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The production cross section and the transverse momentum distribution of charged particles is measured in pp collisions at √s = 2.76 TeV, 5.02 TeV, 7 TeV and 13 TeV, as well as for Pb-Pb collision at √s_NN = 5.02 TeV and Xe-Xe at √s_NN = 5.44 TeV in ALICE at the LHC. The measurement is performed in the transverse momentum region of 0.15 < p_T < 50 GeV/c and in the pseudorapidity range of |η| < 0.8. The precision of the measurement has been substantially enhanced as a result of the improved corrections, by taking into account a more realistic particle composition in the MC simulations. As a result, the systematic uncertainties have been reduced by more than a factor two in all systems and energies.
The average transverse momentum <p_T> results show a faster-than-linear increase with the center-of-mass energy and follow a similar trend with respect to previous measurements. The analysis of the p_T spectra in multiplicity intervals show a weak center-of-mass energy dependence when they are compared to their respective inelastic (INEL) pp measurement. The average multiplicity as a function of the collision energy shows a quadratic trend, and the comparison with other ALICE multiplicity measurements exhibits a remarkable agreement, within uncertainties.
The transverse momentum spectra in pp collisions are compared to state-of-the-art MC simulations, EPOS LHC and PYTHIA 8 event generators; none of them is able to reproduce the distributions over the full p_T range.
The differential cross section in pp collisions is an essential observable for the study of the Quark Gluon Plasma (QGP) created in ultra-relativistic heavy-ion collisions. The absence of a medium formation in pp collisions serves as an essential baseline for studies of particle production and suppression due to parton energy-loss in the QGP. Since pp collisions at √s = 5.44 TeV were not measured by ALICE, the pp reference at this energy was constructed by using a power law interpolation between the s = 5.02 TeV and 7 TeV data. The pp results are compared to the particle production in Pb-Pb collisions at √s_NN = 5.02 TeV and Xe-Xe collisions at √s_NN = 5.44 TeV.
The nuclear modification factor R_AA for Pb-Pb and Xe-Xe collisions was calculated and a strong suppression of high-p_T particles is observed in central collisions. The R AA in different systems allows for a differential study of the parton energy loss in the QGP. The comparison of the R AA in multiplicity intervals between the two systems provide insights into the path length dependence of a parton that propagates in the medium.
FPP und GGPP sind Intermediate des Mevalonat-Weges und fungieren als post-translationale Modifikation kleiner GTPasen. Die Prenylierung kleiner GTPasen erfolgt katalysiert von spezifischen Prenyltransferasen und ist notwendig um die kleinen GTPasen in Membranen zu verankern, wo ihre Aktivierung stattfindet. Zu den intrazellulären Funktionen der GTPasen gehören unter anderem der Aufbau des Cytoskeletts, das neuronale Zellwachstum, die Leitung und Ausläuferbildung von Axonen, das Dendritenwachstum, die Synapsenformation, die synaptische Plastizität und die Apoptose. Diese Funktionen spielen in der Gehirnalterung sowie in neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer Demenz (AD) und auch bei der Glioblastoma multiforme (GBM) eine wichtige Rolle.
Im Zuge einer in vivo Studie an C57BL/6 Mäusen konnten in der vorliegenden Arbeit altersbedingte Veränderungen der Lokalisation verschiedener Rho- und Rab-GTPasen in Membran- und Cytosol-Präparationen sowie der GGTase-I in Gehirnen gealterter Tiere gezeigt werden. Die zelluläre Lokalisation der Rho GTPasen Rac1, RhoA und Cdc42 verschiebt sich im Alter zu reduzierten Membran-gebundenen und erhöhten cytosolischen Gehalten. Dies ist mit einer Reduktion der Protein- und mRNA- Gehalte des Enzyms GGTase-Iβ assoziiert, der Untereinheit der GGTase-I, die die Bindung des Isoprenoids GGPP an die Rho-GTPasen reguliert. Diese wiederum korrelieren direkt mit der altersbedingten Reduktion der relativen GGTase-Aktivität. Die in vitro Inhibition der GGTase-I mittels GGTI-2133 an SH-SY5Y Zellen erwies sich als Modell, welches die gleichen Effekte wie die gealterten Gehirne in vivo zeigt.
7, 8-Dihydroxyflavon (7, 8-DHF) ist ein natürlich vorkommendes Flavon, welches als hoch affiner selektiver TrkB-Rezeptor-Agonist fungiert und hierdurch wie das Neurotrophin BDNF das Überleben von Neuronen, deren Differenzierung, synaptische Plastizität und Neurogenese vermittelt. In vivo verursacht die orale Gabe von 7, 8-Dihydroxyflavon in Gehirnen alter Tiere eine Abnahme des Isoprenoids GGPP, die Zunahme der prenylierten Membran-gebundenen GTPase Rac1 und eine Reduktion des Gehaltes an Membran-gebundenem Rab3A auf das Niveau der Gehalte in den Gehirnen der jungen Kontroll-Tiere. Das Neurotrophin BDNF interagiert mit dem TrkB-Rezeptor und ist in der Lage direkt an den Rac1-spezifischen GEF Tiam1 zu binden, wodurch dieser aktiviert wird und Veränderungen der zellulären Morphologie der betroffenen Neurone induziert. Während das Alter und die orale Gabe von 7, 8-Dihydroxyflavon in vivo keine Effekte auf die Proteingehalte von BDNF und TrkB in der Tierstudie aufzeigten, konnte eine alterbedingte Reduktion von Tiam1 im Hirngewebe detektiert werden, die wiederum durch 7, 8-Dihydroxyflavon aufgehoben werden konnte.
Die Isoprenoide FPP und GGPP, sowie die Regulation kleiner GTPasen spielen auch eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit Veränderungen der APP-Prozessierung in der molekularen Pathogenese der AD. Bei der APP-Prozessierung sind die beiden Sekretasen β- und γ-Sekretase für die Bildung des β-Amyloid-Peptids verantwortlich. In vitro Studien mit dem β-Sekretase-Inhibitor IV und dem γ-Sekretase-Inhibitor DAPT an untransfizierten und APP-transfizierten HEK293 Zellen (HEK293-APP695wt und HEK293-APPsw Zellen) konnten zeigen, dass sowohl die β- als auch die γ-Sekretase an der Regulation der Isoprenoide FPP und GGPP beteiligt sind. FPP und GGPP liegen in APP-transfizierten HEK293 Zellen erhöht vor. Die Inhibition der β-Sekretase führt zur Reduktion von FPP und GGPP. Durch die Inhibition der γ-Sekretase wird ausschließlich FPP reduziert. Weiterhin liegen in APP-transfizierten HEK293 Zellen die Membran-gebundenen prenylierten Rho-GTPasen Rac1, Cdc42 und RhoA erhöht vor. Das Membran-gebundene prenylierte H-Ras kommt jedoch in APP-transfizierten Zellen im Vergleich zu untransfizierten HEK293 Zellen in deutlich niedrigeren Mengen vor. Die Inhibition der β-Sekretase bedingt die Reduktion von Membran-gebundenem prenylierten Rac1 und auch von Membran-gebundenem H-Ras in HEK293-APPsw Zellen.
Veränderungen von Signaltransduktionswegen, die durch kleine GTPasen vermittelt werden, haben sich auch bei der GBM als zentraler Teil der molekularen Pathogenese herausgestellt. Hierbei ist die Prenylierung durch FPP und GGPP die Voraussetzung für die Membran-Insertion und onkogenen Funktion der Ras- und Rho-Proteine über die Stimulierung des Ras-Raf-MEK-ERK Signalweges. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der HMG-CoA-Reduktase Inhibitor Lovastatin die Bildung der beiden Isoprenoide FPP und GGPP in U87 und U343 Glioblastoma Zellen verringert und hierdurch die Isoprenylierung von H-Ras und Rac1 reduziert. Das natürlich vorkommende Monoterpen Perrilylalkohol hingegen inhibiert die Prenyltransferasen FTase und GGTase und verändert dadurch die post-translationale Prenylierung der GTPasen Rac1 und H-Ras in U87 und U343 Zellen ohne die Isoprenoide FPP und GGPP signifikant zu beeinflussen. Jedoch bewirkt Perillylalkohol in U343 Zellen eine Erhöhung des GGPPs. Beide Substanzen bewirkten die Reduktion der ERK-Phosphorylierung und der Migration, Invasion und Proliferation der untersuchten U87 und U343 Glioblastoma Zellen.
The focus of this thesis is the integral membrane protein Escherichia coli diacylglycerol kinase (DGK). It is located within the inner membrane, where it catalyzes the ATP-dependent phosphorylation of diacylglycerol (DAG) to phosphatic acid (PA). DGK is a unique enzyme, which does not share any sequence homology with typical kinases. In spite of its small size, it exhibits a notable complexity in structure and function. The aim of this thesis is the investigation of DGK’s structure and function at an atomic level directly within the native-like lipid bilayer using MAS NMR. This way, a deeper understanding of DGK’s catalytic mechanism should be obtained.
First, the preparation of DGK was optimized, leading to a sample, which provides well-resolved MAS NMR spectra. The high quality MAS NMR spectra formed the foundation for the second step, the resonance assignment of DGK’s backbone and side chains. The assignment was performed at high magnetic field (1H frequency 850 MHz). The sequential assignment of immobile domains was carried out using dipolar coupling based 3D experiments, NCACX, NCOCX and CONCA. The measurement time could be reduced by paramagnetic doping with Gd3+-DOTA in combination with an E-free probehead. The sequential assignment was mainly performed using a uniformly labelled sample (U-13C,15N-DGK). Residual ambiguities could be resolved by reverse labelling (U-13C,15N-DGK-I,L,V). Resonances could be assigned for 82% of the residues, from which 74% were completely assigned. For validation, ssFLYA was applied, which is a generally applicable algorithm for the automatic assignment of protein solid state NMR spectra. Its principal applicability for demanding systems as membrane proteins could be proven for the first time. Overall, ~90% of the manually obtained assignments could be confirmed by ssFLYA. For the completion of DGK’s assignment, J-coupling based 2D experiments, 1H-13C/15N HETCOR and 13C-13C TOBSY, were carried out to detect highly mobile residues. This way, residues of the two termini and the cytosolic loop, which were not detectable by dipolar coupling based experiments, could be assigned tentatively. Whereupon, peaks for arginine and lysine were assigned unambiguously to Arg9 and Lys12. Overall, ~84% of the residues could be assigned by the applied NMR strategy. Furthermore, a secondary structure analysis was carried out. It showed substantial similarities between wild-type DGK, its thermostable mutant determined both by MAS NMR and the crystal structure of wtDGK. However, there are few differences around the flexible regions most likely caused by the high mobility of these regions. During the assignment procedure, no systematic peak doublets or triplets were detected, indicating that the DGK trimer adopts a symmetric conformation. This is in contrast to the X-ray structure, which shows asymmetries between the three subunits. Especially, crystal packing may be a potential source for these structural asymmetries.
On the basis of the nearly complete assignment of DGK, the apo state was compared with the substrate bound states. Perturbations in peak position and intensity of the substrate bound states were analysed for all assigned residues in 3D and 2D spectra. The nucleotide-bound state was emulated by adenylylmethylenediphosphonate (AMP-PCP), a non-hydrolysable ATP analogue, whereas the DAG-bound state was mimicked by 1,2-dioctanoyl-sn-glycerol (DOG, chain length n = 8). Upon nucleotide binding, extensive chemical shift perturbations could be observed. These data provide evidence for a symmetric DGK trimer with all of its three active sites concurrently occupied. Additionally, it could be demonstrated that the nucleotide substrate induces a substantial conformational change. This most likely supports the enzyme in binding of the lipid substrate, indicating positive heteroallostery. In contrast, the overall alterations caused by DOG are very minor. They involve mainly changes in peak intensities. For DGK bound with either AMP-PCP+DOG or only AMP-PCP, a similar spectral fingerprint was observed. This implies that binding of the nucleotide seems to set the enzyme into a catalytic active state, triggering the actual phosphoryl transfer reaction.
The investigation of DGK’s remarkable stability and the cross-talk between its subunits forms the last part of this thesis. This demands for the identification of key intra- and interprotomer contacts, which are of structural or functional importance. For this purpose, 13C-13C DARR and 2D NCOCX spectra with long mixing times were recorded using high field MAS NMR. Additionally, DNP-enhanced 13C−15N TEDOR experiments were conducted on mixed labelled DGK trimers to enable the visualization of interprotomer contacts. With the applied NMR strategy, intra- (Arg32 - Trp25/ Glu28/ Ala29 and Trp112 - Ser61) and interprotomer (ArgNn,e - AspCg/ GluCd/ AsnCg) long-range interactions could be identified.
In this research project we aimed to generate genetically modified megakaryocytes and platelets, by targeting protein expression to their secretory alpha-granules to delivery ectopic or therapeutic proteins, to be stored and kept there until an external stimulus triggers platelet activation and platelet secretion takes place. During platelet activation, the therapeutic proteins would then be released to the extracellular space, either as a soluble protein or exposed as a transmembrane protein on the cell surface of platelets. For long-term approaches, genetic modifications must be introduced at the hematopoietic stem cell level.
AIMS: As first approach, we aimed to characterize the lineage-specificity of expression of six different promoter fragments in lentiviral vectors: the murine platelet factor 4 (mPf4) 1222 bp (-1074 to +148), human glycoprotein Ib alpha (hGP1BA) 595 bp (-265 to +330), a short and a longer fragment of the human glycoprotein 6 (hGP6 / hGP6s) 351 bp (-322 to +29) / 726 bp (-697 to +29), as well the human glycoprotein 9 (GP9) promoter 794 bp (-782 to -12). These promoter fragments were included as internal cellular promoters in self-inactivating lentiviral vectors (SIN), using an enhanced green fluorescent protein (eGFP) as gene reporter. GFP detection was evaluated in vitro (in transduced non-megakaryocitc blood cell progenitors and in-vitro differentiated megakaryocytes) and in vivo (Bone marrow cells, blood cells and spleen cells). For targeting of proteins to the secretory alpha granules of megakaryocytes and platelets, we followed two strategies: A) The sorting signal of the cytokine RANTES was fused N-terminally to the destabilized GFP, d2eGFP (RANTES. d2eGFP), to deliver the protein into the granules as soluble cargo. B) The transmembrane granular targeting sequence of P-selectin (the transmembrane domain and cytoplasmic tail (referred as TDCT) was fused to d2eGFP or the B domain deleted codon optimized human coagulation Factor VIII cDNA (referred as BDcohFVIII_TDCT or FVIII_TDCT), to deliver the protein into the membrane of alpha granules. These two strategies were tested in-vitro, from transduced differentiated megakaryocytes in liquid cultures, and in-vivo, by analysis of genetically modified platelets by means of Laser Scanning Confocal Microscopy (LSM) in colocalization analysis (performed at the single cell level) and fluorescence intensity analysis.
RESULTS: GFP expression in blood cells from transplanted mice was significantly higher in platelets, with a smaller background promoter activity in leukocytes and erythrocytes. The highest expression was observed from the mPf4-vector, followed by hGP1BA, hGP6 and hGP6s vectors, identifying the hGP6 vectors as the most restricted to the megakaryocyte and platelet lineage. Analysis in bone marrow cells showed that hGP6-vectors have the lowest activity in the hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) with less than 10% of GFP positive stem cells. Surprisingly, the mPf4 and hGP1BA vectors were both highly active in the HSPC, in a range of 20 to 70% of GFP-positive cells. Polyploidization in later stages of MK-maturation of in-vitro Mks differentiated from Mpl-/- lineage marker negative cells were recovered after gene transfer of the thrombopoietin receptor Mpl, under the control of MK-specific vectors in differentiated into MKs. These results were corroborated in in-vivo analysis, where Mpl-/- mice transplanted with lin-BM cells transduced with the mPf4.Mpl and hGP6.Mpl vectors, showed significantly elevated platelet counts compared to control mice transplanted with a GFP-encoding control vector (PGK-GFP). In the Fluorescent intensity and colocalization analysis of transduced megakaryocytes with the targeting vectors, we observed a significant difference in the GFP targeting compared with those MK transduced with the non-targeting vectors. The median of the WCC values observed from the RANTES.d2eGFP targeting vector was 0.8 (80 % of colocalization) with P-selectin stained granules, and 0.7 (70%) with von Willebrand Factor stained granules. In the case of the non-targeting vector SFFV.d2eGFP the median of the WCC observed were <0.3 (30%) both in P-selectin and von Willebrand Factor stained granules. We observed as well that the GFP signal of MK transduced with the P-selectin.d2eGFP fusion overlapped the signals emitted by P-selectin and von Willebrand factor stained granules, not just in LSM-digitalized images but in the fluorescens intensity analysis as well, indicating a clear signal of GFP colocalization. Likewise, an evident signal overlap between the targeted FVIII (FVIII_TDCT) with the P-selectin / von Willebrand marker was observed. Colocalization and fluorescens intensity analysis performed on activated platelets from transplanted mice with the targeting vectors, corroborated what was previously observed in in-vitro megakaryocytes. The genetic modification of megakaryocyte and platelets will allow in the furture, not just the development of new generation of cells with advanced functions, but it will help us to elucidate new mechanisms and pathways of important cellular processes, by modifying cell function and cell interactions.
All lifeforms have to sense changes in their environment and adapt to possibly detrimental conditions. On a cellular level, the highly elaborate proteostasis network (PN) consisting of housekeeping and stress-induced proteins, confers this tolerance against stress and maintains cellular protein homoestasis. This is essential for survival, as an accumulation of stress-induced protein aggregation will eventually affect the functionality of crucial cellular components and ultimately lead to cell death. The guardians of this balance are the molecular chaperones and their activity-regulating co-haperones. They are engaged in all aspects of protein biogenesis, maintenance and degradation, especially during stress.
The heat shock proteins (HSPs) are the major chaperones in mammals and encompass constitutive and stress-induced isoforms. Among them, the HSP70 and the HSP90 family are the most abundant HSPs and their activity is involved in a great variety of homoestasis and stress-induced tasks.
As part of the protein triage the E3 ligase CHIP (C-terminal HSC70-interacting protein) is an essential activity regulating co-chaperone of HSP70 and HSP90 which provides a link between chaperone mediated protein-folding and various degradation pathways. Due to its decisive function, CHIP is involved in a wide array of cellular processes, especially in clearing misfolded HSP70 client proteins that are prone to aggregate. As a consequence, CHIP was reported to confer protection against many aggregation-induced pathologies of the neuronal system. Additionally, CHIP has been identified as a critical factor in various types of cancer and is implied to affect the development and the longevity of mammals.
Despite the significant progress in the understanding of CHIP’s structure and function, many aspects surrounding its chaperone dependency and its substrate recognition remain unclear. Moreover, due to the variety of substrates in diverse cellular pathways, there are yet many connections to elucidate between CHIP and components of the cellular proteostasis network.
The work of this thesis was focused on the role of CHIP in acute stress response and the corresponding status of chaperone association. Moreover, it was investigated if CHIP, as the connecting ligase of folding and degradation systems, might also provide a link between the PN and the reorganisation of the cellular architecture upon stress exposure.
This has become of increasing interest as recent reports highlight the importance of spatial sequestration in protein quality control.
To this end, subcellular distribution of CHIP was analysed by live-cell microscopy during heat stress. It became obvious that during the heat-induced challenge of the chaperone system, CHIP migrated to new cellular sites. Further experiments suggested that the observed migration to the plasma membrane is a chaperone-independent process and in vitro reconstitution of membrane association confirmed the competitive nature of membranes and chaperones for CHIP binding. A detailed in vivo and in vitro analysis of the newly observed membrane association of CHIP revealed a distinct lipid specificity and a novel direct association with lipids. Binding experiments with recombinantly purified deletion mutants of CHIP identified the TPR domain and a positive patch in the coiled-coil domain as main determinants for the lipid association. Through biochemical and biophysical approaches, the structural integrity and functionality of CHIP upon membrane binding was confirmed and further characterised.
Moreover, mass spectrometry analysis provided a high confidence identification of chaperone-free interactors of CHIP at the plasma membrane and other membranous compartments.
In accordance with the lipid specificity, the Golgi apparatus was one of these sites. Only chaperone-free CHIP had a significant effect on the morphology of the organelle, again confirming the competitive role of chaperones and lipids. With respect to the physiological consequences of the changed localisation of CHIP, preliminary results indicated increased cell death when the ligase localises to cellular membranes. The results lead to the conclusion that CHIP acts as an initiator of early stress adaptation and as a sensor for the severity and strength of the stress reaction.
Bluttransfusionen ermöglichen es jährlich tausenden von Menschen das Leben zu retten. Allerdings bringt ein unreflektierter Einsatz auch zahlreiche Nachteile mit sich. Patient Blood Management (PBM) beschäftigt sich damit, das optimale Kosten-Nutzen-Verhältnis dieser Maßnahme auszuschöpfen.
Das Programm verfolgt einen multimodalen Ansatz zur Reduktion von Transfusionen. Es zielt darauf ab präoperative Anämie zu erfassen und, wenn möglich, zu therapieren, iatrogenen Blutverlust zu reduzieren und die Anämietoleranz des Körpers maximal auszunutzen. Diese Maßnahmen wurden durch Schulungsprogramme und die Bereitstellung von Informationsmaterial begleitet, um die Sensibilität und das Wissen zu diesem Thema zu vergrößern.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den Einflüssen der Einführung von PBM auf die Mortalität und Morbidität von Malignompatienten in der Viszeralchirurgie. Die retrospektive Analyse war darauf ausgerichtet, einen Unterschied von 10 % im Zweijahresüberleben vor und nach Einführung festzustellen. Hierfür wurden die Daten von 836 Patienten ausgewertet, die sich über einen Zeitraum von vier Jahren einer onkologischen Operation in der Abteilung für Allgemein- und Viszeralchirurgie der Universitätsklinik Frankfurt am Main unterzogen haben. Davon befanden sich 389 vor und 447 nach der Einführung des Projekts in Behandlung.
Das Ziel der Untersuchung bestand darin, die Sicherheit und den Nutzen von PBM in dieser speziellen Patientengruppe näher zu untersuchen. Dazu wurden der primäre Endpunkt des Zweijahresüberlebens und die sekundären Endpunkte 30-Tages- und 90-Tagesüberleben, Prozentsatz an Patienten mit Anämie, Anzahl der transfundierten Erythrozytenkonzentrate (EK) sowie das Auftreten von Komplikationen nach der Dindo-Clavien Klassifikation festgelegt.
Die erhobenen Daten zeigen ein um 13,1 % (p = < 0,001) verbessertes Überleben nach zwei Jahren in den Vergleichsgruppen vor und nach Einführung des Patient Blood Managements. Es haben 21,5 % (p = < 0,001) weniger Patienten Erythrozytenkonzentrate erhalten, zudem wurde die Gesamtsumme der transfundierten Konzentrate signifikant (p = < 0,001) reduziert.
Dabei kam es zu keinem vermehrten Auftreten von Komplikationen. Dies spricht dafür, dass die Einführung von PBM zur Verbesserung der Patientensicherheit beigetragen hat. Es hat sich gezeigt, dass Patienten ohne oder mit moderaten postoperativen Komplikationen (Dindo-Claven < IIIb) von den Veränderungen im besonderen Maße profitieren.
Eine flächendeckende Implementierung des Konzepts in den klinischen Alltag ist als sicher und empfehlenswert zu betrachten. Neben den Patienten profitiert auch das ärztliche Personal, denn im Rahmen von strukturierten Fortbildungsveranstaltungen wird tiefergehendes Wissen vermittelt und klare Handlungsempfehlungen gegeben. Dies reduziert Unsicherheiten, erhöht die Sensibilität und verringert auf diesem Weg Fehler im Transfusionsmanagement. Des Weiteren ergeben sich ökonomische Vorteile. Durch Schulungen, Anämiescreening und der Anschaffung neuer blutsparender Systeme entstehen zwar zunächst zusätzliche Kosten, allerdings stehen diese Einsparungen, durch einen geringeren EK-Verbrauch sowie geringeren Ausgaben durch eine Senkung der Morbidität, gegenüber.
Es wäre von Interesse, in zukünftigen Untersuchungen die genauen Ursachen für den beobachteten Effekt im verbesserten Langzeitüberleben zu analysieren. Mit diesem Wissen kann eine optimale Nutzung der Einflussfaktoren gewährleistet werden. Zudem sollte es auf dieser Basis möglich werden, das Patientenkollektiv, das von einer Transfusion profitiert, genauer einzugrenzen.
Biologische Signalwege bilden komplexe Netzwerke aus, um die Zellantwort sensibel regulieren zu können. Systembiologische Ansätze werden eingesetzt, um biologische Systeme anhand von Computer-gestützten Modellen zu untersuchen. Ein mathematisches Modell erlaubt, neben der logischen Erfassung der Regulation des biologischen Systems, die systemweite Simulation des dynamischen Verhaltens und Analyse der Robustheit und Anfälligkeit.
Der TNFR1-vermittelte Signalweg reguliert essenzielle Zellvorgänge wie Entzündungsantworten,
Proliferation und Zelltod. TNFR1 wird von dem Zytokin TNF-α stimuliert und fördert daraufhin die Bildung verschiedener makromolekularer Komplexe, welche unterschiedliche Zellantworten einleiten, von der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB, welcher die Expression von proliferationsfördernden Genen reguliert, bis zu zwei Formen des Zelltods, der Apoptose und der Nekroptose. Die Regulation der verschiedenen Zellantworten wird auch als molekularer Schalter bezeichnet. Die exakten molekularen Vorgänge, welche die Zellantwort modulieren, sind noch nicht vollständig entschlüsselt. Eine Fehlregulation des Signalwegs kann chronische Entzündungen hervorrufen oder die Entstehung von Tumoren fördern.
In dieser Thesis haben wir die neuesten Erkenntnisse der Forschung des TNFR1-Signalwegs anhand von umfangreichen Interaktionsdaten aus der Literatur erstmals in einem Petrinetz-Modell erfasst und analysiert. Das manuell kuratierte Modell umfasst die sequenziellen Prozesse der NF-κB-Aktivierung, Apoptose und Nekroptose und berücksichtigt den Einfluss posttranslationaler Modifikationen.
Weiterhin wurden Analysemethoden für Signalwegs-Modelle entwickelt, welche die spezifischen Anforderungen dieser biologischen Systeme berücksichtigen und eine biologisch motivierte Netzwerkanalyse ermöglichen. Die Manatee-Invarianten identifizieren Signalflüsse im Gleichgewichtszustand in Modellen, die Zyklen aufweisen, und werden als Linearkombination von Transitions-Invarianten gebildet. Diese Signalflüsse erfassen idealerweise einen Prozess von der Rezeptorstimulation zur Zellantwort in einem Modell eines Signalwegs. Die Bestimmung aller möglichen Signalflüsse in Modellen von Signalwegen ist eine notwendige Voraussetzung für weitere biologisch motivierte Analysen, wie die in silico-Knockout Analyse. Wir haben ebenfalls ein neues Konzept zur Untersuchung von in silico-Knockouts vorgestellt. Die Effekte der in silico-Knockouts auf einzelne Komplexe und Prozesse des Signalwegs werden in der in silico-Knockout-Matrix repräsentiert. Wir haben die Software-Anwendung isiKnock entwickelt, welche beide Konzepte kombiniert und eine systematische Knockout-Analyse von Petrinetz-Modellen unterstützt.
Das Petrinetz-Modell des TNFR1-Signalwegs wurde auf seine elementaren Eigenschaften geprüft und die etablierten Analysen wie Platz-Invarianten und Transitions-Invarianten durchgeführt. Hierbei konnten die Transitions-Invarianten nicht in allen Fällen komplette biologische Signalflüsse beschreiben. Wir haben ebenfalls die neu vorgestellten Methoden auf das Petrinetz-Modell angewandt. Anhand der Manatee-Invarianten konnten wir die zusammenhängenden Signalflüsse identifizieren und nach ihrem biologischen Ausgang klassifizieren sowie die Auswirkungen der Rückkopplungen untersuchen. Wir konnten zeigen, dass die survival-Antwort durch die Aktivierung von NF-κB am häufigsten auftritt, danach die Apoptose, gefolgt von der Nekroptose. Die alternativen Signalflüsse in Form der Manatee-Invarianten spiegeln die Robustheit des biologischen Systems wider. Wir führten eine ausgiebige in silico-Knockout-Analyse basierend auf den Manatee-Invarianten durch, um die Proteine des Signalwegs nach ihrem Einfluss einzustufen und zu gruppieren. Die Proteine des Komplex I wiesen hierbei den größten Einfluss auf, angeführt von der Rezeptorstimulation und RIP1. Wir betrachteten und diskutierten die Regulation des molekularen Schalters anhand der Knockout-Analyse von selektierten Proteinen und deren Auswirkung auf wichtige Komplexe im Modell. Wir identifizierten die Ubiquitinierung in Komplex I sowie die NF-κB-abhängige Genexpression als die wichtigen Kontrollpunkte des TNFR1-Signalwegs. In Komplex II ist die Regulation der Aktivierung der Caspase-Aktivität entscheidend.
Die umfangreiche Netzwerkanalyse basierend auf Manatee-Invarianten und systematischer in silico-Knockout-Analyse verifizierte das Petrinetz-Modell und erlaubte die Untersuchung der Robustheit und Anfälligkeit des Systems. Die neu entwickelten Methoden ermöglichen eine fundierte, biologisch relevante Untersuchung von in silico-Modellen von Signalwegen. Der systembiologische Ansatz unterstützt die Aufklärung der Regulation und Funktion des verflochtenen Netzwerks des TNFR1-Signalwegs.
Viele Studien konnten in den letzten Jahren aufzeigen, dass Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaling eine wichtige Rolle in der Verarbeitung chronischer Schmerzprozesse einnimmt. Bei Verletzung peripherer Nerven oder Entzündung im Gewebe wird NO gebildet, das durch Stimulation der NO-sensitiven Guanylatzyklase (NO-GC) die cGMP-Bildung katalysiert. Seit einigen Jahren ist bekannt, dass zwei Isoformen dieses Enzyms existieren, NO-GC1 und NO-GC2. Das Expressionsmuster der beiden Isoformen im nozizeptiven System und der jeweilige Einfluss auf die Schmerzverarbeitung ist jedoch bisher völlig unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Expression der NO-GC1 und NO-GC2 in den Spinalganglien (DRGs) und im Rückenmark von Mäusen charakterisiert und das Verhalten von NO-GC1 und NO-GC2 Knockout (KO)-Mäusen in verschiedenen Schmerzmodellen untersucht. Mit Immunfluoreszenzfärbungen und In-situ-Hybridisierungen wurde in dieser Arbeit dargestellt, dass die zwei Isoformen in Interneuronen des Rückenmarks lokalisiert sind, wobei die NO-GC1 vorwiegend in inhibitorischen Interneuronen exprimiert wird. In den DRGs konnte die Expression in nicht-neuronalen Zellen nachgewiesen werden, wobei nur die NO-GC2 in Satellitenzellen detektiert werden konnte. Die NO-GC1 KO-Mäuse zeigten eine verringerte mechanische Hypersensitivität in neuropathischen Schmerzmodellen, aber ein normales Verhalten in Modellen inflammatorischer Schmerzen. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen zeigten die NO-GC2 KO-Mäuse ein erhöhtes Schmerzverhalten in Entzündungsmodellen, aber kein verändertes Verhalten in Modellen neuropathischer Schmerzen. Die gezielte Deletion der NO-GC1 und NO-GC2 in Interneuronen des Rückenmarks führte in den entsprechenden Tieren zu Verhaltensänderungen in der Schmerzwahrnehmung, die den Phänotypen der globalen NO-GC KO-Tieren in Schmerzmodellen ähnelte. Zusammengefasst zeigen die Daten dieser Arbeit, dass die NO-GC1- oder NO-GC2-vermittelte cGMP-Produktion in Interneuronen des Rückenmarks sehr wichtige, und teilweise gegensätzliche Funktionen bei der Verarbeitung chronischer Schmerzsignale einnimmt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte der tonische BZR-Signalweg im Burkitt Lymphom näher untersucht werden. Ziel war die Identifizierung von Zielstrukturen, die für die Zellen essentiell für die Aufrechterhaltung des tonischen Signalwegs sind und gleichzeitig die Viabilität der Zellen fördern. Durch die Identifizierung noch unbekannter Zielstrukturen wäre man in der Lage, neue Behandlungsstrategien zu entwickeln oder bereits bestehende zu optimieren. Des Weiteren sollte die Signaltransduktion in der B-ALL, die über einen Vorläufer des BZRs, dem prä-BZR vermittelt wird, hinsichtlich eines tonischen Überlebenssignals untersucht werden.
Durch massenspektrometrische Analysen der tonischen BZR-Signaltransduktion im Burkitt Lymphom, die für die Viabilität der Zellen essentiell ist und die Ergebnisse eines Inhibitorscreens konnte HSP90 als potenzielle neue Zielstruktur im Burkitt Lymphom identifiziert werden.
So konnte gezeigt werden, dass Burkitt-Lymphom-Zellen nach Inhibition der Chaperonfunktion von HSP90 durch zwei auf dem Markt bereits verfügbare Inhibitoren einen Zellzyklusarrest erfahren, der letztlich zur Apoptose der Zellen führt. Dieser Effekt wurde auf einen Verlust des (tonischen) BZR-Signals zurückgeführt, der überwiegend durch den aktiven lysosomalen Abbau von SYK nach HSP90-Inhibition zustande kommt. Demnach führte die Überexpression einer HSP90-resistenten Variante von SYK (TEL-SYK) zu einer Aufhebung der apoptotischen Effekte nach HSP90-Inhibition. Zudem wurde SYK als Interaktionspartner von HSP90 (HSP90-Klientprotein) im Burkitt Lymphom und die für die Interaktion essentielle Phosphorylierungsstelle (pY197 in HSP90α bzw. pY192 in HSP90β) identifiziert bzw. validiert.
Das therapeutische Potenzial der HSP90-Inhibitoren im Burkitt Lymphom offenbarte sich ferner durch den Vergleich der Wirkungseffektivität in gesunden B-Zellen mit der in Tumorzellen. So zeigten HSP90-Inhibitoren eine erhöhte Affinität zu Tumorzellen. Bei verwendeten Konzentrationen der Inhibitoren, die bereits eine apoptotische Wirkung in Tumorzellen hervorriefen, waren gesunde B-Zellen resistent.
In der B-ALL konnte durch den Knockdown von CD79a und der Inhibition von SYK eine tonische Antigenrezeptor-Signalleitung identifiziert werden, die wie im Burkitt Lymphom über den PI3K/AKT-Signalweg vermittelt wird. Durch die Kombination der im Rahmen dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse und weiterführende Analysen (wie zum Beispiel durch Inhibitor- oder CRISPR/Cas-Screens) kann so eine Identifizierung von potenziellen Zielstrukturen mit therapeutischem Nutzen in der B-ALL erfolgen.
Zur Behandlung von chronisch entzündlichen Erkrankungen besteht nach wie vor ein dringendes medizinisches Bedürfnis, da die bisher eingesetzten Medikamente gerade in der Langzeittherapie zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen können. Um chronisch entzündliche Erkrankungen in Zukunft adäquat therapieren zu können, sind bereits verschiedene neuartige Ansätze in klinischer bzw. präklinischer Entwicklung. Ein möglicher Ansatz besteht in einer dualen Hemmung der mikrosomalen Prostaglandin E2 Synthase-1 (mPGES-1) und der 5-Lipoxygenase (5-LO). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Struktur-Wirkungs-Beziehungen (SAR) von zwei verschiedenen Leitstrukturen an der 5 LO und der mPGES 1 untersucht. Die erste Leitstruktur entstammt aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Sulfonamidstruktur. In dieser Arbeit ist es gelungen, durch eine gezielte Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehungen, die Leitstruktur I an der 5 LO und der mPGES-1 in ihrer Potenz zu optimieren. Die Leitstruktur (IC50: 5-LO (zellfrei) = 5.7 µM, IC50: 5 LO (PMNL) = 3.7 µM, IC50: mPGES-1 = 4.5 µM) konnte durch Variation in allen drei Positionen modifiziert werden, so dass die optimierte Struktur 170 (IC50: 5-LO (zellfrei) = 2.3 µM, IC50: 5-LO (PMNL) = 0.4 µM, IC50: mPGES-1 = 0.7 µM) entstanden ist. Für die Verbindung 170 wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften, wie Löslichkeit und metabolische Stabilität, sowie der Wirkmechanismus auf molekularer Ebene bestimmt. Ebenso konnte für Verbindung 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden.
Die zweite Leitstruktur stammt ebenfalls aus den Arbeiten von Waltenberger et al. und besitzt im Grundgerüst eine Mercaptobenzothiazol-Grundstruktur. Aufgrund der Ähnlichkeit zu den bekannten Pirinixinsäurederivaten wurde auch hier für die Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zunächst eine Kettenverlängerung an der Alkylkette vorgenommen. Es ließ sich auch hier durch eine gezielte SAR, die Leitstruktur bis hin zum submikromolaren Bereich in Verbindung 219 optimieren. Gleichzeitig ist es gelungen in Verbindung 219 einer der am potentesten dual ausgeglichensten dualen 5 LO/mPGES-1 Inhibitoren zu identifizieren.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in dieser Arbeit es gelungen ist durch gezielte Untersuchungen der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zwei verschiedene Substanzklassen zu dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren zu optimieren. Ebenso konnte für Substanz 170 auch in vivo anti-entzündliche Eigenschaften festgestellt werden. Diese Arbeit soll dazu beitragen, das therapeutische Potential von dualen 5-LO/mPGES-1 Inhibitoren als anti-entzündliche Wirkstoffe in Zukunft besser einschätzen zu können.
Die Analyse von DNA-Sequenzen steht spätestens seit der Feststellung ihrer tragenden Rolle in der Vererbung organismischer Eigenschaften im Fokus biologischer Fragestellungen. Seit Kurzem wird mit modernsten Methoden die Untersuchung von kompletten Genomen ermöglicht. Dies eröffnet den Zugang zu genomweiten Informationen gegenüber begrenzt aussagekräftigen markerbasierten Analysen. Eine Genomsequenz ist die ultimative Quelle an organismischer Information. Allerdings sind diese Informationen oft aufgrund technischer und biologischer Gründe komplex und werfen meist mehr Fragen auf, als sie beantworten.
Die Rekonstruktion einer bislang unbekannten Genomsequenz aus kurzen Sequenzen stellt eine technische Herausforderung dar, die mit grundlegenden, aber in der Realität nicht zwingend zutreffenden Annahmen verbunden ist. Außerdem können biologische Faktoren, wie Repeatgehalt oder Heterozygotie, die Fehlerrate einer Assemblierung stark beeinflussen. Die Beurteilung der Qualität einer de novo Assemblierung ist herausfordernd, aber zugleich äußerst notwendig. Anschließend ist eine strukturelle und funktionale Annotation von Genen, kodierenden Bereichen und repeats nötig, um umfangreiche biologische Fragestellungen beantworten zu können. Ein qualitativ hochwertiges und annotiertes assembly ermöglicht genomweite Analysen von Individuen und Populationen. Diese Arbeit beinhaltet die Assemblierung und Annotation des Genoms der Süßwasserschnecke Radix auricularia und eine Studie vergleichender Genomik von fünf Individuen aus verschiedenen molekularen Gruppen (MOTUs).
Mollusken beherbergen nach den Insekten die größte Artenvielfalt innerhalb der Tierstämme und besiedeln verschiedenste, teils extreme, Habitate. Trotz der großen Bedeutung für die Biodiversitätsforschung sind verhältnismäßig wenige genomische Daten öffentlich verfügbar. Zudem sind Arten der Gattung Radix auch aufgrund ihrer großen geografischen Verbreitung in diversen biologischen Disziplinen als Modellorganismen etabliert. Eine annotierte Genomsequenz ermöglicht über bereits untersuchte Felder hinaus die Forschung an grundlegenden biologischen Fragestellungen, wie z.B. die Funktionsweise von Hybridisierung und Artbildung. Durch Assemblierung und scaffolding von sechs whole genome shotgun Bibliotheken verschiedener insert sizes und einem transkriptbasiertem scaffolding konnte trotz des hohen Repeatgehalts ein vergleichsweise kontinuierliches assembly erhalten werden. Die erhebliche Differenz zwischen der Gesamtlänge der Assemblierung und der geschätzten Genomgröße konnte zum Großteil auf kollabierte repeats zurückgeführt werden.
Die strukturelle Annotation basierend auf Transkriptomen, Proteinen einer Datenbank und artspezifisch trainierten Genvorhersagemodellen resultierte in 17.338 proteinkodierenden Genen, die etwa 12,5% der geschätzten Genomgröße abdecken. Der Annotation wird u.a. aufgrund beinhaltender Kernrthologen, konservierter Proteindomänenarrangements und der Übereinstimmung mit de novo sequenzierten Peptiden eine hohe Qualität zugesprochen.
Das mapping der Sequenzen von fünf Radix MOTUs gegen die R. auricularia Assemblierung zeigte stark verringerte coverage außerhalb kodierender Bereiche der nicht-Referenz MOTUs aufgrund hoher Nukleotiddiversität. Für 16.039 Gene konnten Topologien berechnet werden und ein Test auf positive Selektion ausgeführt werden. Insgesamt konnte über alle MOTUs hinweg in 678 verschiedenen Genen positive Selektion detektiert werden, wobei jede MOTU ein nahezu einzigartiges Set positiv selektierter Gene beinhaltet. Von allen 16.039 untersuchten Genen konnten 56,4% funktional annotiert werden. Diese niedrige Rate wird vermutlich durch Mangel an genomischer Information in Mollusken verursacht. Anschließende Analysen auf Anreicherungen von Funktionen sind deshalb nur bedingt repräsentativ.
Neben den biologischen Ergebnissen wurden Methoden und Optimierungen genomischer Analysen von Nichtmodellorganismen entwickelt. Dazu zählen eigens angefertigte Skripte, um beispielsweise Transkriptomalignments zu filtern, Trainings eines Genvorhersagemodells automatisiert und parallelisiert auszuführen und Orthogruppen bestimmter Arten aus einer Orthologievorhersage zu extrahieren. Zusätzlich wurden Abläufe entwickelt, um möglichst viele vorhandene Daten in die Assemblierung und Annotation zu integrieren. Etwa wurde ein zusätzliches scaffolding mit eigens assemblierten Transkripten mehrerer MOTUs sequenziell und phylogenetisch begründet ausgeführt.
Insgesamt wird eine umfassende und qualitativ hochwertige Genomsequenz eines Süßwassermollusken präsentiert, welche eine Grundlage für zukünftige Forschungsprojekte z.B. im Bereich der Biodiversität, Populationsgenomik und molekularen Ökologie bietet. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen einen Wissenszuwachs in der Genomik von Mollusken dar, welche bisher trotz ihrer Artenvielfalt deutlich unterrepräsentiert bezüglich assemblierter und annotierter Genome auffallen.
In dieser Arbeit wurden mittels Fragebogen chronobiologische - hier als Chronobiologika bezeichnet -, biologische und soziale Parameter von Patienten mit einer definierten Malignomerkrankung (Mamma-Karzinom, Kolon-Karzinom, Lymphom) bestimmt und auf Zusammenhänge überprüft. Die Chronobiologika wurden für die Zeit vor der Erkrankung sowie für den Zeitpunkt der Befragung erhoben und die Veränderungen berechnet. Die Parameter vor der Erkrankung wurden bei der Gruppe der Patienten mit Mamma-Karzinom mit einer repräsentativen Referenzgruppe (Gesundheitsmonitor des Jahres 2013 der Bertelsmann Stiftung) auf Unterschiede verglichen. Es wurde insbesondere untersucht, ob Zusammenhänge zwischen den Veränderungen der Chronobiologika und der unter der Chemotherapie empfundenen Belastung (= Distress) bestehen.
Dazu wurden im Rahmen einer multizentrischen Studie bei 378 Personen anhand eines Fragebogens auf Basis des Munich ChronoType Questionnaires (MCTQ) Angaben zu ihrem Schlaf-Wach-Rhythmus, ihrer Malignomerkrankung, deren Therapie, der darunter empfundenen Belastung und dem Lebensstil ausgewertet. Ein besonderes Augenmerk wurde dabei auf den Chronotyp, den Social Jetlag und das Schlafdefizit gelegt.
Es ließen sich nur wenige Unterschiede in den Chronobiologika zum Zeitpunkt vor der Erkrankung und dem aktuellen pathologischen Zustand, zwischen den Malignomgruppen, zwischen den Gruppen mit und ohne Chemotherapie sowie zwischen den Gruppen mit geringem und hohem Distress finden.
Im Rahmen der Malignomerkrankung kam es zu Veränderungen im Schlaf-Wach-Rhythmus der Teilnehmer: So wurden Einschlaf- und Aufwachzeit sowie der Chronotyp früher in den Tagesverlauf verlegt. Der Social Jetlag und das Schlafdefizit verminderten sich. Die Einschlaflatenz wurde länger. Diese Veränderungen fanden sich bevorzugt bei Patienten mit Mamma-Karzinom, Chemotherapie und hohem Distress. Der Distress war bei Frauen und jüngeren Personen stärker ausgeprägt.
Die Studienpopulation zeigte im Vergleich zur vorgenannten Referenzgruppe in allen Altersgruppen einen späteren Chronotyp, einen höheren Social Jetlag und einen höheren Anteil an Berufstätigen.
Die beschriebenen Veränderungen im Schlaf-Wach-Rhythmus ließen sich im Wesentlichen mit der veränderten Berufstätigkeit und dem subjektiven Distress im Rahmen der Erkrankung und ihrer Therapie erklären. So fanden sich die stärksten Veränderungen in den Chronobiologika bei Patienten mit hohem Distress und einer Aufgabe der Berufstätigkeit. Die Unterschiede zwischen der Referenzgruppe und der Gruppe der Patientinnen mit Mamma-Karzinom lassen sich tatsächlich mit einer Krankheitsprädisposition oder durch soziokulturelle Besonderheiten in der Studienpopulation gegenüber der Normalbevölkerung (Referenzgruppe) erklären.
Translation is a universal process in all kingdoms of life and organized in a cycle that requires ribosomal subunits (40S and 60S), messenger RNA (mRNA), aminoacylated transfer RNAs (tRNAs), and a myriad of regulatory factors. As soon as translation reaches a stop codon or stalls, a termination or surveillance process is launched via release factors eRF1 or Pelota (Dom34), respectively. The ATP-binding cassette (ABC) protein ABCE1 interacts with release factors at the ribosomal A-site and coordinates the recycling process in Eukarya and Archaea. Two asymmetric nucleotide-binding sites (NBSs) control and execute the ribosome splitting upon dimerization and closure of the two nucleotide-binding domains (NBDs).
Ribosome nascent chain complexes (RNCs), ABCE1, and Dom34 from S. cerevisiae were produced for the reconstitution of splitting assays in order to probe for ABCE1’s actions in the splitting process with its native substrate. Translating ribosomes were stalled in vivo in a no-go situation on truncated mRNAs by a 3´-ribozyme motif that generates truncated mRNAs. The initiated decay mechanisms were circumvented by genomic deletion of the release factor Dom34 (Pelota) of the no-go decay machinery. The mRNA coded for an N terminal affinity purification tag (His-tag) and the green fluorescent protein (GFP) as a reporter of the translated nascent chain in the ribosomal complexes. RNCs were successfully in vivo stalled, enriched, and purified. In native gels, the reconstituted splitting experiments were analyzed by separation of RNCs, ribosomal subunits, and nascent chain-tRNA complexes based on the fluorescence readout of the GFP reporter. In addition, the anti-association factor eIF6 was added in the splitting reaction because it blocks the immediate re-association of ribosomal subunits after splitting. The anti-association activity of eIF6 was probed by an anti-/re-association assay, in which ribosomes are anti-associated by high salt and low magnesium conditions and in a second step re-associated. The re-association can be blocked by binding of eIF6 and other anti-associating factors to the ribosomal intersubunit sites. This approach allowed for the discovery of an anti-association activity of ABCE1 that was dependent on the non-hydrolysable ATP analog AMP-PNP. In addition, the formed complex between 40S and ABCE1 represented formally a post-splitting intermediate.
In collaboration with the Beckmann lab, the structure of the post-splitting complex was reconstructed at 3.9 Å. The ABC system of ABCE1 is fully closed and its N-terminal iron-sulfur (FeS) cluster domain is rotated by 150-degree to a cleft at helix 44 and uS12. The FeS cluster domain is stabilized by interactions of Pro30 to uS12, Arg7 to helix 5, and the cantilever arm that links it to NBD1. Tyr301 of NBD1 stabilizes the FeS cluster domain in the rotated position by interaction to the backbone of the cantilever arm. Upon transition to the post-splitting state, the FeS cluster domain must clash with the release factor and push it in between the ribosomal subunits like a wedge and split the ribosome. In addition, in the post-splitting state, the FeS cluster domain would putatively clash with uL14 of the large ribosomal subunit, and this is the structural explanation for the anti-association effect of ABCE1. In Archaea, a similar conformation of the post-splitting complex was reconstructed in collaboration with the Beck and Beckmann labs and Kristin Kiosze-Becker and Elina Nürenberg-Goloub. Based on the high-resolution structure of the post-splitting complex, the post-splitting state of ABCE1 was identified in the 43S initiation complex 40S–ABCE1–tRNA–eIF2–eIF3. Subsequently, we proposed the post-splitting complex as a platform for initiation.
In the quest to elucidate conformational dynamics of ABCE1, a reconstituted system was established to study conformational dynamics in real-time. Single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) was used for the relative distance detection between a donor and acceptor fluorophore. A cysteine-less ABCE1 variant was engineered with additional cysteines for fluorescent labeling by thiol-maleimide-coupling. In collaboration with Philipp Höllthaler, the double-cysteine variants were labeled for smFRET studies and alternating-laser excitation (ALEX) smFRET measurements were performed with ABCE1 and the small ribosomal subunit. ABCE1’s nucleotide-dependent NBD dimerization and FeS cluster domain rotation was determined in real-time. Finally, a higher opening and closing frequency of the NBDs was discovered than the determined ATPase rate. This observation could be explained by the hypothesis of elastic dimerization that is not immediately connected to ATP hydrolysis.
Die Bestrahlung atmungsbewegter Tumoren stellt eine Herausforderung für die moderne Strahlentherapie dar. In der vorliegenden Arbeit werden zu Beginn die physikalischen, technischen und medizinischen Grundlagen vorgestellt, um dem Leser den Einstieg in die komplexe Thematik zu erleichtern. Des Weiteren werden verschiedene Techniken zur Bestrahlung atmungsbewegter Zielvolumina vorgestellt. Auch wird auf die Sicherheitssäume eingegangen, die notwendig sind, um Fehler in der Bestrahlungskette beim Festlegen des Planungszielvolumens für die Bestrahlung auszugleichen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Konzept entwickelt, wodurch sich der Sicherheitssaum von bewegten Tumoren in der Radiochirurgie mit dem Tumor-Tracking-System des Cyberknifes noch weiter verkleinern lässt. Somit kann die sogenannte therapeutische Breite der Behandlung weiter vergrößert werden kann. Dafür wurden ein 4D-CT und ein Gating-System in den klinischen Betrieb aufgenommen. Die entwickelte Technik basiert auf den zehn individuellen Atemphasen des 4D-CTs und lässt eine Berücksichtigung bewegter Risikostrukturen bereits während der Bestrahlungsplanung zu. Diese Methode wurde mit aktuellen Bestrahlungstechniken mittels eines Vergleichs der Bestrahlungspläne anhand von zehn Patientenfällen verglichen. Zur Erstellung der Bestrahlungspläne kamen die Bestrahlungsplanungssysteme von Varian (Eclipse 13.5) und Accuray (Multiplan 4.6) zum Einsatz. Es wurden insbesondere die Bestrahlungsdosen an den Risikoorganen und die Volumina ausgewählter Isodosen betrachtet. Hier zeigte sich eine klare Abhängigkeit von der Belastung des gesunden Gewebes von der verwendeten Bestrahlungstechnik. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass mit einer Reduzierung des Sicherheitssaums, welcher abhängig von der verwendeten Planungs- und Bestrahlungstechnik ist, eine Vergrößerung der therapeutischen Breite einhergeht. Zusätzlich bleibt bei einer geringen Belastung des umliegenden gesunden Gewebes die Möglichkeit für eine weitere Bestrahlung offen.
Anschließend wurden anhand von berechneten Testplänen Messungen an einem für diese Arbeit modifizierten Messphantom am Varian Clinac DHX und am Cyberknife VSI durchgeführt. Hier wurden die beim Planvergleich verwendeten Bestrahlungstechniken verwendet, um einen Abgleich von berechneter und tatsächlich applizierter Dosis zu erhalten. Das verwendete Messphantom simuliert die Atmung des Patienten und lässt gleichzeitig eine Verifikation der Dosisverteilung mit EBT3-Filmen sowie Messungen mit Ionisationskammern zu. Es zeigte sich, dass für die Techniken, welche aktiv die Atmung berücksichtigen (Synchrony am Cyberknife und Gating am Varian Clinac), selbst im Niedrigdosisbereich eine gute Übereinstimmung zwischen Messung und Berechnung der Dosisverteilung vorliegt. Sobald die Bewegung des Zielvolumens bereits bei der Bestrahlungsplanung berücksichtigt wird, steigt die Übereinstimmung weiter an. Für Techniken, welche die Atmung lediglich bei der Zielvolumen-Definition einbeziehen (ITV-Konzept), liegen sowohl die mit Ionisationskammern gemessenen Werte als auch die Übereinstimmung von berechneter und gemessener Dosisverteilung außerhalb des Toleranzbereichs.
Eine weitere Frage dieser Arbeit befasst sich mit der Treffsicherheit des Tumor-Tracking-Systems des Cyberknifes (Synchrony). Hier wurden Messungen mit dem XSightLung-Phantom und unterschiedlichen Sicherheitssäumen, welche die Bewegung des Tumors ausgleichen sollen, durchgeführt. Dies geschah sowohl mit dem für das Phantom vorgesehenen Würfel mit Einschüben für EBT3-Filme als auch mit einem Film-Sanchwich aus Flab-Material zur Untersuchung einer dreidimensionalen Dosisverteilung. Die Analyse der Filme ergab, dass es zumindest an einem Phantom mit einer einfachen kraniokaudalen Bewegung nicht nötig ist, die Bewegung des Zielvolumens durch einen asymmetrischen Sicherheitssaum in Bewegungsrichtung zu kompensieren um die Abdeckung des Zielvolumens mit der gewünschten Dosis zu gewährleisten.
Durch diese Arbeit konnten zusätzlich weitere wertvolle Erkenntnisse für den klinischen Alltag gewonnen werden: bei der Untersuchung der Bewegung von Tumoren in freier Atmung sowie bei maximaler Inspiration und Exspiration zeigte sich, dass zum Teil die Tumorbewegung in maximalen Atemlagen (3-Phasen-CT) deutlich von der freien Atmung abweicht. Dies lässt den Schluss zu, dass für eine Bestrahlung in freier Atmung ein 4D-CT die Tumorbewegung deutlich realistischer widerspiegelt als ein 3-Phasen-CT, zumal letzteres eine größere Dosisbelastung für den Patienten bedeutet.
Ebenfalls konnte anhand einer retrospektiven Untersuchung von Lungentumoren gezeigt werden, dass für die Berechnung von Bestrahlungsplänen für Tumoren in inhomogenem Gewebe der Ray-Tracing-Algorithmus die Dosis im Zielvolumen teilweise sehr stark überschätzt. Um eine realistische Dosisverteilung zu erhalten, sollte deshalb insbesondere bei Tumoren in der Lunge auf den Monte-Carlo-Algorithmus zurückgegriffen werden.
Strong convergence rates for numerical approximations of stochastic partial differential equations
(2018)
In this thesis and in the research articles which this thesis consists of, respectively, we focus on strong convergence rates for numerical approximations of stochastic partial differential equations (SPDEs). In Part I of this thesis, i.e., Chapter 2 and Chapter 3, we study higher order numerical schemes for SPDEs with multiplicative trace class noise based on suitable Taylor expansions of the Lipschitz continuous coefficients of the SPDEs under consideration. More precisely, Chapter 2 proves strong convergence rates for a linear implicit Euler-Milstein scheme for SPDEs and is based on an unpublished manuscript written by the author of this thesis. This chapter extends an earlier result1 by slightly lowering the assumptions posed on the diffusion coefficient and a different approximation of the semigroup. In Chapter 3 we introduce an exponential Wagner-Platen type numerical scheme for SPDEs and prove that this numerical approximation method converges in the strong sense with oder up to 3/2−. Moreover, we illustrate how the (mixed) iterated stochastic-deterministic integrals, that are part of our numerical scheme, can be simulated exactly under suitable assumptions.
The second part of this thesis, i.e. Chapter 4 and Chapter 5, is devoted to strong convergence rates for numerical approximations of SPDEs with superlinearly growing nonlinearities driven by additive space-time white noise. More specifically, in Chapter 4, we prove strong convergence with rate in the time variable for a class of nonlinearity-truncated numerical approximation schemes for SPDEs and provide examples that fit into our abstract setting like stochastic Allen-Cahn equations. Finally, in Chapter 5, we extend this result with spatial approximations and establish strong convergence rates for a class of full-discrete nonlinearity truncated numerical approximation schemes for SPDEs. Moreover, we apply our strong convergence result to stochastic Allen-Cahn equations and provide lower and upper bounds which show that our strong convergence result can, in general, not essentially be improved.
The multistep-processes leading to the formation of tumors have been extensively studied in the past decades, leading to the identification of “hallmarks of cancer”. They are characteristic changes in biological processes that discriminate tumor cells from healthy cells. Increasing knowledge on the molecular structures associated with tumorigenesis allowed their specific inhibition in targeted anti-cancer therapy. However, successful targeted anti-cancer therapy is only available for a limited subset of diseases, so the continuous investigation of tumorigenic mechanisms is required to tackle the immense diversity of neoplastic entities.
AVEN and FUSE binding protein 1 (FUBP1) display the ability to regulate apoptosis and cell cycle progression. Thus, the proteins are associated with hallmarks of cancer (resisting cell death and uncontrolled proliferation). Indeed, aberrant expression of AVEN and FUBP1 could be demonstrated in multiple cancers. In contrast, there is only little knowledge on the physiological function of AVEN and FUBP1. The lack of knowledge results in part from the embryonic lethality of the homozygous knockout of Aven and Fubp1 in mouse models, limiting the gain of information by analyzing these animals.
In this study, I generated conditional Aven and Fubp1 knockout mice to investigate their physiological function.
By analyzing reporter mice expressing β-galactosidase under the control of the endogenous Aven promoter, I identified Aven promoter activity to be both tissue- and cell type-specific and dependent on the developmental stage. Detecting apoptotic cell death by immunohistochemistry did not reveal increased apoptosis in Aven knockout mice, suggesting a functional role of AVEN besides apoptosis inhibition during embryogenesis.
Basing on the significant Aven promoter activity detected in the adult brain and in the mammary gland, I generated and characterized conditional Aven knockout mice with Aven deletion restricted to cells within the brain or the mammary gland. AVEN depletion in these tissues was not embryonic lethal and the affected tissues displayed a normal histology.
Since aberrant Aven expression had been associated with hematologic malignancies, I also analyzed mice with an Aven knockout in the hematopoietic system. Depletion of AVEN in the blood cells had no effect on hematopoietic stem and progenitor cell frequencies. Consequently, AVEN seems to be dispensable for the maintenance and differentiation of stem, progenitor and mature blood cells, at least as far as the expression of particular differentiation markers was concerned.
As loss of AVEN in the analyzed tissues did not affect the viability of mice and did not produce any other obvious phenotype, the exact role of AVEN that is essential for embryo survival remains to be identified.
To study the oncogenic potential of AVEN, I investigated the role of AVEN in a mouse model for breast carcinogenesis. While AVEN expression seemed to be increased in breast tumors, tumor onset and progression were not altered in mice with depleted AVEN expression in the mammary gland. Consistently, Aven knockout tumor cells were neither less proliferative nor more prone to undergo apoptosis than Aven wildtype tumor cells. Cell culture experiments demonstrated that AVEN expression is upregulated by estrogen. Knockdown of AVEN in the breast cancer cell line MCF-7 slightly increased UV irradiation-induced apoptosis and accelerated metabolism. So while AVEN does not promote development or progression of breast tumors, enhanced AVEN expression in ER+ breast cancers might contribute to chemotherapy resistance.
To study the physiological role of FUBP1, I generated a conditional Fubp1 knockout mouse model. While the insertion of loxP sites into the Fubp1 locus was occasionally embryonic lethal, some mice with a cell type-specific deletion of Fubp1 in hematopoietic cells or EPO receptor expressing cells were born alive. In these mice, frequencies of hematopoietic stem and progenitor cells as well as erythrocytes were unaltered. These results conflict with previous publications. However, compensating mechanisms might be responsible for the discrepancies between the observed phenotypes and reported FUBP1 function.
In cell culture studies, I could demonstrate that the previously reported upstream regulation of FUBP1 by TAL1 depended on an intact GATA motif in the FUBP1 promoter and that binding of GATA1 to the FUBP1 promoter increased during erythropoiesis.
To identify new FUBP1 target genes with relevance for erythropoiesis, I performed differential gene expression analysis in cells with wildtype and depleted FUBP1 expression. RNA-sequencing and PCR-arrays revealed only moderate differences in the expression of genes that are components of the EPO receptor signaling pathway as well as genes associated with apoptosis and proliferation of hematopoietic cells. By regulating the transcription of these genes, FUBP1 could contribute to efficient erythropoiesis.
With the discovery of light beyond human visibility, scientists strove to extend the range of observation to invisible parts of the light’s spectrum. Realising that light of all frequencies is part the same physical phenomenon, brought a leap in understanding about electromagnetic waves. With the development of more advanced technology, detectors with higher sensitivity for adjacent frequencies to the visible were built. From this, with each new observable wavelength, more insight into otherwise invisible processes and phenomenons were observed. Hand in hand with this went the enhancement of the output power of corresponding sources. This has lead to higher sensitivity setups throughout the spectrum, leading to observations which have given a deeper understanding in various fields of science. Nowadays, detectors and emitters in many different regions of the invisible electro magnetic spectrum have found their way in our every day life. Innovations in technology has lead to practical applications such as X-rays in medicine, motion sensors and remote controls using infrared light, distance sensors and data transmission using radar and radio devices. The frequency regions above infrared are optically generated and below radar can be produced using electric methods. There is no straight line that separates these frequencies. There rather is a whole intermediate region known as the terahertz (THz) regime. Due to the lack of sensitive detectors and efficient sources, the THz frequency region has not been exploited for application use on a widespread basis so far. It combines properties from the surrounding frequency ranges which make it an ideal spectrum for various applications. Consequently, THz radiation and THz imaging are active fields of research.
The work presented in this thesis consists of the development and testing of novel THz imaging concepts, which uses a THz antenna coupled field effect transistor (TeraFET) detector. Two detection principles are applied using two different optical setups. The first uses a pulsed optical parametric oscillator (OPO) THz source where the optical output power is detected. The source relies on a nonlinear effect of a lithium niobate crystal to generate tunable THz pulses from a Q-switched pump laser. The THz signal is detected and amplified by a double stage operational amplifier for monitoring the real time 20 ns pulses on an oscilloscope where a signal to noise ratio (SNR) of ⇠ 25 at a frequency range from 0.75 to 1.1 THz is reached. Imaging of the area of interest with a resolution of 1.2 mm is achieved through raster scanning of the THz pulses. Also spectroscopy with a frequency resolution of ⇠ 50 GHz is demonstrated using a para-aminobenzoic acid sample. The second setup utilises two synchronised electronic multiplier chain sources where their output is mixed on the detector. To form a heterodyne detection setup, the intermediate frequency is fed to a lock-in amplifier which then amplifies the so called beat signal from the TeraFET detector. One source is fixed relative to the detector even through scanning to ensure a stable signal. This detection method allows for amplitude and phase detection for every scanning position, making numerical light field propagation and object reconstruction possible. Numerical focussing is a key feature achieving a lateral resolution of the input transmittance of ⇡ 2 mm.
After the introduction, the second chapter describes the setup, measurement results and challenges which arise using a TeraFET together with the pulsed THz source “Firefly-THz”. In the description of the setup, special attention is given to the shielding of the detector and the electronics. General findings discuss first the overall performance and later spectroscopy and imaging as application examples. Another subsection continues with potential noise sources before the chapter is concluded. Chapter three expands on the topic of Fourier optics from a theoretical point of view. First, parts of the theory of the Fourier Transform (FT) are set out for the reader and how the Fast Fourier Transform (FFT) results from the Discrete Fourier Transform (DFT). This approach is used for theoretical considerations and the implementation of a Fourier optic script that allows for numerical investigations on electro magnetic field propagation through an optical system. The boundary conditions are chosen to be practical relevant to make predictions on measurements presented in chapter four. The following fourth chapter describes the realisation of a heterodyne THz detection setup. Before the measurement results are presented, the setup and its electric configuration are shown. The results come close to the analytical predictions so that the same algorithm which propagates the field from an object to the Fourier plane is used to propagate the measured field back to the object. The influence of phase noise on the measurement results are discussed before simulation and measurement is compared. The last chapter in this thesis concludes on the findings in the pulsed THz detection and the heterodyne THz Fourier imaging and gives an outlook for both configurations.
Die Tumorprotein-Familie des Proteins p53 besteht aus drei Familienmitgliedern p53, p63 und p73 mit diversen Funktionen als Transkriptionsfaktoren. p53 war das erste Mitglied dieser Familie, das im Jahre 1979 entdeckt wurde und wurde zunächst als krebsverursachendes Protein eingeordnet, weil es in vielen Tumorgeweben in erhöhter Menge vorgefunden wurde. Es wurde allerdings festgestellt, dass der Großteil dieser gefundenen p53-Proteine funktionsunfähig durch Mutationen in ihrer Aminosäuresequenz waren. Unmutiertes p53 hingegen führt zu einem Stopp von Zellteilung oder sogar Zelltod, sofern die Zellen genetischem Stress durch Strahlung oder mutagene Chemikalien ausgesetzt sind. Heute wird p53 als eines der wichtigsten Tumor-Unterdrückungsproteine betrachtet. Die beiden anderen Familienmitglieder p63 und p73 existieren in einer Vielzahl von Isoformen. Neben carboxyterminaler alternativer mRNA-Prozessierung (α, β, γ, usw. Isoformen) führen zwei unabhängige Promotoren auch zu zwei unterschiedlichen Aminotermini. Hier wird zwischen ΔN- und TA-Isoformen unterschieden. Im Falle von p63 treten zwei dominante Isoformen auf, ΔNp63α und TAp63α. Während ΔNp63α eine Rolle in der Differenzierung von Haut spielt, wurde TAp63α bisher ausschließlich in Eizellen gefunden. Dort hat es die Funktion eines Sensors, der die genetische Integrität der weiblichen Keimbahn sicherstellt. Es liegt in Eizellen in hoher Konzentration vor, allerdings in einer komplett inaktiven Form. Werden Schäden im der Erbgut der Eizelle festgestellt, so wird das Protein aktiviert und kann so den Prozess des Zelltods der Eizelle einleiten. Mutationen oder das Fehlen des p63-Genes führen zu Missbildungen während der Entwicklung und zu unvollständig ausgebildeter Haut. Im Falle von p73 gibt es ebenfalls mehrere Isoformen, wobei die Funktionen und Relevanzen der einzelnen Isoformen bisher nicht komplett geklärt werden konnten. Eine p73-negative Maus hat einen diffusen Phänotyp, der sich durch niedrige Intelligenz, fast sterile Männchen und chronische bronchiale Infektion auszeichnet. Generell sind alle Mitglieder der p53-Familie tetramere Proteine und sind nur in diesem Zustand auch aktiv. Die einzige Ausnahme stellt, wie oben beschrieben, TAp63α dar, das in einem inaktiven dimeren Zustand vorliegt und nur durch Modifikation durch zwei unabhängige Kinasen aktiviert werden kann. Dabei geht es in den tetrameren Zustand über und ist daraufhin aktiv.
Alle drei Proteine haben (anhand ihrer längsten Isoform beschrieben) eine konservierte Domänenstruktur. Am Aminoterminus befindet sich zunächst die transaktivierende-Domäne (TAD), die für Interaktionen mit transkriptionellen Koaktivatioren relevant ist. Danach folgt die stark konservierte Desoxyribonukleinsäure (DNA) bindende Domäne (DBD). Sie stellt sicher, dass der Transkriptionsfaktor sequenzspezifisch an der richtigen Stelle auf die DNA bindet. Weitergehend folgt die Tetramerisierungsdomäne (TD), welche den oligomeren Zustand des Proteins herstellt. Im Falle von p53 endet das Protein an dieser Stelle, bei p63 und p73 folgen noch das Sterile-Alpha-Motiv (SAM) und die Transkription-inhibierende Domäne (TID). Die SAM Domäne wird generell als Interaktionsdomäne beschrieben, es konnte allerdings bis dato kein Interaktionspartner gefunden werden. Die TID hat einen negativen Einfluss auf die transkriptionelle Aktivität der Proteine. Im Falle von TAp63α interagiert sie zusätzlich mit der TAD um den Dimeren Zustand zu stabilisieren.
Histon Acetylasen
Die Acetylierung von Histonen ist neben deren Methylierung die wichtigste Modifikation. Sie ist essenziell für die Transkription innerhalb aller eukaryontischen Lebewesen, da sie durch die Modifikation von Histonen die DNA für die DNA-Polymerase II zugänglich macht. Es gibt insgesamt fünf verschiedene, nicht näher miteinander verwandte Familien von Histonacetylasen. Diese Studie beschäftigt sich ausschließlich mit der KAT3 Familie, bestehend aus den Proteinen p300 und CBP. Beide sind hochgradig konserviert, in gefalteten Bereichen der Proteine erreicht die Sequenzidentität fast 100%. Beide Proteine scheinen sehr ähnliche Aufgaben zu erfüllen, die jedoch nicht komplett identisch sind. Die Fehlfunktion von einem Allel von CBP führt zum Krankheitsbild des Rubinstein-Taybi-Syndrom (RTS), während ein Mangel an p300 sich in Mäusen auf das Gedächtnis auswirkt. Der komplette Verlust beider Allele eines der Proteine ist immer tödlich, genauso wie auch Verlust jeweils eines Allels bei beiden Proteinen. Insgesamt vier unabhängige Domänen in p300/CBP sind in der Lange die transaktivierende Domänen der p53-Familie zu binden. Bei zwei der Domänen handelt es sich um Zinkfinger-Proteine (Taz1 und Taz2), die anderen beiden sind kleine, ausschließlich α-helikale Domänen (Kix und IBiD).
Diese Studie beschäftigt sich mit der Lösung von Strukturen von der transaktivierenden Domäne von p63 und p73 mit der p300-Domäne Taz2. Außerdem wurden die Auswirkungen von direkten Acetylierungen von TAp63α charakterisiert und der Effekt von einem potenten p300/CBP Inhibitor auf Oozyten unter genotoxischem Stress analysiert. Zusätzlich wurde die Phosphorylierungskinetiken von Tap63α wärend der Aktivierung durch Kinasen untersucht.
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Mit S-303 pathogenreduzierten Erythrozytenkonzentraten können sowohl infektiöse also auch nicht-infektiöse Risiken einer Transfusionen möglicherweise weiter reduziert werden. Frühere Studien mussten abgebrochen werden, da Antikörper gegen S-303-behandelte Erythrozyten festgestellt wurden. S-303 reagiert als unerwünschten Nebeneffekt auch mit Oberflächenmolekülen der roten Blutkörperchen. Dabei wird die Acridin-Komponente von S-303 auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen gebunden. Gegen diese Acridin-Komponente können nach Transfusion von pathogenreduzierten EK immuninduzierte AK gebildet werden. Es existieren aber auch natürlich präformierte AK gegen S-303-behandelte Erythrozytenkonzentrate. Das Verfahren wurde modifiziert, indem der Anteil von GSH erhöht wurde. Dadurch wird vermehrt S-303 im Extrazellulärraum abgefangen und weniger Acridin auf der Oberfläche der Erythrozyten gebunden.
In dieser Studie wurden 9671 potentiell transfusionsbedürftigen Patienten auf einen natürlich präformierten Antikörper gegen S-303-behandelte Erythrozytenkonzentrate untersucht. Diese Patienten hatten zuvor noch keine S-303-behandelten Erythrozytenkonzentrate erhalten. Es wurden Testzellen von Blutspendern der Blutgruppe 0 hergestellt. Aus jedem EK wurden drei unterschiedliche Testzellen hergestellt (Erstgenerationszellen, Zweitgenerationszellen, Kontrollzellen). Das Screening erfolgte mittels IAT in Gelkartentechnik mit einer Testzelle der ersten und zweiten Generation. Die Antikörper wurden weiter charakterisiert bezüglich Spezifität, Titer, Antikörperklasse und –subklasse, Affinität und Temperaturreaktivität.
Bei zwölf Patienten konnte ein AK gegen S-303 pathogenreduzierte Erythrozy-tenkonzentrate nachgewiesen werden und somit konnte gezeigt werden, dass die Prävalenz eines solchen Antikörpers gering ist. Bei elf Patienten handelt es sich um einen Anti-Acridin-AK. Alle elf Patienten hatten immer einen positiven AKS mit der Erstgenerationszelle, jedoch nicht mit der Zweitgenerationszelle. Die Sensitivität, einen AK gegen Acridin mit der Erstgenerationszelle zu finden, ist höher als mit der Zweitgenerationszelle. Die Erstgenerationszelle hat auf ihrer Oberfläche mehr Acridin gebunden als die Zweitgenerationszelle. Bei einem Patienten konnte ein AK unbekannter Spezifität nachgewiesen werden, welcher jedoch ausschließlich mit der Zweitgenerationszelle reagierte. Vor einer möglichen Transfusion von S-303 pathogenreduzierten Erythrozytenkonzentraten wird empfohlen immer eine Testung auf Antikörper gegen Testzellen der ersten und der zweiten Generation durchzuführen. Eine Transfusion sollte grundsätzlich nur erfolgen, wenn weder ein AK gegen die Erstgenerationszelle noch gegen die Zweitgenerationszelle nachgewiesen wurde. Insgesamt handelt es sich überwiegend um niedrigtitrige IgG-AK der Subklasse 2 oder 4. Es lässt sich daher vermuten, dass natürlich präformierten AK gegen S-303-behandelte Erythrozytenkonzentrate nur eine geringe klinische Relevanz haben.
Eine klinischen Studie mit 51 kardiochirurgischen Patienten zeigte, dass nach Transfusion von pathogenreduzierten Erythrozytenkonzentraten der zweiten Generation keine immuninduzierten Antikörper gebildet wurden. Somit ist davon auszugehen, dass die Zweitgenerationszelle wegen der geringen Expression von Acridin auf der Zelloberfläche weniger immunogen ist als die Erstgenerationszelle. Klinische Studien mit einer größeren Anzahl an Patienten können nun grundsätzlich geplant werden.
Generell sollten Patienten mit natürlich präformierten Antikörpern gegen S-303-behandelte Erythrozytenkonzentrate keine pathogenreduzierten Erythrozytenkonzentrate erhalten. Patienten, welche nach Transfusion von S-303-behandelten Erythrozytenkonzentraten AK gegen die pathogenreduzierten Erythrozyten gebildet haben, sollten regelmäßig nachuntersucht werden, um eine Hämolyse frühzeitig zu entdecken.
In times of a growing world population and the associated demand for high crop yield, the understanding and improvement of plant reproduction is of central importance. One key step of plant reproduction is the development of the male gametophyte, which is better known as pollen. In addition, the development of pollen was shown to be very sensitive to abiotic stresses, such as heat, which can cause crop damage and yield loss. To obtain new insights in the development and heat stress response of pollen, a combined transcriptome and proteome analysis was performed for three pollen developmental stages of non- and heat-stressed tomato plants.
The analysis of the transcriptomes of non-stressed pollen developmental stages enabled the determination of mRNAs accumulated in certain developmental stages. The functional analysis of these mRNAs led to the identification of protein families and functional processes that are important at different times of pollen development. A subsequent comparison of the transcriptomes of non- and heat-stressed pollen revealed a core set of 49 mRNAs, which are upregulated in all three developmental stages. The encoded proteins include among other things different heat stress transcription factors and heat shock proteins, which are known key players of the plant heat stress response.
Furthermore, 793 potential miRNAs could be identified in the transcriptome of non- and heat-stressed pollen. Interestingly, 38 out of the 793 miRNAs have already been identified in plants. For more than half of these miRNAs potential target mRNAs were identified and the interactions between miRNAs and mRNAs linked to the development and heat stress response of pollen. In total, 207 developmentally relevant interactions could be determined, out of which 34 have an effect on transcriptional-networks. In addition, 24 of the interactions contribute the heat stress response of pollen, whereby this mainly affects post-meiotic pollen.
An initial correlation of the proteome and transcriptome of the developmental stages revealed that transcriptome analyses are not sufficient to draw exact conclusions about the state of the proteome. A closer look on the relationship of the transcriptome and proteome during pollen development revealed two translational modes that are active during the development of pollen. One mode leads to a direct translation of mRNAs, while the second mode leads a delayed translation at a later point in time. Regarding the delayed translation, it could be shown that this is likely due to a short-term storage of mRNAs in so-called EPPs. The comparison of the proteome and transcriptome response to heat stress revealed that the proteome reacts much stronger and that the reaction is mainly independent from the transcriptome. Finally, the comparison of the proteome of non- and heat-stressed pollen provided first indications for changes in the ribosome composition in response to heat stress, as 57 ribosomal proteins are differentially regulated in at least one developmental stage.
Cell-free-synthesized voltage-gated proton channels: Approaches to the study of protein dynamics
(2018)
We often only realize how important health is when diseases manifest themselves through their symptoms and, ultimately, in a diagnosis. Over time, we suffer from many diseases starting with the first childhood disease to colds to gastrointestinal infections. Most diseases pass harmlessly and symptoms fade away. However, not all diseases are so harmless. Alzheimer’s disease, breast cancer, Parkinson’s disease, and colorectal cancer usually cause severe illness with high mortality rates. In pharmaceutical research, efforts are therefore being made to determine the molecular basis of them in order to provide patients with potential relief and, at best, healing. A special group of regulators, involved in the previously mentioned diseases, are voltage-gated proton channels. Thus, the understanding of their structure, function, and potential drug interaction is of great importance for humanity.
Voltage-gated proton channels are localized in the cell membrane. As their name indicates, they are controlled by voltage changes. Depolarization of the cell membrane induces conformational changes that open these channels allowing protons to pass through. Here, the transfer is based on a passive process driven by a concentration gradient between two individual compartments separated by the cell membrane. Voltage-gated proton channels are highly selective for protons and show a temperature- and pH-dependent gating behavior. However, little is known about their channeling mechanism. Previous experimental results are insufficient for understanding the key features of proton channeling.
In this thesis, for the first time, the cell-free production of voltage-sensing domains (VSD) of human voltage-gated proton channels (hHV1) and zebrafish voltage-sensing phosphatases (DrVSP) is described. Utilizing the cell free approach, parameters concerning protein stability, folding and labeling can be easily addressed. Furthermore, the provision of a membrane mimetic in form of detergent micelles, nanodiscs, or liposomes for co-translational incorporations of these membrane proteins is simple and efficient. Both VSDs were successfully produced up to 3 mg/ml. Furthermore, the cell-free synthesis enabled for the first time studies of lipid-dependent co-translational VSD insertions into nanodiscs and liposomes. Cell-free produced VSDs were shown to be active, and to exist mainly as dimers. In addition, also their activation was stated to be lipid-dependent, which has not been described so far. Solution-state NMR experiments were performed with fully and selectively labeled cell-free produced VSDs. With respect to the development of potential drug candidates, I could demonstrate the inhibition of the VSDs by 2-guanidinobenzimidazole (2GBI). Determined KD values were comparable to literature data for the human construct. For the first time, a low affinity for 2GBI of the zebrafish VSD could be described.
In future, the combination of a fast, easy and cheap cell-free production of fully or selectively labeled VSDs and their analysis by solution state NMR will enable structure determinations as well as inhibitor binding studies and protein dynamic investigations of those proteins. The results of these investigations will serve as a basis for example for the development of new drugs. In addition, a detailed description of the lipid-dependent activity might be helpful in controlling the function of voltage-gated proton channels in cancer cells and thereby reducing their growth or disturbing their cell homeostasis in general.
Die eingereichte Dissertation liefert fundamentale Erkenntnisse zur Chemie nucleophiler Borzentren, die unter B•B-, B–B- und B=B-Bindungsbildungen reagieren. Zusammen mit den aufgedeckten Prinzipien zu (e–)-induzierten Umlagerungen des 9-Borafluorengrundgerüsts und Übertragungen von Hydridionen liegt nun ein umfassendes mechanistisches Wissen vor, das die effiziente Synthese neuartiger Moleküle ermöglicht. Im Folgenden ist eine Übersicht über bearbeitete Teilprojekte gegeben.
Durch Reduktion des Bis(9-borafluorenyl)methans 7 wurde über [7•]– (B•B-Einelektron-Zweizentrenbindung) und [7]2– (B–B-Zweielektronen-Zweizentrenbindung) das Tetraanion [7]4– dargestellt, das bei Zugabe von Elektrophilen unter Oxidation reagiert.
Die Injektion von Elektronen in das B(µ-H)2B dotierte Dibenzo[g,p]chrysen 12 führt in Abhängigkeit der Natur und der Stöchiometrie des eingesetzten Reduktionsmittels zu unterschiedlichen Hauptprodukten (bordotierte Dibenzo[g,p]chrysen- oder 9,9‘-Bifluorenylgrundkörper) mit verschiedenen Bindungsmodi (B–B-, B=B- oder (µ-H)B-B-Bindungen), deren Entstehung mechanistisch über Gerüstumlagerungen und Hydridübertragungen dargelegt wurde.
Durch die Zugabe etherischer HCl kann die B=B-Bindung in [37]2– quantitativ zu [116]– [(µ-H)B–B] oder 12 (B(µ-H)2B) protoniert werden. Umgekehrt lässt sich das scheinbar hydridische Diboran 12 durch sterisch anspruchsvolle Basen selektiv zu [116]– deprotonieren. Die kleine Base H3CLi führt neben der Deprotonierung von 12 auch zu einem Bis(9-borafluorenyl)methan, das ein verbrückendes Hydridion trägt ([125]–). Der Mechanismus wurde detailliert untersucht (z. B. wurde eine C–H-Aktivierung aufgeklärt), was u. a. genutzt werden konnte, um einen atomökonomischen Pfad von [37]2– zu [125]– zu etablieren.
Die Intermediate [132Cn,X]– (formale Addukte eines 9-Borafluorenyl-Anions an borständig substituierte 9-Borafluorene), gebildet durch die Zugabe von Halogenalkanen zu [37]2–, reagieren in Abhängigkeit der borständigen Alkylkette unter: (i) intramolekularer C–H-Aktivierung, (ii) intramolekularer Substitutionen oder (iii) intermolekularer Substitution.
Die Reduktion des 9-Borafluorens 6∙THF mit Lithium erzeugt das B=B-gebundene Dibenzo[g,p]chrysen-Dianion [37]2–, das 9-Borafluoren-Dianion [6]2–, das 9,9-Dihydroboratafluoren [34]– und das tetraanionische Bis(9-borafluorenyl) [146]4–.
Das 9-Borafluoren-Dianion [6]2–, das durch Reduktion von 6∙THF bei –78 °C mit Alkalimetallen selektiv dargestellt wurde, reagiert als formales Nucleophil. Über eine Reaktionskaskade gelang die selektive Synthese unterschiedlicher Produkte, die bei der literaturbekannten Reduktion des unsymmetrischen 9-Borafluoren-Dimers (6)2 mit Lithium in Toluol in Gegenwart von Et3SiBr beschrieben wurden. Hierüber konnte u. a. die Bildung eines organischen Derivats von [B3H8]– erklärt werden.
Hintergrund:
Zur Klärung der klinischen Relevanz einer Milbensensibilisierung bei Kindern und Jugendlichen mit Asthma bronchiale ist die spezifische bronchiale Allergenprovokation (BAP) der Goldstandard. Aufgrund der technischen und personellen Voraussetzungen, sowie der potentiellen Gefahr einer schweren asthmatischen Spätreaktion ist die BAP nur eingeschränkt in spezialisierten Zentren verfügbar. Im Gegensatz dazu zeichnet sich nasale Allergenprovokation (NPT) durch ein hohes Maß an Patientensicherheit aus und kann ambulant durchgeführt werden. In dieser Studie sollte daher ein Vergleich zwischen der BAP vs. NPT erfolgen und klären inwiefern die NPT eine vorteilhafte Alternative im Diagnostikalgorithmus darstellen kann.
Methodik:
Von 157 untersuchten Patienten mit asthmatischen Beschwerden und positivem Pricktest (Dermatophagoides pteronyssinus; Dermatophagoides farinae) erfüllten 74 die Ein- / Ausschlusskriterien in vollem Umfang (Alter MW: 9,1 + 3,1 Jahre). Nach der BAP und der Messung des eNO, erfolgte eine Blutentnahme zur Bestimmung von Blutbild und spezifischem IgE, ggf. konnte Nasensekret gewonnen werden. Im Anschluss wurde innerhalb von 12 Wochen eine NPT mit Milbenallergen in aufsteigender Verdünnung durchgeführt. Hierbei wurde das Ergebnis zum einen mittels Symptomscore nach Lebel evaluiert, sowie die nasale Obstruktion mittels Peak Nasal Inspiratory Flow Meter (PNIF) bestimmt. Zum Abschluss beantworteten die Patienten einen standardisierten Fragebogen zur Lebensqualität mit Rhinokonjunktivitis (RQLQ).
Ergebnisse:
In der BAP konnten 57 Patienten mit einer bronchialen Frühreaktion (FEV1 - Abfall Mean bei 29,2% ± 7,4) identifiziert werden, von diesen wurden 41 mittels Lebelsymptomscore und 19 mittels PNIF erkannt. Während der Symptomscore nach Lebel damit eine ausreichende Sensitivität von 71,9 % und einen positiv prädiktiven Wert (PPV) von 89,1 % erreichte, war die Sensitivität für den PNIF mit 33,3 % ungenügend bei einem PPV von 82,6 %. Die negativ prädiktiven Werte lagen bei 42,8 %, respektive 25,4 %. Sowohl das eNO größer oder gleich 10 ppb (AUC 0,78) als auch das kumulative spez. IgE größer oder gleich 25,5 kU/l (AUC 0,72) erwiesen sich als gute Prädiktoren einer bronchialen Frühreaktion (EAR), eine Korrelation mit dem Symptomscore nach Lebel konnte jedoch nicht festgestellt werden.
Schlussfolgerung:
Unsere Ergebnisse zeigen für den Symptomscore nach Lebel eine hohe Vorhersagekraft zur Detektion einer EAR in der bronchialen Milbenprovokation. Ein negativer Score konnte eine asthmatische Reaktion jedoch nicht ausreichend ausschließen. Für den PNIF fanden wir keine ausreichende Testvalidität. Besonders bei pädiatrischen Patienten ist zu berücksichtigen, dass diese Messung stark von der individuellen Leistungsfähigkeit beeinflusst wird. Zudem weisen die nasale und bronchiale Mukosa lokale Unterschiede auf, sodass eine nasale Reaktion nicht identisch mit einer EAR ist. Bei Kindern und Jugendlichen mit Asthma bronchiale ist die BAP daher nicht vollständig durch die NPT ersetzbar. Besonders im ambulanten Bereich findet die NPT jedoch ihre Berechtigung, durch die deutlich geringeren Testanforderungen bei einem hohen Maß an Patientensicherheit. Darüber hinaus gehen rhinitische Beschwerden häufig einem Asthma bronchiale voraus, sodass auch falsch positive Testergebnisse im Lebel - Score berücksichtigt werden sollten. Neben dem Symptomscore identifizierten wir sowohl das spezifische IgE als auch das eNO als valide Prädiktoren einer EAR, eine direkte Korrelation zum NPT konnte jedoch nicht gefunden werden.
Einleitung: Feedback ist ein elementarer Bestandteil effektiven Lernens, auch im Medizinstudium, insbesondere beim Erlernen praktischer Fertigkeiten. Feedback kann in verschieden Formen gegeben werden, die Einfluss auf das Erlernen und Behalten der Fertigkeit haben.
Videofeedback, auf der Grundlage von Videoaufzeichnungen einer Tätigkeit, erscheint hierbei eine effektive Methode zum Verstärken des Lerneffektes bei komplexen praktischen Fertigkeiten darzustellen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die vergleichende Effektivitätsanalyse von Videofeedback im Vergleich zu mündlichem Feedback auf das Erlernen des sterilen Arbeitens bei der Wundversorgung als Beispiel für eine komplexe praktische Fertigkeit.
Methode: Medizinstudierende an der Goethe-Universität Frankfurt am Main absolvieren im Rahmen ihrer curricularen Ausbildung im 2. bzw. 3. klinischen Semester das dreiwöchige Blockpraktikum Chirurgie. Hierbei durchlaufen sie das einwöchige „Training praktischer Fertigkeiten“ im Skillslab. Im Rahmen dieses aus 12 Modulen bestehenden Trainings absolvieren die Studierenden unter anderem das Modul „Wundversorgung“. In dieser 210-minütigen Trainingseinheit erlernen und üben sie die Versorgung einer einfacher Schnittwunden (von der Anamnese über das sterile Abdecken bis zum Anlegen des Verbandes) unter Anleitung und Supervision eines Peer-Tutors.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Studierenden in eine Interventions- und eine Kontrollgruppe randomisiert. Die Interventionsgruppe wurde beim Üben auf Video aufgezeichnet. Im Anschluss erhielten die Studierenden anhand der Videoaufzeichnung Feedback durch einen Peer-Tutor. Die Kontrollgruppe erhielt nach dem Üben Feedback durch den Peer-Tutor ohne Videoaufzeichnung.
Direkt im Anschluss an das Modul absolvierten die Studierenden zwei strukturierte checklistenbasierte formative Prüfungsstationen im Sinne von zwei Objective Structured Clinical Examination-Stationen (OSCE); 2 bis 3 Monate nach dem Training erfolgte die zweite Datenerhebung im Rahmen des summativen curricularen OSCE als Abschlussprüfung des Blockpraktikums Chirurgie.
Ergebnisse: Insgesamt nahmen 107 Studenten an der vorliegenden Studie teil. Am Messzeitpunkt 1 zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen Interventions- und Kontrollgruppe. Am Messzeitpunkt 2 mussten an der Prüfungsstation „Wundversorgung“ 39 Studierende durch veränderte und damit nicht mehr vergleichbare Prüfungsbedingungen ausgeschlossen werden. An der zweiten Prüfungsstation konnten alle Studierenden in die Auswertung inkludiert werden. Auch am Messzeitpunkt 2 zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen Interventions- und Kontrollgruppe.
Schlussfolgerung: Im Kontext des curricularen chirurgischen Training praktischer Fertigkeiten konnte für das Erlernen des sterilen Arbeitens kein Unterschied zwischen reinem mündlichen Feedback und Videofeedback nachgewiesen werden.
Heat stress transcription factors (Hsfs) have an essential role in heat stress response (HSR) and thermotolerance by controlling the expression of hundreds of genes including heat shock proteins (Hsps) with molecular chaperone functions. Hsf family in plants shows a striking multiplicity, with more than 20 members in many species. In Solanum lycopersicum HsfA1a was reported to act as the master regulator of the onset of HSR and therefore is essential for basal thermotolerance. Evidence for this was provided by the analysis of HsfA1a co-suppression (A1CS) transgenic plants, which exhibited hypersensitivity upon exposure to heat stress (HS) due to the inability of the plants to induce the expression of many HS-genes including HsfA2, HsfB1 and several Hsps. Completion of tomato genome sequencing allowed the completion of the Hsf inventory, which is consisted of 27 members, including another three HsfA1 genes, namely HsfA1b, HsfA1c and HsfA1e.
Consequently, the suppression effect of the short interference RNA in A1CS lin e was re-evaluated for all HsfA1 genes. We found that expression of all HsfA1 proteins was suppressed in A1CS protoplasts. This result suggested that the model of single master regulator needs to be re-examined.
Expression analysis revealed that HsfA1a is constitutively expressed in different tissues and in response to HS, while HsfA1c and HsfA1e are minimally expressed in general, and show an induction during fruit ripening and a weak upregulation in late HSR. Instead HsfA1b shows preferential expression in specific tissues and is strongly and rapidly induced in response to HS. At the protein level HsfA1b and HsfA1e are rapidly degraded while HsfA1a and HsfA1c show a higher stability. In addition, HsfA1a and HsfA1c show a nucleocytosolic distribution, while HsfA1b and HsfA1e a strong nuclear retention.
A major property of a master regulator in HSR is thought to be its ability to cause a strong transactivation of a wide range of genes required for the initial activation of protective mechanisms. GUS reporter assays as well as analysis of transcript levels of several endogenous transcripts in protoplasts transiently expressing HsfA1 proteins revealed that HsfA1a can stimulate the transcription of many genes, while the other Hsfs have weaker activity and only on limited set of target genes. The low activity of HsfA1c and HsfA1e can be attributed to the lower DNA capacity of the two factors as judged by a GUS reporter repressor assay.
HsfA1a has been shown to have synergistic activity with the stress induced HsfA2 and HsfB1. The formation of such complexes is considered as important for stimulation of transcription and long term stress adaptation. All HsfA1 members show synergistic activity with HsfA2, while only HsfA1a act as co-activator of HsfB1 and HsfA7. Interestingly, HsfA1b shows an exceptional synergistic activity with HsfA3, suggesting that different Hsf complexes might regulate different HS-related gene networks. Altogether these results suggest that HsfA1a has unique characteristics within HsfA1 subfamily. This result is interesting considering the very high sequencing similarity among HsfA1s, and particularly among HsfA1a and HsfA1c.
To understand the molecular basis of this discrepancy, a series of domain swapping mutants between HsfA1a and HsfA1c were generated. Oligomerization domain and C-terminal swaps did not affect the basal activity or co-activity of the proteins. Remarkably, an HsfA1a mutant harbouring the N-terminus of HsfA1c shows reduced activity and co-activity, while the reciprocal HsfA1c with the N-terminus of HsfA1a cause a gain of activity and enhanced DNA binding capacity.
Sequence analysis of the DBD of HsfA1 proteins revealed a divergence in the highly conserved C-terminus of the turn of β3-β4 sheet. As the vast majority of HsfA1 proteins, HsfA1a at this position comprises an Arg residue (R107), while HsfA1c a Leu and HsfA1e a Cys. An HsfA1a-R107L mutant has reduced DNA binding capacity and consequently activity. Therefore, the results presented here point to the essential function of this amino acid residue for DNA binding function. Interestingly, the mutation did not affect the activity of the protein on Hsp70-1, suggesting that the functionality of the DBD and consequently the transcription factor on different promoters with variable heat stress element number and architecture is dependent on structural peculiarities of the DBD.
In conclusion, the unique properties including expression pattern, transcriptional activities, stability, DBD-peculiarities are likely responsible for the dominant function of HsfA1a as a master regulator of HSR in tomato. Instead, other HsfA1-members are only participating in HSR or developmental regulations by regulating a specific set of genes. Furthermore, HsfA1b and HsfA1e are likely function as stress primers in specific tissues while HsfA1c as a co-regulator in mild HSR. Thereby, tomato subclass A1 presents another example of function diversity not only within the Hsf family but also within the Hsf-subfamily of closely related members. The diversification based on DBD peculiarities is likely to occur in potato as well. Therefore this might have eliminated the functional redundancy observed in other species such as Arabidopsis thaliana but has probably allowed the more refined regulation of Hsf networks possibly under different stress regimes, tissues and cell types.
Ziel der Studie war es, das Auftreten von Fatigue, Depression und Einschränkungen der Lebensqualität zu untersuchen bei einem an nichtmuskelinvasivem Blasenkrebs erkrankten Patienten unter BCG-Therapie. Die Hypothese war, dass es keinen Unterschied zu dem Validierungskollektiv der genutzten Fragebögen gibt. Zum Ende der Auswertung wurden die Ergebnisse mit dem Patientenkollektiv der mit Mitomycin behandelten Patienten (Dissertation Fr. Elena Walther) und BPH-bzw. Prostatakarzinom-Patienten (Dissertation Fr. Dr Daniela Drescher) verglichen. Ausgegeben wurden 400 Fragebögen an Patienten betreut in urologischen Praxen deutschlandweit. Zuvor war die Studie von der Ethikkommission der Landesärztekammer Hessen bewilligt worden. Der Fragebogen wurde vollständig anonymisiert, ein Rückschluss auf die Identität der Teilnehmer ist nicht möglich. Die Testinstrumente setzten sich zusammen aus dem sozioökonomischen Status, dem Brief Fatigue Inventory (BFI), dem EORTC-QLQ-C30, dem Beck Depression Inventar und dem EORTC Blasenmodul QLQ-NMIBC24. Ausgewertet wurden 67 Fragebögen. Das Geschlecht der teilnehmenden Patienten war überwiegend männlich, 58, versus 9, weiblich. Das Mindestalter lag bei 45, das Höchstalter bei 91 Jahren. Die Mehrheit der Patienten (46) waren verheiratet, zusammenlebend. 50 % der Probanden verfügten über einen Hauptschulabschluss, 22 bzw. 15 % über einen Hochschul- bzw. Realschulabschluss. Die Mehrzahl der Patienten nahm keine Psychopharmaka ein (85 %). Es konnte gezeigt werden, dass die Lebensqualität der Patienten gut ist, gemessen der der Krebsdiagnose und der begleitenden belastenden intravesikalen Therapie. Entscheidende Faktoren für die guten Ergebnisse schienen in diesem Patien tenkollektiv die Lebensumstände zu sein, da herausgearbeitet werden konnte, dass Patienten, zusammenlebend mit Partner beim QLQ-C30-Fragebogen beim emotionalen Teil der Fragen bessere Ergebnisse zeigten. Bei den kognitiven Einschränkungen war das Alter ein negativer Einflussfaktor. Die körperlichen Einschränkungen waren trotz des hohen Durchschnittsalters der Teilnehmer eher gering. Der Anteil an Patienten mit schwerer Fatigue war mit 6 von 67 Teilnehmern sehr gering.
Der Vergleich mit anderen Patientengruppen, wie Prostatakarzinom- und BPH-Patienten und mit Mitomycin behandelten Patienten ergab keine signifikanten Unterschiede. Der größte limitierende Faktor dieser Arbeit war die geringe Patientenzahl. Dies ist umso bedeutsamer, da alle den Themenbereich untersuchenden Studien so geringe Patientenzahlen aufweisen. In der täglichen Praxis scheint es schwierig, noch zusätzliche Befragungen durchzuführen, die über das normale Maß hinausgehen. Die im Fragebogen abgefragten Punkte sind allerdings sehr wichtig für den Therapieerfolg, da Patienten mit einer schlechten Lebensqualität oder einer Depression, die sich unter Therapie entwickelt eher dazu geneigt sein werden, die Behandlung abzubrechen. Wünschenswert wäre weitere Studien mit größerer Patientenzahl, um den Einfluss des Alters und der Lebensumstände noch besser untersuchen zu können. Auch Unterschiede zwischen Männern und Frauen könnten so besser aufgearbeitet werden. Es wäre sehr wichtig, diese Studien durchzuführen, um Standards in der Versorgung der Patienten zu erarbeiten, beispielsweise Messinstrumente, die gut in den Alltag zu integrieren sind, um Krankheiten oder Begleitsymptome aufzudecken, die den Krankheitsverlauf negativ beeinflussen.
Die moderne Hauptgruppenchemie ermöglicht es Siliciumverbindungen in unterschiedlichen Oxidationsstufen und mit ungewöhnlichen Koordinations- umgebungen zu realisieren: Silane, Silylene, Disilene, Disiline und molekularer Sand (SiO2) können soweit stabilisiert werden, dass eine Charakterisierung gelingt. Ein Verständnis für die Eigenschaften und Reaktivitäten dieser Verbindungen eröffnet Perspektiven zur gezielten Synthese verschiedener Siliciumverbindungen. Industriell sind im wesentlichen zwei Substanzklassen interessant: Perchlorierte Silane, die als Vorstufen für die Abscheidung elementaren Siliciums als Halbleitermaterial Verwendung finden und Organo(Chlor)silane, die wichtige Bausteine für den Aufbau von Silikonen und für Hydrosilylierungsreaktionen darstellen. Im Rahmen dieser Dissertationsschrift wurden mittels quantenchemischer Rechnungen Schlüssel-intermediate für den Aufbau solcher Verbindungen identifiziert und durch Einblicke in den Reaktionsmechanismus das Fundament für ein tiefergehendes Verständnis der dynamischen kovalenten Chemie der Oligosilane gelegt. Dies geschah in enger Zusammenarbeit mit den experimentellen Arbeitsgruppen von Prof. Wagner und Prof. Auner.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Hochtemperatur-Komproportionierungsreaktion von gasförmigem Siliciumtetrachlorid und elementarem Silicium untersucht (Chem. Eur. J. 2017, 23, 12399). In einer Gasphasenreaktion entsteht dabei ein perchloriertes Polysilan (PCS) unbekannter Zusammensetzung. Im Ergebnis konnten wir zeigen, dass PCS eine komplexe Mischung verschiedener molekularer perchlorierter Silane darstellt, von denen lediglich cyc-Si5Cl10 experimentell eindeutig charakterisiert werden kann. Ausgehend von Dichlorsilylen als reaktive Spezies in der Gasphase zeigten DFT-Berechnungen, dass durch Silylendimerisierung, Silyleninsertion und eine Reihe von Isomerisierungsreaktionen der Aufbau cyclischer Perchlorsilane mit unterschiedlichem Silylierungsgrad gegenüber dem entsprechenden Aufbau acyclischer Perchlorsilane aus nicht umgesetzten Siliciumtetrachlorid bevorzugt stattfindet. PCS liefert ein 29Si-NMR- Spektrum mit einer verwirrenden Vielzahl verschiedener Signale, die auch anhand quantenchemisch berechneter 29Si-NMR-chemischer Verschiebungen nicht eindeutig zugeordnet werden konnten. Dennoch war eine Einteilung der berechneten Verschiebungen in Bereiche möglich, in denen Verschiebungen für Siliciumatome cyclischer und acyclischer Perchlorsilane mit einer bestimmten formalen Oxidationsstufe zu erwarten sind.
Weiterhin wurde der Chlorid-induzierte Aufbau perchlorierter Silane aus Si2Cl6 untersucht: Der Bildungsmechanismus für die durch Tillmann röntgen- kristallographisch charakterisierten perchlorierten Silikate und dianionischen (silylsubstituierten) Cyclohexasilane wurde in einer DFT-Studie untersucht und Schlüsselintermediate sowie stabile Zwischenstufen identifiziert (Chem. Eur. J. 2014, 20, 9234). Wir konnten zeigen, dass SiCl3– als reaktives Intermediat für die Si–Si Bindungsknüpfung verantwortlich ist. Die experimentell nachgewiesenen Silikate sind, mit einer Ausnahme für die ein anderes Konformer gefunden wurde, identisch mit den theoretisch vorhergesagten lokalen Minima. Sie entstehen durch eine Reihe von reversiblen Additions- und Isomerisierungsreaktionen. Dabei sind die acyclischen Silikate über Gleichgewichtsreaktionen miteinander verknüpft, wobei die berechneten Aktivierungsbarrieren für die Rückreaktion immer etwas höher sind als die Barrieren für den nächsten Aufbauschritt. Im Rahmen dieser Gleichgewichtsreaktionen entsteht nicht nur SiCl3–, sondern es können auch höhere Silanide eliminiert werden, die ab einer Größe von drei Siliciumatomen zu Cyclohexasilanen dimerisieren. Mit der head- to-tail Dimerisierung des bevorzugt gebildeten Silanids erklärt sich zwanglos das Substitutionsmuster aller röntgenkristallographisch charakterisierten zweifach silylsubstituierten Cyclohexasilane. Weiterhin ist es gelungen, den Reaktions- mechanismus für den Chlorid-induzierten Aufbau des dianionischen inversen Sandwichkomplexes [Si6Cl12*2Cl]2– aus HSiCl3 aufzuklären, in dem ebenfalls SiCl3– das Schlüsselintermediat darstellt. Letzteres entsteht durch die Eliminierung von HCl aus dem Chloridaddukt von HSiCl3. Der Reaktionsmechanismus beinhaltet Chlorid- abstraktionen, Hydridabstraktionen, Deprotonierungen, Silanid-Additionen, sowie Silanid-Eliminierungen, die nahezu gleichberechtigt nebeneinander vorkommen. Alle identifizierten Reaktionsschritte münden immer wieder in die Pfade, die bereits für den Aufbau aus Si2Cl6 gefunden wurden.
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Smut fungi (Ustilaginomycotina) were previously defined as plant parasites that produced blackish or brownish masses of teliospores in or on various organs of plants. Each teliospore germinates to form a single basidium with usually four basidiospores that subsequently grow as a saprobic, yeast-like, haploid stage. The Ustilaginomycotina are a highly diverse group with about 1,700 species in 115 different genera. All of the species were united in a single order, the Ustilaginales, in late 19th century. These teliospore producing fungi are now considered the classic smut fungi. Towards the end of the 20th century, new ideas were brought into this classification system. Most notable was the comparative work regarding the ultrastructure of septal pores and the anatomy of the interaction zones between host and parasite. This work changed the whole concept of smut fungi and their evolutionary relationships. These results were subsequently supported by molecular phylogenetic studies. Both lines of investigation led to the classification of the smut fungi into four different classes, Ustilaginomycetes, Exobasidiomycetes, Malasseziomycetes and Moniliellomycetes (see chapter 1.3).
A reliable taxonomy that reflects phylogenies needed in order to estimate the diversity and the relationships between the diverse groups of smut fungi. In the last 20 years, molecular investigations based mostly on rDNA loci, e.g. ITS (internal transcribed spacer) or LSU (large subunit), have revealed the evolutionary relationships between many taxa of smut fungi. However, there are few phylogenetic studies available for smut fungi (see chapter 1.5.1), and much work is needed to develop backbone phylogenetic trees and to resolve species complexes of many smut fungi.
This thesis reports the results of six different studies that aimed to develop new and improved tools for the phylogenetic analyses of smut fungi, and then apply these methods to selected groups of smut fungi. The first study (Kruse et al. 2017a, Chapter 3) developed a method to improve the amplification of ITS sequences of some smut fungi. Due to its high discrimination value, the ITS gene region is widely used as a barcoding locus for species delimitation of fungi. For this purpose, the general ITS primers ITS1 and ITS4 or more specific modifications, e.g. ITS1F for Ascomycota, ITS4B for Basidiomycota or M-ITS1 for smut fungi, were used. As these primer combinations often yielded unsatisfactory results, due to coamplification of other (contaminant) fungi or the host plant DNA, improvement of the amplification of the ITS region was needed. In order to design new smut specific primers for the ITS region, a representative set of several sequences of the flanking regions of the ITS region (LSU and SSU) of smut fungi, plants and other fungi were downloaded from GenBank. A set of primers was designed on this dataset. These primers were tested on a representative set of about 70 different smut genera under different PCR conditions. Finally, three different primers, one forward primer, smITS-F, and two reverse primers, smITS-R1 and -R2, were selected as the best ones. The following tests with different combinations of these primers, and also under inclusion of the M-ITS1 primer, showed only slight differences in the number of different genera that successfully amplified. But there were some differences regarding the genera that amplified. A broader test on 205 samples in 39 genera showed that the PCR efficiency of the newly designed primers was much better than the primer set ITS4/M-ITS1. With the primers designed in this study almost no non-target ITS was amplified, giving new opportunities especially for amplifying ancient DNA or DNA from older herbarium samples. However, many species groups remain unresolved by only one gene region.
The second study (Kruse et al. 2017c, Chapter 4) found new loci and suitable primers that better resolved multi-locus trees. To date, the most frequently used loci for making multi-locus trees are SSU (small subunit), LSU (large subunit) and ITS (internal transcribed spacer). While the LSU is not always sufficient to distinguish between closely related species, it is highly discriminative above the species level. In an effort to increase the phylogenetic resolution of smut phylogenies, some protein-coding genes were used, including rpb1, rpb2, and atp6 with varying success (see Chapter 2.1.2). As most of these loci are seldom used or sometimes only work on pure cultures because of their low specifity, new protein-coding loci were identified that produced reliable phylogenetic trees. Based on five available genomes, potential gene loci were filtered for possible primers. Initially, 40 different primer combinations for 14 gene loci were tested on a set of twelve different genera of smut fungi. The best candidates were selected and optimized during further tests. Finally, 22 different forward primers and 17 different reverse primers for nine different gene regions were developed, with each differentiating at least one genus of smut fungi (preferably for Ustilaginomycetes). The different primers showed varying discriminative power for different smut genera. They worked best for the Ustilaginaceae, based on the primer designed from Ustilaginomycetes genomes. These new primer sets and loci have the potential to resolve different species groups within the smut fungi and furthermore to produce reliable phylogenetic trees with high resolution. To prove their applicability, three species complexes were investigated in-depth, two from the Ustilaginomycetes and one from the Exobasidiomycetes.
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Vorhofflimmern entsteht unter anderem durch ein Ungleichgewicht zwischen sympathischem und parasympathischem autonomen Nervensystem. Sowohl invasive Ansätze via Ablation oder Denervierung als auch minimalinvasive Ansätze via Elektrostimulation liefern erfolgsversprechende Ergebnisse in Bezug auf Beeinflussung eines bestehenden Vorhofflimmerns.
Interessanterweise konnte durch Akupunktur des Tragus eine Reduktion von Vorhofflimmer-Rezidiven nach Kardioversion erreicht werden. Ziel dieser Studie war die Evaluation von Akupunktur-induzierten kardialen (vegetativen) Effekten bei gesunden Probanden.
Herzgesunde männliche Probanden (n=24) wurden im Bereich des Vagus-Innervationsgebietes an der Concha inferior des Ohres (Herzpunkt 100, OHR) sowie an einem klassischen Akupunktur-Punkt des Herzens (ventralen Unterarm, P6/Neiguan, ARM) akupunktiert. Eine „Placebo“-Akupunktur eines Punktes, der gegen Gonarthrose-Schmerzen helfen soll (Magenpunkt 35), diente als Kontrolle. Die Hälfte der Probanden erhielt eine zusätzliche Messung ohne Akupunktur, um Effekte durch das alleinige Platzieren einer Nadel zu untersuchen.
Um eine Aktivierung des ANS zu bewirken und Veränderungen quantifizieren zu können, wurden 12-Kanal Langzeit-EKG Messungen wie folgt durchgeführt: 30 Minuten (min) in liegender Position unter Akupunktur, Entfernung der Akupunkturnadel, 5 min liegend, 5 min sitzend, 5 min stehend, 5 min sitzend.
Es erfolgten Analysen folgender Parameter der Herzfrequenzvariabilität: Herzfrequenz, SDNN, RMSSD, HF, LF, LF/HF. Des Weiteren wurden Periodic Dynamics Repolarization und Deceleration Capacity untersucht.
Verglichen mit Placebo-Akupunktur wurde sowohl durch Akupunktur am OHR als auch am ARM die Herzfrequenz in liegender und sitzender Körperpositionen signifikant gesenkt (Phasen 30L, 5S1, 5S2, ∆5L-5S1, ∆5S1-5ST).
Während die Akupunktur am OHR vor allem die SDNN signifikant erhöhte, führte die Akupunktur am ARM zu einer signifikanten Steigerung von RMSSD und dem parasympathischen Leistungsdichtespektrum-Parameter HF. Der Quotient LF/HF wurde ebenfalls signifikant gesenkt.
Kein Unterschied bestand zwischen Placebo-Akupunktur und Messung ohne Akupunktur, sodass postuliert werden kann, dass das alleinige Platzieren einer Nadel keinen nennenswerten Effekt auf das autonome Nervensystem besitzt.
Die Ergebnisse der Studie zeigen, dass eine Akupunktur an Orten, die mit dem autonomen Nervensystem verschaltet sind, zu einer Modulation des parasympathischen kardialen autonomen Nervensystems führen kann.
Eine Modulation der parasympathisch-sympathischen Balance durch minimalinvasive Zusatzbehandlung, wie in unserer Studie, könnte möglicherweise bei Patienten mit Vorhofflimmern zusätzlich zu medikamentöser oder nach invasiver Behandlung wie der Pulmonalvenenisolation das Therapieresultat verbessern und die Rezidivrate verringern.
Die digitale Pathologie ist ein neues, aber stetig wachsendes, Feld in der Medizin. Die kontinuierliche Entwicklung von verbesserten digitalen Scannern erlaubt heute das Abscannen von kompletten Gewebeschnitten und Whole Slide Images gewinnen an Bedeutung. Ziel dieser Arbeit ist die Methodenentwicklung zur Analyse von Whole Slide Images des klassischen Hodgkin Lymphoms. Das Hodgkin-Lymphom, oder Morbus Hodgkin, ist eine Tumorerkrankung des Lymphsystems, bei der die monoklonalen Tumorzellen in der Regel von B-Lymphozyten im Vorläuferstadium abstammen.
Etwas mehr als 9.000 Hodgkin-Lymphom-Fälle werden jährlich in den USA diagnostiziert. Zwar ist die 5-Jahre-Überlebensrate für Hodgkin-Lymphome mit 85,3 % vergleichsweise hoch, dennoch werden etwa 1.100 Todesfälle pro Jahr in den USA registriert. Auf mikroskopischer Ebene sind die Hodgkin-Reed-Sternberg Zellen (HRS-Zellen) typisch für das klassische Hodgkin Lymphom. HRS-Zellen haben einen oder mehrere Zellkerne, die stark vergrößert sind und eine grobe Chromatinstruktur aufweisen. Immunhistologisch gibt es für HRS-Zellen charakterisierende Marker, so sind HRS-Zellen positiv für den Aktivierungsmarker CD30.
Neben der konventionellen Mikroskopie, ermöglichen Scanner das Digitalisieren von ganzen Objektträgern (Whole Slide Image). Whole Slide Images werden bisher wenig in der Routinediagnostik eingesetzt. Ein großer Vorteil von digitalisierten Gewebeschnitten bietet sich bei der computergestützten Analyse. Automatisierte Bildanalyseverfahren wie Zellerkennung können Pathologen bei der Diagnose unterstützen, indem sie umfassende Statistiken zur Anzahl und Verteilung von immungefärbten Zellen bereitstellen.
Die untersuchten immunohistologischen Bilder wurden vom Dr. Senckenbergisches Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Frankfurt bereit gestellt. Die betrachteten Gewebeschnitte sind gegen CD30 immungefärbt, einem Membranrezeptor, welcher in HRS-Zellen und aktivierten Lymphozyten exprimiert wird. Die Gewebeschnitte wurden mit einem Aperio ScanScope slide scanner digitalisiert und liegen mit einer hohen Auflösung von 0,25 μm pro Pixel vor. Bei den vorliegenden Gewebeschnittgrößen ergeben sich Bilder mit bis zu 90.000 x 90.000 Pixeln.
Der untersuchte Bilddatensatz umfasst 35 Bilder von Lymphknotengewebeschnitten der drei Krankheitsbilder: Gemischtzelliges klassisches Hodgkinlymphom, noduläres klassisches Hodgkinlymphom und Lymphadenitis. Die Bildverarbeitungspipeline wurden teils neu implementiert, teils von etablierten Bilderkennungssoftware und -bibliotheken wie CellProfiler und Java Advanced Imaging verwendet. CD30-positive Zellobjekte werden in den Gewebeschnitten automatisiert erkannt und neben der globalen Position im Whole Slide Image weitere Morphologiedeskriptoren berechnet, wie Fläche, Feret-Durchmesser, Exzentrität und Solidität. Die Zellerkennung zeigt mit 84 % eine hohe Präzision und mit 95 % eine sehr gute Sensitivität.
Es konnte gezeigt werden, dass in Lymphadenitisfällen im Schnitt deutlich weniger CD30- positive Zellen präsent sind als in klassisches Hodgkinlymphom. Während hier im Schnitt nur rund 3.000 Zellen gefunden wurden, lag der Durchschnitt für das Mischtyp klassisches Hodgkinlymphom bei rund 19.000 CD30 positiven Zellen. Während die CD30-positiven Zellen in Lymphadenitisfällen relativ gleichmäßig verteilt sind, bilden diese in klassischen Hodgkinlymphom-Fällen Zellcluster höherer Dichte.
Die berechneten Morphologiedeskriptoren bieten die Möglichkeit die Gewebeschnitte und den Krankheitsverlauf näher zu beschreiben. Zudem sind bisher Größe und Erscheinungsbild der HRS-Zellen hauptsächlich anhand manuell ausgewählter Zellen bestimmt worden. Ein Maß für die Ausdehnung der Zellen ist der maximale Feret-Durchmesser. Bei CD30-Zellen im klassischen Hodgkinlymphom liegt dieser im Durchschnitt bei 20 μm und ist somit deutlich größer als die durchschnittlich gemessenen 15 μm in Lymphadenitis.
Es wurde ein graphentheoretischer Ansatz gewählt, um die CD30 positiven Zellen und ihre räumliche Nachbarschaft zu modellieren. In CD30-Zellgraphen von klassischen Hodgkinlymphom-Gewebeschnitten ist der durchschnittliche Knotengrad gegenüber den von Lymphadenitis-Bildern stark erhöht. Der Vergleich mit Zufallsgraphen zeigt, dass die beobachteten Knotengradverteilungen nicht für eine zufällige Verteilung der Zellen im Gewebeschnitt sprechen. Eigenschaften und Verteilung von Communities in CD30-Zellgraphen können hinzugenommen werden, um klassisches Hodgkinlymphom Gewebeschnitte näher zu charakterisieren.
Diese Arbeit zeigt, dass die Auswertung von Whole Slide Image unterstützend zur Verbesserung der Diagnose möglich ist. Die mehr als 400.000 automatisch erkannten CD30-positiven Zellobjekte wurden morphologisch beschrieben, und zusammen mit ihrer Position im Gewebeschnitt ist die Betrachtung wichtiger Eigenschaften des klassischen Hodgkinlymphoms realisierbar. Zellgraphen können durch weitere Zelltypen erweitert werden und auf andere Krankheitsbilder angewendet werden.
Das Prinzip der endovaskulären Therapie von Aneurysmen mit Platinspiralen hat sich seit seiner Einführung durch Guglielmi 1991 immer mehr als alternatives Verfahren zum neurochirurgischen Clipping etabliert. Insbesondere bei Aneurysmen, die durch den neurochirurgischen Zugang nur schwer zu erreichen sind, hat sich diese Therapieoption bewährt. Neben der Lage spielen auch Größe und Form bei der Entscheidung für das Coiling eine wichtige Rolle. Es ist technisch anspruchsvoll, breitbasige oder besonders kleine Aneurysmen durch dieses Verfahren auszuschalten. Angesichts der aktuellen Datenlage ist es nicht immer möglich, eine zweifelsfreie Entscheidung zu treffen, ob und wie betroffene Patienten bestmöglich behandelt werden sollten. Insbesondere Fragen zur Behandlung und zu Komplikationen bei Aneurysmen ≤ 3 mm sind nicht hinreichend beantwortet, da diese nur in wenigen Studien Gegenstand der Analyse sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, klinische und bildgebende Ergebnisse von Patienten, die im Institut für Neuroradiologie des Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main durch eine endovaskuläre Intervention behandelt wurden, retrospektiv zu analysieren. Insbesondere wurde ein Schwerpunkt auf die Untersuchung der Komplikationsraten und der Aneurysmarupturen gelegt. Dies dient einer erweiterten Einschätzung von Risiko und Nutzen dieser Therapieoption, um eine bestmögliche Beratung und Behandlung der betroffenen Patienten zu gewährleisten.
In der vorliegenden Arbeit wurden 637 endovaskuläre Interventionen betrachtet, die am Institut für Neuroradiologie des Klinikum der Johann Wolfgang Goethe-Universität zwischen Februar 1999 und März 2011 durchgeführt wurden. In diesem Untersuchungszeitraum von 12 Jahren konnten 47 Patienten mit einem Aneurysma ≤ 3 mm in die Studie eingeschlossen werden. Es erfolgte eine retrospektive Datenerhebung mit Hilfe von Krankenakten, radiologischen Befunden und Angiographie-Dokumentationsprotokollen. Die Zusammensetzung des Patientenkollektivs war vergleichbar mit der der bisherigen Literatur. Das Durchschnittsalter des Patientenkollektivs betrug 55 Jahre. 85 % der Patienten waren Frauen. Bei der Häufigkeit des Auftretens an bestimmten Gefäßlokalisationen konnte ein geringer Unterschied festgestellt werden. Während bei ähnlichen Studien der Großteil der Aneurysmen an der ACI gefunden wurde, war in der vorliegenden Arbeit die AcomA am häufigsten betroffen, gefolgt von der ACI. In Bezug auf die Fehlschlagraten sind die Ergebnisse heterogen. In der vorliegenden Studie war es bei 17 % der behandelten Patienten nicht möglich, das Einbringen einer Platinspirale erfolgreich abzuschließen. Ein kompletter Aneurysmaverschluss erfolgte bei 55 % der Patienten. Bei 28 % der Fälle blieb nach der Intervention ein minimaler Halsrest bestehen. Die allgemeine Komplikationsrate betrug 12,8 %. Zu einer durch die Intervention ausgelösten Ruptur kam es in zwei Fällen (4,3 %), wobei dieser Anteil im mittleren Bereich der in der aktuellen Literatur beschriebenen Rupturraten von 0 % bis 11,7 % liegt. Für die Beurteilung des Therapieerfolgs spielt die Verfügbarkeit von Nachkontrollen eine wichtige Rolle. In der vorliegenden Arbeit war es möglich, in 87 % der Fälle Verlaufskontrollen durchzuführen, was Ergebnissen der Literatur entspricht. Die Wiederbehandlungsrate war mit 4,3 % vergleichsweise niedrig. Die Bildung eines Rezidivaneurysmas konnte in einem Fall beobachtet werden. 59 % der Patienten wiesen präoperativ einen Hunt und Hess Grad von 0 bis 2 auf, während es in anderen Arbeiten bis zu 87 % der Patienten waren. Grad 3 lag bei 15 % der Patienten vor, schwer betroffen waren 15 % mit einem Hunt und Hess Grad von 4 und 11 % mit einem von Grad 5. 55,3 % der in der vorliegenden Studie betrachteten Patienten konnten am Ende des Beobachtungszeitraums nach Einschätzung mittels mRS ihren Alltag ohne fremde Hilfe bewältigen (Stadien 0, 1 und 2). 34,0 % der Patienten benötigten fremde Hilfe und 10,9 % verstarben an den Folgen der SAB. Im Gegensatz dazu konnte in anderen Arbeiten ein mRS-Grad von 0-2 in mehr als 75 % gefunden werden. Dies bestärkt die Annahmen, dass ein primär niedriger Hunt und Hess Grad mit einem besseren und ein hoher Hunt und Hess Grad mit einem schlechteren klinischen Verlauf assoziiert sein könnte.
Durch die geringe Größe der Stichprobe und die retrospektive Datenanalyse der vorliegenden Arbeit ist es nicht möglich, zuverlässige allgemein gültige Behandlungsempfehlungen abzuleiten. Hier wurde das eigene Patientenkollektiv detailliert analysiert und die Ergebnisse wurden mit ähnlichen Publikationen verglichen. Weitere prospektiv geplante Studien sind sinnvoll.
Aus der zusammenfassenden Betrachtung der Ergebnisse lässt sich schließen, dass mit den momentan verfügbaren Mitteln bei ausreichender Erfahrung des behandelnden Neuroradiologen eine relativ sichere endovaskuläre Behandlung von sehr kleinen Aneurysmen möglich ist. Neben der Erfahrenheit des interventionellen Neuroradiologen kann die Weiterentwicklung der eingesetzten Materialien wie Coils, Stents, Ballons und Mikrokatheter zur Minimierung des Komplikationsrisikos beitragen.
To date, chemicals are used ubiquitous in everyday life and an increasing consumption of pharmaceuticals and personal care products and industrial chemicals results in an increased water pollution. Conventional wastewater treatment plants are not able to completely remove the variety of (polar) organic compounds from today’s wastewater and thus serve as constant key point sources for the unintentional release of (micro-)pollutants into the aquatic environment. Anthropogenic micropollutants are detectable in very low concentrations in almost every aquatic compartment and may cause adverse effects on aquatic organisms. Considering the current situation of water pollution and to enhance water quality with regard to environmental and human health, the implementation of advanced wastewater treatment technologies, such as ozonation and activated carbon filtration was extensively discussed and investigated in recent years. Yet, besides their advantages regarding the efficient removal of a variety of recalcitrant, organic compounds as well as pathogens from the wastewater, it is known that especially the treatment with ozone may lead to the formation of largely unknown ozonation by-products with often unknown toxicity and unknown threats to human and the environment. To address these topics the joint research project TransRisk aimed at the “characterization, communication and minimization of risks originating from emerging contaminants and pathogens in the water cycle”. Within this research project the present thesis focuses on the ecotoxicological investigation of emerging waterborne contaminants, including their potential transformation products (TPs). Additionally, focus was laid on the investigation of combined effects of anthropogenic contaminants and pathogens with effects especially on aquatic invertebrate organisms.
The potential ecotoxicological effects of the antiviral drug acyclovir and two of its structurally identified TPs, were investigated on three aquatic organisms (Raphidocelis subcapitata, Daphnia magna and embryos of Danio rerio). While the parent compound acyclovir caused no acute toxicity up to a tested concentration of 100 mg/l on any of the investigated organisms, both TPs were shown to exhibit an increased aquatic toxicity. Carboxy-acyclovir, the biodegradation product of acyclovir, significantly reduced reproduction of D. magna by 40% at 102 mg/l, and the ozonation product COFA significantly inhibited growth of green algae R. subcapitata (EC10 = 14.1 mg/l). In the present case, advanced wastewater treatment was shown to lead to the formation of TPs, that reveal a higher toxicity towards investigated organisms, than the parent compound. Results highlight the necessity of further research related to the topic of identification and characterization of TPs, formed during advanced wastewater treatment processes.
To investigate the potential reduction or enhancement of toxic effects of nine differently treated wastewater effluents, selected bioassays with Daphnia magna, Lumbriculus variegatus and Lemna minor were conducted in flow-through test systems on a pilot treatment plant. The different treatment processes included ozonation of conventional biological treatment, with subsequent filtration processes as well as membrane bioreactor treatment in combination with ozonation. While exposure to the conventionally treated wastewater did not result in significant impairing effects on D. magna and L. minor, a reduced abundance of L. variegatus (by up to 46%) was observed compared to the medium control. Subsequent ozonation and additional filtration of the wastewater enhanced water quality, visible in an improved performance of L. variegatus. In general, direct evidence for the formation of toxic TPs due to the advanced wastewater treatments was not found, at least not in concentrations high enough to cause measurable effects in the investigated test systems. Additionally, no evidence for immunotoxic effects of the investigated wastewater effluents were observed. Yet, study-site- and species-specific effects hindered the definite interpretation of results. That underline the importance of a suitable test battery consisting of representatives of different taxonomic groups and trophic levels, to ensure a comprehensive evaluation of the complex matrix of wastewater and to avoid false-negative or false-positive results.
With aim to improve knowledge regarding immunotoxicity in invertebrates, the potential immunotoxic effects of the immunosuppressive pharmaceutical cyclosporine A (CsA) were investigated by applying the host-parasite model system Daphnia magna – Pasteuria ramosa in an adapted host resistance assay. Co-exposure to CsA and Pasteuria synergistically affected long-term survival of D. magna. Additionally, the enhanced virulence of the pathogen upon chemical co-exposure was expressed in synergistically increased infection rates and an increased speed of Pasteuria-induced host sterilization. In conclusion, results provide evidence for a suppressed disease resistance in a chemically stressed invertebrate host, highlighting the importance of investigating the conjunction of environmental pollutants and pathogens in the environmental risk assessment of anthropogenic pollutants.
Die Analyse früher Entwicklungsstadien von Säugetierembryonen und daraus gewonnener Stammzelllinien kann entscheidende Erkenntnisse im Bereich der Reproduktionsbiologie und der regenerativen Medizin hervorbringen. Dabei spielt die Maus, als geeignetes Modellsystem für die Übertragbarkeit auf den Menschen eine wichtige Rolle, in erster Linie weil die Blastozysten der Maus verglichen mit menschliche Blastozysten eine morphologische Ähnlichkeit aufweisen. Humane embryonale Stammzelllinien haben großes Potential für die Anwendung in der regenerativen Medizin und vergleichend dazu wurde Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen verwendet, um tausende neuer Mausstämme zu generieren. Die Gewinnung embryonaler Stammzellen erfolgt im Blastozystenstadium, diese können dann nach Injektion in eine andere Blastozyste zur Entwicklung aller Gewebearten, einschließlich der Keimbahngewebe, beitragen (Martin, 1981; Evans and Kaufman 1981).
Ursache einer Fehlgeburt können vor allem Defekte in der Entwicklung des Trophoblasten und des primitive Entoderms (PrE) sein, dabei sind ca. 5 % der Paare betroffen die versuchen ein Kind zu bekommen (Stephenson and Kutteh, 2007). Eine Untersuchung dieser Zelllinien im Mausmodell könnte weitere Erkenntnisse für die Gründe einer Fehlentwicklung liefern. Trophoblasten Stammzelllinien können aus den Blastozysten der Maus und dem extraembryonalen Ektoderm von bereits implantieren Embryonen gewonnen werden (Tanaka et al., 1998). Diese Zelllinien geben Aufschluss über die Entwicklung des Trophoblasten, fördern die Entwicklung der Plazenta und sind gleichzeitig ein gutes Modellsystem um die Implantation des Embryos im Uterus näher zu untersuchen. Zellen des primitive Entoderms (PrE) beeinflussen das im Dottersack vorhandene extraembryonale Entoderm, welches dort als “frühe Plazenta” fungiert und für die Versorgung des Embryos mit Nährstoffen zuständig ist (Cross et al., 1994). Des Weiteren besitzt das Entoderm einen induktiven Einfluss auf die Bildung von anterioren Strukturen und die Bildung von Endothelzellen sowie Blutinseln (Byrd et al., 2002).
Extraembryonale Endodermstammzellen (XEN Zellen) können aus Blastozysten gewonnen und in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) umgewandelt werden (Fujikura et al., 2002; Kunath et al., 2005). Es war jedoch nicht bekannt, ob XEN-Zellen auch aus Postimplantations-Embryonen gewonnen werden können. XEN-Zellen tragen in vivo zur Entwicklung des Darmendoderms bei (Kwon et al., 2008; Viotti et al., 2014) und könnten als alternative, selbsterneuernde Quelle für extraembryonale Endoderm-abgeleitete Zellen dienen, die zur Herstellung von Geweben für die regenerative Medizin verwendet werden könnten (Niakan et al., 2013).
In der Embryogenese der Maus zeigt sich an Tag E3.0 eine kompakte Morula die sich allmählich in das Trophektoderm (TE) differenziert, welches wiederum den Embryonalknoten (“innere Zellmasse”) umschließt (Johnson and Ziomek, 1981). Ein wichtiger Schritt im Rahmen der Entwicklung findet an Tag E3.5 statt, in diesem Zeitraum gehen aus dem Embryonalknoten der pluripotente Epiblast und das primitive Entoderm hervor. Im späten Blastozystenstadium an Tag E4.5 liegt das PrE als Zellschicht entlang der Oberfläche der Blastocoel-Höhle. Aus dem Epiblast entwickeln sich im weiteren Verlauf der Embryo, das Amnion und das extraembryonale Mesoderm des Dottersacks. Die Zellen des Trophektoderm führen zur Entwicklung der Plazenta. Das PrE differenziert sich im Zuge der Weiterentwicklung in das viszerale Entoderm (VE) und das parietale Entoderm (PE) des Dottersacks (Chazaud et al., 2006; Gardner and Rossant, 1979; Plusa et al., 2008). VE umgibt den Epiblast und extraembryonisches Ektoderm (ExE). PE-Zellen wandern entlang der inneren Oberfläche von TE und sezernieren zusammen mit Trophoblasten-Riesenzellen Basalmembranproteine, um die Reichert-Membran zu bilden (Hogan et al., 1980). Die Reichert-Membran besteht aus Basalmembranproteinen, einschließlich Kollagenen und Lamininen, die zwischen den parietalen Endoderm- und Trophoblastzellen liegen. Diese Membran wirkt als ein Filter, der dem Embryo den Zugang zu Nährstoffen ermöglicht, während er eine Barriere zu den Zellen der Mutter bildet (Gardner, 1983).
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The Dodd Frank Act of 2010 (DFA) was the legislative response by the US Government to the Global Financial Crisis of 2007. DFA’s rescission of Rule 436 (g) of the Securities Act of 1933 - the exemption from liability clause - was the response to the post-crisis perception that credit rating agencies were insufficiently constrained by reputational risk considerations and consistently failed to provide high quality and accurate credit ratings as a consequence of the immunity they enjoyed and the regulatory reliance placed on ratings, as well as the conflicts of interest that they faced. This paper investigates whether the market failure event that occurred in the Asset Backed Securities market immediately after DFA was signed into law on July 21, 2010 was due to real economic concerns held by rating agencies about operating under a liability regime or whether it was merely an act of brinkmanship on the part of the rating agencies. The paper also predominantly examines US case law to identify the dilution of the freedom of speech defence in state courts, the conflict of interest issues and the legal challenges faced by plaintiffs when bringing a lawsuit against credit rating agencies, and proposes a novel co-pay and capped liability model to address the concerns of both credit rating agencies and investors.
Die vorliegende Dissertation befasst sich mit der Entwicklung und Erforschung eines konzeptionell neuartigen Injektionssystems zum Transport von Ionenstrahlen in toroidale Magnetfeldstrukturen. Die Forschungsarbeit ist dabei Teil des Figure-8 Speicherringprojekts (F8SR) des IAP, bei welchem es um die Erforschung der Physik und die Entwicklung eines niederenergetischen, supraleitenden, magnetostatischen Figure-8 Hochstromspeicherrings geht. Dieser neuartige Speicherring ermöglicht aufgrund des Einsatzes von fokussierenden solenoidalen und toroidalen Magnetfeldern das Speichern von Strahlströmen von bis zu einigen Ampere. Diese Arbeit baut auf früheren Forschungsarbeiten zu diesem Themenfeld auf, in welchen die Grundlagen und Ausgangsparameter für die experimentelle Untersuchung der Injektion gelegt und mit dem Aufbau des Injektionsexperiments begonnen wurde.
In dieser Dissertation wird den Fragen nachgegangen, ob ein magnetisches Konzept des Injektionssystems mittels eines „Scaled-Down“-Experiments experimentell umsetzbar ist und ob mit diesem die Injektion von Ionenstrahlen in toroidale Magnetfeldstrukturen realisiert werden kann. Ziel ist es dabei, ein Injektionssystem aufzubauen, durch welches sowohl ein seitlich injizierter Injektionsstrahl, welcher den in den Speicherring zu injizierenden Strahl darstellt, als auch ein gleichzeitig durch die toroidalen Magnetfelder driftender Ringstrahl, welcher den im Speicherring zirkulierenden Strahl darstellt, ohne Verluste transportiert werden können. Das Injektionssystem besteht dabei aus drei normalleitenden Magneten, wobei es sich um zwei baugleiche 30 Grad Toroide sowie einen Solenoid handelt. Die Toroide bilden den Transportkanal für den Ringstrahl, während der Injektionssolenoid senkrecht zwischen den beiden Toroiden endet und den Injektionskanal für den Injektionsstrahl darstellt.
Zunächst wurde das Injektionssystem mittels Strahltransportsimulationen untersucht und aufbauend auf den Ergebnissen die benötigen Vakuumkomponenten sowie der Injektionsmagnet ausgelegt, entwickelt und umgesetzt. Anschließend wurde mit dem fertigstellten Injektionsexperiment der Transport von zwei Ionenstrahlen durch das Injektionssystem experimentell erforscht. Dabei wurden die Strahlpfade mit einem in Entwicklung befindlichen Kameradetektorsystem aus verschiedenen Perspektiven aufgenommen und das Strahlverhalten in Abhängigkeit von unterschiedlichen Parametern phänomenologisch analysiert und diskutiert, mit den Ergebnissen der Simulationen verglichen sowie theoretisch bzgl. der RxB Drift und eines Gedankenmodells eingeordnet. Die technische Umsetzung, Inbetriebnahme und Durchführung verschiedener Vorabexperimente bzgl. weiterer Komponenten des Injektionsexperiments (bspw. Ionenquellen und Filterkanäle) ist ebenfalls Bestandteil dieser Arbeit.
Bei den experimentellen Untersuchungen mit Wasserstoff- und Heliumionenstrahlen konnte beobachtet werden, wie der Injektionsstrahl in den zweiten Toroid driftet und somit erfolgreich injiziert wird. Des Weiteren wurde eine Heliummessung durchgeführt, bei der sowohl der Injektionsstrahl als auch der Ringstrahl erfolgreich durch das Injektionssystem transportiert werden konnten. Auch die Auswirkungen des Injektionsmagneten auf den Ringstrahl konnten experimentell untersucht werden. Die verschiedenen Messungen wurden mittels des Gedankenmodells diskutiert und mit den Ergebnissen der Simulationen sowie untereinander verglichen.
Das abschließende Ergebnis dieser Arbeit ist, dass durch den Einsatz von solenoidalen und toroidalen Magnetfeldern der Injektionsstrahl vom Injektionsmagneten in den zweiten Toroid transportiert und dieser somit in die gekoppelte magnetische Konfiguration der Toroide eingelenkt werden kann. Der gleichzeitige verlustfreie Transport eines Ringstahls durch das Injektionssystem konnte dabei ebenfalls realisiert werden. Des Weiteren stimmen die Ergebnisse der Simulationen und Experimente sowie die theoretischen Überlegungen überein.
Das neuartige Injektionskonzept, welches als Schlüsselkomponente für die Umsetzung des Figure-8 Hochstromspeicherrings benötigt wird, wurde somit mittels Theorie, Simulation und Experiment überprüft und die Funktionalität bestätigt.
Zukünftige Forschungsfragen für welche der Figure-8 Hochstromspeicherring verwendet werden könnte, bspw. aus den Bereichen der experimentellen Astrophysik oder Fusionsforschung, wurden abschließend diskutiert.
Angesichts heutiger Umweltprobleme ist die Stärkung positiver Mensch-Natur-Beziehungen wichtiger denn je. Zeitgenössische Umweltbildung zielt darauf ab, Motivation und Einstellungen zu fördern sowie eine grundlegende Wissensbasis zu schaffen (IUCN, UNEP, & WWF, 1991; Potter, 2010), um einen selbstbestimmten, verantwortungsvollen Umgang mit der Natur zu ermöglichen. Positiver Naturbezug und Umwelteinstellungen gelten als Basis für aktiven Umweltschutz. Direkte Naturerfahrungen gelten dabei als didaktische Möglichkeit, die Motivation für Umweltschutz zu festigen (Kaiser, Roczen, & Bogner, 2008). Einstellungen verändern sich im Laufe des Lebens und so kann das Alter eine wichtige Rolle bezüglich der Effektivität von Umweltbildungsprogrammen spielen (Ernst & Theimer, 2011). Auch Umweltwissen gilt als Grundlage von Umwelthandeln. Denn sinnliche Erfahrungen allein führen nicht zum Verständnis ökologischer Zusammenhänge (Frick, Kaiser, & Wilson, 2004; Liefländer, Bogner, Kibbe, & Kaiser, 2015). Die biologiedidaktische Forschung sieht Fakten-, Handlungs- und Effektivitäts-wissen als zentral für die Genese von Umwelthandeln (Frick, Kaiser, & Wilson, 2004). Isoliertes Fachwissen wiederum führt nach aktueller Erkenntnis auch nicht zur Entwicklung von Haltungen und Wertvorstellungen, welche unser Handeln beeinflussen (Barr, 2003; Finger, 2010; Leiserowitz, Kates, & Parris, 2005).
Bis heute sind altersbasierte Unterschiede bei Schülerinnen und Schülern bezüglich ihrer Naturverbundenheit und Umwelteinstellungen nicht hinreichend untersucht. Auch ist die nötige Dauer der Naturerfahrungen noch nicht nachgewiesen. Es gibt bislang keine Studie, die Umwelteinstellungen, -wissen und –handeln von Kindern verschiedener Regionen der Erde untersucht und Daten auf internationaler Ebene erhoben und ausgewertet hat. Die gezielte Integration der drei Umweltwissensarten in ein solch globales Umweltbildungsprojekt stellt eine zusätzliche bislang nicht angegangene Aufgabe dar. Die vorliegende Arbeit schließt diese Forschungslücken, indem sie auf internationaler Ebene jene Variablen mit einbezieht, die einen nahezu vollständigen Eindruck der Effektivität von Umweltbildung in verschiedenen Regionen, Sozialisationen und Altersklassen zulässt. So wird der Einfluss eines umfassenden Umweltbildungsprogramms auf Naturverbundenheit, Umwelteinstellungen und -wissen der verschiedenen Typen untersucht und ein Bezug zur eventuellen Veränderung des Umwelthandelns hergestellt. Dabei stehen sowohl traditionelle als noch unerforschte mögliche Einflussfaktoren im Fokus. Die Studie umfasst insgesamt 1454 Schülerinnen und Schüler aus Bangladesch, Malaysia, Deutschland und Singapur, die alle an dem Umweltbildungsprojekt „Global denken, lokal handeln – wir schützen unsere Umwelt!“ bzw. “Think global, act local – we protect our environment!“ teilgenommen haben.
Zur Messung der Naturverbundenheit diente Schulz’ INS-Skala (Inclusion of Nature in Self) (2002). Umwelteinstellungen wurden mit dem 2-MEV-Modell (Two Major Environmental Values) gemessen (Johnson & Manoli, 2011). Eine Skala zur Erhebung von Umweltwissen wurde eigens erstellt und hinsichtlich der drei Wissenstypen nochmals modelliert. Eine Skala zur Ermittlung von Umwelthandeln wurde auf Grundlage von Bögeholz (1999) erstellt. Alle Skalen waren Teil eines Fragebogens, welcher in Form eines Pre-, Post- und Follow-up-Test eingesetzt wurde. Kinder aus Parallelklassen, die nicht am Projekt teilnahmen, aber Klassenunterricht zu den jeweiligen Themen erhielten, dienten als Kontrollgruppen.
Die Ergebnisse bestätigen einen positiven Effekt außerschulischer Umweltbildung bezüglich der Entwicklung der untersuchten Variablen. So wurde nach der Teilnahme am eintägigen und auch nach dem fünftägigen Umweltbildungsprogramm eine signifikante Verstärkung des Naturbezugs gemessen, wohingegen die Kontrollgruppen keine messbare Veränderung zeigten. Jedoch nur die fünftägige Intervention führte auch zu nachhaltigen Veränderungen. Hierbei am stärksten beeinflusst wurden Kinder zwischen sieben und neun Jahren.
Bei der Untersuchung demographischer Einflussfaktoren auf Umwelteinstellung, -wissen und –handeln stellten sich das Wohnsitzland sowie die städtische bzw. ländliche Prägung der Wohngegend als entscheidend heraus. So waren dies die einflussreichsten Determinanten zur Vorhersage des Grundvorhandenseins sowie Veränderungen der untersuchten Variablen in Folge der Bildungsmaßnahme. Einzig bei der Entwicklung des Umwelthandelns schien die direkte Naturerfahrung unwesentlich, zeigten die Kontrollgruppen ähnlichen Wandel in ihrem aktiven Einsatz für die Umwelt. Im internationalen Vergleich scheint die komplexe Verkettung diverser einflussnehmender Faktoren, wie der Wohlstand des jeweiligen Staates, das generelle politische System sowie spezifische bildungspolitische Begebenheiten, den Erfolg von Umweltbildungsprogrammen mit zu bestimmen.
Die Daten zeigen, dass Faktenwissen Grundlage für Handlungs- und Effektivitätswissen ist. Alle Dimensionen wurden durch die Intervention signifikant gesteigert. Effektivitätswissen wuchs am stärksten. Auch das Umweltverhalten wurde positiv verstärkt. Jedoch ließen sich nur schwache Korrelationen zwischen den einzelnen Wissenstypen und Handeln feststellen. Zusammenfassend war das durchgeführte Bildungsprojekt erfolgreich in der Förderung von Naturverbundenheit sowie Umwelteinstellungen, -wissen und- handeln. Die Ergebnisse werden im Rahmen dieser Arbeit im Hinblick auf ihre Bedeutung für die schulische Umweltbildung sowie die didaktische Forschung erörtert.
Ziel der Studie war es, das Auftreten von Fatigue, Depression und Einschränkungen der Lebensqualität zu untersuchen bei einem an nichtmuskelinvasivem Blasenkrebs erkrankten Patienten unter BCG-Therapie. Die Hypothese war, dass es keinen Unterschied zu dem Validierungskollektiv der genutzten Fragebögen gibt. Zum Ende der Auswertung wurden die Ergebnisse mit dem Patientenkollektiv der mit Mitomycin behandelten Patienten (Dissertation Fr. Elena Walther) und BPH-bzw. Prostatakarzinom-Patienten (Dissertation Fr. Dr Daniela Drescher) verglichen. Ausgegeben wurden 400 Fragebögen an Patienten betreut in urologischen Praxen deutschlandweit. Zuvor war die Studie von der Ethikkommission der Landesärztekammer Hessen bewilligt worden. Der Fragebogen wurde vollständig anonymisiert, ein Rückschluss auf die Identität der Teilnehmer ist nicht möglich. Die Testinstrumente setzten sich zusammen aus dem sozioökonomischen Status, dem Brief Fatigue Inventory (BFI), dem EORTC-QLQ-C30, dem Beck Depression Inventar und dem EORTC-Blasenmodul QLQ-NMIBC24. Ausgewertet wurden 67 Fragebögen. Das Geschlecht der teilnehmenden Patienten war überwiegend männlich, 58, versus 9, weiblich. Das Mindestalter lag bei 45, das Höchstalter bei 91 Jahren. Die Mehrheit der Patienten (46) waren verheiratet, zusammenlebend. 50 % der Probanden verfügten über einen Hauptschulabschluss, 22 bzw. 15 % über einen Hochschul- bzw. Realschulabschluss. Die Mehrzahl der Patienten nahm keine Psychopharmaka ein (85 %). Es konnte gezeigt werden, dass die Lebensqualität der Patienten gut ist, gemessen der der Krebsdiagnose und der begleitenden belastenden intravesikalen Therapie. 73 Entscheidende Faktoren für die guten Ergebnisse schienen in diesem Patientenkollektiv die Lebensumstände zu sein, da herausgearbeitet werden konnte, dass Patienten, zusammenlebend mit Partner beim QLQ-C30- Fragebogen beim emotionalen Teil der Fragen bessere Ergebnisse zeigten. Bei den kognitiven Einschränkungen war das Alter ein negativer Einflussfaktor. Die körperlichen Einschränkungen waren trotz des hohen Durchschnittsalters der Teilnehmer eher gering. Der Anteil an Patienten mit schwerer Fatigue war mit 6 von 67 Teilnehmern sehr gering. Der Vergleich mit anderen Patientengruppen, wie Prostatakarzinom- und BPHPatienten und mit Mitomycin behandelten Patienten ergab keine signifikanten Unterschiede. Der größte limitierende Faktor dieser Arbeit war die geringe Patientenzahl. Dies ist umso bedeutsamer, da alle den Themenbereich untersuchenden Studien so geringe Patientenzahlen aufweisen. In der täglichen Praxis scheint es schwierig, noch zusätzliche Befragungen durchzuführen, die über das normale Maß hinausgehen. Die im Fragebogen abgefragten Punkte sind allerdings sehr wichtig für den Therapieerfolg, da Patienten mit einer schlechten Lebensqualität oder einer Depression, die sich unter Therapie entwickelt eher dazu geneigt sein werden, die Behandlung abzubrechen. Wünschenswert wäre weitere Studien mit größerer Patientenzahl, um den Einfluss des Alters und der Lebensumstände noch besser untersuchen zu können. Auch Unterschiede zwischen Männern und Frauen könnten so besser aufgearbeitet werden. Es wäre sehr wichtig, diese Studien durchzuführen, um Standards in der Versorgung der Patienten zu erarbeiten, beispielsweise Messinstrumente, die gut in den Alltag zu integrieren sind, um Krankheiten oder Begleitsymptome aufzudecken, die den Krankheitsverlauf negativ beeinflussen.
Defossiliation of the energy system is crucial in the face of the impending risks of climate change. Electricity generation by burning fossil fuels is being displaced by renewable energy sources like hydro, wind and solar, driven by support schemes and falling costs from technological advances as well as manufacturing scale effects. The unavoidable shift from flexibly dispatchable generation to weather-dependent spatio-temporally varying generators transforms the generation and distribution of electricity into highly interdependent complex systems in multiple dimensions and disciplines:
In time, different scales, stretching from intra-day, diurnal, synoptic to seasonal oscillations of the weather interact with years and decades of planning and construction of capacity. In space, long-range correlations and local variations of weather systems as well as local bottlenecks in transmission networks affect solutions. The investment decisions about technological mix and spatial distribution of capacity follow economic principles, within restrictions which adapt in social feedback loops to public opinion and lobbyist influences.
In this work, a family of self-consistent models is developed which map physical steady-state operation, capacity investments and exogeneous restrictions of a European electricity system, in higher simultaneous spatial and temporal detail as well as scope than has previously been computationally tractable. Increasing the spatial detail of the renewable resources and co-optimizing the expansion of only a few transmission lines, reveals solutions to serve the European electricity demand at about today’s electricity cost with only 5% of its carbon-dioxide emissions; and importantly their electricity mix differs from the findings at low spatial resolution.
As important intermediate steps,
• new algorithms for the convex optimization of electricity system infrastructure are derived from graph-theoretic decompositions of network flows. Only these enable the investigation of model detail beyond previous computational limitations.
• a comprehensive European electricity network model down to individual substations at the transmission voltage levels is built by combining and completing data from freely available sources.
• a network reduction technique is developed to approximate the detailed model at a sequence of spatial resolutions to investigate the role of spatial scale, and identify a level of spatial resolution which captures all relevant detail, but is still computationally tractable.
• a method to trace the flow of power through the network, which is related to a vector diffusion process on a directed flow graph embedded in a network, is used to analyse the resulting technology mix and its interactions with the power network
The open-source nature of the model and restriction to freely available data encourages an accessible and transparent discussion about the future European electricity system, primarily based on renewable wind and solar resources.
Ribonukleinsäure (ribonucleic acid, RNA) wirkt bei der Proteinbiosynthese nicht nur als Informationsüberträger, sondern kann auch beispielsweise durch sogenannten Riboschalter (auch Riboswitches) regulatorische Funktionen übernehmen. Riboschalter sind komplett aus RNA aufgebaut und man kann sie sich als molekulare Schalter vorstellen, die die Genexpression kontrollieren. Konzeptionell besteht ein Riboswitch aus zwei Untereinheiten, dem Aptamer und der Expressionsplattform. Das Aptamer bindet, üblicherweise sehr spezifisch, kleine organische Moleküle, aber auch Ionen. Diese Ligandenbindung induziert Änderungen in der Struktur des Riboswitches, welche wiederum die Expressionsplattform beeinflussen. Je nach Riboswitch ermöglicht oder verhindert dies schließlich die Genexpression. Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung und Etablierung von Methoden der optischen Spektroskopie zur Aufklärung von RNA-Dynamiken und -Strukturen im Allgemeinen und der Erforschung von Aptamerbindungsmechanismen im Besonderen.
Eine der dazu verwendetet Methoden ist die FTIR-Spektroskopie. Hierfür wurden zunächst kritische Parameter wie verschiedenste Messeinstellungen oder die Probenpräparation ausgiebig an RNA-Modellsträngen getestet. Dabei war es möglich, eine kleine Spektrenbibliothek als internen Standard aufzubauen. Gleichzeitig konnte gezeigt werden, dass kleinere RNA-Oligonukleotide (< ca. 20 Nukleobasen) gut mittels FTIR-Methoden untersucht werden können. Anschließend wurde eine statische Bindungsstudie am adenosin- sowie am guanosinbindenden Aptamer vorgenommen.
Die zweite hier vorgestellte Methode zur Untersuchung von RNA-Molekülen ist die Fluoreszenzspektroskopie. Im Gegensatz zur FTIR-Spektroskopie ist dazu allerdings eine Modifizierung der RNA durch ein Fluoreszenzlabel nötig. Deshalb beschäftigt sich der Hauptteil dieser Doktorarbeit mit der Charakterisierung und der Anwendung des quasi bifunktionellen RNA-Markers (auch RNA-Labels) Çmf. So wurden zunächst die photophysikalischen und photochemischen Eigenschaften des Markers untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass Çmf sich als lokale Sonde eignet, da es empfindlich auf Änderungen der Mikroumgebung in Lösung reagiert. Durch direkten Vergleich der optischen Eigenschaften von Çmf mit den entsprechenden Eigenschaften des Spinlabels Çm war es möglich, den starken Fluoreszenzlöschungseffekt (sog. quenching) des Çm aufzuklären. So kann davon ausgegangen werden, dass die Fluoreszenz des Çm durch eine sehr schnelle interne Konversion (IC) in einen dunklen Dublettzustand (D1) gelöscht wird.
Im nächsten Schritt wurde Çmf in RNA-Modellstränge eingebaut, um den Einfluss der RNA auf die Photochemie des Markers zu untersuchen. Dabei konnte gezeigt werden, dass sich dessen Fluoreszenzsignal abhängig von den direkten Nachbarbasen sowie abhängig vom Hybridisierungszustand signifikant ändert. Gleichzeitig konnte keine deutliche Veränderung der Stabilität der Modellstränge festgestellt werden. So konnte also nachgewiesen werden, dass sich Çmf sehr gut als lokale Sonde in RNA eignet. Im Speziellen wurde aus den Ergebnissen geschlossen, dass der Fluorophor für Ligandenbindungsstudien herangezogen werden kann.
Deshalb wurde Çmf schließlich an mehreren verschiedenen Stellen in das neomycinbindende Aptamer (N1) eingebaut, um dessen Bindungskinetik zu untersuchen. Mittels Stopped-Flow-Messungen war es möglich, die Bindungsdynamik des Aptamers zu beobachten. Anhand dieser transienten Daten konnte ein Zweischrittbindungsmodell abgeleitet werden. Dabei bindet Neomycin zunächst unspezifisch an das weitgehend vorgeformte Aptamer. Anschließend kommt es durch die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zu einer spezifischen Bindung des Liganden am Aptamer.
Im dritten Teil dieser Arbeit geht es ebenfalls um die Entwicklung und Etablierung eines spektroskopischen Werkzeuges. Dabei stehen allerdings Rhodopsine im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit. Hierbei handelt es sich um Membrantransportproteine, die nach optischer Anregung einen sehr schnellen Photozyklus mit mehreren Intermediaten durchlaufen. Es ist möglich, diese Intermediate dank transienter Absorptionsmessungen mit sehr guter zeitlicher und spektraler Auflösung zu beobachten. Allerdings besteht der Bedarf, diese Intermediate statisch zu präparieren, um sie näher charakterisieren und mit anderen Methoden, wie z.B. der Festkörper-NMR, vergleichen zu können.
Ein spektroskopisches Werkzeug zum Präparieren von frühen Photointermediaten ist kryogenes Einfangen (sog. Cryotrapping) dieser Intermediate. Im Rahmen dieser Arbeit wurden das Cryotrapping und die anschließende statische UV/vis-Absorptionsspektroskopie der fixierten (getrappten) Zustände optimiert und an einer Reihe von Rhodopsinen (ChR2, GPR) demonstriert.
Ein Hauptziel dieser Arbeit war die spektroskopische Charakterisierung einer neuartigen photolabilen Schutzgruppe (Photocage). Diese besteht aus dem weitverbreiteten (7-Diethylaminocumarin)methyl (DEACM), welches zusätzlich mit einer Art Antenne (ATTO 390) ausgestattet ist. Letztere soll die Zwei-Photonen-Absorption (2PA) erleichtern, was neben dem Energietransfer von der Antenne zur photolabilen Schutzgruppe sowie die Freisetzungsreaktion eines gebundenen Effektormoleküls untersucht wurde. Der Nachweis der erhöhten 2PA wurde durch Zwei-Photonen-induzierte Fluoreszenz erbracht, welche die Bestimmung des Zwei-Photonen-Einfangquerschnitts ermöglicht. Die 2PA wurde durch Messungen mit variierender Anregungsenergie an Rhodamin B und dem neuartigen Antennen-Photocage-System bestätigt, welche eine fast perfekte quadratische Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität nach vorangegangener 2PA widerspiegelten. Die Werte des Zwei-Photonen-Einfangquerschnitts der neuartigen photolabilen Schutzgruppe sind über alle Wellenlängen hinweg größer als die von DEACM-OH. Der Beweis eines intramolekularen Energietransfers von der Antenne zu DEACM erfolgte durch transiente Absorptionsspektroskopie. Hierfür wurde der Photocage mit 365nm angeregt, was überwiegend die Antenne adressiert. Ein intramolekularer Energietransfer konnte mit einer Zeitkonstante von 20 ps beobachtet werden, welcher wahrscheinlich von einem nachgelagerten Ladungstransfer von DEACM auf ATTO 390 begleitet wurde. Die Funktionalität des neuartigen Photocages wurde durch Aufnahme von Absorptionsspektren im IR-Bereich während kontinuierlicher Belichtung bei 365 nm untersucht. Hierbei konnte die Entstehung der intensiven Absorption von Kohlendioxid aufgrund der Photodecarboxylierung detektiert werden. Absorptionsänderungen während kontinuierlicher Belichtung wurden ebenfalls im UV/Vis-Bereich detektiert, in welchen eine hypsochrome Verschiebung der langwelligen Absorptionsbande sowie ein Anstieg der Absorption festgestellt wurden. Hieraus konnte eine Quantenausbeute der Freisetzungsreaktion von 1,5% ermittelt werden. Die Ergebnisse zum Antennen-Photocage-System zeigen auf, dass durch Anbringen einer Antenne die 2PA verbessert werden kann, ohne die Funktionalität des Freisetzungsprozesses negativ zu beeinflussen. In einem nächsten Schritt zielen Verbesserungen des untersuchten Photocages darauf ab, den Ladungstransfer zu unterdrücken. Die Validierung dieses Ansatzes sollte die Einführung anderer Antennen mit erhöhten Zwei-Photonen-Einfangquerschnitten, wie z.B. Quantenpunkte, weiter motivieren. Der zweite Ergebnisteil dieser Arbeit konzentriert sich auf drei verschiedene Photosysteme, die sich durch eine sehr kurzlebige Fluoreszenz auszeichnen, welche mit einem Kerrschalter aufgenommen wurde. Das erste der drei untersuchten Systeme umfasst eine kooperative BODIPY-DTE-Dyade(Bordipyrromethen-Dithienylethen), die einen hocheffizienten photochromen Förster-Resonanzenergietransfer aufweist. Dieser wurde durch verkürzte Lebenszeiten der Differenzsignale im transienten Absorptionsspektrum der Dyade im photostationären Zustand abgeleitet. In diesem stellt BODIPY-DTE eine hochkonjugierte Einheit dar, welches durch die geschlossene Form des photochromen DTEs einen Energietransfer vom photoangeregten BODIPY zum DTE ermöglicht. Bei diesem Prozess wird die Fluoreszenz des Donors um einige Größenordnungen reduziert. Die Ergebnisse der transienten Absorptionsmessung wurde durch ein zeitaufgelöstes Fluoreszenzexperimentbestätigt. Die detektierte Fluoreszenztransiente zerfällt mit einer Zeitkonstante von etwa 15 ps und weist somit sehr hohe Ähnlichkeit mit dem Signal des Grundzustandsbleichens (GSB) aus dem transienten Absorptionsexperiment auf. Des Weiteren wurde die photochrome Ringschlussreaktion eines wasserlöslichen Indolylfulgimids spektroskopisch charakterisiert. Transiente Absorptionsmessungen geben einen direkten Einblick in den Mechanismus der Reaktion, in welcher, nach Photoanregung, die Relaxation aus dem Franck-Condon Bereich und die schnelle biphasische Relaxation des Moleküls über die konische Durchschneidung abgeleitet werden kann. Zusätzlich wurden zeitaufgelöste Fluoreszenzmessungen mit Hilfe des Kerrschalters durchgeführt, da die stimulierte Emission (SE) in transienten Absorptionsmessungen durch die Überlagerung mehrerer Signale nicht vollständig zu erkennen war. Die globale Lebensdaueranalyse der mit dem Kerrschalter aufgenommenen Breitband-Fluoreszenz lieferte drei Zeitkonstanten, welche wesentliche Übereinstimmung mit den Zeitkonstanten aus der globalen Lebensdaueranalyse der transienten Absorptionsmessungen aufweisen. Schlussendlich wurde die Deaktivierung des elektronisch angeregten Zustands des flavinbindenden Dodecins aus Mycobacterium tuberculosis mit Hilfe von unterschiedlichen spektroskopischen Methoden charakterisiert. Stationäre Fluoreszenzmessungen bei unterschiedlichen pH-Werten zeigten bei pH 5 eine im Vergleich zu nahezu physiologischen Bedingungen (pH 7,5)reduzierte Fluoreszenz auf. Auffällig ist, dass diese Beobachtungen durch transiente Absorptionsmessungen nicht bestätigt werden konnten, da diese eine große Ähnlichkeit bezüglich der Dynamik und der spektralen Signatur zueinander besaßen. Ein negatives Signal, hervorgerufen durch die SE, wurde hierbei nicht gefunden. Allerdings konnte in den zerfallsassoziierten Spektren eine spektrale Signatur beobachtet werden, die auf eine SE hindeutete, welche allerdings mit größeren positiven Signalen überlagert ist. Dieser Aspekt wurde in einer Kerrschalter-Messung untersucht, in der eine schwache Emission bei pH 7,5 festgestellt werden konnte. Zusätzlich wies die Zerfallsdynamik der Emission Übereinstimmung mit dem GSB-Signal aus den transienten Absorptionsmessungen auf.
Throughout the entire life, new neurons of the granule cell type (GCs) are continu-ously generated in the mammalian hippocampal dentate gyrus (DG). As a part of the limbic system, the hippocampus is concerned with spatial and declarative memory for-mation. Increasing evidence exists, that adult born granule cells (ABGCs) play an im-portant role in this process. An especially critical period, when these ABGCs are 4-6 weeks old, has come into the focus of research. It is during this specific time-span that the ABGCs express enhanced excitability and synaptic plasticity as well as a lowered threshold for the induction of long term potentiation (LTP), a mechanism associated to learning and memory formation.
This study investigates the time course and dynamics of synaptic integration in ABGCs and mature GCs together with which differences exist between them at various cell ages. Furthermore, spine plasticity following high frequency stimulation (HFS) is analysed focusing on a critical phase of enhanced excitability in 4-5 week old ABGCs.
In this thesis, two approaches at studying the synaptic integration and structural plas-ticity of ABGCs in rats were investigated. This work was performed on fixed brain ma-terial that was provided by two laboratories that performed the in vivo labelling, stimu-lation procedures and brain fixation. In the first project, 6, 12 and 35 weeks old XdU-labelled ABGCs were studied. Adult rats were exposed to an enriched environment and received unilateral intrahippocampal delta burst stimulation (DBS) and LTP induction. The ABGCs and a control population of mature GCs were immunohistologically ana-lysed for Egr1 (early growth response 1) expression. Egr1 is an immediate early gene (IEG), expressed after LTP induction and marks neuronal excitation.
It was found, that unilateral stimulation of the perforant path of the hippocampus re-sults in an increase of Egr1 expression in ABGCs of both hemispheres. It could be shown that the enhanced expression intensity of Egr1 in ABGCs is not a usual state of young GCs but a reaction to DBS. ABGCs from unstimulated control animals and mature GCs expressed lower levels of Egr1. Interestingly, the stimulation induced a similar degree of Egr1 expression intensity in all ABGC age groups. Furthermore, it was found that young ABGC from the infrapyramidal dentate gyrus (DG) express a higher excita-bility than those from the suprapyramidal DG.
In the second project, fixed brain sections were analysed. They stemmed from rat brains containing 28 and 35 day old ABGC that had been transfected with intrahippo-campal RV-GFP (retroviral-green fluorescent protein) injections and had received uni-lateral high frequency stimulation of the medial perforant path in vivo. Nuclear Egr1 expression intensity was analysed in a cell specific manner. Dendritic spine size was measured in the inner-, middle- and outer molecular layer (IML, MML, OML). It was found that in ABGC, stimulation induced Egr1 expression increase is lower than in ma-ture GC. Following HFS, a significant homosynaptic spine enlargement was observed in the MML indicating homosynaptic LTP, while heterosynaptic spine shrinkage was found in the adjacent IML and OML. The latter corresponds to heterosynaptic long term depression (LTD). Homosynaptic plasticity describes an input-specific potentiation of synapses that received direct activation. The weakening of synapses not stimulated dur-ing homosynaptic potentiation is oppositely coined heterosynaptic plasticity1.
A positive correlation between an increase in nuclear Egr1 expression intensity and spine enlargement due to homosynaptic plasticity induced by HFS could be shown. Concomitant heterosynaptic plasticity, as indicated by spine shrinkage was observed. Spine shrinkage in the IML and OML showed a negative correlation to a decrease in Egr1 intensity.
Taken together, the results provide detailed information on the gradual integration of ABGC with ongoing maturation. Cell specific proof for homo- and heterosynaptic plas-ticity following HFS was found in the critical period of synaptic integration of ABGCs.
Krebs ist eine bedeutende Todesursache, und Krebsfrüherkennungsuntersuchungen in Form von Screeningmaßnahmen sind ein möglicher Ansatz, die spezifische Mortalität der jeweiligen Krebsart zu senken. Die Studienlage zeigt allerdings nur für die Koloskopie als Darmkrebsscreeningmaßnahme einen eindeutigen Nutzen. Brust-, Haut-und Gebärmutterhalskrebsfrüherkennung sind im Vergleich dazu wenig untersucht, und die entsprechenden Studien zeigen zum Teil widersprüchliche Ergebnisse. Eine Beschränkung der Maßnahmen auf Risikogruppen könnte die Kosten-Nutzen-Bilanz der Screeningmaßnahmen möglicherweise ins Positive verschieben. Derzeit raten gesetzliche Empfehlungen für die gesamte Bevölkerung ab einem festgelegten Alter zur Teilnahme an Darm-, Brust-, Haut- und Gebärmutterhalskrebsfrüherkennungs-untersuchungen, wobei die Inanspruchnahme je nach Untersuchung und Studie stark variiert. Hausärzte können als Ansprechpartner der Patienten zur Entscheidungsfindung für oder gegen eine Untersuchung beitragen. Um ihre Bedeutung in diesem Zusammenhang zu untersuchen, ist es sinnvoll, die Einstellung von Hausärzten gegenüber Krebsfrüherkennungsuntersuchen, sowie deren Empfehlung und mögliche Gründe für oder gegen eine Empfehlung zu erfassen. Hierzu wurde im Rahmen dieser Dissertation ein Fragebogen erstellt.
Die mittels des Fragebogens durchgeführte Datenerhebung stellt einen Teil des am Institut für Allgemeinmedizin Frankfurt durchgeführten Projektes „Onkologie in der Hausarztpraxis“ dar. Zur Entwicklung des Fragebogens wurde zunächst eine Literaturrecherche durchgeführt. Im weiteren Verlauf wurde ein Itempool erstellt, der thematisch sowohl auf den Ergebnissen der Recherche, als auch auf qualitativen telefonischen Interviews beruhte, die im Rahmen des oben beschriebenen Projektes „Onkologie in der Hausarztpraxis“ durchgeführt wurden. Aus diesem Itempool wurden zur Beantwortung folgender Forschungsfragen 28 Items zur weiteren Ausarbeitung ausgewählt:
1) Welche Einstellung haben Hausärzte gegenüber den gesetzlich empfohlenen, populationsbasierten Krebsfrüherkennungsuntersuchungen?
2) Unterscheidet sich die hausärztliche Einstellung in Abhängigkeit davon, ob die jeweilige Untersuchung populationsbasiert oder auf definierte Risikogruppen angewandt wird?
3) Für welche Risikogruppen halten die Hausärzte die verschiedenen Krebsfrüh-erkennungsuntersuchungen für sinnvoll?
4) Welche Gründe für oder gegen die Empfehlung von Krebsfrüherkennungsuntersu-chungen werden angegeben?
Die Konstruktion der einzelnen Fragen und Antwortskalen, die Formulierung von Handlungsanweisungen und die Gestaltung des Fragebogens mit Anschreiben, Titelseite und Layout erfolgte auf Basis von publizierten Expertenempfehlungen für eine qualitativ hochwertige Fragebogenkonstruktion. Der entstandene Fragebogen wurde anschließend einem Pretest unterzogen, der aus einer Stichprobe und einer kognitiven Testung bestand. Die Stichprobe wurde mit 35 Lehrärzten des Instituts für Allgemeinmedizin Frankfurt durchgeführt. Drei von ihnen sowie ein weiterer, vom Institut unabhängiger Hausarzt wurden im Verlauf für die kognitive Testung befragt. Auf Grundlage dieses Pretests wurde der Fragebogen nochmals angepasst.
Durch diesen Schritt wurden die 28 ausgewählten Items auf 19 Fragen reduziert, die gemeinsam mit neun Fragen zur Erhebung persönlicher Daten den fertigen Fragebogen bilden. Kriterien, die im Rahmen des Pretests zu Veränderungen geführt haben, waren erhöhte Non-Response-Raten, Hinweise auf mangelndes Fragenverständnis sowie geringe Relevanz einzelner Antwortoptionen. Zur Qualitätsprüfung wurde der fertige Fragebogen mittels einer publizierten Fragencheckliste auf mögliche Kritikpunkte hin getestet. Die Vorgehensweise zur Entwicklung des Fragebogens entsprach gängigen Empfehlungen von Experten. Der entwickelte Fragebogen stellt ein geeignetes Instrument zur Beantwortung der in der Einleitung gestellten Forschungsfragen dar, und leistet einen Beitrag zur Analyse der hausärztlichen Einstellung und Empfehlung zu Krebsfrüherkennungsuntersuchungen.
A sound and well-functioning legal system will encourage growth in investment and create opportunities for investors. Trademarks as part of intellectual property play an important role in the future development of a country. A mark or symbol is needed in order to give products and services identity and to distinguish them and their qualities from identical or similar products and services of a competitor.
This research studies, examines and analyses the degree, nature and function of trademark protection within the legal system of Afghanistan and compare them with the Paris, Madrid and TRIPs agreements. It has been divided into four chapters: Chapter one provides general information and an overview of the current legal system of Afghanistan. Chapter two studies and analyses international agreements pertaining to the legal protection of trademark. It also critically assesses the ATML compatibility with these agreements: and answers the research question of to what extent the ATML provisions are compatible with them. Chapter three provides information on the different purposes of trademarks from a development perspective and compares the purposes provided by the ATML. Finally, chapter four assesses and examines the acquisition, assignment and termination of trademarks. The conclusions and findings of the thesis are the final section of this research.
Afghanistan, as a transitioning economy, has not developed a solid legal and practical foundation for providing comprehensive protection mechanisms for trademarks as have been articulated in developed countries and international agreements. Accordingly, the Afghan government has not entirely integrated these needs into its legal system and there are some inconsistencies of the ATML with these agreements.
One more challenge is the lack of appropriate legal institutions for issuing, managing, administering and protecting of trademarks. The establishment of a well-functioning administrative institution will serve to fulfil the objectives of the laws. Therefore, the CBR office holds the administrative responsibility for processing the registration of trademarks.
However, the methods and facilities of the CBR office remain outdated, and the office does not have the capacity to provide applicants with up-to-date administrative and technical facilities.
Therefore, legal protection of trademark in Afghanistan is linked not only to the existence of a well functioning of laws, regulations, clear procedures, mechanism and guidelines but also to an efficient and well-functioning administrative office.
Das Zusammenspiel von experimentellen mit quantenchemischen Methoden ermoeglicht eine detaillierte Untersuchung der ablaufenden Mechanismen einer chemischen Reaktion auf molekularer Ebene. Insbesondere für quantenchemische Rechnungen zu molekularen Uebergangsmetall-Verbindungen haben sich die Methoden der Dichtefunktionaltheorie (DFT) als aeusserst leistungsfaehiges Forschungswerkzeug herausgestellt. Im Rahmen der DFT fehlt es allerdings prinzipiell an der Möglichkeit zur systematischen Verbesserung der erzielten Ergebnisse und DFT-Rechnungen zeigen eine hohe Abhängigkeit von der Natur der untersuchten molekularen Verbindungsklasse. Daher muss vor jeder mechanistischen Untersuchung ein jeweils optimaler DFT-Ansatz durch Vergleich mit hochgenauen Referenzrechnungen oder mit experimentellen Referenzdaten für relevante Vergleichssysteme identifiziert und gegebenenfalls kalibriert werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden quantenchemische Rechnungen zur Reaktivität von Übergangsmetall-Verbindungen anhand von fünf Forschungsprojekten vorgestellt. Im ersten Kapitel werden die Ergebnisse für die Aktivierung kleiner Moleküle (Alkohole, Sauerstoff und Stickstoff) durch bifunktionelle Übergangsmetall-Pincer-Komplexe dargestellt. Das zweite Kapitel befasst sich mit der bioanorganischen Chemie von dinuklearen Kupfer-Sauerstoff-Komplexen. Die Auswahl einer geeigneten DFT-Methodik erfolgte in allen Fällen durch den Vergleich zu experimentellen Referenzdaten.
In Kooperation mit der Arbeitsgruppe Schneider wurden Eisen-Komplexe für die katalytische (De)hydrogenierung von Alkoholen entwickelt, eine wichtige Reaktion zur Funktionalisierung von Alkoholen zu Carbonylverbindungen. Durch DFT-Rechnungen konnte der ablaufende Katalysezyklus der (De)hydrogenierung des Modell-Substrats Methanol aufgeklärt und der geschwindigkeitsbestimmende Schritt identifiziert werden. Ebenfalls in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Schneider wurde die selektive Reduktion von Sauerstoff zu Wasser, vermittelt durch einen dihydridischen Iridium-Komplex, untersucht. Da durch die beiden Hydrid-Liganden insgesamt vier Elektronen für die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser bereitgestellt werden, sollte prinzipiell ein monomolekularer Reaktionsverlauf möglich sein. Detaillierte DFT-Rechnungen in Kombination mit experimentellen Kinetikmessungen ergeben starke Hinweise auf einen derartigen Reaktionspfad mit geschwindigkeitsbestimmender Sauerstoff-Aktivierung. Zuletzt wird ein weiteres Kooperationsprojekt mit derselben Arbeitsgruppe vorgestellt. Die protoneninduzierte
übergangsmetallvermittelte Spaltung von Stickstoff in zwei Metall-Nitrid-Komplexe stellt ein neuartiges synthetisches Konzept dar. Durch die Protonierung eines dinuklearen Molybdän-Stickstoff-Komplexes erfolgt die Spaltung in die entsprechenden Mo-Nitrid-Komplexe. Der Grund für die ungewöhnliche Änderung der Spin-Multiplizität bei der Protonierung der Molybdän-Komplexe konnte durch detaillierte quantenchemische Analysen identifiziert werden.
Im zweiten Kapitel werden Untersuchungen zur bioanorganischen Chemie von dinuklearen Kupfer-Sauerstoff-Komplexen vorgestellt. In der Natur werden viele (bio)chemisch relevante Prozesse durch übergangsmetallhaltige Enzyme unter moderaten Reaktionsbedingungen vermittelt. Kupferhaltige Enzyme sind unter Anderem für die hochselektive Oxidation organischer Substrate zuständig. Der Ansatz der Bioanorganik befasst sich mit der Übertragung der enzymatischen Struktur und/oder Funktion auf synthetische Modell-Verbindungen. Da die akkurate Beschreibung der Energien von dinuklearen Kupfer-Sauerstoff-Komplexen höchste Anforderungen an die angewandten quantenchemischen Methoden stellt, wurde eine geeignete DFT-Methode in aufwändigen Voruntersuchungen durch den Vergleich mit experimentellen Ergebnissen identifiziert. Mit Hilfe des so kalibrierten BLYP-D3-Ansatzes wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Meyer ein neuartiges Konzept für die baseninduzierte Isomerisierung des reaktiven Kerns etabliert. In einer weiteren Arbeit wurde die regio- und stereoselektive Hydroxylierung von nicht-aktivierten aliphatischen C-H-Bindungen in Steroid-Substraten mit Hilfe von mechanistischen DFT-Rechnungen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die stereochemische Anordnung des Liganden um den reaktiven Kupfer-Sauerstoff-Kern die Selektivität der Hydroxylierung bestimmt.
Bindung bildet in der Erforschung langfristiger psychosozialer Entwicklung ein zentrales Konstrukt. In Bezug auf die Phase der mittleren Kindheit liegt dabei jedoch oft eine eingeschränkte Forschungsperspektive vor: dem Konzept der Monotropie folgend, wird trotz des wachsenden sozialen Umfelds allein Eltern eine besondere Aufmerksamkeit in ihrer Rolle als Bindungsfiguren zugeordnet. Zudem fehlen Studien jenseits westlich-europäischer Entwicklungsverläufe. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die explorative Erforschung der transkulturellen Spannbreite und der kontextspezifischen Adaptivität in der Auswahl und Funktionalität von Bindungsfiguren der mittleren Kindheit. Dazu werden Daten in zwei ökokulturell gegensätzlichen Settings erhoben, um kontextspezifische und globale Trends betrachten zu können.
Zunächst erfolgt eine ethnologische Annäherung an die frühste Kindheit im kamerunischen Setting der Nseh entlang des Tragetuchs als zentralem Care-Objekt. Diese offenbart eine symbiotische Beziehungsgestaltung, aber auch strenge Regeln des Aufbaus und der Abgrenzung im geteilten Care-System.
Anschließend wird eine methodische Strategie zur Erforschung der mittleren Kindheit entwickelt, die eine Netzwerkperspektive beinhaltet und der kindlichen Wahrnehmung folgt. Dabei werden teilnehmende Beobachtungen mit Photo Elicitation Interviews verbunden, um das vollständige Kollektiv der Bindungsfiguren zu identifizieren und in ihren soziostrukturellen und funktionellen Eigenschaften zu charakterisieren. Indem das Setting zum inhärenten Teil der Datenerhebung wird, werden dabei adaptive Prozesse zugänglich.
In Umsetzungen dieser kontextualisierend explorativen Strategie bei den kamerunischen Nseh und im deutschen Bad Nauheim werden die Bindungsnetzwerke der mittleren Kindheit erfasst und in ihrer Adaptivität diskutiert. Der Kontrastvergleich offenbart, dass die Kinder der Nseh im Vergleich zu den Kindern aus Bad Nauheim in der Altersstruktur vielfältigere, räumlich enger begrenzte und zeitlich stabilere Netzwerke beschreiben. In beiden Settings identifizieren die Kinder eine Aufteilung der inhaltlich-funktionelle Verantwortlichkeiten, die bei den Nseh gemäß den Altersgruppen verläuft.
Insgesamt zeichnet sich für die mittlere Kindheit ein komplexes Bindungsumfeld ab. Dabei verbinden sich settingspezifische Kindheitsbedingungen mit globalen Entwicklungsthemen. Das mehrdimensionale kindliche Sicherheitsgefühl kann auf die Wirkung eines Kollektivs an Bindungsfiguren zurückgeführt werden, zu dem kontextunabhängig in einem bedeutsamen Ausmaß auch Peers gehören.
Einleitung: Die häufigste Komplikation nach einer totalen Thyreoidektomie ist der postoperative sekundäre Hypoparathyreoidismus. Eine Prävention dieser Komplikation wäre erstrebenswert. Nicht nur dass die Patienten unter den Symptomen (wie z.B. Kribbelparästhesien) leiden, auch der Krankenhausaufenthalt wird meist verlängert und es wird ein höherer Aufwand an diagnostischen Maßnahmen und Medikamenten in der Folge notwendig.
Um das Auftreten des sekundären Hypoparathyreoidismus einzuschränken sind schon einige Studien durchgeführt worden, die u.a. ein erhöhtes Risiko für Patienten mit einem präoperativen Vitamin D3-Defizit aufzeigten.
Der Einfluss dieses Vitamin D3-Defizits wird in der vorliegenden prospektiven, multizentrischen, randomisiert kontrollierten Studie näher untersucht. Es sollte geklärt werden, ob eine präoperative Prophylaxe mit Vitamin D3 eine Verminderung der Hypokalzämierate gegenüber einer Kontrollgruppe bewirken kann.
Da sich der sekundäre Hypoparathyreoidismus als multifaktorielles Geschehen darstellt, sind in dieser Studie weitere Risikofaktoren untersucht worden.
Zusätzlich sollten eine Veränderung der Lebensqualität und die Belastung der Patienten durch Hypoparathyreoidismus-Symptome beurteilt werden.
Material und Methoden: Im Zeitraum vom 23.07.2014 bis zum 26.10.2016 wurden 246 Patienten an sechs verschiedenen Kliniken rekrutiert. Das Durchschnittsalter der 61 Männer und 185 Frauen lag bei 49 Jahren (Min.: 22 Jahre, Max.: 81 Jahre). Alle Patienten unterzogen sich einer totalen Thyreoidektomie als Ersteingriff an der Schilddrüse.
Die Patienten wurden in zwei Gruppen randomisiert, wobei die Interventionsgruppe präoperativ über drei Tage eine Vitamin D3–Prophylaxe (0,5µg, jeweils morgens und abends) einnahm. Neben dieser Intervention wurde nicht in die standardmäßige Behandlung der Patienten eingegriffen, um eine möglichst praxisnahe Untersuchung zu gewährleisten.
Bei allen Patienten wurde präoperativ und mindestens am ersten Tag postoperativ der Serumcalcium-Wert bestimmt. Der Beobachtungszeitraum erstreckte sich über ca. 30 Tage postoperativ, in dem auch weitere Parameter untersucht wurden. U.a. wurden die Patienten gebeten den SF-36-Fragebogen nach Bullinger et al (1) und den Hypoparathyreoidismus-Fragebogen nach Bohrer et al (2) auszufüllen. Mit diesen Fragebögen sollten die empfundene Lebensqualität der Patienten und die Belastung durch Hypoparathyreoidismus-Symptome abgefragt werden.
Ergebnisse: Die Untersuchungsgruppen zeigten keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf das Auftreten einer postoperativen Hypokalzämie. Insofern eine Hypokalzämie auftrat, konnte die Normokalzämie in der Interventionsgruppe signifikant schneller erreicht werden. Aufgrund dieses Ergebnisses konnte eine NNT für jede Klinik errechnet werden. Diese Werte ließen eine Skalierung zu, durch die jedes Klinikum für sich eine Nützlichkeit der Intervention anhand der Hypokalzämie-Rate errechnen kann.
Herausgefunden werden konnte ebenfalls, dass die Kliniken signifikant unterschiedliche Hypokalzämie-Raten aufwiesen. Je nach Hypokalzämie-Rate der Klinik bewirkte die Intervention abweichende Veränderungen (von einer Verschlechterung um 20% bis zu einer Verbesserung um 24, 6%).
Zu den signifikanten Risikofaktoren für eine postoperative Hypokalzämie zählten in dieser Studie das weibliche Geschlecht, ein relativ junges Alter (44,7 ±10,6 Jahre im Gegensatz zu 50,5 ±12 Jahre) und die intraoperative Identifizierung von mehr als drei Nebenschilddrüsen. Weiterhin zeigte sich, dass sich bei hypokalzämen Patienten der Krankenhausaufenthalt signifikant verlängerte.
Beim SF-36-Fragebogen zeigte sich ein signifikanter Unterschied zwischen den prä- und postoperativen Werten der Frauen. Der Belastungsscore des Hypoparathyreoidismus-Fragebogens hingegen zeigte nur bei den Frauen der Interventionsgruppe eine signifikante Verbesserung zu den präoperativen Werten.
Schlussfolgerung: Die prophylaktische Vitamin D3-Gabe präoperativ konnte zwar keine Verminderung der Hypokalzämie-Rate in der Interventionsgruppe bewirken, aber bei aufgetretener Hypokalzämie eine schnellere Erholung des Calcium-Spiegels bewirken. Die postoperative Belastung durch Hypokalzämiesymptome wurde durch die Vitamin D3-Prophylaxe von Frauen signifikant gemildert empfunden. Eine Vitamin D3-Prophylaxe ist daher empfehlenswert. Der Nutzen der Intervention steigt allerdings mit der jeweiligen institutionellen Hypokalzämie-Rate. Bemerkenswert ist, dass die Kliniken sich in vielen Parametern gleichen, aber letztlich das chirurgische Vorgehen den größten Einfluss auf die Hypokalzämie-Rate zu haben scheint und die Intervention in Form der Gabe einer Vitamin D3-Prophylaxe überlagert hat.
In the course of this thesis we discuss a certain kind of supersolid, the lattice-supersolid, which can be realized using quantum gases in an optical lattice trap. The lattice-supersolid, which simultaneously possesses off-diagonal and diagonal long-range order in its density matrix and also breaks the discrete translational symmetry of an underlying lattice, is induced by self-ordering of the gas due to strong long-range van der Waals interactions. In the considered scenario, the interactions are facilitated by the excitation of atomic Rydberg states, which exhibit enhanced van der Waals forces.
In the first part of this thesis (chapters 1-3), we review the relevant basics of quantum gases, Rydberg physics and introduce the extended Bose-Hubbard model. We start with the relevant methods and devices of the vast toolbox available in common quantum gas experiments, as well as consider the main concepts behind superfluidity and supersolidity. This is followed by an introduction of some basic concepts of Rydberg atoms in quantum many-body systems, with a focus on the facilitation of long-range interactions and the implementation in a theoretical model. Thereafter a brief introduction is given, on the realization of the Bose-Hubbard model in optical lattice systems and its extension to include Rydberg states, which concludes the introductory part of this thesis.
In the following part (chapters 4-6), we introduce the theoretical tools used to derive the results presented in the final part. First, an introduction to a real-space extension of bosonic dynamical mean-field theory (RB-DMFT) for bosonic systems with long-range interactions in the Hartree approximation is given. This method is based on the non-perturbative self-consistent evaluation of the lattice Green’s function, which also incorporates the effect of nearest neighbor correlations due to the non-condensed particles. Then we focus on a quasiparticle expansion of the Bose-Hubbard model, which has its foundation in linearized fluctuations of a static mean-field ground-state, allowing for the prediction of a vast range of experimentally relevant observables. Lastly, we introduce an efficient truncation scheme for the local bosonic Fock-basis, which allows for the simulation of phases with high condensate density at a vastly reduced computational effort.
In the final part (chapters 7 and 8), we discuss the application of both methods to itinerant bosonic gases in two-dimensional optical lattices, in order to predict the equilibrium ground-state phases, as well as the signatures of supersolidity and its formation in spectral functions and the dynamic and static structure factor. Specifically, we focus on two limiting cases. Firstly, we consider a two-component gas, as realized by two hyperfine ground states, for example, of rubidium-87, where one component is off-resonantly excited to a Rydberg state, which generates a soft-core shaped interaction potential. Secondly, we discuss the opposing limit, using near-resonant excitations
of Rydberg states, where the interacting component now directly corresponds to the Rydberg state, which interacts via a van der Waals potential. In both cases we discuss the rich variety of supersolid phases, which are found for a wide range of parameters. We also discuss how some of these phases can be realized in experiment.
In the subsequent appendices (A to D) we discuss some methodological details. Most notably, we consider the possible Fock-extension of the Hartree approximation (appendix A), introduced in the RB-DMFT treatment of the extended Bose-Hubbard model.
Reactive oxygen species (ROS) are involved in various signalling mechanisms. Redox homeostasis is important in cancer cells, since they are dependent on upregulated antioxidant defence pathways to cope with elevated ROS levels. Therefore, targeting the antioxidant defence system and/ or increasing ROS to a lethal level may be a feasible strategy to counteract cancer cell progression.
Acute lymphoblastic leukaemia (ALL) is the most frequent malignant childhood cancer, displaying on one side resistance to cell death induction and on the other side elevated ROS levels. Therefore, inducing ferroptosis, a ROS- and iron-dependent cell death pathway might be useful to trigger cell death in ALL as a novel treatment strategy. In the first study of this thesis we observed that RSL3, a glutathione (GSH) peroxidase 4 (GPX4) inhibitor, triggered ROS accumulation and lipid peroxidation which contributed to ferroptotic cell death. These observations were based on suppression of RSL3 stimulated cell death using different ferroptosis inhibitors like Ferrostatin-1 (Fer-1), Liproxstatin-1 (Lip-1), as well as iron chelator Deferoxamine (DFO) and the vitamin E derivate α-Tocopherol (α-Toc). RSL3-triggered ROS and lipid peroxide production were also inhibited through Fer-1 and α-Toc. Furthermore, lipoxygenases (LOX) were activated upon RSL3 stimulation and contributed to ferroptotic cell death in ALL as well. Selective inhibition of LOX with the 12/15-LOX inhibitor Baicalein and the pan-LOX inhibitor nordihydroguaiaretic acid (NDGA) abolished RSL3-induced ROS production, lipid peroxidation and cell death. In addition, RSL3 induced lipid peroxide-dependent ferroptotic cell death in FAS-associated Death Domain (FADD)-deficient, death receptor-induced apoptosis resistant cells, demonstrating that ferroptosis might circumvent apoptosis resistance.
The second part of the study revealed that RSL3 and Erastin (Era), a GSH-depleting agent, inhibiting the cystine/glutamate antiporter system xc- and ferroptosis inducer, cooperated with the Smac mimetic BV6 to trigger cell death in ALL cells. RSL3/BV6 and Era/BV6 combination-induced cell death was dependent on ROS accumulation, but independent of caspases and key modulators of necroptosis. RSL3/BV6-treated ALL cells exhibited classical features of ferroptotic cell death with iron-dependency, ROS accumulation and lipid peroxidation which was diminished through either pharmacological inhibition (Fer-1, DFO, α-Toc) or genetic inhibition by overexpressing GPX4. Interestingly, Era/BV6-induced cell death in ALL cells was independent of iron but dependent on ROS accumulation, since α-Toc rescued from Era/BV6-triggered ROS production, lipid peroxidation and cell death. Moreover, inhibition of lipid peroxide formation through the addition of Fer-1 or by overexpressing GPX4 failed to rescue from Era/BV6-triggered cell death, even if Era/BV6-stimulated lipid peroxidation was diminished. Likewise, Fer-1 protected from RSL3/BV6-, but not from Era/BV6-generated ROS production, leading to the assumption that other ROS besides lipid-based ROS contributed to cell death in Era/BV6-treated cells. In summary, while RSL3/BV6 induced ferroptosis in ALL, Era/BV6 stimulated a ROS dependent cell death, which was neither dependent on iron nor caspases or receptor-interacting protein (RIP) kinase 1 nor 3. Additionally, using Erastin alone did not trigger ferroptotic cell death in ALL. Finally, with these two studies we tried to unravel the molecular pathway of ferroptosis by using RSL3 and Erastin as well described ferroptosis stimulators. Here, we demonstrate the possibility of a novel treatment strategy to reactivate programmed cell death by impeding redox homeostasis in ALL.
Since ALL failed to induce ferroptosis upon Erastin treatment, we investigated in the third part of this thesis a new model system to induce ferroptosis upon Erastin and RSL3 exposure. Previous studies revealed that rhabdomyosarcoma (RMS) cells might be susceptible to oxidative stress-induced compounds. To this end, we used Erastin as a prototypic ferroptosis stimulus and GSH-depleting agent and demonstrated that GSH depletion, ROS and lipid ROS accumulation contributed to cell death. Additionally, Fer-1, Lip-1, DFO, lipophilic vitamin E derivate α-Toc and GSH, a cofactor of GPX4, protected from Erastin stimulated ROS accumulation, lipid peroxidation and cell death. Also, the use of a broad spectrum protein kinase C (PKC) inhibitor Bisindolylmaleimide I (Bim1), a PKCα and ß selective inhibitor Gö6976 and siRNA-mediated knockdown of PKCα suppressed Erastin-mediated cell death in RMS. Moreover broad spectrum nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase (NOX) inhibitor Diphenyleneiodonium (DPI) and a more selective NOX1/4 isoform inhibitor GKT137831 abrogated Erastin-generated ROS formation, lipid peroxidation and cell death. With this, we demonstrate that RMS are vulnerable to ferroptotic cell death and investigated the molecular mechanism of ferroptosis by unravelling that PKC and NOX could have a pivotal role in ROS-mediated ferroptosis signalling in RMS. In this regard, ferroptosis inducers may act as a possible novel treatment strategy for RMS, especially those with poor clinical outcome.