassen. Die Methylierungsanalyse von Promoterelementen auf Sequenzebene erbrachte zudem konkrete Ansätze zum Design von nicht-viralen Vektoren mit einer noch stabileren FIX-Expression. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mit Hilfe eines Screening-Systems zur Aktivitätstestung von rekombinant exprimierten FIX-Varianten die Mutation K265T als die entscheidende Sub-stitution im 99-loop identifiziert, welche die FVIII-unabhängige Aktivität im FIX-Protein unter physiologischen Bedingungen begünstigt. Das Wildtyp- IX-Protein braucht hingegen FVIII um eine 106-fache Steigerung seiner proteolytischen Aktivität zu erreichen. Durch Kombination der Mutation K265T mit V181I und I383V konnte diese spezifische FVIII-Bypass-Aktivität in der resultierenden FIX-Variante (ITV) auf 15,6% (verglichen zu FIX in Anwesenheit von FVIII) gesteigert werden. Durch Inkubation der FIX-Varianten mit Plasma-proben aus Hemmkörper-Patienten konnte die Funktionalität der FIX-Varianten selbst in der Anwesenheit von inhibitorischen FVIII-Antikörpern demonstriert werden. Durch Untersu-chungen des Aktivierungszustands von FIX konnte zudem gezeigt werden, dass die im Rah-men dieser Arbeit generierten FIX-Varianten nicht voraktiviert sind und die messbare FVIII-Bypass-Aktivität FIX spezifisch ist. Darüber hinaus konnte hier erstmals eine hämostatische Effizienz von FIX-Varianten mit einer FVIII-unabhängigen Aktivität in einem relevanten Krankheitsmodel demonstriert werden. Diesbezüglich resultierte der nicht-virale Gentransfer der FIX-Varianten in FVIII-K.O.-Mäusen in einer dosisabhängigen Verkürzung der aPTT-basierenden Gerinnungszeit und in einer Reduktion des Blutverlustes im tail-clip-Assay in An- oder Abwesenheit von inhibitorischen FVIII-Antikörpern. Desweiteren konnte zudem mittels Vakzinierung von FIX-WT-tolerierten Mäusen mit den FIX-Varianten demonstriert werden, dass die hier eingeführten Mutationen keine hoch-immunogenen Epitope des FIX-Proteins betreffen. Schließlich konnte die Expression der FIX-Varianten in hämostatisch normalen Mäusen nicht mit der Entstehung von thromboembolischen Ereignissen selbst in einem intakten Gerinnungssystem assoziiert werden. Die hier beschriebenen FIX-Varianten könnten somit einen sicheren und effizienten Therapieansatz zur Behandlung der Hämophilie A mit inhibitorischen Antikörpern darstellen und hinsichtlich der Halbwertszeit und des möglichen throboembolischen Risikos zu einer wesentlichen Verbesserung der bereits verfügbaren Bypass-Strategien beitragen.
Um die Bedeutung bestimmter Neurone oder Klassen von Neuronen innerhalb von Nervensystemen zu untersuchen, sind Methoden, die eine Manipulation der Aktivität der Neurone in vivo erlauben, besonders nützlich. Die bisher zur Verfügung stehenden Methoden haben jedoch Einschränkungen in beispielsweise der Zelltypspezifität, der zeitlichen Präzision, der Reversibilität oder der Anwendbarkeit in frei beweglichen Tieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden optogenetische, d.h. auf der Expression lichtempfindlicher Proteine basierende Methoden entwickelt, um eine präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone durch Licht zu ermöglichen. Die Techniken wurden daraufhin zur Untersuchung z.B. der Neurotransmission sowie der Funktion kleiner Netzwerke im Nervensystem des Nematoden Caenorhabditis elegans verwendet. Die zelltypspezifische heterologe Expression des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii ermöglichte es, Muskel- oder Nervenzellen der Nematoden durch blaue Beleuchtung innerhalb weniger Millisekunden zu depolarisieren. Dadurch ließen sich spezifische Verhaltensweisen in frei beweglichen Tieren auslösen. Dieser Ansatz wird in Zukunft die Untersuchung der Bedeutung einzelner Neurone innerhalb ihrer Schaltkreise deutlich erleichtern. So konnte hier gezeigt werden, dass die Photostimulation des propriorezeptiven Neurons DVA eine signifikante Erhöhung der mittleren Körperbiegungswinkel während der sinusförmigen Fortbewegung der Tiere zur Folge hatte. Außerdem wurde versucht, die Anwendbarkeit von ChR2 durch die gezielte Manipulation der subzellulären Lokalisation mittels Fusion mit speziellen Peptiden oder Proteinen zu erhöhen. Des Weiteren wurde eine zur Verwendung von ChR2 analoge Methode zur Hemmung von Neuronen durch Licht entwickelt. Hierfür wurde die lichtgetriebene Cl--Pumpe Halorhodopsin aus Natronomonas pharaonis (NpHR) zelltypspezifisch in C. elegans exprimiert. Durch Photoaktivierung von NpHR mit gelbem Licht war es möglich, Muskelzellen und cholinerge Neurone zu hyperpolarisieren und somit in ihrer Aktivität zu hemmen. Dies führte in frei beweglichen Tieren zu einer augenblicklichen Paralyse verbunden mit einer drastischen Reduktion der Schwimmfrequenz und einer Erhöhung der Körperlänge. Die Aktionsspektren von ChR2 und NpHR sind unterschiedlich genug, um eine unabhängige Photoaktivierung der beiden Proteine mit blauem und gelbem Licht zu ermöglichen. Dadurch konnte die Aktivität von Muskelzellen und cholinergen Neuronen nach Koexpression der beiden Proteine bidirektional kontrolliert werden. Es wurden somit Methoden entwickelt, die in vivo eine zeitlich äußerst präzise Manipulation des Membranpotentials definierter Neurone mit Licht verschiedener Wellenlängen ermöglichen. Die Beobachtung der dadurch induzierten Verhaltensänderungen erlaubt es, zuverlässige Aussagen über die Bedeutung einer Nervenzelle für die Ausprägung eines Verhaltens zu treffen und wird die Erforschung der Nervensysteme von C. elegans und anderen Modellorganismen deutlich vereinfachen. Schließlich wurden in dieser Arbeit optogenetische Methoden zur Untersuchung der synaptischen Übertragung an neuromuskulären Synapsen (neuromuscular junctions, NMJs) von C. elegans entwickelt. Hierfür wurde ChR2 in GABAergen oder cholinergen Neuronen exprimiert, um eine lichtgesteuerte Freisetzung des inhibitorischen Neurotransmitters GABA bzw. des exzitatorischen Neurotransmitters Acetylcholin (ACh) an NMJs zu erreichen. Die Methode wurde OptIoN getauft, ein Akronym für „Optogenetic Investigation of Neurotransmission“, also „optogenetische Untersuchung der Neurotransmission“. Die GABA-Freisetzung hatte ähnlich wie die NpHR-vermittelte Photoinhibition von Muskelzellen eine Reduktion der Schwimmfrequenz und Erhöhung der Körperlänge zur Folge. Die Ausschüttung von ACh verursachte hingegen starke Muskelkontraktionen verbunden mit einer Reduktion der Körperlänge. Die Änderungen der Körperlänge waren bei Mutanten mit verschiedenen Neurotransmissionsdefekten signifikant unterschiedlich im Vergleich zum Wildtyp. Außerdem kam es während längerer Beleuchtungsphasen in Mutanten mit defektem Recycling der synaptischen Vesikel (SV) zu einer verstärkten Abnahme der lichtinduzierten Effekte. OptIoN ermöglicht es dadurch erstmals, die Mechanismen des SV-Recyclings in C. elegans Verhaltensexperimenten zu untersuchen. In elektrophysiologischen Messungen ließen sich durch kurze Lichtpulse wiederholt und mit hoher Frequenz Neurotransmitter-spezifische postsynaptische Ströme evozieren. Diese Ströme waren in Mutanten mit gestörter SVExozytose reduziert und gingen bei wiederholter Stimulation in Mutanten mit defektem SVRecycling schneller zurück. Die Verwendung von OptIoN erleichtert die elektrophysiologische Untersuchung neuronaler Defekte und stellt erstmals eine Möglichkeit dar, Vorgänge der neuronalen Plastizität in dem genetischen Modellsystem C. elegans zu untersuchen. Das Potential von OptIoN zeigte sich unter anderem auch in der Identifizierung eines neuen, über metabotrope GABA-Rezeptoruntereinheiten vermittelten Mechanismus zur heterosynaptischen Hemmung cholinerger Neurone.
Der L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiporter CaiT ist ein Mitglied der Betain/Carnitin/Cholin Transporter (BCCT) Familie. Sekundärtransporter der BCCT Familie transportieren Substrate, die eine positiv-geladene quartäre Ammoniumgruppe besitzen. CaiT besteht aus 504 Amiosäuren und besitzt ein moleculares Gewicht von etwa 56 kDa. In Enterobakterien wie Escherichia coli, Proteus mirabilis und Salmonella typhimurium wird die Expression des caiTABCDE Operons unter anaeroben Bedingungen induziert. Unter diesen Bedinungen ist CaiT der Haupttransporter des Betain-Derivates L-Carnitin. In Enterobakterien wird L-Carnitin unter anaeroben Bedingungen aufgenommen und dehydratisiert wobei Crotonobetain ensteht. Crotonobetain wird anschließend zum Endprodukt gamma-Butyrobetain reduziert. Gamma-Butyrobetain ist das Gegensubstrat, das aus der Zelle hinaustransportiert wird, wenn L-Carnitin in die Zelle aufgenommen wird. Der Austauschmechanismus von LCarnitin gegen gamma-Butyrobetain geschieht ohne das Vorhandensein eines elektrochemischen Gradients, d.h. CaiT ist sowohl H+- als auch Na+-unabhängig. Ein Ziel dieser Arbeit war es die drei-dimensionale (3D) Struktur von CaiT mittels Röntgenstrukturanalyse zu lösen. Weiterhin sollten mit Hilfe der 3D-Struktur und funktionellen Studien detailiertere Erkenntnisse über den kationenunabhängigen Antiportmechanismus von CaiT ermittelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die 3D-Röntgenkristallstrukturen von drei CaiT-Homologen der Enterobakterien P. mirabilis (PmCaiT), E. coli (EcCaiT) und S. typhimurium (StCaiT) mittels molekularem Ersatz (engl.: molecular replacement, MR) mit einem Alanin-Model des CaiT verwandten Na+/Glycinbetain Symporters BetP gelöst. PmCaiT konnte mit einer Auflösung von 2.3 Å gelöst werden. Das Protein kristallisierte in der Kristallraumgruppe H3, mit drei Molekülen in der asymmetrischen Einheit (engl.: asymmetric unit, AU). Die drei PmCaiT-Moleküle ordneten sich innerhalb der AU um eine kristallographische dreifach Symmetrieachse an. EcCaiT wurde mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT bei einer Auflösung von 3.5 Å gelöst. EcCaiT kristallisierte in der Kristallraumgruppe P32, ebenfalls mit drei Molekülen in der AU, jedoch ohne kristallographische Symmetry. Während der Verfeinerung des EcCaiT-Models wurde eine strenge dreifache nichtkristallographische Symmetry (engl.: non-crystallographic symmetry, NCS) angewandt. StCaiT, das ebenfalls mittels MR mit einem Alanin-Model von PmCaiT, aber bei einer Auflösung von 4.0 Å gelöst wurde, kristallisierte in der Kristallraumgruppe P65, ebenfalls mit drei StCaiT-Molekülen in der AU, ohne kristallographische Symmetry. Bei der Verfeinerung des StCaiT-Modells wurde wie bei EcCaiT eine strenge NCS angewandt. Da die Auflösung von 4.0 Å bei StCaiT zu niedrig ist um detailierte moleculare Erkenntnisse zu gewinnen, wurden Protein- sowie Substratinteraktionen nur an den Strukturen von PmCaiT und EcCaiT analysiert. Alle drei CaiT-Homologe weisen jedoch einen ähnlichen strukturellen Aufbau auf. In der Röntgenkristallstruktur bildet CaiT ein symmetrisches Trimer, das über ionische und polare Wechselwirkungen zwischen den Protomeren stabilisiert wird. Der trimere Oligomerisierungszustand von CaiT in Detergenzlösung sowie in zweidimensionalen Lipidmembrankristallen wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt. Jedes der drei CaiT-Protomere besteht aus zwölf Transmembranhelices (TMH), die N- und C-terminalen Domänen des Proteins befinden sich auf der cytoplasmatischen Seite. Zehn der TMH bilden zwei invertierte Wiederholungseinheiten aus jeweils fünf TMH. Die erste Einheit besteht aus den TMH 3 – 7, die invertierte zweite Einheit besteht aus den TMH 8 – 12. Beide Wiederholungseinheiten sind strukturell nahezu identisch und lassen sich fast vollständig übereinanderlegen, jedoch weisen die Aminosäuren der beiden Einheiten keine signifikante Sequenzidentität auf. Die ersten beiden Helices der Wiederholungseinheiten, die TMH 3 – 4 und die TMH 8 – 9, bilden ein antiparalleles vier-Helix-Bündel, in dem in CaiT zwei Substratbindestellen lokalisiert sind. Eine derartige Transporterarchitektur wurde erstmals in der Struktur des Na+/Alanin Symporters LeuTAa des thermophilen Bakteriums Aquifex aeolicus gezeigt. Bislang wurden, inklusive CaiT, sieben Sekundärtransporterstrukturen gelöst, die diese LeuT-Transporterarchitektur aufweisen. Ungewöhnlich dabei ist, dass diese sieben Sekundärtransporter fünf verschiedenen Transporterfamilien angehören und eine Verwandschaft auf Basis der Aminosäuren nicht zu finden ist. Da jedoch die tertiäre Struktur dieser Tansporter konserviert ist, kann davon ausgegangen werden, dass sie alle von einem Urprotein entstanden sind, welches zunächst aus fünf TMH bestanden haben muss. Im Laufe der Evolution hat sich das Urgen des Urproteins zunächst dupliziert und die weitere Evolution hat zwar die Aminosäuresequenz verändert und den Umweltbedingungen angepasst, jedoch ist die tertiäre Struktur erhalten geblieben. Da sich die tertiäre Struktur der sieben Sekundärtransporter so stark ähnelt, ist zu vermuten, dass auch der Transportmechanismus ähnlich, jedoch nicht identisch ist. Nach dem strukturellen Aufbau der Transporter, der Lage der Substratbindestellen in den jeweiligen Transportern und der Tatsache, dass es sich bei diesen Proteinen um Membranproteine handelt, wurde ein Transportmechanismus aufgestellt, in dem die Bindestelle des zu transportierende Substrats alternierend zu beiden Seiten der Membran zugänglich ist, ohne jedoch jemals den Substratweg innerhalb des Proteins vollständig zu öffnen. Dieser Mechanismus wurde als “alternating access mechanism” beschrieben. Anhand der unterschiedlichen Zustände, in denen einige der Transporter kristallisierten, kann abgeleitet werden, welche Konformationsänderungen erforderlich sind um das Substrat von einer Seiter der Membran auf die andere zu transportieren. Bisher kristallisierten einzelne der sechs Transporter in der nach außen gerichteten offenen Form, der nach außen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht mehr zugänglich ist, in einer Form, die keine Öffnungspräferenz der Substratbindestelle zu einer Seite der Membran hat und in der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle jedoch nicht geöffnet ist. CaiT kristallisierte in der noch fehlenden Konformation, der nach innen gerichteten Form, in der die Substratbindestelle zugänglich ist. Mit dieser noch fehlenend Konformation kann der Transportzyklus des “alternating access mechanism” vollständig beschrieben werden. Alle drei CaiT-Homologe kristallisierten in der nach innen gerichteten, offenen Konformation. Im Gegensatz zur EcCaiT-Struktur kristallisierte PmCaiT in der substratungebundenen Form. In der StCaiT-Struktur konnte aufgrund der niedrigen Auflösung kein Substrat nachgewiesen werden. In der EcCaiT-Struktur sind zwei gamma-Butyrobetain-Moleküle gebunden. Das erste Molekül wurde in der zentralen Substratbindestelle, der sogenannten Tryptophan-Box bestehend aus vier Tryptophanen, im Zentrum des Protein lokalisiert. Das zweite gamma-Butyrobetain-Molekül wurde in einer Vertiefung an der extrazellulären Proteinoberfläche gefunden. Beide Substrate werden hauptsächlich über Kation-Pi-Interaktionen zwischen der positiv geladenen quatären Ammoniumgruppe des Substrats und des Pi-Elektronensystems der Tryptophane in den jeweiligen Bindestellen gebunden. Eine besondere Eigenschaft von CaiT ist der H+- bzw. Na+-unabhängige Substrattransport. Die CaiT-Struktur erklärt warum kein zusätzliches Kation benötigt wird um Substrat zu binden oder zu transportieren. In der EcCaiT-Struktur ist eine wichtige polare nicht-bindende Interaktion zwischen der Carboxylgruppe des gamma-Butyrobetains und dem Schwefelatom eines Methionins in der zentrale Bindestelle zu erkennen. Dieses Methionin ist konserviert in den prokaryotischen CaiTs und in den Na+-unabhängigen eukaryotischen L-Carnitin Transportern (OCTN), jedoch ist es nicht konserviert im Na+-abhängigen verwandten Glycinbetain Transporter BetP. In BetP ist diese Position des Methionins durch ein Valin ersetzt. Die Mutation des Methionins in CaiT zu Valin ermöglicht zwar immernoch die H+- bzw. Na+-unabhängige Bindung des Substrates durch die Tryptophan-Box, jedoch ist der Substrattransport nahezu vollständig zerstört. Eine derart wichtige Substratkoordinierende Funktion des Schwefelatoms eines Methionins wurde bisher nicht beschrieben. Eine weitere Stelle, die in H+- bzw. Na+-abhängigen Transporter mit H+ bzw. Na+ besetzt ist, ist in CaiT von einem positiv geladenen Arginin eingenommen. Eine positive Ladung an dieser Stelle stabilisiert den Bereich im Protein in der Nähe der zentralen Substratbindestelle. Die Mutation des Arginins zu Glutamat in CaiT erzielt eine vollständige Inaktivierung des Substrattansports. Durch Zugabe von Na+ im Transportansatz kann die Substrattransportaktivität der Glutamat-Mutante jedoch teilweise zurückerlangt werden. Diese eben beschriebenen Aminosäurereste in den beiden Stellen des Proteins erklären die Kationenunabhängigkeit von CaiT. Die Aktivierung des Antiportmechanismus in CaiT wurde mit Hilfe von Bindungsstudien an rekonstituiertem Protein ermittelt. Diese Messungen ergaben für das Wildtypprotein ein sigmoidales Substratbindungsverhalten, was auf ein positiv-kooperatives Bindungsverhalten hindeutet. Die beiden Substratbindestellen im Protein sowie die beiden unterschiedlichen Substrate, L-Carnitin und gamma-Butyrobetain, lassen auf einen heterotropen positiv-kooperativen Bindungs- und einen allosterisch regulierten Transportmechanismus schließen. Bei diesem Mechanismus erhöht die Bindung eines Substrats in der regulatorischen Bindestelle durch induzierte Konformationsänderungen die Affinität eines anderen Substrats in einer weiteren Substratbindestelle. Die regulatorische Bindestelle in CaiT befindet sich an der extrazellulären Proteinoberfläche. Eine Schwächung der Substrataffinität in dieser Bindestelle durch Einführung einer Mutation, verstärkt das sigmoidale Substratbindungsverhalten und hat einen negativen Einfluss auf den Substrattransport. Durch die in dieser Arbeit gelösten 3D-Röntgenkristallstrukturen der zwei CaiT-Homologen, PmCaiT und EcCaiT, sowie den durchgeführten funktionellen Studien sowohl an Wildtypprotein wie auch an Mutanten konnte ein L-Carnitin/gamma-Butyrobetain Antiport-Mechanismus für CaiT vorzuschlagen werden.
Die Verfügbarkeit synthetischer Oligonukleotide hat der Entwicklung einer Vielzahl molekularbiologischer, biochemischer und medizinischer Anwendungen den Weg geebnet. Und sind viele diese Anwendungen für sich genommen schon hochinteressant, so eröffnet die Kombination mehrerer Methoden oft noch ganz neue Möglichkeiten. In der vorliegenden Doktorarbeit ist es gelungen, die Technik der photolabilen Schützung auf die Anwendungen von siRNAs und molecular beacons zu übertragen und diesen damit die Option der orts- und zeitaufgelösten Aktivierung zu ermöglichen. Durch die Einführung eines Nukleotids mit 2-(2-nitrophenyl)propyl-geschützter Nukleobase in eine siRNA, konnte der katalytische Schritt der RNA-Interferenz, die mRNA-Spaltung, unterbunden werden. Hierzu wurde das photolabil modifizierte Nukleotid so in der siRNA positioniert, dass es gegenüber der mRNA-Schnittstelle bzw. in unmittelbarerer Nachbarschaft zu dieser lag. Dabei war das modifizierte Nukleotid selbst kein Ribonukleotid sondern ein Desoxynukleotid. Zuvor konnte gezeigt werden, dass die Einführung einzelner Desoxynukleotide in eine siRNA keinerlei Einfluss auf deren Aktivität hat. Als Modellsystem diente der RFP/eGFP-Reportergenassay, wobei die Plasmide mit der siRNA in die verwendeten HeLa-Zellen kotransfiziert wurden. Die verwendete siRNA regulierte dabei die eGFP-mRNA, die gemessene Fluoreszenz wurde auf die RFP-Fluoreszenz normiert. In der Studie gelang es, ein sauberes „An/Aus-Verhalten“ zu erzielen, das heißt, die modifizierte siRNA zeigte zunächst keinerlei Einfluss auf die eGFP-mRNA. Bestrahlte man diese siRNA jedoch für drei Minuten bei 366 nm, erzielte man eine Unterdrückung der eGFP-Expression, die der einer unmodifizierten siRNA entsprach. Dies funktionierte für vor der Transfektion bestrahlte siRNAs ebenso, wie für solche, die erst nach der Transfektion in der Zelle entschützt wurden. Vereinfachte Darstellung der lichtaktivierbaren RNA Interferenz. Links: solange die Photoschutzgruppe (rot) auf dem Führungsstrang sitzt wird das Substrat des RISC nicht geschnitten. Rechts: Bestrahlung mit UV-Licht entfernt die Photoschutzgruppe und aktiviert die RNAi-Maschinerie. Ein bis jetzt ungeklärtes und noch näher zu untersuchendes Phänomen ist die Stabilität der Modifikationen in der Zelle. Aus bisher nicht eindeutig zu benennender Ursache fand nach einer definierten Zeit eine Aktivierung der ausgeschalteten siRNA statt, ohne dass diese bestrahlt wurde. Versuche mit photolabil modifizierten Nukleotiden an anderen Positionen innerhalb der siRNA, sowie eine Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Studie mit fluoreszenzmarkierter siRNA und fluoreszenzmarkiertem RISC erlaubten es Rückschlüsse auf den Schritt der RNAi zu ziehen, der durch die Einführung der Basenmodifikation blockiert wird. Offenbar handelt es sich tatsächlich um den katalytischen Schritt der mRNA-Spaltung, ein Einbau der modifizierten siRNA in den RISC findet statt. Zudem zeigte die erfolgreiche Inaktivierung der für die FCS-Studie genutzten anti-TK siRNA, dass der Ansatz, die Modifikation im Bereich der Schnittstelle einzubauen, von der anti-eGFP siRNA auf andere siRNAs übertragbar ist. Im zweiten erfolgreichen Projekt gelang es, molecular beacons durch Einführung zahlreicher photolabiler Basenmodifikationen lichtaktivierbar zu machen. Hierzu wurde ein bereits beschriebener GAPDH-molecular beacon verwendet. Modifiziert man die Schleife dieses molecular beacon mit sieben photolabilen Basenschutzgruppen (NPP und NPE) so gelingt es die Bindung desselben an seine komplementäre Ziel-RNA komplett zu unterbinden, während ein GAPDH-beacon mit drei oder fünf Modifikationen noch in verringertem Maße bindungsfähig ist. Dieses Verhalten wurde sowohl mittels einfachen Auslesens der Fluoreszenzintensität, als auch anhand eines PA-Geles belegt. Eine große Herausforderung bei diesem Projekt stellte die Aufreinigung des hochmodifizierten molecular beacon dar, der neben Fluorophor und Quencher auch zahlreiche Photoschutzgruppen trägt. Diese gelang schließlich durch den Einsatz einer extra densely bond-RP-HPLC-Säule und wiederholter HPL-Chromatographie. Ebenfalls konnte der große Vorteil eines lichtaktivierbaren molecular beacon, die Möglichkeit der präzisen Ortsauflösung der Aktivierung, dargestellt werden. Hierzu wurde modellhaft die Ziel-RNA auf einer Objektträgeroberfläche immobilisiert. Die dann aufgetragene molecular beacon-Lösung zeigte zunächst keine Fluoreszenz. Diese trat erst nach Bestrahlung und auch nur begrenzt auf den wenige Quadratmikrometer großen Bestrahlungsbereich auf.
The increasing resistance of almost all pathogenic bacteria to antibiotics (multidrug resistance) causes a severe threat to public health. The mechanisms underlying multidrug resistance include the induced over expression of multidrug transporters which extrude a variety of lipophilic and toxic substrates in an energy dependent fashion through the membrane out of the cell. These proteins are found in all transporter families. The work described in this thesis is dedicated to drug-proton antiporters from the small multidrug resistance (SMR) family. These efflux pumps with just four transmembrane helices per monomer are so far the smallest transporters discovered. Their oligomeric state, topology, three dimensional structure, catalytic cycle and transport mechanism are still rather controversial. Therefore, the aim of this thesis was to directly address these questions for the small multidrug resistance proteins Halobacterium salinarium Hsmr and Escherichia coli (E. coli) EmrE using a number of biophysical methods such as NMR, transport assays, mass spectrometry and analytical ultracentrifugation. Especially the work on Hsmr has been challenging due to the halophilic nature of this protein. In Chapter 1, key questions and the most important biophysical techniques are introduced followed by Material and Methods in Chapter 2. Depending on experimental requirements, cell free or ‘classical’ in vivo expression has been used for this thesis. Cell free expression as an option for the production of small multidrug transporters has been explored in Chapter 3. It has been possible to produce the SMR family members Hsmr, EmrE, TBsmr and YdgF in vitro. The expression of Hsmr was investigated in more detail under different experimental conditions. Hsmr was either refolded from precipitate or maintained in a soluble form during expression in the presence of detergents and liposomes. Furthermore, amino acids for which no auxotrophic strains were available could be labelled successfully. This expression system has been also used for preparing labelled samples of EmrE as described in Chapter 9. In vivo in E. coli expression of Hsmr, as described in Chapter 4, provided large amounts of proteins if fermenter production was used. Uniform labelling and selective unlabelling with stable isotopes (13C, 15N) for NMR spectroscopy was achieved in vivo in a more efficient and cost effective manner than using the cell free approach for this protein. Hsmr could be purified successfully from both in vitro and in vivo expression media. Hsmr is expressed in vivo and in vitro with N-terminal formylation. The Nterminal formylation is unstable and Hsmr in the presence of low salt concentrations was amenable to N-terminal degradation. It was found that Hsmr shows longest stability in Fos-ß-choline® 12 and sodium dodecyl sulphate, but best reconstitution conditions were found, when dodecyl maltoside is used and exchanged with Escherichia coli lipids. A molar protein lipid ratio of 1 to 100, amenable to solid state nuclear magnetic resonance, has been achieved. Sample homogeneity was shown by freeze fracture electron microscopy. The oligomeric state of Hsmr in detergent has been assessed by SDS PAGE, blue native PAGE, size exclusion chromatography, analytical ultracentrifugation and laser induced liquid bead ion desorption mass spectrometry (LILBID) as described in Chapter 5. A concentration and detergent dependent monomer-oligomer equilibrium has been found by all methods. The activity of Hsmr under the sample preparation conditions used here was shown using radioactive and fluorescence binding as well as fluorescence and electrochemical transport assays (Chapter 6). For transport studies, a stable pH gradient was generated by co-reconstitution of Hsmr with bacteriorhodopsin and subsequent sample illumination. Based on the observed long term stability of Hsmr in Fos-ß-choline® 12 and sodium dodecyl sulphate, liquid state NMR experiments were attempted in order to assess the correct folding of Hsmr in detergent micelles (Chapter 7). 1D proton and 2D HSQC spectra of U-15N Hsmr revealed a poor spectral dispersion, low resolution and only a small number of peaks. These are at least partly due to long rotational correlation times of the large protein detergent complex. This problem has been overcome by applying solid-state NMR to Hsmr reconstituted into E. coli lipids (Chapter 8). Uniform 13C labelled samples were prepared and two dimensional proton-driven spin diffusion and double quantum-single quantum correlation spectra were acquired successfully. Unfortunately, the spectral resolution was not yet sufficient for further structural studies. Reasons for the observed linebroadening could be structural heterogeneity or molecular motions which interfere with the NMR timescale. Therefore, the protein mobility has been probed using static 2H solid state NMR on Ala-d3-Hsmr. It could be shown, that parts of Hsmr are remarkably mobile in the membrane and that this mobility can be limited by the addition of the substrate ethidium bromide. Ethidium bromide as well as tetraphenylphosphonium (TPP+) is typical multidrug transporter substrates. The membrane interaction of TPP+ in DMPC membranes has been resolved by 1H MAS NMR. It was found that it penetrates into the interface region of the lipid bilayers and therefore behaves like many other transporter substrates adding to the hypothesis that the membrane could act as a pre-sorting filter. Finally, Chapter 9 is dedicated to the characterisation of the essential and highly conserved residue Glu-14 in EmrE by solid-state NMR. In order to avoid spectral overlap, the single Glu EmrE E25A mutant was chosen instead of the wildtype. The protein has been produced in vitro to take advantage of reduced isotope scrambling in the cell free expression system as verified by analytical NMR spectroscopy. Correct labelling of EmrE was tested by MALDI-TOF and solid-state NMR. The dimeric state of DDM solubilised EmrE has been probed by LILBID. The labelled protein was reconstituted into E. coli lipids to ensure a native membrane environment. Activity was determined by measuring ethidium bromide transport. Freeze fracture EM revealed very homogeneous protein incorporation even after many days of MAS NMR experiments. 2D 13C double quantum filtered experiments were used to obtain chemical shift and lineshape information of Glu-14 in EmrE. Two distinct populations were found with backbone chemical shift differences of 4 - 6 ppm which change upon substrate binding. These findings indicate a structural asymmetry at the assumed dimerisation interface and are discussed in the context of a model for shared substrate/proton binding. These studies represent the first successful use of cell free expression to prepare labelled membrane proteins for solid-state NMR and allow for the first time an NMR insight into the binding pocket of a multidrug efflux pump.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung inter- und intramolekularer Wechselwirkungen in Molekülkristallen, Ausgangspunkt sind die Kristallisation und Strukturbestimmung ausgewählter Modellverbindungen. Die einzelnen Fragestellungen werden durch geeignete Kombinationen sich ergänzender Analysenmethoden, umfangreichen Datenbank-Recherchen und quantenchemischen sowie Atompotential-Berechnungen zu beantworten versucht.
In this thesis, the structure of the C-terminal domain of presenilin-1, the catalytic component of the y-secretase complex, is investigated by NMR spectroscopy. The ysecretase complex has a definitive role in the pathogenic development of Alzheimer's disease, in that it mediates the cleavage of aprecursor to create the amyloid ß peptide. Aggregates of amyloid ß which form amyloid plaques are the most overt clinieal feature observed in the post-mortem brains of Alzheimer's patient. In addition, many of the mutations found in the aggressive early onset familial Alzheimer's disease have been linked to presenilin-1, highlighting its importance in disease progression and deeming it an important target for investigation. One of the greatest challenges for the structural investigation of the y-secretase components is their low expression yields in cell-based systems. We therefore applied continuous-exchange cell-free expression to obtain sufficient amounts of protein for our structural studies. An added benefit of the cell-free expression system is the freedom to incorporate any desired combination of stable-isotope labels directly into sampies. We were therefore able to develop a labeling scheme which targets the amino acid composition of transmembrane a-helices, allowing us to simplify an assignment procedure whieh tends to be cumbersome and diffieult for most a-helical transmembrane proteins. The y-secretase complex is a member of the intramembrane cleaving proteases which, as their name implies, cleave their transmembrane substrates within the bilayer. Single particle analysis of the y-secretase (1) as weil as crystal structures of rhomboid (2) and S2P (3) have revealed the presence of hydrophilie po res within the membrane where catalysis occurs. In light of evidence that certain elements of CTF reside in close proximity or even contribute to the formation of the hydrophilic pore, we chose to study the structure of CTF in mieelles, whieh may be better suited to accommodate CTF in isolation as compared with solid membranes in the absence of the other y-secretase components. The structure of CTF was solved to 1.7 A (backbone r.m.s.d) and revealed the presence of unusual features, including a partially membrane-spanning helix which situates the catalytic asparte at its N-terminus in what would be the center of the membrane where catalysis is proposed to occur, as weil as a severely kinked helix which is partially embedded beneath the surface of the membrane (P6). Interestingly, similar features have been observed in the crystal structure of the GlpG rhomboid. In addition, a soluble helix was found in the long N-terminal loop of CTF which until now has been described as unstructured. The first part of the thesis is designed to provide an introduction to Alzheimer's disease, the role of y-secretase and its presenilin-l catalytic component in disease progression, as weil as cell-free expression and liquid-state NMR techniques involved in the structural investigation of membrane proteins. In chapter 2, the reader is familiarized with the history, the clinical manifestation, and biochemical features of Alzheimer's disease. The chapter goes further to describe the role of the y-secretase complex and its individual components in disease progression and substrate processing. Chapter 3 focuses more specifically on presenilin-l in the context of the newly emerging class of intramembrane proteases. In chapter 4, attention is shifted to the cell-free expression system with special focus on the expression of membrane proteins, and chapter 5 explores the various liquid-state NMR techniques that were required for the characterization of CTF. The second part of the thesis is cumulative and contains original research, method, and review articles that were produced during the course of study. Chapter 6 explores the various techniques and innovations used to study membrane proteins using continuous exchange cell-free expression coupled with NMR spectroscopy. In chapter 7, a new technique, transmembrane segment targeted labeling, is described as a tool that facilitates the backbone assignment of transmembrane proteins which display severe overlap in NMR spectra. Chapter 8 presents the novel NMR structure of the C-terminal fragment of presenilin-l solved in SOS micelles.
Zusammenfassung der Dissertation "9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracen: Ein neuartiges ditopes Hydroborierungsreagenz zum Aufbau photolumineszenter pi-konjugierter Organylborane" von Andreas Lorbach (2011) Borhaltige pi-konjugierte Verbindungen eignen sich u.a. als Chemosensoren zur Detektion von Lewis-Basen sowie als Materialien für optoelektronische Bauteile, wie z.B. organische Leuchtdioden. Vertreter dieser Substanzklasse sind Vinylborane, welche sich sehr effizient durch Addition von Hydroboranen an terminale Alkine erzeugen lassen. Diese Reaktivität nutzten Chujo et al. zum Aufbau pi-konjugierter Polymere, wobei sie Aryldiine mit sterisch anspruchsvollen Organylboranen RBH2 (R = 2,4,6-Trimethylphenyl; 2,4,6-Triisopropylphenyl; 1,1,2-Trimethylpropyl) umsetzten. Zur Detektion von Lewis-Basen sind sterisch weniger anspruchsvolle Substituenten R, die einen freien Zugang zum Boratom ermöglichen, von Vorteil. Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe haben jedoch gezeigt, dass sich die entsprechenden Organylborane RBH2 nicht als Hydroborierungsreagenzien eignen, da sie stattdessen unter Abspaltung von Diboran spontan zu Diorganylboranen kondensieren. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sich diese unerwünschte Substituentenübertragung durch Einbindung des Borzentrums in ein cyclisches Molekülgerüst verhindern lässt und 9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracen (1) somit ein isolierbares ditopes Hydroboran darstellt. Mittels eines in dieser Dissertation entwickelten dreistufigen Synthesewegs kann 1 in guten Ausbeuten aus 1,2-Dibrombenzol gewonnen werden. Im Festkörper bildet 1 eine polymere supramolekulare Struktur [1]n aus, in der die 9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracen-Einheiten über 2-Elektronen-3-Zentren-BHB-Bindungen miteinander verknüpft sind. Durch Umsetzung von schwerlöslichem [1]n mit Dimethylsulfid lässt sich das supramolekulare Aggregat aufbrechen und man erhält das lösliche Addukt 1(Me2S)2, das als kristallines Material in hoher Reinheit isoliert werden kann. Bei 1(Me2S)2 handelt es sich um ein hervorragendes Hydroborierungsreagenz, welches bei Raumtemperatur mit terminalen Alkinen zu den entsprechenden Vinylboranen reagiert. Aus 1 lassen sich mit Diethinylarenen außerdem lumineszente pi-konjugierte Hydroborierungspolymere erzeugen. Die Umsetzung mit bidentaten Lewis-Basen, wie z.B. Pyridazin, führt zu sehr stabilen symmetrischen Addukten, in denen die Base die beiden aziden Borzentren des Diboraanthracens verbrückt. Um einen Einblick in die elektronischen Eigenschaften des 9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracens (1) zu erhalten, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit das zu Anthracen isoelektronische dianionische Diborataanthracen ([1]2-) isoliert und hinsichtlich seiner Festkörperstruktur und Reaktivität untersucht.
NK cells are part of the innate immune system, and are important players in the body’s first defence line against virus-infected and malignantly transformed cells. While T cells recognize neoplastic cells in an MHC-restricted fashion, NK cells do not require prior sensitization and education about the target. In leukemia and lymphoma patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation not only T cells but also NK cells have been found to mediate potent graft-versus-tumor effects. Hence, autologous or donor-derived NK cells hold great promise for cancer immunotherapy. Since the generation of highly purified NK cell products for clinical applications is labor-intensive and time consuming, established human NK cell lines such as NK-92 are also being considered for clinical protocols. NK-92 cells display phenotypic and functional characteristics similar to activated primary NK cells. While NK-92 cells are highly cytotoxic towards malignant cells of hematologic origin, they do not affect healthy human tissues. NK-92 cells can be expanded under GMP-compliant conditions, and can therefore be provided in sufficient numbers with defined phenotypic characteristics for clinical applications. Safety of NK-92 cells for adoptive immunotherapy was already shown in two phase I/II clinical trials...
ABCB9 is a peptide transporter belonging to the ATP-binding cassette (ABC) transporter subfamily B. Due to its high sequence identity to the transporter associated with antigen processing (TAP) the protein was named TAP-like (TAPL). The primary aim of this PhD thesis was the functional characterization of the TAPL transport complex. Despite the lack of TAPL function in the classical MHC class I pathway an involvement of TAPL in antigen presentation was still suggested. Apart from the crucial role of TAP for peptide delivery into the ER, TAP-independent translocation pathways in professional antigen presenting cells (pAPC) have been proposed, but not identified so far. Remarkably, TAPL mRNA and protein expression is strongly induced during differentiation of monocytes to immature and mature dendritic cells. This result was confirmed in the promonocytic cell line THP-1, which was used as a model system for monocyte to macrophage differentiation. By using quantitative immunofluorescence microscopy and subcellular fractionation, TAPL was detected in the lysosomal compartment co-localizing with the lysosome associated membrane protein 2 (LAMP-2) thus excluding the ER-localization formerly reported. Furthermore, by in vitro assays, a TAPL-specific and ATPdependent translocation of peptides into isolated lysosomes was demonstrated. Hence, TAPL is a candidate mediating peptide transport in alternative antigen presentation pathways in pAPCs. The presence of an extra N-terminal transmembrane domain (TMD0) lacking sequence homology to any known protein distinguishes TAPL from most other ABC transporters of its subfamily. By dissecting the TAPL translocation complex into its four putative transmembrane helices containing TMD0 and the core complex, distinct functions to the core complex and TMD0 were assigned. The core-TAPL complex composed of six predicted transmembrane helices and the nucleotide-binding domain (NBD) was expressed transiently in HeLa or stably in Raji cells. Crude membranes containing core-TAPL showed the same peptide transport activity as wt-TAPL demonstrating that the six core helices and the NBD are sufficient for peptide transport. This result also shows that the core transport complex is correctly targeted to and assembled in the membrane. Strikingly, in contrast to the wt transporter, the core complex localizes only partially to lysosomes and is mistargeted to the plasma membrane as observed by immunofluorescence microscopy and confirmed biochemically by cell surface biotinylation. Thus, a crucial role for TMD0 in proper subcellular targeting can be postulated. The vast majority of biological processes are mediated by protein complexes, hence characterization of such protein-protein-interactions is essential for understanding protein function on the cellular level. To identify interaction partners of TAPL, the transporter was isolated by tandem affinity purification. By tandem mass spectrometry the membrane proteins LAMP-1 and LAMP-2 were deciphered as specific proteins interacting with wt-TAPL. Notably, core-TAPL lacks these interactions indicating a role for TMD0 in recruiting other proteins. These results were verified for endogenous TAPL by co-immunoprecipitation. Using cells deficient in LAMP-1 and/or in LAMP-2 an escort function for the LAMP proteins was excluded. Very importantly, the physiological function of the LAMP-1and LAMP-2 interaction with TAPL is an increase in stability, since in their absence half-life of TAPL is drastically reduced.
An chemischen Synapsen diffundieren von der präsynaptischen Nervenendigung ausgeschüttete Neurotransmitter durch den synaptischen Spalt und aktivieren Rezeptormoleküle in der postsynaptischen Plasmamembran. Eine schnelle und zuverlässige Kommunikation an Synapsen bedingt, dass die Rezeptoren in Clustern direkt gegenüber den aktiven Zonen der Präsynapsen angereichert sind. Eine hohe Rezeptorendichte in der postsynaptischen Membran wird durch sog. Gerüstproteine, die mit den Rezeptormolekülen assoziieren, erreicht. Bisher wurden für verschiedene Synapsen unterschiedliche Gerüstproteine identifiziert. An glutamatergen Synapsen werden Rezeptoren durch u.a. das Postsynaptic Density 95 (PSD 95)-Protein, an cholinergen Synapsen durch Rapsyn, und an GABAergen und glyzinergen Synapsen durch Gephyrin verankert. An inhibitorischen Synapsen wurde bisher ausschliesslich Gephyrin als Ankerprotein für Glyzin- und GABAARezeptoren identifiziert. An exzitatorischen glutamatergen Synapsen dagegen regulieren weitere Gerüstproteine wie Shank, Homer und das Glutamatrezeptor interagierende Protein (GRIP) die Lokalisation, den Transport und die Stabilität verschiedener Glutamatrezeptor- Subtypen. Gephyrin wurde ursprünglich als peripheres Membranprotein zusammen mit dem Glyzin-rezeptorkomplex aufgereinigt. Es bindet an die große intrazelluläre Schleife der ß-Untereinheit des Glyzinrezeptors. Experimente mit Antisense-Oligonukleotiden und Gephyrin-defizienten Mäusen zeigten, dass Gephyrin essentiell für die synaptische Lokalisation von Glyzinrezeptoren und α2- und γ2-Untereinheiten enthaltenden GABAARezeptoren ist. Die Rezeptorlokalisation an der Synapse wird durch eine stabile Verankerung des Gephyrin-Gerüstes am Zytoskelett gewährleistet. Die Gerüstbildung erfolgt durch die Oligomerisierung zweier Gephyrin-Domänen, der aminoterminalen G-Domäne und der carboxyterminalen E-Domäne, wodurch ein hexagonales Gephyrinnetzwerk entsteht, welches für die Clusterbildung an der Synapse notwendig ist. Live-imaging Studien in Neuronenkulturen zeigten, daß an Rezeptor-Transportvesikel gebundenes Gephyrin kontinuierlich an und von aktiven Synapsen weg transportiert wird, was eine hochdynamische Modulation des Gephyrin-Gerüsts nahelegt. Der retro- und anterograde Transport von Gephyrin wird durch Dynein bzw. Kinesin bewerkstelligt. Einige zytosolische Proteine wie Profilin, das Mena/Vasodilator-stimulierte Phosphoprotein (VASP) und Collybistin (Cb) spielen in der Zytoskelett-Regulation eine Rolle und interagieren mit Gephyrin. Cb ist notwendig für die Gephyrin-Clusterbildung an bestimmten GABAergen Synapsen. Im Hippocampus Cb-defizienter Mäuse befindet sich kein Gephyrin an den Postsynapsen. Cb gehört zur Familie der Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren (GEF), die durch eine DH-PH (Dbl Homologie-/Pleckstrin-Homologie) Tandem-Domäne charakterisiert sind und existiert in zwei Spleißvarianten, CbI und CbII. Die DH-Domäne aktiviert spezifisch das kleine G-Protein Cdc42, und die PH-Domäne interagiert mit Phosphoinositol-3-Phosphat (PI3P). In vitro-Studien haben gezeigt, dass die Interaktion von Gephyrin mit Cb II eine Reduktion der GEF-Aktivität für Cdc42 bewirkt. Basierend auf diesen Resultaten wurde vorgeschlagen, dass Gephyrin die Cdc42-Aktivierung durch Cb beendet. Dieser Mechanismus könnte für die initiale Bildung inhibitorischer Synapsen notwendig sein. Analysen mit Domänen-deletierten Cb-Konstrukten zeigten, dass sowohl die DH- als auch die PH-Domäne für die Bildung von submembranären Gephyrin-Microclustern an der Plasmamembran notwendig sind. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der Gephyrin-Gerüstbildung durch Cb weiter untersucht. Insbesondere wurde geklärt, inwiefern Cdc42-Aktivierung bzw. PI3P-Bindung durch Cb an der Gephyrin-Gerüstbildung beteiligt ist. Zusätzlich wurde anhand einer eigens erzeugten GFP-Gephyrin transgenen Maus untersucht, ob sich die Stabilität des Gephyrin-Gerüsts während der Differenzierung ändert und in die Regulation der Stabilität und Plastizität inhibitorischer Synapsen involviert ist. Die Rolle von Cdc42 in der Gephyrin-Gerüstbildung wurde mittels einer konstitutiv aktiven Spleißvariante von Cb untersucht. Basierend auf Homologien zu anderen bereits charakterisierten GEFs und der publizierten Kristallstruktur des CbII-Cdc42 Komplexes wurden Aminosäurereste in der DH-Domäne von Cb mutiert, um die Cdc42-Aktivierung zu unterbrechen (CB T61A, K192A und NE232-233AA). In vitro GTPase-Aktivierungsassays und Filopodien-Induzierung in NIH-3T3-Zellen bestätigten, dass diese Mutationen die Cdc42-Aktivierung reduzierten bzw. aufhoben. Dennoch induzierten sie die Gephyrin-Gerüstbildung in heterologen Zellen und hippocampalen Neuronen ähnlich effektiv wie Wildtyp-Cb II. Die Rolle von Cdc42 in der synaptischen Gephyrin-Clusterbildung wurde außerdem in konditionell Cdc42-defizienten Mäusen, in denen das Cdc42-Gen selektiv im Vorderhin inaktiviert wurde, untersucht. Die Dichte von Gephyrin- und das GABAA-Rezeptor-Clustern war bei Verlust von Cdc42 im Hippocampus nicht verändert. Dies steht im Gegensatz zu einem fast 80%igen Verlust von Gephyrin- und GABAA-Rezeptor-Clustern im Hippocampus von Cb-defizienten Mäusen. Diese Ergebnisse zeigen, dass Cdc42 für die Gephyrin-Gerüstbildung an inhibitorischen Synapsen nicht notwendig ist. Die Rolle der PH-Domäne von Cb bei der Gephyrin-Clusterbildung wurde ebenfalls durch Mutagenese-Experimente analysiert. Viele PH-Domänen haben die Fähigkeit, Phosphoinositide zu binden und damit Membranbindung zu vermitteln, während andere PHDomänen, die nicht an Phosphoinositide binden, nur nach Bindung weiterer Liganden mit Membranen assozieren. In früheren Arbeiten war gezeigt worden, dass humanes Cb PI3P bindet. Hier wurde eine mögliche Beteiligung von Phospholipid-Bindung an der Gephyrin-Gerüstbildung durch Substitution zweier basischer Reste in der β3- und β4- Schleife, R303 und R304, mit Asparaginen untersucht. Ein Lipid-Dot-Blot-Assay mit der Cb II-RR303-304NN-Mutante zeigte einen völligen Verlust der PI3P-Bindung in vitro. Die Expression dieser Mutante in heterologen Zellen und hippocampalen Neuronen zeigte, dass die Gerüstbildung und die synaptische Lokalisation von Gephyrin Phosphoinositidbindung erfordern. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die Aktivierung von Cdc42, nicht aber die PI3P- Bindung, für die Cb II-vermittelte Gephyrin-Gerüstbildung entbehrlich ist. Cb hat also zumindest zwei biologische Funktionen: Einerseits ist die DH-Domänen vermittelte Aktivierung von Cdc42 notwendig für die Regulation des Aktinzytoskeletts und die Bildung von Filopodien; andererseits wird die PH-Domänen-abhängige und Cdc42-unabhängige Phospholipidbindung für die Gephyrin-Gerüstbildung an inhibitorischen Postsynapsen benötigt. Um die Dynamik von Gephyrin an inhibitorischen Synapsen zu untersuchen, wurde eine transgene Maus entwickelt, welche GFP-Gephyrin unter der Kontrolle des Neuronspezifischen Thy1-Promotors exprimiert. In verschiedenen Hirnregionen der transgenen Mauslinie, wie Hippocampus, Stammhirn, Rückenmark und Kortex, wurde punktuelle synaptische GFP- Fluoreszenz beobachtet. Diese GFP-Gephyrin-Fluoreszenz kolokalisierte mit einem inhibitorischen Präsynapsenmarker, dem vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT). Immunfärbungen von Hirnschnitten mit Gephyrin-spezifischen Antikörpern zeigten, daß die durchschnittliche Größe und Dichte der GFP-Gephyrin-Cluster mit denen endogener Gephyrin-Cluster identisch waren. Eine Western-Blot Analyse inhibitorischer synaptischer Proteine zeigte keinen Unterschied zwischen Thy1-GFP-Gephyrin- und Wildtyp-Mäusen auf, ebensowenig wie elektrophysiologische Untersuchungen von GFP-Gephyrin-positiven und -negativen Neuronen. Sowohl die durchschnittliche Amplitude der mIPSCs als auch deren Frequenz waren nicht signifikant verändert, was dafür spricht, dass die transgene Expression von GFP- Gephyrin keine funktionellen Veränderungen verursacht. Verhaltensversuche zeigten gleiche Ergebnisse für Thy1-GFP-Gephyrin und WTMäuse. Daher kann die GFP-Gephyrin-Maus als verlässliche Reporterlinie für Studien zur Gephyrin-Dynamik an inhibitorischen Synapsen im Hippocampus und in einigen anderen Hirnregionen eingesetzt werden. Die Dynamik des synaptischen Gephyrin-Gerüsts wurde an inhibitorischen Postsynapsen in organotypischen entorhinal-hippocampalen Schnittkulturen aus GFPGephyrin-Mäusen untersucht. Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP)-Analysen individueller GFP-Gephyrin-Cluster in 1-Woche- und 4-Wochen-alten Kulturen zeigten eine entwicklungsabhängige Stabilisierung der GFP-Gephyrin-Cluster auf. Diese Stabilisierung ist eng verbunden mit einer Größenzunahme der Gephyrin-Cluster an GABAergen Synapsen. Mit elektrophysiologischen Ableitungen wurde eine Reifung der GABAergen synaptischen Übertragung ebenfalls während dieser Periode beobachtet. Die Stabilisierung und Grössenzunahme des Gephyrin-Gerüsts spiegelte sich in einer erhöhten miniature inhibitory postsynaptic current (mIPSC)- Amplitude wieder. Außerdem wies die Zunahme der mIPSCFrequenz auf eine effiziente Reifung der präsynaptischen Endigungen hin, die immunhistochemisch durch eine Zunahme der VIAAT-Immunfluoreszenz erhärtet werden konnte. Ein möglicher Einfluss der GABAergen, synaptischen Aktivität auf die Grösse und Stabilität der Gephyrin-Cluster wurde in reifen Neuronenkulturen durch pharmakologische Modulation der GABAA-Rezeptoren untersucht. Die Behandlung 4-Wochen-alter Kulturen mit GABAA-Rezeptor-Antagonisten und mit dem potenzierenden Benzodiazepin Diazepam zeigte eine homöostatische Regulation der Stabilität und Größe des Gephyrin-Gerüsts durch die Aktivität inhibitorischer Synapsen auf. Zusammenfassend sind diese Resultate starke Hinweise für dynamische Veränderungen in synaptischen Gephyrin-Gerüsten während der Reifung und Aktivitäts-induzierten Plastizität GABAerger Synapsen
In Philadelphia Chromosome (Ph) positive ALL and CML the fusion between BCR and ABL leads to the BCR/ABL fusion proteins, which induces the leukemic phenotype because of the constitutive activation of multiple signaling pathways down-stream to the aberrant BCR/ABL fusion tyrosine kinase. Targeted inhibition of BCR/ABL by ABL-kinase inhibitors induces apoptosis in BCR/ABL transformed cells and leads to complete remission in Ph positive leukemia patients. However, a large portion of patients with advanced Ph+ leukemia relapse and acquire resistance. Kinase domain (KD) mutations interfering with inhibitor binding represent the major mechanism of acquired resistance in patients with Ph+ leukemia. Tetramerization of BCR/ABL through the N-terminal coiled-coil region (CC) of BCR is essential for the ABL-kinase activation. Targeting the CC-domain forces BCR/ABL into a monomeric conformation, reduces its kinase activity and increases the sensitivity for Imatinib. Here we show that i.) targeting the tetramerization by a peptide representing the Helix-2 of the CC efficiently reduced the autophosphorylation of both WT BCR/ABL and its mutants; ii.) Helix-2 inhibited the transformation potential of BCR/ABL independently of the presence of mutations; iii.) Helix-2 efficiently cooperated with Imatinib as revealed by their effects on the transformation potential and the factor-independence related to BCR/ABL with the exception of mutant T315I. These findings suggest that BCR/ABL harboring the T315I mutation have a transformation potential which is at least partially independent from its kinase activity. Targeted inhibition of BCR/ABL by small molecule inhibitors reverses the transformation potential of BCR/ABL. We definitively proved that targeting the tetramerization of BCR/ABL mediated by the N-terminal coiled-coil domain (CC) using competitive peptides, representing the Helix-2 of the CC, represents a valid therapeutic approach for treating Ph+ leukemia. To further develop competitive peptides for targeting BCR/ABL, we created a membrane permeable Helix-2 peptide (MPH-2) by fusing the Helix-2 peptide with a peptide transduction tag. In this study, we report that the MPH-2: (i) interacted with BCR/ABL in vivo; (ii) efficiently inhibited the autophosphorylation of BCR/ABL; (iii) suppressed the growth and viability of Ph+ leukemic cells; and (iv) was efficiently transduced into mononuclear cells (MNC) in an in vivo mouse model. The T315I mutation confers resistance against all actually approved ABL-kinase inhibitors and competitive peptides. It seems not only to decrease affinity for kinase inhibitors but to confer additional features to the leukemogenic potential of BCR/ABL. To determine the role of T315I in resistance to the inhibition of oligomerization and in the leukemogenic potential of BCR/ABL, we investigated its influence on loss-of-function mutants with regard to the capacity to mediate factor-independence. Thus we studied the effects of T315I on BCR/ABL mutants lacking functional domains in the BCR portion indispensable for the oncogenic activity of BCR/ABL such as the N-terminal coiled coil (CC), the tyrosine phosphorylation site Y177 and the serine/threonine kinase domain (ST), as well as on the ABL portion of BCR/ABL (#ABL-T315I) with or without the inhibitory SH3 (delta SH3-ABL) domain. Here we report that i.) T315I restored the capacity to mediate factor independence of oligomerization_deficient p185BCR/ABL; ii.) resistance of p185-T315I against inhibition of the oligomerization depends on the phosphorylation at Y177; iii.) autophosphorylation at Y177 is not affected by the oligomerization inhibition, but phosphorylation at Y177 of endogenous BCR parallels the effects of T315I; iv.) the effects of T315I are associated with an intact ABL_kinase activity; v.) the presence of T315I is associated with an increased ABL_kinase activity also in mutants unable to induce Y177 phosphorylation of endogenous BCR; vi.) there is no direct relationship between the ABL-kinase activity and the capacity to mediate factor_independence induced by T315I as revealed by the #ABL-T315I mutant, which was unable to induce Y177 phosphorylation of BCR only in the presence of the SH3 domain. In contrast to its physiological counterpart c-ABL, the BCR/ABL kinase is constitutively activated, inducing the leukemic phenotype. The N-terminus of c-ABL (Cap region) contributes to the regulation of its kinase function. It is myristoylated, and the myristate residue binds to a hydrophobic pocket in the kinase domain known as the myristoyl binding pocket in a process called “capping”, which results in an auto-inhibited conformation. Because the cap region is replaced by the N-terminus of BCR, BCR/ABL “escapes” this auto-inhibition. Allosteric inhibition by myristate “mimics”, such as GNF-2, is able to inhibit unmutated BCR/ABL, but not the BCR/ABL that harbors the “gatekeeper” mutation T315I. Here we investigated the possibility of increasing the efficacy of allosteric inhibition by blocking BCR/ABL oligomerization. We demonstrate that inhibition of oligomerization was able not only to increase the efficacy of GNF-2 on unmutated BCR/ABL, but also to overcome the resistance of BCR/ABL-T315I to allosteric inhibition. These results strongly suggest that the response to allosteric inhibition by GNF-2 is inversely related to the degree of oligomerization of BCR/ABL. Taken together these data suggest that the inhibition of tetramerization inhibits BCR/ABL-mediated transformation and can contribute to overcome Imatinib-resistance. The study provides the first evidence that an efficient peptide transduction system facilitates the employ-ment of competitive peptides to target the oligomerization interface of BCR/ABL in vivo. Further the data show that T315I confers additional leukemogenic activity to BCR/ABL, which might explain the clinical behavior of patients with BCR/ABL -T315I-positive blasts. In summary, our observations establish a new approach for the molecular targeting of BCR/ABL and its resistant mutants represented by the combination of oligomerization and allosteric inhibitors.
Das Ziel dieser Arbeit ist die Synthese von nicht-kovalenten supramolekularen Komplexen, um nachfolgend aus den Kristallstrukturen dieser Verbindungen bessere Einsichten über die H-Brückenwechselwirkungen zwischen den organischen Molekülen zu erlangen. Um an dieses Ziel zu kommen, wurde ein Konzept zur gezielten Synthese von supramolekularen Komplexen entwickelt. Die Steuerung des Co-Kristallisationsprozesses ist keine einfache Aufgabe, deshalb darf der Verlauf einer solchen Synthese von nicht-kovalenten Verbindungen nicht einfach dem Zufall überlassen werden. Der Start erfolgt mit einer gründlichen Auswahl der Verbindungen durch Intuition mit Hilfsmitteln (Chemikalienkataloge und chemische Datenbanken). In einem Selektionsabschnitt werden chemische Datenbanken, analytische Methoden und rechnergestützte Programme zu Hilfe genommen. Aussichtsreiche Kandidaten werden mit dem Programm SUPRA getestet; so zeigt sich, ob das gewünschte H-Brückenmuster prinzipiell realisierbar ist. Auch die verschiedenen Vorproben zum Test auf H-Brücken gebundene Komplexe (siehe Kapitel 8 und 9) liefern wertvolle Informationen. Mit den so ausgewählten Kandidaten wurden schließlich Kristallisationsversuche angesetzt. Falls möglich können Strukturvorhersagen der jeweiligen Komplexe mit Hilfe von Strukturvorhersageprogrammen getroffen werden (siehe Kapitel 7). Die erhaltenen Co-Kristalle werden anschließend am Einkristalldiffraktometer gemessen und darauf folgend die Kristallstrukturen gelöst. Um die Reaktionsbedingungen zur Bildung von bestimmten supramolekularen Komplexen kontrollieren zu können, wurden die Gitterenergie des Komplexes berechnet und die Schmelzpunkte bestimmt. Mit Kenntnis der Gitterenergie des Komplexes, der Edukte bzw. der Pseudokomplexe kann die Reaktionsbedingung so eingestellt werden, dass nur eine bestimmte Verbindung bei einer vorgegebenen Reaktionsbedingung auskristallisiert. Der Einfluss bzw. die Auswahl von Lösungsmitteln darf bei Co-Kristallisationsprozessen nicht vernachlässigt werden. Der erste Abschnitt dieser Arbeit befasst sich mit der Synthese von supramolekularen Komplexen aus Komponenten, die ausschließlich zwei Protonen-Akzeptoren bzw. zwei Protonen-Donoren (AA-DD-Muster) beinhalten. Die fehlgeschlagenen Experimenten passen zur Trefferquote dieser Verbindungsklasse in der CSD. Der Grund für diesen Misserfolg ist grundsätzlich auf die geometrische Anordnung der freien Elektronenpaare der Akzeptoren zurückzuführen. Sind Sauerstoffatome an solchen H-Brückenmustern als H-Akzeptoren beteiligt, ist es oft nicht möglich, eine lineare Anordnung der H-Donorengruppe mit diesen Sauerstoffatomen als Akzeptoren zu bewerkstelligen. Nach erfolglosen Bemühungen wandten wir uns Verbindungen zu, die mindestens drei Akzeptoren bzw. Donoren im jeweiligen Molekül aufweisen. Für dieses Experiment wurden zunächst starre, kleine organische Moleküle ausgesucht. Das AAA-DDD-Muster konnte im gesamten Verlauf dieser Arbeit nicht hergestellt werden. Es ist nicht leicht, eine Verbindung zu synthetisieren, bei der alle H-Akzeptorgruppen auf einer Seite benachbart angeordnet sind. Eine Literaturaussage, dass Verbindungen mit dem AAA-DDD-Muster die stabilsten aller dreifach gebildeten Wasserstoffbrückenbindungen sind, konnte daher nicht experimentell verifiziert werden. Unsere Gruppe hat daraufhin versucht, die bekannten H-Brückenmuster aus den Watson-Crick-Basenpaarungen (AAD-DDA) sowie das ADA-DAD-Muster nachzuahmen. Nur mit dem Muster ADA-DAD konnten Erfolge erzielt werden. Die entsprechenden Komplexe konnten nicht nur erfolgreich synthetisiert, sondern auch durch die Einführung sterisch anspruchsvoller Substituenten die Bildung von unerwünschten Wasserstoffbrückenmustern gezielt verhindert werden. Nachdem die Synthese von zahlreichen Komplexen gelang, sind wir zu pharmazeutischen Wirkstoffen übergegangen. Mit diesem Schritt soll eine Brücke zur Pharmazie geschlagen werden. Vier pharmazeutische Wirkstoffe mit definiertem Wasserstoffbrückenmuster wurden ausgesucht und anschließend mit den passenden Gegenstücken zur Kristallisation angesetzt. Nur für Trimethoprim konnten Co-Kristalle erhalten werden. Mit diesem Wirkstoff konnte anschließend gezeigt werden, wie sich Moleküle in bestimmten chemischen Umgebungen im Festkörper anpassen und ihre geometrische Anordnung ändern, um die bestmöglichen Wechselwirkungen zu erreichen. Sämtliche Kristallstrukturen von Trimethoprim, die in der CSD in neutraler Form aufzufinden sind, demonstrieren, wie flexibel diese Verbindung in Abhängigkeit von der Umgebung ihre Konformation ändert. In dieser Arbeit konnte auch gezeigt werden, wie Kristallisationsbedingungen verändert werden sollten, um den gewünschten Komplex herstellen zu können. Die Schmelzpunktbestimmung sowie die Kombination mit der Gitterenergie dienten dazu, für die gegebenen Verbindungen die passenden Bedingungen für den Kristallisationsprozess zu ermitteln. Die Schmelztemperaturen von drei in der Struktur ähnlichen Komplexen liegen jeweils zwischen den Schmelztemperaturen ihrer Ausgangsverbindungen, was zu der Annahme verleitet, dass bei höheren Temperaturen die Verbindungen mit höheren Schmelztemperaturen und somit stabileren Kristallgittern bevorzugt gebildet werden. Wird die Temperatur gesenkt, so könnten alle Formen von Kristallen (die der Edukte, Pseudokomplexe und der supramolekularen Komplexe) in einer einzigen Probe anfallen. Um die Gültigkeit dieser Annahme zu überprüfen, bedarf es der Durchführung von Pulveraufnahmen der gesamten Proben. Diese konnten aufgrund der geringen Mengen an Kristallsubstanz nicht realisiert werden. In Zukunft wird das Augenmerk besonders auf die Erforschung von supramolekularen Komplexen mit anspruchsvolleren Freiheitsgraden gelegt. Diese Komplexe sollen mehrere Rotationsfreiheitsgrade besitzen bzw. aus mehr als vier H-Brücken komplementär zusammengesetzt sein. Darüber hinaus ist unsere Gruppe immer noch bemüht, Komplexe zu co-kristallisieren, die am Ende die Muster bzw. die Konstellationen aufweisen, die von vornherein konzeptionell ausgearbeitet wurden.
Cytochrome c oxidase (CcO), also called Complex IV of the aerobic respiratory chain, is located in the plasma membrane of prokaryotes and in the inner mitochondrial membrane of eukaryotes. The redox energy of dioxygen reduction is used to translocate protons across the membrane resulting in an electrochemical proton gradient. The generated proton gradient is exploited by the adenosine-5’-triphosphate synthase. In this work, bacterial four-subunit aa3-Type CcO from Paracoccus denitrificans (ATCC 13543, 4 SU-wt ATCC CcO) was used for analyses. 1) The recombinant homologously produced 4 SU-wt CcO (4 SU-wt rec CcO) was functionally compared with the native 4 SU-wt ATCC CcO. The 4 SU-wt rec CcO showed functional deficiencies as determined by UV-vis spectroscopy and electron paramagnetic resonance (EPR) studies. Total X-ray Reflection Fluorescence measurements show in both wild type CcOs the same ratio of the redoxactive Fe and Cu (2 Fe : 3 Cu) indicating full complement of the functional metals. If CcO contains only subunit I and II, it loses its functional integrity during continuous turnover activity. The importance of subunit III for integrity of CcO was demonstrated using 2 SU-wt rec CcO. Crystallisation trials of suicide inactivated 2 SU-wt rec CcOs have been ineffective using standard crystallisation conditions. Crystals of active 2 SU-wt rec CcO (positive control) have been obtained under these conditions and this result indicates possible structural changes in suicide inactivated 2 SU-wt rec CcO. The structure of active 2 SU-wt rec CcO was determined to 2.25 Å resolution. 2) Terminal oxidases require four electrons for the cleavage of the dioxygen bond (O=O). In general, the catalytic cycle of CcO is described by the electron input and thus by the different redox states of the metal centres: the O, E, R, P and F state. The two-electron reduced R intermediate is able to donate four electrons for dioxygen reduction forming the P state. The P intermediate is an oxoferryl state implying the lack of an electron for the R -> P transition, because the metal centres can only provide three electrons (Fe+II forms Fe+IV and Cu+II forms Cu+I). The P state, where the dioxygen bond is already broken, shows an oxoferryl state (FeIV=O2-) and a nearby tyrosine is proposed to form a tyrosyl radical representing the donor of the missing electron. H2O2-induced artificial intermediates provide the opportunity to investigated different catalytic intermediates in detail. Mixing equimolar amounts of H2O2 to CcO in the O state induces the "two-electron" reduced PH state at high pH and the electronically equal "two-electron" reduced F• H state at low pH. The addition of an excess amount of H2O2 leads to the three-electron reduced FH state. Functional studies using the 4 SU-wt ATCC CcO have demonstrated a bound peroxide (O- - O-) intermediate during the catalytic cycle. Using EPR it was previously shown that Y167 hosts a radical species in PH/F• H state which suggests that Y167 could provide this "missing electron". While X-ray structural models of CcO and Fourier-transformed infrared (FTIR) measurements of oxygenated ("pulsed") 4 SU-wt ATCC CcO suggest a bound peroxide in the O state, UV-vis and EPR spectroscopic studies indicate that other intermediates may also contain such peroxide species. Equimolar and excess amounts of H2O2 induce the PH/F• H and FH states, respectively and catalase treatment of the FH state leads, contrary to the natural direction of the catalytic cycle, to the apparent transition of the FH -> PH/F• H states, which is accompanied by reappearance of an EPR signal from the Y167• radical. The novel PFH/F• FH states are presented here and we postulate that the FH state hosts a superoxide (or peroxide) adduct at CuB in the binuclear site. In addition, the novel P10 state is also introduced having a maximum at lambda = 612 nm in the difference absorption spectrum (minus the O state). The P10 state is induced by mixing CcO in the O state with a pH 10 buffer. This pH 10 induced state resembles standard P states such as PCO, PH and PR. However, the P10 state evolves out of the O state without addition of reduction equivalents. Using EPR spectroscopy it was shown that Y167 hosts a radical species in the P10 state such as in the PH state. In summary, all functional data presented here provide evidence for a peroxide bound during the O state. Finally, a new model for the natural catalytic cycle is proposed. If the O state contains a peroxide, it is also likely that the E and R state contain this species. Even the oxoferryl intermediates P and F states may complex a peroxide at CuB in the binuclear site. 3) The amino acid residue Y167, which hosts the radical in the PH/F•H states, is not directly part of the binuclear site of CcO. For identification of the primary electron donor, two tryptophan variants of CcO, W272F and W164F, which are located nearby the binuclear site, were produced. Evidence is provided that W272 is a kinetically fast electron donor for the O2 molecule. The electron is replenished by Y167, or probably by Y280 in the natural cycle. The Y167 radical is detectable by EPR spectroscopy after treatment with equimolar amounts of H2O2 in the active variant W164F, but is absent in the inactive variant W272F. 4) CcO contains two proton conducting pathways, the D- and the K-pathway. Proteoliposomes of the variants H28A and D30N, mutations located at the entrance of the D-pathway, both show the identical proton pumping activity as the 4 SU-wt rec CcO (pumped H+/e- = 1). The variant N113D shows abolished proton pumping (pumped H+/e- = 0), but a relative high cytochrome c oxidation activity (63 %). G196D displays no cytochrome c oxidation and proton pumping activity. Overall, the addition or removal of a negative charge within the D-pathway such as in D124N, N131D, N113D and G196D leads to a decoupled phenotype indicating the high degree of electrostatic coupling in CcO.
G-protein coupled receptors (GPCRs) are the key players in signal perception and transduction and one of the currently most important class of drug targets. An example of high pharmacological relevance is the human endothelin (ET) system comprising two rhodopsin-like GPCRs, the endothelin A (ETA) and the endothelin B (ETB) receptor. Both receptors are major modulators in cardiovascular regulation and show striking diversities in biological responses affecting vasoconstriction and blood pressure regulation as well as many other physiological processes. Numerous disorders are associated with ET dysfunction and ET antagonism is considered an efficient treatment of diseases like heart failure, hypertension, diabetes, artherosclerosis and even cancer. This study exemplifies strategies and approaches for the preparative scale synthesis of GPCRs in individual cell-free (CF) systems based on E. coli, a newly emerging and promising technique for the production of even very difficult membrane proteins. The preparation of high quality samples in sufficient amounts is still a major bottleneck for the structural determination of the ET receptors. Heterologous overexpression has been a challenge now for decades but extensive studies with conventional cell-based systems had only limited success. A central milestone of this study was the development of efficient preparative scale expression protocols of the ETA receptor in qualities sufficient for structural analysis by using individual CF systems. Newly designed optimization strategies, the implementation of a variety of CF expression modes and the development of specific quality control assays finally resulted in the production of several milligrams of ETA receptor per one millilitre of reaction mixture. The versatility of CF expression was extensively used to modulate GPCR sample quality by modification of the solubilization environment with detergents and lipids in a variety of combinations at different stages of the production process. Downstream processing procedures of CF synthesized GPCRs were systematically optimized and sample properties were analysed with respect to homogeneity, protein stability and receptor ligand binding competence. Evaluation was accomplished by an array of complementary and specifically modified techniques. Depending on its hydrophobic environment, CF production of the ETA receptor resulted in non-aggregated, monodisperse forms with sufficient long-term stability and high degrees of secondary structure thermostability. The obtained results document the CF production of the ETA receptor in two different modes as an example of a class A GPCR in ligand-binding competent and non-aggregated form in quantities sufficient for structural approaches. The presented strategy could serve as basic guideline for the production of related receptors in similar systems.
Lichtgesteuerte Channelrhodopsine (ChR) haben im letzten Jahrzehnt neue Wege zur Untersuchung neurophysiologischer Zusammenhänge eröffnet. Die ersten grundlegenden Charakterisierungen von Channelrhodpsin-1 und Channelrhodopsin-2 (ChR-1 und ChR-2) zeigten bereits die hohe Selektivität dieser Ionenkanäle für Protonen gegenüber monovalenten und divalenten Kationen und veranschaulichten die Dominanz der einwärtsgerichteten gegenüber den auswärtsgerichteten Kationenströmen durch die Kanalpore (Einwärtsgleichrichtung) (Nagel et al., 2002; Nagel et al., 2003). Nach Expression von Channelrhodopsin können erregbare Zellen mit einem Ruhepotential von -60 mV durch Licht depolarisiert und Aktionspotentiale (AP’s) ausgelöst werden (Boyden et al., 2005; Li et al., 2005; Nagel et al., 2005b). Aufgrund der Einwärtsgleichrichtung von ChR nehmen die lichtaktivierten Ströme mit zunehmender Depolarisation ab, sodass die vollständige Ausbildung des AP’s nicht gestört wird. Dadurch wird ChR zu einem optimalen optogenetischen Werkzeug. Dennoch ist die Einwärtsgleichrichtung bisher wenig detailliert charakterisiert. Auch die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht genau bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte anhand von Patch-Clamp Messungen gezeigt werden, dass zwei Mechanismen die Rektifizierung des Kanalstroms durch ChR-2 hervorrufen: eine Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit und eine Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit. Die Spannungsabhängigkeit der Einzelkanalleitfähigkeit ist von der Art der geleiteten Ionen abhängig und konnte experimentell über die Unterschiede der stationären IV-Kurve für H+ und Na+ bei symmetrischen Ionenkonzentrationen bewiesen werden. Des Weiteren wurden die Resultate für unterschiedliche Ionenbedingungen anhand eines Ionenbindungsmodells mit einem „3-Barrieren 2-Bindungsstellen“ Profil für die Kanalpore simuliert. Die Spannungsabhängigkeit der Offenwahrscheinlichkeit ist an eine Lichtadaption des ChR-2 Proteins gekoppelt. Diese Lichtadaption konnte mithilfe von repetitiven Messungen, d.h. Strommessungen mit mehrfachen kurzen Lichtblitzen (10 ns), gezeigt werden. Da die Lichtadaption wie auch die Kanalkinetik stark vom pH abhängig sind, ist anzunehmen, dass mechanistisch wichtige De- und Reprotonierungsreaktionen mit diesen Prozessen einhergehen. Ferner konnte über die Untersuchung der elektrophysiologischen Eigenschaften der ChR-2 Mutante E90A eine Region im Protein identifiziert werden, die höchstwahrscheinlich am Protonentransport durch die Kanalpore beteiligt ist. Die Mutante E90A wies eine verringerte Protonenleitfähigkeit und eine natriumabhängige Blockierung der lichtaktivierten Ströme bei niedrigem extrazellulären pH auf. Doppelbelichtungsexperimente mit gelbem oder kurzwelligem blauen Licht ergaben außerdem neue Hinweise auf die Identität einiger Intermediate des Photozyklus. Die vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass die bisher beschriebene „lichtadaptierte“ Form, die als P480 Intermediat bezeichnet wird, eher einem P520 Intermediat entspricht. Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit eine funktionelle Beteiligung des Intermediats P390, in dem die Schiff Base deprotoniert ist, am Photostrom von ChR-2 im Wildtyp-Protein gezeigt werden. Diese Beteiligung ist bisher nur für ChR-2 Mutanten bekannt (Bamann et al., 2010). Neben der Untersuchung der Kanaleigenschaften von ChR-2 wurde in dieser Arbeit auch der Frage nachgegangen, ob an den Photozyklus von ChR-2 eine vektorielle Protonenverschiebung über der Membran gekoppelt ist. Mithilfe der BLM-Technik und Patch-Clamp Messungen an elektrofusionierten HEK-293 Zellen (Zimmermann et al., 2006) konnte gezeigt werden, dass auch ohne elektrochemische Triebkraft lichtaktivierte Ströme (Pumpströme) zu beobachten sind, die einer vektoriellen Protonenverschiebung von 0,2 - 0,4 Ladungen pro Photozyklus entsprechen. Die Doppelbelichtungsexperimente und der vektorielle Protonentransport geben einen Einblick in den Zusammenhang zwischen Photozyklus und den funktionalen Zuständen des Kanals. Die Ergebnisse zeigen das komplexe Geflecht zwischen Spannungsabhängigkeit, der Kinetik und den offenen Zuständen und wurden in einem Modell zusammengefasst. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine stabile Zelllinie für die Expression von ChR-1 etabliert, die eine genauere Charakterisierung dieses Proteins möglich macht. Es konnte gezeigt werden, dass ChR-1 ebenso wie ChR-2 eine Kationenleitfähigkeit besitzt. Aus zeitaufgelösten Messungen wurde außerdem ermittelt, dass ChR-1 gegenüber ChR-2 eine verkürzte Zykluszeit besitzt. Die verkürzte Zykluszeit von ChR-1, die zu kleineren Gesamtstromamplituden im Vergleich zu ChR-2 führt und die vergleichsweise geringere Expression, v.a. in transienten Expressionssystemen, limitiert dessen neurophysiologische Anwendung. Zusammenfassend stellt die vorliegende Dissertation eine detaillierte biophysikalische Charakterisierung von Channelrhodopsinen dar, die neue Erkenntnisse über die mechanistische Kopplung der Kanalfunktion an den Photozyklus hervorbringt. Zudem kann sie eine Grundlage für die gezielte Suche nach Channelrhodopsin Mutanten bieten, deren Kinetik oder analeigenschaften für die neurophysiologische Anwendung optimiert sind.
Succinate:quinone oxidoreductases (SQORs) are integral membrane protein complexes, which couple the two-electron oxidation of succinate to fumarate (succinate → fumarate + 2H+ + 2e-) to the two-electron reduction of quinone to quinol (quinone + 2H+ + 2e- → quinol) as well as catalyzing the opposite reaction, the reduction of fumarate by quinol. In mitochondria and some aerobic bacteria, succinate:ubiquinone reductase, also known as complex II of the aerobic respiratory chain or as succinate dehydrogenase from the tricarboxylic acid (TCA or Krebs) cycle, catalyzes the oxidation of succinate by ubiquinone, which is mildly exergonic under standart conditions and not directly associated with energy storage in the form of a transmembrane electrochemical proton potential (Δp). Gram-positive bacteria do not contain ubiquinone but rather menaquinone, a quinone with significantly lower oxidation-reduction (“redox”) midpoint potential. In these cases, the catalyzed oxidation of succinate by quinone is endergonic under standard conditions. Consequently, these bacteria face a thermodynamic problem in supporting the catalysis of this reaction in vivo. Based on experimental evidence obtained on whole cells and purified membranes, it had previously been proposed that the SQR from Gram-positive bacteria supports this reaction at the expense of the protonmotive force, Δp. Nonetheless, it has been argued that the observed Δp dependence is not associated specifically with the activity of SQR because the occurrence of artifacts in experiments with bacterial membranes and whole cells can not be fully excluded. Clearly, definitive insight into the mechanism of catalysis of this intriguing reaction required a corresponding functional characterization of an isolated, membranebound SQR from a Gram-positive bacterium. The first aim of the present work addresses the question if the general feasibility of the energetically uphill electron transfer from succinate to menaquinone is associated specifically to a single enzyme complex, the SQR. The prerequisite to achieve this goal was stable preparation of this enzyme.
In dieser Arbeit sollte die Bindung von Tetrahydromethanopterinderivaten an zwei Enzyme des methanogenen, CO2-reduzierenden Energiestoffwechselweges strukturell charakterisiert werden. In jenem Stoffwechselweg verläuft die schrittweise Reduktion von CO2 über die Bindung an den C1-Carrier Tetrahydromethanopterin (H4MPT), ein Tetrahydrofolat-Analogon, welches unter anderem in methanogenen Archaeen zu finden ist. Die thermophilen bzw. hyperthermophilen Ursprungsorganismen der untersuchten Enzyme, Methanothermobacter marburgensis, Methanocaldococcus jannaschii und Methanopyrus kandleri, sind aufgrund ihrer Anpassung an extreme Habitate durch spezielle genomische, strukturelle und enzymatische Eigenschaften von strukturbiologischem Interesse. Beim ersten in dieser Arbeit untersuchten Enzym handelte es sich um den aus acht Untereinheiten bestehenden membrangebundenen N5-Methyl-H4MPT:Coenzym M-Methyltransferasekomplex (MtrA-H). Dieser katalysiert in einem zweistufigen Mechanismus den Methyltransfer von H4MPT zum Co(I) der prosthetischen Gruppe 5’-Hydroxybenzimidazolylcobamid (Vitamin B12a), um die Methylgruppe dann auf Coenzym M zu übertragen. Gleichzeitig findet ein der Energiekonservierung dienender vektorieller Natriumtransport über die Membran statt. Für den Mtr-Komplex aus M. marburgensis (670 kDa) lag bereits ein Protokoll zur Reinigung unter anaeroben Bedingungen vor. Dieses wurde im Rahmen dieser Arbeit verbessert, für die Isolierung und Reinigung unter aeroben Bedingungen vereinfacht und für die Erfordernisse der zur Strukturbestimmung verwendeten elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung optimiert. Neben der Präparation des kompletten Komplexes MtrA-H wurde als Alternative die Präparation des Enzymkomplexes MtrA-G unter möglichst vollständiger Abtrennung der hydrophilsten Untereinheit MtrH gewählt. Mit der zu diesem Zweck entwickelten Methode konnte das Abdissoziieren von MtrH besser als im etablierten Protokoll kontrolliert und somit die Homogenität der Probe deutlich verbessert werden. Dies schafft zum einen die Vorraussetzungen für eine Kristallisation zur Röntgenstrukturanalyse, zum anderen war auch in bei der elektronenmikroskopischen Einzelpartikelmessung erkennbar, dass mit dem Mtr-Komplex ohne MtrH bessere Ergebnisse zu erzielen sind. Parallel zu den Untersuchungen am Gesamtkomplex sollten die den Cobamid-Cofaktor bindende Untereinheit MtrA sowie die H4MPT-bindende Untereinheit MtrH in für die Kristallisation und röntgenkristallographische Untersuchung ausreichender Menge und Qualität gereinigt werden. Hierfür wurden MtrA und MtrH aus oben genannten Organismen für die heterologe Expression in E. coli kloniert, die Expressionsbedingungen optimiert und Reinigungsprotokolle etabliert. Anschließend wurden die Untereinheiten umfangreichen Kristallisationsversuchen unterzogen. Die Untereinheit MtrA aus M. jannaschii konnte ohne die C-terminale Transmembranhelix als lösliches Protein in E. coli produziert und als Holoprotein bis zur Homogenität gereinigt werden. Bei M. kandleri MtrA gelang die Herstellung von geringen Mengen teilweise löslichen StrepII-Fusionsproteins ohne C-terminale Transmembranhelix in E. coli. Eine Produktion der Untereinheit MtrH in E. coli als lösliches Protein war bei keiner der in dieser Arbeit getesteten Varianten möglich. Mit dem in Einschlusskörperchen exprimierten Protein aus M. marburgensis wurde eine Reinigung und Rückfaltung versucht. Auch eine Co-Expression der Untereinheiten MtrA und MtrH, durch welche eine bessere Faltung und Löslichkeit erreicht werden sollte, war nur in Einschlusskörperchen möglich. Das zweite in dieser Arbeit untersuchte Enzym, die F420 abhängige N5,N10 Methylen-H4MPT-Dehydrogenase (Mtd), katalysiert den reversiblen, stereospezifischen Hydrid-Transfer zwischen reduziertem F420 (F420H2) und Methenyl-H4MPT+, welches hierbei zu Methylen-H4MPT reduziert wird. Die Reaktion verläuft über einen ternären Komplex bestehend aus Protein, Substrat (Methylen-H4MPT) und Cosubstrat (F420), welcher strukturell charakterisiert werden sollte. Das gereinigte, rekombinante Enzym aus M. kandleri wurde mit verschiedenen H4MPT- und F420-Derivaten co-kristallisiert, die Struktur des ternären Komplexes röntgenkristallographisch bestimmt und die Bindung von H4MPT und F420 analysiert. Methenyl-H4MPT+ und F420H2 sind in der in dieser Arbeit gelösten Kristallstruktur in katalytisch aktiver Konformation gebunden, jedoch kann bei einer Auflösung von 1,8 Å nicht beurteilt werden, ob Methylen-H4MPT und F420 oder Methenyl-H4MPT+ und F420H2 vorlagen. Ein Vergleich mit der Struktur von M. kandleri-Mtd (KMtd) ohne Substrat und Cosubstrat ergab nur äußerst geringe Abweichungen in der Proteinkonformation, sodass sich KMtd überraschenderweise als Beispiel für ein Enzym mit ungewöhnlich starrer, vorgegebener Bindetasche erwies.
NMR-spektroskopische Untersuchungen zur Bindung kleiner Moleküle an das Zellzyklusprotein CDC25A
(2010)
Viele verschiedene Funktionen der Zelle werden durch posttranslationale Modifikationen von Proteinen reguliert. Die reversible Phosphorylierung der OH-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin ist eine der Möglichkeiten die Aktivität von Proteinen an- und abzuschalten und Interaktion mit Bindungspartnern zu ermöglichen oder zu verhindern. Die Phosphatase CDC25A übernimmt eine zentrale Rolle in der Steuerung des Zellzyklus, unterliegt selbst wiederum einer differenzierten Kontrolle durch Änderung des Expressionslevel, Phosphorylierung und Lokalisation innerhalb der Zelle. Da eine Überfunktion von CDC25A mit einer Vielzahl von verschiedenen Krebserkrankungen assoziiert ist, wird die Entwicklung starker und selektiver Inhibitoren, die auch in vivo wirksam sind, vorangetrieben. Die strukturellen Grundlagen selektiver Inhibition sind allerdings noch unzureichend erforscht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Grundlagen für eine erfolgreiche Durchführung von NMR-Experimenten gelegt, für die Proteinproben mit hoher Konzentration und Langzeitstabilität benötigt werden. CDC25A kann nicht in der vollen Länge exprimiert werden und wäre als Vollkonstrukt auch zu groß, um effektiv per NMR untersuchbar zu sein. Durch Erzeugung diverser Konstrukte der katalytischen Domäne von CDC25A konnte ein Expressionslevel erreicht werden, der die Erzeugung ausreichender Mengen an Protein praktikabel macht. Neben des oftmals geringen Expressionslevels ist ein weiteres Problem bei NMR-spektroskopischen Untersuchungen vieler Phosphatasen deren geringe Stabilität während der Aufreinigung und in der endgültigen Probe. Durch Optimierung der Pufferbedingungen für den Zellaufschluss in Bezug auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Kations per „Incomplete Factorial Design“ konnte die Ausbeute an löslichem Protein erheblich gesteigert werden. Die Verwendung dieser Pufferbedingungen während der ersten Aufreinigungsschritte verminderte auch die Tendenz des Proteins während der Chromatografie auszufallen. Die Zusammensetzung des Puffers für die endgültige NMR-Probe wurde schließlich durch das aus der Kristallografie entlehnte Verfahren der Dampfdiffusion ebenso in Hinblick auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Anions optimiert. Unter diesen optimierten Pufferbedingungen wurde die katalytische Aktivität des Proteinkonstrukts anhand der Hydrolyse von para-Nitrophenylphosphat nachgewiesen. Acht Substanzen wurden auf Inhibition dieser katalytischen Aktivität getestet. Das natürliche Substrat Phosphotyrosin zeigte eine kompetitive Hemmung, zwei starke und ein schwacher Inhibitor zeigten entsprechend verminderte Reaktionsraten. Von den restlichen 4 Substanzen (Inhibitoren anderer Protein-Tyrosin-Phosphatasen und strukturelle Verwandte) zeigten 3 weitere eine starke Wirkung. Diese hohe Promiskuität gegenüber Inhibitoren stellt ein großes Problem für die strukturgetriebene Wirkstoffentwicklung bei CDC25A und generell aller Phosphatasen dar. Nach Erhalt der fertigen Proben zeigten erste 2D-NMR-Spektren eine geringer als zu erwartende Zahl von Signalen und starke Überlappungen der sichtbaren Signale. Um auszuschließen, das Dimerisierung oder unspezifische Aggregation hierfür verantwortlich sind, wurden DOSY-Spektren gemessen. Aus der Eigendiffusionsrate ergibt sich ein hydrodynamischer Radius, der mit durch HYDROPRO simulierten Werten übereinstimmt und sich deutlich von dem des putativen Dimers absetzt. Daher wird davon ausgegangen, dass die Signalverluste im NMR nicht durch Dimerisierung oder Aggregation ausgelöst werden. Um die Bindung von Inhibitoren auch durch NMR-Spektroskopie nachzuweisen, wurden Saturation-Transfer-Difference-Experimente (STD) durchgeführt. In diesen war aber sowohl für das natürliche Substrat Phosphotyrosin als auch für alle im Enzymtest aktiven Inhibitoren kein Effekt nachweisbar. Dies weist auf eine sehr hohe koff-Rate der Bindung an das Protein hin oder auf eine irreversible chemische Modifikation des aktiven Zentrums, die bis zum Zeitpunkt der Messung bereits abgeschlossen war. Für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung werden spezifische Interaktionspunkte auf der Proteinoberfläche gesucht. Hierfür wurden 15N-HSQC-Spektren mit und ohne Bindungspartner gemessen und die Veränderungen der chemischen Verschiebung bestimmt („chemical shift perturbation“). Es konnten für Phosphotyrosin und die beiden starken Inhibitoren BN82002 und NSC663284 signifikante Veränderungen nachgewiesen werden. Für alle drei Moleküle gab es sowohl komplett einzigartige Veränderungen als auch paarweise übereinstimmende als auch ein Signal das für alle 3 übereinstimmt. Neben den Inhibitoren wurden drei Peptide auf spezifische Interaktion getestet. Das erste entspricht der Zielsequenz des natürlichen Substrats CDK, die anderen beiden sind Teile der Sequenz von CDK an einer nachgewiesenen als auch einer putativen sekundären Interaktionsfläche der beiden Proteine. Auch für die drei Peptide konnten wie für die Inhibitoren individuelle als auch übereinstimmende Signalveränderungen nachgewiesen werden. Als Voraussetzung für die Bestimmung der Oberflächenkontakte, die für die spezifische Bindung von Substrat, Inhibitoren und Interaktionspeptiden nötig sind, wird eine Zuordnung der Signale des 15N-HSQC-Spektrums zu den Aminosäureresten des Proteins benötigt. Hierzu wurden 3D-Tripelresonanz-NMR-Experimente an 15N, 13C-markierten Proben (zusätzlich auch noch 2H-markierte Proben zur Unterdrückung von Relaxationseffekten) durchgeführt. Um die Zuordnung zu unterstützen wurden außerdem Proben mit individuell 15N-markierten Aminosäuren hergestellt, um einem Signal im HSQC zumindest den Typ der Aminosäure zuordnen zu können. Aufgrund der trotz Pufferoptimierung, Deuterierung des Proteins und verringerter Signalüberlagerung in den Spektren der individuell markierten Proben zu geringen Anzahl an Signalen konnten nur kurze Bereiche der Aminosäuresequenz zugeordnet werden. Aufgrund dieser Basis konnte kein aussagekräftiges Mapping erzielt werden.
Übergangsmetallboride und -nitride weisen besondere physikalische und mechanische Eigenschaften auf; sie vereinen dabei sowohl die Merkmale von Metallen als auch von Keramiken. Sie besitzen z. B. große Härten, hohe Schmelzpunkte und hohe Abriebfestigkeiten. Des Weiteren sind sie sehr beständig gegenüber Hitze und Korrosion. Sie zeigen eine hohe elektrische und thermische Leitfähigkeit. In den industriellen Anwendungen kommen oft Übergangsmetallboride und -nitride der 4. und 5. Gruppe zum Einsatz. Die Boride und Nitride des Niobs gelten als potentielle Kandidaten für Baumaterialien, welche hohen Temperaturen standhalten sollen. Niobnitride werden zum Teil schon als Beschichtungen von Turbinenmotoren und in der Raumfahrt eingesetzt. Für den industriellen Einsatz als Beschichtung oder Überzug werden in der Regel dünne Filme benötigt, diese werden oft durch Gasphasenabscheidung aufgebracht. Eine alternative Möglichkeit zur Präparation dünner Filme bietet das Rapid Thermal Processing (RTP). Dabei handelt es sich um einen optischen Schnellheizofen, mit dem Aufheiz- und Abkühlraten bis zu 300 K s-1 erreicht werden können. Im Vergleich zu gängigen Ofenprozessen werden Reaktionszeiten deutlich verkürzt. Durch eine Variation der Reaktionsbedingungen ist es möglich, verschiedene Phasen zu erzeugen und deren Abfolge zu beeinflussen. Zusätzlich können metastabile Phasen und Zwischenstufen abgefangen werden. Als Ausgangsschichten für die in dieser Arbeit untersuchte Darstellung von Niobboriden und -nitriden dienten verschiedene B/Nb- sowie B/Nb2N-Schichtsysteme. Diese wurden mittels Magnetronsputtern bzw. Elektronenstrahlverdampfung auf Si/SiO2-Substraten abgeschieden. Die Ausgangsschichten wurden anschließend in der RTP im Temperaturbereich von 600 °C bis 1200 °C getempert. Die Temperungen wurden in Argon bzw. Ammoniak durchgeführt. Zur Charakterisierung der Proben dienten verschiedene Analyseverfahren (XRD, LM, REM, AFM, SIMS, EPMA). Die folgenden Niobboride sowie -nitride können durch Temperungen in der RTP dargestellt werden. Die hexagonale NbB2-Phase entsteht bei Argon- sowie Ammoniaktemperungen in B/Nb-Schichtsystemen mit einem 1 : 1-Schichtdickenverhältnis. Das NbB2 erweist sich unter den untersuchten Reaktionsbedingungen als effektive Diffusionsbarriere gegenüber Sauerstoff, Kohlenstoff, Wasserstoff und Stickstoff. Weitere boridische Phasen werden nur bei Argontemperungen gefunden. Das tetragonale Nb3B2 entsteht in Schichtsystemen mit einem B : Nb-Verhältnis von 1 : 4 und 1 : 10 sowie mit einem Nb : B : Nb-Verhältnis von 5 : 1 : 5. Die Nb3B2-Phase wird durch Kohlenstoff und Sauerstoff verunreinigt. Die Verunreinigungen stammen sowohl aus den Ausgangsschichten als auch aus anderen Quellen (z. B. Trägermaterial). Durch eine Änderung der Sputter- Methode konnten die in den Ausgangschichten vorhandenen Verunreinigungen reduziert werden. In entsprechend neupräparierten Schichtsystemen mit einem B : Nb-Verhältnis von 1 : 4 und 1 : 10 führt dies bei den Argontemperungen zur Ausbildung des orthorhombischen NbB neben dem Nb3B2. Die Bildung der Nitride erfolgt bei den Ammoniaktemperungen der verwendeten Schichtsysteme (außer bei B : Nb im Verhältnis 1 : 1). Welche Phase dabei entsteht ist abhängig von der gewählten Temperatur. Es zeigt sich dabei von niedrigeren zu höheren Temperaturen folgende Phasenabfolge: hexagonales Nb2N -> hexagonales delta‘-NbN -> kubisches NbN. Beim Übergang zwischen den einzelnen Phasen liegen diese nebeneinander vor. Durch die schnellen Aufheiz- und Abkühlraten des RTP-Systems, bildet sich neben dem Nb2N das kinetisch bevorzugte delta‘-NbN. Die Bildung der delta‘-NbN-Phase wird durch die Ähnlichkeit der beiden Elementarzellen unterstützt. Die Nb2N-Phase der B/Nb2N-Bilayer behindert stark die Eindiffusion des Bors, des Stickstoffes und der Verunreinigungen. Damit ist das Nb2N eine relativ gute Diffusionsbarriere. Ein Teil der Nb2N-Schicht weicht dem Druck der Eindiffusion durch Aufstauungseffekte an der Grenzfläche aus. Die aus der Literatur bekannten Phasen Nb3B4 (orthorhombisch), epsilon-NbN (hexagonal) und Nb5N6 (hexagonal) werden bei den untersuchten Reaktionsbedingungen nicht gefunden. Die vorhandenen Verunreinigungen führen vor allem während der Argontemperungen zu verschiedenen Oberflächenphänomenen und zur Ausbildung carbidischer und oxidischer Phasen. Im Zuge der Ammoniaktemperungen spielen die Verunreinigungen eine deutlich geringere Rolle. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass durch Temperungen in der RTP verschiedene Niobboride sowie -nitride innerhalb weniger Minuten dargestellt werden können. Jedoch sollten für weiterführende Arbeiten reinere Ausgangschichten bzw. anderer Trägermaterialien verwendet werden um die Ergebnisse weiter zu verbessern.
Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung lichtinduzierter Strukturänderungen verschiedener photoschaltbarer Moleküle durch zeitaufgelöste Infrarotspektroskopie. Hierzu war es notwendig, eine komplexe Messapparatur zu konzipieren, aufzubauen und zu optimieren. Das entwickelte Anreg-/Abtast-Experiment ermöglicht die Messung kleinster transienter Absorptionsänderungen (delta A<1E-5) im Spektralbereich von 1000 cm^-1 bis 2500 cm^-1 mit einer Zeitauflösung von etwa 0,3 ps. Es können Anregungspulse im Bereich von 258nm bis über 600nm generiert werden. Über ein computergesteuertes Wellenplättchen kann die Polarisation des Anregungslichtes während der Datenaufnahme variiert werden, was eine Auswertung hinsichtlich der molekularen Anisotropie ermöglicht. Die eingesetzten Probenzellen gestatten die Untersuchung geringster Probenmengen (V <20µL) bei Temperaturen bis zu 50°C. Nitrophenylacetat (NPA) wurde hinsichtlich seiner Photodecarboxylierungsreaktion untersucht. Für alle drei Konstitutionsisomere konnte nachgewiesen werden, dass die Freisetzung von CO2 innerhalb von 1 ns erfolgt. Es zeigen sich signifikante Unterschiede zwischen den Reaktionsverläufen der drei Konstitutionen, wobei die erhaltenen Amplituden der Photoproduktspektren mit den bekannten Decarboxylierungsquantenausbeuten korrelieren. Die globale Analyse ergibt einen multiexponentiellen Aufbau des CO2-Signals. Im Fall von meta- und para-NPA erfolgt die Abspaltung von CO2 über einen dominanten Zerfallskanal mit einer Zeitkonstante von t~200 ps. Quantenchemische Rechnungen legen nahe, dass dieser Hauptreaktionspfad über den Triplettzustand verläuft. Bei ortho- NPA wird dieser Zerfallskanal effektiv gequencht, was mit einer schnellen Deaktivierung des angeregten Singulettzustandes durch einen intramolekularen Protonentransfer erklärt wird. Nach diesen Messungen steht fest, dass meta-Nitrophenylacetat hervorragend als caged compound für CO2 geeignet ist. Die Primärdynamik von solubilisiertem Proteorhodopsin (PR) in D2O wurde im infraroten und sichtbaren Spektralbereich sowohl bei saurem als auch bei alkalischem pD-Wert untersucht. Dies erlaubt den direkten Vergleich der in beiden Spektralbereichen gemessenen Daten. Der primäre Protonenaktzeptor Asp97 liegt dabei entweder protoniert (pD=6,4) oder deprotoniert (pD=9,2) vor. Die transienten vis-Absorptionsspektren ergaben, wie bei PR in H2O, einen biexponentiellen Zerfall des angeregten Zustands und die gleichzeitige Bildung des PRK-Photoproduktes. Die Abweichung der bei PR in D2O ermittelten Werte von den publizierten Zeitkonstanten der H2O-Messung wird als kinetischer Isoptopeneffekt interpretiert. Dieser variiert mit dem pD-Wert, was auf Unterschiede der Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerke in der Retinalumgebung hinweist. Die Signaturen der transienten Infrarotspektren werden den C=C- und C=N-Moden des Retinals sowie der Amid I-Mode des Proteins zugeordnet. Es konnte ebenfalls die Bildung des PRK-Produktes nachgewiesen werden, wobei die Isomerisierungsquantenausbeute des Retinals unabhängig von der Protonierung von Asp97 ist. Die im IR bestimmten Zeitkonstanten sind dabei unabhängig vom pD-Wert und weichen von den im Sichtbaren ermittelten Werten ab. Dieser Befund wird mit dem Einfluss der molekularen Temperatur auf die transienten IR-Spektren und dem Auftreten von Kühlprozessen erklärt. Zusätzlich zum Wildtyp-Protein wurde die PR-D97N-Mutante als Modellsystem für PR im sauren pH-Bereich ebenfalls im vis- und IR-Bereich untersucht. Die dabei erzielten Ergebnisse stehen im Einklang mit den bisherigen Ausführungen. Der geringe kinetische Isotopeneffekt weist auf ein ähnliches Wasserstoffbrückennetzwerk wie beim Wildtyp unter sauren Bedingungen hin. Als letztes wurde ein synthetisches Modellcollagen untersucht. Die Seitenkettenverbrückung der Peptidsequenz mit einem Azobenzol-basierten, künstlichen Photoschalter sollte eine lichtinduzierte Entfaltung der Tertiärstruktur ermöglichen. Der isolierte Photoschalter und die gekoppelte Sequenz wurden zunächst unter Gleichgewichtsbedingungen sowohl im UV/vis- als auch im IR -Bereich umfangreich spektroskopisch charakterisiert. Diese Messdaten lagen zum großen Teil bereits vor und wurden in dieser Arbeit einer detaillierten Auswertung unterzogen. Für den isolierten Schalter konnte im IR-Bereich eine umfassende Bandenzuordnung erstellt werden. Dabei wird im photostationären Gleichgewicht eine reversible trans-> cis-Isomerisierung festgestellt, welche keine Temperaturabhängigkeit aufweist. Darüberhinaus wurden polarisationsabhängige, transiente IR-Spektren des isolierten Azoschalters für die trans->cis- und die cis->trans-Isomerisierungsrichtung aufgenommen. Die instantan auftretenden, markanten Differenzsignale können den Amid I- und Amid II-Moden der im Schalter enthaltenen Peptidbindungen sowie den Phenylmoden zugeordnet werden. Die extrahierten kinetischen Parameter sind für beide Isomere nahezu identisch, was durch einen dominanten Beitrag molekularer Kühlprozesse erklärt werden kann. Aufgrund der geringen Isomerisierungsquantenausbeute (< 10 %) können die Differenzspektren der photostationären Gleichgewichte nicht in den Produktspektren dieser Messungen reproduziert werden. Hinsichtlich der ermittelten Anisotropieparameter ergeben sich kleine Unterschiede zwischen beiden Datensätzen. Zusammen mit theoretischen Modellierungen werden diese in Zukunft genauere Aussagen über die Strukturen der Isomere erlauben. Die UV/vis-Absorptionsspektren des gekoppelten Systems zeigen, dass die Absorptionsbanden des Azoschalters durch die Kopplung an das Collagen nicht signifikant beeinflusst werden. Im IR-Absorptionsspektrum konnten wichtige Amid I-, Amid II- und Amid II0-Banden des Azoschalters und der Peptidsequenz sowie eine große Anzahl weiterer Banden zugeordnet werden. Temperaturabhängige Absolut- und Differenzspektren im UV/vis- und IR-Bereich zeigen eine irreversible thermische Denaturierung der Collagentripelhelix ab etwa 50°C. Das verwendete, deuterierte Lösungsmittelgemisch führt zu einem H/D-Austausch. Anhand der Amid II-Bande der in der tripelhelikalen Struktur geschützten Glycine kann die Existenz der Collagenstruktur und ihre Entfaltung nachgewiesen werden. Die Amplituden der photostationären Differenzspektren sind jedoch kleiner als beim isolierten Schalter, was auf eine verringerte Isomerisierungsquantenausbeute hinweist. Die bei Erwärmung beobachtete Vergrößerung der Differenzsignale wird mit einer effizienteren Isomerisierung nach dem Aufschmelzen der Tripelhelix erklärt. Für die trans->cis-Isomerisierungsrichtung wurden transiente IR-Spektren des Azocollagens bei unterschiedlichen Temperaturen aufgenommen. Alle instantan auftretenden Differenzsignale können auf die Schwingungsmoden des Azoschalters zurückgeführt werden. Bei einer Temperatur von 50°C lässt sich ein Einfluss der Peptidsequenz auf die transienten Spektren nicht nachweisen, was mit einer aufgeschmolzenen Tertiärstruktur im Einklang ist. Hingegen wird bei 20°C das Ausbleichen von Amid I-Schwingungsbanden der Peptidsequenz beobachtet, was eindeutig einen Energietransfer auf diese Moden zeigt. Bei 35°C sind die Bleichsignale des Collagens in diesem Bereich bereits deutlich abgeschwächt. Die transienten Spektren des isolierten Azoschalters besitzen keine derartige Temperaturabhängigkeit.
The glycine receptor (GlyR) is the major inhibitory neurotransmitter receptor in spinal cord and brainstem. Heteropentameric GlyRs are clustered and anchored at inhibitory postsynaptic sites by the binding of the large intracellular loop between transmembrane domains 3 and 4 of the GlyRbeta subunit (GlyRbeta-loop) to the cytoplasmic scaffolding protein gephyrin. GlyRs are also cotransported with gephyrin along microtubules in the anterograde and retrograde direction due to the binding of gephyrin to microtubule-associated motor proteins. Additionally, GlyRs undergo lateral diffusion in the plasma membrane from extrasynaptic to synaptic sites and vice versa. Since its discovery, gephyrin has remained for many years the only binding partner interacting directly with the GlyRbeta subunit. In an attempt to elucidate further mechanisms involved in GlyR function and regulation at inhibitory postsynaptic sites, a proteomic screen for putative binding partners to the GlyRbeta loop was performed. Three proteins were identified as putative interactors. In this thesis, the interaction between these putative binding proteins and the GlyRbeta subunit was analyzed and characterized. Binding studies with glutathione-S-transferase fusion proteins revealed that all putative binding proteins, Syndapin (Sdp), Vacuolar Protein Sorting 35 (Vps35) and Neurobeachin (Nbea), interact specifically with the GlyRbeta loop. The Sdp family of proteins are F-BAR and SH3 domain containing proteins. Inmmunocytochemical experiments showed that SdpI as well as the isoforms SdpII-S and SdpIIL colocalize with the full-length GlyRbeta subunit in a mammalian cell expression system. In cultured spinal cord neurons, a partial colocalization of endogenous SdpI with several excitatory and inhibitory synaptic markers was demonstrated. Mapping experiments using deletion mutants narrowed the SdpI binding site down to 22 amino acids. Peptide competition experiments confirmed the specificity of the interaction between SdpI and this sequence of the GlyRbeta subunit. Point mutation analysis revealed a SH3-proline rich domain dependent interaction between SdpI and the GlyRbeta subunit, respectively. In addition, binding studies in mammalian cells showed that both splice variants of SdpII as well as SdpI interact with the GlyR scaffolding protein gephyrin. Although the SdpI and gephyrin binding sites do not overlap, protein competition studies revealed that interaction of the E-domain of gephyrin with the GlyRbeta loop interferes with SdpI binding. Since SdpI is a dynamin binding protein involved in vesicle endocytosis and recycling pathways, a possible function of SdpI in the regulation of GlyR synaptic distribution was investigated. Co-immunoprecipitation experiments confirmed a SdpI-GlyR association in the vesicle-enriched fraction of rat spinal cord tissue. Immunocytochemical studies of SdpI knock out mice showed that the clustering and distribution of GlyRs in the brain stem is unchanged. However, acute down-regulation of SdpI in rat spinal cord neurons by viral shRNA expression led to a reduction in the number and size of GlyR clusters, an effect that could be rescued upon shRNA-resistant SdpI overexpression. Further immunocytochemical analysis of the localization of gephyrin, the gamma2 subunit of the type A gamma-aminobutyric acid receptor (GABAARgamma2 subunit) and the vesicular inhibitory amino acid transporter (VIAAT) under SdpI knock-down conditions showed that both the number and average size of the gamma2-subunit containing GABAA receptor clusters were significantly reduced in spinal cord neurons. In contrast to GlyR and GABAARgamma2 immunoreactivity, the number and average size of gephyrin and VIAAT clusters were barely reduced upon SdpI downregulation. These results suggest that SdpI has a role in GlyR trafficking that can be compensated by other syndapin isoforms or other trafficking pathways. Furthermore, SdpI might be required for the clusters of GlyRs and gamma2-subunit containing GABAARs in spinal cord and brainstem. Vps35 is the core protein of the retromer complex, which mediates the endosome to Golgi apparatus retrieval of different types of receptors in mammals and yeast. Here, protein-protein interaction assays revealed for the first time that Vps35 interacts directly with the GlyRbeta loop as well as with gephyrin. The generation of specific Vps35 antibodies allowed to determine the distribution of this protein in the central nervous system. Immunocytochemical analyses revealed the presence of Vps35 in the somata and neurites of spinal cord neurons, suggesting a possible interaction of Vps35 with the GlyR under physiological conditions. Nbea is a BEACH domain containing, neuron-specific protein. Binding studies revealed a direct interaction between two regions of Nbea and the GlyRbeta loop. Immunocytochemical experiments confirmed a somatic and synaptic distribution of Nbea in primary cultures. In spinal cord neurons, a partial colocalization of Nbea with excitatory and inhibitory synaptic markers suggests a possible interaction of Nbea with the GlyR at inhibitory synaptic sites.
Um Materie mit Nanometergenauigkeit anzuordnen, ist Selbstorganisation die mächtigste Strategie. DNA (Desoxyribonukleinsäure) ist hierfür ein hervorragendes Baumaterial, da sie ein billiges, programmierbares, biokompatibles und gut verstandenes Polymer ist. Aus diesen Gründen ist DNA zur Basis für ein schnell wachsendes Gebiet geworden: die DNA-Nanotechnologie. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Interaktionsmöglichkeiten für die DNA-Nanotechnologie zu entwickeln und neuartige Strukturen aus DNA-minicircles aufzubauen, einem bislang vernachlässigten Konstruktionselement. ...
The various OPE mixtures were also tested on sSOI material which consists of a thin strained silicon layer on top of an insulator like silicon dioxide. The OPE A, B and F are able to reveal threading dislocations (TD) in the strained silicon film (chapter 5.11). The TD densities determined for the OPE A correspond very well with those obtained with the Secco diluted reference. The tested OPE mixtures are not able to delineate other crystal defects like stacking faults, pile ups or twins, which also appear in the strained silicon. Some Organic Peracid Etches were also tested on wafers with an epitaxial silicon layer and on silicon substrates. Epitaxially produced silicon layers are nearly defect-free. Etching times were chosen such that only a part of the epitaxial layer was removed. Nevertheless, after very long etching times (> 16 h) isolated pits were found, with defect densities ranging from 104/cm3 to 106/cm3 depending on the etching solution used. No etch pits were found in the remaining epitaxial layer when OPE F was used. Longer etching times appear to favour the formation of artefects. These artefacts could be caused by the formation of gas bubbles, particles or micro scratches at the crystal surface. The OPE C and D are able to reveal vacancy agglomerates (D-defects) in silicon substrates (see under 5.5, 5.6 and 5.11in chapter 5). Due to their low removal rates and the long etching times which favour the formation of artifacts, these solutions are less suited to the delineation of defects in silicon substrates. In the second part of this study the different etch formulations have been compared with each other in respect of their physical properties like removal rates, activation energies, standard potentials and selectivities (chapter 6). The selectivity was determined at etch pits caused by dislocations. The depth of the etch pits, determined by atomic force microscopy (AFM), should be dependent on the selectivity of the corresponding etching solution used. The higher the selectivity of the solution the deeper the etch pit should be. It was assumed that a low removal rate and a high activation energy for the etching process should correspond to a high selectivity. However, the experimental results have shown that it is not possible to predict the selectivity of an etching solution from experimental parameters like removal rate or activation energy. One must bear in mind that selectivity was only determined on one particular type of crystal defect, namely on dislocations. Values for selectivity in the etching solutions can differ for other defect types. Besides the etching solutions used in this study differ considerably from each other in respect of their chemical and physical roperties. They can be divided into three completely different etching systems. The original Secco solution and the diluted variations thereof are hydrofluoric acid-dichromate mixtures with the Cr6+ species as the oxidizing agent. The Jeita and MEMC solutions contain nitric acid, hydrofluoric acid and, as diluents, acetic acid and water. Here the oxidizing agents are various N(III) species which are formed autocatalytically during the etching process. The concentration of acetic acid also plays an important role as it lowers the degree of dissociation of HF and of HNO3. This has an influence on the pH and the standard potential of the etching solution. The Organic Peracid Etches are mixtures of hydrogen peroxide and a short-chain alkanoic acid like acetic acid. Such systems are strictly speaking not aqueous solutions, the reactive species is the peracid formed.Within each system, however, a certain relationship is perceived between the selectivity of the etching solution on the one hand, and the and the activation energy or the removal rate on the other. The decreased activation energy for the etching process of silicon at a dislocation can be calculated from experimental data by using the Arrhenius equation (chapter 6.3). It was found that the strain inside the crystal lattice caused by a dislocation loop leads to an increase of the potential energy of ~ 5 % and, hence, a decrease of the activation energy of ~ 5 % and an increase in the removal rate of ~ 100 %.
Orthopoxviruses are large DNA viruses that replicate within the cytoplasm of infected cells encoding over a hundred different proteins. The orthopoxviral 68k ankyrin‐like protein (68k‐ank) is highly conserved among orthopoxviruses, and this study aimed at elucidating the function of 68k‐ank. The 68k‐ank protein is composed of four ankyrin repeats (ANK) and an F‐box‐like domain; both motifs are known proteinprotein interaction domains. The F‐box is found in cellular F‐box proteins (FBP), crucial components of cellular E3 ubiquitin (Ub) ligases. With yeast‐two‐hybrid screens and subsequent co‐immunoprecipitation analyses, it was possible to identify S‐phase kinase‐associated protein 1a (Skp1a) as a cellular counterpart of 68k‐ank via binding to the F‐box‐like domain. Additionally, Cullin‐1 was co‐precipitated, suggesting the formation of a viral‐cellular SCF E3 Ub ligase complex. Modified Vaccinia virus Ankara (MVA) ‐ being attenuated and unable to replicate in most mammalian cell lines due to a block in morphogenesis – nevertheless, expresses its complete genetic information attributing to its properties as promising vector vaccine. Conservation of 68k‐ank as the only ANK protein encoded by MVA implied a substantial role of this viral factor. Hence, its function in the viral life cycle was assessed by studying a 68k‐ank knock‐out MVA. A mutant phenotype manifested in nonpermissive mammalian cells characterized by a block succeeding viral early gene expression and by a reduced ability of the virus to shutoff host protein synthesis. Studies with MVA encoding a 68k‐ank F‐box‐like domain truncated protein revealed that viral‐cellular SCF complex formation and maintenance of viral gene expression are two distinct, unrelated functions fulfilled by 68k‐ank. Moreover, K1, a well‐described VACV host range factor of the ANK protein family, is able to complement 68k‐ank function. This suggests that gene expression of MVA putatively depends on the ANKs encoded in 68k‐ank. In addition to the important findings in vitro, first virulence studies with the mouse pox agent, ectromelia virus (ECTV) deleted of the 68k‐ank ortholog (C11) suggested that this factor contributes to ECTV virulence in vivo.
In dieser Arbeit wurden Methoden entwickelt, mit denen das Auflösungsverhalten schwer wasserlöslicher schwacher Säuren verbessert werden kann. Als Modellwirkstoffe wurden drei Vertreter der Sulfonylharnstoff-Gruppe (Glibenclamid, Glipizid und Glimepirid) gewählt. Diese Wirkstoffe, werden zur oralen Standardtherapie des Typ 2 Diabetes eingesetzt. Die Ergebnisse aus den Löslichkeits- und Freisetzungsuntersuchungen der reinen Arzneistoffe bildeten in dieser Arbeit den Ausgangspunkt der Entwicklungsarbeit. Um den Einfluss der galenischen Methoden auf das Freisetzungsverhalten der entwickelten Formulierungen besser zu beurteilen, wurden ebenfalls entsprechende Handelspräparate (Euglucon N 3,5 mg, Luditec 5 mg und Amaryl 4 mg) untersucht. Zunächst wurden mit Glibenclamid und dem natürlichen ?-CD sowie verschieden Cyclodextrin-Derivaten (M-?-CD und HP-?-CD) binäre Komplexe im molaren Verhältnis von 1:2 (Glibenclamid:CD) hergestellt und charakterisiert. Anschließend wurden feste Lösungen aus Glibenclamid und Kollicoat(r) IR bzw. PVP K30 entwickelt. Bei den nachfolgenden Freisetzungsuntersuchungen zeichnete sich im Falle der binären Cyclodextrin-Komplexe ab, dass der Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex das beste Freisetzungsverhalten von Glibenclamid in den untersuchten Medien erreichte. Bei den festen Lösungen von Glibenclamid gab es zwischen den beiden untersuchten Polymeren keine signifikanten Unterschiede im Ausmaß der Glibenclamidfreisetzung. Im nächsten Schritt wurden ternäre Komplexe (Glibenclamid-HP-?-CD-Polymer) entwickelt, eine Kombination aus binären CD- Komplexen und festen Lösungen. Als dritte Komponente wurden Kollicoat(r) IR, PVP K30 und PEG 6000 in unterschiedlichen Zusätzen, 5, 10 und 20% bezogen auf den zugrunde liegenden binären Glibenclamid-HP-?-CD-Komplex eingearbeitet. Die Charakterisierung der verschiedenen ternären Komplexe ergab, dass das beste Freisetzungsverhalten bei den Komplexen, welche einen 10%igen Kollicoat(r) IR- bzw. 20%igen PVP K30-Zusatz enthielten, generiert werden konnte. Bei den drei verwendeten Methoden (binäre-, ternäre Komplexe und feste Lösungen) erhielt man während der Freisetzungsuntersuchungen in den Medien mit einem pH-Wert unterhalb des pKs-Wertes von Glibenclamid (5,4) eine übersättigte Wirkstofflösung, was zum Teil innerhalb kürzester Zeit zum Präzipitieren des Wirkstoffes führte. Initiale DSC-Untersuchungen hatten gezeigt, dass Glibenclamid in den beschriebenen Präformulierungen in amorpher Form vorlag, was der Grund für die rasche Freisetzung war. Anschließend wurde versucht, das Präzipitieren zu verlangsamen und im besten Fall zu verhindern. Hierfür wurde HPMC in verschiedenen Formen verwendet. Das einfache Hinzumischen von HPMC in eine Gelatine-Kapsel zu der Glibenclamid-Formulierung führte aufgrund von Agglomeratbildungen zu einer deutlichen Verzögerung der Wirkstofffreisetzung. Pankreatin als Zusatz zum Freisetzungsmedium konnte die Bildung eines Agglomerates nicht verhindern, was darauf schließen ließ, dass dieses nicht durch sogenanntes "Cross-linking" der Gelatine entstanden war. In einem nächsten Schritt wurden HPMC-Kapseln eingesetzt. Die Glibenclamidfreisetzung konnte durch einfaches Austauschen der Gelatine-Kapseln gegen Vcaps(r) Plus-Kapseln in allen untersuchten Medien deutlich gesteigert werden, was auf die durch die Anwesenheit von HPMC verzögerte Präzipitation des Wirkstoffes im Freisetzungsmedium zurückzuführen war. Im nächsten Schritt wurde, die Formulierungsmethode von Glibenclamid, auf Glipizid übertragen. Es wurde analog zu Glibenclamid ein binärer Glipizid-HP-?-CD-Komplex im molaren Verhältnis von 1:2 (Glipizid:HP-?-CD) hergestellt. Dieser Komplex führte zu einer deutlichen Verbesserung des Auflösungsverhaltens von Glipizid, was zu einer annähernd 100%igen Wirkstofffreisetzung in allen untersuchten Medien führte. Weiterhin wurden die mit Glibenclamid entwickelten Methoden auch auf Glimepirid übertragen. Die Formulierung von Glimepirid zu einem binären Glimepirid-HP-?-CD-Komplex führte zu einer höheren Wirkstofffreisetzung, verglichen mit der kristallinen Reinsubstanz und des Handelspräparates. Durch die Verarbeitung von Glimepirid in ternären Komplexen erhöhte sich das Ausmaß der Wirkstofffreisetzung deutlich. Mit Kollicoat(r) IR konnte eine Wirkstofffreisetzung von ca. 60% der Dosis und mit PVP K30 als dritter Komponente sogar ca. 85% Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF erzielt werden. Das Präzipitieren des Wirkstoffes nach initialer Wirkstofffreisetzung in Blank FeSSIF konnte durch den Einsatz von Vcaps(r) Plus-Kapseln deutlich reduziert werden. Stabilitätsuntersuchungen, welche mit den in dieser Arbeit verwendeten Präformulierungen durchgeführt wurden zeigten, dass der jeweilige Wirkstoff auch nach einem Jahr der Lagerung bei Raumtemperatur und < 30% rel. Luftfeuchte, in amorpher Form in den entsprechenden Präformulierungen vorlag. All diese Untersuchungen zeigten eindrucksvoll, dass sich Cyclodextrin-Derivate in Kombination mit hydrophilen Polymeren, dazu eigneten, die Verfügbarkeit schwer löslicher Wirkstoffe im Dünndarm für deren Resorption zu verbessern. Es wurde gezeigt, dass die Herstellungsmethodik der Cyclodextrin-Komplexe einen wesentlichen Einfluss auf die Wirkstofffreisetzung hatte.
1. Fab co-complexes of proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) Fab fragments suitable for co-crystallization with complex I were generated using an immobilized papainbased protocol. The binding of the antibody fragments to complex I was verified using Surface Plasmon Resonance and size exclusion chromatography. The binding constants of the antibodies and their respective Fab fragments were found to be in the nanomolar range. This work presents the first report on successful crystallization of complex I (proton pumping NADH:ubiquinone oxidoreductase) from Yarrowia lipolytica with proteolytic Fab fragments. The quality of the crystals was significantly improved when compared to the initial experiments and the best crystals diffracted X-rays to a resolution of ~7 Å. The activity of complex I remained uninfluenced by antibody fragment binding. The initial diffraction data suggest that the complex I/Fab co-complex crystals represent a space group different to the one observed for the native protein. Ongoing experiments are aimed at further enhancements of the diffraction quality of the crystals. Providing a different space group the CI/Fab co-complexes may become a very useful approach for structure determination of the enzyme. Moreover, the bound Fab offers an additional possibility to generate phase information. The antibody-mediated crystallization represents a valuable tool in structural characterization of the NADH:oxidoreductase subcomplexes or even single subunits. 2. UDP-glucose pyrophosphorylase UDP-glucose pyrophosphorylase from Yarrowia lipolytica displays affinity towards Ni2+ NTA and was first detected in a contaminated sample of complex I. Following, separation from complex I, Ugp1p was purified using anion exchange chromatography. Sequence similarity studies revealed high identity to other known pyrophosphorylases. As indicated by laser-based mass spectrometry method (LILBID) Ugp1p from Y. lipolytica builds octamers similarly to the enzyme from Saccharomyces cerevisiae. The initial crystals grew as thin needles favorably in sitting drop setups. The size of the crystals was increased by employment of a micro batch technique. The improved crystals diffracted X-rays to a resolution of 3.2 Å at the synchrotron beamline. Structural characterization is under way using a molecular replacement approach based on the published structure of baker’s yeast UGPase.
Die genetische Information innerhalb einer Zelle kodiert nicht nur die spezifische Struktur und Funktion von Proteinen, sondern auch die Entstehung dieser Struktur durch den Prozess der Proteinfaltung. Aus zahlreichen experimentellen und theoretischen Studien wurde offensichtlich, dass Faltung und Entfaltung von Proteinen in vielen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielt. Diese Beobachtungen führten zu der zwangsläufigen Erkenntnis, dass das Unvermögen von Proteinen sich korrekt zu falten oder korrekt gefaltet zu bleiben der Auslöser für viele verschiedene Arten biologischen Fehlverhaltens ist und infolgedessen unterschiedliche Krankheitsformen mit sich bringt. Die strukturelle und dynamische Charakterisierung von nicht-nativen Proteinzuständen ist daher eine wichtige Grundlage einerseits zur Erforschung der krankheitsauslösenden Prozesse, andererseits aber auch zum generellen Verständnis der Proteinfaltung an sich. Allein hochauflösende NMR-Experimente können detaillierte Informationen über Struktur und Dynamiken solcher Zustände auf atomarer Ebene liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde die C-terminale Domäne des humanen Prionenproteins [hPrP(121-230)] unter Bedingungen untersucht, bei denen dieses Protein permanent in einem nicht-nativen Zustand vorliegt. Dies wurde durch die Verwendung einer hochmolaren Harnstofflösung (8 M, pH 2,0) erreicht. Zur Untersuchung dieses nicht-nativen Zustands mittels NMR wurde das PrP(121-230) in E.coli-Zellen isotopenmarkiert exprimiert und in Mengen von einigen Milligramm aufgereinigt. Nach der sequentiellen Zuordnung der 13Ca-, 13Cb-, 13CO-, 1Ha- und 1HN-Resonanzen konnte aus den sekundären chemischen Verschiebungen auf Regionen innerhalb der Polypeptidkette geschlossen werden, die erhöhte b-faltblattartige Konformationsanteile enthalten. Heteronukleare Relaxa-tionsraten wurden zur Untersuchung der konformationellen Dynamik herangezogen. Auch hier konnten Regionen verminderter Mobilität (hydrophobe Cluster) nachgewiesen werden, die mit den zuvor entdeckten Bereichen aus der Analyse der chemischen Verschiebungen übereinstimmten. Die Messung von R1r-Relaxationsraten erbrachte zudem keine Hinweise auf konformationellen Austausch auf der μs-ms-Zeitskala. Weiterhin wurde der Einfluss der Disulfidbrücke auf Konformation und Dynamik des hPrP(121-230) untersucht. Dies wurde durch die Reduktion der Disulfidbrücke und die anschließende Methylierung der beiden Cysteine erreicht. Im Gegensatz zu der Analyse der chemischen Verschiebungen zeigte die Auswertung der konformationellen Dynamiken dramatische Unterschiede zwischen den oxidierten und reduzierten Zuständen des hPrP(121-230). Insbesondere im Bereich um die beiden Cysteine konnten große Unterschiede festgestellt werden; im reduzierten Zustand führte die zusätzliche Bewegungsfreiheit zu erhöhten Dynamiken und gab den Blick auf zusätzliche hydrophobe Bereiche frei, die im oxidierten Zustand durch hohe Relaxationsraten verdeckt geblieben waren. Ein weiterer wesentlicher Unterschied zwischen dem oxidierten und dem reduzierten Zustand des hPrP(121-230), der mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffes Thioflavin T beschrieben werden konnte, bestand in der Fähigkeit Fibrillen auszubilden; während das oxidierte hPrP diese Eigenschaft besaß, führte der Verlust der intakten Disulfidbrücke zu einer Proteinkonformation, die nicht mehr zur Bildung von fibrillären Strukturen im Stande war. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die strukturellen, dynamischen und kinetischen Charakteristika des hPrP(121-230) mit denen des murinen Prionenproteins mPrP(121-232) sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand verglichen. Auf der Basis der chemischen Verschiebungen und der heteronuklearen Relaxationsdaten konnte gezeigt werden, dass beide Proteine in den jeweiligen komplementären Zuständen (oxidiert bzw. reduziert) sehr ähnliche strukturelle und dynamische Eigenschaften besitzen. Aufgrund einiger Aminosäureaustausche in den beiden Proteinsequenzen kommt es jedoch zu kleineren Unterschieden, die jedoch nur in lokalen Bereichen der Polypeptidkette zum Tragen kommen. Somit konnte gezeigt werden, dass das mPrP(121-232) als ein geeignetes Modellsystem für das humane Prionenprotein dienen kann. Abschließend wurde der Einfluss von insgesamt zwölf verschiedenen Punktmutationen, die beim Menschen mit Prionenerkrankungen assoziiert sind, auf das Aggregationsverhalten des mPrP(121-232) untersucht. Dabei fiel zum einen auf, dass die Aggregation mit zunehmender Proteinkonzentration schneller verlief, zum anderen aber auch, dass es insbesondere bei geringen Proteinkonzentrationen zu signifikanten Unterschieden in der Aggregationsgeschwindigkeit der verschiedenen mutierten Proteinkonstrukte kommt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass in dieser Arbeit strukturelle und dynamische Eigenschaften der nicht-nativen Zustände von hPrP(121-230) und mPrP(121-232) sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand durch die Verwendung von NMRspektroskopischen Experimenten charakterisiert werden konnten. Zudem konnte mit Hilfe von Fluoreszenzspektroskopie das Aggregationsverhalten der einzelnen Proteinzustände beschrieben und in einem ersten Schritt der Einfluss von verschiedenen Punktmutationen auf die Aggregationsgeschwindigkeit ermittelt werden.
Es wurden mit phys. Verfahren hergestellte 200 und 500 nm dicke Niobfilme auf oxidiertem Si thermischen Kurzzeitprozessen (RTP) unterzogen, um Oxynitride zu synthetisieren. Die Filme wurden mit verschiedenen Methoden untersucht, um einen Überblick über die entstandenen Produkte und ihre Position im Film zu erlangen. Die Reaktionen wurden in N2 oder NH3 zur Nitridierung mit anschließender Oxidation in O2 durchgeführt. Um eine mögliche direkte Einstufensynthese von Oxynitriden des Niobs zu finden, wurde N2O eingesetzt. Der einfachste Ansatz zur Präparation von Oxynitriden bestand in der Verwendung des N2 und NH3, mit denen die Metallfilme zwischen 600 und 1200 °C umgesetzt wurden. Die Nitridierung mit N2 verlief von der Bildung einer festen Stickstofflösung in Niob bei tiefen Temperaturen über Nb2N zwischen 700 und 1000 °C bis zum Nb4N3 oberhalb 1000 °C. Aus dem Substrat diffundierte Sauerstoff aus, der am Interface Nb/SiO2 zur Bildung einer Oxidzone führte. Der O-Gehalt der Oxide stieg mit steigender Reaktionstemp. Unterhalb 1000 °C wurde NbO gefunden, oberhalb 1000 °C bildete sich NbO2. Eine TEM-Untersuchung gekoppelt mit EEL-Spektrometrie ergab Hinweise auf die Bildung einzelner stickstoffreicher NbOxNy-Kristallite im Bulk der mit N2 umgesetzten Filme. Auch die Nitridierung mit NH3 ergab eine Abhängigkeit des N-Gehaltes der Produkte von der Rkt.-Temperatur. Es erfolgte die Bildung der festen Lösung und Nb2N bei tiefen und mittleren Temperaturen. Ab 900 °C bildete sich NbN, oberhalb 1100 °C wurde vermutlich Nb4N5 detektiert. Im Gegensatz zur Umsetzung mit N2 ergaben genauere Untersuchungen der in NH3 nitridierten Filme keine Hinweise auf die Bildung von Oxynitriden. Die Erstellung von Tiefenprofilen zeigte, dass sich Nitridphasen mit höchstem N-Gehalt an der Oberfläche befanden und der Anteil des Stickstoffs in den Produkten mit zunehmender Tiefe abnahm. Mit Oxiden verhielt es sich umgekehrt: Sobald höhere Oxide gebildet wurden, befanden sie sich am Interface, wo die Sauerstoffkonzentration am höchsten ist. Oxide mit niedrigerem O-Gehalt wurden in der Filmmitte gefunden, wo der Sauerstoff durch die gebildeten Nitride an der Diffusion in Richtung Filmoberfläche gehindert wurde. Die 200-nm-Filme waren formal reaktiver als die 500-nm-Filme. Sie bildeten bereits bei tieferen Temperaturen Phasen mit höherem N- oder O-Gehalt, wofür das geringere zur Verfügung stehende Volumen ursächlich ist. Die Reinheit der Filme führte zu Unterschieden in der Reaktivität: Gesputterte Filme waren reiner als aufgedampfte Filme, die auf Grund der Einlagerung einer geringen Sauerstoffmenge während der Präparation passiviert waren. Dadurch wurde die Diffusion des Stickstoffs eingeschränkt zur Bildung abweichender Phasen zwischen aufgedampften und gesputterten Filmen. Eine Variante der Nitridierung in N2 bzw. NH3 bestand in der Verwendung von O2 als Kühlgas. Die Zugabe des O2 wurde bei unterschiedlichen Temperaturen untersucht. Statt der Einlagerung von Sauerstoff in das Oberflächennitrid unter Oxynitridbildung kam es zur Bildung einer oxidischen Deckschicht. Die Bildung der Schicht erforderte eine Zugabetemperatur höher als 700 °C, bei tieferen Temperaturen war der Film durch das bereits gebildete Nitrid soweit passiviert, dass keine chemische Veränderung stattfand. Die im Nitridierungsschritt gebildeten Produkte wurden als Auswirkung des sog. Schneepflugeffektes unter Kompression in tiefere Filmregionen verschoben. Dies führte zur Bildung von Produkten höherer Stöchiometrie (Nb2N zu NbN oder NbO zu NbO2). Der Einsatz von Lachgas, der zur Einlagerung von N2O-Einheiten in den Metallfilm führen sollte, verlief ergebnislos. Bei Prozesstemperaturen unterhalb 450 °C wurde lediglich die Bildung einer festen Lösung von Sauerstoff im Niob nachgewiesen. Oberhalb 450 °C zersetzte sich N2O unter O-Bildung wodurch der Film oxidiert wurde. Die Umsetzung nitridierter Filme mit N2O und auch dessen Verwendung als Kühlgas brachte keine Veränderung. Die Oberflächennitride waren stabil gegenüber dem N2O. Die Nitridierung der Filme im N2-Strom wurde durch die stoßweise Zugabe von O2 bzw. N2O nach definierten Zeiten variiert. Die Filme bilden nach kurzen Nitridierungszeiten von maximal 20 s gefolgt von einem 10-sek. Sauerstoffstoß eine komplizierte Filmstruktur aus, wie das elementare Tiefenprofil zeigt, das in denselben Filmzonen sowohl Stickstoff als auch Sauerstoff nachweist. Da die Röntgendaten lediglich die Bildung von NbO2 nachweisen, jedoch mit einer leichten Verschiebung der Reflexe zu kleineren Winkeln aufgrund der Einlagerung der größeren Nitridionen in das Oxidgitter, muss es sich bei dem präparierten Film um ein Oxynitrid der Form NbO(2-x)Nx handeln, in dem das Verhältnis von N zu O auf der sauerstoffreichen Seite liegt.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine Variante des Anti-Thrombin-Aptamers HD1 entwickelt, die vor Belichten aktiv war und sich durch Belichten deaktivieren ließ. Dazu wurde das Wildtyp-Aptamer am 5'-Ende um eine GAAA-Schleife und eine Gegenstrangregion, bestehend aus vier Nukleotiden, erweitert. Dies reichte für eine vollständige Inaktivierung des Aptamers aus. In die Gegenstrangregion wurde ein photolabil geschütztes Nukleotid eingebaut, das die Bildung einer Haarnadelstruktur vorübergehend verhindert. Dazu wurde ein Desoxycytidin-Derivat synthetisiert, das an seiner N4-Position mit einer 1-(2-Nitrophenyl)ethyl-Gruppe modifiziert war. Durch die Maskierung der Antisense-Region wies das Aptamer vor Belichtung blutgerinnungshemmende Aktivität auf, allerdings in geringerem Maße als das Wildtyp-Aptamer. Durch Belichten wurde die Gegenstrangregion freigesetzt und dadurch die aktive Konformation des Aptamers zerstört, sodass es keine blutgerinnungshemmende Wirkung mehr besaß. In einem daran anknüpfenden Projekt sollte eine mit Licht ausschaltbare HD1-Variante mit verbessertem Schaltverhalten entwickelt werden, deren Aktivität vor dem Belichten mit der des Wildtyp-Aptamers vergleichbar ist. Tests zeigten, dass eine 5'-Erweiterung des Aptamers stets einen Aktivitätsverlust zur Folge hatte. Getestet wurden verschiedene Linker-Sequenzen, D-Spacer (Abasic Sites) und nicht nukleotidische Linker wie Glykollinker oder alkylische Linker. Eine Erweiterung am 3'-Ende brachte dagegen fast immer Aptamervarianten hervor, deren Aktivität die des Wildtypaptamers überstiegen. Um diese verbesserten Aptamervarianten zu deaktivieren, war eine Antisense-Region bestehend aus bis zu neun Nukleotiden nötig. Für eine photolabil geschützte Variante wurde zusätzlich ein Desoxyadenosinderivat mit N6-1-(2-Nitrophenyl)ethylmodifikation synthetisiert. Es zeigte sich, dass eine photolabile Schutzgruppe nicht ausreichte um die Antisense- Region zu neutralisieren. Aptamervarianten mit vier oder fünf photolabilen Schutzgruppen in der Antisenseregion waren vor dem Belichten aktiver als das Wildtyp-Aptamer HD1 und konnten durch Belichten vollständig deaktiviert werden. In einem weiteren Projekt dieser Arbeit wurde eine photolabil geschützte Glukosamin-6- phosphat-Variante synthetisiert, um eine lichtabhängige Spaltung des glmS-Ribozyms aus Bacillus subtilis zu induzieren. Dazu wurde GlcN6P an der Aminofunktion über eine Carbonyllinker mit einer 2-(2-Nitrophenyl) propylgruppe modifiziert. In vitro konnte gezeigt werden, dass mit dieser Verbindung durch Belichten die Spaltung eines glmS-EGFP-mRNA-Konstrukts induziert werden konnte. In HeLa-Zellen wurde untersucht, ob sich dieses System zur Regulation der EGFP-Expression eignet. Da erste Versuche erfolglos blieben, wurde eine lipophile, zellgängige Variante des photolabil geschützten GlcN6Ps synthetisiert. Versuche, in denen dieses Derivat getestet wird, werden zur Zeit von unseren Kooperationspartnern durchgeführt. In einem weiteren Projekt wurden Desoxyguanosinderivate für die DNA-Festphasensynthese synthetisiert, die an ihrer O6-Position mit einer p-Hydroxyphenacylgruppe bzw. mit einer 1-(3-Nitrodibenzofuran-2-yl)ethylgruppe modifiziert wurden. Diese wurden in ein Desoxyoligonukleotid eingebaut und es konnte gezeigt werden, dass die photolabilen Schutzgruppen durch Belichten abgespalten werden. Beide photolabilen Modifikationen waren allerdings unter den basischen DNA-Abspaltbedingungen zu instabil, als dass sie sich für den routinemäßigen Einsatz zur Herstellung lichtaktivierbarer Nukleinsäuren eignen würden. Im letzten Teil der Arbeit wurde eine photolabile Schutzgruppe entwickelt, die über einen zusätzlichen Aminolinker verfügt [2-(4-(Aminomethyl)-2-nitrophenyl)-propanol]. Die Aminofunktionalität war für die Dauer der DNA/RNA-Festphasensynthese mit einer Trifluoracetylgruppe geschützt, die unter den basischen Abspaltbedingungen ebenfalls entfernt wird. Mit dieser photolabilen Schutzgruppe wurden ein Thymidinderivat an der O4-Position und ein Desoxyguanosinderivat an der O6-Position modifiziert. Das Desoxyguanosinderivat wurde erfolgreich in der Oligonukleotidfestphasensynthese eingesetzt. Die photolabile Schutzgruppe konnte durch Belichten vollständig von der synthetisierten Nukleinsäure abgespalten werden. Darüber hinaus gelang es, über die Aminofunktionalität die heterobifunktionalen Crosslinker SMCC und SMPB mit der Nukleinsäure zu verknüpfen. Auf diese Weise ist eine reversible Vernküpfung der Nukleinsäure mit einem nahezu beliebigen Bindungspartner möglich. Durch Belichten kann die Nukleinsäure in ihrer ursprünglichen Form wiederhergestellt werden.
Type 1 diabetes (T1D) is a chronic T cell-mediated autoimmune disorder that results in the destruction of insulin-producing pancreatic ß cells leading to life-long dependence on exogenous insulin. Attraction, activation and transmigration of inflammatory cells to the site of ß-cell injury depend on two major molecular interactions. First, interactions between chemokines and their receptors expressed on leukocytes result in the recruitment of circulating inflammatory cells to the site of injury. In this context, it has been demonstrated in various studies that the interaction of the chemokine CXCL10 with its receptor CXCR3 expressed on circulating cells plays a key role in the development of T1D. Second, once arrived at the site of inflammation adhesion molecules promote the extravasation of arrested cells through the endothelial cell layer to penetrate the site of injury. Here, the junctional adhesion molecule (JAM) JAM-C expressed on endothelial cells is involved in the process of leukocyte diabedesis. It was recently demonstrated that blocking of JAM-C efficiently attenuated cerulein-induced pancreatitis in mice. In my thesis I studied the influence of the CXCL10/CXCR3 interaction on the one hand, and of the adhesion molecule JAM-C on the other hand, on trafficking and transmigration of antigen-specific, autoaggressive T cells in the RIP-LCMV mouse model. RIP-LCMV mice express the glycoprotein (GP) or the nucleoprotein (NP) of the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) as a target autoantigen specifically in the ß cells of the islets of Langerhans and turn diabetic after LCMV-infection. In my first project I found that pharmacologic blockade of CXCR3 during development of virus-induced T1D results in a significant delay but not in an abrogation of overt disease. However, neither the frequency nor the migratory properties of islet-specific T cells was significantly changed during CXCR3 blockade. In the second project I was able to demonstrate that JAM-C was upregulated around the islets in RIP-LCMV mice after LCMV infection and its expression correlated with islet infiltration and functional ß-cell impairment. Blockade with a neutralizing anti-JAM-C antibody slightly reduced T1D incidence, whereas overexpression of JAM-C on endothelial cells did not accelerate virus-induced diabetes. In summary, our data suggest that both CXCR3 as well as JAM-C are involved in trafficking and transmigration of antigen-specific autoaggressive T cells to the islets of Langerhans. However, the detection of only a moderate influence on the onset of clinical disease during CXCR3 or JAM-C blockade reflects the complex pathogenesis of T1D and indicates that several different inflammatory factors need to be neutralized in order to achieve a stable and persistent protection from disease.
Erkrankungen des hämatopoietischen Systems treten oft als Folge balancierter chromosomaler Translokationen auf. Dabei ist das MLL Gen auf Chromosom 11 Bande q23 in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen involviert. Alle diese Veränderungen sind entweder mit einer akuten myeloischen oder lymphatischen Leukämie assoziiert. Translokationen mit Beteiligung des MLL Gens - mit Ausnahme der Translokation t(9;11) - werden aufgrund ihrer schlechten Therapierbarkeit und schlechten Prognose als Hochrisiko- Leukämien eingestuft. Das häufigste Partnergen ist das AF4 Gen (42% aller MLL Translokationen) auf Chromosom 4 Bande q21. Die daraus resultierende Translokation t(4;11) ist mit einer akuten lymphatischen Leukämie (pro-B ALL) assoziiert und tritt gehäuft bei Säuglingen und Kleinkindern auf. Das Resultat der Translokation t(4;11) ist letztendlich die Entstehung zweier reziproker Derivatchromosomen, die die beiden Fusionsgene MLL•AF4 und AF4•MLL kodieren. Welcher Mechanismus die Entstehung der Leukämie hervorruft, konnte bis heute nicht ausreichend geklärt werden. Basierend auf den Daten anderer MLLassoziierter Translokationen, dass ausschließlich das Derivat 11 Fusionsprotein onkogene Effekte vermittelt, wurde das Fusionsprotein MLL•AF4 intensiv erforscht. Erst Ende 2008 gelang es einer amerikanischen Arbeitsgruppe in einem Mll•AF4 knock-in Mausmodell den Krankheitsphänotyp einer AML bzw. einer prä-B ALL auszulösen. Allerdings exprimieren 80% aller t(4;11)-Patienten auch das reziproke AF4•MLL Fusionstranskript und die restlichen 20% tragen komplexe Aberrationen zwischen MLL, AF4 und einem dritten oder sogar einem vierten Partnergen. Deshalb befassen sich die Studien unserer Arbeitsgruppe hauptsächlich mit dem reziproken AF4•MLL Fusionsprotein. Die Ergebnisse dieser Studien zeigen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein in den Zellen akkumuliert und dadurch onkogene Ereignisse auslöst, welche letztendlich in der Wachstumstransformation der Zellen resultieren. Aufgrund dieser Daten war davon auszugehen, dass das AF4•MLL Fusionsprotein ebenfalls einen entscheidenden Beitrag bei der Entstehung der Leukämie leistet. Um das leukämogene Potential der beiden Fusionsproteine MLL•AF4 und AF4•MLL in einem Mausmodell weiter zu untersuchen, wurde zunächst ein retrovirales Transduktionssystem in BA/F3-Zellen etabliert. Dabei wurden BA/F3-Zellen sowohl einzeln mit MLL•AF4 oder AF4•MLL als auch mit beiden Fusionsgenen der Translokation t(4;11) cotransduziert. Nachdem die Funktionalität der beiden Expressionskassetten, durch full-length Integration und durch Transkription erfolgreich nachgewiesen werden konnte, erfolgten erste Transduktions-/Transplantationsexperimente in Mäusen. Dafür wurden Lin-/Sca-1+ aufgereinigte Knochenmarkzellen mit retroviralen Überständen von MLL•AF4 und AF4•MLL einzeln- als auch co-transduziert. Mäuse denen MLL•AF4- oder Mock-transduzierte Lin-/Sca-1+-Zellen transplantiert wurden, entwickelten über einen Beobachtungszeitraum von 13 Monaten keinerlei Anzeichen einer leukämischen Erkrankung. Im Gegensatz dazu resultierte die Transplantation von AF4•MLLoder co-transduzierten Lin-/Sca-1+-Zellen in der Entwicklung einer leukämischen Erkrankung innerhalb von 7 Monaten. Anhand pathologischer Parameter, sowie durch histochemische, molekulare als auch durchflusszytometrische Analysen konnten drei verschiedene Immunophänotypen identifiziert werden. Die Expression des Fusionsproteins AF4•MLL resultierte in der Ausprägung des Phänotyps einer pro-B ALL oder einer B/T biphänotypischen akuten Leukämie (B/T BAL). In Anwesenheit beider Fusionsproteine der Translokation t(4;11) entwickelte sich ebenfalls eine B/T BAL oder einer Mixed Lineage Leukemia (MLL). Retransplantationsexperimente mit den primären leukämischen Blasten zeigten, dass die drei verschiedenen Krankheitsphänotypen stabil transplantierbar sind, wobei sich die Latenzzeit erheblich verkürzte. Damit wurde zum ersten Mal der Beweis erbracht, dass das Fusionsprotein AF4•MLL auch allein ohne die Gegenwart des Fusionsproteins MLL•AF4 in der Lage ist eine leukämische Erkrankung auszulösen. Aufgrund dieser Daten, vorausgehenden Studien unserer Arbeitsgruppe sowie den Studien zum Fusionsprotein MLL•AF4 ist davon auszugehen, dass der pathomolekulare Mechanismus der Translokation t(4;11) auf zwei Onkoproteinen basiert.
Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Außergewöhnliche Fortschritte in der Human- und Mausgenetik führten zur Charakterisierung einer Vielzahl von krankheitsrelevanten Mutationen, die entweder natürlich auftreten oder über genetische Manipulation im Tiermodell erzeugt wurden. Die nahezu vollständige Sequenzierung der Genome von Mensch und Maus im Rahmen der internationalen Sequenzierungsprojekte ebnete den Weg für groß angelegte, internationale Mutagenese-Programme, die zum Ziel haben jedes einzelne Gen funktionell zu charakterisieren. Der hierfür bevorzugte Organismus ist die Maus, weil der Aufbau des Mausgenoms dem menschlichen Genom sehr ähnlich ist und weil für die Maus embryonale Stammzellen (mES Zellen) existieren, die ohne Einschränkung ihres pluripotenten Status in Gewebekultur genetisch manipuliert werden können. Darüber hinaus lassen sich mES Zellen über Blastozysteninjektion in Mäuse konvertieren. Dadurch können die Folgen von in vitro gesetzten Mutationen im Kontext eines Gesamtorganismus analysiert werden. Die so genannte „Knock out“ Maus ist ein weit verbreitetes Tiermodell, das nicht nur Genfunktionen in vivo offenbart, sondern auch die Modellierung humaner genetischer Erkrankungen ermöglicht. Mit dem Ziel Kranheitsgene ihren Signalwegen zuzuordnen wurde in dieser Dissertation ein in situ Proteinmarkierungssystem entwickelt, das Hochdurchsatz-proteomik in mES Zellen ermöglicht. Das System beinhaltet die Einführung einerProteinmarkierungskassette in mES Zellen, die konditionale FlipROSAβgeo-Genfal-lenintegrationen in proteinkodierenden Genen enthalten. Weil die Konditionalität der FlipROSAβgeo-Genfallenkassette auf einem sequenzspezifischen Rekombinations-mechanismus beruht, kann diese postinsertionell über Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) durch eine Proteinmarkierungskassette ersetzt werden. Das hierfür entwickelte Konstrukt entspricht einem durch 5’ Spleißakzeptor- und 3’ Spleißdonorsequenzen definierten dizistronischen Exon, in dem ein Hygromyzin-Resistenzgen über eine P2A Polyproteinspaltungssequenz mit einem für das egfp (enhanced green fluorescent protein) kodierenden nLAP-Tag (N-terminal localization and affinity purification) verbunden ist. Eine erste Validierung dieses Exons in einem retroviralen Genfallenansatz ergab, dass sämtliche in Hygromyzin selektierte und auf DNA-Kassettenintegrationen untersuchte Klone nLAP-markierte Proteine exprimierten. Im Folgenden wurden in den GGTC (German Gene Trap Consortium) und EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis Project) mES Zellressourcen Genfallenintergationen identifiziert, die sich für eine RMCE vermittelte, N-terminale in situ Proteinmarkierung eignen. Als kompatibel wurden Genfallenklone klassifiziert, die eine FlipROSAβgeo-Integration im ersten Intron eines proteinkodierenden Gens aufweisen, wobei diese Integration sowohl hinter einem ersten nichtkodierenden, als auch hinter einem ersten kodierenden Exon liegen kann. Allerdings darf im letzteren Fall die kodierende Sequenz keine funktionale Domäne enthalten und muss kurz genug sein, um bei Verlust nicht mit der endogenen Proteinfunktion zu interferieren. Auf diesen Kriterien basierend wurden in den GGTC und EUCOMM Ressourcen 25.130 Proteinmarkierungs-kompatible Genfallenklone identifiziert, die 3.695 mutierten Genen entsprechen. Hiervon wurden acht für die Validierung der RMCE-vermittelten Proteinmarkierungsstrategie ausgewählt. In jedem Fall gelang es die Genfallen-kassette mit dem Proteinmarkierungsexon zu ersetzten. Sowohl der Genfallen-, als auch der RMCE-Proteinmarkierungsansatz führte ohne Ausnahme zur Expression nLAP-Tag markierter Proteine, wobei in allen 13 untersuchten Klonen die Größe der markierten Proteine derjenigen der entsprechenden nativen Proteine mit zusätzlichem Marker entsprach. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die physiologische Expression der markierten Proteine sich von denen der Wildtypproteine in der Regel nicht unterscheidet und für Lokalisations- und massenspektrometrische Interaktionsstudien ausreicht. Darüber hinaus spiegelten 90% der hier untersuchten markierten Proteine das subzelluläre Lokalisationsmuster der entsprechenden nativen Proteine wider. Ähnlich verhielt es sich mit den Interaktionspartnern der jeweiligen Proteine, die sich aus bereits bekannten, aber auch noch bisher unbekannten Proteinen zusammensetzen. Insgesamt wurden in dieser Dissertation die Voraussetzungen zu einer Hochdurchsatzproteomanalyse in mES Zellen geschaffen. Während der RMCE-Ansatz die Markierung von über 3.600 Proteinen in mES Zellen ermöglicht, eignet sich der Genfallenansatz neben der Proteinmarkierung in murinen auch für die Markierung von Proteinen in humanen Zellen. In dieser Hinsicht ist die Markierung von Proteinen in humanen ES Zellen und in reprogrammierten Stammzellen (iPS) von Patienten mit unterschiedlichsten Erkrankungen besonders attraktiv, weil damit sowohl Spezies- als auch Krankheitsspezifische Unterschiede im Ablauf individueller Signaltransduktionskaskaden definiert werden können.
Durchgeführte Arbeiten und Ergebnisse: Zur Erschließung des Themas Lebensmittelverpackungen im Chemieunterricht wurde zunächst eine grundlegende fachliche Recherche durchgeführt, um mögliche thematische Schwerpunkte zu identifizieren und Grundlagen für eine experimentelle Zugänglichkeit zu erarbeiten. Parallel hierzu wurde der derzeitige Stand der fachdidaktischen Forschung unter besonderer Berücksichtigung des Themas Lebensmittelverpackungen erhoben. Es zeigte sich, dass nur vereinzelt auf diese Themenstellung eingegangen wird. Dabei steht allerdings, wie etwa bei dem Recycling von Joghurtbechern, die stoffliche Weiterverwendung von Abfällen im Vordergrund, während die Anforderungen an die Eigenschaften einer Verpackung keine Rolle spielen. Daher erfahren Bau und Funktion unterschiedlicher Verpackungsmaterialien in der vorliegenden Arbeit eine besondere Berücksichtigung. Die vorliegende Arbeit umfasst im Wesentlichen zwei Schwerpunkte: - Die schulexperimentelle Erschließung des Themas Lebensmittelverpackungen für unterschiedliche Klassenstufen, - die exemplarische Ausarbeitung von Unterrichtseinheiten, die die Möglichkeit der Integration der Experimente in die Schulpraxis aufzeigen. Bei der experimentellen Entwicklung stand die Barrierefunktion der Lebensmittelverpackungen und im Hinblick auf die Verträglichkeit mit Lebensmitteln deren chemische Zusammensetzung im Vordergrund. Gesichtspunkte wie die mechanische Belastbarkeit, z. B. die Reißfestigkeit einer Verpackungsfolie, wurden erst in zweiter Linie erarbeitet. Die Struktur-Eigenschaftsbeziehungen wurden thematisiert. Zunächst wurde eine Versuchsreihe ausgearbeitet, die die Funktion von Aluminiumschichten in Lebensmittelverpackungen in das Zentrum der Betrachtung stellt. Hierbei konnte zur Bestimmung der Dicke einer Aluminiumschicht mit schulischen Mitteln ein Verfahren ausgearbeitet werden, in dem die Aluminiumanteile einer ausgemessenen Fläche einer Verpackung gelöst und anschließend über eine Titration bestimmt werden. Diese Versuchsreihe kann auf viele Beispiele angewandt werden und liefert zuverlässige Ergebnisse. Der Nachweis unterschiedlicher Kunststoffe in Lebensmittelverpackungen stand im Mittelpunkt einer zweiten Versuchsserie. Hierbei wurden Versuche zur Analyse von Verpackungsstoffen (Polyolefine und Polykondensate) entwickelt und zusammengestellt. Einfache Versuche zeigen die Möglichkeit zur Trennung der Schichten von Verbundfolien sowie die chemische Beschaffenheit der verwendeten Polymere. Es wird anhand der gewählten Beispiele auf die unterschiedlichen Eigenschaften von Folien, wie Sauerstoffdurchlässigkeit und Wasserdampflöslichkeit, eingegangen. Dabei wird die gezielte Kombination unterschiedlicher Folien berücksichtigt. Eine wesentliche Fragestellung bei der Auswahl von Lebensmittelverpackungen ist die Frage nach der Barrierewirkung gegenüber unerwünschten Stoffen, z.B. von Sauerstoff. Hierbei gelang es, eine Zink-Luft-Batterie so in eine geeignete Schaltung einzubauen, dass sie zum Nachweis des Sauerstoffdurchtritts durch eine Folie verwendet werden kann. Allerdings ist dieser bei üblicherweise verwendeten Folien so gering, dass im Sinne einer didaktischen Reduktion für einen Modellversuch Backpapier eingesetzt wird, um ein Experiment zu erhalten, das in einer Schulstunde durchgeführt werden kann. Eine weitere umfangreiche Versuchsserie wurde zur Durchlässigkeit von PET-Flaschen gegenüber Kohlenstoffdioxid entwickelt. Besonders interessant für Schülerinnen und Schüler sind dabei Experimente, die zeigen, dass PET Kohlenstoffdioxid in geringen Mengen speichert. Exemplarische Unterrichtsentwürfe zeigen, welche konkreten Möglichkeiten für die Umsetzung des Themas gegeben sind. Hierfür wurden exemplarisch Entwürfe zum Forschend-entwickelnden Unterrichtsverfahren, zum Analytisch-synthetischen Verfahren, zum Expertenunterricht, zur Chemie im Kontext, zum Wahldifferenzierten Chemieunterricht und zum Projektunterricht / projektorientierten Chemieunterricht ausgearbeitet. Insgesamt vermittelt die vorliegende Arbeit einen umfassenden Zugang zum Thema Lebensmittelverpackung im Chemieunterricht, wobei ausgehend von den fachlichen Grundlagen die schulexperimentellen Möglichkeiten und Wege der unterrichtlichen Umsetzung entwickelt wurden.
Synthese und Optimierung von Nitroxyl-Spin-Labeln zur Analyse von Nukleinsäuren mittels EPR und NMR
(2010)
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Einsatz der Nitroxyl-Spin-Markierung für die Strukturaufklärung von Oligonukleotiden getestet. Dafür wurden im Vorfeld verschiedene Spin-Label synthetisiert und charakterisiert. Bei den Nitroxiden handelt es sich hierbei um das Spin-Label TPA (2,2,5,5-Tetramethyl-pyrrolin-1-oxyl-3-acetylene) und TEMPA (2,2,6,6-Tetramethyl-3,4-dehydro-piperidin-N-oxyl-4-acetylene). Beide Spin-Label wurden auch als deuteriert und 15N-markiert synthetisiert. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen auf dem Gebiet der Modell-Systeme und Modell-RNAs wurden biologisch relevante und strukturell anspruchsvolle Oligonukleinsäuren untersucht. Dabei konnten DNA-RNA-Hybride, die HCV-IRES Domain II, ein Tetra-Loop, das Neomycin-B Aptamer, das Diels-Alder Ribozym und ein Nep1-RNA-Komplex charakterisiert werden. Die Einführung des Spin-Labels erfolgte noch auf der Festphase mittels der Sonogashira-Kreuz-Kupplungs Reaktion.
Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) are rare but fatal neurodegenerative diseases affecting human and animals. The prion protein which is the causative agent, according to “protein-only” hypothesis misfold in to rogue amyloid conformer. Despite several years of studies, the atomic structural details of the rogue conformers have not been clearly understood. This study focused on developing an in-vitro conversion method, which allows us to monitor the transition from unfolded state of prion protein to fibril state. In order to reach maximal unfolded state, we have used 8 M urea as chemical denaturant, pH 2 and prion fragment 90-230 as the model. It has been demonstrated earlier that acidic pH and mild denaturant induce the fibril formation. The mechanism underlying the structural transition from monomeric state to polymeric form is largely unknown. We have confirmed by EM and AFM that fibrils are formed in our conditions, which resemble to naturally occurring fibrils in morphologies observed. The agitation accelerates the rate of fibril formation and, which allow us to do time-resolved NMR on these preparations. The conformational flexibility is inherent to amyloid fibrils and has been observed in our preparations. We aimed to map the important segment of prion protein, which forms the rigid core in its fibrillar structured form. Our time-resolved NMR studies allowed us to monitor the changes happening from unfolded state to fibrillar state. Analysis of data identified the segment between residues 145 to 223 forming the rigid core in these fibrils, which correspond to β strand 2, helix 2 and major part of helix 3 of native prion monomeric structure. Most of the point mutations which are associated with hereditary prion disease are part of rigid core, which undergo a refolding on fibril formation. The C-terminal residues from 224 to 230 displayed peak shifting and therefore, indicate the adaptation to a fibril specific conformation. The major part of N-terminal 90-144 segment, remains dynamic, which can be understood by their accessibility to amyloid specific antibodies. This provides novel structural insight to the amyloid formation from unfolded state of prion protein fragment 90-230, which represents the proteinase-K resistant part naturally occurring prions. Earlier studies have established the core to 160-220 where hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry or site-directed spin labeling EPR spectroscopy was used for analysis. Those studies have been initiated from either native-like or partially unfolded state of recombinant prion protein, and therefore, it is quite striking to find out that fibrils initiated from unfolded monomeric state share the same “amyloid core”. This structural insight has important implications for understanding the molecular basis of prion propagation.
Acute myeloid/lymphoid leukemia is a fatal hematological malignancy characterized by accumulation of nonfunctional, immature blasts, which interferes with the production of normal blood cells. Activating mutations of receptor tyrosine kinases are common genetic lesions in leukemia. FLT3-ITD is a frequent activating mutation found in AML patients, leading to uncontrolled proliferation of leukemic blasts. FLT3-ITD directly activates STAT5, leading to the induction of STAT5 target gene expression like PIM kinases and SOCS genes. STAT5 and PIM kinases have been shown to play a crucial role in the FLT3-ITD mediated transformation. On the other hand, the role of SOCS proteins in FLT3-ITD mediated transformation has not been studied to date. SOCS proteins are part of a negative feedback mechanism that controls Jak kinases downstream of cytokine receptors. One of the SOCS family members, SOCS1 has been reported to suppress oncogenecity of several activating kinases implicated in hematologic malignancies. In this thesis the role of these SOCS proteins in FLT3-ITD mediated transformation (in vitro) and leukemogenesis (in vivo) is systematically explored. Expression of FLT3-ITD in cell lines of myeloid (32D) and lymphoid (Ba/F3) origin, led to CIS, SOCS1 and SOCS2 expression. FLT3-ITD expression in primary murine bone marrow stem/progenitor cells led to a 59 fold induction of SOCS1 expression. Furthermore, FLT3-ITD positive AML cell lines (MV4-11, MOLM-13) show kinase dependent CIS, SOCS1, and SOCS3 expression. Importantly SOCS1 is highly expressed in AML patients with FLT3-ITD compared to healthy individuals. SOCS1 protein was expressed in FLT3-ITD transduced murine bone marrow stem cells and SOCS1 expression was abolished with kinase inhibition in MOLM-13 cell line. In conclusion, SOCS1 was highly regulated by FLT3-ITD in myeloid, lymphoid cell lines, in bone marrow stem/progenitors and in AML patient samples. SOCS1 co-expression did not affect FLT3-ITD mediated signaling and proliferation, but abolished IL-3 mediated proliferation and protected 32D cells from interferon-α and interferon-γ mediated growth inhibition. FLT3-ITD expressing 32D cells showed diminished STAT1 activation in response to interferons (α and γ). Alone, SOCS1 strongly inhibited cytokine induced colony formation of bone marrow stem and progenitors, but not FLT3-ITD induced colony formation. Most importantly, in the presence of growth inhibitory interferon-γ, SOCS1 co-expression with FLT3-ITD led to increased colony formation compared to FLT3-ITD alone. Taken together, FLT3-ITD induced and exogenously expressed SOCS1, shielded cells from external cytokines, signals, while not affecting FLT3-ITD induced proliferation/signaling. In further experiments the in vivo effects of SOCS1 were studied in a bone marrow transplantation model. SOCS1 bone marrow transplants were unable to engraft/proliferate in mice. FLT3-ITD was shown to induce a myeloproliferative disease. Both control (empty vector), SOCS1 transplanted mice were normal and did not show any disease phenotype. FLT3-ITD alone and SOCS1 co-expressing FLT3-ITD developed either myeloproliferative disease or acute lymphoblastic leukemia with equal distribution. SOCS1 co-expression with FLT3-ITD led to a decreased latency. Mice transplanted with FLT3-ITD alone and SOCS1 co-expressing FLT3-ITD displayed enlarged spleens, liver and hypercellular bone marrow indicating infiltration of leukemic cells. Mice were also anemic and showed decreased platelet counts. Importantly SOCS1 co-expression particularly shortened the latency of myeloproliferative disease but not of acute lymphoblastic leukemia. In summary, in the context of FLT3-ITD, SOCS1 acts as a ‘conditional oncogene’ and cooperates with FLT3-ITD in the development of myeloproliferative disease. With these data we propose the following model: FLT3-ITD induces SOCS gene expression, which shields cells against proliferation and differentiation signals from cytokines, while not affecting FLT3-ITD mediated proliferative signals. This leaves cells under the dictate of FLT3-ITD thereby contributing to leukemogenesis. Similar to FLT3-ITD, BCR/ABL (P190) (an oncogenic fusion kinase often found in acute lymphoblastic leukemia) induces SOCS gene expression in K562 and long-term cultured cells from patients with acute lymphoblastic leukemia. SOCS1 co-expression does not affect BCR/ABL mediated proliferation while abrogating IL-3 mediated proliferation. These findings suggest that SOCS proteins may play a general co-operative role in the context of oncogenes which aberrantly activate STAT3/5 independently of JAK kinases. This study reveals a novel molecular mechanism of FLT3-ITD mediated leukemogenesis and suggests SOCS genes as potential therapeutic targets.
By adopting a variety of shapes, proteins can perform a wide number of functions in the cell, from being structural elements or enabling communication with the environment to performing complex enzymatic reactions needed to sustain metabolism. The number of proteins in the cell is limited by the number of genes encoding them. However, several mechanisms exist to increase the overall number of protein functions. One of them are post-translational modifications, i.e. covalent attachment of various molecules onto proteins. Ubiquitin was the first protein to be found to modify other proteins, and, faithful to its evocative name, it is involved in nearly all the activities of a cell. Ubiquitylation of proteins was believed for a long time only to be responsible for proteasomal degradation of modified proteins. However, with the discovery of various types of ubiquitylation, such as mono-, multiple- or poly-ubiquitylation, new functions of this post-translational modification emerged. Mono-ubiquitylation has been implicated in endocytosis, chromatin remodelling and DNA repair, while poly-ubiquitylation influences the half-life of proteins or modulates signal transduction pathways. DNA damage repair and tolerance are example of pathways extensively regulated by ubiquitylation. PCNA, a protein involved in nearly all types of DNA transaction, can undergo both mono- and poly-ubiquitylation. These modifications are believed to change the spectrum of proteins that interact with PCNA. Monoubiquitylation of PCNA is induced by stalling of replication forks when replicative polymerases (pols) encounter an obstacle, such as DNA damage or tight DNA-protein complexes. It is believed that monoubiquitylation of PCNA stimulates the exchange between replicative pols to one of polymerases that can synthesize DNA across various lesions, a mechanism of damage tolerance known as translesion synthesis (TLS). Our work has helped to understand why monoubiqutylation of PCNA favours this polymerase switch. We have identified two novel domains with the ability to bind Ub non-covalently. These domains are present in all the members of Y polymerases performing TLS, and were named Ub-binding zinc finger (UBZ) (in polη and polκ) and Ub-binding motif (UBM) (in polι and Rev1). We have shown that these domains enable Y polymerases to preferentially gain access to PCNA upon stalling of replication, when the action of translesion polymerases is required. While the region of direct interaction between Y pols and PCNA had been known (BRCT domain in Rev1 and PIP box motif (PIP) in three others members), we propose that Ub-binding domains (UBDs) in translesion Y pols enhance the PIP- or BRCT-domain-mediated interaction between these polymerases and PCNA by binding to the Ub moiety attached onto PCNA. Following these initial studies, we have also discovered that Y polymerases themselves undergo monoubiquitylation and that their UBDs mediate this modification. This auto-ubiquitylation is believed to lead to an intramolecular interaction between UBD and Ub attached in cis onto the UBD-containing protein. We have mapped monoubiquitylation sites in polη in the C-terminal portion of the protein containing the nuclear localization signal (NLS) and the PIP box. Beside PIP, the NLS motif is also involved in direct interaction of polη with PCNA. Based on these findings, we propose that monoubiquitylation of either NLS or PIP masks them from potential interaction with PCNA. Lastly, using several functional assays, we have demonstrated the importance of all these three motifs in the C-terminus of polη (UBZ, NLS and PIP) for efficient TLS. We have also constructed a mimic of monoubiquitylated polη by genetically fusing polη with Ub. Interestingly, this chimera is deficient in TLS as compared to the wild-type protein. Altogether, these studies demonstrate that the C-terminus of polη constitutes a regulatory module involved in multiple-site interaction with monoubiquitylated PCNA, and that monoubiquitylation of this region inhibits the interaction between polη and PCNA. Our work has also revealed that the UBDs of Y pols as well as of other proteins implicated in DNA damage repair and tolerance, such as the Werner helicase-interacting protein 1 (Wrnip1), are required for their proper sub-nuclear localization. All these proteins localize to discrete focal structures inside the nucleus and mutation of their UBDs results in inability to accumulate in these foci. Interestingly, by exchanging UBDs between different proteins we have learned that each UBD seems to have a distinct functional role, surprisingly not limited to Ubbinding ability. In fact, swapping the UBZ of Wrnip1 with the UBM of polι abolished the localization of Wrnip1 to foci despite preserving the Ub-binding ability of the chimeric protein. In summary, this work provides an overview of how post-translation modification of proteins by Ub can regulate several DNA transactions. Firstly, key regulators (e.g. PCNA) can be differentially modified by Ub. Secondly, specialized UBDs (e.g. UBM, UBZ) embedded only in a subset of proteins act as modules able to recognize these modifications. Thirdly, by means of mediating auto-ubiquitylation, UBDs can modulate the behaviour of host proteins by allowing for either in cis or in trans Ub-UBD interactions.
Enantioselective carbon-carbon bond-forming reactions, particularly, using organocatalysts represent one of the most important areas in modern synthetic chemistry. New concepts and methods in organocatalysis are emerging continuously, allowing more selective, economically more appealing and environmentally friendlier transformations. Chiral Brønsted-acid catalysts have recently emerged as a new class of organocatalysts for a number of enantioselective carbon-carbon bond-forming reactions. The first part of this thesis focused on the new development of new Brønsted acid-catalyzed enantioselective Nazarov cyclizations. The Nazarov reaction belongs to the group of electrocyclic reactions and is one of the most versatile methods for the synthesis of five-membered rings, which are the key structural elements of numerous natural products. In general, the Nazarov cyclization can be catalyzed by Brønsted or Lewis acids. However, only a few asymmetric variations have been described, of which most require the use of large amounts of chiral metal complexes. The reactivities of Nazarov cyclizations are also depending on the substituents of the divinyl ketone substrates as described in the first chapter. The substrates to study Brønsted acid-catalyzed enantioselective Nazarov cyclization were prepared following the known procedures. The dihydropyran was treated with tBuLi in THF at –78 oC and then the α,β-unsaturated aldehydes 1 were added to the reaction mixture to afford the corresponding alcohols 2 in moderate to good yields. The alcohols 2 were oxidized to divinyl ketones 3 employing Dess-Martin periodinane/pyridine (DMP/py) in CH2Cl2 at room temperature to obtain the divinyl ketones 3 in moderate to good yields (Scheme 1). Scheme 1. Preparation of substrates in order to study Brønsted acid-catalyzed enantioselective Nazarov cyclization and subsequent transformations. At the starting point, an evaluation of suitable Brønsted acid catalysts for the enantioselective Nazarov cyclization of divinyl ketone 3a was performed. The initial reactions conducted with various BINOL-phosphoric acids 4a-4e in toluene at 60 oC provided the mixture of cis and trans cyclopentenones 5a with enantioselectivities of up to 82% ee (Table 1, entries 1-5). Eventually, improved reactivity could be achieved by using the corresponding N-triflylphosphoramides 4f and 4g, which even at 0 oC gave complete conversion after ten minutes. Additionally, it was shown that the use of these catalysts significantly enhanced both the diastereoselectivity (cis/trans ratio up to 7:1) and the enantioselectivity (up to 96% ee; Table 1, entries 6 and 7). Table 1. Evaluation of Brønsted acids 4a-4g in the enantioselective Nazarov cyclization. The scope of the Brønsted acid-catalyzed enantioselective Nazarov cyclization of various divinyl ketones 3 was explored under an optimized reaction condition (Scheme 2). Treatment of divinyl ketones 3 in CHCl3 in the presence of 2 mol% chiral BINOL-Ntriflylphosphoramide 4g at 0 oC for 1-6 h provided the corresponding cyclopentenone 5 in good yields (45-92%) with excellent enantioselectivities (up to 93% ee) (Scheme 2). Furthermore, the isomerization of cis-cyclopentenone under basic condition led to the corresponding trans-cyclopentenone without loss of enantiomeric purity. This efficient method introduced here was not only the first example of an organocatalytic electrocyclic reaction but also represented the first enantioselective activation of a carbonyl group catalyzed by a chiral BINOL phosphoric acid. Compared to the metal-catalyzed reaction, special features of this new Brønsted acid-catalyzed electrocyclization are the lower catalyst loadings (2 mol%), higher enantioselectivities, accessibility to all possible stereoisomers, as well as the mild conditions. ....
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Synthese von spaltbaren Linkern. Dabei wurden zwei unterschiedliche Themengebiete bearbeitet: 1) Entwicklung eines enzymatisch spaltbaren Safety-Catch-Linkers, der eine flexible Modifizierung ermöglicht für den potentiellen Einsatz zur zielgerichteten Zellaufnahme von (Antisense-)Oligonukleotiden. 2) Entwicklung eines Fluorid-spaltbaren Linkers für die reversible Fluo¬reszenz¬markie¬rung von Triphosphaten zum Einsatz in einer neuen Methode der DNA-Sequenzierung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein neuer, variabler enzymatisch spaltbarer Safety-Catch-Linker entwickelt und es wurden drei Derivate synthetisiert. Die drei neuen Safety-Catch-Linker sind über Amid- bzw. Esterbindungen an die 5' Position von 2' Desoxythymidin angebunden und sind Substrate für zwei unterschiedliche Enzyme. Zwei der synthetisierten Derivate des Linkers sind Substrate der Penicillin G Acylase und eins ist ein Substrat für die Pyroglutamyl Aminopeptidase I. Sie wurden hinsichtlich ihrer Spaltungs- und Stabilitätseigenschaften intensiv untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die Ester-verknüpften Linker für eine Anwendung unter physiologischen Bedingungen geeignet sind. Es wurden kinetische Spaltungsexperimente durchgeführt und dabei eine sehr effektive enzymatische Spaltung durch das entsprechende Enzym beobachtet. Es wurde außerdem der Mechanismus einer, bei höheren pH-Werten beobachteten, nicht-enzymatischen Spaltung aufgeklärt. Darüber hinaus konnte das sehr basenlabile, mit Pyroglutamyl Aminopeptidase I spaltbare Derivat unter Anwendung einer aminoschutzgruppenfreien Oligonukleotidsynthesemethode erfolgreich in ein Antisense-Oligonukleotid eingebaut werden. Für das EU-Projekt „ArraySBS“ wurde im Rahmen dieser Arbeit ein neuer, hoch effizient mit Fluoridionen spaltbarer Linker für die reversible Anbindung eines Fluoreszenzfarbstoffs an die Baseneinheit eines Nukleotids entwickelt. Die spaltbare Einheit des Linkers basiert auf dem Strukturmotiv der 2-Cyanoethylgruppe, als Spacer zwischen dem Nukleotid und dem Fluoreszenzfarbstoff wurde eine Triglykoleinheit verwendet. Die Spaltungseigenschaften wurden an einer Modellverbindung, einem modifizierten Nukleosid und einem immobilisierten Oligonukleotid intensiv untersucht. Dabei wurde eine vollständige Spaltung mit 1 M TBAF in THF in weniger als einer Minute gefunden und die erwartete beta-Eliminierung als Spaltungsmechanismus bestätigt. Mit Hilfe des entwickelten Linkers wurden vier neue, Fluoreszenz-markierte, reversible Terminatoren in sehr hoher Reinheit hergestellt und analytisch eindeutig identifiziert. Dabei handelt es sich um ein Fluorescein-markiertes 2'-Desoxyuridin Derivat, ein Cy3-markiertes 2' Desoxycytidin, ein Cy5-markiertes 2'-Desoxyguanosin und ein TexasRed-markiertes 2' Desoxyadenosin Derivat. Diese wurden dann in Zusammenarbeit mit den Kooperationspartnern des EU Projekts erfolgreich durch eine DNA-Polymerase in DNA-Template eingebaut und in einem ersten Anwendungsexperiment an immobilisierten Hairpin-Templaten in zwei Sequenzierungszyklen eingesetzt.