Refine
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (729) (remove)
Has Fulltext
- yes (729)
Is part of the Bibliography
- no (729)
Keywords
- NMR-Spektroskopie (11)
- RNS (9)
- Membranproteine (8)
- RNA (8)
- Paracoccus denitrificans (7)
- Cytochromoxidase (6)
- Ubihydrochinon-Cytochrom-c-Reductase (6)
- ABC-Transporter (5)
- Gentherapie (5)
- HIV (5)
Institute
- Biochemie und Chemie (729) (remove)
Beiträge zur Erweiterung der Hückel'schen Theorie der π-Elektronensysteme [Pi-Elektronensysteme]
(1963)
Beiträge zur Erweiterung der Hückel'schen Theorie der Pi-Elektronensysteme Hückel entwickelte 1931 ein Verfahren zur quantenmechanischen Berechnung zahlreicher Eigenschaften von zr-Elektronensystemen. Obwohl die Theorie halbtheoretisch ist, hat sie einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis solcher Eigenschaften von ungesättigten und aromatischen Verbindungen geliefert, die dem Grundzustand der Moleküle zugeschrieben werden können, so z. B. der Resonanzstabilität und der Reaktivität. Doch ist sie nur in der Lage, die Eigenschaften dieser Verbindungen richtig zu beschreiben, die durch angeregte Zustände der Moleküle mitbestimmt werden, wie z. B. die Spektren, wenn man für das Resononanzintegral einen entsprechenden Wert verwendet, der von dem für den Grundzustand benutzten bedeutend abweichen kan. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wird die Hückel'schen Theorie der Pi-Elektronensysteme diskutiert. Einen nur annähernd vollständigen Überblick über die Beiträge zu dieser Theorie zu geben, würde den Rahmen der Arbeit überschreiten. Daher wurde sich im Wesentlichen darauf beschänkt, die Grundgedanken und die Näherungen des Verfahrens klar darzustellen und kritisch zu betrachten, sowie die Anwendungsmöglicheiten zu beschreiben. Hartmann hat 1960 eine Erweiterung der Hückel 'schen Theorie vorgeschlagen, die auch solche Eigenschaften ungesättigter und aromatischer Verbindunsen richtig erfaßt, die aur der Beteiligung angeregter Zustände beruhen, wie am Beispiel der Spektren gezeigt wurde. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die Hückel-Hartmann'sche Theorie der Pi-Elektronensysteme dargestellt und die Ergebnisse mit denen der Hückel'schen Theorie verglichen. Hartmann selbst hat die Erweiterung nur für gleichatomige Pi-Elektronensysteme und unter zahlreichen Vernachlässigunen durchgeführt. Dieser Umstand und die wenigen zu der Theorie erst vorliegenden Arbeiten ließen es wünschensert erscheinen, die Hückel-Hartmannsche Theorie der Pi-Elektronensysteme systematisch und in möglichst allgemeiner Form zu diskutieren. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird daher eine Generalisierung der Hückel-Hartmannt'schen Theorie durchgeführt. Mit Hilfe des entwickelten Verfahrens wird anschließend der Einfluß der Überlappungen auf die Ergebnisse untersucht und eine Erweiterung der Hückel-Hartmann'schen Theorie auf heteroatomare Pi-Elektronensysteme angegeben.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden modifizierte Nukleoside synthetisiert, um ihren Einfluss auf die Stabilität von RNA-Duplexen zu untersuchen. Bei den fluorierten Benzimidazol-Nukleosidanaloga handelt es sich um universelle Basen, die bei der Basenpaarung nicht zwischen den vier natürlichen Nukleosiden unterscheiden können. Die dabei auftretende Destabilisierung der RNA-Duplexe sollte durch die Änderung physikalisch-chemischer Eigenschaften vermindert werden. Durch die Synthese der fluorierten Indol-Nukleosidanaloga mit denselben Fluoratompositionen sollte nachgewiesen werden, welche Rolle ein ausfallendes Stickstoffatom im Fünfring-System spielt. Weitere Untersuchungen wurden so entwickelt, dass die zwei spC-F in 4,6DFBI wie auch in 4,6DFI mit Stickstoffatomen getauscht wurden. So wurde noch eine neue Serie Nukleosidanaloga synthetisiert (Abbildung 9.2). Schließlich wurde noch 1-Desoxy-D-ribofuranose AS als absischer Baustein synthetisiert. Die Synthese der Indol- und 9-Deazapurin-Nukleosidanaloga wurde über eine Glycsilierungsreaktion mit geeignet geschützter Deoxyribose durchgeführt. Dies wurde über vier Stufen, ohne Aufreinigung, aus Deoxyribose synthetisiert. Die entsprechenden Deoxy-nukleoside wurden danach in fünf Schritten zu Ribo-nukleosiden transformiert. Nach der Entschützung von Toluoyl-Gruppen wurden die 5´- und 3´-OH Gruppen sukzessiv geschützt. Nach simultaner 5´-OH Entschützung und 3´-OMs Eliminierung, wurden die gewünschten Ribonukleoside durch katalytische Dihydroxilierung erhalten. Die Darstellung der Verbindung 7NP erfolgte über die Silyl-Hilbert-Johnson-Reaktion. Der abasische Baustein AS wurde ausgehend von 2,3,5-Tri-O-benzyl-ribofuranose durch Dehydroxylierung und anschließende Entschützung erreicht. Von allen Nukleosiden gelang es Kristalle aus Wasser oder Methanol zu erhalten und röntgenkristallographisch zu untersuchen. Die Kristallpackungen zeigten eine sehr interessante Anordnung der Moleküle. Alle Fluorindol-Nukleoside mit Ausnahme von 7-N-Purin-Nukleosid 7NP zeigten nicht die für aromatische Systeme normale Fischgräten-Struktur, sondern eine Anordnung, in der die Moleküle gegenüberliegen. Die Kristallpackung besteht abwechselnd aus hydrophilen und lipophilen Schichten. Die hydrophilen Schichten bestehen aus den Zuckeruntereinheiten und die lipophilen aus den Fluoraromaten. Die Zucker sind durch Wasserstoffbrücken miteinander verbunden. Für die Orientierung der Moleküle zueinander sind aber die Fluoratome verantwortlich. In der Kristallpackung von 7-Fluorindol-Nukleosid 7FI kann ein Fluor-Wasserstoff-Abstand von nur 230 pm detektiert werden. Dies ist deutlich kürzer als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff von 2,55 Å. Der Abstand wird zwischen dem Fluor des einen Nukleosids und einem Wasserstoff eines gegenüberliegenden Nukleosids gemessen. Der Abstand von 2,30 Å ist einer der kürzesten jemals in Kristallen gemessenen F-H Abstände des Typs Csp²-F...H-Csp². Bedingt durch diesen kurzen Abstand kann von einer F...H Wasserstoffbrücke gesprochen werden. Auf der anderen Seite in der Kristallstruktur von 4-Fluorindol-Nukleosid 4FI konnte ein F-H Abstand von 2,69 Å nachgewiesen werden, welcher deutlich länger als die Summe der van-der-Waals Radien von Fluor und Wasserstoff ist. Die Nukleoside wurden auf ihre Lipophilie hin untersucht. Zu diesem Zweck wurden Octanol-Wasser Verteilungskoeffizienten der Nukleoside gemessen. Die fluorierten Nukleoside zeigten im Gegensatz zu den nichtfluorierten Nukleosiden eine deutlich größere Lipophilie. Nach Umsetzung der Nukleoside zu den Phosphoramiditen konnten diese kupplungsfähigen Monomere in den RNA-Festphasensynthesen eingesetzt und in RNA 12mere eingebaut werden. Um den Einfluss der aromatischen Fluorosubstitutionen auf die thermodynamische Stabilität von RNA-Duplexen zu untersuchen, wurden UV/VIS- und CD- spektroskopische Messungen an monomodifizierten RNA 12meren durchgeführt. Aus den erhaltenen Schmelzkurven wurden die Schmelzpunkte bestimmt (Abbildung 9.3) und die thermodynamischen Daten ausgerechnet. Die Anwendung hydrophober, Fluorsubstituierter Nukleobasen führte im Fall der fluorierten Indol-Nukleoside zu Destabilisierung im Vergleich mit natürlichen Basenpaaren. Aus den folgenden Resultaten lässt sich zusammenfassen: 1. Position der Fluoratom in fluorierten Indole spielt eine wesentliche Rolle für die Stabilität des RNA-Duplex 2. 6FI bildet die stabilste Basenpaaren mit natürlichen Basen. 3. Basenpaarung von 4FI trägt eine deutlich höhere Destabilisierung. Für diese Modifikation wurden auch die längsten Abstandwerte zwischen C-F…H in der Kristallpackung gemessen. (Die Vermutung liegt nahe, dass diese Base sich außerhalb des Duplex befindet). 4. Alle Fluorindol-Basenanaloga zeigen die Tendenz zur Paarung mit Adenosin. 5. Bei 4,6DFI handelt sich um universelle Base. Um noch weniger destabilisierende universelle Basen zu finden, wurde das Forschungsfeld mit Methoden aus dem Bereich der strukturellen Bioinformatik, Molekül-dynamiksimulationen und freie Energie-Rechnungen ausgeweitet. Resultierende Simulationen führten zu zwei neuen Basen: 7NP als Analogon zu 4,6DFBI und 9DP als Analogon zu 4,6DFI (siehe Kapitel 8). Theoretische Rechnungen ließen sich bestätigen durch experimentelle Ergebnisse Die so entstandene Serie von Purin-Basenanaloga hat uns gezeigt, dass der Austausch von Fluoratomen durch Stickstoffatome stabilisierende Effekte bringt. Die chemischen Änderungen beeinflussen die physikalischen Eigenschaften, welche dadurch Stabilisierung oder Destabilisierung des RNA-Duuplex dirigieren. In Abbildung 9.5 befinden sich ausgerechnete Dipolmomente. Somit können wir für diese Serie folgendes resümieren: * 4,6FI als universelles Base Analogon zu 4,6DFBI zeigt geringere destabilisierende Effekte auf den 12mer RNA-Duplex. * Umtausch von Fluoratomen in den beiden Basen (4,6DFI und 4,6DFBI) resultiert in deutlich besserer Basenpaarung. * Auserrechnete thermodynamische Parametern (von gemessenen Tm-Werten) wurde ersichtlicht, dass höhere Tm-Werte durch geringere Destabilisierung aus Solvatation resultieren, nicht aus erhöhten Stacking Effekten des RNA-Duplex.
Ein bekanntes Beispiel für regulatorische RNA-Protein-Wechselwirkung stellt der Komplex der TAR-RNA von HIV-1 und dem viralen Protein Tat dar. Dieser Komplex ist wichtig für die effiziente Transkription des viralen Genoms. Essentiell für die Erkennung der Stem-Loop Struktur ist die Wechselwirkung des Tat-Proteins mit dem aus drei Nukleotiden bestehenden Bulge der TAR-RNA. Das Wissen über die Prinzipien der Erkennung von Tat zu TAR-RNA sollte es möglich machen, spezifische Liganden zu designen, die als antivirale Tat Antagonisten angreifen können. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese von RNA Liganden für die Festphasenpeptidsynthese (FPPS) basierend auf heteroaromatischen Bausteinen. Als Strategie wurde gewählt, die heteroaromatischen Reste über Amid-Bindungen an ein Fmoc geschütztes (2-Aminoethyl)glycin-Rückgrat einzufügen. Die peptidomimetischen Bausteine X konnten in der FPPS zur Synthese von Tripeptiden mit der allgemeinen Struktur Arg-X-Arg und Modifikationen mit Lysin eingesetzt werden. Die Bindungsaffinitäten der Tripeptide und kleinen Moleküle zur TAR-RNA von HIV-1 wurden über einen fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Der Assay verwendet ein doppelt endmarkiertes Tat-Peptid mit Fluorescein und Rhodamin als Farbstoff. Durch Verdrängung des Tat-Peptides durch einen konkurrierenden Liganden kommt es zur Konformationsänderung des Peptides, die zur Löschung der Lichtemmission führt. Dabei zeigen die Tripeptide H2N-(D)Arg-Lactam-(D)Arg-CONH2 (154) und H2N-(D)Arg-Amidin-(D)Arg-CONH2 (158) IC50-Werte von 2-3 mikroM, die auch durch Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) bestätigt wurden. In massenspektrometrischen Untersuchungen von 158 bzw. Tat-Protein mit TAR-RNA konnten bei beiden Peptiden 1:1 und 1:2-Komplexe beobachtet werden. 158 zeigt antivirale Eigenschaften (IC50 = 10-50 mikroM) in HeLa P4-Zellassays. Durch NMR-Untersuchungen und molekulardynamische Berechnungen war es möglich, eine Konformationsänderung der TAR-RNA durch eine Wechselwirkung mit Guanidinium-Gruppen festzustellen. Ein weiteres Ziel der Arbeit war daher ausgehend von den gewonnenen Daten die Untersuchung des Bindungskonzeptes von Diaminopyrazolen und Indazolen. Diaminopyrazole mit kleinen Resten und Triaminopyrazol übertreffen im protonierten Zustand den dikationischen Liganden Argininamid. In Übereinstimmung mit dem Bindungsmodell verhalten sich protonierte Aminopyrazole wie „Super-Guanidine“ hinsichtlich der TAR-RNA. Das Einfügen des Triaminopyrazols in ein Phenazin-Grundgerüst führt zu Verbindungen, die im protonierten und reduzierten Zustand zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können und nicht planar, aber lipophil sind. Der Austausch von Stickstoff zu Sauerstoff im Phenazinring sollte den reduzierten Zustand stabilisieren. Die resultierende Struktur ist jedoch zersetzlich, so dass auf weitere Untersuchungen verzichtet wurde.
Die gezielte Modifikation von Proteinen für die Erforschung des Proteoms stellt eine entscheidende Herausforderung dar. Sie wird meistens dann zwingend notwendig, wenn das intrinsische Signal zum Auslesen ungeeignet ist. So ist es z.B. für die größte Anzahl von fluoreszenzbasierenden Methoden unerlässlich, das zu untersuchende Protein spezifisch und einheitlich mit einem Fluorophor zu markieren. Eine weitere Schwierigkeit ist die gerichtete Immobilisierung von Proteinen für deren Charakterisierung an Oberflächen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die spezifische Markierung, Manipulation und strukturierte Immobilisierung von rekombinanten Proteinen analysiert. Dafür wurde mit dem hauptsächlich aus der Proteinreinigung bekannten NTA/Oligohistidin-System gearbeitet. Verwendet wurden multivalte NTA-Chelatorköpfen mit zwei (bisNTA), drei (trisNTA) oder vier (tetrakisNTA) NTA-Gruppen pro Molekül. Durch die Multivalenz können hervoragende Bindungsaffinitäten im nanomolaren Bereich erzielt werden, die die stabile, stöchiometrische, nicht kovalente und damit reversible Modifikation His-getaggter Proteine in Lösung und an Grenzflächen erlaubt. Fluoreszente trisNTAs wurden vielfach erfolgreich für die Markierung His-getaggter Proteine eingesetzt. Dabei wurde die Beobachtung gemacht, dass die Ni2+-Ionen im trisNTA die Emission des benachbarten Fluorophors stark quenchen und dadurch die Einsatzmöglichkeiten der Verbindung reduzieren. Durch die räumliche Trennung der beiden Gruppen mit starren, biokompatiblen Polyprolin-Helices konnte erstmals systematisch demonstriert werden, dass das Ausmaß der Fluoreszenzlöschung abstandsabhängig ist. Bei der Verwendung von 12 Prolinen (3.6 nm lange Helix) wurde mit einem ATTO565-Derivat eine Intensitätserhöhung um etwa 70%, und bei einem OregonGreen488-Derivat um etwa 40% erreicht. Bei den Verbindungen können der Abstand der beiden Gruppen voneinander und der Fluorophor nahezu frei gewählt werden, so dass eine Optimierung in Hinblick auf die jeweilige Fragestellung ohne Probleme möglich ist. In Kooperationen untersucht wurden z.B. die ATP-Hydrolyse von MDL1 und die ATP-Bindung von TAP. Die deutlich verbesserte Quantenausbeute, die stabile Bindung an einen His-Tag und die geringe Größe machen die Verbindungen zu idealen Reportersonden für die Einzelmolekül-Fluoreszenz-Analyse. Die gezielte Manipulation eines makromolekularen Proteinkomplexes mit einem kleinen Molekül wurde in einem weiteren Projekt untersucht. Das tetrakisNTA wurde verwendet, um die His-getaggten Eingänge des alphaN-His6 Proteasoms von Thermoplasma acidophilum gezielt zu blockieren. Durch den Abbau von Fluoreszein-markiertem Casein konnte die Aktivität der Proteasomkomplexe in Echtzeit verfolgt werden. Unter Zugabe von tetrakisNTA fand kein Abbau statt, während dieser ohne oder nach Entfernen der tetrakisNTAs von den Eingängen im gleichen Maße detektierbar war. Die Aktivität der Peptidase-Schnittstellen im blockierten Zustand konnte durch die Überschichtung eines nativen Gels mit einem Peptidsubstrat demonstriert werden. Die Ergebnisse belegen, dass die His-Tags an den Eingängen des Proteasomkomplexes so umstrukturiert werden, dass der Eintritt von Proteinen reversibel blockiert wird. Neben der gezielten Manipulation des Proteasoms wurde außerdem erstmals die spezifische Fluoreszenzmarkierung His-getaggter Proteine in kompletten E. coli Zelllysaten mittels nativer PAGE nachgewiesen. Um neue Anwendungsgebiete für das trisNTA zu erschließen, sollte dieses mit einem 1.4 nm großen Goldcluster modifiziert werden. Damit könnte die Position von His-Tags in Proteinkomplexen mittels Elektronenmikroskopie visualisiert werden. Mittels Gelfiltration mit MBP-H6 wurde nachgewiesen, dass die entwickelten Goldcluster teilweise mehr als eine trisNTA-Gruppe auf der Oberfläche hatten, wobei eine Trennung der Partikel nach der Anzahl der NTA-Gruppen nicht möglich war. Die Partikel wurden erfolgreich für die spezifische Markierung des alphaN-His6 Proteasoms verwendet. In der Einzelpartikelanalyse deutlich erkennbar waren der markierte Proteasomkomplex und die Lage des trisNTA-Goldclusters. Die Verwendung solcher Goldpartikel in der EM bringt entscheidende Vorteile im Hinblick auf die Strukturaufklärung von Proteinen mit sich. Orthogonale NTA/His-Tag Bindungspaare, bei denen ein bestimmtes, multivalentes NTA-Molekül einen definierten His-Tag bindet, würden einen großen Nutzen für die spezifische Markierung oder Immobilisierung verschiedener His-getaggter Proteine bringen. Durch die Verwendung teilweise rigider His-Tags und möglichst starrer bisNTAs sollten solche Bindungspaare realisiert werden. Die Synthese rigider bisNTAs mit unterschiedlichen Abständen zwischen den NTA-Gruppen konnte erfolgreich etabliert werden. Allerdings zeigten Fluoreszenztitrationen mit verschieden Fluoreszeinmarkierten His-Peptiden nicht die erhofften Unterschiede in den Affinitäten. Im letzten Teil der Arbeit wurden durch intramolekulare His-Tags inaktive trisNTAs synthetisiert. Diese können durch Licht gespalten und damit aktiviert werden (photoaktivierbare trisNTAs, PAtrisNTAs). Die Verbindungen mit unterschiedlicher Anzahl an Histidinen im intramolekularen Tag wurden systematisch in Lösung und an Oberflächen charakterisiert. Dazu wurden HPLC-Studien, Gelfiltrationen und SPR-Experimente durchgeführt. Die strukturierte Organisation von Proteinen auf solchen lichtaktivierbaren Oberflächen wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie demonstriert. Außerdem konnten durch die Laserlithographie gezielt verschiedene His-getaggte Proteine in situ in definierten Bereichen immobilisiert werden. Die Biokompatibilität der Oberflächen wurde erfolgreich durch die strukturierte Organisation aktiver, Virusbindender Rezeptor-Partikel gezeigt. Im Prinzip sollte das Konzept die lichtinduzierte Aufkonzentrierung von His-getaggten Rezeptoren in lebenden Zellen ermöglichen. Durch das Clustern ausgelöste Vorgänge könnten so gezielt herbeigeführt und analysiert werden.
Misregulated receptor tyrosine kinases (RTKs), i.e. the epidermal growth factor receptor EGFR or the insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R), can be involved in the development of cancer. Monoclonal antibodies specifically inhibit the RTKs in cancer therapy. The scope of this thesis is to investigate the molecular basis of the inhibition through the therapeutic antibodies matuzumab (EMD72000) against EGFR and EMD1159476 against IGF-1R. The 3D crystal structure of matuzumab in complex with the EGFR domain III shows an eptiope connected with a novel inhibition mechanism: a non-competitive, sterical inhibition of receptor acitivation. The anti-IGF-1R targeted monoclonal antibody EMD1159476 shows a reduced binding capacity to the receptor in the presence of ligand indicating a competitive inhibition mechanism. The epitope of EMD1159476 is within domain II of the receptor. The results of these molecular interaction studies are important for the clinical therapies with these monoclonal antibodies. The matuzumab-EGFR complex crystal structure shows that a simultaneous binding of matuzumab and cetuximab (Erbitux) is possible. The latter antibody is already in clinical use. A combination of several therapeutic antibodies in cancer treatment might show synergistic effects and benefits for the patients.
Regulation des matrizellulären Proteins SMOC-1 durch Zytokine und Stickoxid in Rattenmesangiumzellen
(2009)
Zytokine stimulieren in Mesangiumzellen die Produktion und die Freisetzung großer Mengen entzündlicher Mediatoren. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der RAP-PCR („RNA arbitrarily primed polymerase chain reaction“), einer auf mRNA basierenden „Differential display“-Methode, die Effekte von Interleukin-1β (IL-1β) auf das Genexpressionsmuster in glomerulären Rattenmesangiumzellen untersucht. Dabei wurde das matrizelluläre Glykoprotein „Secreted modular calcium-binding protein-1“ (SMOC-1) identifiziert, welches in Mesangiumzellen durch IL-1β herunterreguliert wird. SMOC-1 wird von verschiedenen Zelltypen exprimiert und sezerniert, doch seine biologische Funktion konnte bisher nicht aufgedeckt werden. Weitere Experimente bestätigten, dass die mRNA- und Proteinexpression von SMOC-1 durch proinflammatorische Zytokine, wie IL-1β und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) herunterreguliert wird. Dieser Effekt wird zu einem großen Teil durch die endogene Freisetzung von Stickoxid (NO) aufgrund der Aktivität der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) und der nachfolgenden Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) vermittelt. Außerdem tragen auch reaktive Sauerstoffver-bindungen (ROS), deren Bildung durch die Zytokine verstärkt wird, zur Herunter-regulierung der SMOC-1-Expression bei. Durch In-situ-Hybridisierungsexperimente konnte ferner gezeigt werden, dass die Hemmung der NO-Synthese durch den spezifischen iNOS-Inhibitor L-NIL in einem Rattenmodell der anti-Thy1.1-Glomerulonephritis die SMOC-1-Expression deutlich erhöhte. Dies belegt somit auch in vivo die biologische Relevanz von NO in der Modulierung der SMOC-1-Expression. Die funktionelle Rolle von SMOC-1 in Mesangiumzellen wurde durch die Hemmung der SMOC-1-Expression mit Hilfe einer spezifischen siRNA untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Hemmung von SMOC-1 eine deutliche Inhibierung der mRNA-Expression von „Transforming growth factor β1“ (TGF-β1) sowie dessen Gesamtproteinspiegel zur Folge hat. Auch die Aktivität von TGF-β1 wurde reduziert, wie anhand der verringerten Spiegel an aktivem TGF-β1-Protein und der verringerten mRNA-Expression bekannter TGF-β-regulierter Gene, wie „Connective tissue growth factor“ (CTGF), „Plasminogen activator inhibitor-1“ (PAI-1) und Biglykan gezeigt wurde. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von SMOC-1 bei der Modulierung des TGF-β1-Signalwegs hin. Zusammenfassend betrachtet scheint NO die SMOC-1-Expression in der akuten glomerulären Entzündung zu vermindern und dadurch die TGF-β-getriebenen profibrotischen Signalprozesse zu limitieren. Der zweite Aspekt dieser Arbeit befasst sich mit der Rolle von Peroxisomen-Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) in der IL-1β-vermittelten Expression der induzierbaren NO-Synthase. PPARα-Aktivatoren steigern in Mesangiumzellen die IL-1β-induzierte Aktivität der iNOS, während die Hemmung von PPARα durch spezifische Inhibitoren oder siRNA die iNOS-Expression/-Aktivität deutlich reduziert. Die Ergebnisse von Promotor-studien zeigten die essentielle Rolle einer möglichen PPAR-Bindestelle im iNOS-Promotor. IL-1β scheint die Bildung eines endogenen PPAR-Liganden zu induzieren, wodurch die Bindung von PPAR-Proteinkomplexen an das regulatorische DNA-Element im iNOS-Promotor verstärkt und dessen Aktivität gesteigert wird. Daneben scheinen jedoch auch Nebeneffekte der PPAR-Aktivatoren, wie die Freisetzung von ROS, zur synergistischen Wirkung auf die IL-1β-induzierte iNOS-Expression beizutragen. Die Wirkung von dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf entzündliche Prozesse wird seit längerem diskutiert, daher wurden die biologischen Effekte von neu synthetisierten möglichen dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf Entzündungsparameter, wie z. B. die iNOS-Expression, in Mesangiumzellen untersucht. Alle untersuchten Aktivatoren steigerten in der Form von Esterverbindungen die IL-1β-induzierte Expression der iNOS sowie der sekretorischen Phospholipase A2 (sPLA2), während die entsprechenden freien Säuren wenig Effekte zeigten. Diese proinflammatorische Wirkung scheint jedoch weniger auf einer Aktivierung des PPAR-Rezeptors zu beruhen als auf der Freisetzung von ROS, die durch die Aktivatoren teilweise deutlich erhöht wurde. Weitere Experimente zur Charakterisierung der PPAR-spezifischen Wirkung der Aktivatoren sowie zur optimalen Wirkkonzentration sind nötig, bevor der Effekt dieser Aktivatoren auf die inflammatorische Genexpression genau bewertet werden kann.
Die Entwicklung neuer und Verbesserung bestehender Methoden zur theoretischen Beschreibung molekularer Systeme ist eine der wichtigsten Aufgaben der theoretischen Chemie, vor allem zur Berechnung elektronisch angeregter Zustände zur Simulation von Spektren. Das Ziel dieser Arbeit ist in diesem Zusammenhang die Weiterentwicklung des algebraisch-diagrammatischen Konstuktionsverfahrens (ADC), einer Methode zur Berechnung elektronisch angeregter Zustände, und die Bereitstellung effizienter Computerprogramme zum theoretischen Studium optischer Eigenschaften von "open-shell" Molekülen. Im Vordergrund stehen hierbei die physikalisch richtige Beschreibung von ladungsgetrennten Zuständen und solchen mit hohem Doppeltanregungscharakter. Verbesserte theoretische Methoden sind notwendig, da die zu berechnenden Systeme häufig für eine Beschreibung mit vorhandenen hochgenauen ab initio Methoden zu groß sind. Einfachere, durchführbare Methoden wie z.B. semi-empirische oder DFT-basierte Methoden, die es erlauben, sehr große Molekülsysteme mit mehr als 100 Atomen zu beschreiben, weisen häufig große, nicht vorhersagbare Fehler auf. Experimente im Forschungsgebiet angeregter Zustände von Molekülen finden spektroskopisch statt und erfordern auf der anderen Seite eine Unterstützung durch zuverlässige theoretische Voraussagen. Die Weiterentwicklung der Theorie ist also auch im allgemeinen Interesse der Chemie, Biologie und der anderen Naturwissenschaften. Teil 1 dieser Arbeit umfasst die Theorie, während in Teil 2 deren Anwendung auf ausgewählte Systeme zu finden ist. Nach einer allgemeinen Einführung in die Problematik und grundlegenden Methoden der Quantenchemie in Kapitel 1, wurde im ersten Teil von Kapitel 2 die Methode zur Berechnung angeregter Zustände und ihrer Eigenschaften vorgestellt, auf der diese Arbeit basiert, nämlich das algebraisch-diagrammatische Konstruktionsverfahren (ADC). Dabei sind Eigenschaften von ADC zu betonen, die es von den anderen Methoden unterscheidet. Zum einen werden in ADC alle angeregten Zustände energetisch zuverlässig beschrieben, das heißt Rydberg-, Ladungstransfer- und doppelt angeregte Zustände findet man im Anregungsspektrum an der richtigen Position. Andererseits ist die Methode eine der schnellsten zur Beschreibung doppelt angeregter Zustände (z.B. bei Polyenen) und eignet sich, deren Relevanz im Spektrum zu ermitteln. Denn die beiden Schemata ADC(2)-s und ADC(2)-x unterscheiden sich in der störungstheoretischen Behandlung doppelt angeregter Zustände um eine Ordnung, ADC(2)-s beschreibt sie in nullter Ordnung, ADC(2)-x in erster. Im folgenden Abschnitt stehen die ausführlichen Gleichungen des ADC-Verfahrens für unseren Computercode. Kapitel 2 wurde abgeschlossen durch die Gleichungen der Erweiterung von ADC zur Behandlung von "open-shell" Molekülen auf UADC. Kapitel 3 umfasst die Beschreibung der "intermediate state representation" (ISR), die zur Berechnung von Eigenschaften angeregter Zustände dient und die theoretische Herleitung des UADC-Verfahrens erlaubt. Am Anfang von Teil 2 in Kapitel 4 steht die Untersuchung der Genauigkeit und Zuverlässigkeit des neu entwickelten UADC-Verfahrens. Dabei wurden elf verschiedene, mittelgroße, aromatische Moleküle ausgewählt, zu denen in der Literatur auch experimentelle Daten zu Vergleichszwecken zu finden waren. Das Ergebnis ist sehr überzeugend und nur minimal aufwändiger als ADC. Kapitel 5 zeigt eine erste Anwendung von UADC auf größere Moleküle und stellt die Eigenschaft der Bestimmung von doppelt angeregten Zuständen von ADC und UADC noch einmal heraus. Der Vergleich der Polyene mit ihren "open-shell" Partnern, den Polyen-Radikalkationen und den neutralen Polyenylradikalen, zeigte, dass der Einfluss der Doppeltanregungen in den Radikalen kleiner ist, für eine exakte Beschreibung der angeregten Zustände ist er jedoch nicht zu vernachlässigen. Danach wurde eine Extraplation der angeregten Zustände von langkettigen Polyenen, Polyenradikalkationen und Polyenylradikalen vorgenommen, die den konjugierten pi-Systemen von Karotinoiden als Modellsysteme dienen. Die Beschreibung der Polyene bestätigte die experimentellen Vorhersagen zu Karotinoiden. Eine erste Anwendung der ISR bezüglich der Berechnung von Eigenschaften angeregter Zustände ist mit der Berechnung von Dipolmomenten angeregter Zustände in Kapitel 6 durchgeführt worden. Die Ergebnisse zeigen eine gute Übereinstimmung mit anderen Methoden und Messergebnissen. Eine weitere Anwendung der ISR ist die Berechnung von resonanten Zwei-Photonen-Absorptionsspektren, mit deren Hilfe spektroskopisch "dunkle" Zustände detektiert werden können. Die zur Berechnung notwendigen Übergangsdipolmomente zwischen angeregten Zuständen aus der ISR wurden dazu in einer sogenannten "sum-over-states" Näherung verwendet. Eine mögliche andere Berechnung über einen geschlossenen Ausdruck mit Hilfe der ADC-Näherung ist noch nicht implementiert.
Kraftfelder sind ein vielseitiges Werkzeug zur schnellen Berechnung vielfältiger Moleküleigenschaften. Die Qualität der damit erhaltenen Vorhersagen ist auch ein Maß, wie gut die wichtigen Einflussgrößen verstanden und vor allem in das Kraftfeld-Modell integriert sind. Bei der Parametrisierung müssen viele Effekte gegeneinander ausbalanciert werden, da die Kraftfeldterme nicht unabhängig voneinander betrachtet werden können. Umfangreiche Testrechnungen sind erforderlich, um die notwendige Qualität der Parameter sicher zu stellen. Eine Automatisierung dieses Prozesses bringt nicht nur eine enorme Zeitersparnis, sie zwingt auch zur sorgfältigen Definition von Vorgaben und Qualitätskriterien. Die Formulierung einer Strategie in einem Programm anstelle von „intelligentem Raten“ fördert zudem ein tieferes Verständnis. Bei einer Änderung der Strategie muss nur das entsprechende Programm geändert werden, dem Entwickler bleibt der manuelle Test erspart. Automatische Methoden zur Plausibilitätsprüfung vermeiden Probleme durch Fehler bei der Dateneingabe von Hand. Die programmgesteuerte Erstellung aussagekräftiger Protokolle und Grafiken macht die Fülle der bei der Parametrisierung und Evaluierung eines Kraftfeldes anfallenden Informationen für den Benutzer überschaubar. Probleme und deren Zusammenhang können so leichter erfasst werden. Für das MOMO-Kraftfeld konnten auf diese Weise verbesserte und neue Parameter für Wasserstoffbrücken abgeleitet werden, zwei empirische Punktladungsmodelle und deren Verträglichkeit mit zwei quantenchemischen Modellen verbessert und prinzipielle Probleme bei deren Vereinbarkeit erkannt werden sowie die automatische Parametrisierung von Bindungslängen, Bindungswinkeln und Torsionswinkeln ermöglicht werden. Bei Letzterem konnte jedoch keine Verbesserung gegenüber den Originalparametern erreicht werden, was nicht weiter verwunderlich ist, da diese seit Jahrzehnten entwickelt worden sind, wohingegen Wasserstoffbrücken und Partialladungen erst später hinzugekommen sind und nicht so umfangreich wie die bindenden Kraftfeldterme getestet wurden. Voraussetzung für die hier gewählte Vorgehensweise, alle Arbeiten weitgehend zu automatisieren und Strategien immer in Programme umzusetzen, waren sehr umfangreiche Programmierarbeiten. Ziel war es, auf einfache Weise die Steuerung des Kraftfeldes aus kleineren Programmen, die spezielle Probleme bearbeiten, zuzulassen. Durch die Nutzung zahlreicher Open-Source-Projekte, die gemeinsam die gewünschte Funktionalität zur Verfügung stellen, konnte der Aufwand auf die dazu passende Implementierung des MOMO-Kraftfeldes und das Verbinden mit der von diesen Projekten bereitgestellten Software beschränkt werden. Der Kern des MOMO-Kraftfeldes wurde aus Geschwindigkeitsgründen in der Compilersprache C geschrieben, Datenein- und -ausgabe und die Programme zur Parametrisierung und Auswertung wurden in Python geschrieben.
A solid-supported membrane (SSM) is an alkanethiol/lipid hybrid membrane with comparable lipid mobility, conductivity, and capacitance than a black lipid membrane (BLM). However, mechanical perturbations, which usually destroy a BLM, do not influence the life-time of a SSM, which is mechanically so stable that solutions may be rapidly exchanged at its surface. This key property has been utilized in this thesis to characterize electrophysiologically two bacterial secondary active transporters (MelB and LacY) as well as to investigate the specific interactions between ions and lipid membranes. These three different projects are summarized below: (1) The properties of lipid membranes, which represent the most important biological interface between intracellular and extracellular compartments, are essentially modulated by the ionic composition of the surrounding aqueous medium. To investigate specific interactions between ions and lipid membranes, solutions of different ionic composition were exchanged at the surface of a SSM through a flow system. This solution exchange resulted in charge translocations that were interpreted in terms of binding of the ions to the lipid headgroups at the SSM surface. We found that chaotropic anions and kosmotropic cations are attracted to the membrane independent of the membrane composition. In particular, the same behaviour was found for lipid headgroups bearing no charge like monoolein. This general trend is modulated by the electrostatic interaction of the ions with the lipid headgroup charge. Our experimental results are in agreement with recent molecular dynamic simulations of PC membranes. (2) Rapid solution exchange on a solid-supported membrane (SSM) is investigated using fluidic structures and a solid-supported membrane in a wall jet geometry. The flow was analyzed with a new technique based on specific ion interactions with the surface combined with an electrical measurement. The critical parameters affecting the time course of the solution exchange and the transfer function describing the time resolution of the SSM system were determined. The experimental data indicate that the solution transport follows a plug flow geometry while the rise of the surface concentration can be approximated by Hagen Poiseuille flow with ideal mixing at the surface of the SSM. Using an improved cuvette design a solution exchange as fast as 2 ms was achieved at the surface of a solid supported membrane. As an application of the technique the rate constant of a fast electrogenic reaction in the melibiose permease MelB, a bacterial (Escherichia coli) sugar transporter, is determined. For comparison, the kinetics of a conformational transition of the same transporter was measured using stopped-flow tryptophan fluorescence spectroscopy. The relaxation time constant obtained for the charge displacement agrees with that determined in the stopped-flow experiments. This supports the previous proposition that upon sugar binding MelB undergoes an electrogenic conformational transition with a rate constant of k ~ 250 s-1. (3) Electrogenic events due to activity of wild-type lactose permease from Escherichia coli (LacY) were investigated with proteoliposomes containing purified LacY adsorbed on a solid-supported membrane electrode. Downhill sugar/H+ symport into the proteoliposomes generates transient currents. Studies at different lipid to protein ratios and at different pH values, as well as inactivation by N-ethylmaleimide, show that the currents are due specifically to the activity of LacY. From analysis of the currents under different conditions and comparison with biochemical data, it is apparent that the predominant electrogenic event in downhill sugar/H+ symport is H+ release. In contrast, LacY mutants E325A and C154G, which bind ligand normally but are severely defective with respect to lactose/H+ symport, exhibit a minor electrogenic event upon addition of LacY-specific substrates, representing only 6% of the total charge displacement of the wild-type. This activity is due either to substrate binding per se or to a conformational transition following substrate binding. We propose that turnover of LacY involves at least two electrogenic reactions: (i) a minor reaction that occurs upon sugar binding and is due to a conformational transition in LacY; and (ii) a major reaction due to cytoplasmic release of H+ during downhill sugar/H+ symport, which is the limiting step for this mode of transport.
Specific functions of biological systems often require conformational transitions of macromolecules. Thus, being able to describe and predict conformational changes of biological macromolecules is not only important for understanding their impact on biological function, but will also have implications for the modelling of (macro)molecular complex formation and in structure-based drug design approaches. The “conformational selection model” provides the foundation for computational investigations of conformational fluctuations of the unbound protein state. These fluctuations may reveal conformational states adopted by the bound proteins. The aim of this work is to incorporate directional information in a geometry-based approach, in order to sample biologically relevant conformational space extensively. Interestingly, coarse-grained normal mode (CGNM) approaches, e.g., the elastic network model (ENM) and rigid cluster normal mode analysis (RCNMA), have emerged recently and provide directions of intrinsic motions in terms of harmonic modes (also called normal modes). In my previous work and in other studies it has been shown that conformational changes upon ligand binding occur along a few low-energy modes of unbound proteins and can be efficiently calculated by CGNM approaches. In order to explore the validity and the applicability of CGNM approaches, a large-scale comparison of essential dynamics (ED) modes from molecular dynamics (MD) simulations and normal modes from CGNM was performed over a dataset of 335 proteins. Despite high coarse-graining, low frequency normal modes from CGNM correlate very well with ED modes in terms of directions of motions (average maximal overlap is 0.65) and relative amplitudes of motions (average maximal overlap is 0.73). In order to exploit the potential of CGNM approaches, I have developed a three-step approach for efficient exploration of intrinsic motions of proteins. The first two steps are based on recent developments in rigidity and elastic network theory. Initially, static properties of the protein are determined by decomposing the protein into rigid clusters using the graph-theoretical approach FIRST at an all-atom representation of the protein. In a second step, dynamic properties of the molecule are revealed by the rotations-translations of blocks approach (RTB) using an elastic network model representation of the coarse-grained protein. In the final step, the recently introduced idea of constrained geometric simulations of diffusive motions in proteins is extended for efficient sampling of conformational space. Here, the low-energy (frequency) normal modes provided by the RCNMA approach are used to guide the backbone motions. The NMSim approach was validated on hen egg white lysozyme by comparing it to previously mentioned simulation methods in terms of residue fluctuations, conformational space explorations, essential dynamics, sampling of side-chain rotamers, and structural quality. Residue fluctuations in NMSim generated ensemble is found to be in good agreement with MD fluctuations with a correlation coefficient of around 0.79. A comparison of different geometry-based simulation approaches shows that FRODA is restricted in sampling the backbone conformational space. CONCOORD is restricted in sampling the side-chain conformational space. NMSim sufficiently samples both the backbone and the side-chain conformations taking experimental structures and conformations from the state of the art MD simulation as reference. The NMSim approach is also applied to a dataset of proteins where conformational changes have been observed experimentally, either in domain or functionally important loop regions. The NMSim simulations starting from the unbound structures are able to reach conformations similar to ligand bound conformations (RMSD < 2.4 Å) in 4 out of 5 cases of domain moving proteins. In these four cases, good correlation coefficients (R > 0.7) between the RMS fluctuations derived from NMSim generated structures and two experimental structures are observed. Furthermore, intrinsic fluctuations in NMSim simulation correlate with the region of loop conformational changes observed upon ligand binding in 2 out of 3 cases. The NMSim generated pathway of conformational change from the unbound structure to the ligand bound structure of adenylate kinase is validated by a comparison to experimental structures reflecting different states of the pathway as proposed by previous studies. Interestingly, the generated pathway confirms that the LID domain closure precedes the closing of the NMPbind domain, even if no target conformation is provided in NMSim. Hence, the results in this study show that, incorporating directional information in the geometry-based approach NMSim improves the sampling of biologically relevant conformational space and provides a computationally efficient alternative to state of the art MD simulations.
This thesis describes the structural characterization of interactions between biological relevant ribonucleic acid biomacromolecules (RNAs) and selected ligands to optimize the methodologies for the design of pharmacological lead compounds. To achieve this aim, not only the structures of the RNA, the ligand and their complexes need to be known, but also information about the inherent dynamics, especially of the target RNA, are necessary. To determine the structure and dynamics of these molecules and their complexes, liquid state nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) is a suitable and powerful method. The necessity for these investigations arises from the lack of knowledge in RNA-ligand interactions, e.g. for the development of new medicinal drugs targeting crucial RNA sequences. In the first chapters of this thesis (Chapters II to IV), an introduction into RNA research is given with a focus on RNA structural features (Chapter II), into the interacting molecules, the biology of the specific RNA targets and the further development of their ligands (Chapter III) and into the NMR theory and methodologies used within this thesis (Chapter IV). Chapter II begins with a description of RNA characteristics and functions, placing the focus on the increasing attention that these biomacromolecules have attracted in recent years due to their diverse biological functionalities. This is followed by a detailed description of general structural features of RNA molecules. The biological functions of the RNAs investigated in this thesis (Human immunodeficiency virus PSI- and TAR-RNA and Coxsackievirus B3 Stemloop D in the 5’-cloverleaf element), together with their known structural characteristics are introduced in Chapter III. Furthermore, a description of the investigated ligands is given, focusing on the methods how their affinity and specificity were determined. The introduction is completed in Chapter IV, where the relevant NMR theory and methodologies are explained. First, kinetics and thermodynamics of ligand binding are summarized from an NMR point of view. Subsequently, a detailed description of the resonance assignment procedures for RNAs and peptidic ligands is given. This procedure mainly concentrates on the assignment of the proton resonances, which are essential for the later structure calculation from NMR restraints. The procedure for NMR structure calculation of RNA and its complexes follows with a short introduction into the programs ARIA and HADDOCK. The final part of this chapter explains the relaxation theory and the methodology to extract dynamic information from autocorrelated relaxation rates via the model-free formalism. In the Chapters V to VII of this thesis, the original publications are included and grouped into three topics. Chapter V comprehends the publications on the investigations of HIV PSI-RNA and its hexapeptidic ligand. These three publications[1-3] focus on the characterization of the ligand and its binding properties, its structure and the optimization of its composition aiming to improve its usage for further spectroscopic investigations.
The aim of the study was to investigate the role of the CX3C chemokine FKN in the role of platelet adhesion. The presence of the FKN receptor CX3CR1 in platelets is demonstrated and G-protein dependent activation of platelets with soluble FKN results in the increased adhesion of platelets to collagen and fibrinogen under flow 228 and adhesion of leucocytes to firmly attached platelets 231. Whether membrane-bound FKN is capable to promote the direct adhesion of platelets in flowing blood analogue to leucocytes was completely unknown. The adhesion mechanisms of FKN in mediating the adhesion of leucocytes under flow are well characterised and represent a novel unique mechanism of leucocyte capture and firm adhesion: FKN is responsible for immediate arrest of flowing CX3CR1 expressing leucocytes without the participation of additional adhesion receptors and ligands. This is in contrast to the classical leucocyte adhesion pathways, which are multistep processes involving leucocyte arrest, rolling and subsequent cell activation prior to firm arrest. In leucocytes, the FKN – CX3CR1 axis is sufficient to allow rapid arrest of leucocytes at low shear flow conditions 67, 101, 115, 122, 261. The set of data from this study demonstrates that immobilised FKN was capable to mediate the adhesion of platelets under low shear conditions, whereas there was no interaction in the absence of shear flow. In the presence of vWf in the adhesion matrix, FKN mediated the potent increased adhesion of platelets. This was in parts due to the activation of flowing platelets via CX3CR1 and the augmented translocation of platelets on FKN via the vWf receptor GPIbα. With respect to platelet activation, the function of endothelial FKN was comparable to leucocytes: in both cell types, the FKN dependent activation is mediated by its cognate receptor CX3CR1. This is in contrast to the adhesive capacity: in leucocytes, FKN dependent adhesion is mediated by CX3CR1, whereas in platelets, the adhesive capacity was mostly mediated by the vWf receptor GPIbα with only minor contribution from CX3CR1. In platelets, activation and adhesion by FKN were mediated by two distinct receptors, whereas in leucocytes, CX3CR1 is solely responsible for FKN dependent activation and adhesion. The presented results point out to a role of platelets in early stage of atherosclerosis. The in vivo expression of both, FKN and vWf is regulated by TNF-α, which is released in early stages of inflammation. The presence of vWf and FKN in the endothelial lining of blood vessels during these conditions is sufficient to initiate the capturing and translocation of platelets on the tunica interna. The rolling of platelets on the endothelium can induce endothelial damage and inflammation of the vessel, which might advance to the generation of clinically significant atherosclerotic plaques and fibrous atheroma.
P2X receptors represent the third superfamily of ligand gated ion channels with ATP as their natural ligand. Most of the mammalian P2X receptors are non-selective cation channels, which upon activation, mediate membrane depolarization and have physiological roles ranging from fast excitatory synaptic transmission, modulation of pain-sensation, LTP to apoptosis etc. In spite of them being an attractive drug target, their potential as a drug target is limited by the lack of basic understanding of the structure-function relationship of these receptors. In my thesis, I have investigated the behavior of homomeric P2X receptor subunits with the help of photolabeling and fluorescence techniques coupled to electrophysiological measurements using Xenopus laevis oocytes heterologous expression system. Concurrent photolabeling by BzATP and current recordings from the same set of receptors in real time has revealed that the gating process in homomeric P2X receptors is contributed individually by each subunit in an additive manner. Our study for the first time describes the agonist potency of Alexa-ATP (a fluorescent ATP analog) on P2X1 receptors. The use of Alexa-ATP in our experiments elucidated that receptor subunits are not independent but interacting with each other in a cooperative manner. The type of cooperativity, however, depended on the type and concentrations of allosteric/competing ligands. Based on our results, in my thesis we propose an allosteric model for ligand-receptor interactions in P2X receptors. When simulated, the model could replicate our experimental findings thus, further validating our model. Further, correlation between occupancy of P2X1 receptors (determined using binding curve for Alexa-ATP) with the steady-state desensitization suggests that binding of three agonist molecules per receptor are required to desensitize P2X1 receptors. We further extended the approach of fluorescence with electrophysiological measurement to assign the role for different domains in P2X1 receptors with the help of environmental sensitive, cysteine reactive fluorophore (TMRM). Cysteine rich domain-1 of P2X1 receptors (C117-C165) was found to be involved in structural rearrangements after agonist and antagonist binding. In contrast to the present understanding, that the binding of an antagonist cannot induce desensitization in P2X1 receptors and the receptors need to open first before undergoing desensitization, we propose based on our results that a competitive antagonist can also induce desensitization in P2X1 receptors by bypassing the open state. We have attempted to answer few intriguing questions in the field of P2X receptor research and we think that our answers provide many avenues to the basic understanding of functioning of P2X receptors.
Na+/H+ antiporters are ubiquitous membrane proteins involved in ion homeostasis and pH sensing. The amino acid sequence of one such antiporter, MjNhaP1, from Methanococcus jannaschii, shows a significant homology to eukaryotic sodium proton exchangers like NHE1 from Homo sapiens and SOS1 of Arabidopsis thaliana than to the well-characterized Escherichia coli NhaA or NhaB. MjNhaP1 shows activity at acidic pH unlike NhaA, which is active at basic pH. 13 transmembrane helices have been predicted to be present in NhaP1. A projection map, calculated by Cryo-EM of 2D crystals of MjNhaP1 grown at pH 4, showed it to be a dimer containing elongated densities in the centre of the dimer and a cluster of density peaks on either side of the dimer core (Vinothkumar et al., 2005). Incubation of 2D crystals at pH 8 on the EM grid resulted in well-defined conformational changes, clearly evident in a difference map as a major change in density distribution within the helix bundle (Vinothkumar et al., 2005). The aim of this dissertation is to understand the working mechanism of MjNhaP1 by determining its three-dimensional structure. The aim was initially approached by structure determination by X-ray crystallography. The limitation for this method was the low expression yield, which was 0.5–0.7mg/ml (Vinothkumar et al., 2005). After various optimization trials, the expression yield of the recombinant protein could be elevated to 2-2.5mg of pure protein per litre of culture by the method of autoinduction (Studier et al., 2005). To obtain well diffracting 3D crystals, purification conditions (Vinothkumar et al., 2005) were modified. 3D crystals were obtained under various conditions, which has so far not diffracted X-Ray beyond 8Å. Parallely, optimization of parameters (Vinothkumar et al., 2005) for 2D crystals formation was carried out. A combination of 1% DDM used for lipid solubilization, and 1% OG in the buffer of the purified protein produced 1-2 μm wide tubular 2D crystals of NhaP1. This batch of crystal proved to be the optimal for data collection at higher tilt angle with the electron microscope. A 3D map showed p22121 symmetry and revealed a tight dimer with an oval shape. The region in the central part of the dimer is composed of several tilted helices forming an interface between both monomers. On either side of the dimer interface, a group of six tightly packed helices form a bundle. This bundle contains three straight helices in the centre of the monomer and three helices in the periphery. Comparison of the structures of E.coli NhaA and M. jannaschii NhaP1 show substantial differences in length and slope of corresponding helices between both antiporters. A 3D model of NhaP1 based on the 3D map revealed 13 helices, which has been named as A-M to distinguish it from the NhaA helices. Overlaying the X-ray structure onto the 3D map revealed that the disrupted helices IV and XI of NhaA superimpose two central helices at similar position in the 3D map of NhaP1. The disrupted helices IV and XI in the X-ray structure of NhaA have been proposed as the putative ion-binding and translocation site (Hunte C et al, 2005; Arkin IT et al, 2007; Screpanti & Hunte (2007). This motif appears to be present also in NhaP1, as suggested by the close fit of NhaA helices IV and XI on the putative helices E and L of the NhaP1 model. These two putative helices E and L in NhaP1 contain the highly conserved TDP and GPRVVP motif, which are crucial for antiporter activity (Hellmer et al., 2002, Hellmer et al., 2003). In the overlay, helix V of NhaA containing the two essential, conserved aspartates D163 and D164 fits the density of the putative helix F of NhaP1, which contains the conserved motif FNDP. The homologous D161 in the FNDP motif of NhaP1 is essential for transport activity as show by mutagenesis (Hellmer at al., 2003). Significant differences are visible in the region of the dimer interface of the 3D map of NhaP1 occupied by helices VI, VII, and VIII in NhaA. This region shows an extra helical density (A) in the 3D map of NhaP1. By alignment of MjNhaP1 sequence with the amino acid sequences of several Na+/H+ exchangers, it was evident that the additional helix (A) is located in the N terminus of NhaP1. In our sequence alignment, a putative hydrophobic segment corresponding to this additional helix A is present in other archaeal and eukaryotic antiporters but not in any of the bacterial ones. The N-terminus of the human Na+/H+ exchanger NHE1 has been predicted to contain a highly hydrophobic signal peptide. This indicates the probability of the N-terminal helix A of NhaP1 to be an uncleaved signal peptide. Besides being a signal sequence targeting NhaP1 to the membrane, the map suggests that this helix might be involved in the formation of dimer contacts between both monomers. A gene duplication event is evident in the 3D map of NhaP1, as not only the helices D, E, F and K, L, M are related by an inverted repeat but also the helices B, C and I, J are related. We present here the three-dimensional architecture of a Na+/H+ antiporter from archaea. The presence of the 13th helix suggests the location of the N-terminus to be located in the cytosol and the C-terminus in the periplasm. This would orient NhaP1 in an inverted manner in the membrane in comparison to NhaA. Further structural information at higher resolution and biochemical and biophysical investigations are required to confirm the topology.
Die vorliegende Arbeit ist aus drei Teilen aufgebaut. Im ersten, relativ kurz gehaltenen Kapitel wird die klassische Standard-Industrie-Solarzelle auf der Basis monokristallinen Siliziums vorgestellt. Der bisherige Herstellungsprozess der Standard-Industrie-Solarzelle, der in wesentlichen Teilen darauf abzielt, diese Verluste zu minimieren, dient als Referenz für die Entwicklung neuer Fertigungsverfahren, wie sie in den Kapiteln 2 und 3 dieser Arbeit vorgestellt werden. Den ersten thematischen Schwerpunkt dieser Arbeit bildet die Entwicklung eines alternativen Wafering-Konzeptes zum Multi-Drahtsägen, der klassischen Technologie zur Fertigung von Silizium-Wafern. Die Basis des neuen, hier vorgestellten Wafering-Prozesses bildet das Laser-Micro-Jet-Verfahren (LMJTM). Dieses System besitzt eine Reihe von Vorteilen gegenüber klassischen „trockenen“ Laserverfahren. Das ursprünglich auf reinem, deionisiertem Wasser als Strahlmedium aufbauende System wurde im Rahmen dieser Arbeit so modifiziert, dass der Flüssigkeitsstrahl nunmehr nicht nur als flüssiger Lichtleiter dient, sondern gleichzeitig auch als Transportmedium für Ätzmittel, welche den thermischen Abtrag des Siliziums durch den Laserstrahl unterstützen. Ausgehend vom aus der Literatur bekannten chemischen Verhalten des Siliziums wurden 3 Ätzsysteme für Silizium vorgestellt. Dabei wurden Vor- und Nachteile für deren technischen Einsatz diskutiert. Den praktischen Teil dieses Arbeitspaketes bildete der Test zweier Ätzmedien im Experiment. Dabei konnte gezeigt werden, dass wasserfreie Strahlmedien basierend auf perfluorierten Lösemitteln mit bereits sehr geringen Zusätzen gasförmigen Chlors als Ätzmittel für Silizium wässrigen alkalischen Ätzsystemen jeder Konzentration prinzipiell überlegen sind- Parallel zur Evaluation des Einflusses der chemischen Beschaffenheit des Flüssigkeitsstrahls auf den Abtragsprozess fand auch eine Untersuchung verschiedener Prozessparametereinflüsse statt, etwa der Laserleistung, der Laserlichtwellenlänge, etc. Den zweiten thematischen Schwerpunkt der Arbeit bildet die Modifizierung der nasschemischen Schritte zwischen dem Wafering und dem ersten Hochtemperatur-Fertigungsschritt in der Solarzellen-Produktion, der Emitterdiffusion. Diese nasschemischen Schritte umfassen bei der Standard-Industrie-Solarzelle in der Regel eine zum Teil aufwändige Reinigung der Wafer-Oberflächen von partikulären und metallischen Kontaminationen, die vor allem vom Wafering-Prozess herrühren, als auch eine Texturierung der Substrate. Kernanliegen des praktischen Teils dieses Arbeitspaketes ist zum einen die Suche nach alternativen Texturmitteln zum 2-Propanol, dem klassischen Badadditiv in basischen Ätzbädern, das in der Praxis über zahlreiche Nachteile verfügt, etwa einem relativ niedrigen Siedepunkt, der zu seinem permanenten Ausgasen aus der Lösung führt. Zum anderen sollte der auf die Textur folgende Reinigungsprozess rationalisiert werden, um Prozesskosten zu minimieren, entweder durch eine Straffung des Prozesses durch Verringerung des Chemikalienverbrauchs und einer Reduzierung der Prozesszeit oder durch eine Verringerung der Chemikalienkosten. Bei der Suche nach neuen Texturmitteln wurden 45 verschiedene organische Substanzen verschiedener Verbindungsklassen hinsichtlich ihrer Texturwirkung auf monokristallinen Silizium-substraten getestet. Mit 1-Pentanol und p-Toluolsulfonsäure wurden zwei Substanzen ermittelt, welche in der Zukunft als praktikable Alternativen zu 2-Propanol als Texturadditive dienen könnten. Im Kontext der Suche nach neuen Reinigungsverfahren wurden eine Reihe verschiedener neuer Reinigungssequenzen getestet, die sich entweder durch veränderte - in der Regel verringerte - Badkonzentrationen, durch neue Badsequenzen, welche auf bestimmte Teilschritte verzichten oder durch neue Badkompositionen, etwa durch Hinzuziehen von Komplexbildnern für metallische Verunreinigungen von den klassischen Reinigungsprozessen unterscheiden. Der Erfolg des Reinigungseffektes der nasschemischen Sequenzen wurde anhand der Ladungsträger-Lebensdauer in den Wafern abgeschätzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe von LMJ produzierte (gelaserte) Wafer-Oberflächen wesentlich straffere Reinigungsprozesse erfordern als drahtgesägte Substrate. Neben einer deutlichen Straffung des Reinigungsprozesses ist auch eine Verkürzung der Texturzeit bei den mit Lasern geschnittenen Oberflächen möglich, die wiederum ihren Grund im geringeren Schädigungsgrad dieser Oberflächen hat, der einen geringeren Materialabtrag durch die Ätzbäder erfordert, als bei drahtgesägten Wafern. Abschließend konnte noch gezeigt werden, dass drahtgesägte Substrate, die bei gleicher Prozesszeit mit den neuen Texturmitteln prozessiert wurden, über erheblich höhere mechanische Stabilitäten verfügen, als jene, bei denen das klassische Texturmittel 2-Propanol eingesetzt wurde.
Die vorliegende Arbeit befasste sich in erster Linie mit der Regulation des P2X2 Rezeptors (P2X2R) durch Phosphoinositide (PI). P2X Rezeptoren sind durch extrazelluläres ATP aktivierte Kationenkanäle, die ubiquitär unter Vertebraten, v. a. im zentralen wie peripheren Nervensystem exprimiert werden. Bis heute sind 7 verschiedene Untereinheiten dieser Rezeptorfamilie bekannt, die nach homo- oder heterotrimerer Assemblierung unterschiedliche funktionelle Phänotypen ausbilden. Die P2X Rezeptoren sind an einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Für ihre Beteiligung am zellulären Signalgeschehen wurde in der Vergangenheit der Begriff der purinergen Signaltransduktion geprägt. PI4,5P2 ist ein zelluläres, an der Innenseite der Plasmamembran verankertes Phospholipid, dem zahlreiche, essentielle Funktionen zukommen. Dass es auch Signalfunktion besitzen kann, wurde erst spät (1980) bekannt; dass es darüber hinaus zudem membranäre Transportsysteme reguliert, konnte erst in den letzten Jahren gezeigt werden. Die ersten Kanäle, für die eine Phosphoniositid (PI)-Beeinflussung nachgewiesen wurde, waren die einwärts gleichrichtenden K+-Kanäle. 2006 wurden die ersten vorläufigen Hinweise publiziert, dass auch die Kanalfunktion der P2X Rezeptoren durch Phosphoinositide beeinflusst werden kann. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit der P2X2R nach Expression in Xenopus Oozyten elektrophysiologisch auf eine mögliche Regulation durch PIPns untersucht. Um die in der Oozyte vorliegenden PI-Level gezielt während der Messung ändern zu können, wurde die spannungsgesteuerte Phosphoinositid-Phosphatase Ci-VSP coexprimiert. Ci-VSP, die der PTEN-Phosphatase strukturell sehr ähnlich ist, wurde 2005 aus der Schlauchascidie Ciona intestinalis kloniert. In der veröffentlichten Klonierungsarbeit wurde bereits gezeigt, dass Ci-VSP in der Lage ist, bekannte PI4,5P2-sensitive Membrankanäle, wie z. B. bestimmte K+-Kanäle, spannungsabhängig zu inhibieren. Es konnte in TEVC-Experimenten gezeigt werden, dass die durch Depolarisation induzierte Aktivierung dieser Phosphatase den P2X2 Rezeptorstrom in seiner Desensibilisierung sowohl beschleunigt als auch verstärkt. Dieser Effekt war spannungsabhängig und nahm mit höherer Depolarisation zu. Die ermittelte Spannungsabhängigkeit stimmte dabei mit dem sensitiven Potentialbereich der spannungsgesteuerten Ci-VSP-Domäne, gemessen an ihren gating-Strömen, überein. Der „Ci-VSP-Effekt“ auf den P2X Rezeptor konnte nur in Anwesenheit von ATP, d.h. bei aktiviertem Rezeptor, beobachtet werden. Wurden die Oozyten mit Wortmannin, einem PI4-Kinase(PI4K)-Inhibitor, behandelt, zeigte sich eine vergleichbare Veränderung des Rezeptorstroms. Eine PI4K-Inhibition zielt demnach offensichtlich auf die gleichen Regulationsmechanismen wie die Ci-VSP-Aktivierung. In weiterführenden zellfreien Patch Clamp-Messungen an Oozytenmembranen wurden sowohl Einzelkanal- als auch makroskopische Ströme des P2X2R unter Einfluss verschiedener, intrazellulär verabreichter PIs und PI-beeinflussender Enzyme untersucht. Einzig die Zugabe von PI4,5P2 hatte einen deutlich aktivierenden Einfluss auf den makroskopischen Rezeptorstrom, andere getestete PIs (wie auch PI3-Kinase und PTEN-Phosphatase) zeigten keinerlei Wirkung. Vergleichbare Ergebnisse konnten in vorläufigen Einzelkanal-Messungen an diesem Rezeptor Subtyp beobachtet werden. Da die PI4-Kinase offensichtlich an der beobachteten Beeinflussung der P2X2R Desensibilisierung beteiligt ist, wurde die P2X2-Rezeptorsequenz auf potentielle - über sogenannte SH3-Epitope vermittelte - PI4K-Interaktionsbereiche hin untersucht. Diese SH3-Epitope kommen in vielen zellulären Proteinen vor, um Protein-Protein-Interaktionen zu vermitteln. Nach Sequenzanalyse des maßgeblich am Desensibilisierungsgeschehen beteiligten C-Terminus des P2X2R konnte im distalen Teil ein SH3-Bindungsmotiv lokalisiert werden, das daraufhin durch gerichtete Mutagenese (P2X2-P451A/P454A) unwirksam gemacht wurde. Dieser mutierte Rezeptor verhielt sich in seiner Desensibilisierung wie der Wildtyp nach Wortmannin-Behandlung, zeigte also eine intrinsisch verstärkte Desensibilisierung. Eine Wortmannin-Behandlung der Oozyten, die den mutierten Rezeptor exprimierten, führte hingegen zu keiner weiteren Beeinflussung des Rezeptorstroms. Somit konnte letztlich der Schluss gezogen werden, dass die PI4K, und das mit ihr in direkter Verbindung stehende PI4,5P2, einen maßgeblichen Einfluss auf das Desensibilisierungsverhalten des P2X2R hat. Auf Basis der erarbeiteten Befunde wurde ein kinetisches Reaktionsmodell des P2X2R erstellt, das bisher aufgestellte Modelle mit den Ergebnissen dieser Arbeit vereint, aber auch in teilweisem Gegensatz zu dem von FUJIWARA & KUBO [2006] steht. Des Weiteren wurde im Verlauf dieser Arbeit die reversible Inhibition des P2X2R durch eine Reihe von Aminoglykosid-Antibiotika untersucht. Durch Analyse der Dosis-Wirkungs-Beziehungen, der Spannungs- sowie wie ATP-Konzentrations-Abhängigkeit der Inhibition konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um einen nicht-kompetitiven open pore block handelte. Durch weiterführende Untersuchungen an einer nicht-desensibilisierenden P2X2/1 Rezeptorchimäre wurde gezeigt, dass eine Aminoglykosid-Inhibition die ATP-Dissoziation von der Rezeptorbindungsstelle signifikant verlangsamte. Dieser Befund deutet auf eine im Vergleich zum geschlossenen Zustand erhöhte Affinität des offenen Zustands für ATP hin. Neben den hier untersuchten Aminglykosiden sind bislang keine weiteren Substanzklassen bekannt, die den P2X2R durch einen derartigen Mechanismus hemmen.
The transcription factor p63 is part of the p53 protein family, which consists of three members, p53, p63 and p73. P63 shares structural similarity with all family members, but is associated to different biological functions than p53 or p73. While p53 is mainly linked to tumor suppression and p73 is connected with neuronal development, p63 has been connected to critical biological roles within ectodermal development and skin stem cell biology as well as supervision of the genetic stability of oocytes. Due to its gene structure p63 is expressed as at least six different isoforms, three of them containing a N-terminal transactivation domain. The isoforms that are of biological relevance both have a C-terminal inhibitory domain that negatively regulates the transcriptional activity. This inhibitory domain is supposed to contain two individual components of which one is internally binding and masking the transactivation domain while the other one can be sumoylated. To further investigate this domain a mutational analysis with the help of transactivation assays in SAOS2 cells was carried out to identify the critical amino acids within the inhibitory domain and the impact on transcriptional activity of TAp63alpha, the p63-isoform which is essential for the integrity of the female germline. The results of these experiments show that a stretch of approximately 13 amino acids seems to be important for the regulation of transcriptional activity in TAp63alpha, due to the increased transcriptional activity occurring in this region after mutation. Additional experiments showed that this mechanism is distinct from sumoylation, which seems to have only implications for the intracellular level of TAp63alpha. As a conclusion, the C-terminus of the Tap63alpha is essential for two different mechanisms, which control the transcriptional activity of the protein. Both regulatory elements are independent from each other and can now be restricted to certain amino acids. Activation of the wild type protein might take place in the identified region via post-translational modification. Furthermore an inhibition assay was carried out to test if the same region might have implications on the second biological relevant isoform deltaNp63alpha. The results show that the same amino acids which show an impact on transcriptional activity in Tap63alpha lead to a significant change in functional behaviour of deltaNp63alpha. There is a possibility that both proteins are regulated with opposite effects via the same mechanisms, based at the C-terminus of the p63alpha-isoforms. In both cases a modification of these residues could lead to a more opened conformation of the protein with consequences on promoter binding, which can be even important for deltaNp63alpha with respect to promoter squelching. Both alpha-isoforms seem to be regulated via the C-terminus and to elucidate if that is also the case for TAp63gamma a deletion analysis was carried out. The results show that there are also amino acids within the C-terminus of TAp63gamma, which have implications on the transcriptional activity of the protein. Therefore the C-terminus seems to play a major role for regulation of diverse p63 isoforms.
Elektronentransferprozesse in Pd-Komplexen 1,4-Chinon-basierter Bis(pyrazol-1-yl)methan-Liganden
(2009)
PdII-katalysierte Oxidationsreaktionen organischer Verbindungen stellen wichtige synthetische Werkzeuge dar. Um das Übergangsmetall in katalytischen Mengen einsetzen zu können ist es nötig, das im Zuge der Substratumwandlung entstehende Pd0 seinerseits wieder zu reoxidieren. Im großtechnischen Wacker-Prozess setzt man zu diesem Zweck das Redoxsystem CuII/CuI ein, welches Elektronen von Pd0 aufnimmt und sie auf molekularen Sauerstoff überträgt, so dass als einziges Abfallprodukt Wasser entsteht. Da beim Einsatz von Kupfersalzen allerdings Probleme durch unerwünschte Nebenreaktionen auftreten können, stieß man auf der Suche nach alternativen Redox-Cokatalysatoren auf 1,4-Benzochinon. Man nimmt an, dass der Reoxidation von Pd0 eine Koordination des 1,4-Benzochinons an das Übergangsmetallatom vorausgeht. Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit ein 1,4-Naphthochinon-basierter Bis(pyrazol-1-yl)methan-Ligand entwickelt, dessen Pd-Komplex das katalytisch aktive Übergangsmetallatom und den Redox-Cokatalysator in einem einzigen Molekül vereint. Eine direkte intra- und intermolekulare 1,4-Chinon/Pd-Koordination wird durch das Ligandendesign jedoch verhindert. Anhand dieses Modellsystems sollte dann untersucht werden, ob alternativ zu den etablierten mechanistischen Vorstellungen zum Ablauf des Elektronentransfers, eine durch den Raum verlaufende elektronische Kommunikation der beiden redoxaktiven Zentren möglich ist. Sollte das der Fall sein, wäre man künftig bei der Entwicklung und Optimierung solcher Hybridkatalysatoren nicht auf die Miteinbeziehung des 1,4-Chinons in die Koordinationssphäre des Übergangsmetallions angewiesen, sondern könnte diese ausschließlich an die koordinationschemischen Erfordernisse des Pd-Zentrums anpassen. Nachdem das Modellsystem zur Verfügung stand, galt es im ersten Schritt, die elektrochemischen Eigenschaften von freiem Ligand und PdII-Komplex mittels Cyclovoltammetrie zu bestimmen. Mit Kenntnis der Redoxpotentiale wurden daraufhin elektrochemisch selektiv reduzierte Spezies des Liganden bzw. seines PdII-Komplexes erzeugt und deren UV-vis-Spektren in situ aufgenommen. Letztere lieferten nötige Referenzwerte für die folgenden Experimente. Auf Grundlage dieser Vorarbeiten konnte nun die elektronische Kommunikation der redoxaktiven Zentren in dem Komplex untersucht werden. Da im Modellsystem zunächst beide redoxaktive Zentren in der oxidierten Form vorliegen, war es erforderlich, das PdII-Ion selektiv zu reduzieren, um dem System an der richtigen Stelle Elektronen zuzuführen. Als Reduktionsmittel wurde Triethylamin gewählt; entsprechende Vergleichsexperimente stellten zuvor sicher, dass dieses keine Nebenreaktionen mit dem Liganden selbst eingeht. Im Zuge der Reduktion des PdII-Zentrums ist eine Änderung der UV-vis-spektroskopischen Eigenschaften des Liganden zu beobachten. Ein Vergleich der erhaltenen Daten mit den Referenzspektren der elektrochemisch erzeugten reduzierten Spezies legt den Schluss nahe, dass nach Überführung des PdII-Zentrums in die nullwertige Stufe der durch den Raum verlaufende Übergang eines Elektrons auf den 1,4-Naphthochinon-basierten Liganden erfolgt. Das hierbei entstehende 1,4-Naphthosemichinonradikal wurde zusätzlich ESR-spektroskopisch nachgewiesen.
Die Erforschung der neuartigen Materialien BST, PZT und SBT für den Einsatz in neuartigen Speichertechnologien wie dem FeRAM besteht aus vielen unterschiedlichen Teilbereichen. Im Rahmen dieser Dissertation wurden primär zwei Hauptbereiche analysiert. Als Erstes wurden sowohl die Mechanismen der Oberflächenausbildung (Wachstumsverfahren, Prozeßparameter, Substrat Einflüsse) von einzelnen Filmen, als auch die Wechselwirkungen der Schichten untereinander und deren Auswirkung auf das Schichtsystem, untersucht. Im zweiten Schritt wurde das elektrische Verhalten, und die auftretenden Phänomene sowohl qualitativ als auch quantitativ erfaßt und bewertet. Als Elektrodenmaterial für die di/ferroelektrische Speicher kann nicht wie gewohnt dotiertes Silizium/Polysilizium verwenden werden. Da Platin den chemischen und thermischen Belastungen bei der Herstellung dieser Filme besonders gut gewachsen ist, wird es bevorzugt als Elektrode eingesetzt. Bei dem Aufbau der Pt-Elektrode erfolgt die größte Veränderung des Systems durch die RTP-Oxidation des reaktiven Titans. Die Rauhigkeit des vorher sehr fein kristallinen Ti-Films steigt auf das Vierfache bei einer gleichzeitigen Verdreifachung der Korngröße. Da in vielen Bauelementen Si oder Poly-Si in Kombination mit einer Ti/TiN-Barriere als Basis für den Pt-Film fungieren, wurde bei den nächsten Experimenten der Einfluß des Substrates und der TiN-Sputtertemperatur auf die Topologie/Morphologie der Elektrode untersucht. Nur durch Anpassung der TiN Sputterleistung, eine niedrige Substrattemperatur und der Kombination aus N2-RTP Temperung (nach TiN) und O2-Temperung (nach Pt), gelingt es die Rauhigkeit und Kristallitgrößen des entstandenen Filmsystems zu minimieren. Bei der Charakterisierung der di/ferroelektrischen Materialien BST, PZT und SBT wurden zum einen das Wachstum und die beim Aufbau der Schichten auftretenden Phänomene anhand verschiedener Abscheidungstechniken untersucht/verglichen. Zum anderen sind mehrere Schichtdicken, Schichtabfolgen und eine Reihe unterschiedlich getemperter Proben analysiert worden. Die mittels Sputtern hergestellten BST Filme belegen, dieses Material hat typischerweise ein columnares Kristallwachstum und läßt sich sehr fein kristallin aufbringen. Bei der reaktiven Abscheidung aus der Gasphase (MOCVD) hat sich schnell gezeigt, das komplexe Material System BST reagiert bereits bei Variation eines Parameters extrem unterschiedlich. So findet bei einer hohen Substrattemperatur (690°C) ein fließender Übergang vom zwei dimensionalen (2D, Frank-van der Merwe), zum drei dimensionalen (3D, Stranski-Krastanov) Wachstum statt. Wird BST bei 600°C abgeschieden, liegt von Anfang an ein gemischter 2D/3D Schichtaufbau vor, der überwiegend in einen 3D inselartigen Aufbau (Vollmer-Weber) übergeht. Senkt man die Temperatur auf 450°C, bildet sich auf der Oberfläche Haze, der durch eine instabile Gasphasenreaktion an der Oberfläche entsteht und sich hauptsächlich aus Strontium- und Bariumoxid zusammensetzt. Gesputtertes PZT besitzt im Vergleich zu BST eine um den Faktor 6 höhere Wachstumsrate, und bildet zweimal so breite Kristallite aus. Es hat eine relativ feinkörnige Struktur und seine Kristalle wachsen wie beim BST columnar auf. Die MOD Technik erzeugt einen relativ homogenen SBT-Schichtaufbau mit Korngrößen bis zu 135 nm. Erst nach dem Ferroanneal entstehen bis zu dreimal größere Kristalle, die von markanten Korngrenzen getrennt werden und große Kristallflächen mit Unterstrukturen haben. Die mit der MOCVD Methode hergestellten SBT-Proben zeigen teilweise Wachstumsphänomene in Form von Hillocks, die im EDX allerdings keine Unterschiede in der Zusammensetzung aufweisen. Die systematische Untersuchung der Wechselwirkung von Temperatur (600-800°C) und Schichtdicke (ca. 80-175 nm) bei konstanter Temperzeit hat ergeben, daß die Filme bei einem 600°C Ferroanneal kleine Hillocks besitzen, die erst ab 700°C nicht mehr zu beobachten sind. Neben der topographischen Analyse von Di- und Ferroelektrika gibt es einen zweiten sehr wichtigen Aufgabenbereich, die elektrische Charakterisierung dieser Materialien. Da alle herkömmlichen Verfahren diese Daten nur Integral erfassen können, eröffnet die Rastersondenmikroskopie hier erstmalig die Chance, sowohl Topographie als auch elektrische Parameter simultan und mit hoher Ortsauflösung (10-50 nm) zu analysieren. Die ersten Versuchsreihen wurden mit dem EFM gemacht und haben sich mit dem Polarisationsverhalten von PZT und SBT beschäftigt. Zu diesem Zweck wurde ein Experiment entwickelt, bei dem das Ferroelektrikum durch gezielte Polarisationen in zwei definierte Zustände entgegengesetzter maximaler Polarisation versetzt wird. Die Ergebnisse konnten mit dem Oberflächenpotential Mikroskop reproduziert werden, allerdings reagiert das Oberflächenpotential Mikroskop deutlich stärker auf freie Ladungen als das EFM. Um zwischen Ladungsartefakt und realer Beobachtung unterscheiden zu können, wurde ein Verfahren zur Konditionierung und Ladungsentfernung der Probe entwickelt, ohne die Probe merklich zu manipulieren. Da bei den EFM-Untersuchungen viele verschiedene elektrostatische Phänomene aufgetreten sind, ist eine generelle Betrachtung zur Fragestellung, was bildet das erhaltene EFM-Signal eigentlich ab, gemacht worden. Dazu wurde ein deutlich vereinfachtes Ladungsmodell vorgestellt, das den Polarisationsvorgang mit seinen unterschiedlichen Einzelprozessen beschreibt. Zusammenfassend ist zu sagen, daß EFM ein elektrostatisches Gesamtfeld detektiert, das aus verschiedenen Komponenten besteht, die in der Regel qualitativ und nicht quantitativ miteinander verknüpft sind. Im Gegensatz zu makroskopischen Messungen haben zeitabhängige Untersuchungen an SBT gezeigt, die abgebildete Polarisation verringert sich bereits nach wenigen Tagen signifikant. Eine Erklärung für den Signalverlust ist die Annahme, daß sich über die Zeit primär nur die SBT-Oberfläche verändert, da ihr die elektrisch und chemisch stabilisierende Pt-Elektrode fehlt. Eine weitere Überlegung geht davon aus, durch die EFM-Spitze hat eine wesentlich höhere Feldstärke auf das Ferroelektrikum eingewirkt und das Material dadurch stärker gestreßt. Die Untersuchung der temperaturabhängigen Relaxation von ferroelektrischen Filmen liefert weitere interessante Erkenntnisse. Ohne obere Pt-Elektrode kann man bereits ab 130°C einen deutlichen Polarisationsverlust beobachten (Curie-Punkt SBT: 310°C). Die Temperversuche sprechen damit für die Hypothese, durch die fehlende obere Elektrode wurde bei der Polarisation erhöhter Streß in das SBT eingeprägt und das System hat darauf mit stark beschleunigter Relaxation reagiert. Es kann jedoch nicht abschließend geklärt werden, was auf das Materialverhalten einen größeren Einfluß ausübt, die Oberflächenladungen oder die fehlende obere Pt-Elektrode. In weiteren Experimenten wurde die Bildung der ferroelektrischen Phase und deren Störungen untersucht. Versuche mit unterschiedlicher Ferroannealtemperatur bei MOD SBT-Schichten haben gezeigt, die Kristallphasenbildung wird hauptsächlich von der Annealtemperatur gesteuert. Bei einer Temperatur von 600°C wird nur eine partielle Phasenumwandlung erzielt, dagegen liegt bei 800°C eine vollständige Umwandlung in den pseudotetragonalen Perowskit vor. Die Untersuchung eines mittels MOCVD-Verfahren abgeschiedenen SBT-Films ergab eine nicht vollständig polarisierte Oberfläche. Da sich bei einer Substrattemperatur von 640°C primär eine a/b-Kristallachsenorientierung ausbildet, die Probe jedoch nur partiell polarisierbar war, ist höchstwahrscheinlich die Substrattemperatur während der Abscheidung zu niedrig gewesen. Zum Abschluß der Versuche wurde der Polarisationsbereich zunächst auf wenige Mikrometer verkleinert und schließlich sogar auf einzelne Kristalle eingeschenkt. Obwohl es gelingt, einzelne Kristalle zu polarisieren, zeigen diese Experimente deutlich die Limitierungen des EFMs auf. Die ersten Messungen mit dem Piezoresponse-SPM haben ergeben, daß es möglich ist, subkristalline Polarisationsstrukturen ohne nennenswerte Topographieartefakte und „Übersprechen“ abzubilden. Mit dem C-AFM ist in sehr hoher Orts- und Stromauflösung das Leckstromverhalten von BST, PZT und SBT untersucht worden. Da diese di- und ferroelektrischen Materialien eine polykristalline Struktur haben, treten neben Fehlertypen wie Fremdatomdefekten und Leerstellen auch noch eine Vielzahl anderer Kristallbaufehler (Versetzungen, Korngrenzen, ...) auf, die zu erhöhten Leckströmen führen. Auch die Morphologie der Filme beeinflußt das elektrische Verhalten der Materialien. Bei den als Erstes vermessenen BST-Proben ist eine starke Schichtdicken- und Feldstärken-Abhängigkeit zu beobachten. So wird das Leckstromverhalten bei dünnen BST-Proben und niedrigem Potential von extrinsischen Fehlern in Form von Fremdatomdefekten, Leerstellen und verschiedenen Kristallbaufehlern dominiert. Erhöht man allerdings die Feldstärke, so bestimmen die intrinsischen Fehler die Leckstrompfade, da durch das hohe Potential die Bandstruktur solange degradiert bis ein elektrischer Durchbruch vorliegt. Bei höheren Schichtdicken (70 nm) werden durch den intrinsischen Streß des Films hervorgerufene Leckströme erkennbar. Sie treten erst ab einem kritischen Zug- oder Druckstreßniveau in Insel/Domänen-ähnlicher Form auf, der in der topographischen Aufnahme nicht sichtbar ist. Im Gegensatz zu amorphen Materialien wie dem SiO2 spielt bei BST, PZT und SBT die Filmdicke nur eine untergeordnete Rolle, da eine partielle Dünnung nicht automatisch einen erhöhten Leckstrom zur Folge hat. Da ferroelektrische Materialien eine Leckstromgenerierung besitzen die komplexer ist, und einem anderen Zeitablauf folgt, als bei einem Dielektrikum, wurde zuerst das ferroelektrische PZT mit dem C-AFM analysiert. Die ersten Untersuchungen an einer PZT-Probe haben allerdings sehr schnell gezeigt, zwischen BST und PZT gibt es keine nennenswerten Unterschiede im Leckstromverhalten. Für die Herstellung von SBT-Schichten werden hauptsächlich das MOD und das MOCVD Verfahren verwendet. Um festzustellen welche der beiden Abscheidetechniken das bessere Leckstromverhalten hat, wurden MOD und MOCVD SBT-Filme charakterisiert. Diese Untersuchungen haben gezeigt, bei MOCVD Filmen treten die Leckströme hauptsächlich in den Bereichen auf, die leicht vereinzelte oder nicht dicht verwachsene Korngrenzen und Kristallecken besitzen. Im Vergleich dazu weisen die MOD Schichten in ähnlichen Bereichen deutlich wenigere und niedrigere Leckströme auf. Den Einfluß von Topologie und Filmdicke hat die Analyse einer mit 90 nm MOD SBT beschichteten Stufe (120 nm) belegt, da dort nur im Kantenbereich extrem erhöhte Leckströme zu beobachten sind. Das Degradationsverhalten von SBT ist außerdem auch noch dickenabhängig. Dies beweisen I/V Spektren, die bei C-AFM Messungen an unterschiedlich dicken MOD SBT-Schichten (90/180 nm) aufgenommen wurden. Es zeigt sich, speziell bei höheren Feldstärken liegt bei der dünnen SBT-Probe (90 nm) eine um den Faktor vier steilere Degradation vor.
Based on the commonly used and well-established state-of-the-art DNA sequencing method, i. e. Sanger sequencing, the major target of future research is to develop a fast, cost-effective and gelelectrophoresis-free sequencing method. The aim of the new sequencing technologies is to detect DNA mutations faster and more accurate in order to develop individual therapies for patients (personalized medicine). For this purpose, a lot of novel sequencing techniques like pyrosequencing, mass-spectrometry-assisted sequencing, sequencing by hybridization etc. have been put into practice and already led to commercialized sequencers. The sequencing technology we were mostly interested in is the so-called sequencing-by-synthesis method (SBS). This PhD thesis covers the synthesis of modified nucleosides – the so-called reversible terminators – and their evaluation as reversible terminators. These 3′-modified and dye-labeled nucleotides are incorporated by the polymerase into the DNA-template, then the DNA-synthesis is stopped. After detection of the fluorescent signal, the reversible terminator has to be cleavable in a way (i. e. the polymerase-blocking modification) that the DNA-synthesis can continue. As a result of the polymerase-acceptance tests that have been carried out with the two triphosphates cyanoethoxymethyl(CEM)-dTTP and cyanoethyl(CE)-dTTP as substrates it became clear that the latter one was better incorporated than the first one. Based on this knowledge all four key compounds for the whole reversible terminators possessing the cyanoethyl (CE) group where synthesized within this PhD thesis. Additionally to the synthesis of the modified key compounds, the cleavability of the cyanoethyl function had to be evaluated which is an essential requirement of a reversible terminator for SBS. For addressing this issue, three different CE- and CEM modified monophosphates were created. For each of these three monophosphates an individual synthetic strategy has been developed within this PhD work, each of these strategies and subsequent phosphorylation led to the desired modification. These previously unknown model compounds mimicking the solubility of short oligonucleotides were employed the for qualitative cleavage experiments after their purification and spectroscopical characterization. With these three monophosphates suitable cleavage conditions for a quantitative removal of the CE and the CEM group were examined. In case of the CE function we selectively improved the cleavage conditions while varying the solvent, the reaction temperature as well as the amount of cleaving agent used, in order to make the conditions applicable for an SBS experiment. Due to the fact that the CE function was the most important modification for our SBS experiment, we could even optimize the cleavage efficiency by employing co-solvents like DMSO or DMF. An additional cleavage experiment was carried out by using a short CE-modified oligomer which led to further results that were comparable to the ones obtained from the cleavage experiments of the monomers. One big difference is the required amount of TBAF as cleaving agent for the quantitative removal of the CE-modification from the oligomer. In this case, 7500 equivalents of TBAF are needed for complete CE cleavage at 45 °C compared to the amount of 40 to 80 equivalents TBAF for the monomer (monophosphate). As a conclusion of this result we assume that the amount of cleaving agent and the solubility of the oligomer plays an important role in the CE cleavage efficiency. This assumption was already supported by Saneyoshi et al. who demonstrated for CE-modified RNA oligonucleotides that the CE-cleavage rate is strongly lowered with the increasing of the oligomer length. Thus we could demonstrate that the CE function is quantitatively removable from an oligomer without destroying it. With these results in hands we could prove that the CEM and the CE group are quantitatively cleavable and therefore applicable as blocking groups for reversible terminators. The conditions for the CE cleavage are used for the ArraySBS-“proof-of-principle” which is currently under investigation.
X-ray structure of the Na+-coupled Glycine-Betaine symporter BetP from Corynebacterium glutamicum
(2009)
Cellular membranes are important sites of interaction between cells and their environment. Among the multitude of macromolecular complexes embedded in these membranes, transporters play a particularly important role. These integral membrane proteins perform a number of vital functions that enable cell adaptation to changing environmental conditions. Osmotic stress is a major external stimulus for cells. Bacteria are frequently exposed to either hyperosmotic or hypoosmotic stress. Typical conditions for soil bacteria, such as Corynebacterium glutamicum, vary between dryness and sudden rainfall. Physical stimuli caused by osmotic stress have to be sensed and used to activate appropriate response mechanisms. Hypoosmotic stress causes immediate and uncontrolled influx of water. Cells counteract by instantly opening mechanosensitive channels, which act as emergency valves leading to fast efflux of small solutes out of the cell, therebydiminishing the osmotic gradient across the cell membrane. Hyperosmotic stress, on the other hand, results in water efflux. This is counterbalanced by an accumulation of small, osmotically active solutes in the cytoplasm, the so-called compatible solutes. They comprise a large variety of substances, including amino acids (proline), amino acid derivatives (betaine, ectoine), oligosaccharides (trehalose), and heterosides (glucosylglycerol). Osmoregulated transporters sense intracellular osmotic pressure and respond to hyperosmotic stress by facilitating the inward translocation of compatible solutes across the cell membrane, to restore normal hydration levels. This work presents the first X-ray structure of a member of the Betaine-Choline-Carnitine-Transporter (BCCT) family, BetP. This Na+-coupled symporter from Corynebacterium glutamicum is a highly effective osmoregulated and specific uptake system for glycine-betaine. X-ray structure determination was achieved using single wavelength anomalous dispersion (SAD) of selenium atoms. Selenium was incorporated into the protein during its expression in methione auxotrophic E. coli cells, grown in media supplemented with selenomethionine. SAD data with anomalous signal up to 5 Å led to the detection of 39 selenium sites, which were used to calculate the initial electron density map of the protein. Medium resolution and high data anisotropy made the structure determination of BetP a challenging task. A specific strategy for data anisotropy correction and a combination of various crystallographic programs were necessary to obtain an interpretable electron density map suitable for model building. The crystal structure of BetP shows a trimer with glycine-betaine bound in a three-fold cation-pi interaction built by conserved tryptophan residues. The bound substrate is occluded from both sides of the membrane and aromatic side chains line its transport pathway. Very interestingly, the structure reveals that the alpha-helical C-terminal domain, for which a chemo- and osmosensory function was elucidated by biochemical methods, interacts with cytoplasmic loops of an adjacent monomer. These unexpected monomer-monomer interactions are thought to be crucial for the activation mechanism of BetP, and a new atomic model combing biochemical results with the crystal structure is proposed. BetP is shown to have the same overall fold as three unrelated Na+-coupled symporters. While these were crystallised in either the outward- or inward-facing conformation, BetP reveals a unique intermediate state, opening new perspectives on the alternating access mechanism of transport.
In jüngster Zeit werden vom humanen Immundefizienzvirus-1-abgeleitete lentivirale Vektoren auch in der Gentherapie eingesetzt. Obwohl diese Vektoren nicht-mitotische Zellen transduzieren können, sind sie für einen Gentransfer in primäre ruhende Zellen oft nicht geeignet. In der Abteilung „Medizinische Biotechnologie“ des Paul-Ehrlich-Insituts wurde ein vom simianen Immundefizienzvirus SIVsmmPBj-abgeleiteter lentiviraler Vektor entwickelt, welcher im Gegensatz zu HIV-1-abgeleiteten Vektoren effizient in der G0-Phase des Zellzyklus arretierte humane Fibroblasten und humane primäre Monozyten transduzieren kann (Mühlebach et al., 2005). Im dieser Arbeit wurde das Potenzial dieses neuen Vektors für mögliche Anwendungen in der Gentherapie untersucht, indem seine Transduktionsfähigkeit für weitere primäre Zellen bestimmt wurde. Dabei waren humane hämatopoetische Stammzellen von besonderem Interesse, da sie die Vorläuferzellen aller Zellen des Blutes sind und die Eigenschaft zur Selbsterneuerung besitzen. Die Effizienz des Gentransfers in unstimulierten Stammzellen mit dem SIVsmmPBj-Vektor war jedoch nicht höher als mit anderen lentiviralen Vektoren. Interessanterweise konnte aber ein Einfluss der lentiviralen Vektoren auf das in vitro-Differenzierungspotenzial der transduzierten Stammzellen in die verschiedenen Vorläuferzellen beobachtet werden: Nach Transduktion mit dem SIVsmmPBj- und einem HIV-2-abgeleiteten Vektor differenzierten die Stammzellen bevorzugt in granulozytäre Vorläuferzellen, während die Transduktion mit einem HIV-1-abgeleiteten Vektor die Anzahl aller Vorläuferzellen deutlich reduzierte und insbesonders die Differenzierung in Makrophagenvorläuferzellen verminderte. Zur Untersuchung ihres Differenzierungs-potenzials in vivo wurden transduzierte hämatopoetische Stammzellen zur Repopulierung des Knochenmarks von NOD/SCID-Mäusen eingesetzt. Hierbei wurde jedoch kein Einfluss der verschiedenen lentiviralen Vektoren auf die Differenzierung der Stammzellen beobachtet. Allerdings konnte nur in einem sehr geringen Anteil der transplantierten Zellen eine Expression des übertragenen Gens nachgewiesen werden, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass die transduzierten Zellen die Fähigkeit zur Repopulierung verloren hatten. Insgesamt ist jedoch zu sagen, dass entgegen der Erwartungen der neue Vektor keinen Vorteil gegenüber HIV-1-Vektoren zur Transduktion von hämatopoetischen Stammzellen aufweist. Weiter wurde die Transduktionsfähigkeit des SIVsmmPBj-Vekors für humanen B-Lymphozyten, Makrophagen und dendritische Zellen untersucht. Auf ruhenden B-Lymphozyten besaß der SIVsmmPBj-Vektor keinen Transduktionsvorteil gegenüber einem HIV-1-abgeleiteten Vektor, während Makrophagen und dendritische Zellen mit signifikant höherer Effizienz transduziert werden konnten. Die hohe Transduktionseffizienz des SIVsmmPBj-Vektors für Monozyten und dendritische Zellen eröffnet die Möglichkeit einer Anwendung in der Immuntherapie, da dendritische Zellen die professionellsten und effektivsten Antigen-präsentierenden Zellen sind. Daher wurde die generelle Eignung des SIVsmmPBj-Vektors für immuntherapeutische Anwendungen untersucht. Ein Tumor-assoziiertes Antigen (Mart-1) wurde in Monozyten übertragen und die transduzierten Zellen zu reifen dendritischen Zellen maturiert. Diese Zellen besaßen die Fähigkeit, Antigen-spezifische zytotoxische T-Zellen zu generieren, deren Funktion durch Sekretion von Zytokinen, in Einzelfällen auch durch spezifische Lyse von Mart-exprimierenden Tumorzellen nachgewiesen wurde. Weiterhin wurde gezeigt, dass nach Transduktion von Monozyten und deren Differenzierung zu Makrophagen auch diese prinzipiell in der Lage sind, Antigen-spezifische zytotoxische T-Zellen zu generieren. Obwohl hier keine vergleichenden Untersuchungen zur Effizienz des T-Zell-Primings durchgeführt werden konnten, ist die prinzipielle Eignung des SIVsmmPBj-abgeleiteten Vektors für eine Immuntherapie damit nachgewiesen. Schließlich wurde untersucht, ob die Maus oder nicht-menschliche Primaten als Tiermodelle für eine mögliche Weiterentwicklung des Vektors in Frage kommen. Murine Monozyten konnten jedoch nicht effizient transduziert werden. Hingegen erwies sich der SIVsmmPBj-Vektor als gut geeignet zur Transduktion von simianen Monozyten, so dass ein Affenmodell für Anwendungen des SIVsmmPBj-Vektors, wie beispielsweise zur Tumor-Immuntherapie oder für Vakzinierungsstudien, in Frage kommt.
Die Fluoreszenz der organischen Verbindung ''Pigment Yellow 101'' wurde mittels zeitaufgelöster Anreg-Abtast-Spektroskopie im sichtbaren Spektralbereich untersucht. P.Y. 101 und ein Derivat mit zusätzlichen Methylgruppen an den Azin-Kohlenstoffatomen, wurden mit zwei Derivaten verglichen, die keine Hydroxygruppen tragen und nicht fluoreszieren. Es konnte gezeigt werden, dass die Fluoreszenz bei diesen Verbindungen eine intrinsische Eigenschaft ist, die von der Reihenfolge der angeregten Zustände bestimmt wird. Bei Derivaten mit Hydroxygruppe entspricht der niedrigste angeregte Zustand einem pp*-Übergang, welcher hauptsächlich durch Fluoreszenz zurück in den Grundzustand gelangt. Bei den Verbindungen ohne Hydroxygruppe fehlt die stabilisierende Wasserstoffbrücke, die zur Absenkung des entsprechenden Zustands führt, so dass bei diesen Derivaten der unterste angeregte Zustand einem np*-Übergang entspricht, der optisch verboten ist und somit nicht direkt populiert wird. Bei der Anregung wird ein höher angeregter Zustand bevölkert, der in den niedrigsten angeregten Zustand relaxiert, welcher über eine konische Durchschneidung schnell und strahlungsfrei erreicht werden kann. Der niedrigste angeregte Zustand schneidet seinerseits den Grundzustand, so dass auch die Repopulierung des Ausgangszustands schnell, effizient und strahlungslos abläuft. Eine ganz andere Art der Photochemie wird bei Azobenzol (AB) und AB-Derivaten beobachtet. Durch Isomerisierung um die N-N-Doppelbindung wird ein Photoprodukt gebildet, das cis-Isomer. Die Quantenausbeute der Isomerisierung ist dabei abhängig davon, welcher elektronische Übergang angeregt wurde. Substituenten am AB üben unterschiedlichen Einfluss auf die elektronischen Eigenschaften aus: Elektronegative Gruppen in meta-Position zur Diazobrücke verändern die Lage der Absorptionsbanden kaum, ebensowenig die Rate der thermischen Rückisomerisierung und auch die Dynamik nach Photoanregung zeigt keine signifikanten Unterschiede in Abhängigkeit vom Substituenten und kann in Analogie an unsubstituiertes AB interpretiert werden. Nach Anregung des np*-Übergangs zerfällt der angeregte Zustand biexponentiell. Die Anregung des pp*-Übergangs, dem optisch erlaubten Übergang, führt zur Population des zweiten angeregten Zustands. Entlang einer konischen Durchschneidung wird schnell und effizient der erste angeregte Zustand populiert. Dieser Prozess zeigt sich bei den zeitaufgelösten Messungen in einer schnellen Zerfallszeit, die nur wenige hundert Femtosekunden beträgt. Die nun folgenden Prozesse finden im ersten angeregten Zustand statt und sind vergleichbar mit den Prozessen nach np*-Anregung. Der Hauptunterschied zwischen den beiden Dynamiken im S1-Zustand ist die Ausgangsgeometrie, mit der die Moleküle diesen Zustand populieren (Franck-Condon-Bereich bei direkter Anregung, bzw. eine große Bandbreite an Geometrien nach dem S2-S1-Übergang), sowie die Schwingungsenergie die das System jeweils besitzt. Auch nach ursprünglicher S2-Anregung können zwei Zerfallszeiten dem ersten angeregten Zustand zugeordnet werden, die analog der direkten Population als Geometrieänderung in Richtung des Potentialminimums und Isomerisierung bzw. Rückkehr in den Grundzustand interpretiert werden und in der Größenordnung von einer bzw. fünf Pikosekunden liegen. Die Modifizierung von Peptiden mit Azobenzol stellt einen Weg dar, zeitlich synchronisiert, eine Störung in der Struktur zu induzieren. Dieses Konzept wurde bereits erfolgreich zur Untersuchung der Faltung zyklischer Peptide eingesetzt. Modifizierte Kollagenstränge sind eine Erweiterung dieses Prinzips, da sie eine Möglichkeit darstellen, die Tertiärstruktur eines Peptids zu adressieren. Für das vorliegende Azokollagen konnte gezeigt werden, dass die gewählte Aminosäuresequenz auch nach Anbringen der Azobenzolklammer zu gefaltetem Kollagen führt, welches thermodynamisch stabil ist. Der Schmelzpunkt der Tripelhelix liegt unter den gewählten Bedingungen bei 55°C. Die Isomerisierung des Azobenzols induziert eine Störung der Tertiärstruktur, die zur teilweisen Entfaltung der Tripelhelix führt, was ein reversibler Prozess ist. Eine vollständige Entfaltung findet erst bei Temperaturen oberhalb des Schmelzpunkts statt. Zeitaufgelöste Messungen im sichtbaren Spektralbereich zeigten, dass die Schalterdynamik durch Anbringung an das Peptid nicht signifikant im Vergleich zum reinen AB-Schalter verändert wird.
Azopeptide: Peptide mit eingebauten lichtgesteuerten Schaltern sind interessante Systeme, um konformationelle Dynamik in Peptiden zu untersuchen. In dieser Arbeit ist es gelungen einen solchen Schalter herzustellen und in ein von Robertson et al. entworfenes Modellsystem als Teil des Peptidrückgrats einzuführen. Es wurde somit die Synthese von Peptiden mit eingebauten lichtgesteuerten Schaltern fortgeführt und auf ein größeres System übertragen. Die zu erwartenden Probleme bei der Synthese eines Systems dieser Größe (30 Aminosäuren + Schalter) konnten durch Modifizierung der Standardsynthese für Peptide (Fmoc-Strategie) an der Festphase erreicht werden. Es war daher möglich, ausreichende Mengen des Peptids herzustellen sowie die freie SH-Gruppe des Peptids mit einer Schutzgruppe zu versehen, was dem Molekül zu weiterer Stabilität verhalf. Das Azopeptid wurde mit UV/vis- und Ultrakurzzeit-Spektroskopie, und besonders im Vergleich mit dem Schalter AMPB alleine, charakterisiert. Hierbei wurden folgende Erkenntnisse offen gelegt: - Das Azopeptid in Wasser verhält sich bei Belichtung (367 nm) sehr ähnlich dem AMPB (7) in DMSO (isosbestischer Punkt bei 288 nm) - Die thermische Rückreaktion lässt sich bei 330 nm biexponentiell fitten, bei 260 nm nicht, was Rückschlüsse auf mangelnde Stabilität des Azopeptids nach Belichtung zulässt (freie SH-Gruppe). - Der Abfall des angeregten Zustandes des Azopeptids folgt multiexponentiellen Kinetiken auf Zeitskalen zwischen einigen hundert fs bis zu wenigen ps. - Der Schalter AMPB (7) in DMSO verhält sich bei Belichtung (367 nm) sehr ähnlich dem beidseitig entschütztem Schalter (8) in Wasser. - Es sehr ähnliche Kinetiken für AMPB (7) in DMSO und das Azopeptid in Wasser über den gesamten spektralen Bereich werden gefunden; Absorptionsaufbau erfolgt innerhalb der Zeitauflösung des Experiments, Unterschied um einen Faktor 2 in der Zerfallsdynamik, die für das Azopeptid langsamer ist. Parvulustat: Parvulustat ist wie Tendamistat ein alpha-Amylase-Inhibitor; die Struktur von Tendamistat ist bereits sehr gut sowohl durch NMR als auch durch Röntgenkristallographie untersucht ist. Mit Parvulustat teilt Tendamistat nur 29,6 % Sequenzidentität bei ähnlicher Länge und gleicher Funktion der beiden Proteine. Es war daher von großem Interesse, die Struktur von Parvulustat aufzuklären um Ähnlichkeiten und Unterschiede der beiden Proteine diskutieren zu können. In dieser Arbeit ist es gelungen mit Hilfe der hochauflösenden, heteronuklearen 3D NMR-Spektroskopie in Lösung und iterativen Rechungsmethoden die Struktur des Proteins Parvulustat, anhand von 15N- und 13C,15N-markierten Proben, in sehr guter Qualität aufzuklären. Weiterhin ist es gelungen, dynamische Eigenschaften des Proteins durch Relaxationsdaten darzustellen. Basierend auf diesen Daten war es möglich die beiden Proteine Parvulustat und Tendamistat umfassend miteinander zu vergleichen und Schlüsse bezüglich ihres Bindungsmechanismus zu ziehen. Insgesamt ist zwischen beiden Proteinen eine große Ähnlichkeit zu verzeichnen, aber es wurden auch einige Unterschiede festgestellt: beide Proteine besitzen zwar die gleiche beta-Faltblatt-Struktur, jedoch sind bei Parvulustat die einzelnen Stränge etwas kürzer ausgebildet. Weiterhin hat in Parvulustat ein Strang eine andere Krümmung, weil ein Prolin anstelle eines Leucins in Tendamistat sitzt und durch seine einzigartige Form die Struktur in dieser Region ändert. Bezug nehmend auf die Ladungsverteilung beider Proteine ist festzustellen, dass beide durch ein hydrophobes Herzstück stabilisiert werden und sich insgesamt sehr ähnlich sind, bis auf die Position R44 in Parvulustat bzw. Y46 in Tendamistat, was in Parvulustat eine positive Ladung an der Oberfläche generiert. Generell ist noch zu sagen, dass man beim Interpretieren der Daten in Bezug auf Tendamistat vorsichtig sein muss, da es durchaus Unterschiede in der Datenakquise gibt: im Gegensatz zu Tendamistat dessen Struktur anhand von homonuklearen 2D NMR-Techniken aufgeklärt wurde, waren für Parvulustat bereits 3D Pulssequenzen verfügbar, NMR-Spektrometer mit höheren Feldern, weiterentwickelte Rechenprogramme, so dass u. a. auch die Relaxationsdaten einflussnehmend in die Strukturrechnung mit eingebaut werden konnten.
Structural analysis of the enzyme N-formylmethanofuran:tetrahydromethanopterin formyltransferase
(2008)
Archaea represent a third domain of life and some archaea exhibit a high degree of tolerance to extreme environmental conditions. Several members are methanogens and present in many anaerobic environments. Most methanogens are able to maintain growth simply on H2 and CO2 via the enzymatically catalyzed reaction 4H2 + CO2 > CH4 + 2 H2O. The archaeon Methanopyrus kandleri grows optimally at temperatures of 84°C to 110°C, pH values of 5.5 to 7.0 and NaCl concentrations 0.2% to 4%. The enzyme N-formylmethanofuran tetrahydromethanopterin formyltransferase (MkFTR) catalyzes the transfer of a formyl group from the cofactor N-formylmethanofuran (FMF) to the cofactor tetrahydromethanopterin (H4MPT), the second step of the above reaction. X-ray crystallographic analysis yielded insights into the structure and function of MkFTR, (1) the MkFTR monomer exhibits a pseudo-two fold structure suggestive of an evolutionary gene duplication. (2) The structure is a D2 homo-tetramer with prominent cleft-like surface features. Analysis of the interface contacts showed that the tetramer is best described as a dimer of dimers. The clefts were associated with the monomer:monomer interface and were weakly occupied by extra electron density which might be attributed to the H4MPT analog folate. (3) This suggested that the clefts are active sites and their association with oligomer interfaces suggested a basis for the dependence of activity on oligomerization. (4) The thermal stability of MkFTR most likely arises from the greater number of H- and ionic-bonds within the monomer and between monomers with respect to mesophilic protein structures. (5) The structure showed a large number of surface exposed negatively charged, glutamate and aspartate residues. These residues explain the salt dependent oligomerization, as only at high enough salt concentration is the electrostatic charge compensated by cation binding and neutralized allowing oligomerization. (6) These residues also improve the solubility of MkFTR at high salt concentration by increased charge repulsion. (7) Comparison of MkFTR structures from low and hight salt conditions showed that surface glutamate residues bind slightly more water molecules at high salt conditions further contributing to MkFTR solubility at high salt concentration.
Despite the well-known importance of ribonucleic acids (RNA) in cell biology, it is astounding to realize the pace at which new fundamental functions of RNAs have been discovered. One of the fundamental reasons for the multitude of functions of RNA is the property of RNA to adopt different conformations or folds. The primary sequence of RNA, a linear polymer built from four different repetition units, can fold into alternate secondary structure motifs which in turn form alternate long-range interactions in complex tertiary structures. Ligands such as metal ions or small molecular weight metabolites and also proteins or peptides can bind to RNA and induce the changes in tertiary conformation. For example, in the cell, RNA participates in gene regulation in the form of riboswitches. Riboswitches are found in untranslated regions of messenger RNA (mRNA) and adopt alternate conformations depending on the presence or absence of specific metabolites. If a metabolite is present above a specific concentration, it induces a conformational change in the respective riboswitch by binding and thereby alters gene expression. Another example is the RNA thermometer which participates in the cell translational mechanism by a similar strategy. Translation initiation requires the binding of RNA thermometers to the ribosome. The ribosome binding region is located in the 5’ untranslated region of mRNA. At low temperatures this region is prevented from binding to the ribosome by forming basepairs. At higher temperatures, these basepairs dissociate allowing ribosome binding and subsequent translation. Therefore, the characterization and delineation of the kinetics and pathway of RNA folding is important to understand the function of RNA and is an important contribution to fundamentally understand RNA’s role in the cell. RNA conformational transitions occur over a wide range of timescales. Depending on the timescale, various biophysical techniques are used to study RNA conformational transitions. In these biophysical studies, achieving good structural and temporal resolution constitute frequently encountered challenges or limitations. For example, single molecule FRET spectroscopy provides high temporal resolution in the milliseconds at high sensitivity but lacks atomic resolution. Recent advances in the field of Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy have enabled the elucidation of tertiary folding events to be characterized with atomic resolution. This thesis involves the use of NMR spectroscopy to characterize the folding of RNA molecules. Kinetics experiments require rapid initiation of the kinetics followed by monitoring of the reaction. In this thesis, two different folding initiation techniques have been applied and coupled to the subsequent detection of RNA folding using NMR spectroscopy, namely, photocaging and rapid mixing. The method of photocaging is well established (Kuhn and Schwalbe, 2000) and builds on the following principle: A photolabile moiety is attached to a molecule that prevents a specific interaction. Upon irradiation of the molecule with the photolabile group using laser light at a specific wave length, at which the molecule of interest is not absorbing, the protecting group is released. In our group, together with the group of S. Pitsch, ETH Lausanne, we could "cage" RNA at its equilibrium state by a photolabile molecule (similar work has been carried out in the group of A. Heckel). Rapid and traceless release of the photolabile precursor compound by a laser pulse releases the RNA to fold into its native state; the build-up of the native state of the RNA is monitored by NMR signals that are uniquely characteristic for the native state of the RNA. By optically coupling a laser source to an NMR magnet, the above procedure can take place in situ and the kinetics recorded by NMR. Several different molecules can be caged: The photocage can be attached to RNA. Then, a modified photolabile nucleotide can be placed at strategic positions of a target RNA whose folding properties is to be studied. The photocage can also be attached to a ligand: if folding is dependent on ligand binding then the ligand can be modified to carry a photosensitive unit whose degradation allows binding to RNA. In this thesis, an alternative method for photocaging is introduced. Here, metal ions essential for folding of the RNA are photocaged using the photolabile chelating agent Dimethyl-nitrophen (DMN). Photolysis of DMNr releases the metal ion, thereby RNA folding is initiated. In the rapid-mixing technique, one of (several) components required for proper folding of the RNA is rapidly injected into an NMR sample in situ by the use of a pneumatic injection device. ...
Seit gezeigt wurde, dass die genetischen Informationen in Form von DNA gespeichert wird, ist das Geheimnis der DNA-Struktur gelöst, der Mechanismus der Gen-Expression und die Rolle der RNA verstanden worden. Das Interesse für die Chemie und die Biologie der Nukleinsäuren ist somit kontinuierlich gewachsen. Besonders interessant ist die RNA, die eine Rolle als ein Vermittler der genetischen Informationen (mRNA) spielt, aber auch als Bote von Aminosäuren (tRNA). Sie ist im Ribosom (rRNA) anwesend, arbeitet als Templat in Telomerasen für DNA-Synthese und hat außerdem wichtige Funktionen in der RNA-Spaltung, z.B. bei Ribozymen wie RNAse P inne. Betreffend bestimmter Spaltstellen in RNA hat auch das Phänomen der siRNA beträchtliche Aufmerksamkeit in diesem Prozess erregt. Der sogenannte RISC-Komplex wird programmiert, einzelsträngige RNA mit hoher Sequenz-Spezifität zu schneiden. Die für die RNA-Interferenz verantwortliche zelluläre Maschinerie ist auch an der Bilbung von MikroRNAs beteiligt. RNA-Interferenz ist heute eines der nützlichsten Werkzeuge in functional genomics geworden. Die große Hoffnung ist, dass es auch vielleicht in der Therapie angewandt werden könnte. Das Thema meiner Doktorarbeit trägt den Titel „Synthesis of Site-Specific Artificial Ribonucleases“. Es beschäftigt sich mit der Entwicklung künstlicher bindungsspezifischer Ribonucleasen. Diese künstlichen Katalysatoren sind im Wesentlichen aus drei Gründen bedeutsam: Zum einen liegt eine mögliche Anwendung in der Affinity-Cleavage (Affinitätsspaltung), eine Technik, die Bindungsstellen von RNA-Liganden durch das kovalente Anbringen eines Reagenzes lokalisiert, das zwischen den Nukleinsäuren schneidet. Zum anderen entsteht die Möglichkeit, neue Werkzeuge für eine gezielte Manipulation großer RNA-Moleküle zu schaffen. Die Vorteile des Ansatzes sind, dass man damit beliebige Zielsequenzen anwählen kann. Das Problem dieser Strategie ist die Notwendigkeit, hohe Genauigkeit im Spaltungssschritt zu erreichen, wie zum Beispiel mit natürlichen Ribozymen. Wichtige Ergebnisse wurden auch während meiner Arbeit erhalten, mit einem Fall von genauer Spaltung zwischen zwei Basen. Der dritte Grund ist die potentielle Anwendung als katalytische antisense-Oligonucleotide in der Chemotherapie. Gegenwärtig existieren zwei Ansätze, unspezifische künstliche RNasen relativ kleiner Größe zu schaffen. Der erste basiert auf Metallkomplexen und führt im Allgemeinen zu höheren Raten. Die Idee ist, ein Metall als elektrophiles Zentrum zur Unterstützung der Transesterfikation zu nutzen. Unter diesen Katalysatoren enthalten die effizientesten Lanthanid-Ionen, Cu2+ und Zn2+. Der zweite Ansatz zielt darauf ab, metallfreie künstliche Ribonucleasen zu entwickeln. Die Vorteile dieser Strategie sind, den Katalysator von der Stabilität der Metallkomplexe, die in vivo problematisch sein könnten, unabhängig zu machen. In diesem Ansatz wird die natürliche Katalyse durch Enzyme simuliert. Zweckmäßige Gruppen mit beschränkter katalytischer Aktivität z.B. als Nucleophile, Säuren oder Basen, werden in einer Weise zusammengesetzt, um Kooperation zu ermöglichen. Potente Katalysatoren können so ohne die Notwendigkeit von Metallen als Cofaktoren erzeugt werden. ...
CpG-Oligodesoxynukleotide (CpG-ODN) sind von medizinischem Interesse aufgrund ihrer immunstimulierenden Wirkung, die durch chemische Wechselwirkungen zwischen dem Toll-like-Rezeptor 9 und dem CpG-Oligodesoxynukleotid ausgelöst wird. Um die molekulare Grundlage dieser DNA-Protein-Erkennung näher zu erforschen und um neue modifizierte CpG-Oligodesoxynukleotide mit einem verbessertem Wirkungsprofil für medizinische Anwendungen zu synthetisieren, wurde diese Arbeit angefertigt. Untersucht wurde, welche Synthesestrategie eine effiziente Syntheseroute zur Modifizierung von CpG-Oligodesoxynukleotiden ermöglicht. Als prinzipiell interessante Modifikationen wurden solche gewählt, die dem CpG-ODN-Liganden, Toll-like-Rezeptor 9, zusätzliche Wechselwirkungen eröffnen, wie die H-Brückenwechselwirkungen durch OH, NH2, NO2 oder pi-Stacking-Wechselwirkungen, wie durch z. B. Phenyl oder Pyren. Zunächst wurde in Erwägung gezogen, die bislang in der Literatur nicht für CpG-ODN unter-suchte Position 6 von Cytidin mit OH oder NH2 modifizieren. Hierfür wurde die allgemeine Synthesestrategie verwendet, bei der die Cytosin-Derivate stereoselektiv durch Vorbrüggen-Glykosilierung mit peracetylierter Ribose zum Nukleosid umgesetzt werden. Anschließend erfolgte die Deacetylierung, die regiospezifische Einführung der Tetra-(iso-propyl)-di-siloxan-Schutzgruppe an der 3´,5´-Position. Danach sollte die 2´-OH-Funktion mit Thio-phenylchlorid verestert und nach Barton McCombie desoxygeniert werden. Nach Dimethoxy-triphenylmethylierung an der 5´-OH-Funktion sollte die Umsetzung zum Phosphoramidit erfolgen. ...
The Na+,K+-ATPase was discovered more than 50 years ago, but even today the pumpcycle and its partial reactions are still not completely understood. In this thesis, Voltage Clamp Fluorometry was used to monitor the conformational changes that are associated with several electrogenic partial reactions of the Na+,K+-ATPase. The conformational dynamics of the ion pump were analyzed at different concentrations of internal Na+ or of external K+ and the influences on the conformational equilibrium were determined. To probe the effect of the internal Na+ concentration on the Na+ branch of the ion pump, oocytes were first depleted of internal Na+ and then loaded with Na+ using the epithelial sodium channel which can be blocked by amiloride. The conformational dynamics of the K+ branch were studied using different external K+ concentrations in the presence and in the absence of external Na+ to yield additional information on the apparent affinity of K+. The results of our Voltage Clamp Fluorometry experiments demonstrate that lowering the intracellular concentration of Na+ has a comparable effect on the conformational equilibrium as increasing the amount of K+ in the external solution. Both of these changes shift the equilibrium towards the E1/E1(P) conformation. Furthermore, it can be shown that the ratio between external Na+ and K+ ions is also a determinant for the position of the conformational equilibrium: in the absence of external Na+, the K+ dependent shift of the equilibrium towards E1 was observed at a much lower K+ concentration than in the presence of Na+. In addition, indications were found that both external K+ and internal Na+ bind within an ion well. Finally, the crucial role of negatively charged glutamate residues in the 2nd extracellular loop for the control of ion-access to the binding sites could be verified.
RNA interference (RNAi) is triggered by recognition of double-stranded RNA (dsRNA), and elicits the silencing of gene(s) complementary to the dsRNA sequence. RNAi is thought to have emerged as a way of safeguarding the genome against mobile genetic elements and viral infection, thus maintaining genomic integrity. dsRNA is first processed into small interfering RNAs (siRNA) by the enzyme Dicer. siRNAs are ~21 to 25 -nt long, and contain a signature 5’ phosphate group and a two nucleotide long 3’ overhang (Bernstein et al., 2001). The siRNA is then loaded into the RNA-induced si-lencing complex (RISC), of which Argonaute is the primary catalytic component (Liu et al., 2004). Energetic asymmetry of the siRNA ends allows for its directional loading into RISC (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Argonaute cleaves the passen-ger strand of the siRNA, leaving the guide strand of the siRNA bound to RISC (Gregory et al., 2005; Matranga et al., 2005; Rand et al., 2005). This single-stranded guide strand siRNA bound to Argonaute is able to recognize target mRNA in a sequence-specific manner, and cleaves the mRNA. Argonaute 2 in complex with single-stranded siRNA is sufficient for mRNA recognition and cleavage, thus forming a minimal RISC (Rivas et al., 2005). miRNAs, endogenously expressed small RNA genes which typically contain mismatches and non-Watson-Crick base pairing, are processed by this general pathway, although typically modulate gene expression by translational repression as opposed to cleavage of their target mRNA. The number of Argonaute genes is highly variable between species, ranging from one in S. pombe to twenty-seven in C. elegans. Earlier crystal structures of Argonaute apoen-zymes show the architecture of Argonaute to be a multidomain protein composed of N terminal, PAZ, MID, and PIWI domains (Song et al., 2004; Yuan et al., 2005). These multi-domain proteins are present in both prokaryotic and eukaryotic organisms. The role of Argonaute proteins in prokaryotes is still unknown, but based similarity to eu-karyotic Argonautes, they may also be involved in nucleic acid-directed regulatory pathways. These proteins have served as excellent models for learning about the struc-ture and function of this family of proteins. RNAi has found a widespread application for the simple yet effective knockdown of genes of interest. The catalytic cycle of RISC requires the binding of a number of different nucleotide structures to Argonaute, and we expect Argonaute to undergo a number of conforma-tional changes during the cycle of mRNA recognition by RISC (Filipowicz, 2005; Tom-ari and Zamore, 2005). Nevertheless, it remains unclear how the multi-domain ar-rangement of Argonaute recognizes and distinguishes between single-stranded and dou-ble-stranded oligonucleotides, which correspond to the Dicer-processed siRNA product, guide strand siRNA, and the guide strand / mRNA duplex. The Argonaute protein from Aquifex aeolicus was cloned, expressed, crystallized and solved by molecular replacement. Relative to earlier Argonaute structures, a 24° reorientation of the PAZ domain in this structure opens a basic cleft between the N-terminal and PAZ domains, exposing the guide strand binding pocket of PAZ. A 5.5-ns molecular dynamics simulation of Argonaute showed a strong tendency of the PAZ and N-terminal domains to be mobile. Binding of single-stranded DNA to Argonaute was monitored by total internal reflection fluorescence spectroscopy (TIRFS). The experi-ments showed biphasic kinetics indicative of large conformational changes, and re-vealed a hotspot of binding energy corresponding to the first 9 nucleotides, the so-called “seed region” most crucial for sequence-specific target recognition. As RNAi may have evolved as a way of safeguarding the genome viral infection, it is not surprising that viruses have evolved different strategies to suppress the host RNAi response in the form of viral suppressor protein. (Hock and Meister, 2008; Lecellier and Voinnet, 2004; Rashid et al., 2007; Song et al., 2004; Vastenhouw and Plasterk, 2004). These viral suppressors are widespread, having been identified in a number of different viral families. Not surprisingly, they generally share little sequence homology with one another, although they appear to exist as oligomers built upon a ~ 100-200 amino acid protomer. Tomato aspermy virus, a member of the Cucumoviruses, encodes for protein 2B (TAV 2B, 95 a.a., ~11.3 kDa) that acts as an RNAi suppressor. Intriguingly, a similar genomic arrangement is seen in RNAi suppressors in the Nodaviruses, a family of viruses that can infect both plants and animals, such as Flock house virus b2 (FHV b2). The 2B and b2 proteins are both derived from a frameshifted ORF within the RNA polymerase gene (Chao et al., 2005). In spite of this genomic similarity, the 2B and b2 proteins share little sequence identity, and it is not well understood how the Cucumovirus 2B proteins suppress RNAi. To address how TAV 2B suppresses RNAi, the oligonucleotide-binding properties of TAV 2B were studied. TAV 2B shows a preference for double-stranded RNA oligonucleotides corresponding to siRNAs and miRNAs, and also binds to single-stranded RNA oligonucleotides. A stretch of positively charged residues between amino acids 20-30 are critical for RNA binding. Binding to RNA oligomerizes and induces a conformational change in TAV 2B into a primarily helical structure. These studies sug-gest that suppression of RNAi by TAV 2B may occur by targeting different stages of the RNAi pathway. TAV 2B falls under the category of more general RNAi suppres-sors, with potentially multiple targets for suppression.
Zusammenfassung Die Alzheimersche Krankheit (AD) ist mit 60% die am häufigsten auftretende Art der Demenz. Weltweit sind ca. 24 Mio. Menschen von der neurodegenerativen Krankheit betroffen, welche sich durch den Verlust der kognitiven Fähigkeiten auszeichnet. Es gibt zwei Ausprägungen der Demenz, zum einen die sporadische Verlaufsform, die bei Menschen in einem Alter ab 65 Jahren auftritt und zum anderen die familiäre Alzheimersche Krankheit (FAD), die schon weitaus jüngere Menschen betrifft und auf genetische Mutationen zurück zu führen ist. Beide Formen der Demenz zeigen den gleichen neuropathologische Phänotyp, der zur Ausbildung von extrazellulären Plaques und intrazellulären Neurofibrillen führt. Durch die Entstehung der Plaques und der Neurofibrillen werden die Verbindungen zwischen den einzelnen Neuronen verringert und die Neuronen sterben ab. Für das Auftreten der FAD sind Mutationen in den Genen des Amyloid Vorläufer Proteins (APP, Substrat) sowie der Aspartatprotease Einheit des γ-Sekretase Komplexes, Presenilin 1 (PS1) oder Presenilin 2 (PS2), verantwortlich. Die γ-Sekretase ist ein membranständiger Komplex bestehend aus den vier Untereinheiten PS1 oder PS2, Nicastrin (Nct), Aph-1 und Pen-2. Um ausreichende Informationen über den γ-Sekretase Komplex bezüglich seiner Interaktionsflächen, seines Katalysemechanismus und seiner Substraterkennung zu erhalten, wäre es hilfreich seine 3 Dimensionale Struktur aufzuklären, wozu große Mengen der sauberen und homogenen Proteine benötigt werden. Die Herstellung von ausreichenden Proteinmengen stellt derzeit aber einen Engpass für die strukturelle und funktionelle Charakterisierung des γ-Sekretase Komplexes in-vitro dar. Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia, which affects 24 million people worldwide. It is a neurodegenerative disorder, which occurs either in its most common form in people over 65 years or in the rare early-onset familial AD (FAD). Responsible for the autosomal dominant FAD are mutations in the genes encoding for the β-amyloid precursor protein (APP) and the two homologues integral membrane proteins Presenilin 1 (PS1) and Presenilin 2 (PS2). The two PSs are major but alternative components of the intramembrane aspartyl protease γ-secretase. Further components are the membrane proteins Nicastrin (Nct), Aph-1 and Pen-2. Production of sufficient amounts of protein samples is still the major bottleneck for the detailed functional and structural in-vitro characterization of the γ-secretase complex. Due to toxicity, stability and targeting problems, the overproduction of MPs in conventional in-vivo systems often has only limited success. Therefore, efficient expression protocols using the cell-free (CF) system were established in this work. After optimization, I was able to produce up to milligram amounts of the single proteins PS1 and PS2, the cleavage products PS1-NTF and PS1-CTF, and Pen-2. The in-vitro produced γ-secretase subunits were further characterized, concerning their purity, secondary fold, thermal stability and homogeneity. Highest purities with over 90% after affinity chromatography could be achieved for PS1-CTF and Pen-2. Reconstitution of PS1, PS1-NTF, PS1-CTF and Pen-2 into E. coli liposomes results in a homogeneously distribution, which gives evidence for a structural folding. This was confirmed by CD spectroscopy of PS1-CTF and Pen-2. The thermal stability of Pen-2 shows a transition at 68°C, whereas PS1-CTF is stable up to 95°C. Both proteins show in addition homogeneous elution profiles investigated by analytical SEC and exhibit a monomeric (Pen-2) or dimeric (PS1-CTF) character analyzed by blue native PAGE. Different methods were performed to get evidence about the assembly of the complex, like pull-down experiments, immunoprecipitation, co-expression of radioactive labeled subunits and titration assays by liquid-state NMR. First hints for an interaction of the CF synthesized proteins could be observed by co-expression. Supplemental, Pen-2 and CTF could be purified in sufficient amounts and to apparent homogeneity that allow structural approaches by X-ray crystallography and liquid-state NMR spectroscopy. First conditions for protein crystals were achieved for Pen-2 and structural investigations of PS1-CTF by liquid-state NMR could be performed after optimization of the expression-, purification- and detergent conditions.
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym in der Biosynthese proinflammatorischer Leukotriene, die maßgeblich an der Entstehung allergischer und entzündlicher Erkrankungen wie Arthritis, Asthma und kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt sind (23). Humane 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 77,8 kDa (25). Das Protein besteht aus einer größeren katalytischen Domäne, die ein zentrales Eisen(II)-Atom enthält, dass für die zweistufige LTA4-Bildung aus Arachidonsäure benötigt wird, und einer kleineren C2-ähnlichen Domäne, die Bereiche für die Membran- sowie Ca2+-Bindung enthält. Durch Stimulation von intakten Zellen kommt es zu einer Translokation der 5-LO an die Kernmembran. Die Wechselwirkung mit dem membranständigen FLAP fördert die 5-LO-Leukotrienbildung. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit niedermolekularen Modifikationen der 5-LO durch U-73122 und Glutathion sowie mit der Charakterisierung von 5-LO-Inhibitoren. U-73122 ist ein Inhibitor, der in vitro und in vivo mit einem IC50-Wert von 30 nM bzw. 2,4 µM die 5-LO-Aktivität hemmt (2). U-73122 verfügt über eine thiol-reaktive Maleinimid-Gruppe, wodurch die Substanz kovalent an einige 5-LO-Cysteine (Cys-99, -159 und weitere) binden kann. Entsprechende U-73122-5-LO-Peptide konnten nach Trypsin-Verdau der 5-LO mit MALDI-MS-Messungen nachgewiesen werden. Für diesen Zweck musste eine effiziente Aufreinigung für native 5-LO (Reinheit > 95%) entwickelt werden. Um die Veränderung der 5-LO-Aktivität nach U-73122-Zugabe zu untersuchen, wurden Cystein/Serin-5-LO-Mutanten hergestellt. Es konnte festgestellt werden, dass die Mutante C416S-5-LO nicht mehr effektiv durch U-73122 gehemmt werden konnte. Daher ist anzunehmen, dass U-73122 an Cystein-416 der 5-LO bindet und die 5-LO-Produktbildung hemmt. Auf der 5-LO-Oberfläche kann ein Bereich lokalisiert werden, der einen Zugang für das Substrat zum aktiven Zentrum der 5-LO bilden könnte (238,239). Dieser Bereich liegt in unmittelbarer Nähe zu Cystein-416. Daher besteht die Möglichkeit, dass U-73122, nachdem es an Cystein-416 gebunden hat, diesen Bereich hemmend beeinflussen kann. Es konnte nachgewiesen werden, dass Glutathion an mehrere Cysteine der 5-LO (Cystein-99, -264 und -449) kovalent binden kann. Um Veränderungen der 5-LO-Aktivität durch in vivo Glutathionylierungen zu zeigen, wurden HeLa-Zellen mit 5-LO, Cystein-/Serin-5-LO-Mutanten sowie FLAP transfiziert und mit Diamid inkubiert. Es konnte festgestellt werden, dass die native sowie FLAP-gesteigerte 5-LO-Produktbildung durch Diamid gehemmt wird. Dies konnte ebenfalls für die Mutante 3W-5-LO beobachtet werden. Zusätzlich wurden verschiedene Cystein-/Serin-5-LO-Punktmutanten sowie eine 4fach Mutante (C159S/C300S/C416S/C418S-5-LO = 2D-5-LO) untersucht. Das Verhalten dieser Mutanten konnte in drei Gruppen eingeteilt werden. Gruppe A (C159S-, C300S- und C418S-5-LO) wurde durch Diamid nicht beeinflusst. Gruppe B (C416S- und 2D-5-LO) zeigte eine sehr starke Stimulation der 5-LO±FLAP-Leukotrienbildung nach Zugabe von Diamid. Bei Gruppe C (C99S-, C264S- und C449S-5-LO) konnte eine FLAP-gesteigerte 5-HETE-Bildung beobachtet werden. Durch Diamid kommt es zu Glutathionylierungen von zellulären Proteinen, da reduziertes Glutathion (GSH) zu reaktiveren oxidierten Glutathion (GSSG) umgesetzt wird. An der 5-LO-Oberfläche können in Folge an verschiedenen Cysteinen Glutathione binden. Durch die Glutathion-Bindung wird eine stark polare Struktur auf der 5-LO-Oberfläche eingebracht. Dadurch kommt es zu einer verminderten Membranbindung und Produktbildung der nativen 5-LO. Die 5-LO-Oberfläche der 2D-5-LO-Mutante kann an verschiedenen Positionen keine Glutathione mehr binden, es kommt es zu einer stärkeren Wechselwirkung mit Membranbestandteilen und zu einer erhöhten 5-LO-Leukotrienbildung. Für Celecoxib konnte gezeigt werden, dass neben der COX2-Hemmung auch die 5-LO-Aktivität mit einem IC50-Wert von 3-10 µM gehemmt werden kann (268). Im Rahmen dieser Arbeit wurden HeLa-Zellen mit 5-LO±FLAP transfiziert, um den Einfluss von Celecoxib auf FLAP zu untersuchen. Celecoxib führt zu einer direkten Hemmung der 5-LO. ML3000 (Licofelon) wurde als dualer COX/5-LO-Inhibitor entwickelt und hemmt die 5-LO-Aktivität in intakten Zellen, aber nicht im Homogenat. Daher wurden Versuche mit 5-LO±FLAP-tranfizierten HeLa-Zellen durchgeführt, um den Einfluss von ML3000 auf die FLAP-gesteigerte 5-LO-Leukotrienbildung zu zeigen. Aus diesen und weiteren Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe konnte gefolgert werden, dass ML3000 ein FLAP-Inhibitor ist (277). Garsubellin A ist strukturverwandt zu Hyperforin, einem dualen COX/5-LO-Inhibitor (204). Garsubellin A hemmt die 5-LO-Aktivität im Homogenat von PMNL und am gereinigten Enzym mit einer IC50 von 10-30 µM. Verbindungen, die den Bicyclo[3.3.1]nonan-Grundkörper des Garsubellin A und Hyperforin enthalten, wurden auf ihr inhibitorisches Potential getestet. Es konnte gezeigt werden, dass der Bicyclo[3.3.1]nonan-Grundkörper alleine nicht für eine 5-LO-Hemmung ausreicht, sondern eine freie Carbonsäure sowie eine bis zwei Prenylierungen vorliegen müssen, um eine 5-LO-Hemmung zu erzielen. Sind diese Voraussetzungen vorhanden, wird die 5-LO-Aktivität in intakten PMNL mit einer IC50 von 10 µM und an gereinigter 5-LO mit 0,3-1 µM gehemmt.
A generic drug product (World Health Organization (WHO) terminology: multisource product) is usually marketed and manufactured after the expiry date of the innovator’s patent. Generic drugs are less expensive than the innovator products because generic manufacturers do not have to amortize the investment costs of research, development, marketing, and promotion. Multisource products must contain the same active pharmaceutical ingredients (APIs) as the original formulation and have to be shown to be interchangeable with the original formulation. Multisource products have to be shown bioequivalent to the innovator counterpart with respect to pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Multisource products are therefore identical in dose, strength, route of administration, safety, efficacy, and intended use. Bioequivalence can be demonstrated by in vitro dissolution, pharmacokinetic, pharmacodynamic or clinical studies. Since 2000, the U.S. Food and Drug Administration (FDA) allows the approval of certain multisource products solely on the basis of in vitro studies, i.e. by waiving in vivo studies in humans (“Biowaiver”), based on the Biopharmaceutics Classification Scheme (BCS). The BCS characterizes APIs by their solubility and permeability in the gastrointestinal tract (GIT). The different BCS Classes I-IV (Class I: high solubility, high permeability; Class II: low solubility, high permeability; Class III: high solubility, low permeability and Class IV: low solubility, low permeability) result from all possible combinations of high and low solubility with high and low permeability. Since the adoption of the BCS by the FDA in 1995, the BCS criteria have been under continuous development. In 2006, the WHO has released the most recent bioequivalence guidance including relaxed criteria for bioequivalence studies based on modified BCS criteria. According to this guidance, APIs belonging to the BCS classes I – and under defined conditions - II and III – are eligible for a biowaiver-based approval. The principal objective of this work was to characterize the first-line anti tuberculosis APIs, isoniazid, pyrazinamide, ethambutol dihydrochloride and rifampicin, according to their physicochemical, biopharmaceutical, pharmacokinetic and pharmacological properties and to classify them according to the BCS. Ethambutol dihydrochloride and isoniazid were classified as borderline BCS class I/III APIs. Pyrazinamide was classified as a BCS class III and rifampicin as a BCS class II API. Based on the BCS classification and the additional criteria defined in the WHO bioequivalence guidance, the possibility of biowaiver-based approval for immediate release (immediate release) solid oral dosage forms containing the first-line antituberculosis drugs was evaluated. A biowaiver-based approval with defined constraints was recommended for immediate release solid oral dosage forms containing isoniazid (interaction with reducing sugars), pyrazinamide and ethambutol dihydrochloride (relative narrow therapeutic index). Rifampicin was classified as a BCS class II API, and it was concluded that rifampicin containing solid oral immediate release drug products as well as Scale-Up and Post-Approval Changes (SUPAC) changes should not be approved by a biowaiver on the following basis: (i) its solubility and dissolution are highly variable due to polymorphism and instability, (ii) concomitant intake of food and antacids reduces its absorption and bioavailability, (iii) no in vitro predictive dissolution test has been found which correlates to in vivo absorption and (iv) several publications reporting cases of non-bioequivalent and bioinequivalent rifampicin products have been located in the literature. Thus, it is recommended that bioequivalence of rifampicin containing solid oral immediate release drug products should be established by in vivo pharmacokinetic studies in humans. This risk-benefit benefit assessment of a biowaiver-based approval was presented as a poster at the American Association of Pharmaceutical Scientists (AAPS) 2005 and subsequently published as “Biowaiver Monographs” in the Journal of Pharmaceutical Sciences. Based on the assessment of the dissolution properties of the antituberculosis drugs for a biowaiver approval, quality control dissolution methodologies for the International Pharmacopoeia (Pharm. Int.) were developed, presented at the WHO expert meeting and adopted in the Pharm. Int. (http://www.who.int/medicines/publications/pharmprep/OMS_TRS_948.pdf). Additionally, preliminary biowaiver recommendations were also developed for four firstline antimalarial drugs listed on the WHO Essential Medicines List (EML): Quinine, as both the hydrochloride and sulphate, and proguanil hydrochloride were classified as borderline BCS class I/III APIs. Since quinine is a narrow therapeutic index drug and many cases of non-bioequivalence have been reported in the literature, a biowaiverbased approval was not recommended. For solid oral immediate release dosage forms containing proguanil a biowaiver-based approval was recommended under the condition that they dissolve very rapidly. Primaquine phosphate was classified as a BCS class I API. Therefore, a biowaiver-based approval was recommended for immediate release solid oral dosage forms containing primaquine phosphate. Mefloquine hydrochloride was classified as a basic, BCS class IV/II API, making it ineligible for the biowaiver. Additionally, reports of non-bioequivalence and a narrow therapeutic index were found in the scientific literature. Consequently, bioequivalence of solid oral immediate release dosage forms containing mefloquine hydrochloride should be established by in vivo pharmacokinetic studies. The results for quinine hydrochloride and sulphate, proguanil hydrochloride, primaquine diphosphate and mefloquine hydrochloride were presented as a poster at the Pharmaceutical Sciences World Congress (PSWC) 2007 and published as a WHO Collaborating Center Report in June 2006. The aim of this project was to collect, evaluate, generate and publish relevant information for a biowaiver-based approval of essential medicines in order to provide a summary to local regulatory authorities. This information complements the selected list of essential medicines by providing information about the biopharmaceutical properties and pharmaceutical quality of solid oral immediate release dosage forms containing these APIs. The aim of the biowaiver project, inspired by the WHO and brought in life by the International Pharmaceutical Federation (FIP), is to enable access to essential medicines in standardized quality at an affordable price. In this work, a significant contribution to this aim in the form of four biowaiver monographs for the antituberculosis drugs and several reports on the antimalarials has been achieved.
Photo-initiated processes, like photo-excitation and -deexcitation, internal conversion, excitation energy transfer and electron transfer, are of importance in many areas of physics, chemistry and biology. For the understanding of such processes, detailed knowledge of excitation energies, potential energy surfaces and excited state properties of the involved molecules is an essential prerequisite. To obtain these informations, quantum chemical calculations are required. Several quantum chemical methods exist which allow for the calculation of excited states. Most of these methods are computationally costly what makes them only applicable to small molecules. However, many biological systems where photo-processes are of interest like light-harvesting complexes in photosynthesis or the reception of light in the human eye by rhodopsin are quite large. For large systems, however, only few theoretical methods remain applicable. The currently most widely used method is time-dependent density functional theory (TD-DFT), which can treat systems of up to 200–300 atoms with the excitation energies of some excited states exhibiting errors of less than 0.5 eV. Yet, TD-DFT has several drawbacks. The most severe failure of TD-DFT is the false description of charge transfer states which is particularly problematic in case of larger systems where it yields a multitude of artificially low-lying charge transfer states. But also Rydberg states and states with large double excitation character are not described correctly. Still, if these deficiencies are kept in mind during the interpretation of results, TD-DFT is a useful tool for the calculation of excited states. In my thesis, TD-DFT is applied in investigations of excitation energy and electron transfer processes in light-harvesting complexes. Since light-harvesting complexes, which consist of thousands of atoms, are by far too large to be calculated, model complexes for the processes of interest are constructed from available crystal structures. The model complexes are used to calculate potential energy curves along meaningful reaction coordinates. Artificial charge transfer states are corrected with the help of the so-called ∆DFT method. The resulting potential energy curves are then interpreted by comparison with experimental results. For the light-harvesting complex LH2 from purple bacteria the experimentally observed formation of carotenoid radical cations is studied. It is shown that the carotenoid radical cation is formed most likely via the optically forbidden S1 state of the carotenoid. In light-harvesting complex LHC-II of green plants the fast component of the so-called non-photochemical quenching (NPQ) is investigated. Two of several different hypotheses on the mechanism of NPQ, which have been proposed recently, are studied in detail. The first one suggests that NPQ proceeds via simple replacement of violaxanthin by zeaxanthin in the binding pocket in LHC-II. However, the calculated potential energy curves exhibit no difference between violaxanthin and zeaxanthin in the binding pocket. In combination with experimental results it is thus shown that simple replacement alone does not mediate NPQ in LHC-II. The second hypothesis proposes conformational changes of LHC-II that lead to quenching at the central lutein and chlorophyll molecules during NPQ. My TD-DFT calculations demonstrate that if this mechanism is operative, only the lutein 1 which is one of two central luteins present in LHC-II can take part in the quenching process. This is corroborated by recent experiments. Though several conclusions can be drawn from the investigations using TD-DFT, the interpretability of the results is limited due to the deficiencies of the method and of the models. To overcome the methodological deficiencies, more accurate methods have to be employed. Therefore, the so-called algebraic diagrammatic construction scheme (ADC) is implemented. ADC is a widely overlooked ab initio method for the calculation of excited states, which is based on propagator theory. Its theoretical derivation proceeds via perturbation expansion of the polarization propagator, which describes electronic excitations. This yields separate schemes for every order of perturbation theory. The second order scheme ADC(2), which is employed here, is the equivalent to the Møller-Plesset ground state method MP(2), but for excited states. It represents the computationally cheapest excited state method which can correctly describe doubly excited states, as well as Rydberg and charge transfer states. The quality of ADC(2) results is demonstrated in calculations on linear polyenes which serve as model systems for the larger carotenoid molecules. The calculations show that ADC(2) describes the three lowest excited states of polyenes sufficiently well, particularly the optically forbidden S1 state which is known to possess large double excitation character. Yet, the applicability of the method is limited compared to TD-DFT due to the much larger computational requirements. To facilitate the calculation of larger systems with ADC(2) a new variant of the method is developed and implemented. The variant employs the short-range behavior of electron correlation to reduce the computational effort. As a first step, the working equations of ADC(2) are transformed into a basis of local orbitals. In this basis negligible contributions of the equations which are due to electron correlation can be identified based on the distances of local orbitals. A so-called “bumping” scheme is implemented which removes the negligible parts during a calculation. This way, the computation times as well as the disk space requirements can be reduced. With the “bumping” scheme several new parameters are introduced that regulate the amount of “bumping” and thereby the speed and the accuracy of computations. To determine useful values for the parameters an evaluation is performed using the linear polyene octatetraene as test molecule. From the evaluation an optimal set of parameter values is obtained, so that the computation times become minimal, while the errors in the excitation energies due to the “bumping” do not exceed 0.15 eV. With further calculations on various molecules of different sizes it is tested if these parameter values are universal, i.e. if they can be used for all molecules. The test calculations show that the errors in the excitation energies are below 0.15 eV for all test systems. Additionally, no trend is visible for the errors that their magnitude might depend on the system. In contrast, the amount of disregarded contributions in the calculations increases drastically with growing system size. Thus, the local variant of ADC(2) can be used in future to reliably calculate excited states of systems which are not accessible with conventional ADC(2).
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei verschiedenen Hämostasedefekten eine unterschiedliche Aktivierung des Gerinnungssystems besteht. So wiesen Personen mit heterozygoter Prothrombin-Mutation (G20210A) eine massiv erhöhte Thrombinbildung auf, während sie in den üblichen Globaltests (Prothrombinzeit (PT) und aktivierte partielle Thromboplastinzeit (aPTT)) und der Thrombinzeit (TZ) nicht pathologisch waren. Bei Personen mit reaktiv aktiviertem Gerinnungssystem war ebenfalls eine erhöhte Thrombinbildung nachweisbar, zudem war die aPTT verkürzt. Dagegen zeigten Personen mit Antiphospholipidsyndrom und Personen mit heterozygoter/homozygoter FV-Leiden-Mutation eine leicht gesteigerte Thrombinbildung, ferner waren die anderen plasmatischen Tests (PT, aPTT, TZ), außer der Lupus-Antikoagulans-sensitiven aPTT, unauffällig. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, um die in-vitro Wirksamkeit neuer Antithrombotika auf die Blutgerinnung zu untersuchen. Die verwendeten Antithrombotika repräsentieren 3 Klassen oral applizierbarer, niedermolekularer Substanzen: 1. Thrombininhibitoren (Dabigatran und Melagatran) 2. FXa-Inhibitoren (Rivaroxaban und Apixaban) 3. Duale Thrombin/FXa-Inhibitoren (BR4965 und BR4966) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Antithrombotika je nach Wirkmechanismus (FXa-Hemmung, Thrombinhemmung oder duale Thrombin/FXa-Hemmung) unterschiedliche Effekte auf die TGT-Parameter ETP (endogenes Thrombinpotential) und PEAK (größte Thrombinbildungsgeschwindigkeit) haben. Während der PEAK gut geeignet war, die antihämostatische Wirkung von selektiven FXa-Inhibitoren abzubilden, wurde das ETP durch die FXa-Inhibitoren nicht so stark beeinflusst, insbesondere in plättchenarmen Plasma (PPP). Im Gegensatz dazu hatten die selektiven Thrombininhibitoren eine gute dosisabhängige Wirkung auf das ETP, jedoch keine auf den PEAK. Mehr noch wurde für Inhibitoren mit thrombinhemmender Komponente beobachtet, dass sie den PEAK der Thrombinbildung erhöhen statt reduzieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zugegeben wurden. Dieses Phänomen war umso stärker ausgeprägt, je höher die Thrombinselektivität der Substanz war. Erwartungsgemäß zeigten die beiden dualen Thrombin/FXa-Inhibitoren sowohl Eigenschaften von FXa-Inhibitoren, als auch von selektiven Thrombininhibitoren, wobei die Substanz BR4965 in ihrer Wirkung eher den FXa-Inhibitoren ähnelte und BR4966 eher den selektiven Thrombininhibitoren. In PPP und PRP (plättchenreichem Plasma) von Personen mit aktiviertem Gerinnungssystem (heterozygote/homozygote FV-Leiden Mutation, heterozygote Prothrombin-Mutation oder reaktiv aktiviertes Gerinnungssystem) zeigten die Antithrombotika ähnliche Effekte auf die Thrombinbildung wie bei gesunden Probanden. Lediglich in PRP von Patienten mit Antiphospholipidsyndrom verursachten die Inhibitoren eine stärkere Hemmung der Thrombinbildung, insbesondere die FXa-Hemmer. Der Einfluss des FXa-Inhibitors Rivaroxaban auf die PT erwies sich als dosisabhängig und korreliert eng mit dem Plasmaspiegel, so dass mit diesem Globaltest ein einfacher Monitoring-Test zur Verfügung steht. Es ist aber zu beachten, dass die PT in Sekunden abgelesen werden muss, denn nur für eine Ablesung in Sekunden, aber nicht in % (= Quick-Wert) ergab sich eine enge Korrelation mit den Plasmaspiegeln. Für das Monitoring von selektiven Thrombininhibitoren wie Dabigatran war die aPTT besser geeignet. Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II (HIT Typ II) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparin-Therapie. Daher wurde untersucht, ob die neu entwickelten Antithrombotika auch das Risiko für die Enstehung einer HIT Typ II bergen. Hierzu wurde auf Basis der Thrombinbildung ein Testsystem entwickelt, in dem gezeigt wurde, dass Plättchenfaktor 4 (PF4) die gerinnungshemmende Aktivität von Heparinen, aber nicht die der neuen Antithrombotika neutralisiert. Hieraus ist zu schließen, dass PF4 an Heparine binden kann, aber nicht an die neuen Antithrombotika. Folglich sollte das Risiko einer HIT Typ II unter den neuen Antithrombotika gering sein, da hierfür zunächst Antikörper an den Komplex aus PF4 und Heparin (bzw. PF4/Antithrombotikum) binden müssen. Abschließend wurde der Einfluss der neuen Inhibitoren auf die Ausbildung der Thrombozyten- Leukozyten-Aggregate untersucht, da bei akuten thromboembolischen Ereignissen (z.B. Herzinfarkt) erhöhte Werte von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten nachgewiesen wurden. Alle untersuchten Substanzen hatten eine inihibitorische Wirkung auf die Ausbildung der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate, wobei der hemmende Effekt umso stärker ausgeprägt war, je höher die Thrombinselektivität des Inhibitors war. In dieser Arbeit wurde mit dem Thrombingenerierungstest (TGT) eine Methode etabliert und evaluiert, um die in-vitro Wirksamkeit neuer Antithrombotika auf die Blutgerinnung zu untersuchen. Die verwendeten Antithrombotika repräsentieren 3 Klassen oral applizierbarer, niedermolekularer Substanzen: 1. Thrombininhibitoren (Dabigatran und Melagatran) 2. FXa-Inhibitoren (Rivaroxaban und Apixaban) 3. Duale Thrombin/FXa-Inhibitoren (BR4965 und BR4966) Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Antithrombotika je nach Wirkmechanismus (FXa-Hemmung, Thrombinhemmung oder duale Thrombin/FXa-Hemmung) unterschiedliche Effekte auf die TGT-Parameter ETP (endogenes Thrombinpotential) und PEAK (größte Thrombinbildungsgeschwindigkeit) haben. Während der PEAK gut geeignet war, die antihämostatische Wirkung von selektiven FXa-Inhibitoren abzubilden, wurde das ETP durch die FXa-Inhibitoren nicht so stark beeinflusst, insbesondere in plättchenarmen Plasma (PPP). Im Gegensatz dazu hatten die selektiven Thrombininhibitoren eine gute dosisabhängige Wirkung auf das ETP, jedoch keine auf den PEAK. Mehr noch wurde für Inhibitoren mit thrombinhemmender Komponente beobachtet, dass sie den PEAK der Thrombinbildung erhöhen statt reduzieren, wenn sie in niedrigen Konzentrationen zugegeben wurden. Dieses Phänomen war umso stärker ausgeprägt, je höher die Thrombinselektivität der Substanz war. Erwartungsgemäß zeigten die beiden dualen Thrombin/FXa-Inhibitoren sowohl Eigenschaften von FXa-Inhibitoren, als auch von selektiven Thrombininhibitoren, wobei die Substanz BR4965 in ihrer Wirkung eher den FXa-Inhibitoren ähnelte und BR4966 eher den selektiven Thrombininhibitoren. In PPP und PRP (plättchenreichem Plasma) von Personen mit aktiviertem Gerinnungssystem (heterozygote/homozygote FV-Leiden Mutation, heterozygote Prothrombin-Mutation oder reaktiv aktiviertes Gerinnungssystem) zeigten die Antithrombotika ähnliche Effekte auf die Thrombinbildung wie bei gesunden Probanden. Lediglich in PRP von Patienten mit Antiphospholipidsyndrom verursachten die Inhibitoren eine stärkere Hemmung der Thrombinbildung, insbesondere die FXa-Hemmer. Der Einfluss des FXa-Inhibitors Rivaroxaban auf die PT erwies sich als dosisabhängig und korreliert eng mit dem Plasmaspiegel, so dass mit diesem Globaltest ein einfacher Monitoring-Test zur Verfügung steht. Es ist aber zu beachten, dass die PT in Sekunden abgelesen werden muss, denn nur für eine Ablesung in Sekunden, aber nicht in % (= Quick-Wert) ergab sich eine enge Korrelation mit den Plasmaspiegeln. Für das Monitoring von selektiven Thrombininhibitoren wie Dabigatran war die aPTT besser geeignet. Die Heparin-induzierte Thrombozytopenie Typ II (HIT Typ II) ist eine schwerwiegende Komplikation der Heparin-Therapie. Daher wurde untersucht, ob die neu entwickelten Antithrombotika auch das Risiko für die Enstehung einer HIT Typ II bergen. Hierzu wurde auf Basis der Thrombinbildung ein Testsystem entwickelt, in dem gezeigt wurde, dass Plättchenfaktor 4 (PF4) die gerinnungshemmende Aktivität von Heparinen, aber nicht die der neuen Antithrombotika neutralisiert. Hieraus ist zu schließen, dass PF4 an Heparine binden kann, aber nicht an die neuen Antithrombotika. Folglich sollte das Risiko einer HIT Typ II unter den neuen Antithrombotika gering sein, da hierfür zunächst Antikörper an den Komplex aus PF4 und Heparin (bzw. PF4/Antithrombotikum) binden müssen. Abschließend wurde der Einfluss der neuen Inhibitoren auf die Ausbildung der Thrombozyten- Leukozyten-Aggregate untersucht, da bei akuten thromboembolischen Ereignissen (z.B. Herzinfarkt) erhöhte Werte von Thrombozyten-Leukozyten-Aggregaten nachgewiesen wurden. Alle untersuchten Substanzen hatten eine inihibitorische Wirkung auf die Ausbildung der Thrombozyten-Leukozyten-Aggregate, wobei der hemmende Effekt umso stärker ausgeprägt war, je höher die Thrombinselektivität des Inhibitors war.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Entwicklung von neuen enantioselektiven und diastereoselektiven Brønsted-Säure katalysierten Reaktionen. Das Aktivierungsprinzip entspricht dabei einer klassischen Säure-Base-Reaktion, in der eine Brønsted-Säure einen Elektronenpaar-Donor protoniert, woraus die Bildung eines Ionenpaares resultiert. Erweitert man dieses Konzept durch den Einsatz einer chiralen Protonenquelle und verwendet als Base ein prochirales Substrat, wie ein Imin, so entsteht durch dessen Protonierung ein chirales Ionenpaar, wodurch das Substrat einerseits aktiviert wird und anderseits asymmetrische Induktion über das chirale Anion erfährt. Greift in dem darauf folgenden Schritt ein Nucleophil selektiv über eine Seite des positiv geladenen Elektrophils an, so bildet sich enantioselektiv ein neues Stereozentrum. Die Natur nutzt dieses Prinzip zum Aufbau von optisch reinen α-Aminosäuren. So katalysiert die Glutamatdehydrogenase (GDH) die Darstellung von Glutaminsäure durch Protonierung des entsprechenden α-Iminoglutarats, wodurch der nachfolgende Hydrid-Angriff mittels Nicotinamidadenindinukleotid (NADH) selektiv die (L)-Aminosäure liefert. Dieses Konzept konnte während der eigenen Diplomarbeit auf die enantioselektive Brønsted-Säure katalysierte Transferhydrierung von Ketiminen übertragen werden. Dabei simuliert eine chirale Protonenquelle 1 das Enzym (GDH) und das Reduktionsmittel NADH wird durch ein synthetisches Analogon, das Hantzsch Dihydropyridin 8a ersetzt ... Die vorliegende Arbeit ist kumulativ verfasst. Der größte Teil der hier vorgestellten Ergebnisse ist bereits veröffentlicht oder zur Publikation eingereicht. Die experimentellen Daten sind Bestandteil der in Kapitel 10 aufgeführten Publikationen und werden nicht gesondert diskutiert. Folgende Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht: Highly Enantioselective Organocatalytic Carbonyl-Ene Reaction with strongly Acid, Chiral Brønsted Acids as Efficient Catalysts Rueping M., Theissmann T., Kuenkel A., Koenigs R.M., Angewandte Chemie International Edition 2008, 47, 6798, Angewandte Chemie 2008, 120, 6903. Asymmetric counterion pair catalysis: An enantioselective Brønsted acid-catalyzed protonation Rueping M., Theissmann T., Raja S., Bats J.W., Advanced Synthesis & Catalysis 2008, 350, 1001. An enantioselective chiral brønsted acid catalyzed imino-azaenamine reaction Rueping M., Sugiono E., Theissmann T., Kuenkel A., Köckritz A., Pews-Davtyan A., Nemati N., Beller M., Organic Letters 2007, 9, 1065. Remarkably low catalyst loading in Brønsted acid catalyzed transfer hydrogenations: Enantioselective reduction of benzoxazines, benzothiazines, and benzoxazinones Rueping M., Antonchick A.P., Theissmann T., Angewandte Chemie International Edition 2006, 45, 6751, Angewandte Chemie 2006, 118, 6903. A highly enantioselective brønsted acid catalyzed cascade reaction: Organocatalytic transfer hydrogenation of quinolines and their application in the synthesis of alkaloids Rueping M., Antonchick A.P., Theissmann T., Angewandte Chemie International Edition 2006, 45, 3683, Angewandte Chemie 2006, 118, 3765. Metal-free Brønsted acid catalyzed transfer hydrogenation - New organocatalytic reduction of quinolines Rueping M., Theissmann, T., Atonchick A.P., Synlett 2006, 1071. The twinned crystal structure of diiodobis(triphenylphosphine) palladium(II) dichloromethane disolvate at 173 K Theissmann T., Bolte M., Acta Crystallographica Section E, 2006, E62, 1056. Folgende Manuskripte wurden zur Veröffentlichung eingereicht: First Enantioselective Chiral Brønsted Acid Catalyzed Synthesis of 4´-Substituted Tetrahydroquinolines Rueping M., Theissmann T., Stoeckel M., Atonchick A.P. Asymmetric Organocatalytic Reductions in the Enantioselective Synthesis of Fluoroquinolones, Flumiquine and Levofloxacin Rueping M, Stoeckel M., Theissmann T., Haack K. Synthesis and Structural Investigations of H8-BINOL-derived N-triflylphosphoramides Rueping M., Nachtsheim B.J., Koenigs R., Ieawsuwan W., Theissmann T. Buchbeitrag: Metal-free Brønsted Acid Catalyzed Transfer-Hydrogenation: Enantioselective Synthesis of Tetrahydroquinolines Rueping M., Theissmann T., Atonchick A.P., Catalysts for Fine Chemical Industry, Vol. 5, 2006
Das Ziel des adaptiven Entwurfs von Substanzbibliotheken ist es, die vollständige biologische Testung einer molekularen Screeningbibliothek zu vermeiden. Stattdessen erfolgt, geleitet durch Optimierungsalgorithmen, eine "intelligente" Navigation durch den chemischen Raum, um so bevorzugt Substanzen mit gewünschten Eigenschaften auszuwählen. In einer retrospektiven Studie wurden die Optimierungsalgorithmen "Zufallssuche", "Simulated Annealing", "Evolutionsstrategie" und "Partikelschwarmoptimierung" im Hinblick auf den Entwurf von Bibliotheken von Serinproteaseinhibitoren systematischen verglichen. Die Gesamtzahl verfügbarer Substanztestungen wurde auf 300 beschränkt, um Laborbedingungen zu simulieren. Als Ergebnis zeigten sich besonders die Evolutionsstrategien für einen Einsatz in einer Niedrigdurchsatzscreening-Kampagne geeignet, da diese effizient mit großen Populationen und wenigen Iterationen arbeiteten. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt den erfolgreichen Entwurf einer fokussierten Bibliothek von RNA-Liganden. In einer hybriden, prospektiven Optimierungsstudie wurden nach dem Vorbild einer iterativen Niedrigdurchsatzscreening-Kampagne vom Computer vorgeschlagene Moleküle im Labor getestet. Die Substanzen wurden auf Inhibition einer spezifischen molekularen Wechselwirkung im Replikationszyklus von HIV getestet (Tat-TAR-Interaktion). In vier Generationen wurden 9 von 170 untersuchten Verbindungen positiv auf Inhibition der Tat-TAR-Interaktion getestet (Trefferquote: 5,3%), wobei lediglich 0,089% der Verbindungen der Screeningbibliothek untersucht wurden. Die zwei potentesten Kandidaten wiesen einen IC50 von 51 uM bzw. 116 uM auf.
Diese Arbeit teilt sich in zwei Themenblöcke, deren zentrales Element Borat-Anionen darstellen, die unterschiedlichste Funktionen erfüllen. Durch entsprechende Wahl der Substituenten am Bor können sowohl Anionen mit schwach koordinierenden Eigenschaften erzeugt werden, als auch Borate, die sich zum Einsatz als Ligand in der Koordinationschemie eignen. ...
SIVsmmPBj-derived lentiviral vectors are capable of efficient primary human monocyte transduction, a capacity which is linked to the viral accessory protein Vpx. To enable novel gene therapy approaches targeting monocytes, in this thesis it was aimed to generate enhanced lentiviral vectors that meet the required standards for clinical applications with respect to gene transfer efficiency and safety. The vectors were tested for their suitability in a relevant therapeutic gene transfer approach. At first, it was investigated whether vectors derived from another Vpx-carrying lentivirus reveal the same capacity for monocyte transduction as SIVsmmPBj-derived vectors. A transduction experiment using HIV-2-derived vectors in comparison to PBj-derived vectors revealed a comparable transduction capacity, thus disproving the assumed uniqueness of the PBj vectors. The further generation and analysis of expression constructs for the vpx genes of HIV-2 and SIVmac demonstrated a similar functionality in monocyte transduction as the Vpx of PBj. As VpxPBj, both Vpx proteins facilitated monocyte transduction of a vpx-deficient PBj-derived vector system. For the generation of enhanced SIVsmmPBj and HIV-2 vector systems, only the transfer vectors were optimized, since the packaging vectors available already meet current standards. At first, several modifications were introduced into an available preliminary PBj-derived transfer vector by conventional cloning. The modifications included insertions of cPPT/CTS and WPRE as well as the deletions of the remaining pol sequence, the second exons of tat end rev, and the U3-region within the 3’LTR to generate a SIN vector. Thus, beside safety enhancement, the vector titers were also increased from 9.1x105 TU/ml achieved after concentration with the initial transfer vector up to 1.1x107 TU/ml with the final transfer vector. The PBj vector retained its capability of monocyte transduction when supplemented with Vpx. This conventional method of vector enhancement is time-consuming and may result in only sub-optimal vectors, since it depends on the presence of restriction sites which may not allow deletion of all needless sequences. Moreover, mutations may accumulate during the high number of cloning and amplification steps. Therefore, a new and easier method for lentiviral transfer vector generation was conceived. Three essential segments of the viral genome (5‘ LTR, RRE, ΔU3-3’ LTR) are amplified on the template of the lentiviral wild-type genome and fused by Fusion-PCR. Further necessary elements namely the cPPT/CTS-element, MCS, and PPT are included into the resulting vector by extension of the nucleotide primers used for the PCRs. The amplified and fused vector-scaffold can easily be integrated into a plasmid backbone, followed by insertion of the expression cassette of choice. By applying this approach, two novel lentiviral transfer vectors, based on the non-human SIVsmmPBj and the human HIV-2, were derived. Vector titers achieved for PBj and HIV-2 vectors supplemented with Vpx reached up to 4.0x108 TU/ml and 5.4x108 TU/ml, respectively. The capacity for monocyte transduction was maintained. Thus, safe and efficient, state of the art HIV-2- and PBj-derived vector systems are now available for future gene therapy strategies. Finally, the new vectors were used to set up an approach for gene correction of gp91phox-deficient monocytes for the treatment of X-linked chronic granulomatous disease (xCGD). The administration of autologous, gene-corrected monocytes to counteract systemic and acute infections could lead to a decreased infection load, dissolve granulomas and therefore improve the survival rate of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) which is the current treatment of choice for this disease. First, methods for analysis of gp91phox function were established. Next, they were employed to demonstrate the capacity of monocytes, obtained from healthy humans or mice, for phagocytosis, oxidative burst, and Staphylococcus aureus killing. The in vivo half-life of murine monocytes in the bloodstream and their distribution to specific tissues was determined. Lastly, HIV-1 vectors were used to transfer the gp91phox gene into monocytes from gp91phox-deficient mice. This resulted in the successful restoration of the oxidative burst ability in the cells. In summary, the general suitability of the new vectors for treatment of CGD by monocyte transduction was demonstrated. The results of the mouse experiments provide the foundation for future challenge experiments to evaluate the capability of gene-corrected monocytes to kill off microbes in vivo.
Channelrhodopsine sind blaulichtsensitive, Retinal-bindende Proteine aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii. Channelrhodopsin 2 (ChR2) wurde als heptahelikaler, kationenselektiver Ionenkanal charakterisiert (Nagel et al., 2003). Wie die zur selben Proteinfamilie gehörende Protonenpumpe Bakteriorhodopsin (bR) wird ChR2 durch Licht aktiviert; allerdings wird hierbei ein passiver Strom ausgelöst, bei dem Kationen entsprechend ihres elektrochemischen Gradienten fließen. Aufgrund dieser Eigenschaft eignet sich ChR2 zur lichtinduzierten Depolarisation von Zellen und zur Auslösung von Aktionspotentialen in Neuronen, über deren Membran ein Konzentrationsgradient von Kationen anliegt (Boyden et al., 2005). Die Stimulation elektrischer Aktivität von ChR2-exprimierenden Neuronen im Hirngewebe von Mäusen, die ChR2 transgen exprimieren, kann beispielsweise genutzt werden, um die Konnektivität von Neuronen und Hirnbereichen zu untersuchen (z.B. Wang et al., 2007). Für diese und weitere Anwendungen war es interessant, ChR2 zelltyp- oder regionenspezifisch in Mäusen zu exprimieren. Zu diesem Zweck sollte ChR2/eGFP bicistronisch oder ChR2-YFP als Fusionsprotein unter einem ubiquitären Promotor exprimiert werden; die Expression sollte aber durch ein Stop-Element unterbunden werden, das von loxP-sites flankiert ist (unaktiviertes Transgen). Das Enzym Cre- Rekombinase entfernt durch Rekombination das Stop-Element an diesen Erkennungssequenzen, wodurch die ChR2-Expression ermöglicht werden sollte (aktiviertes Transgen). Die Cre-Rekombinase kann dabei sowohl viral als auch transgen unter zelltyp- und regionenspezifischen Promotoren exprimiert werden und damit die regionale Spezifität und den Zeitpunkt der ChR2-Expression bestimmen. Es wurden drei Mauslinien über Pronukleus-Injektionen erhalten, die den Reporter β-Galactosidase des unaktivierten Transgens exprimierten. Die Verpaarung von Mäusen dieser Linien mit Cre-Rekombinase-exprimierenden Mauslinien führte aber nur zu einer ineffizienten Aktivierung des Transgens, so dass ChR2-Expression einzig mittels RT-PCR nachgewiesen werden konnte. Nach viraler Expression der Cre-Rekombinase im Hippokampus konnte eine Aktivierung des ChR2-Transgens auch mittels Immunfluoreszenz gezeigt werden. Mangels GFP-Fluoreszenz waren die transgenen Linien aber nicht für gezielte elektrophysiologische Ableitungen verwendbar. In einem zweiten Ansatz wurden transgene Mäuse über embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert. Bei diesem Ansatz wird eine geringere Kopienzahl des Transgens ins Genom integriert. In den ES-Zellen konnte durch transiente Cre-Rekombinase-Expression gezeigt werden, dass das Transgen effizient aktiviert werden konnte. Aus mehreren ES-Zell-Klonen wurden chimäre Mäuse erhalten, die zum jetzigen Zeitpunkt auf Keimbahntransmission getestet werden. Wie ChR2 einen Kationenkanal bildet und welche Transmembrandomänen und Aminosäuren daran beteiligt sind, ist unbekannt. Daher wurde im zweiten Teil dieser Arbeit untersucht, ob die Positionen E90, E97 und E101, welche in der zweiten Transmembranhelix untereinander zu liegen scheinen, Teil einer Ionenpore sein könnten. Um den Einfluss dieser Aminosäuren auf die Kationenleitung und/ oder – selektivität zu untersuchen, wurden diese Positionen substituiert und die resultierenden ChR2-Mutantenproteine in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch analysiert. Um Na+- bzw. Protonen-mediierte Ströme unterscheiden zu können, wurden Na+-haltige und Na+-freie Puffer verschiedener pH-Werte verwendet. Lichtinduzierte Ströme von ChR2E97A, ChR2E97Q, ChR2E97K und ChR2E101K waren im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert, ausschließlich bei pH 4 zu detektieren und wohl hauptsächlich durch Protonen getragen. Die isofunktionale, aber ladungsneutrale Mutation ChR2E90Q zeigte nur geringe Unterschiede zum Wildtyp. Alaninsubstitution (E90A) als auch Ladungsinversion (E90K) führte zu starken Veränderungen des ChR2-Stroms im Vergleich zum Wildtyp. ChR2E90A zeigte im Vergleich zum Wildtyp reduzierte Protonenströme sowie einen erhöhten Natriumstrom, der durch Protonen inhibierbar war. Die Ladungsinversion ChR2E90K führte zu allgemein stark verminderten Leitfähigkeiten, lediglich bei pH 4 konnten noch Ströme gemessen werden. Die Ergebnisse sind der erste Hinweis auf eine Beteiligung von Glutamatresten an der Ionenleitfähigkeit in der Transmembranhelix 2 von ChR2.
Innerhalb des adaptiven Immunsystems spielt der Major Histocompatibility Complex (MHC)-Klasse I-Weg der Antigenpräsentation eine essenzielle Rolle bei der Erkennung und Zerstörung Virus-infizierter Zellen. Ein grundlegender Schritt innerhalb dieses Prozesses ist die Translokation endogener Peptide durch den transporter associated with antigen processing (TAP) in das ER-Lumen. Der TAP-Transporter ist zusammen mit verschiedenen Chaperonen und weiteren Faktoren in einem Peptidbeladungskomplex (PLC) assoziiert. Insbesondere Herpesviren, die durch eine lebenslange Persistenz im Wirt und wiederkehrende Reaktivierung unter Stresssituationen gekennzeichnet sind, interferieren direkt mit dem PLC und dem TAP-Transporter. Das varicellovirale Typ-I-Membranprotein UL49.5 inhibiert den TAP-Komplex, wobei das Protein des Rinderherpesvirus (Bovines Herpesvirus 1, BHV-1) zusätzlich die proteasomale Degradation verschiedener Komponenten des PLCs einleitet. Dieser Mechanismus wird durch die C-terminale Domäne des UL49.5-Proteins vermittelt und ist von keinem anderen Virusprotein bekannt. Welche Aminosäuren des Virusproteins jedoch für diese Inhibition und Degradation essenziell sind, wurde bisher nicht aufgeklärt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die Funktionsweise des BHV-1 UL49.5-Proteins zu verstehen und insbesondere zu analysieren, welche Bereiche des Proteins für die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes verantwortlich sind. Das UL49.5-Protein wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit erfolgreich in Insektenzellen und in HeLa-Zellen exprimiert. Mittels Coimmunpräzipitation (Co-IP) wurde daraufhin die Bindung verschiedener UL49.5-Varianten an den TAP-Komplex analysiert. Unterstützt wurden diese Daten durch einen in vivo Interaktionsscreen (BiFC) und in vitro translatiertes UL49.5. Hierbei stellte sich heraus, dass das UL49.5-Protein in Abwesenheit sämtlicher Komponenten des Immunsystems an beide Untereinheiten des TAP-Transporters bindet. Die Bindung erfolgt sowohl an vollständige TAP-Untereinheiten als auch an den sogenannten coreTAP-Komplex, der nur die inneren sechs Transmembranhelices besitzt. Weiterhin wurden systematisch verkürzte UL49.5-Varianten generiert, um wichtige Reste für TAP-Inhibition und proteasomale Degradation zu identifizieren. Interessanterweise sind weder die N-terminale noch die C-terminale Domäne von UL49.5 für die Bindung an den TAP-Komplex zwingend notwendig. Die Bindung an den TAP-Transporter wird demnach über die Transmembrandomäne von UL49.5 vermittelt. Mit Hilfe von Peptidtransport-Analysen wurde die inhibitorische Aktivität verschiedener UL49.5-Mutanten eingehend untersucht. Zusätzlich wurde eine Untersuchung der MHC I-Oberflächenexpression in transient transfizierten HeLa-Zellen etabliert. In diesen Zellen wurde nach Sortierung eine drastisch reduzierte TAP-Konzentration nachgewiesen, die auf proteasomale Degradation des TAP-Komplexes zurückzuführen war. Die Untersuchung von C-terminal verkürzten UL49.5-Mutanten zeigte, dass die letzten zwei C-terminalen Aminosäuren essenziell für die Induktion der TAP-Degradation sind. Die C-terminale Domäne von UL49.5 konnte jedoch, nach Übertragung auf andere Proteine, keine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleiten. Demnach ist ein weiterer Bereich des Proteins für diesen Prozess zwingend notwendig. Erstaunlicherweise waren auch N-terminal verkürzte UL49.5-Proteine deutlich in ihrer inhibitorischen Funktion beeinträchtigt. Bereits nach der Deletion von 10 N-terminalen Aminosäuren war das Protein nicht mehr in der Lage, eine proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einzuleiten. Demnach spielt auch die ER-luminale Domäne von UL49.5 eine wichtige Rolle bei der UL49.5-induzierten TAP-Degradation. Somit wurde ein bisher noch nicht beschriebener neuartiger Inhibitionsmechanismus für das BHV-1 UL49.5-Protein entdeckt. Nach Bindung von UL49.5 über die Transmembrandomäne an beide Untereinheiten des TAP-Transporters scheint die ER-luminale Domäne von UL49.5 ein Signal über die ER-Membran an die zytoplasmatische Domäne zu übertragen, die dann die proteasomale Degradation des TAP-Komplexes einleitet. Es konnte im Rahmen dieser Doktorarbeit erstmals gezeigt werden, dass additive Effekte eines sehr kleinen Virusproteins auf zwei unterschiedlichen Seiten der ER-Membran zu einer proteasomalen Degradation eines sehr großen Membran-Komplexes führen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Protein CtaG aus Paracoccus denitrificans eingehend charakterisiert. Es wurde überprüft, ob dieses 21 kDa große Membranprotein als Kupferchaperon und Assemblierungsfaktor für die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase, das heißt für die Biogenese des CuB-Zentrums, in Frage kommt. Eine bioinformatische Analyse zeigte zunächst, dass CtaG, ein Homolog des eukaryotischen Proteins Cox11, zu den am stärksten konservierten Assemblierungsfaktoren der Cytochrom c Oxidase gehört. Interessanterweise sind diese Proteine alle an der Biogenese der redoxaktiven Metallzentren beteiligt, und nur sie sind auch in Paracoccus denitrificans konserviert. Somit stellt Paracoccus ein ideales Modellsystem dar, um die essentiellen Schritte der Biogenese der Cytochrom c Oxidase zu untersuchen. Ein lösliches Fragment von CtaG (CtaGLF) wurde heterolog in E. coli exprimiert und mit Hilfe eines spaltbaren His6-tags aufgereinigt. Es wurde ein Protokoll entwickelt, mit dessen Hilfe die Aggregation des löslichen Fragments minimiert und das Protein in hochreiner, aggregatfreier Form isoliert werden kann. Rekonstitutionsversuche zeigten, dass CtaGLF ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist. Nach der heterologen Expression in E. coli ist CtaGLF kofaktorfrei. Ein Protokoll zur in vitro Rekonstitution mit Kupferionen wurde entwickelt, mit welchem ein stöchiometrisches Kupfer/Protein-Verhältnis erreicht wird. Gelfiltrations- und ICP-MS-Analysen zeigten, dass CtaGLF Kupferionen ausschließlich als Dimer bindet. Rekonstitutionen bei denen Cu(I), Cu(II), Co(II), Fe(II), Mn(II), Mg(II) und Ni(II) sowohl einzeln als auch simultan angeboten wurden, führten zwar zu wenig reproduzierbaren absoluten Stöchiometrien, bestätigten aber, dass CtaGLF bevorzugt Cu(I) bindet. Mutagenesestudien bewiesen einerseits, dass drei Cysteinreste maßgeblich für die Kupferbindung verantwortlich sind und deuteten andererseits darauf hin, dass zwei identische, punktsymmetrische Bindungsstellen des CtaGLF-Dimers die Kupferionen koordinieren. Mit Hilfe einer Multiseq-Analyse wurden zunächst hochkonservierte Oberflächenreste von CtaG identifiziert. Eine Auswahl dieser Aminosäuren wurde per gerichteter Mutagenese ersetzt und der Effekt dieser Mutationen auf Stöchiometrie, Affinität und Dimerisierung von CtaGLF wurde untersucht. Die Affinitäten wurden dabei mit Hilfe von Kompetitionsexperimenten mit dem Cu(I)-spezifischen Chelator BCA analysiert. Insgesamt vier mögliche Szenarien für die Kupferbindung von CtaG wurden postuliert und anhand der Datenlage diskutiert. Das Szenario III, welches die Datenlage am besten zu erklären vermag, sieht eine trigonale Koordination der Kupferionen vor, an welcher die Cysteine des hochkonservierten CFCF-Motivs einer Polypeptidkette ein gemeinsames Koordinationsfeld mit dem nahe der Transmembranhelix gelegenen Cystein 38 der jeweils anderen Polypeptidkette bilden. Mit Hilfe von UV/Vis-spektroskopischen Messungen wurde gezeigt, dass die Bindung von Kupferionen an CtaGLF zu einer Absorption bei 358 nm führt. Diese kann mit einem Extinktionskoeffizienten von E delta 358 nm = 936 M-1cm-1 zur Beobachtung des Kupfertransfers von CtaGLF auf einen Akzeptor verwendet werden. Um eine Beteiligung von CtaG bei der Insertion des CuB-Ions in die Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase (UE I) zu beweisen, wurden zwei Arbeitshypothesen aufgestellt und empirisch untersucht: Die erste Hypothese geht von einer posttranslationalen Kupferinsertion aus. Die UE I wird laut dieser Hypothese zunächst vollständig exprimiert und in die Membran inseriert, bevor das Kupferion über einen Kanal in das 13 Å unterhalb der Membranoberfläche gelegene aktive Zentrum der Oxidase inseriert wird. Drei Ansätze wurden zur empirischen Überprüfung dieser Hypothese verfolgt: Erstens wurde ein in vitro Transferassay etabliert, bei dem heterolog exprimierte, kofaktorfreie UE I als Akzeptor für Kupferionen von CtaGLF diente. Zweitens wurden bioinformatische Analysen durchgeführt um potentielle Interaktionsflächen zwischen CtaG und UE I zu identifizieren. Und drittens wurde mit Hilfe koaffinitätschromatographischer Versuche eine Interaktion zwischen CtaG und kofaktorfreier UE I untersucht. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sprechen allesamt gegen eine posttranslationale CtaG-vermittelte Insertion von Kupferionen in die UE I der Cytochrom c Oxidase. Die zweite Hypothese geht davon aus, dass die prosthetischen Häm- und Kupfergruppen bereits vor der vollständigen Membraninsertion, das heißt kotranslational auf die UE I übertragen werden. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden ebenfalls mehrere Ansätze verfolgt: Erstens wurde die UE I in Gegenwart und Abwesenheit von CtaG heterolog in E. coli exprimiert und anschließend aufgereinigt. In Abwesenheit weiterer Assemblierungsfaktoren ist CtaG in diesem System nicht dazu in der Lage den Kupfergehalt der UE I zu erhöhen. Zweitens wurde mit Hilfe von Blau-Nativ Gelen und Crosslinking-Versuchen im nativen Wirt Paracoccus denitrificans nach einer Wechselwirkung zwischen CtaG und UE I gesucht. Insbesondere die Ergebnisse der Crosslinking-Versuche deuten auf einen Assemblierungskomplex hin, der sowohl CtaG als auch die UE I der Cytochrom c Oxidase enthält. In einem dritten Ansatz wurde ein zellfreies Expressionssystem etabliert, welches direkten Zugang zu naszierenden Ketten der UE I ermöglicht. Dieses System erscheint vielversprechend und dient derzeit als Basis für weitere Biogenesestudien. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass CtaG ein spezifisch Cu(I)-bindendes Protein ist, das im Zuge der Kupferbindung dimerisiert und in Paraoccus denitrificans in einem hochmolekularen Komplex gemeinsam mit UE I vorliegt. Die gegenwärtige Datenlage spricht dafür, dass CtaG als Kupferchaperon an der Biogenese der Cytochrom c Oxidase beteiligt ist und das CuB-Ion in einem kotranslationalen Mechanismus in die UE I der Cytochrom c Oxidase inseriert.
5-LO is the key enzyme in the biosynthesis of proinflammatory leukotrienes. It catalyses the conversion of arachidonic acid to the hydroperoxy intermediate 5(S)-hydroperoxy-6- trans-8,11,14-cis-eicosatetraenoic acid (5-HpETE). In a second step 5-LO catalyses a dehydration reaction forming the unstable epoxide intermediate 5(S)-trans-5,6-oxido-7,9- trans-11,14-cis-eicosatetraenoic acid (leukotriene A4 , LTA4). The 5-LO gene is subjected to versatile regulation mechanisms. Apart from regulation by DNA-methylation and histone acetylation / deacetylation 5-LO gene expression can be regulated by the differentiation inducers calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D3) and transforming growth factor beta (TGFβ) 5-LO gene expression. In the myeloid cell lines Mono Mac 6 (MM6) and HL-60, differentiation with both agents caused a prominent upregulation of 5-LO mRNA level, of 5-LO protein expression and of 5-LO activity. Treatment with calcitriol alone already has an impact on 5-LO gene expression which is additionally potentiated by TGFβ treatment. Previous nuclear run-off analysis and reporter gene analysis could not associate the 5-LO promoter with the induction of 5-LO mRNA expression mediated by calcitriol and TGFβ. Inclusion of the 5-LO coding sequence (cds) and inclusion of the 5-LO cds plus the last four introns of the gene (J to M) in the 5-LO promoter construct pN10 led to an enhanced reporter gene activity. The inductions were dependent on vitamin D receptor (VDR) and retinoid x receptor (RXR) cotransfection. Therefore the work was concentrated on identifying elements outside the 5-LO promoter region which contribute to the calcitriol / TGFβ effect on 5-LO mRNA expression. Insertion of the LTA4 hydrolase coding sequence – a coding sequence of similar size - instead of the 5-LO cds led to a loss of the calcitriol / TGFβ effect (pN10LTA4Hcds 1-fold induction). Therewith, it was proven that the presence of the 5-LO cds is crucial for the upregulating effect of calcitriol / TGFβ on 5-LO mRNA level. Cloning of the SV40 promoter instead of pN10 upstream of the 5-LO cds still showed inducibility by treatment with the inducers which argues for a promoter unspecific effect. Insertion of the 5-LO cds in a promoterless basic vector (pGL3cds) displayed same inductions by calcitriol / TGFβ treatment as the 5-LO promoter 5-LO cds construct (pN10cds). Thus, the effect of the inducers is not dependent on the 5-LO promoter under the in vitro conditions of the reporter gene assay. Hence, further cloning was done with promoterless constructs. Through 5-LO cds deletion constructs a positive regulating region in exon 10 to 14 was discovered. To adapt the natural gene context the last four introns (J-M) of the 5-LO gene were inserted in a promoterless construct containing exon 10 to 14 (pGL3cdsΔABInJM). 5end deletion constructs of it revealed putative vitamin D responsive elements (VDREs) in exon 12 and intron M. Mutation of the putative VDREs led to a reduced calcitriol effect –more prominent when the putative VDRE in intron M was mutated (reduction of 40%). Moreover another putative VDRE in exon 10 with an adjacent SMAD binding element (SBE) was detected. SMAD proteins are effector proteins of TGFβ signalling. Gelshift experiments demonstrated in vitro binding of the VDR-RXR heterodimer to those three putative VDREs. By chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay in vivo binding of VDR and RXR was shown to the VDRE in the region of exon 10, exon 12 and intron M. 8h and 24h incubation with calcitriol / TGFβ resulted in enhanced expression of VDR in each of the examined regions. The VDR is able to bind to the VDRE without its ligand, whereas this goes along with corepressor recruitment and thus the VDR has a repressive effect on transcription. Histone H4 acetylation was increased when MM6 cells were treated for 8h or 24h with calcitriol or the combination of calcitriol / TGFβ. This finding implies that at that point of time corepressors associated with the VDR are replaced by coactivators. It seems convincing that 5-LO transcription is mainly promoted by calcitriol alone which leads to a more accessible chromatin structure. Previous data indicated that calcitriol and TGFβ upregulate 5-LO RNA maturation and 5- LO transcript elongation. Thus several elongation markers were investigated by ChIP analysis: Histone H3 lysine 36 (H3K36) trimethylation and H4K20 monomethylation were detected in the analysed regions in exon 10, exon 12 and intron M. In region exon 10 the H3K36 trimethylation status was enhanced after 24h calcitriol or calcitriol / TGFβ treatment. An increased H4K20 monomethylation status in all regions was observed when MM6 cells were treated for 24h with calcitriol / TGFβ. 24h treatment with both agents also enhanced the recruitment of the elongation form of RNA polymerase II, which is phosphorylated at serine 2 of the carboxyterminal domain, to the investigated regions. These findings prove the positive regulating role for calcitriol and TGFβ on 5-LO transcript elongation. A putative mechanism of the effect of calcitriol and TGFβ on 5-LO RNA maturation might be the elevated phosphorylation of serine 2 of the RNA Polymerase II which is known to be followed by recruiting polyadenylating factors.
Die Aufklärung der dreidimensionalen Helix-Struktur der DNA, des Trägermoleküls der genetischen Information aller Lebewesen, durch Watson und Crick im Jahre 1953 ermöglichte eine ganz neue Sichtweise auf ihre Eigenschaften und viele zelluläre Prozesse. Von besonderem Interesse sind hier u.a. Mechanismen, bei denen die DNA an den Phosphaten nucleophil substituiert wird, wie dies beispielsweise bei der Rekombination oder der Transkription geschieht. Dies ist daher interessant, weil sich die DNA gegenüber nucleophilen Angriffen in verschiedenen Experimenten als überaus stabil und reaktionsträge gezeigt hat. Spezialisierte Enzyme wie die Staphylokokkennuklease oder Restriktionsendonukleasen nutzen u.a. Metall-Ionen, um Phosphoryltransfer-Reaktionen zu katalysieren und in eine akzeptable Zeitskala zu verschieben. Die Topoisomerase vom Typ I zeigt eindrucksvoll, dass Katalyse solcher Reaktionen auch ohne Metall-Ion möglich ist, womit auch gleichzeitig die Quelle für eine potentielle oxidative Schädigung der DNA entfernt ist. Leider ist die Palette der natürlich vorkommenden Enzyme begrenzt. Die Erforschung und Entwicklung von künstlichen Nukleasen ermöglicht daher potentiell den zukünftigen Einsatz neuer, maßgeschneiderter Werkzeuge für die Biochemie und die Biotechnologie, sowie langfristig die Bereitstellung neuartiger Chemotherapeutika. Vom aktiven Zentrum der Staphylokokkennuklease abgeleitete Moleküle auf Bisguanidinium-Naphthol-Basis bzw. deren Derivate zeigten in der Vergangenheit deutliche Aktivität als metallfreie, unspezifische Spalter von Plasmid-DNA. Die vorliegende Arbeit beschreibt die weitere Entwicklung und Charakterisierung neuer unspezifischer und potentiell sequenzselektiver Bisguanidinium-Naphthol-Derivate. Hierbei wurde eine neue, zuverlässige Synthesestrategie für Bisguanidinium-Naphthole und parallel dazu ein neuer und flexibler Weg der Flüssigphasen-Synthese von DNA-bindenden Polyamiden ausgearbeitet, um daraus DNA-bindende Konjugate herzustellen. Vier unspezifische Moleküle (45, 94, 95, 97) und zwei Konjugate (46 und 140) wurden dann bei physiologischen Bedingungen auf ihre Spaltaktivität gegenüber Plasmid-DNA und linearer Duplex-DNA untersucht. Bei allen oben genannten Verbindungen konnte - verglichen mit der Stamm-Verbindung 36 aus Vorgängerarbeiten - eine erhöhte Aktivität gegenüber Plasmid-DNA bestimmt werden, die im Falle der Konjugate zwischen 4000- und 8000-fach liegt. Zur weiteren Charakterisierung wurden Experimente in Anwesenheit von EDTA oder Mg2+, zur pH-Abhängigkeit und zur Kinetik der Spalt-Reaktion durchgeführt. Erste Testreihen zum Nachweis sequenzselektiver DNA-Spaltung lieferten kein abschließendes Ergebnis, gaben jedoch erste Hinweise auf Selektivität, welche zur Zeit näher untersucht und überprüft werden.
Lentiviral vectors mediate gene transfer into dividing and most non-dividing cells. Thereby, they stably integrate the transgene into the host cell genome. For this reason, lentiviral vectors are a promising tool for gene therapy. However, safety and efficiency of lentiviral mediated gene transfer still needs to be optimised. Ideally, cell entry should be restricted to the cell population relevant for a particular therapeutic application. Furthermore, lentiviral vectors able to transduce quiescent lymphocytes are desirable. Although many approaches were followed to engineer retroviral envelope proteins, an effective and universally applicable system for retargeting of lentiviral cell entry is still not available. Just before the experimental work of this thesis was started, retargeting of measles virus (MV) cell entry was achieved. This virus has two types of envelope glycoproteins, the hemagglutinin (H) protein responsible for receptor recognition and the fusion (F) protein mediating membrane fusion. For retargeting, the H protein was mutated in its interaction sites for the native MV receptors and a ligand or a single-chain antibody (scAb) was fused to its ectodomain. It was hypothesised that the retargeting system of MV can be transferred to lentiviral vectors by pseudotyping human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) derived vector particles with the MV glycoproteins. As the unmodified MV glycoproteins did not pseudotype HIV vectors, two F and 15 H protein variants carrying stepwise truncations or amino acid (aa) exchanges in their cytoplasmic tails were screened for their ability to form MV-HIV pseudotypes. The combinations Hcd18/Fcd30, Hcd19/Fcd30 and Hcd24+4A/Fcd30 led to most efficient pseudotype formation with titers above 10exp6 transducing units /ml, using concentrated particles. The F cytoplasmic tail was truncated by 30 aa and the H cytoplasmic tail was truncated by 18, 19 or 24 residues with four added alanines after the start methionine in the latter case. Western blot analysis indicated that particle incorporation of the MV glycoproteins was enhanced upon truncation of their cytoplasmic tails. With the MV-HIV vectors high titers on different cell lines expressing one or both MV receptors were obtained, whereas MV receptor-negative cells remained untransduced. Titers were enhanced using an optimal H to F plasmid ratio (1:7) during vector particle production. Based on the described pseudotyping with the MV glycoprotein variants, HIV vectors retargeted to the epidermal growth factor receptor (EGFR) or the B cell surface marker CD20 were generated. For the production of the retargeted vectors MVaEGFR-HIV and MVaCD20-HIV, Fcd30 together with a native receptor blind Hcd18 protein, displaying at its ectodomain either the ligand EGF or a scAb directed against CD20 were used. With these vectors, gene transfer into target receptor-positive cells was several orders of magnitude more efficient than into control cells. The almost complete absence of background transduction of non-target cells was e.g. demonstrated in mixed cell populations, where the CD20-targeting vector selectively eliminated CD20-positive cells upon suicide gene transfer. Remarkably, transduction of activated primary human CD20-positive B cells was much more efficient with the MVaCD20-HIV vector than with the standard pseudotype vector VSV-G-HIV. Even more surprisingly, MVaCD20-HIV vectors were able to transduce quiescent primary human B cells, which until then had been resistant towards lentiviral gene transfer. The most critical step during the production of MV-HIV pseudotypes was the identification of H cytoplasmic tail mutants that allowed pseudotyping while retaining the fusion helper function. In contrast to previously inefficient targeting strategies, the reason for the success of this novel targeting system must be based on the separation of the receptor recognition and fusion functions onto two different proteins. Furthermore, with the CD20-targeting vector transduction of quiescent B cells was demonstrated for the first time. Own data and literature data suggest that CD20 binding and hyper-cross-linking by the vector particles results in calcium influx and thus activation of quiescent B cells. Alternatively this feature may be based on a residual binding activity of the MV glycoproteins to the native MV receptors that is insufficient for entry but induces cytoskeleton rearrangements dissolving the post-entry block of HIV vectors. Hence, in this thesis efficient retargeting of lentiviral vectors and transduction of quiescent cells was combined. This novel targeting strategy should be easily adaptable to many other target molecules by extending the modified MV H protein with appropriate specific domains or scAbs. It should now be possible to tailor lentiviral vectors for highly selective gene transfer into any desired target cell population with an unprecedented degree of efficiency.
Das Ziel dieser Arbeit war es, RNA-Strukturen als potentielle Zielstrukturen für die Medikamentenentwicklung zu untersuchen. Hierbei ging es im Speziellen um die Anwendung Virtueller Screening Verfahren für die RNA-Liganden-Vorhersage. Hierzu wurde die als TAR-Motiv (transactivating response element) bekannte RNA-Struktur der mRNAs des HI-Virus ausgewählt. Diese Struktur wurde gewählt, da mit den vier PDB-Einträgen 1ANR, 1ARJ, 1LVJ und 1QD3 bereits experimentell motivierte Strukturmodelle zum Beginn der Untersuchung vorlagen. Ausschlaggebend war hierbei auch das Vorhandensein eines Tat-TAR-FRET-Assays im Rahmen des SFB 579, in welchem diese Arbeit angefertigt wurde. Die Aufmerksamkeit, welche dem HI-Virus im Rahmen der Bekämpfung der Immunschwächekrankheit bereits zukam, führte bei dem gewählten Testmodell ebenfalls zu einem, wenn auch immer noch überschaubaren Datensatz bereits getesteter Substanzen, der als Grundlage für einen Liganden-basierten Ansatz als erste Basis dienen konnte. Basierend auf diesen Voruntersuchungen ergaben sich die weiteren Schritte dieser Arbeit. Die Arbeit lässt sich zusammenfassend in vier zum Teil parallel verlaufende Phasen einteilen: Phase 1:Bestandsaufnahme bekannter Informationen über die Zielstruktur · experimentell bestimmte Zielstrukturen · experimentell bestimmte Liganden/Nichtliganden der Zielstruktur Phase 2: Ableiten eines ligandenbasierten Ansatzes zur Vorhersage von potentiellen Bindern der Zielstruktur aus Substanzbibliotheken, der nicht auf Strukturdaten der Zielstruktur beruht. Phase 3: Analyse der bekannten Konformere der Zielstruktur auf konstante Angriffspunkte für ein spezielles Liganden-Design. Phase 4: Einbinden der bekannten Strukturinformationen der Zielstruktur zur weiteren Verfeinerung der Auswahlverfahren neuer Kandidaten für die weitere experimentelle Bestimmung des Bindeverhaltens. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels der Anwendung von künstlichen neuronalen Netzen in einem ligandenbasierten Ansatz durch virtuelles Screening der Chemikalien-Datenbanken verschiedener Lieferanten fünf neue potentielle TAR-RNA-Liganden identifiziert werden (drei davon mit einem Methylenaminoguanidyl-Substrukturmotiv), sowie als „Spin-Off“ durch die Anwendung der ursprünglich nur für den Tat-TAR-FRET-Assay vorgesehenen Testsubstanzen in einem Kooperationsprojekt (mittels CFivTT-Assay) zwei neue potentiell antibakterielle Verbindungen identifiziert werden. Die Beschäftigung mit der offensichtlichen Flexibilität der TAR-RNA und damit einer nicht eindeutig zu definierenden Referenz-Zielstruktur für das Liganden-Docking führte zur Erstellung eines Software-Pakets, mit dem flexible Zielstrukturen – basierend auf den Konformer-Datensätzen von MD-Simulationen – auf konstante Angriffspunkte untersucht werden können. Hierbei wurde ausgehend von der Integration eines Taschenvorhersage-Programms (PocketPicker) eine Reihe von Filtern implementiert, die auf den hierzu in einer MySQL-Datenbank abgelegten Strukturinformationen eine Einschränkung des möglichen Taschenraums für das zukünftige Liganden-Design automatisiert vornehmen können. Des Weiteren ermöglicht dieser Ansatz einen einfachen Zugriff auf die einzelnen Konformere und die Möglichkeit Annotationen zu den Konformeren und den daraus abgeleiteten Tascheninformationen hinzuzufügen, so dass diese Informationen für die Erstellung von Liganden-Docking-Versuchen verwendet werden können. Ferner wurden im Rahmen dieser Arbeit ein neuer Deskriptor für die Beschreibung von Taschenoberflächen eingeführt: der auf der „Skalierungs-Index-Methode“ basierende molekulare SIMPrint. Die Beschäftigung mit der Verteilung der potentiellen Bindetaschen auf der Oberfläche der Konformerensemble führte ferner zur Definition der Taschenoberflächenbildungswahrscheinlichkeit (Pocket Surface Generation Probability – PSGP) für einzelne Atome einer Zielstruktur, die tendenziell für die Einschätzung der Ausbildung einer potentiell langlebigen Interaktion eines Liganden mit der Zielstruktur herangezogen werden kann, um beispielsweise Docking-Posen zu bewerten.
Die trimeren P2X–Rezeptoren sind nicht–selektive Kationenkanäle, die durch Adenosintriphosphat (ATP) aktiviert werden. Es gibt sieben Untereinheiten (P2X1–7). P2X–Rezeptoren sind in nahezu jedem Gewebe exprimiert und dort an den verschiedensten physiologischen Vorgängen beteiligt. Neben den „Cys–Loop“–Rezeptoren und den ionotropen Glutamat–Rezeptoren stellen die P2X–Rezeptoren eine eigenständige Familie von Neurotransmitter–gesteuerten Rezeptoren dar. Eine Untereinheit der trimeren P2X–Rezeptoren besteht aus den intrazellulären N– und C–Termini und zwei Transmembrandomänen, die über eine große extrazelluläre Domäne verbunden sind. Da weder ein P2X–homologes lösliches Protein für Kristallisationsstudien noch ein Gewebe zur Aufreinigung großer Mengen von P2X–Rezeptorprotein zur Verfügung steht, stützen sich Struktur–Funktions–Studien auf einzelpunktmutierte Rezeptoren in heterologen Expressionsystemen. Einige Aminosäuren, die bei Austausch gegen Alanin eine deutliche Verschiebung der Dosis–Wirkungs–Kurve von ATP bewirken und von denen daher vermutet wird, dass sie an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, wurden bereits identifiziert. Ob sich die Agonisten–Bindungstasche der P2X–Rezeptoren zwischen zwei Untereinheiten, wie bei den nikotinischen Acetylcholin–Rezeptoren, oder innerhalb einer Untereinheit, vergleichbar mit den ionotropen Glutamat–Rezeptoren, befindet, ist weitgehend ungeklärt. Um die Lokalisation der ATP–Bindungstasche zu bestimmen, wurden, basierend auf vorhandener Literatur, potenziell an der ATP–Bindung beteiligte Aminosäuren des P2X1–Rezeptors durch zielgerichtete Mutagenese gegen Cysteine ausgetauscht und die P2X–Rezeptormutanen in Xenopus laevis–Oozyten exprimiert. Das Ziel dabei war, quervernetzte Cystein–Mutanten durch Disulfidbrückenbildung zwischen den substituierten Cysteinen zu identifizieren und so die Distanz von Aminosäure–Seitenketten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, zu bestimmen. Für die biochemischen Untersuchungen wurden entweder alle neu gebildeten Proteine der Oozyten metabolisch durch Inkubation mit radioaktivem [35S]–Methionin oder selektiv die Plasmamembran– ständigen Proteine mit Sulfo–NHS–Fluoreszenz–Farbstoffen markiert. Die Rezeptormutanten wurden affinitätschromatographisch über ein N–terminales Hexahystidyl–Motiv unter nicht–denaturierenden Bedingungen aufgereinigt und mit nicht–reduzierender SDS–Polyacrylamid–Gelelektrophorese (PAGE) auf Expression sowie mit Blauer–Nativer–PAGE auf korrekte Trimerisierung überprüft. Darüber hinaus wurden homologe Cystein–Substitutionen einer P2X2–1–Chimäre, welche dieselben Bindungseigenschaften des P2X1–Rezeptors besitzt, mittels der Zwei–Elektroden–Spannungsklemme charakterisiert (TEVC). Die Koexpression der verschiedenen P2X–Mutanten ergab eine spontane Quervernetzung über Disulfidbrücken zwischen den P2X1 K68C– und F291C–Mutanten, die in nicht–reduzierenden SDS–PAGE–Gelen über eine Dimerbildung nachgewiesen werden konnte. Dies deutet auf eine geringe Distanz zwischen diesen Cystein–substituierten Aminosäuren hin. Die Ausbildung der Disulfidbrücke konnte nach Reduktion der Quervernetzung während der Aufreinigung und durch Zugabe von ATP verhindert werden. In funktionellen Studien der P2X2–1 K68C/F291C–Doppelmutante war es entsprechend möglich die Disulfidbrücke reversibel zu reduzierenden. In den Mutantenkanäle exprimierenden Xenopus–Oozyten wurde der geringe Rezeptorstrom durch Reduktion mit DTT ca. 60fach potenziert und dadurch überhaupt messbar gemacht. Die Reoxidation durch H2O2 wurde wie in den biochemischen Experimenten in Anwesenheit von ATP ebenfalls verhindert. Da die Aminosäuren K68 und F291 des P2X1–Rezeptors möglicherweise an der Agonisten–Bindung beteiligt sind, sind diese Ergebnisse die ersten direkten experimentellen Hinweise auf die Aposition von Domänen benachbarter Untereinheiten, die an der Agonisten–Bindung beteiligt sind. Demnach befindet sich die ATP–Bindungstasche an der Grenzfläche zwischen zwei Untereinheiten der P2X–Rezeptoren. Die Koexpression homologer Cystein–substituierter P2X2–, P2X3– und P2X4–Rezeptoren zeigte analog zu den P2X1–Experimenten eine spontane Dimerisierung der P2X2 K69C– und F289C–Mutanten. Eine mäßige Quervernetzung von zwei Untereinheiten der P2X3 K63C– und F280C– sowie der P2X4 K67C– und F294C–Mutanten konnte nach Anwendung einer ca. 0,5 nm langen Cystein–spezifischen quervernetzenden Substanz erreicht werden. Die paarweise Kombination der P2X1–, P2X2–, P2X3–und P2X4–Cystein–Mutanten zeigte selbst nach Anwendung quervernetzender Substanzen nur in der Kombination von P2X1–K68C und P2X2–F289C eine Quervernetzung von zwei unterschiedlichen Untereinheiten eines heteromeren P2X1/2–Rezeptors. Diese Kombination konnte in elektrophysiologischen Messungen durch Reduktion der Disulfidbrücke spezifisch messbar gemacht und somit die Heteromerisierung dieser Untereinheiten eindeutig aufgezeigt werden. Zusammenfassend deutet die geringe Distanz der an der Quervernetzung beteiligten Cystein–Mutationen der P2X1–, P2X2– und homomeren P2X1/2–Rezeptoren auf ein konserviertes strukturelles Motiv dieser P2X–Subtypen hin, welches in P2X3– und P2X4–Rezeptoren nicht konserviert zu sein scheint. Diese Ergebnisse liefern wichtige Hinweise auf die generelle Struktur der P2X–Rezeptoren und werden maßgeblich zur Interpretation einer zukünftigen Kristallstruktur beitragen.