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Gedanken und Versuche zum ernsthaften Einsatz des wissenschaftlichen Films im Hochschulunterricht
(1956)
Die aktuellen HIV Medikamente basieren sich zum größten Teil auf Substanzen, die gegen virale Proteine gerichtet sind. Ein großer Nachteil dieser Medikamente besteht darin, dass das HI-Virus durch Mutationen Resistenzen gegen diese Substanzen entwickeln kann. Zelluläre Co-Faktoren als antivirales Ziel in der HIV-Therapie zu nutzen, könnte ein neuer Lösungsansatz sein, da das menschliche Genom stabiler ist als das virale. Der Schwerpunkt dieser Arbeit konzentriert sich auf die RNA Helikase DDX3, welche als zellulärer Co-Faktor für die HIV-1 Replikation identifiziert wurde.
Im Rahmen der Dissertation wurde die RNA-Helikase DDX3 durch biochemische Untersuchungen von DDX3Wt und DDX3-Mutanten näher charakterisiert. Die Versuche zeigten, dass die konservierten Motive V und VI bei DDX3Wt für die Bindung und Hydrolyse von ATP essentiell sind. Die spezifische DDX3 Insertion wies ebenfalls eine mutmaßliche Rolle bei der ATP-Bindung und bei Ausbildung der ATP-Bindestelle auf. Ferner konnte für die spezifische Insertion von DDX3 eine Funktion bei der Bindung von viraler RNA Bindungsnachweise nachgewiesen werden. Daher bietet diese Insertion von DDX3 ein mögliches Ziel für die spezifische Modulation bzw. Manipulation der Interaktion von DDX3Wt und viralen Interaktionspartnern sein, ohne weitere RNA Helikasen zu beeinflussen.
Zusätzlich wurden weitere Eigenschaften von DDX3Wt entdeckt. Die ATPase-Aktivität von DDX3Wt konnte durch die Zugabe von ssDNA deutlicher stimuliert werden, als durch die Zugabe ssRNA. Das DDX3Wt eine höhere katalytische Effizienz durch DNA aufweist ist neu, da die meisten DEAD-box Helikasen eine Präferenz für RNA als Co-Faktor für die ATPase-Aktivität besitzen. Des Weiteren konnte erstmalig nachgewiesen werden, dass DDX3 neben der ATPase-Aktivität auch eine Exonuklease-Aktivität besitzt. Die Versuche zeigten, dass DDX3Wt in der Lage war, ssDNA und dsDNA effizient zu spalten. In der DDX3Wt AS-Sequenz wurden fünf Aminosäuresequenz-Motive, sogenannte Exonuklease-Boxen identifiziert, die mit der Exonukleaseaktivität in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung der Bindungseigenschaften von DDX3Wt zeigte auf, dass DDX3Wt auch ohne den zellulären Co-Faktor XPO1 in der Lage ist, virale HIV-1 RNA und DNA direkt zu binden. Diese Erkenntnisse tragen dazu bei, die Funktionen von DDX3Wt im zellulären System besser zu verstehen. Eine genaue Analyse ist Voraussetzung für die Entwicklung von spezifischen Inhibitoren, die die Interaktion von HIV-1 und DDX3Wt hemmen sollen ohne dabei zelluläre Prozesse negativ zu beeinflussen.
Durch Lokalisationsstudien konnte ein neuer relevanter Angriffspunkt für die Inhibition der HIV-1 Replikation identifiziert werden. Denn entgegen den Literaturangaben spielt das putative Leucin-reiche Exportsignal im N-Terminus von DDX3Wt eine wichtige Rolle beim Export aus dem Zellkern und somit auch für die Interaktion mit XPO1.
Mithilfe der Phagen-Display-Technologie konnte im Rahmen dieser Arbeit ein Sequenz-spezifischer Peptid-Ligand für die Insertion von DDX3 identifiziert werden, der eine Aminosäurehomologie zu dem zellulären Co-Faktor XPO1 zeigt. Das identifizierte Peptid DDX3-INS1 wurde für weitere Untersuchungen in Verbindung mit einer Proteintransduktionsdomäne synthetisiert. Das Peptid DDX3-INS1 ist in HIV-1 infizierten Zellen funktionell aktiv und inhibiert die Produktion von HI-Viren ab einer Konzentration von 20 µM ohne dabei toxische oder virolytische Effekte auszuüben. Weitere funktionelle Untersuchungen werden zeigen, ob das selektionierte Peptid DDX3-INS1 als therapeutisches Medikament für die Inhibition von HIV-1 geeignet ist.
Das maligne Gliom, auch Glioblastom multiforme (GBM) genannt, ist der häufigste und gleichzeitig auch bösartigste hirneigene Tumor und macht rund 2% aller Krebsneuerkrankungen aus. Die Weltgesundheitsorganisation (world health organisation, WHO) stuft das GBM als Grad IV Tumor ein, was es als hochmalignen Tumor auszeichnet der infiltrativ in das umliegende Hirnparenchym einwandert und mit den gegenwärtigen Behandlungsmethoden, bestehend aus Resektion des Tumors, Chemotherapie und Strahlentherapie nicht kuriert werden kann. Das aggressive Wachstum und die ausgeprägte Resistenz dieses astrozytären Tumors gegenüber den verfügbaren Therapien der Bestrahlung und Chemotherapie sind Hauptgründe für die schlechte Prognose für Patienten mit Glioblastomen, deren medianes Überleben immer noch unter der Zwei-Jahres-Grenze liegt. Daher ist es von Nöten neue therapeutische Strategien auf Grundlage der Chemotherapie zu entwickeln, die selektiv wichtige, deregulierte Signalwege der Krebszelle angreifen. Einer dieser Signalwege in Gliomen ist der Stat3-Signalweg (signal transducer and activator of transcription). Stat3, ein latenter zytoplasmatischer Transkriptionsfaktor liegt in Gliomen oftmals konstitutiv aktiv vor. Diese Deregulation des Signalweges führt zur dauerhaften Transkription proonkogener Zielgene die in transformierten Zellen zu Proliferation, Apoptoseresistenz, Neoangiogenese und Immunsupprimierung führen können. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, inwiefern eine pharmakologische oder gentechnische Inhibierung von Stat3 molekulare und zelluläre Charakteristika von Gliomen beeinflusst. Dazu wurde für die in-vivo Versuche ein syngenes, murines Gliom-Transplantationsmodell verwendet dessen Pathologie der eines humanen Glioms gleicht und den Vorteil besitzt keine immunsupprimierten Tiere verwenden zu müssen. Die murinen Gliomzelllinien, gewonnen aus spontanen Gliomen von GFAP-v-Src überexprimierenden Mäusen, wurden vorher in-vitro und auch exvivo bezüglich ihres Verhaltens auf die pharmakologische oder gentechnische Inhibierung von Stat3 charakterisiert. Für die pharmakologische Inhibierung wurde Kurkumin gewählt, der biologische aktive Wirkstoff der Pflanze Curcuma longa. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit Kurkumin konzentrationsabhängig die Phosphorylierung von Stat3 in drei murinen Gliomzelllinien hemmt. Des Weiteren zeigte sich, dass auch die Proliferation der untersuchten transformierten Zellen sowie ihre Fähigkeit zur Invasion und Migration konzentrationsabhängig durch den Einsatz von Kurkumin inhibiert werden konnte, ohne dabei allerdings die Proliferation von primären Astrozyten im gleichen Maße zu hemmen. Kurkumin induziert zusätzlich in den überaus aopotoseresistenten Gliomzellen einen G2/M Zellzyklusarrest. Diese beobachteten Effekte stehen im Zusammenhang mit der konzentrationsabhängigen transkriptionellen Beeinflussung Kurkumins der tumorpromotenden Stat3- Zielgene. Durch Einsatz einer Stat3-Mutante, Stat3C, die ohne Phosphorylierung konstitutiv aktiv in der Zelle vorliegt, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Kurkumin seinen Einfluss auf die Invasion und Migration der murinen Gliomzelllinien auch über den Stat3-Signalweg vermittelt, zeigte sich, dass durch Einbringung dieser Mutante trotz Kurkuminbehandlung die Migrations- und Invasionsfähigkeit partiell retabliert werden konnte. Durch dietätische Gabe von Kurkumin konnte in tumortragenden Mäusen gezeigt werden, dass die invitro ermittelten Effekte an einem längeren Überleben jener Mäuse beteiligt waren, deren Futter das Kurkumin enthielt. Die Administration des Kurkumins wurde entsprechend einer für die Klinik bevorzugten Darreichugsform gewählt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde Stat3 in den murinen Gliomzelllinien durch Transduktion mit shRNA gerichtet gegen die Stat3-mRNA stabil depletiert um im Folgenden untersuchen zu können, welche zellulären und molekularen Konsequenzen konstitutiv aktives Stat3 für die Gliomzellen hat. Es zeigte sich, dass der Wegfall von Stat3 das Migrations- und Invasionspotential signifikant verringerte und die Expression tumorfördernder Zielgene ebenfalls in den Stat3-defizienten Zellen auf Protein- und mRNA-Ebene signifikant reduziert war. Der Einfluss von Stat3 auf die Hif1α-Expression, ein Transkriptionsfaktor der die Anpassung der Gliomzellen an ein hypoxisches Milieu und damit verbunden auch Migration und Invasion induziert kann, macht deutlich, dass konstitutiv aktives Stat3 unter normoxischen sowie auch hypoxischen Bedingungen upstream entscheidender Transkriptionsfaktoren liegt und sich somit als Zielmolekül für eine therapeutische Intervention anbietet. Eine ex-vivo Applikation auf organotypischen Schnittkulturen zeigte, dass durch den Wegfall von Stat3 in den murinen Gliomzellen die Einzelzellinvasion unterbunden werden konnte was entscheidend für das klinisch hochrelevante Problem der Rezidive sein könnte. Transplantierte man nun Kontroll- und Stat3-defiziente Zellen orthotrop in die immunkompetenten Mäuse zeigte die Kaplan-Meier-Kurve, dass der Krankheitsbeginn so wie das mediane Überleben in den Mäusen mit Stat3-defizientem Tumor zeitlich deutlich nach hinten verschoben war. Neben den invitro und ex-vivo ermittelten Effekte des Stat3-Wegfalls ist anzunehmen, dass das verlängerte Überleben dieser Mäuse auch mit der fehlenden Immunsupprimierung der Stat3-defizienten Tumore zusammenhängt. Es zeigte sich, dass eine Intervention gegen Stat3, ob nun pharmakologisch oder gentechnisch, die malignen Charakteristika des Glioblastoms positiv beeinflussen kann. Stat3, bestätigt als onkogener Transkriptionsfaktor, stellt damit eine lohnenden Zielstruktur in Gliomen dar.
Forest fragmentation and selective logging are two main drivers of global environmental change and modify biodiversity and environmental conditions in many tropical forests. The consequences of these changes for the functioning of tropical forest ecosystems have rarely been explored in a comprehensive approach. In a Kenyan rainforest, we studied six animal-mediated ecosystem processes and recorded species richness and community composition of all animal taxa involved in these processes. We used linear models and a formal meta-analysis to test whether forest fragmentation and selective logging affected ecosystem processes and biodiversity and used structural equation models to disentangle direct from biodiversity-related indirect effects of human disturbance on multiple ecosystem processes. Fragmentation increased decomposition and reduced antbird predation, while selective logging consistently increased pollination, seed dispersal and army-ant raiding. Fragmentation modified species richness or community composition of five taxa, whereas selective logging did not affect any component of biodiversity. Changes in the abundance of functionally important species were related to lower predation by antbirds and higher decomposition rates in small forest fragments. The positive effects of selective logging on bee pollination, bird seed dispersal and army-ant raiding were direct, i.e. not related to changes in biodiversity, and were probably due to behavioural changes of these highly mobile animal taxa. We conclude that animal-mediated ecosystem processes respond in distinct ways to different types of human disturbance in Kakamega Forest. Our findings suggest that forest fragmentation affects ecosystem processes indirectly by changes in biodiversity, whereas selective logging influences processes directly by modifying local environmental conditions and resource distributions. The positive to neutral effects of selective logging on ecosystem processes show that the functionality of tropical forests can be maintained in moderately disturbed forest fragments. Conservation concepts for tropical forests should thus include not only remaining pristine forests but also functionally viable forest remnants.
Members of the genus Xenorhabdus are entomopathogenic bacteria that associate with nematodes. The nematode-bacteria pair infects and kills insects, with both partners contributing to insect pathogenesis and the bacteria providing nutrition to the nematode from available insect-derived nutrients. The nematode provides the bacteria with protection from predators, access to nutrients, and a mechanism of dispersal. Members of the bacterial genus Photorhabdus also associate with nematodes to kill insects, and both genera of bacteria provide similar services to their different nematode hosts through unique physiological and metabolic mechanisms. We posited that these differences would be reflected in their respective genomes. To test this, we sequenced to completion the genomes of Xenorhabdus nematophila ATCC 19061 and Xenorhabdus bovienii SS-2004. As expected, both Xenorhabdus genomes encode many anti-insecticidal compounds, commensurate with their entomopathogenic lifestyle. Despite the similarities in lifestyle between Xenorhabdus and Photorhabdus bacteria, a comparative analysis of the Xenorhabdus, Photorhabdus luminescens, and P. asymbiotica genomes suggests genomic divergence. These findings indicate that evolutionary changes shaped by symbiotic interactions can follow different routes to achieve similar end points.
Chickpea (Cicer arietinum L.) is the third most important cool season food legume, cultivated in arid and semi-arid regions of the world. The goal of this study was to develop novel molecular markers such as microsatellite or simple sequence repeat (SSR) markers from bacterial artificial chromosome (BAC)-end sequences (BESs) and diversity arrays technology (DArT) markers, and to construct a high-density genetic map based on recombinant inbred line (RIL) population ICC 4958 (C. arietinum)×PI 489777 (C. reticulatum). A BAC-library comprising 55,680 clones was constructed and 46,270 BESs were generated. Mining of these BESs provided 6,845 SSRs, and primer pairs were designed for 1,344 SSRs. In parallel, DArT arrays with ca. 15,000 clones were developed, and 5,397 clones were found polymorphic among 94 genotypes tested. Screening of newly developed BES-SSR markers and DArT arrays on the parental genotypes of the RIL mapping population showed polymorphism with 253 BES-SSR markers and 675 DArT markers. Segregation data obtained for these polymorphic markers and 494 markers data compiled from published reports or collaborators were used for constructing the genetic map. As a result, a comprehensive genetic map comprising 1,291 markers on eight linkage groups (LGs) spanning a total of 845.56 cM distance was developed (http://cmap.icrisat.ac.in/cmap/sm/cp/thudi/). The number of markers per linkage group ranged from 68 (LG 8) to 218 (LG 3) with an average inter-marker distance of 0.65 cM. While the developed resource of molecular markers will be useful for genetic diversity, genetic mapping and molecular breeding applications, the comprehensive genetic map with integrated BES-SSR markers will facilitate its anchoring to the physical map (under construction) to accelerate map-based cloning of genes in chickpea and comparative genome evolution studies in legumes.
Background: Fishes show an amazing diversity in hearing abilities, inner ear structures, and otolith morphology. Inner ear morphology, however, has not yet been investigated in detail in any member of the diverse order Cyprinodontiformes. We, therefore, studied the inner ear of the cyprinodontiform freshwater fish Poecilia mexicana by analyzing the position of otoliths in situ, investigating the 3D structure of sensory epithelia, and examining the orientation patterns of ciliary bundles of the sensory hair cells, while combining μ-CT analyses, scanning electron microscopy, and immunocytochemical methods. P. mexicana occurs in different ecotypes, enabling us to study the intra-specific variability (on a qualitative basis) of fish from regular surface streams, and the Cueva del Azufre, a sulfidic cave in southern Mexico.
Results: The inner ear of Poecilia mexicana displays a combination of several remarkable features. The utricle is connected rostrally instead of dorso-rostrally to the saccule, and the macula sacculi, therefore, is very close to the utricle. Moreover, the macula sacculi possesses dorsal and ventral bulges. The two studied ecotypes of P. mexicana showed variation mainly in the shape and curvature of the macula lagenae, in the curvature of the macula sacculi, and in the thickness of the otolithic membrane.
Conclusions: Our study for the first time provides detailed insights into the auditory periphery of a cyprinodontiform inner ear and thus serves a basis—especially with regard to the application of 3D techniques—for further research on structure-function relationships of inner ears within the species-rich order Cyprinodontiformes. We suggest that other poeciliid taxa, or even other non-poeciliid cyprinodontiforms, may display similar inner ear morphologies as described here.
Die Diatomee C. meneghiniana reagiert sowohl auf Veränderung der Lichtintensität während des Wachstums, als auch auf Veränderungen der Eisenkonzentration im Medium. Die Erhöhung der Lichtintensität respektive die Erniedrigung der Eisenkonzentration im Medium wurden als Stresssituationen für C. meneghiniana definiert. Unter Stressbedingungen findet zunächst eine generelle Erhöhung der Zellzahl statt, wobei das Volumen der einzelnen Zellen unter Eisenmangelbedingungen stark reduziert wird. Aus diesem Grund findet man schließlich unabhängig von der Lichtintensität in den Eisenmangelkulturen niedrigere Werte für die Biovolumina als in den Kulturen mit Eisensättigung.
Es konnten je nach Kulturbedingung kleine Unterschiede in der äußeren Morphologie der Silikatschalen festgestellt werden, die sich jedoch im Rahmen der normalen Variationsbreite bewegen und daher nicht signifikant sind. In allen Kulturen konnten auf Grund der schonenden Präparationsmethode die für C. meneghiniana als typisch beschriebenen Schwebfäden aus Chitin beobachtet werden.
Die Größe der Phäoplasten ist in den Eisenmangelkulturen und in de Starklichtkulturen deutlich geringer, weshalb auch die Anzahl der Thylakoidbänder sinkt. Die für Diatomeen typische Dreifachbänderung der Thylakoide bleibt jedoch immer erhalten. Zudem zeigen die Phäoplasten der LL 12 – und HL 12 – Zellen Ansammlungen eines Stoffs, der zwar nicht näher identifiziert wurde, wobei es sich aber höchstwahrscheinlich weder um Lipid-Globuli noch um das als Speicherstoff bei Diatomeen vorkommende -1,3-Glucan Chrysolaminarin handelt.
Die Färbung der Kulturen zeigt bereits eine Veränderung in der Pigmentierung der Zellen in Abhängigkeit von der Kulturbedingung. Der Chlorophyllgehalt pro Zellen wird vor allem unter Eisenmangel reduziert, während es in Zellen der HL – Kulturen zu einer Verdoppellung des Gehalts an XC – Pigmenten kommt. Die Kombination beider Effekte führt dazu, dass die HL 12 und der LL 1 – Kultur gleichermaßen hellbraun gefärbt sind, die Färbung der HL 1 – Kultur jedoch beinahe gelb ist. Die hellere Färbung der Eisenmangelkulturen ist wahrscheinlich als Chlorose anzusehen und eine klassische Folge von Eisenmangel bei Diatomeen. Die zugehörigen DEORs der ganzen Zellen sind in den HL – Kulturen anfangs sehr hoch und sinken später.
Die Ursache ist vermutlich in der hohen Lichtintensität und der durch Erhöhung der Zellzahl im Verlauf der Anzucht entstehenden gegenseitigen Beschattung der Zellen zu sehen. Hierfür spricht auch die parallel stattfindende Abnahme der XC – Pigmente – Konzentration.
Die Ermittlung der PS I : PS II – Stöchiometrien zeigt, dass sich offenbar auch die innere Architektur der Thylakoidmembran verändert. So liegt das relative, berechnete Verhältnis von PS II zu PS I nur in der LL 12 – und der HL 1 – Kultur bei 2 : 1. Dieses Verhältnis wird üblicherweise für küstennahe unter den den Anzuchtbedingungen vergleichbaren Lichtverhältnissen lebende Spezies angenommen. Die HL 12 - und die LL 1 – Zellen hingegen weisen ein Verhältnis von 1 : 1 auf. Da es nicht möglich ist, die Veränderung in beiden Kulturen entweder mit Eisenmangel oder Starklichtstress zu erklären, muss hier von unterschiedlichen Ursachen ausgegangen werden.
Die Reoxidationskinetiken weisen darauf hin, dass die Übertragung der Energie von QA an QB je nach Kultur unterschiedlich schnellen Kinetiken folgt. Dies ist wiederum durch die Bindungsart des QB, bzw. seine Verfügbarkeit als Akzeptor bedingt.
In den O-J-I-P-Messungen zeigt sich zunächst, dass die F0 – Werte der Eisenmangelkulturen niedriger liegen. Als Ursache hierfür wird eine Verkleinerung der Antenne des PS II, die sich durch den unter Eisenmangel deutlich erniedrigten Chlorophyllgehalt pro Zelle erklären lässt, und die dadurch bedingte Verringerung der Fluoreszenz angenommen. Deutlich ist zudem, dass die Energie in den HL – Kulturen deutlich schlechter von QA an QB weitergegeben wird, weshalb auch die daraus resultierenden Fv/FM – Werte deutlich niedriger sind. Als Erklärung hierfür kommt der unter HL stark erhöhte XC – Pool in Frage, der bekanntermaßen am nichtphotochemischen Quenching beteiligt ist, das wiederum vor allem unter Lichtstress auftritt.
Mittels Anionenaustauscherchromatografie ist es möglich in den Thylakoiden der Zellen jeder Kulturbedingung mindestens fünf unterscheidbare Fraktionen zu isolieren. Fraktion I enthält ungebundenes Protein und Pigment, Fraktion II, die in bis zu drei Fraktionen untergliedert sein kann, enthält PS I, Fraktion III entspricht dem FCPa, Fraktion IV enthält ebenfalls ein Photosystem, wobei es sich hier um das bislang aus C. meneghiniana noch nicht isolierte PS II handeln könnte, und Fraktion V entspricht dem FCPb. Es fällt auf, dass die Größe der Fläche unter der 437 nm –Mittels Anionenaustauscherchromatografie ist es möglich in den Thylakoiden der Zellen jeder Kulturbedingung mindestens fünf unterscheidbare Fraktionen zu isolieren. Fraktion I enthält ungebundenes Protein und Pigment, Fraktion II, die in bis zu drei Fraktionen untergliedert sein kann, enthält PS I, Fraktion III entspricht dem FCPa, Fraktion IV enthält ebenfalls ein Photosystem, wobei es sich hier um das bislang aus C. meneghiniana noch nicht isolierte PS II handeln könnte, und Fraktion V entspricht dem FCPb. Es fällt auf, dass die Größe der Fläche unter der 437 nm – Absorption bei, Fraktion II und IV mit der Auswertung der Slotblotsignale für die Photosysteme korreliert.
Die endgültige Aufreinigung der FCPs wurde letztlich mit diskontinuierlichen Saccharosegradienten durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass alle FCP – Fraktionen nach der Anionenaustauscherchromatografie einen mehr oder weniger großen Anteil an Verunreinigungen durch Photosysteme enthalten, die auf diese Weise abgetrennt werden konnten.
Die Kulturbedingungen haben zwar keinen Einfluss auf den Oligomerisierungsgrad von FCPa, bzw. FCPb, allerdings konnten Unterschiede in der Stabilität der Komplexe festgestellt werden. FCPa scheint unter LL weniger stabil zu sein, während der FCPb unter Eisenmangelbedingungen einen Teil seiner Stabilität einbüßt. Weiterhin kann in der Gelfiltration des FCPa kann nur eine Schulter beobachtet werden und im FCPb sieht man teilweise sogar zwei Schultern. Da sich die Schulter mit der längeren Retentionszeit auf Höhe der Monomerschulter des FCPa befindet, und die Retentionszeit der anderen Schulter beinahe der des FCPa-Trimers entspricht, könnte dies die Hypothese unterstützen, dass der FCPb ebenfalls aus Trimeren aufgebaut ist. Kleine Verschiebungen in der Retentionszeit wären durch das unterschiedliche Molekulargewicht der Monomere erklärbar.
Die SDS – PAGE zeigt zunächst keine Veränderungen in der Zusammensetzung der FCPs unterschiedlicher Kulturbedingungen. Einzig die beiden HL –FCPb – Proben weisen eine hochmolekulare Bande bei ca. 62 kDa auf, die nicht näher identifiziert werden konnte. Auf Grund der Größe kann jedoch ausgeschlossen werden, dass es sich um Kopurifikation des unter Eisenstress bei Diatomeen häufig als Ersatz für Ferredoxin vorkommenden Flavodoxins oder einen Eisentransporter handelt. Die Inkubation mit spezifischen Antikörpern gegen einzelne fcp – Proteine zeigt, dass die 18 kDa – Bande des FCPa fcp2 enthält und die 19 kDa – Bande fcp6. Die 19 kDa – Bande des FCPb reagiert jedoch nicht mit dem fcp6 – Antikörper. Da aus C. cryptica nur noch zwei weitere fcp – Proteine mit einem ungefähren Molekulargewicht von 19 kDa bekannt sind und fcp7 auf Aminosäureniveau eine sehr hohe Ähnlichkeit mit dem fcp6 aufweist, kann man vermuten, dass es das entsprechende Protein im FCPb der fcp5 ist.
Prion-Erkrankungen sind neurodegenerative Erkrankungen, die durch die Fehlfaltung des zellulären Prion Proteins (PrPC) in seine pathogene Isoform PrPSc verursacht werden. Welche zellulären Mechanismen an dieser Fehlfaltung oder der Pathogenese beteiligt sind, ist bis heute nur teilweise geklärt. Einerseits wird vermutet, dass z.B. eine toxische cytosolische Form des PrPC aufgrund einer Störung des Proteasoms akkumulieren könnte und spontan in PrPSc umgewandelt wird. Andererseits konnte gezeigt werden, dass viele Signalwege, wie die MAPK-Signalwege am Prozess der Neurodegeneration beteiligt sein könnten.
Ziel dieser Arbeit war daher zum einen die Untersuchung der morphologischen Veränderung einer Zelllinie, die cytosolisches PrP exprimiert, und zum anderen die Identifikation weiterer Signalwege, die an der Prionpathogenese beteiligt sein könnten, was mittels Analysen des (Phospho)proteoms Prion-infizierter Zellen und Mäusegehirne durchgeführt werden sollte.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden murine Neuroblastoma Zellen charakterisiert, die eine cytosolische Form des Prion Proteins (CyPrP) exprimierten. Diese Zellen zeigten zwar keine cytotoxischen Merkmale, jedoch wiesen sie dramatische morphologische Veränderungen auf. Weiterhin wurde herausgefunden, dass diese Zellen vermutlich eine Isoform des cytosolischen PrP (CyPrPmod) exprimierten, die sowohl glykosyliert als auch auf der Zelloberfläche verankert war und somit Eigenschaften des Volllängen-PrP aufwies. Die Glykosylierung des CyPrPs wurde in Western Blots nachgewiesen, während die Verankerung des CyPrPs in der Plasmamembran anhand der Durchflusszytometrie untersucht wurde. Der vermutete Zusammenhang zwischen der CyPrPmod-Expression und der morphologischen Veränderung der Zellen wurde mittels Herunterregulation von CyPrP untersucht. Jedoch resultierte dies nicht in der erwarteten Reversion der morphologischen Effekte. Die Wiederholung der stabilen Transfektion in den parentalen N2a Zellen und anderen Zelllinien führte außerdem weder zu einer veränderten Morphologie noch zur Expression von CyPrPmod. Somit sind diese Veränderungen auf unspezifische Prozesse während der ersten stabilen Transfektion der N2a Zellen mit CyPrP zurückzuführen.
Um neue Therapien oder Biomarker bei Prion-Erkrankungen zu entwickeln, ist die Untersuchung von Signalwegen, die die Prionpathogenese beeinflussen können, wichtig. Oft werden zelluläre Signalwege über die Phosphorylierung von Proteinen gesteuert, allerdings gab es bisher in der Prionenforschung keine Untersuchungen des Phosphoproteoms von Prion-infizierten Zellen in vivo oder in vitro. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher das Phosphoproteom eines Prionen-replizierenden Zellkultursystems näher untersucht. In einer SILAC-Analyse von nicht infizierten und Prion-infizierten Zellen wurden über 100 Phosphoproteine identifiziert und quantifiziert, von denen drei in Western Blots validiert wurden. Die Phosphorylierung von Stathmin und Cdc2 an spezifischen Phosphorylierungsstellen war in den Prion-infizerten Zellen vermindert, während Cofilin eine erhöhte Phosphorylierung aufwies. Diese Proteine sind an der Regulation des Zellzyklus und des Zytoskeletts beteiligt und könnten eine Rolle in der Prionpathogenese spielen. Außerdem wurde nach 2D-Analysen des Proteoms Prion-infizierter Mäusegehirne eine Hochregulation des antioxidativen Proteins Peroxiredoxin 6 (PRDX6) festgestellt. Auch im Prionen-replizierenden Zellkultursystem konnte dieses Protein in erhöhten Mengen nachgewiesen werden. Experimente zur Unterdrückung bzw. Überexpression von PRDX6 ergaben, dass seine Phospholipase A2-Aktivität Signalkaskaden beeinflussen könnte, die vermutlich die Expression von PrPC und somit die Prion-Replikation regulieren können. Weitere Untersuchungen der PRDX6-abhängigen Signalwege in der Prionpathogenese sowie Inokulationen PRDX6-defizienter Mäuse mit Prionen, könnten erste Ansätze für die Entwicklung neuer Therapien bei Prion-Erkrankungen sein.
Die noradrenergen Neurone der sympathischen Ganglien und die cholinergen Neurone der parasympathischen Ziliarganglien gehen aus den NLZ hervor. BMP-Signale induzieren die Differenzierung beider Neuronentypen, die mit der Expression von Ascl1 und Phox2a/b beginnt. Im Fall der sympathischen Ganglien werden dann Hand2 und GATA2/3 exprimiert, was wiederum zur Expression der noradrenergen Marker TH und DBH führt, die auch in differenzierten Neuronen weiterhin vorhanden sind. Im Gegensatz dazu werden während der Entwicklung der parasympathischen Ziliarneurone sowohl Hand2 als auch TH/DBH nur transient exprimiert, die differenzierten Neurone besitzen zum Großteil einen cholinergen Phänotyp (Goridis und Rohrer, 2002; Müller und Rohrer, 2002).
Thema dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle der Hox-Gene bei der Differenzierung des PNS. 14 der analysierten Hox-Gene werden in den sympathischen Ganglien exprimiert, wobei wir uns bei der näheren Analyse auf das HoxB-Cluster beschränkt haben. HoxB5, HoxB6, HoxB7, HoxB8 und HoxB9 werden zwischen E4 und E7 in den sympathischen und sensorischen Ganglien exprimiert, wobei nur HoxB8 und HoxB9 eine deutliche Expression in den sympathischen Ganglien zeigen. Die HoxB-Gene könnten dem Expressionsmuster nach also eine Rolle bei der frühen Entwicklung und auch bei der Aufrechterhaltung des noradrenergen Phänotyps der sympathischen Ganglien spielen.
Die differenzielle Expression der HoxB-Gene in den sympathischen Neuronen und den Ziliarneuronen und ihre mögliche Beteiligung bei der Aufrechterhaltung des noradrenergen Charakters waren Ausgangspunkt für die ektopische Expression eines Vertreters des HoxB-Clusters, HoxB8, in den Ziliarganglien. In der Normalentwicklung wird die Expression von Hand2, TH und DBH nach E4 in den Ziliarneuronen stark reduziert (Abb. 22A). Wird HoxB8 in den Vorläuferzellen der Ziliarneurone in vivo überexprimiert, wird die Hand2-, TH- und DBH-Expression weit über E4 hinaus, bis mindestens E8 auf einem signifikant höheren Niveau gehalten (Abb. 22B). HoxB8 kann diesen Effekt allerdings nur ausüben, wenn es in den noch undifferenzierten Vorläuferzellen exprimiert wird. Die HoxB8-Überexpression in Primärkulturen von Ziliarneuronen an E5 oder E8 führt nur noch zu einem Anstieg der Hand2-Expression, hat aber keinen Einfluss mehr auf die noradrenerge Genexpression (Abb. 22B).
HoxB8 zeigt zusätzlich im Vergleich mit den anderen analysierten Hox-Genen einen spezifischen Effekt auf die Hand2-, TH- und DBH-Expression, denn sowohl das paraloge Hox-Gen HoxC8 als auch das anterior-exprimierte HoxB-Gen HoxB1 erreichen nur an E5 eine signifikante Expression der drei Gene. Weder HoxC8 noch HoxB1 können die Expression von Hand2 und TH/DBH über E5 hinaus aufrechterhalten (Abb. 22C), während HoxB8 deren Expression auch noch an E8 auf einem hohen Niveau halten kann.
Die HoxB8-vermittelte Aufrechterhaltung der TH- und DBH-Expression in den Ziliarneuronen konnte allerdings nicht in einen direkten Zusammenhang mit der erhöhten Hand2-Expression gebracht werden, da die Überexpression von Hand2 nicht zu einer Aufrechterhaltung von TH und DBH an E5 und E6 führt (Abb. 22C).
Die Effekte von HoxB8 auf die Entwicklung der Ziliarneurone, die durch HoxB8 z.T. noradrenerge, sympathische Eigenschaften annehmen, unterstützen die Vorstellung, dass HoxB8 bei der Differenzierung und Ausbildung des noradrenergen Phänotyps in sympathischen Ganglien eine Rolle spielt. Es konnte also erstmals einem Vertreter der Hox-Gen-Familie eine mögliche Funktion bei der Differenzierung autonomer Neurone zugeordnet werden.
The role of small leucine-rich proteoglycans, biglycan and decorin, in podocytopathy and albuminuria
(2011)
Biglycan is a member of the small leucine-rich proteoglycan (SLRP) family and is involved in the assembly of extracellular matrix components. In macrophages soluble biglycan acts as an endogenous ligand of the innate immunity receptors TLR2 and TLR4. Data addressing the role of biglycan in renal pathology are surprisingly limited. In a normal kidney, biglycan is expressed mainly in the tubulointerstitium; however, in the course of various renal diseases its expression may be altered. The biological role and mechanisms of biglycan action in the pathology of renal diseases, especially those affecting glomeruli, remain poorly understood.
Albuminuria is the first detectable clinical abnormality in diabetic nephropathy. In this study we detected increased biglycan mRNA expression in glomeruli of renal biopsies of patients with incipient diabetic nephropathy, with predominant localization in podocytes. This novel finding raised the question about the role and mechanisms of biglycan action in diabetic podocyte injury and whether the mechanisms of biglycan signaling causing podocyte injury and albuminuria could be extrapolated to other glomerular diseases.
To investigate the role of biglycan in the cause of diabetic podocyte injury and albuminuria we used the murine model of STZ-induced diabetic nephropathy and wild type (Bgn+/0) and biglycan deficient (Bgn-/0) mice. We observed that biglycan was expressed on mRNA and protein levels in podocytes of diabetic Bgn+/0 mice and that diabetic Bgn+/0 mice also had significantly higher albuminuria compared to non-diabetic mice 6 and 12 weeks after disease induction. Biglycan deficiency was shown to be an important factor in albuminuria development. Namely, we observed that diabetic Bgn-/0 mice had significantly lower levels of urinary albumin compared to diabetic Bgn+/0 mice. We showed that less severe podocyte loss in the urine of diabetic Bgn-/0 mice was associated with significantly higher nephrin and podocin glomerular expression compared to diabetic Bgn+/0 mice. Our data suggested that biglycan deficiency was protective against podocyte loss into urine and might be beneficial against development of albuminuria in diabetes.
Biglycan contributed to podocyte actin rearrangement due to increased phosphorylation of Rac1 in vitro. Furthermore, biglycan induced caspase-3 activity and production of reactive oxygen species (ROS), thus enhancing apoptosis in cultured podocytes. Biglycan-induced ROS generation was TLR2/TLR4-dependent. Overexpression of soluble biglycan in wild type mice induced albuminuria under normal conditions and significantly increased albuminuria under pathological conditions (murine model of LPS-induced albuminuria). Inhibition of Rac1 activity in vivo decreased the albuminuria induced by biglycan overexpression. In patients with glomerular diseases, biglycan was detected in urine and was associated with nephrin appearance in the urine of these patients and with increased albuminuria. Collectively, our results elucidate a novel mechanism for biglycan-induced TLR2- and TLR4-dependent, Rac1- and ROS-mediated podocytopathy leading to podocyturia, albuminuria development and progression of glomerular diseases. Interfering with biglycan actions and blocking its signaling via TLR2 and TLR4 might be a potential therapeutic strategy against these diseases. To achieve this goal, the specific mechanisms for binding of biglycan to TLR2 and TLR4 must be elucidated and effective ways of preventing this binding must be developed. Nevertheless, biglycan remains the “danger signal” that activates innate immune receptors in non-immune cells and triggers the deleterious mechanisms leading to aggravation of renal injury.
It has been estimated that about 1% of live births carry severe congenital heart defects and 20-30% among them have valve malformations. Despite its medical importance the underlying cause of many valvular diseases remains undiscovered. Thus, it is important to identify genes that play a crucial role in cardiac valve formation and maturation.
A temporal RNA expression analysis of heart development suggested that the extracellular matrix protein Nephronectin might be a novel regulator of valve development and/or trabeculation. Nephronectin is transiently expressed during rat heart development at the time of heart valve morphogenesis and trabeculation. Moreover, the extracellular matrix is known to be crucial for organogenesis. It is a complex, dynamic and critical component that regulates cell behavior by modulating the activity, bioavailability, or presentation of growth factors to cell surface receptors.
In order to verify the hypothesis that Nephronectin is a novel regulator of valve formation and/or trabeculation the zebrafish was chosen as model system. Females are able to spawn at intervals of 5 days laying hundreds of eggs in each clutch. Development progresses rapidly with precursors to all major organs appearing within 36 hours post fertilization. Zebrafish embryos develop externally, are translucent and continue to grow for several days despite developing severely malformed, non functional hearts. In addition, gene expression can be easily modulated. During the present study it has been shown that Nephronectin expression is correlated to valve development and trabeculation. Morpholinomediated knockdown of Nephronectin in zebrafish caused failure of valve formation and trabeculation resulting in > 85% lethality at 7 days post fertilization.
Cardiac valve formation is initiated at the junction of atrium and ventricle and is characterized by extracellular matrix deposition and endocardial cell differentiation. In accordance with the above-described phenotype the earliest observed abnormality in Nephronectin morphants was an extended tube like structure at the atrio-ventricular boundary. In addition, the expression of myocardial genes involved in cardiac valve formation (cspg2, fibulin1, tbx2b, bmp4) was expanded and endocardial cells along the extended tube like structure exhibited characteristics of atrio-ventricular cells (has2, notch1b and Alcam expression, cuboidal cell shape). Inhibition of has2 in Nephronectin morphants rescued the endocardial but not the myocardial expansion. In contrast, diminishment of BMP signaling in npnt morphants resulted in reduced ectopic expression of myocardial and endocardial atrio-ventricular markers. Taken together, these results identify Nephronectin as a novel upstream regulator of BMP4-HAS2 signaling playing a crucial role in atrio-ventricular canal differentiation.
1. Das Genom von A. woodii konnte sequenziert und annotiert werden. Der Organismus besitzt ein Chromosom von 4050521 Bp und keine Plasmide. Es sind 3495 ORFs kodiert. 2. Die Gene, die die Enzyme des Wood-Ljungdahl-Weges kodieren, konnten identifiziert werden. Sie sind hauptsächlich in drei Clustern organisiert, wobei für Cluster II gezeigt werden konnte, dass es ein Operon bildet und dort ungewöhnlicherweise ein RnfC-ähnliches Protein kodiert ist. 3. Gene für Proteine der Hexose-Verwertung konnten ebenfalls identifiziert werden. A. woodii besitzt sowohl PTS-Systeme als auch einen Na+/Zucker-Symporter zur Aufnahme von Hexosen. Die Enzyme der Glykolyse sind vollständig im Genom vorhanden und liegen im gesamten Genom verstreut vor. 4. Neben den Genen für die bereits charakterisierte Hydrogenase existieren im Genom weitere Gene, die potentielle Hydrogenasen oder Untereinheiten dieser kodieren. 5. Lange wurde für Methyltransferasen in A. woodii vermutet, dass es sich um energiekonservierende Enzyme handelt. Die Genomsequenz zeigte, dass das Genom Gene für 20 Methyltransferasen 1, 10 Methyltransferasen 2 und 22 Corrinoid-Proteine enthält. Die Methyltransferase und das Corrinoid-Protein des Wood-Ljungdahl-Weges konnten identifiziert werden. Allerdings konnte für keines der korrespondierenden Proteine eine Membranständigkeit vorhergesagt werden, was eine Beteiligung der Methyltransferasen an der Energiekonservierung ausschließt. Die Vielzahl der Methyltransferasen passt aber zu der Vielzahl von methylierten Verbindungen, die der Organismus verstoffwechseln kann. 6. Neben den gut charakterisierten etf-Genen aus dem car-Operon, das bei der Caffeat-Reduktion eine wichtige Rolle spielt, gibt es ein weiteres etf-Paar, welches mit den Genen für eine Laktat-Dehydrogenase und eine Laktat-Permease kolokalisiert ist. Welche Rolle die Proteine spielen bleibt noch aufzuklären. 7. Außer den Genen für die gut charakterisierte F1F0-ATP-Synthase finden sich Gene für eine V-Typ ATPase. Diese Gene bilden ein Operon. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Untereinheit VatA auch produziert wird. Die physiologische Rolle konnte allerdings noch nicht geklärt werden. 8. Basierend auf den genomischen Daten konnte ein Modell des Flagellums erstellt werden. Desweiteren wurde eine Vielzahl von Genen für chemotaktische Proteine identifiziert. Zur Verarbeitung von Umweltsignalen besitzt A. woodii Komponenten des Che-Systems, die zum einen aus E. coli und zum anderen aus B. subtilis bekannt sind. 9. In Proteomanalysen konnte festgestellt werden, dass die Enzyme des Wood- Ljungdahl-Weges beim Wachstum auf H2 + CO2 im Vergleich zum Wachstum auf Fruktose induziert werden, die Enzyme der Glykolyse werden dagegen reprimiert. Desweiteren ist die Hydrogenase (HydAB) auf H2 + CO2 induziert. Das am stärksten induzierte Protein ist eine Alanin-Dehydrogenase, deren Rolle im Stoffwechsel unbekannt ist. 10. Die Untersuchung des genomischen Kontextes der für die Na+-translozierende Ferredoxin:NAD+-Oxidoreduktase (Fno/Rnf) kodierenden Gene rnfCDGEAB ergab keine weiteren Gene, die mit Rnf in Verbindung stehen. Experimentelle Befunde zeigen, dass die Gene rnfCDGEAB ein Operon bilden. 11. Nach der Generierung von Antikörpern gegen die Untereinheiten des Rnf-Komplexes, die große lösliche Anteile besitzen, konnte nachgewiesen werden, dass RnfB, C und G in der Membran lokalisiert sind. Desweiteren wurde nachgewiesen, dass deren Produktion unabhängig von der An- oder Abwesenheit von Caffeat und den getesteten C-Quellen ist. 12. RnfG konnte in E. coli überproduziert und anschließend gereinigt werden, allerdings fehlte der vorhergesagte, kovalent gebundene Flavin-Cofaktor. 13. RnfC konnte ebenfalls in E. coli überproduziert und anschließend gereinigt werden. Nach Rekonstitution mit Eisen und Schwefel konnte ein Fe-Gehalt von 8 nmol/ nmol Protein und ein Schwefel-Gehalt von 5 nmol/nmol Protein bestimmt werden. Die im UV/Vis-Spektrum sichtbaren Maxima wiesen auf die Anwesenheit von FeS-Zentren hin. EPR-Analysen deuten darauf hin, dass die FeS-Zentren nur unvollständig assembliert sind. 14. Im Genom von A. woodii ist ein Cluster von Genen, das Proteine zur Umsetzung von 1,2-Propandiol kodiert, zu finden. Elektronenmikroskopisch konnte nachgewiesen werden, dass der Organismus in Gegenwart von 1,2-Propandiol Mikrokompartimente bildet. 15. In Zellsuspensionsversuchen konnte nachgewiesen werden, dass 1,2-Propandiol nicht zu Propionat und Acetat, sondern zu 1-Propanol und Propionat über das Intermediat Propionaldehyd umgesetzt wird. 16. Rohextrakte 1,2-Propandiol-gezogener Zellen katalysierten die Reduktion von NAD+ mit Propionaldehyd als Reduktant. Die Reaktion benötigte CoA, NAD+ (Km 0,35 mM) und Propionaldehyd (Km 1,3 mM). Das Temperaturoptimum betrug 30°C und das pH-Optimum lag zwischen pH 8 und 10. 17. Ein Antikörper gegen die Propionaldehyd-Dehydrogenase (PduP) aus S. enterica reagierte mit einem ca. 50 kDa-Protein 1,2-Propandiol-gezogener Zellen. Dies zeigt, dass PduP aus A. woodii und PduP aus S. enterica immunologisch verwandt sind. Western-Blot-Analysen zeigten, dass PduP nur in 1,2-Propandiol-, 2,3-Butandioloder Ethylenglykol-gezogenen Zellen nachweisbar war, aber nicht in Zellen die auf Fruktose, Ethanol oder H2 + CO2 gezogen waren. 18. Die Aktivität der Propionaldehyd-Dehydrogenase war in Zellen gezogen auf 1,2-Propandiol am höchsten. Nach Wachstum auf Fruktose oder H2 + CO2 war die Aktivität sehr niedrig. Genau gegensätzlich verhielten sich die Aktivitäten der Formiat-Dehydrogenase, einem Enzym des Wood-Ljungdahl-Weges, der ATPHydrolyse und des Rnf-Komplexes. 19. In Gegenwart von Caffeat und 1,2-Propandiol konnte A. woodii nicht wachsen. Das Wachstum auf 2,3-Butandiol oder Ethylenglykol in Gegenwart von Caffeat war möglich.
Blood vessel formation is a well orchestrated process where multiple components including different cells types, growth factors as well as extracellular matrix proteins act in synergistic and highly regulated manner to support the growth of new blood vessels. During embryonic development this process is marked as vasculogenesis and entails the differentiation of mesodermal cells into angioblasts and their subsequent fusion into a primitive vascular plexus. Angiogenesis, in contrast, describes the formation of new vessels from the pre-existing vasculature and it occurs in the embryo during remodeling of the primitive plexus into a mature vascular network. Furthermore, in the adult, angiogenic processes play a role in various physiological and pathological conditions. Angiogenesis is governed by a set of factors and molecular mechanisms whose identification has been a major focus of cardiovascular research for the past several decades. Most recently, Epidermal growth factor-like domain 7 (EGFL7) has been described as a novel molecular player in this context. This secreted protein is produced by endothelial cells and has been implicated in vessel development. Studies performed in zebrafish revealed an important role for EGFL7 in lumen formation during vasculogenesis although the underlying molecular mechanism has not been elucidated yet. In contrast, the investigation of EGFL7’s functions during angiogenic sprouting has faced several challenges and the role of EGFL7 in angiogenesis remained elusive. The purpose of this thesis was to identify the functions of EGFL7 during angiogenic mode of vessel formation in a systematic fashion using numerous in vitro as well as in vivo approaches.
Previously it has been suggested that EGFL7 might associate with the extracellular matrix from where it could exert its effects. Indeed, we could show that EGFL7 accumulates on the outer surface of endothelial cells in vivo by demonstrating its co-localization with collagen IV, a major constituent of the basal lamina. Furthermore, after its secretion to the extracellular matrix (ECM), EGFL7 seemed to interact with some components of the extracellular matrix including fibronectin and vitronectin, but not collagens and laminin.
A major group of receptors that mediate the interaction between the cells and the ECM are integrin receptors. Our co-immunoprecipitation studies revealed that EGFL7 associated with integrin αvβ3 which is highly expressed in endothelial cells and known to be important for vessel growth. Importantly, this EGFL7-αvβ3 integrin interaction was dependent on Arg-Gly-Asp (RGD) motif present within the second EGF-like domain of EGFL7 protein. Adhesion assays performed with human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) revealed that EGFL7 promoted endothelial cell adhesion compared to BSA used as a negative control, however, adhesion seemed to be less efficient as compared to bona fide ECM proteins such as fibronectin and vitronectin. In addition, cultivation of endothelial cells on EGFL7 was characterized by the absence of mature focal adhesions and stress fibers, but was paralleled by increased phosphorylation of kinases typical for integrin activation signaling cascade such as FAK, Src and Akt. This led us to the hypothesis that EGFL7 creates an environment that supports a motile phenotype of endothelial cells by serving as a modulator of existing interactions between the cells and the surrounding matrix. Indeed, EGFL7 increased random migration of HUVEC on fibronectin in an αvβ3 integrin dependent manner as shown using a live cell imaging platform. Most importantly, this was paralleled by a decrease in endothelial cell adhesion to fibronectin which is consistent with previous reports on secreted proteins that support a medium strength of adhesion and such promote cellular migration. To assess the overall effect of EGFL7 on the process of blood formation several in vitro and in vivo approaches were employed. First, the addition of EGFL7 to Matrigel injected subcutaneously into mice significantly increased the invasion of endothelial cells into the plugs. Second, a spheroid-based sprouting assay in three-dimensional collagen matrix clearly demonstrated the ability of EGFL7 to support angiogenic sprouting in an integrin dependent manner. This is consistent with the observed effects of EGFL7 on endothelial cell migration. Third, using in vivo assays such as the chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as well as a zebrafish model system we were able to validate the importance of the EGFL7-integrin interaction for the process of angiogenesis in vivo. Taken together, I identified some of the major cellular functions EGFL7 modulates during angiogenesis. In addition, with integrin αvβ3 I unraveled a novel interaction partner of EGFL7 that delivers a mechanistical explanation for EGFL7’s effects on blood vessel formation. Most importantly, data presented in this PhD thesis contribute substantially to the existing literature on EGFL7 unambiguously assigning a role for this protein in the process of angiogenesis.
Savannas are the most important timber and non-timber forest products (NTFPs) providing ecosystems in West Africa. They have been shaped by traditional human land-use (i.e. agriculture, grazing, and harvesting) for thousands of years. In the last decades, land-use has drastically changed due to the rapid population growth and the growing production of cash-crop in West Africa and this process is still continuing. The percentage of land intensively used for agriculture has increased, while the length of fallow periods has decreased. Such changes have enormous ecological, economic, and social consequences. In the context of land-use changes, there is an urgent need to better understand and evaluate the impact of land-use on savannas. Such an understanding provides insights on appropriate management activities that ensure the maintenance of savannas and guarantee the availability of savanna products for subsistence and commercial use of rural West African people.
The major objective of the present thesis was to study the impact of land-use on savanna vegetation and diversity as well as on populations of two important NTFP-providing tree species in a semi-arid area in West Africa. The study area was located in the south-eastern part of Burkina Faso and comprised the protected W National Park and its adjacent communal area.
In the first study (chapter 2), I investigated in cooperation with a colleague from Burkina Faso (Blandine Nacoulma) the impact of land-use on the savanna vegetation. We analyzed which environmental factors determine the occurrence of the vegetation types and investigated the effect of land-use on vegetation structure and the occurrence of life forms and highly valued tree species. Furthermore, we tested whether land-use has an impact on plant diversity pattern and if this impact differed between the vegetation types and layers (woody and herb layer). Vegetation relevés were performed and the vegetation and plant diversity of the protected W National Park were compared with those of its surrounding communal area. Our results reveal five vegetation types occurring in both areas. Elevation and physical soil characteristics and thus soil water availability for plants played the most important role for the occurrence of the vegetation types. The influence of land-use on plant diversity differed between the five vegetation types and the two layers. The impact was highest on the vegetation types with the most favorable soil conditions for cultivation and lowest on rocky habitats with poor soils. While the diversity of the woody layer was increased under human land-use, the diversity of the herb layer was diminished. Overall, as land-use effects were not only negative, our findings suggest that land-use does not automatically lead to a loss of plant species and to a degradation of savanna habitats. We conclude that both protected and communal areas are of great importance for the conservation of savanna vegetation and diversity. Our study highlights furthermore the importance of different management strategies for each vegetation type.
In the following two studies (chapter 3 and 4), the impact of land-use - and in particular of harvesting - on populations of Adansonia digitata L., the baobab tree, and Anogeissus leiocarpa (DC.) Guill. & Perr. was examined. These two tree species were chosen as they provide several NTFPs for the local population and as they show different levels of human protection and opposed life histories. Thus, they may react differently to land-use. Stands of the protected W National Park were compared with those of its surrounding communal area (in fallows, croplands, and villages). I applied dendrometric methods to study the population structures and combined it with rates and patterns of NTFP-harvesting (debarking and chopping/pruning). Furthermore, the impact of land-use and harvesting on the fruit production of A. digitata and on the sprouting ability of A. leiocarpa were studied. The inverse J-shaped size class distribution curve indicates that the stands of A. digitata were in a healthy state in the park, while the low number of smaller size classes in fallows, croplands, and villages may give evidence of an ageing population. However, a high number of seedlings were recorded in villages. The stands of A. leiocarpa were also in healthy states in the park and likewise in fallows. In contrast, the absence of saplings gives evidence of a declining population in croplands. Both species were strongly harvested by local people and harvesting was tree size-specific. Pruning in interaction with tree-size had a significant impact on fruit production of A. digitata. While smaller trees were more vulnerable to pruning, bigger trees benefited from slight-pruning. A. leiocarpa had a great ability to respond to chopping by sprouting. The sprouting ability increased even with higher chopping intensity. Results suggest that despite the intense harvesting and the land-use impact, populations of both species are still well preserved. While A. digitata can withstand the harvesting and land-use pressure by its longevity, extremely low adult mortality rates, and particularly due to positive human influences, A. leiocarpa is able to withstand the use pressure by its fast growing, high recruitment, and high sprouting ability. I conclude that a none protected tree species (A. leiocarpa) might not necessarily be at higher risk to the harvesting and land-use impact than a protected tree species (A. digitata) as the adverse impact of harvesting and land-use can be compensated by its specific life history.
Important additional information to such ecological findings can be provided by local people. Learning from traditional knowledge and management systems of local people will help to produce culturally and ecologically reasonable conservation and management strategies. Thus, I investigated local uses and management strategies of A. digitata and A. leiocarpa in the last two studies (chapter 5 and 6). Quantitative ethnobotanical surveys among the Gulimanceba people were conducted in the communal area in order to document uses of the different plant parts, harvesting modes, perceptions about the population status, and conservation status of both species. Hereby, differences in knowledge between gender, generations, and people from different villages were tested. Interviews reveal that both species are harvested for multipurpose and emphasize the high importance of both species for local people. Especially the leaves and fruits of A. digitata add valuable minerals and vitamins to the otherwise micronutrient-“poor” staple crops of the Gulimanceba people. In comparison with other studies in West Africa, it has turned out that people in this area could benefit even more from A. leiocarpa, e.g. for dyeing of clothes, for treatment of malaria and skin problems. Local knowledge did not differ between genders and generations, while it slightly differed between people from different villages. The lack of age differences suggests that the traditional knowledge about these two species is passed on from one generation to another. Differences between people from different villages might be explained by influences from the neighboring countries Niger and Benin. Current local harvesting modes and management strategies of both species resulted in sustainable use. However, ongoing land-use intensifications require adapted harvesting and management techniques to guarantee the persistence of these economically important species. These results provide, in combination with the ecological findings (chapter 3 and 4), appropriate management recommendations for A. digitata and A. leiocarpa that are reliable under currently practiced management strategies.
Eine verzögerte und mitunter unvollständige Immunrekonstitution nach allogener Stammzelltransplantation (SZT) birgt ein erhöhtes Risiko für Infektionen und das Auftreten eines Rezidivs. Adoptive Immuntherapien können dazu beitragen, die Immunrekonstitution zu beschleunigen. Die Indikation hierzu ist jedoch streng geregelt, da eine zusätzliche Immuntherapie mit Risiken, wie z.B. dem Auftreten einer Graft-versus-Host-Disease (GvHD), verbunden ist. Im Mittelpunkt dieser Arbeit steht die Untersuchung der Immunrekonstitution im Hinblick auf das Auftreten von Komplikationen und das Überleben nach SZT. Dazu wurde ein multivariates Normwertmodell entwickelt, das die Beurteilung der Rekonstitution verschiedener Leukozytensubpopulationen ermöglicht. Der Einfluss der Regeneration spezifischer Immunzellen wie Cytomegalievirus-spezifischer T-Zellen (CMV-CTLs) und regulatorischer T-Zellen (Tregs) auf den Verlauf nach SZT wurde insbesondere hinsichtlich CMV-bedingter Komplikationen, GvHD und Rezidiv untersucht.
Tumor hypoxia and nutrient starvation are common phenomena in cancerous tissue. Cells that resist this hostile environment are selected for a more aggressive phenotype, usually accompanied by therapy resistance. The hypoxia inducible factors HIF-1a and HIF-2a play a key role in the adaptive homeostatic responses to these challenging conditions inducing a number of target genes that are involved in the regulation of a variety of cellular processes such as angiogenesis, proliferation, metabolism, self-renewal and cell death/cycle arrest. Thus, the HIF pathway encompasses opposing adaptive responses on tumor growthgrowth promoting abilities on the one hand and growth inhibiting on the other. A recent study in our lab uncovered that this switch between cell death and cell survival critically depends on HIF-2a protein levels. Since PHDs (HIF prolyl hydroxylases) are the main regulators of HIF protein abundance and hypoxia drives the malignant phenotype of tumors, we wanted to characterize HIF regulatory functions of PHDs under hypoxic conditions. Our intention was to reveal the importance of PHD contribution to the opposing functions of HIFs under hypoxia. Characterization of PHD1-4 mRNA and protein expression levels under normoxic and hypoxic conditions in glioblastoma cell lines led to the identification of PHD2 and PHD3 as hypoxia inducible PHD isoforms and highlighted their predominant function under hypoxia. Mechanistically, we demonstrated that HIF mediates the hypoxic induction of PHD2 and 3 within a negative feedback loop, promoting its own degradation during prolonged hypoxia. The functional impact of PHD2 and 3 abundance on cell viability under hypoxic conditions was analyzed by disrupting PHD2 and PHD3 function either through a siRNA mediated approach or by application of the PHD inhibitor DMOG. These experiments uncovered that PHD2 and 3 are protective under hypoxic conditions and that PHD inhibition expedites cell death. Combined HIF and PHD suppression under hypoxic conditions abrogated this increased susceptibility to cell death, clearly showing that PHD2 and 3 act in a negative feedback regulatory loop to limit the HIF response under prolonged hypoxia. With respect to possible future therapeutical applications we co-treated cells with a PHD inhibitor and pro-apoptotic agents staurosporine or TRAIL. Co-challenging tumor cells even potentiated the cell death response, indicating a more widespread protective function of PHD. Taken together PHD2 and 3 protect tumor cells from cell death induction, functioning in a negative feedback regulatory loop to constrain the HIF dependent cell death responses under hypoxia. Interestingly, however, when assessing the role of PHD2 and PHD3 in in vivo tumor growth using an intracranial tumor model, we identified an exclusive tumor suppressor function for PHD3. Loss of PHD3 function enhanced tumor growth whereas increased PHD3 expression diminished the tumor burden. The accelerated tumor growth following PHD3 loss could be attributed to a decrease in the induction of apoptosis and an increase in proliferation. Tumor cells are frequently exposed to temporary and spatial depletion of nutrients. Interestingly, PHD3 loss conferred a growth advantage under growth factor deprivation. The growth regulatory function of PHD3 was isoform specific, HIF independent and importantly, did not require the hydroxylase function of PHD3. Previous reports have uncovered a regulatory function of the PHD system in NF-kB signaling. However, our results demonstrated that NF- kB signaling remained unaffected by alteration in the PHD3 status of the cell. Additionally, the PHD3 tumor suppressor function proved to be independent of two putative PHD3 downstream effectors, ATF4 and KIF1Bb. Mechanistically, PHD3 suppression reduced EGFR internalization, enhancing the amount of EGFR expressed on the cell surface. We further showed that the impaired EGFR internalization during PHD3 loss resulted in receptor hyperactivation under stimulated and growth factor deprived conditions. Importantly, PHD3 physcially associated with the EGFR complex as evidenced by co-immunoprecpitation. Consequently, this extended EGFR activation in PHD3 deficient cells resulted in enhanced downstream activation of EGFR signaling and increased proliferation. Consistent with the interpretation that PHD3 loss is beneficial for tumor growth, we found PHD3 promoter methylation in glioblastoma cell lines, hinting at a epigenetic mechanism to finetune PHD3 expression on top of the hypoxic driven gene regulation. Finally, we demonstrated that PHD3 tumor suppressor function is not restricted to glioblastomas since PHD3 suppression in lung adenocarcinoma accelerated subcutaneous tumor growth. With these findings, we expand the knowledge of PHD3 action from its oxygen sensing role to a regulatory function in growth factor signaling. This clearly discriminates PHD3 from the other isoforms and supports the exclusive tumor suppressor function in glioblastoma. Taken together our results identify a complex role of PHD signaling in cancer and delineate HIF dependent and HIF independent functions of the PHD system. We think that the HIF dependent protective effect of PHD2 and 3 and the HIF independent PHD3 tumor suppressor function are not mutually exclusive, but might be activated according to the heterogeneous intra-tumoral conditions. However, PHD3 hydroxylase activity is dispensable for its HIFindependent tumor suppressor function in glioma. This uncouples PHD3 function from co-factor and co-substrate requirements and allows it to act over a broader physiological range, since its influence on cellular processes is not constrained by the availability of rate limiting factors. It might explain, why the enzymatic independent functions of PHD3 predominate in vivo. Thus, therapeutic modulation of the PHD system to inhibit tumor growth has to be based on these contrasting functions of the PHD system. However, their differential dependence on the hydroxylase activity may facilitate a therapeutic strategy to specifically inhibit or promote the protective versus suppressive functions of the PHD system.
Project I: The progression of rod and cone degeneration in retinally degenerate (rd) mice ultimately results in a complete loss of photoreceptors and blindness. The inner retinal neurons survive and several recent studies using genetically targeted, light activated channels have made these neurons intrinsically light sensitive. We crossbred a transgenic mouse line expressing channelrhodopsin2 (ChR2) under the control of the Thy1 promoter with the Pde6b(rd1) mouse, a model for retinal degeneration (rd1/rd1). Approximately 30-40% of the ganglion cells of the offspring expressed ChR2. Extracellular recordings from ChR2-expressing ganglion cells in degenerated retinas revealed their intrinsic light sensitivity which was approximately 7 log U less sensitive than the scotopic threshold and approximately 2 log U less sensitive than photopic responses of normal mice. All ChR2-expressing ganglion cells were excited at light ON. The visual performance of rd1/rd1 mice and ChR2 rd1/rd1 mice was compared. Behavioral tests showed that both mouse strains had a pupil light reflex and they were able to discriminate light fields from dark fields in the visual water task. Cortical activity maps were recorded with optical imaging. The ChR2rd1/rd1 mice did not show a better visual performance than rd1/rd1 mice. In both strains the residual vision was correlated with the density of cones surviving in the peripheral retina. The expression of ChR2 under the control of the Thy1 promoter in retinal ganglion cells does not rescue vision. Project II: Lentiviral vectors are becoming the vector of choice for transgene delivery into cells due to their ability to infect non- dividing cells and stably integrate the gene into the genome of the host. Two different viral vector systems, namely HIV-1 and SIV and three different viral vectors PLECYT, PHRCMVChR2 of HIV-1 family and PBjChR2 of SIV were used in this study. The efficiency of the vectors was analyzed by applying them onto the retinal explants in culture and checking the transgene expression. The transgene in the PLECYT lentiviral vector was driven by the EF1A promoter. Upon administration of 5.2 X 106 infectious units of PLECYT viral vector suspension onto the retinal explant resulted in the transduction of retinal ganglion cells. Very few other retinal neurons were found transduced. In the case of PHRCMVChR2, approximately 5 X 105 TU/ml of the vector was used and resulted in the transduction of different neuronal subtypes. Many amacrine cells, ganglion cells and Müller cells were found expressing the transgene. For PBjChR2, 5.6 X104 TU/ml was used which resulted in Müller cell- specific transduction. Very few or no other retinal neurons were found transduced. This study demonstrates the transduction efficiency of different viral vectors on the retinal neurons in vitro. An interesting observation on these viral vectors is their altered tropism. The glycoprotein of the virus is critical for determining their tropism and in this study, all the viral vectors generated were pseudotyped with VSVG, which confers a broad non-specific spectrum of infection. However, analyzing the transgene expression, the viral vectors differ from one another and show remarkable difference in their transduction pattern. To list a few factors that might possibly responsible for the drastic transduction difference exerted by the viral vectors include; 1. Promoters used to drive the transgene expression. 2. HIV or SIV component of the vector in combination with the promoter 3. Titre of the vector used and 4. Other factors like pH and serum used in the study. Therefore optimizing the viral vectors and generating high titers would increase the efficiency and cell-type specific expression of the transgene.
Fuer die schlechte Prognose von Glioblastompatienten mit einer ueberlebenszeit von 9-15 Monaten (Norden and Wen, 2006) ist vor allem die hohe Invasivitaet dieser Tumore verantwortlich. Nach operativer Entfernung des Haupttumors entstehen aus den verbleibenden invadierten Zellen sekundaere Tumore, die sich mitunter ueber weite Bereiche des Hirns verteilen. Des Weitern sind die hochinvasiven Tumorzellen oft resistent gegen Chemo- und Strahlentherapie (Drappatz et al., 2009; Lefranc et al., 2005). In Maustumormodellen und Pateinten konnte zudem gezeigt werden, dass die neuartige antiangiogenetische Therapie zwar das Tumorwachstum verringert, jedoch die Invasivitaet stark erhoeht. (Norden et al., 2008; Ebos et al., 2009; Paez-Ribes et al., 2009). Ueber die Mechanismen die diese hohen Invasivitaet induzieren, ist bislang nur sehr wenig bekannt. Die durch Reduktion von Blutgefaessen steigende Hypoxie des Tumors foerdert die Expression von Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). Dies fuehrt zum Abbau der extrazelluaeren Matrix des umgebenden gesunden Gewebes und beguenstigt dadurch die Tumorzellinvasion (Indelicato et al., 2010; Miyazaki et al., 2008; Shyu et al., 2007). Die Umformung des Aktinzytoskeletts und damit die Mobilitaet von Zellen wird vorwiegend durch ein akkurates Zusammenspeil der Rho GTPasen Rac, Rho und Cdc42, kontrolliert (Ridley et al., 2003). Fuer die Organisation von Axonen im Nervensystem und fuer die Blut- und Lymphgefaessbildung wurde gezeigt, dass die Interaktion der Eph-Rezeptortyrosinkinasen und Ihrer Ephrin-Liganden Signalwege induziert, die in die Regulation dieses Zusammenspiels involviert sind (Egea and Klein, 2007; Makinen et al., 2005; Palmer et al., 2002; Sawamiphak et al., 2010). Des Weiteren zeigt die Analyse der Genloci von Eph-Rezeptoren und Ephrinen in verschieden Hirntumoren eine gehaeufte Deletionen des Ephrin-B2-Gens. Die Quantifizierung von Ephrin-B2 mRNA in diesen Tumoren hat ausserdem ergeben, dass mit zunehmender Malignitaet die Expression von Ephrin-B2 sinkt. Aus diesen Gruenden wurden die Untersuchungen in dieser Arbeit auf die Rolle von Ephrin-B2 anhaengigen Signalwegen in der Glioblastomzellinvasion konzentriert. In einem modifiziertem Boyden-Chamber-Assay konnte gezeigt werden, dass das Ephrin-B2 induzierte EphB4 forward signaling und EphB4 induzierte Ephrin-B2 reverse signaling die Invasivitaet der human Glioblastomzelllinien LN-229, G55 und SNB-19 reduziert. In einem Maustumormodel konnte weiterhin gezeigt werden, dass Ephrin-B2 Knock-Out (KO) Astrozytomzellen, im Vergleich zu Wild-Typ (WT) Zellen, Tumore mit einem groesseren Volumen und einer erhoehten Invasivitaet bilden. Da die Expressionslevel fuer die Ephrin-B2 bindenden Rezeptoren EphA4, EphB1 EphB3 und EphB6 auch im adulten Hirn hoch sind (Hafner et al., 2004), weisen diese in vitro und in vivo Ergebnisse auf eine Tumorsupressorfunktion von Ephrin-B2 hin, die durch repulsive Effekte des Ephrin-B2 reverse signaling vermittelte werden koennten. Dies geht mit Erkenntnissen ueber kolorektale Tumore einher (Batlle et al., 2005). Die in einem Sphaeroid-Invasionsassay mit einer EphB-Rezeptoren freien Umgebung beobachtete verminderte Invasion von Ephrin-B2 WT deutet auf eine zusaetzliche invasionsblockierende Rolle der Ephrin-B2-Eph-Rezeptor Interaktion zwischen benachbarten Tumorzellen hin, wie sie auch in Brusttumoren gefunden wurde (Noren et al., 2006). Es scheint als sei Tumorprogression und Invasion erst moeglich, nachdem die Expression von Ephrin-B2 vermindert wurde. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass in hypoxischen Glioblastomzellen die Ephrin-B2 Expression durch die direkte Bindung des den Transkriptionsfaktors ZEB2 an den Ephrin-B2 Promoter reprimiert wird. In einem Weiteren Maustumormodel konnte gezeigt werden, dass die Blockierung der ZEB2 Expression mittels shRNA und die damit einhergehenden Inhibition der hypoxie induzierten Ephrin-B2 Repression das Wachstum und die Invasivitaet von Glioblastomen verringert. Zusaetzlich wurde gezeigt, dass der Verlust von ZEB2 ausreicht, die durch antiangiogenetische Therapie induzierte stark erhoehte Invasivitaet zu vermeiden. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse fuehren zu folgendem Modelmechanismus. In kleinen normoxischen Tumoren koennen repulsive Effekte des Ephrin-B2 reverse signalings und EphB forward signalings zwischen Tumorzellen und Zellen des umgebenden Gewebes die Ausbreitung und Invasion des Tumors unterdruecken. Zusaetzlich koennte das Ephrin-B2 induzierte EphB forward signaling zwischen benachbarten Tumorzellen die Mobilitaet der Tumorzellen wie in Brusttumoren inhibieren. Beim Erreichen einer bestimmten Tumorgroesse tritt Hypoxie auf, wodurch HIF-1alpha stabilisiert wird. Dies fuehrt dann zur ZEB2 Expression und leitet die Repression von Ephrin-B2 ein, was wiederum zur erhoehten Tumorzellemobilitaet und im Zusammenspiel mit MMPs zu Invasion fuehren kann. Gleichzeitig werden durch den HIF-induzierten VEGF-Gradienten neue Blutgefaesse rekrutiert. Damit wird der hypoxie-induzierten Invasivitaet entgegengewirkt. Wird mittels antiangiogenetischer Behandlung versucht Tumorprogression entgegenzuwirken, resultiert daraus eine erneut gesteigerte Hypoxie, die dann durch die ZEB2 vermittelte Repression von Ephrin-B2 wieder eine erhoehte Invasivitaet induzieren kann. Das Blockieren der ZEB2 Expression kann dieser durch antiangiogenetischen Behandlung induzierten Invasivitaet entgegenwirken.
Integrin a2ß1 ist ein Adhäsionsrezeptor, der verschiedene Kollagentypen bindet. Als solcher spielt es eine bedeutende Rolle für Zellfunktionen wie Migration und die Regulation des Zytoskeletts, Zellteilung, Apoptose und Differenzierung. Integrin a2ß1 übernimmt deshalb eine tragende Funktion in Prozessen wie Wundheilung, Angiogenese und der Progression und Metastasierung von Krebs. Rhodocetin ist ein Antagonist des Integrins a2ß1. Es ist ein C-Typ-Lektin-artiges Protein das im Schlangengift der Malaiischen Grubenotter (Calloselasma rhodostoma) entdeckt wurde. Rhodocetin besteht aus vier Untereinheiten a, ß, ? und d, die zwei Dimere formen (aß und ?d), welche wiederum eine kreuzförmige heterotetramere Quartiärstruktur bilden, die bislang nur für Rhodocetin beschrieben wurde. Rhodocetin bindet an die Integrin-a2A-Domäne der a-Untereinheit des Integrins a2ß1. Rhodocetin unterbindet damit die Bindung von Kollagen und die Aktivierung des Integrins. Der genaue Interaktionsmechanismus von Rhodocetin mit der Integrin-a2A-Domäne ist noch unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Hybridomtechnik monoklonale Antikörper gegen Rhodocetin generiert. Es wurden sechs Fusionen von Lymphozyten mit Myelomazellen durchgeführt, für die sowohl Mäuse als auch Ratten mit Rhodocetin immunisiert wurden. Die erzeugten Hybridomaklone wurden zunächst im ELISA auf ihre Fähigkeit getestet, Rhodocetin zu binden. Positiv getestete Klone wurden selektiert und die monoklonalen Antikörper aus den Zellüberständen aufgereinigt. Es konnten 14 monoklonale Antikörper etabliert werden. Die Antikörper wurden zunächst in ihren Bindungseigenschaften charakterisiert. Hierzu wurden verschiedene ELISAs, Immunblot und Immunpräzipitation genutzt. In der Duchflusszytometrie wurde getestet, ob die Antikörper an Integrin a2ß1 gebundenes Rhodocetin detektieren. Die Antikörper lassen sich hinsichtlich ihr Bindungseigenschaften und der Lage ihrer Bindungsepitope auf den verschiedenen Rhodocetin-Heterodimeren in unterschiedliche Klassen unterteilen. Es wurde nachgewiesen, dass Rhodocetin Konformationsänderungen unterliegt, die durch die Bindung einiger der generierten Antikörper induziert werden. Um den Einfluss divalenter Kationen auf die Konformation von Rhodocetin sowie den Interaktionsmechanismus von Rhodocetin mit der Integrin-a2A-Domäne zu untersuchen, wurde die analytische Gelfiltrationschromatographie genutzt. Es konnte gezeigt werden, dass die Bindung divalenter Kationen die Konformation von Rhodocetin beeinflusst. Um die Interaktionsstudien von Rhodocetin mit der a2A-Domäne auszuwerten wurde ein Sandwich-ELISA etabliert. Dieser ermöglichte es, im Anschluss an die Gelfiltration, die beiden Rhodocetin-Heterodimere unabhängig voneinander im Eluat nachzuweisen und zu quantifizieren. Es wurde nachgewiesen, dass das Rhodocetin-Heterotetramer während der Interaktion mit der Integrin-a2A-Domäne dissoziiert und nur das ?d-Dimer einen stabilen Komplex mit der a2A-Domäne bildet, während das aß-Dimer freigesetzt und unabhängig von diesem Komplex eluiert wird. Die pharmakologischen Eigenschaften von Rhodocetin wurden in einem Tumor-Xenograft-Modell untersucht, für das immundefizienten Mäusen HT1080 Fibrosarkomzellen implantiert wurden. Rhodocetin wurde den Mäusen intravenös appliziert und die Auswirkungen auf die Tumoren sowie der Verbleib von Rhodocetin im Körper analysiert. Die Entwicklung der Serumkonzentration von Rhodocetin wurde mit dem etablierten Sandwich-ELISA untersucht, welches hierzu mit einer Standardreihe kalibriert wurde. Die Elimination von Rhodocetin folgt einer Kinetik erster Ordnung. Die Exkretion von Rhodocetin erfolgt über die Niere. Es zeigte sich, dass etwa zwei Drittel des applizierten Rhodocetins unmittelbar nach Injektion von Integrin a2ß1-exprimierenden Zellen des Blutes gebunden werden. Die immunhistologische Auswertung von Tumoren und Kontrollgeweben ergab, dass Rhodocetin an Endothelzellen innerhalb der Nierenglomeruli sowie der Leber bindet. Rhodocetin konnte auch auf Endothelzellen der Tumorvaskulatur nachgewiesen werden. Innerhalb der Tumoren wurde Rhodocetin auch außerhalb von Blutgefäßen gefunden, wo es an HT1080 Tumorzellen bindet. Die Behandlung mit Rhodocetin beeinträchtigte die Integrität der Blutgefäße innerhalb der Tumoren und führte zu Hämorrhagien. Um die Auswirkungen von Rhodocetin auf die Tumoren genauer zu untersuchen und zu quantifizieren, wurde dynamische Magnetresonanztomographie genutzt. Es zeigte sich, dass Rhodocetin die Durchlässigkeit der Blutgefäße in Tumoren signifikant erhöht.