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Beiträge zur Erweiterung der Hückel'schen Theorie der π-Elektronensysteme [Pi-Elektronensysteme]
(1963)
Beiträge zur Erweiterung der Hückel'schen Theorie der Pi-Elektronensysteme Hückel entwickelte 1931 ein Verfahren zur quantenmechanischen Berechnung zahlreicher Eigenschaften von zr-Elektronensystemen. Obwohl die Theorie halbtheoretisch ist, hat sie einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis solcher Eigenschaften von ungesättigten und aromatischen Verbindungen geliefert, die dem Grundzustand der Moleküle zugeschrieben werden können, so z. B. der Resonanzstabilität und der Reaktivität. Doch ist sie nur in der Lage, die Eigenschaften dieser Verbindungen richtig zu beschreiben, die durch angeregte Zustände der Moleküle mitbestimmt werden, wie z. B. die Spektren, wenn man für das Resononanzintegral einen entsprechenden Wert verwendet, der von dem für den Grundzustand benutzten bedeutend abweichen kan. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wird die Hückel'schen Theorie der Pi-Elektronensysteme diskutiert. Einen nur annähernd vollständigen Überblick über die Beiträge zu dieser Theorie zu geben, würde den Rahmen der Arbeit überschreiten. Daher wurde sich im Wesentlichen darauf beschänkt, die Grundgedanken und die Näherungen des Verfahrens klar darzustellen und kritisch zu betrachten, sowie die Anwendungsmöglicheiten zu beschreiben. Hartmann hat 1960 eine Erweiterung der Hückel 'schen Theorie vorgeschlagen, die auch solche Eigenschaften ungesättigter und aromatischer Verbindunsen richtig erfaßt, die aur der Beteiligung angeregter Zustände beruhen, wie am Beispiel der Spektren gezeigt wurde. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Hückel-Hartmann'sche Theorie der Pi-Elektronensysteme dargestellt und die Ergebnisse mit denen der Hückel'schen Theorie verglichen. Hartmann selbst hat die Erweiterung nur für gleichatomige Pi-Elektronensysteme und unter zahlreichen Vernachlässigunen durchgeführt. Dieser Umstand und die wenigen zu der Theorie erst vorliegenden Arbeiten ließen es wünschensert erscheinen, die Hückel-Hartmannsche Theorie der Pi-Elektronensysteme systematisch und in möglichst allgemeiner Form zu diskutieren. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird daher eine Generalisierung der Hückel-Hartmannt'schen Theorie durchgeführt. Mit Hilfe des entwickelten Verfahrens wird anschließend der Einfluß der Überlappungen auf die Ergebnisse untersucht und eine Erweiterung der Hückel-Hartmann'schen Theorie auf heteroatomare Pi-Elektronensysteme angegeben.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden modifizierte Nukleoside synthetisiert, um ihren Einfluss auf die Stabilität von RNA-Duplexen zu untersuchen. Bei den fluorierten Benzimidazol-Nukleosidanaloga handelt es sich um universelle Basen, die bei der Basenpaarung nicht zwischen den vier natürlichen Nukleosiden unterscheiden können. Die dabei auftretende Destabilisierung der RNA-Duplexe sollte durch die Änderung physikalisch-chemischer Eigenschaften vermindert werden. Durch die Synthese der fluorierten Indol-Nukleosidanaloga mit denselben Fluoratompositionen sollte nachgewiesen werden, welche Rolle ein ausfallendes Stickstoffatom im Fünfring-System spielt. Weitere Untersuchungen wurden so entwickelt, dass die zwei spC-F in 4,6DFBI wie auch in 4,6DFI mit Stickstoffatomen getauscht wurden. So wurde noch eine neue Serie Nukleosidanaloga synthetisiert (Abbildung 9.2). Schließlich wurde noch 1-Desoxy-D-ribofuranose AS als absischer Baustein synthetisiert. Die Synthese der Indol- und 9-Deazapurin-Nukleosidanaloga wurde über eine Glycsilierungsreaktion mit geeignet geschützter Deoxyribose durchgeführt. Dies wurde über vier Stufen, ohne Aufreinigung, aus Deoxyribose synthetisiert. Die entsprechenden Deoxy-nukleoside wurden danach in fünf Schritten zu Ribo-nukleosiden transformiert. Nach der Entschützung von Toluoyl-Gruppen wurden die 5´- und 3´-OH Gruppen sukzessiv geschützt. Nach simultaner 5´-OH Entschützung und 3´-OMs Eliminierung, wurden die gewünschten Ribonukleoside durch katalytische Dihydroxilierung erhalten. Die Darstellung der Verbindung 7NP erfolgte über die Silyl-Hilbert-Johnson-Reaktion. Der abasische Baustein AS wurde ausgehend von 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribofuranose durch Dehydroxylierung und anschließende Entschützung erreicht. Von allen Nukleosiden gelang es Kristalle aus Wasser oder Methanol zu erhalten und röntgenkristallographisch zu untersuchen. Die Kristallpackungen zeigten eine sehr interessante Anordnung der Moleküle. Alle Fluorindol-Nukleoside mit Ausnahme von 7-N-Purin-Nukleosid 7NP zeigten nicht die für aromatische Systeme normale Fischgräten-Struktur, sondern eine Anordnung, in der die Moleküle gegenüberliegen. Die Kristallpackung besteht abwechselnd aus hydrophilen und lipophilen Schichten. Die hydrophilen Schichten bestehen aus den Zuckeruntereinheiten und die lipophilen aus den Fluoraromaten. Die Zucker sind durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden. Für die Orientierung der Moleküle zueinander sind aber die Fluoratome verantwortlich. In der Kristallpackung von 7-Fluorindol-Nukleosid 7FI kann ein Fluor-Wasserstoff-Abstand von nur 230 pm detektiert werden. Dies ist deutlich kürzer als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff von 2,55 Å. Der Abstand wird zwischen dem Fluor des einen Nukleosids und einem Wasserstoff eines gegenüberliegenden Nukleosids gemessen. Der Abstand von 2,30 Å ist einer der kürzesten jemals in Kristallen gemessenen F-H Abstände des Typs Csp²-F...H-Csp². Bedingt durch diesen kurzen Abstand kann von einer F...H Wasserstoffbrücke gesprochen werden. Auf der anderen Seite in der Kristallstruktur von 4-Fluorindol-Nukleosid 4FI konnte ein F-H Abstand von 2,69 Å nachgewiesen werden, welcher deutlich länger als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff ist. Die Nukleoside wurden auf ihre Lipophilie hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden Octanol-Wasser Verteilungskoeffizienten der Nukleoside gemessen. Die fluorierten Nukleoside zeigten im Gegensatz zu den nichtfluorierten Nukleosiden eine deutlich größere Lipophilie. Nach Umsetzung der Nukleoside zu den Phosphoramiditen konnten diese kupplungsfähigen Monomere in den RNA-Festphasensynthesen eingesetzt und in RNA 12mere eingebaut werden. Um den Einfluss der aromatischen Fluorosubstitutionen auf die thermodynamische Stabilität von RNA-Duplexen zu untersuchen, wurden UV/VIS- und CD- spektroskopische Messungen an monomodifizierten RNA 12meren durchgeführt. Aus den erhaltenen Schmelzkurven wurden die Schmelzpunkte bestimmt (Abbildung 9.3) und die thermodynamischen Daten ausgerechnet. Die Anwendung hydrophober, Fluorsubstituierter Nukleobasen führte im Fall der fluorierten Indol-Nukleoside zu Destabilisierung im Vergleich mit natürlichen Basenpaaren. Aus den folgenden Resultaten lässt sich zusammenfassen: 1. Position der Fluoratom in fluorierten Indole spielt eine wesentliche Rolle für die Stabilität des RNA-Duplex 2. 6FI bildet die stabilste Basenpaaren mit natürlichen Basen. 3. Basenpaarung von 4FI trägt eine deutlich höhere Destabilisierung. Für diese Modifikation wurden auch die längsten Abstandwerte zwischen C-F…H in der Kristallpackung gemessen. (Die Vermutung liegt nahe, dass diese Base sich außerhalb des Duplex befindet). 4. Alle Fluorindol-Basenanaloga zeigen die Tendenz zur Paarung mit Adenosin. 5. Bei 4,6DFI handelt sich um universelle Base. Um noch weniger destabilisierende universelle Basen zu finden, wurde das Forschungsfeld mit Methoden aus dem Bereich der strukturellen Bioinformatik, Molekül-dynamiksimulationen und freie Energie-Rechnungen ausgeweitet. Resultierende Simulationen führten zu zwei neuen Basen: 7NP als Analogon zu 4,6DFBI und 9DP als Analogon zu 4,6DFI (siehe Kapitel 8). Theoretische Rechnungen ließen sich bestätigen durch experimentelle Ergebnisse Die so entstandene Serie von Purin-Basenanaloga hat uns gezeigt, dass der Austausch von Fluoratomen durch Stickstoffatome stabilisierende Effekte bringt. Die chemischen Änderungen beeinflussen die physikalischen Eigenschaften, welche dadurch Stabilisierung oder Destabilisierung des RNA-Duuplex dirigieren. In Abbildung 9.5 befinden sich ausgerechnete Dipolmomente. Somit können wir für diese Serie folgendes resümieren: * 4,6FI als universelles Base Analogon zu 4,6DFBI zeigt geringere destabilisierende Effekte auf den 12mer RNA-Duplex. * Umtausch von Fluoratomen in den beiden Basen (4,6DFI und 4,6DFBI) resultiert in deutlich besserer Basenpaarung. * Auserrechnete thermodynamische Parametern (von gemessenen Tm-Werten) wurde ersichtlicht, dass höhere Tm-Werte durch geringere Destabilisierung aus Solvatation resultieren, nicht aus erhöhten Stacking Effekten des RNA-Duplex.
Ein bekanntes Beispiel für regulatorische RNA-Protein-Wechselwirkung stellt der Komplex der TAR-RNA von HIV-1 und dem viralen Protein Tat dar. Dieser Komplex ist wichtig für die effiziente Transkription des viralen Genoms. Essentiell für die Erkennung der Stem-Loop Struktur ist die Wechselwirkung des Tat-Proteins mit dem aus drei Nukleotiden bestehenden Bulge der TAR-RNA. Das Wissen über die Prinzipien der Erkennung von Tat zu TAR-RNA sollte es möglich machen, spezifische Liganden zu designen, die als antivirale Tat Antagonisten angreifen können. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese von RNA Liganden für die Festphasenpeptidsynthese (FPPS) basierend auf heteroaromatischen Bausteinen. Als Strategie wurde gewählt, die heteroaromatischen Reste über Amid-Bindungen an ein Fmoc geschütztes (2-Aminoethyl)glycin-Rückgrat einzufügen. Die peptidomimetischen Bausteine X konnten in der FPPS zur Synthese von Tripeptiden mit der allgemeinen Struktur Arg-X-Arg und Modifikationen mit Lysin eingesetzt werden. Die Bindungsaffinitäten der Tripeptide und kleinen Moleküle zur TAR-RNA von HIV-1 wurden über einen fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Der Assay verwendet ein doppelt endmarkiertes Tat-Peptid mit Fluorescein und Rhodamin als Farbstoff. Durch Verdrängung des Tat-Peptides durch einen konkurrierenden Liganden kommt es zur Konformationsänderung des Peptides, die zur Löschung der Lichtemmission führt. Dabei zeigen die Tripeptide H2N-(D)Arg-Lactam-(D)Arg-CONH2 (154) und H2N-(D)Arg-Amidin-(D)Arg-CONH2 (158) IC50-Werte von 2-3 mikroM, die auch durch Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) bestätigt wurden. In massenspektrometrischen Untersuchungen von 158 bzw. Tat-Protein mit TAR-RNA konnten bei beiden Peptiden 1:1 und 1:2-Komplexe beobachtet werden. 158 zeigt antivirale Eigenschaften (IC50 = 10-50 mikroM) in HeLa P4-Zellassays. Durch NMR-Untersuchungen und molekulardynamische Berechnungen war es möglich, eine Konformationsänderung der TAR-RNA durch eine Wechselwirkung mit Guanidinium-Gruppen festzustellen. Ein weiteres Ziel der Arbeit war daher ausgehend von den gewonnenen Daten die Untersuchung des Bindungskonzeptes von Diaminopyrazolen und Indazolen. Diaminopyrazole mit kleinen Resten und Triaminopyrazol übertreffen im protonierten Zustand den dikationischen Liganden Argininamid. In Übereinstimmung mit dem Bindungsmodell verhalten sich protonierte Aminopyrazole wie „Super-Guanidine“ hinsichtlich der TAR-RNA. Das Einfügen des Triaminopyrazols in ein Phenazin-Grundgerüst führt zu Verbindungen, die im protonierten und reduzierten Zustand zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können und nicht planar, aber lipophil sind. Der Austausch von Stickstoff zu Sauerstoff im Phenazinring sollte den reduzierten Zustand stabilisieren. Die resultierende Struktur ist jedoch zersetzlich, so dass auf weitere Untersuchungen verzichtet wurde.
Die gezielte Modifikation von Proteinen für die Erforschung des Proteoms stellt eine entscheidende Herausforderung dar. Sie wird meistens dann zwingend notwendig, wenn das intrinsische Signal zum Auslesen ungeeignet ist. So ist es z.B. für die größte Anzahl von fluoreszenzbasierenden Methoden unerlässlich, das zu untersuchende Protein spezifisch und einheitlich mit einem Fluorophor zu markieren. Eine weitere Schwierigkeit ist die gerichtete Immobilisierung von Proteinen für deren Charakterisierung an Oberflächen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die spezifische Markierung, Manipulation und strukturierte Immobilisierung von rekombinanten Proteinen analysiert. Dafür wurde mit dem hauptsächlich aus der Proteinreinigung bekannten NTA/Oligohistidin-System gearbeitet. Verwendet wurden multivalte NTA-Chelatorköpfen mit zwei (bisNTA), drei (trisNTA) oder vier (tetrakisNTA) NTA-Gruppen pro Molekül. Durch die Multivalenz können hervoragende Bindungsaffinitäten im nanomolaren Bereich erzielt werden, die die stabile, stöchiometrische, nicht kovalente und damit reversible Modifikation His-getaggter Proteine in Lösung und an Grenzflächen erlaubt. Fluoreszente trisNTAs wurden vielfach erfolgreich für die Markierung His-getaggter Proteine eingesetzt. Dabei wurde die Beobachtung gemacht, dass die Ni2+-Ionen im trisNTA die Emission des benachbarten Fluorophors stark quenchen und dadurch die Einsatzmöglichkeiten der Verbindung reduzieren. Durch die räumliche Trennung der beiden Gruppen mit starren, biokompatiblen Polyprolin-Helices konnte erstmals systematisch demonstriert werden, dass das Ausmaß der Fluoreszenzlöschung abstandsabhängig ist. Bei der Verwendung von 12 Prolinen (3.6 nm lange Helix) wurde mit einem ATTO565-Derivat eine Intensitätserhöhung um etwa 70%, und bei einem OregonGreen488-Derivat um etwa 40% erreicht. Bei den Verbindungen können der Abstand der beiden Gruppen voneinander und der Fluorophor nahezu frei gewählt werden, so dass eine Optimierung in Hinblick auf die jeweilige Fragestellung ohne Probleme möglich ist. In Kooperationen untersucht wurden z.B. die ATP-Hydrolyse von MDL1 und die ATP-Bindung von TAP. Die deutlich verbesserte Quantenausbeute, die stabile Bindung an einen His-Tag und die geringe Größe machen die Verbindungen zu idealen Reportersonden für die Einzelmolekül-Fluoreszenz-Analyse. Die gezielte Manipulation eines makromolekularen Proteinkomplexes mit einem kleinen Molekül wurde in einem weiteren Projekt untersucht. Das tetrakisNTA wurde verwendet, um die His-getaggten Eingänge des alphaN-His6 Proteasoms von Thermoplasma acidophilum gezielt zu blockieren. Durch den Abbau von Fluoreszein-markiertem Casein konnte die Aktivität der Proteasomkomplexe in Echtzeit verfolgt werden. Unter Zugabe von tetrakisNTA fand kein Abbau statt, während dieser ohne oder nach Entfernen der tetrakisNTAs von den Eingängen im gleichen Maße detektierbar war. Die Aktivität der Peptidase-Schnittstellen im blockierten Zustand konnte durch die Überschichtung eines nativen Gels mit einem Peptidsubstrat demonstriert werden. Die Ergebnisse belegen, dass die His-Tags an den Eingängen des Proteasomkomplexes so umstrukturiert werden, dass der Eintritt von Proteinen reversibel blockiert wird. Neben der gezielten Manipulation des Proteasoms wurde außerdem erstmals die spezifische Fluoreszenzmarkierung His-getaggter Proteine in kompletten E. coli Zelllysaten mittels nativer PAGE nachgewiesen. Um neue Anwendungsgebiete für das trisNTA zu erschließen, sollte dieses mit einem 1.4 nm großen Goldcluster modifiziert werden. Damit könnte die Position von His-Tags in Proteinkomplexen mittels Elektronenmikroskopie visualisiert werden. Mittels Gelfiltration mit MBP-H6 wurde nachgewiesen, dass die entwickelten Goldcluster teilweise mehr als eine trisNTA-Gruppe auf der Oberfläche hatten, wobei eine Trennung der Partikel nach der Anzahl der NTA-Gruppen nicht möglich war. Die Partikel wurden erfolgreich für die spezifische Markierung des alphaN-His6 Proteasoms verwendet. In der Einzelpartikelanalyse deutlich erkennbar waren der markierte Proteasomkomplex und die Lage des trisNTA-Goldclusters. Die Verwendung solcher Goldpartikel in der EM bringt entscheidende Vorteile im Hinblick auf die Strukturaufklärung von Proteinen mit sich. Orthogonale NTA/His-Tag Bindungspaare, bei denen ein bestimmtes, multivalentes NTA-Molekül einen definierten His-Tag bindet, würden einen großen Nutzen für die spezifische Markierung oder Immobilisierung verschiedener His-getaggter Proteine bringen. Durch die Verwendung teilweise rigider His-Tags und möglichst starrer bisNTAs sollten solche Bindungspaare realisiert werden. Die Synthese rigider bisNTAs mit unterschiedlichen Abständen zwischen den NTA-Gruppen konnte erfolgreich etabliert werden. Allerdings zeigten Fluoreszenztitrationen mit verschieden Fluoreszeinmarkierten His-Peptiden nicht die erhofften Unterschiede in den Affinitäten. Im letzten Teil der Arbeit wurden durch intramolekulare His-Tags inaktive trisNTAs synthetisiert. Diese können durch Licht gespalten und damit aktiviert werden (photoaktivierbare trisNTAs, PAtrisNTAs). Die Verbindungen mit unterschiedlicher Anzahl an Histidinen im intramolekularen Tag wurden systematisch in Lösung und an Oberflächen charakterisiert. Dazu wurden HPLC-Studien, Gelfiltrationen und SPR-Experimente durchgeführt. Die strukturierte Organisation von Proteinen auf solchen lichtaktivierbaren Oberflächen wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie demonstriert. Außerdem konnten durch die Laserlithographie gezielt verschiedene His-getaggte Proteine in situ in definierten Bereichen immobilisiert werden. Die Biokompatibilität der Oberflächen wurde erfolgreich durch die strukturierte Organisation aktiver, Virusbindender Rezeptor-Partikel gezeigt. Im Prinzip sollte das Konzept die lichtinduzierte Aufkonzentrierung von His-getaggten Rezeptoren in lebenden Zellen ermöglichen. Durch das Clustern ausgelöste Vorgänge könnten so gezielt herbeigeführt und analysiert werden.
Misregulated receptor tyrosine kinases (RTKs), i.e. the epidermal growth factor receptor EGFR or the insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R), can be involved in the development of cancer. Monoclonal antibodies specifically inhibit the RTKs in cancer therapy. The scope of this thesis is to investigate the molecular basis of the inhibition through the therapeutic antibodies matuzumab (EMD72000) against EGFR and EMD1159476 against IGF-1R. The 3D crystal structure of matuzumab in complex with the EGFR domain III shows an eptiope connected with a novel inhibition mechanism: a non-competitive, sterical inhibition of receptor acitivation. The anti-IGF-1R targeted monoclonal antibody EMD1159476 shows a reduced binding capacity to the receptor in the presence of ligand indicating a competitive inhibition mechanism. The epitope of EMD1159476 is within domain II of the receptor. The results of these molecular interaction studies are important for the clinical therapies with these monoclonal antibodies. The matuzumab-EGFR complex crystal structure shows that a simultaneous binding of matuzumab and cetuximab (Erbitux) is possible. The latter antibody is already in clinical use. A combination of several therapeutic antibodies in cancer treatment might show synergistic effects and benefits for the patients.
Regulation des matrizellulären Proteins SMOC-1 durch Zytokine und Stickoxid in Rattenmesangiumzellen
(2009)
Zytokine stimulieren in Mesangiumzellen die Produktion und die Freisetzung großer Mengen entzündlicher Mediatoren. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der RAP-PCR („RNA arbitrarily primed polymerase chain reaction“), einer auf mRNA basierenden „Differential display“-Methode, die Effekte von Interleukin-1β (IL-1β) auf das Genexpressionsmuster in glomerulären Rattenmesangiumzellen untersucht. Dabei wurde das matrizelluläre Glykoprotein „Secreted modular calcium-binding protein-1“ (SMOC-1) identifiziert, welches in Mesangiumzellen durch IL-1β herunterreguliert wird. SMOC-1 wird von verschiedenen Zelltypen exprimiert und sezerniert, doch seine biologische Funktion konnte bisher nicht aufgedeckt werden. Weitere Experimente bestätigten, dass die mRNA- und Proteinexpression von SMOC-1 durch proinflammatorische Zytokine, wie IL-1β und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) herunterreguliert wird. Dieser Effekt wird zu einem großen Teil durch die endogene Freisetzung von Stickoxid (NO) aufgrund der Aktivität der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) und der nachfolgenden Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) vermittelt. Außerdem tragen auch reaktive Sauerstoffver-bindungen (ROS), deren Bildung durch die Zytokine verstärkt wird, zur Herunter-regulierung der SMOC-1-Expression bei. Durch In-situ-Hybridisierungsexperimente konnte ferner gezeigt werden, dass die Hemmung der NO-Synthese durch den spezifischen iNOS-Inhibitor L-NIL in einem Rattenmodell der anti-Thy1.1-Glomerulonephritis die SMOC-1-Expression deutlich erhöhte. Dies belegt somit auch in vivo die biologische Relevanz von NO in der Modulierung der SMOC-1-Expression. Die funktionelle Rolle von SMOC-1 in Mesangiumzellen wurde durch die Hemmung der SMOC-1-Expression mit Hilfe einer spezifischen siRNA untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Hemmung von SMOC-1 eine deutliche Inhibierung der mRNA-Expression von „Transforming growth factor β1“ (TGF-β1) sowie dessen Gesamtproteinspiegel zur Folge hat. Auch die Aktivität von TGF-β1 wurde reduziert, wie anhand der verringerten Spiegel an aktivem TGF-β1-Protein und der verringerten mRNA-Expression bekannter TGF-β-regulierter Gene, wie „Connective tissue growth factor“ (CTGF), „Plasminogen activator inhibitor-1“ (PAI-1) und Biglykan gezeigt wurde. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von SMOC-1 bei der Modulierung des TGF-β1-Signalwegs hin. Zusammenfassend betrachtet scheint NO die SMOC-1-Expression in der akuten glomerulären Entzündung zu vermindern und dadurch die TGF-β-getriebenen profibrotischen Signalprozesse zu limitieren. Der zweite Aspekt dieser Arbeit befasst sich mit der Rolle von Peroxisomen-Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) in der IL-1β-vermittelten Expression der induzierbaren NO-Synthase. PPARα-Aktivatoren steigern in Mesangiumzellen die IL-1β-induzierte Aktivität der iNOS, während die Hemmung von PPARα durch spezifische Inhibitoren oder siRNA die iNOS-Expression/-Aktivität deutlich reduziert. Die Ergebnisse von Promotor-studien zeigten die essentielle Rolle einer möglichen PPAR-Bindestelle im iNOS-Promotor. IL-1β scheint die Bildung eines endogenen PPAR-Liganden zu induzieren, wodurch die Bindung von PPAR-Proteinkomplexen an das regulatorische DNA-Element im iNOS-Promotor verstärkt und dessen Aktivität gesteigert wird. Daneben scheinen jedoch auch Nebeneffekte der PPAR-Aktivatoren, wie die Freisetzung von ROS, zur synergistischen Wirkung auf die IL-1β-induzierte iNOS-Expression beizutragen. Die Wirkung von dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf entzündliche Prozesse wird seit längerem diskutiert, daher wurden die biologischen Effekte von neu synthetisierten möglichen dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf Entzündungsparameter, wie z. B. die iNOS-Expression, in Mesangiumzellen untersucht. Alle untersuchten Aktivatoren steigerten in der Form von Esterverbindungen die IL-1β-induzierte Expression der iNOS sowie der sekretorischen Phospholipase A2 (sPLA2), während die entsprechenden freien Säuren wenig Effekte zeigten. Diese proinflammatorische Wirkung scheint jedoch weniger auf einer Aktivierung des PPAR-Rezeptors zu beruhen als auf der Freisetzung von ROS, die durch die Aktivatoren teilweise deutlich erhöht wurde. Weitere Experimente zur Charakterisierung der PPAR-spezifischen Wirkung der Aktivatoren sowie zur optimalen Wirkkonzentration sind nötig, bevor der Effekt dieser Aktivatoren auf die inflammatorische Genexpression genau bewertet werden kann.
Die Entwicklung neuer und Verbesserung bestehender Methoden zur theoretischen Beschreibung molekularer Systeme ist eine der wichtigsten Aufgaben der theoretischen Chemie, vor allem zur Berechnung elektronisch angeregter Zustände zur Simulation von Spektren. Das Ziel dieser Arbeit ist in diesem Zusammenhang die Weiterentwicklung des algebraisch-diagrammatischen Konstuktionsverfahrens (ADC), einer Methode zur Berechnung elektronisch angeregter Zustände, und die Bereitstellung effizienter Computerprogramme zum theoretischen Studium optischer Eigenschaften von "open-shell" Molekülen. Im Vordergrund stehen hierbei die physikalisch richtige Beschreibung von ladungsgetrennten Zuständen und solchen mit hohem Doppeltanregungscharakter. Verbesserte theoretische Methoden sind notwendig, da die zu berechnenden Systeme häufig für eine Beschreibung mit vorhandenen hochgenauen ab initio Methoden zu groß sind. Einfachere, durchführbare Methoden wie z.B. semi-empirische oder DFT-basierte Methoden, die es erlauben, sehr große Molekülsysteme mit mehr als 100 Atomen zu beschreiben, weisen häufig große, nicht vorhersagbare Fehler auf. Experimente im Forschungsgebiet angeregter Zustände von Molekülen finden spektroskopisch statt und erfordern auf der anderen Seite eine Unterstützung durch zuverlässige theoretische Voraussagen. Die Weiterentwicklung der Theorie ist also auch im allgemeinen Interesse der Chemie, Biologie und der anderen Naturwissenschaften. Teil 1 dieser Arbeit umfasst die Theorie, während in Teil 2 deren Anwendung auf ausgewählte Systeme zu finden ist. Nach einer allgemeinen Einführung in die Problematik und grundlegenden Methoden der Quantenchemie in Kapitel 1, wurde im ersten Teil von Kapitel 2 die Methode zur Berechnung angeregter Zustände und ihrer Eigenschaften vorgestellt, auf der diese Arbeit basiert, nämlich das algebraisch-diagrammatische Konstruktionsverfahren (ADC). Dabei sind Eigenschaften von ADC zu betonen, die es von den anderen Methoden unterscheidet. Zum einen werden in ADC alle angeregten Zustände energetisch zuverlässig beschrieben, das heißt Rydberg-, Ladungstransfer- und doppelt angeregte Zustände findet man im Anregungsspektrum an der richtigen Position. Andererseits ist die Methode eine der schnellsten zur Beschreibung doppelt angeregter Zustände (z.B. bei Polyenen) und eignet sich, deren Relevanz im Spektrum zu ermitteln. Denn die beiden Schemata ADC(2)-s und ADC(2)-x unterscheiden sich in der störungstheoretischen Behandlung doppelt angeregter Zustände um eine Ordnung, ADC(2)-s beschreibt sie in nullter Ordnung, ADC(2)-x in erster. Im folgenden Abschnitt stehen die ausführlichen Gleichungen des ADC-Verfahrens für unseren Computercode. Kapitel 2 wurde abgeschlossen durch die Gleichungen der Erweiterung von ADC zur Behandlung von "open-shell" Molekülen auf UADC. Kapitel 3 umfasst die Beschreibung der "intermediate state representation" (ISR), die zur Berechnung von Eigenschaften angeregter Zustände dient und die theoretische Herleitung des UADC-Verfahrens erlaubt. Am Anfang von Teil 2 in Kapitel 4 steht die Untersuchung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit des neu entwickelten UADC-Verfahrens. Dabei wurden elf verschiedene, mittelgroße, aromatische Moleküle ausgewählt, zu denen in der Literatur auch experimentelle Daten zu Vergleichszwecken zu finden waren. Das Ergebnis ist sehr überzeugend und nur minimal aufwändiger als ADC. Kapitel 5 zeigt eine erste Anwendung von UADC auf größere Moleküle und stellt die Eigenschaft der Bestimmung von doppelt angeregten Zuständen von ADC und UADC noch einmal heraus. Der Vergleich der Polyene mit ihren "open-shell" Partnern, den Polyen-Radikalkationen und den neutralen Polyenylradikalen, zeigte, dass der Einfluss der Doppeltanregungen in den Radikalen kleiner ist, für eine exakte Beschreibung der angeregten Zustände ist er jedoch nicht zu vernachlässigen. Danach wurde eine Extraplation der angeregten Zustände von langkettigen Polyenen, Polyenradikalkationen und Polyenylradikalen vorgenommen, die den konjugierten pi-Systemen von Karotinoiden als Modellsysteme dienen. Die Beschreibung der Polyene bestätigte die experimentellen Vorhersagen zu Karotinoiden. Eine erste Anwendung der ISR bezüglich der Berechnung von Eigenschaften angeregter Zustände ist mit der Berechnung von Dipolmomenten angeregter Zustände in Kapitel 6 durchgeführt worden. Die Ergebnisse zeigen eine gute Übereinstimmung mit anderen Methoden und Messergebnissen. Eine weitere Anwendung der ISR ist die Berechnung von resonanten Zwei-Photonen-Absorptionsspektren, mit deren Hilfe spektroskopisch "dunkle" Zustände detektiert werden können. Die zur Berechnung notwendigen Übergangsdipolmomente zwischen angeregten Zuständen aus der ISR wurden dazu in einer sogenannten "sum-over-states" Näherung verwendet. Eine mögliche andere Berechnung über einen geschlossenen Ausdruck mit Hilfe der ADC-Näherung ist noch nicht implementiert.
Kraftfelder sind ein vielseitiges Werkzeug zur schnellen Berechnung vielfältiger Moleküleigenschaften. Die Qualität der damit erhaltenen Vorhersagen ist auch ein Maß, wie gut die wichtigen Einflussgrößen verstanden und vor allem in das Kraftfeld-Modell integriert sind. Bei der Parametrisierung müssen viele Effekte gegeneinander ausbalanciert werden, da die Kraftfeldterme nicht unabhängig voneinander betrachtet werden können. Umfangreiche Testrechnungen sind erforderlich, um die notwendige Qualität der Parameter sicher zu stellen. Eine Automatisierung dieses Prozesses bringt nicht nur eine enorme Zeitersparnis, sie zwingt auch zur sorgfältigen Definition von Vorgaben und Qualitätskriterien. Die Formulierung einer Strategie in einem Programm anstelle von „intelligentem Raten“ fördert zudem ein tieferes Verständnis. Bei einer Änderung der Strategie muss nur das entsprechende Programm geändert werden, dem Entwickler bleibt der manuelle Test erspart. Automatische Methoden zur Plausibilitätsprüfung vermeiden Probleme durch Fehler bei der Dateneingabe von Hand. Die programmgesteuerte Erstellung aussagekräftiger Protokolle und Grafiken macht die Fülle der bei der Parametrisierung und Evaluierung eines Kraftfeldes anfallenden Informationen für den Benutzer überschaubar. Probleme und deren Zusammenhang können so leichter erfasst werden. Für das MOMO-Kraftfeld konnten auf diese Weise verbesserte und neue Parameter für Wasserstoffbrücken abgeleitet werden, zwei empirische Punktladungsmodelle und deren Verträglichkeit mit zwei quantenchemischen Modellen verbessert und prinzipielle Probleme bei deren Vereinbarkeit erkannt werden sowie die automatische Parametrisierung von Bindungslängen, Bindungswinkeln und Torsionswinkeln ermöglicht werden. Bei Letzterem konnte jedoch keine Verbesserung gegenüber den Originalparametern erreicht werden, was nicht weiter verwunderlich ist, da diese seit Jahrzehnten entwickelt worden sind, wohingegen Wasserstoffbrücken und Partialladungen erst später hinzugekommen sind und nicht so umfangreich wie die bindenden Kraftfeldterme getestet wurden. Voraussetzung für die hier gewählte Vorgehensweise, alle Arbeiten weitgehend zu automatisieren und Strategien immer in Programme umzusetzen, waren sehr umfangreiche Programmierarbeiten. Ziel war es, auf einfache Weise die Steuerung des Kraftfeldes aus kleineren Programmen, die spezielle Probleme bearbeiten, zuzulassen. Durch die Nutzung zahlreicher Open-Source-Projekte, die gemeinsam die gewünschte Funktionalität zur Verfügung stellen, konnte der Aufwand auf die dazu passende Implementierung des MOMO-Kraftfeldes und das Verbinden mit der von diesen Projekten bereitgestellten Software beschränkt werden. Der Kern des MOMO-Kraftfeldes wurde aus Geschwindigkeitsgründen in der Compilersprache C geschrieben, Datenein- und -ausgabe und die Programme zur Parametrisierung und Auswertung wurden in Python geschrieben.
A solid-supported membrane (SSM) is an alkanethiol/lipid hybrid membrane with comparable lipid mobility, conductivity, and capacitance than a black lipid membrane (BLM). However, mechanical perturbations, which usually destroy a BLM, do not influence the life-time of a SSM, which is mechanically so stable that solutions may be rapidly exchanged at its surface. This key property has been utilized in this thesis to characterize electrophysiologically two bacterial secondary active transporters (MelB and LacY) as well as to investigate the specific interactions between ions and lipid membranes. These three different projects are summarized below: (1) The properties of lipid membranes, which represent the most important biological interface between intracellular and extracellular compartments, are essentially modulated by the ionic composition of the surrounding aqueous medium. To investigate specific interactions between ions and lipid membranes, solutions of different ionic composition were exchanged at the surface of a SSM through a flow system. This solution exchange resulted in charge translocations that were interpreted in terms of binding of the ions to the lipid headgroups at the SSM surface. We found that chaotropic anions and kosmotropic cations are attracted to the membrane independent of the membrane composition. In particular, the same behaviour was found for lipid headgroups bearing no charge like monoolein. This general trend is modulated by the electrostatic interaction of the ions with the lipid headgroup charge. Our experimental results are in agreement with recent molecular dynamic simulations of PC membranes. (2) Rapid solution exchange on a solid-supported membrane (SSM) is investigated using fluidic structures and a solid-supported membrane in a wall jet geometry. The flow was analyzed with a new technique based on specific ion interactions with the surface combined with an electrical measurement. The critical parameters affecting the time course of the solution exchange and the transfer function describing the time resolution of the SSM system were determined. The experimental data indicate that the solution transport follows a plug flow geometry while the rise of the surface concentration can be approximated by Hagen Poiseuille flow with ideal mixing at the surface of the SSM. Using an improved cuvette design a solution exchange as fast as 2 ms was achieved at the surface of a solid supported membrane. As an application of the technique the rate constant of a fast electrogenic reaction in the melibiose permease MelB, a bacterial (Escherichia coli) sugar transporter, is determined. For comparison, the kinetics of a conformational transition of the same transporter was measured using stopped-flow tryptophan fluorescence spectroscopy. The relaxation time constant obtained for the charge displacement agrees with that determined in the stopped-flow experiments. This supports the previous proposition that upon sugar binding MelB undergoes an electrogenic conformational transition with a rate constant of k ~ 250 s-1. (3) Electrogenic events due to activity of wild-type lactose permease from Escherichia coli (LacY) were investigated with proteoliposomes containing purified LacY adsorbed on a solid-supported membrane electrode. Downhill sugar/H+ symport into the proteoliposomes generates transient currents. Studies at different lipid to protein ratios and at different pH values, as well as inactivation by N-ethylmaleimide, show that the currents are due specifically to the activity of LacY. From analysis of the currents under different conditions and comparison with biochemical data, it is apparent that the predominant electrogenic event in downhill sugar/H+ symport is H+ release. In contrast, LacY mutants E325A and C154G, which bind ligand normally but are severely defective with respect to lactose/H+ symport, exhibit a minor electrogenic event upon addition of LacY-specific substrates, representing only 6% of the total charge displacement of the wild-type. This activity is due either to substrate binding per se or to a conformational transition following substrate binding. We propose that turnover of LacY involves at least two electrogenic reactions: (i) a minor reaction that occurs upon sugar binding and is due to a conformational transition in LacY; and (ii) a major reaction due to cytoplasmic release of H+ during downhill sugar/H+ symport, which is the limiting step for this mode of transport.
Specific functions of biological systems often require conformational transitions of macromolecules. Thus, being able to describe and predict conformational changes of biological macromolecules is not only important for understanding their impact on biological function, but will also have implications for the modelling of (macro)molecular complex formation and in structure-based drug design approaches. The “conformational selection model” provides the foundation for computational investigations of conformational fluctuations of the unbound protein state. These fluctuations may reveal conformational states adopted by the bound proteins. The aim of this work is to incorporate directional information in a geometry-based approach, in order to sample biologically relevant conformational space extensively. Interestingly, coarse-grained normal mode (CGNM) approaches, e.g., the elastic network model (ENM) and rigid cluster normal mode analysis (RCNMA), have emerged recently and provide directions of intrinsic motions in terms of harmonic modes (also called normal modes). In my previous work and in other studies it has been shown that conformational changes upon ligand binding occur along a few low-energy modes of unbound proteins and can be efficiently calculated by CGNM approaches. In order to explore the validity and the applicability of CGNM approaches, a large-scale comparison of essential dynamics (ED) modes from molecular dynamics (MD) simulations and normal modes from CGNM was performed over a dataset of 335 proteins. Despite high coarse-graining, low frequency normal modes from CGNM correlate very well with ED modes in terms of directions of motions (average maximal overlap is 0.65) and relative amplitudes of motions (average maximal overlap is 0.73). In order to exploit the potential of CGNM approaches, I have developed a three-step approach for efficient exploration of intrinsic motions of proteins. The first two steps are based on recent developments in rigidity and elastic network theory. Initially, static properties of the protein are determined by decomposing the protein into rigid clusters using the graph-theoretical approach FIRST at an all-atom representation of the protein. In a second step, dynamic properties of the molecule are revealed by the rotations-translations of blocks approach (RTB) using an elastic network model representation of the coarse-grained protein. In the final step, the recently introduced idea of constrained geometric simulations of diffusive motions in proteins is extended for efficient sampling of conformational space. Here, the low-energy (frequency) normal modes provided by the RCNMA approach are used to guide the backbone motions. The NMSim approach was validated on hen egg white lysozyme by comparing it to previously mentioned simulation methods in terms of residue fluctuations, conformational space explorations, essential dynamics, sampling of side-chain rotamers, and structural quality. Residue fluctuations in NMSim generated ensemble is found to be in good agreement with MD fluctuations with a correlation coefficient of around 0.79. A comparison of different geometry-based simulation approaches shows that FRODA is restricted in sampling the backbone conformational space. CONCOORD is restricted in sampling the side-chain conformational space. NMSim sufficiently samples both the backbone and the side-chain conformations taking experimental structures and conformations from the state of the art MD simulation as reference. The NMSim approach is also applied to a dataset of proteins where conformational changes have been observed experimentally, either in domain or functionally important loop regions. The NMSim simulations starting from the unbound structures are able to reach conformations similar to ligand bound conformations (RMSD < 2.4 Å) in 4 out of 5 cases of domain moving proteins. In these four cases, good correlation coefficients (R > 0.7) between the RMS fluctuations derived from NMSim generated structures and two experimental structures are observed. Furthermore, intrinsic fluctuations in NMSim simulation correlate with the region of loop conformational changes observed upon ligand binding in 2 out of 3 cases. The NMSim generated pathway of conformational change from the unbound structure to the ligand bound structure of adenylate kinase is validated by a comparison to experimental structures reflecting different states of the pathway as proposed by previous studies. Interestingly, the generated pathway confirms that the LID domain closure precedes the closing of the NMPbind domain, even if no target conformation is provided in NMSim. Hence, the results in this study show that, incorporating directional information in the geometry-based approach NMSim improves the sampling of biologically relevant conformational space and provides a computationally efficient alternative to state of the art MD simulations.
This thesis describes the structural characterization of interactions between biological relevant ribonucleic acid biomacromolecules (RNAs) and selected ligands to optimize the methodologies for the design of pharmacological lead compounds. To achieve this aim, not only the structures of the RNA, the ligand and their complexes need to be known, but also information about the inherent dynamics, especially of the target RNA, are necessary. To determine the structure and dynamics of these molecules and their complexes, liquid state nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) is a suitable and powerful method. The necessity for these investigations arises from the lack of knowledge in RNA-ligand interactions, e.g. for the development of new medicinal drugs targeting crucial RNA sequences. In the first chapters of this thesis (Chapters II to IV), an introduction into RNA research is given with a focus on RNA structural features (Chapter II), into the interacting molecules, the biology of the specific RNA targets and the further development of their ligands (Chapter III) and into the NMR theory and methodologies used within this thesis (Chapter IV). Chapter II begins with a description of RNA characteristics and functions, placing the focus on the increasing attention that these biomacromolecules have attracted in recent years due to their diverse biological functionalities. This is followed by a detailed description of general structural features of RNA molecules. The biological functions of the RNAs investigated in this thesis (Human immunodeficiency virus PSI- and TAR-RNA and Coxsackievirus B3 Stemloop D in the 5’-cloverleaf element), together with their known structural characteristics are introduced in Chapter III. Furthermore, a description of the investigated ligands is given, focusing on the methods how their affinity and specificity were determined. The introduction is completed in Chapter IV, where the relevant NMR theory and methodologies are explained. First, kinetics and thermodynamics of ligand binding are summarized from an NMR point of view. Subsequently, a detailed description of the resonance assignment procedures for RNAs and peptidic ligands is given. This procedure mainly concentrates on the assignment of the proton resonances, which are essential for the later structure calculation from NMR restraints. The procedure for NMR structure calculation of RNA and its complexes follows with a short introduction into the programs ARIA and HADDOCK. The final part of this chapter explains the relaxation theory and the methodology to extract dynamic information from autocorrelated relaxation rates via the model-free formalism. In the Chapters V to VII of this thesis, the original publications are included and grouped into three topics. Chapter V comprehends the publications on the investigations of HIV PSI-RNA and its hexapeptidic ligand. These three publications[1-3] focus on the characterization of the ligand and its binding properties, its structure and the optimization of its composition aiming to improve its usage for further spectroscopic investigations.
The aim of the study was to investigate the role of the CX3C chemokine FKN in the role of platelet adhesion. The presence of the FKN receptor CX3CR1 in platelets is demonstrated and G-protein dependent activation of platelets with soluble FKN results in the increased adhesion of platelets to collagen and fibrinogen under flow 228 and adhesion of leucocytes to firmly attached platelets 231. Whether membrane-bound FKN is capable to promote the direct adhesion of platelets in flowing blood analogue to leucocytes was completely unknown. The adhesion mechanisms of FKN in mediating the adhesion of leucocytes under flow are well characterised and represent a novel unique mechanism of leucocyte capture and firm adhesion: FKN is responsible for immediate arrest of flowing CX3CR1 expressing leucocytes without the participation of additional adhesion receptors and ligands. This is in contrast to the classical leucocyte adhesion pathways, which are multistep processes involving leucocyte arrest, rolling and subsequent cell activation prior to firm arrest. In leucocytes, the FKN – CX3CR1 axis is sufficient to allow rapid arrest of leucocytes at low shear flow conditions 67, 101, 115, 122, 261. The set of data from this study demonstrates that immobilised FKN was capable to mediate the adhesion of platelets under low shear conditions, whereas there was no interaction in the absence of shear flow. In the presence of vWf in the adhesion matrix, FKN mediated the potent increased adhesion of platelets. This was in parts due to the activation of flowing platelets via CX3CR1 and the augmented translocation of platelets on FKN via the vWf receptor GPIbα. With respect to platelet activation, the function of endothelial FKN was comparable to leucocytes: in both cell types, the FKN dependent activation is mediated by its cognate receptor CX3CR1. This is in contrast to the adhesive capacity: in leucocytes, FKN dependent adhesion is mediated by CX3CR1, whereas in platelets, the adhesive capacity was mostly mediated by the vWf receptor GPIbα with only minor contribution from CX3CR1. In platelets, activation and adhesion by FKN were mediated by two distinct receptors, whereas in leucocytes, CX3CR1 is solely responsible for FKN dependent activation and adhesion. The presented results point out to a role of platelets in early stage of atherosclerosis. The in vivo expression of both, FKN and vWf is regulated by TNF-α, which is released in early stages of inflammation. The presence of vWf and FKN in the endothelial lining of blood vessels during these conditions is sufficient to initiate the capturing and translocation of platelets on the tunica interna. The rolling of platelets on the endothelium can induce endothelial damage and inflammation of the vessel, which might advance to the generation of clinically significant atherosclerotic plaques and fibrous atheroma.
P2X receptors represent the third superfamily of ligand gated ion channels with ATP as their natural ligand. Most of the mammalian P2X receptors are non-selective cation channels, which upon activation, mediate membrane depolarization and have physiological roles ranging from fast excitatory synaptic transmission, modulation of pain-sensation, LTP to apoptosis etc. In spite of them being an attractive drug target, their potential as a drug target is limited by the lack of basic understanding of the structure-function relationship of these receptors. In my thesis, I have investigated the behavior of homomeric P2X receptor subunits with the help of photolabeling and fluorescence techniques coupled to electrophysiological measurements using Xenopus laevis oocytes heterologous expression system. Concurrent photolabeling by BzATP and current recordings from the same set of receptors in real time has revealed that the gating process in homomeric P2X receptors is contributed individually by each subunit in an additive manner. Our study for the first time describes the agonist potency of Alexa-ATP (a fluorescent ATP analog) on P2X1 receptors. The use of Alexa-ATP in our experiments elucidated that receptor subunits are not independent but interacting with each other in a cooperative manner. The type of cooperativity, however, depended on the type and concentrations of allosteric/competing ligands. Based on our results, in my thesis we propose an allosteric model for ligand-receptor interactions in P2X receptors. When simulated, the model could replicate our experimental findings thus, further validating our model. Further, correlation between occupancy of P2X1 receptors (determined using binding curve for Alexa-ATP) with the steady-state desensitization suggests that binding of three agonist molecules per receptor are required to desensitize P2X1 receptors. We further extended the approach of fluorescence with electrophysiological measurement to assign the role for different domains in P2X1 receptors with the help of environmental sensitive, cysteine reactive fluorophore (TMRM). Cysteine rich domain-1 of P2X1 receptors (C117-C165) was found to be involved in structural rearrangements after agonist and antagonist binding. In contrast to the present understanding, that the binding of an antagonist cannot induce desensitization in P2X1 receptors and the receptors need to open first before undergoing desensitization, we propose based on our results that a competitive antagonist can also induce desensitization in P2X1 receptors by bypassing the open state. We have attempted to answer few intriguing questions in the field of P2X receptor research and we think that our answers provide many avenues to the basic understanding of functioning of P2X receptors.
Na+/H+ antiporters are ubiquitous membrane proteins involved in ion homeostasis and pH sensing. The amino acid sequence of one such antiporter, MjNhaP1, from Methanococcus jannaschii, shows a significant homology to eukaryotic sodium proton exchangers like NHE1 from Homo sapiens and SOS1 of Arabidopsis thaliana than to the well-characterized Escherichia coli NhaA or NhaB. MjNhaP1 shows activity at acidic pH unlike NhaA, which is active at basic pH. 13 transmembrane helices have been predicted to be present in NhaP1. A projection map, calculated by Cryo-EM of 2D crystals of MjNhaP1 grown at pH 4, showed it to be a dimer containing elongated densities in the centre of the dimer and a cluster of density peaks on either side of the dimer core (Vinothkumar et al., 2005). Incubation of 2D crystals at pH 8 on the EM grid resulted in well-defined conformational changes, clearly evident in a difference map as a major change in density distribution within the helix bundle (Vinothkumar et al., 2005). The aim of this dissertation is to understand the working mechanism of MjNhaP1 by determining its three-dimensional structure. The aim was initially approached by structure determination by X-ray crystallography. The limitation for this method was the low expression yield, which was 0.5–0.7mg/ml (Vinothkumar et al., 2005). After various optimization trials, the expression yield of the recombinant protein could be elevated to 2-2.5mg of pure protein per litre of culture by the method of autoinduction (Studier et al., 2005). To obtain well diffracting 3D crystals, purification conditions (Vinothkumar et al., 2005) were modified. 3D crystals were obtained under various conditions, which has so far not diffracted X-Ray beyond 8Å. Parallely, optimization of parameters (Vinothkumar et al., 2005) for 2D crystals formation was carried out. A combination of 1% DDM used for lipid solubilization, and 1% OG in the buffer of the purified protein produced 1-2 μm wide tubular 2D crystals of NhaP1. This batch of crystal proved to be the optimal for data collection at higher tilt angle with the electron microscope. A 3D map showed p22121 symmetry and revealed a tight dimer with an oval shape. The region in the central part of the dimer is composed of several tilted helices forming an interface between both monomers. On either side of the dimer interface, a group of six tightly packed helices form a bundle. This bundle contains three straight helices in the centre of the monomer and three helices in the periphery. Comparison of the structures of E.coli NhaA and M. jannaschii NhaP1 show substantial differences in length and slope of corresponding helices between both antiporters. A 3D model of NhaP1 based on the 3D map revealed 13 helices, which has been named as A-M to distinguish it from the NhaA helices. Overlaying the X-ray structure onto the 3D map revealed that the disrupted helices IV and XI of NhaA superimpose two central helices at similar position in the 3D map of NhaP1. The disrupted helices IV and XI in the X-ray structure of NhaA have been proposed as the putative ion-binding and translocation site (Hunte C et al, 2005; Arkin IT et al, 2007; Screpanti & Hunte (2007). This motif appears to be present also in NhaP1, as suggested by the close fit of NhaA helices IV and XI on the putative helices E and L of the NhaP1 model. These two putative helices E and L in NhaP1 contain the highly conserved TDP and GPRVVP motif, which are crucial for antiporter activity (Hellmer et al., 2002, Hellmer et al., 2003). In the overlay, helix V of NhaA containing the two essential, conserved aspartates D163 and D164 fits the density of the putative helix F of NhaP1, which contains the conserved motif FNDP. The homologous D161 in the FNDP motif of NhaP1 is essential for transport activity as show by mutagenesis (Hellmer at al., 2003). Significant differences are visible in the region of the dimer interface of the 3D map of NhaP1 occupied by helices VI, VII, and VIII in NhaA. This region shows an extra helical density (A) in the 3D map of NhaP1. By alignment of MjNhaP1 sequence with the amino acid sequences of several Na+/H+ exchangers, it was evident that the additional helix (A) is located in the N terminus of NhaP1. In our sequence alignment, a putative hydrophobic segment corresponding to this additional helix A is present in other archaeal and eukaryotic antiporters but not in any of the bacterial ones. The N-terminus of the human Na+/H+ exchanger NHE1 has been predicted to contain a highly hydrophobic signal peptide. This indicates the probability of the N-terminal helix A of NhaP1 to be an uncleaved signal peptide. Besides being a signal sequence targeting NhaP1 to the membrane, the map suggests that this helix might be involved in the formation of dimer contacts between both monomers. A gene duplication event is evident in the 3D map of NhaP1, as not only the helices D, E, F and K, L, M are related by an inverted repeat but also the helices B, C and I, J are related. We present here the three-dimensional architecture of a Na+/H+ antiporter from archaea. The presence of the 13th helix suggests the location of the N-terminus to be located in the cytosol and the C-terminus in the periplasm. This would orient NhaP1 in an inverted manner in the membrane in comparison to NhaA. Further structural information at higher resolution and biochemical and biophysical investigations are required to confirm the topology.
Die vorliegende Arbeit ist aus drei Teilen aufgebaut. Im ersten, relativ kurz gehaltenen Kapitel wird die klassische Standard-Industrie-Solarzelle auf der Basis monokristallinen Siliziums vorgestellt. Der bisherige Herstellungsprozess der Standard-Industrie-Solarzelle, der in wesentlichen Teilen darauf abzielt, diese Verluste zu minimieren, dient als Referenz für die Entwicklung neuer Fertigungsverfahren, wie sie in den Kapiteln 2 und 3 dieser Arbeit vorgestellt werden. Den ersten thematischen Schwerpunkt dieser Arbeit bildet die Entwicklung eines alternativen Wafering-Konzeptes zum Multi-Drahtsägen, der klassischen Technologie zur Fertigung von Silizium-Wafern. Die Basis des neuen, hier vorgestellten Wafering-Prozesses bildet das Laser-Micro-Jet-Verfahren (LMJTM). Dieses System besitzt eine Reihe von Vorteilen gegenüber klassischen „trockenen“ Laserverfahren. Das ursprünglich auf reinem, deionisiertem Wasser als Strahlmedium aufbauende System wurde im Rahmen dieser Arbeit so modifiziert, dass der Flüssigkeitsstrahl nunmehr nicht nur als flüssiger Lichtleiter dient, sondern gleichzeitig auch als Transportmedium für Ätzmittel, welche den thermischen Abtrag des Siliziums durch den Laserstrahl unterstützen. Ausgehend vom aus der Literatur bekannten chemischen Verhalten des Siliziums wurden 3 Ätzsysteme für Silizium vorgestellt. Dabei wurden Vor- und Nachteile für deren technischen Einsatz diskutiert. Den praktischen Teil dieses Arbeitspaketes bildete der Test zweier Ätzmedien im Experiment. Dabei konnte gezeigt werden, dass wasserfreie Strahlmedien basierend auf perfluorierten Lösemitteln mit bereits sehr geringen Zusätzen gasförmigen Chlors als Ätzmittel für Silizium wässrigen alkalischen Ätzsystemen jeder Konzentration prinzipiell überlegen sind- Parallel zur Evaluation des Einflusses der chemischen Beschaffenheit des Flüssigkeitsstrahls auf den Abtragsprozess fand auch eine Untersuchung verschiedener Prozessparametereinflüsse statt, etwa der Laserleistung, der Laserlichtwellenlänge, etc. Den zweiten thematischen Schwerpunkt der Arbeit bildet die Modifizierung der nasschemischen Schritte zwischen dem Wafering und dem ersten Hochtemperatur-Fertigungsschritt in der Solarzellen-Produktion, der Emitterdiffusion. Diese nasschemischen Schritte umfassen bei der Standard-Industrie-Solarzelle in der Regel eine zum Teil aufwändige Reinigung der Wafer-Oberflächen von partikulären und metallischen Kontaminationen, die vor allem vom Wafering-Prozess herrühren, als auch eine Texturierung der Substrate. Kernanliegen des praktischen Teils dieses Arbeitspaketes ist zum einen die Suche nach alternativen Texturmitteln zum 2-Propanol, dem klassischen Badadditiv in basischen Ätzbädern, das in der Praxis über zahlreiche Nachteile verfügt, etwa einem relativ niedrigen Siedepunkt, der zu seinem permanenten Ausgasen aus der Lösung führt. Zum anderen sollte der auf die Textur folgende Reinigungsprozess rationalisiert werden, um Prozesskosten zu minimieren, entweder durch eine Straffung des Prozesses durch Verringerung des Chemikalienverbrauchs und einer Reduzierung der Prozesszeit oder durch eine Verringerung der Chemikalienkosten. Bei der Suche nach neuen Texturmitteln wurden 45 verschiedene organische Substanzen verschiedener Verbindungsklassen hinsichtlich ihrer Texturwirkung auf monokristallinen Silizium-substraten getestet. Mit 1-Pentanol und p-Toluolsulfonsäure wurden zwei Substanzen ermittelt, welche in der Zukunft als praktikable Alternativen zu 2-Propanol als Texturadditive dienen könnten. Im Kontext der Suche nach neuen Reinigungsverfahren wurden eine Reihe verschiedener neuer Reinigungssequenzen getestet, die sich entweder durch veränderte - in der Regel verringerte - Badkonzentrationen, durch neue Badsequenzen, welche auf bestimmte Teilschritte verzichten oder durch neue Badkompositionen, etwa durch Hinzuziehen von Komplexbildnern für metallische Verunreinigungen von den klassischen Reinigungsprozessen unterscheiden. Der Erfolg des Reinigungseffektes der nasschemischen Sequenzen wurde anhand der Ladungsträger-Lebensdauer in den Wafern abgeschätzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe von LMJ produzierte (gelaserte) Wafer-Oberflächen wesentlich straffere Reinigungsprozesse erfordern als drahtgesägte Substrate. Neben einer deutlichen Straffung des Reinigungsprozesses ist auch eine Verkürzung der Texturzeit bei den mit Lasern geschnittenen Oberflächen möglich, die wiederum ihren Grund im geringeren Schädigungsgrad dieser Oberflächen hat, der einen geringeren Materialabtrag durch die Ätzbäder erfordert, als bei drahtgesägten Wafern. Abschließend konnte noch gezeigt werden, dass drahtgesägte Substrate, die bei gleicher Prozesszeit mit den neuen Texturmitteln prozessiert wurden, über erheblich höhere mechanische Stabilitäten verfügen, als jene, bei denen das klassische Texturmittel 2-Propanol eingesetzt wurde.
Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen.
The transcription factor p63 is part of the p53 protein family, which consists of three members, p53, p63 and p73. P63 shares structural similarity with all family members, but is associated to different biological functions than p53 or p73. While p53 is mainly linked to tumor suppression and p73 is connected with neuronal development, p63 has been connected to critical biological roles within ectodermal development and skin stem cell biology as well as supervision of the genetic stability of oocytes. Due to its gene structure p63 is expressed as at least six different isoforms, three of them containing a N-terminal transactivation domain. The isoforms that are of biological relevance both have a C-terminal inhibitory domain that negatively regulates the transcriptional activity. This inhibitory domain is supposed to contain two individual components of which one is internally binding and masking the transactivation domain while the other one can be sumoylated. To further investigate this domain a mutational analysis with the help of transactivation assays in SAOS2 cells was carried out to identify the critical amino acids within the inhibitory domain and the impact on transcriptional activity of TAp63alpha, the p63-isoform which is essential for the integrity of the female germline. The results of these experiments show that a stretch of approximately 13 amino acids seems to be important for the regulation of transcriptional activity in TAp63alpha, due to the increased transcriptional activity occurring in this region after mutation. Additional experiments showed that this mechanism is distinct from sumoylation, which seems to have only implications for the intracellular level of TAp63alpha. As a conclusion, the C-terminus of the Tap63alpha is essential for two different mechanisms, which control the transcriptional activity of the protein. Both regulatory elements are independent from each other and can now be restricted to certain amino acids. Activation of the wild type protein might take place in the identified region via post-translational modification. Furthermore an inhibition assay was carried out to test if the same region might have implications on the second biological relevant isoform deltaNp63alpha. The results show that the same amino acids which show an impact on transcriptional activity in Tap63alpha lead to a significant change in functional behaviour of deltaNp63alpha. There is a possibility that both proteins are regulated with opposite effects via the same mechanisms, based at the C-terminus of the p63alpha-isoforms. In both cases a modification of these residues could lead to a more opened conformation of the protein with consequences on promoter binding, which can be even important for deltaNp63alpha with respect to promoter squelching. Both alpha-isoforms seem to be regulated via the C-terminus and to elucidate if that is also the case for TAp63gamma a deletion analysis was carried out. The results show that there are also amino acids within the C-terminus of TAp63gamma, which have implications on the transcriptional activity of the protein. Therefore the C-terminus seems to play a major role for regulation of diverse p63 isoforms.
Elektronentransferprozesse in Pd-Komplexen 1,4-Chinon-basierter Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden
(2009)
PdII-katalysierte Oxidationsreaktionen organischer Verbindungen stellen wichtige synthetische Werkzeuge dar. Um das Übergangsmetall in katalytischen Mengen einsetzen zu können ist es nötig, das im Zuge der Substratumwandlung entstehende Pd0 seinerseits wieder zu reoxidieren. Im großtechnischen Wacker-Prozess setzt man zu diesem Zweck das Redoxsystem CuII/CuI ein, welches Elektronen von Pd0 aufnimmt und sie auf molekularen Sauerstoff überträgt, so dass als einziges Abfallprodukt Wasser entsteht. Da beim Einsatz von Kupfersalzen allerdings Probleme durch unerwünschte Nebenreaktionen auftreten können, stieß man auf der Suche nach alternativen Redox-Cokatalysatoren auf 1,4-Benzochinon. Man nimmt an, dass der Reoxidation von Pd0 eine Koordination des 1,4-Benzochinons an das Übergangsmetallatom vorausgeht. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit ein 1,4-Naphthochinon-basierter Bis(pyrazol-1-yl)methan-Ligand entwickelt, dessen Pd-Komplex das katalytisch aktive Übergangsmetallatom und den Redox-Cokatalysator in einem einzigen Molekül vereint. Eine direkte intra- und intermolekulare 1,4-Chinon/Pd-Koordination wird durch das Ligandendesign jedoch verhindert. Anhand dieses Modellsystems sollte dann untersucht werden, ob alternativ zu den etablierten mechanistischen Vorstellungen zum Ablauf des Elektronentransfers, eine durch den Raum verlaufende elektronische Kommunikation der beiden redoxaktiven Zentren möglich ist. Sollte das der Fall sein, wäre man künftig bei der Entwicklung und Optimierung solcher Hybridkatalysatoren nicht auf die Miteinbeziehung des 1,4-Chinons in die Koordinationssphäre des Übergangsmetallions angewiesen, sondern könnte diese ausschließlich an die koordinationschemischen Erfordernisse des Pd-Zentrums anpassen. Nachdem das Modellsystem zur Verfügung stand, galt es im ersten Schritt, die elektrochemischen Eigenschaften von freiem Ligand und PdII-Komplex mittels Cyclovoltammetrie zu bestimmen. Mit Kenntnis der Redoxpotentiale wurden daraufhin elektrochemisch selektiv reduzierte Spezies des Liganden bzw. seines PdII-Komplexes erzeugt und deren UV-vis-Spektren in situ aufgenommen. Letztere lieferten nötige Referenzwerte für die folgenden Experimente. Auf Grundlage dieser Vorarbeiten konnte nun die elektronische Kommunikation der redoxaktiven Zentren in dem Komplex untersucht werden. Da im Modellsystem zunächst beide redoxaktive Zentren in der oxidierten Form vorliegen, war es erforderlich, das PdII-Ion selektiv zu reduzieren, um dem System an der richtigen Stelle Elektronen zuzuführen. Als Reduktionsmittel wurde Triethylamin gewählt; entsprechende Vergleichsexperimente stellten zuvor sicher, dass dieses keine Nebenreaktionen mit dem Liganden selbst eingeht. Im Zuge der Reduktion des PdII-Zentrums ist eine Änderung der UV-vis-spektroskopischen Eigenschaften des Liganden zu beobachten. Ein Vergleich der erhaltenen Daten mit den Referenzspektren der elektrochemisch erzeugten reduzierten Spezies legt den Schluss nahe, dass nach Überführung des PdII-Zentrums in die nullwertige Stufe der durch den Raum verlaufende Übergang eines Elektrons auf den 1,4-Naphthochinon-basierten Liganden erfolgt. Das hierbei entstehende 1,4-Naphthosemichinonradikal wurde zusätzlich ESR-spektroskopisch nachgewiesen.
Die Erforschung der neuartigen Materialien BST, PZT und SBT für den Einsatz in neuartigen Speichertechnologien wie dem FeRAM besteht aus vielen unterschiedlichen Teilbereichen. Im Rahmen dieser Dissertation wurden primär zwei Hauptbereiche analysiert. Als Erstes wurden sowohl die Mechanismen der Oberflächenausbildung (Wachstumsverfahren, Prozeßparameter, Substrat Einflüsse) von einzelnen Filmen, als auch die Wechselwirkungen der Schichten untereinander und deren Auswirkung auf das Schichtsystem, untersucht. Im zweiten Schritt wurde das elektrische Verhalten, und die auftretenden Phänomene sowohl qualitativ als auch quantitativ erfaßt und bewertet. Als Elektrodenmaterial für die di/ferroelektrische Speicher kann nicht wie gewohnt dotiertes Silizium/Polysilizium verwenden werden. Da Platin den chemischen und thermischen Belastungen bei der Herstellung dieser Filme besonders gut gewachsen ist, wird es bevorzugt als Elektrode eingesetzt. Bei dem Aufbau der Pt-Elektrode erfolgt die größte Veränderung des Systems durch die RTP-Oxidation des reaktiven Titans. Die Rauhigkeit des vorher sehr fein kristallinen Ti-Films steigt auf das Vierfache bei einer gleichzeitigen Verdreifachung der Korngröße. Da in vielen Bauelementen Si oder Poly-Si in Kombination mit einer Ti/TiN-Barriere als Basis für den Pt-Film fungieren, wurde bei den nächsten Experimenten der Einfluß des Substrates und der TiN-Sputtertemperatur auf die Topologie/Morphologie der Elektrode untersucht. Nur durch Anpassung der TiN Sputterleistung, eine niedrige Substrattemperatur und der Kombination aus N2-RTP Temperung (nach TiN) und O2-Temperung (nach Pt), gelingt es die Rauhigkeit und Kristallitgrößen des entstandenen Filmsystems zu minimieren. Bei der Charakterisierung der di/ferroelektrischen Materialien BST, PZT und SBT wurden zum einen das Wachstum und die beim Aufbau der Schichten auftretenden Phänomene anhand verschiedener Abscheidungstechniken untersucht/verglichen. Zum anderen sind mehrere Schichtdicken, Schichtabfolgen und eine Reihe unterschiedlich getemperter Proben analysiert worden. Die mittels Sputtern hergestellten BST Filme belegen, dieses Material hat typischerweise ein columnares Kristallwachstum und läßt sich sehr fein kristallin aufbringen. Bei der reaktiven Abscheidung aus der Gasphase (MOCVD) hat sich schnell gezeigt, das komplexe Material System BST reagiert bereits bei Variation eines Parameters extrem unterschiedlich. So findet bei einer hohen Substrattemperatur (690°C) ein fließender Übergang vom zwei dimensionalen (2D, Frank-van der Merwe), zum drei dimensionalen (3D, Stranski-Krastanov) Wachstum statt. Wird BST bei 600°C abgeschieden, liegt von Anfang an ein gemischter 2D/3D Schichtaufbau vor, der überwiegend in einen 3D inselartigen Aufbau (Vollmer-Weber) übergeht. Senkt man die Temperatur auf 450°C, bildet sich auf der Oberfläche Haze, der durch eine instabile Gasphasenreaktion an der Oberfläche entsteht und sich hauptsächlich aus Strontium- und Bariumoxid zusammensetzt. Gesputtertes PZT besitzt im Vergleich zu BST eine um den Faktor 6 höhere Wachstumsrate, und bildet zweimal so breite Kristallite aus. Es hat eine relativ feinkörnige Struktur und seine Kristalle wachsen wie beim BST columnar auf. Die MOD Technik erzeugt einen relativ homogenen SBT-Schichtaufbau mit Korngrößen bis zu 135 nm. Erst nach dem Ferroanneal entstehen bis zu dreimal größere Kristalle, die von markanten Korngrenzen getrennt werden und große Kristallflächen mit Unterstrukturen haben. Die mit der MOCVD Methode hergestellten SBT-Proben zeigen teilweise Wachstumsphänomene in Form von Hillocks, die im EDX allerdings keine Unterschiede in der Zusammensetzung aufweisen. Die systematische Untersuchung der Wechselwirkung von Temperatur (600-800°C) und Schichtdicke (ca. 80-175 nm) bei konstanter Temperzeit hat ergeben, daß die Filme bei einem 600°C Ferroanneal kleine Hillocks besitzen, die erst ab 700°C nicht mehr zu beobachten sind. Neben der topographischen Analyse von Di- und Ferroelektrika gibt es einen zweiten sehr wichtigen Aufgabenbereich, die elektrische Charakterisierung dieser Materialien. Da alle herkömmlichen Verfahren diese Daten nur Integral erfassen können, eröffnet die Rastersondenmikroskopie hier erstmalig die Chance, sowohl Topographie als auch elektrische Parameter simultan und mit hoher Ortsauflösung (10-50 nm) zu analysieren. Die ersten Versuchsreihen wurden mit dem EFM gemacht und haben sich mit dem Polarisationsverhalten von PZT und SBT beschäftigt. Zu diesem Zweck wurde ein Experiment entwickelt, bei dem das Ferroelektrikum durch gezielte Polarisationen in zwei definierte Zustände entgegengesetzter maximaler Polarisation versetzt wird. Die Ergebnisse konnten mit dem Oberflächenpotential Mikroskop reproduziert werden, allerdings reagiert das Oberflächenpotential Mikroskop deutlich stärker auf freie Ladungen als das EFM. Um zwischen Ladungsartefakt und realer Beobachtung unterscheiden zu können, wurde ein Verfahren zur Konditionierung und Ladungsentfernung der Probe entwickelt, ohne die Probe merklich zu manipulieren. Da bei den EFM-Untersuchungen viele verschiedene elektrostatische Phänomene aufgetreten sind, ist eine generelle Betrachtung zur Fragestellung, was bildet das erhaltene EFM-Signal eigentlich ab, gemacht worden. Dazu wurde ein deutlich vereinfachtes Ladungsmodell vorgestellt, das den Polarisationsvorgang mit seinen unterschiedlichen Einzelprozessen beschreibt. Zusammenfassend ist zu sagen, daß EFM ein elektrostatisches Gesamtfeld detektiert, das aus verschiedenen Komponenten besteht, die in der Regel qualitativ und nicht quantitativ miteinander verknüpft sind. Im Gegensatz zu makroskopischen Messungen haben zeitabhängige Untersuchungen an SBT gezeigt, die abgebildete Polarisation verringert sich bereits nach wenigen Tagen signifikant. Eine Erklärung für den Signalverlust ist die Annahme, daß sich über die Zeit primär nur die SBT-Oberfläche verändert, da ihr die elektrisch und chemisch stabilisierende Pt-Elektrode fehlt. Eine weitere Überlegung geht davon aus, durch die EFM-Spitze hat eine wesentlich höhere Feldstärke auf das Ferroelektrikum eingewirkt und das Material dadurch stärker gestreßt. Die Untersuchung der temperaturabhängigen Relaxation von ferroelektrischen Filmen liefert weitere interessante Erkenntnisse. Ohne obere Pt-Elektrode kann man bereits ab 130°C einen deutlichen Polarisationsverlust beobachten (Curie-Punkt SBT: 310°C). Die Temperversuche sprechen damit für die Hypothese, durch die fehlende obere Elektrode wurde bei der Polarisation erhöhter Streß in das SBT eingeprägt und das System hat darauf mit stark beschleunigter Relaxation reagiert. Es kann jedoch nicht abschließend geklärt werden, was auf das Materialverhalten einen größeren Einfluß ausübt, die Oberflächenladungen oder die fehlende obere Pt-Elektrode. In weiteren Experimenten wurde die Bildung der ferroelektrischen Phase und deren Störungen untersucht. Versuche mit unterschiedlicher Ferroannealtemperatur bei MOD SBT-Schichten haben gezeigt, die Kristallphasenbildung wird hauptsächlich von der Annealtemperatur gesteuert. Bei einer Temperatur von 600°C wird nur eine partielle Phasenumwandlung erzielt, dagegen liegt bei 800°C eine vollständige Umwandlung in den pseudotetragonalen Perowskit vor. Die Untersuchung eines mittels MOCVD-Verfahren abgeschiedenen SBT-Films ergab eine nicht vollständig polarisierte Oberfläche. Da sich bei einer Substrattemperatur von 640°C primär eine a/b-Kristallachsenorientierung ausbildet, die Probe jedoch nur partiell polarisierbar war, ist höchstwahrscheinlich die Substrattemperatur während der Abscheidung zu niedrig gewesen. Zum Abschluß der Versuche wurde der Polarisationsbereich zunächst auf wenige Mikrometer verkleinert und schließlich sogar auf einzelne Kristalle eingeschenkt. Obwohl es gelingt, einzelne Kristalle zu polarisieren, zeigen diese Experimente deutlich die Limitierungen des EFMs auf. Die ersten Messungen mit dem Piezoresponse-SPM haben ergeben, daß es möglich ist, subkristalline Polarisationsstrukturen ohne nennenswerte Topographieartefakte und „Übersprechen“ abzubilden. Mit dem C-AFM ist in sehr hoher Orts- und Stromauflösung das Leckstromverhalten von BST, PZT und SBT untersucht worden. Da diese di- und ferroelektrischen Materialien eine polykristalline Struktur haben, treten neben Fehlertypen wie Fremdatomdefekten und Leerstellen auch noch eine Vielzahl anderer Kristallbaufehler (Versetzungen, Korngrenzen, ...) auf, die zu erhöhten Leckströmen führen. Auch die Morphologie der Filme beeinflußt das elektrische Verhalten der Materialien. Bei den als Erstes vermessenen BST-Proben ist eine starke Schichtdicken- und Feldstärken-Abhängigkeit zu beobachten. So wird das Leckstromverhalten bei dünnen BST-Proben und niedrigem Potential von extrinsischen Fehlern in Form von Fremdatomdefekten, Leerstellen und verschiedenen Kristallbaufehlern dominiert. Erhöht man allerdings die Feldstärke, so bestimmen die intrinsischen Fehler die Leckstrompfade, da durch das hohe Potential die Bandstruktur solange degradiert bis ein elektrischer Durchbruch vorliegt. Bei höheren Schichtdicken (70 nm) werden durch den intrinsischen Streß des Films hervorgerufene Leckströme erkennbar. Sie treten erst ab einem kritischen Zug- oder Druckstreßniveau in Insel/Domänen-ähnlicher Form auf, der in der topographischen Aufnahme nicht sichtbar ist. Im Gegensatz zu amorphen Materialien wie dem SiO2 spielt bei BST, PZT und SBT die Filmdicke nur eine untergeordnete Rolle, da eine partielle Dünnung nicht automatisch einen erhöhten Leckstrom zur Folge hat. Da ferroelektrische Materialien eine Leckstromgenerierung besitzen die komplexer ist, und einem anderen Zeitablauf folgt, als bei einem Dielektrikum, wurde zuerst das ferroelektrische PZT mit dem C-AFM analysiert. Die ersten Untersuchungen an einer PZT-Probe haben allerdings sehr schnell gezeigt, zwischen BST und PZT gibt es keine nennenswerten Unterschiede im Leckstromverhalten. Für die Herstellung von SBT-Schichten werden hauptsächlich das MOD und das MOCVD Verfahren verwendet. Um festzustellen welche der beiden Abscheidetechniken das bessere Leckstromverhalten hat, wurden MOD und MOCVD SBT-Filme charakterisiert. Diese Untersuchungen haben gezeigt, bei MOCVD Filmen treten die Leckströme hauptsächlich in den Bereichen auf, die leicht vereinzelte oder nicht dicht verwachsene Korngrenzen und Kristallecken besitzen. Im Vergleich dazu weisen die MOD Schichten in ähnlichen Bereichen deutlich wenigere und niedrigere Leckströme auf. Den Einfluß von Topologie und Filmdicke hat die Analyse einer mit 90 nm MOD SBT beschichteten Stufe (120 nm) belegt, da dort nur im Kantenbereich extrem erhöhte Leckströme zu beobachten sind. Das Degradationsverhalten von SBT ist außerdem auch noch dickenabhängig. Dies beweisen I/V Spektren, die bei C-AFM Messungen an unterschiedlich dicken MOD SBT-Schichten (90/180 nm) aufgenommen wurden. Es zeigt sich, speziell bei höheren Feldstärken liegt bei der dünnen SBT-Probe (90 nm) eine um den Faktor vier steilere Degradation vor.
Based on the commonly used and well-established state-of-the-art DNA sequencing method, i. e. Sanger sequencing, the major target of future research is to develop a fast, cost-effective and gelelectrophoresis-free sequencing method. The aim of the new sequencing technologies is to detect DNA mutations faster and more accurate in order to develop individual therapies for patients (personalized medicine). For this purpose, a lot of novel sequencing techniques like pyrosequencing, mass-spectrometry-assisted sequencing, sequencing by hybridization etc. have been put into practice and already led to commercialized sequencers. The sequencing technology we were mostly interested in is the so-called sequencing-by-synthesis method (SBS). This PhD thesis covers the synthesis of modified nucleosides – the so-called reversible terminators – and their evaluation as reversible terminators. These 3′-modified and dye-labeled nucleotides are incorporated by the polymerase into the DNA-template, then the DNA-synthesis is stopped. After detection of the fluorescent signal, the reversible terminator has to be cleavable in a way (i. e. the polymerase-blocking modification) that the DNA-synthesis can continue. As a result of the polymerase-acceptance tests that have been carried out with the two triphosphates cyanoethoxymethyl(CEM)-dTTP and cyanoethyl(CE)-dTTP as substrates it became clear that the latter one was better incorporated than the first one. Based on this knowledge all four key compounds for the whole reversible terminators possessing the cyanoethyl (CE) group where synthesized within this PhD thesis. Additionally to the synthesis of the modified key compounds, the cleavability of the cyanoethyl function had to be evaluated which is an essential requirement of a reversible terminator for SBS. For addressing this issue, three different CE- and CEM modified monophosphates were created. For each of these three monophosphates an individual synthetic strategy has been developed within this PhD work, each of these strategies and subsequent phosphorylation led to the desired modification. These previously unknown model compounds mimicking the solubility of short oligonucleotides were employed the for qualitative cleavage experiments after their purification and spectroscopical characterization. With these three monophosphates suitable cleavage conditions for a quantitative removal of the CE and the CEM group were examined. In case of the CE function we selectively improved the cleavage conditions while varying the solvent, the reaction temperature as well as the amount of cleaving agent used, in order to make the conditions applicable for an SBS experiment. Due to the fact that the CE function was the most important modification for our SBS experiment, we could even optimize the cleavage efficiency by employing co-solvents like DMSO or DMF. An additional cleavage experiment was carried out by using a short CE-modified oligomer which led to further results that were comparable to the ones obtained from the cleavage experiments of the monomers. One big difference is the required amount of TBAF as cleaving agent for the quantitative removal of the CE-modification from the oligomer. In this case, 7500 equivalents of TBAF are needed for complete CE cleavage at 45 °C compared to the amount of 40 to 80 equivalents TBAF for the monomer (monophosphate). As a conclusion of this result we assume that the amount of cleaving agent and the solubility of the oligomer plays an important role in the CE cleavage efficiency. This assumption was already supported by Saneyoshi et al. who demonstrated for CE-modified RNA oligonucleotides that the CE-cleavage rate is strongly lowered with the increasing of the oligomer length. Thus we could demonstrate that the CE function is quantitatively removable from an oligomer without destroying it. With these results in hands we could prove that the CEM and the CE group are quantitatively cleavable and therefore applicable as blocking groups for reversible terminators. The conditions for the CE cleavage are used for the ArraySBS-“proof-of-principle” which is currently under investigation.
X-ray structure of the Na+-coupled Glycine-Betaine symporter BetP from Corynebacterium glutamicum
(2009)
Cellular membranes are important sites of interaction between cells and their environment. Among the multitude of macromolecular complexes embedded in these membranes, transporters play a particularly important role. These integral membrane proteins perform a number of vital functions that enable cell adaptation to changing environmental conditions. Osmotic stress is a major external stimulus for cells. Bacteria are frequently exposed to either hyperosmotic or hypoosmotic stress. Typical conditions for soil bacteria, such as Corynebacterium glutamicum, vary between dryness and sudden rainfall. Physical stimuli caused by osmotic stress have to be sensed and used to activate appropriate response mechanisms. Hypoosmotic stress causes immediate and uncontrolled influx of water. Cells counteract by instantly opening mechanosensitive channels, which act as emergency valves leading to fast efflux of small solutes out of the cell, therebydiminishing the osmotic gradient across the cell membrane. Hyperosmotic stress, on the other hand, results in water efflux. This is counterbalanced by an accumulation of small, osmotically active solutes in the cytoplasm, the so-called compatible solutes. They comprise a large variety of substances, including amino acids (proline), amino acid derivatives (betaine, ectoine), oligosaccharides (trehalose), and heterosides (glucosylglycerol). Osmoregulated transporters sense intracellular osmotic pressure and respond to hyperosmotic stress by facilitating the inward translocation of compatible solutes across the cell membrane, to restore normal hydration levels. This work presents the first X-ray structure of a member of the Betaine-Choline-Carnitine-Transporter (BCCT) family, BetP. This Na+-coupled symporter from Corynebacterium glutamicum is a highly effective osmoregulated and specific uptake system for glycine-betaine. X-ray structure determination was achieved using single wavelength anomalous dispersion (SAD) of selenium atoms. Selenium was incorporated into the protein during its expression in methione auxotrophic E. coli cells, grown in media supplemented with selenomethionine. SAD data with anomalous signal up to 5 Å led to the detection of 39 selenium sites, which were used to calculate the initial electron density map of the protein. Medium resolution and high data anisotropy made the structure determination of BetP a challenging task. A specific strategy for data anisotropy correction and a combination of various crystallographic programs were necessary to obtain an interpretable electron density map suitable for model building. The crystal structure of BetP shows a trimer with glycine-betaine bound in a three-fold cation-pi interaction built by conserved tryptophan residues. The bound substrate is occluded from both sides of the membrane and aromatic side chains line its transport pathway. Very interestingly, the structure reveals that the alpha-helical C-terminal domain, for which a chemo- and osmosensory function was elucidated by biochemical methods, interacts with cytoplasmic loops of an adjacent monomer. These unexpected monomer-monomer interactions are thought to be crucial for the activation mechanism of BetP, and a new atomic model combing biochemical results with the crystal structure is proposed. BetP is shown to have the same overall fold as three unrelated Na+-coupled symporters. While these were crystallised in either the outward- or inward-facing conformation, BetP reveals a unique intermediate state, opening new perspectives on the alternating access mechanism of transport.
In jüngster Zeit werden vom humanen Immundefizienzvirus-1-abgeleitete lentivirale Vektoren auch in der Gentherapie eingesetzt. Obwohl diese Vektoren nicht-mitotische Zellen transduzieren können, sind sie für einen Gentransfer in primäre ruhende Zellen oft nicht geeignet. In der Abteilung „Medizinische Biotechnologie“ des Paul-Ehrlich-Insituts wurde ein vom simianen Immundefizienzvirus SIVsmmPBj-abgeleiteter lentiviraler Vektor entwickelt, welcher im Gegensatz zu HIV-1-abgeleiteten Vektoren effizient in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte humane Fibroblasten und humane primäre Monozyten transduzieren kann (Mühlebach et al., 2005). Im dieser Arbeit wurde das Potenzial dieses neuen Vektors für mögliche Anwendungen in der Gentherapie untersucht, indem seine Transduktionsfähigkeit für weitere primäre Zellen bestimmt wurde. Dabei waren humane hämatopoetische Stammzellen von besonderem Interesse, da sie die Vorläuferzellen aller Zellen des Blutes sind und die Eigenschaft zur Selbsterneuerung besitzen. Die Effizienz des Gentransfers in unstimulierten Stammzellen mit dem SIVsmmPBj-Vektor war jedoch nicht höher als mit anderen lentiviralen Vektoren. Interessanterweise konnte aber ein Einfluss der lentiviralen Vektoren auf das in vitro-Differenzierungspotenzial der transduzierten Stammzellen in die verschiedenen Vorläuferzellen beobachtet werden: Nach Transduktion mit dem SIVsmmPBj- und einem HIV-2-abgeleiteten Vektor differenzierten die Stammzellen bevorzugt in granulozytäre Vorläuferzellen, während die Transduktion mit einem HIV-1-abgeleiteten Vektor die Anzahl aller Vorläuferzellen deutlich reduzierte und insbesonders die Differenzierung in Makrophagenvorläuferzellen verminderte. Zur Untersuchung ihres Differenzierungs-potenzials in vivo wurden transduzierte hämatopoetische Stammzellen zur Repopulierung des Knochenmarks von NOD/SCID-Mäusen eingesetzt. Hierbei wurde jedoch kein Einfluss der verschiedenen lentiviralen Vektoren auf die Differenzierung der Stammzellen beobachtet. Allerdings konnte nur in einem sehr geringen Anteil der transplantierten Zellen eine Expression des übertragenen Gens nachgewiesen werden, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass die transduzierten Zellen die Fähigkeit zur Repopulierung verloren hatten. Insgesamt ist jedoch zu sagen, dass entgegen der Erwartungen der neue Vektor keinen Vorteil gegenüber HIV-1-Vektoren zur Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen aufweist. Weiter wurde die Transduktionsfähigkeit des SIVsmmPBj-Vekors für humanen B-Lymphozyten, Makrophagen und dendritische Zellen untersucht. Auf ruhenden B-Lymphozyten besaß der SIVsmmPBj-Vektor keinen Transduktionsvorteil gegenüber einem HIV-1-abgeleiteten Vektor, während Makrophagen und dendritische Zellen mit signifikant höherer Effizienz transduziert werden konnten. Die hohe Transduktionseffizienz des SIVsmmPBj-Vektors für Monozyten und dendritische Zellen eröffnet die Möglichkeit einer Anwendung in der Immuntherapie, da dendritische Zellen die professionellsten und effektivsten Antigen-präsentierenden Zellen sind. Daher wurde die generelle Eignung des SIVsmmPBj-Vektors für immuntherapeutische Anwendungen untersucht. Ein Tumor-assoziiertes Antigen (Mart-1) wurde in Monozyten übertragen und die transduzierten Zellen zu reifen dendritischen Zellen maturiert. Diese Zellen besaßen die Fähigkeit, Antigen-spezifische zytotoxische T-Zellen zu generieren, deren Funktion durch Sekretion von Zytokinen, in Einzelfällen auch durch spezifische Lyse von Mart-exprimierenden Tumorzellen nachgewiesen wurde. Weiterhin wurde gezeigt, dass nach Transduktion von Monozyten und deren Differenzierung zu Makrophagen auch diese prinzipiell in der Lage sind, Antigen-spezifische zytotoxische T-Zellen zu generieren. Obwohl hier keine vergleichenden Untersuchungen zur Effizienz des T-Zell-Primings durchgeführt werden konnten, ist die prinzipielle Eignung des SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektors für eine Immuntherapie damit nachgewiesen. Schließlich wurde untersucht, ob die Maus oder nicht-menschliche Primaten als Tiermodelle für eine mögliche Weiterentwicklung des Vektors in Frage kommen. Murine Monozyten konnten jedoch nicht effizient transduziert werden. Hingegen erwies sich der SIVsmmPBj-Vektor als gut geeignet zur Transduktion von simianen Monozyten, so dass ein Affenmodell für Anwendungen des SIVsmmPBj-Vektors, wie beispielsweise zur Tumor-Immuntherapie oder für Vakzinierungsstudien, in Frage kommt.
Die Fluoreszenz der organischen Verbindung ''Pigment Yellow 101'' wurde mittels zeitaufgelöster Anreg-Abtast-Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. P.Y. 101 und ein Derivat mit zusätzlichen Methylgruppen an den Azin-Kohlenstoffatomen, wurden mit zwei Derivaten verglichen, die keine Hydroxygruppen tragen und nicht fluoreszieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Fluoreszenz bei diesen Verbindungen eine intrinsische Eigenschaft ist, die von der Reihenfolge der angeregten Zustände bestimmt wird. Bei Derivaten mit Hydroxygruppe entspricht der niedrigste angeregte Zustand einem pp*-Übergang, welcher hauptsächlich durch Fluoreszenz zurück in den Grundzustand gelangt. Bei den Verbindungen ohne Hydroxygruppe fehlt die stabilisierende Wasserstoffbrücke, die zur Absenkung des entsprechenden Zustands führt, so dass bei diesen Derivaten der unterste angeregte Zustand einem np*-Übergang entspricht, der optisch verboten ist und somit nicht direkt populiert wird. Bei der Anregung wird ein höher angeregter Zustand bevölkert, der in den niedrigsten angeregten Zustand relaxiert, welcher über eine konische Durchschneidung schnell und strahlungsfrei erreicht werden kann. Der niedrigste angeregte Zustand schneidet seinerseits den Grundzustand, so dass auch die Repopulierung des Ausgangszustands schnell, effizient und strahlungslos abläuft. Eine ganz andere Art der Photochemie wird bei Azobenzol (AB) und AB-Derivaten beobachtet. Durch Isomerisierung um die N-N-Doppelbindung wird ein Photoprodukt gebildet, das cis-Isomer. Die Quantenausbeute der Isomerisierung ist dabei abhängig davon, welcher elektronische Übergang angeregt wurde. Substituenten am AB üben unterschiedlichen Einfluss auf die elektronischen Eigenschaften aus: Elektronegative Gruppen in meta-Position zur Diazobrücke verändern die Lage der Absorptionsbanden kaum, ebensowenig die Rate der thermischen Rückisomerisierung und auch die Dynamik nach Photoanregung zeigt keine signifikanten Unterschiede in Abhängigkeit vom Substituenten und kann in Analogie an unsubstituiertes AB interpretiert werden. Nach Anregung des np*-Übergangs zerfällt der angeregte Zustand biexponentiell. Die Anregung des pp*-Übergangs, dem optisch erlaubten Übergang, führt zur Population des zweiten angeregten Zustands. Entlang einer konischen Durchschneidung wird schnell und effizient der erste angeregte Zustand populiert. Dieser Prozess zeigt sich bei den zeitaufgelösten Messungen in einer schnellen Zerfallszeit, die nur wenige hundert Femtosekunden beträgt. Die nun folgenden Prozesse finden im ersten angeregten Zustand statt und sind vergleichbar mit den Prozessen nach np*-Anregung. Der Hauptunterschied zwischen den beiden Dynamiken im S1-Zustand ist die Ausgangsgeometrie, mit der die Moleküle diesen Zustand populieren (Franck-Condon-Bereich bei direkter Anregung, bzw. eine große Bandbreite an Geometrien nach dem S2-S1-Übergang), sowie die Schwingungsenergie die das System jeweils besitzt. Auch nach ursprünglicher S2-Anregung können zwei Zerfallszeiten dem ersten angeregten Zustand zugeordnet werden, die analog der direkten Population als Geometrieänderung in Richtung des Potentialminimums und Isomerisierung bzw. Rückkehr in den Grundzustand interpretiert werden und in der Größenordnung von einer bzw. fünf Pikosekunden liegen. Die Modifizierung von Peptiden mit Azobenzol stellt einen Weg dar, zeitlich synchronisiert, eine Störung in der Struktur zu induzieren. Dieses Konzept wurde bereits erfolgreich zur Untersuchung der Faltung zyklischer Peptide eingesetzt. Modifizierte Kollagenstränge sind eine Erweiterung dieses Prinzips, da sie eine Möglichkeit darstellen, die Tertiärstruktur eines Peptids zu adressieren. Für das vorliegende Azokollagen konnte gezeigt werden, dass die gewählte Aminosäuresequenz auch nach Anbringen der Azobenzolklammer zu gefaltetem Kollagen führt, welches thermodynamisch stabil ist. Der Schmelzpunkt der Tripelhelix liegt unter den gewählten Bedingungen bei 55°C. Die Isomerisierung des Azobenzols induziert eine Störung der Tertiärstruktur, die zur teilweisen Entfaltung der Tripelhelix führt, was ein reversibler Prozess ist. Eine vollständige Entfaltung findet erst bei Temperaturen oberhalb des Schmelzpunkts statt. Zeitaufgelöste Messungen im sichtbaren Spektralbereich zeigten, dass die Schalterdynamik durch Anbringung an das Peptid nicht signifikant im Vergleich zum reinen AB-Schalter verändert wird.
Azopeptide: Peptide mit eingebauten lichtgesteuerten Schaltern sind interessante Systeme, um konformationelle Dynamik in Peptiden zu untersuchen. In dieser Arbeit ist es gelungen einen solchen Schalter herzustellen und in ein von Robertson et al. entworfenes Modellsystem als Teil des Peptidrückgrats einzuführen. Es wurde somit die Synthese von Peptiden mit eingebauten lichtgesteuerten Schaltern fortgeführt und auf ein größeres System übertragen. Die zu erwartenden Probleme bei der Synthese eines Systems dieser Größe (30 Aminosäuren + Schalter) konnten durch Modifizierung der Standardsynthese für Peptide (Fmoc-Strategie) an der Festphase erreicht werden. Es war daher möglich, ausreichende Mengen des Peptids herzustellen sowie die freie SH-Gruppe des Peptids mit einer Schutzgruppe zu versehen, was dem Molekül zu weiterer Stabilität verhalf. Das Azopeptid wurde mit UV/vis- und Ultrakurzzeit-Spektroskopie, und besonders im Vergleich mit dem Schalter AMPB alleine, charakterisiert. Hierbei wurden folgende Erkenntnisse offen gelegt: - Das Azopeptid in Wasser verhält sich bei Belichtung (367 nm) sehr ähnlich dem AMPB (7) in DMSO (isosbestischer Punkt bei 288 nm) - Die thermische Rückreaktion lässt sich bei 330 nm biexponentiell fitten, bei 260 nm nicht, was Rückschlüsse auf mangelnde Stabilität des Azopeptids nach Belichtung zulässt (freie SH-Gruppe). - Der Abfall des angeregten Zustandes des Azopeptids folgt multiexponentiellen Kinetiken auf Zeitskalen zwischen einigen hundert fs bis zu wenigen ps. - Der Schalter AMPB (7) in DMSO verhält sich bei Belichtung (367 nm) sehr ähnlich dem beidseitig entschütztem Schalter (8) in Wasser. - Es sehr ähnliche Kinetiken für AMPB (7) in DMSO und das Azopeptid in Wasser über den gesamten spektralen Bereich werden gefunden; Absorptionsaufbau erfolgt innerhalb der Zeitauflösung des Experiments, Unterschied um einen Faktor 2 in der Zerfallsdynamik, die für das Azopeptid langsamer ist. Parvulustat: Parvulustat ist wie Tendamistat ein alpha-Amylase-Inhibitor; die Struktur von Tendamistat ist bereits sehr gut sowohl durch NMR als auch durch Röntgenkristallographie untersucht ist. Mit Parvulustat teilt Tendamistat nur 29,6 % Sequenzidentität bei ähnlicher Länge und gleicher Funktion der beiden Proteine. Es war daher von großem Interesse, die Struktur von Parvulustat aufzuklären um Ähnlichkeiten und Unterschiede der beiden Proteine diskutieren zu können. In dieser Arbeit ist es gelungen mit Hilfe der hochauflösenden, heteronuklearen 3D NMR-Spektroskopie in Lösung und iterativen Rechungsmethoden die Struktur des Proteins Parvulustat, anhand von 15N- und 13C,15N-markierten Proben, in sehr guter Qualität aufzuklären. Weiterhin ist es gelungen, dynamische Eigenschaften des Proteins durch Relaxationsdaten darzustellen. Basierend auf diesen Daten war es möglich die beiden Proteine Parvulustat und Tendamistat umfassend miteinander zu vergleichen und Schlüsse bezüglich ihres Bindungsmechanismus zu ziehen. Insgesamt ist zwischen beiden Proteinen eine große Ähnlichkeit zu verzeichnen, aber es wurden auch einige Unterschiede festgestellt: beide Proteine besitzen zwar die gleiche beta-Faltblatt-Struktur, jedoch sind bei Parvulustat die einzelnen Stränge etwas kürzer ausgebildet. Weiterhin hat in Parvulustat ein Strang eine andere Krümmung, weil ein Prolin anstelle eines Leucins in Tendamistat sitzt und durch seine einzigartige Form die Struktur in dieser Region ändert. Bezug nehmend auf die Ladungsverteilung beider Proteine ist festzustellen, dass beide durch ein hydrophobes Herzstück stabilisiert werden und sich insgesamt sehr ähnlich sind, bis auf die Position R44 in Parvulustat bzw. Y46 in Tendamistat, was in Parvulustat eine positive Ladung an der Oberfläche generiert. Generell ist noch zu sagen, dass man beim Interpretieren der Daten in Bezug auf Tendamistat vorsichtig sein muss, da es durchaus Unterschiede in der Datenakquise gibt: im Gegensatz zu Tendamistat dessen Struktur anhand von homonuklearen 2D NMR-Techniken aufgeklärt wurde, waren für Parvulustat bereits 3D Pulssequenzen verfügbar, NMR-Spektrometer mit höheren Feldern, weiterentwickelte Rechenprogramme, so dass u. a. auch die Relaxationsdaten einflussnehmend in die Strukturrechnung mit eingebaut werden konnten.
Structural analysis of the enzyme N-formylmethanofuran:tetrahydromethanopterin formyltransferase
(2008)
Archaea represent a third domain of life and some archaea exhibit a high degree of tolerance to extreme environmental conditions. Several members are methanogens and present in many anaerobic environments. Most methanogens are able to maintain growth simply on H2 and CO2 via the enzymatically catalyzed reaction 4H2 + CO2 > CH4 + 2 H2O. The archaeon Methanopyrus kandleri grows optimally at temperatures of 84°C to 110°C, pH values of 5.5 to 7.0 and NaCl concentrations 0.2% to 4%. The enzyme N-formylmethanofuran tetrahydromethanopterin formyltransferase (MkFTR) catalyzes the transfer of a formyl group from the cofactor N-formylmethanofuran (FMF) to the cofactor tetrahydromethanopterin (H4MPT), the second step of the above reaction. X-ray crystallographic analysis yielded insights into the structure and function of MkFTR, (1) the MkFTR monomer exhibits a pseudo-two fold structure suggestive of an evolutionary gene duplication. (2) The structure is a D2 homo-tetramer with prominent cleft-like surface features. Analysis of the interface contacts showed that the tetramer is best described as a dimer of dimers. The clefts were associated with the monomer:monomer interface and were weakly occupied by extra electron density which might be attributed to the H4MPT analog folate. (3) This suggested that the clefts are active sites and their association with oligomer interfaces suggested a basis for the dependence of activity on oligomerization. (4) The thermal stability of MkFTR most likely arises from the greater number of H- and ionic-bonds within the monomer and between monomers with respect to mesophilic protein structures. (5) The structure showed a large number of surface exposed negatively charged, glutamate and aspartate residues. These residues explain the salt dependent oligomerization, as only at high enough salt concentration is the electrostatic charge compensated by cation binding and neutralized allowing oligomerization. (6) These residues also improve the solubility of MkFTR at high salt concentration by increased charge repulsion. (7) Comparison of MkFTR structures from low and hight salt conditions showed that surface glutamate residues bind slightly more water molecules at high salt conditions further contributing to MkFTR solubility at high salt concentration.
Despite the well-known importance of ribonucleic acids (RNA) in cell biology, it is astounding to realize the pace at which new fundamental functions of RNAs have been discovered. One of the fundamental reasons for the multitude of functions of RNA is the property of RNA to adopt different conformations or folds. The primary sequence of RNA, a linear polymer built from four different repetition units, can fold into alternate secondary structure motifs which in turn form alternate long-range interactions in complex tertiary structures. Ligands such as metal ions or small molecular weight metabolites and also proteins or peptides can bind to RNA and induce the changes in tertiary conformation. For example, in the cell, RNA participates in gene regulation in the form of riboswitches. Riboswitches are found in untranslated regions of messenger RNA (mRNA) and adopt alternate conformations depending on the presence or absence of specific metabolites. If a metabolite is present above a specific concentration, it induces a conformational change in the respective riboswitch by binding and thereby alters gene expression. Another example is the RNA thermometer which participates in the cell translational mechanism by a similar strategy. Translation initiation requires the binding of RNA thermometers to the ribosome. The ribosome binding region is located in the 5’ untranslated region of mRNA. At low temperatures this region is prevented from binding to the ribosome by forming basepairs. At higher temperatures, these basepairs dissociate allowing ribosome binding and subsequent translation. Therefore, the characterization and delineation of the kinetics and pathway of RNA folding is important to understand the function of RNA and is an important contribution to fundamentally understand RNA’s role in the cell. RNA conformational transitions occur over a wide range of timescales. Depending on the timescale, various biophysical techniques are used to study RNA conformational transitions. In these biophysical studies, achieving good structural and temporal resolution constitute frequently encountered challenges or limitations. For example, single molecule FRET spectroscopy provides high temporal resolution in the milliseconds at high sensitivity but lacks atomic resolution. Recent advances in the field of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy have enabled the elucidation of tertiary folding events to be characterized with atomic resolution. This thesis involves the use of NMR spectroscopy to characterize the folding of RNA molecules. Kinetics experiments require rapid initiation of the kinetics followed by monitoring of the reaction. In this thesis, two different folding initiation techniques have been applied and coupled to the subsequent detection of RNA folding using NMR spectroscopy, namely, photocaging and rapid mixing. The method of photocaging is well established (Kuhn and Schwalbe, 2000) and builds on the following principle: A photolabile moiety is attached to a molecule that prevents a specific interaction. Upon irradiation of the molecule with the photolabile group using laser light at a specific wave length, at which the molecule of interest is not absorbing, the protecting group is released. In our group, together with the group of S. Pitsch, ETH Lausanne, we could "cage" RNA at its equilibrium state by a photolabile molecule (similar work has been carried out in the group of A. Heckel). Rapid and traceless release of the photolabile precursor compound by a laser pulse releases the RNA to fold into its native state; the build-up of the native state of the RNA is monitored by NMR signals that are uniquely characteristic for the native state of the RNA. By optically coupling a laser source to an NMR magnet, the above procedure can take place in situ and the kinetics recorded by NMR. Several different molecules can be caged: The photocage can be attached to RNA. Then, a modified photolabile nucleotide can be placed at strategic positions of a target RNA whose folding properties is to be studied. The photocage can also be attached to a ligand: if folding is dependent on ligand binding then the ligand can be modified to carry a photosensitive unit whose degradation allows binding to RNA. In this thesis, an alternative method for photocaging is introduced. Here, metal ions essential for folding of the RNA are photocaged using the photolabile chelating agent Dimethyl-nitrophen (DMN). Photolysis of DMNr releases the metal ion, thereby RNA folding is initiated. In the rapid-mixing technique, one of (several) components required for proper folding of the RNA is rapidly injected into an NMR sample in situ by the use of a pneumatic injection device. ...
Seit gezeigt wurde, dass die genetischen Informationen in Form von DNA gespeichert wird, ist das Geheimnis der DNA-Struktur gelöst, der Mechanismus der Gen-Expression und die Rolle der RNA verstanden worden. Das Interesse für die Chemie und die Biologie der Nukleinsäuren ist somit kontinuierlich gewachsen. Besonders interessant ist die RNA, die eine Rolle als ein Vermittler der genetischen Informationen (mRNA) spielt, aber auch als Bote von Aminosäuren (tRNA). Sie ist im Ribosom (rRNA) anwesend, arbeitet als Templat in Telomerasen für DNA-Synthese und hat außerdem wichtige Funktionen in der RNA-Spaltung, z.B. bei Ribozymen wie RNAse P inne. Betreffend bestimmter Spaltstellen in RNA hat auch das Phänomen der siRNA beträchtliche Aufmerksamkeit in diesem Prozess erregt. Der sogenannte RISC-Komplex wird programmiert, einzelsträngige RNA mit hoher Sequenz-Spezifität zu schneiden. Die für die RNA-Interferenz verantwortliche zelluläre Maschinerie ist auch an der Bilbung von MikroRNAs beteiligt. RNA-Interferenz ist heute eines der nützlichsten Werkzeuge in functional genomics geworden. Die große Hoffnung ist, dass es auch vielleicht in der Therapie angewandt werden könnte. Das Thema meiner Doktorarbeit trägt den Titel „Synthesis of Site-Specific Artificial Ribonucleases“. Es beschäftigt sich mit der Entwicklung künstlicher bindungsspezifischer Ribonucleasen. Diese künstlichen Katalysatoren sind im Wesentlichen aus drei Gründen bedeutsam: Zum einen liegt eine mögliche Anwendung in der Affinity-Cleavage (Affinitätsspaltung), eine Technik, die Bindungsstellen von RNA-Liganden durch das kovalente Anbringen eines Reagenzes lokalisiert, das zwischen den Nukleinsäuren schneidet. Zum anderen entsteht die Möglichkeit, neue Werkzeuge für eine gezielte Manipulation großer RNA-Moleküle zu schaffen. Die Vorteile des Ansatzes sind, dass man damit beliebige Zielsequenzen anwählen kann. Das Problem dieser Strategie ist die Notwendigkeit, hohe Genauigkeit im Spaltungssschritt zu erreichen, wie zum Beispiel mit natürlichen Ribozymen. Wichtige Ergebnisse wurden auch während meiner Arbeit erhalten, mit einem Fall von genauer Spaltung zwischen zwei Basen. Der dritte Grund ist die potentielle Anwendung als katalytische antisense-Oligonucleotide in der Chemotherapie. Gegenwärtig existieren zwei Ansätze, unspezifische künstliche RNasen relativ kleiner Größe zu schaffen. Der erste basiert auf Metallkomplexen und führt im Allgemeinen zu höheren Raten. Die Idee ist, ein Metall als elektrophiles Zentrum zur Unterstützung der Transesterfikation zu nutzen. Unter diesen Katalysatoren enthalten die effizientesten Lanthanid-Ionen, Cu2+ und Zn2+. Der zweite Ansatz zielt darauf ab, metallfreie künstliche Ribonucleasen zu entwickeln. Die Vorteile dieser Strategie sind, den Katalysator von der Stabilität der Metallkomplexe, die in vivo problematisch sein könnten, unabhängig zu machen. In diesem Ansatz wird die natürliche Katalyse durch Enzyme simuliert. Zweckmäßige Gruppen mit beschränkter katalytischer Aktivität z.B. als Nucleophile, Säuren oder Basen, werden in einer Weise zusammengesetzt, um Kooperation zu ermöglichen. Potente Katalysatoren können so ohne die Notwendigkeit von Metallen als Cofaktoren erzeugt werden. ...
CpG-Oligodesoxynukleotide (CpG-ODN) sind von medizinischem Interesse aufgrund ihrer immunstimulierenden Wirkung, die durch chemische Wechselwirkungen zwischen dem Toll-like-Rezeptor 9 und dem CpG-Oligodesoxynukleotid ausgelöst wird. Um die molekulare Grundlage dieser DNA-Protein-Erkennung näher zu erforschen und um neue modifizierte CpG-Oligodesoxynukleotide mit einem verbessertem Wirkungsprofil für medizinische Anwendungen zu synthetisieren, wurde diese Arbeit angefertigt. Untersucht wurde, welche Synthesestrategie eine effiziente Syntheseroute zur Modifizierung von CpG-Oligodesoxynukleotiden ermöglicht. Als prinzipiell interessante Modifikationen wurden solche gewählt, die dem CpG-ODN-Liganden, Toll-like-Rezeptor 9, zusätzliche Wechselwirkungen eröffnen, wie die H-Brückenwechselwirkungen durch OH, NH2, NO2 oder pi-Stacking-Wechselwirkungen, wie durch z. B. Phenyl oder Pyren. Zunächst wurde in Erwägung gezogen, die bislang in der Literatur nicht für CpG-ODN unter-suchte Position 6 von Cytidin mit OH oder NH2 modifizieren. Hierfür wurde die allgemeine Synthesestrategie verwendet, bei der die Cytosin-Derivate stereoselektiv durch Vorbrüggen-Glykosilierung mit peracetylierter Ribose zum Nukleosid umgesetzt werden. Anschließend erfolgte die Deacetylierung, die regiospezifische Einführung der Tetra-(iso-propyl)-di-siloxan-Schutzgruppe an der 3´,5´-Position. Danach sollte die 2´-OH-Funktion mit Thio-phenylchlorid verestert und nach Barton McCombie desoxygeniert werden. Nach Dimethoxy-triphenylmethylierung an der 5´-OH-Funktion sollte die Umsetzung zum Phosphoramidit erfolgen. ...
The Na+,K+-ATPase was discovered more than 50 years ago, but even today the pumpcycle and its partial reactions are still not completely understood. In this thesis, Voltage Clamp Fluorometry was used to monitor the conformational changes that are associated with several electrogenic partial reactions of the Na+,K+-ATPase. The conformational dynamics of the ion pump were analyzed at different concentrations of internal Na+ or of external K+ and the influences on the conformational equilibrium were determined. To probe the effect of the internal Na+ concentration on the Na+ branch of the ion pump, oocytes were first depleted of internal Na+ and then loaded with Na+ using the epithelial sodium channel which can be blocked by amiloride. The conformational dynamics of the K+ branch were studied using different external K+ concentrations in the presence and in the absence of external Na+ to yield additional information on the apparent affinity of K+. The results of our Voltage Clamp Fluorometry experiments demonstrate that lowering the intracellular concentration of Na+ has a comparable effect on the conformational equilibrium as increasing the amount of K+ in the external solution. Both of these changes shift the equilibrium towards the E1/E1(P) conformation. Furthermore, it can be shown that the ratio between external Na+ and K+ ions is also a determinant for the position of the conformational equilibrium: in the absence of external Na+, the K+ dependent shift of the equilibrium towards E1 was observed at a much lower K+ concentration than in the presence of Na+. In addition, indications were found that both external K+ and internal Na+ bind within an ion well. Finally, the crucial role of negatively charged glutamate residues in the 2nd extracellular loop for the control of ion-access to the binding sites could be verified.
RNA interference (RNAi) is triggered by recognition of double-stranded RNA (dsRNA), and elicits the silencing of gene(s) complementary to the dsRNA sequence. RNAi is thought to have emerged as a way of safeguarding the genome against mobile genetic elements and viral infection, thus maintaining genomic integrity. dsRNA is first processed into small interfering RNAs (siRNA) by the enzyme Dicer. siRNAs are ~21 to 25 -nt long, and contain a signature 5’ phosphate group and a two nucleotide long 3’ overhang (Bernstein et al., 2001). The siRNA is then loaded into the RNA-induced si-lencing complex (RISC), of which Argonaute is the primary catalytic component (Liu et al., 2004). Energetic asymmetry of the siRNA ends allows for its directional loading into RISC (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Argonaute cleaves the passen-ger strand of the siRNA, leaving the guide strand of the siRNA bound to RISC (Gregory et al., 2005; Matranga et al., 2005; Rand et al., 2005). This single-stranded guide strand siRNA bound to Argonaute is able to recognize target mRNA in a sequence-specific manner, and cleaves the mRNA. Argonaute 2 in complex with single-stranded siRNA is sufficient for mRNA recognition and cleavage, thus forming a minimal RISC (Rivas et al., 2005). miRNAs, endogenously expressed small RNA genes which typically contain mismatches and non-Watson-Crick base pairing, are processed by this general pathway, although typically modulate gene expression by translational repression as opposed to cleavage of their target mRNA. The number of Argonaute genes is highly variable between species, ranging from one in S. pombe to twenty-seven in C. elegans. Earlier crystal structures of Argonaute apoen-zymes show the architecture of Argonaute to be a multidomain protein composed of N terminal, PAZ, MID, and PIWI domains (Song et al., 2004; Yuan et al., 2005). These multi-domain proteins are present in both prokaryotic and eukaryotic organisms. The role of Argonaute proteins in prokaryotes is still unknown, but based similarity to eu-karyotic Argonautes, they may also be involved in nucleic acid-directed regulatory pathways. These proteins have served as excellent models for learning about the struc-ture and function of this family of proteins. RNAi has found a widespread application for the simple yet effective knockdown of genes of interest. The catalytic cycle of RISC requires the binding of a number of different nucleotide structures to Argonaute, and we expect Argonaute to undergo a number of conforma-tional changes during the cycle of mRNA recognition by RISC (Filipowicz, 2005; Tom-ari and Zamore, 2005). Nevertheless, it remains unclear how the multi-domain ar-rangement of Argonaute recognizes and distinguishes between single-stranded and dou-ble-stranded oligonucleotides, which correspond to the Dicer-processed siRNA product, guide strand siRNA, and the guide strand / mRNA duplex. The Argonaute protein from Aquifex aeolicus was cloned, expressed, crystallized and solved by molecular replacement. Relative to earlier Argonaute structures, a 24° reorientation of the PAZ domain in this structure opens a basic cleft between the N-terminal and PAZ domains, exposing the guide strand binding pocket of PAZ. A 5.5-ns molecular dynamics simulation of Argonaute showed a strong tendency of the PAZ and N-terminal domains to be mobile. Binding of single-stranded DNA to Argonaute was monitored by total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). The experi-ments showed biphasic kinetics indicative of large conformational changes, and re-vealed a hotspot of binding energy corresponding to the first 9 nucleotides, the so-called “seed region” most crucial for sequence-specific target recognition. As RNAi may have evolved as a way of safeguarding the genome viral infection, it is not surprising that viruses have evolved different strategies to suppress the host RNAi response in the form of viral suppressor protein. (Hock and Meister, 2008; Lecellier and Voinnet, 2004; Rashid et al., 2007; Song et al., 2004; Vastenhouw and Plasterk, 2004). These viral suppressors are widespread, having been identified in a number of different viral families. Not surprisingly, they generally share little sequence homology with one another, although they appear to exist as oligomers built upon a ~ 100-200 amino acid protomer. Tomato aspermy virus, a member of the Cucumoviruses, encodes for protein 2B (TAV 2B, 95 a.a., ~11.3 kDa) that acts as an RNAi suppressor. Intriguingly, a similar genomic arrangement is seen in RNAi suppressors in the Nodaviruses, a family of viruses that can infect both plants and animals, such as Flock house virus b2 (FHV b2). The 2B and b2 proteins are both derived from a frameshifted ORF within the RNA polymerase gene (Chao et al., 2005). In spite of this genomic similarity, the 2B and b2 proteins share little sequence identity, and it is not well understood how the Cucumovirus 2B proteins suppress RNAi. To address how TAV 2B suppresses RNAi, the oligonucleotide-binding properties of TAV 2B were studied. TAV 2B shows a preference for double-stranded RNA oligonucleotides corresponding to siRNAs and miRNAs, and also binds to single-stranded RNA oligonucleotides. A stretch of positively charged residues between amino acids 20-30 are critical for RNA binding. Binding to RNA oligomerizes and induces a conformational change in TAV 2B into a primarily helical structure. These studies sug-gest that suppression of RNAi by TAV 2B may occur by targeting different stages of the RNAi pathway. TAV 2B falls under the category of more general RNAi suppres-sors, with potentially multiple targets for suppression.
Zusammenfassung Die Alzheimersche Krankheit (AD) ist mit 60% die am häufigsten auftretende Art der Demenz. Weltweit sind ca. 24 Mio. Menschen von der neurodegenerativen Krankheit betroffen, welche sich durch den Verlust der kognitiven Fähigkeiten auszeichnet. Es gibt zwei Ausprägungen der Demenz, zum einen die sporadische Verlaufsform, die bei Menschen in einem Alter ab 65 Jahren auftritt und zum anderen die familiäre Alzheimersche Krankheit (FAD), die schon weitaus jüngere Menschen betrifft und auf genetische Mutationen zurück zu führen ist. Beide Formen der Demenz zeigen den gleichen neuropathologische Phänotyp, der zur Ausbildung von extrazellulären Plaques und intrazellulären Neurofibrillen führt. Durch die Entstehung der Plaques und der Neurofibrillen werden die Verbindungen zwischen den einzelnen Neuronen verringert und die Neuronen sterben ab. Für das Auftreten der FAD sind Mutationen in den Genen des Amyloid Vorläufer Proteins (APP, Substrat) sowie der Aspartatprotease Einheit des γ-Sekretase Komplexes, Presenilin 1 (PS1) oder Presenilin 2 (PS2), verantwortlich. Die γ-Sekretase ist ein membranständiger Komplex bestehend aus den vier Untereinheiten PS1 oder PS2, Nicastrin (Nct), Aph-1 und Pen-2. Um ausreichende Informationen über den γ-Sekretase Komplex bezüglich seiner Interaktionsflächen, seines Katalysemechanismus und seiner Substraterkennung zu erhalten, wäre es hilfreich seine 3 Dimensionale Struktur aufzuklären, wozu große Mengen der sauberen und homogenen Proteine benötigt werden. Die Herstellung von ausreichenden Proteinmengen stellt derzeit aber einen Engpass für die strukturelle und funktionelle Charakterisierung des γ-Sekretase Komplexes in-vitro dar. Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia, which affects 24 million people worldwide. It is a neurodegenerative disorder, which occurs either in its most common form in people over 65 years or in the rare early-onset familial AD (FAD). Responsible for the autosomal dominant FAD are mutations in the genes encoding for the β-amyloid precursor protein (APP) and the two homologues integral membrane proteins Presenilin 1 (PS1) and Presenilin 2 (PS2). The two PSs are major but alternative components of the intramembrane aspartyl protease γ-secretase. Further components are the membrane proteins Nicastrin (Nct), Aph-1 and Pen-2. Production of sufficient amounts of protein samples is still the major bottleneck for the detailed functional and structural in-vitro characterization of the γ-secretase complex. Due to toxicity, stability and targeting problems, the overproduction of MPs in conventional in-vivo systems often has only limited success. Therefore, efficient expression protocols using the cell-free (CF) system were established in this work. After optimization, I was able to produce up to milligram amounts of the single proteins PS1 and PS2, the cleavage products PS1-NTF and PS1-CTF, and Pen-2. The in-vitro produced γ-secretase subunits were further characterized, concerning their purity, secondary fold, thermal stability and homogeneity. Highest purities with over 90% after affinity chromatography could be achieved for PS1-CTF and Pen-2. Reconstitution of PS1, PS1-NTF, PS1-CTF and Pen-2 into E. coli liposomes results in a homogeneously distribution, which gives evidence for a structural folding. This was confirmed by CD spectroscopy of PS1-CTF and Pen-2. The thermal stability of Pen-2 shows a transition at 68°C, whereas PS1-CTF is stable up to 95°C. Both proteins show in addition homogeneous elution profiles investigated by analytical SEC and exhibit a monomeric (Pen-2) or dimeric (PS1-CTF) character analyzed by blue native PAGE. Different methods were performed to get evidence about the assembly of the complex, like pull-down experiments, immunoprecipitation, co-expression of radioactive labeled subunits and titration assays by liquid-state NMR. First hints for an interaction of the CF synthesized proteins could be observed by co-expression. Supplemental, Pen-2 and CTF could be purified in sufficient amounts and to apparent homogeneity that allow structural approaches by X-ray crystallography and liquid-state NMR spectroscopy. First conditions for protein crystals were achieved for Pen-2 and structural investigations of PS1-CTF by liquid-state NMR could be performed after optimization of the expression-, purification- and detergent conditions.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym in der Biosynthese proinflammatorischer Leukotriene, die maßgeblich an der Entstehung allergischer und entzündlicher Erkrankungen wie Arthritis, Asthma und kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt sind (23). Humane 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 77,8 kDa (25). Das Protein besteht aus einer größeren katalytischen Domäne, die ein zentrales Eisen(II)-Atom enthält, dass für die zweistufige LTA4-Bildung aus Arachidonsäure benötigt wird, und einer kleineren C2-ähnlichen Domäne, die Bereiche für die Membran- sowie Ca2+-Bindung enthält. Durch Stimulation von intakten Zellen kommt es zu einer Translokation der 5-LO an die Kernmembran. Die Wechselwirkung mit dem membranständigen FLAP fördert die 5-LO-Leukotrienbildung. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit niedermolekularen Modifikationen der 5-LO durch U-73122 und Glutathion sowie mit der Charakterisierung von 5-LO-Inhibitoren. U-73122 ist ein Inhibitor, der in vitro und in vivo mit einem IC50-Wert von 30 nM bzw. 2,4 µM die 5-LO-Aktivität hemmt (2). U-73122 verfügt über eine thiol-reaktive Maleinimid-Gruppe, wodurch die Substanz kovalent an einige 5-LO-Cysteine (Cys-99, -159 und weitere) binden kann. Entsprechende U-73122-5-LO-Peptide konnten nach Trypsin-Verdau der 5-LO mit MALDI-MS-Messungen nachgewiesen werden. Für diesen Zweck musste eine effiziente Aufreinigung für native 5-LO (Reinheit > 95%) entwickelt werden. Um die Veränderung der 5-LO-Aktivität nach U-73122-Zugabe zu untersuchen, wurden Cystein/Serin-5-LO-Mutanten hergestellt. Es konnte festgestellt werden, dass die Mutante C416S-5-LO nicht mehr effektiv durch U-73122 gehemmt werden konnte. Daher ist anzunehmen, dass U-73122 an Cystein-416 der 5-LO bindet und die 5-LO-Produktbildung hemmt. Auf der 5-LO-Oberfläche kann ein Bereich lokalisiert werden, der einen Zugang für das Substrat zum aktiven Zentrum der 5-LO bilden könnte (238,239). Dieser Bereich liegt in unmittelbarer Nähe zu Cystein-416. Daher besteht die Möglichkeit, dass U-73122, nachdem es an Cystein-416 gebunden hat, diesen Bereich hemmend beeinflussen kann. Es konnte nachgewiesen werden, dass Glutathion an mehrere Cysteine der 5-LO (Cystein-99, -264 und -449) kovalent binden kann. Um Veränderungen der 5-LO-Aktivität durch in vivo Glutathionylierungen zu zeigen, wurden HeLa-Zellen mit 5-LO, Cystein-/Serin-5-LO-Mutanten sowie FLAP transfiziert und mit Diamid inkubiert. Es konnte festgestellt werden, dass die native sowie FLAP-gesteigerte 5-LO-Produktbildung durch Diamid gehemmt wird. Dies konnte ebenfalls für die Mutante 3W-5-LO beobachtet werden. Zusätzlich wurden verschiedene Cystein-/Serin-5-LO-Punktmutanten sowie eine 4fach Mutante (C159S/C300S/C416S/C418S-5-LO = 2D-5-LO) untersucht. Das Verhalten dieser Mutanten konnte in drei Gruppen eingeteilt werden. Gruppe A (C159S-, C300S- und C418S-5-LO) wurde durch Diamid nicht beeinflusst. Gruppe B (C416S- und 2D-5-LO) zeigte eine sehr starke Stimulation der 5-LO±FLAP-Leukotrienbildung nach Zugabe von Diamid. Bei Gruppe C (C99S-, C264S- und C449S-5-LO) konnte eine FLAP-gesteigerte 5-HETE-Bildung beobachtet werden. Durch Diamid kommt es zu Glutathionylierungen von zellulären Proteinen, da reduziertes Glutathion (GSH) zu reaktiveren oxidierten Glutathion (GSSG) umgesetzt wird. An der 5-LO-Oberfläche können in Folge an verschiedenen Cysteinen Glutathione binden. Durch die Glutathion-Bindung wird eine stark polare Struktur auf der 5-LO-Oberfläche eingebracht. Dadurch kommt es zu einer verminderten Membranbindung und Produktbildung der nativen 5-LO. Die 5-LO-Oberfläche der 2D-5-LO-Mutante kann an verschiedenen Positionen keine Glutathione mehr binden, es kommt es zu einer stärkeren Wechselwirkung mit Membranbestandteilen und zu einer erhöhten 5-LO-Leukotrienbildung. Für Celecoxib konnte gezeigt werden, dass neben der COX2-Hemmung auch die 5-LO-Aktivität mit einem IC50-Wert von 3-10 µM gehemmt werden kann (268). Im Rahmen dieser Arbeit wurden HeLa-Zellen mit 5-LO±FLAP transfiziert, um den Einfluss von Celecoxib auf FLAP zu untersuchen. Celecoxib führt zu einer direkten Hemmung der 5-LO. ML3000 (Licofelon) wurde als dualer COX/5-LO-Inhibitor entwickelt und hemmt die 5-LO-Aktivität in intakten Zellen, aber nicht im Homogenat. Daher wurden Versuche mit 5-LO±FLAP-tranfizierten HeLa-Zellen durchgeführt, um den Einfluss von ML3000 auf die FLAP-gesteigerte 5-LO-Leukotrienbildung zu zeigen. Aus diesen und weiteren Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe konnte gefolgert werden, dass ML3000 ein FLAP-Inhibitor ist (277). Garsubellin A ist strukturverwandt zu Hyperforin, einem dualen COX/5-LO-Inhibitor (204). Garsubellin A hemmt die 5-LO-Aktivität im Homogenat von PMNL und am gereinigten Enzym mit einer IC50 von 10-30 µM. Verbindungen, die den Bicyclo[3.3.1]nonan-Grundkörper des Garsubellin A und Hyperforin enthalten, wurden auf ihr inhibitorisches Potential getestet. Es konnte gezeigt werden, dass der Bicyclo[3.3.1]nonan-Grundkörper alleine nicht für eine 5-LO-Hemmung ausreicht, sondern eine freie Carbonsäure sowie eine bis zwei Prenylierungen vorliegen müssen, um eine 5-LO-Hemmung zu erzielen. Sind diese Voraussetzungen vorhanden, wird die 5-LO-Aktivität in intakten PMNL mit einer IC50 von 10 µM und an gereinigter 5-LO mit 0,3-1 µM gehemmt.
A generic drug product (World Health Organization (WHO) terminology: multisource product) is usually marketed and manufactured after the expiry date of the innovator’s patent. Generic drugs are less expensive than the innovator products because generic manufacturers do not have to amortize the investment costs of research, development, marketing, and promotion. Multisource products must contain the same active pharmaceutical ingredients (APIs) as the original formulation and have to be shown to be interchangeable with the original formulation. Multisource products have to be shown bioequivalent to the innovator counterpart with respect to pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Multisource products are therefore identical in dose, strength, route of administration, safety, efficacy, and intended use. Bioequivalence can be demonstrated by in vitro dissolution, pharmacokinetic, pharmacodynamic or clinical studies. Since 2000, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) allows the approval of certain multisource products solely on the basis of in vitro studies, i.e. by waiving in vivo studies in humans (“Biowaiver”), based on the Biopharmaceutics Classification Scheme (BCS). The BCS characterizes APIs by their solubility and permeability in the gastrointestinal tract (GIT). The different BCS Classes I-IV (Class I: high solubility, high permeability; Class II: low solubility, high permeability; Class III: high solubility, low permeability and Class IV: low solubility, low permeability) result from all possible combinations of high and low solubility with high and low permeability. Since the adoption of the BCS by the FDA in 1995, the BCS criteria have been under continuous development. In 2006, the WHO has released the most recent bioequivalence guidance including relaxed criteria for bioequivalence studies based on modified BCS criteria. According to this guidance, APIs belonging to the BCS classes I – and under defined conditions - II and III – are eligible for a biowaiver-based approval. The principal objective of this work was to characterize the first-line anti tuberculosis APIs, isoniazid, pyrazinamide, ethambutol dihydrochloride and rifampicin, according to their physicochemical, biopharmaceutical, pharmacokinetic and pharmacological properties and to classify them according to the BCS. Ethambutol dihydrochloride and isoniazid were classified as borderline BCS class I/III APIs. Pyrazinamide was classified as a BCS class III and rifampicin as a BCS class II API. Based on the BCS classification and the additional criteria defined in the WHO bioequivalence guidance, the possibility of biowaiver-based approval for immediate release (immediate release) solid oral dosage forms containing the first-line antituberculosis drugs was evaluated. A biowaiver-based approval with defined constraints was recommended for immediate release solid oral dosage forms containing isoniazid (interaction with reducing sugars), pyrazinamide and ethambutol dihydrochloride (relative narrow therapeutic index). Rifampicin was classified as a BCS class II API, and it was concluded that rifampicin containing solid oral immediate release drug products as well as Scale-Up and Post-Approval Changes (SUPAC) changes should not be approved by a biowaiver on the following basis: (i) its solubility and dissolution are highly variable due to polymorphism and instability, (ii) concomitant intake of food and antacids reduces its absorption and bioavailability, (iii) no in vitro predictive dissolution test has been found which correlates to in vivo absorption and (iv) several publications reporting cases of non-bioequivalent and bioinequivalent rifampicin products have been located in the literature. Thus, it is recommended that bioequivalence of rifampicin containing solid oral immediate release drug products should be established by in vivo pharmacokinetic studies in humans. This risk-benefit benefit assessment of a biowaiver-based approval was presented as a poster at the American Association of Pharmaceutical Scientists (AAPS) 2005 and subsequently published as “Biowaiver Monographs” in the Journal of Pharmaceutical Sciences. Based on the assessment of the dissolution properties of the antituberculosis drugs for a biowaiver approval, quality control dissolution methodologies for the International Pharmacopoeia (Pharm. Int.) were developed, presented at the WHO expert meeting and adopted in the Pharm. Int. (http://www.who.int/medicines/publications/pharmprep/OMS_TRS_948.pdf). Additionally, preliminary biowaiver recommendations were also developed for four firstline antimalarial drugs listed on the WHO Essential Medicines List (EML): Quinine, as both the hydrochloride and sulphate, and proguanil hydrochloride were classified as borderline BCS class I/III APIs. Since quinine is a narrow therapeutic index drug and many cases of non-bioequivalence have been reported in the literature, a biowaiverbased approval was not recommended. For solid oral immediate release dosage forms containing proguanil a biowaiver-based approval was recommended under the condition that they dissolve very rapidly. Primaquine phosphate was classified as a BCS class I API. Therefore, a biowaiver-based approval was recommended for immediate release solid oral dosage forms containing primaquine phosphate. Mefloquine hydrochloride was classified as a basic, BCS class IV/II API, making it ineligible for the biowaiver. Additionally, reports of non-bioequivalence and a narrow therapeutic index were found in the scientific literature. Consequently, bioequivalence of solid oral immediate release dosage forms containing mefloquine hydrochloride should be established by in vivo pharmacokinetic studies. The results for quinine hydrochloride and sulphate, proguanil hydrochloride, primaquine diphosphate and mefloquine hydrochloride were presented as a poster at the Pharmaceutical Sciences World Congress (PSWC) 2007 and published as a WHO Collaborating Center Report in June 2006. The aim of this project was to collect, evaluate, generate and publish relevant information for a biowaiver-based approval of essential medicines in order to provide a summary to local regulatory authorities. This information complements the selected list of essential medicines by providing information about the biopharmaceutical properties and pharmaceutical quality of solid oral immediate release dosage forms containing these APIs. The aim of the biowaiver project, inspired by the WHO and brought in life by the International Pharmaceutical Federation (FIP), is to enable access to essential medicines in standardized quality at an affordable price. In this work, a significant contribution to this aim in the form of four biowaiver monographs for the antituberculosis drugs and several reports on the antimalarials has been achieved.
Photo-initiated processes, like photo-excitation and -deexcitation, internal conversion, excitation energy transfer and electron transfer, are of importance in many areas of physics, chemistry and biology. For the understanding of such processes, detailed knowledge of excitation energies, potential energy surfaces and excited state properties of the involved molecules is an essential prerequisite. To obtain these informations, quantum chemical calculations are required. Several quantum chemical methods exist which allow for the calculation of excited states. Most of these methods are computationally costly what makes them only applicable to small molecules. However, many biological systems where photo-processes are of interest like light-harvesting complexes in photosynthesis or the reception of light in the human eye by rhodopsin are quite large. For large systems, however, only few theoretical methods remain applicable. The currently most widely used method is time-dependent density functional theory (TD-DFT), which can treat systems of up to 200–300 atoms with the excitation energies of some excited states exhibiting errors of less than 0.5 eV. Yet, TD-DFT has several drawbacks. The most severe failure of TD-DFT is the false description of charge transfer states which is particularly problematic in case of larger systems where it yields a multitude of artificially low-lying charge transfer states. But also Rydberg states and states with large double excitation character are not described correctly. Still, if these deficiencies are kept in mind during the interpretation of results, TD-DFT is a useful tool for the calculation of excited states. In my thesis, TD-DFT is applied in investigations of excitation energy and electron transfer processes in light-harvesting complexes. Since light-harvesting complexes, which consist of thousands of atoms, are by far too large to be calculated, model complexes for the processes of interest are constructed from available crystal structures. The model complexes are used to calculate potential energy curves along meaningful reaction coordinates. Artificial charge transfer states are corrected with the help of the so-called ∆DFT method. The resulting potential energy curves are then interpreted by comparison with experimental results. For the light-harvesting complex LH2 from purple bacteria the experimentally observed formation of carotenoid radical cations is studied. It is shown that the carotenoid radical cation is formed most likely via the optically forbidden S1 state of the carotenoid. In light-harvesting complex LHC-II of green plants the fast component of the so-called non-photochemical quenching (NPQ) is investigated. Two of several different hypotheses on the mechanism of NPQ, which have been proposed recently, are studied in detail. The first one suggests that NPQ proceeds via simple replacement of violaxanthin by zeaxanthin in the binding pocket in LHC-II. However, the calculated potential energy curves exhibit no difference between violaxanthin and zeaxanthin in the binding pocket. In combination with experimental results it is thus shown that simple replacement alone does not mediate NPQ in LHC-II. The second hypothesis proposes conformational changes of LHC-II that lead to quenching at the central lutein and chlorophyll molecules during NPQ. My TD-DFT calculations demonstrate that if this mechanism is operative, only the lutein 1 which is one of two central luteins present in LHC-II can take part in the quenching process. This is corroborated by recent experiments. Though several conclusions can be drawn from the investigations using TD-DFT, the interpretability of the results is limited due to the deficiencies of the method and of the models. To overcome the methodological deficiencies, more accurate methods have to be employed. Therefore, the so-called algebraic diagrammatic construction scheme (ADC) is implemented. ADC is a widely overlooked ab initio method for the calculation of excited states, which is based on propagator theory. Its theoretical derivation proceeds via perturbation expansion of the polarization propagator, which describes electronic excitations. This yields separate schemes for every order of perturbation theory. The second order scheme ADC(2), which is employed here, is the equivalent to the Møller-Plesset ground state method MP(2), but for excited states. It represents the computationally cheapest excited state method which can correctly describe doubly excited states, as well as Rydberg and charge transfer states. The quality of ADC(2) results is demonstrated in calculations on linear polyenes which serve as model systems for the larger carotenoid molecules. The calculations show that ADC(2) describes the three lowest excited states of polyenes sufficiently well, particularly the optically forbidden S1 state which is known to possess large double excitation character. Yet, the applicability of the method is limited compared to TD-DFT due to the much larger computational requirements. To facilitate the calculation of larger systems with ADC(2) a new variant of the method is developed and implemented. The variant employs the short-range behavior of electron correlation to reduce the computational effort. As a first step, the working equations of ADC(2) are transformed into a basis of local orbitals. In this basis negligible contributions of the equations which are due to electron correlation can be identified based on the distances of local orbitals. A so-called “bumping” scheme is implemented which removes the negligible parts during a calculation. This way, the computation times as well as the disk space requirements can be reduced. With the “bumping” scheme several new parameters are introduced that regulate the amount of “bumping” and thereby the speed and the accuracy of computations. To determine useful values for the parameters an evaluation is performed using the linear polyene octatetraene as test molecule. From the evaluation an optimal set of parameter values is obtained, so that the computation times become minimal, while the errors in the excitation energies due to the “bumping” do not exceed 0.15 eV. With further calculations on various molecules of different sizes it is tested if these parameter values are universal, i.e. if they can be used for all molecules. The test calculations show that the errors in the excitation energies are below 0.15 eV for all test systems. Additionally, no trend is visible for the errors that their magnitude might depend on the system. In contrast, the amount of disregarded contributions in the calculations increases drastically with growing system size. Thus, the local variant of ADC(2) can be used in future to reliably calculate excited states of systems which are not accessible with conventional ADC(2).
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei verschiedenen Hämostasedefekten eine unterschiedliche Aktivierung des Gerinnungssystems besteht. So wiesen Personen mit heterozygoter Prothrombin-Mutation (G20210A) eine massiv erhöhte Thrombinbildung auf, während sie in den üblichen Globaltests (Prothrombinzeit (PT) und aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT)) und der Thrombinzeit (TZ) nicht pathologisch waren. Bei Personen mit reaktiv aktiviertem Gerinnungssystem war ebenfalls eine erhöhte Thrombinbildung nachweisbar, zudem war die aPTT verkürzt. Dagegen zeigten Personen mit Antiphospholipidsyndrom und Personen mit heterozygoter/homozygoter FV-Leiden-Mutation eine leicht gesteigerte Thrombinbildung, ferner waren die anderen plasmatischen Tests (PT, aPTT, TZ), außer der Lupus-Antikoagulans-sensitiven aPTT, unauffällig. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, um die in-vitro Wirksamkeit neuer Antithrombotika auf die Blutgerinnung zu untersuchen. Die verwendeten Antithrombotika repräsentieren 3 Klassen oral applizierbarer, niedermolekularer Substanzen: 1. Thrombininhibitoren (Dabigatran und Melagatran) 2. FXa-Inhibitoren (Rivaroxaban und Apixaban) 3. Duale Thrombin/FXa-Inhibitoren (BR4965 und BR4966) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Antithrombotika je nach Wirkmechanismus (FXa-Hemmung, Thrombinhemmung oder duale Thrombin/FXa-Hemmung) unterschiedliche Effekte auf die TGT-Parameter ETP (endogenes Thrombinpotential) und PEAK (größte Thrombinbildungsgeschwindigkeit) haben. Während der PEAK gut geeignet war, die antihämostatische Wirkung von selektiven FXa-Inhibitoren abzubilden, wurde das ETP durch die FXa-Inhibitoren nicht so stark beeinflusst, insbesondere in plättchenarmen Plasma (PPP). Im Gegensatz dazu hatten die selektiven Thrombininhibitoren eine gute dosisabhängige Wirkung auf das ETP, jedoch keine auf den PEAK. Mehr noch wurde für Inhibitoren mit thrombinhemmender Komponente beobachtet, dass sie den PEAK der Thrombinbildung erhöhen statt reduzieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zugegeben wurden. Dieses Phänomen war umso stärker ausgeprägt, je höher die Thrombinselektivität der Substanz war. Erwartungsgemäß zeigten die beiden dualen Thrombin/FXa-Inhibitoren sowohl Eigenschaften von FXa-Inhibitoren, als auch von selektiven Thrombininhibitoren, wobei die Substanz BR4965 in ihrer Wirkung eher den FXa-Inhibitoren ähnelte und BR4966 eher den selektiven Thrombininhibitoren. In PPP und PRP (plättchenreichem Plasma) von Personen mit aktiviertem Gerinnungssystem (heterozygote/homozygote FV-Leiden Mutation, heterozygote Prothrombin-Mutation oder reaktiv aktiviertes Gerinnungssystem) zeigten die Antithrombotika ähnliche Effekte auf die Thrombinbildung wie bei gesunden Probanden. Lediglich in PRP von Patienten mit Antiphospholipidsyndrom verursachten die Inhibitoren eine stärkere Hemmung der Thrombinbildung, insbesondere die FXa-Hemmer. Der Einfluss des FXa-Inhibitors Rivaroxaban auf die PT erwies sich als dosisabhängig und korreliert eng mit dem Plasmaspiegel, so dass mit diesem Globaltest ein einfacher Monitoring-Test zur Verfügung steht. Es ist aber zu beachten, dass die PT in Sekunden abgelesen werden muss, denn nur für eine Ablesung in Sekunden, aber nicht in % (= Quick-Wert) ergab sich eine enge Korrelation mit den Plasmaspiegeln. Für das Monitoring von selektiven Thrombininhibitoren wie Dabigatran war die aPTT besser geeignet. Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II (HIT Typ II) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparin-Therapie. Daher wurde untersucht, ob die neu entwickelten Antithrombotika auch das Risiko für die Enstehung einer HIT Typ II bergen. Hierzu wurde auf Basis der Thrombinbildung ein Testsystem entwickelt, in dem gezeigt wurde, dass Plättchenfaktor 4 (PF4) die gerinnungshemmende Aktivität von Heparinen, aber nicht die der neuen Antithrombotika neutralisiert. Hieraus ist zu schließen, dass PF4 an Heparine binden kann, aber nicht an die neuen Antithrombotika. Folglich sollte das Risiko einer HIT Typ II unter den neuen Antithrombotika gering sein, da hierfür zunächst Antikörper an den Komplex aus PF4 und Heparin (bzw. PF4/Antithrombotikum) binden müssen. Abschließend wurde der Einfluss der neuen Inhibitoren auf die Ausbildung der Thrombozyten- Leukozyten-Aggregate untersucht, da bei akuten thromboembolischen Ereignissen (z.B. Herzinfarkt) erhöhte Werte von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten nachgewiesen wurden. Alle untersuchten Substanzen hatten eine inihibitorische Wirkung auf die Ausbildung der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate, wobei der hemmende Effekt umso stärker ausgeprägt war, je höher die Thrombinselektivität des Inhibitors war. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, um die in-vitro Wirksamkeit neuer Antithrombotika auf die Blutgerinnung zu untersuchen. Die verwendeten Antithrombotika repräsentieren 3 Klassen oral applizierbarer, niedermolekularer Substanzen: 1. Thrombininhibitoren (Dabigatran und Melagatran) 2. FXa-Inhibitoren (Rivaroxaban und Apixaban) 3. Duale Thrombin/FXa-Inhibitoren (BR4965 und BR4966) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Antithrombotika je nach Wirkmechanismus (FXa-Hemmung, Thrombinhemmung oder duale Thrombin/FXa-Hemmung) unterschiedliche Effekte auf die TGT-Parameter ETP (endogenes Thrombinpotential) und PEAK (größte Thrombinbildungsgeschwindigkeit) haben. Während der PEAK gut geeignet war, die antihämostatische Wirkung von selektiven FXa-Inhibitoren abzubilden, wurde das ETP durch die FXa-Inhibitoren nicht so stark beeinflusst, insbesondere in plättchenarmen Plasma (PPP). Im Gegensatz dazu hatten die selektiven Thrombininhibitoren eine gute dosisabhängige Wirkung auf das ETP, jedoch keine auf den PEAK. Mehr noch wurde für Inhibitoren mit thrombinhemmender Komponente beobachtet, dass sie den PEAK der Thrombinbildung erhöhen statt reduzieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zugegeben wurden. Dieses Phänomen war umso stärker ausgeprägt, je höher die Thrombinselektivität der Substanz war. Erwartungsgemäß zeigten die beiden dualen Thrombin/FXa-Inhibitoren sowohl Eigenschaften von FXa-Inhibitoren, als auch von selektiven Thrombininhibitoren, wobei die Substanz BR4965 in ihrer Wirkung eher den FXa-Inhibitoren ähnelte und BR4966 eher den selektiven Thrombininhibitoren. In PPP und PRP (plättchenreichem Plasma) von Personen mit aktiviertem Gerinnungssystem (heterozygote/homozygote FV-Leiden Mutation, heterozygote Prothrombin-Mutation oder reaktiv aktiviertes Gerinnungssystem) zeigten die Antithrombotika ähnliche Effekte auf die Thrombinbildung wie bei gesunden Probanden. Lediglich in PRP von Patienten mit Antiphospholipidsyndrom verursachten die Inhibitoren eine stärkere Hemmung der Thrombinbildung, insbesondere die FXa-Hemmer. Der Einfluss des FXa-Inhibitors Rivaroxaban auf die PT erwies sich als dosisabhängig und korreliert eng mit dem Plasmaspiegel, so dass mit diesem Globaltest ein einfacher Monitoring-Test zur Verfügung steht. Es ist aber zu beachten, dass die PT in Sekunden abgelesen werden muss, denn nur für eine Ablesung in Sekunden, aber nicht in % (= Quick-Wert) ergab sich eine enge Korrelation mit den Plasmaspiegeln. Für das Monitoring von selektiven Thrombininhibitoren wie Dabigatran war die aPTT besser geeignet. Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II (HIT Typ II) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparin-Therapie. Daher wurde untersucht, ob die neu entwickelten Antithrombotika auch das Risiko für die Enstehung einer HIT Typ II bergen. Hierzu wurde auf Basis der Thrombinbildung ein Testsystem entwickelt, in dem gezeigt wurde, dass Plättchenfaktor 4 (PF4) die gerinnungshemmende Aktivität von Heparinen, aber nicht die der neuen Antithrombotika neutralisiert. Hieraus ist zu schließen, dass PF4 an Heparine binden kann, aber nicht an die neuen Antithrombotika. Folglich sollte das Risiko einer HIT Typ II unter den neuen Antithrombotika gering sein, da hierfür zunächst Antikörper an den Komplex aus PF4 und Heparin (bzw. PF4/Antithrombotikum) binden müssen. Abschließend wurde der Einfluss der neuen Inhibitoren auf die Ausbildung der Thrombozyten- Leukozyten-Aggregate untersucht, da bei akuten thromboembolischen Ereignissen (z.B. Herzinfarkt) erhöhte Werte von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten nachgewiesen wurden. Alle untersuchten Substanzen hatten eine inihibitorische Wirkung auf die Ausbildung der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate, wobei der hemmende Effekt umso stärker ausgeprägt war, je höher die Thrombinselektivität des Inhibitors war.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von neuen enantioselektiven und diastereoselektiven Brønsted-Säure katalysierten Reaktionen. Das Aktivierungsprinzip entspricht dabei einer klassischen Säure-Base-Reaktion, in der eine Brønsted-Säure einen Elektronenpaar-Donor protoniert, woraus die Bildung eines Ionenpaares resultiert. Erweitert man dieses Konzept durch den Einsatz einer chiralen Protonenquelle und verwendet als Base ein prochirales Substrat, wie ein Imin, so entsteht durch dessen Protonierung ein chirales Ionenpaar, wodurch das Substrat einerseits aktiviert wird und anderseits asymmetrische Induktion über das chirale Anion erfährt. Greift in dem darauf folgenden Schritt ein Nucleophil selektiv über eine Seite des positiv geladenen Elektrophils an, so bildet sich enantioselektiv ein neues Stereozentrum. Die Natur nutzt dieses Prinzip zum Aufbau von optisch reinen α-Aminosäuren. So katalysiert die Glutamatdehydrogenase (GDH) die Darstellung von Glutaminsäure durch Protonierung des entsprechenden α-Iminoglutarats, wodurch der nachfolgende Hydrid-Angriff mittels Nicotinamidadenindinukleotid (NADH) selektiv die (L)-Aminosäure liefert. Dieses Konzept konnte während der eigenen Diplomarbeit auf die enantioselektive Brønsted-Säure katalysierte Transferhydrierung von Ketiminen übertragen werden. Dabei simuliert eine chirale Protonenquelle 1 das Enzym (GDH) und das Reduktionsmittel NADH wird durch ein synthetisches Analogon, das Hantzsch Dihydropyridin 8a ersetzt ... Die vorliegende Arbeit ist kumulativ verfasst. Der größte Teil der hier vorgestellten Ergebnisse ist bereits veröffentlicht oder zur Publikation eingereicht. Die experimentellen Daten sind Bestandteil der in Kapitel 10 aufgeführten Publikationen und werden nicht gesondert diskutiert. Folgende Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Highly Enantioselective Organocatalytic Carbonyl-Ene Reaction with strongly Acid, Chiral Brønsted Acids as Efficient Catalysts Rueping M., Theissmann T., Kuenkel A., Koenigs R.M., Angewandte Chemie International Edition 2008, 47, 6798, Angewandte Chemie 2008, 120, 6903. Asymmetric counterion pair catalysis: An enantioselective Brønsted acid-catalyzed protonation Rueping M., Theissmann T., Raja S., Bats J.W., Advanced Synthesis & Catalysis 2008, 350, 1001. An enantioselective chiral brønsted acid catalyzed imino-azaenamine reaction Rueping M., Sugiono E., Theissmann T., Kuenkel A., Köckritz A., Pews-Davtyan A., Nemati N., Beller M., Organic Letters 2007, 9, 1065. Remarkably low catalyst loading in Brønsted acid catalyzed transfer hydrogenations: Enantioselective reduction of benzoxazines, benzothiazines, and benzoxazinones Rueping M., Antonchick A.P., Theissmann T., Angewandte Chemie International Edition 2006, 45, 6751, Angewandte Chemie 2006, 118, 6903. A highly enantioselective brønsted acid catalyzed cascade reaction: Organocatalytic transfer hydrogenation of quinolines and their application in the synthesis of alkaloids Rueping M., Antonchick A.P., Theissmann T., Angewandte Chemie International Edition 2006, 45, 3683, Angewandte Chemie 2006, 118, 3765. Metal-free Brønsted acid catalyzed transfer hydrogenation - New organocatalytic reduction of quinolines Rueping M., Theissmann, T., Atonchick A.P., Synlett 2006, 1071. The twinned crystal structure of diiodobis(triphenylphosphine) palladium(II) dichloromethane disolvate at 173 K Theissmann T., Bolte M., Acta Crystallographica Section E, 2006, E62, 1056. Folgende Manuskripte wurden zur Veröffentlichung eingereicht: First Enantioselective Chiral Brønsted Acid Catalyzed Synthesis of 4´-Substituted Tetrahydroquinolines Rueping M., Theissmann T., Stoeckel M., Atonchick A.P. Asymmetric Organocatalytic Reductions in the Enantioselective Synthesis of Fluoroquinolones, Flumiquine and Levofloxacin Rueping M, Stoeckel M., Theissmann T., Haack K. Synthesis and Structural Investigations of H8-BINOL-derived N-triflylphosphoramides Rueping M., Nachtsheim B.J., Koenigs R., Ieawsuwan W., Theissmann T. Buchbeitrag: Metal-free Brønsted Acid Catalyzed Transfer-Hydrogenation: Enantioselective Synthesis of Tetrahydroquinolines Rueping M., Theissmann T., Atonchick A.P., Catalysts for Fine Chemical Industry, Vol. 5, 2006
Das Ziel des adaptiven Entwurfs von Substanzbibliotheken ist es, die vollständige biologische Testung einer molekularen Screeningbibliothek zu vermeiden. Stattdessen erfolgt, geleitet durch Optimierungsalgorithmen, eine "intelligente" Navigation durch den chemischen Raum, um so bevorzugt Substanzen mit gewünschten Eigenschaften auszuwählen. In einer retrospektiven Studie wurden die Optimierungsalgorithmen "Zufallssuche", "Simulated Annealing", "Evolutionsstrategie" und "Partikelschwarmoptimierung" im Hinblick auf den Entwurf von Bibliotheken von Serinproteaseinhibitoren systematischen verglichen. Die Gesamtzahl verfügbarer Substanztestungen wurde auf 300 beschränkt, um Laborbedingungen zu simulieren. Als Ergebnis zeigten sich besonders die Evolutionsstrategien für einen Einsatz in einer Niedrigdurchsatzscreening-Kampagne geeignet, da diese effizient mit großen Populationen und wenigen Iterationen arbeiteten. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt den erfolgreichen Entwurf einer fokussierten Bibliothek von RNA-Liganden. In einer hybriden, prospektiven Optimierungsstudie wurden nach dem Vorbild einer iterativen Niedrigdurchsatzscreening-Kampagne vom Computer vorgeschlagene Moleküle im Labor getestet. Die Substanzen wurden auf Inhibition einer spezifischen molekularen Wechselwirkung im Replikationszyklus von HIV getestet (Tat-TAR-Interaktion). In vier Generationen wurden 9 von 170 untersuchten Verbindungen positiv auf Inhibition der Tat-TAR-Interaktion getestet (Trefferquote: 5,3%), wobei lediglich 0,089% der Verbindungen der Screeningbibliothek untersucht wurden. Die zwei potentesten Kandidaten wiesen einen IC50 von 51 uM bzw. 116 uM auf.
Diese Arbeit teilt sich in zwei Themenblöcke, deren zentrales Element Borat-Anionen darstellen, die unterschiedlichste Funktionen erfüllen. Durch entsprechende Wahl der Substituenten am Bor können sowohl Anionen mit schwach koordinierenden Eigenschaften erzeugt werden, als auch Borate, die sich zum Einsatz als Ligand in der Koordinationschemie eignen. ...
SIVsmmPBj-derived lentiviral vectors are capable of efficient primary human monocyte transduction, a capacity which is linked to the viral accessory protein Vpx. To enable novel gene therapy approaches targeting monocytes, in this thesis it was aimed to generate enhanced lentiviral vectors that meet the required standards for clinical applications with respect to gene transfer efficiency and safety. The vectors were tested for their suitability in a relevant therapeutic gene transfer approach. At first, it was investigated whether vectors derived from another Vpx-carrying lentivirus reveal the same capacity for monocyte transduction as SIVsmmPBj-derived vectors. A transduction experiment using HIV-2-derived vectors in comparison to PBj-derived vectors revealed a comparable transduction capacity, thus disproving the assumed uniqueness of the PBj vectors. The further generation and analysis of expression constructs for the vpx genes of HIV-2 and SIVmac demonstrated a similar functionality in monocyte transduction as the Vpx of PBj. As VpxPBj, both Vpx proteins facilitated monocyte transduction of a vpx-deficient PBj-derived vector system. For the generation of enhanced SIVsmmPBj and HIV-2 vector systems, only the transfer vectors were optimized, since the packaging vectors available already meet current standards. At first, several modifications were introduced into an available preliminary PBj-derived transfer vector by conventional cloning. The modifications included insertions of cPPT/CTS and WPRE as well as the deletions of the remaining pol sequence, the second exons of tat end rev, and the U3-region within the 3’LTR to generate a SIN vector. Thus, beside safety enhancement, the vector titers were also increased from 9.1x105 TU/ml achieved after concentration with the initial transfer vector up to 1.1x107 TU/ml with the final transfer vector. The PBj vector retained its capability of monocyte transduction when supplemented with Vpx. This conventional method of vector enhancement is time-consuming and may result in only sub-optimal vectors, since it depends on the presence of restriction sites which may not allow deletion of all needless sequences. Moreover, mutations may accumulate during the high number of cloning and amplification steps. Therefore, a new and easier method for lentiviral transfer vector generation was conceived. Three essential segments of the viral genome (5‘ LTR, RRE, ΔU3-3’ LTR) are amplified on the template of the lentiviral wild-type genome and fused by Fusion-PCR. Further necessary elements namely the cPPT/CTS-element, MCS, and PPT are included into the resulting vector by extension of the nucleotide primers used for the PCRs. The amplified and fused vector-scaffold can easily be integrated into a plasmid backbone, followed by insertion of the expression cassette of choice. By applying this approach, two novel lentiviral transfer vectors, based on the non-human SIVsmmPBj and the human HIV-2, were derived. Vector titers achieved for PBj and HIV-2 vectors supplemented with Vpx reached up to 4.0x108 TU/ml and 5.4x108 TU/ml, respectively. The capacity for monocyte transduction was maintained. Thus, safe and efficient, state of the art HIV-2- and PBj-derived vector systems are now available for future gene therapy strategies. Finally, the new vectors were used to set up an approach for gene correction of gp91phox-deficient monocytes for the treatment of X-linked chronic granulomatous disease (xCGD). The administration of autologous, gene-corrected monocytes to counteract systemic and acute infections could lead to a decreased infection load, dissolve granulomas and therefore improve the survival rate of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) which is the current treatment of choice for this disease. First, methods for analysis of gp91phox function were established. Next, they were employed to demonstrate the capacity of monocytes, obtained from healthy humans or mice, for phagocytosis, oxidative burst, and Staphylococcus aureus killing. The in vivo half-life of murine monocytes in the bloodstream and their distribution to specific tissues was determined. Lastly, HIV-1 vectors were used to transfer the gp91phox gene into monocytes from gp91phox-deficient mice. This resulted in the successful restoration of the oxidative burst ability in the cells. In summary, the general suitability of the new vectors for treatment of CGD by monocyte transduction was demonstrated. The results of the mouse experiments provide the foundation for future challenge experiments to evaluate the capability of gene-corrected monocytes to kill off microbes in vivo.
Channelrhodopsine sind blaulichtsensitive, Retinal-bindende Proteine aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Channelrhodopsin 2 (ChR2) wurde als heptahelikaler, kationenselektiver Ionenkanal charakterisiert (Nagel et al., 2003). Wie die zur selben Proteinfamilie gehörende Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) wird ChR2 durch Licht aktiviert; allerdings wird hierbei ein passiver Strom ausgelöst, bei dem Kationen entsprechend ihres elektrochemischen Gradienten fließen. Aufgrund dieser Eigenschaft eignet sich ChR2 zur lichtinduzierten Depolarisation von Zellen und zur Auslösung von Aktionspotentialen in Neuronen, über deren Membran ein Konzentrationsgradient von Kationen anliegt (Boyden et al., 2005). Die Stimulation elektrischer Aktivität von ChR2-exprimierenden Neuronen im Hirngewebe von Mäusen, die ChR2 transgen exprimieren, kann beispielsweise genutzt werden, um die Konnektivität von Neuronen und Hirnbereichen zu untersuchen (z.B. Wang et al., 2007). Für diese und weitere Anwendungen war es interessant, ChR2 zelltyp- oder regionenspezifisch in Mäusen zu exprimieren. Zu diesem Zweck sollte ChR2/eGFP bicistronisch oder ChR2-YFP als Fusionsprotein unter einem ubiquitären Promotor exprimiert werden; die Expression sollte aber durch ein Stop-Element unterbunden werden, das von loxP-sites flankiert ist (unaktiviertes Transgen). Das Enzym Cre- Rekombinase entfernt durch Rekombination das Stop-Element an diesen Erkennungssequenzen, wodurch die ChR2-Expression ermöglicht werden sollte (aktiviertes Transgen). Die Cre-Rekombinase kann dabei sowohl viral als auch transgen unter zelltyp- und regionenspezifischen Promotoren exprimiert werden und damit die regionale Spezifität und den Zeitpunkt der ChR2-Expression bestimmen. Es wurden drei Mauslinien über Pronukleus-Injektionen erhalten, die den Reporter β-Galactosidase des unaktivierten Transgens exprimierten. Die Verpaarung von Mäusen dieser Linien mit Cre-Rekombinase-exprimierenden Mauslinien führte aber nur zu einer ineffizienten Aktivierung des Transgens, so dass ChR2-Expression einzig mittels RT-PCR nachgewiesen werden konnte. Nach viraler Expression der Cre-Rekombinase im Hippokampus konnte eine Aktivierung des ChR2-Transgens auch mittels Immunfluoreszenz gezeigt werden. Mangels GFP-Fluoreszenz waren die transgenen Linien aber nicht für gezielte elektrophysiologische Ableitungen verwendbar. In einem zweiten Ansatz wurden transgene Mäuse über embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert. Bei diesem Ansatz wird eine geringere Kopienzahl des Transgens ins Genom integriert. In den ES-Zellen konnte durch transiente Cre-Rekombinase-Expression gezeigt werden, dass das Transgen effizient aktiviert werden konnte. Aus mehreren ES-Zell-Klonen wurden chimäre Mäuse erhalten, die zum jetzigen Zeitpunkt auf Keimbahntransmission getestet werden. Wie ChR2 einen Kationenkanal bildet und welche Transmembrandomänen und Aminosäuren daran beteiligt sind, ist unbekannt. Daher wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Positionen E90, E97 und E101, welche in der zweiten Transmembranhelix untereinander zu liegen scheinen, Teil einer Ionenpore sein könnten. Um den Einfluss dieser Aminosäuren auf die Kationenleitung und/ oder – selektivität zu untersuchen, wurden diese Positionen substituiert und die resultierenden ChR2-Mutantenproteine in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch analysiert. Um Na+- bzw. Protonen-mediierte Ströme unterscheiden zu können, wurden Na+-haltige und Na+-freie Puffer verschiedener pH-Werte verwendet. Lichtinduzierte Ströme von ChR2E97A, ChR2E97Q, ChR2E97K und ChR2E101K waren im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert, ausschließlich bei pH 4 zu detektieren und wohl hauptsächlich durch Protonen getragen. Die isofunktionale, aber ladungsneutrale Mutation ChR2E90Q zeigte nur geringe Unterschiede zum Wildtyp. Alaninsubstitution (E90A) als auch Ladungsinversion (E90K) führte zu starken Veränderungen des ChR2-Stroms im Vergleich zum Wildtyp. ChR2E90A zeigte im Vergleich zum Wildtyp reduzierte Protonenströme sowie einen erhöhten Natriumstrom, der durch Protonen inhibierbar war. Die Ladungsinversion ChR2E90K führte zu allgemein stark verminderten Leitfähigkeiten, lediglich bei pH 4 konnten noch Ströme gemessen werden. Die Ergebnisse sind der erste Hinweis auf eine Beteiligung von Glutamatresten an der Ionenleitfähigkeit in der Transmembranhelix 2 von ChR2.
Innerhalb des adaptiven Immunsystems spielt der Major Histocompatibility Complex (MHC)-Klasse I-Weg der Antigenpräsentation eine essenzielle Rolle bei der Erkennung und Zerstörung Virus-infizierter Zellen. Ein grundlegender Schritt innerhalb dieses Prozesses ist die Translokation endogener Peptide durch den transporter associated with antigen processing (TAP) in das ER-Lumen. Der TAP-Transporter ist zusammen mit verschiedenen Chaperonen und weiteren Faktoren in einem Peptidbeladungskomplex (PLC) assoziiert. Insbesondere Herpesviren, die durch eine lebenslange Persistenz im Wirt und wiederkehrende Reaktivierung unter Stresssituationen gekennzeichnet sind, interferieren direkt mit dem PLC und dem TAP-Transporter. Das varicellovirale Typ-I-Membranprotein UL49.5 inhibiert den TAP-Komplex, wobei das Protein des Rinderherpesvirus (Bovines Herpesvirus 1, BHV-1) zusätzlich die proteasomale Degradation verschiedener Komponenten des PLCs einleitet. Dieser Mechanismus wird durch die C-terminale Domäne des UL49.5-Proteins vermittelt und ist von keinem anderen Virusprotein bekannt. Welche Aminosäuren des Virusproteins jedoch für diese Inhibition und Degradation essenziell sind, wurde bisher nicht aufgeklärt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die Funktionsweise des BHV-1 UL49.5-Proteins zu verstehen und insbesondere zu analysieren, welche Bereiche des Proteins für die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes verantwortlich sind. Das UL49.5-Protein wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgreich in Insektenzellen und in HeLa-Zellen exprimiert. Mittels Coimmunpräzipitation (Co-IP) wurde daraufhin die Bindung verschiedener UL49.5-Varianten an den TAP-Komplex analysiert. Unterstützt wurden diese Daten durch einen in vivo Interaktionsscreen (BiFC) und in vitro translatiertes UL49.5. Hierbei stellte sich heraus, dass das UL49.5-Protein in Abwesenheit sämtlicher Komponenten des Immunsystems an beide Untereinheiten des TAP-Transporters bindet. Die Bindung erfolgt sowohl an vollständige TAP-Untereinheiten als auch an den sogenannten coreTAP-Komplex, der nur die inneren sechs Transmembranhelices besitzt. Weiterhin wurden systematisch verkürzte UL49.5-Varianten generiert, um wichtige Reste für TAP-Inhibition und proteasomale Degradation zu identifizieren. Interessanterweise sind weder die N-terminale noch die C-terminale Domäne von UL49.5 für die Bindung an den TAP-Komplex zwingend notwendig. Die Bindung an den TAP-Transporter wird demnach über die Transmembrandomäne von UL49.5 vermittelt. Mit Hilfe von Peptidtransport-Analysen wurde die inhibitorische Aktivität verschiedener UL49.5-Mutanten eingehend untersucht. Zusätzlich wurde eine Untersuchung der MHC I-Oberflächenexpression in transient transfizierten HeLa-Zellen etabliert. In diesen Zellen wurde nach Sortierung eine drastisch reduzierte TAP-Konzentration nachgewiesen, die auf proteasomale Degradation des TAP-Komplexes zurückzuführen war. Die Untersuchung von C-terminal verkürzten UL49.5-Mutanten zeigte, dass die letzten zwei C-terminalen Aminosäuren essenziell für die Induktion der TAP-Degradation sind. Die C-terminale Domäne von UL49.5 konnte jedoch, nach Übertragung auf andere Proteine, keine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleiten. Demnach ist ein weiterer Bereich des Proteins für diesen Prozess zwingend notwendig. Erstaunlicherweise waren auch N-terminal verkürzte UL49.5-Proteine deutlich in ihrer inhibitorischen Funktion beeinträchtigt. Bereits nach der Deletion von 10 N-terminalen Aminosäuren war das Protein nicht mehr in der Lage, eine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einzuleiten. Demnach spielt auch die ER-luminale Domäne von UL49.5 eine wichtige Rolle bei der UL49.5-induzierten TAP-Degradation. Somit wurde ein bisher noch nicht beschriebener neuartiger Inhibitionsmechanismus für das BHV-1 UL49.5-Protein entdeckt. Nach Bindung von UL49.5 über die Transmembrandomäne an beide Untereinheiten des TAP-Transporters scheint die ER-luminale Domäne von UL49.5 ein Signal über die ER-Membran an die zytoplasmatische Domäne zu übertragen, die dann die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleitet. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals gezeigt werden, dass additive Effekte eines sehr kleinen Virusproteins auf zwei unterschiedlichen Seiten der ER-Membran zu einer proteasomalen Degradation eines sehr großen Membran-Komplexes führen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein CtaG aus Paracoccus denitrificans eingehend charakterisiert. Es wurde überprüft, ob dieses 21 kDa große Membranprotein als Kupferchaperon und Assemblierungsfaktor für die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase, das heißt für die Biogenese des CuB-Zentrums, in Frage kommt. Eine bioinformatische Analyse zeigte zunächst, dass CtaG, ein Homolog des eukaryotischen Proteins Cox11, zu den am stärksten konservierten Assemblierungsfaktoren der Cytochrom c Oxidase gehört. Interessanterweise sind diese Proteine alle an der Biogenese der redoxaktiven Metallzentren beteiligt, und nur sie sind auch in Paracoccus denitrificans konserviert. Somit stellt Paracoccus ein ideales Modellsystem dar, um die essentiellen Schritte der Biogenese der Cytochrom c Oxidase zu untersuchen. Ein lösliches Fragment von CtaG (CtaGLF) wurde heterolog in E. coli exprimiert und mit Hilfe eines spaltbaren His6-tags aufgereinigt. Es wurde ein Protokoll entwickelt, mit dessen Hilfe die Aggregation des löslichen Fragments minimiert und das Protein in hochreiner, aggregatfreier Form isoliert werden kann. Rekonstitutionsversuche zeigten, dass CtaGLF ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist. Nach der heterologen Expression in E. coli ist CtaGLF kofaktorfrei. Ein Protokoll zur in vitro Rekonstitution mit Kupferionen wurde entwickelt, mit welchem ein stöchiometrisches Kupfer/Protein-Verhältnis erreicht wird. Gelfiltrations- und ICP-MS-Analysen zeigten, dass CtaGLF Kupferionen ausschließlich als Dimer bindet. Rekonstitutionen bei denen Cu(I), Cu(II), Co(II), Fe(II), Mn(II), Mg(II) und Ni(II) sowohl einzeln als auch simultan angeboten wurden, führten zwar zu wenig reproduzierbaren absoluten Stöchiometrien, bestätigten aber, dass CtaGLF bevorzugt Cu(I) bindet. Mutagenesestudien bewiesen einerseits, dass drei Cysteinreste maßgeblich für die Kupferbindung verantwortlich sind und deuteten andererseits darauf hin, dass zwei identische, punktsymmetrische Bindungsstellen des CtaGLF-Dimers die Kupferionen koordinieren. Mit Hilfe einer Multiseq-Analyse wurden zunächst hochkonservierte Oberflächenreste von CtaG identifiziert. Eine Auswahl dieser Aminosäuren wurde per gerichteter Mutagenese ersetzt und der Effekt dieser Mutationen auf Stöchiometrie, Affinität und Dimerisierung von CtaGLF wurde untersucht. Die Affinitäten wurden dabei mit Hilfe von Kompetitionsexperimenten mit dem Cu(I)-spezifischen Chelator BCA analysiert. Insgesamt vier mögliche Szenarien für die Kupferbindung von CtaG wurden postuliert und anhand der Datenlage diskutiert. Das Szenario III, welches die Datenlage am besten zu erklären vermag, sieht eine trigonale Koordination der Kupferionen vor, an welcher die Cysteine des hochkonservierten CFCF-Motivs einer Polypeptidkette ein gemeinsames Koordinationsfeld mit dem nahe der Transmembranhelix gelegenen Cystein 38 der jeweils anderen Polypeptidkette bilden. Mit Hilfe von UV/Vis-spektroskopischen Messungen wurde gezeigt, dass die Bindung von Kupferionen an CtaGLF zu einer Absorption bei 358 nm führt. Diese kann mit einem Extinktionskoeffizienten von E delta 358 nm = 936 M-1cm-1 zur Beobachtung des Kupfertransfers von CtaGLF auf einen Akzeptor verwendet werden. Um eine Beteiligung von CtaG bei der Insertion des CuB-Ions in die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase (UE I) zu beweisen, wurden zwei Arbeitshypothesen aufgestellt und empirisch untersucht: Die erste Hypothese geht von einer posttranslationalen Kupferinsertion aus. Die UE I wird laut dieser Hypothese zunächst vollständig exprimiert und in die Membran inseriert, bevor das Kupferion über einen Kanal in das 13 Å unterhalb der Membranoberfläche gelegene aktive Zentrum der Oxidase inseriert wird. Drei Ansätze wurden zur empirischen Überprüfung dieser Hypothese verfolgt: Erstens wurde ein in vitro Transferassay etabliert, bei dem heterolog exprimierte, kofaktorfreie UE I als Akzeptor für Kupferionen von CtaGLF diente. Zweitens wurden bioinformatische Analysen durchgeführt um potentielle Interaktionsflächen zwischen CtaG und UE I zu identifizieren. Und drittens wurde mit Hilfe koaffinitätschromatographischer Versuche eine Interaktion zwischen CtaG und kofaktorfreier UE I untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sprechen allesamt gegen eine posttranslationale CtaG-vermittelte Insertion von Kupferionen in die UE I der Cytochrom c Oxidase. Die zweite Hypothese geht davon aus, dass die prosthetischen Häm- und Kupfergruppen bereits vor der vollständigen Membraninsertion, das heißt kotranslational auf die UE I übertragen werden. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden ebenfalls mehrere Ansätze verfolgt: Erstens wurde die UE I in Gegenwart und Abwesenheit von CtaG heterolog in E. coli exprimiert und anschließend aufgereinigt. In Abwesenheit weiterer Assemblierungsfaktoren ist CtaG in diesem System nicht dazu in der Lage den Kupfergehalt der UE I zu erhöhen. Zweitens wurde mit Hilfe von Blau-Nativ Gelen und Crosslinking-Versuchen im nativen Wirt Paracoccus denitrificans nach einer Wechselwirkung zwischen CtaG und UE I gesucht. Insbesondere die Ergebnisse der Crosslinking-Versuche deuten auf einen Assemblierungskomplex hin, der sowohl CtaG als auch die UE I der Cytochrom c Oxidase enthält. In einem dritten Ansatz wurde ein zellfreies Expressionssystem etabliert, welches direkten Zugang zu naszierenden Ketten der UE I ermöglicht. Dieses System erscheint vielversprechend und dient derzeit als Basis für weitere Biogenesestudien. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass CtaG ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist, das im Zuge der Kupferbindung dimerisiert und in Paraoccus denitrificans in einem hochmolekularen Komplex gemeinsam mit UE I vorliegt. Die gegenwärtige Datenlage spricht dafür, dass CtaG als Kupferchaperon an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt ist und das CuB-Ion in einem kotranslationalen Mechanismus in die UE I der Cytochrom c Oxidase inseriert.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes. It catalyses the conversion of arachidonic acid to the hydroperoxy intermediate 5(S)-hydroperoxy-6- trans-8,11,14-cis-eicosatetraenoic acid (5-HpETE). In a second step 5-LO catalyses a dehydration reaction forming the unstable epoxide intermediate 5(S)-trans-5,6-oxido-7,9- trans-11,14-cis-eicosatetraenoic acid (leukotriene A4 , LTA4). The 5-LO gene is subjected to versatile regulation mechanisms. Apart from regulation by DNA-methylation and histone acetylation / deacetylation 5-LO gene expression can be regulated by the differentiation inducers calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) and transforming growth factor beta (TGFβ) 5-LO gene expression. In the myeloid cell lines Mono Mac 6 (MM6) and HL-60, differentiation with both agents caused a prominent upregulation of 5-LO mRNA level, of 5-LO protein expression and of 5-LO activity. Treatment with calcitriol alone already has an impact on 5-LO gene expression which is additionally potentiated by TGFβ treatment. Previous nuclear run-off analysis and reporter gene analysis could not associate the 5-LO promoter with the induction of 5-LO mRNA expression mediated by calcitriol and TGFβ. Inclusion of the 5-LO coding sequence (cds) and inclusion of the 5-LO cds plus the last four introns of the gene (J to M) in the 5-LO promoter construct pN10 led to an enhanced reporter gene activity. The inductions were dependent on vitamin D receptor (VDR) and retinoid x receptor (RXR) cotransfection. Therefore the work was concentrated on identifying elements outside the 5-LO promoter region which contribute to the calcitriol / TGFβ effect on 5-LO mRNA expression. Insertion of the LTA4 hydrolase coding sequence – a coding sequence of similar size - instead of the 5-LO cds led to a loss of the calcitriol / TGFβ effect (pN10LTA4Hcds 1-fold induction). Therewith, it was proven that the presence of the 5-LO cds is crucial for the upregulating effect of calcitriol / TGFβ on 5-LO mRNA level. Cloning of the SV40 promoter instead of pN10 upstream of the 5-LO cds still showed inducibility by treatment with the inducers which argues for a promoter unspecific effect. Insertion of the 5-LO cds in a promoterless basic vector (pGL3cds) displayed same inductions by calcitriol / TGFβ treatment as the 5-LO promoter 5-LO cds construct (pN10cds). Thus, the effect of the inducers is not dependent on the 5-LO promoter under the in vitro conditions of the reporter gene assay. Hence, further cloning was done with promoterless constructs. Through 5-LO cds deletion constructs a positive regulating region in exon 10 to 14 was discovered. To adapt the natural gene context the last four introns (J-M) of the 5-LO gene were inserted in a promoterless construct containing exon 10 to 14 (pGL3cdsΔABInJM). 5end deletion constructs of it revealed putative vitamin D responsive elements (VDREs) in exon 12 and intron M. Mutation of the putative VDREs led to a reduced calcitriol effect –more prominent when the putative VDRE in intron M was mutated (reduction of 40%). Moreover another putative VDRE in exon 10 with an adjacent SMAD binding element (SBE) was detected. SMAD proteins are effector proteins of TGFβ signalling. Gelshift experiments demonstrated in vitro binding of the VDR-RXR heterodimer to those three putative VDREs. By chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay in vivo binding of VDR and RXR was shown to the VDRE in the region of exon 10, exon 12 and intron M. 8h and 24h incubation with calcitriol / TGFβ resulted in enhanced expression of VDR in each of the examined regions. The VDR is able to bind to the VDRE without its ligand, whereas this goes along with corepressor recruitment and thus the VDR has a repressive effect on transcription. Histone H4 acetylation was increased when MM6 cells were treated for 8h or 24h with calcitriol or the combination of calcitriol / TGFβ. This finding implies that at that point of time corepressors associated with the VDR are replaced by coactivators. It seems convincing that 5-LO transcription is mainly promoted by calcitriol alone which leads to a more accessible chromatin structure. Previous data indicated that calcitriol and TGFβ upregulate 5-LO RNA maturation and 5- LO transcript elongation. Thus several elongation markers were investigated by ChIP analysis: Histone H3 lysine 36 (H3K36) trimethylation and H4K20 monomethylation were detected in the analysed regions in exon 10, exon 12 and intron M. In region exon 10 the H3K36 trimethylation status was enhanced after 24h calcitriol or calcitriol / TGFβ treatment. An increased H4K20 monomethylation status in all regions was observed when MM6 cells were treated for 24h with calcitriol / TGFβ. 24h treatment with both agents also enhanced the recruitment of the elongation form of RNA polymerase II, which is phosphorylated at serine 2 of the carboxyterminal domain, to the investigated regions. These findings prove the positive regulating role for calcitriol and TGFβ on 5-LO transcript elongation. A putative mechanism of the effect of calcitriol and TGFβ on 5-LO RNA maturation might be the elevated phosphorylation of serine 2 of the RNA Polymerase II which is known to be followed by recruiting polyadenylating factors.
Die Aufklärung der dreidimensionalen Helix-Struktur der DNA, des Trägermoleküls der genetischen Information aller Lebewesen, durch Watson und Crick im Jahre 1953 ermöglichte eine ganz neue Sichtweise auf ihre Eigenschaften und viele zelluläre Prozesse. Von besonderem Interesse sind hier u.a. Mechanismen, bei denen die DNA an den Phosphaten nucleophil substituiert wird, wie dies beispielsweise bei der Rekombination oder der Transkription geschieht. Dies ist daher interessant, weil sich die DNA gegenüber nucleophilen Angriffen in verschiedenen Experimenten als überaus stabil und reaktionsträge gezeigt hat. Spezialisierte Enzyme wie die Staphylokokkennuklease oder Restriktionsendonukleasen nutzen u.a. Metall-Ionen, um Phosphoryltransfer-Reaktionen zu katalysieren und in eine akzeptable Zeitskala zu verschieben. Die Topoisomerase vom Typ I zeigt eindrucksvoll, dass Katalyse solcher Reaktionen auch ohne Metall-Ion möglich ist, womit auch gleichzeitig die Quelle für eine potentielle oxidative Schädigung der DNA entfernt ist. Leider ist die Palette der natürlich vorkommenden Enzyme begrenzt. Die Erforschung und Entwicklung von künstlichen Nukleasen ermöglicht daher potentiell den zukünftigen Einsatz neuer, maßgeschneiderter Werkzeuge für die Biochemie und die Biotechnologie, sowie langfristig die Bereitstellung neuartiger Chemotherapeutika. Vom aktiven Zentrum der Staphylokokkennuklease abgeleitete Moleküle auf Bisguanidinium-Naphthol-Basis bzw. deren Derivate zeigten in der Vergangenheit deutliche Aktivität als metallfreie, unspezifische Spalter von Plasmid-DNA. Die vorliegende Arbeit beschreibt die weitere Entwicklung und Charakterisierung neuer unspezifischer und potentiell sequenzselektiver Bisguanidinium-Naphthol-Derivate. Hierbei wurde eine neue, zuverlässige Synthesestrategie für Bisguanidinium-Naphthole und parallel dazu ein neuer und flexibler Weg der Flüssigphasen-Synthese von DNA-bindenden Polyamiden ausgearbeitet, um daraus DNA-bindende Konjugate herzustellen. Vier unspezifische Moleküle (45, 94, 95, 97) und zwei Konjugate (46 und 140) wurden dann bei physiologischen Bedingungen auf ihre Spaltaktivität gegenüber Plasmid-DNA und linearer Duplex-DNA untersucht. Bei allen oben genannten Verbindungen konnte - verglichen mit der Stamm-Verbindung 36 aus Vorgängerarbeiten - eine erhöhte Aktivität gegenüber Plasmid-DNA bestimmt werden, die im Falle der Konjugate zwischen 4000- und 8000-fach liegt. Zur weiteren Charakterisierung wurden Experimente in Anwesenheit von EDTA oder Mg2+, zur pH-Abhängigkeit und zur Kinetik der Spalt-Reaktion durchgeführt. Erste Testreihen zum Nachweis sequenzselektiver DNA-Spaltung lieferten kein abschließendes Ergebnis, gaben jedoch erste Hinweise auf Selektivität, welche zur Zeit näher untersucht und überprüft werden.
Lentiviral vectors mediate gene transfer into dividing and most non-dividing cells. Thereby, they stably integrate the transgene into the host cell genome. For this reason, lentiviral vectors are a promising tool for gene therapy. However, safety and efficiency of lentiviral mediated gene transfer still needs to be optimised. Ideally, cell entry should be restricted to the cell population relevant for a particular therapeutic application. Furthermore, lentiviral vectors able to transduce quiescent lymphocytes are desirable. Although many approaches were followed to engineer retroviral envelope proteins, an effective and universally applicable system for retargeting of lentiviral cell entry is still not available. Just before the experimental work of this thesis was started, retargeting of measles virus (MV) cell entry was achieved. This virus has two types of envelope glycoproteins, the hemagglutinin (H) protein responsible for receptor recognition and the fusion (F) protein mediating membrane fusion. For retargeting, the H protein was mutated in its interaction sites for the native MV receptors and a ligand or a single-chain antibody (scAb) was fused to its ectodomain. It was hypothesised that the retargeting system of MV can be transferred to lentiviral vectors by pseudotyping human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) derived vector particles with the MV glycoproteins. As the unmodified MV glycoproteins did not pseudotype HIV vectors, two F and 15 H protein variants carrying stepwise truncations or amino acid (aa) exchanges in their cytoplasmic tails were screened for their ability to form MV-HIV pseudotypes. The combinations Hcd18/Fcd30, Hcd19/Fcd30 and Hcd24+4A/Fcd30 led to most efficient pseudotype formation with titers above 10exp6 transducing units /ml, using concentrated particles. The F cytoplasmic tail was truncated by 30 aa and the H cytoplasmic tail was truncated by 18, 19 or 24 residues with four added alanines after the start methionine in the latter case. Western blot analysis indicated that particle incorporation of the MV glycoproteins was enhanced upon truncation of their cytoplasmic tails. With the MV-HIV vectors high titers on different cell lines expressing one or both MV receptors were obtained, whereas MV receptor-negative cells remained untransduced. Titers were enhanced using an optimal H to F plasmid ratio (1:7) during vector particle production. Based on the described pseudotyping with the MV glycoprotein variants, HIV vectors retargeted to the epidermal growth factor receptor (EGFR) or the B cell surface marker CD20 were generated. For the production of the retargeted vectors MVaEGFR-HIV and MVaCD20-HIV, Fcd30 together with a native receptor blind Hcd18 protein, displaying at its ectodomain either the ligand EGF or a scAb directed against CD20 were used. With these vectors, gene transfer into target receptor-positive cells was several orders of magnitude more efficient than into control cells. The almost complete absence of background transduction of non-target cells was e.g. demonstrated in mixed cell populations, where the CD20-targeting vector selectively eliminated CD20-positive cells upon suicide gene transfer. Remarkably, transduction of activated primary human CD20-positive B cells was much more efficient with the MVaCD20-HIV vector than with the standard pseudotype vector VSV-G-HIV. Even more surprisingly, MVaCD20-HIV vectors were able to transduce quiescent primary human B cells, which until then had been resistant towards lentiviral gene transfer. The most critical step during the production of MV-HIV pseudotypes was the identification of H cytoplasmic tail mutants that allowed pseudotyping while retaining the fusion helper function. In contrast to previously inefficient targeting strategies, the reason for the success of this novel targeting system must be based on the separation of the receptor recognition and fusion functions onto two different proteins. Furthermore, with the CD20-targeting vector transduction of quiescent B cells was demonstrated for the first time. Own data and literature data suggest that CD20 binding and hyper-cross-linking by the vector particles results in calcium influx and thus activation of quiescent B cells. Alternatively this feature may be based on a residual binding activity of the MV glycoproteins to the native MV receptors that is insufficient for entry but induces cytoskeleton rearrangements dissolving the post-entry block of HIV vectors. Hence, in this thesis efficient retargeting of lentiviral vectors and transduction of quiescent cells was combined. This novel targeting strategy should be easily adaptable to many other target molecules by extending the modified MV H protein with appropriate specific domains or scAbs. It should now be possible to tailor lentiviral vectors for highly selective gene transfer into any desired target cell population with an unprecedented degree of efficiency.
Das Ziel dieser Arbeit war es, RNA-Strukturen als potentielle Zielstrukturen für die Medikamentenentwicklung zu untersuchen. Hierbei ging es im Speziellen um die Anwendung Virtueller Screening Verfahren für die RNA-Liganden-Vorhersage. Hierzu wurde die als TAR-Motiv (transactivating response element) bekannte RNA-Struktur der mRNAs des HI-Virus ausgewählt. Diese Struktur wurde gewählt, da mit den vier PDB-Einträgen 1ANR, 1ARJ, 1LVJ und 1QD3 bereits experimentell motivierte Strukturmodelle zum Beginn der Untersuchung vorlagen. Ausschlaggebend war hierbei auch das Vorhandensein eines Tat-TAR-FRET-Assays im Rahmen des SFB 579, in welchem diese Arbeit angefertigt wurde. Die Aufmerksamkeit, welche dem HI-Virus im Rahmen der Bekämpfung der Immunschwächekrankheit bereits zukam, führte bei dem gewählten Testmodell ebenfalls zu einem, wenn auch immer noch überschaubaren Datensatz bereits getesteter Substanzen, der als Grundlage für einen Liganden-basierten Ansatz als erste Basis dienen konnte. Basierend auf diesen Voruntersuchungen ergaben sich die weiteren Schritte dieser Arbeit. Die Arbeit lässt sich zusammenfassend in vier zum Teil parallel verlaufende Phasen einteilen: Phase 1:Bestandsaufnahme bekannter Informationen über die Zielstruktur · experimentell bestimmte Zielstrukturen · experimentell bestimmte Liganden/Nichtliganden der Zielstruktur Phase 2: Ableiten eines ligandenbasierten Ansatzes zur Vorhersage von potentiellen Bindern der Zielstruktur aus Substanzbibliotheken, der nicht auf Strukturdaten der Zielstruktur beruht. Phase 3: Analyse der bekannten Konformere der Zielstruktur auf konstante Angriffspunkte für ein spezielles Liganden-Design. Phase 4: Einbinden der bekannten Strukturinformationen der Zielstruktur zur weiteren Verfeinerung der Auswahlverfahren neuer Kandidaten für die weitere experimentelle Bestimmung des Bindeverhaltens. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels der Anwendung von künstlichen neuronalen Netzen in einem ligandenbasierten Ansatz durch virtuelles Screening der Chemikalien-Datenbanken verschiedener Lieferanten fünf neue potentielle TAR-RNA-Liganden identifiziert werden (drei davon mit einem Methylenaminoguanidyl-Substrukturmotiv), sowie als „Spin-Off“ durch die Anwendung der ursprünglich nur für den Tat-TAR-FRET-Assay vorgesehenen Testsubstanzen in einem Kooperationsprojekt (mittels CFivTT-Assay) zwei neue potentiell antibakterielle Verbindungen identifiziert werden. Die Beschäftigung mit der offensichtlichen Flexibilität der TAR-RNA und damit einer nicht eindeutig zu definierenden Referenz-Zielstruktur für das Liganden-Docking führte zur Erstellung eines Software-Pakets, mit dem flexible Zielstrukturen – basierend auf den Konformer-Datensätzen von MD-Simulationen – auf konstante Angriffspunkte untersucht werden können. Hierbei wurde ausgehend von der Integration eines Taschenvorhersage-Programms (PocketPicker) eine Reihe von Filtern implementiert, die auf den hierzu in einer MySQL-Datenbank abgelegten Strukturinformationen eine Einschränkung des möglichen Taschenraums für das zukünftige Liganden-Design automatisiert vornehmen können. Des Weiteren ermöglicht dieser Ansatz einen einfachen Zugriff auf die einzelnen Konformere und die Möglichkeit Annotationen zu den Konformeren und den daraus abgeleiteten Tascheninformationen hinzuzufügen, so dass diese Informationen für die Erstellung von Liganden-Docking-Versuchen verwendet werden können. Ferner wurden im Rahmen dieser Arbeit ein neuer Deskriptor für die Beschreibung von Taschenoberflächen eingeführt: der auf der „Skalierungs-Index-Methode“ basierende molekulare SIMPrint. Die Beschäftigung mit der Verteilung der potentiellen Bindetaschen auf der Oberfläche der Konformerensemble führte ferner zur Definition der Taschenoberflächenbildungswahrscheinlichkeit (Pocket Surface Generation Probability – PSGP) für einzelne Atome einer Zielstruktur, die tendenziell für die Einschätzung der Ausbildung einer potentiell langlebigen Interaktion eines Liganden mit der Zielstruktur herangezogen werden kann, um beispielsweise Docking-Posen zu bewerten.
Die trimeren P2X–Rezeptoren sind nicht–selektive Kationenkanäle, die durch Adenosintriphosphat (ATP) aktiviert werden. Es gibt sieben Untereinheiten (P2X1–7). P2X–Rezeptoren sind in nahezu jedem Gewebe exprimiert und dort an den verschiedensten physiologischen Vorgängen beteiligt. Neben den „Cys–Loop“–Rezeptoren und den ionotropen Glutamat–Rezeptoren stellen die P2X–Rezeptoren eine eigenständige Familie von Neurotransmitter–gesteuerten Rezeptoren dar. Eine Untereinheit der trimeren P2X–Rezeptoren besteht aus den intrazellulären N– und C–Termini und zwei Transmembrandomänen, die über eine große extrazelluläre Domäne verbunden sind. Da weder ein P2X–homologes lösliches Protein für Kristallisationsstudien noch ein Gewebe zur Aufreinigung großer Mengen von P2X–Rezeptorprotein zur Verfügung steht, stützen sich Struktur–Funktions–Studien auf einzelpunktmutierte Rezeptoren in heterologen Expressionsystemen. Einige Aminosäuren, die bei Austausch gegen Alanin eine deutliche Verschiebung der Dosis–Wirkungs–Kurve von ATP bewirken und von denen daher vermutet wird, dass sie an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, wurden bereits identifiziert. Ob sich die Agonisten–Bindungstasche der P2X–Rezeptoren zwischen zwei Untereinheiten, wie bei den nikotinischen Acetylcholin–Rezeptoren, oder innerhalb einer Untereinheit, vergleichbar mit den ionotropen Glutamat–Rezeptoren, befindet, ist weitgehend ungeklärt. Um die Lokalisation der ATP–Bindungstasche zu bestimmen, wurden, basierend auf vorhandener Literatur, potenziell an der ATP–Bindung beteiligte Aminosäuren des P2X1–Rezeptors durch zielgerichtete Mutagenese gegen Cysteine ausgetauscht und die P2X–Rezeptormutanen in Xenopus laevis–Oozyten exprimiert. Das Ziel dabei war, quervernetzte Cystein–Mutanten durch Disulfidbrückenbildung zwischen den substituierten Cysteinen zu identifizieren und so die Distanz von Aminosäure–Seitenketten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, zu bestimmen. Für die biochemischen Untersuchungen wurden entweder alle neu gebildeten Proteine der Oozyten metabolisch durch Inkubation mit radioaktivem [35S]–Methionin oder selektiv die Plasmamembran– ständigen Proteine mit Sulfo–NHS–Fluoreszenz–Farbstoffen markiert. Die Rezeptormutanten wurden affinitätschromatographisch über ein N–terminales Hexahystidyl–Motiv unter nicht–denaturierenden Bedingungen aufgereinigt und mit nicht–reduzierender SDS–Polyacrylamid–Gelelektrophorese (PAGE) auf Expression sowie mit Blauer–Nativer–PAGE auf korrekte Trimerisierung überprüft. Darüber hinaus wurden homologe Cystein–Substitutionen einer P2X2–1–Chimäre, welche dieselben Bindungseigenschaften des P2X1–Rezeptors besitzt, mittels der Zwei–Elektroden–Spannungsklemme charakterisiert (TEVC). Die Koexpression der verschiedenen P2X–Mutanten ergab eine spontane Quervernetzung über Disulfidbrücken zwischen den P2X1 K68C– und F291C–Mutanten, die in nicht–reduzierenden SDS–PAGE–Gelen über eine Dimerbildung nachgewiesen werden konnte. Dies deutet auf eine geringe Distanz zwischen diesen Cystein–substituierten Aminosäuren hin. Die Ausbildung der Disulfidbrücke konnte nach Reduktion der Quervernetzung während der Aufreinigung und durch Zugabe von ATP verhindert werden. In funktionellen Studien der P2X2–1 K68C/F291C–Doppelmutante war es entsprechend möglich die Disulfidbrücke reversibel zu reduzierenden. In den Mutantenkanäle exprimierenden Xenopus–Oozyten wurde der geringe Rezeptorstrom durch Reduktion mit DTT ca. 60fach potenziert und dadurch überhaupt messbar gemacht. Die Reoxidation durch H2O2 wurde wie in den biochemischen Experimenten in Anwesenheit von ATP ebenfalls verhindert. Da die Aminosäuren K68 und F291 des P2X1–Rezeptors möglicherweise an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, sind diese Ergebnisse die ersten direkten experimentellen Hinweise auf die Aposition von Domänen benachbarter Untereinheiten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind. Demnach befindet sich die ATP–Bindungstasche an der Grenzfläche zwischen zwei Untereinheiten der P2X–Rezeptoren. Die Koexpression homologer Cystein–substituierter P2X2–, P2X3– und P2X4–Rezeptoren zeigte analog zu den P2X1–Experimenten eine spontane Dimerisierung der P2X2 K69C– und F289C–Mutanten. Eine mäßige Quervernetzung von zwei Untereinheiten der P2X3 K63C– und F280C– sowie der P2X4 K67C– und F294C–Mutanten konnte nach Anwendung einer ca. 0,5 nm langen Cystein–spezifischen quervernetzenden Substanz erreicht werden. Die paarweise Kombination der P2X1–, P2X2–, P2X3–und P2X4–Cystein–Mutanten zeigte selbst nach Anwendung quervernetzender Substanzen nur in der Kombination von P2X1–K68C und P2X2–F289C eine Quervernetzung von zwei unterschiedlichen Untereinheiten eines heteromeren P2X1/2–Rezeptors. Diese Kombination konnte in elektrophysiologischen Messungen durch Reduktion der Disulfidbrücke spezifisch messbar gemacht und somit die Heteromerisierung dieser Untereinheiten eindeutig aufgezeigt werden. Zusammenfassend deutet die geringe Distanz der an der Quervernetzung beteiligten Cystein–Mutationen der P2X1–, P2X2– und homomeren P2X1/2–Rezeptoren auf ein konserviertes strukturelles Motiv dieser P2X–Subtypen hin, welches in P2X3– und P2X4–Rezeptoren nicht konserviert zu sein scheint. Diese Ergebnisse liefern wichtige Hinweise auf die generelle Struktur der P2X–Rezeptoren und werden maßgeblich zur Interpretation einer zukünftigen Kristallstruktur beitragen.
The light-harvesting complex of photosystem II (LHC-II) is the major antenna complex in plant photosynthesis. It accounts for roughly 30% of the total protein in plant chloroplasts, which makes it arguably the most abundant membrane protein on Earth, and binds about half of plant chlorophyll (Chl). The complex assembles as a trimer in the thylakoid membrane and binds a total of 54 pigment molecules, including 24 Chl a, 18 Chl b, 6 lutein (Lut), 3 neoxanthin (Neo) and 3 violaxanthin (Vio). LHC-II has five key roles in plant photosynthesis. It: (1) harvests sunlight and transmits excitation energy to the reaction centres of photosystems II and I, (2) regulates the amount of excitation energy reaching each of the two photosystems, (3) has a structural role in the architecture of the photosynthetic supercomplexes, (4) contributes to the tight appression of thylakoid membranes in chloroplast grana, and (5) protects the photosynthetic apparatus from photo damage by non photochemical quenching (NPQ). A major fraction of NPQ is accounted for its energy-dependent component qE. Despite being critical for plant survival and having been studied for decades, the exact details of how excess absorbed light energy is dissipated under qE conditions remain enigmatic. Today it is accepted that qE is regulated by the magnitude of the pH gradient (ΔpH) across the thylakoid membrane. It is also well documented that the drop in pH in the thylakoid lumen during high-light conditions activates the enzyme violaxanthin de-epoxidase (VDE), which converts the carotenoid Vio into zeaxanthin (Zea) as part of the xanthophyll cycle. Additionally, studies with Arabidopsis mutants revealed that the photosystem II subunit PsbS is necessary for qE. How these physiological responses switch LHC-II from the active, energy transmitting to the quenched, energy-dissipating state, in which the solar energy is not transmitted to the photosystems but instead dissipated as heat, remains unclear and is the subject of this thesis. From the results obtained during this doctoral work, five main conclusions can be drawn concerning the mechanism of qE: 1. Substitution of Vio by Zea in LHC-II is not sufficient for efficient dissipation of excess excitation energy. 2. Aggregation quenching of LHC-II does not require Vio, Neo nor a specific Chl pair. 3. With one exception, the pigment structure in LHC-II is rigid. 4. The two X-ray structures of LHC-II show the same energy transmitting state of the complex. 5. Crystalline LHC-II resembles the complex in the thylakoid membrane. Models of the aggregation quenching mechanism in vitro and the qE mechanism in vivo are presented as a corollary of this doctoral work. LHC-II aggregation quenching in vitro is attributed to the formation of energy sinks on the periphery of LHC-II through random interaction with other trimers, free pigments or impurities. A similar but unrelated process is proposed to occur in the thylakoid membrane, by which excess excitation energy is dissipated upon specific interaction between LHC-II and a PsbS monomer carrying Zea. At the end of this thesis, an innovative experimental model for the analysis of all key aspects of qE is proposed in order to finally solve the qE enigma, one of the last unresolved problems in photosynthesis research.
Poly(pyrazol-1-yl)borate, die sogenannten Skorpionate, repräsentieren eine der etabliertesten Ligandenklassen in der Koordinationschemie und finden aufgrund ihrer Vielseitigkeit zahlreiche Anwendungen. In den letzten Jahren hat sich ein besonderes Interesse an Bis- und Tris(pyrazol-1-yl)boratliganden entwickelt, die mehrere Skorpionateinheiten im selben Molekül vereinen und dadurch kooperative Effekte zwischen den Metallionen fördern. Diese Liganden können sowohl Einsatz in der homogenen Katalyse als auch in den Materialwissenschaften finden. Die bisher in unserer Arbeitsgruppe entwickelten ditopen Bis(pyrazol-1-yl)borate des Typs L (Abb. 3.1) weisen allerdings eine recht hohe Hydrolyseempfindlichkeit auf, deren Ursache wahrscheinlich im elektronenschiebenden Charakter und der Raumerfüllung der Alkylsubstituenten begründet liegt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden daher zunächst die ditopen Skorpionatliganden M2[3] und M2[6] mit Phenyl- und Pentafluorphenylsubstituenten dargestellt, die in darauf folgenden Hydrolysestudien eine im Vergleich zu L erheblich höhere Beständigkeit gegenüber Feuchtigkeit zeigten. Die Umsetzungen der Liganden Li2[Lpara] (Dissertation Dr. Susanne Bieller; Frankfurt 2005) und Li2[6] mit MnII-chlorid verdeutlichten, dass sich das C6F5-substituierte Heteroskorpionat auch in Bezug auf sein koordinationschemisches Verhalten vom tertButyl-substituierten Liganden unterscheidet. Während Li2[Lpara] mit MnCl2 zu einem chlorid-überbrückten, makrozyklischen, dinuklearen Mangankomplex reagiert, wird mit Li2[6] das in Abb. 3.2 dargestellte Koordinationspolymer {(MnCl2)2(Li(THF)3)2[6]}∞ erhalten. Die Ladung der anionischen Polymerkette wird durch Lithium-Gegenionen ausgeglichen. Um die Bildung von diskreten Komplexen einerseits bzw. von Koordinationspolymeren andererseits gezielt steuern zu können, wurden die mit sterisch anspruchsvollen Pyrazolylsubstituenten versehenen Liganden M2[4], M2[5] und M2[7] (Abb. 3.1) dargestellt. Im Zuge der Kristallisation von Li2[4] zeigte sich, dass diese Verbindung eine hohe Affinität für Chloridionen besitzt. Auch in Anwesenheit eines Überschusses Kronenether führen Spuren des Halogenids zur Ausbildung des in Abb 3.3 gezeigten dinuklearen, chloridverbrückten Lithiumkomplexes Li2Cl[4]. Die ausgeprägte Komplexbildungstendenz lässt Li2Cl[4] im Hinblick auf die Entwicklung von Anionenrezeptoren interessant erscheinen. Komplexe, in denen zwei Metallionen durch zwei Heteroskorpionatliganden in eine makrozyklische Struktur eingebunden werden (Tmeta/para in Abb. 3.4), konnten im Rahmen dieser Arbeit nicht isoliert werden. Ein Hinweis, warum dieses Strukturmotiv ungünstig sein könnte, wurde durch die Charakterisierung des auf einem partiell hydrolysierten Derivat von Li2[Lpara] beruhenden CoII-Makrozyklus Co2[23]2 erhalten. Die Analyse der Strukturparameter dieser Verbindung deutet an, dass die Bildung eines Makrozyklus im Fallder unhydrolysierten Heteroskorpionate aufgrund sterischer Wechselwirkungen zwischen den Pyrazolylringen und der Phenylenbrücke benachteiligt sein sollte. Obwohl zwischen Aryl- und Alkyl-basierte n Heteroskorpionaten erhebliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Neigung zur hydrolytischen Zersetzung erkennbar sind, zeigen beide Ligandentypen ähnliche Labilitäten gegenüber der stark Lewis-aziden Verbindung Brommanganpentacarbonyl. Die Reaktionen von Li2[Lpara], Li2[3] und Li2[6] mit Mn(CO)5Br führten zur Spaltung von B-N-Bindungen, die in allen drei Fällen durch Kristallisation des in Abb. 3.5 gezeigten, pyrazolid-verbrückten MnI-Carbonylkomplexes 21 dokumentiert werden konnte. Im Gegensatz zu den Heteroskorpionatliganden zeigen oligotope phenylenverknüpfte Homoskorpionate keine Tendenz, sich unter dem Einfluss von Mn(CO)5Br zu zersetzen. Reaktionen der di- und tritopen Tris(pyrazol-1-yl)borate Li2[15], Li2[16] und Li3[18] lieferten die in Abb. 3.6 dargestellten Mangantricarbonylkomplexe (Mn(CO)3)2[15], (Mn(CO)3)2[16] und (Mn(CO)3)3[18] in guten Ausbeuten. Neben der Darstellung dieser, für materialwissenschaftliche Fragestellungen (Koordinationspolymere, Metallorganische Netzwerke) interessanten Liganden, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit auch der Frage nachgegangen, ob die Verknüpfung zweier Heteroskorpionateinheiten Auswirkungen auf die katalytische Aktivität entsprechender Rhodium-Cyclooctadien-Komplexe in der Polymerisation von Phenylacetylen hat. Sterisch anspruchsvolle Pyrazolylsubstituenten tragende monotope Rhodium-Cyclooctadien- Skorpionatkomplexe konnten in dieser Reaktion bereits erfolgreich als Katalysatoren eingesetzt werden und lieferten regioselektiv cis-transoid-verknüpftes Poly(phenylacetylen). Zunächst wurden die in Abb. 3.7 dargestellten Rhodiumkomplexe (Rh(cod))2[3] und (Rh(cod))2[6] von Bis(pyrazol-1-yl)boraten, die keine sterisch anspruchsvollen Pyrazolylsubstituenten tragen, synthetisiert. Ähnlich wie der analoge einkernige Komplex Rh(cod)[H2Bpz2 ] zeigten (Rh(cod))2[3] und (Rh(cod))2[6] keinerlei katalytische Aktivität. Daher sollten im Anschluss die mit Phenylpyrazolylgruppen ausgestatteten Derivate (Rh(cod))2[5] und (Rh(cod))2[7] synthetisiert und im katalytischen Prozess eingesetzt werden. Im Verlauf dieser Experimente stellte sich heraus, dass die Reaktionen der Alkalimetallskorpionate Li2[5] und K2[7] mit (Rh(Cl)(cod))2 nicht zu den Zielverbindungen, sondern zur Zersetzung der Ligandgerüste führen. In beiden Fällen konnte das Abbauprodukt 22 isoliert werden (Abb. 3.8). Weitere Untersuchungen ergaben, dass 22 in der Lage ist, Phenylacetylen in guten Ausbeuten und regioselektiv (cis-transoid-verknüpftes Poly(phenylacetylen)) zu polymerisieren. 22 stellt somit ein gut zugängliches und leicht zu modifizierendes Katalysatorsystem dar, dessen Optimierung Thema zukünftiger Untersuchungen sein wird.
The respiratory chain is composed of protein complexes residing in the inner mitochondrial membrane of eukaryotes or in the cytoplasmic membrane of prokaryotes. This cellular energy converter transforms a redox potential stored in low potential substrates into an electrochemical potential across the respective membrane. Typical respiratory chains contain the complexes I, II, III and IV named according to their sequence in the respiratory chain reaction. Electrons of low potential substrates enter at complex I or II and are passed via complex III to complex IV where they are transferred to oxygen. The transport of electrons between the complexes is mediated by small electron shuttles like quinol or cytochrome c. Two different models describe their exchange either by (1) random collision of freely diffusible electron shuttles and membrane protein complexes or (2) arrangement of the complexes in supercomplexes enabling direct channeling of electron shuttles. In the Gram positive bacterium Corynebacterium glutamicum, the complex III to complex IV electron shuttle cytochrome c is not diffusible but a covalently bound part of the diheme cytochrome subunit QcrC of complex III. Therefore, the complexes III and IV have to form a supercomplex for electron transduction. The aim of this thesis was to purify and characterise this obligatory supercomplex III/IV of C. glutamicum. To gain sufficient biomass of C. glutamicum as starting material for purification, a phosphate buffered minimal medium was developed that enabled yield of total 120 g wet cell mass (38 g dry mass) in 12 L (6×2 L) shaking cultures. The determined conversion factor of glucose into biomass was 0.46 g/g indicating an intact respiratory chain. The yield was increased by bioreactor cultivation to ~690 g wet cell mass (~220 g dry mass) in ~10 L culture volume. A previously described homologous expression system was applied that produces the complex IV subunit CtaD with a fused Strep-tag II to facilitate purification. Affinity purifications using the Strep-tag II affinity to Strep-Tactin resin yielded a mixture of complexes and supercomplexes. Two supercomplex III/IV versions named supercomplex A and B and free complex IV were identified in this mixture by size exclusion chromatography, redox difference spectroscopy and two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis including blue native polyacrylamide electrophoresis. The here presented downscaled blue native polyacrylamide electrophoresis method with analysis times of ~1 h enabled efficient screening of factors influencing the stability of supercomplex III/IV. The screening resulted that the integrity of supercomplex III/IV is preserved by using neutral detergents at minimal detergent to protein ratios for solubilisation and low detergent concentrations for purification and storage slightly above the required critical micellar concentration. Furthermore, pH <=7.5 is required for stability of supercomplex III/IV. Large biomass yields enabled upscaling of supercomplex III/IV affinity purification. Application of the identified stability conditions resulted in affinity purified samples free of supercomplex B. The major component supercomplex A was efficiently separated from residual free complex IV by preparative size exclusion chromatography. Concentration of purified supercomplex A by ultracentrifugation resulted in integrity of the supercomplex for several days at 4 °C. Purified supercomplex A contains ten different previously described subunits. The heme content of supercomplex A relative to the protein mass is heme A: 6.0 μmol/g, heme B: 6.5 μmol/g, and heme C: 5.8 μmol/g determined by redox difference spectroscopy and biochemical protein quantification. This indicates an equimolar ratio of complex III and complex IV in supercomplex A. Supercomplex A has quinol oxidase activity that is inhibited by stigmatellin or sodium azide. The turnover number of transferred electrons per complex III monomer is 148 s−1 at 25° C. The homogeneity and stability of the prepared supercomplex A enabled the growth of threedimensional crystals of up to 0.1 mm in length. Their composition of supercomplex A was verified by redox difference spectroscopy of intact crystals and blue native polyacrylamide electrophoresis of dissolved crystals. The crystals diffracted X-rays corresponding to a resolution of ~10 Å. Electron microscopy of negative stained samples revealed the uniform shape of purified supercomplex A particles with dimensions of 22 × 9 nm in the view plane. Combined heme quantification, size determination, determined activity, symmetry considerations, and particle shape indicate that supercomplex A has a central dimer of complex III and two monomers of complex IV on opposite sides. This conformation is functionally reasonable because it provides each complex III monomer with one complex IV monomer as electron acceptor. Therefore, the stoichiometry of supercomplex A is most likely III2IV2. The sensitivity of supercomplex A to detergents indicated a role of phospholipids in its stability. Therefore, a method for phospholipid identification and quantification was developed that is suitable for detergent solubilised crude and purified membrane protein samples. The analysis combines separation of phospholipid classes according to their head group by normal phase high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection. Calibration with external standard allows quantification of phospholipid amount in the range of 0.25-12 μg. The method is verified by analysing the phospholipid content of the well characterised complex III of Saccharomyces cerevisiae. The reduction of its phospholipid content during its purification steps is monitored. The complex III sample purified to crystallisation quality contains the phospholipid content that was also observed in previously reported structures determined by X-ray crystallography. Purified stable supercomplex A from C. glutamicum revealed a large content of bound phospholipids. The main differences between intact supercomplex A and a mixture of potentially disintegrated smaller complexes is that intact supercomplex A has a doubled phosphatidic acid content and an increased phosphatidyl glycerol content. The importance of the small anionic phosphatidic acid for mediation of contacts between complexes in a supercomplex is discussed. The total phospholipid content of stable supercomplex A is sufficient for a complete belt surrounding the supercomplex in the membrane plane. This indicates that also all essential internal phospholipid binding positions are occupied and potentially stabilise supercomplex A.
The function of APOBEC3G in the innate immune response against the HIV infection of primary cells
(2008)
In the past few years the regulation of HIV-1 replication by cellular cofactors has been a major topic of ongoing research. These factors potentially represent new targets for antiviral therapy as resistance will be minimized. However this requires a better understanding of the interaction of HIV-1 with these cellular factors and the immune system. The virus infects the cells of the immune system, beginning with macrophages and dendritic cells as primary target cells during transmission. The cellular cofactor, APOBEC3G was found to be an antiviral factor in macrophages, dendritic cells and primary T cells. APOBEC3G is a cytidindeaminase which causes G->A hypermutations in the HIV-Genome. Another protein which has a strong inhibitory effect on the HIV infection is Interferon alpha (IFN-alpha), however the exact reason for this has not yet been elucidated. The bacterial protein, Lipopolysaccharide (LPS) also induces a strong antiviral state in macrophages. In micro-array analysis it was shown that APOBEC3G was upregulated after the stimulation with both IFN-alpha and LPS in macrophages. The goal of this work was to investigate the role of APOBEC3G in the innate immune response to APOBEC3G. For this, the expression of APOBEC3G was examined in HIV-1 target cells after stimulation with IFN-alpha or LPS and the effect of the protein on the viral infection was examined. In the first experiments it could be shown through real time quantitative PCR that APOBEC3G was overexpressed after the stimulation with IFN-alpha or LPS. This result could be shown in monocytes derived macrophages from different blood donors. It was also shown that the overexpression of APOBEC3G correlated directly with the concentration of IFN-alpha. Through mutational analysis it could be then shown that the overexpressed APOBEC3G protein was also functional in the cells. In order to show that this was the result of APOBEC3G, the protein was the regulated through lentiviral vectors. After transduction of cell lines with lentiviral vectors containing APOBEC3G, the infection was inhibited by up to 70%. The infection was restored after the addition of shRNAs against APOBEC3G. For the further experiments, CD34+ stem cells were used. The cells were transduced the day after thawing with lentiviral vectors containing an eGFP marker gene and either APOBEC3G or shRNAs against APOBEC3G. The CD34+ cells were then cultivated and differentiated to macrophages. The cells transduced with Lentiviral vectors containing APOBEC3G had a very high expression of APOBEC3G in the cells, however the cells transduced with shRNA against APOBEC3G did not show a reduction in the protein expression. The infectivity of the transduced CD34+ and CD34 derived macrophages was then examined. It was expected that the cells transduced with APOBEC3G would show a reduced HIV-1 infection, and the cells transduced with shRNA against APOBEC3G would show an increase in infection. After the transduction and differentiation the CD34+ cells from the 3 donors were stimulated and infected with wild type HIV-1 and Vif defective HIV-1 virus. Vif is a viral protein that can bind to APOBEC3G leading it to the proteasome for degradation. The cells from the first donor transduced with APOBEC3G, were very difficult to infect. In general the shRNA against APOBEC3G had little effect on the course of infection; presumably, the shRNA against APOBEC3G was not active in most of these cells. Only the cells from the first donor showed an increase in HIV infection after the transduction with the shRNAs against APOBEC3G, this was most notably the case in the cells stimulated with IFN-alpha, which usually show very little infection. This work showed that APOBEC3G plays an important role in the innate immune response to HIV-1. The effect of APOBEC3G is both cell type as well as donor dependent. Recently, an interesting study also showed that there is a correlation between the expression of APOBEC3G in HIV infected individuals and their progression to AIDS. A better understanding of the role that APOBEC3G plays in the innate immune response would help in the search of new therapeutic possibilities. This could be done by inhibiting the Vif-APOBEC3G interaction in order to increase the amount of active APOBEC3G in the cells or increasing the APOBEC3G concentration in the cells in some manner.
Ferrocenbasierte Polymere stellen interessante Verbindungen dar. Sie weisen herausragende optische und/oder elektronische Eigenschaften auf, die sich auf die redoxaktiven Eisenionen sowie die kooperativen Effekte entlang des Polymerstrangs zurückführen lassen. Befindet sich Ferrocen in der Hauptkette und sind die Ferrocenbausteine jeweils über ein einzelnes Atom miteinander verbunden, so ist dieses Brückenelement maßgebend für die substanzspezifischen Merkmale des Makromoleküls. Während bereits effiziente Syntheserouten bekannt sind, auf denen sich Atome der Gruppen 14 bis 16 in die Brücke einführen lassen, bereitet die Synthese borverbrückter Poly(ferrocenylene) große Schwierigkeiten. Gerade diese Stoffklasse wäre aber besonders attraktiv, da Boratome sowohl dreifach als auch vierfach koordiniert vorliegen können und über diese Eigenschaft das Ausmaß der elektronischen Wechselwirkungen entlang des Polymerrückgrats ebenso wie die Struktur des Makromoleküls gezielt beeinflussbar ist. Vor diesem Hintergrund galt es im Rahmen der vorliegenden Arbeit, chemisch stabile Poly(ferrocenylene) mit tetrakoordinierten anionischen Boratbrücken darzustellen. Als Grundlage diente die Adduktbildung zwischen lewissauren 1 ,1'-fc(BRz)zDerivaten und dem lewisbasischen doppelt deprotonierten Ferrocen 1,1 '-fcLi2 x 2/3 TMEDA. Frühere Untersuchungen an BMez-verbrückten di- (35) und tri nuklearen (36) Ferrocenkomplexen haben gezeigt, dass diese Verbindungen extrem empfindlich gegenüber Luft und Feuchtigkeit sind. Auch mussten cyclovoltammetrische Messungen an 35 bzw. 36 bei tiefen Temperaturen (-78 Oe) durchgeführt werden, um zu verhindern, dass es zu einer Zersetzung der Moleküle im Zuge der Fe{fI)Oxidation kam. Im Rahmen dieser Arbeit sind Systeme dargestellt worden, bei denen die labilen BMe2-Gruppen durch BPh2- bzw. Borafluorenylbrücken ersetzt sind. An mononuklearen Verbindungen konnten (Diphenylboryl)ferrocen 57, 1, 1'MBis(diphenylboryl) ferrocen 58 und 9-Ferrocenyl-9-borafluoren 61 isoliert und voIlständig charakterisiert werden (Abb. 53). ....
Ionenkanäle bilden therapeutische Schlüsselstellen für viele Erkrankungen und sind daher vor allem für die pharmakologische und medizinische Forschung von herausragender Bedeutung. Der Forschungsbedarf ist enorm und dementsprechend groß auch die Nachfrage nach elektrophysiologischen Systemen, die eine Analyse von Ionenkanälen und/oder Wirkstoffen im Hochdurchsatz erlauben. Derzeitige Hochdurchsatzsysteme basieren zumeist auf modifizierten Patch-Clamp-Verfahren, weisen aber im Vergleich zu manuellen Patch-Clamp-Systemen noch einige Nachteile auf. In der vorliegenden Arbeit wurde daher im Rahmen eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten BioChancePlus-Projektes eine alternative Methode, die Fakir-Methode, entwickelt und ihre Einsatzmöglichkeit in Hochdurchsatzsystemen evaluiert. Bei der Fakir-Methode werden Zellen in einem inhomogenen, elektrischen Wechselfeld mit Hilfe dielektrophoretischer Kräfte zu Metallnanoelektroden hin beschleunigt, aufgrund ihrer Bewegungsenergie von letzteren penetriert und dadurch elektrisch kontaktiert. Dies ermöglicht die anschließende, intrazelluläre Messung in physiologischer Lösung. Im Vergleich zur Patch-Clamp-Methode hat die Fakir-Methode die Vorteile, dass das Zytoplasma der Zelle erhalten bleibt und dass mit einer geringen Zelldichte gearbeitet werden kann. Auf der anderen Seite polarisiert die Elektrode schnell und die genaue, intrazelluläre Zusammensetzung während der Messung ist nicht bekannt. Für die Realisierung der Fakir-Methode im Experiment wurde eine Mikrofluidikkammer mit austauschbaren Metallmikro- und Metallnanoelektroden- Chips entwickelt, die die mikroskopische Beobachtung des Kontaktierungsprozesses ermöglichte. Die Charakterisierung der Elektroden erfolgte sowohl durch Potentialmessungen als auch mit Hilfe von Impedanzspektroskopie. Um die dielektrophoretische Attraktion von Zellen genauer steuern zu können, wurde zudem ein Amplitudenmodulator entwickelt. Zellen konnten sowohl einzeln, als auch in Gruppen kontaktiert werden. Intrazelluläre Potentialmessungen von HEK293-Zellen, die den blaulichtgesteuerten Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (ChR2) exprimierten, zeigten, dass mit Hilfe der Fakir-Methode von Membranproteinen verursachte Spannungsänderungen gemessen werden können. Beim Fakir-Modell auftretende Schwierigkeiten wurden analysiert und die Ergebnisse genutzt, um ein Konzept für eine hochreproduzierbare Herstellung von Nanoelektroden-Arrays unter Verwendung der 2-Photonenpolymerisations- Technolgie (2PP) zu entwerfen. Für den Einsatz als Biosensoren sind große Zellen besonders geeignet. Eine effektive Vergrößerung von Zellen kann durch die Multi-cell-Elektrofusion erreicht werden. Diese Art der Herstellung von Riesenzellen ist insbesondere deshalb so interessant, weil die Elektrofusion problemlos in ein automatisiertes Mikrofluidiksystem eingebunden werden kann. Neben HEK293-Zellen konnten nach Entwicklung geeigneter Protokolle für die Herstellung von Protoplasten auch Saccharomyces cerevisiae und Pichia pastoris zu Riesenzellen elektrofusioniert werden. Solche Riesenzellen wurden im Rahmen dieser Arbeit biophysikalisch charakterisiert. Neben Kapazitätsmessungen zeigten sowohl die Expression von YFP in den Membranen als auch die Verwendung von fluoresceinhaltiger Patch-Clamp- Pipettenlösung, dass es sich bei den Riesenzellen um einheitliche Kompartimente handelte und somit die gesamte Membranfläche für elektrophysiologische Experimente zur Verfügung stand. Vergleichende Patch-Clamp-Messungen von ChR2-exprimierenden Ursprungs- und Riesenzellen ergaben nicht nur, dass das überexprimierte Protein auch nach der Elektrofusion noch funktional war, sondern auch, dass die Expressionsdichte unverändert blieb. Damit bilden elektrofusionierte Riesenzellen weit über ihre Einsatzmöglichkeiten in Hochdurchsatzsystemen hinaus ein vielversprechendes Werkzeug, um zum Beispiel elektrogene Membranproteine mit geringer Stromamplitude nachzuweisen oder in der giant-inside-out- Konfiguration elektrophysiologische Messungen durchzuführen. Lipophile Anionen können eingesetzt werden, um die elektrischen Eigenschaften der Membranen zu verändern und die Zellstabiliät während des Elektromanipulationsprozesses zu verbessern. Daher wurde für vier verschiedene lipophile Anionen die Spannungsabhängigkeit der Erhöhung der spezifischen Membrankapazität in Patch- Clamp-Experimenten mit HEK293-Zellen analysiert.
Eine wichtige Klasse von Membranproteinen ist die der aktiven sekundären Transporter. Diese Proteine werden in allen Spezies gefunden und verwenden einen Gradienten von löslichen Substanzen, um den Transport von Substraten voran zu treiben. Dieser Transportprozess ist essentiell, um die chemische Zusammensetzung des Zytoplasmas, wie Kalium- oder Natriumkonzentration von der des umgebenden Milieus unterschiedlich zu halten. Die Konzentration von K+ und Na+ in der Zelle sind wichtig für ein konstantes Zellvolumen, für die pH-Homöostase, für die Erregbarkeit von Nervenzellen und füür die Akkumulierung von Zuckern und Aminosöuren über Kotransportsysteme. In Bakterien wie Escherichia coli wird mit der Oxidation von Substraten durch die Elektronentransportkette ein Protonengradient und gleichzeitig eine Potentialdifferenz erzeugt. Ein Beispiel für einen sekundären Transporter, der diese Potentialdifferenz ausnutzt ist der Na+/H+-Antiporter NhaA, einer der am besten untersuchten Antiporter aus E. coli (Hunte, Screpanti et al. 2005). Dieser Antiporter ist essentiell für die Fähigkeit von Bakterien im alkalischen pH-Bereich zu überleben. Auch bei Säugetieren, sind die Isoformen der humanen Natrium/Protonen-Antiporter SLC9A1-SLC9A8 (NHE1-8) unentbehrlich für eine Reihe physiologischer Prozesse. So wird über die Antiporter-Aktivität nicht nur der Säure-Base-Haushalt und das Verhältnis des Zellvolumens zur Menge an Elektrolyten reguliert, Antiporter spielen ebenso eine wichtige Rolle bei der Adhäsion, Migration und Proliferation der Zelle (Orlowski and Grinstein 2004). Anomalien in diesem Bereich sind charakteristisch für maligne Zellen. Die Rolle von NHE1 in der Entwicklung von Tumoren ist daher ein wichtiger Ansatzpunkt für die Entwicklung von Krebsmedikamenten. Im Herz ist NHE1 die dominierende Isoform und wird damit zu einem pharmakologisch wertvollen Zielprotein (Malo and Fliegel 2006). Struktur und Mechanismus der meisten Antiporter ist bis dato jedoch noch nicht bekannt. Neben den klassischen Methoden der Pharmaentwicklung wird die strukturbasierende Wirkstoffentwicklung immer wichtiger um effiziente Medikamente ohne Nebenwirkung zu herzustellen. Hierfür werden jedoch 3D-Strukturen von Proteinen, sowie genaue Kenntnisse von deren Mechanismus benötigt. Zieht man in Betracht, dass 70% aller bis jetzt entwickelten Medikamente als Ziel ein Membranprotein haben, wird die Notwendigkeit klar, eine möglichst große Anzahl von Membranproteinstrukturen verfgbar zu haben. Wie bereits erwähnt ist die Klasse der monovalenten Kation/Proton-Antiporter aufgrund ihrer vielfältigen Aufgaben, eine äußerst wichtige Zielgruppe für die strukturbasierende Wirkstoffentwicklung. Die große Anzahl an entschlüsselten Genomen eröffnet hier ein breites Forschungsfeld füür die Strukturbiologie. In dieser Arbeit wurden daher Techniken und Methoden aus Hochdurchsatz-orientierten Strukturgenomikprojekten übernommen, um eine große Anzahl von Zielproteinen in ausreichender Menge für die funktionelle Charakterisierung und für die Kristallisation zu produzieren. Als Zielorganismen wurden Salmonella typhimurium LT2, Helicobacter pylori 26695, Aquifex aeolicus VF5 und Pyrococcus furiosus ausgewählt. Die Grundlage dieser Entscheidung hierfür waren die humanpathogenen Eigenschaften der beiden zuerst genannten Organismen und die Hyperthermophilie der beiden letzteren. Dadurch konnten sowohl klinische Anwendungsmöglichkeiten, als auch die potentiell höhere Stabilität der hyperthermophilen Proteine genutzt werden. Als Proteinzielgruppe wurden die monovalenten Kation/Proton-Antiporter aus allen 4 Organismen ausgewählt. Des Weiteren wurden Antiporter zweier eukaryotischer Systeme, Saccharomyces cerevisiae und Homo sapiens in die Zielproteingruppe aufgenommen. In dieser Arbeit wurden 24 verschiedene monovalente Kation/Proton-Antiporter untersucht. Von diesen 24 Zielproteinen konnten 12 in Expressionsvektoren kloniert und produziert werden. Von diesen 12 Antiportern konnten die Zielproteine STM0039 (STNhaA), HP1552 (HPNhaA), STM1556 (NhaC) und PF2032 (NhaC) in einer für die Kristallisation ausreichenden Homogenität und Ausbeute gereinigt werden. Mit der Ausnahme von HP1552 ist bis heute in keiner Veröffentlichung über diese Zielproteine berichtet worden. Durch Komplementationsexperimente mit dem E. coli-Deletionsstamm EP432 konnten eine Reihe von Zielproteine (STM0039, HP1552, PF2032, Aq_2030, STM1806, STM1556) bezüglich ihrer Fähigkeiten zum Na+/H+-Antiport untersucht werden. Die Ziel-proteine STM0039, STM1556 und HP1552 konnten zum ersten Mal kloniert, produziert, gereinigt und anschlieáen in Liposomen rekonstitutiert werden.Weiterhin konnte durch SSM-Messung die pH-Regulation der Zielproteine STM0039 und HP1552 gezeigt werden. Im Gegensatz zu bisherigen Literaturangaben ist HP1552 im pH-Bereich von pH 6 bis 8,5 nicht konstitutiv aktiv, sondern erfährt eine ähnliche Aktivierung wie STM0039 oder ECNhaA. STM0039 lässt sich zudem durch 2-Aminoperimidin inhibieren. Für STM0039 konnten die ersten Proteinkristalle der inaktiven Konformation bei pH 4 erzeugt werden. Weiterhin wurde in dieser Arbeit ein gegen das Zielprotein STM0039 gerichtetes scFV-Antikörperfragment (F6scFv) eingehend charakterisiert. Durch die Ko-Kristallisation des Antikörperfragments F6scFv mit STM0039 konnten die ersten 3 dimensionalen Kristalle in einer aktiven Proteinkonformation bei pH 7,5 erzeugt werden. Neben den bereits verfeinerten Kristallisationsbedingungen für das Zielprotein STM0039 wurden erfolgreich erste Kristallisationsbedingungen für STM0086 und PF2032 gefunden. Es wurde eine Vielzahl von Produktions- und Reinigungsprotokollen füür die Zielproteine etabliert. Dadurch ist der Grundstein füür weitergehende Charakterisierungs- und Kristalli-sationsexperimente gelegt. Die in dieser Arbeit etablierte Kombination von Hochdurch-satzmethoden mit klassischen Vorgehensweisen zur Proteincharakterisierung lassen sich leicht auf anderen Membranproteinklassen bertragen und die Geschwindigkeit der ver-schiedenen Schritte bis zur Strukturlösung stark beschleunigen.
Ein früherer Vorschlag zum Reaktionsmechanismus der DFPase, der eine Wasseraktivierung durch den Rest H287 postulierte, mußte nach neuen experimentellen Daten verworfen werden. Daher lag zu Beginn der hier vorliegenden Arbeit kein Vorschlag für den Mechanismus der DFPase vor, der die experimentellen Daten erklären konnte. Für das längerfristige Ziel, die katalytischen Eigenschaften der DFPase gezielt verändern zu können, war es daher notwendig, zunächst den Mechanismus der Hydrolyse von Verbindungen wie DFP durch die DFPase näher zu untersuchen. Durch computergestützte Modellierung im aktiven Zentrum der DFPase (Docking) wurde die Bindung von DFP und anderen Substraten der DFPase genauer untersucht und mit vorhandenen experimentellen Daten verglichen. Diese Arbeiten führten auch zur theoretischen Untersuchung des Bindungsverhaltens von O,O-Dialkylphosphoroamidaten als potentiellen Inhibitoren der DFPase. Diese den Dialkylfluorophosphaten strukturell sehr ähnlichen Substanzen werden durch die DFPase nicht umgesetzt. Die Ergebnisse der Dockinguntersuchung führten schließlich zu der Synthese von drei Phosphoroamidaten unter der Untersuchung ihres Verhaltens als Inhibitoren der DFPase. DIe Charakterisierung erfolgte dabei über enzymkinetische Methoden sowie NMR-Experimente. Mit dem stärksten Inhibitor O,O-Dicyclopentylphosphoroamidat gelang die Kristallisation eines Komlexes mit der DFPase, der mit der Methode der Röntgenbeugung strukturell bestimmt werden konnte. Dieser Komplex belegt die Bindung der Phosphorylgruppe von Substraten an das katalytisch wirksame Calciumion im aktiven Zentrum der DFPase und zeigt die vorherrschenden Bindungskräfte zwischen Ligand und Protein auf. Eine Reihe von Mutanten der DFPase, bei denen gezielt die koordinierenden Aminosäuren des katalytischen Calciumions verändert wurden, ergänzte die bereits in früheren Arbeiten erzeugten Mutanten. Die katalyischen Eigenschaften dieser Mutanten und ihre Fähigkeit zur Metallbindung gestatten es, diese Metallbindungsstelle genauer zu beschreiben und lassen zusammen mit den Dockingexperimenten und der Struktur des Inhibitor-Enzymkomplexes vermuten, dass der calciumkoordinierende Aminosäurerest D229 als aktives Nukleophil im Reaktionsmechanismus der DFPase fungiert. Diese Vermutung ließ sich mit experimentellen Daten untermauern. Durch 18O-Isotopenmarkierung konnte gezeigt werden, dass ein Sauerstoffatom von D229 auf das entstehende Produkt übertragen wird. Hierdurch konnte die Existenz eines Phosphoenzymintermediats nachgewiesen werden. Des weiteren gelang es, Kristalle der DFPase zu züchten, die für Neutronenbeugungsexperimente geeignet waren. Im Rahmen dieser Experimente gelang die Aufnahme eines vollständigen Datensatzes und die Lösung der Neutronenbeugungsstruktur der DFPase in einer Auflösung von 2,2 Å. Diese Neutronenstruktur, in der Wasserstoffatome im Unterschied zu Röntgenstrukturen gut sichtbar sind, zeigt eindeutig, dass der Rest D229 wie erforderlich deprotoniert und dass das in der Bindungstasche an das Calciumion koordinierende Wassermolekül nicht als Hydroxid vorliegt. Damit ließ sich die direkte Aktivierung von Wasser durch das Metallion ausschließen. Neben wichtigen Informationen über die Bindungstasche der DFPase lieferte die Neutronenstruktur auch detaillierte Einblicke in das Wasserstoffbrückennetzwerk im zentralen, wassergefüllten Tunnel des Proteins. Über die Bestimmung des Wasserstoff/Deuteriumaustausches von Proteinrückgradamiden konnten weitere Aussagen über die Solvenszugänglichkeit von verschiedenen Proteinbereichen gemacht werden. Für die DFPase konnten strukturell und funktionell ähnliche Proteine identifiziert werden. Neben der Paraoxonase 1 waren dies das Calciumbindeprotein Regucalcin aus Agrobacterium thumefaciens sowie das Drug Resistance Protein 35 aus Staphylococcus aureus. Es konnte gezeigt werden, dass diese Proteine eine der katalytischen Calciumbindestelle der DFPase vergleichbare Metallbindestelle aufweisen und verschiedene Enzymaktivitäten dieser Proteine durch einen Mechanismus mit einem zu D229 analogen Nukleophil erklärt werden können. Ein direkter Vergleich zwischen der DFPase und der humanen Paraoxonase gelang durch Untersuchungen mit fluorogenen Organophosphaten als Substrate. Hierbei konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die DFPase in der Lage ist, Substrate mit einer P-O Bindung hydrolytisch zu spalten. Die unterschiedlich gute Umsetzung der verschiedenen Substrate durch die beiden Enzyme konnte auf der Grundlage der Proteinstrukturen erklärt werden, wobei für die Paraoxonase postuliert wurde, dass der calciumbindende Aminosäurerest D269 als zu D229 analoges Nukleophil wirkt. Abschließend gelang es, zusätzlich eine Zusammensetzung für eine Enzympräparation zu finden, die eine Gefriertrocknung der DFPase mit nur geringem Verlust an enzymatischer Aktivität erlaubt. Ein solches lagerstabiles Enzympulver ist ein notwendiger Schritt hin zu einer praktischen Anwendung der DFPase für die technische Dekontamination von hochtoxischen Nervenkampfstoffen.
IL-18 ist ein proinflammatorisches Zytokin mit tumorsuppressiven Eigenschaften. Daher befindet es sich derzeit in klinischen Studien der Phase II zur Behandlung immunsensitiver Tumore. Erste Ergebnisse dieser Studien sind vielversprechend, zumal IL-18 im Vergleich zu beispielsweise IL-1Beta und IL-12 eine hohe Verträglichkeit im Menschen aufweist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IL-18 nicht nur in soliden Tumoren, sondern auch in leukämischen Zellen wie AML-Zellen zur Expression eines Genmusters führt, welches hohes antileukämisches Potential aufweist. Diese Erkenntnis wurde mittels einer Microarray-Analyse gewonnen und in unabhängigen Versuchen überprüft. Zu den hochregulierten Genen gehören neben IFNY und Fas-Ligand die in der vorliegenden Arbeit untersuchten angiostatischen Chemokine IP10 und I-TAC sowie EBI3, die Beta-Kette des heterodimeren Zytokins IL-27. Da die Regulation des humanen EBI3-Gens bislang schlecht charakterisiert war, schloss sich eine Promotoranalyse des humanen EBI3-Promotors an. Diese brachte hervor, dass zwei NFKB-Bindungsstellen des Promotors für die Expression von EBI3 unter dem Einfluß von proinflammatorischen Zytokinen unabdingbar sind. Der humane Promotor wurde dabei in dieser Arbeit zum ersten Mal im humanen Kontext betrachtet. Weiterhin konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass IL-27 die Fähigkeit besitzt, humane myeloisch-leukämische Zellen zu aktivieren und Signale in Form von STAT1 und STAT3-Phosphorylierung sowie Hochregulation von SOCS3- Expression zu induzieren. Interessanterweise lassen sich die potentiell tumorsuppressiven Eigenschaften von IL-18 in Bezug auf KG1 Zellen durch eine Zugabe von Zink verstärken. So kommt es unter dem Einfluß von Zink zu einer Verstärkung der Expression von IFNY und EBI3. Dieser synergistische Effekt besitzt allgemeinere Gültigkeit, da die hier durchgeführten Experimente an humanen PBMC zeigten, dass eine Erhöhung des extrazellulären Zinkgehalts um den Faktor 2 im Vergleich zu dem physiologisch zugänglichen Zinkgehalt im Blutplasma zu einer Potenzierung der Freisetzung von IFNY durch die proinflammatorischen Zytokine IL-1Beta, IL-18 und IL-12 führt. Diese Ergebnisse waren besonders in Bezug auf IL-1Beta unerwartet und tragen ihren Anteil zum Verständnis der erhöhten Sensibilität von Leukozyten unter zinksupplementierten Bedingungen bei. Weitere Studien werden zeigen, ob eine Therapie mit IL-18 und möglicherweise auch in Kombination mit Zink eine alternative Option bei AML Patienten bietet, die besonders responsiv auf dieses Zytokin reagieren.
In den letzten 25 Jahren HIV-Forschung wurden einige Medikamente entwickelt, die in der Lage sind, den Ausbruch der Krankheit AIDS hinauszuzögern. Als Gemeinsamkeit dieser Arzneimittel ist die Interaktion mit regulatorischen Proteinen des HIV-Lebenscyclus zu erwähnen. In den letzten Jahren intensivierte sich jedoch auch die Forschung auf RNA als Angriffsort für Wirkstoffe, da sie in zahlreichen biochemischen Prozessen involviert ist. Aufgrund der vielfältigen Sekundär- und Tertiärstruktur der RNA bietet sie Bindungsstellen für Proteine, Antibiotika und weitere kleine Moleküle. Die Affinität zwischen RNA und dem Liganden, z.B. einem Peptid, basiert auf Wasserstoffbrücken, Coulombschen Kräften und Stapelwechselwirkungen. Das Konzept dieser Arbeit bestand darin, peptidische RNA-Liganden zu entwickeln, die u.a. aufgrund von Stacking mit den Nucleobasen der RNA eine starke Bindung eingehen. In Anbetracht der Tatsache, dass lediglich vier unterschiedliche natürliche aromatische Aminosäuren existieren, wurden Synthesewege entwickelt, um eine Vielfalt nicht-natürlicher Bausteine zu gewährleisten. In diesem Projekt wurden (L)-Methionin bzw. (L)-Glutaminsäure als chirale Ausgangsverbindungen, in Abhängigkeit von der benötigten Seitenkettenlänge (C2 für Met, C3 für Glu), verwendet. Der Schlüsselschritt in beiden Syntheserouten ist mit der Heck- bzw. Negishi- Kupplung eine Übergangsmetall-katalysierte C-C-Knüpfungsreaktion. Auf beiden Wegen konnten in zehn Stufen Fmoc-geschützte -Aminosäuren dargestellt werden. Diese Bausteine wurden zusammen mit natürlichen Aminosäuren zu peptidischen Bibliotheken aufgebaut, die entweder über kombinatorische oder parallele Festphasensynthese hergestellt wurden. Über homogene Assays wurden die besten RNA-Binder identifiziert. In ersten Experimenten wurden ausgewählte Peptide auf ihre Affinität zum TAR-Element von HIV-1 untersucht. Ein Farbstoff-markiertes Tat-Peptid wurde in dieser Anwendung vom Test- Liganden verdrängt. Alternativ konnte über die Fluoreszenz der Pyren-Peptide eine direkte Bestimmung von Bindungskonstanten erfolgen. Mit dem Tripeptid 172 (IC50 = 900 nM, Kd = 50 nM) konnte eine vielversprechende Verbindung identifiziert werden. In Untersuchungen mit HIV-1-infizierten HeLa-P4- (IC50 = 125 microM) bzw. MT-4-Zellen (EC50 = 46 microM) wurde die antivirale Eigenschaft von 172 bewiesen. Des Weiteren wurden u.a. für das Peptid 172 antimikrobielle Tests gegen B. subtilis (MIC = 22 microM) und S. aureus (MIC = 31 microM) durchgeführt.
Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Formulierungsentwicklung eines nanopartikulären Arzneistoffträgers für Zytostatika zur Gewinnung einer „Drug Targeting“ Zubereitung. Im Fokus der Arbeit stand dabei die Stabilität der unterschiedlichen Zubereitungen. Die untersuchten Partikel waren dabei auf Basis von humanem Serumalbumin. Mittels einer etablierten Desolvatationsmethode ließen sich reproduzierbar Nanopartikel im Größenbereich von 200 nm herstellen. Zur Partikelgrößenbestimmung bediente man sich sowohl der hotonenkorrelationsspektroskopie (PCS) als auch der Analytischen Ultrazentrifugation (AUZ). Bei der Untersuchung verschiedener HSA-Chargen, stellte sich heraus, dass das Ausgangsmaterial einen Einfluss auf die Partikelgröße besaß. Nichtsdestotrotz waren die Partikelgrößenschwankungen aufgrund von unterschiedlichen HSA-Chargen gering. Durch Einlagerung von Doxorubicin in die Partikelmatrix kam es zu einer wesentlichen Partikelvergrößerung, so dass die resultierten Partikel eine Größe von etwa 400 nm aufwiesen. Die Inkorporation des Arzneistoffs in die Partikelmatrix war reproduzierbar und stabil. Auch der Einsatz von Serumalbumin aus rekombinanter Quelle erwies sich als geeignet um Nanopartikel herstellen zu können. Allerdings waren unbeladene Partikel aus diesem Material wesentlich größer als Nanopartikel, die aus dem Standardmaterial hergestellt wurden. Doxorubicinbeladene Partikel zeigten wiederum eine vergleichbare Größe wie Partikel aus HSA. Allerdings war die Beladung der rHSA-Nanopartikel geringer als die der SA-Nanopartikel. Dies zeigte sich besonders bei der geringeren Quervernetzung von 40%. Als Fazit lässt sich sagen, dass prinzipiell eine Herstellung von sowohl Leerpartikeln als auch Doxorubicin-beladenen Partikeln möglich war. Die Biodegradierbarkeit von Nanopartikeln ist eine wichtige Voraussetzung für einen therapeutischen Einsatz kleinpartikulärer Strukturen, damit diese nicht im Körper kumulieren. Zudem könnte bei nicht abbaubaren Partikeln die Idee der intrazellulären Freigabe des eingebetteten Arzneistoffs aus der Partikelmatrix nicht verwirklicht werden. Vorversuche haben gezeigt, dass sich Nanopartikel auf Basis von HSA mit einer Reihe von Enzymen abbauen lassen. Versuche, Nanopartikel aus rHSA enzymatisch abzubauen, führten zu vergleichbaren Abbaukinetiken wie bei Partikeln aus HSA. Zu den eingesetzten nzymen zählten Proteinase K, Protease, Trypsin, Pankreatin, Pepsin und Cathepsin B, die mit Partikel aus rHSA mit den Quervernetzungen 40, 60, 80 und 100% inkubiert wurden. Alle Abbaukinetiken zeigten dabei, dass die Abbaugeschwindigkeit vom Grad der Quervernetzung abhängig war. 40% quervernetzte Nanopartikel wurden am schnellsten, 100% quervernetzte Partikel am langsamsten enzymatisch degradiert. Die Abbauversuche mit Cathepsin B bei zwei verschiedenen pH-Werten zeigten, dass die Wahl des richtigen pH-Werts entscheidend für einen effektiven Abbau ist, denn nur bei einem pH-Wert von 5,4 wurden die Nanopartikel von Cathepsin B abgebaut. Im Gegensatz dazu, wurden die Nanopartikel bei pH 6,4 kaum degradiert. Des Weiteren wurden Beladungsversuche von HSA-Nanopartikeln mit Cisplatin durchgeführt. Dabei wurden im ersten Schritt Adsorptionsversuche an gelöstes HSA durchgeführt, da viele Arzneistoffe eine hohe Plasmaeiweißbindung besitzen, wenn sie sich im Blutkreislauf des Menschen befinden. Diese Tatsache sollte bei der Herstellung von arzneistoffhaltigen Nanopartikel auf Basis von humanem Serumalbumin ausgenutzt werden. Vor dem eigentlichen Desolvatationsprozess wurden gelöstes HSA und Cisplatin bei unterschiedlichen pH-Werten und für unterschiedliche Zeitintervalle inkubiert, um eine Adsorption des Cisplatins an das Protein zu erreichen. Dadurch soll es bei der anschließenden Desolvatation zu einer effektiveren Inkorporation des Arzneistoffs kommen. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass bei sauren pH-Werten die Adsorption schwächer ausfällt als bei einem pH-Wert von 8,0. Zudem war die Adsorption umso ausgeprägter, je länger die Inkubation stattfand. Bei einem pH-Wert von 8,0 führten steigende Konzentrationen an eingesetztem Cisplatin bei konstanter Menge an HSA, zu höheren Konzentrationen an adsorbiertem Arzneistoff. Prozentual gesehen, führten aber zunehmende Mengen an eingesetztem Cisplatin zu geringeren Adsorptionsraten. Als Fazit muss aber festgehalten werden, dass Cisplatin eine geringe Tendenz zur Adsorption an gelöstes HSA zeigte. Die Herstellung von Cisplatin-beladenen HSA-Nanopartikeln zeigte, dass die Desolvatation bei pH 8,0 zu guten Ergebnissen führte. Zum einen wiesen die erhaltenen Nanopartikel gute physikochemische Eigenschaften mit nahezu quantitativen Partikelausbeuten auf, zum anderen besaßen die Partikel eine hohe Beladungseffizienz. Dabei galt, je höher die eingesetzte Menge an Cisplatin war, umso mehr Cisplatin wurde in die Matrix der Partikel eingelagert. Die Dauer der zuvor stattfindenden Adsorption spielte dabei eine eher untergeordnete Rolle im Vergleich zu den Adsorptionsversuchen. Eine Erklärung für diese Beobachtung könnte sein, dass die Zugabe des Desolvatationsmittels Ethanol, in welchem Cisplatin sehr schwer löslich ist, zu einer verstärkten Interaktion zwischen Arzneistoff und Protein führt und diese Komponenten zusammen ausfallen, nahezu unabhängig von der zuvor stattfindenden Adsorptionsphase. Um die Idee einer „Drug Targeting“ Zubereitung umsetzen zu können, wurden mit Hilfe von Polyethylenglykol-Ketten sowohl Leerpartikel als auch arzneistoffbeladene Nanopartikel auf ihrer Oberfläche mit monoklonalen Antikörpern modifiziert. Als Verum wurde dabei Trastuzumab verwendet, als Kontrolle diente ein IgG-Antikörper von Sigma, der kein Target besitzt. Sowohl eine adsorptive Bindung als auch die kovalente Kopplung der Antikörper an die Oberfläche der nanopartikulären Strukturen konnte reproduzierbar durchgeführt werden. Dabei spielte es keine Rolle, ob die Partikel mit Arzneistoff beladen waren oder nicht. Trastuzumab zeigte ein hohes Maß an adsorptiver Bindung an die Oberfläche von HSA-Nanopartikeln, die bei dem Kontollantikörper nicht festgestellt werden konnte. Von allen Partikelpräparationen wurden die Partikelgröße, die Größenverteilung, das Zetapotential und die Partikelausbeute bestimmt. Durch das Aufbringen neuer Oberflächenstrukturen, kam es zu keiner wesentlichen Veränderung der Partikelgröße bzw. der Oberflächenladung. Durch die zahlreichen Umsetzungsschritte, die für eine Oberflächenmodifikation nötig sind, kam es bei Nanopartikeln ohne Arzneistoffbeladung zu einem Verlust an Partikelausbeute. Da die Doxorubicin-beladenen Partikel viel größer waren als Leerpartikel, ließen sie sich einfacher und effektiver abzentrifugieren, was in einem geringeren Partikelausbeuteverlust sichbar wurde. Da die Gefriertrocknung zu den Standardmethoden zählt Zubereitungen eine gute Haltbarkeit zu verleihen, wurden eine Reihe von nanopartikulären Zubereitungen der Lyophilisation unterzogen und im Hinblick auf ihre Langzeitstabilität unter verschiedenen Lagerungsbedingungen getestet. Dabei stellte sich heraus, dass es mittels Gefriertrocknung möglich war aus HSA-Nanopartikelsuspensionen einfach und reproduzierbar Lyophilisate herzustellen. Als geeignete Hilfsstoffe kristallisierten sich dabei die Zucker Sucrose, Trehalose, der Zuckeralkohol Mannitol und Emulgatoren wie Tween® 80 und Pluronic® F68 heraus. Als ungeeignet zeichnete sich der Einsatz von L-Arginin und eines Natriumphosphat-Puffers pH 8,0 ab. Larginin führte schon vor dem Gefriertrocknen zu einer Partikelvergrößerung, die nach der Lyophilisation noch ausgeprägter war. Puffer auf Basis von Natriumsalzen führen zu einem starken pH-Shift während des Gefriertrocknungsprozesses. Dies führte beim Einsatz des Phosphat-Puffers pH 8,0 zu einem starken Partikelwachstum. Gefriertrocknungsprozesse mit unterschiedlichen Geräten haben gezeigt, dass der Zusatz von Sucrose bzw. Trehalose oder Mannitol ab einer Konzentration von 2% (m/V) zu guten physikochemischen Eigenschaften der rekonstituierten Proben führte. Hilfsstoffkombinationen, wie sie in der Literatur beschrieben sind, waren für die Stabilisierung der nanopartikulären Strukturen nicht nötig. Die Langzeitlagerungsstabilitätsdaten der gefriergetrockneten HSA-Nanopartikel über 13 Wochen bei unterschiedlichen Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsbedingungen zeigten eine Überlegenheit der Hilfsstoffe Sucrose und Trehalose im Vergleich zu Mannitol. Als geeignete Hilfsstoffkonzentration stellte sich hier ein 3%iger (m/V) Zusatz heraus. Versuchsansätze mit unterschiedlichen Gefriertrocknern und somit unterschiedlichen Prozessen zeigten, dass nicht nur die Auswahl der Hilfsstoffe, sondern auch die Bedingungen des Gefriertrocknungsprozesses Einfluss auf die Lagerungsstabilität hatten. Ein kontrollierter Prozess zeigte sich dabei gegenüber dem schnellen Einfrieren mittels Stickstoff als überlegen. Von Nanopartikelsuspensionen mit den Hilfsstoffen Trehalsoe, Sucrose und Mannitol wurden die Glasübergangstemperaturen bestimmt. Die Ergebnisse deckten sich im Wesentlichen mit den in der Literatur beschriebenen Daten, so dass schlussgefolgert werden kann, dass die HSA-Nanopartikel keinen wesentlichen Einfluß auf die Glasübergangstemperatrur hatten. Zusätzlich wurde die Restfeuchte der Lyophilisate direkt nach der Gefriertrocknung und nach 13 wöchiger Einlagerungszeit bestimmt. Die Proben wiesen direkt nach dem Prozess eine Restfeuchte von ungefähr 3% auf, durch Lagerung der Partikel bei erhöhter Luftfeuchtigkeit kam es zu einem Anstieg des Wassergehalts in den Proben. Mit den Hilfsstoffzusätzen Trehalose, Sucrose und Mannitol ließen sich auch Doxorubicin-beladene HSA-Nanopartikel gefriertrocknen. Dabei kam es nach der Rekonstitution dieser Partikel zu keinem Austreten des eingelagerten Arzneistoffs. Zusätzlich wurden oberflächenmodifizierte Partikel lyophilisiert. Dabei bestand die Modifikation zum einen aus Methoxypolyethylenglykol-Ketten. Zum anderen wurden über NHS-PEG-Mal Crosslinker kovalent monoklonale Antikörper auf die Oberfläche von HSANanopartikeln gebunden. Zusätzlich wurden auch HSA-NP in Suspension einer Untersuchung bezüglich Langzeitlagerungsstabilität unterworfen. Dabei wiesen auch HSA-Nanopartikel in Suspension bei verschiedenen Einlagerungsbedingungen eine hohe Stabilität auf. Partikel, die über einen Zeitraum von 210 Tagen eingelagert wurden, zeigten bei den Temperaturen 4°C, 20°C und 30°C im Hinblick auf Partikelgröße und Polydispersität kaum Veränderungen. Die Lagerung der Nanopartikel bei Minusgraden führte allerdings zu Mikropartikeln. Bei der Untersuchung der Partikelüberstände hinsichtlich herausgelöstem HSA zeigte sich, dass je höher die Lagerungstemperatur und je länger die Einlagerung war, umso mehr HSA löste sich aus der mittels Glutaraldehyd fixierten Matrix heraus. Bei den eingefrorenen Partikeln löste sich über die gesamte Lagerungszeit kein Protein aus den Nanopartikeln heraus. Zellkulturexperimente zeigten, dass im Gegensatz zu Kontrollzubereitungen, Nanopartikel, die an ihrer Oberfläche therapeutisch wirksame Antikörper trugen, spezifisch von Krebszellen aufgenommen wurden und im Zellinneren den eingebetteten Arzneistoff freisetzten. Daraus resultierte eine spezifische Toxizität dieser Zubereitungen gegenüber Tumorzellen. Dies ist ein erster Ansatz, um zeigen zu können, dass durch nanopartikuläre Trägersysteme die unerwünschten Nebenwirkungen der unspezifisch wirkenden Zytostatika reduziert werden können. In weiteren Versuchen, vor allem mit Hilfe von in vivo Versuchen muss gezeigt werden, dass das Partikelsystem stabil genug ist, ausreichend lang im Körper zirkulieren zu können. Nur so ist das Trägersystem in der Lage, sein Zielgewebe zu erreichen. Zudem müssen Tierversuche die in der Literatur beschriebene Anreicherung des Partikelsystems im Tumorgewebe verifizieren. Dies ist nur möglich, wenn die Nanopartikel in der Lage sind, das Gefäßsystem im Bereich des Tumorgewebes zu verlassen und anschließend in die Tumormasse einwandern können. Nur dann können die in den Zellkulturversuchen gezeigten Effekte greifen.
This work presents a contribution to the literature on methods in search of lowdimensional models that yield insight into the equilibrium and kinetic behavior of peptides and small proteins. A deep understanding of various methods for projecting the sampled configurations of molecular dynamics simulations to obtain a low-dimensional free energy landscape is acquired. Furthermore low-dimensional dynamic models for the conformational dynamics of biomolecules in reduced dimensionality are presented. As exemplary systems, mainly short alanine chains are studied. Due to their size they allow for performing long simulations. They are simple, yet nontrivial systems, as due to their flexibility they are rapidly interconverting conformers. Understanding these polypeptide chains in great detail is of considerable interest for getting insight in the process of protein folding. For example, K. Dill et al. conclude in their review [28] about the protein folding problem that "the once intractable Levinthal puzzle now seems to have a very simple answer: a protein can fold quickly and solve its large global optimization puzzle simply through piecewise solutions of smaller component puzzles".
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Lewis-Säure-katalysierte Friedel-Crafts-Alkylierungen unter Verwendung von Bismut(III)-Salzen als Katalysator untersucht. Bismut(III)-Salze haben gegenüber vielen anderen Metallsalzen den Vorteil, dass sie ungiftig, luftstabil und preiswert sind. In der Regel werden bei der Friedel-Crafts-Alkylierung überstöchiometrische Mengen einer Lewis-Säure wie AlCl3 benötigt und insbesondere Alkylchloride als Reaktionspartner eingesetzt, was eine hohe Menge unerwünschter Abfallprodukte zur Folge hat. Der Einsatz katalytischer Mengen Bi(OTf)3 und die Verwendung von Benzylalkoholen als elektrophile Reaktionspartner beheben diesen gravierenden Nachteil, da hier lediglich Wasser als Nebenprodukt gebildet wird. So konnte innerhalb der vorliegenden Arbeit zunächst eine effiziente Bi(OTf)3-katalysierte Alkylierungen von 1,3-Diketonen unter Verwendung von Benzyl- und Allylalkoholen als Elektrophile entwickelt werden. Mit lediglich 1 Mol-% Bi(OTf)3 konnten die gewünschten 3-alkylierten 1,3-Diketone in guten Ausbeuten isoliert werden. Weiterhin konnten neben Allyl- und Benzylalkoholen auch Styrene als Elektrophile genutzt werden. Unter Verwendung von 0.5 - 5 Mol-% Bi(OTf)3 konnten sowohl Arene, als auch 1,3-Dicarbonylverbindungen wie z. B. Acetylacetonat als nucleophile Reaktionspartner eingesetzt werden. Die entsprechenden 1,1-Diarylalkane und benzylierten 1,3-Dicarbonyle wurden dabei in hohen Ausbeuten erhalten. Um eine Anwendung für die zuvor entwickelten Methoden zu schaffen, wurde im weiteren Verlauf die Bismut(III)-katalysierte Benzylierung und Hydroalkylierung von 4-Hydroxycoumarinen untersucht. Die so erhaltenen Warfarinderivate sind von hohem medizinischem Nutzen, da diese Verbindungen als hoch potente Vitamin K Antagonisten eine breite Anwendung in der Thrombosevorbeugung oder als Rodentizide finden. Im zweiten Teil dieser Arbeit ging es um die Entwicklung neuer, chiraler Brønsted-Säure Katalysatoren. Die asymmetrische Brønsted-Säure Katalyse ist ein wachsendes Forschungsfeld und es konnten in den letzten Jahren viele enantioselektive Transformationen unter Verwendung chiraler BINOL-Phosphorsäurediester entwickelt werden. Bis vor kurzem waren BINOL-Phosphorsäurediester aufgrund ihres milden pH-Werts auf die Aktivierung von prochiralen Iminen beschränkt. Kürzlich wurden jedoch N-triflierte Phosphoramide als eine neue Klasse hoch potenter Brønsted-Säuren beschrieben. Während dieser Arbeit wurden zunächst verschiedene BINOL-basierte N-Triflylphosphoramide synthetisiert. Ausgehend von H8-BINOL konnte hier eine effiziente 3-Schritt Synthese dieser neuen Katalysatorklasse entwickelt werden. Dieser Syntheseweg verzichtet auf Schutzgruppen und ist daher in kürzerer Zeit und in besseren Ausbeuten durchführbar, als die zuvor beschrieben Synthesewege der ungesättigten BINOL-Phosphate oder N-Triflylphosphoramide. Strukturell wurden die auf diese Weise synthetisierten N-Triflylphosphoramide durch Röntgenstrukturanalyse, NMR und TXRF weiter untersucht und deren Aktivität gegenüber verschiedenen prochiralen Carbonylverbindungen überprüft. Hierbei wurde festgestellt, dass N-Triflylphosphoramide, im Vergleich zu BINOL-Phosphorsäurediestern, deutlich besser in der Lage sind, die asymmetrische Nazarov-Cyclisierung von Divinylketonen zu katalysieren. Die gewünschten Cyclopentenone konnten nach sehr kurzen Reaktionszeiten in hohen Ausbeuten und sehr guten Selektivitäten von bis zu 98% ee isoliert werden. Darauf aufbauend wurde die Brønsted-Säure-katalysierte Aktivierung von ungesättigten α-Ketoestern untersucht. Bei der Verwendung von N-Methylindol als Nucleophil konnten die 4-substituierten α-Ketoester unter Verwendung von 5 Mol-% eines 3,3’-silylierten-N-triflylphosphoramids in hohen Ausbeuten und sehr guten Enantioselektivitäten isoliert werden. Neben der erwarteten 1,4-Addition trat, abhängig von der gewählten Brønsted-Säure, eine Doppeladdition des Indols in 2-Position des α-Ketoesters auf. Das so erhaltene Bisindol zeigte hierbei völlig unerwartet atropisomeres Verhalten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Bildung dieses Bisindols vermutlich über eine carbokationische Spezies verläuft und es sich somit um eine enantioselektive Sn1-artige nucleophile Substitution handelt. Darauf aufbauend wurde eine N-Triflylphosphoramid-katalysierte Alkylierung von γ-Hydroxylactamen entwickelt. Hier kommt es Brønsted-Säure-katalysiert zu der Bildung eines N-Acyliminium-Ions, welches schließlich durch Indol als Nucleophil abgefangen wird. Auf diese Weise konnten verschieden substituierte γ-Hydroxylactame in die entsprechenden Indol-substituierten Analoga in hohen Enantioselektivitäten überführt werden. Dies ist das erste Beispiel einer hoch enantioselektiven, Brønsted-Säure-katalysierten Substitution von γ-Hydroxylactamen.
Untersuchung möglicher Wege zur Präparation von Nioboxynitriden mittels thermischer Kurzzeitprozesse
(2008)
In dieser Arbeit wurden mögliche Wege zur Präparation von Nioboxynitriden mittels thermischer Kurzzeitprozesse (Rapid Thermal Processing (RTP)) in dünnen Metallfilmen untersucht. Die dafür verwendeten Nb-Filme wurden mittels Magnetronsputtern auf ein thermisch oxidiertes Siliziumsubstrat (SiO2/Si-Substrat) aufgebracht. Die SiO2-Schicht hatte eine Dicke von 100 nm und soll die unerwünschte Reaktion zwischen Si und Nb vermeiden, welche zur Bildung von Niobsiliziden bei der RTP-Temperung führen kann. Um Nioboxynitride zu präparieren wurden Nb-Filme in mehreren Schritten mittels RTP behandelt. Durch die Variation der Ansatzreihenfolge (Oxidation und Nitridierung), der Reaktionsgase (O2, N2, NH3), der Reaktionstemperatur und der Reaktionszeit sowie der Schichtdicke der Proben wurde die Möglichkeit der Bildung von Nioboxynitriden untersucht. Es stellte sich heraus, dass die Bildung von Nioboxynitriden bei der Nitridierung der Nb2O5-Filme in Ammoniak erfolgt. Die Nb2O5-Filme wurden durch die Oxidation der as-deposited Nb-Filme im molekularem Sauerstoff bei 450 °C (nach 5 min Oxidation) bzw. bei 500 °C (nach 1 min Oxidation) hergestellt. Die gebildete Nb2O5-Phase wurde dem orthorhombischen beta-Nb2O5 zugeordnet. Die Oberfläche der Nb2O5-Filme zeigte Rissbildung sowie sichtbare Delamination bzw. Ablösung der Nb-Filme vom Substrat. Dies wird durch das Stressaufkommen im Film bei der direkten Oxidation des as-deposited Films im O2-Strom erklärt. Das Stressaufkommen wird durch eine starke Ausdehnung des Kristallgitters von Niob bei der Bildung des Nb2O5 sowie durch eine hohe Oxidationsrate des as-deposited Nb-Films in O2 hervorgerufen. Das Herabsetzen der Oxidationsgeschwindigkeit verringerte den Stress zwischen dem Metall und Niobpentoxid und verbesserte die Oberflächenqualität des Films nach der Temperung. Eine Herabsetzung der Reaktionsgeschwindigkeit wurde durch die Änderung der Ansatzreihenfolge erreicht. Die Oxidation der vorher nitridierten Nb-Filme führte zu einer langsameren Bildung des Nb2O5 im Vergleich zu den Filmen, die einer direkten Oxidation im O2-Strom ausgesetzt wurden. Dies wurde durch die Barrierefunktion der bei der Nitridierung gebildeten Niobnitride gegen den eindiffundierenden Sauerstoff hervorgerufen. Bei der Oxidation wurde die Diffusion des Sauerstoffes im nitridierten Film durch den Stickstoff gehemmt, was zu einer Abnahme der Oxidationsgeschwindigkeit und somit zu einer langsameren Bildung des Nb2O5 führte. Die Oxidation der zuvor nitridierten Filme führte zu wesentlich niedrigerem Stress zwischen dem Niob und den gebildeten Oxidphasen als zwischen dem Niob und dem Niobpentoxid bei der direkten Oxidation des Niobs in molekularem Sauerstoff. Die weitere Nitridierung der Filme, bei denen bei der Oxidation der bereits nitridierten Filme die Bildung nur einer Nb2O5-Phase erfolgte, führte zur Bildung von zwei Phasen: Nb4N3 und NbxNyOz. Die Zusammensetzung des gebildeten Nioboxynitrides entspricht am wahrscheinlichsten einer Zusammensetzung von NbN0.6O0.2. Sowohl die 200 als auch 500 nm-Filme zeigten nach der dreifachen Temperung eine hohe Porosität. Die hohe Porosität der Probe wurde durch Gasbildung und -diffusion (H2, H2O) im Innern des Films bei der Temperung des Nb2O5-Films in NH3 verursacht. Die EFTEM/EELS-Untersuchungen zeigten, dass sich beim dünnen 200 nm-Film zwei ausgeprägte Zonen (an der Oberfläche – Nb4N3, im Bulk bzw. am Interface – NbxNyOz) gebildet haben. Beim 500 nm-Film zeigte sich, dass die stickstoffhaltigen sowie stickstoff- und sauerstoffhaltigen Zonen, welche entsprechend Nb4N3 und NbxNyOz zugeordnet wurden, im ganzen Film ziemlich gleichmäßig verteilt sind. Ein Hinweis auf die Bildung eines Nioboxynitrides durch die Nitridierung der unvollständig oxidierten Nb-Filme im molekularen Stickstoff wurde nicht gefunden. Bei diesen Temperungen erfolgte die Bildung von unterschiedlichen Oxid- und Nitridphasen. Es wurde festgestellt, dass die Oxidation sowie die Nitridierung der Nb-Filme zu einem texturierten Wachstum der gebildeten Phasen führten. Die SiO2-Schicht auf dem (100)-orientierten Silizium wirkte sich auf das Schichtwachstum des auf das Silizium aufgebrachten Niobs aus und beeinflusste die Kristallstruktur der entstandenen Nb-Schicht und der bei den RTP-Temperungen gebildeten Phasen. Bei dünnen Schichten, wirkt sich dieser Effekt stärker aus, da der Einfluss des Substrates mit wachsender Schichtdicke abnimmt. Die bei der Oxidation gebildeten Nioboxide stellten eine starke Diffusionsbarriere für den bei der Nitridierung eindiffundierenden Stickstoff dar, was zur Aufstauung von Stickstoff in den an der Oberfläche liegenden Filmschichten führte. Die Analyse der erhaltenen SIMS-Daten zeigte, dass bei der Nitridierung der bereits oxidierten Filme die Diffusion des Stickstoffes zwei gleichzeitig ablaufende Prozesse verursacht. Von einer Seite verdrängt der eindiffundierende Stickstoff den Sauerstoff aus dem Film. Andererseits führt die Diffusion des Stickstoffes aufgrund des Schneepflug-Effekts zur Aufstauung des Sauerstoffes in den tiefliegenden Bereichen des Films. Gleichartige Diffusionsprozesse wurden bei der Oxidation der bereits nitridierten Filme beobachtet. Die Nioboxide, welche am Interfacebereich detektiert wurden, bildeten sich durch die Reaktion zwischen Niob und dem aus der SiO2-Schicht ausdiffundierenden Sauerstoff. Die Gegenwart der schon vorhandenen Nioboxide hemmte allerdings die Ausdiffusion des Sauerstoffes aus der SiO2-Schicht des Substrates im Vergleich zu den unoxidierten Filmen.
By translocating proteasomal degradation products into the endoplasmic reticulum (ER) for loading of major histocompatibility complex (MHC) class I molecules, the ATP binding cassette (ABC) transporter associated with antigen processing (TAP) plays a pivotal role in the adaptive immunity against infected or malignantly transformed cells. A key question regarding the transport mechanism is how the inter-domain communication and conformational dynamics of the TAP complex are connected during the peptide transport. To identify residues involved in this processes, we evolved a Trojan horse strategy in which a small artificial protease is inserted into antigenic epitopes. After binding, the TAP backbone in contact is cleaved, allowing the peptide sensor site to be mapped by mass spectrometry. Within this study, the peptide sensor and transmission interface have been identified. This region aligns with the cytosolic loop 1 (CL1) of Sav1866 and MsbA. Based on a number of experimental data and the homology to the bacterial ABC exporter Sav1866, we constructed a 3D structural model of the core TAP complex. According to this model, the CL1 and CL2 of TAP1 are extended cytosolic loops connecting the transmembrane helices (TMH) 2 and 3, and TMH4 and 5 respectively, and contact both nucleotide binding domains (NBDs) of the opposite subunit. In contrast to exporters, the cytosolic loop (named L-loop) of BtuCD importer is much shorter, and contacts only one NBD. The data confirm that the CL1 of TAP1 functions as signal transducer in ABC exporters, because it does not interfere with substrate binding but with substrate transport. The peptide contact site identified herein is restructured during the ATP hydrolysis cycle. Importantly, TAP showed a structural change trapped in the ATP hydrolysis transition state, because direct contact between peptide and CL1 is abolished. By cysteine scanning, the most conserved residues within CL1 were identified, which disrupted the tight coupling between peptide binding and transport. Together with Val-288, these residues are essential in sensing the bound peptide and inter-domain signal transmission. To characterize the molecular architecture of CL1, a convenient and minimally perturbing approach was used, which combined cysteine substitution in the CL1 region and determination of accessibility to thiol specific compounds with different properties. These studies revealed that the N-terminal region of CL1 has a good accessibility for hydrophilic (iodoacetamidofluorescein, IAF) and amphiphilic probes (BODIPY maleimide, BM), whereas the C-terminal region is accessible for hydrophobic probe (coumarin maleimide, CM). Kinetic studies of fluorescence labeling suggest that this region displayed a different accessibility to probes when the protein undergoes distinct conformations (e. g. nucleotide free state), thereby reflecting conformational transitions. Fluorescence labeling with BM induces a lost of peptide transport, whereas the peptide binding remains unaffected. These results indicate that covalent modifications of the CL1 residues influenced the inter-domain communication between transmembrane domain (TMD) and NBD. The X-loop is a recently discovered motif in the NBD of ABC exporters, which stays in close contact to the CLs. Moreover, because the X-loop precedes the ABC signature motif, it probably responds to ATP binding and hydrolysis and may transmit conformational changes to the CLs. By substitution of the highly conserved Glu-602 of TAP2 with residues that have different chemical properties, it was shown for the first time that the X-loop is a functional important element, which plays an key role in coupling substrate binding to downstream events in the transport cycle. We further verified domain swapping in the TAP complex by cysteine cross-linking. The TAP complex can be reversibly arrested either in a binding or translocation incompetent state by cross-linking of the X-loop to CL1 or CL2, respectively. These results resolve the structural arrangement of the transmission interface and point to different functions of the cytosolic loops in substrate recognition, signaling and transport.
In the present work, the photo-protection mechanisms in plants and purple bacteria were investigated experimentally at the molecular level. For this purpose, several spectroscopic methods were combined and applied to elucidate the function of carotenoids, pigments of the photosynthetic apparatus, in photo-protection. The experiments were focused on the mechanisms involved in quenching of singlet and triplet states of the electronically excited (bacterio)chlorophylls. This photosynthetic reaction events occur on an ultrafast time-scale. Measuring such short-lived events, and understanding the underlying principles, demand some of the most precise experiments and exact measurement technologies currently available. This implies certain requirements for the light source used: a suitable wavelength within the absorption band of the sample, sufficient power, and, most importantly, a pulse duration short compared to the studied reaction. Nowadays, we can achieve all this requirements using femtosecond-spectroscopic systems, which produce laser pulses shorter than 100 femtoseconds (fs). Transient absorption spectroscopy provides important information on molecular dynamics interrogating electronic transitions. The technique is based on photochemical generation of transient species with femtoseconds pump pulses and measuring transient absorption changes of the sample using a second, time delayed probe pulse which in this case is a spectrally broad white-light pulse.
Presentation of intracellular processed antigens by major histocompatibility (MHC) class I molecules to CD8+ cytotoxic T lymphocytes is mediated by the macromolecular peptide loading complex (PLC). In particular accessory proteins, including the transporter associated with antigen processing (TAP) and tapasin, play a pivotal role in the MHC class I mediated antigen presentation pathway. TAP belongs to the ATP-binding cassette (ABC) superfamily and consists of TAP1 (ABCB2) and TAP2 (ABCB3), each of which possesses a transmembrane and a nucleotide-binding domain (NBD). The ER-resident glycoprotein tapasin promotes the optimal folding and assembly of MHC-peptide complexes, and independently stabilizes the steady state expression level of TAP. In the present thesis recombinant Fv, scFv and Fab antibody fragments to human TAP from a hybridoma cell line expressing the TAP1-specific monoclonal antibody mAb148.3, were generated. The epitope of the mAb148.3 was mapped to the very last five C-terminal amino acid residues of TAP1 on solid-supported peptide arrays. The recombinant antibody fragments were heterologously expressed in E. coli and insect cells, and purified to homogeneity by affinity chromatography. The monoclonal and recombinant antibodies display nanomolar affinity to the last five C-terminal amino acid residues of TAP1 as demonstrated by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and surface plasmon resonance (SPR). Surprisingly, the recombinant antibody fragments confer thermal stability to the heterodimeric TAP complex in insect cells when incubated at elevated temperature. At the same time, TAP is arrested in a peptide transport incompetent conformation, although ATP and peptide binding to TAP are not affected. Furthermore, the recombinant antibodies were successfully used in the purification of the PLC from a human B-lymphoblastoid cell line and a novel factor, protein disulfide isomerase (PDI), was identified by matrix assisted laser desorption/ionisation-mass spectrometry (MALDI-MS). In the second part of this thesis the tapasin-MHC class I interaction was investigated. It is for this reason, that an in vitro assay had been established for direct measuring tapasin-MHC class I interactions. First, soluble single chain MHC class I molecules were engineered, choosing two MHC class I alleles: HLA-B4402 representing a highly tapasin-dependent allele and with HLA-B4405, a tapasin-independent allele was chosen. Tapasin as well as the two single chain MHC class I constructs, scB4402-b2m and scB4405-b2m, were expressed in insect cells and purified from insect cell supernatants by affinity chromatography. In contrast to the HLA-B4405 allele, which was expressed and secreted at moderate yield, the HLA-B4402 allele was expressed and trapped inside the insect cells instead of secreted into the medium. Peptide-binding and anisotropy measurements with fluorescein-labeled peptides verified the functionality of the scB4405-b2m. For further investigation of the tapasin-MHC class I interaction an in vitro assay was established using surface plasmon resonance spectroscopy. Due to the transient nature of the interaction including the decreased affinity of both interaction partners, kinetic data acquisition was difficult to evaluate. Furthermore, interaction of the scB4405-b2m with the sensor surface itself contributed to the measured interaction. Additionally, to investigate tapasin editing function, tapasin as well as the scB4405-b2m-peptide complex were tethered on fluid chelator lipid bilayers and monitored by reflectance interference (RIf) and total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). Stable immobilization of scB4405-b2m-peptide complex as well as of tapasin was observed, unfortunately no changes in peptide dissociation kinetics monitored in the TIRFS channel were detected. Presumably, the tapasin-independent HLA-B4405 already loaded with a high affinity peptide is not influenced by the peptide-editing function of tapasin. Here, for the first time an in vitro assay was established for direct probing interactions within the various proteins of the PLC.
Eine in vivo Modifizierung von Blutstammzellen wäre für eine Reihe gentherapeutischer Therapieansätze vorteilhaft. Dies würde voraussetzen, dass retrovirale Vektoren gezielt auf Blutstammzellen ausgerichtet werden können. Für dieses sogenannte Zelltargeting bietet sich das vom Milznekrose-Virus von Vögeln (SNV) abgeleitete Vektorsystem an, bei dem die Rezeptorbindungsdomäne des Env-Proteins modifiziert werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein SNV-basierter retroviraler Zelltargeting-Vektor entwickelt werden, der einen selektiven Gentransfer in die primären humanen CD34-positiven hämatopoetischen Zellen ermöglicht. Zur weitergehenden Charakterisierung des SNV-Vektorsystems sollte geklärt werden, ob das Env-Protein des SNV ein mit anderen gamma-retroviralen Env-Proteinen vergleichbares R-Peptid aufweist, dessen mögliche Rolle bei viralem Zelleintritt ebenfalls untersucht werden sollte. Um eine Zielzell-Spezifität des SNV-Vektors zu erreichen, wurde die gesamte SU-Domäne des SNV-Env-Proteins mit einem einkettigen Antikörperfragment (scFv) ersetzt, das gegen das CD34 Molekül gerichtet ist,. Mit diesem modifizierten Env gelang es, [(antiCD34-TM)SNV]-Vektorpartikel herzustellen, die spezifisch CD34-positive Zellen transduzierten. Essentiell für die Erzeugung solcher Vektoren war die Etablierung einer stabilen Verpackungszelllinie, die Vektorpartikel mit einem Titer von 2x105 i.E./ml produzierte. In Transduktionsexperimenten mit verschiedenen Zelllinien wurde gezeigt, dass [(antiCD34-TM)SNV]-Vektoren eine deutliche Präferenz für CD34+-Zellen und nicht für CD34--Zellen besitzen, wobei der Unterschied in der Transduktionseffizienz zwischen CD34-positiven und –negativen Zellen um den Faktor 100 lag. [(antiCD34-TM)SNV]-Vektoren waren in der Lage, den Reportergentransfer auch in primäre humane Stammzellen zu bewirken. Hierzu wurde ein Transduktionsprotokoll so optimiert, dass die aus dem Nabelschnurblut isolierten CD34+-Zellen transduziert werden konnten. Der für diese Zielzellen bestimmte Vektortiter betrug bis zu 2x106 i.E./ml. In einem Gemisch von primären CD34+- und CD34--Zellen konnte der Vektor zwischen dem Target- und Nontarget-Zellen unterscheiden. Somit wurde zum ersten Mal nicht nur Spezifität, sondern auch Selektivität des SNV-Vektorsystems demonstriert. Dieses Ergebnis ist für eine Weiterentwicklung des Vektors für die in vivo Anwendung in Rahmen einer Gentherapie eine wichtige Voraussetzungen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Fusionsvorgang bei Virus-Eintritt näher untersucht. Anlass dafür war die experimentelle Beobachtung, dass das Env-Protein des SNV bei der Virusknospung von einer viralen Protease innerhalb der zytoplasmatischen Domäne proteolytisch gespalten wird. Ein Sequenz-Vergleich des SNV TM-Proteins mit dem MLV TM-Protein ergab Hinweise darauf, dass es sich um die Abspaltung des sogenannten R-Peptides analog zu MLV handeln könnte. Die Expression von SNV-Env- Mutanten mit einem entsprechend verkürzten C-Tail (Env delta R) führte zur Synzytien-Bildung. Die bildung hochfusogener Oberflächenhüllproteine durch die Abspaltung des R-Peptids konnte auch für andere gamma-Retroviren gezeigt werden. Die Synzytienbildung konnte quantitativ unter den Env delta R-Varianten verschiedener gamma-Retroviren in einem etablierten Fusionsassay verglichen werden. Das Env delta R des endogenen Retrovirus des Schweins (PERV) des Typs A erwies sich als potentestes Fusionsagens. Als Folge der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurde postuliert, dass die Abspaltung des R-Peptides ein allgemeiner Mechanismus bei der Partikelreifung der gamma-Retroviren ist und eine fusionsregulierende Rolle besitzt. Eine Weiterentwicklung fusionsaktiver Env-Varianten als mögliche therapeutische Gene für eine Tumor-Gentherapie ist somit diskutierbar.
Hypoxic pulmonary vasoconstriction (HPV) redistributes pulmonary blood flow from areas of low oxygen partial pressure to areas of normal or relativity high oxygen availability, thus optimising the matching of perfusion to ventilation and preventing arterial hypoxemia. Generalised alveolar hypoxia results in a sustained increase in pulmonary artery pressure which in turn leads to structural changes in the walls of the pulmonary vasculature (pulmonary vascular remodelling). Recent findings have indicated a role for cytochrome P450 (CYP) epoxygenase-derived epoxyeicosatrienoic acids (EETs) in hypoxia-induced pulmonary vasoconstriction. Given that the intracellular concentration of EETs is determined by the soluble epoxide hydrolase (sEH), which metabolises EETs to their less active dihydroxyeicosatrienoic acids (DHETs), we assessed the influence of the sEH and EETs on pulmonary artery pressure, acute and chronic HPV, and pulmonary vascular remodelling in the mouse lung. In isolated lungs from wild-type mice, acute HPV was significantly increased by sEH inhibition, an effect abolished by pre-treatment with CYP epoxygenase inhibitors and the EET antagonist 14,15-EEZE. The acute hypoxia-induced vasoconstriction and EET production were greater in lungs from sEH-/- mice than from wild-type mice and sEH inhibition had no further effect on HPV in lungs from the former animals, while MSPPOH (CYP epoxygenase inhibitor) and 14,15-EEZE decreased the response. Exogenous application of 11,12-EET increased pulmonary artery pressure in a concentration-dependent manner and enhanced acute HPV in wild-type lungs, while 14,15-EET and 11,12-DHET were without significant effect on pulmonary artery pressure. 5-HT2A receptor antagonism or Rho kinase inhibition shifted the EET concentration-response curve to the right and abrogated the EET- and sEH inhibition-induced potentiation of acute hypoxic vasoconstriction. In lungs from wild-type and sEH-/- mice, hypoxic preconditioning (hypoxic ventilation for 10 minutes) enhanced the 5-HT response. 1-Adamantyl-3-cyclohexylurea (ACU), a sEH inhibitor, further amplified the hypoxia-induced 5-HT-hypersensitivity in wild-type mice. However, after hypoxic preconditioning, the sEH-/- lungs displayed a striking leftward shift in the 5-HT response. 11,12-EET can activate TRPC6 channels in endothelial cells by eliciting its translocation to the plasma membrane, more specifically to membrane domains enriched with the caveolae marker caveolin-1. This effect was also observed in rat pulmonary artery smooth muscle cells overexpressing the channel. Exposure of the latter cells to acute hypoxia also stimulated the intracellular translocation of TRPC6 to caveolae, an effect that was sensitive to the EET antagonist. The EET-induced translocation of TRPC6 channels was prevented by a 5-HT2A receptor antagonist but not by a Rho kinase inhibitor. Moreover, while acute hypoxia and 11,12-EET increased pulmonary pressure in lungs from TRPC6+/- mice, lungs from TRPC6-/- mice did not respond to either stimuli. These results indicate that the sEH and CYP-derived EETs are involved in acute HPV and that EET-induced pulmonary contraction under normoxic and hypoxic conditions involves a TRPC6 channel, a 5-HT2A receptor-dependent pathway and Rho kinase activation. In the second part of the study the role of the sEH in the development of pulmonary hypertension and vascular remodelling induced in mice by exposure to hypoxia (10% O2) for 21 days was analysed. In wild-type mice, chronic hypoxia decreased the pulmonary expression/activity of the sEH, induced right heart hypertrophy and erythropoiesis, and increased the number of partially and fully muscularised pulmonary resistance arteries (by 3-fold). Moreover, in HEK 293 cells, hypoxia (1% O2 up to 24 h) decreased sEH promoter activity by 50%. In isolated lungs, pre-exposure to chronic hypoxia significantly increased baseline perfusion pressures and potentiated the acute HPV. While an sEH inhibitor, ACU, potentiated acute HPV in lungs from mice maintained in normoxic conditions, it had no effect on HPV in lungs from mice exposed to hypoxia. The EET antagonist, 14,15-EEZE, abolished the sEH inhibitor-dependent increase in acute HPV in normoxic lungs and decreased HPV in chronic hypoxic lungs. Hypoxia-induced right heart hypertrophy and erythropoiesis were more pronounced in sEH-/- than in wild-type mice. Under normoxic and hypoxic conditions the muscularisation of resistance pulmonary arteries was greater in lungs from sEH-/- mice than in lungs from wild-type mice. sEH-/- mice also displayed an enhanced acute HPV, compared to that observed in wild-type mice and chronic exposure to hypoxia did not further potentiate acute HPV. However, in the presence of 14,15-EEZE responses returned to levels observed in normoxic lungs from wild-type animals. Furthermore, immunohistochemistry demonstrated an extensive expression of the sEH in the medial wall of pulmonary arteries from human donor lungs. Whereas sEH expression was not detectable in samples from pulmonary hypertension patients, indicating that the sEH is involved in hypoxia-induced pulmonary vascular remodelling and hypoxic pulmonary vasoconstriction. Taken together, the results presented in this thesis indicate that the expression/activity of the sEH is an important determinant of the magnitude of acute and chronic hypoxia-induced pulmonary vasoconstriction and pulmonary vascular remodelling by inactivating vasoconstrictor CYP-derived EETs. As sEH inhibitors are currently being developed for the treatment of human systemic hypertension, it should be noted that these compounds may even promote the development of pulmonary hypertension.
Der Cytochrom bc1 Komplex spielt in der mitochondrialen Atmungskette eine zentrale Rolle, er ist am Aufbau des Protonengradienten über die innere Mitochondrien-Membran beteiligt. Die Funktionsweise dieses integralen Membranproteinkomplexes ist trotz mehrerer gelöster Strukturen noch nicht vollständig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Komplex aus P. denitrificans untersucht und dabei mehrere Beiträge zu Struktur und Funktion dieses bakteriellen Modellsystems geleistet, wie z.B. seinem Oligomerenzustand in Detergenz-gelöster Form und zur Frage der Monomer:Monomer-Interaktion. Zur Strukturaufklärung des Cytochrom bc1 Komplexes aus P. denitrificans wurde ein chimärer Komplex zur Kristallisation eingesetzt, der in der Lage ist ein, Antikörper-Fragment zu binden, das bereits mit Erfolg zur Strukturbestimmung des Hefe-Komplexes verwendet wurde. Diese Experimente führten vermutlich wegen mangelnder Proteinstabilität nicht zum gewünschten Ergebnis. Eine zweite Mutante, bei der eine stark saure Domäne des Cyt c1 deletiert vorliegt (Δac Cytochrom bc1 Komplex), konnte jedoch erfolgreich kristallisiert und Diffraktionsmuster bis etwa 3,5 Ǻ erhalten werden. Die Kristalle weisen derzeit noch Inhomogenitäten, wahrscheinlich durch den Einfrierprozess, auf und werden gegenwärtig weiter optimiert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der lange diskutierte Oligomerenzustand des Cytochrom bc1 Komplexes aus P. denitrificans in solubilisiertem Zustand als Tetramer, beziehungsweise unter Einbeziehung struktureller und mechanistischer Daten und Überlegungen als Dimer eines Dimers, geklärt werden. Dies erfolgte durch eine für Membranproteine neue Form der Massenspektrometrie, die als LILBID-MS bezeichnet wird. Diese Daten konnten die bisher vorläufigen Beobachtungen aus BN-Gelelektrophorese und Gelfiltrationsversuchen eindeutig und unabhängig bestätigen. Darüber hinaus sollten noch Beiträge zur funktionellen Monomer:Monomer-Wechselwirkung geliefert werden. Hierfür wurde zunächst ein P. denitrificans Stamm erzeugt, der stabil zwei unterschiedliche fbc-Operons trägt und exprimiert: eine Wildtyp-Version mit Strep-tag und eine mit einem His-tag und einer inaktivierenden Mutation im Cyt b. Aus diesem Stamm sollte durch eine Tandem-Aufreinigung ein gemischter Cytochrom bc1 Komplex isoliert werden. Dies gelang nicht, wie in Westernblots, turnover und pre-steady-state Aktivitätsuntersuchungen gezeigt wurde, da sich der Komplex als Tetramer erwies und damit eine eindeutige Aufreinigung nicht möglich war. Die Lösung für dieses Problem liegt im Δac Cytochrom bc1 Komplex, der wie LILBID-MS Ergebnisse zeigten, lediglich als Dimer vorliegt; dazu müssen zukünftig die Affinitäts-tags und die inaktivierende Mutation auf diesen Komplex übertragen werden. Der zweite Beitrag zur Funktionsuntersuchung wurde anhand von Mutanten konservierter saurer Aminosäuren und von Tyrosinen im und um das QP-Zentrum geliefert, mit anschließenden Aktivitätsuntersuchungen, Inhibitor-Bindungstudien mit Stigmatellin und elektrochemisch-induzierten Redox-FTIR-Differenzspektren. Die Mutanten E295Q, E81Q und Y297Q zeigten eine verringerte Sensitivität für Stigmatellin. Die FTIR-Differenzspektren belegen, dass die Mutation der Positionen E295 und D278 die Signale für protonierte Seitengruppen verschieben. Die Mutation der Seitengruppen Y302, Y297, E81 und E295 beeinflussen direkt das oxidierte Chinon und das Proteinrückgrat. Die Bedeutung der lange diskutierten Seitengruppe E295 ließ sich als direkter Interaktionspartner mit dem Hydrochinon bestätigen. Die wichtige Rolle der Seitengruppen in Positionen E295 und Y302 konnte bestätigt werden. Darüber hinaus wurden die Seitengruppen D278 und E81 als wesentliche Wechselwirkungspartner für die Hydrochinon-Oxidation identifiziert. Die Seitengruppen des QP-Zentrums unterliegen durch das Wasserstoffbrückennetzwerk starken Wechselwirkungen, wodurch die Bindungstasche eine gewisse Toleranz gegenüber Veränderungen zeigt.
Three-dimensional structure of the glycine-betaine transporter BetP by cryo electron crystallography
(2008)
The soil bacterium Corynebacterium glutamicum has five secondary transporters for compatible solutes allowing it to cope with osmotic stress. The most abundant of them, the transporter BetP, performs a high affinity uptake of glycine-betain when encountering hyperosmotic stress. BetP belongs to the betaine/carnitine/choline/transporter (BCCT) family, and is predicted to have twelve transmembrane helices with both termini facing the cytoplasm. The goal of this thesis is to facilitate understanding of BetP function by determining a three dimensional (3D) model of its structure. Two-dimensional (2D) crystallization of wild-type (WT) BetP has been successfully performed by reconstitution into a mixture of E. coli lipids and bovine cardiolipin, which resulted in vesicular crystals diffracting to 7.5 Å resolution (Ziegler, Morbach et al. 2004). Diffraction patterns of these crystals however showed unfocused spots, generally due to high mosaicity. Better results were obtained by using the constitutively active mutant BetPdeltaC45 in which the first 45 amino acids of the positively charged C-terminus were removed. BetPdeltaC45 crystals obtained under the same conditions for BetP WT were concluded to be pseudo crystals, based on the inconsistence of symmetry. These crystals had BetPdeltaC45 molecules randomly up/downwards inserted into membrane crystals, and cannot be used for structure determination, even though they diffracted up to 7 Å. The problem of pseudo crystal formation could be solved by changing the lipids used for 2D crystallization to a native lipid extract from C. glutamicum cells. This change of lipids improved the crystals to well-ordered packing with exclusive p121_b symmetry. To understand the role of lipids in crystal packing and order, lipids were extracted at different stages during crystallization, and identified by using multiple precursor ion scanning mass spectrometry. The results show that phosphatidyl glycerol (PG) 16:0-18:1 is the most dominant lipid species in C. glutamicum membranes, and that BetP has a preference for the fatty acid moieties 16:0-18:1. Crystallization with synthetic PG 16:0-18:1 proved that an excess of this lipid prevents pseudo crystal formation, but these crystals did not reach the quality as previously achieved by using the C. glutamicum lipids. Apart from the effect of lipids in crystallinity, the concentration and type of salts influenced crystal growth and morphology. High salt conditions (>400 mM LiCl or KCl) yielded tubular crystals, whereas low salt conditions (<300 mM LiCl, NaCl or KCl) led to formation of up to 10 µm large sheet-like crystals. The intermediate concentration gave a mixture of sheet-like and tubular crystals. In terms of resolution, sheets diffracted better than tubes. The sheet-like crystals used for 3D map reconstruction were obtained from a dialysis buffer containing 200 mM NaCl combined with using C. glutamicum lipids. Electron microscopic images were taken from frozen-hydrated crystals using a helium-cooled JEOL 300 SFF microscope or a liquid nitrogen-cooled FEI Tecnai G2 microscope at 300 kV, which allowed optimal data collection and minimized radiation damage to the sample. More than 1000 images of tilt angles up to 50° were taken and evaluated using optical diffraction of a laser beam. The best 200 images were processed with the MRC image processing software package, and 79 images from different tilt angles were merged to the final data set used for calculation of a 3D map at a planar resolution of 8 Å. The structure shows BetPdeltaC45 as a trimer with each monomer consisting of 12 transmembrane alpha-helices. Protein termini and loop regions could not be determined due to the limited resolution of the map. Six of the twelve helices line a central cavity forming a potential substrate-binding chamber. Each monomer shows a central cavity in different sizes and shapes. Thus, the constitutively active BetPdeltaC45 thus forms an unusual asymmetric homotrimer. BetP most likely reflects three different conformational states of secondary transporters: the cytoplasmically open (C), the occluded (O), and the periplasmically open (P) states. The C and O states are similar to BetP WT projection structure, while the P state is discrepant and highly flexible due to the shape and size of the central cavity as well as the lowest intensity of the density. The observation of the P state corresponds well to the constitutively active property of BetPdeltaC45. For the high resolution structure of the C and O states are available, this work presents the first structural information of the P state of a secondary transporter.
Ideale universelle Nucleosid-Analoga könnten im Hinblick auf therapeutische Oligonucleotide einen Fortschritt in der Entwicklung darstellen. Zudem bieten solche Nucleosidanaloga auch aus synthetischer Sicht Vorteile: Durch ihre Struktur sind chemische Modifikationen – wie beispielsweise Modifizierungen an der Zuckereinheit – leichter zugänglich, als bei den natürlichen Nucleosiden. Ein Ziel der vorliegenden Doktorarbeit bestand darin, bereits bekannte universelle Nucleosidbausteine solchermaßen zu modifizieren, das bei ihrer Anwendung in Oligonucleotiden ihre Vorteile besser zum Tragen kommen. Vor diesem Hintergrund besaßen vor allem protonierbare 2´-O-Modifikationsmotive eine besondere Relevanz. Im Vergleich zur bereits bekannten 2´-O-Aminoethyl-Modifikation des 4,6-Difluorbenzimidazol-Nucleosidbausteins konnte eine um eine Methyleneinheit längere 2´-O-Aminopropylfunktion des Nucleosids hergestellt werden. Dabei wurde eine Syntheseroute eingeschlagen, mit der diese Modifikation in hohen Ausbeuten und hoher Reinheit aus dem 3´-,5´-Markiewicz-geschützten Nucleosid eingeführt werden konnte. Grundlage dieser Modifizierungsmethode ist eine Michael-Addition von Acrylnitril an die 2´-OH-Funktion unter basischen Bedingungen. Damit konnte ein 2´-O-Cyanoethylrest an das Nucleosid geknüpft werden; dieser wurde als Modifikationsmotiv beibehalten und es konnte das entsprechende 3´-Phosphoramidit hergestellt werden. Außerdem lässt sich ein 2´-O-Cyanoethylrest mittels Raney-Nickel-katalysierter Hydrierung in das primäre Amin überführen. Durch diese Michael-Addition-Reduktionssequenz konnte die erwähnte 2´-O-Aminopropylmodifikation in nur zwei Stufen mit einer Gesamtausbeute von über 80 % an das Difluorbenzimidazolnucleosid geknüpft werden. Die 2´-O-Aminopropylfunktion wurde zudem als Ausgangspunkt zur Kupplung weiterer erfolgsversprechender Modifikationsmotiven verwendet: In diesem Ansatz wurden mittels standardisierter Peptidkupplungschemie Carbonsäurederivate an die freie Aminofunktion gekuppelt. Hierdurch waren neuartige 2´-O-Modifizierungen, wie z.B. Lysin- oder auch Laurinsäurekonjugate zugänglich; diese waren über den Propylamidlinker mit dem Nucleosid verbunden. Im Hinblick einer polykationischen Modifizierung konnte auch ein Sperminderivat an die Aminopropylfunktion gekuppelt werden. Sämtliche dieser Konjugate konnten ebenfalls nach mehrstufigen Synthesen in das 3´-Phosphoramidit überführt werden und wurden schließlich erfolgreich in RNA-Oligonucleotide eingebaut. Für den Einbau der 2´-modifizierten universellen Nucleosidanaloga in RNA-Oligonucleotide wurden zunächst kurze 12mer-Sequenzen gewählt, die sich bereits als gute Testsysteme für spektroskopische Untersuchungen herausgestellt haben. Hernach konnten mit diesen Duplexen spektroskopische Untersuchungen wie UV-Schmelzkurvenanalysen und CD-Spektroskopie durchgeführt werden. Zudem stand die biologische Testung dieser Modifikationen in synthetisch zugänglichen siRNA-Oligonucleotiden im Fokus dieser Arbeit. Um die Flexibilität der Konjugationsmethode zu erhöhen konnte auch eine postsynthetische Kupplung an das festphasengebundene RNA-Oligomer etabliert werden. Dies wurde durch den Einbau des geeignet geschützten 2´-Aminopropyl-Nucleosidbausteins in ein RNA-Oligomer erreicht: Durch einfache Zugabe von Bocanhydrid in den Reduktionsansatzes gelang eine simultane Boc-Schützung des 2´-O-Aminopropylderivats in quantitativer Ausbeute. Diese Prozedur konnte auch auf ein 7N-Purinnucleosidanalogon übertragen werden, welches im Hinblick auf die thermodynamische Stabilisierung eines RNA-Duplexes einem 4,6-Difluorbenzimidazolbaustein gegenüber überlegen zu sein scheint. Die Boc-geschützen Derivate wurden als Phosphoramidite in die automatisierte Festphasensynthese von Oligonucleotiden eingesetzt. Der große synthetische Vorteil dieser Methode besteht einerseits in ihrer einfachen Durchführbarkeit, andererseits in ihrer effizienteren und ökonomischeren Vorbereitung: Es muss nur jeweils ein Phosphoramiditbaustein (mit Boc-geschützter 2´-O-Aminopropylfunktion) synthetisiert und in ein Oligonucleotid eingebaut werden. Sowohl mit dem 4,6-Difluorbenzimidazolnucleosid, als auch mit seinem 7N-Purin-Pendant konnten erfolgreiche Festphasenkupplungen durchgeführt werden. Im Hinblick auf die thermodynamischen Eigenschaften konnten vor allem für das 7N-Purinnucleosid interessante Resultate erzielt werden: Das via Festphasenkupplung erhaltene RNA-12mer, welches eine Argininmodifikation am 2´-O-Aminopropyl-7N-Purinnucleosid trägt, zeigt eine im Vergleich zum unmodifizierten A-U-Basenpaar ähnliche Stabilität bei leicht erhöhtem Tm-Wert. Um den Ursprung dieses Effekts genauer zu ergründen wären weitere thermo-dynamische Untersuchungen anhand des 7N-Purinbausteines z.B. mit anderen Modifikations-motiven oder auch an unterschiedlichen Positionen im Oligomer sinnvoll.
In der Vergangenheit wurden verschiedene Fusionstranskripte, welche normalerweise bei Leukämie-assoziierten chromosomalen Translokationen auftreten, in hämatopoetischen Zellen gesunder Personen gefunden. Da diese Personen keine entsprechenden chromosomalen Abberationen aufwiesen, ist es sehr wahrscheinlich, dass diese Fusionstranskripte durch trans-Spleißen entstehen. Während dieser Arbeit konnten durch inverse PCR, welche an unbehandelter cDNA gesunder Probanden durchgeführt wurde, intragenische trans-Spleiß-Produkte nachgewiesen werden. Interessanterweise weisen das MLL-Gen und seine fünf häufigsten Translokationspartner AF4, AF9, AF10, ELL und ENL ein großes Spektrum an trans-gespleißten RNAs auf. Nur in einem weiteren Mitglied der MLL-Familie (MLL3) konnte intragenisches trans-Spleißen nachgewiesen werden. Für verschiedene als Kontrolle verwendete Haushaltsgene konnte kein intragenisches trans-Spleißen nachgewiesen werden. Intergenische trans-Spleiß-Ereignisse konnten durch direkte PCR und RACEExperimente für die Gene MLL, ELL und ENL nachgewiesen werden. Bemerkenswerterweise entsprechen ein intragenisches trans-Spleiß-Produkt des MLL-Gens dem Transkript der chromosomalen Abberationen MLL-PTD und ein intergenisches trans-Spleiß-Produkt des MLL-Gens dem Transkript der chromosomalen Abberationen MLL•AF4. In Hefe konnte gezeigt werden, dass RNA als Vorlage für DNA-Reparaturen dienen kann. Somit lag der Schluß nahe, dass die oben genannten trans-gespleißten RNAs möglicherweise einen Einfluss auf die DNA-Reparatur haben. Dass RNA nicht nur in Hefen sondern auch in Menschen als Vorlage für DNA-Reparaturen dienen kann, konnte im Zuge dieser Arbeit durch mehrere in vitro Experimente mit Kernextrakten aus humanen Zelllinien bestätigt werden. Allerdings konnte keinerlei Einfluss von (trans-)gespleißter RNA auf die DNA-Reparatur in zahlreichen in vitro Experimenten nachgewiesen werden. Mit einem daraufhin etablierten in vivo System konnte ebenfalls ein Einfluss von (trans-) gespleißter RNA auf die DNA-Reparatur ausgeschlossen werden. Weiterhin konnten mit Hilfe der durchgeführten RACE-Experimente vorzeitige Polyadenylierungen von Transkripten in den Bruchpunktsregionen von MLL, AF4, AF9 und ENL identifiziert werden. Durch diese ungewöhnliche Termination der Transkription werden stark verkürzte Transkripte erzeugt, welche in kurze Proteinisoformen translatiert werden können. Ein Vergleich von 274 unterschiedlichen Bruchpunktsequenzen mit größeren direkten und indirekten Sequenzwiederholungen zwischen der Bruchpunktsregion von MLL und den Bruchpunktsregionen seiner häufigsten Translokationspartner wurde ebenfalls durchgeführt. Eine signifikante Korrelation zwischen den Sequenzwiederholungen und der Lokalisation der Bruchpunkte war jedoch nicht erkennbar. Bei diesem Vergleich fielen allerdings Häufungen von Bruchpunkten im MLL-Gen mit AF4, AF9 und ENL als Translokationspartner auf, wobei sich die Ursache für diese Häufungen auf Topoisomerase II Spaltstellen zurückführen ließ.
Mit den in dieser Arbeit entwickelten und getesteten Nachweismethoden konnte in verschiedenen Marktstudien gezeigt werden, dass sowohl molekularbiologische als auch immunologische Verfahren für den Nachweis von versteckten Allergenen in Lebensmitteln geeignet und auch miteinander vergleichbar sind. Dies wurde in zwei Studien deutlich, in denen beide Methoden sowohl für den Haselnuss- bzw. Erdnussnachweis miteinander verglichen wurden. In beiden Studien wurde eine sehr gute Übereinstimmung der beiden Verfahren gefunden. Nur in Einzelfällen gab zwischen beiden Methoden Abweichungen im Resultat, was aber fast ausschließlich Proben betraf, die einen sehr geringen Anteil (ca. 10 ppm Protein) Haselnuss bzw. Erdnuss enthielten. Damit konnte erstmals im direkten Vergleich gezeigt werden, dass PCR-basierte Methoden für den Allergennachweis in prozessierten Lebensmitteln genauso gut geeignet sind, wie antikörperbasierte Methoden. Allerdings besteht bis zum heutigen Zeitpunkt das Problem solche Anteile korrekt zu quantifizieren, da es an Referenzmaterialien mangelt, die es ermöglichen würden einen Mengenstandard für ein quantitatives Verfahren herzustellen. Momentan sind quantitative Messungen nur exakt möglich, wenn die zu untersuchende Lebensmittelmatrix genau bekannt ist und ein entsprechender Standard generiert werden kann. Trotzdem bieten beide Verfahren die Möglichkeit prozessierte Lebensmittel sehr empfindlich auf allergene Bestandteile zu untersuchen, um somit sicherzustellen dass die aktuellen gesetzlichen Regelungen und Richtlinien für die Etikettierung von Lebensmitteln, wie die EU-Richtlinie 2006/146/EU bzw. die Lebensmittelkennzeichnungsverordnung (LMKV), von den Lebensmittelherstellern eingehalten werden. Weiterhin bieten die etablierten Nachweismethoden den Herstellern die Möglichkeit, ihre Produktion im Hinblick auf potenzielle Kontaminationsrisiken mit allergenen Zutaten zu überprüfen bzw. die Effizienz der verwendeten Reinigungsmethoden einzuschätzen. Dies wurde erstmals im Rahmen an einer Modellstudie in Zusammenarbeit mit einem Aromenhersteller durchgeführt. In dieser Studie sollte die Effizienz von verschiedenen Reinigungsprozeduren hinsichtlich der Kontaminationsgefahr von allergenfreien Nachfolgeprodukten überprüft werden. Es konnte gezeigt werden, dass der verwendete Reinigungsprozess sehr effektiv abläuft und nicht mit Kontaminationen gerechnet werden muss. Diese Studie hat exemplarisch gezeigt, dass es möglich ist, allergenspezifische Nachweismethoden in einem Betrieb einzusetzen, um die Belastung der Produktionsanlage und der hergestellten Produkte mit potenziellen Allergenen zu überwachen. Prinzipiell sollte es also möglich sein allergenspezifische HAACCP Konzepte innerhalb eines Betriebes zu etablieren, um so die Produktsicherheit noch weiter zu verbessern. Abschließend kann man sagen, dass die Entwicklung von allergenspezifischen Nachweismethoden einen wichtigen Beitrag zur Gewährleistung der Lebensmittelsicherheit darstellt. Nicht nur dass diese Methoden wichtig sind, um bestehendes Recht zu überwachen, sie sind auch für die Lebensmittelproduzenten ein wichtiges Werkzeug die Qualität ihrer Produkte zu erhöhen.
The research presented in this thesis characterizes U2AF homology motifs (UHM) and their interactions with UHM ligand motifs (ULM) in the context of splicing regulation. UHM domains are a subgroup of RNA recognition motifs (RRM) originally discovered in the proteins U2AF65 and U2AF35. Whereas canonical RRMs are usually involved in binding of RNA, UHM domains bind tryptophan containing linear protein motifs (ULM) instead. In the first article, we analyze the complex network of interactions between splicing factors and RNA that initiate the assembly of the spliceosome at the 3´ splice site of an intron. The protein U2AF65 binds a pyrimidine-rich element in introns and recruits U2snRNP by binding its protein component SF3b155. My contribution was to define the binding site of the protein U2AF65 to the intrinsically unstructured N-terminus of the scaffolding protein SF3b155. I could show that the UHM domain of U2AF65 recognizes a ULM in SF3b155, and that this binding site is not overlapping with the binding sites of other splicing factors, like p14, to SF3b155. As the U2AF65-UHM:SF3b155-ULM interaction is mutually exclusive with an interaction between U2AF65-UHM and a ULM in the splicing factor SF1, which was reported to initially recognize the branch point sequence, my results provide the molecular details on how SF3b155 replaces SF1 during spliceosomal reorganizations. In the second article, we show that overexpression of the UHM domain of the splicing factor SPF45 induces exon 6 skipping in the pre-mRNA of Fas (CD95/APO-1). I provide evidence for in vitro binding of SPF45-UHM to ULM sequences in the splicing factors U2AF65, SF1, and SF3b155. I crystallized free and SF3b155-bound SPF45 UHM and solved both structures by X-ray crystallography. The analysis of the complex interface and sequence differences in the ULMs allowed me to design mutations of SPF45-UHM, which selectively inhibit binding to distinct ULMs. After assessing the ULM binding properties in vitro, we could show that the activity of SPF45-UHM in influencing the splicing pattern of Fas relies on interactions with SF3b155 and/or SF1, but that an interaction with U2AF65 is dispensable. A mechanism for the activity of SPF45-UHM could thus be engaging in ULM interactions and thus interfering with the network of interactions that initiate the assembly of the spliceosome at the 3´splice site, as described above. In the third article, we describe an unusual flexible homodimerization mode of the UHM in the splicing factor Puf60, which enables simultaneous interactions with ULM sequences on other splicing factors. I could show that the NMR relaxation properties of Puf60-UHM are inconsistent with a model of a rigid dimer, but rather indicate a dimerization via a flexible linker. I identified a flexible loop in the peptide backbone of Puf60-UHM, and showed that mutiation of acidic residues in this loop impairs the dimerization. To analyze the dimerization interface in further detail, I solved the structure of Puf60-UHM by X-ray crystallography. The acidic residues in the flexible loop of one UHM dimer subunit mediate the dimerization by contacting basic residues on the β-sheet surface of the other dimer subunit. Differences in the four dimer interfaces observed for the eight molecules in the asymmetric unit of the crystal support the model of an undescribed, flexible mode of dimerization, and thus complement the NMR relaxation data. Furthermore, I could show that the Puf60-UHM dimer and U2AF65-UHM contact different ULM sequences on the SF3b155 N-terminus in vitro, thus providing a possible explanation for the mutual cooperative activation of Puf60 and U2AF65 in splicing assays described in the literature. The fourth article is a review about recent research on the recognition of DNA double strand breaks (DSB) by covalent histone modifications. The p53 binding protein 1 (53BP1) is a DSB sensor and a checkpoint protein for mitosis. Recent crystallographic evidence indicates that 53BP1 recognizes DSB sites by binding histone H4 dimetylated at lysine 20 (H4-K20). We provide a comprehensive overview of the atomic resolution structures that revealed how proteins can specifically recognize histone tail modifications, especially methylated lysines, to read the information stored in what is called the histone code.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, die über die 1,´-Position phenylenverbrückten Bis(silolyl)verbindungen 120, 123, 125, 156, 158, 160, 135, 137 und 139, sowie die entsprechenden Phenylsilole 126, 163 und 141 (siehe Schema 4.1) zu synthetisieren und NMR-spektroskopisch, massenspektroskopisch und zum Teil auch durch Kristallstrukturen zu charakterisieren. Weiterhin ist es gelungen eine über die 3,3´-Position verknüpfte phenylenverbrückte Bis(silolyl)verbindung 175, sowie auch die Vorstufe zu einer 2,2´-verknüpften Bis(silolyl)verbindung 177 zu synthetisieren und zweifelsfrei zu charakterisieren.
The focus of this thesis has been to further advance and develop existing NMR techniques for the study of protein folding. In order to do so, experimental as well as theoretical approaches have been pursued. From the theoretical side, a successful attempt to the development of a general theory for the treatment of residual dipolar couplings in the case of unfolded proteins has been undertaken. Information contained in residual dipolar couplings is especially valuable due to its long-range nature. The dynamic character of unfolded states of proteins, which may be composed of distinct subsets of conformations, renders reliable interpretation of data a non-trivial task. Statistical-coil-based approaches have been shown to be powerful in data interpretation. A consistent theory based on fundamental polymer physics, however, had not been presented so far. The herein presented model addresses this problem building on the original work by Annila and co-workers. In this work, several shortcomings have been identified. These shortcomings have been corrected here leading to a general approach for the treatment of residual dipolar couplings of unfolded proteins. More specifically, it is shown that, in the case of fully unfolded proteins aligned by a steric mechanism, basic dependencies of dipolar couplings such as on chain length and location with in the chain can be analysed in simple analytical terms. The main predictions of the model are compared to experimental data showing reasonable agreement. The presented mathematical framework is principally suited for various improvements which could include the treatment of long-range interactions and of the actual geometry of the given aligment medium. From the experimental side, bovine alpha-lactalbumin has been chosen as a model system for the development of improved time-resolved 1D NMR methods aiming at the observation of conformational transitions by kinetic means. The presented results show that high-quality data can now be obtained at protein concentrations as low as 100uM. Rate constants characterising distinct conformational transitions of up to 8/s have been measured. These are the fastest rate constants which have been reported so far for protein folding events. The NMR data supplemented by complementary biophysical data furthermore demonstrate that the folding of bovine alpha-lactalbumin is more complex than has been anticipated. All data are consistent with a triangular folding mechanism involving parallel pathways of folding for formation of the native state of the protein. Interestingly, such a folding mechanism has also been found for the highly structurally homologous protein lysoyzme from hen egg white. Evidence is presented that the guiding role of long-range interactions in the unfolded state of lysoyzme for mediating intersubdomain interactions during folding is replaced in the case of bovine alpha-lactalbumin by the Ca2+ binding site.
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung von Nanopartikeln als Trägersysteme für nukleosidische Arzneistoffe. Ihr Einsatz verhindert z.B. die Degradierung der Nukleoside und verbessert ihre Aufnahme in Zellen. Die Partikel wurden aus humanem Serumalbumin (HSA) durch Desolvatation hergestellt und mittels Glutaraldehyd stabilisiert. Durch die Kopplung von Trastuzumab an die Partikeloberfläche können HER2-überexprimierende Brustkrebszellen spezifisch erreicht werden. Bindet der Antikörper an den HER2-Rezeptor, kommt es zu einer Internalisierung des Ligand-ezeptorkomplexes und an den Liganden gebundene Partikel werden zusammen mit dem Komplex in die Zellen aufgenommen. Die Kopplung von Trastuzumab an die Oberfläche der HSA-Nanopartikel über eine Thioetherbindung war sehr effizient und stabil.Die Stabilität von Partikelsystemen über lange Lagerzeiten kann durch Gefriertrocknung erhöht werden. Zur Gefriertrocknung trastuzumabmodifizierter Partikel wurden Trehalose, Sucrose und Mannitol in Konzentrationen bis 5% als Hilfsstoffe eingesetzt. Trehalose und Sucrose waren bereits in einer Konzentration von 3% in der Lage, die physikochemischen Eigenschaften der Partikel direkt nach der Gefriertrocknung zu erhalten, die Partikel waren aber nicht lagerfähig. Mit Mannitol war dies direkt nach der Gefriertrocknung auch bei einer Konzentration von 5% nicht in gleichem Umfang möglich, die Partikel konnten aber am besten gelagert werden. Als nukleosidische Wirkstoffe wurden In die Matrix von HSA-Nanopartikeln unter anderem Antisenseoligonukleotide (ASOs) eingebettet. Das inkorporierte ASO P12 gehört zur Gruppe der Phosphorothioate (PTOs) und bewirkt eine Reduktion der Polo-like Kinase 1 (Plk1) auf mRNA- und Proteinebene. Plk1 ist wesentlich an der Zellteilung beteiligt und wird in vielen Tumoren überexprimiert, eine Hemmung von Plk1 führt zur Apoptose der Zellen. Damit das PTO eine Wirkung zeigen kann, muss es intrazellulär aus den Partikeln freigesetzt werden. Deshalb wurden die Partikel enzymatisch abgebaut. Die Wiederfindung der PTOs aus der abgebauten Partikelmatrix betrug maximal 30% und war von der Menge des zur Partikelstabilisierung verwendeten Glutaraldehyds abhängig. Je mehr Glutaraldehyd verwendet worden war, desto schlechter war die Wiederfindung. Eventuell werden die PTOs durch Glutaraldehyd inaktiviert, indem es zu einer Quervernetzung untereinander oder mit Albuminmolekülen kommt. Dennoch konnte in Brustkrebszelllinien eine biologische Wirkung der PTO-beladenen Partikelsysteme gezeigt werden. P12-beladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt HER2-überexprimierende Zellen aufgenommen. Die Partikel reduzierten die Menge der Plk1-mRNA signifikant. Dies ging mit einer ebenfalls signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge einher. Die Folge der Plk1-Reduktion war eine Aktivierung der Caspasen 3 und 7, die die Induktion der Apopotose zeigte. Plk1 kann nicht nur durch PTOs, sondern auch durch Plasmid-DNA, die small hairpin RNA (shRNA) gegen Plk1 exprimiert, gehemmt werden. Die Plasmide blieben bei der Einbettung in die Partikelmatrix intakt, allerdings trat eine Umformung von der supercoiled in die lineare und zirkuläre Form auf. Auch plasmidbeladene, trastuzumabmodifizierte Partikel wurden zeitabhängig und rezeptorvermittelt in HER2-überexprimierende Zelllinien aufgenommen und führten dort zu einer signifikanten Reduktion der Plk1-Proteinmenge. Als weiterer nukleosidischer Wirkstoff wurde noch eine siRNA gegen Plk1 in die HSA-Partikel inkorporiert. Mit siRNA-beladenen Nanopartikeln konnte ebenfalls eine signifikante Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge beobachtet werden. Partikel aus HSA können nicht nur durch den Einsatz von Glutaraldehyd stabilisiert werden, eine thermische Quervernetzung der Partikelmatrix ist ebenfalls möglich. Die besten physikochemischen Eigenschaften PTO-beladener Partikel wurden bei einer Quervernetzungstemperatur von 105°C über 10 min erzielt. Wurden diese Partikel enzymatisch abgebaut und das PTO aus der Partikelmatrix bestimmt, so konnten bis zu 80% des eingebetteten PTOs intakt detektiert werden. Allerdings waren die Partikel weniger stabil als chemisch quervernetzte Partikel. Bei einer Einlagerung über 6 Wochen stieg der Partikeldurchmesser an, 25% des eingebetteten P12s wurden aus der Matrix freigesetzt und bis zu 20% des Trastuzumabs wurden von der Oberfläche abgelöst. Dennoch war die Reduktion der Plk1-mRNA- und –Proteinmenge in der Zellkultur signifikant und mit der von chemisch stabilisierten Partikeln vergleichbar. Trastuzumabmodifizierte HSA-Nanopartikel stellen somit ein geeignetes Trägersystem für nukleosidische Arzneistoffe dar und führen zu einer spezifischen Wirkung in HER2-überexprimierenden Brustkrebszellen.
Der Einsatz von Mikrowellen zur Synthese von Organosilicioumverbindungen ist bislang nicht beschrieben und wird mit der vorliegenden Arbeit eingeführt. Dazu wurde eine Haushaltsmikrowelle durch Öffnen des Sicherheitskäfigs und entsprechender Abschirmung so modifiziert, dass mit den üblichen Labormaterialien gearbeitet werden konnte. Exemplarische Reaktionen in flüssiger Phase, wie die Synthese von Silatranen und silatrananalogen Verbindungen, können gegenüber der klassischen Reaktionsführung bis zum Faktor 60 bei vergleichbaren Ausbeuten und Reinheiten beschleunigt werden. Auch die direkte Konversion von SiO2 in reaktive Verbindungen gelingt unter Mikrowellenbedingungen deutlich beschleunigt. Weitere Modifikationen der Apparatur ermöglichen die Durchführung von Festphasen-Gas Reaktionen unter Verwendung von Silicium und verschiedenen Reaktionsgasen. Verwendet wurden dazu Cl2, HCl, CH3Cl sowie Gemishce dieser Gase. Auch wurden die Reaktionen unter verschiedenen Stufen der Argonverdünnung durchgeführt. Erstaunlicherweise glüht dabei das Silicium innerhalb von Sekunden mit einer Temperatur von über 1000°C. Die Untersuchungen zeigen eine hohe Tendenz zur Bildung von monomeren Siliciumverbindungen, sobald Methylchlorid beteiligt ist, wird bevorzugt das technisch bedeutsame Me2SiCl2 beobachtet. Alle Ergebnisse gehen konform mit der Annahme, dass durche Mikrowelle aktiviertes Silicium bereitgestellt wird. Dadurch kann es zur Bildung und Stabilisierung von intermediären Silylenen kommen, die in verschiedene Bindungen der Reaktionspartner insertieren. Bemerkenswert ist auch die geringe elektrische Leistung von 200 Watt, die in allen diskutierten Umsetzungen ausreicht, um die gewünschten Reaktionen durchzuführen. Darüber hinaus wurde auch der Unterschied zwischen Multimode- und Singlemodegeräten untersucht. Nur bei Verwendung von Multimodegeräten könenn die beschriebenen Ergebnisse erzielt werden. Beim Einsatz von Singlemodegeräten entsprechen die Resultate denen, die bei klassischer thermischer Reaktionsführung erzielt werden.
Life-threatening fungal infections are becoming increasingly common for immunocompromised patients such as those with AIDS, or those undergoing organ transplantation or chemotheraphy, as well as for other health-vulnerable patients. Excellent targets for antifungal drugs are chitin synthases, which are essential for survival of the fungus and lacking in humans. To design new antifungal drugs, knowledge of the three-dimensional structure and mechanism of action of chitin synthases are crucial. Chitin synthases are members of an important family of enzymes that synthesize structural polysaccharides, such as cellulose, β(1,3)-glucan, β(1,4)-mannan and hyaluronan. Therefore, chitin synthases could be used as a model system to understand these more complex enzymes, which are also of major medical and commercial importance. Chitin synthase 2 from Saccharomyces cerevisiae (ScChS2), the protein under study, is an integral membrane protein that synthesizes the primary septum between mother and daughter cells in budding yeast. It is essential for proper cell separation and expected to be highly regulated. An important aspect is that ScChS2 shows 55% sequence identity and is functionally analogous to chitin synthase 1 from the human opportunistic pathogen Candida albicans, this enzyme is also essential for cell survival (Munro, Winter et al. 2001). ...
Self-inactivating gammaretroviral vectors for the gene therapy of chronic granulomatous disease
(2008)
Chronic granulomatous disease (CGD) is a rare inherited primary immunodeficiency characterized by defective intracellular oxidative killing of ingested invading microbes by PMN and monocytes. It is caused by mutations in one of the four genes coding for the essential subunits of the NADPH oxidase (gp91phox, p47phox, p67phox and p22phox). Approximately 75% of the CGD cases are due to mutations in the gp91phox gene. If regular care and conventional therapy fail, the recommended therapy is allogeneic bone marrow transplantation (BMT), but only if a matched donor is available. A therapeutic option for patients lacking suitable donors is the genetic modification of autologous hematopoietic stem cells. The gene therapy offers an interesting alternative to BMT since it implies a less invasive treatment and represents a possibly unique curative option for patients with no suitable donor. Gammaretroviral vectors were already used in some gene therapy trials for CGD and other immunodeficiencies showing relevant clinical benefit. However, these trials uncovered an unexpected mutagenic side effect. If the retrovial integration ocurrs near to, or into proto-oncogenes this might lead to clonal dominance or even malignant transformation (Hacein-Bey-Abina et al., 2003a; Ott et al., 2006). Therefore, there was a need to further improve the safety of these vectors and to this end the self-inactivating gammaretroviral vectors were engineered. Non essential sequences for virus infectivity and integration, which might influence the surrounding gene expression, were deleted in these vectors. In the first set of experiments, a series of SIN gamma retroviral vectors was cloned driving the expression of the wild-type gp91phox cDNA under the control of a viral constitutive SFFV promoter. However initial studies with these vectors failed because the titers of the virus produced by transient transfection protocols were extremely low (<5x105 TU/ml). Therefore, a codon optimization of the gp91phox cDNA was considered as an alternative. The codon optimized synthetic gp91phox gene was used to construct a SIN gammaretroviral vector, again under the control of the SFFV promoter (Schambach et al., 2006c). With this vector an increase in titer was observed compared to the native gp91phox sequence, which was due to the improved transcription in 293T transfected cells. The enhancement of the synthetic gp91phox transcription led to a higher internal transcript production and protein expression. An enhanced superoxide production in transduced myelomonocytic X-CGD PLB-985 populations was also detected. All these data indicate that the synthetic gp91phox might represent an excellent alternative to those former constructs expressing the native gp91phox transgene. Since it was postulated that the SFFV promoter could still cause transactivation of neighboring genes due to its strength (Modlich et al., 2006), three different non-viral promoters were tested, one constitutive (the EFs promoter) and two myeloid-specific promoters (the c-fes and MRP8 promoter). The three SIN gammaretroviral vectors were able to generate high titers after transient transfection of 293T packaging cells, to efficiently transduce the X-CGD PLB-985 cell line and to reconstitute the NADPH oxidase activity to a high degree. In mouse transplantation experiments, the EFs promoter showed a high variable transgene expression in the different lineages analyzed, and the c-fes promoter showed also a ubiquitinous expression. In contrast, the MRP8 promoter showed a high myeloid specificity since gp91phox expression in mSca-1+ cells and lymphoid B cells from transplanted mice was extremly low and even absent. However, the lowest levels of transgene expression were observed in the myeloid populations both in bone marrow and peripheral blood with this vector. When the oxidase reconstitution ability of these promoters was tested, the numbers of superoxide producing cells obtained were similar than those observed in the clinical X-CGD trial conducted by the groups of Dr. M. Grez and Prof. R. A. Seger (over 35% in one patient and ~15% in the second), which led to the eradication of therapy refractory infections (Ott et al., 2006). Between the three constructs, the MRP8 promoter was less effective in restoring the NADPH oxidase activity than the EFs and c-fes promoters. The c-fes promoter reached the highest levels of DHR reactive cells in the highest number of mice. Overall, these data showed that between all constructs tested, the c-fes containing construct in combination with the codon optimized gp91phox sequence showed the best performance within the SIN gammaretroviral backbone. It generated the highest titers in combination with a better NADPH oxidase reconstituting ability. One main goal in the development of SIN gammaretroviral vectors is reducing the genotoxic effect due to random vector integration. An improved gene transfer and expression, and a constant performance are also highly desirable. The present study shows that the c-fes SIN vector in combination with the synthetic gp91phox may be considered as an effective gene therapy strategy for the restoration of the NADPH oxidase activity in CGD. It allows the use of a cellular promoter generating adequate physiological levels of the therapeutic protein and reduces the number of vector copies required for a therapeutic effect.
Eine weltweite Veränderung der Lebensweise hat eine Zunahme der Anzahl adipöser Menschen und damit ein verstärktes Auftreten von Typ 2 Diabetes mellitus zur Folge. Eine häufig auftretende Komplikation dieser Erkrankung ist das diabetische Fußulkus, dessen molekularen und zellbiologischen Grundlagen weitestgehend unbekannt sind. Für einen normalen Wundheilungsverlauf ist ein Zusammenspiel vieler Wachstumsfaktoren und Zytokine essentiell. Auch die Insulinsensitivität der Haut scheint von großer Bedeutung zu sein. Die Funktionen von Insulin im Wundheilungsprozess und in der Haut sind weitestgehend unerforscht. Um ein besseres Verständnis für die Bedeutung von Insulin in der Wundheilung zu erhalten, bestand das Ziel dieser Arbeit in der Analyse eines Insulin-regulierten Enzyms in der Haut, der HMG-CoA-Reduktase, während des Heilungsprozesses normaler sowie diabetisch chronischer Wunden. Die HMG-CoA-Reduktase katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Mevalonat-Stoffwechselweg und ist somit indirekt an vielen zellulären Ereignissen beteiligt. Die Verletzung von murinem Hautgewebe führte zu einem Anstieg der HMG-CoA-Reduktase-mRNA-Expression an Tag 3 und an Tag 13 nach Verletzung. Die Lokalisation der HMG-CoA-Reduktase im Wundgewebe zeigte, dass insbesondere die am Wundrand gelegenen Keratinozyten durch eine besonders starke mRNA-Expression des Enzyms charakterisiert waren. Im Gegensatz dazu konnte im diabetischen, chronischen Wundgewebe keine Regulation der mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase detektiert werden. Wundheilungsrelevante Faktoren, wie Insulin und EGF, induzierten die mRNA-Expression der HMG-CoA-Reduktase in HaCaT-Keratinozyten (in vitro). Für die Insulin-vermittelte mRNA-Induktion konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor SREBP2 für die Transkription des Gens essentiell war. Neben einer erhöhten Transkription der HMG-CoA-Reduktase wurde ebenfalls eine gesteigerte Enzymaktivität nach Insulin- oder EGF-Stimulation detektiert. Die Induktion der Insulin-vermittelten HMG-CoA-Reduktase-Aktivität stand in einem funktionellen Zusammenhang zur Biosynthese des angiogenen Faktors VEGF. Der Einfluss der HMG-CoA-Reduktase auf die VEGF-Biosynthese war posttranskriptionell über die Phosphorylierung des eIF4E-BP1 vermittelt. Auch im tierexperimentellen Modell (in vivo) konnte durch eine Statin-Behandlung bei Mäusen gezeigt werden, dass die Enzymaktivität der HMG-CoA-Reduktase in Keratinozyten für eine normale VEGF-Expression essentiell war. Die VEGF-Synthese wurde von der Aktivität der HMG-CoA-Reduktase in vivo, wie in vitro nach Insulin-Stimulation, posttranskriptionell beeinflusst. Die Analyse weiterer wundheilungsrelevanter Vorgänge ergab, dass eine Inhibierung der HMG-CoA-Reduktase in vivo wie in vitro eine Verringerung der Keratinozytenproliferation zur Folge hatte. Die Keratinozytenproliferation ist ein wichtiger Vorgang bei der Reepithelisierung einer Wunde. Ist das Wundareal durch Keratinozyten geschlossen, beginnt die Differenzierung der Zellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass der Differenzierungsprozess von Keratinozyten in vitro mit einer Induktion der HMG-CoA Redukase Aktivität assoziiert war. Eine Hemmung der Enzymaktivität hatte eine Inhibierung der mRNA-Expression von Keratinozyten-Differenzierungsmarkern, wie Involucrin, Filaggrin und Keratin 1 zur Folge. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass die HMG-CoA-Reduktase wichtige Prozesse, wie Wundangiogenese und Keratinozytenproliferation, im kutanen Wundheilungsverlauf beeinflusst.
Die Identifikation neuer Hits und Leitstrukturen sind die ersten Schritte bei der Entwicklung neuer Arzneistoffe. Dieser Herausforderung wird derzeit primär mittels High-Throughput-Screening oder der gezielten Modifikationen bekannter Liganden begegnet. Eine weitere Option ist das computerbasierte virtuelle Screening, das es kostengünstig ermöglicht, in kurzer Zeit sehr viele Moleküle auf ihre potentielle biologische Aktivität hin zu untersuchen. Der in dieser Arbeit verwendete Ansatz zur Identifikation neuer Inhibitoren der 5-Lipoxygenase und der Cyclooxygenase-2 beruht auf dem Verfahren des ligandenbasierten virtuellen Screenings. Unter der Voraussetzung der Kenntnis mindestens eines Referenzliganden können so mittels einer Ähnlichkeitsanalyse potentielle neue strukturelle Grundgerüste identifiziert werden. Zu diesem Zweck wurde ein auf atomaren Partialladungen und der dreidimensionalen Struktur der Moleküle basierender Deskriptor (Charge3D/TripleCharge3D) entwickelt. In retrospektiven Studien mit Cyclooxygenase-2 Inhibitoren wurde die Effektivität der neuen Deskriptoren überprüft und mittel eines evolutionären Algorithmus optimiert. Der Charge3D Deskriptor erreicht Anreicherungsfaktoren bis zu 16,1 im ersten Perzentil der durchsuchten Datenbank, wohingegen der TripleCharge3D Deskriptor mit seiner detailierteren Ladungsauftrennung Werte von bis zu 24,8 erreichte. Ein ebensolches retrospektives Screening wurde für 5-Lipoxygenase Inhibitoren durchgeführt. Den maximalen Anreicherungsfaktor von 6,1 im ersten Prozent der Datenbank erreichte hier der Charge3D Deskriptor, der TripleCharge3D Deskriptor erreichte 5,3. Diese wesentlich geringeren Werte sind auf die Diversität der 5-LO Inhibitoren (54 Inhibitoren mit 39 verschiedenen Grundgerüsten) und deren unterschiedliche Inhibitortypen (Redox, nicht Redox und Eisen-bindende Inhibitoren) mit ihren jeweiligen Bindemodi zurückzuführen. In Screenings nach 5-LO Inhibitoren in der Naturstoffdatenbank der Firma AnalytiCon Discovery und COX-25-LO Dualinhibitoren in Datenbanken der Firma Asinex konnten unter Verwendung der beiden Deskriptoren Inhibitoren, mit für diese Targets bislang unbekannten Scaffolds identifiziert werden. Unter Verwendung des 2D Pharmakophor Deskriptors CATS wurden zuerst zwei neue Scaffolds für Inhibitoren der 5-LO identifiziert. Struktur 1 ist den in vitro Assaydaten zufolge ein direkter Inhibitor der 5-LO. Struktur 2 hingegen erreicht seine Wirkung nicht nur über die direkte Interaktion mit der 5-LO. Eine Erklärung dafür wäre die Wechselwirkung mit dem 5-LO aktivierenden Protein FLAP, der Hemmung der Translokation der 5-LO zur Kernmembran, oder die Inhibition 5-LO aktivierender bzw. inaktivierender Kinasen. In nachfolgenden Screenings mit den Strukturen 1 und 2 als Referenzstrukturen konnten mittels der Charge Deskriptoren Substanzderivate (17 Moleküle) mit 5-LO inhibitorischer Wirkung (5 Moleküle mit IC50 Werte ≤ 1 μM an partiell aufgereinigter 5-LO), identifiziert werden. Für das Screening nach COX-2/5-LO Dualinhibitoren wurden 11 Strukturen mit 7 unterschiedlichen Scaffolds unter Verwendung der Charge Deskriptoren aus gewählt. Drei Moleküle zeigten keine 5-LO Aktivität, und jeweils eines nur in intakten PMNLs bzw. im S100 Zellüberstand. Die restlichen 6 Moleküle waren in beiden 5-LO Assays aktiv (intakte PMNLs IC50 zwischen 2 und 15 μM, S100 Zellüberstand 5-LO zwischen 0.5 μM und 25 μM). Somit zeigten 7 Moleküle im S100 Assay Aktivität und konnten als direkte Inhibitoren der 5-LO identifiziert werden. Im Cyclooxygenase-2 Aktivitätsassay mit intakten MonoMac6 Zellen zeigte eine der 11 Strukturen zudem eine geringe (IC50 = 70 μM) inhibierende Aktivität. Modifikationen zur Verbesserung der COX-2 Hemmung könnten in einem potenten COX-2/5-LO Dualinhibitor resultieren, der beispielsweise in der Schmerzbehandlung eingesetzt werden könnte. Ein weiteres Projekt war die Erstellung eines Homologiemodells der 5-LO basierend auf der 15-Lipoxygenase Struktur des Kaninchens (PDB-Struktur: 1LOX). Die Sequenzidentität der beiden Strukturen (1LOX / humane 5-LO) lag bei 37 %. Das Modell wurde zum einen zur Vorhersage von zugänglichen Caspase-6 Schnittstellen an der 5-LO angewandt, und zum anderen wurden Dockingexperimente in Aktiven Zentrum und in Bereichen der C2-like Domäne der 5-LO durchgeführt. Hyperforin, ein bekannter Inhibitor d er 5-Lipoxygenase, wurde an verschiedenen Stellen des Modells für Dockingexperiment eingebracht. Die im Aktiven Zentrum erreichten Scorewerte (Chemscore = -9±1) deuteten hier auf eine unfavorisierte Bindungsstelle hin. BWA4C (ein bekannter Eisenbinder) und ZM230487 (ein nicht-redox Inhibitor) erhielten im Aktiven Zentrum Scorewerte von 27±0,1 und 22±2,5, wodurch eine Bindung als wahrscheinlich angenommen werden kann. Weitere Dockingexperimente an der C2-like Domäne, und speziell am Interface zwischen der C2-like und der katalytischen Domäne, ergaben ähnlich hohe Chemscorewerte für Hyperforin, BWA4C und ZM230487. Aus diesen Resultaten ließ sich kein eindeutiger Bindemodus für Hyperforin ableiten. Eine Positionierung im Aktiven Zentrum ist nach diesen Experimenten unwahrscheinlich, so dass die Existenz einer weiteren, experimentell noch nicht identifizierten Bindestelle vermutet werden kann. Eine solche Interaktionsfläche könnte als Ansatzpunkt für die Entwicklung weiterer 5-Lipoxygenaseinhibitoren eine zentrale Rolle einnehmen.
Development of chromium(VI)-free defect etching solutions for application on silicon substrates
(2008)
Determination of the distribution of halocarbons in the tropical upper troposphere and stratosphere
(2008)
The aim of this thesis was to investigate distributions of 32 volatile chlorinated and/or brominated halocarbons that are currently believed to be present in the tropical upper troposphere and stratosphere and to contribute to stratospheric ozone depletion and also to global warming. For this purpose an analytical system was established, which is capable to measure ultra-low concentrated atmospheric trace gases. A quadrupole Mass Spectrometric (MS) Detector was attached to an existing Gas Chromatograph with pre-concentration system and Electron Capture Detector (ECD). The characterisation of the chromatographic system was significantly enhanced by the subsequent identification of 48 additional volatile organic compounds. Furthermore a Gaussian fit algorithm, which was developed in the workgroup, was applied to the chromatographic signals. This algorithm was proven to reflect peaks quantitatively and to enhance the performance of the integration process – especially the reproducibilities for peaks with a low signal to noise ratio. As it is known that the Electron Capture Detector responds nonlinear the new MS detector was checked for such behaviour and found to respond linear. In logical consistency the complete quantification process including e.g. pre-concentration of trace gases and signal integration can be considered as linear responding within the investigated parameter ranges. Moreover, the long term stability of the targeted halocarbons was proven inside the calibration standard containers over a period of 25 months. Many substances were also found to be stable inside the containers used for storage of air samples but a number of substances showed significant concentration changes. These were mainly CH3Cl (methyl chloride), CH3Br (methyl bromide), CH2Cl2 (dichloromethane), CHCl3 (chloroform), CCl4 (tetrachloromethane), C2Cl4 (tetrachloroethene), CH3CCl3 (methyl chloroform), CH2ClCH2Cl (1,2-dichloroethane) und C2H5Cl (chloroethane). But the number of affected substances and also the corresponding concentration changes varied between the individual containers. A systematic investigation of the influence of possible causes (e.g. air sampling methods, container materials) is recommended. Results from both internal detectors were compared and revealed biases and disadvantages of the ECD caused by its lower selectivity and its nonlinear response behaviour. Consequently the MS detector was chosen for the quantification of atmospheric trace gases. The quantification process was performed relative to externally calibrated air standards. To assess the uncertainties connected with different absolute calibration scales cross-comparisons between calibration standards of three different laboratories were carried out. Most substances’ calibrations agreed within the measurement uncertainties but significant differences were observed for CF2ClBr (H1211), CH3Cl (methyl chloride), CH2Cl2 (dichloromethane), CHCl3 (chloroform), CCl4 (tetrachloromethane) and CH3CCl3 (methyl chloroform). As five of these substances were also observed to show concentration changes inside sample containers it is likely, that such changes are responsible for calibration differences. In addition to the detailed assessment of uncertainties connected with the analytical quantification process a set of air samples was available for measurements. These samples mainly originated from the upper troposphere and lower and middle stratosphere in the tropics and the determined halocarbon quantities were used to investigate their distributions in the respective atmospheric regions. In detail, the altitudinal distributions and interrelations of 17 long-lived halocarbons in the tropical stratosphere were determined and compared with those of other stratospheric regions. Tracer-tracer-correlations of these substances in the tropical stratosphere were found to differ from those in mid- and high-latitudes. Characteristic fit functions relative to CF2Cl2 (F12) which are valid for the tropical stratosphere in 2005 were derived as well as time-independent fit functions of fractional release factors (FRFs) relative to the mean age of air. Both sets of correlations could be used for the parameterisation and evaluation of models and also to reassess the Global Warming Potentials (GWPs) of the corresponding halocarbons which might affect future climate predictions. However, the data set on halocarbons in the tropical stratosphere is still insufficient to investigate the variability of tracer-tracer-correlations and FRFs caused by dynamical and photochemical processes. Therefore it is important for future research to perform additional measurements there and – if possible – to extend the measurements to the upper tropical stratosphere in order to characterise the sink of those halocarbons that are still present in these altitudes. In addition, the amount of chlorine and bromine present in the form of organic compounds inside and above the main stratospheric entrance region (the Tropical Tropopause Layer, TTL) was quantified in the frame of a case study. This was possible because of a cooperation with scientists from the University of East Anglia which carried out measurements of six additional halocarbons leading to a total of 28 quantified target substances. Ten of these substances have short atmospheric lifetimes compared with the mean transport times of tropospheric air to the stratosphere (i.e. lifetimes below 0.5 years) and show non-uniform distributions in the upper troposphere. The contribution of these substances to stratospheric ozone depletion is subject of an ongoing scientific debate. In the performed case study a fraction range of short-lived halocarbons of 6 – 8 % (0.98 – 1.25 ppt) relative to the sum of bromine from organic substances and of 1.1 – 1.4 % (36.6 – 47.1 ppt) for the corresponding sum of chlorine was calculated to enter the stratosphere above Brazil in June 2005. Moreover by combining the data with tropospheric reference data and age of air observations the abundances of inorganic chlorine and bromine (Cly and Bry) were derived. At an altitude of 34 km an amount of 3062 ppt of Cly and 17.5 ppt of Bry from organic source gases was calculated. The latter is significantly lower than Bry mixing ratios inferred from quasisimultaneous BrO measurements at 33 km altitude above Brazil (Dorf, 2005, Dorf et al., 2008). But at the University of East Anglia indications for the presence of unknown brominated organic substances in the TTL were found which might cause this difference. Finally, a major result of this thesis adds to the knowledge of the composition of the troposphere as three Chlorofluorocarbons (CFCs) were first observed. Trifluorochloroethene, 3-chloropentafluoropropene and 4,4-dichlorohexafluoro-1-butene were found in air samples collected at the Taunus Observatory near Frankfurt (Main) and the Jungfraujoch High Altitude Research Station in Switzerland (Laube and Engel, 2008). Identification was possible because of an air plume containing high concentrations of these substances. It is suggested that the abundances found on this occasion originated from a local source. The atmospheric lifetimes of these substances are expected to be rather short as they contain a double bond. A quantitative calibration could only be derived for trifluorochloroethene but not for the other species by now. Thus, a relative sensitivity method was derived to get a first indication of the observed atmospheric abundances. All three CFCs could also be detected in air masses representative of background conditions, though with much lower concentrations. These species and some of their degradation products are toxic and could also be relevant for stratospheric and tropospheric ozone depletion. It is important to find out more about their atmospheric distributions, lifetimes, sinks and sources and their ability to reach the stratosphere to assess their possible influence on the global atmosphere. This will be done in the frame of the project "CLEARFOGG – Checking Layers of the Earths AtmospheRe For halogenated Ozone-depleting and Greenhouse Gases". This research project aims to perform a systematic scan of the atmosphere because there are indications for the presence of a number of halogenated organic compounds which are unknown by now. It was recently decided to be funded by the British National Environmental Research Council and will be carried out at the University of East Anglia mainly by the author of this thesis.
Die Eigenschaften, die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Co-Polymeren auf Basis von a-Hydroxycarbonsäuren und Polyolen, unterscheiden sich deutlich von denn entsprechenden reinen Polymeren ohne Polyolkomponente. Die Polymere dieser Klasse, die sich durch Variation der Parameter Alkoholkomponente, Alkohol/Lactid-Verhältnis, Lactid/Glycolid-Verhätnis, L/DL-Verhältnis ergibt sind äußerst vielfältig. Schwerpunktmäßig wurden Polymere untersucht, die als Carbonsäurekomponente Milch- und/oder Glycolsäure enthalten und bei denen Glycerin oder Ethylenglycol als Polyol verwendet wurde. Diese Arbeit verfolgte zum einen das Ziel, grundlegende Erkenntnisse über die neuartige Polymerklasse zu gewinnen und zum anderen die Eignung dieser Polymere als implantierbares Arzneistoffdepot zu untersuchen. Dabei konnte – wie im ersten Teil dieser Arbeit beschrieben – nur ein Ausschnitt aus dem großen Spektrum der Polymere beispielhaft synthetisiert und untersucht werden. Von vornherein ausgeschlossen waren bei diesen Untersuchungen Polymere, deren Glasübergangstemperatur unter Raum- und über Körpertemperatur lagen. Es sollten so lagerstabile, aber nach Applikation ins Gewebe anpassungsfähige Formkörper erhalten werden. Die Untersuchungen mit den entwickelten Polymerstäbchen haben gezeigt, dass sich die Klasse der Polyol-oligolactide/co-glycoliden von herkömmlichen, reinen Polylactiden bzw. Polylactiden/co-glycoliden in einigen Punkten unterscheidet. So wurde bei keinem der Versuche ein inhomogenes Abbauverhalten festgestellt, wie dies in der Literatur bei reinen Polylactiden/co-glycoliden beschrieben ist. Es kam also nicht zu einem beschleunigten Polymerabbau im Inneren der Stäbchen durch Autokatalyse der sich dort akkumulierenden Milchsäure. Die Glycerol-Polymere scheinen eine ausreichende Diffusion der Degradationsprodukte nach außen zu gewährleisten. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für die gleichmäßige Freisetzung von Wirkstoffen. Die Eigenschaften der Polymerstäbchen ließen sich auf unterschiedliche Weise beeinflussen. So konnte ihre Wasseraufnahmefähigkeit durch das Verhältnis der Mischung von L-Polymeren zu DL-Polymeren sehr weit variiert werden. Das amorphe DL-Polymer ermöglicht eine erleichterte Wasseraufnahme gegenüber der reinen teilkristallinen L-Variante. Die Co-Polymerisation mit Glycolid bot eine weitere Möglichkeit, die Eigenschaften der Polymere zu beeinflussen. So stieg bei den Polymeren mit gleichem Glycerin/Monomer-Verhältnis die Hydrophilie in der Reihe GOL-DL-1:18 < GOL-DL-1:13,5:4,5 < GOL-DL-1:9:9 < GOL-L-1:4,5:13,5 an. Die Versuche, die im zweiten Teil der Arbeit beschrieben werden, wurden im Rahmen der Entwicklung eines Applikationssystems für niedermolekulare Cyclooligo-peptide durchgeführt, die in der Krebstherapie eingesetzt werden sollten. Es wurde deutlich, dass die bisher verwendeten Polymerstäbchen für eine solche Anwendung nicht geeignet waren. Sie boten der zur Applikation notwendigen Menge an Peptid eine zu geringe Menge an Polymermatrix, was zu einer hohen Beladungsrate führte. Die Folge war ein mechanisch instabiles System, das nach Implantation zerbrechen könnte und so den Wirkstoff unkontrolliert freisetzen würde. Aus diesem Grund wurde ein Verpressungsverfahren gewählt, um Tabletten beziehungsweise stäbchenförmige Presslinge als Applikationssystem zu erhalten. Für beide Varianten wurde das Polymer gemahlen, die zu untersuchenden Hilfs- oder Wirkstoffe eingemischt und dann verpresst. Bei den Untersuchungen zeigte es sich, dass eine gleichmäßige Freisetzung über mehrere Tage mit diesen resorbierbaren Trägersystemen nicht möglich war. Der Grund hierfür war ein zweiphasiger Verlauf der Freisetzung. Im ersten Teil des zweiphasigen Verlaufs wurde eine große Menge des Wirkstoffes zusammen mit der niedermolekularen Komponente ausgespült. In der zweiten Phase wurde der Wirkstoff im Zuge der Degradation der höhermolekularen Komponente langsam freigesetzt. Der Einfluss des Pressdruckes bei Erstellen der Prüfkörper war für die Freisetzung eher von untergeordneter Bedeutung, während eine vermehrte Zumischung von leicht wasserlöslichen Substanzen oder die Verwendung von hydrophileren Polymeren (DL-Lactide anstelle von reinen L-Lactiden) die Freisetzung des Peptides deutlich erhöhte. Im dritten Teil der Arbeit wurde beispielhaft an den Substanzen Gentamicinsulfat, Methotrexat und einem Cyclo-Oligo-Peptid die Freisetzung aus 13 verschiedenen halbfesten Polymersystemen untersucht. Diese Systeme wurden durch Mischung von nieder- mit höhermolekularen Polymeren hergestellt. Die Menge an freigesetztem Arzneistoff korrelierte erwartungsgemäß mit der Oberfläche der Probenkörper. Die Freisetzung des gut wasserlöslichen Gentamicinsulfats erfolgte aus den Systemen mit einem hohen Anteil an niedermolekularem Polymer sehr schnell und vollständig. Systeme mit überwiegend höhermolekularem Polymer gaben den Wirkstoff weniger schnell frei und es konnte gezeigt werden, dass der Wirkstoff sich in beiden Polymeren der Mischung verteilt. Das Freisetzungsverhalten bei dem in Wasser schwerlöslichen Methotrexat war nicht grundsätzlich anders. Die Verteilung zwischen der höher- und niedermolekularen Phase ähnelt der des Gentamicinsulfates. Eine relativ hohe Beladungsrate mit einem hydrophilen Wirkstoff (EMD 121974) führte zu einer deutlich höheren Freisetzung aus dem höhermolekularen Teil des Polymergemisches, so dass insgesamt eine beinahe vollständige Freisetzung erreicht wurde. Das im vierten Teil der Arbeit untersuchte Beschichten von Hydroxylapatit- Zylindern aus einer Kombination von bFGF mit einem Glycerin-L-1:13 Lactid Polymer führte zu einer gleichmäßigeren Freisetzung als bei Zylindern, die ohne Einsatz von Polymer beschichtet wurden. Außerdem war auch noch nach dem 5. Tag eine Freisetzung von bFGF zu beobachten. Eine signifikante Verzögerung des Einwachsens von Knochen in das Implantat nach 42 und 84 Tagen konnte bei der Gruppe mit bFGF/Polymer-Beschichtung histomorphologisch gezeigt werden. Die Poren des Implantates waren mit dem Polymer gefüllt, was das Einwachsen in den ersten Wochen deutlich erschwerte. Erst nach Beginn der Degradation des Polymers war das Eindringen des umgebenden Knochen möglich. Das Polymer GOL-L-1:12 war also aufgrund seiner langsamen Degradation für eine solche Anwendung ungeeignet. Für eine Verwendung als Beschichtungsmaterial sollte ein Polymer deutlich schneller degradieren und die Beschichtungsdicke müsste optimiert werden. Die Charakterisierung der Polyol-oligolactide/co-glycoliden in dieser Arbeit hat gezeigt, dass es sich bei dieser Polymerklasse um eine sehr interessante Variante der resorbierbaren Polymere handelt. Die einfache Synthese, die gute Bioverträglichkeit und die in sehr weiten Bereichen variierbaren Eigenschaften machen diese Polymere zu vielversprechenden Kandidaten bei der Entwicklung von Arzneimittelträgern oder Medizinprodukten.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym bei der zellulären Leukotriensynthese. Sie katalysiert zunächst die Umwandlung von AA zu 5-Hydroperoxyeicosatetraensäure (5-HPETE) und als zweiten Schritt die Dehydratisierung der 5-HPETE zum instabilen Epoxid Leukotrien A4 (LTA4). Leukotriene sind wichtige Mediatoren bei Entzündungsprozessen und allergischen Reaktionen. Die 5-LO besteht aus zwei Domänen, einer N-terminalen regulatorischen Domäne (AS 1-121) und einer C-terminalen katalytischen Domäne (AS 120-673). Die katalytische Domäne besteht hauptsächlich aus a-Helices, die regulatorische hingegen hat fast ausschließlich b-Faltblätter als Sekundärstrukturelemente. Mit ihrem aus acht Faltblättern bestehenden antiparallelen b-Sandwich hat sie Ähnlichkeit mit einer C2- Domäne. Sie besitzt eine Ca2+-Bindungsstelle und ist maßgeblich bei der Bindung des Enzyms an Membranen beteiligt. Für einige Inhibitoren und zelluläre Faktoren existieren Hinweise, dass sie an die C2-ähnliche Domäne der 5-LO binden, die direkten Beweise fehlen jedoch. Die katalytische Domäne enthält das aktive Zentrum mit einem prosthetischen Eisen und drei Phosphorylierungsstellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal erfolgreich eine Methode zur Überexpression und Aufreinigung der regulatorischen Domäne in E. coli entwickelt, die eine große Ausbeute des Zielproteins erbringt. In einer einfachen one-step Aufreinigung können bis zu 80 mg Fusionsprotein aus MBP und der regulatorischen Domäne der 5-LO (MBP-5LO1-128) pro Liter Expressionskultur gewonnen werden. Ein Verdau mit TEV-Protease führt zur effizienten Abspaltung des MBP. Die weitere Aufreinigung mit hydrophober Interaktionschromatogragphie ergibt eine Ausbeute von 3,4 mg reiner regulatorischer Domäne. Dabei weisen sowohl das Fusionsprotein, als auch die abgespaltene regulatorische Domäne eine Reinheit von über 95% auf. Leider ist die momentan erreichbare Konzentration der reinen regulatorischen Domäne noch nicht ausreichend, um damit NMR-Messungen zur Strukturaufklärung durchführen zu können. Es konnte bestätigt werden, dass die katalytische Domäne der 5-LO alleine nicht zu einer Umsetzung von Arachidonsäure in der Lage ist. Der Verlust der enzymatischen Aktivität ist vermutlich nicht auf eine Fehlfaltung der Proteindomäne zurückzuführen. Die korrekte Faltung der katalytischen Domäne konnte durch eine - wenn auch schwache - Bindung der Domäne an ATP gezeigt werden konnte. Die Zugabe von regulatorischer Domäne zu rekombinanter, aufgereinigter WT 5-LO hat unter gewissen Bedingungen (Abwesenheit von PC) einen stimulierenden Effekt auf die Aktivität des Gesamtenzyms. Dieser Effekt könnte durch eine „Dimerisierung“ der regulatorischen Domäne mit WT 5-LO hervorgerufen werden. In Gegenwart von PC ruft die regulatorische Domäne eine Hemmung der 5-LO-Aktivität hervor. Außerdem ist MBP-5LO1-128 (im Gegensatz zu MBP alleine) in der Lage, das Zwischenprodukt der 5-LO, 5-HPETE, in einer 1:1 Reaktion zu reduzieren. Diese Fähigkeit könnte zur Unterdrückung einer Selbstaktivierung der 5-LO physiologisch bedeutend sein. Interessant ist, dass die Reduktion in Anwesenheit von Ca2+, PC oder PC und Ca2+ deutlich verringert war. Ca2+ führte vor allem in Abwesenheit von PC zu einer deutlichen Verminderung der 5-HPETE-Reduktion. In Gegenwart von PC zeigt Ca2+ nur einen minimalen Einfluss auf die 5-HPETE-Reduktion. Es existieren deutliche Hinweise für eine Konformationsänderung von C2-Domänen durch Ca2+-Bindung [105; 106]. Geht man davon aus, dass dies auch für die C2-ähnliche Domäne der 5-LO zutrifft, erklärt sich damit die Verminderung der 5-HPETE-Menge in Gegenwart von Ca2+. Es ist gut vorstellbar, dass eine Ca2+-induzierte Konformationsänderung zu einer schlechteren Zugänglichkeit der für die Reduktion wichtigen Aminosäureseitenketten führt. Die Anwesenheit von PC führte zu einer noch stärkeren Hemmung der 5-HPETEReduktion, als die Zugabe von Ca2+. Die Beobachtung, dass 5-HPETE in Anwesenheit von PC teilweise vor einer Reduktion geschützt wird, ist in Übereinstimmung mit Ergebnissen von Rakonjac [62]. Vermutlich werden die, für die Reduktion wichtigen Aminosäureseitenketten bei Bindung der Domäne an die PC-Micellen teilweise verdeckt. Cystein 99 könnte eine Rolle bei dieser Reaktion spielen. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass es bei der Reduktion von 5-HPETE nicht zu einer maßgeblichen Ausbildung von Disulfidbrücken kommt. Vorstellbar wäre die Ausbildung einer Hydroxysulfonylgruppe am Cystein. Eine Beteiligung von Cystein 99 wird durch die Ergebnisse des Dockings von 5-HPETE an das Homologiemodell der 5-LO und experimentelle Daten aus anderen Arbeiten (M. Hörnig, O. Rådmark) unterstützt. Um den genauen Mechanismus aufzuklären und die physiologische Relevanz zu zeigen sind weitere umfassende Untersuchungen nötig. Um eine Bindung von Hyperforin, LP 121, C06 und B02 an die regulatorische Domäne zu untersuchen wurde ein Kompetitionsassay entwickelt. Dabei wurde rekombinante, aufgereinigte 5-LO mit dem entsprechenden Inhibitor versetzt und dann versucht, die Hemmung mit Hilfe der regulatorischen Domäne aufzuheben. Greift der Inhibitor an der regulatorischen Domäne an, so sollte die Zugabe von MBP-5LO1-128 bewirken, dass ein Teil des Inhibitors an die regulatorische Domäne bindet, er sich somit nicht mehr an der 5-LO befindet und seine Wirkung vermindert wird. Um sicher zu gehen, dass die beobachteten Effekte nicht artifiziell sind, wurde ein Inhibitor, der an der katalytischen Domäne der 5-LO angreift als Negativkontrolle für den Assay benutzt. Für diesen Zweck wurde der Eisenligandinhibitor Zileuton ausgewählt. Es ist bekannt, dass Zileuton das Eisen im aktiven Zentrum der 5-LO chelatiert und nicht an die regulatorische Domäne bindet. Die Hemmung von Zileuton konnte erwartungsgemäß durch Zugabe der regulatorischen Domäne nicht aufgehoben werden. Hyperforin und B02 zeigten eine deutlich verminderte 5-LOHemmung bei steigender Menge an MBP-5LO1-128. Die Hemmung durch LP 121 und C06 wurde nicht von der regulatorischen Domäne beeinflusst. Es konnte also ein effektives und einfaches Screeningverfahren zur Untersuchung der Bindung von 5-LO-Inhibitoren an die regulatorische Domäne entwickelt werden, mit der Einschränkung, dass der Assay nur für den Nachweis einer reversiblen Bindung von Inhibitoren an die regulatorische Domäne tauglich ist. Dieser Assay wird sich in Zukunft als wichtiges Tool bei der Suche nach neuen 5-LO-Inhibitoren erweisen, da die Substanzen mit einem direkten Angriff des aktiven Zentrums bisher nicht zu effektiven und nebenwirkungsarmen Arzneimitteln geführt haben.
Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Komplexen mittels organischer Synthese und NMR-Spektroskopie
(2008)
Viele biologische Prozesse basieren auf der spezifischen Bindung eines Liganden an einen Rezeptor. Die Wechselwirkung zwischen dem Rezeptor und seinem Ligand kann im Wesentlichen durch zwei verschiedene Modelle beschrieben werden: zum einen das vom E. Fischer eingeführte Schlüssel-Schloss-Prinzip und zum anderen das von Koshland beschriebene "induced-fit-model". Bei dem Schlüssel-Schloss-Prinzip liegt der Ligand in der Bindetasche des Rezeptors wie ein Schlüssel im Schloss. Ganz anders hierzu setzt die induzierte Anpassung ("induced-fit-model") eine konformationelle Änderung des Proteins durch den Liganden für die Bindung voraus. Ändern sich jedoch die Konformationen von Substrat und Rezeptor in einer gegenseitigen Beeinflussung, dann spricht man von "double-induced-fitmodel". Die Untersuchung dieser Erkennung auf molekularer Ebene ist von großer Wichtigkeit, denn sie dient zum besseren Verständnis und damit auch zur gezielten Beeinflussung solcher Prozesse. Wie wird der Ligand von einem Rezeptor selektiv erkannt und gebunden? Für die Erkennung und Bindung spielen spezifische nichtkovalente Wechselwirkungen eine wichtige Rolle. Zum Repertoire der nichtkovalenten Wechselwirkungen gehören die elektrostatische Wechselwirkungen, die Wasserstoffbrückenbindung und der hydrophobe Effekt.
In der vorliegenden Arbeit werden anhand von drei ausgewählten Beispielen solche Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Liganden mit ihrem Rezeptor untersucht. In den ersten beiden Kapiteln werden Proteine und im letzten Kapitel RNA als Rezeptor untersucht. Die einzelnen Kapitel beginnen jeweils mit einer kurzen Einführung der Rezeptoren und der dazugehörenden Liganden, schließlich wird dann die Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung beschrieben. Als Rezeptor wurden in der vorliegenden Arbeit Proteine (Kinasen und Membranproteine) und strukturierten Elemente der RNA (Aptamerdomäne der purinbindenden Riboswitche und der SELEX-RNA) gewählt. Membranproteine der Atmungskette, Kinasen und Riboswitches stellen zusätzlich attraktive Rezeptoren für das Wirkstoffdesign dar. Die damit interferierenden Liganden umfassen Substrate, Cofaktoren, Metabolite und Inhibitoren. Die Untersuchung der Wechselwirkung erfolgte mittels NMR-Spektroskopie und organischer Synthese.
Proteorhodopsin (PR) originally isolated from uncultivated γ-Proteobacterium as a result of biodiversity screens, is highly abundant ocean wide. PR, a Type I retinal binding protein with 26% sequence identity, is a bacterial homologue of Bacteriorhodopsin (BR). The members within this family share about 78% of sequence identity and display a 40 nm difference in the absorption spectra. This property of the PR family members provides an excellent model system for understanding the mechanism of spectral tuning. Functionally PR is a photoactive proton pump and is suggested to exhibit a pH dependent vectorality of proton transfer. This raises questions about its potential role as pH dependent regulator. The abundance of PR in huge numbers within the cell, its widespread distribution ocean wide at different depths hints towards the involvement of PR in utilization of solar energy, energy metabolism and carbon recycling in the Sea. Contrary to BR, which is known to be a natural 2D crystal, no such information is available for PR til date. Neither its functional mechanism nor its 3D structure has been resolved so far. This PhD project is an attempt to gain a deeper insight so as to understand structural and functional characterization of PR. The approach combines the potentials of 2D crystallography, Atomic Force Microscopy and Solid State NMR techniques for characterization of this protein. Wide range of crystalline conditions was obtained as a result of 2D crystallization screens. This hints towards dominant protein protein interactions. Considering the high number of PR molecules reported per cell, it is likely that driven by such interactions, the protein has a native dense packing in the environment. The projection map represented low resolution of these crystals but suggested a donut shape oligomeric arrangement of protein in a hexagonal lattice with unit cell size of 87Å*87Å. Preliminary FTIR measurements indicated that the crystalline environment does not obstruct the photocycle of PR and K as well as M intermediate states could be identified. Single molecule force spectroscopy and atomic force microscopy on these 2D crystals was used to probe further information about the oligomeric state and nature of unfolding. The data revealed that protein predominantly exists as hexamers in crystalline as well as densely reconstituted regions but a small percentage of pentamers is also observed. The unfolding mechanism was similar to the other relatively well-characterized members of rhodopsin family. A good correlation of the atomic force microscopy and the electron microscopy data was achieved. Solid State NMR of the isotopically labeled 2D crystalline preparations using uniformly and selectively labeling schemes, allowed to obtain high quality SSNMR spectra with typical 15N line width in the range of 0.6-1.2 ppm. The measured 15N chemical shift value of the Schiff base in the 2D crystalline form was observed to be similar to the Schiff base chemical shift values for the functionally active reconstituted samples. This provides an indirect evidence for the active functionality of the protein and hence the folding. The first 15N assignment has been achieved for the Tryptophan with the help of Rotational Echo Double Resonance experiments. The 2D Cross Polarization Lee Goldberg measurements reflect the dynamic state of the protein inspite of restricted mobility in the crystalline state. The behavior of lipids as measured by 31P from the lipid head group showed that the lipids are not tightly bound to the protein but behave more like the lipid bilayer. The 13C-13C homonulear correlation experiments with optimized mixing time based on build up curve analysis, suggest that it is possible to observe individual resonances as seen in case of glutamic acid. The signal to noise was good enough to record a decent spectrum in a feasible period. The selective unlabeling is an efficient method for reduction in the spectral overlap. However, more efficient labeling schemes are required for further characterization. The present spectral resolution is good for individual amino acid investigation but for uniformly labeled samples, further improvement is required.
Cellular metabolism can be envisaged by fluorescence lifetime imaging of fluorophores sensitive to specific intracellular factors such as [H+], [Ca2+], [O2], membrane potential, temperature, polarity of the probe environment, and alterations in the conformation and interactions of macromolecules. Lifetime measurements of the probes allow the quantitative determination of the intracellular factors. Fluorescence microscopy taking advantage of time-correlated single photon counting is a novel method that outperforms all other techniques with its single photon sensitivity and picoseconds time resolution. In this work, a time- and space-correlated single photon counting system was established to investigate the behavior of 2-(4-(dimethylamino)styryl)-1-methylpyridinium iodide (DASPMI) in living cells. DASPMI is known to selectively stain mitochondria in living cells. The uptake and fluorescence intensity of DASPMI in mitochondria is a dynamic measure of membrane potential. Hence, an endeavour was made to elucidate the mechanism of DASPMI fluorescence by obtaining spectrally-resolved fluorescence decays in different solvents. A bi-exponential decay model was sufficient to globally describe the wavelength dependent fluorescence in ethanol and chloroform. While in glycerol, a three-exponential decay model was necessary for global analysis. In the polar low-viscous solvent water, a mono-exponential decay model fitted the decay data. The sensitivity of DASPMI fluorescence to solvent viscosity was analysed using various proportions of glycerol/ethanol mixtures. The lifetimes were found to increase with increasing solvent viscosity. The negative amplitudes of the short lifetime component found in chloroform and glycerol at the longer wavelengths validated the formation of new excited state species from the initially excited state. Time-resolved emission spectra in chloroform and glycerol showed a biphasic increase of spectral width and emission maxima. The spectral width had an initial fast increase within 150 ps and a near constant thereafter. A two-state model based on solvation of the initially excited state and further formation of TICT state has been proposed to explain the excited state kinetics and has been substantiated by the de-composition of time-resolved spectra. The knowledge of DASPMI photophysics in a variety of solvents now provides the means of deducing complex physiological parameters of mitochondria from its behavior in living cells. Spatially-resolved fluorescence decays from single mitochondria or only very few organelles of XTH2 cells signified distinctive three-exponential decay kinetics of viscous environment. Based on DASPMI photophysics in a variety of solvents, these lifetimes have been attributed to the fluorescence from locally excited state (LE), intramolecular charge transfer state (ICT) and twisted intramolecular charge transfer (TICT) state. A considerable variation in lifetime among mitochondria of different morphology and within single cell was evident corresponding to the high physiological variations within single cells. Considerable shortening of the short lifetime component (τ1) under high membrane potential condition, such as in the presence of ATP and/or substrate, was similar to quenching and dramatic decrease of lifetime in polar solvents. Under these conditions τ2 and τ3 increased with decreasing contribution. Upon treatment with ionophore nigericin, hyperpolarization of mitochondria resulted in remarkable shortening of τ1 from 159 ps to 38 ps. Inhibiting respiration by cyanide resulted in notable increase of mean lifetime and decrease of mitochondrial fluorescence. Increase of DASPMI fluorescence on conditions elevating mitochondrial membrane potential has been attributed to uptake according Nernst distributions, to de-localisation of π electrons, quenching processes of the methyl pyridinium moiety and restricted torsional dynamics at the mitochondrial inner membrane. Accordingly, determination of anisotropy in DASPMI stained mitochondria in living XTH2 cells, revealed dependence of anisotropy on membrane potential. Such changes in anisotropy attributed to restriction of the torsional dynamics about the flexible single bonds neighboring the olefinic double bond revealed the previously known sub-mitochondrial zones with higher membrane potential along its length. Membrane-potential-dependent changes in anisotropy have further been demonstrated in senescent chick embryo fibroblasts. In conclusion, spectroscopic observations of excited-state kinetics of DASPMI in solvents and its behavior in living cells had revealed for the first time its localisation, mechanism of voltage sensitive fluorescence and its membrane-potential-dependent anisotropy in living cells. The simultaneous dependence of DASPMI photophysics on mitochondrial inner membrane viscosity and transmembrane potential has been highlighted.
Das Steroid-Hormon 17ß-Estradiol ist maßgeblich an der Entstehung und Entwicklung von Brustkrebs beteiligt. Die intrazelluläre Verfügbarkeit des aktiven Estrogens, 17ß-Estradiol, wird durch die 17ßHydroxysteroiddehydrogenase (17ßHSDl) reguliert, die die NADPH-abhängige Reduktion von Estron zu Estradiol katalysiert. Damit stellt die 17ßHSD1 einen interessanten Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Inhibitoren im Hinblick auf potente Wirkstoffe gegen Brustkrebs dar. Die 17ß-Hydroxysteroiddehydrogenase 2 bevorzugt hingegen die oxidative Aktivität und wandelt die biologisch aktiven Hydroxysteroide wie Estradiol in ihre inaktiven Ketoformen um. Ein möglicher Inhibitor der 17ß-HSD1 sollte demnach die Funktion der 17ß-HSD2 nicht beeinträchtigen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Strategien und Methoden entwickelt, die 17ßHSD1 durch heterologe Expression erstmals in E. coli darzustellen. Durch NMR-Spektroskopie in Kombination mit Docking konnten detaillierte Aussagen über die Bindungsepitope der untersuchten Liganden gemacht werden. Diese Informationen sind für eine gerichtete Optimierung von Leitstrukturen von großer Bedeutung.
Mannheimia haemolytica und Pasteurella multocida gehören zu den Verursachern der unter Rindern weltweit verbreiteten Enzootischen Bronchopneumonie. Derzeitige Impfstoffe und Antibiotika gegen diese Bakterien können die Verbreitung der Krankheit nicht maßgeblich einschränken, weshalb Bedarf an neuen Medikamenten besteht. Bei der Besiedelung der Lunge treffen M. haemolytica und P. multocida auf Eisenmangel. Die Aufnahme von Eisen ist ein wesentlicher Faktor bei der Kolonisierung und Persistenz pathogener Bakterien im Wirt, da Eisen essentiell ist. Medikamente, die an Proteinen der Eisenversorgung angreifen, können deshalb zur Eindämmung der Bronchopneumonie beitragen. Um einen Überblick über die Gene von M. haemolytica und P. multocida zu erhalten, die bei der Adaptation an Eisenmangel beteiligt sind, wurden die Bakterien in der vorliegenden Arbeit in vitro unter Eisenmangel kultiviert, denn die meisten bakteriellen Gene, die an der Eisenaufnahme beteiligt sind, werden erst bei Eisenmangel transkribiert. Mittels Mikroarray-Analyse der Transkriptome wurden erstmals die in vitro eisenregulierten Gene von M. haemolytica und erstmals auch die eisenregulierten Gene eines Rinder-Isolats von P. multocida identifiziert. Der in dieser Arbeit verwendete Mikroarray war ein Multigenom-Mikroarray und stellt die offenen Leserahmen beider Bakterien dar. Mit der Mikroarray-Analyse wurden 129 Gene von M. haemolytica identifiziert, die bei Wachstum unter Eisenmangel eine veränderte Transkription aufwiesen. Die größte Gruppe der Gene mit verstärkter Transkription bildeten die Gene, die für Rezeptoren und Transporter kodieren. Von diesen kodieren etwa drei Viertel für Proteine, die an der Aufnahme von Eisen aus verschiedenen Quellen beteiligt sind. Die größte Gruppe der Gene mit verminderter Transkription wurde von Genen gebildet, die für Proteine des Energie-Stoffwechsels kodieren. Damit wurde auch für M. haemolytica das Prinzip bestätigt, dass Bakterien bei Eisenmangel verstärkt Gene transkribieren, deren Proteine an der Eisenaufnahme beteiligt sind, während Gene für eisenhaltige Proteine des Energie-Stoffwechsels vermindert transkribiert werden. Bei der Analyse des Transkriptoms von P. multocida wurden 173 Gene mit veränderter Transkription identifiziert. Auch bei P. multocida konnte mit der funktionellen Klassifizierung der kodierten Proteine die größte Gruppe an Genen mit verstärkter Transkription den Transport- und Bindungsproteinen zugeordnet werden. Die größte Gruppe an Genen mit verminderter Transkription wurde auch bei P. multocida von Genen gebildet, die für Proteine des Energie-Stoffwechsels kodieren. Beim Vergleich des Transkriptoms von M. haemolytica mit dem von P. multocida wurden mehr Unterschiede als Gemeinsamkeiten festgestellt. Nur 40 der 1424 homologen Gene zeigten die gleiche Richtung in der Änderung in der Transkription. Unter den 15 homologen Genen mit verstärkter Transkription waren die Gene, die für einen Hämoglobin-Rezeptor, die ABC-Transportsysteme FbpABC und YfeABCD sowie das Energie liefernde System TonB-ExbBD kodieren. In den 25 homologen Genen mit verminderter Transkription waren 15 Gene enthalten, deren kodierte Proteine am Energie-Stoffwechsel beteiligt sind. Dies waren die Proteine NapABCDFGH des Nitrat-Reduktase-Komplexes, die Proteine NrfABCD des Nitrit-Reduktase-Komplexes und die Proteine FrdABCD des Komplexes der Fumarat-Reduktase. Ein auffälliger Unterscheid war, dass bei M. haemolytica die gesamten Gene verstärkt transkribiert wurden, deren Proteine an der Aufnahme von Eisen aus Transferrin beteiligt sind. Bei P. multocida dagegen konnte das Gen für den Transferrin-Rezeptor nicht nachgewiesen werden. Somit gehört das in dieser Arbeit verwendete Isolat von P. multocida vermutlich zu den 30% der Rinder-Isolate von P. multocida, die keinen Transferrin-Rezeptor besitzen, aber die Rinderlunge besiedeln können (Ewers et al., 2006). Im Vergleich zu M. haemolytica fielen bei P. multocida die vielen verstärkt transkribierten Gene auf, die an der Aufnahme von Eisen aus dem Blut beteiligt sind. Die Transkription dieser verschiedenen Transporter deutet auf eine gute Adaptation von P. multocida für die Verwendung von Eisen aus dem Blut des Wirts hin, die bei M. haemolytica in diesem Maß nicht gegeben scheint. Für M. haemolytica wurde die in vivo-Relevanz einiger eisenregulierter Gene überprüft, die in der Mikroarray-Analyse eine erhöhte Transkription zeigten. Dazu wurde die RNA untersucht, die aus dem Lungengewebe von infizierten Rindern isoliert worden war. In diesem Gewebe wurde die Transkription von 11 Genen mittels RT-PCR nachgewiesen. Für die Gene, die für die Hämoglobin-Rezeptoren von M. haemolytica kodieren, wurde mittels quantitativer real time PCR auch eine Verstärkung der Transkription im Lungengewebe nachgewiesen. Die Verstärkung der Transkription in vivo war der transkriptionellen Verstärkung in vitro vergleichbar, was auf eine Funktion der Hämoglobin-Rezeptoren bei der Infektion in vivo hindeutet. Zur Untersuchung der Regulation des Eisenhaushalts von M. haemolytica wurde versucht, das Gen fur zu deletieren, das für den Hauptregulator des Eisenhaushalts kodiert, was jedoch nicht gelungen ist. In einem antisense-Ansatz konnte jedoch gezeigt werden, dass der Stamm mit dem fur-antisense-Plasmid ein signifikant verzögertes Wachstum hatte, was auf die essentielle Funktion des Gens fur in M. haemolytica hinweist. Ein antisense-Ansatz ist noch kein Beweis für die essentielle Funktion eines Gens. Doch die mit Gioia et al. (2007) übereinstimmenden Schwierigkeiten bei der Herstellung einer ∆-fur-Mutante von M. haemolytica sowie das verringerte Wachstum in Gegenwart der fur-antisense-mRNA deuten stark auf eine essentielle Funktion dieses Gens hin.
Pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) is a well established method concerning nanometer distance measurements involving two nitroxide spin-labels. In this thesis the applicability of this method to count the number of spins is tested. Furthermore, this work explored the limits, up to which PELDOR data obtained on copper(II)-nitroxide complexes can be quantitatively interpreted. Spin counting provides access to oligomerization studies – monitoring the assembly of homo- or hetero-oligomers from singly labeled compounds. The experimental calibration was performed using model systems, which contain one to four nitroxide radicals. The results show that monomers, dimers, trimers, and tetramers can be distinguished within an error of 5% in the number of spins. Moreover, a detailed analysis of the distance distributions in model complexes revealed that more than one distance can be extracted from complexes bearing several spins, as for example three different distances were resolved in a model tetramer – the other three possible distances being symmetry related. Furthermore, systems exhibiting mixtures of oligomeric states complicate the analysis of the data, because the average number of spin centers contributes nonlinearly to the signal and different relaxation behavior of the oligomers has to be treated explicitly. Experiments solving these problems are proposed in the thesis. Thus, for the first time spin counting has been experimentally calibrated using fully characterized test systems bearing up to four spins. Moreover, the behavior of mixtures was quantitatively interpreted. In addition, it has been shown that several spin-spin distances within a molecule can be extracted from a single dataset. In the second part of the thesis PELDOR experiments on a spin-labeled copper(II)-porphyrin have been quantitatively analyzed. Metal-nitroxide distance measurements are a valuable tool for the triangulation of paramagnetic metal ions. Therefore, X-band PELDOR experiments at different frequencies have been performed. The data exhibits only weak orientation selection, but a fast damping of the oscillation. The experimental data has been interpreted based upon quantitative simulations. The influence of orientation selection, conformational flexibility, spin-density distribution, exchange interaction J, as well as anisotropy and strains of the g-tensor has been examined. An estimate of the spin-density delocalization has been obtained by density functional theory calculations. The dipolar interaction tensor was calculated from the point-charge model, the extension of the point-dipole approximation to several spin bearing centers. Even assuming asymmetric spin distributions induced by an ensemble of asymmetrically distorted porphyrins the effect of delocalization on the PELDOR time trace is weak. The observed damping of dipolar oscillations has been only reproduced by simulations, if a small distribution in J was assumed. It has been shown that the experimental damping of dipolar modulations is not solely due to conformational heterogeneity. In conclusion the quantitative interpretation of PELDOR data is extended to copper-nitroxide- and multi-spin-systems. The influence of the mean distance, of the number of coupled spins, of the conformational flexibility, of spin-density distribution and of the electronic structure of the spin centers has been analyzed using model systems. The insights on model compounds mimicking spin-labeled biomacromolecules – in oligomeric or metal bound states – calibrate the method with respect to the information that can be deduced from the experimental data. The resulting in-depth understanding allows correlating experimental results (from for example biological systems) with models of structure and dynamics. It also opens new fields for PELDOR as for example triangulation of metal centers and oligomerization studies. In general, this thesis has demonstrated that modern pulsed electron paramagnetic resonance techniques in combination with quantitative data analysis can contribute to a detailed insight into molecular structure and dynamics.
Der Typ I Interferonrezeptor, der aus den Transmembranproteinen ifnar1 und ifnar2 besteht, nimmt eine wichtige Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunantwort ein. Durch Bindung von Typ I Interferonen werden antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Aktivitäten in der Zelle induziert. Die Wirkung der Interferone wird bereits bei der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten eingesetzt. Es ist bislang nicht bekannt, wie die verschiedenen Typ I Interferone nach Bindung an einen gemeinsamen Rezeptor, unterschiedliche Zellantworten induzieren. So unterscheiden die Typ I Interferone sich nicht hinsichtlich ihrer Bindungsstelle oder der Stöchiometrie der Bindung an ifnar1 bzw. ifnar2. Sie weisen jedoch unterschiedliche Affinitäten zu den Rezeptoruntereinheiten auf, wobei ihnen eine niedrigere Affinität zu ifnar1 gemeinsam ist. Bislang konnte keine Interaktion zwischen den Rezeptoruntereinheiten nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass bei der Rezeptorassemblierung das Interferon zunächst an ifnar2 bindet und anschließend ifnar1 rekrutiert. Es wird postuliert, dass die unterschiedlichen Zellantworten für verschiedene Typ I Interferone auf Unterschieden in der Stabilität der ternären Komplexe beruhen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Struktur und Dynamik des Interferonrezeptors in vitro für die Typ I Interferone IFNa2 und IFNb charakterisiert. Die Struktur des ternären Komplexes aus den extrazellulären Domänen von ifnar1 und ifnar2 mit IFNa2 wurde mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Über Einzelpartikelanalyse aufgereinigter Komplexe von IFN mit den extrazellulären Domänen von ifnar1 (ifnar1-EC) und ifnar2 (ifnar2-EC) konnte ein Strukturmodell des ternären Komplexes erstellt werden. Dieses zeigte eine Verschiebung der membranproximalen Domänen von ifnar1-EC und ifnar2-EC wie sie bereits für den Rezeptor für Erythropoietin und den Wachstumsfaktor beobachtet wurden, welche zu den Typ I Zytokinrezeptoren gehören. Die Struktur des ternären Komplexes ermöglicht als erste Struktur eines Typ II Zytokinrezeptors einen Einblick in die Architektur des Komplexes und mögliche Aktivierungsmechanismen. Die Strukturen der Komplexe für die verschiedenen Typ I Interferone IFNa2 und IFNb wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf, was auf einen gemeinsamen Aktivierungsmechanismus hinweist. Temperatur-abhängige Messungen von Bindungskinetik und –affinität ergaben sehr unterschiedliche Energiehyperflächen für die Ligandenbindung an ifnar1- und ifnar2-EC, und wiesen auf einen mehrstufigen Prozess und mögliche Konformationsänderungen bei der Bindung an ifnar1-EC hin. Zur Analyse der Dynamik von ifnar1-EC wurden daher verschiedene fluoreszenzbasierte Assays etabliert. Eine besondere Herausforderung bestand darin, das Protein ortsspezifisch und stöchiometrisch mit zwei verschiedenen Fluorophoren zu koppeln. Ifnar1-EC wurde an verschiedenen Stellen kovalent mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Es wurde gezeigt, dass nach Bindung eines geeigneten tris-NTA-Fluorophor-Konjugats an den C-terminalen His-Tag die Fluoreszenz abstandsabhägig durch Förster-Resonanz-Energie-Transfer gelöscht wurde. Für ifnar1-EC wurde eine ligandeninduzierte Abstandsänderung detektiert. Die detaillierte Analyse ergab nach Bindung von IFNa2 eine Abstandszunahme von 13 A vom N- zum C-Terminus. Durch die Interferonbindung nimmt demnach ifnar1-EC eine gestrecktere Konformation ein. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in Anwesenheit von ifnar2-EC und für IFNb erhalten. Die Einzelmolekülanalysen mittels Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) zeigten sowohl einen Verlust der Flexibilität von ifnar1-EC nach Ligandenbindung als auch ein ligandeninduziertes Rearangement der Ig-ähnlichen Domänen. Die Änderung der Flexibilität wurde durch Messungen der Fluoreszenzlebensdauer bestätigt. Untersuchungen der Kinetik der Ligand-induzierten Konformationsänderung mittels Stopped-Flow Messungen bestätigten eine mehrstufige Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen nach Ligandenbindung. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich nach Ligandenbindung die Zugänglichkeit des Tryptophans in der membranproximalen Domäne von ifnar1-EC ändert. Da die membranproximale Domäne nicht bei der Ligandenbindung beteiligt ist, deutet dieser Effekt auf eine Propagation der Ligand-induzierten Konformationsänderung in diese Domäne hin. Das Tryptophan könnte mit der Membran interagieren, was auf eine wichtige Rolle der membranproximalen Domäne für die korrekte Orientierung von ifnar1 in der Membran hindeut. Die Stopped-Flow Analyse zeigte, dass es sich hierbei um einen einstufigen Prozess handelt, der mit der Interferonbindung korreliert. Die Ergebnisse wiesen insgesamt auf eine Ligand-induzierte Flexibilitätsänderung und Umorientierung der Ig-ähnlichen Domänen bei ifnar1-EC hin. Vermutlich wird nach Ligandenbindung das Signal in die membranproximale Domäne von ifnar1-EC propagiert. Die Strukturen der ternären Komplexe mit den verschiedenen Typ I Interferonen wiesen keine fundamentalen Unterschiede auf. Auch die Ergebnisse der fluoreszenzbasierten Assays zeigten keine Unterschiede für IFNa2 und IFNb, was die Hypothese stützt, dass die differentielle Aktivität der Interferone nicht auf grundsätzlichen Unterschieden in der Architektur des ternären Komplexes beruht, sondern in der unterschiedlichen Dynamik der Komplexe codiert sein könnte.
Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Synthese und strukturellen Charakterisierung von sandwichartig aufgebauten kupferhaltigen Organosiloxanen. Diese sollten nach Möglichkeit kristalline Eigenschaften aufweisen und ein interessantes magnetisches Verhalten zeigen. Es galt, die Beziehungen zwischen molekularer Struktur und magnetischen Eigenschaften herauszuarbeiten, um auf der Basis experimenteller Daten dem maßgeschneiderten Design neuer molekularer Magnete näher zu kommen. .... Die in der hier vorgelegten Arbeit erzielten Ergebnisse belegen, dass der Weg zur gezielten Erzeugung molekularer Magnete erfolgreich beschritten wurde. Es wird weiteren Arbeiten vorbehalten bleiben, Cluster der nun vorliegenden Art chemisch so zu verknüpfen, dass daraus polymere Ketten oder Netzwerke entstehen. Deren magnetisches Verhalten lässt erwarten, dass damit möglicherweise neue Materialien zugänglich werden, die dem Anspruch eines molekularen Magneten voll gerecht werden.
Ribozyme und siRNAs sind in der Lage, durch sequenzspezifische Spaltung der viralen RNA, die HIV-Replikation in vitro zu inhibieren. Es konnten bis jetzt allerdings nur wenige Antisense-basierte Therapeutika entwickelt werden, die eine ausreichend effiziente antivirale Wirkung in klinischen Studien zeigen. In dieser Arbeit wurden verschiedene Untersuchungen zur Wirksamkeit von therapeutischen RNA-Effektor-Molekülen durchgeführt. Die Effizienz von exogen in Zellen transfizierter therapeutischer siRNAs wird von vielen Faktoren beeinflusst. Neben der Bindung der Effektor-RNA an ihre Ziel-RNA und der Stabilität der Effektor-RNA sind weitere wichtige Faktoren die Lokalisation innerhalb der Zelle sowie die Effizienz der Transfektion. Zur Beurteilung der Knockdown-Effizienz einer exogen zugeführten Effektor-RNA bedarf es somit einer Meßmethode, die diese unterschiedlichen Parameter berücksichtigt. Wesentlich ist dabei insbesondere die Transfektionseffizienz, in den meisten in vitro Studien finden jedoch Unterschiede in der Transfektionseffizienz wenig Beachtung. Da die Wirksamkeit der Effektor-RNA in einer Zelle nur dann hinreichend beurteilt werden kann, wenn bekannt ist wie viel RNA in die jeweilige Zelle transfiziert wurde, wurde ein Assay-System etabliert, mit welchem die Konzentrations-Wirkungs-Beziehung der Effektor-Moleküle ermittelt werden kann. Mit Hilfe dieses Assay-Systems wurde in dieser Arbeit der Einfluss verschiedener Nukleotidanaloga auf die Wirksamkeit von siRNAOligonukleotiden untersucht. Bei dem einen Nukleotidanaloga handelt es sich um das 2,4,6-Trifluorbenzene, eine universelle Base, welche den RNA-Duplex partiell destabilisiert. Es konnte bereits gezeigt werden, dass für die Effektivität von siRNAs ein thermodynamisch destabilisiertes 5’-Ende des antisense-Stranges von Vorteil ist. Eine siRNA mit zwei 2,4,6-Trifluorbenzenen am 5’-Ende des sense-Stranges zeigte eine erhöhte Effektivität gegenüber den Kontrollen. Das zweite Nukleotidanaloga war das 4,6-Difluorbenzimidazol. Dabei handelt es sich ebenfalls um eine universelle Base, die nicht zwischen den einzelnen Basen diskriminiert. Die Verwendung dieser Base soll die Toleranz einer verwendeten siRNA gegenüber Punktmutationen erhöhen. Im Einsatz gegen HIV könnte diese Strategie die Bildung von Escape-Mutanten verhindern. Diese Base wurde an den Positionen 7 und 10 im antisense-Strang eingebaut. Als Kontrollen wurden an diesen Positionen mismatch-Basenpaarungen eingesetzt. An diesen Positionen werden mismatch-Basenpaarungen allerdings gut toleriert, so dass durch den Einsatz des 4,6-Difluorbenzimidazol keine Effektivitätssteigerung erreicht werden konnte. Durch gezielte Punktmutagenese konnten Nukleotidpositionen innerhalb des siRNA Moleküls identifiziert werden, bei denen mismatch-Basenpaarungen zu einem hohen Aktivitätsverlust führen und an denen der Einbau des 4,6-Difluorbenzimidazol sinnvoll erscheint. Ein zweiter Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit anti-HIV Ribozymen. In unserer Arbeitsgruppe wurden mehrere neue anti-HIV Ribozyme entwickelt und charakterisiert. Das Hammerhead Ribozym gegen das 13. GUC Triplett im Pol Gen erwies sich als äußerst effizienter Inhibitor der HIV-Replikation in vitro. In dieser Arbeit konnte die antivirale Wirksamkeit durch Bestimmung der kinetischen Parameter bestätigt werden. Der Wert für Kcat von 3,9 min-1 entspricht der Spaltungsrate von Hammerhead Ribozymen von <5 min-1. Der ermittelte Wert ist verglichen mit anderen anti-HIV Ribozymen sehr hoch. Es handelt sich um ein Ribozym mit einer sehr hohen molaren katalytischen Aktivität. Die antivirale Wirkung dieses anti-HIV Ribozyms sollte durch die Kolokalisation an seine Target-RNA zusätzlich verbessert werden. Ribozyme binden sequenzspezifisch an ihre Target RNA, das Zusammentreffen von Ribozym und Ziel-RNA ist jedoch ein zufälliges Ereignis. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Kolokalisation von Ribozymen zu einer Effektivitätssteigerung führt. Es war geplant das Ribozym über RNA-Aptamere an die HIV-1 Proteine Tat und Rev zu kolokalisieren, da beide Proteine spezifisch über ihre RNA Bindedomäne an die HIV mRNAStrukturen TAR (Tat Activated Region) bzw. RRE (Rev Responsive Element) binden. In dieser Arbeit konnten Expressionssysteme und die Reinigung für beide viralen Proteine etabliert werden, allerdings ließ sich das Affinitätstag nicht durch Proteaseverdau entfernen. Aus diesem Grund wurde die Selektion der Aptamere mit Peptiden durchgeführt. In dieser Arbeit konnten jedoch keine RNAs identifiziert werden, die eine Affinität zu den Peptiden aufwiesen. RNA Interferenz wird zunehmend als das effektivste Verfahren zum spezifischen Knockdown einer mRNA angesehen. Zum Vergleich von siRNA mit anti-HIV Ribozymen wurden überlappende Zielsequenzen im HIV-1 Pol Gen für beide Effektor-Moleküle identifiziert und ihre antivirale Wirkung verglichen. Beide Ribozyme und shRNAs wurden retroviral in T-Zellen exprimiert, um die antivirale Wirkung der beiden Effektor-Moleküle vergleichen zu können. Die antivirale Aktivität der siRNAs wurde nach HIV-1 Exposition mit der unseres Referenzribozyms HHPol 13 verglichen. Die siRNA gegen eine Sequenz im Bereich des 7. GUC Tripletts im HIV-1 Pol Gen war in der Lage die HIV Replikation effektiv zu hemmen. In gleicher Weise konnte dies auch das Referenzribozym gegen das 13. GUC Triplett im Pol Gen. Die siRNA, die gegen die gleiche Sequenz wie das effektive Ribozym gerichtet war, zeigte hingegen keinerlei antivirale Aktivität. Dieses Ergebnis zeigt, dass ein Ribozym ebenso effektiv wie eine siRNA die HIV Replikation hemmen kann. Die siRNA, die gegen die gleiche Sequenz wie das effektive Ribozym gerichtet ist, hatte keine antivirale Aktivität. Neben der Zugänglichkeit der Ziel-RNA beeinflussen scheinbar noch andere Faktoren die Effizienz von siRNA-Molekülen. In diesen Experimenten wurden erstmals systematisch siRNAs und Ribozyme gegen identische Zielsequenzen miteinander vergleichen. Der antivirale Effekt der siRNA Pol7 wurde näher untersucht. Um die Effizienz der siRNA leichter zu bestimmen und vergleichen zu können, wurden die weiteren Versuche mit synthetischen Oligonukleotiden und der Zelllinie Hela-P4 CCR5 durchgeführt. Dabei zeigte die siRNA eine sehr gute Inhibition der viralen Replikation.
Antibiotic resistance of pathogenic bacteria is a major worldwide problem. Bacteria can resist antibiotics by active efflux due to multidrug efflux pumps. The focus of this study has been the mycobacterial multidrug transporter TBsmr because it belongs to the small multidrug resistance (SMR) family whose members are a paradigm to study multidrug efflux due to their small size. SMR proteins are typically 11-12 kDa in size and have a four-transmembrane helix topology. They bind cationic, lipophilic antibiotics such as ethidium bromide (EtBr) and TPP+, and transport them across the membrane in exchange for protons. To understand the molecular mechanism of multidrug resistance, we have to gain information about the structure and function of these proteins. The research described in this thesis aimed to deduce details about the topology, transport cycle and key residues of TBsmr using biophysical techniques. Solid-state NMR (ssNMR) can provide detailed insight into structural organization and dynamical properties of these systems. However, a major bottleneck is the preparation of mg amounts of isotope labeled protein. In case of proteoliposomes, the problem is compounded by the presence of lipids which have to fit into the small active volume of the ssNMR rotor. In Chapter 3, an enhanced protein preparation is described which yields large amounts of TBsmr reconstituted in a native lipid environment suitable for further functional and structual studies. The achieved high protein-to-lipid ratios made a further characterization by ssNMR feasible. The transport activity and oligomeric state of the reconstituted protein in different types of lipid was studied as shown in Chapter 4. The exact oligomeric state of native SMR proteins is still uncertain but a number of biochemical and biophysical studies in detergent suggest that the minimal functional unit capable of binding substrate is a dimer. However, binding assays are not ideal since a protein may bind substrate without completing the transport cycle which can only be shown for reconstituted protein in transport assays.By combining functional data of a TPP+ transport assay with information about theoligomeric state of reconstituted TBsmr obtained by freeze-fracture electron microscopy, it could be shown that lipids affect the function and the oligomeric state of the protein, and that the TBsmr dimer is the minimal functional unit necessary for transport. The transport cycle must involve various conformational states of the protein needed for substrate binding, translocation and release. A fluorescent substrate will therefore experience a significant change of environment while being transported, which influences its fluorescence properties. Thus the substrate itself can report intermediate states that form during the transport cycle. In Chapter 5, the existence of such a substrate-transporter complex for the TBsmr and its substrate EtBr could be shown. The pH gradient needed for antiport has been generated by co-reconstituting TBsmr with bacteriorhodopsin. The measurements have shown the formation of a pH-dependant, transient substrate-protein complex between binding and release of EtBr. This state was further characterized by determining the Kd, by inhibiting EtBr transport through titration with non-fluorescent substrate and by fluorescence anisotropy measurements. The findings support a model with a single occluded intermediate state in which the substrate is highly immobile. Liquid-state NMR is a useful tool to monitor protein-ligand interactions by chemical shift mapping and thus identify and characterize important residues in the protein which are involved in substrate binding. In agreement with previous studies (Krueger-Koplin et al., 2004), the detergent LPPG was found to be highly suitable for liquid-state NMR studies of the membrane protein TBsmr and 42% of the residues could be assigned, as reported in Chapter 6. However, no specific interactions with EtBr were found. This observation was confirmed by LILBID mass spectrometry which showed that TBsmr was predominantly in the non-functional monomeric state. Functional protein was prepared in proteoliposomes which can be investigated by solidstate NMR (Chapter 7). Besides the essential E13, the aromatic residues W63, Y40, and Y60 have been shown to be directly involved in drug binding and transport. Different isotope labeling strategies were evaluated to improve the quality of the NMR spectra to identify and characterize these key residues. In a single tryptophan mutant of reconstituted TBsmr W30A, the binding of ethidium bromide could be detected by 13C solid-state NMR. The measurements have revealed two populations of the conserved W63 residue with distinct backbone structures in the presence of substrate. There is a controversy about the parallel or anti-parallel arrangement of the protomers in the EmrE dimer (Schuldiner, 2007) but this structural asymmetry is consistent with both a parallel and anti-parallel topology.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei Knockout-Mutanten für die Cyclophiline CypA1 und CypA2 hergestellt. Für die Konstruktion wurde nicht nur das eigentlich Gen verwendet, sondern auch umliegende Bereiche. Im Endeffekt standen der homologen Rekombination an beiden Seiten des Knockout-Konstrukts ca. 1000 bp zur Verfügung. Zunächst wurden die DNA-Abschnitte der Cyclophiline aus der genomischen DNA von Streptomyces lividans mittels PCR isoliert. Aufgrund des hohen GC-Gehalts wurde die Amplifikation in Fragmenten durchgeführt. Es wurden verschiedene PCR-Bedingungen getestet und für jedes Fragment optimale Bedingungen ermittelt. Nach Aufreinigung und A-Tailing folgte eine Ligation mit pGemT-Easy. Die erhaltenen Fragmente wurden sequenziert und anschließend über mehrere Klonierungsschritte in E. coli wieder zusammengefügt. Dabei wurde eine Apramycinresistenz-Kassette so in das Gen eingebaut, dass die eigentliche Information für das Cylophilin-Gen zerstört wurde. Das daraus resultierende Knockout-Konstrukt wurde in den temperatursensitiven pGM160, einem E.coli-Streptomyces-Shuttle Vektor, kloniert und in Streptomyces lividans transformiert. Nach einem Temperaturshift integrierte der temperatursensitive Vektor über homologe Rekombination in das Genom. Die DNA der potenziellen Mutanten wurde auf den zielgerichteten Einbau des Knockout-Konstrukts im gewünschten Cypclophilin-Gen untersucht. Mittels PCR konnten entsprechende Amplifikate hergestellt werden, die den Nachweis für die erfolgreiche homologe Rekombination lieferten. Der physiologische Zustand des Zellstoffwechsels kann durch extreme Umweltbedingungen wie Nährstoffdefizienz oder Hitzeschock in radikaler Weise verändert werden. Bei diesen Prozessen können Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen beteiligt sein, indem sie durch Isomerisation der Prolyl-Bindung ein Enzym modulieren oder bei der Expression von neuen Proteinen im Rahmen der Proteinfaltung mitwirken. Experimente unter veränderten Wachstumsbedingungen wie z.B. Nährstoffdefizienz oder Hitzeschock können Aufschluss darüber geben, ob in diesem Fall Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen an der Modulation von Enzymen beteiligt sind.
Die Arbeit überprüft die Zusammensetzung der F1FO-ATP-Synthase in Säugetiermitochondrien, dem Enzymkomplex, der das meiste ATP für den Energiebedarf einer Zelle liefert. Es sind zwei neue Proteine identifiziert und als ATP-Synthase assoziiert verifiziert worden, das sog. dapit protein (diabetes-associated protein in insulin-sensitive tissue; Datenbanknummer in NCBI für Rattus norvegicus, gi|19424210) bzw. 6.8 kDa mitochondrial proteolipid (Datenbanknummer in NCBI für Rattus norvegicus, gi|109478763). Bis jetzt sind beide Proteine nicht zusammen mit dem Komplex V detektiert worden, da es sich bei beiden Proteinen um sehr kleine Membranproteine (kleiner 7 kDa) handelt und sie sehr leicht in Gegenwart von Detergenzien verloren gehen. Die etablierte Strategie zur milden Aufreinigung von Komplex V, die eingesetzte gelelektrophoretische Trennung und die gewonnenen Erkenntnisse zur Identifizierung solch kleiner Proteine können sicherlich auch Lösungsansätze für andere ungelöste Problemfälle in der Proteinkomplexanalytik liefern. Da beide neuen Proteine in die Modulation des metabolischen Zellzustandes involviert sein könnten, sind die erarbeiteten Daten für weitere funktionelle und biochemische Untersuchungen der ATP-Synthase äußerst nützlich. Außerdem könnten die Ergebnisse für neurologische und klinische Studien hinsichtlich der Ursachenforschung von Funktionsstörungen in den Mitochondrien von Interesse sein, da eines der zwei neuen Proteine früher schon mit Diabetes in Zusammenhang gebracht worden ist (dapit, diabetesassociated protein in insulin-sensitive tissue). Für ein bakterielles Multihäm c-Typ Cytochrom konnte massenspektrometrisch gezeigt werden, dass es auf eine unkonventionelle Weise Häm bindet. Durch massenspektrometrische Charakterisierung des Proteins konnte erstmals nachgewiesen werden, dass es nicht nur die Häm c-Bindemotive CX2-4CH und CXXCK, sondern auch Häm c-Bindemotive der Form CXnCH in Bakterien gibt. Diese Erkenntnis führt in der Molekularbiologie zu neuen Fragen, z. B. welche speziellen Lyasen (cytochrome c haem lyases) letztendlich für das Einfügen der Häm-Gruppe an solche neuen Motive verantwortlich sind. Auch die computerbasierte Vorhersage von c-Typ Cytochromen wird dieses Wissen wohl zukünftig in Suchstrategien umsetzen, um die neuen Häm c-Bindemotive bei der Genomanalyse von Organismen nicht zu übersehen. In dem Feld der Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen im Allgemeinen konnten grundlegende Erkenntnisse zum Umgang mit alternativen Enzymen und deren Potential für einen zukünftigen Einsatz erarbeitet werden. Schwerpunktmäßig wurden die Enzyme Chymotrypsin, Elastase und Pepsin untersucht. Es konnte für alle drei Kandidaten gezeigt werden, dass sie bevorzugt an einer begrenzten Anzahl von Aminosäuren spalten. Besonders für Elastase ist diese Erkenntnis neu, da sie in der Literatur bisher als unspezifisches Enzym wie Proteinase K geführt wurde. Auch wenn die Spezifität der drei Enzyme nicht zu 100% wie bei Trypsin festgelegt werden kann, sondern es sich nur um eine Bevorzugung gewisser Aminosäuren handelt, sind die enzymatischen Spaltungen reproduzierbar. Selbst eine Auswertung der MS-Spektren mittels Peptide Mass Fingerprint (PMF) ist deshalb auch bei diesen weniger spezifischen Enzymen möglich. Die Intensität der MS-Signale muss aber berücksichtigt werden, was bei bisherigen PMF-Suchen jedoch nicht in der Art und Weise geschieht, wie es für diese Enzyme nötig wäre. An einigen Membranproteinen konnte letztendlich bereits beispielhaft gezeigt werden, dass der Einsatz von weniger spezifischen Enzymen für die Identifizierung des Proteins und der nachfolgenden Charakterisierung (z. B. Identifizierung von posttranslationale Modifikationen) vorteilhaft ist. Für Elastase konnte in diesem Zusammenhang auch demonstriert werden, dass sie problemlos in Lösungsmittelsystemen mit einem hohen organischen Anteil (Acetonitril, Isopropanol, Methanol) einsetzbar ist. 100% Sequenzabdeckung lassen sich aber auch bei weniger spezifischen Enzymen trotz der größeren Anzahl an Schnittmöglichkeiten nur erahnen. Zwei Hauptursachen hierfür sind wahrscheinlich die schlechte Zugänglichkeit des Enzyms zum Membranprotein bzw. die Bevorzugung bestimmter enzymatischer Fragmente in MALDI und ESI. Polyacrylamidgele mit alternativen Quervernetzern, bei denen sich die Geldichte vor dem Verdau verringern lässt, könnten die Zugänglichkeit zum Membranprotein zukünftig vielleicht positiv beeinflussen. Der Einsatz von organischen Lösungsmitteln und bestimmter Detergenzien beim Verdau verbessert ebenfalls die Zugänglichkeit zum Membranprotein. Die Zahl der Tenside, die mit der Massenspektrometrie sehr gut kompatibel sind, ist aber sehr gering, wie Untersuchungen in dieser Arbeit ebenfalls ergeben haben. Außerdem beschränkt sich die Anwendung von diesen Detergenzien ausschließlich auf MALDI. Die zu erwartenden Fortschritte bei der Identifizierung und Charakterisierung von Membranproteinen umschreibt daher besonders gut ein Aphorismus von Christian Morgenstern (deutscher Schriftsteller; 1871 – 1914): „Es gibt nur ein Neues: Die Nuance.“ Einige Nuancen sind in dieser Arbeit enthalten. In der Zukunft werden aber viele weitere solcher Nuancen das Überwinden der Hürde „Membran Proteomics“ immer realistischer werden lassen.