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Obwohl Böden unzweifelhaft ein signifikanter Pool von organischem Kohlenstoff sind, ist ihre Bedeutung als potenzielle langfristige Senke für atmosphärischen Kohlenstoff keineswegs klar. Trotz bedeutender wissenschaftlicher Forschritte aus den letzten Jahren zur Klärung der Kohlenstoffdynamik in Böden gibt es nach wie vor offene Fragen insbesondere hinsichtlich der spezifischen geochemischen Mechanismen, die für die Stabilisierung organischen Kohlenstoffs in Böden verantwortlich sind. Vor diesem Hintergrund besteht ein wesentliches Ziel der vorliegenden Dissertation darin, in unterschiedlichen Bodentypen die Konzentration von organischem Kohlenstoff und Stickstoff sowie die mineralogische Zusammensetzung zu untersuchen, um Hinweise auf einen möglichen Einfluss der Tonmineralogie, der spezifischen Oberfläche und der Oxidkonzentration auf die Stabilisierung organischen Materials zu ermitteln. Die Ergebnisse sollen einen Beitrag dazu liefern, die Mechanismen der Fixierung organischer Substanz in Böden besser zu verstehen und das vorhandene Wissen hierüber zu erweitern. Hierzu wurden fünf verschiedene Bodenprofile aus Hessen mit unterschiedlicher mineralogischer Zusammensetzung untersucht. Um die Auswirkungen verschiedener physikalischer und geochemischer Faktoren auf den Gehalt organischer Substanz in den untersuchten Böden festzustellen, wurden folgende Parameter untersucht: -Tonmineralogie, -organische Kohlenstoff- und Stickstoff-Konzentrationen, -%-Kationensättigung, -spezifische Oberfläche, -dithionit- und oxalatlösliche Gehalte an Fe, Al und Mn. Anhand dieser Parameter wurden weiterführende statistische Analysen unter Verwendung der Statistiksoftware SPSS für Windows durchgeführt, um mögliche statistische Zusammenhänge aufzudecken, die für die Stabilisierung von organischem Kohlenstoff in den betrachteten Böden verantwortlich sind. Die im Rahmen der vorliegenden Dissertation ermittelten Ergebnisse zeigen, dass der Tonanteil und die Tonmineralogie der untersuchten Böden nur einen begrenzten Einfluss auf die Stabilisierung organischer Substanz haben. Weiterhin wird gezeigt, dass die in der Literatur propagierte Beziehung zwischen spezifischer Oberfläche und der Konzentration organischen Kohlenstoffs nicht auf alle Böden anwendbar ist. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Präsenz von amorphen Eisen- und Aluminiumoxiden der wichtigste Einflussfaktor für die Fixierung von organischem Material in den untersuchten Böden ist. Die größeren Konzentrationen von organischem Kohlenstoff in den kleinsten Fraktionen (Feinschluff und Ton) der Profile sind vor allem darauf zurückzuführen, dass Oxide ebenfalls in diesen Fraktionen aufzufinden sind. Tonminerale haben demnach eine sekundäre Bedeutung, indem sie Komplexe mit den Oxiden bilden, die zur Stabilisierung von organischer Substanz führen können. Insgesamt deuten die Ergebnisse daraufhin, dass Böden keine geeignete Senke für die langfristige Speicherung von organischem Kohlenstoff sind. Obwohl Mechanismen wie die Adsorption von organischer Substanz an Oxide die Stabilisierung organischen Materials unterstützen, scheinen diese nicht stark genug zu sein, um eine permanente Speicherung von organischem Kohlenstoff zu bewirken.
Die Hyperhomocysteinämie wird als unabhängiger Risikofaktor atherosklerotischer Gefäßerkrankungen angesehen. Viele Studien haben eine deutliche Korrelation zwischen Hyperhomocysteinämie, koronarer Herzkrankheit, cerebrovaskulären und peripheren thromboembolischen Erkrankungen aufgezeigt. Aus diesem Grund hat natürlich die Homocysteinbestimmung in die diagnostischen Maßnahmen, die bei Verdacht auf Arteriosklerose durchgeführt werden, Eingang gefunden. Mit der Zielsetzung, ein zuverlässiges und standardisiertes Verfahren für die Routinediagnostik bereitzustellen, wurde im Rahmen dieser Dissertation eine quantitative HPLC-Methode zur Bestimmung von Homocystein im Blut etabliert. Weiterhin erfolgte auch eine Homocysteinbestimmung mit dem ELISA und im Anschluß daran ein Methodenvergleich zwischen HPLC und ELISA. Der Methodenvergleich ergab, daß die ELISA-Homocysteinwerte immer um etwa 4,77% niedriger lagen als die HPLC-Homocysteinwerte. Dies bestätigte auch die Literatur. Die wichtigste Aufgabenstellung dieser Doktorarbeit war allerdings die Suche nach einer neuen genetischen Mutation auf dem MTHFR-Gen mittels Probenscreening von Patienten mit Hyperhomocysteinämien. Die katalytische Domäne der MTHFR liegt im N-terminalen Bereich des Proteins. Dieser Bereich entspricht Exon 1 bis Exon 6 des MTHFR-Gens. Folglich wurde für diese Exonbereiche 1,2,3,4,5 und 6 das Mutationsscreening etabliert. Dieses ließ sich mit der Temperaturgradientengelelektrophorese (TGGE) erfolgreich durchführen, wobei für jeden Exonbereich 300 Proben aus der Luric-Studie durchgemessen worden sind. LURIC steht für LUdwigshafener RIsikofaktor- und Cardiovaskuläre Gesundheits-Studie. Das Ziel dieser Untersuchungen ist das Erkennen neuer Risikofaktoren für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, insbesondere die zum Herzinfarkt führen. Für alle Probenwerte erhielten wir Angaben über Geschlecht, Geburtsdatum, Größe, Gewicht, KHK-Status, Hypertonie, Diabetes mellitus, Homocystein, Vitamin B6, Vitamin B12 und Folsäure. Nach eingehender Betrachtung ließen sich nun drei Kollektive mit unterschiedlichen Homocystein-/ Folsäurewerten ermitteln, welche dann durchgescreent wurden: Das erste Kollektiv erfaßt Homocysteinwerte, welche größer als 16µmol/l sind und zwar unabhängig von den Folsäurewerten. Das zweite Kollektiv enthält Homocysteinwerte, welche größer als 10µmol/l sind und Folsäurewerte, welche ebenfalls größer als 10 µmol/l sind. Das dritte Kollektiv ist das größte und enthält die übrigen Werte, welche negativ auf schon bekannte Mutationen auf Exon 4 und Exon 7 sind. Dieses Kollektiv wurde hier zunächst betrachtet und enthält etwa für jeden Exonbereich 200 Proben. Bei jeder Art von Korrelationsuntersuchungen in den einzelnen Kollektiven (1. Kollekiv, 2. Kollektiv, 3. Kollektiv, homozygotes Kollektiv, heterozygotes Kollektiv und Referenzkollektiv) konnte zwischen Homocystein und Folsäure, zwischen Homocystein und Vitamin B12, zwischen Homocystein und Vitamin B6 und Homocystein und dem Alter keine Korrelation festgestellt werden. Die Korrelationen lagen alle unter -0,5 und 0,3. Einen negativen Korrelationskoeffizienten weisen die Parameter Homocystein/Folsäure, Homocystein/Vitamin B12 und Homocystein/Vitamin B6 auf. Einen positiven Korrelationskoeffizienten weisen Homocystein und das Alter auf. Bei den Signifikanzuntersuchungen ergab sich, daß fast alle Mittelwerte der einzelnen Kollektive signifikant unterschiedlich sind. Die Mittelwerte aller Kollektive von Folsäure/Homocystein, Vitamin B12/Homocystein und das Alter/Homocystein sind signifikant unterschiedlich Nur bei dem Vergleich Vitamin B6/Homocystein ist bei den meisten Kollektiven keine Signifikanz festgestellt worden. D. h. diese Mittelwerte sind annähernd gleich, sie sind nicht bedeutend unterschiedlich. Nur das 1. Kollektiv und das homozygote Kollektiv sind bei dem Vergleich der Mittelwerte Vitamin B6/Homocystein signifikant unterschiedlich. Mit Hilfe der TGGE und anschließender Sequenzierung konnten drei verschiedene Mutationen identifiziert werden: Auf Exon 4 ließ sich eine bekannte Mutation und zwar die (C-677-T) mit dem Basenaustausch Alanin gegen Valin an Patient 540 und Patient 786 feststellen. Dies ließ sich auch durch eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym Hinfl bestätigen. Auf Exon 6 konnte eine stille Mutation mit dem Basenaustausch (T-1068-C) an zwei Patienten (762 und 624) identifiziert werden. Die Aminosäure Serin bleibt hierbei erhalten (AGT-AGC). Auf Exon 5 ließ sich eine interessante Mutation erkennen, welche weitere Messungen wie Enzymaktivität und Familienanamnesen erfordert. Am Patient 569 entsteht hier durch einen Basenaustausch (C-844-T) aus der Aminosäure Glutamin (CAG) ein Stopcodon (TAG). Dies ließ sich weiterhin durch eine Restriktionsanalyse mit dem Enzym Mae III bestätigen. Erhöhte Homocysteinspiegel und reduzierte MTHFR-Aktivitäten erklären ebenfalls das Mutationsergebnis. Auch die Familienanamnese ergab eine interessante Entdeckung. Die gleiche Mutation (C-844-T) vom Patienten 569 ließ sich auch bei seinem Bruder feststellen. Damit wurde die Mutation vererbt und ereignete sich nicht spontan.
Die NO/cGMP-Kaskade spielt bei der nozizeptiven Transmission im Hinterhorn des Rückenmarks eine wichtige Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden bekannte cGMP-Targets (PKG-1, CNG-Kanäle, PDE-2 und -3) sowie synaptische Vesikelproteine (Synapsin 2, Rabphilin) als potentielle Targets der NO/cGMP-Kaskade mit Hilfe von molekularbiologischen Methoden und nozizeptiven Verhaltensstudien hinsichtlich einer Beteiligung an der nozizeptiven Transmission im Rückenmark untersucht. Im Formalintest reduzierte der PKG-1-Inhibitor Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,5 µmol i.t.) die nozizeptive Antwort, während der PKG-1-Aktivator 8-Br-cGMP in hoher Dosis (2,5 µmol i.t.) einen gegenteiligen Effekt zeigte. Überraschenderweise wirkte 8-Br-cGMP in niedriger Dosis (0,1 - 0,25 µmol i.t.) antinozizeptiv, was durch die gleichzeitige Applikation des PKG-Inhibitors weiter verstärkt wurde. Im Gegensatz zu Rp-8-Br-cGMPS oder 8-Br-cGMP beeinflussten weder der CNG-Kanal-Inhibitor L-cis-Diltiazem (0,5 mg i.t.), noch die PDE-Inhibitoren EHNA (0,25 µmol i.t.) oder Milrinon (5 - 10 mg/kg i.p.) die nozizeptive Antwort im Formalintest. Mit Western Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Formalininjektion in eine Hinterpfote im Lumbalmark nach 48 - 96 h eine Steigerung der PKG-1-Proteinkonzentration zur Folge hat. Dies wurde durch Vorbehandlung der Versuchstiere mit Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,5 µmol i.t.) oder Morphin (2,5 - 5 mg/kg i.p.) verhindert, während 8-Br-cGMP (2,5 µmol i.t.) die Formalin-induzierte Steigerung der PKG-1-Konzentration im Lumbalmark verstärkte. Die Formalininjektion in eine Hinterpfote veränderte auch die Synapsin 2b-Konzentration im Lumbalmark: 10 min bis 8 h nach der Injektion wurde die Synapsin 2b-Proteinkonzentration gesenkt, nach 48 h war jedoch eine Zunahme zu beobachten. Diese späte Zunahme der Synapsin 2b-Proteinkonzentration wurde durch eine Steigerung der Genexpression hervorgerufen, denn mit quantitativer Realtime RT-PCR wurden erhöhte mRNA-Konzentrationen 24 - 48 h nach der Formalininjektion gemessen. Die rasche Formalin-induzierte Abnahme der Synapsin 2b-Proteinkonzentration ging jedoch weder mit Änderungen der mRNA-Konzentration, noch mit veränderten Solubilisierungseigenschaften bei der Proteinaufbereitung einher, und wurde durch Vorbehandlung der Versuchstiere mit Morphin (10 mg/kg i.p.), Diclofenac (10 mg/kg i.p.), Metamizol (1 g/kg i.p.) oder dem NOS-Inhibitor L-NAME (10 - 100 mg/kg i.p.) verhindert. Demgegenüber führte die Vorbehandlung mit dem NO-Donor NOC-5 (4 - 20 µg i.t.), 8-Br-cGMP (0,1 - 2,5 µmol i.t.), Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,25 µmol i.t.) oder der Kombination von 8-Br-cGMP und Rp-8-Br-cGMPS (0,1 + 0,1 und 0,5 + 0,5 µmol i.t.) zu einer Verstärkung der Formalin-induzierten raschen Senkung der Synapsin 2b-Konzentration. Die funktionelle Relevanz dieser Befunde wurde in mehreren nozizeptiven Tiermodellen überprüft. Durch eine kontinuierliche i.t. Infusion von Antisense-Oligonukleotiden wurde die Synapsin 2-Konzentration im Lumbalmark der Ratte gesenkt, was eine Reduktion der nozizeptiven Antwort im Formalintest zur Folge hatte. Bei Synapsin 2-Knockout-Mäusen war im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine verminderte nozizeptive Antwort im Formalintest und eine Reduktion der mechanischen Hyperalgesie bei Zymosan-induzierter Pfotenentzündung zu beobachten. Im Hot-Plate-Test zeigten die Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen kürzere Latenzzeiten. Im Gegensatz zu Synapsin 2b wurde die Rabphilin-Konzentration im Lumbalmark durch Formalininjektion in eine Hinterpfote nicht beeinflusst. Allerdings führte die Verabreichung von Metamizol (500 mg/kg i.p.) oder Diclofenac (5 mg/kg i.p.) nach 1 h zu einer Steigerung der Rabphilin-Proteinkonzentration, welche nicht von Änderungen der mRNA-Expression begleitet war. Eine Senkung der Rabphilin-Proteinkonzentration wurde durch Applikation von NOC-5 (4 - 20 µg i.t.), 8-Br-cGMP (0,5 - 2,5 µmol i.t.), oder Rp-8-Br-cGMPS (0,1 - 0,25 µmol i.t.) hervorgerufen. Zusammenfassend bestätigen diese Ergebnisse die Hypothese, dass im Rückenmark PKG-1 einen Effektor der NO-induzierten Hyperalgesie darstellt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass NO/cGMP über noch unbekannte Mechanismen die Verfügbarkeit bestimmter synaptischer Vesikelproteine moduliert, die vor allem bei starker oder anhaltender nozizeptiver Erregung für die Transmitterausschüttung und damit für die nozizeptive Transmission notwendig sind. Interessanterweise führt NO/cGMP über diese Mechanismen eher zur Hemmung der Nozizeption, was die bei niedrigen intrathekalen Dosen beobachteten antinozizeptiven Effekte von 8-Br-cGMP erklären kann. Die These der NO-induzierten Hyperalgesie kann aufgrund der Untersuchungen in dieser Arbeit und früherer Studien um eine insbesondere in niedriger Dosis auftretende NO/cGMP-vermittelte Antinozizeption erweitert werden.
An den Folgen der HIV-Infektion sind bisher mehr als 15 Millionen Menschen gestorben und die Zahl der Neuinfektionen wächst ständig. Nach Einführung der hochaktiven antiretroviralen Kombinationstherapie (HAART) 1995 konnte die HIV-Replikation im Patienten unterdrückt und der Verlauf der Krankheit verzögert werden. Aber die Bildung resistenter HIV-Stämme während der Therapie und die hohe Toxizität der Medikamente limitieren diese Erfolge. Einen neuen Therapieansatz bietet die genetische Modifikation von T-Lymphozyten zur "intrazellulären Immunisierung" der Zielzellen von HIV. Dabei werden die Zellen mit einem retroviralen Vektor transduziert und exprimieren ein antivirales Gen, das sie vor der HIV-Infektion schützt. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Laer wurde der retrovirale Vektor M87- Ineo entwickelt, der die Expression des membranverankerten Fusionsinhibitors C36/T20 auf der Zelloberfläche ermöglicht. Durch das Peptid sind die Zielzellen effizient vor der Infektion mit HIV geschützt (Hildinger et al., 2001). Das therapeutische Gen von M87-Ineo besteht aus dem Signalpeptid von LNGFR für die Translokation in das ER, dem inhibitorischen Peptid C36/T20, das von HIV-1 gp41 abgleitet ist, einem flexiblen Linker sowie aus der Transmembrandomäne von LNGFR für die Verankerung in der Plasmamembran. In der vorliegenden Arbeit wurde dieser retrovirale Vektor erfolgreich für die klinische Applikation zur Gentherapie der HIV-Infektion optimiert. Ziel war es, die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu minimieren, die Expression zu erhöhen sowie der Resistenzbildung entgegenzuwirken. Der Linker im Basiskonstrukt M87-Ineo ist abgeleitet aus dem Gelenk des murinen Antikörpers von IgG2 und verleiht dem Hemmpeptid Flexibilität. Um die potentielle Immunogenität des exprimierten Peptides zu reduzieren, wurde der Linker des murinen Antikörpers IgG2 durch Gelenke ("Hinge") von humanen Antikörpern der IgG-Klasse ersetzt. Das Konstrukt mit der humanen "Hinge" von IgG2 exprimierte genauso hoch wie das Basiskonstrukt und hemmte mindestens so effizient die HIV-Replikation. Durch die N-terminale Verlängerung des C-Peptids um 10 Aminosäuren konnte das Risiko der Resistenzbildung minimiert werden. Das verlängerte C-Peptid war in der Lage, HIV-Hüllproteine zu hemmen, die gegen das C36/T20-Peptid resistent sind. Das optimierte Peptid von M87o bestand somit aus dem Membrananker von trunkiertem CD34, dem Linker von humanem IgG2 sowie aus dem verlängerten C-Peptid (C46). Weiterhin wurde ohne Verlust der Expression oder Hemmwirkung des membranverankerten C-Peptids ein RNAElement (RRE decoy) erfolgreich als weiteres Hemmprinzip in den Vektor eingefügt, um die Bildung resistenter HIV-Stämme zu unterbinden. Durch Einsatz eines optimierten Leaderelementes im retroviralen Vektor konnte die Expression des inhibitorischen Peptides mehr als verzehnfacht werden. Damit konnte das Peptid und dessen Hemmung erstmals auch in primären Zellen nachgewiesen werden. Der Vergleich zwischen dem Basiskonstrukt M87-Ineo und dem optimierten Konstrukt M87o-RRE-Ineo zeigte, dass die erhöhte Expression auch mit einer wesentlich verbesserten Hemmwirkung einherging. In Zell-Zellfusionsassays wurde außerdem nachgewiesen, dass die Wirkung des C-Peptids auf der Hemmung des Viruseintritts von HIV in die Zelle beruht. Für die klinische Applikation wurde der Vektor M87o-RRE konstruiert, der die optimalen Vektorelemente und Peptidmodule enthielt, aber aus dem das Neomycin-Resistenzgen entfernt wurde. Dies führte zu einer nochmals höheren Expression des C-Peptids sowie zur weiteren Verminderung der Immunogenität des retroviralen Vektors. Das Markergen wurde ohnehin nicht mehr benötigt, da die genetisch modifizierten Zellen aufgrund der hohen Transgenexpression einfach detektiert werden konnten. Der optimierte Vektor M87o-RRE hemmte die HIV-Replikation so effizient, dass bisher keine resistenten Stämme isoliert werden konnten. Bei Toxizitätsstudien in Maus und Rhesusmacaquen konnten keine Nebenwirkungen oder Immunogenität beobachtet werden. Durch die erfolgreiche Optimierung steht nun für die klinische Studie der Phase I der bestmögliche retrovirale Vektor zur Verfügung.
Das Philadelphia-Chromosom (Ph) ist das zytogenetische Korrelat der t(9;22). 95% der chronisch myeloischen Leukämien (CML) und 20-25% der akuten lymphatischen Leukämien (ALL) des Erwachsenen sind Ph-positiv (Ph+). Die t(9;22) führt zur Expression des chimären BCR/ABL Fusionsproteins, das für die Pathogenese der Ph+ Leukämien verantwortlich ist. Das ABL-Protein ist eine nicht-Rezeptor Tyrosinkinase. Im BCR/ABL-Fusionsprotein wird die Kinase-Aktivität von ABL, die im Normalfall streng reguliert ist, durch die Fusion mit BCR konstitutiv aktiviert. Die N-terminale BCR-"coiled-coil" Domäne vermittelt die Oligomerisierung des Fusionsproteins und dadurch zur Aktivierung der ABL-Kinase. Dies führt zur malignen Transformation hämopoetischer Zellen. Der ABL-Kinaseinhibitor STI571 ist ein tumorzellspezifisches Therapeutikum für Ph+ Leukämien, das bei der Mehrzahl der Patienten zur hämatologischen Vollremission führt. Insbesondere bei Patienten mit CML-Blastenkrise und Ph+ ALL kommt es durch klonale Selektion STI571-resistenter Zellen zu einem frühen Therapie-refraktären Rezidiv der Krankheit. Ziel dieser Arbeit war es, die Grundlagen für neue, tumorzellspezifische Therapiestrategien für die Behandlung BCR/ABL-positiver Leukämien zu legen. Im ersten Teil der Arbeit sollte geklärt werden, ob sich die "coiled-coil" Domäne als Zielstruktur für einen molekularen Therapieansatz eignet: es wurde untersucht, ob eine Hemmung der Oligomerisierung das Transformationspotential von BCR/ABL negativ beeinflußt. Der Zusammenhang zwischen Oligomerisierung und Transformationspotential von BCR/ABL wurde mit Hilfe verschiedener Fusionskonstrukte untersucht, bei denen die Oligomerisierungsdomänen verschiedener Proteinen, (BCR, PML, PLZF und TEL) mit dem ABL-Teil von BCR/ABL fusioniert wurden (X-ABL). Es konnte gezeigt werden, daß ein direkter Zusammenhang zwischen der Oligomerisierung, Transformationspotential und STI571-Sensitivität besteht: verstärkte Oligomerisierung der X-ABL Konstrukte führte zu einem ein höheren Transformationspotential und einer geringeren STI571-Sensitivität und umgekehrt. Außerdem wurde gezeigt, daß die Inhibierung der Oligomerisierung mit Hilfe eines rekombinanten Peptids das Transformationspotential von BCR/ABL erniedrigt und gleichzeitig die Sensibilität gegenüber STI571 stark erhöht. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Oligomerisierungsdomäne von BCR/ABL einen therapeutischer Angriffspunkt für die Behandlung Ph+ Leukämien darstellt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Tumorzell-spezifische Mechanismus der As2O3-induzierten Apoptose bei Ph+ Zellen untersucht. Kürzlich wurde gezeigt, daß aktiviertes RAS die Expression von endogenem PML hochreguliert. RAS wird durch BCR/ABL konstitutiv aktiviert. Bei der Akuten Promyelozytenleukämie (APL) ist PML im Rahmen der t(15;17) durch die Fusion mit RARa modifiziert. Die Behandlung von Zellen mit As2O3 führt zur Modifikation von PML durch den "small ubiquitin like modifier" (SUMO-1). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sich die Gemeinsamkeiten zwischen Ph+ CML und ALL-Blasten und den t(15;17) positiven APL-Blasten in Hinsicht auf die Sensibilität für die As2O3-induzierte Apoptose auf die direkte oder indirekte Modifikation von PML durch die jeweiligen Translokationsprodukte zurückführen lassen. In dieser Arbeit wurde mittels Überexpression von PML und konstitutiv aktiviertem RAS (RASV12) gezeigt, daß BCR/ABL durch Aktivierung des RASSignalweges die PML-Expression modifiziert und die As2O3-induzierte Apoptose Ph+ Zellen somit durch PML vermittelt wird. An einem Mausmodell der Ph- Leukämie wurde die Wirkung von As2O3 auf die normale Hämopoese sowie auf die BCR/ABL-positive Leukämie überprüft. Es konnte gezeigt werden, daß As2O3 die normale Hämopoese nicht stört und bei 25% der behandelten Tiere zu einer Verbesserung des Blutbildes und einem längerem Überleben führt. Sowohl das therapeutische Angreifen an der Oligomerisierungsoberfläche von BCR/ABL als auch das Ausnützen der Modifikation von PML durch BCR/ABL eröffnen neue Möglichkeiten zur Behandlung von Ph+ Leukämien.
Viele mikroskopische Vorgänge in Festkörpern und molekularen Verbindungen sind verbunden mit Änderungen ihres Magnetisierungszustandes. Dies macht den Einsatz externer Magnetfeldsensoren interessant, die sich über wohlbekannte Effekte kalibrieren ließen und dann im Messeinsatz quantitative Aussagen liefern können. Nun laufen viele der interessanten magnetischen Vorgänge in besagten Materialien auf sehr schnellen Zeitskalen im Piko- und Subpikosekundenbereich ab. Kein etablierter Magnetfeldsensor kann diese Anforderung leisten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine systematische Untersuchung verschiedener Ansätze zum Bau ultraschneller Magnetfelddetektoren durchgeführt. Ein Teil der Arbeit beschäftigt sich mit dem Potential photokonduktiver Ringantennen als Emitter und Detektor für ultraschnelle Magnetfelder. Ein alternativer Ansatz zur Messung transienter Magnetfelder besteht in der Verwendung magnetooptischer Sensoren, wie sie in verschiedenen Anwendungen, in denen keine Zeitauflösung gefordert wird, bereits zum Einsatz kommen (z. B. in der Faradaymikroskopie). Es wird eine für ultraschnelle Magnetooptik vielversprechende Materialklasse als Sensormaterial vorgestellt: die DMS-Systeme. Das sind magnetisch dotierte Verbindungshalbleiter, die in der Umgebung ihrer exzitonischen Resonanzen gewaltige Verdetkonstanten aufweisen. Parallel zu den DMS-Systemen wird das Verhalten eines dotierten Eisengranats untersucht, der als Ferrimagnet völlig andere Voraussetzungen als Messsensor bietet. Darüber hinaus werden verschiedene experimentelle Techniken zur Messung magnetooptischer Phänomene vorgestellt und ihre Vor- und Nachteile ausführlich diskutiert. Es wird ein Verfahren entwickelt, das trotz des Einsatzes der hochempfindlichen Differenzdetektion eine gewisse spektrale Auflösung gewährleistet und deshalb den Betrieb der DMS-Systeme als magnetooptische Sensoren erst ermöglicht. Es werden für die verschiedenen Messmethoden und magnetooptischen Materialien die Grenzen der Nachweisempfindlichkeit analysiert und ihre Eignung als schnelle Detektoren untersucht. Die verschiedenen Vor- und Nachteile der beiden Sensorsubstanzen wird anhand der gemessenen magnetischen Transienten detailliert analysiert. Anschließend wird das Optimierungspotenzial der beiden Materialklassen hinsichtlich ihrer chemischen Zusammensetzung ausgearbeitet und dargestellt.
Mithilfe der klinischen Routinemethode, TRAK-Assay®, wurden bei Patienten TSH-Rezeptor-Antikörpern (TRAK) nachgewiesen, um die Diagnose M. Basedow zu erhärten oder auszuschließen. Diese Methode ist aber nur in der Lage die Gesamtheit aller TRAK zu erfassen. In dieser Studie wurde eine andere Methode, der cAMP-Assay verwendet, bei welchem Chinesische Hamster Ovarien (CHO)-Zellen eingesetzt wurden, die auf ihrer Oberfläche stabil exprimierte humane TSH-Rezeptoren besitzen, und welcher in der Lage ist, zwischen dem Vorhandensein von funktionsstimulierenden und funktionsblockierenden Antikörpern zu unterscheiden. Die Differenzierung zwischen diesen verschiedenen Antikörper-Typen kann wichtige Hinweise dafür liefern, warum das klinische Bild bei vielen Erkrankten nicht mit dem Vorhandensein oder der Höhe der TRAK korreliert und Anhaltspunkte über die Prognose über den weiteren Verlauf der Erkrankung geben. Große Patientenkollektive von insgesamt mehr als 300 Patienten wurden auf das Vorhandensein von TRAK im Serum untersucht, getrennt nach TRAK mit stimulierender und blockierender Funktion. Neben Patienten mit M. Basedow wurden in diese Studie auch Patienten einbezogen, welche an Hashimoto-Thyreoiditis, an einer anderen Autoimmunerkrankung, an nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen oder an Thyreoiditis de Quervain erkrankt waren. Bei Patienten mit M. Basedow wurde außerdem der Einfluß der thyreostatischen Behandlungsdauer auf das Auftreten von TRAK mit stimulierender und blockierender Funktion untersucht. Material und Methode Es wurde die CHO- Zelllinie JP 26 verwendet. Die Zellen wurden kultiviert mit IMDM- Medium, 100 U/ml Penicillin, 100 U/ml Streptomycin, 5% FCS in einer 5%igen CO2-Atmosphäre bei 37°C. Für den cAMP-Assay wurden die Zellen in 96-Well-Platten angezüchtet. 24 Stunden später wurden die CHO-Zellen, nach Entfernung des Kulturmediums, zur Ermittlung funktionsstimulierender TRAK, mit 60 µl hypotonem KRB- Puffer, 20 µl IMBX (Isobutylmethylxanthine) und 20 µl Patientenserum für zwei Stunden inkubiert. Zur Ermittlung funktionsblockierender TRAK wurden 40 µl KRB, 20 µl IMBX, 20 µl Patientenserum und 20 µl TSH (Konz. 0,5 mU/ml) verwendet. Die cAMP-Konzentration wurde mittels eines kompetitiven Radioimmunoassays (BIOTRAK® cAMP) und eines Gamma-Counters gemessen. Ergebnisse Mit dieser Methode läßt sich zeigen, dass nicht nur bei Patienten mit M. Basedow signifikant hohe Titer mit funktionsstimulierenden und funktionsblockierenden Antikörpern vorhanden sind. Funktionsstimulierende TRAK wurden bei 25,7% der Hashimoto-Thyreoiditis-Patienten, bei 5,56% der Patienten mit schilddrüsenunabhängigen Autoimmunerkrankungen (M. Addison, Diabetes mellitus Typ 1) und bei 17,4% der Patienten mit nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen detektiert. Funktionsblockierende TRAK waren in signifikanter Höhe bei 19,15% der Patienten mit Hashimoto-Thyreoiditis, bei 27,78% mit schilddrüsenunabhängigen Autoimmunerkrankungen und bei 50% mit nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen aufzufinden. Die Gruppe der Thyroiditis-de Quervain-Patienten zeigte keine signifikanten Unterschiede im Vorkommen von Antikörpern zur Kontrollgruppe. In der Gruppe der M. Basedow-Patienten konnten bei 52,1% funktionsstimulierende Antikörper entdeckt werden. Bei den Patienten, welche weniger als vier Wochen thyreostatisch behandelt wurden, konnten in ca. 10% mehr Antikörper-positive Fälle detektiert werden, als bei Patienten mit einer Behandlungsdauer von mehr als neun Monaten. Nur 9,62% der M. Basedow-Patienten hatten laut cAMP-Assay TRAK mit blockierender Funktion. Diese verteilen sich ausschließlich auf Patienten, welche seit mindestens neun Monaten in thyreostatischer Behandlung waren. Der hier verwendete cAMP ist ein geeignetes Verfahren zur Differenzierung unterschiedlicher TRAK-Typen, was mit dem herkömmlichen TRAK-Assay® nicht möglich ist. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass Antikörper gegen den TSH-Rezeptor nicht nur bei Patienten mit M. Basedow vorkommen, sondern auch bei Patienten anderer Schilddrüsen- und Autoimmunerkrankungen. Es wird außerdem deutlich, dass eine thyreostatische Behandlung mit einer Dauer über neun Monaten bei M. Basedow-Patienten zum gehäuften Auftreten von funktionsblockierenden Antikörpern führt.
Einleitung und Zielsetzung: In der vorliegenden Arbeit sollte der Nachweis von TSH-Rezeptorantikörpern mittels eines Bindungsassays und JP26- Zellen erbracht werden. TSH-Rezeptorantikörper (TRAK) werden in Seren von vielen Patienten mit einer Autoimmunthyreoiditis entdeckt. Der in dieser Arbeit ausgewählte Radioimmunassay verwendet chinesische Hamster Ovarienzellen (CHO-Zellen), die humanen TSH-Rezeptoren exprimieren. Der Bindungsassay basiert auf dem Prinzip der Verdrängung von radioaktiv markiertem bovinem-TSH (Tracer) durch vorhandene TSH-Rezeptorantikörper im Patientenserum. Dabei ist es nicht entscheidend, ob es sich um funktionsblockierende oder funktionsstimulierende TRAK handelt. Der verwendete Bindungsassay gilt als einer der sensitivsten, kompetitiven Bindungsassays für die Detektion von TRAK und kann deshalb ein relevanter Verlaufsmarker bei Patienten mit Morbus Basedow und Hashimoto sein. Material und Methode: Die JP26-Zellen wurden ausgewählt, weil sie sich mit einer Anzahl von 2.000 TSH-Rezeptoren an ihrer Oberfläche gut mit der TSH-Rezeptordichte humaner Thyreozyten vergleichen lassen. Die verwendeten Patientenseren wurden unterteilt in 5 Gruppen: Gruppe 1: Morbus Basedow (n = 85), Gruppe 2: Kontrollgruppe (n = 76), Gruppe 3: Hashimoto-Thyreoiditis (n = 29), Gruppe 4: Andere Autoimmunerkrankungen (n = 14), Gruppe 5: Nicht-autoimmune Schilddrüsenerkrankungen (n = 38). Die Morbus Basedow-Gruppe wurde zusätzlich untergliedert in floride und länger als 9 Monate behandelte Gruppen sowie in TRAK positive und TRAK negative Gruppen: Gruppe 1A: floride und positive TRAK, Gruppe 1B: floride und negative TRAK, Gruppe 1C: behandelt und positive TRAK, Gruppe 1D: behandelt und negative TRAK. Die kultivierten JP26-Zellen wurden mit einer Zellanzahl von 300.000 Zellen / Well zusammen mit IMDM-Medium in 24-Lochplatten aufgeteilt. Am nächsten Tag wurden die in 5 %iger CO2-Atmosphäre bei 37°C inkubierten Lochplatten mit PBS gewaschen. Danach wurde 150 ml modifizierter KRB-Puffer, 50 ml Serum und 50 ml 125 I-bTSH in jede Vertiefung pipettiert. Die bestückten Lochplatten wurden diesmal bei 4°C über 24 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die JP26-Zellen mit 0,5 ml 4 °C kalten KRB-Puffers gewaschen und mit 0,5 ml 1 N Natronlauge (NaOH) gelöst. Die verbliebene Radioaktivität wurde zuletzt im gamma-Counter gemessen. Ergebnisse: Gruppe 1: 31 %, Gruppe 2: 5 %, Gruppe 3: 17 %, Gruppe 4: 0 %, Gruppe 5: 16 %. Gruppe 1A: 80 %, Gruppe 1B: 0 %, Gruppe 1C: 36 %, Gruppe 1D: 14 %. Schlußfolgerung: Die Sensitivität der TRAK-Nachweise in der MB-Gruppe war entgegen aller Erwartungen niedriger als im Routinelabor. Dies lag vermutlich auch an einer sehr hohen Affinität des verwendeten bovinen-TSH-Tracers für TSH-Rezeptoren. Es fanden sich jedoch bemerkenswerte Ergebnisse in der Gruppe der Hashimoto- Thyreoiditis und der nicht-autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen. In beiden Gruppen konnten in mehreren Seren ( 17 bzw. 16 % ) positive TRAK-Werte nachgewiesen werden. Daraus läßt sich schließen, daß die in vorliegender Arbeit angewendete Untersuchungsmethode eine höhere Sensitivität zum Nachweis von TRAK bei Hashimoto- Thyreoiditis besitzt. Gewichtige und neueste Studien, sowie Ergebnisse von Untersuchungen der gleichen Arbeitsgruppe, die sich mit zwei unterschiedlichen Assays zur Unterscheidung funktionsblockierender und funktionsstimulierender TRAK befaßt haben, stützen diese Aussage. Letztlich liegt der Schluß nahe, daß es sich bei den in diesen beiden Gruppen nachgewiesenen TSH-Rezeptorantikörpern, um überwiegend funktionsblockierende TRAK handelt. Dagegen erscheint zum TRAK-Nachweis, insbesondere funktionsstimulierender TRAK bei Morbus Basedow Patienten, die Anwendung einer auf kompetitiver Hemmung beruhende Untersuchungs-methode nur unzureichend sensitiv. Das in vorliegender Arbeit angewendete Verfahren eignet sich offenbar vergleichsweise besser zur Detektion funktionsblockierenden TRAK.
Verschiedene Nanopartikel, darunter Gelatine- und Albuminnanopartikel und Cyanoakrylatnanopartikel mit Butyl- und Hexylseitenketten, wurden in dieser Arbeit auf ihre Tauglichkeit als Trägersystem zum Einsatz für einen späteren Gentransfer in Bronchialepithelzellen erprobt. In der Zellkultur wurden dazu an primären humanen Bronchialepithelzellen und an der Zelllinie 16HBE14o Zytotoxizitätstest nach Inkubation mit oben genannten Nanopartikeln durchgeführt. Weiterhin wurden qualitative und quantitative Aspekte der Anreicherung von fluoreszenzmarkierten Gelatine- und Albuminnanopartikeln in diese Zellen mit dem konfokalen Laserrastermikroskop und dem Durchflußzytometer untersucht. Zusätzlich evaluiert wurde die inflammatorische Potenz von Gelatine- und Albuminnanopartikeln mittels einer quantitativen Interleukin-8-Bestimmung. Es konnte gezeigt werden, dass Cyanoakrylate aufgrund eines hohen zytotoxischen Effekts nicht für die Behandlung von Bronchialepithelzellen geeignet sind. Hierbei zeigten Cyanoakrylate mit kurzen Butylseitenketten eine ausgeprägtere Zytotoxizität als jene mit langen Hexylseitenketten. Gelatine- und Albuminnanopartikel hingegen zeichneten sich durch sehr geringe bis fehlende Zytotoxizität aus. Mit dem konfokalen Laserrastermikroskop konnte die Aufnahme von fluoreszenzmarkierten Gelatine- und Albuminnanopartikel in das Zellinnere von primären Bronchialepithelzellen dokumentiert werden. Erstmals wurde somit eine Nanopartikelaufnahme in Zellen nachgewiesen, die nicht zum mononukleären Phagozytensystem gehören. Die Versuche zur zellulären Aufnahme der Nanopartikel mit verschiedenen Inkubationsbedingungen zeigten, dass primäre Bronchialepithelzellen und 16HBE14o-Zellen Gelatine- und Albuminnanopartikel in einem aktiven, stoffwechselabhängigen Prozess aufnehmen, der am ehesten der Phagozytose entspricht. Ferner haben sich Albuminnanopartikel im Rahmen dieser Versuche als bioadhäsiv erwiesen. Mit dem Durchflußzytometer ließ sich schließlich eine Konzentrationsabhängigkeit der Aufnahme fluoreszenzmarkierter Gelatine- und Albuminnanopartikel zeigen und feststellen, dass alle Zellen einer Zellpopulation von primären Bronchialepithelzellen oder 16HBE14o-Zellen Nanopartikel aufnehmen. Selbst primäre Zellen, die durch die Kultur auf Membraneinsätzen auf einem hohen Differenzierungsniveau gehalten wurden, nahmen Nanoparikel auf. Eine quantitative Interleukin-8-Bestimmung zeigte schließlich, dass Gelatine- und Albuminnanopartikel keine Inflammation in primären humanen Bronchialepithelzellen und der Zelllinie 16HBE14o verursachen. Abschließend lässt sich sagen, dass die hier erprobten Nanopartikel bezüglich ihrer Zytotoxizität und ihrem inflammatorischem Potenzial als geeignet für den Gentransfer erscheinen. Die Aufnahme der Nanopartikel in das Zellinnere ist vielversprechend für eine spätere Expression von Transgenen in Bronchialepithelzellen.
Durch Integration beziehungsweise Deletion einzelner oder mehrerer Gene der Carotinoidbiosynthese wurden Cyanobakterien-Transformanten mit einem vom Wildtyp abweichenden Carotinoidgehalt oder einer veränderten Carotinoidzusammensetzung hergestellt. Anhand dieser Transformanten wurden die Auswirkungen der geänderten Carotinoidkomposition auf die Photosyntheseleistung und besonders auf den Schutz der Photosynthese vor Schädigungen durch Starklicht untersucht. Die Integration des Zeaxanthin Epoxidase-Gens aus Gentiana lutea in das Genom von Synechococcus PCC 7942 PIM8 führte zu einer Transformante Synechococcus PCC 7942 PIM8 pFP1ZE in der erstmalig die am Xanthophyllzyklus der höheren Pflanzen beteiligten Carotinoidepoxide Violaxanthin und Antheraxanthin gebildet wurden. Diese beiden zusätzlich gebildeten Carotinoidepoxide hatten keine Auswirkungen auf die Photosyntheseleistung und die Quantenausbeute von Synechococcus PCC 7942 PIM8 pFPlZE unter Schwachlichtbedingungen. Allerdings ging in dieser Transformante die maximale Photosyntheseleistung nach Inkubation im Starklicht deutlich stärker zurück als in der Kontroll-Transformante. Diese erhöhte Sensitivität gegenüber Starklicht korreliert mit dem signifikant niedrigeren Zeaxanthingehalt dieser Transformante. Die wichtige Schutzfunktion von Zeaxanthin vor Starklichtschädigungen des Photosyntheseapparates wurde durch Experimente mit Synechocystis PCC 6803 bestätigt. Es wurden durch Inaktivierung des Ketolase-Gens, des b-Carotin Hydroxylase-Gens bzw. beider Gene zusammen, Mutanten hergestellt. die entweder kein Echinenon, kein Zeaxanthin oder keines der beiden Carotinoide synthetisieren konnten. Darüber hinaus wurde in den b-Carotin Hydroxylase-defizienten Mutanten ein nicht hydroxyliertes Myxoxanthophyllderivat anstelle von Myxoxanthophyll gebildet. In den Zeaxanthin defizienten Synechocystis Mutanten ist die Photosynthese nach Inkubation in Starklicht deutlich stärker inhibiert als im Wildtyp und der Mutante ohne Echinenon. Besonders empfindlich gegenüber Starklicht erwiesen sich die Kulturen ohne Zeaxanthin und Myxoxanthophyll, wenn in Gegenwart von Methylenblau oder Methylviologen verstärkt 1O2 bzw. O2.-, H2O2 und OH. generiert wurden, In diesen Mutanten war ein drastisch erhöhter Chlorophyll- und Carotinoidabbau messbar. Um den verstärkten Abbau an Carotinoiden unter Starklichtbedingungen zu kompensieren, muss die Carotinoidbiosynthese unter diesen Bedingungen erhöht werden. In Hemmstoffversuchen konnte nachgewiesen werden, dass die Bildung von Phytoen, dem ersten Carotinoid im Syntheseweg, unter Starklichtbedingungen erhöht ist. Messungen der Transkriptmenge aller Carotinoidgene aus Synechococcus zeigten, dass die Gene der Phytoen Synthase (crtB), der Phytoen Desaturase (crtP), z-Carotin Desaturase (crtQb) sowie der b-Carotin Hydroxylase (crtR) im Starklicht hochreguliert werden. Die Gene der Lycopin lsomerase (crtH) und der Lycopin Zyklase (crtL) werden nicht auf Ebene der Transkription reguliert. Während die Erhöhung der Transkriptmenge von crtR bereits nach 15 min erfolgt und somit bereits nach 60 min eine deutlich gesteigerte Umwandlung von b-Carotin in das antioxidativ wirksamere Zeaxanthin nachgewiesen wurde, erfolgt ein Anstieg der Transkriptmenge der Gene crtB, crtP und crtQb erst nach ca. 60 min und führt damit erst wesentlich später zu einer generellen Steigerung der Carotinoidbiosynthese, um den verstärkten Carotinoidabbau im Starklicht zu kompensieren. lnkubationen von Synechococcus in Gegenwart von Substanzen, die den Redoxzustand der photosynthetischen Elektronentransportkette oder des Thioredoxinsystems modulieren, zeigten, dass nicht Licht direkt der auslösende Reiz für die Hochregulation der Carotinoidsynthese im Starklicht ist. Ein funktionierender photosynthetischer Elektronentransport ist für eine Hochregulation der Carotinoidbiosynthese erforderlich. Weder die Reduktion des Plastochinonpools noch die der zellulären Thioldisulfid-Gruppen erwiesen sich als Signal, dass in Synechococcus PCC 7942 zur Hochregulation der Carotinoidbiosynthese im Starklicht führt. Möglicherweise ist der Redoxzustand des Cytochromb6/f-Komplexes oder eine der unter Starklichtbedingungen verstärkt gebildeten ROS, wie z. B. O2- oder OH, der Reiz, der eine Steigerung der Carotinoidbiosynthese auslöst.
A gene trap strategy was used to identify genes induced in hematopoietic cells undergoing apoptosis by growth factor withdrawal. IL-3 dependent survival of hematopoietic cells relies on a delicate balance between proliferation and apoptosis that is controlled by the availability of cytokines (Thompson, 1995; Iijima et al., 2002). From our previous results of gene trap assay, we postulated that transcriptionally activated antagonistic genes against apoptosis might actually block or delay cell death (Wempe et al., 2001) causing cells to have carcinogenic behavior. The analysis attempted to better understand the outcome of a death program following IL-3 deprivation and to identify those survival genes whose expression is affected by time dependent manner. As described in the chapter 4, there would be two major conclusions evident from the three separate experiments (Genetrap, Atlas cDNA array and Affymetrix chips): Firstly 56% of trapped genes, that are up-regulated by IL-3 withdrawal (28 of 50), are directly related to cell death or survival. Secondly, unlike most array technologies, gene trapping only selects for the transiently induced genes that is independent of pre-existing steady state mRNA levels. In regarding correlations of the genes with potential carcinogenesis, the pre-existing mRNA makes difficult to describe the unique characteristics of deregulated tumor tissue genes. For a joint project with Schering (Schering AG, Berlin), the genes of our GTSTs were examined. The first screen with custom array was used to look for whether the survival genes of our GTSTs are involved in various cancer cell lines, whilst the second screen with Matched Tumor/Normal Array was used to characterize if the selected seven genes (ERK3, Plekha2, KIAA1140, PI4P5Ka/g, KIAA0740, KIAA1036 and PEST domains) are transformation-related genes or not in different tumor tissues. Twenty-six genes were identified as either induced or repressed in one or more cell lines. Genetic information is expressed in complex and ever changing patterns throughout a life span of cells. A description of these patterns and how they relate to the tissue specific cancer is crucial for our understanding of the network of genetic interactions that underlie the processes of normal development, disease and evolution. The development of cancer and its progression is clearly a multiplex phenotype, as a function of time, involving dozens of primary genes and hundreds of secondary modifier genes. There would be a major conclusion evident from the three separate experiments (Genetrap, Affymetrix mouse chip and Matched Tumor/Normal Array): ERK3 could play a significant role in breast, stomach and uterus carcinogenesis with tissue specific regulations. It is clear that ERK3 is obvious putative survival gene in these tumor tissues. Especially, in breast tumors, seven times up-regulation was considerable and the activation of ERK3 could be a feature of breast tumors. My results imply that the unique deregulation of ERK3 is perhaps the major consequence of possible transformation of normal cells into malignant cancer cells, even though further analysis remains to be determined whether an alterated activity of associated survival genes is primarily responsible for a carcinogenesis. However unlike all the other known MAP Kinases, no stimuli and no nuclear substrates of ERK3 is reported. Therefore, it will be necessary first to determine the spectrum of substrates and to identify the proximal effectors for the ERK3 in breast carcinoma cells.
Ziel dieser Arbeit war die Klärung des pathogenen Mechanismus einer Mutation im kardialen Myosinbindungsprotein C Gen. Diese Mutation (eine G-Insertion), die zu einer intern deletierten mRNA mit vorzeitigem Stop Codon führt, wurde im Rahmen einer HCM- Familienanalyse identifiziert. Ein C-terminal verkürztes MyBP-C war jedoch im Herzgewebe eines Patienten nicht nachweisbar (Moolman et al., 2000). Es stellte sich die Frage, ob die Krankheit in dieser Familie auf einen "dominant-negativen" Effekt von sehr wenigen veränderten Proteinen oder auf einen Mangel an normalem MyBP-C (Haploinsuffizienz) zurückzuführen ist. Zur Überprüfung einer möglichen Suppression des mutierten Allels auf mRNA Ebene wurde eine semiquantitative RT-PCR-Analyse myokardialer RNA durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass die nicht-mutierte mRNA in einem vierfachen Überschuß gegenüber der mutierten mRNA im Patienten-Herzgewebe vorliegt. In Modellversuchen wurde sodann die Expression der intern deletierten mRNA in transient transfizierten Zellen untersucht. Hierfür wurden drei MyBP-C cDNAs verwendet: (1) die vollständige Wildtyp cDNA (WT), (2) eine intern deletierte cDNA, die mit dem vorzeitigen Stop-Codon endet (MTI) und (3) eine cDNA, die sich nur durch die interne Deletion von der WT-Sequenz unterscheidet (MTII). Aufgrund einer Leserahmenverschiebung enthält die cDNA MTII (wie die mutierte Patienten-mRNA) zusätzlich zum nativen Stop-Codon ein vorzeitiges Terminationscodon. In COS-1 Zellen führten alle drei cDNAs zur Synthese der erwarteten Genprodukte. In neonatalen Kardiozyten wurde nur das verkürzte Protein vom Typ MTI eindeutig exprimiert. Die cDNA MTII führte nicht, bzw. nur in sehr geringem Ausmaß zur Synthese eines verkürzten MyBP-C (Western Blot). Die Analyse immunfluoreszent markierter Kardiozyten für das c-myc/MyBP-C-Fusionsprotein und für Titin ergab folgende "steady state" Expressionen: WT>MTI>>MTII. In der Mehrzahl der Zellen, die MTI oder MTII exprimierten, lagen die Rumpfproteine diffus im Cytoplasma vor, ohne eine erkennbare Veränderung der endogenen Sarkomerstruktur hervorzurufen. Ein relativ geringer Anteil von Zellen zeigte eine korrekte, sarkomere Inkorporation der verkürzten Proteine. Aufgrund der unterschiedlichen "steady state" Konzentration von MTI und MTII in Kardiozyten und aufgrund der Expressionsunterschiede in den verschiedenen Zelltypen wurde ein zelltypspezifischer und intron-unabhängiger Mechanismus vermutet, der die Suppression der Nonsense-mRNA (MTII) und damit eine Reduktion der Synthese des verkürzten MyBP-C bewirkt. Dieser Effekt wurde auf den Einfluß von Sequenzen zurückgeführt, die sich in der reifen mRNA 3' vom vorzeitigen Stop-Codon befinden. Zur Eingrenzung dieser Sequenzen wurde der Bereich zwischen dem vorzeitigen und dem nativen Stop-Codon in überlappende Fragmente unterteilt und an das Stop-Codon der cDNA MTI angefügt. Die transiente Expression dieser cDNA-Konstrukte (MTI-DSE I, II, III, I/II) führte in Kardiozyten ebenfalls zu einer reduzierten Synthese des verkürzten MyBP-C. Die erhaltenen Ergebnisse, d.h. sowohl die reduzierte Transkriptmenge des mutierten MyBP-C Allels im Patienten- Herzgewebe als auch die geringe Akkumulation verkürzter MyBP-C Proteine in transient transfizierten Kardiozyten erklären den pathogenen Mechanismus der untersuchten MyBP-C Mutation nicht vollständig. Jedoch unterstützen sie die Vermutung, dass die Abwesenheit des verkürzten MyBP-C auf einer Suppression der MyBP-C Nonsense-mRNA basiert und bekräftigen die Vorstellung, dass die HCM in der untersuchten Familie mit einem Mangel an Myosinbindungsprotein C im Myokard assoziiert ist (Haploinsuffizienz). Ein "dominant- negativer" Effekt einer sehr geringen Menge von veränderten Molekülen auf die Struktur oder auf die regulatorische Funktion der kardialen Sarkomere kann allerdings nicht völlig ausgeschlossen werden.
Die LC/MS/MS Methoden zur Quantifizierung des selektiven COX-2-Hemmers Celecoxib und des selektiven COX-1-Hemmers SC-560 wurden auf einem Sciex API 3000 Tandem Massenspektrometer mit einer TurboIon Spray Quelle entwickelt und validiert. Für Celecoxib wurden zwei Assays mit internem Standard für die Quantifizierung aus Plasmaproben und ein Assay ohne internen Standard für die Quantifizierung aus Microdialysaten entwickelt. Die Plasmaproben wurden mittels Festphasenextraktion über C18 Material extrahiert. Für die Methode CLX-1 wurde über eine RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Methanol/Wasser/NH4OH 20% 80:20:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 10-1000 ng/ml für Humanplasma und 10-500 ng/ml für Rattenplasma validiert. Für die Methode CLX-2 wurde die Chromatographie mit einer RP-C18 Säule (30 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 85:15:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min eluiert. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml für Humanplasma validiert. Für die Methode CLX-Microdialysate wurde die Elution über eine RP-C18 Säule (70 x 2 mm) isokratisch mit Acetonitril/Wasser/NH4OH 20% 65:25:0,1 v/v mit einer Flussrate von 0,2 ml/min durchgeführt. Das Assay wurde über den Konzentrationsbereich von 0,25-250 ng/ml validiert. Die Analytik von SC-560 mittels LC/MS/MS wurde für den Nachweis in Microdialysaten entwickelt. Die Microdialysate wurden mit dem Äquivalenten Volumen Acetonitril verdünnt, um den Analyten vollständig in Lösung bringen zu können. Eine RP-C18 Säule (60 x 1 mm) wurde verwendet und die chromatographische Trennung mit einem Gradientenprogramm durchgeführt. Die Methode wurde über den Konzentrationsbereich von 0,5-20 ng/ml für Microdialysate validiert. Die Assays wurden für pharmakologische Untersuchungen zur Wirkung und zum molekularen Wirkmechanismus von selektiven Cyclooxygenasehemmern eingesetzt. Die Rolle der Cyclooxygenase-Isoformen bei der nozizeptiven Transmission im Rückenmark wurde in der ersten Studie untersucht. SC-560 reduzierte das Schmerzverhalten der Tiere und hemmte die spinale Prostaglandinproduktion. Celecoxib hatte auf die Effekte keinen Einfluss. Die Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass die Wirksamkeit von Celecoxib bei Trauma-bedingten Akutschmerzen der Wirksamkeit unselektiv wirkender NSAIDs unterlegen ist. In der zweiten Studie wurden Die Effekte hoher Dosen von Celecoxib untersucht. In Tierversuchen mit Zymosan-induzierten Entzündungen der Hinterpfoten konnte Celecoxib bei 50 mg/kg das Ödem in der Hinterpfote reduzieren, aber nicht bei Dosierungen größer gleich 100 mg/kg. In Zellkultur konnte an Mesangiumzellen der Ratte gezeigt werden, dass eine Dosis von 50 µM Celecoxib den Transskriptionsfaktor NF-_B aktiveren kann. In einer dritten Studie wurde der Einfluss COX-abhängiger und -unabhängiger Mechanismen auf die antiproliferative Wirkung von Celecoxib untersucht. SC-560 und Celecoxib verursachten einen Zellzyklus-Block. Celecoxib beeinflusste die Expression Zellzyklus-regulierender. Celecoxib induzierte Apoptose unabhängig vom COX-2 Status der Zellen. In vivo wurde das Wachstum von COX-2 defizienten Tumoren durch Celecoxib und SC-560 reduziert. Die in vitro und in vivo Daten deuten auf COX-2 unabhängige Mechanismen der antiproliferativen Wirkung von Celecoxib hin.
Zahnwale sind die einzige Säugetiergruppe, die umfassend an ein Leben im Wasser angepasst ist und dabei ein aktives Sonarsystem zur Orientierung nutzt. Wahrscheinlich produzieren alle Zahnwalarten sonische oder ultrasonische Klicklaute, deren Echos die Tiere zu einem drei-dimensionalen "akustischen Bild" zusammensetzen. Im Gegensatz zu den meisten anderen Säugetieren produzieren Zahnwale diese Laute im Nasen-Komplex durch einen pneumatisch betriebenen Mechanismus. Jedoch spielt auch der Kehlkopf dabei eine wichtige Rolle, indem er den nötigen Luftdruck in der Nase erzeugt. Die Ergebnisse werden in Bezug auf die physikalischen Voraussetzungen eines Bio-Sonars in einer aquatischen Umwelt interpretiert. Um die morphologischen Eigenschaften (Struktur, Form, Topographie) der Organe im Kopf verschiedener Zahnwalarten vollständig zu erfassen, wurden diese mittels Computertomographie und Magnetresonanztomographie gescannt. Daraufhin wurden die Köpfe makroskopisch präpariert und histologische Schnitte von Gewebeproben angefertigt. Schließlich wurden die Ergebnisse durch digitale dreidimensionale Rekonstruktionen vervollständigt. Diese Studie basiert zum größten Teil auf der Untersuchung von Schweinswalen (Phocoena phocoena) und Pottwalen (Physeter macrocephalus). Zum Vergleich wurden fetale und postnatale Individuen anderer Zahnwalarten herangezogen wie Delphinartige (Delphinus delphis, Stenella attenuata, Tursiops truncatus), Flussdelphinartige (Pontoporia blainvillei, Inia geoffrensis) und der Zwergpottwal (Kogia breviceps). Im Allgemeinen konnte durch die morphologischen Daten dieser Studie die einheitliche "phonic lips-Hypothese der Schallproduktion bei Zahnwalen, wie sie von Cranford, Amundin und Norris [J. Morphol. 228 (1996): 223-285] aufgestellt wurde, bestätigt werden. Diese Hypothese beschreibt eine ventilartige Struktur in der Nasenpassage, den sogenannten "monkey lips/dorsal bursae complex" (MLDB) als Schallgenerator. Der pneumatische Mechanismus lässt die beiden Hälften des MLDB aufeinanderschlagen und erzeugt damit die initiale Schallschwingung im Gewebe ("phonic lips"). Diese Vibration wird über die Melone, einen großen Fettkörper in der vorderen Nasenregion der Zahnwale, fokussiert und in das umgebende Wasser übertragen. Die akzessorischen Nasensäcke und spezielle Schädel- und Bindegewebestrukturen können zu der Fokussierung beitragen. Obwohl die Echolotsignale der Schweinswale sehr spezialisiert zu sein scheinen, weisen die Übereinstimmungen in der Topographie und in der Form der Nasenstrukturen im Vergleich zu Delphinen und Flussdelphinartigen (Pontoporia und Inia) auf eine ganz ähnliche Funktion der Nase bezüglich der Produktion und Emission von Echolotschall hin. Allerdings gibt es einige anatomische Besonderheiten im Nasenkomplex des Schweinswals, welche die besondere Pulsstruktur der Sonarsignale erklären könnte. Diese werden in der Dissertation diskutiert. Bei einem Vergleich der Nasenmorphologie der Pottwale einerseits und der nicht-pottwalartigen Zahnwale andererseits fällt vor allem der Grad der Asymmetrie ins Auge. Im Gegensatz zu dem oben für Delphine und Schweinswale beschrieben Mechanismus betreiben Pottwale die Schallproduktion an den "monkey lips" mit Luft, die im rechten Nasengang unter Druck gesetzt wird (und nicht im nasopharyngealen Raum). Zudem könnte durch Änderung des Luftvolumens im rechten Nasengang die Schalltransmission zwischen den Fettkörpern, und somit die Schallemission, kontrolliert werden. In diesem theoretischen Szenario fungiert der breite rechte Nasengang als eine Art "akustische Schranke", welche zwischen zwei verschiedenen Modi der Klickproduktion wechselt: Der erste Modus mit luftgefülltem Nasengang führt zur Produktion der Kommunikationsklicks ("coda clicks") und der zweite Modus zur Aussendung von Echolotklicks, wenn der Nasengang kollabiert ist. Somit scheinen die zentrale Position und die nahezu horizontale Orientierung des rechten Nasengangs im Kopf der Pottwale als Schnittstelle (Schranke) zwischen den beiden großen Fettkörpern mit dem Mechanismus der Schallproduktion bei veränderten Luftvolumina korreliert zu sein. Die hier beschriebenen und andere Ergebnisse dieser Dissertation deuten darauf hin, dass die Gestalt und das Ausmaß der Nasenasymmetrie nicht mit der systematischen Zugehörigkeit der jeweiligen Art korrelieren, sondern durch den jeweiligen Typus des Sonarsystems als Ausdruck einer bestimmten ökologischen Anpassung bedingt sind. Bei Zahnwalen ist der Kehlkopf charakterisiert durch eine rostrale Verlängerung des Kehldeckels und der beiden Stellknorpel, die ein gänseschnabelartiges Rohr bilden, das von einem starken Sphinktermuskel umrundet und dabei in Position gehalten wird. Auf diese Weise ist das Atemrohr vollständig vom Digestionstrakt getrennt. Aus anatomischer Sicht ist es wahrscheinlich, dass die Schallerzeugung bei Zahnwalen durch eine Kolbenbewegung des Kehlkopfes in Richtung der Choanen zustande kommt, wodurch der Luftdruck im Nasenbereich erzeugt wird. Die Kontraktion des Sphinktermuskels als einem muskulösen Schlauch erzeugt wahrscheinlich die größte Kraft für diese Kolbenbewegung. Jedoch dürften die Muskelgruppen, die den Kehlkopf und das Zungenbein am Unterkiefer und an der Schädelbasis aufhängen, signifikant zur Druckerhöhung beitragen.
Entwicklung von Methoden zur Konformationsanalyse supramolekularer Komplexe in Kraftfeldprogrammen
(2003)
Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurde mit dem SUPRA-Algorithmus ein Verfahren zur Berechnung der Struktur Supramolekularer Komplexe programmiert und in das Kraftfeldprogramm MOMO implementiert. Bei der Konformationsanalyse Supramolekularer Komplexe ergibt sich das Problem, dass die Anzahl der notwendigen Rechenschritte mit der Größe der zu berechnenden Struktur, genauer mit der Anzahl vorhandener Torsionsfreiheitsgrade, exponentiell ansteigt. Dieses Problem wurde umgangen, indem die Rechnung in drei kleinere Abschnitte aufgeteilt wurde. Es werden nacheinander drei Konformationsanalysen durchgeführt. Zuerst erfolgt jeweils eine Konformationsanalyse für die beiden beteiligten Einzelmoleküle. Deren Strukturen dienen dann wiederum als Eingabe für die dritte, eigentliche Konformationsanalyse des Supramolekularen Komplexes. Ziel dieser Arbeit war dann unter anderem zu überprüfen, ob trotz der Vereinfachungen diese Vorgehensweise effiziente Ergebnisse liefert. Zu Beginn wurden Berechnungen für den Komplex Adenin-Uracil durchgeführt, die Resultate stimmten mit experimentell gefundenen Paarungsmustern (Watson-Crick, reverse Watson- Crick, Hoogsteen, reverse Hoogsteen) überein. Eine weitere Rechnung am Komplex Cytosin- Guanin fand als Ergebnis Watson-Crick- und reverse Watson-Crick-Paarung. Die besten Ergebnisse wurden unter Verwendung des Ladungsmodells von Gasteiger und Marsili sowie der Wasserstoffbrücken-Potenzialfunktion von Vedani und Dunitz ohne Berücksichtigung der van-der-Waals-Wechselwirkungen erhalten. Diese Kraftfeldeinstellungen wurden im weiteren Verlauf der Arbeit als die optimalen Parameter für den SUPRA-Algorithmus beibehalten. Anschließend wurden zwei Komplexe fluormodifizierter Basenpaare berechnet, um die in einem RNA-Duplex experimentell aufgefundenen C-H...F-C-Brücken rechnerisch zu reproduzieren. Nur für eines der beiden Basenpaare konnte dieses Wasserstoffbrücken- Bindungsmuster erhalten werden, für das andere Dimer wurde die erwartete Struktur nicht gefunden. Es sollte deshalb der gesamte RNA-Duplex berechnet werden. Hierzu war das Programm MOMO nur sehr bedingt geeignet, und zwar sowohl was den Aufbau des Doppelstranges betraf als auch die Energie- und Geometrieberechnung. Trotz umfangreicher Versuche gelang es nicht, die Doppelhelixstruktur im Verlauf der Energieminimierung beizubehalten. Durch Anpassung der Kraftfeldparameter konnte aber eine stark aufgeweitete Helixstruktur berechnet werden, in welcher die modifizierten Basen nach dem experimentell gefundenen Muster gepaart waren. Außerdem wurde der SUPRA-Algorithmus anhand eines Dipyridon-Komplexes auf seine Fähigkeit getestet, Moleküle mit mehreren Torsionsfreiheitsgraden zu berechnen. Hier ergab sich wegen der konformationellen Flexibilität eine Rechenzeit von über drei Wochen. Das Ergebnis der Rechnung stimmte gut mit der experimentell gefundenen Struktur überein. Am Beispiel zweier Komplexe selbstkomplementärer Diketopiperazine sowie eines Komplexes aus N,N'-Di(tert-butyl)-melamin und 5,5-Dimethylbarbitursäure wurden Rechnungen von Komplexen aus mehr als zwei Molekülen durchgeführt. Es zeigte sich eine gute Übereinstimmung der Ergebnisse mit den bekannten Kristallstrukturen. Als letztes wurden anhand zweier selbstkomplementärer Acetylhydrazon- und dreier Diketon- Diol-Komplexe fünf unbekannte Strukturen doppelt wasserstoffbrücken-gebundener Dimere vorhergesagt. Anschließend sollte jeweils die Kristallstruktur bestimmt und mit dem Ergebnis der Vorhersage verglichen werden. Im Fall der Diketon-Diol-Komplexe gelang bisher keine Züchtung eines entsprechenden Mischkristalls, sondern die beteiligten Komponenten kristallisierten einzeln aus. Bei den zwei Acetylhydrazonen dagegen konnten Kristalle erhalten werden. Eine der Kristallstrukturen wies das mit dem SUPRA-Algorithmus vorhergesagte Dimer auf. Im Verlauf der Arbeit zeigte sich des Öfteren, dass die gewählte Strategie, die Anzahl der Startstrukturen bei der Konformationsanalyse zu begrenzen, um ein exponentielles Ansteigen der Rechenschritte zu verhindern, erfolgreich war. Mehrmals fanden sich als Ergebnis der Rechnung Strukturen von komplexgebundenen Molekülen, die sich stark von der Startkonformation eines Einzelmoleküls unterschieden, so zum Beispiel im Falle des Dipyridon-Komplexes oder der Diketon-Diol-Komplexe. Für die Zukunft sind weitere Kristallisationsversuche der Acetylhydrazone geplant, um eventuelle Polymorphe aufzufinden, bei denen sich auch eine Übereinstimmung mit der zweiten vorhergesagten Struktur zeigt. Weiterhin ist beabsichtigt, die Packungsenergien der gefundenen Kristallstruktur sowie einer theoretischen Kristallstruktur, die in ihrem Wasserstoffbrückenbindungs-Muster der mit MOMO gemachten Vorhersage entspricht, zu berechnen und zu vergleichen. Durch Einführung verschiedener Liganden in das Acetylhydrazon und Vergleich der daraus resultierenden Packungsmuster sollen Regeln über die den Kristallisationsprozess bestimmenden Einflussfaktoren abgeleitet werden. Weiterhin soll eine Reihe von anderen Verbindungsklassen synthetisiert, strukturell untersucht und berechnet werden, um so weitere Vergleiche zwischen theoretischen Vorhersagen und Kristallstruktur anstellen zu können. Für das Programm MOMO wäre wünschenswert, den Multipol-Ansatz in die Vollversion zu integrieren, um eine exaktere Berechnung von Basenstapelungs- und anderen p-p- Wechselwirkungen zu erreichen. Darüber hinaus sollte eine Parametrisierung des von S. Monz verbesserten Abraham-Ladungsmodells vorgenommen werden. Beides würde zu einer Verbesserung der Beschreibung intermolekularer Wechselwirkungen führen, welche für den SUPRA-Algorithmus relevant sind.
Der Elektronentransfer von NADH zu Sauerstoff ist ein essentieller Bestandteil im Energiehaushalt der Zelle und wird durch transmembrane Enzymkomplexe vermittelt. Hohe Geschwindigkeit und Spezifität dieser Reaktionen sind dabei von großer Bedeutung. In der Atmungskette von Paracoccus denitrificans und Thermus thermophilus wird Sauerstoff durch Cytochrom c Oxidasen umgesetzt. Beide Enzymkomplexe erhalten die für diese Reaktion notwendigen Elektronen von einem Cytochrom c552 in einer sehr schnellen bimolekularen Reaktion bei hoher Selektivität für das Partnerprotein. Hauptziel dieser Arbeit war es, lösliche Module der elektronenakzeptierenden CuA-Domäne der Cytochrom c Oxidasen zu generieren, das Kupferzentrum zu rekonstituieren und die Proteine für Wechselwirkungsstudien mit den Cytochrom c-Partnern zugänglich zu machen. Die Charakterisierung der Elektronentransferreaktionen erfolgte durch stopped-flow Spektroskopie und ermöglichte die Bestimmung der bimolekularen Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten unter verschiedenen Ionenstärkebedingungen. Ein Vergleich zwischen dem mesophilen Reaktionspaar aus P. denitrificans mit dem thermophilen aus T. thermophilus zeigte die unterschiedlichen Interaktionsmechanismen auf. Während die Reaktion in T. thermophilus weitgehend auf Ladungsinteraktionen verzichtet, wurde für die Reaktanden aus P. denitrificans eine Beteiligung von 2 - 3 Ladungen mit entgegengesetztem Vorzeichen auf jedem Protein festgestellt. Die Interaktionen wurden weiterhin durch chemical-shift-perturbation Experimente mittels NMR-Spektroskopie charakterisiert. Durch Isotopenanreicherung des Cytochroms c552 aus P. denitrificans konnten für dieses Protein Aminosäurereste identifiziert werden, die an einer direkten Bindung mit dem CuA-Partnerprotein beteiligt sind. In einem ähnlichen Ansatz wurde auch die Interaktionsfläche der löslichen CuA-Domäne aus T. thermophilus charakterisiert. Für das Cytochrom c552 aus P. denitrificans konnte gezeigt werden, daß bei direkten Kontakten zwischen den Proteinen fast keine Ladungen beteiligt sind und primär ungeladene Reste die Wechselwirkung dominieren. Ein ähnliches Bild wurde auch für die Interaktion der löslichen CuA-Domäne aus T. thermophilus mit ihrem Substrat ermittelt. Für die lösliche CuA-Domäne aus P. denitrificans konnte aufgrund der geringen Stabilität keine Zuordnung durchgeführt werden, so daß eine Charakterisierung der Interaktionsfläche nicht möglich war. Weiterhin wurde ein für T. thermophilus bisher nicht beschriebener Komplex III aufgrund von Sequenzdaten identifiziert. Eine lösliche Domäne des membranständigen Cytochrom c1 wurde in E. coIi heterolog exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. Die Elektronentransferkinetiken zum Cytochrom c552 wurden durch stopped-flow Spektroskopie aufgenommen, und das Cytochrom c1 wurde als effizienter Elektronendonor für das Protein identifiziert. Für spätere Mutageneseansätze wurde ein Plasmid-basiertes Expressionssystem für das extrem thermophile Eubakterium T. thermophilus etabliert, um Schwierigkeiten, die bei der Expression von Cofaktor-tragenden Membranproteinen auftreten können, zu umgehen. Durch Expression eines löslichen c-Typ Cytochroms und der ba3-Cytochrom c Oxidase in T. thermophilus konnte gezeigt werden, daß dieses homologe Expressionssystem funktional ist und damit rekombinante Proteine exprimiert werden können. Durch die Konstruktion von Histidin-Tags konnte die Aufreinigung der Proteine erleichtert werden und eine notwendige Abgrenzung von chromosomal kodierten Wildtyp-Formen erfolgen.
Winterroggen (Secale cereale L.) erwirbt durch längerfristiges Wachsen bei tiefen Temperaturen eine Anpassung an Kälte und Frost und entwickelt eine erhöhte Toleranz gegenüber kälte-induzierter Photoinhibierung. Diese Anpassung wird als Kältehärtung bezeichnet. Die erworbene Toleranz gegenüber kälteinduzierter Photoinhibierung geht nach drei Tagen Enthärtung bei einer Temperatur von 220C wieder verloren. Die Zielsetzung der Promotion war es, nach differentiell exprimierten Genen zu suchen, die nicht als Antwort auf kurzzeitigen Kältestreß hochreguliert werden, sondern Gene zu isolieren die im Zuge länger einwirkender Kälte in Winterroggenblättern verstärkt exprimiert werden. Werden die mRNAs aus kältegehärteten (CHL) mit den mRNAs aus enthärteten Roggenblättern (DHL) verglichen, so können Gene isoliert werden, die in CHL stärker exprimiert werden. Diese differentiell exprimierten Gene können, da sie nach Enthärtung deutlich seltener exprimiert werden, eine limitierende Funktion bei Kältehärtung einnehmen. Um diese Gene isolieren zu können wurden zwei molekularbiologische Methoden, "Suppression Subtractive Hybridisation"-PCR und "Differential Display"-PCR angewendet. Mit diesen Methoden konnten insgesamt zwölf verschiedene cDNA-Fragmente differentiell exprimierter Gene isoliert werden. Im Vergleich mit DHL sind in CHL die Transkriptmengen für neun cDNA-Fragmente isolierter Gene erhöht. Auch die Transkriptmenge des Chloroplasten-kodierte Gens für LSU ist in CHL bei einem Vergleich mit DHL gesteigert. Die isolierten cDNA-Fragmente von differentiell exprimierten Genen kodieren für Proteine aus den verschiedensten Teilbereichen des pflanzlichen Stoffwechsels und sind nachfolgend aufgelistet. Photosynthesestoffwechsel: SSU und LSU (kleine und große Untereinheit von RubisCO), LHCIIb (Lichtsammelkomplex IIb), Fructose-1,6-bisphosphatase, Transketolase, Genexpression: RNA-bindendes Protein, Transkriptionselongationsfaktor, Nucleotidstoffwechsel: UMP Synthase, Antioxidativ wirkendes Enzym: PMSR (Peptid-Methioninsulfoxidreduktase) Es konnten cDNA-Fragmente dreier bekannter Gene und eines unbekannten Gens (Klon 5C, zeigte Homologie zu einer Sequenz aus Oryza sativa) isoliert werden, deren Expression in DHL spezifisch erhöht ist. Energiestoffwechsel: H+ATPase, Pathogenabwehr/ programmierter Zelltod: Llsl Gen (lethal leaf spot Gen 1), Proteinstoffwechsel: Disulfidisomerase Neben der Analyse der Expression auf RNA-Ebene wurden Untersuchungen zur Expression auf Proteinebene vorgenommen. Western Blut Analysen zeigten, daß die geringeren Transkriptmengen von rbcS und rbcL in DHL und NHL nicht mit einem parallelen Rückgang der Proteinmengen von SSU und LSU korrelieren. Die Proteinmengen an SSU und LSU in CHL, DHL und NHL weisen keine allzu großen Unterschiede auf Sowohl die Transkiptmenge des Gens Lhcb als auch die Menge des LHCIIb-Proteins war in enthärteten Winterrogenblättern in Vergleich zu gehärteten Winterroggenblättern vermindert. Auch für das antioxidativ wirkende Enzym PMSR (Peptid-Methionin-Sulfoxid-Reduktase) konnten in CHL höhere Transkriptmengen als in DHL und in NHL nachgewiesen werden. PMSR ist ein ubiquitär verbreitetes Enzym, das eine nachgewiesene wichtige Funktion bei der Abwehr von reaktiven Sauerstoffformen (ROS) ausübt. Den bislang untersuchten antioxidativen Schutz-Systemen konnte bei der Kältehärtung keine begrenzende Funktion zugeschrieben werden. Ein Schwerpunkt der Promotion lag deshalb auf der Untersuchung vom ScPMSR als antioxidativ wirkendes Enzym im Zusammenhang mit Kältehärtung. Die Transkriptmenge an ScPMSR erhöht sich nach dem längerfristigen Einwirken von Kälte. Zur Durchführung von Immunoblot Analysen mußte zunächst ein Antikörper gegen ScPMSR hergestellt werden. Mittels eines aus einer cDNA-Bank isolierten cDNA-Klons von ScPMSR wurde rekombinantes ScPMSR-Protein in E. coli Zellen produziert und nach der Reinigung zur Herstellung spezifischer Antiseren eingesetzt. Bei dem in dieser Arbeit isolierten ScPMSR handelt es sich um ein cytoplasmatisches Isoenzym. In Western Blot Analysen mit dem ScPMSR-Antikörper konnte in Gesamtproteinextrakten aus CI-IL, DHL und NHL die ScPMSR-Proteinbande (23kDa) nachgewiesen werden. In CHL und in NHL die in niedrige Temperaturen umgesetzt wurden liegt noch eine zusätzliche Proteinbande einer Größe von 68kDa vor. Werden CHL in 220C umgesetzt wird diese Bande innerhalb von 48h deutlich schwächer. Im Gegensatz dazu verstärkt sich die 68kDa-Proteinbande kontinuierlich, wenn NHL bis zu 48h in tiefe Temperaturen gestellt werden. Die Gesamtmengen an PMSR-Protein (23 kDa + 68kDa) zeigen nicht allzu große Unterschiede bei CHL, DHL und NHL und korrelieren damit nicht mit der geringeren Transkriptmenge an PMSR in DHL und NHL. Rechnerisch könnte es sich bei dem bei Kälte gebildeten 68kDa großen Proteinaggregat um ein PMSR-Trimer handeln. Dieses Aggregat konnte allerdings in vitro durch die stark denaturierend wirkenden Stoffe Guanidinhydrochlorid und SDS nicht in nachweisbare Untereinheiten aufgelöst werden. Bei dem bei Kälte gebildeten Proteinaggregat könnte es sich um die enzymatisch aktive Form eines PMSR-Trimers handeln, das bei Kälte der Abwehr von ROS dient. Insgesamt deuten die Resultate darauf hin, daß ScPMSR bei der Kältehärtung von S. cereale von Bedeutung ist. Aufgrund der geringer Substratspezifität kann PMSR bei Kälte als weitgefächertes Reparaturenzym fungieren. Nicht zuletzt wird der zyklische Oxidations- und Reduktionsprozeß von Methionin und Methioninseitenketten auch als "sink" für ROS angesehen. Es bedarf jedoch zusätzlicher Untersuchungen, um die Rolle von ScPMSR bei Kältehärtung von Secale cereale als antioxidativ wirkendes Enzym weiter definieren zu können.
The endothelin B receptor belongs to the rhodopsin-like G-protein coupled receptors family. It plays an important role in vasodilatation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. During the course of this work, the production of recombinant human ETB receptor in yeast, insect and mammalian cells was evaluated. A number of different receptor constructs for production in the yeast P. pastoris was prepared. Various affinity tags were appended to the receptor N-and C-termini to enable receptor detection and purification. The clone pPIC9KFlagHisETBBio, with an expression level of 60 pmol/mg, yielded the highest amount of active receptor (1.2 mg of receptor per liter of shaking culture). The expression level of the same clone in fermentor culture was 17 pmol/mg, and from a 10L fermentor it was possible to obtain 3 kg of cells that contained 20-39 mg of the receptor. For receptor production in insect cells, Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with the recombinant baculovirus pVlMelFlagHisETBBio. The peak of receptor production was reached at 66 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed 30 pmoL of active receptor /mg of membrane protein. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing the active receptor was evaluated. N-dodecyl-beta-D-maltoside (LM), lauryl-sucrose and digitonine/cholate performed best, and LM was chosen for further work. The ETB receptor was produced in mammalian cells using the Semliki Forest Virus expression system. Radioligand binding assays on membranes from CHO cells infected with the recombinant virus pSFV3CAPETBHis showed 7 pmol of active receptor /mg of membrane protein. Since the receptor yield from mammalian cells was much lower than in yeast and insect cells, this system was not used for further large-scale receptor production. After production in yeast and insect cells, the ETB receptor was saturated with its ligand, endothelin-1, in order to stabilize its native form. The receptor was subsequently solubilized with n-dodecyl-beta-D-maltoside and subjected to purification on various affinity matrices. Two-step affinity purification via Ni2+-NTA and monomeric avidin proved the most efficient way to purify milligram amounts of the receptor. The purity of the receptor preparation after this procedure was over 95%, as judged from silver stained gels. However, the tendency of the ETB receptor produced in yeast to form aggregates was a constant problem. Attempts were made to stabilize the active, monomeric form of the receptor by testing a variety of different buffer conditions, but further efforts in this direction will be necessary in order to solve the aggregation problem. In contrast to preparations from yeast, the purification of the ETB receptor produced in insect cells yielded homogeneous receptor preparations, as shown by gel filtration analysis. This work has demonstrated that the amounts of receptor expressed in yeast and insect cells and the final yield of receptor, isolated by purification, represent a good basis for beginning 3D and continuing 2D crystallization trials.
In den letzten Jahren gewann die Photodynamische Therapie deutlich an Bedeutung bei der Behandlung von Neoplasien. Für die nächsten Jahren werden weitere Zulassungen für neue Indikationen erwartet. Diese Neuzulassungen werden einerseits durch neue Photosensibilisatoren und andererseits durch neue Ansätze beim Drug Targeting ermöglicht. Zur Zeit wird der Ansatz forciert, die Sensibilisatoren an einen tumorspezifischen Antikörper zu knüpfen. Eine weitere Möglichkeit für das Drug Targeting besteht darin, den Photosensibilisator an tumorspezifische Rezeptorliganden zu binden. In der vorliegenden Dissertation wird der Versuch einer Kopplung eines Photosensibilisators über einen Spacer an ein nicht steroidales Antiprogestin erarbeitet. Der Progesteron-Rezeptor wurde als Target ausgewählt, da zahlreiche Tumorarten, wie beispielsweise das Mammakarzinom, den Progesteron-Rezeptor überexprimieren. Als Leitstruktur für die Synthese der Antiprogestine wurde ein mariner Naturstoff ausgewählt. Das Cyclocymopol-Derivat besitzt den Vorteil einer im Vergleich zu Mifepriston verbesserten Selektivität für den Progesteron-Rezeptor und eines einfacheren synthetischen Zugangs. Für die Erstellung einer Bibliothek von Progesteron-Antagonisten, die auf den Cyclocymopol-Derivaten aufbauen, sind hinsichtlich der Struktur-Wirkungs-Beziehungen zwei Merkmale zu beachten. Der aromatische Ring muss eine elektronenziehende Gruppe, der aliphatische Ring eine exocyclische Methylengruppe aufweisen, da diese Gruppen essentiell für die Rezeptorbindung sind. Bei der Synthese des Progesteron-Antagonisten wird zunächst ein Benzaldehyd-Derivat mit dem gewünschten Spacer verknüpft, der in der Folge mit dem Phototherapeutikum verknüpft werden kann. Im nächsten Schritt wird die Aldehydfunktion mit Natriumborhydrid zur Alkoholfunktion reduziert. Die so erhaltenen Alkohole werden anschließend mit Hilfe einer Appelartigen Reaktion in das Bromid überführt. Die Benzylbromide wurden mit Isophoron und Buthyllithium zu dem Naturstoff-Analoga umgesetzt. Durch Variieren der Reaktionsbedingungen konnten die aus der Literatur bekannten Ausbeuten erhöht werden. Für die Einführung der exocyclischen Methylengruppe in die Naturstoff-Derivate mussten zunächst verschiedene Synthesenmethoden untersucht werden. In der Literatur wurde für diesen Synthesewege bisher das Tebbe Reagenz eingesetzt, welches bei den hier eingesetzten Edukten zu keiner Reaktion führte. Es kann vermutet werden, dass die sterische Hinderung durch den Spacer die Umsetzung blockiert. In weiteren Experimenten wurde versucht, über eine Simmons-Smith-ähnliche Reaktion die gewünschte Funktionalität zu erhalten. Da auch bei dieser Reaktion das gewünschte Produkt nicht erhalten werden konnte, wurde in weiteren Ansätzen die Peterson-Olefinierung ausgewählt. Mit dieser Methode gelang es schließlich, geringe Mengen des gewünschten Produktes herzustellen. Als Nebenreaktion kam es dabei jedoch zu einer Methylierung des aromatischen Rings. Durch Anwendung der Horner-Emmons-Reaktion konnte schließlich das Antiproestin in ausreichender Menge und Reinheit erhalten werden. Es war jedoch nicht möglich, das in Abb. 7 erläuterte Zielmolekül aus dem Photosensibilisator, Spacer und Antiprogestin darzustellen.