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Obwohl Böden unzweifelhaft ein signifikanter Pool von organischem Kohlenstoff sind, ist ihre Bedeutung als potenzielle langfristige Senke für atmosphärischen Kohlenstoff keineswegs klar. Trotz bedeutender wissenschaftlicher Forschritte aus den letzten Jahren zur Klärung der Kohlenstoffdynamik in Böden gibt es nach wie vor offene Fragen insbesondere hinsichtlich der spezifischen geochemischen Mechanismen, die für die Stabilisierung organischen Kohlenstoffs in Böden verantwortlich sind. Vor diesem Hintergrund besteht ein wesentliches Ziel der vorliegenden Dissertation darin, in unterschiedlichen Bodentypen die Konzentration von organischem Kohlenstoff und Stickstoff sowie die mineralogische Zusammensetzung zu untersuchen, um Hinweise auf einen möglichen Einfluss der Tonmineralogie, der spezifischen Oberfläche und der Oxidkonzentration auf die Stabilisierung organischen Materials zu ermitteln. Die Ergebnisse sollen einen Beitrag dazu liefern, die Mechanismen der Fixierung organischer Substanz in Böden besser zu verstehen und das vorhandene Wissen hierüber zu erweitern. Hierzu wurden fünf verschiedene Bodenprofile aus Hessen mit unterschiedlicher mineralogischer Zusammensetzung untersucht. Um die Auswirkungen verschiedener physikalischer und geochemischer Faktoren auf den Gehalt organischer Substanz in den untersuchten Böden festzustellen, wurden folgende Parameter untersucht: -Tonmineralogie, -organische Kohlenstoff- und Stickstoff-Konzentrationen, -%-Kationensättigung, -spezifische Oberfläche, -dithionit- und oxalatlösliche Gehalte an Fe, Al und Mn. Anhand dieser Parameter wurden weiterführende statistische Analysen unter Verwendung der Statistiksoftware SPSS für Windows durchgeführt, um mögliche statistische Zusammenhänge aufzudecken, die für die Stabilisierung von organischem Kohlenstoff in den betrachteten Böden verantwortlich sind. Die im Rahmen der vorliegenden Dissertation ermittelten Ergebnisse zeigen, dass der Tonanteil und die Tonmineralogie der untersuchten Böden nur einen begrenzten Einfluss auf die Stabilisierung organischer Substanz haben. Weiterhin wird gezeigt, dass die in der Literatur propagierte Beziehung zwischen spezifischer Oberfläche und der Konzentration organischen Kohlenstoffs nicht auf alle Böden anwendbar ist. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Präsenz von amorphen Eisen- und Aluminiumoxiden der wichtigste Einflussfaktor für die Fixierung von organischem Material in den untersuchten Böden ist. Die größeren Konzentrationen von organischem Kohlenstoff in den kleinsten Fraktionen (Feinschluff und Ton) der Profile sind vor allem darauf zurückzuführen, dass Oxide ebenfalls in diesen Fraktionen aufzufinden sind. Tonminerale haben demnach eine sekundäre Bedeutung, indem sie Komplexe mit den Oxiden bilden, die zur Stabilisierung von organischer Substanz führen können. Insgesamt deuten die Ergebnisse daraufhin, dass Böden keine geeignete Senke für die langfristige Speicherung von organischem Kohlenstoff sind. Obwohl Mechanismen wie die Adsorption von organischer Substanz an Oxide die Stabilisierung organischen Materials unterstützen, scheinen diese nicht stark genug zu sein, um eine permanente Speicherung von organischem Kohlenstoff zu bewirken.
Die Hyperhomocysteinämie wird als unabhängiger Risikofaktor atherosklerotischer Gefäßerkrankungen angesehen. Viele Studien haben eine deutliche Korrelation zwischen Hyperhomocysteinämie, koronarer Herzkrankheit, cerebrovaskulären und peripheren thromboembolischen Erkrankungen aufgezeigt. Aus diesem Grund hat natürlich die Homocysteinbestimmung in die diagnostischen Maßnahmen, die bei Verdacht auf Arteriosklerose durchgeführt werden, Eingang gefunden. Mit der Zielsetzung, ein zuverlässiges und standardisiertes Verfahren für die Routinediagnostik bereitzustellen, wurde im Rahmen dieser Dissertation eine quantitative HPLC-Methode zur Bestimmung von Homocystein im Blut etabliert. Weiterhin erfolgte auch eine Homocysteinbestimmung mit dem ELISA und im Anschluß daran ein Methodenvergleich zwischen HPLC und ELISA. Der Methodenvergleich ergab, daß die ELISA-Homocysteinwerte immer um etwa 4,77% niedriger lagen als die HPLC-Homocysteinwerte. Dies bestätigte auch die Literatur. Die wichtigste Aufgabenstellung dieser Doktorarbeit war allerdings die Suche nach einer neuen genetischen Mutation auf dem MTHFR-Gen mittels Probenscreening von Patienten mit Hyperhomocysteinämien. Die katalytische Domäne der MTHFR liegt im N-terminalen Bereich des Proteins. Dieser Bereich entspricht Exon 1 bis Exon 6 des MTHFR-Gens. Folglich wurde für diese Exonbereiche 1,2,3,4,5 und 6 das Mutationsscreening etabliert. Dieses ließ sich mit der Temperaturgradientengelelektrophorese (TGGE) erfolgreich durchführen, wobei für jeden Exonbereich 300 Proben aus der Luric-Studie durchgemessen worden sind. LURIC steht für LUdwigshafener RIsikofaktor- und Cardiovaskuläre Gesundheits-Studie. Das Ziel dieser Untersuchungen ist das Erkennen neuer Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere die zum Herzinfarkt führen. Für alle Probenwerte erhielten wir Angaben über Geschlecht, Geburtsdatum, Größe, Gewicht, KHK-Status, Hypertonie, Diabetes mellitus, Homocystein, Vitamin B6, Vitamin B12 und Folsäure. Nach eingehender Betrachtung ließen sich nun drei Kollektive mit unterschiedlichen Homocystein-/ Folsäurewerten ermitteln, welche dann durchgescreent wurden: Das erste Kollektiv erfaßt Homocysteinwerte, welche größer als 16µmol/l sind und zwar unabhängig von den Folsäurewerten. Das zweite Kollektiv enthält Homocysteinwerte, welche größer als 10µmol/l sind und Folsäurewerte, welche ebenfalls größer als 10 µmol/l sind. Das dritte Kollektiv ist das größte und enthält die übrigen Werte, welche negativ auf schon bekannte Mutationen auf Exon 4 und Exon 7 sind. Dieses Kollektiv wurde hier zunächst betrachtet und enthält etwa für jeden Exonbereich 200 Proben. Bei jeder Art von Korrelationsuntersuchungen in den einzelnen Kollektiven (1. Kollekiv, 2. Kollektiv, 3. Kollektiv, homozygotes Kollektiv, heterozygotes Kollektiv und Referenzkollektiv) konnte zwischen Homocystein und Folsäure, zwischen Homocystein und Vitamin B12, zwischen Homocystein und Vitamin B6 und Homocystein und dem Alter keine Korrelation festgestellt werden. Die Korrelationen lagen alle unter -0,5 und 0,3. Einen negativen Korrelationskoeffizienten weisen die Parameter Homocystein/Folsäure, Homocystein/Vitamin B12 und Homocystein/Vitamin B6 auf. Einen positiven Korrelationskoeffizienten weisen Homocystein und das Alter auf. Bei den Signifikanzuntersuchungen ergab sich, daß fast alle Mittelwerte der einzelnen Kollektive signifikant unterschiedlich sind. Die Mittelwerte aller Kollektive von Folsäure/Homocystein, Vitamin B12/Homocystein und das Alter/Homocystein sind signifikant unterschiedlich Nur bei dem Vergleich Vitamin B6/Homocystein ist bei den meisten Kollektiven keine Signifikanz festgestellt worden. D. h. diese Mittelwerte sind annähernd gleich, sie sind nicht bedeutend unterschiedlich. Nur das 1. Kollektiv und das homozygote Kollektiv sind bei dem Vergleich der Mittelwerte Vitamin B6/Homocystein signifikant unterschiedlich. Mit Hilfe der TGGE und anschließender Sequenzierung konnten drei verschiedene Mutationen identifiziert werden: Auf Exon 4 ließ sich eine bekannte Mutation und zwar die (C-677-T) mit dem Basenaustausch Alanin gegen Valin an Patient 540 und Patient 786 feststellen. Dies ließ sich auch durch eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym Hinfl bestätigen. Auf Exon 6 konnte eine stille Mutation mit dem Basenaustausch (T-1068-C) an zwei Patienten (762 und 624) identifiziert werden. Die Aminosäure Serin bleibt hierbei erhalten (AGT-AGC). Auf Exon 5 ließ sich eine interessante Mutation erkennen, welche weitere Messungen wie Enzymaktivität und Familienanamnesen erfordert. Am Patient 569 entsteht hier durch einen Basenaustausch (C-844-T) aus der Aminosäure Glutamin (CAG) ein Stopcodon (TAG). Dies ließ sich weiterhin durch eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym Mae III bestätigen. Erhöhte Homocysteinspiegel und reduzierte MTHFR-Aktivitäten erklären ebenfalls das Mutationsergebnis. Auch die Familienanamnese ergab eine interessante Entdeckung. Die gleiche Mutation (C-844-T) vom Patienten 569 ließ sich auch bei seinem Bruder feststellen. Damit wurde die Mutation vererbt und ereignete sich nicht spontan.
Die NO/cGMP-Kaskade spielt bei der nozizeptiven Transmission im Hinterhorn des Rückenmarks eine wichtige Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden bekannte cGMP-Targets (PKG-1, CNG-Kanäle, PDE-2 und -3) sowie synaptische Vesikelproteine (Synapsin 2, Rabphilin) als potentielle Targets der NO/cGMP-Kaskade mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden und nozizeptiven Verhaltensstudien hinsichtlich einer Beteiligung an der nozizeptiven Transmission im Rückenmark untersucht. Im Formalintest reduzierte der PKG-1-Inhibitor Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,5 µmol i.t.) die nozizeptive Antwort, während der PKG-1-Aktivator 8-Br-cGMP in hoher Dosis (2,5 µmol i.t.) einen gegenteiligen Effekt zeigte. Überraschenderweise wirkte 8-Br-cGMP in niedriger Dosis (0,1 - 0,25 µmol i.t.) antinozizeptiv, was durch die gleichzeitige Applikation des PKG-Inhibitors weiter verstärkt wurde. Im Gegensatz zu Rp-8-Br-cGMPS oder 8-Br-cGMP beeinflussten weder der CNG-Kanal-Inhibitor L-cis-Diltiazem (0,5 mg i.t.), noch die PDE-Inhibitoren EHNA (0,25 µmol i.t.) oder Milrinon (5 - 10 mg/kg i.p.) die nozizeptive Antwort im Formalintest. Mit Western Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Formalininjektion in eine Hinterpfote im Lumbalmark nach 48 - 96 h eine Steigerung der PKG-1-Proteinkonzentration zur Folge hat. Dies wurde durch Vorbehandlung der Versuchstiere mit Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,5 µmol i.t.) oder Morphin (2,5 - 5 mg/kg i.p.) verhindert, während 8-Br-cGMP (2,5 µmol i.t.) die Formalin-induzierte Steigerung der PKG-1-Konzentration im Lumbalmark verstärkte. Die Formalininjektion in eine Hinterpfote veränderte auch die Synapsin 2b-Konzentration im Lumbalmark: 10 min bis 8 h nach der Injektion wurde die Synapsin 2b-Proteinkonzentration gesenkt, nach 48 h war jedoch eine Zunahme zu beobachten. Diese späte Zunahme der Synapsin 2b-Proteinkonzentration wurde durch eine Steigerung der Genexpression hervorgerufen, denn mit quantitativer Realtime RT-PCR wurden erhöhte mRNA-Konzentrationen 24 - 48 h nach der Formalininjektion gemessen. Die rasche Formalin-induzierte Abnahme der Synapsin 2b-Proteinkonzentration ging jedoch weder mit Änderungen der mRNA-Konzentration, noch mit veränderten Solubilisierungseigenschaften bei der Proteinaufbereitung einher, und wurde durch Vorbehandlung der Versuchstiere mit Morphin (10 mg/kg i.p.), Diclofenac (10 mg/kg i.p.), Metamizol (1 g/kg i.p.) oder dem NOS-Inhibitor L-NAME (10 - 100 mg/kg i.p.) verhindert. Demgegenüber führte die Vorbehandlung mit dem NO-Donor NOC-5 (4 - 20 µg i.t.), 8-Br-cGMP (0,1 - 2,5 µmol i.t.), Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,25 µmol i.t.) oder der Kombination von 8-Br-cGMP und Rp-8-Br-cGMPS (0,1 + 0,1 und 0,5 + 0,5 µmol i.t.) zu einer Verstärkung der Formalin-induzierten raschen Senkung der Synapsin 2b-Konzentration. Die funktionelle Relevanz dieser Befunde wurde in mehreren nozizeptiven Tiermodellen überprüft. Durch eine kontinuierliche i.t. Infusion von Antisense-Oligonukleotiden wurde die Synapsin 2-Konzentration im Lumbalmark der Ratte gesenkt, was eine Reduktion der nozizeptiven Antwort im Formalintest zur Folge hatte. Bei Synapsin 2-Knockout-Mäusen war im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine verminderte nozizeptive Antwort im Formalintest und eine Reduktion der mechanischen Hyperalgesie bei Zymosan-induzierter Pfotenentzündung zu beobachten. Im Hot-Plate-Test zeigten die Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen kürzere Latenzzeiten. Im Gegensatz zu Synapsin 2b wurde die Rabphilin-Konzentration im Lumbalmark durch Formalininjektion in eine Hinterpfote nicht beeinflusst. Allerdings führte die Verabreichung von Metamizol (500 mg/kg i.p.) oder Diclofenac (5 mg/kg i.p.) nach 1 h zu einer Steigerung der Rabphilin-Proteinkonzentration, welche nicht von Änderungen der mRNA-Expression begleitet war. Eine Senkung der Rabphilin-Proteinkonzentration wurde durch Applikation von NOC-5 (4 - 20 µg i.t.), 8-Br-cGMP (0,5 - 2,5 µmol i.t.), oder Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,25 µmol i.t.) hervorgerufen. Zusammenfassend bestätigen diese Ergebnisse die Hypothese, dass im Rückenmark PKG-1 einen Effektor der NO-induzierten Hyperalgesie darstellt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass NO/cGMP über noch unbekannte Mechanismen die Verfügbarkeit bestimmter synaptischer Vesikelproteine moduliert, die vor allem bei starker oder anhaltender nozizeptiver Erregung für die Transmitterausschüttung und damit für die nozizeptive Transmission notwendig sind. Interessanterweise führt NO/cGMP über diese Mechanismen eher zur Hemmung der Nozizeption, was die bei niedrigen intrathekalen Dosen beobachteten antinozizeptiven Effekte von 8-Br-cGMP erklären kann. Die These der NO-induzierten Hyperalgesie kann aufgrund der Untersuchungen in dieser Arbeit und früherer Studien um eine insbesondere in niedriger Dosis auftretende NO/cGMP-vermittelte Antinozizeption erweitert werden.
An den Folgen der HIV-Infektion sind bisher mehr als 15 Millionen Menschen gestorben und die Zahl der Neuinfektionen wächst ständig. Nach Einführung der hochaktiven antiretroviralen Kombinationstherapie (HAART) 1995 konnte die HIV-Replikation im Patienten unterdrückt und der Verlauf der Krankheit verzögert werden. Aber die Bildung resistenter HIV-Stämme während der Therapie und die hohe Toxizität der Medikamente limitieren diese Erfolge. Einen neuen Therapieansatz bietet die genetische Modifikation von T-Lymphozyten zur "intrazellulären Immunisierung" der Zielzellen von HIV. Dabei werden die Zellen mit einem retroviralen Vektor transduziert und exprimieren ein antivirales Gen, das sie vor der HIV-Infektion schützt. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Laer wurde der retrovirale Vektor M87- Ineo entwickelt, der die Expression des membranverankerten Fusionsinhibitors C36/T20 auf der Zelloberfläche ermöglicht. Durch das Peptid sind die Zielzellen effizient vor der Infektion mit HIV geschützt (Hildinger et al., 2001). Das therapeutische Gen von M87-Ineo besteht aus dem Signalpeptid von LNGFR für die Translokation in das ER, dem inhibitorischen Peptid C36/T20, das von HIV-1 gp41 abgleitet ist, einem flexiblen Linker sowie aus der Transmembrandomäne von LNGFR für die Verankerung in der Plasmamembran. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser retrovirale Vektor erfolgreich für die klinische Applikation zur Gentherapie der HIV-Infektion optimiert. Ziel war es, die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu minimieren, die Expression zu erhöhen sowie der Resistenzbildung entgegenzuwirken. Der Linker im Basiskonstrukt M87-Ineo ist abgeleitet aus dem Gelenk des murinen Antikörpers von IgG2 und verleiht dem Hemmpeptid Flexibilität. Um die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu reduzieren, wurde der Linker des murinen Antikörpers IgG2 durch Gelenke ("Hinge") von humanen Antikörpern der IgG-Klasse ersetzt. Das Konstrukt mit der humanen "Hinge" von IgG2 exprimierte genauso hoch wie das Basiskonstrukt und hemmte mindestens so effizient die HIV-Replikation. Durch die N-terminale Verlängerung des C-Peptids um 10 Aminosäuren konnte das Risiko der Resistenzbildung minimiert werden. Das verlängerte C-Peptid war in der Lage, HIV-Hüllproteine zu hemmen, die gegen das C36/T20-Peptid resistent sind. Das optimierte Peptid von M87o bestand somit aus dem Membrananker von trunkiertem CD34, dem Linker von humanem IgG2 sowie aus dem verlängerten C-Peptid (C46). Weiterhin wurde ohne Verlust der Expression oder Hemmwirkung des membranverankerten C-Peptids ein RNAElement (RRE decoy) erfolgreich als weiteres Hemmprinzip in den Vektor eingefügt, um die Bildung resistenter HIV-Stämme zu unterbinden. Durch Einsatz eines optimierten Leaderelementes im retroviralen Vektor konnte die Expression des inhibitorischen Peptides mehr als verzehnfacht werden. Damit konnte das Peptid und dessen Hemmung erstmals auch in primären Zellen nachgewiesen werden. Der Vergleich zwischen dem Basiskonstrukt M87-Ineo und dem optimierten Konstrukt M87o-RRE-Ineo zeigte, dass die erhöhte Expression auch mit einer wesentlich verbesserten Hemmwirkung einherging. In Zell-Zellfusionsassays wurde außerdem nachgewiesen, dass die Wirkung des C-Peptids auf der Hemmung des Viruseintritts von HIV in die Zelle beruht. Für die klinische Applikation wurde der Vektor M87o-RRE konstruiert, der die optimalen Vektorelemente und Peptidmodule enthielt, aber aus dem das Neomycin-Resistenzgen entfernt wurde. Dies führte zu einer nochmals höheren Expression des C-Peptids sowie zur weiteren Verminderung der Immunogenität des retroviralen Vektors. Das Markergen wurde ohnehin nicht mehr benötigt, da die genetisch modifizierten Zellen aufgrund der hohen Transgenexpression einfach detektiert werden konnten. Der optimierte Vektor M87o-RRE hemmte die HIV-Replikation so effizient, dass bisher keine resistenten Stämme isoliert werden konnten. Bei Toxizitätsstudien in Maus und Rhesusmacaquen konnten keine Nebenwirkungen oder Immunogenität beobachtet werden. Durch die erfolgreiche Optimierung steht nun für die klinische Studie der Phase I der bestmögliche retrovirale Vektor zur Verfügung.
Das Philadelphia-Chromosom (Ph) ist das zytogenetische Korrelat der t(9;22). 95% der chronisch myeloischen Leukämien (CML) und 20-25% der akuten lymphatischen Leukämien (ALL) des Erwachsenen sind Ph-positiv (Ph+). Die t(9;22) führt zur Expression des chimären BCR/ABL Fusionsproteins, das für die Pathogenese der Ph+ Leukämien verantwortlich ist. Das ABL-Protein ist eine nicht-Rezeptor Tyrosinkinase. Im BCR/ABL-Fusionsprotein wird die Kinase-Aktivität von ABL, die im Normalfall streng reguliert ist, durch die Fusion mit BCR konstitutiv aktiviert. Die N-terminale BCR-"coiled-coil" Domäne vermittelt die Oligomerisierung des Fusionsproteins und dadurch zur Aktivierung der ABL-Kinase. Dies führt zur malignen Transformation hämopoetischer Zellen. Der ABL-Kinaseinhibitor STI571 ist ein tumorzellspezifisches Therapeutikum für Ph+ Leukämien, das bei der Mehrzahl der Patienten zur hämatologischen Vollremission führt. Insbesondere bei Patienten mit CML-Blastenkrise und Ph+ ALL kommt es durch klonale Selektion STI571-resistenter Zellen zu einem frühen Therapie-refraktären Rezidiv der Krankheit. Ziel dieser Arbeit war es, die Grundlagen für neue, tumorzellspezifische Therapiestrategien für die Behandlung BCR/ABL-positiver Leukämien zu legen. Im ersten Teil der Arbeit sollte geklärt werden, ob sich die "coiled-coil" Domäne als Zielstruktur für einen molekularen Therapieansatz eignet: es wurde untersucht, ob eine Hemmung der Oligomerisierung das Transformationspotential von BCR/ABL negativ beeinflußt. Der Zusammenhang zwischen Oligomerisierung und Transformationspotential von BCR/ABL wurde mit Hilfe verschiedener Fusionskonstrukte untersucht, bei denen die Oligomerisierungsdomänen verschiedener Proteinen, (BCR, PML, PLZF und TEL) mit dem ABL-Teil von BCR/ABL fusioniert wurden (X-ABL). Es konnte gezeigt werden, daß ein direkter Zusammenhang zwischen der Oligomerisierung, Transformationspotential und STI571-Sensitivität besteht: verstärkte Oligomerisierung der X-ABL Konstrukte führte zu einem ein höheren Transformationspotential und einer geringeren STI571-Sensitivität und umgekehrt. Außerdem wurde gezeigt, daß die Inhibierung der Oligomerisierung mit Hilfe eines rekombinanten Peptids das Transformationspotential von BCR/ABL erniedrigt und gleichzeitig die Sensibilität gegenüber STI571 stark erhöht. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Oligomerisierungsdomäne von BCR/ABL einen therapeutischer Angriffspunkt für die Behandlung Ph+ Leukämien darstellt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Tumorzell-spezifische Mechanismus der As2O3-induzierten Apoptose bei Ph+ Zellen untersucht. Kürzlich wurde gezeigt, daß aktiviertes RAS die Expression von endogenem PML hochreguliert. RAS wird durch BCR/ABL konstitutiv aktiviert. Bei der Akuten Promyelozytenleukämie (APL) ist PML im Rahmen der t(15;17) durch die Fusion mit RARa modifiziert. Die Behandlung von Zellen mit As2O3 führt zur Modifikation von PML durch den "small ubiquitin like modifier" (SUMO-1). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sich die Gemeinsamkeiten zwischen Ph+ CML und ALL-Blasten und den t(15;17) positiven APL-Blasten in Hinsicht auf die Sensibilität für die As2O3-induzierte Apoptose auf die direkte oder indirekte Modifikation von PML durch die jeweiligen Translokationsprodukte zurückführen lassen. In dieser Arbeit wurde mittels Überexpression von PML und konstitutiv aktiviertem RAS (RASV12) gezeigt, daß BCR/ABL durch Aktivierung des RASSignalweges die PML-Expression modifiziert und die As2O3-induzierte Apoptose Ph+ Zellen somit durch PML vermittelt wird. An einem Mausmodell der Ph- Leukämie wurde die Wirkung von As2O3 auf die normale Hämopoese sowie auf die BCR/ABL-positive Leukämie überprüft. Es konnte gezeigt werden, daß As2O3 die normale Hämopoese nicht stört und bei 25% der behandelten Tiere zu einer Verbesserung des Blutbildes und einem längerem Überleben führt. Sowohl das therapeutische Angreifen an der Oligomerisierungsoberfläche von BCR/ABL als auch das Ausnützen der Modifikation von PML durch BCR/ABL eröffnen neue Möglichkeiten zur Behandlung von Ph+ Leukämien.
Viele mikroskopische Vorgänge in Festkörpern und molekularen Verbindungen sind verbunden mit Änderungen ihres Magnetisierungszustandes. Dies macht den Einsatz externer Magnetfeldsensoren interessant, die sich über wohlbekannte Effekte kalibrieren ließen und dann im Messeinsatz quantitative Aussagen liefern können. Nun laufen viele der interessanten magnetischen Vorgänge in besagten Materialien auf sehr schnellen Zeitskalen im Piko- und Subpikosekundenbereich ab. Kein etablierter Magnetfeldsensor kann diese Anforderung leisten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine systematische Untersuchung verschiedener Ansätze zum Bau ultraschneller Magnetfelddetektoren durchgeführt. Ein Teil der Arbeit beschäftigt sich mit dem Potential photokonduktiver Ringantennen als Emitter und Detektor für ultraschnelle Magnetfelder. Ein alternativer Ansatz zur Messung transienter Magnetfelder besteht in der Verwendung magnetooptischer Sensoren, wie sie in verschiedenen Anwendungen, in denen keine Zeitauflösung gefordert wird, bereits zum Einsatz kommen (z. B. in der Faradaymikroskopie). Es wird eine für ultraschnelle Magnetooptik vielversprechende Materialklasse als Sensormaterial vorgestellt: die DMS-Systeme. Das sind magnetisch dotierte Verbindungshalbleiter, die in der Umgebung ihrer exzitonischen Resonanzen gewaltige Verdetkonstanten aufweisen. Parallel zu den DMS-Systemen wird das Verhalten eines dotierten Eisengranats untersucht, der als Ferrimagnet völlig andere Voraussetzungen als Messsensor bietet. Darüber hinaus werden verschiedene experimentelle Techniken zur Messung magnetooptischer Phänomene vorgestellt und ihre Vor- und Nachteile ausführlich diskutiert. Es wird ein Verfahren entwickelt, das trotz des Einsatzes der hochempfindlichen Differenzdetektion eine gewisse spektrale Auflösung gewährleistet und deshalb den Betrieb der DMS-Systeme als magnetooptische Sensoren erst ermöglicht. Es werden für die verschiedenen Messmethoden und magnetooptischen Materialien die Grenzen der Nachweisempfindlichkeit analysiert und ihre Eignung als schnelle Detektoren untersucht. Die verschiedenen Vor- und Nachteile der beiden Sensorsubstanzen wird anhand der gemessenen magnetischen Transienten detailliert analysiert. Anschließend wird das Optimierungspotenzial der beiden Materialklassen hinsichtlich ihrer chemischen Zusammensetzung ausgearbeitet und dargestellt.
Mithilfe der klinischen Routinemethode, TRAK-Assay®, wurden bei Patienten TSH-Rezeptor-Antikörpern (TRAK) nachgewiesen, um die Diagnose M. Basedow zu erhärten oder auszuschließen. Diese Methode ist aber nur in der Lage die Gesamtheit aller TRAK zu erfassen. In dieser Studie wurde eine andere Methode, der cAMP-Assay verwendet, bei welchem Chinesische Hamster Ovarien (CHO)-Zellen eingesetzt wurden, die auf ihrer Oberfläche stabil exprimierte humane TSH-Rezeptoren besitzen, und welcher in der Lage ist, zwischen dem Vorhandensein von funktionsstimulierenden und funktionsblockierenden Antikörpern zu unterscheiden. Die Differenzierung zwischen diesen verschiedenen Antikörper-Typen kann wichtige Hinweise dafür liefern, warum das klinische Bild bei vielen Erkrankten nicht mit dem Vorhandensein oder der Höhe der TRAK korreliert und Anhaltspunkte über die Prognose über den weiteren Verlauf der Erkrankung geben. Große Patientenkollektive von insgesamt mehr als 300 Patienten wurden auf das Vorhandensein von TRAK im Serum untersucht, getrennt nach TRAK mit stimulierender und blockierender Funktion. Neben Patienten mit M. Basedow wurden in diese Studie auch Patienten einbezogen, welche an Hashimoto-Thyreoiditis, an einer anderen Autoimmunerkrankung, an nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen oder an Thyreoiditis de Quervain erkrankt waren. Bei Patienten mit M. Basedow wurde außerdem der Einfluß der thyreostatischen Behandlungsdauer auf das Auftreten von TRAK mit stimulierender und blockierender Funktion untersucht. Material und Methode Es wurde die CHO- Zelllinie JP 26 verwendet. Die Zellen wurden kultiviert mit IMDM- Medium, 100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin, 5% FCS in einer 5%igen CO2-Atmosphäre bei 37°C. Für den cAMP-Assay wurden die Zellen in 96-Well-Platten angezüchtet. 24 Stunden später wurden die CHO-Zellen, nach Entfernung des Kulturmediums, zur Ermittlung funktionsstimulierender TRAK, mit 60 µl hypotonem KRB- Puffer, 20 µl IMBX (Isobutylmethylxanthine) und 20 µl Patientenserum für zwei Stunden inkubiert. Zur Ermittlung funktionsblockierender TRAK wurden 40 µl KRB, 20 µl IMBX, 20 µl Patientenserum und 20 µl TSH (Konz. 0,5 mU/ml) verwendet. Die cAMP-Konzentration wurde mittels eines kompetitiven Radioimmunoassays (BIOTRAK® cAMP) und eines Gamma-Counters gemessen. Ergebnisse Mit dieser Methode läßt sich zeigen, dass nicht nur bei Patienten mit M. Basedow signifikant hohe Titer mit funktionsstimulierenden und funktionsblockierenden Antikörpern vorhanden sind. Funktionsstimulierende TRAK wurden bei 25,7% der Hashimoto-Thyreoiditis-Patienten, bei 5,56% der Patienten mit schilddrüsenunabhängigen Autoimmunerkrankungen (M. Addison, Diabetes mellitus Typ 1) und bei 17,4% der Patienten mit nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen detektiert. Funktionsblockierende TRAK waren in signifikanter Höhe bei 19,15% der Patienten mit Hashimoto-Thyreoiditis, bei 27,78% mit schilddrüsenunabhängigen Autoimmunerkrankungen und bei 50% mit nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen aufzufinden. Die Gruppe der Thyroiditis-de Quervain-Patienten zeigte keine signifikanten Unterschiede im Vorkommen von Antikörpern zur Kontrollgruppe. In der Gruppe der M. Basedow-Patienten konnten bei 52,1% funktionsstimulierende Antikörper entdeckt werden. Bei den Patienten, welche weniger als vier Wochen thyreostatisch behandelt wurden, konnten in ca. 10% mehr Antikörper-positive Fälle detektiert werden, als bei Patienten mit einer Behandlungsdauer von mehr als neun Monaten. Nur 9,62% der M. Basedow-Patienten hatten laut cAMP-Assay TRAK mit blockierender Funktion. Diese verteilen sich ausschließlich auf Patienten, welche seit mindestens neun Monaten in thyreostatischer Behandlung waren. Der hier verwendete cAMP ist ein geeignetes Verfahren zur Differenzierung unterschiedlicher TRAK-Typen, was mit dem herkömmlichen TRAK-Assay® nicht möglich ist. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass Antikörper gegen den TSH-Rezeptor nicht nur bei Patienten mit M. Basedow vorkommen, sondern auch bei Patienten anderer Schilddrüsen- und Autoimmunerkrankungen. Es wird außerdem deutlich, dass eine thyreostatische Behandlung mit einer Dauer über neun Monaten bei M. Basedow-Patienten zum gehäuften Auftreten von funktionsblockierenden Antikörpern führt.
Einleitung und Zielsetzung: In der vorliegenden Arbeit sollte der Nachweis von TSH-Rezeptorantikörpern mittels eines Bindungsassays und JP26- Zellen erbracht werden. TSH-Rezeptorantikörper (TRAK) werden in Seren von vielen Patienten mit einer Autoimmunthyreoiditis entdeckt. Der in dieser Arbeit ausgewählte Radioimmunassay verwendet chinesische Hamster Ovarienzellen (CHO-Zellen), die humanen TSH-Rezeptoren exprimieren. Der Bindungsassay basiert auf dem Prinzip der Verdrängung von radioaktiv markiertem bovinem-TSH (Tracer) durch vorhandene TSH-Rezeptorantikörper im Patientenserum. Dabei ist es nicht entscheidend, ob es sich um funktionsblockierende oder funktionsstimulierende TRAK handelt. Der verwendete Bindungsassay gilt als einer der sensitivsten, kompetitiven Bindungsassays für die Detektion von TRAK und kann deshalb ein relevanter Verlaufsmarker bei Patienten mit Morbus Basedow und Hashimoto sein. Material und Methode: Die JP26-Zellen wurden ausgewählt, weil sie sich mit einer Anzahl von 2.000 TSH-Rezeptoren an ihrer Oberfläche gut mit der TSH-Rezeptordichte humaner Thyreozyten vergleichen lassen. Die verwendeten Patientenseren wurden unterteilt in 5 Gruppen: Gruppe 1: Morbus Basedow (n = 85), Gruppe 2: Kontrollgruppe (n = 76), Gruppe 3: Hashimoto-Thyreoiditis (n = 29), Gruppe 4: Andere Autoimmunerkrankungen (n = 14), Gruppe 5: Nicht-autoimmune Schilddrüsenerkrankungen (n = 38). Die Morbus Basedow-Gruppe wurde zusätzlich untergliedert in floride und länger als 9 Monate behandelte Gruppen sowie in TRAK positive und TRAK negative Gruppen: Gruppe 1A: floride und positive TRAK, Gruppe 1B: floride und negative TRAK, Gruppe 1C: behandelt und positive TRAK, Gruppe 1D: behandelt und negative TRAK. Die kultivierten JP26-Zellen wurden mit einer Zellanzahl von 300.000 Zellen / Well zusammen mit IMDM-Medium in 24-Lochplatten aufgeteilt. Am nächsten Tag wurden die in 5 %iger CO2-Atmosphäre bei 37°C inkubierten Lochplatten mit PBS gewaschen. Danach wurde 150 ml modifizierter KRB-Puffer, 50 ml Serum und 50 ml 125 I-bTSH in jede Vertiefung pipettiert. Die bestückten Lochplatten wurden diesmal bei 4°C über 24 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die JP26-Zellen mit 0,5 ml 4 °C kalten KRB-Puffers gewaschen und mit 0,5 ml 1 N Natronlauge (NaOH) gelöst. Die verbliebene Radioaktivität wurde zuletzt im gamma-Counter gemessen. Ergebnisse: Gruppe 1: 31 %, Gruppe 2: 5 %, Gruppe 3: 17 %, Gruppe 4: 0 %, Gruppe 5: 16 %. Gruppe 1A: 80 %, Gruppe 1B: 0 %, Gruppe 1C: 36 %, Gruppe 1D: 14 %. Schlußfolgerung: Die Sensitivität der TRAK-Nachweise in der MB-Gruppe war entgegen aller Erwartungen niedriger als im Routinelabor. Dies lag vermutlich auch an einer sehr hohen Affinität des verwendeten bovinen-TSH-Tracers für TSH-Rezeptoren. Es fanden sich jedoch bemerkenswerte Ergebnisse in der Gruppe der Hashimoto- Thyreoiditis und der nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen. In beiden Gruppen konnten in mehreren Seren ( 17 bzw. 16 % ) positive TRAK-Werte nachgewiesen werden. Daraus läßt sich schließen, daß die in vorliegender Arbeit angewendete Untersuchungsmethode eine höhere Sensitivität zum Nachweis von TRAK bei Hashimoto- Thyreoiditis besitzt. Gewichtige und neueste Studien, sowie Ergebnisse von Untersuchungen der gleichen Arbeitsgruppe, die sich mit zwei unterschiedlichen Assays zur Unterscheidung funktionsblockierender und funktionsstimulierender TRAK befaßt haben, stützen diese Aussage. Letztlich liegt der Schluß nahe, daß es sich bei den in diesen beiden Gruppen nachgewiesenen TSH-Rezeptorantikörpern, um überwiegend funktionsblockierende TRAK handelt. Dagegen erscheint zum TRAK-Nachweis, insbesondere funktionsstimulierender TRAK bei Morbus Basedow Patienten, die Anwendung einer auf kompetitiver Hemmung beruhende Untersuchungs-methode nur unzureichend sensitiv. Das in vorliegender Arbeit angewendete Verfahren eignet sich offenbar vergleichsweise besser zur Detektion funktionsblockierenden TRAK.
Verschiedene Nanopartikel, darunter Gelatine- und Albuminnanopartikel und Cyanoakrylatnanopartikel mit Butyl- und Hexylseitenketten, wurden in dieser Arbeit auf ihre Tauglichkeit als Trägersystem zum Einsatz für einen späteren Gentransfer in Bronchialepithelzellen erprobt. In der Zellkultur wurden dazu an primären humanen Bronchialepithelzellen und an der Zelllinie 16HBE14o Zytotoxizitätstest nach Inkubation mit oben genannten Nanopartikeln durchgeführt. Weiterhin wurden qualitative und quantitative Aspekte der Anreicherung von fluoreszenzmarkierten Gelatine- und Albuminnanopartikeln in diese Zellen mit dem konfokalen Laserrastermikroskop und dem Durchflußzytometer untersucht. Zusätzlich evaluiert wurde die inflammatorische Potenz von Gelatine- und Albuminnanopartikeln mittels einer quantitativen Interleukin-8-Bestimmung. Es konnte gezeigt werden, dass Cyanoakrylate aufgrund eines hohen zytotoxischen Effekts nicht für die Behandlung von Bronchialepithelzellen geeignet sind. Hierbei zeigten Cyanoakrylate mit kurzen Butylseitenketten eine ausgeprägtere Zytotoxizität als jene mit langen Hexylseitenketten. Gelatine- und Albuminnanopartikel hingegen zeichneten sich durch sehr geringe bis fehlende Zytotoxizität aus. Mit dem konfokalen Laserrastermikroskop konnte die Aufnahme von fluoreszenzmarkierten Gelatine- und Albuminnanopartikel in das Zellinnere von primären Bronchialepithelzellen dokumentiert werden. Erstmals wurde somit eine Nanopartikelaufnahme in Zellen nachgewiesen, die nicht zum mononukleären Phagozytensystem gehören. Die Versuche zur zellulären Aufnahme der Nanopartikel mit verschiedenen Inkubationsbedingungen zeigten, dass primäre Bronchialepithelzellen und 16HBE14o-Zellen Gelatine- und Albuminnanopartikel in einem aktiven, stoffwechselabhängigen Prozess aufnehmen, der am ehesten der Phagozytose entspricht. Ferner haben sich Albuminnanopartikel im Rahmen dieser Versuche als bioadhäsiv erwiesen. Mit dem Durchflußzytometer ließ sich schließlich eine Konzentrationsabhängigkeit der Aufnahme fluoreszenzmarkierter Gelatine- und Albuminnanopartikel zeigen und feststellen, dass alle Zellen einer Zellpopulation von primären Bronchialepithelzellen oder 16HBE14o-Zellen Nanopartikel aufnehmen. Selbst primäre Zellen, die durch die Kultur auf Membraneinsätzen auf einem hohen Differenzierungsniveau gehalten wurden, nahmen Nanoparikel auf. Eine quantitative Interleukin-8-Bestimmung zeigte schließlich, dass Gelatine- und Albuminnanopartikel keine Inflammation in primären humanen Bronchialepithelzellen und der Zelllinie 16HBE14o verursachen. Abschließend lässt sich sagen, dass die hier erprobten Nanopartikel bezüglich ihrer Zytotoxizität und ihrem inflammatorischem Potenzial als geeignet für den Gentransfer erscheinen. Die Aufnahme der Nanopartikel in das Zellinnere ist vielversprechend für eine spätere Expression von Transgenen in Bronchialepithelzellen.
Durch Integration beziehungsweise Deletion einzelner oder mehrerer Gene der Carotinoidbiosynthese wurden Cyanobakterien-Transformanten mit einem vom Wildtyp abweichenden Carotinoidgehalt oder einer veränderten Carotinoidzusammensetzung hergestellt. Anhand dieser Transformanten wurden die Auswirkungen der geänderten Carotinoidkomposition auf die Photosyntheseleistung und besonders auf den Schutz der Photosynthese vor Schädigungen durch Starklicht untersucht. Die Integration des Zeaxanthin Epoxidase-Gens aus Gentiana lutea in das Genom von Synechococcus PCC 7942 PIM8 führte zu einer Transformante Synechococcus PCC 7942 PIM8 pFP1ZE in der erstmalig die am Xanthophyllzyklus der höheren Pflanzen beteiligten Carotinoidepoxide Violaxanthin und Antheraxanthin gebildet wurden. Diese beiden zusätzlich gebildeten Carotinoidepoxide hatten keine Auswirkungen auf die Photosyntheseleistung und die Quantenausbeute von Synechococcus PCC 7942 PIM8 pFPlZE unter Schwachlichtbedingungen. Allerdings ging in dieser Transformante die maximale Photosyntheseleistung nach Inkubation im Starklicht deutlich stärker zurück als in der Kontroll-Transformante. Diese erhöhte Sensitivität gegenüber Starklicht korreliert mit dem signifikant niedrigeren Zeaxanthingehalt dieser Transformante. Die wichtige Schutzfunktion von Zeaxanthin vor Starklichtschädigungen des Photosyntheseapparates wurde durch Experimente mit Synechocystis PCC 6803 bestätigt. Es wurden durch Inaktivierung des Ketolase-Gens, des b-Carotin Hydroxylase-Gens bzw. beider Gene zusammen, Mutanten hergestellt. die entweder kein Echinenon, kein Zeaxanthin oder keines der beiden Carotinoide synthetisieren konnten. Darüber hinaus wurde in den b-Carotin Hydroxylase-defizienten Mutanten ein nicht hydroxyliertes Myxoxanthophyllderivat anstelle von Myxoxanthophyll gebildet. In den Zeaxanthin defizienten Synechocystis Mutanten ist die Photosynthese nach Inkubation in Starklicht deutlich stärker inhibiert als im Wildtyp und der Mutante ohne Echinenon. Besonders empfindlich gegenüber Starklicht erwiesen sich die Kulturen ohne Zeaxanthin und Myxoxanthophyll, wenn in Gegenwart von Methylenblau oder Methylviologen verstärkt 1O2 bzw. O2.-, H2O2 und OH. generiert wurden, In diesen Mutanten war ein drastisch erhöhter Chlorophyll- und Carotinoidabbau messbar. Um den verstärkten Abbau an Carotinoiden unter Starklichtbedingungen zu kompensieren, muss die Carotinoidbiosynthese unter diesen Bedingungen erhöht werden. In Hemmstoffversuchen konnte nachgewiesen werden, dass die Bildung von Phytoen, dem ersten Carotinoid im Syntheseweg, unter Starklichtbedingungen erhöht ist. Messungen der Transkriptmenge aller Carotinoidgene aus Synechococcus zeigten, dass die Gene der Phytoen Synthase (crtB), der Phytoen Desaturase (crtP), z-Carotin Desaturase (crtQb) sowie der b-Carotin Hydroxylase (crtR) im Starklicht hochreguliert werden. Die Gene der Lycopin lsomerase (crtH) und der Lycopin Zyklase (crtL) werden nicht auf Ebene der Transkription reguliert. Während die Erhöhung der Transkriptmenge von crtR bereits nach 15 min erfolgt und somit bereits nach 60 min eine deutlich gesteigerte Umwandlung von b-Carotin in das antioxidativ wirksamere Zeaxanthin nachgewiesen wurde, erfolgt ein Anstieg der Transkriptmenge der Gene crtB, crtP und crtQb erst nach ca. 60 min und führt damit erst wesentlich später zu einer generellen Steigerung der Carotinoidbiosynthese, um den verstärkten Carotinoidabbau im Starklicht zu kompensieren. lnkubationen von Synechococcus in Gegenwart von Substanzen, die den Redoxzustand der photosynthetischen Elektronentransportkette oder des Thioredoxinsystems modulieren, zeigten, dass nicht Licht direkt der auslösende Reiz für die Hochregulation der Carotinoidsynthese im Starklicht ist. Ein funktionierender photosynthetischer Elektronentransport ist für eine Hochregulation der Carotinoidbiosynthese erforderlich. Weder die Reduktion des Plastochinonpools noch die der zellulären Thioldisulfid-Gruppen erwiesen sich als Signal, dass in Synechococcus PCC 7942 zur Hochregulation der Carotinoidbiosynthese im Starklicht führt. Möglicherweise ist der Redoxzustand des Cytochromb6/f-Komplexes oder eine der unter Starklichtbedingungen verstärkt gebildeten ROS, wie z. B. O2- oder OH, der Reiz, der eine Steigerung der Carotinoidbiosynthese auslöst.
A gene trap strategy was used to identify genes induced in hematopoietic cells undergoing apoptosis by growth factor withdrawal. IL-3 dependent survival of hematopoietic cells relies on a delicate balance between proliferation and apoptosis that is controlled by the availability of cytokines (Thompson, 1995; Iijima et al., 2002). From our previous results of gene trap assay, we postulated that transcriptionally activated antagonistic genes against apoptosis might actually block or delay cell death (Wempe et al., 2001) causing cells to have carcinogenic behavior. The analysis attempted to better understand the outcome of a death program following IL-3 deprivation and to identify those survival genes whose expression is affected by time dependent manner. As described in the chapter 4, there would be two major conclusions evident from the three separate experiments (Genetrap, Atlas cDNA array and Affymetrix chips): Firstly 56% of trapped genes, that are up-regulated by IL-3 withdrawal (28 of 50), are directly related to cell death or survival. Secondly, unlike most array technologies, gene trapping only selects for the transiently induced genes that is independent of pre-existing steady state mRNA levels. In regarding correlations of the genes with potential carcinogenesis, the pre-existing mRNA makes difficult to describe the unique characteristics of deregulated tumor tissue genes. For a joint project with Schering (Schering AG, Berlin), the genes of our GTSTs were examined. The first screen with custom array was used to look for whether the survival genes of our GTSTs are involved in various cancer cell lines, whilst the second screen with Matched Tumor/Normal Array was used to characterize if the selected seven genes (ERK3, Plekha2, KIAA1140, PI4P5Ka/g, KIAA0740, KIAA1036 and PEST domains) are transformation-related genes or not in different tumor tissues. Twenty-six genes were identified as either induced or repressed in one or more cell lines. Genetic information is expressed in complex and ever changing patterns throughout a life span of cells. A description of these patterns and how they relate to the tissue specific cancer is crucial for our understanding of the network of genetic interactions that underlie the processes of normal development, disease and evolution. The development of cancer and its progression is clearly a multiplex phenotype, as a function of time, involving dozens of primary genes and hundreds of secondary modifier genes. There would be a major conclusion evident from the three separate experiments (Genetrap, Affymetrix mouse chip and Matched Tumor/Normal Array): ERK3 could play a significant role in breast, stomach and uterus carcinogenesis with tissue specific regulations. It is clear that ERK3 is obvious putative survival gene in these tumor tissues. Especially, in breast tumors, seven times up-regulation was considerable and the activation of ERK3 could be a feature of breast tumors. My results imply that the unique deregulation of ERK3 is perhaps the major consequence of possible transformation of normal cells into malignant cancer cells, even though further analysis remains to be determined whether an alterated activity of associated survival genes is primarily responsible for a carcinogenesis. However unlike all the other known MAP Kinases, no stimuli and no nuclear substrates of ERK3 is reported. Therefore, it will be necessary first to determine the spectrum of substrates and to identify the proximal effectors for the ERK3 in breast carcinoma cells.
Ziel dieser Arbeit war die Klärung des pathogenen Mechanismus einer Mutation im kardialen Myosinbindungsprotein C Gen. Diese Mutation (eine G-Insertion), die zu einer intern deletierten mRNA mit vorzeitigem Stop Codon führt, wurde im Rahmen einer HCM- Familienanalyse identifiziert. Ein C-terminal verkürztes MyBP-C war jedoch im Herzgewebe eines Patienten nicht nachweisbar (Moolman et al., 2000). Es stellte sich die Frage, ob die Krankheit in dieser Familie auf einen "dominant-negativen" Effekt von sehr wenigen veränderten Proteinen oder auf einen Mangel an normalem MyBP-C (Haploinsuffizienz) zurückzuführen ist. Zur Überprüfung einer möglichen Suppression des mutierten Allels auf mRNA Ebene wurde eine semiquantitative RT-PCR-Analyse myokardialer RNA durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass die nicht-mutierte mRNA in einem vierfachen Überschuß gegenüber der mutierten mRNA im Patienten-Herzgewebe vorliegt. In Modellversuchen wurde sodann die Expression der intern deletierten mRNA in transient transfizierten Zellen untersucht. Hierfür wurden drei MyBP-C cDNAs verwendet: (1) die vollständige Wildtyp cDNA (WT), (2) eine intern deletierte cDNA, die mit dem vorzeitigen Stop-Codon endet (MTI) und (3) eine cDNA, die sich nur durch die interne Deletion von der WT-Sequenz unterscheidet (MTII). Aufgrund einer Leserahmenverschiebung enthält die cDNA MTII (wie die mutierte Patienten-mRNA) zusätzlich zum nativen Stop-Codon ein vorzeitiges Terminationscodon. In COS-1 Zellen führten alle drei cDNAs zur Synthese der erwarteten Genprodukte. In neonatalen Kardiozyten wurde nur das verkürzte Protein vom Typ MTI eindeutig exprimiert. Die cDNA MTII führte nicht, bzw. nur in sehr geringem Ausmaß zur Synthese eines verkürzten MyBP-C (Western Blot). Die Analyse immunfluoreszent markierter Kardiozyten für das c-myc/MyBP-C-Fusionsprotein und für Titin ergab folgende "steady state" Expressionen: WT>MTI>>MTII. In der Mehrzahl der Zellen, die MTI oder MTII exprimierten, lagen die Rumpfproteine diffus im Cytoplasma vor, ohne eine erkennbare Veränderung der endogenen Sarkomerstruktur hervorzurufen. Ein relativ geringer Anteil von Zellen zeigte eine korrekte, sarkomere Inkorporation der verkürzten Proteine. Aufgrund der unterschiedlichen "steady state" Konzentration von MTI und MTII in Kardiozyten und aufgrund der Expressionsunterschiede in den verschiedenen Zelltypen wurde ein zelltypspezifischer und intron-unabhängiger Mechanismus vermutet, der die Suppression der Nonsense-mRNA (MTII) und damit eine Reduktion der Synthese des verkürzten MyBP-C bewirkt. Dieser Effekt wurde auf den Einfluß von Sequenzen zurückgeführt, die sich in der reifen mRNA 3' vom vorzeitigen Stop-Codon befinden. Zur Eingrenzung dieser Sequenzen wurde der Bereich zwischen dem vorzeitigen und dem nativen Stop-Codon in überlappende Fragmente unterteilt und an das Stop-Codon der cDNA MTI angefügt. Die transiente Expression dieser cDNA-Konstrukte (MTI-DSE I, II, III, I/II) führte in Kardiozyten ebenfalls zu einer reduzierten Synthese des verkürzten MyBP-C. Die erhaltenen Ergebnisse, d.h. sowohl die reduzierte Transkriptmenge des mutierten MyBP-C Allels im Patienten- Herzgewebe als auch die geringe Akkumulation verkürzter MyBP-C Proteine in transient transfizierten Kardiozyten erklären den pathogenen Mechanismus der untersuchten MyBP-C Mutation nicht vollständig. Jedoch unterstützen sie die Vermutung, dass die Abwesenheit des verkürzten MyBP-C auf einer Suppression der MyBP-C Nonsense-mRNA basiert und bekräftigen die Vorstellung, dass die HCM in der untersuchten Familie mit einem Mangel an Myosinbindungsprotein C im Myokard assoziiert ist (Haploinsuffizienz). Ein "dominant- negativer" Effekt einer sehr geringen Menge von veränderten Molekülen auf die Struktur oder auf die regulatorische Funktion der kardialen Sarkomere kann allerdings nicht völlig ausgeschlossen werden.
Die LC/MS/MS Methoden zur Quantifizierung des selektiven COX-2-Hemmers Celecoxib und des selektiven COX-1-Hemmers SC-560 wurden auf einem Sciex API 3000 Tandem Massenspektrometer mit einer TurboIon Spray Quelle entwickelt und validiert. Für Celecoxib wurden zwei Assays mit internem Standard für die Quantifizierung aus Plasmaproben und ein Assay ohne internen Standard für die Quantifizierung aus Microdialysaten entwickelt. Die Plasmaproben wurden mittels Festphasenextraktion über C18 Material extrahiert. Für die Methode CLX-1 wurde über eine RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Methanol/Wasser/NH4OH 20% 80:20:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 10-1000 ng/ml für Humanplasma und 10-500 ng/ml für Rattenplasma validiert. Für die Methode CLX-2 wurde die Chromatographie mit einer RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 85:15:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml für Humanplasma validiert. Für die Methode CLX-Microdialysate wurde die Elution über eine RP-C18 Säule (70 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 65:25:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min durchgeführt. Das Assay wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml validiert. Die Analytik von SC-560 mittels LC/MS/MS wurde für den Nachweis in Microdialysaten entwickelt. Die Microdialysate wurden mit dem Äquivalenten Volumen Acetonitril verdünnt, um den Analyten vollständig in Lösung bringen zu können. Eine RP-C18 Säule (60 x 1 mm) wurde verwendet und die chromatographische Trennung mit einem Gradientenprogramm durchgeführt. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,5-20 ng/ml für Microdialysate validiert. Die Assays wurden für pharmakologische Untersuchungen zur Wirkung und zum molekularen Wirkmechanismus von selektiven Cyclooxygenasehemmern eingesetzt. Die Rolle der Cyclooxygenase-Isoformen bei der nozizeptiven Transmission im Rückenmark wurde in der ersten Studie untersucht. SC-560 reduzierte das Schmerzverhalten der Tiere und hemmte die spinale Prostaglandinproduktion. Celecoxib hatte auf die Effekte keinen Einfluss. Die Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass die Wirksamkeit von Celecoxib bei Trauma-bedingten Akutschmerzen der Wirksamkeit unselektiv wirkender NSAIDs unterlegen ist. In der zweiten Studie wurden Die Effekte hoher Dosen von Celecoxib untersucht. In Tierversuchen mit Zymosan-induzierten Entzündungen der Hinterpfoten konnte Celecoxib bei 50 mg/kg das Ödem in der Hinterpfote reduzieren, aber nicht bei Dosierungen größer gleich 100 mg/kg. In Zellkultur konnte an Mesangiumzellen der Ratte gezeigt werden, dass eine Dosis von 50 µM Celecoxib den Transskriptionsfaktor NF-_B aktiveren kann. In einer dritten Studie wurde der Einfluss COX-abhängiger und -unabhängiger Mechanismen auf die antiproliferative Wirkung von Celecoxib untersucht. SC-560 und Celecoxib verursachten einen Zellzyklus-Block. Celecoxib beeinflusste die Expression Zellzyklus-regulierender. Celecoxib induzierte Apoptose unabhängig vom COX-2 Status der Zellen. In vivo wurde das Wachstum von COX-2 defizienten Tumoren durch Celecoxib und SC-560 reduziert. Die in vitro und in vivo Daten deuten auf COX-2 unabhängige Mechanismen der antiproliferativen Wirkung von Celecoxib hin.
Zahnwale sind die einzige Säugetiergruppe, die umfassend an ein Leben im Wasser angepasst ist und dabei ein aktives Sonarsystem zur Orientierung nutzt. Wahrscheinlich produzieren alle Zahnwalarten sonische oder ultrasonische Klicklaute, deren Echos die Tiere zu einem drei-dimensionalen "akustischen Bild" zusammensetzen. Im Gegensatz zu den meisten anderen Säugetieren produzieren Zahnwale diese Laute im Nasen-Komplex durch einen pneumatisch betriebenen Mechanismus. Jedoch spielt auch der Kehlkopf dabei eine wichtige Rolle, indem er den nötigen Luftdruck in der Nase erzeugt. Die Ergebnisse werden in Bezug auf die physikalischen Voraussetzungen eines Bio-Sonars in einer aquatischen Umwelt interpretiert. Um die morphologischen Eigenschaften (Struktur, Form, Topographie) der Organe im Kopf verschiedener Zahnwalarten vollständig zu erfassen, wurden diese mittels Computertomographie und Magnetresonanztomographie gescannt. Daraufhin wurden die Köpfe makroskopisch präpariert und histologische Schnitte von Gewebeproben angefertigt. Schließlich wurden die Ergebnisse durch digitale dreidimensionale Rekonstruktionen vervollständigt. Diese Studie basiert zum größten Teil auf der Untersuchung von Schweinswalen (Phocoena phocoena) und Pottwalen (Physeter macrocephalus). Zum Vergleich wurden fetale und postnatale Individuen anderer Zahnwalarten herangezogen wie Delphinartige (Delphinus delphis, Stenella attenuata, Tursiops truncatus), Flussdelphinartige (Pontoporia blainvillei, Inia geoffrensis) und der Zwergpottwal (Kogia breviceps). Im Allgemeinen konnte durch die morphologischen Daten dieser Studie die einheitliche "phonic lips-Hypothese der Schallproduktion bei Zahnwalen, wie sie von Cranford, Amundin und Norris [J. Morphol. 228 (1996): 223-285] aufgestellt wurde, bestätigt werden. Diese Hypothese beschreibt eine ventilartige Struktur in der Nasenpassage, den sogenannten "monkey lips/dorsal bursae complex" (MLDB) als Schallgenerator. Der pneumatische Mechanismus lässt die beiden Hälften des MLDB aufeinanderschlagen und erzeugt damit die initiale Schallschwingung im Gewebe ("phonic lips"). Diese Vibration wird über die Melone, einen großen Fettkörper in der vorderen Nasenregion der Zahnwale, fokussiert und in das umgebende Wasser übertragen. Die akzessorischen Nasensäcke und spezielle Schädel- und Bindegewebestrukturen können zu der Fokussierung beitragen. Obwohl die Echolotsignale der Schweinswale sehr spezialisiert zu sein scheinen, weisen die Übereinstimmungen in der Topographie und in der Form der Nasenstrukturen im Vergleich zu Delphinen und Flussdelphinartigen (Pontoporia und Inia) auf eine ganz ähnliche Funktion der Nase bezüglich der Produktion und Emission von Echolotschall hin. Allerdings gibt es einige anatomische Besonderheiten im Nasenkomplex des Schweinswals, welche die besondere Pulsstruktur der Sonarsignale erklären könnte. Diese werden in der Dissertation diskutiert. Bei einem Vergleich der Nasenmorphologie der Pottwale einerseits und der nicht-pottwalartigen Zahnwale andererseits fällt vor allem der Grad der Asymmetrie ins Auge. Im Gegensatz zu dem oben für Delphine und Schweinswale beschrieben Mechanismus betreiben Pottwale die Schallproduktion an den "monkey lips" mit Luft, die im rechten Nasengang unter Druck gesetzt wird (und nicht im nasopharyngealen Raum). Zudem könnte durch Änderung des Luftvolumens im rechten Nasengang die Schalltransmission zwischen den Fettkörpern, und somit die Schallemission, kontrolliert werden. In diesem theoretischen Szenario fungiert der breite rechte Nasengang als eine Art "akustische Schranke", welche zwischen zwei verschiedenen Modi der Klickproduktion wechselt: Der erste Modus mit luftgefülltem Nasengang führt zur Produktion der Kommunikationsklicks ("coda clicks") und der zweite Modus zur Aussendung von Echolotklicks, wenn der Nasengang kollabiert ist. Somit scheinen die zentrale Position und die nahezu horizontale Orientierung des rechten Nasengangs im Kopf der Pottwale als Schnittstelle (Schranke) zwischen den beiden großen Fettkörpern mit dem Mechanismus der Schallproduktion bei veränderten Luftvolumina korreliert zu sein. Die hier beschriebenen und andere Ergebnisse dieser Dissertation deuten darauf hin, dass die Gestalt und das Ausmaß der Nasenasymmetrie nicht mit der systematischen Zugehörigkeit der jeweiligen Art korrelieren, sondern durch den jeweiligen Typus des Sonarsystems als Ausdruck einer bestimmten ökologischen Anpassung bedingt sind. Bei Zahnwalen ist der Kehlkopf charakterisiert durch eine rostrale Verlängerung des Kehldeckels und der beiden Stellknorpel, die ein gänseschnabelartiges Rohr bilden, das von einem starken Sphinktermuskel umrundet und dabei in Position gehalten wird. Auf diese Weise ist das Atemrohr vollständig vom Digestionstrakt getrennt. Aus anatomischer Sicht ist es wahrscheinlich, dass die Schallerzeugung bei Zahnwalen durch eine Kolbenbewegung des Kehlkopfes in Richtung der Choanen zustande kommt, wodurch der Luftdruck im Nasenbereich erzeugt wird. Die Kontraktion des Sphinktermuskels als einem muskulösen Schlauch erzeugt wahrscheinlich die größte Kraft für diese Kolbenbewegung. Jedoch dürften die Muskelgruppen, die den Kehlkopf und das Zungenbein am Unterkiefer und an der Schädelbasis aufhängen, signifikant zur Druckerhöhung beitragen.
Entwicklung von Methoden zur Konformationsanalyse supramolekularer Komplexe in Kraftfeldprogrammen
(2003)
Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde mit dem SUPRA-Algorithmus ein Verfahren zur Berechnung der Struktur Supramolekularer Komplexe programmiert und in das Kraftfeldprogramm MOMO implementiert. Bei der Konformationsanalyse Supramolekularer Komplexe ergibt sich das Problem, dass die Anzahl der notwendigen Rechenschritte mit der Größe der zu berechnenden Struktur, genauer mit der Anzahl vorhandener Torsionsfreiheitsgrade, exponentiell ansteigt. Dieses Problem wurde umgangen, indem die Rechnung in drei kleinere Abschnitte aufgeteilt wurde. Es werden nacheinander drei Konformationsanalysen durchgeführt. Zuerst erfolgt jeweils eine Konformationsanalyse für die beiden beteiligten Einzelmoleküle. Deren Strukturen dienen dann wiederum als Eingabe für die dritte, eigentliche Konformationsanalyse des Supramolekularen Komplexes. Ziel dieser Arbeit war dann unter anderem zu überprüfen, ob trotz der Vereinfachungen diese Vorgehensweise effiziente Ergebnisse liefert. Zu Beginn wurden Berechnungen für den Komplex Adenin-Uracil durchgeführt, die Resultate stimmten mit experimentell gefundenen Paarungsmustern (Watson-Crick, reverse Watson- Crick, Hoogsteen, reverse Hoogsteen) überein. Eine weitere Rechnung am Komplex Cytosin- Guanin fand als Ergebnis Watson-Crick- und reverse Watson-Crick-Paarung. Die besten Ergebnisse wurden unter Verwendung des Ladungsmodells von Gasteiger und Marsili sowie der Wasserstoffbrücken-Potenzialfunktion von Vedani und Dunitz ohne Berücksichtigung der van-der-Waals-Wechselwirkungen erhalten. Diese Kraftfeldeinstellungen wurden im weiteren Verlauf der Arbeit als die optimalen Parameter für den SUPRA-Algorithmus beibehalten. Anschließend wurden zwei Komplexe fluormodifizierter Basenpaare berechnet, um die in einem RNA-Duplex experimentell aufgefundenen C-H...F-C-Brücken rechnerisch zu reproduzieren. Nur für eines der beiden Basenpaare konnte dieses Wasserstoffbrücken- Bindungsmuster erhalten werden, für das andere Dimer wurde die erwartete Struktur nicht gefunden. Es sollte deshalb der gesamte RNA-Duplex berechnet werden. Hierzu war das Programm MOMO nur sehr bedingt geeignet, und zwar sowohl was den Aufbau des Doppelstranges betraf als auch die Energie- und Geometrieberechnung. Trotz umfangreicher Versuche gelang es nicht, die Doppelhelixstruktur im Verlauf der Energieminimierung beizubehalten. Durch Anpassung der Kraftfeldparameter konnte aber eine stark aufgeweitete Helixstruktur berechnet werden, in welcher die modifizierten Basen nach dem experimentell gefundenen Muster gepaart waren. Außerdem wurde der SUPRA-Algorithmus anhand eines Dipyridon-Komplexes auf seine Fähigkeit getestet, Moleküle mit mehreren Torsionsfreiheitsgraden zu berechnen. Hier ergab sich wegen der konformationellen Flexibilität eine Rechenzeit von über drei Wochen. Das Ergebnis der Rechnung stimmte gut mit der experimentell gefundenen Struktur überein. Am Beispiel zweier Komplexe selbstkomplementärer Diketopiperazine sowie eines Komplexes aus N,N'-Di(tert-butyl)-melamin und 5,5-Dimethylbarbitursäure wurden Rechnungen von Komplexen aus mehr als zwei Molekülen durchgeführt. Es zeigte sich eine gute Übereinstimmung der Ergebnisse mit den bekannten Kristallstrukturen. Als letztes wurden anhand zweier selbstkomplementärer Acetylhydrazon- und dreier Diketon- Diol-Komplexe fünf unbekannte Strukturen doppelt wasserstoffbrücken-gebundener Dimere vorhergesagt. Anschließend sollte jeweils die Kristallstruktur bestimmt und mit dem Ergebnis der Vorhersage verglichen werden. Im Fall der Diketon-Diol-Komplexe gelang bisher keine Züchtung eines entsprechenden Mischkristalls, sondern die beteiligten Komponenten kristallisierten einzeln aus. Bei den zwei Acetylhydrazonen dagegen konnten Kristalle erhalten werden. Eine der Kristallstrukturen wies das mit dem SUPRA-Algorithmus vorhergesagte Dimer auf. Im Verlauf der Arbeit zeigte sich des Öfteren, dass die gewählte Strategie, die Anzahl der Startstrukturen bei der Konformationsanalyse zu begrenzen, um ein exponentielles Ansteigen der Rechenschritte zu verhindern, erfolgreich war. Mehrmals fanden sich als Ergebnis der Rechnung Strukturen von komplexgebundenen Molekülen, die sich stark von der Startkonformation eines Einzelmoleküls unterschieden, so zum Beispiel im Falle des Dipyridon-Komplexes oder der Diketon-Diol-Komplexe. Für die Zukunft sind weitere Kristallisationsversuche der Acetylhydrazone geplant, um eventuelle Polymorphe aufzufinden, bei denen sich auch eine Übereinstimmung mit der zweiten vorhergesagten Struktur zeigt. Weiterhin ist beabsichtigt, die Packungsenergien der gefundenen Kristallstruktur sowie einer theoretischen Kristallstruktur, die in ihrem Wasserstoffbrückenbindungs-Muster der mit MOMO gemachten Vorhersage entspricht, zu berechnen und zu vergleichen. Durch Einführung verschiedener Liganden in das Acetylhydrazon und Vergleich der daraus resultierenden Packungsmuster sollen Regeln über die den Kristallisationsprozess bestimmenden Einflussfaktoren abgeleitet werden. Weiterhin soll eine Reihe von anderen Verbindungsklassen synthetisiert, strukturell untersucht und berechnet werden, um so weitere Vergleiche zwischen theoretischen Vorhersagen und Kristallstruktur anstellen zu können. Für das Programm MOMO wäre wünschenswert, den Multipol-Ansatz in die Vollversion zu integrieren, um eine exaktere Berechnung von Basenstapelungs- und anderen p-p- Wechselwirkungen zu erreichen. Darüber hinaus sollte eine Parametrisierung des von S. Monz verbesserten Abraham-Ladungsmodells vorgenommen werden. Beides würde zu einer Verbesserung der Beschreibung intermolekularer Wechselwirkungen führen, welche für den SUPRA-Algorithmus relevant sind.
Der Elektronentransfer von NADH zu Sauerstoff ist ein essentieller Bestandteil im Energiehaushalt der Zelle und wird durch transmembrane Enzymkomplexe vermittelt. Hohe Geschwindigkeit und Spezifität dieser Reaktionen sind dabei von großer Bedeutung. In der Atmungskette von Paracoccus denitrificans und Thermus thermophilus wird Sauerstoff durch Cytochrom c Oxidasen umgesetzt. Beide Enzymkomplexe erhalten die für diese Reaktion notwendigen Elektronen von einem Cytochrom c552 in einer sehr schnellen bimolekularen Reaktion bei hoher Selektivität für das Partnerprotein. Hauptziel dieser Arbeit war es, lösliche Module der elektronenakzeptierenden CuA-Domäne der Cytochrom c Oxidasen zu generieren, das Kupferzentrum zu rekonstituieren und die Proteine für Wechselwirkungsstudien mit den Cytochrom c-Partnern zugänglich zu machen. Die Charakterisierung der Elektronentransferreaktionen erfolgte durch stopped-flow Spektroskopie und ermöglichte die Bestimmung der bimolekularen Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten unter verschiedenen Ionenstärkebedingungen. Ein Vergleich zwischen dem mesophilen Reaktionspaar aus P. denitrificans mit dem thermophilen aus T. thermophilus zeigte die unterschiedlichen Interaktionsmechanismen auf. Während die Reaktion in T. thermophilus weitgehend auf Ladungsinteraktionen verzichtet, wurde für die Reaktanden aus P. denitrificans eine Beteiligung von 2 - 3 Ladungen mit entgegengesetztem Vorzeichen auf jedem Protein festgestellt. Die Interaktionen wurden weiterhin durch chemical-shift-perturbation Experimente mittels NMR-Spektroskopie charakterisiert. Durch Isotopenanreicherung des Cytochroms c552 aus P. denitrificans konnten für dieses Protein Aminosäurereste identifiziert werden, die an einer direkten Bindung mit dem CuA-Partnerprotein beteiligt sind. In einem ähnlichen Ansatz wurde auch die Interaktionsfläche der löslichen CuA-Domäne aus T. thermophilus charakterisiert. Für das Cytochrom c552 aus P. denitrificans konnte gezeigt werden, daß bei direkten Kontakten zwischen den Proteinen fast keine Ladungen beteiligt sind und primär ungeladene Reste die Wechselwirkung dominieren. Ein ähnliches Bild wurde auch für die Interaktion der löslichen CuA-Domäne aus T. thermophilus mit ihrem Substrat ermittelt. Für die lösliche CuA-Domäne aus P. denitrificans konnte aufgrund der geringen Stabilität keine Zuordnung durchgeführt werden, so daß eine Charakterisierung der Interaktionsfläche nicht möglich war. Weiterhin wurde ein für T. thermophilus bisher nicht beschriebener Komplex III aufgrund von Sequenzdaten identifiziert. Eine lösliche Domäne des membranständigen Cytochrom c1 wurde in E. coIi heterolog exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. Die Elektronentransferkinetiken zum Cytochrom c552 wurden durch stopped-flow Spektroskopie aufgenommen, und das Cytochrom c1 wurde als effizienter Elektronendonor für das Protein identifiziert. Für spätere Mutageneseansätze wurde ein Plasmid-basiertes Expressionssystem für das extrem thermophile Eubakterium T. thermophilus etabliert, um Schwierigkeiten, die bei der Expression von Cofaktor-tragenden Membranproteinen auftreten können, zu umgehen. Durch Expression eines löslichen c-Typ Cytochroms und der ba3-Cytochrom c Oxidase in T. thermophilus konnte gezeigt werden, daß dieses homologe Expressionssystem funktional ist und damit rekombinante Proteine exprimiert werden können. Durch die Konstruktion von Histidin-Tags konnte die Aufreinigung der Proteine erleichtert werden und eine notwendige Abgrenzung von chromosomal kodierten Wildtyp-Formen erfolgen.
Winterroggen (Secale cereale L.) erwirbt durch längerfristiges Wachsen bei tiefen Temperaturen eine Anpassung an Kälte und Frost und entwickelt eine erhöhte Toleranz gegenüber kälte-induzierter Photoinhibierung. Diese Anpassung wird als Kältehärtung bezeichnet. Die erworbene Toleranz gegenüber kälteinduzierter Photoinhibierung geht nach drei Tagen Enthärtung bei einer Temperatur von 220C wieder verloren. Die Zielsetzung der Promotion war es, nach differentiell exprimierten Genen zu suchen, die nicht als Antwort auf kurzzeitigen Kältestreß hochreguliert werden, sondern Gene zu isolieren die im Zuge länger einwirkender Kälte in Winterroggenblättern verstärkt exprimiert werden. Werden die mRNAs aus kältegehärteten (CHL) mit den mRNAs aus enthärteten Roggenblättern (DHL) verglichen, so können Gene isoliert werden, die in CHL stärker exprimiert werden. Diese differentiell exprimierten Gene können, da sie nach Enthärtung deutlich seltener exprimiert werden, eine limitierende Funktion bei Kältehärtung einnehmen. Um diese Gene isolieren zu können wurden zwei molekularbiologische Methoden, "Suppression Subtractive Hybridisation"-PCR und "Differential Display"-PCR angewendet. Mit diesen Methoden konnten insgesamt zwölf verschiedene cDNA-Fragmente differentiell exprimierter Gene isoliert werden. Im Vergleich mit DHL sind in CHL die Transkriptmengen für neun cDNA-Fragmente isolierter Gene erhöht. Auch die Transkriptmenge des Chloroplasten-kodierte Gens für LSU ist in CHL bei einem Vergleich mit DHL gesteigert. Die isolierten cDNA-Fragmente von differentiell exprimierten Genen kodieren für Proteine aus den verschiedensten Teilbereichen des pflanzlichen Stoffwechsels und sind nachfolgend aufgelistet. Photosynthesestoffwechsel: SSU und LSU (kleine und große Untereinheit von RubisCO), LHCIIb (Lichtsammelkomplex IIb), Fructose-1,6-bisphosphatase, Transketolase, Genexpression: RNA-bindendes Protein, Transkriptionselongationsfaktor, Nucleotidstoffwechsel: UMP Synthase, Antioxidativ wirkendes Enzym: PMSR (Peptid-Methioninsulfoxidreduktase) Es konnten cDNA-Fragmente dreier bekannter Gene und eines unbekannten Gens (Klon 5C, zeigte Homologie zu einer Sequenz aus Oryza sativa) isoliert werden, deren Expression in DHL spezifisch erhöht ist. Energiestoffwechsel: H+ATPase, Pathogenabwehr/ programmierter Zelltod: Llsl Gen (lethal leaf spot Gen 1), Proteinstoffwechsel: Disulfidisomerase Neben der Analyse der Expression auf RNA-Ebene wurden Untersuchungen zur Expression auf Proteinebene vorgenommen. Western Blut Analysen zeigten, daß die geringeren Transkriptmengen von rbcS und rbcL in DHL und NHL nicht mit einem parallelen Rückgang der Proteinmengen von SSU und LSU korrelieren. Die Proteinmengen an SSU und LSU in CHL, DHL und NHL weisen keine allzu großen Unterschiede auf Sowohl die Transkiptmenge des Gens Lhcb als auch die Menge des LHCIIb-Proteins war in enthärteten Winterrogenblättern in Vergleich zu gehärteten Winterroggenblättern vermindert. Auch für das antioxidativ wirkende Enzym PMSR (Peptid-Methionin-Sulfoxid-Reduktase) konnten in CHL höhere Transkriptmengen als in DHL und in NHL nachgewiesen werden. PMSR ist ein ubiquitär verbreitetes Enzym, das eine nachgewiesene wichtige Funktion bei der Abwehr von reaktiven Sauerstoffformen (ROS) ausübt. Den bislang untersuchten antioxidativen Schutz-Systemen konnte bei der Kältehärtung keine begrenzende Funktion zugeschrieben werden. Ein Schwerpunkt der Promotion lag deshalb auf der Untersuchung vom ScPMSR als antioxidativ wirkendes Enzym im Zusammenhang mit Kältehärtung. Die Transkriptmenge an ScPMSR erhöht sich nach dem längerfristigen Einwirken von Kälte. Zur Durchführung von Immunoblot Analysen mußte zunächst ein Antikörper gegen ScPMSR hergestellt werden. Mittels eines aus einer cDNA-Bank isolierten cDNA-Klons von ScPMSR wurde rekombinantes ScPMSR-Protein in E. coli Zellen produziert und nach der Reinigung zur Herstellung spezifischer Antiseren eingesetzt. Bei dem in dieser Arbeit isolierten ScPMSR handelt es sich um ein cytoplasmatisches Isoenzym. In Western Blot Analysen mit dem ScPMSR-Antikörper konnte in Gesamtproteinextrakten aus CI-IL, DHL und NHL die ScPMSR-Proteinbande (23kDa) nachgewiesen werden. In CHL und in NHL die in niedrige Temperaturen umgesetzt wurden liegt noch eine zusätzliche Proteinbande einer Größe von 68kDa vor. Werden CHL in 220C umgesetzt wird diese Bande innerhalb von 48h deutlich schwächer. Im Gegensatz dazu verstärkt sich die 68kDa-Proteinbande kontinuierlich, wenn NHL bis zu 48h in tiefe Temperaturen gestellt werden. Die Gesamtmengen an PMSR-Protein (23 kDa + 68kDa) zeigen nicht allzu große Unterschiede bei CHL, DHL und NHL und korrelieren damit nicht mit der geringeren Transkriptmenge an PMSR in DHL und NHL. Rechnerisch könnte es sich bei dem bei Kälte gebildeten 68kDa großen Proteinaggregat um ein PMSR-Trimer handeln. Dieses Aggregat konnte allerdings in vitro durch die stark denaturierend wirkenden Stoffe Guanidinhydrochlorid und SDS nicht in nachweisbare Untereinheiten aufgelöst werden. Bei dem bei Kälte gebildeten Proteinaggregat könnte es sich um die enzymatisch aktive Form eines PMSR-Trimers handeln, das bei Kälte der Abwehr von ROS dient. Insgesamt deuten die Resultate darauf hin, daß ScPMSR bei der Kältehärtung von S. cereale von Bedeutung ist. Aufgrund der geringer Substratspezifität kann PMSR bei Kälte als weitgefächertes Reparaturenzym fungieren. Nicht zuletzt wird der zyklische Oxidations- und Reduktionsprozeß von Methionin und Methioninseitenketten auch als "sink" für ROS angesehen. Es bedarf jedoch zusätzlicher Untersuchungen, um die Rolle von ScPMSR bei Kältehärtung von Secale cereale als antioxidativ wirkendes Enzym weiter definieren zu können.
The endothelin B receptor belongs to the rhodopsin-like G-protein coupled receptors family. It plays an important role in vasodilatation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. During the course of this work, the production of recombinant human ETB receptor in yeast, insect and mammalian cells was evaluated. A number of different receptor constructs for production in the yeast P. pastoris was prepared. Various affinity tags were appended to the receptor N-and C-termini to enable receptor detection and purification. The clone pPIC9KFlagHisETBBio, with an expression level of 60 pmol/mg, yielded the highest amount of active receptor (1.2 mg of receptor per liter of shaking culture). The expression level of the same clone in fermentor culture was 17 pmol/mg, and from a 10L fermentor it was possible to obtain 3 kg of cells that contained 20-39 mg of the receptor. For receptor production in insect cells, Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with the recombinant baculovirus pVlMelFlagHisETBBio. The peak of receptor production was reached at 66 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed 30 pmoL of active receptor /mg of membrane protein. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing the active receptor was evaluated. N-dodecyl-beta-D-maltoside (LM), lauryl-sucrose and digitonine/cholate performed best, and LM was chosen for further work. The ETB receptor was produced in mammalian cells using the Semliki Forest Virus expression system. Radioligand binding assays on membranes from CHO cells infected with the recombinant virus pSFV3CAPETBHis showed 7 pmol of active receptor /mg of membrane protein. Since the receptor yield from mammalian cells was much lower than in yeast and insect cells, this system was not used for further large-scale receptor production. After production in yeast and insect cells, the ETB receptor was saturated with its ligand, endothelin-1, in order to stabilize its native form. The receptor was subsequently solubilized with n-dodecyl-beta-D-maltoside and subjected to purification on various affinity matrices. Two-step affinity purification via Ni2+-NTA and monomeric avidin proved the most efficient way to purify milligram amounts of the receptor. The purity of the receptor preparation after this procedure was over 95%, as judged from silver stained gels. However, the tendency of the ETB receptor produced in yeast to form aggregates was a constant problem. Attempts were made to stabilize the active, monomeric form of the receptor by testing a variety of different buffer conditions, but further efforts in this direction will be necessary in order to solve the aggregation problem. In contrast to preparations from yeast, the purification of the ETB receptor produced in insect cells yielded homogeneous receptor preparations, as shown by gel filtration analysis. This work has demonstrated that the amounts of receptor expressed in yeast and insect cells and the final yield of receptor, isolated by purification, represent a good basis for beginning 3D and continuing 2D crystallization trials.
In den letzten Jahren gewann die Photodynamische Therapie deutlich an Bedeutung bei der Behandlung von Neoplasien. Für die nächsten Jahren werden weitere Zulassungen für neue Indikationen erwartet. Diese Neuzulassungen werden einerseits durch neue Photosensibilisatoren und andererseits durch neue Ansätze beim Drug Targeting ermöglicht. Zur Zeit wird der Ansatz forciert, die Sensibilisatoren an einen tumorspezifischen Antikörper zu knüpfen. Eine weitere Möglichkeit für das Drug Targeting besteht darin, den Photosensibilisator an tumorspezifische Rezeptorliganden zu binden. In der vorliegenden Dissertation wird der Versuch einer Kopplung eines Photosensibilisators über einen Spacer an ein nicht steroidales Antiprogestin erarbeitet. Der Progesteron-Rezeptor wurde als Target ausgewählt, da zahlreiche Tumorarten, wie beispielsweise das Mammakarzinom, den Progesteron-Rezeptor überexprimieren. Als Leitstruktur für die Synthese der Antiprogestine wurde ein mariner Naturstoff ausgewählt. Das Cyclocymopol-Derivat besitzt den Vorteil einer im Vergleich zu Mifepriston verbesserten Selektivität für den Progesteron-Rezeptor und eines einfacheren synthetischen Zugangs. Für die Erstellung einer Bibliothek von Progesteron-Antagonisten, die auf den Cyclocymopol-Derivaten aufbauen, sind hinsichtlich der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zwei Merkmale zu beachten. Der aromatische Ring muss eine elektronenziehende Gruppe, der aliphatische Ring eine exocyclische Methylengruppe aufweisen, da diese Gruppen essentiell für die Rezeptorbindung sind. Bei der Synthese des Progesteron-Antagonisten wird zunächst ein Benzaldehyd-Derivat mit dem gewünschten Spacer verknüpft, der in der Folge mit dem Phototherapeutikum verknüpft werden kann. Im nächsten Schritt wird die Aldehydfunktion mit Natriumborhydrid zur Alkoholfunktion reduziert. Die so erhaltenen Alkohole werden anschließend mit Hilfe einer Appelartigen Reaktion in das Bromid überführt. Die Benzylbromide wurden mit Isophoron und Buthyllithium zu dem Naturstoff-Analoga umgesetzt. Durch Variieren der Reaktionsbedingungen konnten die aus der Literatur bekannten Ausbeuten erhöht werden. Für die Einführung der exocyclischen Methylengruppe in die Naturstoff-Derivate mussten zunächst verschiedene Synthesenmethoden untersucht werden. In der Literatur wurde für diesen Synthesewege bisher das Tebbe Reagenz eingesetzt, welches bei den hier eingesetzten Edukten zu keiner Reaktion führte. Es kann vermutet werden, dass die sterische Hinderung durch den Spacer die Umsetzung blockiert. In weiteren Experimenten wurde versucht, über eine Simmons-Smith-ähnliche Reaktion die gewünschte Funktionalität zu erhalten. Da auch bei dieser Reaktion das gewünschte Produkt nicht erhalten werden konnte, wurde in weiteren Ansätzen die Peterson-Olefinierung ausgewählt. Mit dieser Methode gelang es schließlich, geringe Mengen des gewünschten Produktes herzustellen. Als Nebenreaktion kam es dabei jedoch zu einer Methylierung des aromatischen Rings. Durch Anwendung der Horner-Emmons-Reaktion konnte schließlich das Antiproestin in ausreichender Menge und Reinheit erhalten werden. Es war jedoch nicht möglich, das in Abb. 7 erläuterte Zielmolekül aus dem Photosensibilisator, Spacer und Antiprogestin darzustellen.
Sozial kompetente Personen sind in der Lage, zwischenmenschliche Interaktionen zu analysieren und zielorientiert zu agieren, während sie gleichzeitig die Interessen ihrer Interaktionspartner berücksichtigen. Sozial kompetente Personen verfügen demnach über perzeptive Fähigkeiten sowie behaviorale Fertigkeiten. Diese auf Thorndike (1920) zurückgehende Definition weist Soziale Kompetenz als leistungsbezogene Persönlichkeitsvariable aus. Förderlich sollte sie sich insbesondere im Umgang mit interpersonellen Stressoren auswirken: Sozial kompetenten Personen sollte es per definitionem gelingen, den Verlauf interpersoneller Konflikte konstruktiv zu beeinflussen. Tatsache ist, dass soziale Konflikte zudem selbst-regulatorische Fähigkeiten verlangen, da nicht nur die negativen Emotionen der Konfliktpartner, sondern auch persönliche aversive Gefühle bewältigt werden müssen. In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob Soziale Kompetenz implizit auch selbstregulative Kompetenzen im Umgang mit negativen Emotionen umfasst. Diese Fragestellung wurde an N = 124 Arbeitnehmern verschiedener Branchen untersucht. Nach einer performanzorientierten Diagnose Sozialer Kompetenz mit Hilfe eines computergestützten Multimedia-Tests (lnteraktives System zur Identifikation Sozialer Kompetenzen, ISIS 2.0; Runde, Bastians, Kluge & Wübbelmann, 1999) sowie der Erhebung von Selbstkonzept- und habitueller Affektivitäts-Variablen per Fragebogen protokollierten die Teilnehmer in einer anschließenden vierwöchigen Untersuchungsphase jeweils am Ende einer Arbeitswoche, wie viele interpersonelle Spannungssituationen sie in den vergangenen Tagen mit Vorgesetzten, Kollegen und/oder Mitarbeitern erlebt und auf welche Weise sie die für sie belastendste Situation bewältigt hatten. Wider Erwarten stand Soziale Kompetenz in positivem Zusammenhang mit defensivem Konfliktverhalten, das durch das Unterdrücken negativer Emotionen, nicht deren Bewältigung gekennzeichnet war. lntegratives Konfliktverhalten, der Prototyp sozial kompetenten Konfliktmanagements, stand hingegen in positivem Zusammenhang mit nicht-leistungsbezogenen Persönlichkeitsvariablen wie statebezogener Positiver Affektivität und Allgemeiner Selbstwirksamkeit. Performanzorientiert gemessene Soziale Kompetenz umfasst demnach die Fähigkeit zur Regulation des Verhaltens, nicht die Fähigkeit zur Regulation eigener Emotionen. Bezüge dieser Ergebnisse zur Emotionsarbeit, insbesondere zu den Auswirkungen emotionaler Dissonanz, werden diskutiert.
ZIELSETZUNG: In heutiger Zeit beobachtet man in allen Bereichen der Chirurgie den Trend zu weniger traumatischen Operationen im Sinne einer minimalinvasiven Chirurgie. In der Herzchirurgie ist eines dieser Verfahren die OPCAB-Methode, eine Bypassoperation ohne Einsatz der Herz-Lungen-Maschine (off pump coronary artery grafting). Um eventuelle Vorteile dieser Methode auf die Kontraktilität des Herzmuskels zu untersuchen, wurde sie mit einer Bypassoperation unter Verwendung der extrakorporalen Zirkulation verglichen. Dazu wurde ein Leitfähigkeitskatheter verwendet, welcher die linksventrikuläre Funktion mit Hilfe von Druck-Volumen-Beziehungen vor und nach der Operation erfassen kann. METHODEN: 34 Yorkshire Duroc Schweine wurden sternotomiert und anschließend der jeweiligen OP-Methode zugeführt. Der Leitfähigkeitskatheter wurde in den linken Ventrikel eingeführt. Die Kontraktilitätsparameter wurden prä- und postoperativ gemessen. Eine Gruppe (n=11) wurde für eine Stunde einer normothermen extrakorporalen Zirkulation ausgesetzt. Eine zweite Gruppe (n=8) wurde nach der OPCAB-Methode operiert. Die dritte Gruppe (n=15) diente als Kontrollgruppe ohne Operation und extrakorporale Zirkulation. ERGEBNISSE: In der EKZ-Gruppe zeigt sich postoperativ bei allen bestimmten Kontraktilitätsparametern (ESPVR [p=0,01], dP/dt max [p<0,0001] & EF [p<0,0002]) ein signifikanter Kontraktilitätsverlust des Herzmuskels. Hinzu kommt ein signifikanter Abfall des Herzindex [p=0,0004]. In der OPCAB-Gruppe ist kein signifikanter Unterschied bezüglich der ESPVR [p=0,06] sowie der EF [p<0,65] nachzuweisen. Ebenso kommt es nicht zu einem Abfall des Herzindex [p=0,34]. Nicht ganz eindeutig stellt sich in unseren Versuchen das Ergebnis von dP/dt max [p=0,02] dar. Es zeigt einen signifikanten Unterschied, obwohl dieser von der ESPVR sowie der EF nicht wiedergegeben wird. Im intraoperativen Vergleich zeichnet sich insgesamt ein signifikanter Abfall der Herzmuskelkontraktilität während des Anlegens der Anastomose ab. In der Kontrollgruppe ist bei keinem der bestimmten Parameter im prä- und postoperativen Vergleich eine Änderung nachzuweisen (ESPVR [p=0,94], dP/dt max [p=0,75], EF [p=0,65], CI [p=0,78]). SCHLUSSFOLGERUNG: Der Einsatz der extrakorporalen Zirkulation führt zu einer signifikanten postoperativen Einschränkung der linksventrikulären Funktion. Die OPCAB-Methode führt in der sensiblen Phase des Anlegens der Gefäßanastomose ebenfalls zu einer Einschränkung der Herzmuskelkontraktilität, dennoch sind die Auswirkungen im Vergleich zur extrakorporalen Zirkulation deutlich reduziert. Im prä- /postoperativen Vergleich lässt sich kein Kontraktilitätsverlust nachweisen. Es kommt nicht zu einem Abfall der Herzleistung. Diese Studie zeigt somit einen eindeutigen Vorteil der OPCAB-Methode hinsichtlich Kontraktilität und liefert damit ein zusätzliches Argument zur weiteren Verbesserung dieser OP-Methode.
Hepatitis E virus (HEV) is a positive-stranded RNA virus with a 7.2 kb genome that is capped and polyadenylated. The virus is currently unclassified : the organisation of the genome resembles that of the Caliciviridae but sequence analyses suggest that it is more closely related to the Togaviridae. HEV is an enterically transmitted virus that causes both epidemics and sporadic cases of acute hepatitis in many countries of Asia and Africa but only rarely causes disease in more industrialised countries. Initially the virus was believed to have a limited geographical distribution. However, serological studies suggest that that HEV may be endemic also in the United states and Europe even though it infrequently causes overt disease in these countries. Many different animal species worldwide recently have been shown to have antibodies to HEV suggesting that hepatitis E may be zoonotic. Although two related strains have been experimentally transmitted between species, direct transmission from animal to a human has not been documented. Our main objective in this study is to evaluate the suitability of current available HEV antibody assays for use in low-endemicity areas such as in Germany. Methods: We selected sera on the basis of at least borderline reactivity in the routinely used Abbot EIA. Most were tested as part of routine screening of long-term expatriates in endemic countries. The following assays (recombinant antigens : ORF2 and ORF3) were used: Abbot EIA, Genelabs ELISA, Mikrogen recomBlot and a 'Prototype' DSL-ELISA. We observed a wide range of sensitivity ( average of 56.8%) and specificity ( an average of 61.4%) in these used assays. These results implies that , these assays might be unreliable for detection of HEV infection in areas where hepatitis E is not endemic. However, most anti- HEV assays have not been correlated with the HEV RNA determined by reverse transcription. Many of these unexpected results and discrepancies can be alluded to the following reasons: I. The choice and the size of the HEV antigen. II. Duration of the antibody persistence III. A cross reactivity with different agent IV. Due to geographic species V. A low sensitivity of the available assays. VI. And infection with non-pathogenic HEV strain. (zoonotic strain?). We therefore suggest that, further studies will be required to improve the sensitivity and specificity of the available commercial assays on the market.
Die Peritonitis bezeichnet eine durch Bakterien oder chemische Noxen ausgelöste Entzündung des Peritoneums. Entwickelt sich aus der lokalisierten Entzündung der Bauchhöhle durch Abstrom bakterieller Bestandteile in die systemische Zirkulation eine generalisierte Sepsis mit multiplem Organversagen, beträgt die Letalität trotz chirurgischer Herdsanierung, intensivmedizinischer Betreuung und potenter Antibiotikatherapie 20-50%. Eine entscheidende Rolle in der Abwehr der Peritonitis tragen polymorphkernige Leukozyten. PMNL werden bei einer Infektion der Abdominalhöhle durch chemotaktile Botenstoffe zum Fokus gelockt und tragen durch Phagozytose der Bakterien und Sauerstoffradikalproduktion entscheidend zur Elimination der Mikroorganismen bei. Viele Untersuchungen weisen jedoch auch darauf hin, daß überschießend aktivierte zirkulierende PMNL für die Pathologie des septischen multiplen Organversagens mitverantwortlich sind. Die vorliegende Studie dient der Charakterisierung der Sauerstoffradikalproduktion emigrierter und zirkulierender PMNL bei Patienten mit sekundärer Peritonitis. Hierfür wurde mit Hilfe der luzigenin- bzw. luminolverstärkten Chemilumineszenz die extra- sowie intrazelluläre Sauerstoffradikalproduktion polymorphkerniger Leukozyten bestimmt. Dabei wurde die Sauerstoffradikalproduktion von Patienten mit unkompliziertem Verlauf einer Peritonitis mit der der Peritonitispatienten mit systemischen Komplikationen (septischer Schock, multiples Organversagen) verglichen. Acht Patienten nach abdominalchirurgischer Operation ohne Infektion dienten als Kontrollen. Eine Aktivierung der extrazellulären und intrazellulären Sauerstoffradikalproduktion polymorphkerniger Leukozyten war durch rezeptorabhängige und rezeptor-unabhängige Stimuli möglich. Bei Patienten nach abdominalchirurgischer Operation ohne Infektion war die Sauerstoffradikalproduktion der in die Bauchhöhle emigrierten PMNL höher als die zirkulierender PMNL. Auch bei Patienten mit einer unkomplizierten Peritonitis war die Sauerstoffradikalproduktion der intraabdominalen Granulozyten stärker aktivierbar als die der zPMNL. Im Gegensatz hierzu war jedoch bei Peritonitispatienten mit systemischen Komplikationen die extrazelluläre sowie auch die intrazelluläre Sauerstoffradikal-produktion emigrierter, intraabdominaler PMNL reduziert. Die stimulierte Sauerstoff-radikalproduktion zirkulierender PMNL war bei Patienten mit schwerer Peritonitis hochgradig aktivierbar und übertraf die der emigrierten PMNL. Die hohe Sauerstoffradikalproduktion zirkulierender PMNL bei Patienten mit kompliziertem Verlauf einer Peritonitis verbunden mit einer erniedrigten Sauerstoffradikalproduktion emigrierter polymorphkerniger Leukozyten sprechen für eine überaus starke systemische Aktivierung der Leukozyten. Dagegen scheint die lokale Abwehr im Rahmen einer schweren Peritonitis supprimiert. Die bei der vorliegenden Untersuchung erfaßten hohen intraabdominalen Zytokinkonzen-trationen könnten für eine Deaktivierung emigrierter Leukozyten verantwortlich sein. Zudem könnte die systemische Hyperinflammation polymorphkerniger Leukozyten mit einer vorzeitigen Einleitung der Apoptose und konsekutiver lokaler Immunparalyse verbunden sein. Wenig ist bis heute über die Modulierbarkeit emigrierter, intraabdominaler polymorphkerniger Leukozyten durch antiinflammatorische Substanzen bekannt. Daher wurde in der vorliegenden Untersuchung die Suppression der Sauerstoff-radikalproduktion emigrierter polymorphkerniger Leukozyten durch verschiedene antiinflammatorische Substanzen erprobt. Der Einfluß dieser Substanzen auf die Phagozytoseaktivität emigrierter PMNL wurde mit Hilfe der Durchflußzytometrie evaluiert. Chloramin, Buflomedilhydrochlorid und Pentoxiphyllin konnten die Sauerstoffradikal-produktion der emigrierten polymorphkernigen Leukozyten supprimieren, ohne die Phagozytosekapazität der Leukozyten zu beeinträchtigen.
Es wurden 1000 von der Polizei in und um Frankfurt am Main in der Praxis ermittelte AAK-Messwerte und die entsprechenden BAK, die im Zentrum der Rechtsmedizin der Johann Wolfgang Goethe-Universität in Frankfurt am Main bestimmt wurden, einer statistischen Auswertung unterzogen. In die Auswertung sind alle aus den Untersuchungsunterlagen entnehmbaren Parameter, wie Geburtsdatum der Probanden, Geschlecht, Datum und Uhrzeit der AA-Entnahme, AAK, Datum und Uhrzeit der Tat, zuständiges Polizeirevier, AAK-Messgerät, BAK, Datum und Uhrzeit der Blutentnahme, eingeflossen. Die statistische Auswertung hat ergeben, dass die durchschnittliche Differenz aller AAK- und BAK-Werte bei -0,02 Promille liegt, mit einer Standardabweichung von ±0,35 Promille bei einer maximalen Differenz von -1,13 Promille nach unten und +2,81 Promille nach oben. Die Standardabweichung von ±0,35 Promille wurde als Grenzwert zur Überprüfung der Korrelation der wahrscheinlichen BAK zum Zeitpunkt der AAK-Bestimmung gewählt. Trotz der großen Spanne des Grenzbereichs von 0,7 Promille wurden nur 77,9% der AAK-BAK-Paare als korrelierend ermittelt. Bei Festlegen individueller Grenzwerte, gebildet aus der minimalen bzw. der maximalen BAK zum Zeitpunkt der AAK-Bestimmung, erwiesen sich nur noch 34,7% der Wertepaare als korrelierend. Der durchschnittliche BAK-AAK-Quotient betrug 1:2181, mit einer Standardabweichung von ±1:473. Die Quotientenspanne lag zwischen 1:0 und 1:4480. Als einziger, eindeutig nachzuweisender Faktor für die Beeinflussung der AAK-Messwerte galt die tatsächliche Höhe der BAK. Je höher die Probanden-BAK war, umso größer waren die AAK-Abweichungen von der BAK. Erwähnenswert ist, dass die AAK-Messgeräte der Firma Dräger (Alcotest® 7310 und 7410), auf Redox-Halbleiter-Gassensoren aufbauend, die indirekte BAK im Durchschnitt zu hoch, während die Brennstoffzellen-Geräte LMB S-D3 der Firma LMB Laborservice GmbH die indirekte BAK im Durchschnitt zu niedrig angaben. Die Untersuchung der Wertepaare aus AAK und minimaler BAK zum Zeitpunkt der AAKBestimmung im Vergleich zu den vom Gesetzgeber vorgegebenen Promille-Stufen für ein bestimmtes Strafmaß (0,3 Promille, 0,5 Promille, 0,8 Promille, 1,1 Promille, 1,6 Promille, 2,0 Promille, 3,0 Promille) hat ergeben, dass bei dem vorliegenden Datenmaterial 203 Probanden eine zu niedrige und 239 Probanden eine zu hohe Strafe erhalten hätten, wenn die AAK als alleiniges Maß verwendet worden wäre. Diese Fehleinschätzung wäre eingetreten, weil die AAK der Probanden über bzw. unter den oben genannten Grenzwerten lag und sich ihre BAK umgekehrt unter bzw. über denselben Werten befand. Es lässt sich feststellen, dass eine Berechnung der BAK aus dem Ethanolgehalt der Atemluft nicht möglich ist, weil viele Faktoren die AAK-Messung beeinflussen, die bisher unberücksichtigt blieben und auch von modernen, hochpräzisen AAK-Messgeräten schwerlich erfasst werden können. Daher gilt die Empfehlung, die AAK-Messung nur als Vorprobe und zum Screening zu verwenden. Bei juristischen Begutachtungen sollte nur die BAK verwendet werden, weil diese als einziger Wert präzise und beweissicher ist und außerdem über den Trunkenheitszustand eindeutig informiert. Betroffene sollten auf jeden Fall auf einer BAK-Untersuchung bestehen und die AAK als Messwert in Frage stellen.
Fragestellung: Ziel der vorliegenden Studie ist die umfassende psychologische Untersuchung aller Lebendnierenspender, die zwischen 1973 und 2001 im Frankfurter Universitätsklinikum eine Niere gespendet haben. Bisherige Untersuchungen deuten auf eine gute körperliche und psychische Gesundheit der Nierenspender hin. Diese Untersuchungen weisen jedoch zumeist eine geringe Rücklaufquote und methodische Probleme auf. Sie beschränken sich auf die Erhebung einer geringen Anzahl der immer wieder gleichen Variablen. Zudem besteht ein Mangel an langfristigen Follow-up Untersuchungen. Methode: In einem gemeinsamen Projekt der Kliniken für Nephrologie und Psychosomatik werden die Nierenspender (N=152) internistisch und psychologisch nachuntersucht. Die psychologische Untersuchung verwendet ein breites Spektrum von Erhebungsmethoden. Neben einem halbstrukturierten Interview (Dauer ca. 30 - 60 Minuten) werden vier standardisierte Fragebögen eingesetzt. Ergebnisse: Acht Spender verstarben vor Beginn der psychologischen Untersuchung - in keinem Fall als Folge der Einnierigkeit. Fünf Spender waren unauffindbar. 20 Spender wurden aufgrund von Sprachproblemen ausschließlich medizinisch untersucht und nicht in die psychologische Untersuchung mit einbezogen. 112 der verbleibenden 119 Spender konnten psychologisch untersucht werden, was einer Rücklaufquote von 94 % entspricht. Die untersuchten Spender weisen, im Vergleich zu vorliegenden Normen, überdurchschnittliche Kennwerte in verschiedenen gesundheitsrelevanten psychologischen Variablen, wie psychische Symptombelastung, Gesundheitsverhalten, Selbstwirksamkeitsüberzeugung und Kohärenzgefühl auf. Auch in einer Reihe medizinischer Variablen spiegelt sich die insgesamt gute Befindlichkeit der Lebendnierenspender wider. Fast alle Spender (97 %) geben an, dass sie sich wieder für eine Spende entscheiden würden. 91 % der Spender äußern sich als vollständig zufrieden mit ihrer Entscheidung, während nur ein Spender (1 %) die Entscheidung zur Spende bedauert. Lediglich 2 % der Spender berichten von psychologischen Komplikationen. Bezüglich der kleinen Gruppe von Spendern, für die sich mit der Nierenspende auch negative Erfahrungen verbinden, lassen sich keine eindeutigen Muster eines ungünstigen Verlaufs erkennen. Diskussion: Die Ergebnisse der Studie weisen auf eine insgesamt gute Langzeitprognose für das körperliche und psychische Wohlbefinden der Spender hin. Schlussfolgerungen für die weitere Untersuchung prognostisch relevanter Variablen zur Evaluation der Spendewilligen und die Bereitstellung eines adäquaten Beratungs- und Hilfsangebot für die Spender werden diskutiert.
Auswertungen der Ausgrabungen von Oursi, Oursi Village und Saouga führten zu einer zeitlichen Gliederung der keramischen Fundinventare. Anhand von Entwicklungen in Keramikform, -herstellung und -verzierung wurden drei Phasen unterschieden. Die frühe Eisenzeit, die zeitlich in einen Bereich von Christi Geburt bis zur Mitte des ersten nachchristlichen Jahrtausends einzuordnen ist, zeichnet sich durch die Verzierung der Randpartie mit Riefen, Ritzverzierungen auf dem Gefäßkörper in Kombination mit anderen Verzierungselementen und durch Einführung der Topfform aus. Diese Elemente unterscheiden sie von der Keramik der Endsteinzeit. Der polierte Kammstich ist das neue Verzierungselement der mittleren Eisenzeit. Um 1000 AD beginnt die späte Eisenzeit. Sie wird bis in das 14. Jahrhundert auf den Siedlungshügeln des Oudalan nachgewiesen. Mit der Einführung des Verzierungselementes "Bastroulette" sowie der Gefäßformen Flasche mit Deckel, Siebgefäße und Dreibeingefäße wird das bisherige Keramikspektrum erweitert. Bei Begehungen im Oudalan, der nördlichsten Provinz des Landes, wurden Siedlungshügel entdeckt, die an der Oberfläche die jeweils typischen Keramikelemente der eisenzeitlichen Epochen aufweisen. Die letzte Besiedlungsphase dieser Siedlungshügel läßt sich demnach ebenfalls chronologisch einordnen. Das Besiedlungsmuster während der Eisenzeit zeigt eine Bevorzugung von fruchtbaren Böden, die auf den Dünenzügen und am Fuß der Inselberge verfügbar waren, sowie die Nähe von Wasser für die Wahl des Siedlungsplatzes. Dort siedelten Menschen über lange Zeit am selben Ort. Das führte zur Akkumulation von Siedlungsabfällen und damit zur Bildung von Siedlungshügeln. Die Wirtschaftsweise während der Eisenzeit bestand aus Herstellung und Verarbeitung von Eisen. In der Eisenzeit wurde Hirse angebaut sowie Vieh gehalten (Schaf, Ziege und Rind). Darüber hinaus erweiterte das Sammeln von wilden Früchten und Samen und der Fischfang das Nahrungsangebot zur damaligen Zeit. Die Besiedlungskontinuität über 14 Jahrhunderte während der Eisenzeit des Oudalan findet im überregionalen Kontext Entsprechungen. Bei Vergleichen der Siedlungsform und der Keramikverzierung des nördlichen Burkina Faso mit anderen Regionen werden die Beziehungen zwischen den Gruppen der Savannenbevölkerung von Westafrika, aber besonders zum Bereich des Nigerbogens im südlichen Mali deutlich. Die vielfältigen Parallelen innerhalb des Fundgutes des Oudalan und des südlichen Mali vermitteln während der Eisenzeit den Eindruck einer Epoche der Stabilität, in der sich über lange Zeiträume Siedlungen entwickelten und expandierten. Auch der Austausch von Gütern mit den ländlicheren Gegenden, wie dem Oudalan, war zu dieser Zeit genauso intensiv wie mit denjenigen der Handelsrouten. Die Eisenzeit in den Savannen Westafrikas weist durch die Siedlungshügel und durch die Verwendung der unterschiedlichsten Rouletteformen als Keramikverzierung, die gleichsam als Leitform betrachtet werden können, eine einheitliche Erscheinungsform auf, die wahrscheinlich erst durch politische Umwälzungen in weiten Teilen Westafrikas um das 14. Jahrhundert zu einem Ende kam.
Die verschiedenen Typen von Nervenzellen sind durch die differentielle Expression terminaler Differenzierungsgene charakterisiert. Dies sind z.B. Gene, deren Produkte die Synthese und den Transport der verwendeten Neurotransmitter gewährleisten. Die Expression dieser Gene wird während der Entwicklung durch spezifisch exprimierte Transkriptionsfaktoren reguliert. In der Entwicklung sympathischer Nervenzellen sind Mitglieder aus der Familie der basic Helix-Loop-Helix-(bHLH)-Transkriptionsfaktoren und der paired-Homöodomänen-Faktoren identifiziert worden, deren Expression in Vorläuferzellen aus der Neuralleiste durch das Signalmolekül BMP4 induziert wird und die an der Regulation des sympathischen Phänotyps beteiligt sind. Nullmutanten des bHLH-Faktors Mash1 und des Homöodomänen-Faktors Phox2b zeigen eine stark gestörte Entwicklung der sympathischer Nervenzellen. Weitere bHLH-Faktoren, dHand und eHand, vermögen in vitro die Expression noradrenerger Differenzierungsgene in Neuralleistenzell-kulturen zu induzieren. Ob diese Faktoren in vivo eine Rolle in der entwicklungsabhängigen sympathischen Differenzierung spielen, kann im Mausmodell nicht untersucht werden, da die Nullmutanten noch vor der Sympathogenese sterben. Das Huhnembryo bietet das ideale Modellsystem, die Rolle von Transkriptionsfaktoren in vivo zu untersuchen und durch Kopplung embryologisch-experimenteller und molekularer Verfahren die Faktoren gezielt in bestimmten Geweben zu exprimieren. In dieser Arbeit werden Experimente dargestellt, welche die Rolle dieser Transkriptionsfaktoren genauer definieren. Durch die viral induzierte Expression von Phox2a und Phox2b im Huhnembryo wird gezeigt, dass die Expression dieser Faktoren ausreicht, in multipotenten Vorläuferzellen des Brachialnervs und des Hinterwurzelganglions die Differenzierung sympathischer Nervenzellen zu induzieren. Dieser Phänotyp umfasst neben der Expression typisch noradrenerger und panneuronaler Gene ebenfalls die Expression der Transkriptionsfaktoren Phox2a und -b, dHand und Cash1. Es wird gezeigt, dass dHand im Laufe der sympathischen Entwicklung noch vor den noradrenergen und panneuronalen Differenzierungsgenen exprimiert wird. Auch dHand ist in der Lage, nach viraler Misexpression in multipotenten Vorläuferzellen des Embryos Differenzierung zu sympathischen Nervenzellen auszulösen. Weiter wird gezeigt, dass die Überexpression von BMP4 im Huhnembryo dazu führt, dass undifferenzierte Vorläuferzellen im Brachialnerv zu sympathischen Nervenzellen differenzieren. Mash1 vermag nach Überexpression die Expression neuronaler Gene im Brachialnerv und umliegenden Mesoderm zu induzieren. Die Bildung sympathischer Nervenzellen im Bereich des Brachialnervs wird ebenfalls induziert. Diese exprimieren wiederum neben den noradrenergen und panneuronalen Genen auch die Transkriptionsfaktoren Phox2a/b und dHand. Die Ergebnisse zeigen überzeugend das Vermögen der Transkriptionsfaktoren Phox2a/b, dHand und Mash1 den komplexen sympathischen Phänotyp in multipotenten Vorläuferzellen aus der Neuralleiste zu induzieren. Besonders wichtig sind hierbei die Ergebnisse nach dHand-Überexpression. Hiermit wird erstmals gezeigt, dass dieser bHLH-Transkriptionsfaktor in vivo eine hervorragende Rolle innerhalb der Regulation noradrenerger und neuronaler Gene einnimmt. Die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungen zeigen darüber hinaus, dass während der Normalentwicklung in Vorläuferzellen des peripheren Nervensystems die Expression einer Gruppe von Transkriptionsfaktoren induziert wird. Deren Mitglieder werden in einer festgelegten zeitlichen und epistatischen Reihung exprimiert. Jeder Einzelne dieser Transkiptionsfaktoren ist ausreichend, in Vorläuferzellen die Entstehung sympathischer Nervenzellen auszulösen. Dabei wird die Expression der anderen Mitglieder dieser Gruppe induziert. Es handelt sich also nicht um eine lineare Kaskade von Transkriptionsfaktoren, sondern um ein Netzwerk von Faktoren, die ihre Expression gegenseitig regulieren und vermutlich gemeinsam die Expression terminaler Differenzierungsgene steuern.
Zur Erkundung der Depotfunktion von quellfähigen Tonmineralen für organische Umweltchemikalien und der möglichen Verdrängung dieser Chemikalien durch biogene Tenside wurden kinetische Untersuchungen mit Hilfe von Batch-Experimenten durchgeführt. Dabei wurde zunächst das Adsorptions- und Desorptionsverhalten von ausgesuchten Umweltchemikalien an mineralische Festphasen und danach die Verdrängung dieser Chemikalien durch biogene Tenside untersucht. Als Umweltchemikalien dienten in den Experimenten Di-(n-butyl)phthalat (DBP) und Di-(2-ethylhexyl)phthalat (DEHP), die in industriellem Maßstab hauptsächlich als Weichmacher in Kunststoffen verwendet werden und fünf ausgewählte polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), die bei pyrolytischen Prozessen sowie der unvollständigen Verbrennung organischen Materials entstehen. In den durchgeführten Versuchsreihen dienten ein smektitreicher Bentonit, Quarzsand und Gemische aus diesen beiden Stoffen mit verschiedenen Gewichtsanteilen der Bentonit- und Sandphase sowie Seesand als Adsorbermedium für die Umweltchemikalien. Diese Variationen sollten das unterschiedliche Verhalten der verschiedenen Festphasen bezüglich der drei untersuchten Prozesse (Adsorption, Desorption und Austausch) mit den Chemikalien verdeutlichen. Untersuchungen am verwendeten Bentonit ergaben, daß sein Hauptbestandteil ein Calcium- Montmorillonit war. Der Montmorillonit ist ein quellfähiges, dioktaedrisches Tonmineral aus der Gruppe der Smektite. Die Quellfähigkeit dieses Smektits wurde in Quellversuchen mit Ethylenglykol und Glycerin mittels Röntgendiffraktometrie festgestellt. Die chemische Zusammensetzung des Minerals wurde mit Röntgenfluoreszenzmessungen analysiert. Mit dem Greene-Kelly-Test wurde der Montmorillonit als smektitischer Anteil im Bentonit identifiziert. Im Laufe einer jeden Versuchsreihe sind nacheinander drei Prozesse mit jeder Probe im Labor untersucht worden: 1. Adsorption von Umweltchemikalien (Phthalate und PAK) an Sandproben mit unterschiedlichen Tongehalten und an reinen Tonproben. 2. Desorption der adsorbierten Umweltchemikalien aus den Sand/Ton-Gemischen und Tonproben in vier Schritten. 3. Austausch dieser Chemikalien aus den Sand/Ton-Gemischen und Tonproben gegen biogene Tenside. Im ersten Schritt der Batch-Experimente wurden die beiden Phthalate bzw. die PAK (Naphthalin, Acenaphthen, Fluoren, Phenanthren und Fluoranthen) aus einer wässrigen Lösung an die mineralischen Festphasen adsorbiert. Die Phthalate wurden in einem 1:1 Verhältnis in den Experimenten eingesetzt, die fünf PAK als ein Gemisch oder auch einzeln. Für die PAKAdsorption wurde auch eine Wasser-Aceton-Mischung beim Adsorptionsversuch verwendet, da sich dadurch ihre Löslichkeit erheblich verbessern ließ und die kinetischen Reihenversuche bezüglich der Gleichgewichtseinstellung wesentlich gleichmäßiger verliefen. Die Proben wurden 20 Stunden lang bis zur Einstellung des Gleichgewichts im Überkopfmischer geschüttelt. Die festen Phasen wurden danach von den wässrigen Phasen getrennt und zur Ermittlung der Einstellung des Desorptionsgleichgewichts weiterverwendet. Die wässrigen Phasen wurden mit organischen Lösemitteln extrahiert und der Gehalt an Umweltchemikalien gaschromatographisch quantifiziert. Die verbliebenen Festphasen wurden jeweils viermal mit frischem, destilliertem Wasser 20 Stunden lang zur Ermittlung des Gleichgewichts der Desorption geschüttelt, wobei nach Abtrennung der wässrigen Phasen diese auf ihren Organikgehalt hin wie oben beschrieben untersucht wurden. An diese vier Desorptionsschritte schloß sich das Verdrängungsexperiment einer Versuchsreihe an. Hierbei wurden verseifte, langkettige biogene Tenside (Alkoholate und Carbonsäuresalze mit geradzahliger Anzahl der Kohlenstoffatome) zu jeder Probe hinzugegeben und jede Festphase nochmals mit frischem Wasser im Überkopfmischer geschüttelt. In diesem Schritt sollte überprüft werden, ob die in den Festphasen verbliebenen Phthalate und PAK durch Zugabe von biogenen Tensiden in höherem Maße in der wässrigen Phase wiedergefunden werden als dies aus dem jeweiligen Desorptionsgleichgewicht zu erwarten war. Mit den Ergebnissen konnten Adsorptionsisothermen (nur für Phthalate) aufgenommen und Angaben zur Einstellung des Desorptionsgleichgewichts oder dessen Störung nach Austauschexperimenten gemacht werden. Die Auswertung der Adsorptionsexperimente ergab, daß Festphasen mit Bentonitanteil befähigt sind, einen höheren Anteil an Phthalaten und PAK zu adsorbieren als reine Sandproben. Bei kleinen Phthalatkonzentrationen wurde DEHP aufgrund einer stärkeren Affinität zur Festphase besser adsorbiert als DBP. Stiegen die Phthalatzugaben, so wurde DBP in höherem Maße als DEHP adsorbiert. Dies wurde durch eine bessere Einlagerung der DBP-Moleküle in die innerkristallinen Zwischenschichten des Montmorillonit-Minerals ermöglicht (Interkalation). Röntgenographisch wurde ein deutlich vergrößerter Wert für den Schichtabstand im Montmorillonit nachgewiesen als im ursprünglichem Zustand (bis zu 18 Å gegenüber 15,3 Å). Die Desorptionsisothermen zeigten für Festphasen mit Quarzsandanteilen häufig ein ungleichmäßiges Verhalten. So wurde häufig im zweiten und dritten Desorptionsschritt eine unerwartet hohe Menge an Phthalaten in der wässrigen Lösung gefunden. Reine Bentonitproben zeigten dagegen eine gleichmäßige Konzentrationsabnahme der Phthalate nach jedem Desorptionsschritt. Der eingesetzte Bentonit war in der Lage, Phthalate stärker von der Desorption zurückzuhalten als Quarzsand. Die Einstellung des Desorptionsgleichgewichts erfolgte mit reinem Bentonit schneller als bei Sandproben oder Sand-Bentonit Gemischen. Bei Austauschexperimenten, in denen die ursprünglich eingesetzte Menge an Phthalaten unter 1 mg lag, wurden keine Verdrängungsprozesse festgestellt. Stiegen die Konzentrationen der Phthalate (bis zu ca. 200 mg), so kam es aufgrund der größeren Oberflächenbelegung im Montmorillonit zu Verdrängungsprozessen der Phthalate durch biogene Tenside. Die Extraktion der wässrigen Lösung ergab nach dem Austauschexperiment eine höhere Menge an Phthalaten als es aus dem Desorptionsexperimenten erwartet worden war. Insgesamt wurde mehr DBP als DEHP nach den Austauschexperimenten in der wässrigen Lösung gefunden. Da DBP besser als DEHP in die Zwischenschichten des Montmorillonits eingebaut wurde, konnte auch diese Feststellung damit erklärt werden, daß biogene Tenside die Phthalate aus den innerkristallinen Zwischenschichten verdrängen. Bei PAK wurden Verdrängungsprozesse nur im Falle von Phenanthren festgestellt. Bei anderen in den Experimenten eingesetzten PAK (vorwiegend Naphthalin, Acenaphthen und Fluoren) war offenbar der Dampfdruck so groß, daß vor dem Austauschexperiment nicht mehr genügend organisches Material in der Bodenprobe adsorbiert war. Bei parallel durchgeführten Versuchen mit reinem Quarzsand und mit Seesand als Festphase wurde dagegen weder bei Phthalaten noch PAK eine wesentliche Störung des Desorptionsgleichgewichts in der Größenordnung der bentonithaltigen Proben nach dem Verdrängungsexperiment festgestellt. Dies ist ein Hinweis darauf, daß Verdrängungsprozesse bevorzugt auf Oberflächen von Tonmineralen stattfinden. Insgesamt konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, daß Gleichgewichtseinstellungen von Umweltchemikalien an Tonmineralen durch biogene Tenside gestört werden können. Durch die Einwirkung der biogenen Tenside kommt es zu einer verstärkten Desorption der Umweltchemikalien aus den Tonmineralen.
In the present study the cryo-immunogold technique was used and optimized for investigating the ultrastructure and immunolabeling of synaptic proteins. It is evidently a suitable method for the localization of membrane proteins since the antigens are not treated with any chemical denaturation before immunolabeling except for the fixation and since the antigens are directly exposed to the surface of the cryo-ultrasections. The v-SNARE VAMP II and the vesicle-associated proteins SV2 and Rab3A were detected extensively at small vesicles in the mossy fiber terminals. The t-SNARE SNAP-25, and N-type and P/Q type Ca2+ channels were allocated to the plasma membrane both at the active zone and outside the active zone. SNAP-25 and N-type Ca2+ channels appeared also at synaptic vesicles. A significantly increased immunolabeling of VAMP II, SV2, Rab3A, SNAP-25 and N-type Ca2+ channels was found at the active zones of fast synapses, indicating a concentration of these proteins at sites of exocytosis. The widespread distribution of the t-SNARE SNAP-25 at the axonal plasma membrane reveals that membrane-targeting specificity cannot be determined solely by v/t-SNARE interactions. Additional control components are required to assure the docking and exocytosis of the synaptic vesicles at active zones. The novel protein Bassoon was only found at active zones of central synapses and showed the highest specific labeling among all proteins investigated. Its labeling pattern implies an association of Bassoon with the presynaptic dense projections, the structural guide for vesicle exocytosis. The involvement of Bassoon in the organization of the neurotransmitter release site suggests that Bassoon may play an important role in determining the specificity of vesicle docking and fusion. In the neurosecretory endings of neurohypophysis the synaptic proteins VAMP II, SNAP- 25, SV2, Rab3A, and the N-type Ca2+ channels showed a preferential labeling over microvesicles. Moreover, the immunolabeling intensity of these proteins over microvesicles corresponded closely to that over synaptic vesicles. This suggests that these synaptic proteins share an identical association with synaptic vesicle and microvesicles. A significant labeling of SNAP-25, the N-type Ca2+ channels and VAMP II was also detected at the plasma membrane near the clustered microvesicles, indicating the competence of microvesicles for docking and exocytosis along the plasma membrane in the absence of active zones. No significant labeling of VAMP II, SNAP-25, SV2 and N-type Ca2+ channel was observed at the membrane of neurosecretory granules. This is in agreement with the notion that synaptic vesicles and microvesicles possess regulatory mechanisms for exocytosis different from those of granules. In contrast, a/ß-SNAP and NSF were found on the granules, and Rab3A and the P/Q-type Ca2+ channels on granules in a subset of terminals. Rab3A is associated specifically with the oxytocin-containing granule population. Interestingly, some plasma membrane proteins, such as SNAP-25 and even N-type Ca2+ channels and P/Q-type Ca2+ channels, were observed not only at the plasma membrane but also at the vesicular organelles. This suggests that these vesicular organelles may be involved in transporting newly synthesized proteins from the soma to the plasma membrane of the terminal. Furthermore, the vesicular pool of the Ca2+ channels may serve in the stimulationinduced translocation into the plasma membrane when required. Using the conventional preembedding method with Epon and the post-embedding method with LR Gold, VAMP II was localized at vesicular organelles of varying size and on horseradish peroxidase filled endocytic organelles in cultured astrocytes, with and without stimulation in the presence of the horseradish peroxidase. This indicates that VAMP II is involved in the cycle of vesicular exocytosis and endocytosis in astrocytes. U373 cells are capable of expressing all three members of the synaptic SNARE complex (v-SNARE VAMP II, t-SNARE syntaxin I and SNAP25). This indicates the competence of U373 to carry out regulated exocytosis by means of the classical SNARE mechanism. In addition, the ubiquitous v-SNARE cellubrevin and the endosome-associated small GTPbinding protein Rab5 could be expressed in U373 cells. All recombinant synaptic proteins investigated in U373 cells revealed a punctuate cellular distribution under the fluorescence microscope, suggesting that they are mainly associated with intracellular compartments. The cryo-electron microscopy provided direct evidence for the association of all expressed proteins with electron-lucent vesicular organelles. It further supports the potential of U373 MG cells to release low molecular weight messengers by a regulated exocytosis mechanism. In addition, myc-VAMP II was found on dispersed granules. Probably, VAMP II also participates in the exocytosis event of granules in U373 cells. Gold labeling for the two presumptive t-SNAREs syntaxin I and SNAP-25 in U373 cells was confined to the vesicular organelles. At the ultrastructural level no significant labeling was identified at the plasma membrane. The high level of colocalization of the two SNARE proteins VAMP II and syntaxin I in the cell body and in cell processes suggests that the two proteins are mostly sorted into identical vesicular organelles. A partial colocalization of VAMP II and cellubrevin as well as of VAMP II and Rab5 was observed under the fluorescence microscope. At the ultrastructural level, a colocalization of VAMP II and cellubrevin as well as of VAMP II and Rab5 was found on some clustered vesicles. The partial colocalization of VAMP II and cellubrevin implies that they similarly function as v-SNAREs. The partial colocalization of Rab5 with VAMP II in U373 cells suggests that the endosomal protein Rab5 is associated with VAMP II-containing organelles during some stages of their life cycle.
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stand die Untersuchung von Faktoren, die eine physiologische Funktion bei der VIP-Induktion cholinerger sympathischer Neuronen des Huhns besitzen. Die essentielle Bedeutung von neuropoietischen Zytokinen bei diesem Differenzierungsprozess wurde bereits durch Geissen et al. (1998) gezeigt. Eine weitere Eingrenzung der in vivo beteiligten Mitglieder dieser Zytokinfamilie sollte nun durch Klärung des beteiligten Rezeptorkomplexes vorgenommen werden. Hierzu wurde zunächst die Klonierung des 5'-Bereiches der Huhn-LIFRb-cDNA unter Verwendung der 5'-RACE-Technik abgeschlossen. Anschließend wurde ein antisense Ansatz etabliert, der es ermöglicht, in vivo die Signaltransduktion über die Rezeptoruntereinheit LIFRb zu blockieren. Unter Verwendung eines retroviralen Expressionsvektors RCAS(B) wurde LIFRb antisense RNA im sich entwickelnden Hühnerembryo exprimiert. Dies bewirkte eine spezifische Reduzierung der endogenen LIFRb-Expression in den infizierten Geweben, die über In situ-Hybridisierung und Immunfärbungen nachweisbar war. Die Reduktion der LIFRb hatte keinen Einfluß auf die allgemeine Entwicklung des sympathischen Ganglions. Sie führte jedoch zu einer selektiven Reduktion der VIP-Expression, wohingegen die frühe cholinerge (ChAT), noradrenerge (TH) und panneuronale (SCG10) Genexpression unbeeinflußt bleibt. Damit ist eindeutig gezeigt, daß neuropoietische Zytokine, die über LIFRb wirken, essentiell sind für bestimmte Aspekte der terminalen Differenzierung (VIP-Expression) cholinerger sympathischer Neuronen. In Anlehnung an die vorangegangene Studie sollten unbekannte Zytokine, die an den Komplex aus LIFRb- und gp130-Rezeptoruntereinheiten binden, über eine Expressionsklonierung identifiziert werden. Hierzu konnten funktionelle LIFRb-Fc/gp130-Fc Rezeptorfusionsproteine hergestellt werden, die in der Lage sind, VIP-induzierende Faktoren in HCM, RCM und AMG zu blockieren. Über Kontrollexperimente wurde ein Expressionsklonierungsprotokoll erarbeitet, das geeignet ist auf Einzelzellebene Zytokin-exprimierende Zellen zu detektieren und aus diesen die Plasmid-Information zu ermitteln. Somit wird das Verfahren als prinzipiell durchführbar erachtet. In der bisher durchgeführten Suchrunde in einer HCM-Bank gelang es jedoch nicht, neuropoietische Zytokine zu identifizieren.
Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Untersuchung einer Transferionisation am Beispiel des Stoßsystems (H + ; He), bei der ein Elektron des Targets eingefangen und ein Elektron ins Kontinuum emittiert wird. Ausgangspunkt für die theoretische Untersuchung der Transferionisation sind Experimente für das (H + ; He) Stoßsystem (1) . Unter anderem wurden beobachtet, dass die Elektronen bevorzugt in entgegengesetzter Richtung zum auslaufenden Projektil emittiert werden, dass hohe Emissionsenergien auftreten und alle Ejektile, (He 2+ , H 0 , e ), in die durch Einschuss- und Streurichtung des Projektils definierte Ebene emittiert werden. Unter der Annahme, dass zur Transferionisation hauptsächlich unabhängige Ein-Teilchen-Prozesse beitragen, wurde mit der vorliegenden Arbeit das Ziel verfolgt, das beobachtete markante Emissionsverhalten einer Transferionisation am Proton-Helium-Stoßsystem im Rahmen einer theoretischen Untersuchung zu verstehen. Dazu wurde ein Modellkonzept entwickelt, bei dem das Stoßgeschehen in einem semiklassischen nichtrelativistischen perturbativen Rahmen im Bild unabhängiger Ereignisse beschrieben wird. Das zentrale Anliegen der Modellierung war es, die Bedeutung der Targetstruktur für die Emissionseigenschaften zu klären. Hierbei interessierte der Einfluss der Struktur der Wellenfunktion auf dem Niveau des Modells unabhängiger Teilchen als auch die Rolle der interelektronischen Korrelation im Grundzustand des Targets. Der Einfluss der Targetstruktur auf das Emissionsverhalten wurde durch Einbau dreier verschiedener Wellenfunktionen für den Helium-Grundzustand untersucht: Um die Sensitivität der Rechnungen auf die strukturellen Eigenschaften der Targetbeschreibung zu untersuchen, wurden eine wasserstoffähnliche und eine Hartree-Fock-Beschreibung in das Modell implementiert. Beide bilden die Targetstruktur auf der Basis des Modells unabhängiger Teilchen (IPM) ab und enthalten per Definiton keine interelektronische Korrelation. Um den Einfluss zu klären, den die interelektronische Korrelation auf die Emissionseigenschaften hat, wurde der Eckart-Ansatz in das Modell eingebaut. Dieser Ansatz schließt radiale Anteile von Korrelation mit ein. Anhand eines systematischen Vergleichs der Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass die strukturellen Eigenschaften der Wellenfunktion zwar eine Rolle spielen, aber die Qualität der Beschreibung ohne Berücksichtigung der interelektronischen Korrelation unbefriedigend bleibt, während die Berücksichtigung der radialen Anteile elektronischer Korrelation mit dem Eckart-Ansatz verglichen mit den IPM-Ansätzen sich im Hinblick auf das Emissionsverhalten als effizient erwiesen hat. Dieser Befund legt den Schluss nahe, dass die interelektronische Korrelation im Grundzustand des Heliumatoms zum Verständnis der Emissionseigenschaften äußerst wichtig ist. Trotzem werden auch mit dem Eckart-Ansatz nicht alle Züge des Emissionsverhaltens richtig wiedergegeben. Da die Bewegungen der Komponenten eines Vielteilchenproblems voneinander abhängen, besteht Grund zu der Annahme, dass ein radialsymmetrischer Ansatz zur Beschreibung des Systems Helium nicht in der Lage ist, die experimentell beobachtete Emission von Elektronen in einer Vorzugsrichtung zutreffend zu beschreiben: Neben der Radialkorrelation ist auch die Winkelkorrelation zu berücksichtigen. Die logische Erweiterung des Modells in dieser Richtung ist die Implementation eines Konfigurationsmischungs-Ansatzes. Eine zukünftige Rechnung unter Verwendung eines Konfigurationsmischungs-Ansatzes erscheint daher im Hinblick auf eine Erklärung des Emissionsverhaltens im Bild unabhängiger Ereignisse interessant. (1) V.Mergel, Dissertation, Frankfurt am Main 1996
The focus of this study were Celtic gold coins excavated from the Martberg, a Celtic oppidium and sanctuary, occupied in the first century B.C. by a Celtic tribe known as the Treveri. These coins and a number of associated coinages, were characterised in terms of their alloy compositions and their geochemical and isotopic signatures so as to answer archaeological and numismatic questions of coinage development and metal sources. This required the development of analytical methods involving; Electron Microprobe (EPMA), Laser Ablation-ICP-MS, solution Multicollector-ICPMS and LA-MC-ICP-MS. The alloy compositions (Au-Ag-Cu-Sn) were determined by EPMA on a small polished area on the edge of the coins. A large beam size, 50µm (diameter), was used to overcome the extreme heterogeneity of these alloys. These analyses were shown to be representative of the bulk composition of the coins. The metallurgical development of the coinages was defined and showed that the earlier coinages followed a debasement trend, which was superceded by a trend of increasing copper at the expense of sliver while gold compositions remained stable. This change occurred with the appearance of the inscribed "POTTINA" coinage, Scheers 30/V. Two typologically different coinages, Scheers 16 and 18 ("Armorican Types") were found to have markedly different compositions which do not fit into the trends described above. A Flan for a gold coin, which may indicate the presence of a mint at the Martberg, was found to have an identicle weight and composition as the Scheers 30/I coins, which preceeded the majority of the coins found at the Martberg in the coin development chronology. The trace element anaylses were made by Laser Ablation-ICPMS using an AridusTM desolvating nebuliser to introduce matrix matched solution standards to calibrate the measurements, which were then normalised to 100%. Quantitative results were obtained for the following elements: Sc, Ti, Cr, Mn, Co, Ni, Cu, Zn, Se, Ru, Rh, Pd, Ag, Sb, Te, W, Ir, Pt, Pb, Bi. The remaining elements remain problematic as they produced incorrect standardisations mainly due to chemical effects in solution such as adsorption onto the beaker walls or oxidation : V, Fe, Ga, Ge, As, Mo, Sn, Re, Os, Hg. Changes in the sources of Au, Ag and Cu were observed during the development of the coinages through the variation of trace elements, which correlate positively with the major components of the coin alloys. Changes in the Pt/Au ratios show that the Scheers 23 coins contain distinctly different gold from the later coinages and that the Scheers 18 gold source was also different. Te/Ag was used to show that the Sch.23 coins also contained different silver and some subgroups were observed in the Sch. 30/V coins. A major change in copper source is indicated by the sudden increase of Sb and Ni with the introduction of the Sch. 30/V coins (POTTINA), which can be linked to a similar change in copper observed in the contemporary silver coinage, Sch. 55 (with a ring). Lead isotopic analyses were made by solution- and Laser Ablation - MC-ICP-MS, The laser technique proved to be in good agreement with the solution analyses with precisions between 1 and 0.1%o (per mil). The development of the laser method opens the way for easy and virtually non-destructive Pb isotopic determinations of ancient gold coins. The results showed that Sch. 23 is very different from the following coinages, Sch. 16 and 18 are also different, forming their own group, and all the later "Eye" staters (Sch. 30/I-VI) lie on a mixing line controlled by the addition of copper from a Mediterranean source, probably Sardinia or Spain. An indication of gold and silver sources should be possible with further analyses of the Sch. 23 and Rainbow Cup gold coins and the Sch. 54 and 55 silver coinages. Copper Isotopic analyses were made by solution- and Laser Ablation - MC-ICP-MS. Both techniques require further development to produce more reproducible results. The results show that there appears to be a trend to more positive d Cu65 values for the later coinages and that the link between the copper used in the Sch. 30/V (POTTINA) coins and the silver Sch. 55 (with a ring) coins is also shown by similarly postive d Cu65 values. The full suite of analyses were also made on samples of gold from the region. They were mostly composed of "placer gold", alluvial gold found in rivers. It was found that when a study is restricted to a limited number of deposits or areas then it is possible to distinguish between deposits based on the concentration of those elements which are least affected by transport related alteration processes. These elements include; the PGE's, due to their refractory nature, and those elements which are usually present in high enough concentrations to remain relatively unaffected, eg: Cu, Pb and Sb. Due to the nature of the coin alloy it is not possible to link the gold used in the coins studied here with gold deposits, as the large amounts of Ag and Cu, added to the coin alloys, have masked the Au signature. However, further Pb isotopic analyses of gold deposits should prove useful in determining from which regions Celtic gold was derived.
In dieser Arbeit wurde das Potential von CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen (HSC) und Endothelprogenitorzellen (EPC) aus peripherem Blut bzw. Nabelschnurblut sowie von aus diesen Vorläuferzellen differenzierten Zellen als Zielzellen für die Gentherapie der Hämophilie A untersucht. Der Gentransfer erfolgte mit einem lentiviralen Vektorsystem der zweiten Generation, das einen bicistronischen Transfervektor mit internem CMV-Promotor, einer FVIII-cDNA mit Deletion der B-Domäne, einem IRES-Element und dem EGFP-Gen als Markergen enthielt. Das Vektorsystem wurde zunächst für die Transduktion humaner hämatopoetischer Zellinien verwendet, die verschiedene Leukozytentypen repräsentierten, um es in bezug auf Gentransfereffizienz und FVIII-Expressionsstärke zu evaluieren. Im Rahmen dieser Versuchsreihe konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß hämatopoetische Zellen grundsätzlich in der Lage sind, FVIII zu sezernieren. Zugleich verwiesen die Befunde auf mögliche Expressionsprobleme, da trotz durchweg erfolgreichen Gentransfers und FVIII-Transkription nur in den Überständen von vier der sechs charakterisierten Zellinien FVIII-Protein meßbar war. In anschließenden Experimenten mit humanen und murinen HSC sowie humanen Granulozyten und Makrophagen konnte nach lentiviralem Gentransfer keine Sezernierung von FVIII-Protein detektiert werden. In expandierten humanen HSC wurden jedoch FVIII-mRNA und intrazelluläres FVIII-Protein detektiert, so daß in diesen Zellen ein Exportdefekt für das FVIII-Protein vorzuliegen schien. Da hämatopoetische Zellen und Endothelzellen mit dem Hämangioblasten eine gemeinsame Vorläuferzelle besitzen, wurde zudem geprüft, ob aus CD34-positiven Stammzellen generierte Endothelprogenitorzellen (EPC) in der Lage sind, therapeutisch relevante FVIII-Mengen zu sezernieren. In Anwesenheit von VEGF, FGF-2, SCF und SCGF-beta wurden adhärente Zellen gewonnen, die aufgrund des Musters der Expression von Oberflächenmarkern und durch ihr Verhalten im Matrigel-Assay einen eindeutig endothelialen Phänotyp besaßen. Diese Zellen wurden (bezogen auf die Zahl der eingesetzten CD34-positiven Zellen) um bis zu neun Größenordnungen expandiert. Nach lentiviraler Transduktion der Zellen, die weder das Proliferationspotential der Zellen noch ihren Phänotyp veränderte, wurde eine hocheffiziente FVIII:C-Sezernierung (7,0-7,8 IU/10 hoch 6 Zellen/48 Std.) gemessen. Im ELISA fielen leicht erhöhte FVIII:Ag-Werte auf, und eine nachfolgende Western Blot- Analyse legte nahe, daß dies auf unvollständige intrazelluläre Spaltung des FVIII-Polypeptids in schwere und leichte Kette zurückführbar sein könnte, die sich wegen der weiteren proteolytischen Aktivierung im Plasma jedoch nicht negativ auf die Gerinnungsaktivität in vivo auswirken sollte. Die Befunde dieser Arbeit identifizieren EPC aus CD34-positiven Nabelschnurblutzellen als potentielle Zielzellen für eine FVIII-Substitution nach ex vivo-Gentransfer, da sie sich nicht nur durch ihr hohes Expansionsvermögen auszeichnen, sondern auch durch die Fähigkeit zur rekombinanten FVIIISezernierung auf sehr hohem Niveau, das nur wenig unter dem FVIII-Sekretionspotential humaner Hepatozyten liegt. Primäre hämatopoetische Zellen sind aufgrund eines Exportdefektes zwar nicht direkt für eine FVIII-Substitution, möglicherweise aber für eine Toleranzinduktion geeignet.
In der vorliegenden Arbeit wurden Tauben daraufhin trainiert, in einer Außenvoliere verstecktes Futter zu finden. Nachdem die Tauben diese Aufgabe erlernt hatten, fand keine weitere Verbesserung des Wiederfindeverhaltens statt. Die komplexe Aufgabe, drei aus 48 möglichen Bechern auszuwählen, wurde mit einer überraschend hohen Präzision von den Tauben gelöst. Zudem erwies sich das Ortsgedächtnis als zeitlich äußerst stabil. Die Ergebnisse meiner Arbeit belegen zum ersten mal, dass Brieftauben (Columba livia) in der Lage sind, sich über einen Zeitraum von mindestens 5 Jahren einmal erlernte Orte zu merken, ohne dabei vermehrt Fehler zu machen. Unterschiedliche Fehlerquoten konnten infolge der unterschiedlichen Anordnung der Futterverstecke gefunden werden. Dabei war es für Tauben offensichtlich schwieriger, Futterverstecke in einer flächigen Anordnung aufzusuchen. Die Taubengruppen, deren Zielbecher in einer Reihe angeordnet waren, zeigten eine stärkere Reihenfolgepräferenz beim Aufsuchen der Futterverstecke. Diese Reihenfolgepräferenz führte zu einer geringeren Fehlerquote. Der Sonnenkompass scheint beim Aufsuchen der Futterverstecke für die Brieftauben eine wichtige Rolle zu spielen. Alle vier untersuchten Taubengruppen reagierten auf eine Verstellung der inneren Uhr mit einer Abweichung ihrer Richtungspräferenzen in die erwartete Richtung. Dabei sind Unterschiede in der Stärke dieser Abweichung zwischen den Gruppen und zwischen einzelnen Individuen feststellbar. Diese Abweichung ging wieder zurück, sobald die innere Uhr der Tiere wieder dem natürlichen Tagesrhythmus angepasst war. Diese Beobachtung kann als weiterer Beleg für das Nutzen des Sonnenkompasses in der Voliere zum Auffinden von Futterorten gewertet werden. Aber auch die Landmarken in der Umgebung der Versuchsvoliere werden als Orientierungsparameter von den Tauben genutzt. So erhöhte sich die Fehleranzahl deutlich, wenn die Voliere nach außen hin abgeschirmt wurde. Dieser Effekt verstärkt sich, wenn zusätzlich zur Abschirmung bei bedecktem Himmel die Sonne nicht mehr sichtbar ist. Offensichtlich nutzen die Tauben zur Orientierung im extremen Nahbereich, genau wie in der Fernorientierung, ein multifaktorielles System. Fällt einer der Faktoren aus, wie beispielsweise die Sonne, kann auf ein anderes System zurückgegriffen werden. Die Tauben waren auch bei der Manipulation zweier Orientierungssysteme, wie dies bei der Abschirmung der Voliere von den äußeren Landmarken bei gleichzeitigem bedecktem Himmel der Fall war, immer noch in der Lage, Futterorte zu finden. Dies spricht für das Vorhandensein weiterer Orientierungsfaktoren. Welcher Art diese Faktoren sind, könnte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Mechanismus der funktionell relevanten Kopplung von Kontaktallergenen in dendritischen Zellen
(2002)
Über die Signaltransduktion in Langerhanszellen, den antigenpräsentierenden Zellen der Epidermis, ist bisher nur wenig bekannt. Mit ein Grund dafür ist die schlechte Verfügbarkeit reiner Langerhanszellen aufgrund ihrer geringen Zahl und der schwierigen Präparation, die häufig schon zur Voraktivierung dieser Zellen führt. Humane unreife und reife dendritische Zellen erwiesen sich als geeignete Modellzellpopulation für kutane antigenpräsentierende Zellen. Mit Hilfe dieser Modellzellen wurde die Beteiligung von zentralen Signaltransduktionswegen nach Interaktion mit dem Kontaktallergen TNCB untersucht. 1. Zum ersten Mal wird gezeigt, dass TNCB in den ersten 10 Minuten nach der Haptenisierung bei dendritischen Zellen intrazellulär lokalisiert ist. Die Stimulation von DC mit dem starken Kontaktallergen TNCB führte zu einer Aktivierung der ERK1/2 MAP Kinase. Dieses Ergebnis entspricht der Vorstellung, dass starke Kontaktallergene in subtoxischen Konzentrationen zellulären Streß bei MAP Kinasen auslösen und somit zu einer für die Kontaktallergie typischen Antigenpräsentation führen. 2. Die Tyrosinphosphorylierung wurde bereits in vorausgegangenen Arbeiten (Kuhn, 1998; Brand, 2002) als Charakteristikum für haptenbehandelte Monozyten und humane dendritische Zellen herausgestellt. Diese Ergebnisse konnten mit humanen unreifen und reifen DC weitergeführt werden. Proteinbiochemisch ergab das Kontaktallergen TNCB ein spezifisches und reproduzierbares Muster hyperphosphorylierter Proteinbanden. Der gemessene Anstieg an Phosphotyrosin beruhte auf der gesteigerten Aktivität von Protein Tyrosin-Kinasen. 3. In weiteren Untersuchungen wurden Proteine massenspektrometrisch analysiert, die tyrosinphosphoryliert waren und gleichzeitig TNCB gebunden hatten. Es wurden drei Proteine identifiziert: Gewebstransglutaminase bei 74-80kD, Thyroidhormon Bindeprotein bei 58kD und Aktin bei 38kD. Nach Literaturrecherchen war die Transglutaminase am vielversprechendsten und wurde auf ihre Aktivität innerhalb der Kontaktallergen-induzierten Signaltransduktionskaskade hin untersucht. Drei strukturell verschiedene Stoffe, das Kontaktallergen TNCB, die Retinsäure (RA) und ein Phorbolester (PMA) induzierten eine starke, proteinbiochemisch meßbare Tyrosinphosphorylierung der ERK1/2 MAP Kinase. Aus der Literatur war die RA für eine Aktivierung der tTG bekannt (Antonyak et al., 2002) und PMA als Stimulator der ERK1/2 MAP Kinase (Chen et al., 2002; Lee et al., 2002) - aus diesem Grund wurden sie als Positivkontrolle mitgeführt. 4. Mittels Immunpräzipitation wurde der Nachweis, dass TNCB an die tTG bindet, erbracht. Dies war der erste Indikator für eine Bedeutung der tTG als Zielstruktur für ein Kontaktallergen. 5. TNCB, RA und PMA lösen eine gesteigerte Transamidierungsaktivität der tTG aus, die essentiell zur Induktion der ERK-Phosphorylierung ist. Dies wurde durch einen Transamidierungs Aktivitäts Assay bestimmt (Zhang et al., 1998), einem Nachweis der tTG Aktivität mittels Inkorporation von biotinylierten Polyaminen in lokale Proteine. 6. Sowohl die tTG Aktivität als auch die ERK-Phosphorylierung nach TNCB Stimulation konnten durch den spezifischen Inhibitor der Transamidierungsaktivität der tTG MDC gehemmt werden. Dies war ein zweiter Hinweis, dass die enzymatische Aktivität der tTG eine große Rolle spielt. Das gleichzeitige Ausbleiben der Transamidierung und der ERK-Phosphorylierung deutet auf den deutlichen Einfluß der tTG auf den Signaltransduktionsweg der ERK1/2 MAP Kinase hin. Analysen mit anderen starken Kontaktallergenen, wie z.B. Thiomersal und Chlormethylisothiazolon/ Methylisothiazolon bieten zukünftige Forschungsansätze zur weiteren Charakterisierung der funktionellen Bedeutung der tTG und des ERKWeges. Interessant wären auch Untersuchungen zur Hochregulation der tTGExpression in DC von 24-72 Stunden nach einer Inkubation mit TNCB, RA und PMA. Auch sind weitere Untersuchungen zur Signaltransduktionskaskade im Hinblick auf die erforderlichen, nachgeschalteten Elemente interessant, wie z.B. der von der tTG aktivierten Protein B Kinase AKT (Antonyak et al., 2002) sowie beteiligter Kinasen des ERK-Weges.
Role in routing to the plasma membrane of the L 0 domain of the multidrug resistance protein MRP1
(2003)
Die mehrfache Chemotherapieresistenz (Multidrug Resistance) beruht auf vermehrtem Transport von Xenobiotika aus der Zelle, was zu einer dramatischen Verringerung der intrazellulären Konzentration von chemotherapeutischen Substanzen führt. Dieser Effekt wird von transmembranen Transporter-Proteinen der ABC-Familie verursacht. Zu dieser Familie gehört MRP1, die eine große Vielfalt an Substraten transportieren kann. MRP1 ist ein 190 kDa Glykoprotein mit einer vermuteten Topologie, die zusätzlich zum typischen P-gp ähnlichen Kern (Delta MRP1) eine amino-proximale transmembrane Domäne aufweist, die aus fünf transmembranen Alpha-Helices besteht. Sie ist durch einen cytoplasmatischen Verbindungs-Loop (L0) mit Delta MRP1 verbunden. Wenn MRP1 in polarisierten Zellen exprimiert wird, wird es zu der basolateralen Membran geleitet. In der vorliegenden Arbeit sollte nun die Funktion des amino-terminalen Bereichs von MRP1, der aus der ersten transmembranen Domäne TMD0 und dem cytoplasmischen Verbindungs-Loop L0 besteht, durch Expression und Koexpression von diversen MRP1 Mutanten in polarisierten MDCKII Zellen untersucht werden. Es wurde gezeigt, dass in der L0 Region eine amphipathische Helix vorhanden ist, die für die Funktionalität der MRP1 notwendig ist; dass das isolierte L0-Peptid in der Lage ist, sich mit Delta MRPI zu assoziieren (dadurch erlangt das Protein wieder seine Funktion und lokalisiert sich in der basolateralen Membrane); dass TMD0L0 sich teilweise in der basolaterale Membrane befindet und dass seine Anwesenheit genügt, um die Glycosilierung (Fig. 4.17 in der Dissertation) und die Lokalisierung in der basolateralen Membrane des Delta MRP1 zu ermöglichen (Fig. 4.18 in der Dissertation); dass die Koexpression der zwei komplementären Fragmente eine wild-type-ähnliche Transportaktivität ergibt (Fig. 4.19 in der Dissertation) und dass die beiden Fragmente interagieren (Fig. 4.21 in der Dissertation). Es wurde ausserdem ein chimerisches Protein hergestellt, welches aus TMD0 von MRP1 und L0 von MRP2 besteht und in MDCKII und MDCKII-Delta MRP1 Zellen exprimiert. Es wurde festgestellt, dass das unvollständig glycosiliert ist (Fig. 4.24 in der Dissertation) und dass es sich im endoplasmatischen Reticulum lokalisiert (Fig. 425 in der Dissertation).
Die Komplexität des durch 2-Aminoacetophenon (AAP) ausgelösten "Untypischen Alterungstones" (UTA) in Weinen wurde im Zusammenhang mit pflanzenbaulichen und mikrobiologischen Einflussfaktoren diskutiert. Neben einem Überblick über den Stand der Forschung wurde der Wirkzusammenhang zwischen Pflanzen- und Mikroorganismenstress verdeutlicht. Indol-3-essigsäure (IAA) gilt als wesentliche Vorstufe für die Bildung von AAP. Die Funktion und Wirkung des Pflanzenhormons IAA wurde vorgestellt, um die Bildung und den Stoffwechsel in der Pflanze in Verbindung mit der Metabolisierung durch Mikroorganismen zu diskutieren. Die mögliche Bedeutung des Elicitors Jasmonsäure konnte gezeigt werden. Um die Faktoren der typischen Weinentwicklung von denen der atypischen zu trennen, wurden zunächst die Einflüsse verschiedener Rebsorten, Rebsortenklone und der Gärungsbedingungen als substratdeterminierende Faktoren für die Hefen durch Mikrovinifikationen und Modellgärungen auf wertbestimmende Inhaltsstoffe untersucht. Die Zusammenhänge zwischen Umwelt- und Substrateinflüssen einerseits und dem Auftreten des UTA andrerseits wurden untersucht. Zum Schutz der Pflanze vor UV-B-Strahlung wurde ein Absorber in die Laubwand bzw. Traubenzone versprüht. Der Einfluss kurzwelliger energieintensiver Strahlung (UV-B) auf die Bildung fehltonrelevanter Verbindungen wie AAP und Skatol wurde festgestellt. Die in Verbindung mit dem UTA stehenden Substanzen AAP und Skatol konnten durch UV-B-Schutzmassnahmen sowie einer Blattdüngung und einer Argininsupplementierung des Mostes reduziert werden. Die Bildung wertbestimmender Inhaltsstoffe während der Weinbereitung steht im engen Zusammenhang mit pflanzenbaulichen und mikrobiologischen Parametern. Der Wirkungs-zusammenhang zwischen Pflanzen- und Mikroorganismenstress und seine Auswirkungen auf die Bildung von dem "UTA" zuzurechnenden unerwünschten Aromasubstanzen wurde aufgezeigt. Ein Stress-Organismus-Reaktions-Modell für Pflanzen zur Beschreibung von Stressreaktionen auf Umwelteinflüsse und ein Erklärungsansatz des "UTA" wurde erstellt. Vor dem Hintergrund der Beobachtungen wurde eine Stressdefinition für Mikroorganismen entwickelt.
Im Rahmen einer prospektiven Studie wurde untersucht, ob ein Zusammenhang besteht zwischen der Körperzellmasse als wesentliches Kompartiment des Körpergewichtes und dem Auftreten von unerwünschten Ereignissen (UAW) unter einer Chemotherapie. Zunächst wurden Patienten (n=23) mit verschiedenen malignen Erkrankungen (M. Hodgkin, Bronchialkarzinom, malignes Melanom, NHL) bezüglich ihrer Körperzusammensetzung untersucht mit der Frage ob überhaupt relevante Unterschiede zu verzeichnen sind. Im Verlauf wurden dann aus diesem Kollektiv die Patienten mit M.Hodgkin (n=11) über den gesamten Therapieverlauf untersucht, um einen Zusammenhang zwischen Zellmasse und Nebenwirkungen einer Chemotherapie zeigen zu können. Zur Beurteilung der Wirksamkeit der Therapie erfolgte eine Nachbeobachtung über 60 Monate. Die Bestimmung der Körperzusammensetzung bzw. der Körperzellmasse erfolgte mittels der bioelektrischen Impedanzanalyse, die während der Therapie aufgetretenen UAW wurden durch einen modifizierten WHO-Nebenwirkungsscore erfaßt. Es konnte gezeigt werden, daß im Gesamtkollektiv der Patienten mit malignen Erkrankungen deutliche Unterschiede in der Körperzusammensetzung bestehen. So reicht die ermittelte Körperzellmasse (BCM) der Patienten von 17,65 bis zu 38,95 kg. Im Hodgkin-Kollektiv war die Bestimmung der Körperoberfläche nicht in der Lage, die Unterschiede in der Zusammensetzung abzubilden. Errechnet man die Dosis der Chemotherapeutika bezogen auf die unterschiedlich großen Zellmassen so zeigen sich deutliche Unterschiede (rel. Dosis in % des Mittelwertes bezogen auf BCM: 78,3-129,8%). Die klinische Relevanz der ermittelten Dosisunterschiede bezogen auf die BCM zeigt sich in der strengen Korrelation von rel. Dosis/BCM und dem Auftreten von UAW verschiedener Schweregrade (UAW-Score) mit r = 0,83 (p = 0,002). In der Nachbeobachtungszeit traten 2 Rezidive auf (nach 10 bzw. 19 Monaten), beide Patienten erhielten eine bezogen auf die BCM relativ niedrige Dosis (78,3 bzw.83,7 % vom MW). In Folge dieser Ergebnisse stellt sich die Körperzusammensetzung als eine wesentliche Variable zur prädiktiven Bestimmung des Nebenwirkungsprofils von Patienten unter Chemotherapie dar, auch die Suffizienz hing in diesem Kollektiv von der Dosis pro Zellmasse ab. Die Berücksichtigung von Ergebnissen aus der Bestimmung der Körperzusammensetzung bei der Ermittlung einer Chemotherapie-Dosis könnte in Zukunft eine Verbesserung in der individuellen Therapie von Patienten mit malignen Erkrankungen darstellen.
Funktionelle und strukturelle Untersuchungen an der Diisopropylfluorophosphatase aus L.vulgaris
(2003)
Das Ziel dieser Arbeit war, mittels gezielter Mutagenese den postulierten Reaktionsmechanismus der durch die DFPase katalysierten Reaktion zu untermauern und gegebenenfalls weitere an der Hydrolysereaktion beteiligte Reste zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde zunächst die Rolle der Ca-1 Liganden untersucht. Hierbei ergab sich, dass sowohl die Nettoladung an der Ca-1-Bindungsstelle als auch die Positionen der Ladungen für den Erhalt der katalytischen Aktivität des Enzyms von Bedeutung sind. Die Einführung einer dritten negativen Ladung in der Bindungsstelle führte zum nahezu kompletten Aktivitätsverlust, was, wie die kristallographischen Untersuchungen der N175D-Mutante ergaben, hauptsächlich auf die veränderte Elektrostatik in der Bindungsstelle zurückzuführen ist. Durch eine Reihe von Mutationen des für die katalytische Aktivität als essentiell beschriebenen His287-Restes konnte gezeigt werden, dass auch andere, hydrophobe Reste an dieser Position die Katalyse ermöglichen. Die Fähigkeit dieser Reste, Wasserstoffbrücken mit Trp244 auszubilden, könnte für die Katalyse zwar förderlich sein, ist aber nicht unbedingt notwendig. Außerdem scheint die vom His287 vermutlich durchgeführte Aktivierung des hydrolytischen Wassermoleküls ebenfalls nicht essentiell für die enzymatische DFP-Spaltung zu sein. Anhand der in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen konnte der von Scharff et al. (2001a) vorgeschlagene Reaktionsmechanismus zumindest teilweise bestätigt werden. Gleichzeitig konnte jedoch gezeigt werden, dass die katalytische Reaktion auch ohne einige der in der Wildtyp-DFPase gegebenen Voraussetzungen - wie das Bestehen einer Wasserstoffbrücke zwischen His287 und Trp244, sowie eine durch das His287 durchgeführte Wasseraktivierung - ablaufen kann. Es konnte außerdem mittels gezielter Mutagenese gezeigt werden, dass die hydrophoben Anteile in der gesamten Substratbindungstasche und speziell an der Position 173 für die Substratbindung und -umsetzung eine wichtige Rolle spielen. Wie bereits bekannt, ist das Ca-2 Ion für die Stabilität der DFPase von großer Bedeutung. Mit Hilfe einer Mutation an der Ca-2-Bindungsstelle konnte gezeigt werden, dass der Verlust einer negativen Ladung die Koordination des Ca-2 Ions offensichtlich abschwächt. Die Position des Calciumions konnte in der D232S-Mutante nicht eindeutig definiert werden, obwohl die Struktur und die Aktivität des Enzyms intakt geblieben sind. Außerdem wurden, bedingt durch die Einführung dieser Mutation, geringe strukturelle Veränderungen im aktiven Zentrum des Enzyms hervorgerufen, was auf Wechselwirkungen zwischen den beiden Calciumbindungsstellen hindeutet. Dies könnte auf das ausgedehnte Wasserstoffbrückennetzwek im Inneren des die DFPase durchspannenden Tunnels zurückzuführen sein. Die Untersuchung verschiedener anderer, im zentralen Tunnel der DFPase gelegener Reste deutet ebenfalls auf die Existenz eines solchen Wasserstoffbrückennetzwerks hin, welches für die Aufrechterhaltung der katalytischen Funktion sowie der Strukturstabilität der DFPase von erheblicher Bedeutung zu sein scheint. Die für die Reste His287, Glu37, Ser271 postulierte Beteiligung an der katalytischen Reaktion konnte durch die Bestimmung der kinetischen Parameter dieser Mutanten untermauert werden. Die H287N-Mutante besitzt sehr niedrige KM- und Vmax-Werte, was die Bedeutung dieses Restes für die Katalyse unterstreicht. Kinetische Messungen wurden im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal mit dem rekombinanten Enzym und außerdem auch den DFPase-Substraten Sarin, Soman und Tabun durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Messungen haben gezeigt, dass die DFPase auch zur Dekontamination dieser letztgenannten Organophosphate effizient eingesetzt werden kann. Schließlich konnte mittels Gleichgewichtsdialyse das niederaffin gebundene Calciumion der DFPase gegen Co2+ und Tm3+ ausgetauscht werden. Da die Verwendung dieser Metalle für NMR-spektroskopische Messungen von "residual dipolar couplings" gedacht war, wurden 15N-angereicherte Proben des derivatisierten Proteins hergestellt, welche die für die NMR-Experimente notwendige Stabilität besassen.
In dieser Arbeit wurde der chemische Ozonverlust in der arktischen Stratosphäre über elf Jahre hinweg, zwischen 1991 und 2002, mit Hilfe der so genannten "Ozon-Tracer Korrelationstechnik" (TRAC), untersucht. Bei dieser Methode werden Korrelationen zwischen Ozon und langlebigen Spurenstoffen im Verlauf des Winters im Polarwirbels beobachtet und so der jährliche akkumulierte Ozonverlust berechnet. Die Ergebnisse dieser Arbeit basieren im wesentlichen auf Messdaten der Satelliteninstrumente: HALOE (Halogen Occultation Experiment) auf UARS (Upper Atmosphere Research Satellite) und ILAS (Improved Limb Atmospheric Spectrometer) Instrument auf ADEOS (Advanced Earth Observing Satellite). Das HALOE Instrument misst seit Oktober 1991 kontinuierlich alle zwei bis drei Monate für einige Tage in höheren nördlichen Breiten. ILAS lieferte ausschließlich für den Winter 1996-97 Messungen, die über sieben Monate hinweg in hohen Breiten aufgenommen wurden. Aufgrund der eingeführten Erweiterungen und Verbesserungen der Methode in dieser Arbeit, konnte die Methode anhand einer detaillierten Studie für den Winter 1996-97 validiert werden. Die ILAS Messreihe wurde dazu verwendet, erstmals die Untersuchung der zeitlichen Entwicklung von Ozon-Tracer Korrelationen kontinuierlich für die gesamte Lebensdauer des Polarwirbels durchzuführen. Dabei wurden auch Korrelationen während der Bildung des Wirbels untersucht und im Besonderen mögliche Mischungsvorgänge zwischen Wirbelluft und Luftmassen außerhalb des Wirbels. Ausserdem wurde ein Vergleich der Ergebnisse von ILAS und HALOE Messdaten durchgeführt und Unterschiede in den Ergebnissen tiefgreifend analysiert. Basierend auf HALOE Messungen konnte die erweiterte TRAC Methode über elf Jahren hinweg angewendet werden. Damit war erstmals eine konsistente Analyse von Ozonverlust und Chloraktivierung über diesen Zeitraum möglich. Die Erweiterungen führten zu einer Verringerung und genauen Quantifizierung von Unsicherheiten der Ergebnisse. Ein deutlicher Zusammenhang zwischen meteorologischen Bedingungen, Chloraktivierung und dem chemischen Ozonverlust wurde deutlich. Weiterhin zeigte sich eine Abhängigkeit zwischen den meteorologischen Bedingungen und der Homogenität des Ozonverlustes innerhalb eines Winters, sowie der mögliche Einfluss von horizontaler Mischung auf Luftmassen in einem schwach ausgeprägten Polarwirbel. In dieser Arbeit wurde eine positive Korrelation zwischen den über die gesamte Lebensdauer des Wirbels auftretenden möglichen PSC-Flächen und den akkumulierten Ozonverlusten für die elf untersuchten Jahre deutlich. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass der Ozonverlust von deutlich mehr Einflüssen als nur von der Fläche möglichen PSC Auftretens bestimmt wird, sondern zum Beispiel von der Stärke der Sonneneinstrahlung abhängt. Außerdem lassen sich Auswirkungen von Vulkanausbrüchen, wie zum Beispiel im Jahr 1991 der des Mount Pinatubo, identifizieren.
Die Messung von heteronuklearen 15N-Relaxationszeiten (Longitudinale, transversale sowie heteronukleare NOE) bei verschiedenen Magnetfeldstärken (500, 600 und 800 MHz 1H Larmorfrequenz) ergeben Informationen über interne dynamische Prozesse in Biomolekülen. Diese verschiedenen Relaxationsraten sind voneinander abhängig und über die spektrale Leistungsdichtefunktion miteinander gekoppelt. Die mikrodynamischen Parameter des NH-Peptidrückgratvektors (der Ordnungsparameter S2 und die effektive interne Korrelationszeit te) sowie der Beitrag des konformationellen Austausches zur transversalen Relaxationsrate der Austauschparameter Rex wurden für einige Proteine errechnet und angepaßt. Das Human ILBP gehört zur Familie der intrazellulären Lipidbindungsproteine (LBP), die in der Lage sind, Fett- und Gallensäuren spezifisch zu binden und in Cytosol zu transportieren. Viele verschiedene Typen von LBPs sind bis heute identifiziert worden. Diese Proteine enthalten 127 - 135 Aminosäurereste und werden nach dem Gewebe benannt, aus dem sie isoliert wurden. Human-ILBP enthält 127 Aminosäurereste und besteht haupsächlich aus 10 antiparallelen beta-Faltblattsträngen, die eine beta-Fassstruktur mit einer großen Bindungstasche bilden, und zwei alpha-Helices. ILBP hat die Tendenz, Gallensäuren oder Fettsäuren zu binden. Diese geringe Tendenz zur liganden Spezifität ist entweder in der Struktur oder in seiner Dynamik begründet. Aus diesem Grund kann die Untersuchung der Dynamik des Human ILBP (apo- und holo-Form) in zwei Zeitfenstern zum besseren Verständnis der Funktion führen. Für die nicht-terminalen Peptidrückgratgruppen wurde ein S2-Parameter> 0,8 mit einen Durchschnitt von 0,88 beobachtet, was auf eine niedrige Mobilität im ganzen Protein in einem Nano- zu Picosekunden-Zeitfenster deutet, wobei eine Korrelationszeit von tc = 6.25 ns für ILBP (apo-form) und tc = 6.10 ns für ILBP (holo-Form) beobachtet wurde. Apo- und holo-Form (mit Taurocholat als Ligand) zeigen eine ähnliche Dynamik in diesem Zeitfenster. Überdurchschnittliche S2-Werte der alpha-Helix I deuten eine geringe Flexibilität des Peptidrückgrats an, während alpha-Helix II als Teil der Portalregion eine höhere Beweglichkeit zeigt. Austauschparameter Rex wurden hauptsächlich in den Regionen der Ligandenbindung nachgewiesen. Die hier beschriebenen Eigenschaften unterscheiden sich von denen des H-FABP und des E-FABP. Offensichtlich unterscheiden sich verschiedene Mitglieder der LBP-Familie wie ILBP (Human oder Schwein), H-FABP und E-FABP in der Funktion und Dynamik des Peptidrückgrats. In der vorliegenden Arbeit wurden die transversalen 15N CSA/DD-kreuzkorrelierten Kreuzrelaxationsraten bestimmt. Für die Bestimmung der Anisotropie des chemischen Verschiebungstensors wurde des Verhältnis zwischen den Auto- und Kreuzrelaxationsraten in Abhängigkeit von der magnetischen Feldstärke genutzt, wobei es möglich war, die Orientierung und Größe des CSA-Tensors einzelner Aminosäurereste zu bestimmen. Bei dieser Methode (wie auch in vielen anderen Studien gezeigt) wurde keine Korrelation zwischen der Sekundärstruktur des Proteins und den 15N CSA-Werten festgestellt. Zum Vergleich der CSA-Konstanten der ILBP-Spezies wurden die entsprechenden Parameter der RNaseT1 gemessen. Alle Daten wurden im Hinblick auf strukturelle Details kritisch diskutiert.
Der tägliche und jahreszeitliche Wechsel in den Lichtverhältnissen bedeutet für alle Lebewesen eine regelmäßige und fundamentale Veränderung ihrer Lebensbedingungen. Mit Hilfe einer Inneren Uhr können Lebewesen regelmäßige Veränderungen ihrer Umwelt antizipieren. Diese Innere Uhr gewährleistet die Generierung eines endogenen, zirkadianen Rhythmus und dessen Synchronisation mit der Umwelt. Bei Wirbeltieren werden diese Funktionen durch einen spezifischen neuronalen Schaltkreis im Gehirn, dem photoneuroendokrinen System (PNS), erfüllt. Das Pinealorgan ist ein essenzieller Bestandteil des PNS. Dort werden photoperiodische Reize und Signale vom endogenen Oszillator in die Synthese des Neurohormons Melatonin umgesetzt. Die vom zentralen Oszillator im SCN gesteuerte Freisetzung von Noradrenalin (NA) aus sympathischen-postganglionären Nervenfasern in das Pinealorgan ist der entscheidende Reiz zur nächtlichen Ankurbelung der Melatoninbiosynthese. Melatonin wird ausschließlich in der Nacht gebildet und fungiert daher als ein Zeithormon. Unmittelbar nach der Synthese wird das Melatonin in die Blutbahn abgegeben und liefert allen Zellen, die mit spezifischen Melatoninrezeptoren ausgestattet sind, die entsprechenden Licht- und Zeitinformationen. NA bewirkt in allen untersuchten Säugetierarten die Aktivierung des Schlüsselenzyms der Melatoninbiosynthese, der AANAT. Die zellulären und molekularen Regulationsmechanismen für die AANAT unterscheiden sich jedoch artspezifisch. So ruft NA in Pinealozyten der Ratte die cAMP/PKA/pCREB-vermittelte Aktivierung der Transkription des Aanat Gens hervor, wogegen in Pinealozyten des Rindes NA die Regulation der proteasomalen Proteolyse des AANAT Proteins kontrolliert. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es, zelluläre und molekulare Mechanismen der noradrenergen Signaltransduktionskaskade zu identifizieren, welche für die Steuerung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan von Säugetieren verantwortlich sind. Deshalb wurden in kultivierten Pinealozyten der Ratte und des Rindes sowohl transkriptionale als auch posttranslationale Regulationsmechanismen untersucht, welche durch NA gesteuert und an der Regulation des Schlüsselenzyms der Melatoninbiosynthese, der AANAT, beteiligt sind. Mit Hilfe der Immunzytochemie konnte erstmalig das subzelluläre Verteilungsmuster sämtlicher bekannter regulatorischer (R)-Untereinheiten der PKA Typ I und II in Pinealozyten der Ratte nachgewiesen werden. Ebenso wurden die A Kinase Anker Proteine (AKAP) 95 und 150 immunzytochemisch dargestellt, wobei zwischen der AKAP 150-Immunreaktivität (IR) und der IR von RII alpha bzw. RII beta eine weitgehende Kolokalisation in der Nähe der Zellmembran der Pinealozyten vorlag. Diese Kolokalisationen deuten eine funktionelle Interaktion der PKA Typ II mit AKAP 150 in Pinealozyten der Ratte an. Keine Funktion bei der Steuerung der Melatoninbiosynthese scheinen der cAMPregulierte Austauschfaktor EPAC und die monomere GTPase Rap zu besitzen. So konnte eine Stimulation kultivierter Pinealorgane mit 8-CPT-2'-O-Me-cAMP, einem EPAC-spezifischen cAMP-Analog, einzeln oder in Kombination mit Noradrenalin (NA) weder den AANAT Proteingehalt noch die Freisetzung von Melatonin beeinflussen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass die cAMP-vermittelte Aktivierung der Melatoninbiosynthese ausschließlich auf die PKA zurückzuführen ist. Ebenso beeinflussten weder NA noch 8- CPT-2'-O-Me-cAMP den Aktivitätszustand von ERK 1 und 2. Eine Erhöhung des cAMP-Spiegels in Pinealozyten der Ratte scheint somit keinen Einfluss auf den Aktivitätszustand von ERK 1 und 2 im Pinealorgan der Ratte auszuüben. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die schnelle Dephoshorylierung von pCREB eine entscheidende Funktion bei der akuten Herabregulation des CRE-tragenden Aanat Gens darstellt und somit eine wichtige Rolle für die Beendigung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan der Ratte spielt. Nach Entzug des NA-Stimulus kam es innerhalb von 30 Minuten zu einer fast vollständigen pCREB Dephosphorylierung, die mit einer Abnahme der Aanat mRNA, des AANAT Proteingehalts und der Melatoninbiosynthese einherging. Die pCREB Dephosphorylierung und die Abnahme der Melatoninbiosynthese konnten durch PSP-Inhibitoren verhindert werden. Aufgrund der pharmakologischen Untersuchungen und des intrazellulären Verteilungsmusters scheint die PSP 1 die pCREB Dephosphorylierung im Zellkern der Rattenpinealozyten zu steuern. Mit Hilfe eines Ko-Immunpräzipitationsansatzes wurde erstmalig eine NA-abhängige Komplexbildung von AANAT und Protein 14-3-3 in Pinealozyten der Ratte und des Rindes dargestellt. Die vorliegenden Untersuchungen belegen somit, dass Tierarten, welche generell eine unterschiedliche molekulare Strategie zur Regulation der Melatoninbiosynthese entwickelt haben, mit der NA-abhängigen Ausbildung des AANAT/Protein 14-3-3 Komplexes jedoch einen gemeinsamen Mechanismus zur Regulation des AANAT Proteins besitzen. Ferner wurde die funktionelle Bedeutung des Cannabinoidsystems für die Steuerung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan der Ratte untersucht. Mit Hilfe der Immunhistochemie und des Immunoblotverfahrens konnten erstmalig CB 1- und 2 Rezeptorproteine im Pinealorgan der Ratte dargestellt werden. Die Stimulation kultivierter Pinealorgane der Ratte mit THC hatte keinen Einfluss auf den pCREB- und AANAT Proteingehalt, konnte jedoch die NA-induzierte Aktivierung des AANAT Proteins und die Melatoninfreisetzung hemmen. Das Pinealorgan der Ratte und des Rindes dient als ein gut geeignetes Modellsystem zum Studium von Signalskaskaden, da hier Noradrenalinreize in ein definiertes, einfach messbares Endprodukt, die Biosynthese und Sekretion des Neurohormons Melatonin, umgewandelt werden. Die in dieser Arbeit aufgedeckten Signaltransduktionsprozesse liefern daher nicht nur neue Einblicke in die Regulationsprozesse der Melatoninbiosynthese, sondern dienen ebenso dem besseren Verständnis von Signalübertragungs- und Signalverarbeitungsprozessen in komplexeren neuronalen und neuroendokrinen Systemen.
Transdermale Therapeutische Systeme (TTS) sind Arzneiformen, die über einen längeren Zeitraum eine kontrollierte Arzneistoffabgabe durch die Haut ermöglichen. Um ausreichende Permeationsraten zu erreichen, sind häufig hohe Arzneistoffkonzentrationen im Reservoir notwendig. In TTS, deren Arzneistoffkonzentration über der Sättigungskonzentration der Matrix liegt, neigen die Wirkstoffe dazu auszukristallisieren. Die Kristallisation stellt ein wichtiges Stabilitätsproblem bei der Entwicklung solcher Systeme dar, da die Bioverfügbarkeit negativ beeinflusst werden kann. Diese Studie zeigt, dass Kristallisationsprozesse in TTS mithilfe der isothermen Wärmeleitungsmikrokalorimetrie über eine Messzeit von 7 Tagen mit hoher Empfindlichkeit erfasst werden können, denn die Kristallisation stellt einen exothermen Prozess dar. Die mikrokalorimetrische Messkurve zeigte sowohl bei Placebo- als auch bei wirkstoffhaltigen Zubereitungen einen starken initialen, exothermen Wärmefluss, der über einige Tage langsam abfiel bis ein konstantes Wärmeflussplateau erreicht wurde. Der hohe initiale Wärmefluss entstand durch das Ausstanzen der Laminate und die damit verbundene mechanische Beanspruchung. Die Kristallisation wurde von den Stanzrändern ausgehend initiiert und war damit an den Schnittkanten auch stärker ausgeprägt als im Inneren der Laminate. An den Schnittstellen des TTS waren mikroskopisch wesentlich mehr Kristalle nachweisbar als in den nicht mechanisch beanspruchten Bereichen. Die messbare Arzneistoff-immanente Wärmemenge stieg mit erhöhtem Arzneistoffgehalt an, war aber über 7 Tage bei den E2-haltigen und NEA-haltigen TTS-Laminaten nicht proportional zum Arzneistoffgehalt, da die Kristallisation nach dieser Messzeit nicht beendet war. Dieses Ergebnis konnte durch die mit steigender Übersättigung beschleunigte Kristallisation erklärt werden, die für alle untersuchten Messreihen beobachtet wurde. Je höher die Arzneistoffkonzentration in den Laminaten war, desto stärker war auch die Triebkraft für Kristallisationsvorgänge. Das Kristallisationsende war rascher erreicht. War die Kristallisationsgeschwindigkeit dagegen über einen gewissen Konzentrationsbereich konstant oder war der Kristallisationsprozess während der Messzeit bereits beendet, so stieg die Arzneistoff-immanente Wärmemenge proportional zur erhöhten Arzneistoffkonzentration. Eine konstante Kristallisationsgeschwindigkeit wurde für NEA im Bereich von 4 bis 10 % beobachtet. Bei höherer Übersättigung verlief der Kristallisationsprozess allerdings ebenfalls beschleunigt. Die Kristallisationsgeschwindigkeitskonstante sowie der Avrami-Exponent als Parameter für den Kristallisationsmechanismus konnten anhand der mikrokalorimetrischen Daten berechnet werden, ebenso wie die Kristallisationsenthalpien in Höhe von -23,3 ± 1,2 kJ/mol für E2-hemihydrat, -22,8 ± 2,6 kJ/mol für NEA sowie -7,9 ± 0,95 kJ/mol für die 1:3- Mischung. Alle Kristallisationsvorgänge waren durch die hohe Viskosität der Matrix diffusionskontrolliert und zeigten ein eindimensionales Kristallwachstum. Bei der Mikrokalorimetrie handelt sich um eine unspezifische Methode, bei der der Ursprung der Wärmeeffekte durch zusätzliche Methoden aufgeklärt werden muss. Als weitere Untersuchungsmethoden bei der Kristallisation in transdermalen Systemen boten sich die Polarisationsmikroskopie und die Pulverröntgenbeugung an. Die DSC war ungeeignet. Im Vergleich zur Mikrokalorimetrie war die polarisationsmikroskopische Untersuchung von Kristallisationsprozessen jedoch wesentlich zeitaufwendiger, wobei sich die Empfindlichkeit als höher erwiesen hat. Die Mikrokalorimetrie detektierte im Vergleich zur Mikroskopie erst eine Kristallmenge von ungefähr 0,5 % zuverlässig. Die Pulverröntgenbeugung stellte im Vergleich zu Mikroskopie und Mikrokalorimetrie eine weniger empfindliche analytische Methode für die Erkennung von kristallinem organischen Material in einer polymeren amorphen Matrix dar. Während kleine Kristalle in den Polymerfilmen bereits mit bloßem Auge zu sehen waren, traten zum Teil keine Reflexe im Pulverdiagramm auf. Die Detektionsgrenze lag im Vergleich zur Mikroskopie bei ungefähr 1 bis 1,5 % Kristallen in der polymeren Umgebung. Dagegen ist die Pulverröntgenbeugung für verschiedene Kristalltypen sehr spezifisch. Sie erlaubt die Aufklärung von Strukturen sowie eine quantitative Auswertung der Kristallmengen in Mischungen, sofern die Kristalltypen bekannt sind. Mithilfe der Polarisationsmikroskopie und Pulverröntgenbeugung wurden die Kristallstrukturen der Arzneistoffe in der polymeren Matrix der TTS untersucht. Für Systeme, die nur einen der Arzneistoffe enthielten, wurde eine unveränderte Kristallisation in der Matrix in Form von E2-hemihydrat bzw. NEA beobachtet. Die Kombination von E2-hemihydrat und NEA veränderte die Kristallstruktur der gebildeten Kristalle im Vergleich zu den reinen Arzneistoffen und führte zur Ausbildung einer neuen Kristallstruktur in der Matrix, die sich in den Reflexlagen auch von der aus Ethylacetat kristallisierten unterschied. Sogar geringe E2-Konzentrationen führten zu einer deutlichen Veränderung der Kristallform und des Röntgenbeugungsmusters der NEA-Kristalle. Außerdem wurde der Kristallisationsprozess durch die Kombination der Hormone stark beschleunigt. Bei der neuen Kristallform handelte es sich um eine thermodynamisch weniger stabile Struktur, da die Kristallisationsenthalpie geringer war, allerdings war die Kristallisation kinetisch bevorzugt. Trotz der Unterschiede in der Empfindlichkeit der Methoden, die zur Bestimmung der Sättigungslöslichkeit angewendet wurden, stehen die erhaltenen Ergebnisse entsprechend den Detektionsgrenzen in guter Übereinstimmung, wobei es sich bei den ermittelten Werten von 1,5 % für E2-hemihydrat und 4 % für NEA unter Umgebungsbedingungen um die Sättigungslöslichkeit unter Kristallisationsbedingungen und nicht um die wahre Sättigungslöslichkeit handelt. Hohe Feuchtigkeit in der polymeren Matrix fördert die E2-hemihydrat- sowie NEA-Kristallisation durch die geringe Wasserlöslichkeit der Steroidhormone. Die Trocknungsbedingungen konnten die physikalische Stabilität der Pflaster stark beeinflussen, was eventuell auch durch die Ausbildung einer besser löslichen, wasserfreien Kristallform des Estradiols begründet sein könnte. Die Vorbehandlung der Laminate bei 80°C scheint eine gute Möglichkeit zu sein, die TTS vor Kristallisationsprozessen zu schützen, wobei bei der Lagerdauer ein Kompromiss zwischen der physikalischen Stabilisierung und der chemischen Zersetzung gefunden werden muss. Zusammenfassend wurde festgestellt, dass es sich bei der Mikrokalorimetrie um eine zeitsparende und effektive Methode für die Beurteilung einer Vorbehandlung bei 80°C sowie des Einflusses von verschiedenen Hilfsstoffen auf den Kristallisationsprozess der Arzneistoffe im TTS handelt. Die Mikrokalorimetrie ermöglichte dabei innerhalb von 7 Tagen die Klassifikation verschiedener Zusatzstoffe nach deren Effizienz, die Kristallisation in den Pflastern zu initiieren. Dagegen sind häufig viele Monate nötig, um ähnlich zuverlässige Ergebnisse mit der Polarisationsmikroskopie bzw. der Pulverröntgenbeugung zu erhalten. Die Mikrokalorimetrie stellt demnach eine interessante Methode für ein Hilfsstoffscreening und die Optimierung von Rezepturen dar.
Im Rahmen dieser Arbeit werden die Synthese, Eigenschaften und Anwendungsmöglichkeiten von Arylalkyl-Rückgrat modifizierten DNA-Oligonucleotiden untersucht. Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war, lipophile, arylalkylmodifizierte Oligonucleotide zu synthetisieren und die Auswirkungen der absoluten Konfiguration der Modifikationen auf die Eigenschaften der resultierenden Duplexe zu untersuchen. Als zweites sollten die Modifikationen in Antisense-Oligonucleotide eingebaut werden um diese auf ihre Anwendbarkeit für die lnhibierung der HCV Genexpression zu testen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 18 unterschiedliche Rückgrat-Modifikationen synthetisiert. Dabei wurde die Alkylkettenlänge wie auch die Größe des aromatischen Systems variiert. Zudem wurde untersucht, welchen Einfluss Ringsubstituenten auf die Eigenschaften der resultierenden Oligonucleotide ausüben. Die Rückgratmodifikationen wurden über die Festphasensynthese nach der Phosphoramiditmethode in Oligonucleotide eingebaut. Als Ausgangsverbindungen für die modifizierten Phosphoramidite dienten die Arylalkylhalogide. Diese wurden in einer dreistufigen in situ Reaktion - über das Grignard-Reagenz zu der entsprechenden cadmiumorganischen Verbindung und deren weitere Reaktion mit Phosphortrichlorid - zu den Arylalkyldichlorphosphanen umgesetzt. Die als Phosphorylierungsreagenzien fungierenden (Arylalkyl)(diisopropylamin)-chlorphosphane konnten durch Umsetzung mit N,N-Diisopropylamin erhalten werden. Die folgende Reaktion mit den 5'-hydroxyl- und aminogeschützten, natürlichen Nucleosiden führte zu den modifizierten Phosphoramidit-Bausteinen. Diese wurden mittels der OligonucleotidFestphasensynthese selektiv, an verschiedenen Positionen in sehr guten Ausbeuten in ModellOligonucleotide eingebaut und die erhaltenen Diastereoisomeren mittels RP-HPLC getrennt. Die einfach modifizierten, diastereoisomerenreinen Oligonucleotide zeigten eine signifikant erhöhte Lipophilie im Vergleich zu den unmodifizierten Strängen. Die Lipophilie nahm bei der Verlängerung der Alkylkettenlänge und der Vergrößerung des aromatischen Ringsystems pro (CH2)-Gruppe sowie pro weiterem Sechsring in konstanten Schritten zu, wodurch die Lipophilie gezielt gesteuert werden kann. Um den Einfluss der Modifikationen im Doppelstrang zu untersuchen wurden die Tm-Werte der Duplexe bestimmt und diese zudem CD- und Fluoreszenzspektroskopisch untersucht. Die erhaltenen Tm-Werte variierten sehr stark in Abhängigkeit der Alkylkettenlänge, der Ringgröße und der absoluten Konfiguration. Mit den Rp-konfigurierten benzyl- (B), (naphth-1-yl)methyl- (I) und 2,4-difluorbenzylmodifizierten (M) Oligonucleotid-Duplexen konnte eine Schmelzpunktserhöhung erzielt werden. Auch konnte mit den 3-(Anthracen-9-yl)propylphosphonaten K eine signifikante Tm-Wert Steigerung aufgrund eines "Dangling-End-Effektes" beobachtet werden. Die erhaltenen Tm-Werte korrelierten hervorragend mit den erhaltenen CD- und Fluoreszenz-Daten. Für die Zuordnung der absoluten Konfiguration der Modifikation wurden drei 3-Phenylpropylphosphonat-Dimere E synthetisiert. Die Zuordnung erfolgte mittels der 2D-ROESY-NMR-Spektren und den berechneten Protonenabständen der diastereoisomerenreinen Dimere sowie über empirische Regeln die von den Methylphosphonaten S abgeleitet wurden. Diese Ergebnisse lassen sich auf längere Oligonucleotide übertragen. Neben den Untersuchungen der Charakteristika der Arylalkyl-Rückgrat modifizierten Oligonucleotide wurden während dieser Arbeit einige Modifikationen gezielt auf ihre Einsetzbarkeit für den Antisense-Einsatz getestet. Als RNA-Zielsequenz wurden die Nucleotide 326-342 der 5'-nicht codierenden Region des Hepatitis C Virus gewählt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden fünf unterschiedlich modifizierte Antisense-Oligonucleotide synthetisiert. Die arylalkylmodifizierten Oligonucleotide zeigten gute Hybridisierungseigenschaften gegenüber der sense-DNA bzw. sense-RNA und eine deutlich erhöhte Stabilität gegenüber der Nuclease Pl. Ferner konnte die Lipophilie der Oligonucleotide signifikant gesteigert werden. Die 2-Phenylethylphosphonate (D) und 2,4-Difluorbenzylphosphonate (M) sind zudem in der Lage die RNase H zu aktivieren. Alle dargestellten Antisense-Oligonucleotide wurden in einem zellfreien in vitro- sowie in einem in vitro-Zellkultur-Translations-Assay auf ihr lnhibierungspotential gegen die Hepatitis C Virus Genexpression getestet. Dabei zeigten die Benzylphosphonate (B), Phosphorthioate (Ps) und die 2-Phenylethylphosphonate (D) im zellfreien in vitro Testsystem hohe, spezifische Inhibierungsraten (>87%), bei einer Oligonucleotid-Konzentration von 5 µM. Auch erwiesen sich die arylalkylmodifizierten Antisense-Oligonucleotide, mit Ausnahme der 4-Phenylbutylphosphonate F, als sehr gute lnhibitoren der HCV-Genexpression in CCI13- und HepG2-Zellen.
Die Infrarotspektroskopie in Verbindung mit photoaktivierbaren Substraten wurde zur Untersuchung von Substrat-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt. Dabei wurden Konformationsänderungen der Ca2+-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums bei Bindung des Nukleotids, der Phosphorylierung der ATPase und der Hydrolyse des Phosphoenzyms beobachtet. Verwender wurden das native Substrat ATP und seine Analoga ADP, AMPPNP, 2'-deoxyATP, 3'-deoxyATP, ITP, AMP, Pyrophosphat, Ribosetriphosphat und TNP-AMP beobachtet. Diese Analoga waren an spezifischen funktionellen Gruppen des Substrats ATP modifiziert. Modifikation der 2'- und 3'-OH Gruppe des Ribosetriphosphats, der beta- und gamma-Phosphatgruppe und der Aminogruppe des Adenins reduzieren das Ausmaß an bindungsinduzierten Konformationsänderungen. Ein besonders starker Effekt wird für die 3'-OH Gruppe und die Aminogruppe des Adenins beobachtet. Dies zeigt die strukturelle Empfindlichkeit des Nukleotid-ATPase Komplexes auf einzelne Wechselwirkungen zwischen dem Nukleotid und der ATPase. Die Wechselwirkungen einer bestimmten Ligandengruppe mit der ATPase hängen von Wechselwirkungen anderer Ligandengruppen mit die ATPase ab. Die TNP-AMP Bindung verursacht teilweise gegenläufige und kleinere Konformationsänderungen verglichen mit ATP. Die Bindungweise von TNP-AMP ist unterschiedlich zu der von ATP, AMPPNP und anderen Tri- und Diphosphat Nucleotiden. Die Phosphorylierung der ATPase wurde mit ITP und 2'-deoxyATP beobachtet. Ca2E1P wurde in gleichem Ausmaß mit ITP und 2'-deoxyATP wie mit ATP akkumuliert, obwohl das Ausmaß der Konformationsänderungen bei Ca2E1P-Bildung geringer ist. Änderungen der 2'- und 3'-OH des Ribosetriphosphats und der Aminogruppe des Adenins beeinflussen die Reaktionsgeschwindigkeit der Phosphorylierung der ATPase. Es gibt keine direkte Verbindung zwischen dem Ausmaß der Konformationsänderung bei Nukleotid- Bindung und der Rate der Phosphorylierung. Das volle Ausmaß der ATP-induzierten Konformationsänderung ist nicht zwingend für die Phosphorylierung. Die Konformationen von Ca2E1N und Ca2E1P hängen vom Nukleotid ab. Dies weist darauf hin, dass die Struktur von ATPase Zuständen heterogener ist, als bisher erwartet. Die Aussagekraft und der Reichtum an Informationen in den Infrarotspektren zeigen, dass hiermit eine leistungsfähige Methode für die Untersuchung von Enzym-Substrat-Wechsel-Wirkungen und das räumliche Abtasten von Bindungstaschen zur Verfügung steht.