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Die postnatale Neovaskularisierung ist eine wichtige Vorraussetzung um Gewebe vor kritischer Ischämie zu schützen. Eine der Grundlagen dieses Prozesses bilden die Angiogenese, bei der neue Kapillaren durch Proliferation und Migration von Endothelzellen aus bereits vorhandenen Blutgefäßen entstehen. Ein zweiter Eckpfeiler ist die Vaskulogenese, die unter anderem durch zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (EPC) vermittelt wird. Homeobox-Gene der Klasse 1 (Hox) sind Transkriptionsfaktoren, die während der Embryonalentwicklung an der Organogenese und der Entwicklung des kardiovaskulären Systems beteiligt sind. Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass Homeobox-Proteine auch im adulten Organismus bei der transkriptionellen Regulation von Genen der Angio- und Vaskulogenese eine wichtige Rolle spielen. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse zeigen eine essentielle Rolle von HoxA9 für die postnatale Neovaskularisierung sowie für die funktionelle Integrität von Endothelzellen und endothelialen Progenitorzellen. HoxA9-defiziente Mäuse hatten einen signifikant verringerten Blutfluss nach einer Hinterlauflauf-Ischämie. Für die reduzierte Neovaskularisierung des ischämischen Gewebes, genügte der Verlust eines einzigen HoxA9-Wildtypallels. Außerdem zeigen HoxA9-defiziente Endothelzellen in vitro eine stark gehemmte Migration sowie eine verringerte Gefäßstrukturbildung. Zusätzlich war auch deren Interaktion mit EPC im Matrigel verschlechtert. Eine Bestätigung dieser Beobachtung zeigten Untersuchungen an endothelialen Vorläuferzellen, die ebenfalls einen Verlust angiogener Funktionen bei verminderter HoxA9-Expression aufwiesen. Neben der postnatalen Neovaskularisierung konnten erste Untersuchungen embryonaler Allantois zeigen, das HoxA9 vermutlich auch in der embryonalen Gefäßbildung beteiligt ist. Diese Theorie wird durch eine nicht-Mendelsche Verteilung der postnatalen Genotypen nach Kreuzung heterozygoter HoxA9-Mäuse unterstützt. Als molekulare Ursachen der Hemmung angiogener Funktionen bei Endothelzellen, konnte die Regulation verschiedener Gene nachgewiesen werden. So ist HoxA9 für die Expression der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS), des VEGF-Rezeptors 2 (VEGF-R2), der Adhäsionsmoleküle VE-Cadherin und Integrin v3 sowie des EphB4-Rezeptors von essentieller Bedeutung. Diese von HoxA9 regulierten Gene spielen für die Angio- und Vaskulogenese alle eine entscheidende Rolle. Der EphB4-Rezeptor, die eNOS und der VEGF-R2 werden durch eine direkte Bindung von HoxA9 an den jeweiligen Promotor auf transkriptioneller Ebene reguliert. Bei den Genen Integrin v3 und VE-Cadherin erfolgt die Regulation durch HoxA9 indirekt über andere Gene oder posttranskriptionell. Zusätzlich zum Nachweis der Kontrolle der Genexpression, konnte für den EphB4-Rezeptor nachgewiesen werden, dass dieser von großer Bedeutung für die HoxA9-regulierte Migration ist. Außerdem besitzt der EphB4-Promotor eine für die Regulation der EphB4-Expression durch HoxA9 wichtige Bindungsstelle. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass HoxA9 Schubspannungs-abhängig reguliert wird und dabei auch in die Regulation der Schubspannungs-induzierten Migration und die Schubspannungs-abhängige Expression der untersuchten Zielgene von HoxA9 eingreift. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass HoxA9 endotheliale Gene vielfältig reguliert, eine entscheidende Rolle bei der Modulation verschiedener endothelialer Funktionen spielt und essentiell für die postnatale Neovaskularisierung ist.
Das Philadelphia-Chromosom (Ph) ist das zytogenetische Korrelat der t(9;22). 95% der chronisch myeloischen Leukämien (CML) und 20-25% der akuten lymphatischen Leukämien (ALL) des Erwachsenen sind Ph-positiv (Ph+). Die t(9;22) führt zur Expression des chimären BCR/ABL Fusionsproteins, das für die Pathogenese der Ph+ Leukämien verantwortlich ist. Das ABL-Protein ist eine nicht-Rezeptor Tyrosinkinase. Im BCR/ABL-Fusionsprotein wird die Kinase-Aktivität von ABL, die im Normalfall streng reguliert ist, durch die Fusion mit BCR konstitutiv aktiviert. Die N-terminale BCR-"coiled-coil" Domäne vermittelt die Oligomerisierung des Fusionsproteins und dadurch zur Aktivierung der ABL-Kinase. Dies führt zur malignen Transformation hämopoetischer Zellen. Der ABL-Kinaseinhibitor STI571 ist ein tumorzellspezifisches Therapeutikum für Ph+ Leukämien, das bei der Mehrzahl der Patienten zur hämatologischen Vollremission führt. Insbesondere bei Patienten mit CML-Blastenkrise und Ph+ ALL kommt es durch klonale Selektion STI571-resistenter Zellen zu einem frühen Therapie-refraktären Rezidiv der Krankheit. Ziel dieser Arbeit war es, die Grundlagen für neue, tumorzellspezifische Therapiestrategien für die Behandlung BCR/ABL-positiver Leukämien zu legen. Im ersten Teil der Arbeit sollte geklärt werden, ob sich die "coiled-coil" Domäne als Zielstruktur für einen molekularen Therapieansatz eignet: es wurde untersucht, ob eine Hemmung der Oligomerisierung das Transformationspotential von BCR/ABL negativ beeinflußt. Der Zusammenhang zwischen Oligomerisierung und Transformationspotential von BCR/ABL wurde mit Hilfe verschiedener Fusionskonstrukte untersucht, bei denen die Oligomerisierungsdomänen verschiedener Proteinen, (BCR, PML, PLZF und TEL) mit dem ABL-Teil von BCR/ABL fusioniert wurden (X-ABL). Es konnte gezeigt werden, daß ein direkter Zusammenhang zwischen der Oligomerisierung, Transformationspotential und STI571-Sensitivität besteht: verstärkte Oligomerisierung der X-ABL Konstrukte führte zu einem ein höheren Transformationspotential und einer geringeren STI571-Sensitivität und umgekehrt. Außerdem wurde gezeigt, daß die Inhibierung der Oligomerisierung mit Hilfe eines rekombinanten Peptids das Transformationspotential von BCR/ABL erniedrigt und gleichzeitig die Sensibilität gegenüber STI571 stark erhöht. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Oligomerisierungsdomäne von BCR/ABL einen therapeutischer Angriffspunkt für die Behandlung Ph+ Leukämien darstellt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Tumorzell-spezifische Mechanismus der As2O3-induzierten Apoptose bei Ph+ Zellen untersucht. Kürzlich wurde gezeigt, daß aktiviertes RAS die Expression von endogenem PML hochreguliert. RAS wird durch BCR/ABL konstitutiv aktiviert. Bei der Akuten Promyelozytenleukämie (APL) ist PML im Rahmen der t(15;17) durch die Fusion mit RARa modifiziert. Die Behandlung von Zellen mit As2O3 führt zur Modifikation von PML durch den "small ubiquitin like modifier" (SUMO-1). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß sich die Gemeinsamkeiten zwischen Ph+ CML und ALL-Blasten und den t(15;17) positiven APL-Blasten in Hinsicht auf die Sensibilität für die As2O3-induzierte Apoptose auf die direkte oder indirekte Modifikation von PML durch die jeweiligen Translokationsprodukte zurückführen lassen. In dieser Arbeit wurde mittels Überexpression von PML und konstitutiv aktiviertem RAS (RASV12) gezeigt, daß BCR/ABL durch Aktivierung des RASSignalweges die PML-Expression modifiziert und die As2O3-induzierte Apoptose Ph+ Zellen somit durch PML vermittelt wird. An einem Mausmodell der Ph- Leukämie wurde die Wirkung von As2O3 auf die normale Hämopoese sowie auf die BCR/ABL-positive Leukämie überprüft. Es konnte gezeigt werden, daß As2O3 die normale Hämopoese nicht stört und bei 25% der behandelten Tiere zu einer Verbesserung des Blutbildes und einem längerem Überleben führt. Sowohl das therapeutische Angreifen an der Oligomerisierungsoberfläche von BCR/ABL als auch das Ausnützen der Modifikation von PML durch BCR/ABL eröffnen neue Möglichkeiten zur Behandlung von Ph+ Leukämien.
Die lösliche Guanylyl Zyklase (sGC) ist das Schlüsselenzym, das die Stickstoffmonoxid (NO)-induzierte Vasodilatation über eine Erhöhung des intrazellulären zyklischen 3´5´-Guanosinmonophosphats (cGMP) vermittelt. Obwohl die sGC oft als "Haushalts"-Gen bezeichnet wurde, dessen Aktivität nur akut durch die verfügbare NO-Menge reguliert wird, zeigen einige neuere Befunde, dass eine Regulation auch auf Ebene der Gen-Expression stattfindet. Z.B. wurde in zwei Rattenmodellen, der Nitrat-Toleranz (Mülsch et al., 2001) bzw. des chronischen Herzversagens (Bauersachs et al., 1999), eine zwei- bis dreifache Induktion der sGC-Expression beobachtet. Bei der Nitrat-Toleranz wurde zudem ein Anstieg der Endothelin- 1 (ET-1)-Expression beobachtet (Münzel et al., 1995). In dieser Arbeit wurde deshalb untersucht, ob ET- 1 einen Einfluss auf die sGC-Expression und die sGC/cGMP vermittelte Relaxation von Rattengefäßen hat. Um den möglichen Einfluss von ET-1 auf die Transkription der sGC zu untersuchen sollten die Promotoren der beiden Untereinheiten (UE) a1 und ß1 der Ratte kloniert werden. Dazu wurde zuerst eine Bestimmung der Transkriptionsstarts für beide UE durchgeführt. Es konnte gezeigt werde, dass die Sequenz der bis dahin bekannten 5´ Untranslatierten Region (5´ UTR) der a1-UE (Nakane et al., 1990) nicht korrekt war. Die ersten 213 bp dieser Sequenz konnten nicht gefunden werden. Für die ß1-UE konnte der 5´ UTR um 30 bp, im Vergleich zu der von Nakane (1990) publizierten Sequenz, verlängert werden. Letztlich konnten mit Hilfe einer PCR-Technik 2864 bp (a1) und 1287 bp (ß1) in 5´ Richtung des Transkriptionsstarts kloniert und sequenziert werden. Beide Promotoren zeigten eine basale Aktivität, die sich mit zunehmender Verkürzung der Bereiche in Richtung Transkriptionsstart erhöhte. Die basale Aktivität der beiden UE-Prornotoren zeigte, dass die Gene der beiden UE nicht in Tandemorganisation, wie im Medakafisch (Mikami et aI., 1999) vorliegen, sondern ähnlich wie bei der Maus (Sharina et al., 2000) beide UE unabhängig voneinander reguliert werden. Beide Promotoren ließen sich durch eine 6 stündige Stimulation mit ET-1 [10nM] um das ca. 1,6 bis l,9fache aktivieren. Bei Verkürzung des a1-Promotors wurde zudem festgestellt, dass das kürzeste Fragment sich nicht mehr durch ET-1 stimulieren ließ. In den 146 bp, die diesem Konstrukt fehlten, befinden sich mögliche Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren PEA3, NF-Il6 und E2A. In kultivierten glatten Gefäßmuskelzellen der Ratte konnte mit Hilfe der RT-PCR gezeigt werden, dass ET-I (10 nM, 6 Std.) die Expression beider UE auf mRNA-Ebene um das ca. dreifache erhöht. Zudem konnte für die ß1-UE mit Hilfe der Real-Time-PCR (TaqManTM) und für die ET-Rezeptortypen spezifische Antagonisten gezeigt werden, dass dieser ET-1 Effekt über den ETA-Rezeptor vermittelt wird. Bei isometrischen Kontraktionsmessungen an Endothel-freien Rattengefäßen konnte gezeigt werden, dass eine 4 stündige Vorstimulation mit 10 nM ET-1 die für eine 50%ige Relaxation der Gefäße nötige Konzentration des NO-Donors Natriumnitropussuid (SNP) um ca. eine Zehnerpotenz verringert. ET-1 erzeugt also eine deutliche Sensitivierung der Gefäße gegenüber NO. Durch Versuche mit einem stabilem cGMP-Analogon (8-Bromo-cGMP) konnte zudem gezeigt werden, dass nachfolgenden Elemente der NO/cGMP Signalkette nicht durch die ET-1 Stimulation beeinflusst wurden. Auch Teile der Signalkette, die die cAMP-induzierte Relaxation vermitteln, wurden nicht durch ET-1 beeinflusst. Schließlich konnte in in-vitro Versuchen gezeigt werden, dass ET-1 sowohl in Endothel-freien Rattenaorten und Koronargefäßen des Schweins, als auch in kultivierten, glatten Rattengefäßmuskelzellen eine signifikante Steigerung der spezifischen NO-induzierten sGC-Aktivität bewirkt. Die in dieser Arbeit gezeigte Steigerung der Promotoraktivität, der mRNA-Mengen und der enzymatischen Aktivität der sGC durch ET-1 deutet auf einen biologischen Rückkoppelungsmechanismus hin. Dieser würde einer übermässigen Vasokontraktion und den mitogenen Effekten von ET-l bei einer Überexpression entgegen wirken und wäre somit ein wichtiges Element der Feineinstellung der ET-1 Wirkung.
Der Typ 1 Diabetes mellitus (IDDM) ist eine multifaktorielle Erkrankung deren Risiko zu 50-60% von genetischen Faktoren vermittelt werden, wobei dem HLA-System auf Chromosom 6 (IDDM1) eine Schlüsselrolle zugesprochen wird. Innerhalb dieser Genregion befinden sich die beiden solitären retroviralen "long terminal repeats" (LTRs) DQ-LTR3 und DQ-LTR13. Sie können theoretisch mit Hilfe ihrer regulatorischen Elemente die Expression benachbarter funktioneller Gene beeinflussen. Im Rahmen der Fragestellung nach einer möglichen Funktion retroviraler LTRs im Kontext des Typ 1 Diabetes mellitus ist das unmittelbar benachbarte DQB1 Gen ein Kandidatengen von besonderer Bedeutung. Im Rahmen einer Familienassoziationsstudie wurde DQ-LTR13 als potentieller genetischer Risikomarker charakterisiert und es konnte gezeigt werden, daß die Haplotypen DQ8/LTR13+ und DQ2/LTR13- signifikant häufiger transmittiert werden als bei einer zufälligen Vererbung erwartet. Gleichzeitig unterscheidet sich ihr Segregationsmuster signifikant von dem der Haplotypen DQ8/LTR13- und DQ2/LTR13+. Das Kopplungsungleichgewicht zwischen DQ-LTR3 und DQ-LTR13 ist so ausgeprägt, daß sie zwar präferentiell aber nicht ausschließlich zusammen auf einem Haplotypen vorkommen. Die Wahrscheinlichkeit einer Erkrankung an IDDM in Zusammenhang mit einem der beiden Risikohaplotypen DQ8/LTR13+ bzw DQ2/LTR13- liegt bei 76% bzw. 68%. Aufgrund dieser Ergebnisse ist DQ-LTR13 insgesamt als unabhängiger genetischer Risikomarker für Typ 1 Diabetes mellitus zu bewerten, zusätzlich zu den bekannten Risikohaplotypen DQ8 und DQ2 und unabhängig von DQ-LTR3. Im Rahmen funktioneller Analysen unter Verwendung eines Reportergen-Assays konnte nach Transfektion diverser EBV-transformierter lymphoblastoider B-Zellen für keine der beiden LTRs die Fähigkeit nachgewiesen werden, als eigenständiger Promotor auf die Expression des Reportergens Luciferase zu wirken. Diese Fähigkeit konnte auch nicht durch die Gabe von Hydrocortison bzw. ß-Estradiol induziert werden. DQ-LTR13 ist jedoch in vitro in der Lage, abhängig von transkriptioneller Orientierung und Position, über den Promotor des DQB1 Gens verstärkend auf die Expression des Luciferase-Gens zu wirken. Dieser Effekt ist darüber hinaus, bezüglich der beiden Risikoallele DQB1*0302 und DQB1*0201, differentiell ausgeprägt. Eine Verifizierung des beobachteten Effekts in vivo war im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit leider nicht möglich.
Die Stat-Proteine (signal transducers and activators of transcription) bilden eine Familie von 7 verschiedenen Signaltranskriptionsfaktoren, die latent im Zytoplasma vorliegen. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Übertragung von zytokin- und wachstumsfaktorvermittelten Signalen von der Zellmembran in den Nukleus. Die Aktivierung der Stat-Proteine ist ein transienter und streng regulierter Signaltransduktionsprozess, dessen Deregulation eine Rolle bei der Krebsentstehung spielt. In verschiedenen Tumorarten werden vor allem konstitutiv aktive Stat3- und Stat5-Proteine gefunden. Stat5 ist das Hauptsignalprotein bei der prolaktinvermittelten Signaltransduktion im Brustgewebe. Neben Stat3 und Stat1 ist vor allem Stat5A maßgeblich an der Entwicklung und Differenzierung (Laktation) des Brustgewebes beteiligt. Bei der Entstehung von Brusttumoren scheint der Prolaktin/JAK/Stat5-Signalweg ebenfalls involviert zu sein. Die Funktion, die Stat5 dabei hat, ist jedoch weitgehend ungeklärt. Eine gezielte, nur Stat5-abhängige Regulation des Zellsystems ist nur schwer zu untersuchen, da Prolaktin noch eine Reihe weiterer Signalkaskaden aktiviert. In dieser Arbeit wird daher mit Hilfe einer konstitutiv aktiven Mutante die Funktion von Stat5A in der Regulation der Proliferation, Migration, Differenzierung und Apoptose, deren Fehlregulation die Transformation zu Tumorzellen bestimmt, untersucht. Es kann gezeigt werden, dass Stat5 multiple Aufgaben in Brustkrebs- und -epithelzellen übernimmt. Einige dieser Funktionen lassen sich mit der Wirkungsweise von Prolaktin korrelieren. In Tumorzellen hat nicht nur Prolaktin, sondern auch die konstitutiv aktive Stat5A-Mutante Einfluss auf die Proliferation und den Zellzyklus. Die Überexpression dieser Mutante führt, ebenso wie die Prolaktinstimulation, zu einer Erhöhung der Proliferationsrate, die im Falle von Prolaktin Cyclin D1 vermittelt ist. Für die konstitutiv aktive Stat5A-Mutante kann keine Regulation einiger am Zellzyklus beteiligter Proteine festgestellt werden. Die Untersuchungen der Zellmobilität dienen als Marker für das Metastasierungspotential. Sowohl in Brusttumor- als auch in -epithelzellen ist die Fähigkeit zur Migration in Zellen mit konstitutiv aktivem Stat5A, oder nach Prolaktinstimulation erhöht. Für die Tumorentstehung zeichnet sich demnach folgendes Bild: Prolaktin und konstitutiv aktives Stat5A erhöhen sowohl die Proliferations- als auch die Migrationsrate von Brustkrebszellen. Zusammenfassung 2 In der nicht transformierten Brustepithelzelllinie HC11 hat die konstitutiv aktive Stat5AMutante eine andere Funktion. Sie wirkt nicht als Mitogen, wie in Tumorzelllinien, sondern ist in Differenzierungsvorgänge involviert. Die konstitutiv aktive Mutante ist in der Lage, die Signaltransduktion in vitro durch Prolaktin und Dexamethason zu ersetzen und unabhängig davon, die ß-Kaseinbildung zu induzieren. In vivo zeigt sich, dass konstitutiv aktives Stat5A in die Kontrolle der Differenzierung des alveolaren Brustepithels involviert ist. Die alveolaren Strukturen bilden sich schon im jungfräulichen Gewebe und nicht erst in trächtigen Mäusen aus. Eine Überexpression der konstitutiv aktiven Stat5A-Mutante führt in HC11 Zellen jedoch nicht nur zu einer Differenzierung der Zellen, sondern ebenfalls zu einem Anstieg der Apoptoserate. Die konstitutiv aktive Stat5A-Mutante induziert die Expression der negativen Regulatoren des JAK/Stat-Signalweges SOCS1 und SOCS3. Diese blockieren die Janus-Kinase 2, welches wiederum eine Deaktivierung von Stat3 zu Folge hat. Als potentieller molekularer Mechanismus für die Förderung der Apoptose kann eine Inhibierung der Bcl-XL-Expression gezeigt werden. Die Ergebnisse zeigen, das Stat5 unterschiedliche Funktionen sowohl bei der Proliferation und Apoptose als auch bei der Differenzierung von Brustepithelzellen hat. Die Funktion von Stat5 auf das Zellgeschehen scheint vom zellulären Kontext und bereits aktivierten Signalwegen abzuhängen.
Ausgangspunkt dieser Doktorarbeit ist die dominant erbliche hypertrophische Kardiomyopathie, eine Herzkrankheit, die mit Funktionseinschränkungen des Myokards und einem relativ hohen Risiko für einen plötzliche Herztod assoziiert ist. Als Ursachen wurden ca. 160 Mutationen in bisher zehn verschiedenen Genen nachgewiesen, die - mit einer möglichen Ausnahme - für Proteine des kardialen Sarkomers kodieren. Am häufigsten betroffen sind das ventrikelspezifische -Myosin (schwere Kette) sowie das kardiale Myosin-Bindungsprotein C. Ein in Bad Nauheim initiiertes Projekt hat zum Ziel, die Wirkungen einer Mikrodeletion im - Myosingen (Deletion des Codons 927, E927) auf die Struktur und Arbeitsweise des Herzens in transgenen Mäusen zu untersuchen. Es ist bei diesem Projekt beabsichtigt, die Expression des mutierten Myosin-Transgens so zu steuern, dass es nicht unkontrolliert dauernd (konstitutiv), sondern zeitlich kontrolliert (induzierbar) im Herzen exprimiert wird. Als Induktionssystem der Wahl ist dabei das bakterielle Tetrazyklinrepressor-System vorgesehen. Dieses besteht aus dem Repressor tetR, einer DNA- Repressor-Bindungssequenz tetO und einem von außen zugeführten Induktor (Tetrazyklin, tet, oder Doxyzyklin, DOX, einem tet-Derivat). Da dieses Regulationssystem vor dem aufwändigen Einsatz an transgenen Mäusen zunächst in vitro an Zellkulturen zu testen war, wurden für die transiente Transfektion von Zellen in Kultur zwei Plasmide (mit jeweils zwei verschiedenen Promotoren, also insgesamt vier Plasmide) hergestellt. Ein Plasmid enthielt den Repressor und das zweite die tetO-Sequenz mit einem nachgeschalteten Reportergen (lacZ für -Galactosidase). Die beiden Promotoren waren der ubiquitäre virale CMV-Promotor (hCMV-Promotor) einerseits und der herz- und mäusespezifische -Myosin-Promotor (-MHC Promotor) andererseits. Getestet wurde die Regulierbarkeit des Reportergens in transient transfizierten COS1-Zellen, L6 Myoblasten sowie an neonatalen Kardiozyten von Ratten. Für die Kotransfektion von jeweils einem Paar der Plasmide (mit dem tetR-Gen, bzw. dem tetO/lacZ-Gen) wurde ein modifiziertes und in dieser Arbeit optimiertes ballistisches System (Gene Gun von BioRad) benutzt. Die Versuchsanordnung bestand aus Anzüchtung der Zellen, Transfektion, Induktion und Nachweis des Reporterenzyms. Mit dem hCMV-Promotor wurde in allen drei getesteten Zelltypen eine von DOX abhängige Expression der -Galaktosidase nachgewiesen. Mit dem -MHC Promotor, der wegen seiner Herzspezifität nur an kardialen Rattenmyozyten getestet werden konnte, waren in der Standardversuchsanordnung (nach DOX Induktion) nur sehr geringe Mengen an - Galaktosidase nachweisbar. Um die Regulierbarkeit des lacZ-Gens eindeutig zu demonstrieren, wurden als Stimulatoren des -MHC Promotors die Hormone Trijodthyronin, Insulin und Dexamethason einzeln und in Kombination verwendet. Die höchste Stimulierung (ca. 5-fach) wurde mit einer Kombination aller drei Hormone erreicht. In dieser Anordnung wurde damit gezeigt, dass das binäre tetR/tetO-System in vitro nach Induktion auch mit dem -MHC Promotor funktioniert. Mit diesem Resultat war - im Prinzip - der Weg für Experimente mit transgenen Mäusen vorgegeben. In Transgen-Linien mit Einzeltransgenen (entweder mit dem tetR-Gen oder dem lacZ-Gen, beide unter Kontrolle des -MHC Promotors, letzteres zusätzlich mit der tetO- Sequenz für den Repressor) wurde die herzspezifische Expression der -Galaktosidase eindeutig nachgewiesen, nicht jedoch die des tet-Repressors. Die Gründe dafür können gegenwärtig nur vermutet werden. Die Zahl der Genkopien könnte unzureichend gewesen sein. Da es sich um ein bakterielles Gen handelt, könnte auch eine ungünstige Codon-Verwendung einer effizienten Expression entgegenstehen. Zur Klärung dieser Umstände sind weitere Versuche (die nicht mehr Gegenstand dieser Doktorarbeit sind) inzwischen initiiert worden. Das hier in Zellkultur getestete Regelsystem wird als tetON-System charakterisiert, bei dem das Transgen, dessen Expression kontrolliert werden soll (jetzt das Gen für -Galktosidase, später ein mutiertes ventrikelspezifisches Myosingen), erst nach Zugabe des Induktors (Doxyzyklin, bei Mäusen im Trinkwasser) aktiviert wird. Damit unterscheidet sich dieses System von vielfach benutzten tetOFF-Systemen. Diese bestehen aus einem hybriden Protein, das aus zwei verschiedenen Struktur/Funktionsdomänen besteht: der tet-Bindungsdomäne des bakteriellen tet-Repressors und einem viralen ubiquitären Transkriptionsaktivator (das Hybridprotein hat die Bezeichnung tTA). Die zu regulierenden Zielgene enthalten die tetO- Sequenz. Bindung von tet an tTA führt zur Dissoziation des tTA/tetO-Komplexes und damit zur Deaktivierung des Zielgens. Entzug von tet erlaubt die Bindung von tTA an den Promotor des Zielgens und ermöglicht damit dessen Transkription. Dieses System, dessen Funktionalität an Modellversuchen nachgewiesen wurde, hat gleichwohl Nachteile. Diese sind erstens auf eine gewisse Toxizität des Transkriptionsaktivators tTA und zweitens auf negative Wirkungen in Verbindung mit der Dauerzufuhr von Tetrazyklin (zur Unterdrückung der Expression des Zielgens) zurückzuführen. Da ein in der Literatur auch beschriebenes tTA-basiertes tetON- System als nicht ausreichend berichtet wird, erscheint der Aufwand für die Herstellung eines einfachen (nicht-viralen) und ggf. genetisch modifizierten tetON-Systems für die Anwendung an Mäusen sinnvoll und notwendig.
Die Regulation des Zellzyklus wird durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung gesteuert. Schlüsselenzyme sind dabei die Cdk/Cyclin-Komplexe. Für den Eintritt und das Durchlaufen der Mitose von besonderer Bedeutung ist die Polo-like Kinase 1 (Plk1). Zur Aufklärung Mitose-spezifischer Signalwege wurden in dieser Arbeit neue Interaktionspartner der Plk1 gesucht. Die Bedeutung dieser Interaktionen für Zellzyklus und Mitose sollten näher charakterisiert werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß Plk1 direkt mit humanem Cyclin B1, der regulatorischen Untereinheit des M-phase-promoting-factors (MPF), interagiert. Dabei konnte festgestellt werden, daß Plk1 in der Lage ist, Cyclin B1 innerhalb dessen cytoplasmic retention signals (CRS) am Ser-133 zu phosphorylieren. Ferner konnte gezeigt werden, daß die Phosphorylierung der CRS in einer synergistischen Weise durch Plk1 und MAPK (Erk2) stattfindet. Vorphosphorylierung der CRS durch MAPK an Ser-126 und Ser-128 führt nicht nur zu einer 3-4 fach stärkeren Phosphorylierung durch Plk1, sondern auch zur Entstehung neuer Phosphorylierungs-Stellen für Plk1. Die hier aufgeführten Daten zeigen, daß durch synergistische Phosphorylierung der CRS, an der Plk1 beteiligt ist, der rapide nukleäre Import des Cyclin B1/Cdk1-Komplexes in der Prophase gesteuert wird. Dieser rapide Import in den Kern ist Voraussetzung für die Auflösung der Kernmembran in der Prometaphase. Damit konnte gezeigt werden, daß Plk1 dazu beiträgt, den MPF in den Kern (zu seinen Substraten) zu bringen, um früh-mitotische Ereignisse zu induzieren. Mitotische Kinasen (wie MPF, aber auch MAPK) phosphorylieren ihre Substrate oft an Ser/Thr-Pro-Motiven. Sind diese Motive phosphoryliert (pSer/Thr-Pro), so können sie von Pin1, einer Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase isomerisiert werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß Plk1 mit Pin1 interagiert. Dabei bindet Plk1 an die Protein-Interaktionsdomäne (WW-Domäne) von Pin1, ist aber gleichzeitig in der Lage, Pin1 innerhalb seiner katalytischen Domäne (PPIase Domäne) zu phosphorylieren. Es konnte gezeigt werden, daß das Ser-65 in Pin1 eine Phosphorylierungs-Stelle für Plk1 darstellt. Da bekannt war, daß Vortäuschung einer Phosphorylierung an Ser-16 oder Ser-67 die Pin1-Aktivität hemmt, wurde ein ähnlicher Effekt für Ser-65 erwartet. Jedoch führte die Vortäuschung der Phosphorylierung an Ser-65 nicht zu einer Reduktion der PPIase-Aktivität von Pin1. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, daß Pin1 über das Proteasom abgebaut wird. Die Vortäuschung der Ser-65-Phosphorylierung führt zur Stabilisierung des Pin1-Proteins. Damit ist Plk1 das erste bekannte Enzym, welches Pin1 durch Phosphorylierung stabilisiert.
Identifizierung potentieller Schlüsselgene für die Pathogenese des myelodysplastischen Syndroms
(2005)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung von potentiellen Pathogeneserelevanten Genen in differenzierenden, hämatopoetischen Zellen von Patienten mit myelodysplastischem Syndrom. Grundlage für diese Arbeit war die Etablierung eines in vitro Systems zur Differenzierung primärer, hämatopoetischer Stammzellen. Durch globale Genexpressionsanalyse mit Oligonukleotid Mikroarrays sollten enexpressionsmuster gefunden werden, die die normale Hämatopoese charakterisieren und darüber hinaus zur Identifizierung relevanter Gene für die einzelnen Risikotypen des MDS beitragen. Die Ergebnisse können in Anlehnung an die einzelnen Fragestellungen (Kapitel 1.4.) wie folgt zusammengefasst werden: 1. Welche Gene werden im Verlauf der normalen hämatopoetischen Differenzierung angeschaltet? Bei der Differenzierung normaler hämatopoetischer Stammzellen werden im Verlauf der Erythro-, Granulo- und Megakaryopoese hochdifferentielle transkriptionelle Programme initiiert. Die Betrachtung von Genen mit einem sich kontinuierlich verändernden Expressionsniveau zeigte eine ansteigende Expression linienspezifischer Markergene mit zunehmender Differenzierung der Zellen. Darüberhinaus lassen sich differentielle Gene definieren, die für die einzelnen hämatopoetischen Linien und den Zeitpunkt der Expression im untersuchten Zeitrahmen spezifisch sind. Die Anzahl zellreihenübergreifender „Schlüsselgene“ im Verlauf der normalen hämatopoetischen Differenzierung ist stark begrenzt. Lediglich ein Gen (CD86) wird in allen drei hämatopoetischen Linien exprimiert. 2. Gibt es spezifische Genexpressionsmuster, die für die Differenzierung der unterschiedlichen hämatopoetischen Zellreihen charakteristisch sind? Mit Hilfe der „Class membership prediction“ konnte ein Set von 53 Genen identifiziert werden, deren Expression zu unterschiedlichen Zeitpunkten in den einzelnen hämatopoetischen Linien eine Klassifizierung der Einzelproben gemäß dem determinierenden Stimulus zulassen. Diese prädiktiven Gene haben ein spezifisches Expressionsmuster, das Zellen der Erythro-, Granulo- oder Megakaryopoese charakterisieren kann. 3. Ist eine Differenzierung von CD34+ Stammzellen im in vitro Modell möglich? Lassen sich normale Stammzellen und Stammzellen von Patienten mit MDS unterscheiden? Es wurde ein in vitro Modell zur Untersuchung von differenzierenden hämatopoetischen Stammzellen etabliert und eine liniendeterminierte Differenzierung normaler Stammzellen durch Morphologie und Immunophänotyp bestätigt. Die Untersuchungen zeigen, dass die Differenzierung und Proliferation in vitro differenzierter Zellen bei Patienten mit MDS im Vergleich zu normalen Zellen vermindert ist. Diese in vitro Daten korrelieren gut mit klinischen Befunden des MDS, wonach die veränderte Proliferation und Differenzierung der Stammzellen die Insuffizienz der Hämatopoese beim MDS nach sich zieht. 4. Gibt es Gene, welche die differenzierende myelodysplastische Stammzelle charakterisieren können ? Mittels globaler Genexpressionsanalyse differenzierender CD34+ Zellen ist es möglich, zwischen der Gruppe der low risk MDS, der Gruppe der high risk MDS sowie normalen CD34+ Zellen zu unterscheiden. Diese Ergebnisse könnten für die Einschätzung des Krankheitsrisikos beim MDS herangezogen werden. Die vergleichende Analyse der Genexpression in differenzierenden CD34+ Zellen von gesunden Spendern und MDS-Patienten zeigt, dass die Regulation der Differenzierung beim MDS bereits in CD34+ Zellen und nicht erst auf der Ebene späterer Entwicklungsstufen (wie bisher angenommen) gestört ist. Es konnten eine Reihe von Schlüsselgenen (z.B. DLK1, RAP1GA1, BNIP3L, API5), die in differenzierenden CD34+ Zellen differentiell exprimiert sind, gefunden werden. 5. Welchen Einfluss haben demethylierende und hyperacetylierende Substanzen auf die Genexpression hämatopoetischer Stammzellen? Nur eine relativ begrenzte Anzahl von Genen werden sowohl in normalen als auch in MDS-Zellen durch eine Behandlung mit Decitabine und SAHA induziert bzw. reprimiert. Diese Daten weisen darauf hin, dass die Induktion bzw. Repression der Genexpression in einer gerichteten und spezifischen Art und Weise erfolgen muss. Eine Induktion der Expression konnte in allen verwendeten Stammzelltypen nachvollzogen werden, was zeigt, dass die verwendeten demethylierenden und hyperacetylierenden Substanzen nicht ausschließlich tumorzellspezifisch wirken. Die verstärkte Suppression der Expression von Transkriptionsregulatoren in MDS-Zellen deutet darauf hin, dass eine Verbesserung der Hämatopoese in MDS-Patienten durch Behandlung mit Decitabine und SAHA möglicherweise primär durch die Blockierung von Signalkaskaden und nicht durch die Aktivierung von Tumorsuppressorgenen erreicht wird. 6. Unterscheiden sich die Genexpressionsprofile von low und high risk MDS-Zellen nach Behandlung mit Decitabine und Suberoylanilidhydroxaminsäure? Die veränderte Genexpression in high und low risk MDS-Zellen zeigen nach einer Behandlung mit Decitabine und SAHA unterschiedliche Profile. Die Anzahl von induzierten Genen in high risk MDS-Zellen ist höher als in low risk MDS-Zellen. Nur wenige Gene lassen sich in beiden Zelltypen induzieren (2 Gene). Der Effekt der Behandlung auf das Genexpressionslevel ausgewählter Gene zeigt einen graduellen Verlauf, wobei z.B. die Genexpression in normalen Zellen, hin zu Zellen von low risk MDS und schließlich zu high risk MDS-Zellen abnimmt (Methylierung). Diese Resultate lassen vermuten, dass in normalen und MDS-Zellen zwar die gleichen Gene durch eine Behandlung induziert werden, das Maß der Induktion aber vom Subtyp und möglicherweise von der Schädigung der Zelle abhängt. 7. Welche Hinweise zum Pathomechanismus des MDS können mit Hilfe globaler Genexpressionsanalysen gesammelt werden? Mit Hilfe der Genexpressionsanalysen konnte bestätigt werden, dass Zellen von MDSPatienten bereits auf Ebene der Stammzelle Defekte aufweisen und dass diese alterierten Stammzellen ein transkriptionelles Programm determinieren, das massive Alterationen zum transkriptionelles Programm normaler Zellen aufweist. Eine gestörte Expression essentieller linienspezifischer Markergene der Erythro-, Granulo- und Megakaryopoese konnte identifiziert werden und bestätigt die klinischen Befunde. Im Zuge dieser Untersuchungen sind darüber hinaus neue Kandidatengene, die an der Pathogenese des MDS beteiligt sein könnten erstmals durch eine massiv gestörte Expression im Vergleich zu normalen Zellen gefunden worden.
Molekularbiologische Charakterisierung und Expressionsanalyse des Brust-Tumorantigens NY-BR-1
(2005)
Brustkrebs ist die häufigste Krebserkrankung bei Frauen. Trotz guter Behandlungsmöglichkeiten für lokalisierte Primärtumoren verläuft die fortgeschrittene Erkrankung, bei der sich bereits Metastasen gebildet haben, oft tödlich. Es besteht daher ein großer Bedarf an weiteren Tumormarkern für die Diagnostik und Verlaufsbeurteilung sowie an geeigneten Zielproteinen für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien. Neben Radio- und Chemotherapie hat in den letzten Jahren die Immuntherapie bei der Behandlung von Krebserkrankungen an Bedeutung gewonnen. Im Gegensatz zur systemischen Wirkungsweise der Zytostatika wird hierbei das zytolytische Potential des Immunsystems genutzt, um zielgerichtet Tumorzellen zu eliminieren. Sogenannte tumorassozierte Antigene bzw. „Cancer/Testis“ Antigene repräsentieren potente und effektive Zielproteine sowohl für die Anwendung therapeutischer Antikörper als auch für Vakzinierungen. Besonders die auf dem Einsatz von Antikörpern basierenden Strategien haben sich in Kombination mit einer Chemotherapie in jüngster Zeit als erfolgreich erwiesen. In einer brustspezifischen SEREX Analyse konnte vor wenigen Jahren das Tumorantigen NY-BR-1 identifiziert werden, für das eine gewebespezifische mRNA Expression in Testis, Brust sowie eine Überexpression in Mammakarzinomen beschrieben wurde. Bioinformatische Vorhersagen legten nahe, dass es sich bei diesem neuen, nicht charakterisierten Protein um einen Transkriptionsfaktor handeln könnte. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Brust Tumorantigen NY-BR-1 molekularbiologisch und biochemisch zu charakterisieren. Des Weiteren sollten dessen Expression in Zelllinien und Geweben untersucht und eine erste Evaluierung der klinischen Relevanz dieses Tumorantigens als Zielprotein für immuntherapeutische Strategien durchgeführt werden. Hierfür wurden zunächst ein NY-BR-1 Volllängen-Expressionskonstrukt kloniert sowie ein polyklonales anti-NY-BR-1 Antiserum hergestellt, das in der Lage ist, rekombinantes und überexprimiertes NY-BR-1 Protein zu detektieren. Für den Nachweis des endogenen Proteins konnte später ein monoklonaler anti-NY-BR-1 Antikörper verwendet werden, der im Rahmen dieser Arbeit bezüglich seiner Funktionalität und Spezifität in diversen Anwendungen (Western Blot, Immunpräzipitation, Immunfluoreszenz, Durchflusszytometrie, Immunhistochemie) getestet und eingesetzt wurde. Expressionsanalysen mittels quantitativer RT-PCR und cDNA-„Microarrays“ zeigten, dass NY-BR-1 in normalem Brustgewebe, in primären Mammakarzinomen und in Brusttumormetastasen exprimiert ist, wobei im Vergleich zu Normalgewebe in 70% der Tumorproben eine Überexpession zu beobachten war. Interessanterweise wird NY-BR-1 auch in normalem Prostatagewebe und in einigen Prostatatumoren exprimiert. Es gelang in der vorliegenden Arbeit erstmalig, die Expression des endogenen NY-BR-1 Proteins in normalem Brust-, Testis- und Prostatagewebe sowie entsprechenden Tumorproben im “Western Blot” nachzuweisen, wobei das Protein nur in der unslöslichen Membranfraktion einer Gewebe-Lysatpräparation detektiert werden konnte. Es wurde mit verschiedenen biochemischen und zellbiologischen Methoden in transient transfizierten Zellen gezeigt, dass NY-BR-1 ein Membranprotein ist, dessen N- und C-Terminus sich auf der Zelloberfläche befinden. Immunfluoreszenz und FACS-Analysen belegen, dass der monoklonale Antikörper das NY-BR-1 Epitop auf der Zelloberfläche lebender transfizierter Zellen erkennt. Da NY-BR-1 in Pleuralergusszellen von Brustkrebspatientinnen sowie in etablierten Brust-Zelllinien nur in einigen Fällen auf mRNA Ebene, nicht jedoch auf Proteinebene nachweisbar war, wurde die Lokalisation des endogenen Proteins in Gewebeproben immunhistochemisch untersucht. Während NY-BR-1 in Brust-, Prostata- und Hodentumorzellen überwiegend im Zytoplasma gefunden wird und zum Teil vesikulär/aggregiert vorliegt, konnte in einigen Zellen der Brust- und Hodenkarzinome eine Membranlokalisation des Proteins beobachtet werden. Die vorhergesagte Funktion von NY-BR-1 als Transkriptionsfaktor konnte experimentell nicht bestätigt werden. Die Ergebnisse von Co-Immunpräzipitationsexperimenten legten nahe, dass das NY-BR-1 Protein Dimere oder Multimere mit sich selbst bzw. mit dem C-Terminus des Proteins bilden kann. Erste funktionelle Studien lassen eine direkte Beteiligung von NY-BR-1 an der malignen Transformation vermuten. In Weichagar Experimenten konnten NY-BR-1 exprimierende murine Fibroblasten (NIH3T3 Zellen) Kolonien bilden. Desweiteren wurde beobachtet, dass NY-BR-1 Expression in embryonalen Nierenzellen (293T Zellen) einen positiven Einfluß auf deren Adhäsionsverhalten an humane Endothelzellen zur Folge hat. Serologische Untersuchungen von über 50 Brustkrebs Patientenseren konnten bestätigen, dass NY-BR-1 ein Tumorantigen ist und ergaben, dass mindestens 5% der Patienten detektierbare anti-NY-BR-1 Serumantikörper entwickelten. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten dazu beitragen, das Expressionsmuster, die zelluläre Lokalisation und die biologische Funktion des Tumorantigens NY-BR-1 näher zu untersuchen. Da NY-BR-1 gewebespezifisch in Brust, Testis und Prostata exprimiert ist und in 70% der Brust- und einigen Prostatatumoren (über)exprimiert wird, ist NY-BR-1 ein geeigneter Tumormarker und ein attraktives Zielprotein für aktive und passive Immuntherapie bei Brust- und evtl. bei Prostatakrebspatienten. Speziell für auf Antikörpern basierenden Therapien stellt das Zelloberflächenantigen NY-BR-1 ein interessantes „target“ für zukünftige Therapiestudien dar.
Funktionelle Charakterisierung von Peptidliganden für das komplexe HIV-1-RNA-Verpackungssignal PSI
(2008)
Im Laufe der vergangenen Jahre hat die Identifizierung von Peptidleitstrukturen in der Wirkstoffentwicklung zunehmend an Bedeutung gewonnen. Die Phage Display Technologie ist eine Methode, welche zur Selektion von inhibitorischen Peptiden weit verbreitet ist. Prinzipiell eignet sich dieser Ansatz auch für die Suche nach neuen Leitstrukturen für die Therapie der HIV-Infektion, welche in hochspezifische und -regulierte Schritte im HIV-Replikationszyklus eingreifen sollen. Bei der Verpackung viraler RNA in neu entstehende Virionen handelt es sich um einen Prozess, welcher auf der gezielten Erkennung der dreidimensionalen Struktur der PSI-Region am 5'-Ende ungespleißter, viraler RNA durch die NCp7-Domäne des Gagp55-Vorläuferproteins basiert. Darüber hinaus partizipiert das NCp7-Protein noch an der Reversen Transkription der HIV-RNA sowie an der Integration proviraler DNA und spielt somit eine zentrale Rolle im HIV-1 Replikationszyklus. In vorangegangenen Arbeiten konnten wir mittels der Phage Display Technologie Peptidliganden für die HIV-1 PSI-RNA selektieren, welche die PSI-RNA-NCp7-Interaktion hemmten und in Folge dessen die Verpackung viraler RNA verhindern sollten. Die Bindung der identifizierten tryptophanreichen Peptide an die PSI-RNA konnte zwar zum Teil in vitro mit NCp7 kompetitiert werden, jedoch wiesen die Peptide eine relativ geringe Affinität für die PSI-RNA auf. Im Vordergrund der vorliegenden Arbeit stand nach Optimierung der Affinität eine umfassende funktionelle Charakterisierung der Peptide hinsichtlich ihrer antiviralen Aktivität in vitro. Zunächst gelang es mittels Spot-Synthese-Membranen die Affinität der PSI-RNA-bindenden Peptide um etwa das 30-fache zu verbessern. Der KD-Wert des optimierten HKWPWW-Peptids lag bei 1,1 µM für ein Teilelement der PSI-RNA, das allein über Verpackungsaktivitäten verfügt. Die folgende Analyse der Bindungseigenschaften des HKWPWW-Peptids an die PSI-RNA über NMR und Fluoreszenz-Spektroskopie offenbarte, dass das Peptid über die hydrophoben Aminosäuren an eine charakteristische Schleifenregion in der Sekundärstruktur der PSI-RNA bindet, ähnlich wie der natürliche Ligand NCp7. Gestützt auf diese Ergebnisse, wurde im Hauptteil des Projekts untersucht, ob das HKWPWW-Peptid in der Lage ist, die Verpackung viraler RNA in HI-Virionen zu hemmen. Hierfür erfolgte die Etablierung diverser Testsysteme, welche die intrazelluläre Expression des Peptids ermöglichten. Die Expression von HKWPWW in Fusion mit RFP in Pseudoviren-produzierenden Zellen über transiente Transfektion führte in der höchsten getesteten DNA-Konzentration (2,5 µg) zu einer 95%igen Reduktion des infektiösen Titers. Dieser inhibitorische Effekt war spezifisch für lentivirale Pseudoviren, da die Produktion gammaretroviraler Pseudoviren nicht durch die Anwesenheit des Peptids beeinflusst wurde. Mittels einer stabilen HKWPWW-exprimierenden T-Zelllinie gelang es nachzuweisen, dass das Peptid sogar in der Lage ist, replikationskompetentes HIV über einen Zeitraum von fünf Tagen zu hemmen. Die Synthese des HKWPWW-Peptids in Fusion mit einer Proteintransduktionsdomäne ermöglichte die direkte Behandlung von HIV-infizierten Zellen und führte zu einer verminderten Freisetzung infektiöser HI-Viren in die Zellkulturüberstände. Dabei lagen die IC50- und IC90-Werte des HKWPWW-Peptids nach zweimaliger Peptidzugabe bei 5, 7 bzw. 28,6 µM. Eine in der Literatur oftmals beschriebene Beobachtung ist, dass bei einer reinen Hemmung der HIV-Verpackung Viren entstehen, welche keine virale RNA enthalten. Das Phänomen war in Anwesenheit des HKWPWW-Peptids wenig ausgeprägt wie Korrelationen von p24-Antigen-ELISA und die Quantifizierung viraler RNA in Viruspartikeln zeigten. Diese Gegebenheit sowie das Wissen über die mannigfaltigen Funktionen des NCp7-Proteins im HIV-Replikationszyklus ließen vermuten, dass HKWPWW noch zusätzlich andere Schritte im HIV-Replikationszyklus hemmen könnte. Unterstützt wurde diese Annahme dadurch, dass HKWPWW Ähnlichkeiten zu der hydrophoben Plattform von NCp7 aufweist, welche essentiell für die Verpackung viraler RNA sowie die Reverse Transkription ist. Damit in Einklang steht, das neben einer Bindung an die PSI-RNA auch eine schwächere Interaktion des HKWPWW-Peptids mit den viralen TAR- und PBS-Strukturen nachgewiesen werden konnte. Die auch beobachtete Hemmung der frühen HIV-Replikationsschritte durch HKWPWW könnte somit mit einer möglichen Hemmung der Transkription viraler Gene, der Reversen Transkription oder Integration erklärt werden. Jedoch zeigte die elektronenmikroskopische Analyse, dass nicht nur weniger Viren in Anwesenheit des HKWPWW-Peptids entstehen, sondern dass diese zum Teil einen weniger kondensierten Kern aufweisen. Dies kann als ein Anhaltspunkt angesehen werden, dass HKWPWW tatsächlich auch auf der Ebene der RNA-Verpackung bzw. der viralen Partikelentstehung einen hemmenden Effekt ausübt. Somit resultiert die beobachtete antivirale Aktivität des HKWPWW-Peptids vermutlich aus kombinierten inhibitorischen Effekten auf mehreren Ebenen der HIV-Replikation.