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Die rechtzeitige Diagnose und Behandlung kindlicher Katarakte ist von großer Wichtigkeit. Ein Hindernis in der visuellen Achse während der Periode sensorischer Vulnerabilität führt zur Amblyopie, insbesondere wenn diese innerhalb der ersten 3 Lebensmonate stattfindet.Wir untersuchten inwiefern sich das Wachstum der Augen je nach verschiedenen Kataraktformen verhält. In unserer Studie wurden retrospektiv die Krankenakten von 44 Patienten mit 58 erkrankten Augen ausgewertet, die im Zeitraum von 1992-1996 an der Augenklinik des Frankfurter Universitätsklinikums, Abteilung für Kinderaugenheilkunde, operiert wurden. Das Alter zum Zeitpunkt der Operation reichte in der Gruppe der 29 (50,0%) kongenitalen Katarakte von 1 Woche bis 10 Jahren, mit einem Durchschnitt von 2 Jahren und 5 Monaten. Die 16 (27,6%) Augen mit entwicklungsbedingter Katarakt waren in einem Alter zwischen 3 und 14 Jahren, mit einem Durchschnittsalter von 6 Jahren und 11 Monaten operiert worden, während das Alter zum Zeitpunkt der Operation bei den 13 (22,4%) traumatischen Katarakten von 3 Jahren und 4 Monaten bis 9 Jahren reichte, mit im Mittel 6 Jahren und 3 Monaten. Die Bulbuslängen veränderten sich in einem mittlerem Beobachtungszeitraum von 3 Jahren und 1 Monat bei den kongenitalen Katarakten um durchschnittlich 2,34 mm von 19,80 auf 22,14 mm, in der Gruppe der entwicklungsbedingten Katarakte um durchschnittlich 0,86 mm von 22,33 auf 23,19 mm und bei den Augen mit traumatischer Katarakt um durchschnittlich 1,53 mm von 21,95 auf 23,48 mm. Unsere mit dem U-Test nach Mann und Whitney durchgeführten Vergleiche ergaben, bis auf zwei Ausnahmen, keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Bulbuslängenwachstum in den verschiedenen Alters- und Ursachengruppen. Als wichtig erwies sich jedoch das signifikant unterschiedliche Bulbuslängenwachstum von 1,52 mm im Vergleich der 18 Augen mit schlechter Sehschärfe (Augen mit einem Visus von 0,2 und darunter) zu den 34 Augen mit guter Sehschärfe (Augen mit einem Visus von 5,0 und darüber). Augen mit schlechter Sehschärfe zeigten ein signifikant höheres Längenwachstum als Augen mit guter Sehschärfe. Bei dem Vergleich der 14 kongenital beidseitig aphaken Augen zu den 13 entwicklungsbedingt beidseitig pseudophaken Augen zeigte sich ein signifikant höheres Wachstum von Augen mit kongenitaler Katarakt. Einschränkend auf dieses Ergebnis wirkt, dass die entwicklungsbedingte Katarakt in einem Alter entstanden ist, als die Phase mit dem größten Wachstumsschub der Augen schon vorüber war. Dadurch nimmt sie weniger Einfluß auf die Längenentwicklung des Auges als eine kongenitale Katarakt. Das Alter zum Zeitpunkt der Operation scheint der wichtigste Faktor für die Längenentwicklung des Augen zu sein. Eine kongenitale Katarakt mit ihrem frühen Operationszeitpunkt hat großen Einfluß auf die Längenentwicklung des Auges. Kongenital einseitig aphake Augen zeigten allgemein im Vergleich zu anderen Gruppen nach der Geburt und Operation häufig das größte Bulbuslängenwachstum. Die Früherkennung und frühest mögliche Behandlung einer kindlichen Katarakt sowie die Amblyopienachbehandlung sind neben einer erfolgreichen Operation für das Erreichen einer guten Sehschärfe von größter Bedeutung.
R-Flurbiprofen wird als das „inaktive“ Isomer des NSAIDs Flurbiprofen angesehen, weil es in vitro die Cyclooxygenase-Aktivität in therapeutischen Konzentrationen nicht hemmt. Dennoch zeigte sich, dass R-Flurbiprofen antinozizeptive und antikanzerogene Effekte hervorruft, obwohl das R-Enantiomer bei Ratte und Mensch nur marginal zum S-Enantiomer epimerisiert wird. Um diese Effekte näher untersuchen zu können, wurden sowohl in vivo als auch molekularbiologische Experimente durchgeführt: R- und S-Flurbiprofen wurden intraperitoneal in den Do sierungen 1, 3, 9 mg/kg und Dexamethason (Kontrolle) in einer intraperitonealen Dosis von 0.5 mg/kg Ratten verabreicht. Die Effekte von R- und S-Flurbiprofen und Dexamethason wurden in der Zymosan-induzierten Hinterpfotenentzündung im Vergleich zu Vehikel untersucht. Die Gruppengröße umfasste 3 – 6 Ratten pro Behandlung. Außerdem wurden Gewebeproben aus der entzündeten Pfote und dem Rückenmark auf eine PGE2-Freisetzung, Expression von COX mRNA und COX Protein hin untersucht. Weiterhin wurde die Hemmung der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren (NFkB und AP-1) in RAW 264.7 Mausmakrophagen gemessen. R-Flurbiprofen zeigte in der Zymosan-induzierten Hinterpfotenentzündung der Ratte eine ähnliche antiinflammatorische Aktivität wie Dexamethason. Dieser beobachtete Effekt läßt sich zumindest teilweise über eine Hemmung der NFkB Aktivität erklären. R-Flurbiprofen hemmte: 1.) die LPS-induzierte NFkB DNA-Bindungsaktivität in RAW 264.7 Makrophagen, 2.) die Translokation der p65 Untereinheit in den Kern dieser Zellen und 3.) die Zymosan induzierte NFkB abhängige Gentranskription in der entzündeten Pfote und dem Rückenmark von Ratten. S-Flurbiprofen zeigte ähnliche Effekte, war jedoch weniger potent. R-Flurbiprofen hemmte ebenfalls die DNA Bindungsaktivität von AP-1, einem anderen wichtigen Transkriptionsfaktor bei Entzündungsprozessen. Da R-Flurbiprofen eine wesentlich geringere gastrointestinale Toxizität aufweist, lässt es sich möglicherweise als antiinflammatorische Substanz bei Erkrankungen einsetzen, in der die vermehrte oder konstitutive NFkB und AP-1 Aktivierung an pathophysiologischen Prozessen beteiligt ist. Zusammengefasst lässt sich der antiinflammatorische Effekt von R-Flurbiprofen über eine verminderte COX-2 Expression und eine Hemmung der Aktivierung der Transkriptions faktoren NFkB und AP-1 erklären.
Die Reinigung von Siliciumoberflächen verbraucht große Mengen von hochreinen und teueren Chemikalien. Komplexbildner dienen der Maskierung von Metallionen in den Reinigungschemikalien mit dem Ziel, die vorhandenen Reinigungsverfahren zu vereinfachen, den Reinigungsvorgang zu beschleunigen und Chemikalien und Kosten zu sparen. Zur Beurteilung, ob ein Komplexbildner für diese Anwendung geeignet ist, bedarf es eines analytischen Verfahrens zur Bestimmung seiner Stabilität in Halbleitersilicium-Reinigungsbädern. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden ob die HPLC für diese Aufgabe eingesetzt werden kann. Zusätzlich sollte versucht werden, über die Detektion und die Identifizierung von Zersetzungsprodukten Informationen über die Zersetzungsreaktion zu gewinnen. Es wurden Untersuchungen zur Komplexbildnerstabilität in verschiedenen Reinigungsbädern und in 30% H2O2 durchgeführt. Vier strukturell unterschiedliche Komplexbildner wurden untersucht. Pyrinan (N, N´, N´´-Tris (3-hydroxy-6-methyl-2-pyridylmethyl) 1, 4, 7-Triazacyclononan), ABS-BAMTPH (N,N’,N’’-tris [2-(N-hydroxycarbamoyl) propyl]-1,3,5-benzentricarboxamid), Tiron (Dinatrium-1,2-Dihydroxybenzen-3,5-Disulfonsäure) und die Pyridinone (3-Hydroxy-4(1H)-pyridinone). Bei den Pyridinonen handelte es sich um eine Gruppe von Komplexbildnern mit dem gleichen Grundgerüst, welches mit unterschiedlichen Substituenten verbunden war. Das Verhalten der Pyridinone in 30% H2O2 zeigt, dass es möglich ist mit relativ geringen Modifikationen der Molekülstruktur die Stabilität dieser Komplexbildner gegen Zersetzung zu steigern. Die auftretenden Zersetzungsprodukte wurden mit HPLC-MS untersucht. Die Beobachtung, dass in 30% H2O2 und in dem Reinigungsbad APM (H2O2/NH3/H2O-Gemisch) jeweils identische Zersetzungsprodukte auftraten deutet darauf hin, dass in beiden Fällen eine Oxidation durch H2O2 stattfindet. Die in 30% H2O2 beständigsten Komplexbildner waren ESEHP (Sulfoniumsubstituent) und BMHP (Alkylsubstituent). In APM war ECEHP am stabilsten (Carboxylsubstituent). Tiron wurde nur in 30% H2O2 untersucht. Seine Stabilität wird in dieser Lösung nur von 2 der 13 untersuchten Pyridinone, ESEHP und BMHP, übertroffen. Es wurden keine Zersetzungsprodukte detektiert. ABS-BAMTPH hingegen wurde nur in APM untersucht. In APM erwies sich ABS-BAMTPH als der am wenigsten stabile von allen untersuchten Komplexbildnern. Die Brauchbarkeit von ABS-BAMTPH wurde zusätzlich durch einen hohen Anteil an Nebenprodukten eingeschränkt, die bei der Synthese des Komplexbildners entstanden waren. Die Nebenprodukte konnten mittels HPLC-MS und Kenntnis des Syntheseweges identifiziert werden. Über die Zersetzungsreaktion(en) des Pyrinan konnte mit Hilfe von HPLC-MS und MS/MS eine Reihe von Informationen gewonnen werden. Eine Abfolge von Reaktionen wird zur Erklärung der beobachteten Zersetzung vorgeschlagen. Alle Reaktionen laufen an den 3 tertiären Amin-Stickstoffatomen des Pyrinans ab. Diese stellen den Schwachpunkt der Pyrinanstruktur dar. Die Bildung von Aminoxiden leitet die Zersetzung ein. Die Aminoxide reagieren über eine Meisenheimer-Umlagerung weiter. Eine komplexierende Wirkung der Zersetzungsprodukte kann aufgrund der beobachteten Stabilisierung des H2O2 gegen die durch Übergangsmetallionen katalysierte Disproportionierung angenommen werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, das die HPLC zur Untersuchung der Stabilität von Komplexbildnern in Halbleiter-Reinigungschemikalien geeignet ist. Die HPLC-MS und die MS/MS lieferten zusätzliche Informationen über Zersetzungsprodukte und die stattfindenden Zersetzungsreaktionen. Die HPLC-MS ist darin den bisher in der Halbleiterindustrie für diese Fragestellung benutzten analytischen Methoden überlegen.
Im Rahmen dieser Arbeit wird ein Experiment vorgestellt, mit dem es möglich ist, die Wechselwirkungen zwischen Elektronen in der Gegenwart eines extrem starken Laserfeldes zu untersuchen. Diese resultieren aus der nichtsequentiellen Multiphoton- Doppelionisation von Neon in einem starken elektrischen Feld, das durch einen Hochleistungslaser erzeugt wird. Mit Hilfe der COLTRIMS-Technologie ist es möglich die entstandenen Teilchen nachzuweisen und die Impulskomponenten zu bestimmen. Bei dieser Technologie handelt es sich um ein „Mikroskop“, das atomphysikalische Prozesse vollständig differntiell beobachtet. Die bei der Doppelionisation entstandenen Elektronen und das Rückstossion werden mittels eines schwachen elektrischen Feldes auf orts- und zeitaufgelöste Multichannelplate-Detektoren mit Delaylineauslese geleitet. Zusätzlich wird noch ein magnetisches Feld überlagert. Aus dem Auftreffort und der Flugzeit der Teilchen können die Impulse bestimmt werden. Es ist erstmals möglich die Impulskomponenten der drei Raumrichtungen für alle an der Ionisation beteiligten Teilchen mit hinreichend guter Auflösung zu bestimmen. Es können vollständige differentielle Winkelverteilungen erzielt werden. Damit gelingt es, ein kinematisch vollständiges Experiment zu realisieren. Die Elektronen werden bevorzugt in Richtung des Polarisationsvektors des Laserlichtes emittiert. Aufgrund der guten Impulsauflösung ist es jetzt möglich, die Richtung senkrecht zur Polarisation zu untersuchen und die Erkenntnisse in Bezug zueinander zu bringen. Das der nichtsequentiellen Doppelionisation zu grunde liegende sehr anschauliche Modell ist der „Rescattering-Prozess“: Das Laserfeld koppelt an das Coulombpotential des Atoms und verformt es derart, dass ein Elektron die effektive Potentialbarriere überqueren oder durch diese durchtunneln kann. Dieses zuerst befreite Elektron wird durch das oszillierende elektromagnetische Feld zunächst vom Ursprungsion fortgetrieben. Kehrt aber die Phase des Laserfeldes um, wird es zurück zum Ion beschleunigt, nimmt dabei Energie aus dem Feld auf und kann durch Elektron-Elektron-Stossionisation ein zweites Elektron aus dem Atom ionisieren oder es können kurzzeitige Anregungszustände erzeugt werden, die später feldionisiert werden. Dieses Modell wurde schon durch ein Vielzahl von Experimenten verifiziert. Gleichzeitig wirft es aber auch Fragen auf: Wie sind die Elektron-Elektron-Korrelationen zu erklären? Wie hängt der Longitudinal- mit dem Transversalimpuls zusammen? Welche Ionisationsmechanismen treten wann auf? Zusammenfassend kann man sagen, dass ein Experiment präsentiert wird, das zur Erfoschung von Korrelationseffekten bei Multiphoton-Ionisation beiträgt und sehr detaillierte Einblicke in die Welt der Laseratomphysik gewährt. Die Daten belegen eindeutig, dass eine Messung der korrelierten Impulse mehrerer Teilchen in einem Laserfeld eine Zeitmessung mit einer Auflösung weit unter einer Femtosekunde ermöglicht. Das beobachtete Ein- und Ausschalten der Elektronenabstossung, je nach der über die Longitudinal-Impulskorrelation gemessenen Verzögerungszeit, zeigt die Möglichkeit „Attosekunden Physik ohne Attosekunden-Pulse“ zu betreiben.
Die in vivo MR-Protonenspektroskopie (1H-MRS) ist ein nichtinvasives Verfahren, das die Untersuchung biochemischer Substanzen beim Lebenden ermöglicht. In einer prospektiven Studie wurden Patienten, die an einer Demenz vom Alzheimer-Typ (DAT) litten, und altersentsprechende Probanden mit der 1H-MRS untersucht. Im Hirngewebe wurden Konzentrationen von Molekülen bestimmt, die Aussagen über die zelluläre Zusammensetzung ermöglichen. Das Hauptinteresse galt der Untersuchung von Glutamat und Glutamin, da ein Überangebot des Neurotransmitters Glutamat im synaptischen Spalt möglicherweise für die Neurodegeneration beim M. Alzheimer mitverantwortlich ist. Bei 29 Patienten mit einer DAT sowie 19 Probanden wurden zwei Volumina in Kortex und Marklager des Parietallappens bei 1,5 Tesla Magnetfeldstärke mit einer PRESS-Sequenz (TE = 22 ms, TR = 3 s) untersucht. Die Patienten waren kognitiv leicht bis mittelschwer beeinträchtigt (Mini Mental State Examination, MMSE, 11-27 Punkte). Die quantitative Auswertung der Spektren erfolgte nach der "phantom replacement method" mit dem Softwareprogramm LCModel. Als Kriterium für die Zuverlässigkeit der Konzentrationsangaben diente die vom Programm als %SD-Wert angegebene Auswertegenauigkeit der Einzelmessungen. Neben dem Glutamat- und Glutamingehalt wurden der Liquorgehalt im kortikalen Messvolumen und die Konzentrationen der Moleküle N-Acetyl-Aspartat und N-Acetyl-Aspartyl- Glutamat (tNAA), myo-Inositol (mI), Kreatin und Kreatinphosphat (tCr) sowie der cholinhaltigen Substanzen (tCh) bestimmt. Bei den Patienten konnten 25 aussagekräftige Spektren aus der Rindenregion und 19 aus dem Marklager des Parietallappens gemessen werden, bei den Probanden 17 Kortex- und 13 Marklager-Spektren. Glutamat und Glutamin können mit der in vivo-Spektroskopie wegen ihrer sich überlappenden Resonanzen nicht separat bestimmt werden und wurden deshalb als „Glx“ zusammengefasst. Der Glx-Gehalt betrug in der Rindenregion bei den Patienten im Durchschnitt 15,48 ± 5,15 mmol/l, bei den Probanden 13,98 ± 3,14 mmol/l. Die um 11% höhere Konzentration bei den Patienten war nicht signifikant. Die Glx-Konzentrationen im Marklager betrugen 8,16 ± 3,79 mmol/l bei den Patienten und 8,14 ± 3,71 mmol/l bei den Probanden. Nach dem Kriterium der %SD war die Zuverlässigkeit der Konzentrationsbestimmung von Glutamat und Glutamin eingeschränkt, was auf die protonenspektroskopischen Eigenschaften von Glutamat und Glutamin zurückzuführen ist. Sie erzeugen wegen ihrer gekoppelten Resonanzen breite und mehrgipflige Protonensignale, die wegen der resultierenden niedrigen Signalamplitude für LCModel von Makromolekülresonanzen oder von Artefakten, die durch ungenügende Wasserunterdrückung entstehen, schwierig abzugrenzen sind. Die %SD-Werte der Einzelmessungen von tNAA, mI, tCr und tCh waren gering, die Messergebnisse können daher als zuverlässig angesehen werden. Die tNAA-Konzentrationen in beiden Gruppen unterschieden sich weder in der grauen noch in der weißen Substanz signifikant voneinander. Im Hirnrindenvolumen zeigte sich bei den Patienten jedoch eine positive Korrelation von tNAA und MMSE-Ergebnis, also eine Reduktion von tNAA mit zunehmenden kognitiven Einbußen. Dies spricht für eine Abnahme des neuronalen Volumenanteils mit fortschreitender Erkrankung. Der durchschnittliche myo-Inositolgehalt im Marklagervolumen lag in der Patientengruppe um 20% höher als bei den Probanden. Der Unterschied erreichte jedoch kein Signifikanzniveau (p = 0,09). Im Rindenvolumen war die mittlere myo-Inositolkonzentration bei den Patienten um 7% höher als in der Kontrollgruppe, auch hier war der Unterschied nicht signifikant. Der nichtsignifikante myo-Inositolanstieg lässt sich als mäßige entzündliche oder reaktive Gliaproliferation interpretieren. Die tCr-Konzentrationen in beiden Gruppen unterschieden sich nicht, jedoch bestand bei den DAT-Patienten eine positive Korrelation des tCr-Gehalts mit der MMSE-Punktzahl in der grauen Substanz des Parietallappens, die Konzentration nahm also mit zunehmendem Schweregrad der Demenz ab. Bei der durchschnittlichen tCh-Konzentration bestanden keine Gruppenunterschiede in den untersuchten Regionen. Die Patienten wiesen eine signifikante Zunahme des mittleren Liquoranteils um 16% im kortikalen Volumen auf. Dies ist als kortikale Hirngewebeatrophie in frühen und mittleren Stadien der DAT zu werten. Während die in vivo-Konzentrationen von tNAA, mI, tCr und tCh zuverlässig bestimmt werden konnten, war die Messung von Glutamat und Glutamin bei 1,5 T mit technischen Schwierigkeiten verbunden. Wegen der hohen Standardabweichungen konnte aus dieser Untersuchung keine gesicherte Aussage zu einer möglichen Konzentrationsänderung dieser Aminosäuren bei der DAT abgeleitet werden. Es ist zu erwarten, dass hier durch MR-Geräte mit 3 T Feldstärke sowie durch den Einsatz der parallelen Bildgebung ein erheblich höheres Signal/Rausch-Verhältnis und damit genauere Ergebnisse erzielt werden können.
In dieser klinischen Phase I-Studie an 39 gesunden, männlichen Probanden im Alter zwischen 18 und 45 Jahren wurde die Fragestellung untersucht, wie ein Übergang von intravenöser Blutgerinnungshemmung mit dem direkten Thrombinhemmer Argatroban und den oralen Antikoagulantien Phenprocoumon und Acenocoumarol in der klinischen Praxis zu kontrollieren ist. Bei den bisher verwendeten Laboruntersuchungen, wie der aPTT existieren Interaktionen zwischen Argatroban und oraler Antikoagulation, welche nicht notwendigerweise die wirkliche in vivo Situation reflektieren, was durch eine ex vivo-in vitro-Interferenz des Gerinnungsassays verursacht wird. APTT Reagenzien aktivieren die intrinsische Gerinnungskaskade zu einem sehr frühen Zeitpunkt (gleich zu Beginn derselben bei Faktor XI). Dadurch werden die Interaktionen zwischen der oralen Antikoagulation und den Rückkopplungsmechanismen zwischen beiden Gerinnungswegen, welche durch die orale Antikoagulation teilweise erschöpft sind, begreifbar. Ebenso wurde die Interaktion zwischen anderen direkten Thrombinhemmern und der oralen Antikoagulation am Beispiel Napsagatran mit Warfarin beschrieben 35: Die Gabe von Napsagatran alleine führte zur Erhöhung von aPTT und Prothrombinzeit (PT), die zusätzliche Einmaldosis Warfarin erhöhte die AUEC (Fläche unter der Effekt-Kurve) für die PT zusätzlich um das vierfache und für die aPTT um 45%. Obwohl die PT unter dem Einfluss direkter Thrombinhemmer verlängert ist, wird sie nicht als Parameter des Monitorings der Wirkung therapeutischer Dosierungen von Argatroban und anderen direkten Thrombinhemmern bei der Thrombosephrophylaxe und Behandlung tiefer Beinvenethrombosen empfohlen 39. Die aPTT wird hingegen, neben ihrem Einsatz zur Überwachung der klinischen Therapie direkter Thrombinhemmer 40,41, auch als pharmakodynamischer Schlüsselparameter in Phase-I-Studien derselben eingesetzt 42,43. Da jedoch höhere Konzentrationen der Thrombinhemmer die aPTT-Werte für die Kalibrierung verändern und darüber hinaus verschiedene aPTT-Reagenzien mit unterschiedlicher Empfindlichkeit gegenüber den Thrombinhemmern angeboten werden, ist die aPTT nicht der ideale Parameter zur Überwachung der Wirkung direkter Thrombinhemmer. Die ECT ist hierfür wesentlich spezifischer 40,41. Dennoch werden validierte ECT-Assays nicht kommerziell vertrieben, was deren Einsatz in der Klinik bisher unmöglich macht. Insofern ist es notwendig geworden, eine Empfehlung für den Übergang von intravenöser auf orale Antikoagulation mit dem bisherigen Instrument der INR zu finden. Auch wenn dies aus den o.g. Gründen nicht optimal ist, mag es zulässig sein, die Nomogramme für Acenocoumarol und Phenprocoumon in einfache Regeln zu übersetzen, ohne daß ein Sicherheitsproblem in der Klinik entsteht. Vorausgesetzt, ein Vorhersagefehler von <± 0,6 wird als annehmbar akzeptiert, 35 so erlaubt das Nomogramm für Phenprocoumon und Acenocoumarol eine valide Vorhersage der realen Gerinnungsverhältnisse bis zu einer Dosis von 2,0 µg/kg/min unter Verwendung eines ISI von 1-2. Derzeitige Richtlinien für die Hepariniserung nach tiefer Beinvenenthrombose 47 erlauben den Stopp der Infusionstherapie mit niedermolekularen Heparinen (bei gleichzeitiger Gabe einer oralen Antikoagluation), wenn der INR wenigstens 2,0 erreicht hat. Um den Übergang von Argatroban zu einer oralen Antikoagulation zu vereinfachen, wird eine Regel für die Berechnung der "wahren" INR während der Übergangsperiode vorgeschlagen: 1. Die Argatrobaninfusion kann eingestellt werden, wenn unter gleichzeitiger oraler Antikoagulation die INR für einen angemessenen Zeitraum der Komedikation bei 4,0 angekommen ist. Das gilt für einen ISI des PT-Reagens von 1-2. Die reale INR befindet sich dann im therapeutischen Bereich zwischen 2,2 und 3,7. 2. aPTT-Ergebnisse unter Argatroban und beginnender oraler Antikoagulation müssen um 5-15 Sekunden verkürzt abgelesen werden. Die Verlängerung der aPTT während des Übergangs von Argatroban auf die oraler Antikoagulation sollten nicht zu einer Unterbrechung bzw. Dosiserniedrigung der Argatroban-Infusion während dieses Zeitraums führen. Prinzipiell sollte die Dosis von Argatroban während der Übergangszeit auf die orale Antikoagulation bei 1-2 µg/kg/min fixiert werden. Genauso wie bei Hirudin 48 sollte die ECT, wenn klinisch angezeigt, zur Überwachung der direkten Argatroban-Effekte auf die Gerinnung benutzt und hierbei der aPTT als Alternative vorgezogen werden. Das gilt sowohl für die Anwendung von Argatroban alleine als auch die Kombination mit oralen Antikoagulanzien. Wie bereits oben erwähnt steht die ECT als validierte Messmethode für die Klinik bisher jedoch nicht zur Verfügung. Die Blutungszeit war in dieser Untersuchung in der Periode der Umstellung von Argatroban auf orale Antikoagulation nicht wesentlich verlängert, so daß für Patienten keine zusätzliche Blutungsgefahr entstanden ist. Einschränkend ist dennoch zu bemerken, daß obwohl in den erwähnten Phase-I-Untersuchungen an gesunden Probanden keine größeren Blutungsereignisse aufgetreten sind, bei Patienten durchaus ein erhöhte Blutungsgefährdung bei einer INR von > 3,0 bestehen kann. Dies ist in der Praxis aufmerksam zu kontrollieren. Argatroban ist also für HIT Typ II-Patienten, die unter klinischen Bedingungen antikoaguliert werden müssen, eine gut steuerbare Alternative, bei welcher auch die anschließende Umstellung auf orale Antikoagulation kontrolliert sicher handhabbar ist.
Für Hepatitis-Viren sind für Westeuropa im allgemeinen und Deutschland im besonderen niedrige bis sehr niedrige Belastungen dokumentiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Prävalenz der serologischen Marker der verschiedenen Erreger in Proben, die dem Institut für Medizinische Virologie der Universitätsklinik Frankfurt am Main vorgelegt wurden, untersucht. Aus den Jahren 1995 - 2002 wurden 220.468 Tests auf Hepatitis-Virus-Antikörper sowie HBs-Antigen und HGV-RNA in die Analysen einbezogen. Dabei ließ sich ein starker Rückgang der jährlichen Testzahlen vom Höchststand in 1996 mit 30.566 auf nur noch 20.435 in 2002 (-33%) belegen. Außerdem wurden die Präferenzen bei den einzelnen Erregern deutlich: 98% aller Untersuchungen entfielen auf die Hepatitis-Viren A-C und ganze 4.114 Tests auf die Viren D-G. Bei der Hepatitis-A-Infektion, die fast immer folgenlos ausheilt und eine lebenslange Immunität hinterlässt, spiegelten die Antikörper-Prävalenzen die kumulative Wahrscheinlichkeit für den Erregerkontakt mit einem altersabhängig hohen Gesamtdurchschnitt (48,02%) wider. Der Nachweis von viralem Antigen bzw. Genom zeigte die aktuelle Infektionslage (für HBV mit 3,9% und HGV mit 6,06%). Bei Erkrankungen, die zu einem komplizierten Verlauf neigen und/oder keine langfristige Immunität hinterlassen, standen unterschiedliche Antikörper-Prävalenzen für das jeweilige Risiko (im Mittel HBV 19,15%, HCV 11,51%, HDV 6,55%, HEV 3,98%). Diese Zahlen liegen über den in anderen Untersuchungen für die deutsche Gesamtbevölkerung angegebenen Werten. Das ist insofern nicht verwunderlich, als hier kein Normalkollektiv untersucht wurde, sondern belastete Probanden, bei denen bereits eine Infektion vermutet wurde oder die einer erhöhten Infektionsgefahr ausgesetzt waren. Die Auswertung der Daten für spezifische Risikogruppen belegte die höhere Belastung von HIV-Positiven und i.v. -Drogenabhängigen für fast alle Hepatitis-Viren, während sich für Empfänger von Organen, Blut- und Blutprodukten vielfach eine unterdurchschnittliche oder zumindest eine gegenüber früheren Untersuchungen gesunkene Belastung als Bestätigung für vorgeschriebene Screening-Methoden zeigte. Ein ähnliches Bild bot das medizinische Personal, das lediglich bei den akuten HBV-Erkrankungen über dem Durchschnitt lag. Die Aufnahme der Hepatitis-B-Impfung in den Impfkalender der STIKO (Ständige Impfkommission am Robert-Koch-Institut) zeigte schon in den ersten acht Jahren einen beachtlichen Erfolg: bereits in dieser kurzen Zeit stieg die Anti-HBs-Prävalenz bei den Unter-10-Jährigen von anfangs 21,53% auf 82,50%. Dabei hatten in 1995 lediglich 40% die Antikörper durch eine Immunisierung, folglich 60% aufgrund einer Infektion entwickelt. Bis zum Jahr 2002 verschob sich dieses Verhältnis auf 96,49% vs. 3,51% zu Gunsten der Impfung.
Unter dem Aspekt der steigenden Inzidenz der Syphilis und häufiger Komorbidität mit HIV-Infektion sowie zahlreicher Berichte über atypische klinische und serologische Befunde bei HIV-infizierten Syphilispatienten wurde in einer prospektiven Studie eine Gruppe (1) von 29 HIV-positiven Patienten (26 Männer und 3 Frauen, Alter median 33 J.) mit einer Gruppe (2) von 28 HIV-negativen Patienten (24 Männer, 4 Frauen, Alter median 32 J.), die alle eine aktive, therapiebedürftige Syphilis hatten, unter standardisierter Therapie bezüglich serologischer und klinischer Verläufe sowie des Therapieerfolges verglichen. Über 50 % aller männlichen Patienten (76 % in Gruppe 1, 25 % in Gruppe 2) gehörten zu der Risikogruppe der Männer die Sex mit Männern haben. Bei HIV-Infizierten kam eine Syphilis latens häufiger als in der Kontrollgruppe vor (41 % vs. 21 % / p = 0,09; n.s.). Syphilis maligna kam ausschließlich bei zwei HIV-Infizierten vor, und trat bei CD4+ Zellzahlen von 494/µl bzw. 390/µl auf. HIV-Patienten mit primärer und sekundärer Syphilis sowie mit Neurosyphilis zeigten ansonsten die gleichen klinischen Symptome wie die Patienten der Kontrollgruppe. Bei HIV-Patienten wurden anamnestisch signifikant häufiger andere STDs als bei nicht HIV-Infizierten gefunden (34,5 % vs. 10,7 % / p < 0,05). Bei HIV-Infizierten wurden falsch negative Seroreaktionen im VDRL-, 19s IgM-FTA-Abs-, IgG-FTA-Abs- und TPHA-Tests registriert. Zum einen traten diese Befunde bei CD4+Zellzahlen <500 auf, und waren daher vermutlich mit der HIV-bedingten Immundefizienz assoziiert. Zum anderen hatten diese Patienten gehäuft eine Syphilis latens, bei der die serologischen Befunde von den frühen klinischen Stadien der Syphilis abweichen können. Extrem hohe TPHA-Titer (größer gleich 1:10240) wurden in hohem Anteil (>30 %) in beiden Gruppen beobachtet. Sie fielen vor allem bei Patienten mit neurologischer Beteiligung in beiden Gruppen auf. Eine Seroreversion des TPHA-Titers, die gleichzeitig ein Verschwinden der Seronarbe bedeutet, konnten wir ausschließlich bei HIV-positiven Patienten finden (n=3 Patienten). Ein nicht reaktiver TPHA-Test schließt bei HIV-Patienten eine frühere Syphilisinfektion nicht aus, weswegen bei diesen Patienten ein TPHA-Test alleine als Screening nicht ausreicht. Bei HIV-negativen Patienten wurden häufiger niedrigere, bei HIV-Infizierten häufiger höhere TPHA-Titer gefunden. Eine frühe serologische Antwort auf die Therapie (mindestens zweifacher Titerabfall im VDRL-Test drei Monate nach Therapiebeginn) war bei HIV-negativen Patienten (75 % vs. 55 %) häufiger zu finden als bei den immundefizienten HIV-Patienten. Ein gehäuftes Vorkommen von Neurosyphilis konnten wir bei den HIV-infizierten Patienten nicht finden. Eine Beteiligung des ZNS bei frühen Formen der Syphilis wird auch bei nicht HIV-Infizierten beobachtet. Die klinische Relevanz ist ungeklärt. Nicht immer führt die Liquorpunktion zu einer klaren Aussage. Sie sollte dennoch bei allen Syphilispatienten mit neurologischen Symptomen, bei ausbleibendem Titerabfall nach einer Therapie und bei ungewöhnlichen klinischen und serologischen Manifestationen erfolgen. Am Ende der einjährigen Nachbeobachtungszeit wurde kein klinisch definierter, aber ein serologisch definierter Therapieversager in der HIV-infizierten Gruppe diagnostiziert. Alle HIV-negativen Patienten waren sowohl klinisch als auch nach serologischen Kriterien erfolgreich therapiert. Die aktuellen Therapieempfehlungen der DSTDG sind auch bei HIV-infizierten Patienten wirksam. Eine erkennbare Verschlechterung der HIV-Infektion (deutliche Abnahme der CD4+T-Zellzahl) konnten wir bei den HIV-Patienten im ersten Jahr nach Therapiebeginn nicht beobachten.
Aufgrund der raschen Fortschritte in der Entwicklung der Informationstechnologie kann der Staat mit immer geringerem Aufwand immer schwerwiegender in Grundrechte eingreifen. Bei der staatlichen Überwachung der Telekommunikation stehen sich Sicherheits- und Freiheitsinteressen gegenüber. Durch die kontinuierliche Ausweitung der Überwachungsbefugnisse in den vergangenen Jahrzehnten konnten sich die Sicherheitsinteressen immer weiter in den Vordergrund schieben. Inzwischen ist die vorsorgliche Speicherung sämtlicher Telekommunikations-Verkehrsdaten in der Diskussion. Angesichts der allgemeinen Entwicklung hin zu mehr Überwachung, deren Ende nicht absehbar ist, ist es für eine freiheitliche Gesellschaft von größter Bedeutung, ob dem staatlichen Zugriff auf die Telekommunikation in Deutschland rechtliche Grenzen gesetzt sind und welche dies sind. Der Autor beschreibt aus Sicht des Staates, der Bürger und der betroffenen Unternehmen das Konfliktfeld, in dem sich Regelungen über den staatlichen Zugriff auf Telekommunikationsdaten bewegen. Anschließend werden die rechtlichen Anforderungen an staatliche Zugriffe auf Telekommunikationsdaten diskutiert und entwickelt. Hierbei geht der Autor exemplarisch auch darauf ein, ob vorhandene und geplante Regelungen und Verfahren diesen Anforderungen gerecht werden. Vertieft wird die rechtliche Zulässigkeit einer generellen Vorratsspeicherung von Telekommunikations- Verkehrsdaten unter dem Aspekt der Freiheitsgrundrechte und des Gleichheitssatzes erörtert. Der Autor stellt fest, dass eine generelle Vorratsspeicherung von Telekommunikations- Verkehrsdaten aus mehreren Gründen mit dem Grundgesetz und der Europäischen Menschenrechtskonvention unvereinbar ist. Weil diese Unvereinbarkeit insbesondere in der Verdachtsunabhängigkeit einer generellen Verkehrsdatenspeicherung begründet ist, besteht sie unabhängig von der inhaltlichen Ausgestaltung einer solchen Regelung im Einzelnen. Nach Auffassung des Autors liegt keine besondere Dringlichkeitssituation vor, in der die sofortige Einführung einer generellen Verkehrsdatenspeicherung geboten wäre.
Rumination im Alltag : Inhalte, Verlauf, Vorhersage und klinische Aspekte gedanklicher Bewältigung
(2004)
Unerwünschte wiederkehrende Gedanken - gewissermaßen gedankliches Wiederkäuen - werden auch als Rumination bezeichnet. Rumination kann harmlose Selbsterinnerung an noch zu erledigende Aufgaben beinhalten, aber auch bis hin zu klinisch bedeutsamen Symptomen reichen. Entsprechend gilt Rumination je nach theoretischem Ansatz beispielsweise als instrumentell im Dienste der Zielerreichung (Martin & Tesser, 1996a; 1996b) oder als maladaptive Bewältigung von dysphorischer oder depressiver Verstimmung (Nolen-Hoeksema, 1991; 1996). Da in den meisten bislang vorliegenden Studien jedoch entweder indirekte Indikatoren für Rumination oder aber Fragebögen zur Ruminationsneigung verwendet wurden, lagen ökologisch valide Daten zur spontan auftretenden Rumination im Alltag bislang kaum vor. Hierzu haben wir vier Studien durchgeführt. In der ersten Studie wurde das Ruminationsverhalten von N = 46 Studienanfängern mittels der aus Alltagsbewältigungsforschung und Therapie bekannten strukturierten Tagebücher untersucht. Der Anteil ruminativer Strategien an der Bewältigung negativer Alltagsereignisse lag je nach zugrundeliegender Ruminationsdefinition bei 28 bis 33%. Zur Vorhersage aktueller Rumination wurden aus den Ruminationstheorien von Martin und Tesser (1996a; 1996b) sowie Nolen-Hoeksema (1991; 1996) Hypothesenmodelle abgeleitet. Ein von uns vorgeschlagenes drittes Hypothesenmodell berücksichtigte mit Appraisal aus dem Bewältigungsmodell von Lazarus (1991; 1993) auch ein kognitives Element. Hierarchisch lineare Datenanalysen ergaben theoriekonforme Belege für die Bedeutung von Zielen und Dysphorie in der aktuellen, spontanen Rumination. Die beste Varianzerklärung gelang jedoch unter Einbeziehen des Appraisal im dritten Hypothesenmodell. Dieses Modell ließ sich anhand der Daten aus Studie II replizieren. Außerdem wurden bei den N = 72 Studienanfängern der zweiten Studie zusätzlich Dauer, Inhalte und Beurteilung des Nachdenkens erfasst und im Hinblick auf theoretische Grundannahmen diskutiert. In Studie III wurde die Bewältigung bei N = 54 Opfern eines Wohnungseinbruches untersucht. Hierbei zeigte sich nach 4 Wochen erwartungsgemäß ein Nachlassen der Rumination über den Einbruch bei gleichzeitiger Normalisierung des subjektiven Wohlbefindens. Die Befunde dieser drei Studien deuten darauf hin, dass Rumination eine bei gesunden Normalpersonen häufig eingesetzte alltägliche Bewältigungsstrategie ist. Trotz ihrer Zusammenhänge mit Dysphorie lassen sich keine längerfristig maladaptive Folgen der Rumination, wie Nolen-Hoeksema (1991; 1996) sie postuliert, nachweisen. Kognitive Ereignisbeurteilungen haben einen größeren Einfluss auf die Alltagsrumination als die in der Theorie von Martin und Tesser (1996a; 1996b) ins Zentrum gerückten Ziele. Die Angemessenheit der Ruminationsmodelle für die Alltagsrumination wird diskutiert. Studie IV schließlich untersuchte die Rumination von N = 50 stationär behandelten AlkoholEntgiftungspatienten. Hinsichtlich Dauer und Bewertung des Nachdenkens unterschieden sich die Patienten deutlich von den Studenten aus Studie II. Nach einem Katamnesezeitraum von 3 Monaten ließ sich bei den abstinent gebliebenen Patienten eine ähnliche Verringerung von Ruminationsneigung, Depressivität und negativem Befinden nachweisen, wie sie Hoyer, Heidenreich und Fecht (2000) bei langzeittherapierten Alkoholpatienten gefunden hatten. Die später abstinent bleibenden Patienten zeichneten sich zudem - gemessen an den weiter oder wieder Alkohol konsumierenden Patienten - bereits am Ende des Klinikaufenthaltes durch eine „kritischere“ Einstellung zum eigenen Nachdenken aus. Die explorative, prospektive Regressionsanalyse auf das Kriterium Abstinenz ergab, dass von Parametern der Rumination eine fast ebenso hohe Varianzerklärung ausging wie von „harten“ krankheitsbezogenen Daten. Hohe Ruminationsneigung sowie eine positive Einstellung zur aktuellen Rumination sind demnach prognostische Faktoren, die einen fortgesetzten Alkoholkonsum fördern. Die Ergebnisse werden im Hinblick auf therapeutische Implikationen diskutiert.
Bei der hier vorgelegten Untersuchung wird die Serumkonzentrationen des Akute-Phase-Proteins Lipopolysaccharid-binding Protein (LBP) in einem Normalkollektiv und in Patientenkollektiven mit rheumatoider Arthritis (RA) und systemischem Lupus erythematodes (SLE) evaluiert. Neben dem Vergleich mit etablierten Akute-Phase-Markern, CRP und BSG, wurde der Bezug zu krankheitsrelevanten Laborparametern und Prognosefaktoren, den radiologischen Veränderungen bei der RA und der Nierenbeteiligung beim SLE, untersucht. Im Normalkollektiv beträgt der Referenzwert für LBP mit dem hier verwendeten Immunoassay von DPC Biermann 5,9 ± 4,1 ? g/ml, die absoluten Werte lagen zwischen 1,5 und 12,4 ? g/ml im Serum. Es konnten keine geschlechtsspezifischen Unterschiede gefunden werden. Lediglich in der Population von 50-59-jährigen Männern war eine signifikante Erhöhung der LBP-Werte nachzuweisen. Im Patientenkollektiv mit rheumatoider Arthritis lagen die Serumkonzentrationen für LBP zwischen 2,9 - 26,4 ?g/ml, beim SLEKollektiv zwischen 2,9 – 15,5 ?g/ml. Die mittleren Serumkonzentrationen von LBP lagen damit in beiden Patientenkollektiven signifikant höher als im Normalkollektiv. Im Vergleich von LBP mit den Akute-Phase-Markern CRP und BSG der 1. und 2. Stunde konnten in den beiden untersuchten Patientenkollektiven jeweils hochsignifikante Ergebnisse nachgewiesen werden, p<0,0001. Bei den Aktivitätsparametern des SLE war eine signifikante Korrelation von LBP mit den Leukozytenwerten nachweisbar (r=0,324, p=0,014). Für C3, dsDNS-Antikörper und Thrombozyten ergaben sich keine signifikanten Korrelationen mit LBP. Die LBP-Konzentration im Serum von RA-Patienten korreliert signifikant mit den radiologischen Veränderungen, gemessen am Larsen- und Ratingen- Score. Diese Korrelation beträgt r=0,260, p=0,009 für den Larsen-Score und r=0,244, p=0,014 für den Ratingen-Score. Beim systemischem Lupus erythematodes konnte keine Korrelation von Lipopolysaccharid-binding Protein und der Nierenbeteiligung gezeigt werden. Sowohl in der Höhe der LBP-Werte, als auch in den dargestellten Korrelationen zeigen sich Unterschiede zwischen den Patientenkollektiven. Die mittleren LBP-Serumkonzentrationen sind beim Patientenkollektiv mit RA signifikant höher als beim SLE-Kollektiv. In beiden Patientenkollektiven finden sich aber gleich hohe Korrelationen zwischen LBP und den Akute- Phase-Markern, CRP und BSG. Diese Arbeit trägt zum besseren Verständnis der durch Lipopolysaccharidbinding Protein dargestellten Akute-Phase-Reaktion bei den beiden relativ häufigen rheumatischen Systemerkrankungen, der rheumatoiden Arthritis und dem systemischen Lupus erythematodes, bei. Dabei wurde auf die für die beiden Erkrankungen wichtigen prognostischen Parameter und den Schweregrad, gemessen an der Erosivität der RA und der Nierenbeteiligung beim SLE, eingegangen. Weitere Untersuchungen mit seriellen Messungen von Lipopolysaccharidbinding Protein erscheinen in beiden Patientenkollektiven erforderlich. Damit könnte die Gleichwertigkeit oder sogar Überlegenheit hinsichtlich der prädiktiven Aussagefähigkeit von LBP gegenüber CRP in Bezug auf die Krankheitsaktivität und –prognose der rheumatoiden Arthritis nachgewiesen werden. Beim systemischen Lupus erythematodes liefern Subgruppen mit Serositis, Synovialitis und Infektionen aufgrund der stärker aktivierten Akute- Phase-Reaktion vermutlich interessante Ansätze.
Charakterisierung der alternativen NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (NDH2) aus Yarrowia lipolytica
(2004)
Neben dem protonenpumpenden Komplex I (NDH-1) der Atmungskette besitzt die obligat aerobe Hefe Yarrowia lipolytica eine alternative NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH-2). Diese Enzyme, die in den Atmungsketten von Pflanzen, Pilzen und Bakterien vorkommen, bestehen aus nur einer Untereinheit, führen jedoch dieselbe Reaktion aus wie Komplex I, nämlich die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon, wobei allerdings keine Protonen über die Membran transloziert werden. Nur peripher mit der Membran assoziiert, können alternative Dehydrogenasen entweder zur cytosolischen Seite (extern) oder zur Matrixseite (intern) orientiert sein. Y. lipolytica besitzt im Gegensatz zu anderen Ascomyceten nur eine einzige extern orientierte alternative Dehydrogenase mit einer vorhergesagten Masse von ca. 60 kD und einem nicht kovalent gebundenem Molekül FAD als Cofaktor. Durch Fusion des Leserasters mit der Präsequenz der 75 kD Untereinheit von Komplex I war die interne Expression des Enzyms (NDH2i) gelungen, die das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten ermöglichte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die alternative Dehydrogenase von Y. lipolytica innerhalb ihrer natürlichen Membranumgebung charakterisiert. Das Enzym reagierte mit verschiedenen Chinonanaloga, wobei mit dem hydrophilen Q1 eine höhere katalytische Rate erzielt wurde als mit DBQ, das dem natürlich vorkommenden Q9 am ähnlichsten ist. Da hydrophobe Substrate fast ausschließlich in der Lipidphase der Membranen gelöst vorliegen, musste bei der Bestimmung von kinetischen Parametern (ebenso wie bei Komplex I) auf eine gleichbleibend große Membranphase im Messvolumen geachtet werden. Mit dem standardmäßig benutzten Substrat DBQ reagierte YLNDH2 nach einem Ping-Pong Reaktionsmechanismus. Dieser beschreibt eine abwechselnde Bindung der beiden Substrate, wobei das Enzym die Elektronen von NADH aufnimmt (E-FADH2) und an Ubichinon weitergibt (E-FAD); es existiert kein ternärer Enzym-Substrat Komplex. Gestützt durch Kristallstrukturen des analogen Enzyms QR1 mit NADPH bzw. mit Durochinon, liegt die Vermutung nahe, dass beide Substrate in ähnlicher Weise und sehr wahrscheinlich in der gleichen Bindungstasche binden. Ein Ping-Pong Reaktionsmechanismus wurde bereits für die NADH:DCPIP Oxidoreduktase Aktivität von zwei weiteren alternativen Enzymen postuliert, jedoch noch nie für ein physiologisches Substrat. Als bislang wirksamster Inhibitor für alternative Dehydrogenasen wurde 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1H)chinolon (HDQ) entdeckt. HDQ hemmte NDH2 in Membranen aus Y. lipolytica mit einer I50 von 200 nM, was der 500fachen Hemmwirkung des gängig verwendeten Flavon auf das isolierte Enzym NDI1 von S. cerevisiae entspricht. Allerdings hemmte HDQ auch Komplex I mit einer I50 von 2 µM, ähnlich wie es bei Platanetin in Pflanzenmitochondrien der Fall war [Roberts et al., 1996]. Mit dem Ziel, ein polyklonales Antiserum gegen die native YLNDH2 zu generieren, wurde das Enzym in E. coli heterolog exprimiert. Die Expression führte zur Bildung von Einschlusskörpern, aus denen das rekombinante Enzym unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und zur Immunisierung eines Kaninchens verwendet werden konnte. Das Antiserum kreuzreagierte mit der nativen und der internen Version von YLNDH2 und zeigte nur wenige unspezifische Bindungen. Es wurde gezeigt, dass Y. lipolytica Stämme ohne NDH2 und Komplex I mit NDH2i als einziger Dehydrogenase erzeugt werden konnten. In N. crassa war der Versuch, NDE2 und Komplex I gleichzeitig zu deletieren, gescheitert, was zu der Schlussfolgerung führte, dass sich die beiden Enzyme in diesem Organismus möglicherweise kompensieren könnten. Dies war in Y. lipolytica ausgeschlossen worden, da wahrscheinlich kein (oder nur unzureichender) Austausch zwischen matrixständigem und cytosolischem NADH stattfindet. Die zielgerichtete Mutagenese hochkonservierter Bereiche im offenen Leserahmen von YLNDH2 lieferte das eindeutige Ergebnis, dass die zweite der beiden beta-alpha-beta-Bindungsdomänen NADH binden muß, da sich der KM Wert für NADH bei Mutation des essentiellen sauren Restes E320 dratisch erhöhte. Alle Mutationen, die die Dinukleotid Bindungsdomäne I betrafen, die danach folgerichtig den Cofaktor FAD binden muß, führten zu einem vollständigen Verlust von NDH2. Dieselbe Zuordnung der Bindungsstellen war bereits von Björklöf et al. [2000] vorgeschlagen worden. Eine Chinonbindungstelle konnte durch Mutagenese der beiden apolar/aromatischen Bereiche der Sequenz nicht identifiziert werden. Die Modifikation des C-Terminus von NDH2i führte zu nicht mehr messbarer Aktivität und stark verringerter Expression des Enzyms in mitochondrialen Membranen (siehe Anhang 7.5.1.1). Es kann daher vermutet werden, dass der C-Terminus für die korrekte Faltung eine wichtige Rolle spielt, möglicherweise sogar bei der Membranassoziation, wie bei Rasmusson [1999] vorgeschlagen wurde. Interessant war in diesem Zusammenhang, dass die C-terminal modifizierte NDH2i trotzdem das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten bzw. das Wachstum auf DQA ermöglichte. In Membranen, die einen unterschiedlichen Gehalt an NDH2, jedoch die gleiche Gesamtmenge an Protein enthielten, wurde eine unerwartete lineare Abhängigkeit zwischen KM und Vmax Werten beobachtet. Dieses Phänomen wurde mit dem Modell der externen Diffusionslimitierung beschrieben, die in ähnlicher Weise auch bei immobilisierten Enzymen auftritt. Danach wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von YLNDH2 sowohl durch die kinetisch kontrollierte Rate, als auch durch die Transportrate des Ubichinons bestimmt, das aus der Membran heraus in die wässrige Umgebung des katalytischen Zentrums gelangen muss. Aus diesem Grund ist nicht nur die Maximalgeschwindigkeit, sondern auch die Michaelis Menten Konstante KM abhängig vom Gehalt des Enzyms in Membranen. Dies führte bei niedrig exprimierten mutanten Enzymen zur gleichzeitigen Abnahme von KM und Vmax. Eine externe Diffusionskontrolle der enzymatischen Reaktion wurde auch für Komplex I, dessen Reaktionszentrum im peripheren Arm vermutet werden kann, aber nicht für Komplex III aus S. cerevisiae, dessen Chinonbindungsstellen sich definitiv in hydrophober Umgebung befinden, beobachtet.
Eine Lavage mit exogenem Surfactant, Perfluorcarbonen alleine oder in Kombination mit der partiellen Flüssigkeitsbeatmung, jeweils mit HFOV, verbessert den pulmonalen Gasaustausch im Modell des MAS bei Ferkeln. In unserem Betrachtungszeitraum von vier Stunden erwies sich die Surfactant Lavage bezüglich des Gasaustausches als die beste Therapie. Eine Perfluorcarbonlavage alleine oder in Kombination mit der PLV erreicht nicht die PaO2-Werte einer Surfactantlavage. Der negative Einfluss einer Mekoniumaspiration auf die Hämodynamik der Versuchstiere der Kontrollgruppe konnte klar dargestellt werden. Innerhalb der Therapiegruppen gibt es während einer Betrachtung von vier Stunden keine wesentlichen Unterschiede in der hämodynamischen Entwicklung der Tiere. Arbeiten, die sich mit den Langzeitveränderungen der systemischen Hämodynamik bei der Therapie des MAS mit Surfactant, PFC, und PLV beschäftigen, müssen folgen. Es konnte in allen Therapiegruppen eine über den Betrachtungsverlauf stabile Hämodynamik (z.B. MABP, Puls, Cardiac Index) und ein stetiger Anstieg des PaO2 ermittelt werden. Zudem war das HZVi zum Zeitpunkt t=240 in allen Therapiegruppen signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Die PFC-Lavage Gruppe zeigte nach vier Stunden das signifikant größte ITBVi und schützt vermutlich in Form einer Pufferfunktion in den Alveolen vor „air-trapping“, Pneumothorax und weiteren Lungenschäden beim MAS. Vor allem in Kenntnis der Pathophysiologie des MAS ist dies ein nicht zu unterschätzender Faktor. Wirkliche Langzeiterfahrungen am menschlichen Neonaten stehen leider noch nicht zur Verfügung. Es zeigten sich bei den untersuchten Therapiestrategien keine negativen Auswirkungen auf die protokollierten hämodynamischen Parameter. Früher publizierte Arbeiten, welche den Indikator GEDVi als Vorlastparameter zur Volumensteuerung empfehlen, konnten wir nicht bestätigen. Der positive Einfluss der untersuchten Therapieformen auf das pulmonale Gefäßbett konnte durch den Verlauf des PBV/EVLW Verhältnisses, welches ein Maß für die pulmonalvaskuläre Permeabilität darstellt, nachgewiesen werden.
Inhalt der vorliegenden Forschungsarbeit ist die Entwicklung und Validierung von Trainingsempfehlungen an jugendliche Basketballspieler für das Konditionstraining. Am Beispiel Basketball wurde das Forschungsziel verfolgt, ein Modell zu erarbeiten, dass die diagnostische Betreuung des Konditionstrainings von jugendlichen Mannschaftssportlern ermöglicht. Die Untersuchung am Institut für Sportwissenschaften (IfS) der Johann Wolfgang Goethe — Universität Frankfurt am Main als Diagnosezentrum erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Basketball-Teilzeit-Internat Langen (BTI) als Trainingsinstitution. Die 35 jugendlichen Versuchspersonen waren weibliche und männliche D-und C-Kaderspieler des Hessischen Basketball Verbandes (HBV) und des Deutschen Basketball Bundes (DBB) im Alter von 13 bis 17 Jahren, die zusätzlich zum eigenen Vereinstraining, im BTI zwei- bis dreimal in der Woche individuell trainierten. Das erste Teilziel war die Auswahl einer Merkmalsstichprobe. Dabei mussten die Diagnosemöglichkeiten am IfS genauso wie die zeitlichen und ökonomischen Rahmenbedingungen des BTI-Trainings beachtet werden. Zudem musste eine für den Basketballsport adäquate Auswahl von konditionellen Leistungsfähigkeiten erfolgen, wofür eine detaillierte Betrachtung der Belastungs- und Beanspruchungsanforderungen im Jugendbasketball nötig war. Das entsprechende Literaturstudium deckte erhebliche Forschungsdefizite im Bereich der Belastungsanforderungen auf, was zunächst dazu führte, dass im Rahmen einer ersten Hauptuntersuchung eine Belastungsanalyse von Jugendbasketballspielen durchgeführt wurde. Nach der Entwicklung eines geeigneten wissenschaftlichen Beobachtungsinstruments, wurden allgemeine Spielmerkmale und Spielzeitstrukturen in je 20 Basketballspielen von Jungen- und Mädchenmannschaften der hessischen U16 Jugendoberliga (Saison 1999/00) systematisch beobachtet und ausgewertet. Beobachtungen von individuellen Belastungen und Spielleistungen erfolgten für jedes Geschlecht anhand von jeweils zehn Basketballspielen derselben Leistungs- und Altersklasse. Damit wurden in knapp 830 effektiven Spielminuten na. die zurückgelegten Laufstrecken, Sprunghäufigkeiten und die Anzahl der Ballaufsetzer (Dribbling) sowie die Anzahl von Pass-, Fang- und Wurfaktionen von jugendlichen Basketballspielern während eines Wettkampfspiels quantitativ erfasst. Die Beobachtungsergebnisse wurden in einem Belastungs- und Beanspruchungsprofil der Spielsportart Basketball mit den Ergebnissen von Forschungsarbeiten zur Beanspruchungsstruktur im Basketball zusammengefasst. Dies bildete gemeinsam mit der Analyse der Trainingsmöglichkeiten im BTI die Grundlage bei der Auswahl der zu untersuchenden konditionellen Fähigkeiten (Merkmalsstichprobe) und den dazu passenden Diagnosetests. Verschiedene kraftdiagnostische Testverfahren waren Teil einer ersten Erprobung des Diagnoseverfahrens im Rahmen einer Voruntersuchung, deren Erkenntnisse eine weitere Optimierung des Hauptdiagnoseverfahren möglich machten. Die zweite Hauptuntersuchung bestand aus fünf Diagnoseterminen, die in einem Abstand von sechs Monaten stattfanden. Die Diagnose der 15 ausgewählten Kraft-, Schnelligkeits- und Ausdauerfähigkeiten ermöglichte im Vergleich zu Normwerten eine detaillierte Einschätzung individueller Defizite der Versuchspersonen im Bereich der konditionellen Leistungsfähigkeit. Den Athleten wurde immer dann eine Trainingsempfehlung für einen Bereich ausgesprochen, wenn die individuelle Leistungsfähigkeit unter dem Richtwert lag. Zur Überprüfung der Trainingsergebnisse diente der darauf folgende Diagnosetermin als Ausgangsdiagnose. Anhand der Ergebnisse konnte durch verschiedene merkmalsinterne und merkmals-übergreifende Untersuchungen nachgewiesen werden, dass Leistungsdiagnosen und externe Trainingsempfehlungen durch Trainingsinstitutionen erfolgreich umgesetzt werden können. Damit helfen sie, das Konditionstraining von jugendlichen Mannschaftssportlern individuell zu differenzieren und zeitlich zu ökonomisieren. Dies hat, auch über das Konditionstraining hinaus positive Effekte auf die zeitliche und inhaltliche Gestaltung des Trainings. Es konnten bei allen Diagnosetests signifikante merkmalsinterne und merkmalsübergreifende Unterschiede der Leistungsentwicklungen zwischen Versuchspersonen mit und Versuchspersonen ohne Trainingsempfehlungen nachgewiesen werden, was auf eine erfolgreiche Individualisierung des Trainingsablaufs schließen lässt. Im Rahmen der diagnostischen Betreuung konnten zugunsten der zeitlichen Optimierung von individuellen Trainingsplänen ausreichende Leistungen konserviert werden und bei Versuchspersonen mit Leistungsdefiziten kam es zur Minimierung der Ist-Sollwert-Differenz. Zudem war eine signifikante Leistungshomogenisierung der Trainingsgruppen zu beobachten. Die diagnostische Betreuung ist nicht alleine auf die Diagnose von Leistungszuständen zu reduzieren, sondern umfasst in einem Planungs-, Steuerungs- und Regelungsprozess außerdem die begleitende Beratung der Trainingsinstitution. Das in dieser Forschungsarbeit beschriebene Modell zur diagnostischen Betreuung im Mannschaftsport bietet ein valides Mittel der Trainingssteuerung und ist über den Basketballsport hinaus übertragbar auf andere Mannschaftssportarten.
Soziale Konflikte am Arbeitsplatz stellen Stressoren dar, die ihren Ursprung in den sozialen Beziehungen haben. Als eine Extremform sozialer Stressoren wird Mobbing am Arbeitsplatz verstanden, das durch drangsalierende, schikanöse oder gezielt benachteiligende Handlungen gekennzeichnet ist. Während aufgrund retrospektiver Befragungen von zumeist ehemals von Mobbing betroffenen Personen zahlreiche Forschungsergebnisse vorliegen, wurden die aktuell erlebten sozialen Konflikte und Mobbinggeschehnisse am Arbeitsplatz, deren verschiedene beschreibende als auch bewertungs- und emotionsbezogene Charakteristika, deren unterschiedliche Bewältigung sowie deren unmittelbare Konsequenzen zeitnah zu deren Erleben insbesondere über einen längeren Zeitraum noch nicht näher betrachtet. Von dieser Feststellung ausgehend konzentriert sich die vorliegende Arbeit auf die Erfassung aktueller Informationen zu den interessierenden Aspekten von sozialen Konflikten und Mobbing am Arbeitsplatz, deren Analyse sowie den Vergleich von Mobbingbetroffenen als auch Nichtbetroffenen. Zur Erhebung entsprechender Daten wurde eine intervallkontingente, ereignisbasierte Tagebuchstudie mit Vorab- und Nachbefragung konzipiert. An der siebenmonatigen Studie mit zwei jeweils 20 Arbeitstage umfassenden Erhebungszeiträumen nahmen 50 Mobbingbetroffene und 65 Nichtbetroffene teil. Insgesamt wurde eine Rücklaufquote von 78.79% erreicht und ein umfangreiches, erlebensnahes Datenmaterial erhoben. Die ermittelten Ergebnisse belegen, dass Mobbingbetroffene im Vergleich zu Nichtbetroffenen am Arbeitsplatz und im Privatleben insgesamt häufiger und intensivere soziale Konflikte erleben. Zudem belegen die Ergebnisse, dass die von den Mobbingbetroffenen erlebten sozialen Konflikte durch andere bewertungsbezogene Charakteristika gekennzeichnet sind als die der Nichtbetroffenen. Aufgrund dessen beurteilen die Mobbingbetroffenen die von ihnen erlebten Konflikte am Arbeitsplatz als nichtkontrollierbar sowie kaum bewältigbar, nehmen diese als durch eine Schädigungsabsicht geleitete Handlungen wahr und reagieren auf die von ihnen erlebten Konflikte mit stärkeren unangenehmen und geringer ausgeprägten angenehmen Emotionen. Auch setzen die Mobbingbetroffenen, insbesondere vor dem Hintergrund der geringeren manageability der von ihnen erlebten Konflikte, zu deren Bewältigung andere Strategien ein, vor allem weniger aktive Problemlösung und mehr Vermeidungsverhalten. Zudem erhalten Mobbingbetroffene am Arbeitsplatz weniger soziale Unterstützung. Mobbingbetroffene berichten im Rahmen der von ihnen erlebten sozialen Konflikte am Arbeitsplatz überwiegend andere unmittelbare Konsequenzen als Nichtbetroffene und es gelingt ihnen im Sinne eines mangelhaften unwinding weniger, ihre während des Konflikts erlebten emotionalen Reaktionen bis zum Abend hin angemessen zu verarbeiten. Anschließend wurden die Ergebnisse in die bestehende Befundlage der aktuellen Forschung eingeordnet. Zudem wurden die Grenzen der vorliegenden empirischen Untersuchung als auch deren Mehrwert kritisch diskutiert und gewürdigt. Abschließend wurden die Kernaspekte der vorliegenden Arbeit zusammengefasst und ein Ausblick auf weitere Forschungsarbeiten gegeben.
Das complexe Prostata-spezifische Antigen (cPSA) in der Routinediagnostik des Prostatakarzinoms
(2004)
Die therapeutische Replantation von Zähnen zählt zu den endochirurgischen Eingriffen, wenn alternative Therapiemethoden nicht zum Erhalt des Zahnes oder der Zahnwurzel geführt haben oder aufgrund der bestehenden Risiken (z.B. Gefährdung des Nervus mandibularis bei einer Wurzelspitzenresektion) vom Patienten abgelehnt werden. Im Gegensatz zu Zahnreplantationen, die in Zusammenhang mit einem Trauma stehen, können therapeutische Zahnreplantationen geplant durchgeführt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, einen Vergleich zwischen zwei unterschiedlichen Replantationsmethoden anhand von histologischen Serienschnitten und klinisch erhobenen Röntgenbilder in einer tierexperimentellen Studie an zwei Mantelpavianen durchzuführen. Die beiden Replantationsarten unterscheiden sich in der extraoralen Phase des Zahnes. In der konventionellen Methodik wird der Zahn in der Extraktionszange bzw. mit den Fingern gehalten und die Wurzelhaut mit Ringerlösung benetzt. In einer von LAUER [81] entwickelten Methodik wird der zu replantierende Zahn atraumatisch in einer speziellen Haltevorrichtung fixiert und dabei die Wurzeln in eine gekühlte, semisolide Nährlösung [72,81] eingebettet. Es besteht dadurch ein besserer Schutz des Desmodonts vor mechanischen, chemischen und thermischen Noxen während der extraoralen Therapiephase des Zahnes. Als Versuchsdesign wurde das Split-mouth-design gewählt. Jeder Zahn ist dabei eine Einheit für sich. Dadurch sind die Ergebnisse nicht nur vergleichbar, sondern auch präzise, da sie unter anderem vom Gesundheitszustand des Versuchstieres unabhängig sind. 82 Tage nach dem operativen Eingriff wurden die Versuchstiere geopfert. Vor den Replantationen und vor der Opferung wurden jeweils Röntgenbilder angefertigt. Die Auswertung der Röntgenbilder war aufgrund von Fehlinterpretationen, die anhand von Vergleichen zu histologischen Präparaten diagnostiziert wurden, nicht zielführend. Die histologische Aufarbeitung des Zahnhalteapparates erfolgte in axialen Serienschnitten zum Wurzelquerschnitt. In Anlehnung an ANDREASEN [9] wurde der Zustand des Desmodonts in fünf Klassen differenziert. Der Klassifizierungsdurchschnitt wies bei der die modifizierten Replantationsmethode nach LAUER mit einem Wert von 2,42 gegenüber der konventionellen Replantationsmethode mit einem Wert von 3,31 einen signifikant verbesserten Wert auf. Die nach der Lauer-Methode replantierten Zähne heilten besser ein, erreichten jedoch nicht die Vergleichswerte von nicht reimplantierten Zähnen (1,52). Auch die statistischen Testverfahren im Rahmen einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) zeigen signifikante Unterschiede bei der histologischen Bewertung des Desmodonts. Sowohl die Grundgesamtheit der Klassifizierungsmittelwerte pro Wurzel als auch die Grundgesamtheit der schlechtesten Desmodontbewertung pro Wurzel fallen bei keinem der angewandten Tests durch. Die Verteilung der Klassifizierungsmittelwerte pro Wurzel weist eindeutig auf einen Trend hin. Die innovative Replantationsmethode nach Lauer weist einen besser bewerteten Zustand des Desmodonts auf als bei der konventionellen Replantationsmethode. Die Ernährung, die Kühlung und der Kontaminationsschutz des Desmodonts während der extraoralen Therapiephase scheinen eine erhöhte Überlebensrate der Fibroblastenzelle zu verursachen. Dies führt zu der statistisch signifikant verbesserten Einheilung eines nach Lauer replantierten Zahnes.
Die vorliegende Arbeit geht der Frage nach veränderten Kommunikationsverhalten am Beispiel der Auswirkungen der Mobilfunknutzung auf soziale Beziehungen nach und vergleicht die sozialwissenschaftlichen Erkenntnisse mit dem herkömmlichen Festnetztelefon sowie der Face-to-face Gesprächssituation. Dazu wurden soziologische Texte, aktuelle Umfrageergebnisse sowie eine eigens durchgeführte Stichprobenanalyse ausgewertet. Der Forschungsschwerpunkt behandelt daher nicht demographische Untersuchungen der Mobilfunkanwender oder Nutzungsprofile sondern konkrete Fragestellungen, ob und wie das Mobiltelefon hilft, soziale Beziehungen aufrechtzuerhalten oder zu vertiefen. Als Einführung wurde die Geschichte des Mobiltelefons anhand von technischen, politischen und wirtschaftlichen Gesichtspunkten erläutert. Dabei sticht die schnelle zeitliche Durchdringung des Mobiltelefons in weite Teile der Bevölkerung hervor (mehr als 70 Prozent in 2002). Diese Entwicklung wurde einerseits möglich durch wirtschaftspolitische Weichenstellungen zur Deregulierung und technischem Fortschritt, andererseits aber vor allem durch eine schnelle gesellschaftliche Akzeptanz. Diese breite Akzeptanz, deren Grundvoraussetzung die Adoption ist, wurde als Hinführung zum Forschungsschwerpunkt in Kapitel 2 ausführlich untersucht. Neben der Diskussion des gesellschaftlichen Wandels in der modernen Gesellschaft stand vor allem das Verhältnis von Technik und Gesellschaft sowie der Adoptionsprozess und die gesellschaftliche Annahme des Mobiltelefons im Mittelpunkt. Nach Erläuterung der relevanten soziologischen Konzepte und Definition der wichtigsten Begriffe sowie der methodischen Vorgehensweise wurde der Forschungsschwerpunkt in drei Kapitel gegliedert. - Der erste Abschnitt untersucht soziale Beziehungen und hinterfragt nach der Steigerung beziehungsweise Verringerung sowie der Intensität der sozialen Kontakte bei Mobilfunknutzung. Letzerer Frage schließt sich eine abwägende Diskussion zwischen Erreichbarkeit und Verfügbarkeit an. - Die Ausführungen zu steigender Mobilität in der modernen Gesellschaft sowie dem Einfluss des Mobiltelefon auf die Mobilität und Flexibilität der Individuen folgt im zweiten Abschnitt inklusive der Fragestellung, ob das Nutzen des Mobiltelefons die Grenzen zwischen Privatheit und Beruf verschiebt. - Im dritten Abschnitt werden die Auswirkungen der Mobilfunknutzung in sozialen Räumen im Sinne des Gegensatzes Privatheit und Öffentlichkeit behandelt. Dazu gehören die Unterpunkte Intimität und Selbstinszenierung, Einflussnahme auf die Umwelt und Konflikte im öffentlichen Raum. Die Untersuchungen führen zu folgenden Haupterkenntnissen: - Das Nutzen des Mobiltelefons erleichtert die Kontaktaufnahme und führt daher zu einer Zunahme medial vermittelter Sozialkontakte. Trotz Substitutionseffekten mit dem Festnetztelefon vor allem im Ortsbereich handelt es sich um ein Ergänzungsmedium, dass für häufigere Kommunikation sorgt, da das Telekommunikationsaufkommen (gemessen in Gesprächsminuten) stark ansteigend ist. - Trotz häufigerer Sozialkontakte ist die Intensität der Gespräche bei der Mobilfunknutzung reduziert. Intensität ist hierbei definiert anhand von Gesprächslänge, -themen, -partner und -anlass, nicht als subjektive Empfindung eines Mobiltelefonates. Diese verminderte Intensität kann im Extremfall den Fortbestand von sozialen Beziehungen gefährden, falls ausschließlich mit Mobiltelefonen kommuniziert wird. Im Einklang mit allgemeinen Tendenzen des sozialen Wandels erlaubt das Mobiltelefon eine schnelle Kommunikation, bei der überwiegend knappe Inhalte übermittelt werden. Dies wird einerseits belegt beim Vergleich der Kommunikationsminuten von Festnetz und Mobiltelefon, als auch in der Stichprobenuntersuchung durch die durchschnittliche Gesprächslänge, welche ungefähr vier- bis sechsmal kürzer ausfällt. Die Wahl der Gesprächsthemen scheint zu sachlicheren Themen fokussiert zu sein. - Das Mobiltelefon ist personifiziert anstelle des herkömmlichen ortsgebundenen Telefons. Der Vorteil der möglichen Erreichbarkeit wird schnell zur Verpflichtung der permanenten Verfügbarkeit. Bisher ungekannte Kontrollmöglichkeiten und Druck nach Rechtfertigung entstehen. - Der intuitiv verstandende Gewinn an Mobilität führt zur einer höheren Flexibilität des Mobilfunknutzers. Aufgrund dieser findet die Loslösung der Kommunikation von lokalen Sozialkontakten statt. Damit steht das Mobiltelefon im Einklang mit dem gesellschaftlichen Wandel zur steigenden Mobilität, wie die Jahresberichte des Statistischen Bundesamtes belegen. - Die gewonnene Mobilität und Flexibilität können durch die permanente Erreichbarkeit ein Verschieben der Grenze zwischen Beruf und Privatheit bewirken und somit teilweise diese Zunahme wieder einschränken. Durch das Nutzen eines Mobiltelefons ist es daher nicht mehr einfach möglich, die eigenen sozialen Räumen zu verlassen. - Der öffentliche Gebrauch eines Mobiltelefons steht im Konflikt zwischen dem intimen Charakter eines Privatgespräches und der Aufmerksamkeit der Öffentlichkeit, welche zur Selbstinszenierung führen kann. Als Folge dessen entstehen Regelverletzungen, besonders da bei Entgegennahme eines Mobilfunkgespräches die Aufmerksamkeit von örtlich Anwesenden zum "virtuellen" Gesprächspartner überwechselt. - Besagte Konflikte im öffentlichen Raum durch gleichzeitige Anwesenheit des Mobilfunknutzers in konkurrierenden sozialen Räumen werden einerseits durch das Entstehen von Gebrauchsregeln für das Mobiltelefon wie dem Mobiltelefonverbot am Steuer, andererseits durch das Gewöhnen der Gesellschaft an das öffentliche Nutzen des Mobiltelefons entschärft. Die vorliegende Arbeit kommt damit zu Erkenntnissen, die mit den Ergebnissen anderer Autoren verglichen werden können: - Auch bei anderen Autoren, die sich aktuell mit dem soziologischen Auswirkungen der Mobiltelefonie beschäftigen, ist unbestritten, dass das Mobiltelefon die Kommunikation fördert und somit zu mehr sozialen Kontakten beiträgt. Dies wird zum Beispiel von Geser und Haddon festgestellt. Über die Intensität im Sinne von Gesprächslänge, -thema, -partner und –anlasses ist hingegen nur ansatzweise in der vorliegenden Literatur diskutiert worden. - Neben der allgemeinen Überzeugung des Gewinns an Flexibilität und Mobilität durch das Mobiltelefon und der damit verbunden Möglichkeit zur Kommunikation in Unkenntnis des Aufenthaltortes sind verschiedene kritische Stimmen zur Frage der Vermischung zwischen Privatheit und Beruf und nach der durch Erreichbarkeitsverpflichtung entstehenden Kontrolle vorhanden. Dies wird besonders bei Geser erörtert. - Übereinstimmend werden auch die besondere Problematik der Mobilfunknutzung in der Öffentlichkeit und dem damit verbundenen Konfliktpotential erkannt. Neben oben genannten Autoren diskutiert Ling dieses Thema ausführlich. In der abschließenden Tabelle sind die sozialwissenschaftlichen Erkenntnisse dieser Arbeit, ihre Begründungen und Schlussfolgerungen sowie einige Kernbeispiele als Kurzzusammenfassung aufgeführt.
Die Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) spielt eine Schlüsselrolle in der Vermittlung proliferativer Effekte sowohl von Rezeptoren vom Tyrosinkinase-Typ (RTK) wie dem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), als auch von G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die MAPK-Aktivierungsmechanismen durch GPCR sind im Gegensatz zum EGFR unzureichend verstanden und stark von Rezeptor- und Zelltyp abhängig. Ziel dieser Arbeit war die nähere Charakterisierung der Signaltransduktion des GPCR-zugehörigen Cholezystokinin (CCK)-Rezeptors bezüglich der Aktivierung der MAPK durch Western-Blot-Analysen in der Pankreasazinus-Karzinomzelllinie AR42J der Ratte. Die Ergebnisse zeigen eine Beteiligung des EGFR im Mechanismus der CCK-induzierten MAPK-Aktivierung mittels einer EGFR-Transaktivierung. Diese ist mit einer Tyrosinphosphorylierung des EGFR und von Shc sowie einer Komplexbildung der Adapterproteine Shc und Grb2 mit dem EGFR verbunden. Diese Vorgänge sind von der intrinsischen Tyrosinkinaseaktivität des EGFR abhängig. Neben dem EGFR konnte durch weitere Untersuchungen eine Aktivierung und Beteiligung von Tyrosinkinasen der Src-Familie (SFTK) an der CCK-induzierten MAPK-Aktivierung gezeigt werden. Dabei stellte sich heraus, dass die CCK-induzierte Shc-Tyrosinphosphorylierung und die EGFR-Shc-Grb2-Komplexbildung im Rahmen der EGFR-Transaktivierung SFTK-abhängig sind. Im Gegensatz dazu ist die EGFR-Tyrosinphosphorylierung SFTK-unabhängig. Diese Daten zeigen, dass die CCK-induzierte Signalvermittlung des EGFR die gemeinsame Aktivierung von SFTK und EGFR benötigt. Neben der EGFR-Transaktivierung konnte im Rahmen der CCK-induzierten MAPK-Aktivierung ein weiterer Signaltransduktionsweg charakterisiert werden, welcher die Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) beinhaltet. Es konnte gezeigt werden, dass CCK in AR42J-Zellen eine Aktivierung der PKC-Isoformen alpha, delta und eta induziert. Eine Hemmung aller drei PKC-Isoformen führte zur Hemmung des MAPK-Signals, während die isolierte Hem-mung von PKC alpha und delta keine Effekte verursachte. Diese Resultate deuten darauf hin, dass PKCeta an der CCK-induzierten MAPK-Aktivierung beteiligt ist. Eine Beteiligung der PKC an der EGFR-Transaktivierung konnte nicht nachgewiesen werden. Demnach scheint der PKC-abhängige MAPK-Aktivierungsmechanismus parallel zum EGFR zu verlaufen und erst distal des EGFR mit dem EGFR/SFTK-abhängigen Signaltransduktionsweg zu konvergieren.
Wasserstoffbrücken als strukturbildendes Element : Synthese und Berechnung supramolekularer Komplexe
(2004)
Die nicht-kovalente Synthese sowie die Berechnung der supramolekularen Komplexe wurden anhand dreier unterschiedlicher Stoffklassen demonstriert. Ziel war es, supramolekulare Dimere zu kristallisieren, die durch zwei Wasserstoffbrücken zusammengehalten werden. Die zuerst untersuchten Indol-Derivate waren potentiell selbstkomplementär. Während der Donor im starren Indol-Ring lag, befand sich der Akzeptor in der Seitenkette, was zu konformationell flexiblen Verbindungen führte. Durch Variation des Abstandes von Donor und Akzeptor, was einer Verlängerung der Seitenkette durch zusätzliche CH2-Gruppen entsprach, sollte herausgefunden werden, bei welcher geometrischen Anordnung dimere Komplexe entstehen Die Ergebnisse zeigten, daß die gewünschten Dimere erst bei einer Kettenlänge von drei CH2-Gruppen um Kristall zu beobachten waren. Diese konformationell flexiblen Verbindungen wiesen somit große Unterschiede zwischen berechneter und realer Komplexgeometrie auf, die darauf zurückzuführen sind, daß im Kristall eine Vielzahl von Molekülen wechselwirken, während in der Rechnung mit dem Kraftfeldprogramm MOMO nur zwei Moleküle berücksichtigt werden. Somit führt die „Sandwich“-Form zu einer günstigeren van-der-Waals-Energie als die planare Form. Im zweiten Abschnitt dieser Arbeit konzentrierten sich unsere Untersuchungen auf die Substanzklasse der Acetylhydrazone, welche ebenfalls potentiell selbstkomplementäre Verbindungen darstellen. Im Gegensatz zu den Indol-Derivaten wurde hier der Abstand zwischen Donor und Akzeptor konstant gehalten, um zu untersuchen, wie sich unterschiedliche Reste der Acetylhydrazone auf die Konformation der Moleküle und somit auch auf die Komplexgeometrie auswirken. Zu diesem Zweck wurde eine Reihe von Verbindungen mit Resten unterschiedlicher sterischer Hinderung synthetisiert. Ziel war es auch in dieser Verbindungsklasse gezielt Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken zu kristallisieren. Eine Suche in der CSD zeigte schnell, daß Acetylhydrazone zwei Vorzugskonformationen besitzen: eine, in der Donor und Akzeptor eine anti-Anordnung besitzen, was in der Regel zu kettenförmigen Wasserstoffbrücken führt, und eine syn-Anordnung, die zu den gewünschten Dimeren führen sollte. Es galt nun zu untersuchen, welche dieser Reste zur syn-Konformation führt und welches die Vorzugskonformation der Acetylhydrazone ist. Die Untersuchungen zeigten, daß zwei sterisch anspruchsvolle Reste zur syn-Anordnung von Donor und Akzeptor führen und somit zu Dimeren im Kristall. Verbindungen mit zwei sterisch wenig anspruchsvollen Resten lagen hingegen in der anti-Konformation vor und bildeten wie erwartet Polymere. Für die Acetylhydrazone konnte folgende These aufgestellt werden: Die syn-Konformation entsteht, wenn beide Reste drei oder mehr (Kohlenstoff-) Atome besitzen, anderenfalls entsteht die anti-Anordnung. Die Rechnungen lieferten, bis auf eine Ausnahme, supramolekulare Dimere mit zwei Wasserstoffbrücken. Für jene Verbindungen, die ebenfalls in der syn-Konformation in Dimeren kristallisieren, ist die Übereinstimmung zwischen der berechneten und der realen Komplexgeometrie sehr gut. Im letzten Kapitel dieser Arbeit sollten heteromolekulare Komplexe, also solche, die aus zwei unterschiedlichen Molekülen bestehen, untersucht werden. Die erste der eingesetzten Verbindungen sollte zwei Donor-Gruppen enthalten, während die zweite Verbindung zwei Akzeptoren besitzen sollte. Dabei wurde eine Reihe von Diol-Dion-Komplexen untersucht. Dabei gelang es nur einen dieser Komplexe zu kristallisieren und experimentell zu untersuchen. Leider lagen keine Dimere vor, sondern es bildete sich ein 2:1-Komplex (Diol/Dion), der kettenförmige Wasserstoffbrücken ausbildete. Erfreulich war hingegen, daß eine Konformationänderung des Dions zu beobachten war; denn gegenüber der Kristallstruktur der reinen Verbindung lag 25 im Komplex als planare Verbindung vor. Gleichzeitig wurden die möglichen Komplexgeometrien mit MOMO berechnet. Die meisten der berechneten Komplexe wiesen Dimere mit den gewünschten zwei Wasserstoffbrücken auf.
Monoklonale Antikörper und rekombinante Antikörperfragmente gegen sekundäre Arzneipflanzenmetabolite
(2004)
Monoklonale Antikörper sind seit vielen Jahren aus den biochemischen und molekularbiologischen Laboratorien nicht mehr wegzudenken. Sowohl in der Grundlagenforschung, als auch in der angewandten medizinischen Diagnostik und der Therapie spielen sie eine immer wichtigere Rolle. Dennoch konnten sich monoklonale Antikörper als Hilfsmittel im Bereich der Naturstoffanalytik bisher noch nicht durchsetzen. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand daher die Frage, inwieweit sich monoklonale Antikörper und rekombinante Antikörperfragmente für die Analytik komplexer Naturstoffgemische eignen. Eine der Zielstrukturen, gegen die monoklonale Antikörper generiert werden sollten, ist das pentazyklische Triterpen Oleanolsäure. Oleanolsäure ist als Aglykon in zahlreichen verschiedenen Triterpensaponinen enthalten. Triterpensaponine bzw. Triterpensaponin-haltige Arzneipflanzen spielen aufgrund ihres breiten Wirkungsspektrums in der Phytotherapie eine wichtige Rolle. Sie zeichnen sich nachweislich durch venentonisierende, antiödematöse, antiphlogistische, diuretische, expektorierende und broncholytische Eigenschaften aus. Da es sich bei den Triterpensaponinen um eine sehr heterogene Stoffgruppe handelt, ist ihre Analytik sehr aufwendig. Monoklonale Antikörper könnten daher bei der Analytik von komplexen Saponingemischen sehr nützlich sein. In Zusammenarbeit mit Frau Dr. Kerstin Brand aus dem Arbeitskreis von PD Dr. Werner Knöss (Universität Bonn) konnten verschiedene monoklonale Antikörper gegen Oleanolsäure etabliert werden. Im Rahmen dieser Dissertation wurden die Bindungseigenschaften dieser Antikörper eingehend charakterisiert. In kompetitiven ELISAs konnten die Molekülepitope, an die die verschiedenen Antikörper binden, bestimmt werden. Außerdem wurden die Immunglobuline auf Kreuzreaktivitäten gegenüber 72 unterschiedlichen sekundären Arzneipflanzenmetaboliten untersucht. Die monoklonalen Antikörper zeigten dabei keine Interaktion mit Steroiden, Phytosterolen und Herzglykosiden – Substanzen die zwar in die Gruppe der Triterpene eingeordnet werden können, sich aber in ihrer Struktur und Stereochemie deutlich von der Oleanolsäure unterscheiden. Gegenüber zahlreichen pentazyklischen Triterpenen, die strukturelle Ähnlichkeiten mit der Oleanolsäure besitzen, zeigten hingegen alle untersuchten Immunglobuline eine ausgeprägte Kreuzreaktivität. Daher eignen sie sich für die Analytik von komplex zusammengesetzten Triterpengemischen, z.B. von Arzneipflanzenextrakten. Dies konnte durch verschiedene direkte und indirekte Kompetitionsversuche mit unterschiedlichen Arzneipflanzenextrakten im Rahmen dieser Arbeit und der Dissertation von Frau Dr. Kerstin Brand gezeigt werden. Mit Hilfe eines kompetitiven ELISAs ist z.B. ein Screening von unbekannten Arzneipflanzen auf Triterpensaponine möglich. Auch eine Wertbestimmung von Arzneipflanzen oder Arzneipflanzenextrakten mit Hilfe der monoklonalen Antikörper ist denkbar, sofern eine Referenz zur Verfügung steht, auf den die Kompetitionsergebnisse bezogen werden können. Der Einsatz der hier vorgestellten Antikörper wird allerdings dadurch eingeschränkt, dass die Immunglobuline eine unvorhersehbare Polyspezifität gegenüber den polyphenolischen Sekundärmetaboliten Quercetin und Ellagsäure zeigten. Bei einem Einsatz der Antikörper im Rahmen der Naturstoffanalytik sind daher Vorversuche erforderlich, um diese Substanzen zu identifizieren und wenn möglich zu entfernen. Einer der untersuchten monoklonalen Antikörper, der Antikörper der Zelllinie 10F10, zeigte eine Kreuzreaktivität gegenüber verschiedenen ß-Boswelliasäuren. Boswelliasäuren sind in der Lage, das Enzym 5-Lipoxygenase zu hemmen und dadurch die Synthese von entzündungsfördernden Leukotrienen zu inhibieren. Daher scheinen Boswelliasäuren viel versprechende Arzneistoffe bei der Therapie der unterschiedlichsten inflammatorischen Erkrankungen, wie z.B. Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, Asthma bronchiale oder rheumatoider Arthritis zu sein. Der Antikörper der Zelllinie 10F10 soll im Arbeitskreis von Prof. Dieter Steinhilber am Institut für Pharmazeutische Chemie der Universität Frankfurt unter anderem für eine Immobilisierung der Boswelliasäuren an Immunaffinitätssäulen eingesetzt werden. In diesem Arbeitskreis wird der Einfluss von ß-Boswelliasäuren auf die 5-Lipoxygenase intensiv erforscht. In einem zweiten Projekt wurden rekombinante scFv-Antikörperfragmente gegen das Triterpen Oleanolsäure und gegen das Pyrrolizidinalkaloid Retrorsin generiert. Pyrrolizidinalkaloide sind hepatotoxische Sekundärmetabolite, die in zahlreichen Nutzpflanzen und traditionellen Arzneipflanzen enthalten sind. Insgesamt wurden vier verschiedene scFv-Fragmente konstruiert. Zwei Anti- Oleanolsäure-Antikörperfragmente konnten in E. coli erfolgreich periplasmatisch exprimiert und ihre Funktionalität in verschiedenen Antigenbindungsstudien nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde eine Phagen-Display- und Phagen- Panning-Methode etabliert, mit deren Hilfe es möglich ist, gezielt nach funktionellen Antikörperfragmenten zu suchen. Mit dieser Methode sollte es möglich sein, nach erfolgter Mutation der verschiedenen scFv-Fragmente, Proteine mit neuen Bindungseigenschaften zu identifizieren. Interessant wären dabei z.B. scFv- Fragmente, die mit Pyrrolizidin-N-oxiden interagieren. Gegen diese Substanzen konnten im Arbeitskreis Dingermann mit Hilfe der konventionellen Hybridoma- Technologie bisher noch keine monoklonalen Antikörper generiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es sich bei monoklonalen Antikörpern und rekombinanten Antikörperfragmenten um interessante Hilfsstoffe für die Naturstoffanalytik handelt, deren Bedeutung für dieses Anwendungsgebiet aber bisher noch deutlich unterbewertet ist. Es wäre daher sehr interessant, die hier vorgestellten Projekte fortzuführen und die Arbeitsmethoden weiter zu optimieren. Mit den im Rahmen dieser Arbeit charakterisierten Anti-Oleanolsäure-Antikörpern stehen bereits drei Immunglobuline für die Arzneipflanzenanalytik zur Verfügung. Von allen drei Antikörpern liegen inzwischen auch scFv-Fragmente vor. Diese Fragmente könnten modifiziert und mit Hilfe der hier vorgestellten Phagen-Display-Methode nach Proteinen mit modifizierten Bindungseigenschaften gesucht werden. Letztendlich wäre auf diese Weise die Generierung eines großen Sortiments von Antikörpern und Antikörperfragmenten für die Analytik der unterschiedlichsten Substanzklassen möglich.
Ziel: Ziel der Untersuchungen war es, selektive und potente P2-Rezeptor-Antagonisten, die sich von Suramin und PPADS ableiten, zu ermitteln sowie die Charakterisierung UTP-sensitiver Rezeptoren in epididymalen Segmenten des Samenleiters der Ratte vorzunehmen. Methoden: Am Samenleiter der Ratte (P2X1-Rezeptoren) und dem Ileum des Meerschweinchens (P2Y1-Rezeptoren) wurden Kontraktions-Inhibitions-Studien durchgeführt. Zur Untersuchung des UTP-sensitiven Rezeptors im Samenleiter der Ratte wurden Kontraktions-, Kontraktions-Inhibitions-Studien und histochemische- bzw. immunzytochemische Studien herangezogen. Ergebnisse: Durch Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Analoga des NF023, Suramin, NF279, PPADS und SB9 konnten symmetrische Suramin-Analoga, wie NF816 (pA2=6,45) und unsymmterische NF279-Analoga, wie NF786 (pA2=6,76), erhalten werden, die potent, selektiv und kompetitiv ADPßS-induzierte Kontraktionen des Meerschweinchen-Ileums antagonisierten. Auch die heterodimer-bivalente Verbindung SB9, erwies sich an nativen P2Y1 -Rezeptoren als potenter, selektiver und kompetitiver Antagonist (P2Y1:pA2=6,91 vs. P2X1: pA2=5,98). Darüber hinaus ist SB9 P2-Rezeptor-spezifisch und schwach wirksam an Ekto-Nukleotidasen von Oozyten des Südafrikanischen Krallenfrosches (IC50 = 40 MikroM). Zur Charakterisierung des UTP-sensitiven Rezeptors des Samenleiters der Ratte wurde Evans Blau verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass Evans Blau die Spaltung von exogenem ATP zu 75 % hemmt. Insbesondere die glatte Muskulatur ist ATPase-aktiv. An epididymalen Segmenten ist UTP (100 MikroM Evans Blau) ein voller Agonist (EC50 = 36 MikroM). Die Kontraktion beruht auf der Aktivierung postsynaptischer Strukturen und wird nicht durch UDP oder Uridin beeinflusst. Mit Agonisten konnte in Anwesenheit von 100 MikroM Evans Blau folgende Reihe der Wirkstärke erhalten werden: natürliche Agonisten, Ap4A > ATP = ADP = UTP > UDP; synthetische Agonisten, 2MeSATP > ATPgammaS > ADPßS. In Anwesenheit von 100 MikroM Evans Blau wurden UTP-induzierte Kontraktionen durch PPADS (IC50 = 20 MikroM) und Reaktiv Blau 2 (IC50 = 43 MikroM) nicht aber durch Suramin und MRS 2179 gehemmt. P2Y2-Rezeptor-spezifische Antikörper ergaben die Expression von P2Y2-Rezeptoren auf der glatten Muskulatur des Samenleiter der Ratte. Schlußfolgerungen: Analoga als auch pharmakophore Gruppen des Suramins und PPADS eignen sich als Ausgangs-Verbindungen bzw. -Strukturen zur Synthese von potenten und Subtyp-selektiven P2-Rezeptor-Antagonisten. Die Wirkungen von UTP sind durch P2u-Rezeptoren vermittelt. Die Ergebnisse deuten auf die Beteiligung von P2Y2- bzw. P2Y4-Rezeptoren in epididymalen Segmenten des Sameneiters der Ratte hin.
Das humane Genom besteht zu etwa 8% aus retroviralen Sequenzen. Davon sind ca. 1-2% dem humanen endogenen Retrovirus K (HERV-K) zuzuordnen. Das Virus ist mit ca. 30-50 Proviren und ca. 10.000 sLTRs im humanen Genom vertreten. HERV-K besitzt intakte ORFs für alle retroviralen Proteine und zusätzlich ein ORF für das akzessorische Protein Rec. Obwohl eine basale Transkription in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden konnte, ist eine Expression von HERV-K Proteinen und Viruspartikeln nur in Keimzelltumoren nachgewiesen worden. In dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation des gewebespezifischen Promotors von HERV-K näher charakterisiert. Hierbei wurden regulatorisch wichtige Sequenzen mit Hilfe des Luziferase-Assays eingegrenzt. Transkriptionell sensitive Regionen wurden daraufhin im EMSA auf die Bindung von Transkriptionsfaktoren untersucht. Durch transiente Transfektionen von Luziferasereporterkonstrukten in verschiedenen Zelllinien stellte sich heraus, dass HERV-K LTRs in Keimzelltumorzellen aktiv sind, dass es aber auch inaktive LTRs gibt, die im Zuge der Evolution durch Punktmutationen ihre transkriptionelle Aktivität verloren haben. Aktive und inaktive LTRs unterscheiden sich durch Punktmutationen, die sich in verschiedenen Sequenzabschnitten häufen. Chimäre Konstrukte aus aktiven und inaktiven Sequenzabschnitten und gezielte Mutationen und Deletionen in aktiven HERV-K LTRs enthüllten verschiedene DNA-Bereiche, die transkriptionelle Sensitivität aufweisen. Die LTR-Bereiche bps 572-578, bps 757-798 und bps 809-823 waren im Aktivitäts-Assay besonders empfindlich gegenüber Mutation. In diesen Bereichen liegen zum einen GC/GT-Boxen, also Konsensussequenzen für die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3, zum anderen Konsensussequenzen für ein Inr und ein DPE. Das Binden von Sp1 und Sp3 auf den GC/GT-Boxen der bps 757-798 konnte durch eine EMSA-Analyse bewiesen werden. Der transkriptionell sensitive Bereich der bps 572-578 weist eine weitere putative GC/GT-Box auf. Die TATA-Box bei bp 532 zeigte sich unempfindlich gegenüber Mutation. Eine Beteiligung dieser Konsensussequenz am basalen Promotor wurde deshalb ausgeschlossen. Unterstützt durch die Ergebnisse einer 5’-RACE, ein Verfahren, dass den Transkriptionsstart eines bestimmten Gens bestimmen kann, konnte gezeigt werden, dass der basale HERV-K Promotor aus Konsensusequenzen für die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3 , einem Inr und einem DPE besteht. Sp1 und Sp3 sind ubiquitäre Transkriptionsfaktoren, die durch ihr Mengenverhältnis in einem bestimmten Gewebe oder durch posttranslationale Modifikationen unterschiedliche Auswirkungen auf die Transkription haben können. Diese Eigenschaften könnten zur Gewebespezifität von HERV-K beitragen. Die Core Promotor Komponenten Inr und DPE sind für die korrekte Positionierung von TFIID und damit der PolII verantwortlich. Des weiteren wurde eine starke Beteiligung des Testis-spezifischen Transkriptionsfaktors SRY an der Transkription von HERV-K belegt. Im Luziferase-Assay konnte ein SRY-Expressionsplasmid die Transkription eines aktiven LTRs in GH- wie auch in HeLa-Zellen steigern. Ein Indiz dafür, dass es sich um einen für die Transkription von HERV-K essentiellen Faktor handelt. Verschiedene SRY-Konsensussequenzen auf der HERV-K LTR machen eine Wirkung in cis wahrscheinlich, doch könnte auch in trans ein für die Transkription wichtiger Transkriptionsfaktor in seiner Expression verstärkt werden. Ebenfalls konnte bewiesen werden, dass epigenetische Mechanismen eine starke Rolle bei der Transkription von HERV-K spielen. Die Methylierung eines LTR-haltigen Luziferase-Reportervektors führte zum fast vollständigen Verlust der transkriptionellen Aktivität. Es bleibt abzuwarten, in welcher Weise die Schlüsselkomponenten Sp1, Sp3, SRY und Hypermethylierung des HERV-K Genoms zur Gewebespezifität von HERV-K beitragen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Modellierung der neuronalen Prozesse, die auditorischen Lokalisationsleistungen zugrunde liegen. Viele der hierzu aktuell diskutierten Modellvorstellungen lassen sich auf ein von L. Jeffress bereits in der Mitte des letzten Jahrhunderts vorgeschlagenes Netzwerkmodell zurückführen: Nach Jeffress werden interaurale Laufzeitunterschiede (ITDs) zwischen beiden auditorischen Pfaden in einem Netzwerk von Detektorneuronen (Koinzidenzdetektoren) ausgewertet. Systematische Laufzeitunterschiede resultieren aus der Architektur des Netzwerks, die sogenannte Delay-Lines realisieren soll. Trotz einer Reihe von Evidenzen für das im auditorischen Diskurs inzwischen als Paradigma geltende Modell, findet Kritik am Jeffress-Modell in jüngerer Zeit zunehmend Beachtung und Interesse. So argumentieren B. Grothe und D. McAlpine gegen die Übertragung des Delay-Line Modells auf die Verhältnisse bei Säugern. Zentrales Moment ihrer Kritik ist eine Afferenz der MSO aus einem weiteren Teilgebiet der Olive (MNTB). Wesentlicher Effekt der von der Projektion gebildeten inhibitorischen Synapse ist eine relative Verschiebung der Best-Delays der MSO-Zellen zur Präferenz contralateraler Delays. Damit besteht nicht nur zu der nach dem Jeffress-Modell notwendigen Aufteilung der Best-Delays ein Widerspruch, die ITDs liegen bei tiefen Frequenzen für kleine Säuger aufgrund deren geringer Kopfgröße außerhalb des Bereichs physiologisch auftretender Delays. In dieser Arbeit werden die Ergebnisse von Grothe und McAlpine durch Compartmental Modeling analysiert. Gegenüber einer Simulationsstudie aus den Gruppen von Grothe und McAlpine werden von uns durch explizite Modellierung der Dendriten zusätzliche Effekte der Inhibiton beschrieben. Wir stellen dar, wie die Topographie von Inhibiton und Excitation die Verarbeitungsprozesse in Bipolar-Zellen durch dendritische Low-Pass Filterung und Kontrastverst ärkung zwischen minimaler und maximaler Spikerate unterstützt. Unsere Ergebnisse können die empirisch nachgewiesene Verteilung excitatorischer (distaler) und inhibitorische (proximaler) Synapsen erklären. In der abschliessenden Analyse der von den Bipolar-Zellen generierten Spike Trains wird das von Grothe und McAlpine entworfene alternative ITD-Codierungsmodell auf der Basis von Ratencodes problematisiert: Bislang erklärt ihr Vorschlag nicht, wie organismische Lokalisationsleistungen auf der Basis weniger Spikes realisiert werden können.
Isolierung und Charakterisierung der Atmungsketten-Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans
(2004)
Isolierung von Atmungsketten-Superkomplexen aus Paracoccus denitrificans: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Reinigungsprotokoll zur Präparation der Atmungskettenkomplexe I, III und IV des Gram-negativen, fakultativ anaeroben Bodenbakteriums Paracoccus denitrificans in Form eines NADH Oxidase Komplexes erstellt. Bisher konnten stabile Superkomplexe bakterielle Atmungskettenkomplexe nur in Gestalt einer Chinol Oxidase, bestehend aus den Komplexen III (Ubichinol:Cytochrom c Oxidoreduktase) und IV (Cytochrom c Oxidase), isoliert werden (Berry, et al., 1985). Jedoch enthielten diese Assemblierungen keinen Komplex I (NADH: Ubichinon Oxidoreduktase). Dies ist die erste chromatographische Isolierung eines kompletten "Respirasoms" aus Paracoccus denitrificans. Unter der Verwendung des milden Detergenz Digitonin zur Solubilisierung von Paracoccus denitrificans Membranen gefolgt von zwei chromatographischen Reinigungsschritten, der Hydroxylapatit-Chromatographie und der Gelfiltration, konnte eine NADH Oxidase, bestehend aus den Komplexen I, III und IV in einer 1:4:4 Stöchiometrie isoliert werden. Neben der Isolierung der NADH Oxidase konnten weitere kleine Superkomplexe identifiziert werden, die aus vier Komplex III und vier Komplex IV (III4IV4) sowie vier Komplex III und zwei Komplex IV (III4IV2) assoziiert waren. Charakterisierung der Superkomplexe aus Paracoccus denitrificans: Die isolierten Atmungskettenkomplexe wurden zur Charakterisierung bezüglich ihrer Funktion, enzymatischen Aktivität, Stöchiometrie und Untereinheiten-Zusammensetzung aus Paracoccus denitrificans Wildtyp-Membranen analysiert. Proben aller Präparationsstufen wurden parallel zur BN-Gelelektrophorese und für enzymatische Einzel- und kombinierte Aktivitäten der Komplexe I-IV eingesetzt. Mittels BN-Gelelektrophorese konnten die apparenten Massen der Komplexe bestimmt werden. Im folgenden denaturierenden SDS-Gel wurde die Untereinheiten-Zusammensetzung der Superkomplexe durch Immunodetektion mit Antikörpern gegen die Komplexe I, III, IV und Cytochrom c552 analysiert. Abschließend konnte nach der Gelfiltration festgestellt werden, das Komplex II eindeutig nicht Teil des Superkomplexes (I1III4IV4) war. Die Stöchiometrie des Superkomplexes a wurde mit Hilfe der fluorimetrischen Bestimmung von FMN (Flavin) als Marker für Komplex I und mittels Pyridin Hämochromogen Spektren für Häm a, b und c bestimmt. Da Komplex III physiologisch als Dimer vorliegt (Mayer et al. 2002), müsste die Stöchiometrie der funktionellen Einheit des Superkomplex a folgendermaßen lauten: I1 (III2)2 IV4. In diesem Fall diente der Vergleich der Wechselzahl einzelner Präparationsstufen als Maß der Verunreinigung der ergab, dass Fremdkomplexe mit Flavin und Cytochrom b im Ausgangsmaterial der Präparation vorhanden waren. Nur die Wechselzahl des Komplexes IV blieb während der Präparation konstant. Um den Gehalt an Komplex I und die Qualität der Präparation abzuschätzen, wurde das Verhältnis der HAR zu dNADH:DBQ Oxidoreduktase Aktivität in Membranen und isoliertem Superkomplex a bestimmt. Es war während der Präparation konstant. Die Bestimmung des Phospholipidgehalts aus isoliertem Superkomplex a im Vergleich zu P. denitrificans Membranen ergab eine Abnahme von 980 ± 80 nmol PL / mg Protein in Membranen auf 290 ± 10 nmol / mg Protein in isoliertem Superkomplex a, wohingegen der Ubichinongehalt von 2,7 ± 0,3 nmol / mg auf 6,7 ± 0,8 nmol / mg in isolierter Oxidase anstieg. Katalytische Aktivitäten von P. denitrificans Membranen des Parentalstamms und verschiedener Mutantenstämme zeigten, dass die Inaktivierung des Gens für fest gebundenes Cytochrom c552 die Bildung eines Superkomplexes nicht verhindern konnte, was ein Hinweis dafür ist, dass dieses Elektronen Carrier Protein nicht essentiell für die strukturelle Verbindung zwischen den Komplexen III und KIV ist. Komplex I Aktivität wurde ebenfalls in Membranen von Mutanten-Stämmen, denen Komplex III oder Komplex IV fehlte, gefunden. Jedoch enthielten diese Stämme keinen assemblierten Komplex I, sondern nur dissoziierte Untereinheiten des Komplexes. Trotz der Verwendung der selben Protokolle für die elektrophoretische Trennung und chromatographische Isolierung wie für Superkomplexe aus dem Wildtyp-Stamm, führte die Isolierung aus Mutantenstämmen, denen Komplex III oder IV fehlte, zum vollständigen Verlust der NADH:DBQ Oxidoreduktaseaktivität. Dies weist darauf hin, dass Paracoccus denitrificans Komplex I durch die Assemblierung in Form eines NADH Oxidase Superkomplex stabilisiert wird. Zusätzlich zum Substrat Channeling scheint die strukturelle Stabilisierung von Membran Protein Komplexen die Hauptaufgabe von respiratorischen Superkomplexen zu sein.
In der vorliegenden Arbeit sollten mittels eines Hefe zweihybrid screens neue Interaktionspartner von ARVCF, einem cadherinbindenden armadillo repeat Protein, gefunden werden. Hierbei wurde aus einer cDNA-Bank differenzierender Myoblasten das Cytoskelettprotein Alpha-actinin als Bindungspartner des armadillo repeat Proteins identifiziert. Der Befund aus dem Hefesystem wurde durch Immunofluoreszenzaufahmen, in welchen gezeigt wurde dass die beiden Proteine kolokalisieren, bestätigt. Auch eine Coimmunopräzipitation bestätigte eine Interaktion der beiden Proteine. Weiterhin konnte eine direkte Interaktion von ARVCF mit Alpha-actinin in in vitro Pull-Down assays gezeigt werden, wobei eine Eingrenzung der Bindungsregion von ARVCF für Alpha-actinin jedoch nicht möglich war. Als nächstes wurde ARVCF im Rahmen dieser Arbeit mittels Computeranalysen auf potentielle Phosphorylierungsstellen hin untersucht. In in vitro Kinase assays wurde eine Phosphorylierung des Proteins durch die Proteinkinase C (PKC) festgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die subzelluläre Lokalisation von ARVCF nach Behandlung der Zellen mit den PKC stimulierenden Cytokinen TNF-alpha und EGF, sowie mit dem Phorbolester PMA ändert. Hierbei wurde ein Ablösen des Proteins von der Plasmamembran und eine Lokalisation in cytoplasmatischen Aggregaten beobachtet. Dieser Effekt erwies sich als Zelltypunabhängig und Spezies übergreifend. Es konnte gezeigt werden, dass der N-Terminus der Splicevariante 5'alt ARVCF notwendig und ausreichend für den beobachteten Effekt ist. p120(ctn), das dem ARVCF am nächsten verwandte Protein, zeigte bei einer Behandlung von Zellen mit PMA oder den oben genannten Cytokinen keinen Effekt in Bezug auf Lokalisationsänderung. Ebenso wenig konnte eine Änderung der Lokalisation nach Behandlung für die Proteine Beta-catenin sowie E-cadherin beobachtet werden. Der erhaltene Effekt nach Stimulation der Zellen war somit spezifisch für ARVCF und konnte nicht für ein anderes hier untersuchtes Catenin oder Cadherin gezeigt werden. Eine stark abgeschwächte Cadherinbindung von ARVCF nach Inkubation der Zellen mit den Cytokinen oder PMA konnte im MOM-recruitment assay beobachtet werden. Auch dieser Effekt erwies sich als ARVCF spezifisch und konnte nicht mit p120(ctn) gezeigt werden. Weiterhin wurden chimäre Moleküle mit dem N-Terminus von ARVCF und dem Rest von p120(ctn) und vice versus hergestellt. Hierbei konnte die abgeschwächte Cadherinbindung im MOM-recruitment assay durch den N-Terminus von ARVCF auf p120(ctn) übertragen werden. Die chimären Moleküle ARVCF/p120(ctn) fanden sich nach Behandlung von Zellen nicht mehr in Aggregaten wieder, waren aber über das Cytoplasma verteilt. Es konnte kein Effekt auf Stimulation der Zellen mit dem chimären Protein p120(ctn)/ARVCF gezeigt werden. Durch diese Art von "gain of function" Experiment konnte noch einmal die Wichtigkeit und Spezifität des N-Terminus von ARVCF in Bezug auf die Reaktion auf PMA- oder Cytokinstimulation gezeigt werden. Auch die Punktmutante T50A, bei welcher eine potentielle Phosphorylierungsstelle der PKC von Threonin nach Alanin mutiert war, löste sich nach Stimulation der Zellen von den Cadherinen, wie im MOM-recruitment assay gezeigt werden konnte. Allerdings lokalisierte diese Mutante nach Behandlung der Zellen nicht in Aggregaten, sondern, wie zuvor schon das chimäre Protein ARVCF/p120(ctn), über das Cytoplasma verteilt. So konnte gezeigt werden, dass es sich bei der abgeschwächten Cadherinbindung und bei der Aggregatbildung um zwei klar voneinander trennbare Eigenschaften des Moleküls handelt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine Zellzyklusabhängigkeit der CD95- vermittelten Apoptose besteht. Dazu wurde ein ecdysoninduzierbares Genexpressionsystem für die induzierte Überexpression der CDK-Inhibitoren p21 und p27 in RKO-Zellen (Kolonkarzinomzellen) zur Herbeiführung eines Zellzyklusarrests in der G1-Phase benutzt. Nach Induktion mit dem Ecdysonhomolog Muristeron wurde durch Zugabe von rekombinanten hCD95-Liganden Apoptose ausgelöst und anschließend untersucht. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass der Induktor Muristeron an sich und nicht die p21- bzw. p27-Überexpression die anti-apoptotische Akt-Kinase aktiviert, die Expression des anti-apoptotischen Bcl-xL erhöht, die Caspase-8-Aktivierung (entweder am CD95-DISC oder durch "Feedback"-Aktivierung durch Caspase-3) und die darauf folgenden Ereignisse verhindert und somit die hCD95L-induzierte Apoptose blockiert. Zusätzlich beeinflusst der Induktor auch das Genexpressionsmuster der behandelten Zellen, was ebenfalls für die Hemmung der Apoptose mit verantwortlich sein könnte. Somit ist das ecdysoninduzierbare Genexpressionsystem zur Apoptoseuntersuchung in RKO-Zellen nicht verwendbar. Mit der Untersuchung des Apoptoseverhaltens proliferierender RKO-Zellen konnte gezeigt werden, dass überlebende Zellen nach hCD95L-Behandlung vermehrt in der G0/G1-Zellzyklusphase nachweisbar sind, während apoptotische (Caspase-3-positive) Zellen aus der G2/M-Phase heraus sterben. Allerdings weisen die apoptotischen Zellen kaum Cyclin B1 auf, ein für die G2-Phase wichtiges und typisches Cyclin. Somit bleibt die genaue Verknüpfung von Zellzyklusregulation und Apoptose auch nach diesen Analysen ungeklärt. In einem dritten Ansatz - Zellzyklusarrest durch Dichtearretierung - konnte eine Hemmung der CD95- vermittelten Apoptose in der arretierten Zellpopulation nachgewiesen werden. Allerdings sekretieren RKO-Zellen einen anti-apoptotischen Faktor in ihr Medium, dessen Konzentration und Wirkung mit größerer Zelldichte zunimmt und somit für die Protektion, unabhängig von Zellzyklusarrest oder Proliferation, verantwortlich ist. Konfluente und auch mit konditioniertem Medium behandelte RKO-Zellen zeigen im Vergleich zu dünn ausgesäten RKO-Zellen Veränderungen, die denen sehr ähnlich sind die beim Übergang einer epithelverankerten Zelle zu einer migrierenden Einzelzelle (EMT) auftreten. Beispielsweise verändert sich die Zusammensetzung des Zytoskeletts, die Zellen verlieren den Zell-Zell-Kontakt und lösen sich ab, bleiben aber am Leben. Zusätzlich steigt die Sekretion von Zytokinen an, die Angiogenese, Migration und Invasion positiv beeinflussen. Sowohl konfluente als auch mit konditioniertem Medium behandelte sub-konfluente Zellen sind apoptoseresistent (hCD95L, TRAIL, UV, Staurosporin), woran u.a. die Kinasen PKC und PI3K, aber auch das anti-apoptotische Bcl-xL beteiligt sind. Die Zellen sterben interessanterweise, wenn ein agonistischer anti-CD95-Antikörper statt des rekombinanten CD95-Liganden verwendet wird, was vermuten lässt, dass eine mangelhafte Vernetzung der einzelnen DISC-Komplexe zur Apoptosehemmung führt, welche durch den Antikörper dann aber erzwungen wird. Zwar handelt es sich hierbei um ein reines Zellkulturmodell, dennoch könnte es bedeuten, dass die Umgebung in einer dichten RKO-Zellkultur vergleichbar ist mit der in größeren soliden Tumoren. Die Zellen brauchen Nährstoffe, versuchen über eine Neovaskularisierung Anschluss an ein Blutsystem zu finden und sekretieren Lockstoffe, Wachstumsfaktoren sowie Proteasen, um die Metastasierung zu erleichtern. PI3K, cPKCs und Bcl-xL tragen dabei zu einer Apoptoseresistenz bei, welche die Zellen zum einen resistent gegenüber Anoikis, Nährstoffmangel, aber auch gegen angreifende zytotoxische T-Zellen macht. Eine weitere Aufklärung der hier ablaufenden Prozesse würde es erleichtern, Möglichkeiten zu finden, in diese Signalwege einzugreifen, um die Apoptosesensitivität wieder herzustellen und die Metastasierung zu verhindern. Insbesondere ist die Identifizierung des für die Apoptoseprotektion verantwortlichen Zytokins das nächste wichtige Ziel bei der Fortsetzung dieser Arbeiten.
Das Projekt zum Thema - literarisch-essayistische Reisen zu Beginn der 70er Jahre bei Rolf Dieter Brinkmann, Rom, Blicke und Bernward Vesper, Die Reise stellt ein Experiment dar. Es geht um die wissenschaftliche Bestandsaufnahme des Phänomens 1968 und um das Motiv "Resignation". Die Annäherung erfolgt im Teil A auf wissenschaftlicher Basis, die sich im Teil B in eine literarische Herangehensweise wandelt.
Ziel dieser Arbeit war es festzustellen, inwiefern im Rahmen der Diagnostik des Gastroösophagealen Refluxes mit pulmonaler Relevanz anhand des einen, oder anderen Diagnostik-Verfahrens Vorhersagen über die Ergebnisse der jeweils anderen diagnostischen Möglichkeiten gemacht werden können. Bei den hierbei üblichen Untersuchungsmethoden handelt sich es um die pH-Metrie, die BAL, sowie die oMDP. So sollten insbesondere folgende Fragen geklärt werden: Ist die 2-Punkt pH-Metrie der oMDP in der Diagnostik des pulmonal relevanten GÖR bei Kindern überlegen? Kann die pH-Metrie eine chronische Aspiration erkennen? Kann die 2-Punkt pH-Metrie eine Aussage über die pulmonale Relevanz des GÖR machen? Zur Untersuchung wurden Daten verwandt, die von Patienten im Alter von 3 Monaten bis 16 Jahren stammten, welche in den Jahren 1992 bis 1999 in der Universitätskinderklinik Frankfurt am Main wegen einer chronischen Bronchitis untersucht wurden. Bei allen Patienten wurde im Vorfeld eine Cystische Fibrose (Schweißtest, Pilocarpin-Iontophorese), eine Fremdkörperaspiration, eine Ciliendysfunktion (Cilienbeweglichkeit und -frequenz im Phasenkontrastmikroskop), ein humoraler und zellulärer Immundefekt, sowie ein exogenes Asthma bronchiale (Atopie) als Ursache für die Symptomatik ausgeschlossen. So konnte ein Kollektiv von 817 Patienten zusammengestellt werden. Aus dieser Gruppe wurden in einem ersten Schritt die Patienten ausgewählt, welche sowohl einer 2-Punkt pH-Metrie, als auch einer BAL unterzogen wurden, was zu einer Untergruppe von 400 Kindern führte. Ebenso wurde für die Untersuchung auf eine Beziehung zwischen 2-Punkt pH-Metrie und oMDP (n=511) und zwischen BAL und oMDP (n=358) verfahren. In einem weiteren Schritt wurden die Untersuchungsergebnisse in Korrelation zum Alter der untersuchten Patienten gesetzt, um so eine mögliche Altersabhängigkeit der Untersuchungsergebnisse nachweisen, oder ausschließen zu können. Die Arbeit erbrachte folgende Ergebnisse: 1. Es besteht keine signifikante Korrelation der Ergebnisse der LLAM aus der BAL mit den Parametern der 2-Punkt pH-Metrie. Dies gilt auch für die Voraussetzung, daß nur eindeutig pathologische Ergebnisse in einer der beiden Untersuchungen, oder in beiden Untersuchungen gleichzeitig bewertet wurden. 2. Die Parameter der 2-Punkt pH-Metrie korrelieren untereinander hochsignifikant (p=0.01). 3. Es besteht keine signifikante Korrelation der Ergebnisse der oMDP mit den Parametern der 2-Punkt pH-Metrie. Ausnahme: Die Altersgruppe der 3 Monate bis 2-Jährigen (positive Korrelation, p=0.05). 4. Das Alter korreliert signifikant negativ mit der Anzahl der Refluxe, sowie der Fraktionszeit (p=0.01) am oMP in der 2-Punkt pH-Metrie. Weiter korreliert es signifikant negativ mit der Anzahl der Refluxe > 5 min. am oMP (p=0.05). 5. Das Alter korreliert hochsignifikant positiv mit dem Anteil der fettspeichernden AM in der BAL (p=0.01). Unsere Ergebnisse zeigen also, dass sich kein Zusammenhang zwischen den Ergebnissen der pH-Metrie und jenen der BAL herstellen lässt. Dies gilt ebenso für die erhobenen Daten in ihrer Gesamtheit, sowie unter den oben genannten Ausschluskriterien. Ebenso konnte kein Zusammenhang zwischen den Ergebnissen der pH-Metrie und der oMDP hergestellt werden. Auch der Vergleich zwischen BAL und oMDP ergab keinen signifikanten Zusammenhang. Die signifikante Altersabhängigkeit der Anzahl der Refluxe am oMP, sowie der Fraktionszeit (beide korrelieren negativ mit dem Alter), sowie die hochsignifikante positive Korrelation der LLAM (Bewertungskriterium der BAL) mit dem Alter werfen Fragen auf. Vorausgesetzt die Bestimmung der LLAM ist eine ausreichend sensitive Methode zur Diagnostik einer chronischen Aspiration, so wäre eine gleichsinnige Entwicklung der 2-Punkt pH-Metrie-Parameter mit dem Anteil der LLAM mit dem Alter zu erwarten. Dies wird in unserer Untersuchung jedoch nicht nachgewiesen. Es gilt also, in weiteren Untersuchungen zu klären, inwiefern es sich hierbei um physiologische Veränderungen mit zunehmendem Alter handelt, bzw. wie sich die Ergebnisse in einer asymptomatischen Population verhalten. Daraus folgt also, daß die pH-Metrie weder Aussagen über das zu erwartende Ergebnis einer BAL, noch der oMDP machen kann, oder umgekehrt. Jede der Untersuchungen muss unter ihrer ganz spezifischen Fragestellung angewandt werden. So bleibt, wie in den wesentlichen Arbeiten der Literatur gefordert (Dobhan, Castell 1993; Sondheimer 2000,) die pH-Metrie der Goldstandard zur Diagnostik des GÖR. Die oMDP ist ein Mittel zur Diagnostik von Motilitätsstörungen, oder Hernien im Bereich des Ösophagus und die BAL sollte reevaluiert werden, hinsichtlich ihrer Aussagekraft in der Diagnostik der chronischen Aspiration. Die eingangs gestellten Fragen müssen also wie folgt beantwortet werden: Die 2-Punkt pH-Metrie ist der oMDP in der Diagnostik des pulmonal relevanten GÖR nur insofern überlegen, als daß sie gastro-ösophageale Refluxe über einen längeren Zeitraum dokumentieren kann. Sie ist nicht in der Lage eine Aspiration zu erkennen und kann somit keine Aussage über die pulmonale Relevanz des GÖR machen.
Die Gruppe der T-Lymphozyten beinhaltet je nach Ausprägung des T-Zell-Rezeptors zwei Zell-Populationen, die der Alpha-beta- beziehungsweise der Gamma-delta-T-Zellen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit den Gamma-delta-T-Zellen, da sie eine außerordentlich interessante und wenig erforschte Zellgruppe darstellen. Die Beobachtung einer bevorzugten Anreicherung von Gamma-delta-T-Zellen auf mukosalen Oberflächen, die mit einer Vielzahl von Antigenen konfrontiert sind, hat zur Hypothese geführt, dass Gamma-delta-T-Zellen eine "erste Garde der Immunabwehr" bilden. Des weiteren geben zahlreiche Studienergebnisse Hinweise darauf, dass Gamma-delta-T-Zellen an der Pathogenese vieler Krankheiten, wie z. B. den chronisch entzündlichen Darmerkrankungen, beteiligt sind. Als Mitglied des Immunsystems scheinen Gamma-delta-T-Zellen nicht nur Funktionen sowohl der angeborenen als auch der erworbenen Immunabwehr wahrzunehmen, sondern auch eine Vermittlerrolle zwischen beidem zu spielen. Mit der Intention, ein grosses Tiermodel zu etablieren, um anhand dessen die Beeinflussbarkeit der Gamma-delta-T-Zellen durch die Alterung und durch mikrobielle Faktoren besser analysieren zu können, wurde in vorhergehenden Studien die postnatale Entwicklung des Gamma-delta-T-Zell-Rezeptor(TCR)-Repertoires des Schweins charakterisiert und der von Menschen als sehr ähnlich befunden. Somit war die Verwendung des Schweins als Tiermodell zur weiteren Erforschung der Gamma-delta-T-Zellen gerechtfertigt. In dieser Arbeit richteten wir unser Augenmerk zum einen auf die pränatale Entwicklung des TCR-delta-Repertoires des Schweins, zum anderen darauf, welchen Einfluß Mikroorganismen auf das postnatale TCR-delta-Repertoire des Schweins nehmen. Auf diese Weise sollte die Frage beantwortet werden, ob Fremd- oder Eigenantigene die Selektion und konsekutive Expansion bestimmter Gamma-delta-T-Zellklone in der Postnatalperiode bedingen. Hinsichtlich dieser Fragestellungen führten wir Experimente mit unterschiedlichen Gewebeproben des Schweins durch. Für die Untersuchung der pränatalen Entwicklung des TCR-delta-Repertoires verwendeten wir Gewebeproben von Schweinefeten unterschiedlichen Alters (38.Tag bis 114. Tag der Tragzeit), die aus den verschiedenen Organen stammten: Dünn- und Dickdarm, Leber, Milz und Thymus. Zusätzlich wurden Zellen des Knochenmarks und des peripheren Blutes untersucht. Für die Untersuchungen zum Einfluß durch Mikroorganismen auf das postnatale TCR-delta-Repertoire dienten uns Proben von 10 Wochen alten Schweinen, die unter keimfreien (GF) bzw. spezifisch-Pathogen-freien (SPF) Bedingungen aufgezogen wurden. Die Proben wurden aus Dünn- und Dickdarm, mesenterialen Lymphknoten, Milz und Thymus entnommen. Die Amplifikation der TCRDV1-DV5 Transkripte erfolgte mittels RT-PCR, woran sich eine längenabhängige Auftrennung durch denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese (CDR3 Längenanalyse) anschloß. Einzelne dominante Banden wurden aus den Gelen ausgeschnitten, reamplifiziert, teilweise kloniert und anschließend sequenziert. Unsere Experimente zur pränatalen Entwicklung ergaben, daß das TCR-delta-Repertoire während der frühen Fetalzeit eingeschränkt war und bei Geburt Polyklonalität aufwies. Die durchschnittliche CDR3 Länge der Transkripte nahm während der Ontogenese zu, was auf eine zunehmende Aktivität des Enzyms TdT schließen läßt. Die zentrale Entdeckung dieser Versuche stellt das invariable DV3 Transkript dar, das in allen Feten während der frühen Gestation (38. Tag der Tragzeit) bis hin zur Geburt (114. Tag der Tragzeit) vorhanden war. Während der Mitte der Gestation, etwa um den 55. Tag der Tragzeit, dominierte dieses invariable DV3 Transkript alle analysierten Organe. Gegen Ende der Gestation, also etwa vom 90. Tag bis zum 114. Tag der Tragzeit, verlor dieses Trankript an Dominanz. Gleichzeitig wurde es aber noch häufig in peripheren Organen wie dem Darm und der Milz gefunden. Im Thymus hingegen konnte es zu dieser Zeit nicht mehr nachgewiesen werden. Diese Beobachtung läßt vermuten, daß die invariable DV3 Kette gegen Ende der Gestation im Thymus nicht mehr länger entsteht, wohingegen Gamma-delta-T-Zellen, die diese invariable Kette tragen, in der Peripherie "überleben". Die Tatsache, daß kein anderes invariables TCR-delta-Transkript, welches in verschiedenen Feten präsent gewesen wäre, identifiziert werden konnte, führt zur Annahme, daß den Gamma-delta-T-Zellen, die diesen Rezeptor expremieren, eine einzigartige Rolle zukommen könnte. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die pränatale Entwicklung des TCR-delta-Repertoires des Schweins dem des Menschen ähnlich ist. Es ist jedoch anzumerken, daß beim Menschen kein TCR-delta-Transkript existiert, das das fetale Repertoire in gleicher Weise dominiert. Es bedarf weiterer Untersuchungen in der Zukunft, um die Frage zu klären, ob es sich bei dem invariablen DV3 Transkript des Schweins um das Ergebnis eines vorprogrammierten Rearrangements und/oder einer Selektion durch Eigenantige handelt, ferner, welche wichtige Funktion es während der fetalen Entwicklung erfüllt. Unsere Untersuchungen zum Einfluß durch Mikroorganismen auf das postnatale TCR-delta-Repertoire ergaben keine signifikante Differenz zwischen dem postnatalen TCR-delta-Repertoire von 10 Wochen alten keimfreien (GF) bzw. spezifisch-Pathogen-freien (SPF) Schweinen und dem bereits in Vorarbeiten beschriebenen Repertoire von gleichaltrigen konventionellen Schweinen. Diese Beobachtung veranlasst zur Annahme, daß eine Selektion bestimmter Gamma-delta-T-Zellen eher durch Eigenantige als durch Fremdantigene (z. B. Mikroorganismen) hervorgerufen werden könnte.
Die vorliegende Arbeit ist mit dem Anspruch angetreten, über die Untersuchung eines spezifischen Politikfeldes die geschlechtsspezifische Konstruktion von Politik und Nationalstaat im Detail nachzuzeichnen. Es konnte gezeigt werden, dass staatstheoretische Konzeptionalisierungen innerhalb der policy-Forschung beschränkt bleiben, wenn sie weiterhin die Analyse grundlegender Herrschaftsverhältnisse wie Geschlecht und Rasse außer Acht lassen. Vor dem Hintergrund der Beschäftigung mit einer spezifischen Staatstätigkeit erscheint Staat als Verdichtung eines sozialen Kräfteverhältnisses, in anderen Worten, eines sich ständig ändernden Kompromißgleichgewichts zwischen verschiedenen gesellschaftlichen Kräften. Herrschaftsverhältnisse und die daraus resultierenden sozialen Differenzen – Geschlecht, Klasse, Ethnie – sind das Ergebnis eines Konstitutionsprozesses unterschiedlicher Akteure und des Staates selbst. Staat erscheint einerseits durchdrungen von diesen Hierarchisierungen und Differenzen und erzeugt sie andererseits. Wenn Politiken von Diskursen und Konzeptionalisierungen geprägt werden, können sie auf dieser Ebene auch verändert werden. Daher dient das präzisere Verständnis darüber, wie politische Entscheidungsprozesse entstehen und verlaufen, dem Versuch, aus einer feministischen Perspektive die Möglichkeiten auszuloten, wie Politiken verändert und mitgestaltet werden können. Wenn also davon ausgegangen werden kann, dass staatlichem Handeln spezifische Konzeptionalisierungen zu Grunde liegen, welche die Machtpotentiale gesellschaftlicher AkteurInnen strukturieren und als Legitimationsgrundlage von Herrschaftsverhältnissen dienen, scheint dies in der Entstehung und dem Verlauf politischer Entscheidungsprozesse wieder auf. Um diesen Zusammenhang zu verdeutlichen, wurde mit der vorliegenden Untersuchung der Versuch einer Verknüpfung der bevölkerungspolitischen »Empirie« mit einer Theoretisierung der Konstitutionsprozesse von Staat unternommen. Die zugrunde gelegte staatstheoretische Hypothese war dabei, dass Diskurse, Ideen (belief-Systems) und Wahrnehmungen einen entscheidenden Einfluß auf staatspolitische Strukturen (polity) und staatstragende Politiken (politics) haben und selbst wiederum von letzteren geprägt werden, woraus sich die konkreten Politikinhalte (policies) erklären. Am Beispiel der Bevölkerungspolitik in Mexiko wurde daher den Bestimmungs- und Einflußfaktoren, den Inhalten und Folgen bevölkerungsrelevanter Staatstätigkeit im Rahmen sowohl der mexikanischen als auch der internationalen Strukturen und Prozesse nachgegangen. Im Zentrum der Analyse stand der Paradigmenwechsel der mexikanischen Bevölkerungspolitik, der 1974 die pronatalistischen Politiken, die über Jahrhunderte im nationalen Diskurs mit Modernisierung und Fortschritt gleichgesetzt wurden, mit einer antinatalistischen Bevölkerungspolitik in ihr genaues Gegenteil verwandelte. ...
Die Familie der ubiquitären ATP binding cassette (ABC)-Membranproteine katalysiert unter Hydrolyse von ATP die Translokation von Substraten über biologische Membranen. In der hier vorliegenden Arbeit wurde die Struktur und Funktion des osmoprotectant uptake (Opu) Systems A aus B. subtilis untersucht, das aus drei Untereinheiten, der ATPase OpuAA, dem integralen Membranprotein OpuAB und dem Substrat-Bindeprotein OpuAC, besteht und unter hyperosmolaren Bedingungen die kompatiblen Solute Glycin-Betain (GB) und Prolin-Betain (PB) in die Zelle importiert, um eine Plasmolyse zu verhindern. Sämtliche Untereinheiten wurden getrennt oder als OpuAA/AB Komplex in E. coli überproduziert und bis zur Homogenität isoliert. OpuAA zeigte ein dynamisches Monomer-Dimer Gleichgewicht (KD= 6 µM), das durch Nukleotide beeinflusst wurde. Unter Bedingungen hoher Ionenstärke konnten Monomer und Dimer getrennt isoliert und analysiert werden. Die Affinitäten und Stöchiometrien der OpuAA/Nukleotid Komplexe wurden unter Verwendung des fluoreszierenden TNP-ATP bzw. einer Nukleotid-sensitiven Trp-Mutante des OpuAA untersucht. Das Monomer hatte ein Molekül TNP-ATP gebunden, während zwei Moleküle TNP-ATP in dimerem OpuAA detektiert wurden. Die Affinität von Nukleotiden zu OpuAA nahm in folgender Reihe zu: ATP<ATP/Mg2+<ADP/Mg2+. Eine Erhöhung der Ionenstärke bewirkte nicht nur eine Erniedrigung der KD-Werte von OpuAA/Nukleotid Komplexen, sondern auch eine Steigerung der ATPase Aktivität. In 1 M NaCl zeigte das Monomer basale ATPase Aktivität, während das Dimer nur sehr geringe Aktivität hatte, jedoch durch Zugabe von OpuAB und OpuAC aktiviert wurde. K+ wurde als ein Modulator der ATPase Aktivität von OpuAA identifiziert. Die Zugabe von TNP-ADP/Mg2+ induzierte in dimeren OpuAA einen konformellen Wechsel, der zu einem Zerfall des Dimers führte. Monomer und Dimer hatten gegenüber Nukleotiden unterschiedliche Affinitäten, was eine unterschiedliche Architektur der Nukleotid-Bindetasche implizierte. Die Architektur des OpuAA Dimers wurde mittels FRET untersucht. Dazu wurde OpuAA ortspezifisch mit Fluorophoren markiert und ein Verfahren etabliert, in dem die intermolekularen Distanzen des Dimers bestimmt werden konnten. Ein Vergleich der Distanzen mit anderen NBD Dimeren zeigte, dass OpuAA eine zu BtuD oder MalKE. coli vergleichbare Dimer Architektur mit einer head-to-tail Orientierung hat. Die Struktur des OpuAC/GB und OpuAC/PB Komplexes wurde durch Röntgenstrukturanalyse mit einer Auflösung von 2,7 Å bzw. 2,8 Å aufgeklärt und zeigte zwei globuläre Domänen, die über zwei Peptidsegmente miteinander verbunden waren. Die delokalisierte positive Ladung des Liganden war von einem cluster aus drei Trp-Resten, dem sog. "Tryptophan-Prisma", über kationische-p-Interaktion komplexiert. Nach Ligandenbindung wurden beide Domänen durch eine Wasserstoffbrücke zwischen den konservierten Asp22 und Trp178 überbrückt. Dieser molekulare Schalter wurde von OpuAC genutzt, um Affinitäten von GB und PB zu regulieren.
Die 2-DE-Technik wurde in der Mitte der 70er Jahre von O` Farrelle und Klose vorgestellt, die schon damals die Inhalte ganzer Zellen unter denaturierenden Bedingungen in hunderte bzw. tausende Proteinspots auftrennen konnten. Mangelnde Reproduzierbarkeit und fehlende Auswertungsmöglichkeiten verhinderten jedoch zu diesem Zeitpunkt eine breite Anwendung und damit größeres Interesse an der Methode. In den 80er Jahren erreichte die Methode mit der Einführung immobilisierter pH-Gradienten und der MALDI-Massenspektrometrie einen entscheidenden Wendepunkt. Seit dem Ende der 80er Jahren wird die Methode aufgrund der Möglichkeit der gleichzeitigen Proteinidentifizierung und Quantifizierung auch zunehmend in der Krebsforschung in der Suche nach neuen Markerproteinen eingesetzt. Das Uterusgewebe ist ein Organ, das während der reproduktiven Phase im Leben einer Frau ständig zyklisch verlaufenden physiologischen Änderungen unterworfen ist. Das Leiomyom, ein gutartiger monoklonaler Tumor aus den glatten Muskelzellen des menschlichen Uterus, ist eine der häufigsten gynäkologischen Erkrankung in der westlichen Welt, über deren Ursachen trotz intensiver Forschung nach wie vor fast nichts bekannt ist. Die 2-DE-Technik eignet sich in hervorragender Weise zur Untersuchung derartiger Abweichungen in der Proteinexpression während eines Krankheitsprozesses. Bezüglich der Methodenetablierung und ihrer Reproduzierbarkeit im speziellen Fall des Uterusgewebes bildet der Zellaufschluss der Probe, insbesondre aus harten Geweben, einen zentralen Punkt in der Erarbeitung der Methodik der 2-DE, da ein hohes Risiko besteht, einen großen Teil der Proteine schon während der ersten Probenbearbeitung zu verlieren. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue Aufschlussmethode für die Aufarbeitung des zähen Muskelgewebes ohne größere Proteinverluste entwickelt, indem das Uterusgewebe zunächst mechanisch (Ultra-Turrax) und anschließend mit Ultraschall homogenisiert wird. Die Solubilisierung der Proteinprobe bildet den zweiten wichtigen Punkt der 2-DE-Methodik. Die Solubilisierung während der Proteinextraktion und des Eintritts der Proteinprobe in die fokussierende Gel-Matrix, die aufgetragene Proteinmenge, die Fokussierungsparameter und die zweite Dimension wurde so optimiert, dass die Proteinauflösung eine konstant hohe Qualität auf den Gelen erreichte und damit eine semiquantitative Auswertbarkeit gesichert wurde. Bezüglich der Reproduzierbarkeit der Methode wurden die methodeninhärenten Probleme wie Gelfärbung, Probenpräparation und Auswertungsverfahren untersucht. Die Methodenvalidierung bezüglich der Gelfärbung zeigte, inwieweit die Auswertung, insbesondre bei schwachen Spots, beeinflusst werden kann. Im allgemeinen wurde die angewendete 2-DE-Technik für die Proteinanalyse des Uterus für gut reproduzierbar gefunden. Die Bestimmung der HKP lieferte die Grundlage einer gewebetypischen Proteindatenbank und erlaubt es außerdem, über die Gele ein Koordinationssystem zu legen, mit dem nachfolgende Proteinidentifizierungen erleichtert werden können. In dieser Arbeit konnten 48 Spots als HKP identifiziert werden. Als thematischer Schwerpunkt der Dissertation wurden die Abweichungen der Proteinexpression im Fall des Uterus myomatosus im Vergleich zu einem Kollektiv ohne muskuläre Pathologie des Uterus untersucht. Die Analyse der 2-DE von Patientenproben ergab gegenüber einer schwachen Expression bei den Vergleichsproben eine Überexpression von Prohibitin (PHB1), alpha-2-Aktin und human Growth Hormon Rezeptorprotein (hGhRP) im Endometrium bzw. im darunter liegenden subendometrialen Myometrium und eine hohe Expression im Tumorgewebe (Myomgewebe). Weiteres zeigte die 2-DE-Analyse bei Patientenproben eine Downregulation von zwei Proteinen (beta-4-Proteasom und Fibrinogen) im Gegensatz zur Expression bei den Gesunden. Die analytischen Ergebnisse aus Tumorgeweben verglichen mit den SE-und SS-Geweben derselben Patientinnen zeigten eine deutliche Expression von einigen Proteinen (Desmin, F-Actin, Transaldolase, Thioredoxin-Peroxidase und mutative Glutathion-Transferase), deren Expression in den morphologisch unauffälligen Geweben aller Schichten des Uterus nicht zu beobachten war.
Schichten V/Al-Intermetallischer Phasen und Schichten aus V(Al) (Schichtdicken 150- 300 nm) wurden durch Interdiffusion von V/Al- und V5Al8/V-Mehrfachschichten bei 400-800°C im Vakuum bei 3 x 10-8 mbar hergestellt. Des Weiteren wurden V5Al8-Schichten durch Sputtern einer V5Al8-Legierung erzeugt. Die Gesamtstöchiometrie der Schichten lag zwischen Al0,86V0,14 und Al0,19V0,81. Als Substrat dienten einkristalline (012) Saphirwafer. Die V/Al-Intermetallischen Phasen und V(Al) wurden im RTP-System bei 600-1250°C mit NH 3 umgesetzt. Zum Vergleich der Reaktivität wurden die V/Al- und V5Al8/V-Mehrfachschichten auch ohne vorherige Vakuumtemperung in NH3 getempert. Die Proben wurden mittels XRD, SNMS, TEM/EFTEM, ESCA, XRR und AFM untersucht. Die V/Al-Mehrfachschichten besaßen eine starke Welligkeit, die von der starken Al-Schichtdickenschwankung herrührte. Trotz dieser Welligkeit zeigten die V- und Al-Schichten der V/Al-Mehrfachschicht eine ausgeprägte Textur. Die V-Schichten waren (110) und die Al-Schichten (111) texturiert. Die Bildung von (112) texturiertem Al3V erfolgte bereits bei 400°C, die Bildung von (110) texturiertem V 5Al8 und V(Al) bei 700°C. In der Nähe der Oberfläche durchmischten sich die V- und Al-Schichten aufgrund von O- und C-Einlagerung während der Vakuumtemperung nicht vollständig, und man beobachtete die Bildung von V-Oxiden. Je größer der V-Gehalt der Intermetallischen Verbindung bzw. V(Al), desto größer war die Reaktivität gegenüber Sauerstoff. Bei der Nitridierung der durch Interdiffusion gewonnen Intermetallischen Phasen Al3V und V5Al8 beobachtete man die Bildung von (001) texturiertem AlN an der Oberfläche. Durch die Nitridierung verarmte die Intermetallische Phase an Aluminium und es bildeten sich die V-reicheren Intermetallischen Verbindungen. Weitere Nitridierung führte zur Bildung von (001) texturiertem V2N. Bei der Nitridierung von V0,81(Al)0,19 bildete sich zunächst V(Al)(N), das bei weiterer Nitridierung zunächst in V2N und schließlich in VN und AlN überging. Das Reaktionsverhalten der Intermetallischen Phasen und der V(Al)-Phase stimmte weitestgehend mit dem von Yong Du et al. berechneten ternären Al/V/N-Phasendiagramm überein. Bei der Nitridierung von V0,61(Al)0,39 beobachtete man jedoch ebenfalls die Bildung von V2N. Dies widerspricht dem berechneten V/Al/N-Phasendiagramm, nachdem sich bei dieser Zusammensetzung auch AlN bilden sollte. Möglicherweise ist das Zweiphasengebiet V(Al)(N) + V2N breiter. Die Intermetallischen Phasen Al3V und V5Al8 zeigten im Vergleich zu reinem Vanadium eine stark verminderte Reaktivität gegenüber NH3. Dies ist auf die Passivierung der Oberfläche durch die AlN-Bildung zurückzuführen. Die ebenfalls schwächere Reaktivität der V(Al)-Phase lässt sich mit der geringen Löslichkeit an Stickstoff in V(Al) und der sehr wahrscheinlich höheren Aktivierungsenergie für die V2N-Bildung erklären. Die Reaktivität der V/Al-Mehrfachschichten war deutlich größer als die der Intermetallischen Phasen. Hierfür ist mit Sicherheit der höhere Anteil an Korngrenzendiffusion verantwortlich. Zum anderen könnte Vanadium die AlN-Bildung katalysieren. Bei der direkten Nitridierung wurde die oberste V-Schicht zu einer VN-Schicht umgesetzt. Die Nitridierung ist also nahe der Oberfläche schneller als die Interdiffusion der Metalle. In Richtung der Oberfläche beobachtete man eine stark ansteigende Al-Konzentration, wofür die im Vergleich zu VN höhere Freie Enthalpie von AlN verantwortlich ist. Durch das Sputtern einer V5Al8-Legierung konnte das Problem der Oxidbildung bei der Interdiffusion umgangen werden. Eine dünne Aluminiumoxidschicht bildete sich jedoch bereits schon bei der Lagerung an Luft. Die Reaktivität der gesputterten V5Al8-Schichten unterschied sich nicht wesentlich von der interdiffundierter V/Al-Mehrfachschichten vergleichbarer Stöchiometrie. Tiefenprofilanalysen an nitridierten V5Al8-Schichten machten deutlich, dass zwischen 600 und 900°C eine bemerkenswerte Menge an Sauerstoff in die AlN-Schicht eingebaut wurde. Ab 900°C stieg die Dicke der Aluminiumoxinitridschicht stark an. Eine weitere Temperaturerhöhung auf 1250°C führte zu keiner sign ifikanten Zunahme der AlN-Schichtdicke, jedoch zu einer starken Reduktion des O-Gehalts im AlN. Gleichzeitig beobachtete man bei 1250°C eine partielle Ablösung der AlN-Schicht.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden auf dem Gebiet reaktiver Silicium-Spezies folgende apparative und experimentelle Forschungsergebnisse erzielt: Zunächst wurde eine Hochtemperatur-Pyrolyse Anlage entworfen, die mit Hilfe von Hochvakuum-Bedingungen (p< 5x10 hoch -9 mbar) Verdünnungseffekte simuliert, um die in der Gasphase erzeugten Moleküle unter solchen Bedingungen zu studieren, bei denen sie keine Folgereaktionen mit weiteren Partnern eingehen können. In die Apparatur integriert wurde ein Ofen (Tmax ungefähr gleich 1200°C) für die Pyrolyse von Stoffgemischen sowie zur Analyse des erzeugten Molekularstrahls ein Quadrupol-Massenspektrometer (0-300 amu, EI-Quelle, SEV). Es wurden Precursoren synthetisiert, die durch Thermolyse infolge intramolekularer Umlagerungen und Abspaltungen definierter Abgangsgruppen Si=X-Doppelbindungen (X= O, S) ausbilden. Diese Precursoren und ihre Pyrolyseprodukte wurden sowohl in der neuen Anlage als auch mittels eines vorhandenen PE-Spektrometers charakterisiert. Parallel zu den Synthesen wurden quantenmechanische Berechnungen an den Produkten der Pyrolysereaktionen durchgeführt, um ihre Eigenschaften, wie z.B. die Orbitalenergien und ihre Strukturparameter, zu bestimmen. Die Ergebnisse sollten die Interpretation der spektroskopischen Untersuchungen (PE und MS) unterstützen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Fragestellungen bearbeitet, die in anderen Teilprojekten der Arbeitsgruppe von essentiellem Interesse sind. Dabei wurden Lösungen zu Fragestellungen der direkten Si-C-Knüpfung und von Silylen-Reaktionen erarbeitet. Eine Versuchsreihe, die durchgeführt wurde, beschäftigte sich mit den Hochtemperaturreaktionen von SiCl4 und SiF4. Die flüchtigen Ausgangssubstanzen wurden im Pyrolyseofen bei ansteigenden Temperaturen mit pulverförmigem elementarem Silicium oder SiO umgesetzt. Hierbei wurden die Bildungsbedingungen von Dihalogensilylenen in der Gasphase optimiert. In einer weiteren Fragestellung wurden die Thermolyseeigenschaften von Si und SiO untersucht. Beide Feststoffe können ab einer Temperatur von ca. 1000°C und einem Druck von 2x10 hoch -6 mbar atomar bzw. molekular in die Gasphase überführt werden. Dort reagieren sie mit Halogensilanen unter Bildung von Silylenen und Chlorsilanen. Weiterhin wurde eine Disproportionierung von SiO zu Silicium und SiO2 unter hohen Temperaturen beobachtet; konsequenterweise wird dabei Sauerstoff freigesetzt. Weiterhin wurde versucht, die Produkte der Halogensilan-Pyrolyse mit Oxidationsmitteln wie Ethylenoxid zur Reaktion zu bringen. Zuletzt wurden Hydrolyse-Versuche mit SiCl4/SiF4 bzw. :SiCl2/:SiF2 und Wasser untersucht.
Die Entwicklung von Wirkstoffträgern für Antisense-Oligdesoxyonukleotide auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln stellt einen interessanten Ansatz für antivirale Strategien dar. So konnte gezeigt werden, dass bereits ab einem 1,5-fachen Massenüberschuss an Protamin eine spontane Komplexbildung mit Antisense-Wirkstoffen stattfindet, die einen Größenbereich von etwa 200 nm aufweisen und durch eine Oberflächenladung von ca. + 20 mV charakterisiert sind. Aufgrund dieser physikalischen Eigenschaften besitzen diese Nanopartikel nahezu ideale Eigenschaften, die intrazelluläre Verfügbarkeit von Antisense-Wirkstoffen entscheidend zu verbessern. Eine sehr gute zelluläre Aufnahme von Protamin/Antisense-Nanopartikeln konnte entsprechend in primären humanen Makrophagen als auch in lymphozytären T-Zellen gezeigt werden. Die Anwendung dieser Wirkstoffträger in den beschriebenen Zellen erwies sich dabei als sehr gut verträglich und zeigte keine toxischen Wirkungen in insgesamt drei unterschiedlichen Testverfahren zur Bestimmung der Zelltoxizität. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Protamin/Antisense-Nanopartikel mit unmodifizierten Antisense-Oligodesoxynukleotiden ein sehr günstiges intrazelluläres Auflösungsverhalten besitzen, was zu einer kontinuierlichen Freisetzung des inkorporierten Antisense- Wirkstoffs führte. Dabei wurde deutlich, dass nach spätestens 72 Stunden ein vollständiger Zerfall des Nanopartikels stattfand und der Wirkstoff sich gleichmäßig in intrazellulären Kompartimenten verteilte. Im Gegensatz dazu stellen Protamin/Antisense-Nanopartikel mit modifizierten Phosphorothioat-Wirkstoffen ein äußerst stabiles System dar, das zu keiner merklichen intrazellulären Wirkstofffreisetzung selbst nach 72 Stunden führte. Es konnte gezeigt werden, dass Protamin/AS-ODN-Nanopartikel die Expression eines von einem lentiviralen Vektor exprimierten Reportergens konzentrationsabhängig in primären humanen Makrophagen inhibieren konnte. Die antivirale Wirksamkeit dieser Wirkstoffträger konnte auch gegen das HIV-1-spezifische Transaktivatorprotein Tat in transient transfizierten Zielzellen der HIV-1-Infektion spezifisch demonstriert werden. Hier wurde eine selektive Inhibition der Tat-vermittelten Transaktivierung von 35 % bei einer Konzentration von 2 MikroM in Jurkat-Zellen nachgewiesen. Auch in primären Makrophagen, die mit einem HIV-1-Wildtypisolat infiziert wurden, führte die Anwendung von Protamin/AS-ODN-Nanopartikeln mit spezifischen Sequenzen gegen ein HIV-1-Gen zu einer deutliche Reduktion der Virusausbreitung in der Kultur. Bei einer wiederholten Behandlung von HIV-1-infizierten Makrophagen mit Protamin/AS-ODN-Nanopartikel in einer Konzentration von 2 MikroM zeigten nur einige wenige Zellen eine Infektion mit dem Virus, während sich in unbehandelten Zellen eine komplett durchinfizierte Kultur manifestiert hatte. Entsprechend der ungünstigen Bioverfügbarkeit von AS-PTO-Wirkstoffen nach intrazellulärem Transport in Form von Protamin-Nanopartikeln konnte für diese Formulierungen keine biologische Wirkung in Zellkultursystemen nachgewiesen werden. Die Inkorporation von destabilisierenden Zusätzen in die Nanopartikelmatrix bietet hier Möglichkeiten, die intrazelluläre Dekomplexierung dieser Wirkstoffträger günstig zu beeinflussen. Als Neuentwicklung konnte ein kolloidales Trägersystem für siRNA-Wirkstoffe auf der Basis von Protamin-Nanopartikeln entwickelt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Protaminbase als auch Protaminsulfat siRNA-Wirkstoffe ab einem 2,5-fachen Massenüberschuss komplexieren. Protamin basierte Nanopartikel für siRNA-Wirkstoffe waren durch ein sehr günstiges Zellaufnahmeverhalten und fehlende zytotoxische Wirkung in primären humanen Makrophagen gekennzeichnet. Trotz dieser idealen Ausgangsbedingungen zeigten biologische Wirksamkeitstestungen sowohl gegen das endogene Protein Lamin A/C als auch virale Hemmversuche in HIV-1- infizierten primären Makrophagen nur marginale Effekte. Eine weitere Optimierung der Nanopartikelzusammensetzung und Untersuchungen zur intrazellulären Stabilität sind nötig, um die biologische Aktivität dieser Formulierungen entscheidend zu verbessern. Oberflächenmodifizierte Nanopartikel auf der Basis von Gelatine erwiesen sich in den durchgeführten Experimente als besonders vielversprechend. Hier konnte gezeigt werden, dass ein spezifisches Targeting von T-Zellen mit CD3-Gelatine-Nanopartikel realisiert werden kann, die auf ihrer Oberfläche kovalent einen anti-CD3-Antikörper tragen, der gegen die T-Zell spezifische Zeta-Kette des T-Zell-Rezeptor-Komplexes gerichtet ist. Untersuchungen mit konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie zeigten, dass dabei die Zellaufnahme dieser Wirkstoffträger von der Expression des durch den Antikörper erkannten Zielantigens auf der Oberfläche der Zielzellen ist. In Zellen mit besonders starker Expression des CD3-Epitops wurden Gelatine-Nanopartikel mit oberflächengebundenem anti-CD3-Antikörper zu einem sehr bedeutendem Ausmaß selektiv aufgenommen. In Kompetitionsexperimenten mit freiem anti-CD3-Antikörper konnte diese Aufnahme deutlich reduziert werden, was für die selektive Bindung und Internalisierung der CD3-Gelatine- Nanopartikel über den oberflächengebundenen Antikörper schließen läßt. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass CD3-Gelatine-Nanopartikel das Potential besitzen, als selektives Wirkstoffträgersystem für T-Zellen eingesetzt zu werden.
Mit der nichtenzymatischen templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA zu Selektionsexperimenten
(2004)
Die vorliegende Dissertation beruht auf der Nichtenzymatischen Templatgesteuerten Oligomerisierung von RNA. Dazu inkubiert man einen farbstoffmarkierten Primer mit komplementären Templaten und aktivierten Monomeren, den 2-Methyl-Phosphorimidazoliden. Die Verlängerung des Primers wurde durch Gelelektrophorese mit anschließender Detektion des Fluoreszenzfarbstoffs nachgewiesen. Eine erfolgreiche Primerverlängerung ist an viele Vorraussetzungen gebunden. Wichtig ist, dass der Duplex in der A-Konformation vorliegt. Deshalb ist es nötig, dass wenigstens der Primer oder das Templat aus RNA besteht. Von großem Vorteil ist, wenn die Basenpaare drei Wasserstoffbrücken ausbilden können. Auch die Stapelwechselwirkung ist ebenso wichtig für eine effiziente Kettenverlängerung, der Einbau von Purinen verläuft besser als der Einbau von Pyrimidinen. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Durchführung eines nichtenzymatischen PCR-artigen Experiments möglich ist. Das Verlängerungsprodukt der Hin-Reaktion wurde durch eine präparative Polyacrylamid Gelelektrophorese isoliert. Dieses diente dann als Templat für die Rückreaktion. Das Experiment aus Hin- und Rückreaktion bildete die Grundlage für ein Selektionsexperiment. Die Template wurden dafür um Zufallspositionen erweitert, die zwischen die Primerbindestellen eingefügt wurden. Nach mehrmaligem Durchlaufen des Zyklus aus Hin- und Rückreaktion sollte es sich zeigen, ob sich bestimmte Nucleotide in den Sequenzen angereichert haben. Zur Analyse wurde eine Methode basierend auf einer RP-HPLC entwickelt. Die vollverlängerten Produkte wurden mittels Gelelektrophorese isoliert und durch basische Hydrolyse in Monomere gespalten. Nach anschließender enzymatischer Dephosphorylierung konnte der Anteil der Nucleoside durch RP-HPLC bestimmt werden. Die erste erfolgreiche Anwendung fand diese Methode in der Analyse des Einbaus gegenüber T (U). Hier konkurrieren nämlich D (A) durch Watson/Crick-Paarung und G durch Wobble-Paarung um die Bindestelle. Aus diesem Grund bildeten sich bei Templaten aus C und T und der Inkubation nur mit G-Imidazolid allein die vollverlängerten Produkte zu einem hohen Anteil. Bei Reaktionen mit den Imidazoliden G und D konnte gezeigt werden, dass gegenüber T der Watson/Crick Partner D etwa dreimal häufiger eingebaut wurde als G. Eine weitere wichtige Grundlage für ein Selektionsexperiment bildete die Untersuchung, ob sich gegenüber Zufallspositionen überhaupt eine Kettenverlängerung feststellen lässt. Dazu wurde die Verlängerung unterschiedlicher Primer mit Templaten untersucht, die an einer oder mehreren Stellen Positionen aus [C/T] oder [A/C/G/T] enthielten. Es war deutlich zu sehen, dass die Verlängerung an solchen random-Sequenzen möglich ist. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn man entweder nur mit 2-MeImpG allein oder mit 2-MeImpG und 2-MeImpD inkubierte. Die Verwendung aller vier Imidazolide aus C, D, G und U führte zwar auch zu vollverlängerten Produkten, ihr Anteil war aber deutlich geringer. Eine andere wichtige Aufgabe dieser Dissertation war die Aufklärung der Ursache für die kritische Länge der Template. Es konnte gezeigt werden, dass die Bildung von G-Quadrupelsträngen nicht der Grund ist, der den reibungslosen Einbau an längeren "homoC" Templaten verhindert. Zusätze von NaCl oder LiCl beeinflussten die Effizienz dieser Reaktionen kaum. Gute Resultate wurden bei der Verlängerung an Homopyrimidin-Templaten, die aus C und T bestanden, erzielt. Das vollverlängerte Produkt bildete sich bei der Verwendung von 2-MeImpG und 2-MeImpD in hohen Ausbeuten. Interessante Resultate ergaben sich im Fall des Einbaus von C an "homoG" Templaten. Die besten Ergebnisse wurden erzielt, wenn völlig auf Na+-Ionen verzichtet wurde. Die Verwendung von Li-Imidazoliden, die auch in höherer Konzentration eingesetzt werden konnten, steigerte die Effizienz dieser Reaktionen deutlich. Durch das reduzierte stacking liefen alle Reaktionen allerdings langsamer und unvollständiger ab als beim Einbau von G an "homoC" Templaten. Die Stabilisierung des Duplexes durch stacking ist also entscheidend für erfolgreiche Primerverlängerungen. Überraschend schlechte Ergebnisse waren zu beobachten, wenn die Template gleichzeitig aus G und C aufgebaut waren. Die vollständig verlängerten Produkte wurden zu einem sehr geringen Anteil gebildet. Zusätzlich zum geringeren stacking der Pyrimidine, wurden Unregelmäßigkeiten in der Doppelhelixstruktur, die durch das abwechselnde Auftreten von Purinen und Pyrimidinen verursacht worden sind, als Ursache ausgemacht. Als neue Vorrausetzung für eine effiziente Kettenverlängerung hat sich also das Vorliegen einer regelmäßigen Doppelhelixstruktur herausgestellt.
Zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killer-Zellen sind hochspezialisierte Zellen des Immunsystems, die durch Sekretion der Serin-Protease Granzym B (GrB) und des membranolytischen Proteins Perforin Virusinfizierte, körperfremde oder auch Tumorzellen durch Induktion von apoptotischem Zelltod eliminieren. Während Perforin für die Aufnahme von Granzym B in Zielzellen verantwortlich ist, wirkt Granzym B im Zytosol als aktive Effektor-Caspase und spaltet Caspase-3 und andere zelluläre Caspasen sowie verschiedene zentrale Caspasen-Substrate. Granzym B aktiviert damit wie Caspase-3 Apoptose-Signalwege am unteren Effektorende und umgeht daher die meisten Kontrollmechanismen, die in Tumorzellen häufig dereguliert sind und zur Resistenz gegenüber klassischer Chemo- und Strahlentherapie führen. Beide Proteasen stellen damit vielversprechende Enzymaktivitäten für die Verwendung als Effektorfunktion in Tumorzell-spezifischen zytotoxischen Fusionsproteinen dar. In der vorliegenden Arbeit wurden rekombinante Formen von Granzym B und Caspase-3 hergestellt und daraufhin untersucht, ob beide Enzyme mit dem ErbB2-spezifischen "single chain" Antikörper scFv (FRP5) als Tumorzell-spezifischer Zellbindungsdomäne fusioniert werden können, ohne dadurch die Faltung der Proteasen zu verhindern, um eine gezielte Applikation in Tumorzellen und Eliminierung der Zellen durch Apoptose zu ermöglichen. Die Herstellung von Granzym B als rekombinantes Protein im präparativen Maßstab war bisher nicht in der Literatur beschrieben worden. In dieser Arbeit konnte humanes aktives Granzym B in der Hefe Pichia pastoris mit Ausbeuten von 1 bis 4 mg/l Kultur exprimiert werden. Zum Nachweis der enzymatischen Aktivität wurde ein in vitro Assays etabliert, bei dem rekombinante Procaspase-3 als Substrat für Granzym B eingesetzt wurde. Nach intrazellulärer Applikation mit einem synthetischen Transduktionsreagens induziert das gereinigte Protein Apoptose in HeLa Zellen. Wie für endogenes Granzym B in der Literatur beschrieben, wird rekombinantes Granzym B aus Pichia pastoris sehr schnell in HeLa Zellen aufgenommen, lokalisiert aber in vesikulären Strukturen, in denen die enzymatische Aktivität eingeschlossen ist. Aus verschiedenen Expressionskulturen wurden jedoch zwei unterschiedliche Proteine isoliert, die bei vergleichbarer molarer Masse und enzymatischer Aktivität in Zellen aufgenommen wurden bzw. nicht internalisierten, was darauf hinweist, daß eine posttranslationale Modifikation der Protease für die Bindung von Granzym B an Zielzellen verantwortlich ist. Während für die Freisetzung von Granzym B aus den Membranvesikeln und Induktion von Apoptose Perforin erforderlich ist, konnte in dieser Arbeit beobachtet werden, daß Kulturen verschiedener etablierter Tumorzellinien nach Behandlung mit Granzym B auch in Abwesenheit von Perforin-Aktivität auffallende morphologische Veränderungen zeigen, die mit dem partiellen Verlust des Kontakts zum Kultursubstrat verbunden sind. Dies deutet darauf hin, daß Granzym B auch extrazellulär auf Zellen einwirkt, indem es Komponenten der extrazellulären Matrix spaltet, und so indirekt Apoptose durch Anoikis induziert. Dieser Effekt ist jedoch für eine mögliche therapeutische Verwendung von Granzym B nicht von Bedeutung, da relativ hohe Proteinkonzentrationen erforderlich sind. Um Granzym B selektiv gegen Tumorzellen zu richten, wurden verschiedene Fusionen mit dem "single chain" Antikörper scFv(FRP5) sowie einer bakteriellen Translokationsdomäne von Exotoxin A oder Diphtherietoxin konstruiert und in E. coli oder Pichia pastoris exprimiert. Während verschiedene in E. coli hergestellte Fusionsproteine nicht enzymatisch aktiv waren, konnte im Überstand einer Pichia Expressionskultur volle-Länge GrB-scFv(FRP5) sowie Granzym B Aktivität nachgewiesen werden. Die Expressionsrate war allerdings so gering, daß eine präparative Isolierung nicht möglich war. Es konnte damit aber gezeigt werden, daß die Fusion heterologer Proteindomänen an den C-Terminus von Granzym B unter Erhalt der enzymatischen Aktivität prinzipiell möglich ist, während zusätzliche Peptidsequenzen am N-Terminus der Protease zumindest partiell zum Verlust der enzymatischen Aktivität führen. Aktive Caspase-3 besteht aus zwei Peptiden p12 und p17, die im aktiven Enzym ein Tetramer (p12 p17)2 bilden. Um Caspase-3 selektiv in Tumorzellen zu applizieren, wurden ebenfalls Möglichkeiten untersucht, eine der beiden Untereinheiten mit dem scFv(FRP5) als Tumorzell-spezifische Zellbindungsdomäne zu fusionieren. Während aus den beiden separat in E. coli exprimierten p12 und p17 Untereinheiten durch gemeinsame Rückfaltung enzymatisch aktive Caspase-3 rekonstituiert werden konnte, führte die Fusion heterologer Proteindomänen an den N- und C-Terminus der p12 Untereinheit sowie an den C-Terminus der p17 Untereinheit zum Verlust der enzymatischen Aktivität, wahrscheinlich aufgrund der Verhinderung der korrekten Faltung des Protease-Tetramers. Dagegen konnte an den N-Terminus der p17 Untereinheit eine bakterielle Translokationsdomäne unter Erhalt der enzymatischen Aktivität fusioniert werden; ein entsprechendes Konstrukt, das zusätzlich den "single chain" Antikörper scFv(FRP5) enthielt, wurde aber in E. coli vollständig degradiert. Nachdem die Idee, Granzym B oder aktive Caspase-3 zur selektiven Induktion von Apoptose in Tumorzellen für therapeutische Zwecke einzusetzen, bereits seit längerem diskutiert wird, es jedoch bisher praktisch nicht möglich war, entsprechende rekombinante Fusionsproteine in funktionaler Form herzustellen, liefern die Ergebnisse dieser Arbeit wichtige grundlegende Informationen, wie die weitere Entwicklung solcher Moleküle erfolgreich durchgeführt werden könnte.
Das humane Zytomegalievirus (HCMV) gehört zur Familie der beta-Herpesviridae. Bis zu 80% menschlichen Bevölkerung sind weltweit mit dem Virus infiziert. Nach einer meist asymptotischen Erstinfektion persistiert HCMV lebenslang in seinem Wirtsorganismus. Im Laufe der Evolution wurden von einigen Herpesviren verschiedene Strategien entwickelt, um der Antigenprozessierung und damit der zellulären Immunantwort zu entgehen. Das HCMV-Protein US6 blockiert die Antigenpräsentation via MHC I. US6 ist ein ER-ständiges Typ I Transmembranglykoprotein bestehend aus einer Signalsequenz, einer ER-luminalen Domäne, einer Transmembranhelix und einem kurzen zytoplasmatischen C-Terminus. US6 inhibiert den TAP-abhängigen Peptidtransport aus dem Zytoplasma in das ER-Lumen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die ER-luminale Domäne von US6 bestehend aus der Primärsequenz 20-146 heterolog in E. coli exprimiert und aus inclusion bodies rückgefaltet. Das rückgefaltete Protein erwies sich als Monomer (15,6 kDa). Die in der ER-luminalen Domäne befindlichen acht Cysteine bilden ein intramolekulares Netzwerk aus vier Disulfidbrücken. Zur Aufklärung des molekularen Inhibitionsmechanismus von US6(20-146) wurden verschiedene in vitro TAP-Funktions-Assays angewendet. Die Bindung von US6 an die ER-luminalen Bereiche von TAP blockiert die ATP-Bindung in den zytoplasmatischen NBD des Transporters. Die Peptid- und ADP-Bindung von TAP ist nicht beeinflusst, durch die Inhibition der ATP-Bindung wird jedoch die Peptid-induzierte ATP-Hydrolyse unterbunden. Für die Inhibitionsreaktion konnte ein halbmaximaler Inhibitionskoeffizient (IC50) von 1 µM ermittelt werden. Für die inhibitorische Aktivität von US6 sind die C-terminalen Aminosäuren 126-139 der ER-luminalen Domäne von US6 verantwortlich. Die innerhalb dieser Region befindlichen Aminosäuren Cys127, Cys129, D130, W134 und R138 wurden gegen Serin bzw. Alanin ersetzt. Dies hatte keine Auswirkung auf die Aktivität von US6(20-146). Auch ist der N-Terminus von US6 nicht essentiell für die Aktivität.
Die Promotionsarbeit stellt sich die Aufgabe, den christlichen Missions- oder Sendungsbegriff in seinem nachkonziliaren Verständnis durch eigene Feldforschung empirisch zu überprüfen. Am Beispiel von überwiegend von Christen durchgeführter Entwicklungsarbeit mit Frauengruppen in Indien kann der v.a. geschichtlich belastete Missionsbegriff revidiert werden. Im Schnittfeld von Soziologie/Ethnologie einerseits und Praktischer sowie Systematischer Theologie andererseits stehend gliedert sich die Arbeit in drei große Teile: Theorie-Teil A. Untersuchung des bisherigen Missionsbegriffs, Empirie-Teil B. Theoriegenerierung aus den erhobenen Daten des Entwicklungsprojektes und Synthese-Teil C. Rückfragen aus der Projektanalyse an den christlichen Sendungsbegriff. Teil A diskutiert die mit dem Zweiten Vatikanum eingeläutete Wende des Missionsverständnisses weg von einer geographischen Begrenzung hin zu einer Wesensaktivität der Kirche und die teilweise Rücknahme dieses Neuverständnisses in nachkonziliaren kirchenamtlichen Dokumenten. Sodann wird das Verständnis von Mission bzw. christlicher Sendung in der heutigen theologischen Forschung unter Einschluss der indischen Theologie dargestellt. Gerade in Indien wird die historische Belastung des Begriffs Mission und zugleich ein Bedarf an missionarischen Handeln in Form von Zeugnis geben deutlich. Vier entscheidende Leitfragen, welche durch die Feldforschung zu beantworten sind, resultieren daraus: Wer betreibt Mission? Bei welcher Zielgruppe spricht man von Mission? Wie ist Mission einzugrenzen? Was ist eine missionarische Tätigkeit? Teil 3 wertet die Daten der Feldforschung in einem südindischen Dorf aus. Dabei gewährleistet die Methode der Grounded Theorie als reflexiv-parallel verlaufender Prozess der Datengewinnung, Datenauswertung und Dateninterpretation, dass theoretische Missionsansätze nicht als Hypothesen herangezogen werden. Die Datenanalyse orientiert sich an der rekonstruktiven Sozialforschung. Der Teil C diskutiert anhand der vier Leitfragen den Überschuß des bisherigen, in Teil A diskutierten Sendungsbegriffs, der im Projekt noch nicht zum Tragen kommt, und zugleich seine Mängel, welche die Projektauswertung aufzeigt. Daraus resultiert: (1) Die Identifikation mit dem christlichen Glauben beinhaltet per se eine missionarische Dimension, jeder Christ handelt also unbewusst missionarisch. (2) Dieses missionarische Handeln geschieht sowohl gegenüber Christen wie gegenüber Nicht-Christen, jedoch ist die Kommunikationsweise verschieden. (3) Deswegen wird zwischen innerer und äußerer Mission unterschieden: Äußere Mission findet überall dort statt, wo Christen mit Nicht-Christen kommunizieren. Sie endet gegebenenfalls bei deren freier Entscheidung für das Christ-sein. Dort, wo die äußere Mission zu einer Identifizierung mit dem Inhalt der christlichen Botschaft führt, beginnt die innere Mission, welche nie endet. (4) Insofern ist jedwedes bewusste und unbewusste, verbale und non-verbale Kommunizieren eines überzeugten Christen als missionarische Tätigkeit zu bezeichnen. Entsprechend wird Entwicklungsarbeit, von Christen durchgeführt, auch zu einer missionarischen Tätigkeit, sofern Christen aus ihrem Christ-sein heraus leben und handeln.
Der CD95 Ligand (CD95L, FasL) ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)- Superfamilie und ist in der Lage, Apoptose oder -unter bestimmten Bedingungen- Proliferation in CD95 Rezeptor-positiven Zellen auszulösen. Zusätzlich überträgt der CD95 Ligand aber auch als Rezeptor Signale in die ligandentragende Zelle, ein Phänomen, das auch bei anderen TNF-Familienmitgliedern beobachtet und als "reverse signalling" bezeichnet wird. Diese reverse Signalübertragung bewirkt in T-Zellen ein costimulatorisches Signal, welches zur vollständigen Aktivierung nach Antigen-Erkennung durch den T-Zellrezeptor (TZR) benötigt wird und über bisher unbekannte Adaptorproteine stattfindet, die vermutlich an den intrazellulären Anteil des CD95L binden. Die zytoplasmatische CD95L-Domäne ist auf Primärsequenzebene stark konserviert und besitzt eine prolinreiche Proteininteraktionsdomäne sowie eine Casein Kinase I Phosphorylierungsstelle, welche sich auch im intrazellulären Bereich des membrangebundenen TNFalpha findet und bei diesem Protein für die reverse Signalübertragung essentiell ist. Eine weitere Funktion des CD95L ist der Transport des Liganden zu einem speziellen Typ von Lysosomen in NK- und zytotoxischen T-Zellen. Hierfür ist die prolinreiche Region in der CD95L-intrazellulären Domäne wichtig. In diesen sekretorischen Lysosomen wird der CD95L gespeichert, bis er nach einem TZR-vermittelten Signal an die Zelloberfläche transportiert wird und dort mit dem CD95 Rezeptor der Ziel- Zellen interagieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde zur Aufklärung der oben beschriebenen Funktionen des CD95 Liganden ein Hefe-2-Hybrid Screen mit der intrazellulären CD95L-Domäne als Köder durchgeführt. Mit dieser Methode war es möglich, mehrere potentielle Interaktionspartner zu identifizieren. Eines dieser Proteine, FBP11, wurde schon zuvor als "human fas ligand associated factor" in der Datenbank veröffentlicht. Der HMG-Box-Transkriptionsfaktor Lef- 1, das Formin-bindende Protein FBP11, das thymozytenspezifische Protein TARPP und das Adaptorprotein PSTPIP ("proline serine threonin phosphatase interacting protein")/ CD2BP1 ("CD2 binding protein") interagierten in vitro in einem GST-Pulldown-Experiment mit der intrazellulären Domäne des CD95 Liganden. Mit Hilfe von Co- Immunpräzipitationsstudien und Co-Lokalisierungsexperimenten konnte die Interaktion von überexprimiertem CD95L und PSTPIP auch in vivo bestätigt werden. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass diese Interaktion über eine nicht näher eingegrenzte Aminosäuresequenz in der prolinreichen Region des CD95L mit der SH3-Domäne des PSTPIP-Proteins realisiert wird. Die Phosphatase PTP-PEST bindet an einen Bereich der PSTPIP-Coiled-coil-Domäne, und es besteht die Möglichkeit, dass CD95L, PSTPIP und PTPPEST in der Zelle als ternärer Komplex vorliegen, in welchem der Phosphorylierungsstatus von PSTPIP und CD95L durch PTP-PEST reguliert wird. Wie die gleichzeitige Expression von PSTPIP die Oberflächenexpression von CD95L beeinflusst, war ein weiterer Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Es konnte festgestellt werden, dass bei Überexpression von PSTPIP weniger CD95L auf der Oberfläche nachgewiesen wird. Interessanterweise wurde auch weniger Apoptose durch den CD95L ausgelöst, sobald PSTPIP überexprimiert wurde. Neben den Untersuchungen zur Interaktion von CD95L und PSTPIP (sowie PTP-PEST) wurden auch funktionelle Studien zur reversen Signalübertragung des CD95L durchgeführt. Sowohl in CD4- als auch in CD8-einzelpositiven frisch isolierten Maus-T-Zellen wurde ein co-stimulatorisches Signal nach suboptimaler TZR-Stimulation über CD95L beobachtet, was sich in verstärkter Proliferation und erhöhter Expression von Aktivierungsmarkern wie CD25 äußerte. Außerdem führt die Stimulation des CD95 Liganden zu einer transienten p42/p44-MAPK-Phosphorylierung, die durch Co-Expression von PSTPIP jedoch nicht beeinflusst wird. Die MAPK-Signalkaskade führt zur Zellproliferation und könnte daher eine wichtige Rolle in der CD95L-vermittelten Co- Stimulation spielen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte auch zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Lokalisation des CD95L in Lipid Rafts (Mikrodomänen der Zellmembran) wichtig für dessen apoptoseauslösendes Potential ist, da die Behandlung CD95L-positiver Zellen mit Substanzen, die Cholesterol entfernen und so Rafts zerstören, zur Inhibition der Apoptoseinduktion führt. Die Lokalisation sowohl des CD95 Rezeptors als auch des CD95 Liganden in unterschiedlichen Kompartimenten der Zellmembran könnte beide Moleküle voneinander abschirmen und so autokrine Apoptosemechanismen verhindern. Dadurch wird eine weitere Möglichkeit der Regulation der durch CD95L induzierten Apoptose realisiert.
Die Niere stellt im Organismus einen der Hauptangriffspunkte für Toxine dar. Dies liegt zum einen in der Tatsache begründet, dass zahlreiche Substanzen renal eliminiert werden. Eine weitere Funktion der Niere ist die Regulation des Flüssigkeitsund Elektrolythaushaltes durch Rückresorption von Wasser, Ionen, Aminosäuren und Glucose. Dies führt zu einer Aufkonzentrierung des Primärharns und folglich werden für die zu eliminierenden Toxine im Harn normalerweise höhere Konzentrationen erreicht, als beispielsweise im Blutplasma. Ein Portfolio von verschiedenen metabolisierenden Enzymen, die hauptsächlich in der Niere auftreten, sorgt weiterhin dafür, dass einige der gefilterten Substanzen erst in der Niere eine Bioaktivierung zum Toxin erfahren. Es ist somit von grosser Bedeutung, geeignete Testsysteme zu entwickeln, mit denen die Nephrotoxizität von Arzneistoffen, Chemikalien und anderen Substanzen untersucht werden kann. Die globale Analyse der Genexpression mit Hilfe von Mikroarrays bietet die Möglichkeit, die Veränderungen in der Expression von mehreren Tausend Genen gleichzeitig in der Niere oder in renalen Zellkulturen nach der Einwirkung eines potenziellen Nephrotoxins zu untersuchen. Eines der Ziele dieser Arbeit bestand darin, diese vielversprechende Methode für den Einsatz bei der Untersuchung von Nephrotoxizität zu evaluieren. In diesem Zusammenhang sollte geklärt werden, inwiefern sich aus der Literatur bekannte Tatsachen über den Toxizitätsmechanismus bestimmter Nephrotoxine bestätigen lassen und ob Hinweise auf bisher unbekannte Aspekte bezüglich der Vermittlung der Nephrotoxizität der Nephrotoxine gewonnen werden können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war es, ein Zellkulturmodell zu etablieren und zu charakterisieren, das es ermöglicht, Genexpressionsanalysen zur Untersuchung der Nephrotoxizität in vitro durchzuführen und das ausserdem mit in vivo vergleichbare Daten liefert. In verschiedenen Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass eine Kultur primärer Zellen etabliert werden konnte, die die funktionellen Eigenschaften von proximalen Tubuluszellen zeigt und keine Verunreinigung mit anderen Zelltypen des Nierencortex aufweist. Weiterhin wurden die optimalen Bedingungen für die Durchführung von Expressionsanalysen mit dieser Zellkultur definiert. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden das Expressionsprofil von Ochratoxin A mit Hilfe von cDNA-Mikroarrays, sowie die Profile von Quecksilber-II-chlorid, Paraquat und Puromycin mit Hilfe von Oligonukleotid-Mikroarrays in vivo und in vitro untersucht und bewertet. Ein Vergleich der beiden verfügbaren Plattformen (cDNA-Mikroarrays und Oligonukleotid-Mikroarrays) mit der Echt-Zeit-PCR als unabhängiger Methode lieferte aufschlussreiche Erkenntnisse über ihre Vor- und Nachteile. Die Analyse der Genexpressionsveränderungen nach der Einwirkung von OTA, HgCl2, Paraquat und Puromycin zeigte, dass sich mit Hilfe des Genexpressionsprofils zahlreiche Erkenntnisse über den Toxizitätsmechanismus der Substanzen gewinnen lassen, die sowohl durch die histopathologischen Befunde als auch mit Hilfe der einschlägigen Literatur bestätigt werden konnten. Zum Teil konnten sogar bisher unbekannte Aspekte der nephrotoxischen Wirkungen der untersuchten Modell- Toxine aufgedeckt werden, wie zum Beispiel die verstärkte Induktion von Golgi- Transport-assoziierten Genen im Nierencortex der Ratte nach Behandlung mit Paraquat. Die Analyse des Genexpressionsprofils kann somit vielversprechende Hinweise für das umfassende Verständnis des Toxizitätsmechanismus von Nephrotoxinen liefern. Der Vergleich der Expressionsmuster von HgCl2, Paraquat und Puromycin machte weiterhin deutlich, dass es einerseits transkriptionelle Änderungen gibt, die für das jeweilige Toxin spezifisch waren, andererseits aber auch Expressionsmuster aufgezeigt werden konnten, die allen untersuchten Nephrotoxinen gemeinsam waren. Durch die Identifizierung solcher gemeinsamen Genexpressionsprofile aus einer Datenbank mit zahlreichen bekannten Nephrotoxinen, könnte es in Zukunft sogar möglich sein, die potenzielle Nephrotoxizität unbekannter Arzneistoffe oder Chemikalien mit Hilfe von Mikroarrays vorherzusagen oder beispielsweise aus mehreren Kandidaten für einen neuen Arzneistoff, denjenigen mit dem geringsten nephrotoxischen Potenzial bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Entwicklung herauszufiltern.