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Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, basierend auf den eigenen Publikationen, aktuelle Erkenntnisse aus dem Themenkomplex „Sitzen und Gesundheit“ einschließlich Gesundheitspotentiale leichter Aktivitäten bei Erwachsenen resümierend zusammenzustellen und kritisch zu bewerten.
Das Augenmerk der bewegungsbezogenen Gesundheitsforschung galt anfänglich primär den sportlichen und eher intensiven körperlichen Aktivitäten. Neuere Erkenntnisse lassen annehmen, dass auch andere Bewegungsarten als Sport, z.B. Bewegung im Alltag, gesundheitswirksam sein können. Die besondere Bedeutung dieser Aktivitäten liegt darin, dass sie mit wenigen Ausnahmen für jeden geeignet, risikoarm und niedrigschwellig sind. Die am besten erforschte Alltagsbewegung ist das Gehen. Die gesundheitliche Benefits von Gehen gelten sowohl im Bereich der Prävention als auch der Therapie als wissenschaftlich gesichert. Regelmäßiges Fahrradfahren verbessert die kardiorespiratorische Fitness und mindert das Gesamtmortalitätsrisiko. Die Gesundheitseffekte anderer Alltagsaktivitäten lassen sich u.a aufgrund methodischer Herausforderungen schwieriger nachweisen und quantifizieren. Neuere Arbeiten liefern Hinweise, dass Bewegung schon mit leichter Intensität zumindest bei unfitten und inaktiven Bevölkerungsgruppen ein hohes Gesundheitspotential haben kann.
Veränderte Lebensgewohnheiten in Lebensbereichen wie z.B. Arbeit, Freizeit und Fortbewegung haben dazu geführt, dass ein überwiegender Anteil der Bevölkerung den Tag sitzend verbringt. Seit den letzten 10-15 Jahren widmet sich eine wachsende Anzahl von Arbeitsgruppen der Erforschung möglicher gesundheitlicher Konsequenzen des langen ununterbrochenen Sitzens. „Sendentäres Verhalten“ (sedentary behavior), in Abgrenzung zur Inaktivität, bezeichnet Aktivitäten, die sitzend oder zurücklehnend stattfinden und mit einem Energieverbrauch von 1-1,5 MET einhergehen. In Akzelerometerstudien wird sedentäres Verhalten als Aktivitäten, bei denen das Signal mindestens eine minutelang unter 100 counts per minute (cpm) ausweist, definiert.
Akzelerometerdaten deuten darauf hin, dass sedentäres Verhalten in den Industrieländern weit verbreitet ist: es macht bis zu 69% der wach verbrachten Zeit aus.
Unsere Literaturanalyse nach Reviews und systematischen Reviews zum Thema sedentäres Verhalten und Gesundheit bei Erwachsen ergab 13 Übersichtsarbeiten. Die Übersichtsarbeiten weisen eine hohe methodische Heterogenität auf. 9 der Übersichtsarbeiten sind narrative Reviews. Die Literaturanalyse liefert Hinweise für eine graduelle Abnahme der Evidenz für die Zusammenhänge von sedentärem Verhalten mit Mortalität, Morbidität und gesundheitlichen Risikofaktoren. Die Ergebnisse von Querschnitt- und Langzeitbeobachtungsstudien zu möglichen Auswirkungen sedentären Verhaltens auf die Gesundheit sind durch Interventionsstudien nur sehr bedingt untermauert, (patho)physiologische Wirkmechanismen hinter sedentärem Verhalten nicht gesichert, und ein klarer Dosis-Wirkungszusammenhang nicht definierbar. Dennoch scheint die Evidenzlage beim Endpunkt Mortalität relativ eindeutig, bei den Endpunkten Morbidität und Risikofaktoren aber zunehmend schwach und widersprüchlich. Im Fazit deuten die Ergebnisse dieser Übersicht – besonders beim Endpunkt Mortalität und etwas weniger eindeutig bei kardiovaskulären Erkrankungen und Diabetes – auf die gesundheitsschädliche Wirkung langen ununterbrochenen Sitzens hin. In der Konsequenz ist neben Aktivität gemäß Leitlinien zu empfehlen, längere Sitzphasen nach Möglichkeit zu unterbrechen und durch Bewegung mit zumindest leichter Intensität zu ersetzen.
Es liegen einige Hinweise vor, dass nicht nur die Gesamtzeit des sedentären Verhaltens, sondern auch das Muster, in dem es entsteht, von gesundheitlicher Relevanz sein könnte. Neben der Erforschung (patho)physiologischer Effekte des langen Sitzens, ist die Überprüfung von Machbarkeit und Akzeptanz von Unterbrechungsintervention von großer Relevanz. In unserer eigenen Untersuchung haben wir in vivo überprüft, wie weit Beschäftigte mit einer überwiegend sitzenden Tätigkeit vorgegebenen Unterbrechungsempfehlungen nachkommen können, wie sie diese subjektiv erleben und wie sie ihre eigene Bereitschaft einschätzen, die Empfehlungen auch längerfristig durchzuführen.
Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass schon eine einmalige Information über die Gesundheitsrisiken langen Sitzens und über Unterbrechungen zu einer zumindest kurzfristigen Reduktion der Sitzphasen führen kann. In unserer Untersuchung erwies sich ein Unterbrechungsintervall von 60 Minuten als am ehesten realisierbar. Dieses Intervall wurde von den Teilnehmern am angenehmsten wahrgenommen.
Biopharmazeutika sind heutzutage ein wichtiger Bestandteil des Arzneimittelmarktes. Ihr komplexer Aufbau und ihre Mikroheterogenität erfordern eine genaue strukturelle Charakterisierung auf verschiedenen Ebenen der Moleküle, wobei die Anwendung neuer Methoden von den entsprechenden Richtlinien durchaus erwünscht ist. Die Massenspektrometrie als Analysemethode hat sich in diesem Gebiet bereits fest etabliert. Verschiedenste massenspektrometrische Untersuchungen können an den intakten Biopharmazeutika sowie an größeren und kleineren Bruchstücken derselben durchgeführt werden. Trotzdem wird meist auf wenige, lange etablierte Protokolle zurückgegriffen, die häufig mit langwieriger Probenvorbereitung verbunden sind. Bei der Analyse der Glykosylierung wird immer noch die chromatographische Trennung mit anschließender Detektion durch UV- oder Fluoreszenzmessung bevorzugt.
In dieser Arbeit sollten die Möglichkeiten der Massenspektrometrie bei der Analyse von Biopharmazeutika genauer untersucht werden. Dazu gehört auch, den hohen Informationsgehalt der üblichen chromatographischen Auftrennung von Peptiden aus einem proteolytischen Verdau vollständig zu nutzen. Es wurde gezeigt, dass die manuelle Auswertung der Analyse zusätzliche Ergebnisse bringt, und dass gleichzeitig eine Analyse von posttranslationalen und prozessbedingten Modifikationen möglich ist. Zudem wurde der Verdau mit der Protease Trypsin auf das jeweilige Biopharmazeutikum und auf das Ziel der Analyse optimiert. Da mit Trypsin eine vollständige Sequenzabdeckung nicht erreichbar war, wurden zusätzlich verschiedene weniger spezifische Proteasen angewendet. Alle untersuchten weniger spezifischen Proteasen (Elastase, Chymotrypsin und Thermolysin) waren für eine solche Analyse gut geeignet. Die Komplementarität von MALDI- und ESI-MS-Analysen konnte durch ihre Kombination optimal ausgeschöpft werden. Zudem wurden weitere Methoden zur Erhöhung der Sequenzabdeckung wie die Derivatisierung der Peptide mit TMTzero vorgestellt.
Für die Analyse intakter Biopharmazeutika wurden neben der Größenausschlusschromatograph und gelelektrophoretischen Trennungen sowohl MALDI- als auch ESI-MS-Analysen verwendet. Die Trennung großer Proteinmoleküle in kleinere Untereinheiten erleichterte dabei die massenspektrometrische Analyse maßgeblich. Die Fragmentierung der Biopharmazeutika mittels MALDI-ISD war für die Bestimmung der Protein-N- und C-Termini sehr gut geeignet.
Die Analyse der Glykosylierung wurde an den freien N-Glykanen aus einem PNGaseF-Verdau sowie an Glykopeptiden aus einem Verdau mit Pronase durchgeführt. Die freien N-Glykane konnten zudem für die MALDI-MS-Analyse mit der MALDI-Matrix 3-Aminochinolin direkt auf dem Probenteller derivatisiert werden. Die Derivatisierung und Vermessung der N-Glykane wurde zunächst an verschiedenen Standardoligosacchariden, Humanmilcholigosacchariden und N-Glykanen aus Standardglykoproteinen optimiert. Durch die Fragmentierung der N-Glykane konnten diese sequenziert und isomere Strukturen unterschieden werden.
Bei einem Pronaseverdau wurden Proteine so weit verdaut, dass nur noch einzelne Aminosäuren bzw. Di- oder Tripeptide übrig blieben. Lediglich die Glykosylierungsstellen waren durch die voluminösen Glykanstrukturen vor dem Verdau geschützt und behielten eine kurze Peptidsequenz, die für eine Identifizierung der Glykosylierungsstelle ausreichend war. So konnten die N- und O-Glykopeptide direkt ohne Aufreinigung mittels MALDI-MS aus den Verdauansätzen analysiert werden, ohne dass nicht glykosylierte Peptide störten. Das Verdauprotokoll wurde zunächst an mehreren Standard-N- und -O-Glykoproteinen optimiert und anschließend auf die untersuchten Biopharmazeutika angewendet. N- und O-Glykopeptide konnten sogar nebeneinander analysiert werden. Die hohe Massengenauigkeit des verwendeten MALDI LTQ-Orbitrap Massenspektrometers ließ eine eindeutige Identifizierung der Glykopeptide mit Hilfe eines dafür entwickelten Programms zu. Weiterhin konnte die Identifizierung durch die Fragmentierung der Glykopeptide unterstützt werden.
Somit konnten in dieser Arbeit verschiedene massenspektrometrische Analysen von Biopharmazeutika neu entwickelt, optimiert oder vereinfacht werden. Dabei wurden für jede Strukturebene (intaktes Molekül, größere und kleinere Fragmente) sowohl Ansätze mit MALDI-MS als auch mit ESI-MS verfolgt. Einige Methoden, die in der Proteomforschung bereits Anwendung fanden, konnten erfolgreich auf Biopharmazeutika übertragen werden. Die Arbeit zeigt, dass die Massenspektrometrie ein großes Potential in der Analyse der Biopharmazeutika besitzt, das aber bisher noch nicht vollständig ausgeschöpft wird. Durch die Wahl der richtigen Methoden und der geeigneten Instrumentierung wird eine vollständige strukturelle Charakterisierung ermöglicht.
Construction and commissioning of a setup to study ageing phenomena in high rate gas detectors
(2014)
In high-rate heavy-ion experiments, gaseous detectors encounter big challenges in terms of degradation of their performance due to a phenomenon dubbed ageing. In this thesis, a setup for high precision ageing studies has been constructed and commissioned at the GSI detector laboratory. The main objective is the study of ageing phenomena evoked by materials used to build gaseous detectors for the Compressed Baryonic Matter (CBM) experiment at the future Facility for Antiproton and Ion Research (FAIR).
The precision of the measurement, e.g., of the gain of a gaseous detector, is a key element in ageing studies: it allows to perform the measurement at realistic rates in an acceptable time span. It is well known the accelerating ageing employing high intensity sources might produce misleading results. The primary objective is to build an apparatus which allows very accurate measurements and is thus sensitive to minute degradations in detector performance. The construction and commissioning of the
setup has been carried out in two steps. During the first step of this work, a simpler setup which already existed in the detector laboratory of GSI had been utilised to define all conditions related to ageing studies. The outcome of these studies defined the properties and characteristics that must be met to build and operate a new, sophisticated and precise setup. The already existing setup consisted of two identical Multi Wire Proportional Chambers (MWPCs), a gas mixing station, an 55Fe source, an x-ray generator, an outgassing box and stainless steel tubing. In a first step, the gain and electric field configuration of the MWPCs were simulated by a combination of a gas simulation (Magboltz) and electric field simulation program (Garfield). The performance and operating conditions of the chambers have been thoroughly characterised before utilising them in first preparatory ageing test. The main diagnostic parameter in ageing studies is the detector gain, thus it is mandatory for precise ageing studies to minimise the systematic and statistical variation of the pressure and temperature corrected gain. To achieve the required accuracy, several improvements of the chamber design and the gas system have been implemented. In addition, the temperature measurement has been optimised. During the preparatory tests, several ageing studies have been carried out. The ageing effect of seven materials and gases have been carried out during these tests: RTV-3145, Ar/CO2 gas, Durostone flushed with Ar/Isobutane gas, Vetronit G11, Vetronit G11 contaminated with Micro 3000 and Gerband 705. The results of these studies went into the design of the new sophisticated ageing setup. For example some tests revealed that there was, even after cleaning, a certain level of contamination with "ageing agents" in the existing setup, which made it imperative to ensure a very high level cleanness of all components during the construction of the setup. The curing period of some testing samples like glues or the gas flow rate were found to be very important factors that must be taken into account to obtain comparable results. Very important changes in the chamber design have been made, i.e., the aluminium-Kapton cathodes used in MWPCs have been replaced with multi-wire planes and the fibreglass housing of the chamber has been changed to metal. The second step started with building the new setup which was designed based on the findings from the first step. The new ageing setup consists of three MWPCs, two moving platforms, an 55Fe source, a copper-anode x-ray generator, two outgassing boxes, both flexible and rigid stainless steel tubes. Before fabrication of the chambers, simulations of their electric field and the gain have been done using Magboltz and Garfield programs. After that, the chambers were installed and tested. A 0.3% peak-to-peak residual variation of the corrected gain has been achieved. Finally, the complete setup has been operated with full functionality in no-ageing conditions during one week. This test revealed very stable gain in all three chambers. After that two materials (Gerban 705 and RTV-3145) have been inserted in the two outgassing boxes and tested. They revealed an ageing rate of about 0.3%/mC/cm and 3%/mC/cm respectively. The final test proves the stability and accuracy of the ageing measurements carried out with the ageing setup at the detector laboratory at GSI which is ready to conduct the envisaged systematic ageing studies.
In der vorliegenden Arbeit galt es, stabile, lumineszente, tetrakoordinierte Organoborane unter Verwendung eines Bor-funktionalisierten ditopen Grundbausteins und unterschiedlicher π- konjugierter Ligandensysteme zu synthetisieren. Die Bifunktionalität sollte die gleichzeitige Einführung von zwei Lewis-Basen erlauben, um eine mögliche elektronische Kommunikation oder einen Energietransfer zwischen den Chromophoren zu gewährleisten.
...
Zusammenfassend war es möglich unter Einsatz eines Bor-haltigen Grundsystems (DBA) durch die Variation der chelatisierenden bzw. verbrückenden π-konjugierten Liganden stabile und effiziente Fluorophore mit nützlichen optischen Eigenschaften zu realisieren.
Meine Arbeit beschäftigt sich mit dem systematischen Problem des Selbstbewusstseins, nämlich mit der konzeptuellen Möglichkeit des Selbstbewusstseins. Für die Problemstellung meiner Arbeit ist die Kritik von Fichte und der Philosophen der Heidelberger Schule (dazu gehört Dieter Henrich, Ulrich Pothast, Manfred Frank und Konrad Cramer) an Kant von zentraler Bedeutung. Sie besagt, dass Kants Selbstbewusstsein konzeptuell unmöglich ist, weil es sich in einem petitio principii bzw. Zirkelargument verwickelt. Aufgrund dieser Problemstellung formuliere ich die Fragestellung meiner Arbeit folgendermaßen: ob erstens die Kritik dieser Philosophen angemessen ist? Ob zweitens die Selbstbewusstseinstheorie der Philosophen der Heidelberger Schule, die als Alternative zu Kants Selbstbewusstseinstheorie gemeint ist, überzeugend ist? Drittens ob Kants Selbstbewusstsein konzeptuell unmöglich ist bzw. ob bei Kant eine Theorie des Selbstbewusstseins vorliegt, die philosophisch möglich erscheint?
Die Ergebnisse meiner Untersuchung, die zugleich als Thesen meiner Dissertation gelten, zeigen: erstens sind die Kritiken von Fichte sowie Henrich und seinen Schülern an Kant nicht angemessen. Die Argumentation, derer sich Fichte und Henrich bedienen, um die definitorische Unmöglichkeit der Selbstbewusstseinsphilosophie Kants zu belegen, basiert auf ihrer Gleichsetzung von Apperzeption und Reflexion. Die Apperzeption kann konzeptuell jedoch nicht mit der Reflexion gleichgesetzt werden. Zweitens sind die von Henrich und seinen Schülern entwickelten Selbstbewusstseinstheorien nicht überzeugend, weil sie paradoxerweise zum Verschwinden des erklärten Phänomens, d. h. des Selbstbewusstseins führen. Die Unzulänglichkeit der Selbstbewusstseinstheorie Henrichs verkleinert aber nicht ihre Beiträge zu der Philosophie des Selbstbewusstseins. Durch seine Untersuchung und seine Reflexion über das Selbstbewusstseinsproblem hat Henrich die anderen Dimensionen des Selbstbewusstseinsphänomens eröffnet, die ihn dazu veranlasst haben, dass dasselbe Phänomen von der Perspektive der Intuition und der Mystik und der Romantik her herangegangen werden kann, wie die Selbstbewusstseinstheorien von seinen Schülern zeigen. Drittens ist Kants Selbstbewusstseins nicht unmöglich, wie Fichte, Henrich und seine Schüler behaupten. Kant hat eine Theorie des Selbstbewusstseins. Für ihn ist das Selbstbewusstsein bzw. das Ich ein spontanes Handeln im Form des Ich denke. Es fungiert als das Zugrundeliegende, hypokeimenon, als transzendentales Subjekt im Erkenntnisprozess. Kants Selbstbewusstsein ist ein transzendentales Selbstbewusstsein, das logisch angenommen werden muss als die objektive und notwendige Bedingung der Möglichkeit der Erfahrung.
Das kantische Subjekt kann jedoch nicht im ontologischen Sinne, nämlich als Substanz oder als ein erkennbares Dingartiges verstanden werden. Kant selbst warnt sein Leser an einigen Stellen der KrV, damit sein Subjekt nicht missverstanden wird. Es ist zwar ihm zufolge eine Substanz oder ein Ich, aber „nur eine Substanz in der Idee“ (A 351) oder „(Ich) Substanz im Begriffe, einfach im Begriffe“ (A 400) und nicht in Realität. D. h. das kantische Subjekt ist ein transzendentales Subjekt.
Kants Selbstbewusstsein thematisiert also einen philosophischen Sachverhalt. Worin liegt der philosophische Sinn des Selbstbewusstseins Kants? Er liegt erstens in seiner Transzendentalität, nämlich als Prinzip bzw. als apriorische Bedingung der Möglichkeit der Erkenntnis. Und seine Transzendentalität erlaubt uns nicht, es auf ein bestimmtes wissenschaftliches Problem zu reduzieren. Die Reduktion des Phänomens des Selbstbewusstseins Kants hat uns unmittelbar von seiner Transzendentalität weggeführt. Das philosophische Selbstbewusstsein kann nicht epistemologisch als natürliches Phänomen behandelt werden. Solche Naturalisierung hat unmittelbar seine Transzendentalität verneint. Kants Selbstbewusstsein hat auch zweitens philosophischen Sinn, weil unsere Erkenntnis davon bloß aus dem Begriff der Erfahrung kommt. Das heißt, wir haben Erkenntnis über dieses Selbstbewusstsein bloß aufgrund der Erklärbarkeit der Erfahrung.
Das Kino ist ein Ort, in dem das Kindliche vorausgesetzt und reaktiviert wird: kindlicher Glaube, kindlicher Wunsch und kindliche Ängste. Darum ist das Kino im freud'schen Sinne ein unheimlicher Ort par exellence, vor allem weil dort die Doppelgänger des Lebens erfahren werden, nämlich die Filme. Doppelgänger bezeichnet zwar ein aus narzisstischem Verhältnis entstandenes Spiegelbild, das aber im Laufe der Zeit zum Schattenbild wird, das uns dann an dem Tod erinnert. Das Kino bietet aus diesem Grund einen Möglichkeitsraum, in dem unser altes Ich sterben und neues Bewusstsein gewonnen werden kann, und zwar so wie die lacan'sche Trias den Heilungsprozess erklärt: durch den narzisstischen bzw. imaginären und symbolischen Tod, gelangt das Subjekt zum Realen, wo es sich seine eigene Realität erschafft.
Die vorliegende Studie befasst sich mit Stanley Kubricks letztem Film Eyes Wide Shut als Metafilm, der filmisches Sehen räumlich repräsentiert. Der Film wurde von Arthur Schnitzlers Traumnovelle inspiriert, die die sexuelle Ambivalenz in einer glücklichen Ehe durchforstet und die geträumte Untreue der Ehefrau mit dem wirklichen Versuch des Ehemannes gleichsetzt. Der Film verweist zudem auf das Kindliche, einerseits indem der Protagonist als Stellvertreter des Zuschauenden agiert, der wiederum wie ein Kleinkind wirkt, und andererseits indem die Frauen wie Puppen erscheinen. Das Augenmerk der Arbeit richtet sich auf die Erzählsituation sowie auf die geschlechterspezifische Darstellung, wobei die Dreierbeziehung zwischen Kubrick, Eyes Wide Shut und den Zuschauenden mit dem Erzählschema von Gérard Genette untersucht wird. Mit Eyes Wide Shut schuf Kubrick außerdem ein Metakino, indem er die innerfilmische Struktur die außerfilmische widerspiegeln ließ.
During the last decade of the 20th century, the field of mass spectrometry has seen a revolutionary change in its application and scope. The introduction of soft ionization methods for the analysis of biological molecules has expanded the area of mass spectrometry from its early roots in the analysis of inorganic and organic species into the fields of biology and medicine.
Today, the use of the mass spectrometry is extended to a wide range of applications in biotechnology and pharmaceutical industry, in geological, environmental and clinical research. In biochemistry, the principles of mass spectrometry are, however, broadly applicable in accurate molecular weight determination, reaction monitoring, amino acid sequencing, oligonucleotide sequencing and protein structure.
In order to carry out their biological activities, proteins interact most often to each other and form transient or stable complexes. In addition, some proteins specifically interact also with other proteins or with non-protein molecules, such as DNA, RNA or metabolites, these interactions being critical for their function. Hence, defining the composition of protein complexes, as well as understanding how protein complexes are assembled and regulated yield invaluable insights into protein function. Coupled with an isolation technique to purify a specific protein complex of interest, mass spectrometry can rapidly and reliably identify the components of complexes. In addition, quantitative MS techniques offer the possibility of studying dynamically regulated interactions....
Since Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins are frequently dysregulated in different cancer entities and contribute to apoptosis resistance, pharmacological IAP antagonists are considered to be promising agents for the future development of cancer treatment strategies. IAP antagonists are small-molecule drugs that have been designed to mimic the interaction site of IAP proteins with their endogenous inhibitor Second mitochondrial activator of caspases (SMAC). Thus, they are frequently referred to as SMAC mimetics. Treatment with SMAC mimetics engages an apoptotic program in cancers by affecting different components of the apoptotic machinery. Besides disinhibition of caspases, SMAC mimetics trigger non-canonical nuclear factor-κB (NF-κB) signaling, which induces upregulation of tumor necrosis factor (TNF) α and other NF-κB target genes. In particular, TNFα production has been closely linked to the induction of SMAC mimetic-mediated cell death. The TNFα-dependent para/autocrine loop facilitates the formation of a cytosolic complex consisting of caspase-8, Fas-associated death domain (FADD) and Receptor-interacting protein (RIP) 1, which serves as caspase-8 activation platform and ultimately triggers induction of apoptosis. In the present study, we use the small-molecule bivalent SMAC mimetic BV6 to analyze SMAC-stimulated NF-κB signaling in cancer cell lines of different entities. Interestingly, we identify two novel NF-κB-regulated factors that are both required for SMAC mimetic-induced apoptosis in a context-dependent manner. First, we show that NF-κB-dependent upregulation of death receptor 5 (DR5) can serve as an alternative mechanism of BV6-mediated cell death. We demonstrate that BV6 treatment induces NF-κB-dependent but largely TNFα -independent apoptosis in A172 glioblastoma cells. By using an unbiased whole genome expression analysis approach, we identify DR5 as a critical NF-κB target gene, which substitutes TNFα and is indispensable for BV6-initated cell death in A172 cells. Second, we demonstrate that Interferon regulatory factor (IRF) 1 is required for BV6-induced TNFα production and apoptosis. Our study provides evidence that IRF1 closely cooperates with the NF-κB network in BV6-mediated cell death and additionally alters expression of selective SMAC mimetic-induced target genes. Furthermore, we show that BV6 treatment triggers secretion of a set of proinflammatory cytokines and increases attraction of monocytes to BV6-treated tumor cells in an IRF1-dependent manner. In summary, our work supports the notion that NF-κB-regulated factors are critically required for SMAC mimetic-initiated apoptosis. We show that IRF1 is indispensable for TNFα production and cell death in BV6-sensitive cell lines and that also DR5 can serve as a proapoptotic NF-κB-controlled factor in BV6-induced apoptosis besides TNFα. Furthermore, this study contributes to an improved understanding on non-apoptotic functions of SMAC mimetics, as IRF1 additionally influences expression levels of proinflammatory cytokines and attraction of immune cells. Thus, our work provides novel insights into the regulation of SMAC mimetic-induced signaling events, which is crucial for the translation of SMAC mimetics for use in clinical application.
Patienten mit chronisch-unspezifischen Nackenschmerzen weisen Studien zufolge ein gegenüber symptomfreien Personen pathologisch verändertes Bewegungsverhalten der Halswirbelsäule auf. Aktuelle Untersuchungen bestätigen dabei eine im Vergleich zu gesunden, symptomfreien Probanden verminderte Beweglichkeit der Zervikalregion. Mit dem Fokus auf sensomotorische Funktionen deuten Studien zudem ein erhöhtes Maß an nicht-intendierter Bewegungsvariabilität sowie ein vermindertes Maß an Nebenbewegungen in andere Ebenen bei der Durchführung zweidimensionaler Bewegungsabfolgen an. Demgegenüber verändert sich bei symptomfreien Personen das zervikale Bewegungs-verhalten im Altersverlauf. Aktuelle Untersuchungen indizieren dabei eine im Alter erhöhte Bewegungsvariabilität. Zusätzlich indizieren Studien ein mit zunehmendem Alter geringer werdendes maximales Bewegungsausmaß der Halswirbelsäule. Publizierte Normwerte drücken diese altersabhängigen Veränderungen jedoch nur grob kategorisierend für größere Altersspannen aus. Daten zu möglichen Zuordnungsmöglichkeiten von Patienten und gesunden Personen anhand trennscharfer Schwellenwerten zum Bewegungsausmaß und zur Bewegungskonsistenz fehlen gänzlich.Vor diesem Hintergrund war das Ziel der Studie die Entwicklung und Validierung klassifikatorischer Modelle zur Diskriminierung von symptomatischem und asympto-matischem zervikalem Bewegungsverhalten. Symptomfreie Probanden (120) wurden konsekutiv der Modellentwicklung (n = 100, 18 – 75 Jahre, 36 f) bzw. der Modellvalidierung zugeteilt (n = 20, 23 – 75 Jahre, 15 f). Zusätzlich wurden zur Modellvalidierung ebenfalls 20 Patienten mit chronisch-unspezifischen Nackenschmerzen eingeschlossen (22 – 71 Jahre, 15 f). Alle Probanden absolvierten initial eine Bewegungsanalyse zur Erhebung des Bewegungsverhaltens der Halswirbelsäule. Diese beinhaltet ein Set zu fünf repetitiven zervikalen Flexions-/Extensions-Bewegungszyklen. Die kinematischen Variablen wurden dabei ultraschalltopometrisch erfasst. Diese standardisierte Erhebung erfolgte in stabiler aufrechter Positionierung und selbstgewählter Geschwindigkeit unter Verwendung eines nichtinvasiven 3D-Bewegungsanalysesystems. Die kinematischen Charakteristika, bestehend aus maximalem Bewegungsausmaß in der Sagittalebene (ROM), den Variationskoeffizienten (CV) sowie den mittleren Nebenbewegungen in Frontal- und Transversalebene (NEB) wurden final aus den Rohdaten berechnet. Im Anschluss erfolgte die Modellentwicklung auf Basis von Cut-Offs. Dies geschah mittels der Erstellung von voraussetzungskonformen linearen Regressionsmodellen. Unabhängige Variable war dabei das Alter, die abhängige Variable stellte das jeweilige kinematische Charakteristikum dar. Die Cut-Offs beschrieben jeweils die Prognose-Konfidenzintervalle der Regressionsgeraden (90% Prognose-Konfidenzintervall für individuelle Werte (ind) und 95% Prognose-Konfidenzintervall für Mittelwerte (MW)). Die Werte der kinematischen Analyse jedes Probanden, der in die Modellvalidierung der entwickelten Cut-Offs eingeschlossen wurde, wurden anschließend mittels dieser Cut-Offs klassifiziert als ‘asymptomatisch’ oder ‘symptomatisch’. Auf der Basis dieser Zuteilung wurden die Cut-Offs stringent mittels Vierfeldertafeln auf ihre Trennschärfe in der Diskriminierung von chronisch-unspezifischen Nackenschmerzpatienten und symptomfreien Personen überprüft. Alle entwickelten Modelle wiesen einen gerichteten linearen Zusammenhang zwischen Alter und dem jeweiligen kinematischen Charakteristikum auf. Auf Basis der internen Validierung beinhaltet das 95%-Konfidenzintervall der Steigung der Regressionsgeraden in dem vorliegenden Modell den Nullwert nicht und schließt zudem bei allen drei Modellen die bei der Erstellung des Modells gefundene Steigung ein. Bei der Modellvalidierung ergab die Bewertung der Vierfeldertafeln überzufällige Unterschiede zwischen erwarteter und beobachteter Häufigkeitsverteilung der mittels Prognose-Konfidenzintervalle für Mittelwerte für ROM (ROMMW; Chi2= 6.8; p< .01) und CV (CVMW; Chi2= 6.42; p< .05) klassierten kinematischen Größen, nicht jedoch für die vier anderen Klassifikatoren (p> .05). Im Anschluss ergab die Analyse der Trennschärfe der Modelle mit überzufälliger Merkmalsverteilung eine Sensitivität von 60 % für ROMMW und von 75 % für CVMW. Die Spezifität betrug 85 % für ROMMW und 65 % für CVMW. Die Resultate demonstrieren einerseits einen linearen Zusammenhang von Alter und verschiedener kinematischer Charakteristika sowie eine überzufällige Merkmalsverteilung für die Modelle ROMMW und CVMW mit ausreichender Spezifität und Sensitivität und – daraus hervorgehend – eine ausreichende Trennschärfe der klassifikatoren in der Differenzierung von symptomatischen und asymptomatischen Bewegungsmustern. Die Resultate sind einerseits im Einklang mit anderen – kategorisierenden – Studienresultaten und ergänzen andererseits – durch die Erstellung und Bewertung trennscharfer Klassifikatoren – den aktuellen Forschungsstand konsekutiv. Die Trennschärfe-Indizes bewegen sich dabei in vergleichbarer Größenordnung wie andere (subjektive) Klassifikatoren (z.B. Schmerzstärke) zur Einordnung von Nackenschmerzpatienten. Insbesondere in der individuellen Beurteilung, aber auch für mögliche prospektive Vergleiche sind valide Ein ordnungskriterien von Belangen und bieten gegenüber einfachen kategorisierenden Gruppenwerten genauere und verlässlichere Klassierungen. Zukünftige Forschungsaktivitäten sollten sich insbesondere mit der Übertragbarkeit vorliegender Cut-Offs auf interventionsinduzierte individuelle Veränderungen auseinandersetzen.
In mitochondria, biogenesis of oxidase is a crucial process involving the participation of an array of assembly factors. Studying the process of biogenesis in eukaryotes is highly complicated due to the presence and partaking of two genetic systems. Employing a bacterial model such as Paracoccus denitrificans that utilizes only one genetic system enables easy studying of the assembly process. The aa3 cytochrome c oxidase of P. denitrificans shows high structural and functional homology to its mitochondrial counterpart despite its simple subunit composition. The assembly of the core subunits I and II that house the active redox centers (heme a, and heme a3.CuB centre in subunit I; and the binuclear CuA centre in subunit II) along with the chaperons responsibly for their incorporation form the crux of this work. This work concentrates particularly on CtaG, a chaperone previously speculated to be involved in the delivery of copper to the CuB center in subunit I. As the full length structure of CtaG or its structural homologues have not been solved, attempts were made to obtain high-diffracting crystals of CtaG by heterologously expressing it in E. coli. Growth media, expression strains and induction parameters were some of the conditions screened in order to obtain optimal yield. Additives, pH and detergent were screened to yield a homogeneous preparation of CtaG. Crystallization trials were conducted by employing the sitting drop, vapour diffusion, method and later the bicelles were employed. Preliminary crystals obtained were further optimized employing seeding, detergent and additives, to improve diffraction. The diffraction improved from 30 Å to 15 Å. BN PAGE (Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis) analysis and cross-linking studies were undertaken to decipher the oligomeric condition of CtaG. Both the methods indicate that the protein is a dimer under native conditions. To study the importance of CtaG in the process of oxidase assembly, two deletion mutants were obtained from the lab; one with only ctaG deleted and the other with ctaG and most of the upstream ORF. The effect of the deletion was assayed on the assembly and activity of oxidase. The deletion mutants showed residual activity of approx. 20 %, while displaying a very low heme signal (both in membranes and in purified COX). In order to exclude polar effects arising due to gene manipulation, complementation strains were prepared, reintroducing ctaG alone into both the deletion strains. Complementation strains, where only ctaG was deleted and re-introduced assayed for COX activity showed a restoration in activity to approx. 70 %. Further, calculating the heme:protein ratio, the deletion strains displayed a value of 7 nmol/mg of oxidase which was increased to wild type levels of 16 nmol/mg in the complementation strains. To further confirm the absence of the copper in subunit I, total reflection X-ray fluorescence spectroscopy analysis was carried out, which showed a decrease in the copper content in the deletion strain, restored on complementation. The strain lacking in the ORF and ctaG when complemented with ctaG alone illustrated no increase in activity or heme signal in comparison to that of the deletion strain. These point at a possible role for ORF in the assembly of COX, which is still absent in the complementation strains. To further characterize the ORF, a series of bioinformatical analysis was carried out, the results from which were insufficient to characterize the ORF conclusively. In order to enlist the proteins involved in the biosynthesis of COX, two independent approaches were employed. Two-dimensional gel examinations of solubilised membranes from untreated and cross-linked cells were analyzed by Western blotting. The CtaG-COX interaction was observed in untreated membranes, which was additionally strengthened by cross-linking. To further confirm this association, pull-down assays were done employing protein A coated magnetic beads coated with different antibodies and incubated with solubilised membranes derived from untreated or cross-linked cells. The elutions were assayed by Western blotting and confirmed for the CtaG-COX interaction. These fractions were further analysed by mass spectrometry to identify other chaperons involved in biogenesis of oxidase. Along with CtaG, I also noticed Sco, Surf1c and other factors involved in the recruitment and transport of heme (CtaB, CtaA, and Ccm proteins). Interestingly, protein components of both ribosomal subunits and protein translocation factors were observed, which indicated a co-translational approach for co-factor insertion into COX.
Das Anforderungsprofil des Fußballspieles zeigt, dass Maximal- und Schnellkraftleistungen einen leistungsdeterminierenden Faktor in dieser Sportart einnehmen. Krafttrainingsinterventionen im Kindes- und Jugendalter bis hin zum Erwachsenenalter führen zu Leistungsverbesserungen in Maximal- und Schnellkraftparametern. Ziel dieser Untersuchung ist es daher zu klären, ob und wie sich eine zweijährige Krafttrainingsintervention auf Maximal- und Schnellkraftleistungen jugendlicher Athleten aus dem Nachwuchsleistungssport auswirkt. An der zweijährigen Untersuchung nahmen 114 Probanden aus zwei Vereinen teil, die durch den Deutschen Fußball Bund e.V. mit dem Prädikat eines Leistungszentrums ausgezeichnet sind. Die Fußballer wurden in zwei Gruppen unterteilt. Die Fußballer wurden zusätzlich jeweils in Subgruppen nach Alter (unter 14 Jahren [U14], unter 16 Jahren [U16] und unter 18 Jahren [U18]) zugeordnet. Die eine Gruppe (KT) führte zweimal wöchentlich zusätzlich zum regulären Fußballtraining ein Krafttraining durch, die andere Gruppe (KG) absolvierte ausschließlich das reguläre Fußballtraining. Es wurde die Leistungsfähigkeit im Squat- (SJ), Countermovement- (CMJ) und Drop Jump (DJ) aus unterschiedlichen Höhen (16 bis 40 Zentimeter), sowie Maximalkraftleistungen im Einer-Wiederholungs-Maximum (1RM) der Front- und Nackenkniebeuge vor, nach einem Jahr und nach der zweijährigen Trainingsphase erfasst. Zur Kontrolle des Einflussfaktors Wachstum wurden in diesem Forschungsprojekt Querschnittsdaten im SJ, CMJ und DJ von insgesamt 426 Schülern (männlich) im Alter zwischen 12 und 19 Jahren analog zu den Fußballern erhoben. Die Schüler wurden in Altersklassen (U13 bis U19) eingeteilt. Für die Analyse der Leistungsentwicklung innerhalb einer Gruppe und die paarweisen Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse mit Messwiederholung mit den Faktoren Gruppe und Zeit durchgeführt. Im Falle signifikanter F-Werte wurde eine Posthoc-Analyse (Scheffe) durchgeführt, um die Lokalisation der signifikanten Veränderungen zu errechnen. Die Analyse der Querschnittsdaten erfolgte über die einfaktorielle Varianzanalyse. Die Posthoc-Analyse (Scheffe) zeigte statistisch signifikante Leistungsunterschiede zwischen den Altersklassen auf (paarweise Vergleiche zwischen zwei Altersstufen). Zur Ermittlung von Zusammenhängen zwischen verschiedenen Parametern wurde die Produkt-Moment-Korrelation nach Pearson berechnet. Das Signifikanzniveau wurde für alle statistischen Verfahren auf p < 0,05 festgelegt. Im Vergleich der Fußballer schnitt die Krafttrainingsgruppe nach der zweijährigen Untersuchungsdauer in den Maximalkraftleistungen der Front- und Nackenkniebeuge in allen Altersklassen signifikant besser ab. Die Ergebnisse der KG zeigen in der U18 für die Maximalleistungen bei den Kniebeugen über zwei Jahre Steigerungen im Mittel von 9,3 ± 13,1 bis 37,1 ± 21,4%, in der U16 von 48,3 ± 39,7 bis 62,1 ± 53,3% und in der U14 von 84,4 ± 26,1 bis 94 ± 39,8%. Die Leistungssteigerungen der KT in den Maximalkraftparametern übersteigen die Zunahmen der KG bei Weitem. In der U14 finden sich je nach Parameter zwischen 290,9 ± 107,7 bis 312,6 ± 118,6% Leistungssteigerung über zwei Jahre. Die U16 weist 112,4 ± 32,7 bis 121,4 ± 39,4% Leistungssteigerung auf und die U18 zwischen 104,0 ± 45,6 bis 106,0 ± 34,4% Leistungssteigerung je nach Parameter über zwei Jahre. Im Squat Jump zeigte die KT ebenfalls signifikant bessere Leistungen (U18: 26,1 ± 13,9%, U16: 29,7 ± 16,7%, U14: 30,9 ± 13,8%), als die Gruppe, die kein Krafttraining absolvierte (U18: 1,0 ± 8,7%, U16: 10,4 ± 11,8%, U14: 8,1 ± 9,9%). Ähnliche signifikante Steigerungsraten wurden beim Countermovement Jump (U18: 20,3 ± 14,0% vs. 1,2 ± 6,9%, U16: 21,2 ± 14,4% vs. 11,1 ± 10,5%, U14: 21,6 ± 14,4% vs. 9,9 ± 7,7%) zugunsten der KG ermittelt. Die U18 der KT weist im Mittel Steigerungen des Drop Jump in den jeweiligen Höhen von 6,6 ± 16,9 bis 14,8 ± 21,3% auf. Es wurden keine signifikanten Unterschiede zur KG analysiert (Steigerungen: 0,0 ± 20 bis 6,2 ± 27,0%). Die U16 der KT erreicht Steigerungen im DJ im Mittel von 35,8 ± 28,8 bis 36,9 ± 22,5%. Dies führte zu signifikanten Unterschieden gegenüber der KG, die Steigerungen von 15,1 ± 20,8 bis 22,0 ± 19,0% aufwies. Zwischen den Gruppen der U14 kam es zu signifikanten Unterschieden im Ausgangstest. Die KT der U14 wies höhere Steigerungen (29,2 ± 25,8 bis 41,3 ± 29,3%) auf als die KG (1,5 ± 18,3 bis 15,2 ± 30,8%). Die Abschätzung der Leistungsentwicklung in den Schnellkraftparametern zeigte, dass es mit dem Alter zu leistungspositiven Veränderungen kommt. Unterstellt man, dass die Differenz zwischen den Mittelwerten der Leistungsparameter der einzelnen Altersklassen der untrainierten Schüler die entwicklungsbedingte Leistungsentwicklung darstellt, finden sich die höchsten Zunahmen zwischen den Altersklassen der U13 und der U17 und die geringsten Zunahmen bei den ältesten Jugendlichen. Die Gruppenvergleiche erreichten nicht zwischen allen Altersstufen signifikantes Niveau, sondern zum Teil erst zu mindestens zwei Jahre älteren Probandengruppen. Die Zusammenhangsanalysen zeigen hohe Zusammenhänge zwischen dem SJ und CMJ und den Maximalkraftparametern. Die Zusammenhänge zwischen den Maximalkraftparametern und den Leistungen im DJ klassifizieren sich als gering bis mittel. Die Daten zeigen, dass sowohl dem Faktor körperliche Entwicklung, als auch der Sportart Fußball leistungspositive Einflüsse auf Schnellkraftleistungen zugeordnet werden können. Die Datenlage dieser Untersuchung zeigt ferner, dass ein Krafttraining einen positiven Effekt auf Leistungsparameter im Fußball hat. Eine langfristige Trainingsintervention von zwei Jahren kann zu einer deutlichen Steigerung des 1RM, des SJ, des CMJ und des DJ führen. Die Maximal- und Schnellkraft ist demnach im Jugendalter durch ein langfristig angelegtes Krafttraining sehr gut zu steigern. Demnach ist ein ergänzendes Krafttraining im Nachwuchsleistungssport der Sportart Fußball zu empfehlen.
Hintergrund: Das Monitoring von unfraktioniertem Heparin (UFH) bei extrakorporaler Zirkulation (EKZ) erfolgt standardmäßig mit Phospholipid-abhängigen Gerinnungstests wie „Activated Clotting Time“ [ACT, (sec)] bzw. „aktivierte partielle Prothrombinzeit“ [aPTT, (sec)]. Durch die im Rahmen von Autoimmunerkrankungen wie dem Antiphospholipid-Syndrom (APLS) auftretenden Antiphospholipid-Antikörper (aPL) ist die Aussagekraft dieser Tests bei solchen Patienten durch eine Verlängerung der Gerinnungszeit deutlich eingeschränkt. Die Wirkung von UFH kann auch mit der photometrischen Messung der aXa-Aktivität bestimmt werden. Ziel der vorliegenden Studie war es zu erfassen, ob die aXa-Aktivitiät mit der ACT korreliert und ob es Cut-off-Werte gibt, die bei der Steuerung der Antikoagulation von kardiochirurgischen Patienten z.B. mit Antiphospholipid-Antikörpern während EKZ hilfreich sein können.
Methodik: Nach einem positiven Ethikvotum wurden in diese prospektive Studie Patienten eingeschlossen, die sich einem erstmaligen elektiv geplanten kardiochirurgischen Eingriff unterzogen. Ausschlusskriterien waren Alter < 18 Jahren, bekanntes Antiphospholipidsyndrom, bekannte Heparin-induzierte Thrombozytopenie und Schwangerschaft. Die ACT-gesteuerte Antikoagulation mit UFH (ACT > 400 sec während EKZ) und dessen Reversierung mit Protamin (ACT ≤ 100 sec) wurden auf der Grundlage klinikinterner Standards durchgeführt. Für jeden perioperativ analysierten ACT-Wert (prä-, intra- und postoperativ) wurde die korrespondierende aXa-Aktivität erfasst. Abhängig von EKZ-Dauer ergaben sich bis zu 14 Messzeitpunkte mit insgesamt 144 Messungen. Die statistische Auswertung umfasste u.a. Spearman Rangkorrelation und die Receiver Operative Characteristic (ROC)-Kurve.
Ergebnisse: Es wurden die Daten von n = 15 Patienten in dieser Studie ausgewertet. Das Hauptergebnis zeigte eine hochsignifikante lineare Korrelation (r = 0.771, p < 0.0001) zwischen den Ergebnissen der ACT und der jeweils korrespondierenden aXa-Aktivität. Der optimale Cut-off-Wert der aXa-Aktivität zur Indikation einer ACT > 400 sec betrug 1.135 IU/ml (Fehlklassifikationsrate: 9.4%). Die Fläche unter der ROC betrug 0.899. Es wurde ein optimaler Cut-off-Wert von 0.55 IU/ml (Fehlerklassifikation: 13.3%, AUC: 0.867) analysiert, der eine ACT von ≤ 100 sec vor der Gabe von UFH und nach der Gabe von Protamin indiziert.
Zusammenfassung: Die aXa-Aktivität korreliert mit der ACT und kann für das Monitoring der Antikoagulation mit UFH während EKZ geeignet sein. Die im Rahmen dieser Studie ermittelten aXa-Cut-off-Werte können dazu beitragen, die Antikoagulation mittels UFH zu steuern, wenn die Messwerte von aPTT und ACT nicht aussagekräftig sind
Neben ihrer Rolle in der DNA Mismatch Reparatur wird eine Beteiligung von MMR Proteinen an der Apoptoseinduktion, der Antikörperbildung sowie an der Mitose und Meiose beschrieben. Untersuchungen zu Partnerproteinen des MMR Proteins MLH1 zeigten darüber hinaus eine Interaktion von MLH1 zu einigen Zytoskelett-assoziierten Proteinen. In der vorliegenden Arbeit sollte der Zusammenhang von MLH1 und nicht-erythroidem Spectrin alpha II (SPTAN1) auf Proteinebene untersucht und eine mögliche Beteiligung von SPTAN1 am DNA Mismatch Reparaturprozess mittels eines in vitro MMR-Assays analysiert werden. Die vergleichenden in vitro Analysen der MLH1 und SPTAN1 Expression erfolgten in fünf verschiedenen MLH1-profizienten und zwei MLH1-defizienten Zelllinien. Zudem wurde in vivo die Expression von MLH1 und SPTAN1 exemplarisch am Beispiel eines sporadischen sowie eines MLH1-defizienten Kolonkarzinomgewebes und des jeweils zugehörigen Normalgewebes durchgeführt. Im MMR-Assay wurden Kernextrakte aus HEK293T Zellen eingesetzte, in denen MLH1 und PMS2 bzw. MLH1, PMS2 sowie SPTAN1 überexprimiert wurde oder solche in denen die SPTAN1 Menge durch siRNA Behandlung zuvor reduziert worden war. Während die Untersuchungen hinsichtlich einer Beteiligung von SPTAN1 an der DNA Mismatch Reparatur keine eindeutigen Ergebnisse erbrachten, zeigten die Analysen der Expression von MLH1 und SPTAN1 interessanterweise sowohl in vitro als auch in vivo, dass die Proteinkonzentration von SPTAN1 bei MLH1-Profizienz deutlich höher war, als bei MLH1-Defizienz. Da SPTAN1 ein überaus wichtiges, filamentöses Gerüstprotein darstellt, an der Aktin-Vernetzung und der Stabilisierung der Plasmamembran beteiligt und mitverantwortlich für Organisation der intrazellulären Organellen ist, könnten die Expressions-unterschiede in MLH1-defizienten und MLH1-profizienten Zellen für die Progression und das Metastasierungsverhalten entsprechender Kolontumore eine wichtige Rolle spielen. Weiterführende Untersuchungen, die im Anschluss an diese Arbeit hinsichtlich des Einflusses der SPTAN1 Menge auf das Migrationsverhalten entsprechender Zellen durchgeführt wurden, zeigen, dass MLH1-defiziente Zellen SPTAN1 abhängig weniger stark migrieren, als die MLH1-profizienten Vergleichszellen. Möglicherweise ist die MLH1 abhängige Expression von SPTAN1 Grund dafür, dass Kolontumoren mit MLH1-Defizienz signifikant weniger zur Metastasierung neigen, als sporadische Kolonkarzinome, die MLH1 exprimieren. Ob dies wirklich zutrifft muss allerdings durch weitere nachfolgende Experimente noch weiter untersucht werden.
The nature of spontaneous brain activity during wakefulness and sleep: a complex systems approach
(2014)
In this thesis we study the organization of spontaneous brain activity during wakefulness and all stages of human non-rapid eye movement sleep using an approach based on developments and tools from the theory of complex systems. After a brief introduction to sleep physiology and different theoretical models of consciousness, we study how the organization of cortical and sub-cortical interactions is modified during the sleep cycle. Our results, obtained by modeling global brain activity as a complex functional interaction network, show that the capacity of the human brain to integrate different segregated functional modules is diminished during deep sleep, in line with an informationintegration account of consciousness. We then show that integration is impaired not only across space but also in the temporal domain, by assesing the emergence of long-range temporal correlations in brain activity and how they are modified during sleep. We propose an encompassing explanation for this observation, namely, that the brain operatsat different dynamical regimes during different states of consciousness. Finally, we gather massive amounts of data from different collaborative projects and apply machine learning techniques to reveal that the \resting state" cannot be considered as a pure brain state and is in fact a mixture containing different levels of conscious awareness. This last result has deep implications for future attempts to develop a discovery science of brain function both in health and disease.
Ziel der Studie: Die akute alkoholinduzierte Fettleber stellt das erste Stadium alkoholischer Leberer-krankungen dar. Bereits eine akute Alkoholintoxikation führt zu einer signifikanten Ak-kumulation von Fett in den Hepatozyten. Trotz verbesserter serologischer und bildge-bender Diagnoseverfahren ist die Leberbiopsie nach wie vor der Goldstandard zur Di-agnose einer Fettleber. Mögliche Komplikationen als invasives Verfahren, Stichproben-fehler sowie eine geringe Sensitivität im Bereich geringgradiger Verfettung sind die größten Nachteile der Leberbiopsie. Ziel dieser Studie war es, mit Hilfe der 1H-Magnetresonzspektroskopie eine akute alkoholinduzierte Fettleber zu diagnostizieren und quantitativ zu beurteilen. Um die Korrelation zwischen spektroskopisch gemesse-nem Leberfettgehalt und histologischer, biochemischer sowie laborchemischer Analyse zu bestimmen, wurde eine alkoholinduzierte Fettleber im Tiermodell verwendet.
Methodik: In 20 Lewis-Ratten wurde eine alkoholische Fettleber mittels gastraler Ethanol-Applikation induziert; 10 Ratten dienten als Kontrolle. Der intrahepatische Fettgehalt wurde mittels 1H-MRS (3.0 T) als prozentuales Verhältnis zwischen Lipid- und Was-ser-Peak berechnet. Fettgehalt sowie Triglyceride wurden nach Entnahme der Leber histologisch und biochemisch (nach FOLCH) bestimmt. Um spezifische Leberenzyme zu untersuchen, wurde Blut aus dem orbitalen Venenplexus entnommen.
Ergebnisse: In allen 20 Tieren konnte nach Ethanolapplikation eine Leberverfettung mittels 1H-MRS nachgewiesen werden. Histologisch zeigten 16 Tiere eine Fettleber. Ebenso zeigte sich nach Ethanolgabe und folgender biochemischer Analyse im Durschnitt eine Erhö-hung des Triglyceridgehalts, welcher einer Leberverfettung entsprach. Es fanden sich statistisch signifikante Korrelationen zwischen der histologisch bestimmten intrahepati-schen Verfettung und dem spektroskopisch gemessenen Fettgehalt (Pearson-Korrelationskoeffizient r = 0.90, p < 0.01) sowie zwischen der biochemischen Analyse nach FOLCH und 1H-MRS (r = 0.97, p < 0.01). Ebenso zeigte sich eine positive signifi-kante Korrelation zwischen spektroskopisch gemessener Leberverfettung und den Le-berparametern AST (r = 0.91, p < 0.05) und ALT (r = 0.84, p < 0.05).
Schlussfolgerung: Es konnte gezeigt werden, dass bereits geringgradige intrahepatische Verfettungen prä-zise quantitativ mittels 3.0 T-Protonen-MR-Spektroskopie darstellbar sind. Somit kann die Methode – bei Beachtung geeigneter Grenzwerte histologischer Messungen – als verlässliche diagnostische Alternative in Betracht gezogen werden. Bereits 48 Stunden nach Alkoholintoxikation ist mittels 1H-MRS eine exakte Differenzierung gesunder und pathologischer Lebern möglich – entscheidend vor allem im Rahmen einer Prätrans-plantationsdiagnostik bei Verdacht auf eine akute Fettleber. Darüber hinaus ist die 1H-MRS anderen bildgebenden Verfahren wie Ultraschall, CT und MRT in der genauen Quantifizierung intrahepatischen Fettgehalts überlegen. Der Einsatz erscheint auch in der Diagnostik und Verlaufskontrolle alkoholischer Lebererkrankungen in Zukunft sinnvoll. Kommende Untersuchung sollten an einem größeren Probandenkollektiv durchgeführt werden, um den Stellewert der 1H-MRS zu unterstreichen.
To overcome poor treatment response of pediatric high-risk acute lymphoblastic leukemia (ALL), novel treatment strategies are required to reactivate programmed cell death in this malignancy. Therefore, we take advantage of using small-molecule antagonists of Inhibitor of apoptosis (IAP) proteins, so called Smac mimetics such as BV6, which are described to overcome apoptosis resistance and thereby sensitize tumor cells for several apoptotic stimuli. To address the question whether redox alterations can sensitize leukemic cells for Smac mimetic-mediated cell death, we interfered with the cellular redox status in different ALL cell lines. Here, we show for the first time that redox alterations, mediated by the glutathione depleting agent Buthioninesulfoximine (BSO), prime ALL cells for BV6-induced apoptosis. Besides ALL cell lines, BV6/BSO cotreatment similarly synergizes in cell death induction in patient-derived primary leukemic samples. In contrast, the combination treatment does not exert any cytotoxicity against peripheral blood lymphocytes (PBLs) or mesenchymal stroma cells (MSCs) from healthy donors, suggesting some tumor selectivity of this treatment. We also identify the underlying molecular mechanism of the novel synergistic drug interaction of BSO and BV6. We demonstrate that both agents act in concert to increase reactive oxygen species (ROS) production, lipid peroxidation and finally apoptotic cell death. Enhanced ROS levels in the combination treatment account for cell death induction, since several ROS scavengers, like NAC, MnTBAP and Trolox attenuate BSO/BV6-induced apoptosis. BSO/BV6-induced ROS can be mainly classified as lipid peroxides, since the vitamin E derivate α-Tocopherol as well as Glutathione peroxidase 4 (GPX4), which both specifically reduce lipid-membrane peroxides, prevent lipid peroxidation, caspase activation and cell death induction. Vice versa, GPX4 knockdown and pharmacological inhibition of GPX4 by RSL3 or Erastin enhance BV6-induced cell death. Importantly, cell death induction critically depends on the formation of a complex consisting of RIP1/FADD/Caspase-8, since all complex components are required for ROS production, lipid peroxidation and cell death induction. Taken together, we demonstrate that BSO and BV6 cooperate to induce ROS production and lipid peroxidation which are eventually required for caspase activation and cell death execution. Collectively, findings of this study indicate that BV6-induced apoptosis is mediated via redox alterations offering promising new treatment strategy to overcome apoptosis resistance in ALL.
Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common malignant tumor and third leading cause of cancer-related death worldwide. Most cases arise as a consequence of underlying liver disease, e.g. developed from chronic hepatitis B or C infectionsalcohol abuse or obesity, and are most often associated with liver cirrhosis. Hypoxiand the hypoxia inducible factors (HIF)-1α and -2α promote tumor progression of HCC, not only affecting tumor cell proliferation and invasion, but also angiogenesis and lymphangiogenesis and thus, increasing the risk of metastasis.
HCC is characterized as one of the most vascularized solid tumors. While HIF-1α and HIF-2α are frequently up-regulated in HCC only HIF-2α is correlated with high patientlethality. HIF-dependent regulation of HCC angiogenesis is controversially discussed.VEGFA, for example, as the most prominent factor inducing tumor angiogenesis represents not only a HIF-1 target, but also a HIF-2 target gene in HCC. This questions whether both isoforms have overlapping functions in regulating the angiogenic switch in HCC.
Besides angiogenesis also tumor-associated lymphangiogenesis significantly influences patient survival in HCC. Lymphatic spread is an important clinical determinant for the prognosis of HCC, but little is known how lymphangiogenesis is controlled in this context. To date, mainly HIF-1α was positively correlated with olymphatic invasion and metastasis in HCC, while a defined role of HIF-2α is missing. Thus, although HIF-1α and HIF-2α are structurally alike and regulate overlapping but not identical sets of target genes, they promote highly divergent outcomes in cancer progression and may even have counteracting roles. The aim of my work was to characterize the specific role of HIF-1α and HIF-2α in the angiogenic switch and lymphangiogenesis induction during HCC development.
Therefore, I created a stable knockdown of HIF-1α and HIF-2α in HepG2 cells and generated cocultures of HepG2 spheroids and embryonic bodies derived from embryonic mouse stem cells as an in vitro tumor model mimicking the cancer microenvironment to analyze which HIF isoform has key regulatory functions in HCC (lymph)angiogenesis. In cocultures with a HIF-2α knockdown angiogenesis was attenuated but lymphangiogenesis increased, while the knockdown of HIF-1α was without effect. Microarray analysis identified plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1)and insulin-like growth factor binding protein 1 (IGFBP1) as HIF-2 target genes.However, prominent angiogenic and lymphangiogenic factors such as VEGFs, PDGFB, ANG and their receptors were not regulated in a HIF-dependent manner. As PAI-1 was linked to angiogenesis in literature and IGF-signaling, which is negatively regulated by IGFBP-1, was correlated with lymphangiogenesis, I decided to investigate their HIF-2α-dependent influence on HCC (lymph)angiogenesis. The knockdown of PAI-1 in HepG2 cells also lowered angiogenesis in PAI-1k/d cocultures similar to the HIF-2α k/d phenotype. PAI-1 as the potent inhibitor of tPA and uPA, both inducing the conversion of plasminogen to plasmin, also inhibits plasmin directly. Therefore, I assumed an increase of plasmin in HIF-2α k/d and PAI-1 k/d cocultures as a result of the reduced PAI-1 levels. Blocking plasmin with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored angioge nesis, suggesting that HIF-2α increases PAI-1 to lower concentrations of active plasmin, thereby supporting angiogenesis. In further experiments I could exclude PAI-1 to reduce angiogenesis by inducing plasmin-mediated apoptosis of differentiating stem cells in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, but demonstrated an increase of VEGFA165 degradation in these cocultures, suggesting plasmin-catalyzed proteolysis of VEGF as an additional layer of regulation required to explain the angiogenic phenotype. Besides the pivotal role of PAI-1 in angiogenesis I also investigated its potentialinfluence in lymphangiogenesis. Indeed, the knockdown of PAI-1 reduced lymphaticstructures and implied an important but opposing role in lymphangiogenesis comparedto induced lymphangiogenesis in HIF-2α k/d cocultures. However, blocking plasmin again with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored lymphangiogenesis to the level of control virus, which indicates a divergent lymphangiogenic role of plasmin in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, possibly because of other essential pathways masking the lymphangiogenic effects of PAI-1 in HIF-2α k/d cocultures.
HIF-2α resulting in reduced IGFBP1 expression induced the differentiation of stem cells toward a lymphatic cell type and significantly enhanced the assembly of human dermal lymphatic endothelial cells into tubes. These data point the first time to an important impact of HIF-2 in the regulatin of lymphangiogenesis in vitro by inducing IGFBP1 and thus, scavenging IGF-1. Furthermore, matrigel plug assays to investigate the in vivorelevance of these observations confirmed HIF-2α as a crucial factor in the regulation of lymphangiogenesis in vivo
In conclusion, this work provides evidence that HIF-2α is a key regulator of angiogenesis and lymphangiogenesis in HCC by regulating PAI-1 and IGFBP1. HIF-2α positively influences the angiogenic switch via PAI-1 and negatively affects lymphangiogenesis via IGFBP1 expression. Targeting HIF-2α in HCC to reduce tumor angiogenesis should be approached carefully, as it might be overcome by induced lymphangiogenesis and metastasis.
During this study clumped isotope analysis of carbonates was established at the Goethe University of Frankfurt, Germany. Therefore, preparation protocols and analytical parameters were elaborated to obtain precise and accurate Δ47 data. Briefly, analyte CO2 was cleaned cryogenically using glass extraction lines to remove traces of water that enable re-equilibration of C–O bonds in the gases. Furthermore, analyte CO2 was passed through a gas chromatograph (GC) to clean it from contaminants that produce isobaric interferences with m/z 47. Initially, phosphoric acid digestions of carbonates was conducted at 25 °C in McCrea-type reaction vessels. Afterwards samples were reacted at 90 °C using a common acid bath. Mass spectrometric analyses were performed using a MAT 253 equipped with a dual inlet system. Δ47 values were directly projected to the absolute scale using CO2 gases equilibrated at distinct temperatures.
In cooperation with Stefano Bernasconi and his research group at ETH Zurich we studied the non-linearity that occurs for the measurement of m/z 47. This effect results from secondary electrons created by the m/z 44 beam. These electrons cause a negative background on the m/z 47 collector. A correction procedure was proposed that relies on the determination of the negative background on the m/z 47 Faraday cup. This approach might reduce time-consuming analyses of heated gases which were used so far to account for the observed non-linearity. However, the suggested correction of the negative background on the m/z 47 cup is only applicable if the slit width of the m/z 44 beam is significantly wider than that of the m/z 47 beam.
This thesis, furthermore, presents a comparison of the different phosphoric acid digestion techniques which are commonly used for carbonate clumped isotope analysis. For calcitic and aragonitic material digested at 25 °C in McCrea-type vessels we observed that the sample size has an effect on Δ47 data: higher mean Δ47 values and a larger scatter of data were received for samples <7 mg than for larger aliquots. For carbonate samples digested at 90 °C in a common acid bath no sample size effect was determined. We assume that secondary re-equilibration of CO2 with water preferentially occurs at 25 °C producing the observed differences. However, a sample size effect can be avoided if reaction temperature is increased to 90 °C.
In order to make carbonate Δ47 data obtained from acid digestions at 90 °C comparable to Δ47 data received from reactions at 25 °C the difference of the acid fractionation factores (Δ47*25-90) between both temperatures has to be known. For the determination of the Δ47*25-90 value we have considered Δ47 data made at 25 °C from samples >7 mg only. For calicte and aragonite we obtained differences in fractionation factores of 0.075‰ and 0.066‰, respectively. These Δ47*25-90 values are coincident with the theoretical prediction of 0.069‰ proposed for calcite (Guo et al., 2009).
Moreover, this dissertation comprises a calibration study of the clumped isotope thermometer based on various natural calcites that grew between 9 and 38 °C. The samples include a brachiopod shell, a bivalve shell, an eggshell of an ostrich and foraminifera tests which formed from distinct biomineralizing processes. Furthermore we included an authigenic carbonate crystallized from biological-induced precipitation. The following linear relationship between 1/T2 and Δ47 was determined (with Δ47 in ‰ and T in K):
Δ47 = 0.0327 (± 0.0026) x 106 / T2 + 0.3030 (± 0.0308) (R2 = 0.9915)
This equation differs from the pioneering Ghosh et al. (2006a) calibration. However, our regression line is statistically indistinguishable from that of Henkes et al. (2013) which is based on aragonitic mollusks and calcitic brachiopod shells. Both studies have in common that calibration data were, at first, directly referenced to the absolute scale. In addition, both datasets rely on similar digestion techniques. Furthermore, the two calibrations are conform with the theoretical prediction of Guo et al. (2009).
The calcite calibration of the clumped isotope paleothermometer received in this study was applied to Δ47 data measured for Silurian brachiopods shells from Gotland/Sweden. Prior to isotopic analysis the fossils were intensively investigated for their preservation state (CL, SEM, trace elements). The lowest T(Δ47) values of ca. 28 to 33 °C were estimated from ultrastructurally well-preserved regions of some shells. For these samples also the lowest δ18Ow values of Silurian seawater were determined. These estimates of ca. −1‰ confirm the assumption that the δ18O value of the Silurian ocean was buffered to (0 ± 1)‰.
Nevertheless, most studied shells were characterized by a patchwork of pristine and altered shell portions resulting in elevated T(Δ47) values which plot mostly between 40 and 60 °C. Our results indicate that the clumped isotopic composition of the shells were altered at low water-rock ratios, not affecting the δ18O values. Δ47 and δ18O data of associated diagenetic phases (sparitic and micritic phases of the inner fillings of the fossils) provide evidence that the sparitic cements grew during several diagenetic events which occurred at different temperatures in fluid-buffered systems. We, furthermore, conclude that the micritic phases lithified at a very early diagenetic stage with the δ18O values being most probably close to a Silurian seawater composition
Vorhofflimmern ist die am weitesten verbreitete Herzrhythmusstörung. Die bisherige antiarrhythmische Therapie ist durch erhebliche kardiale und extrakardiale Nebenwirkungen nur wenig zufriedenstellend. Die Erforschung neuer antiarrhythmischer Substanzen ist aufgrund begrenzt zur Verfügung stehenden menschlichen Probematerials erschwert. Vorhofgewebe wird z.B. bei Herzoperationen gewonnen und kann dann für Forschungszwecke eingesetzt werden. Die Herzzellen sind allerdings sehr empfindlich, weswegen sie meist bereits nach einigen Stunden nicht mehr für weitere Untersuchungen zu gebrauchen sind. Man ist daher auf das Tiermodell angewiesen. Da das Schweineherz dem des Menschen sehr ähnlich ist, stellt es hier ein ideales Testsystem für neue Antiarrhythmika dar. In neuesten Studien wurde in Schweineherzen der IK,PO als ein vielversprechenden Angriffspunkt vorhofselektiver Antiarrhythmika beschrieben. Die diesem Strom zugrundeliegenden Kanaleinheiten sind jedoch zum jetzigen Zeitpunkt nicht genau erforscht.
Ziel der Arbeit war, ein stabiles Modell der Zellkultur mit atrialen Kardiomyozyten zu etablieren. An den kultivierten Herzzellen sollten elektrophysiologische aber auch molekular- und proteinbiologische Methoden angewandt werden. Das Modell sollte mit Zellen aus Schweineherzen erprobt werden und dazu dienen Untersuchungen an Zellen aus einer Gewebepräparation über mehrere Tage durchzuführen. Darüber hinaus sollte die Zellkultur dazu dienen einen Gen-„Knockdown“ anwenden zu können. Der IK,PO und dem diesem Strom möglicherweise zugrundeliegenden Kanaluntereinheiten Kv1.5, Kv4.3, KChIP2 und TASK-1 sollten hierbei charakterisiert werden.
Atriumzellen aus Schweineherzen wurden isoliert und direkt nach Zellisolation sowie unter dem Einfluss der Zellkultur nach bis zu 48 Stunden untersucht. Es kamen die Patch-Clamp-Technik, Real-time-PCR- und Western-Blot-Analysen zum Einsatz. Die Wirkung verschiedener Substanzen auf den IK,PO wurde getestet. Das Kv1.5-Protein wurde dargestellt und mRNA-Analysen für Kv1.5, Kv4.3, KChIP2 und TASK-1 durchgeführt.
Ein Teil der Zellen wurde mit einer gegen Kv1.5 gerichteten siRNA behandelt und anschließend mRNA-Analysen durchgeführt sowie der IK,PO–Strom gemessen.
Die atrialen Kardiomyozyten des Schweines in Kultur zeigten bis zu 48 Stunden vitale Eigenschaften und zeigten sich für die Patch-Clamp-Technik, Real-time-PCR und Western-Blot-Analysen als geeignet. Im Vergleich zu den frisch präparierten Zellen war eine signifikante Zunahme der Stromdichte für den IK,PO zu messen. Die Kinetik des IK,PO-Stroms sowie das Verhalten gegenüber den Substanzen AV0118, Heteropodatoxin und PAP-1 blieben im Vergleich zu den frisch präparierten Zellen unverändert. In Western-Blot-Analysen war im Vergleich zu frisch isolierten Zellen eine Zunahme des Kv1.5-Proteins zu sehen. Die mRNA-Expression des Kv1.5 war dagegen auf ca. ein Sechstel verringert. Eine Abnahme der mRNA-Expression auf ein Zehntel konnte für die Kanaleinheit KChIP2 gesehen werden. Kv4.3 wurde hingegen bis fast auf ein Zweieinhalbfaches vermehrt exprimiert, während die RNA-Expression für TASK-1 konstant blieb. Ein „Knockdown“ des Kv1.5 mit siRNA zeigte eine weitere Reduktion der Kv1.5 mRNA ohne eine messbare zusätzliche Veränderung des IK,PO.
Die Arbeit hat gezeigt, dass primäre Kulturen atrialer Kardiomyozyten des Schweines für elektrophysiologische sowie molekularbiologische Versuche geeignet sind. Der im Interesse stehende Strom IK,PO hat sich unter Kulturbedingungen zwar vergrößert, jedoch blieben Kinetik und vor allem die Eigenschaft auf verschiedene Substanzen zu reagieren unverändert. Es ist somit möglich neue Substanzen in der Entwicklung von Antiarrhythmika an kultivierten Herzzellen zu testen und somit die Anzahl der für die Experimente benötigten Tiere zu verringern. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass neben dem Kv1.5 die Kanaleinheiten der Kv4.3 und KChIP2 wesentlich zum IK,PO betragen. Die vorliegenden Ergebnisse deuten darauf, dass Kv1.5 den Grundstrom des IK,PO bildet und Kv4.3 vornehmlich den Spitzenstrom des IK,PO ausmacht. Kv1.5 wird dabei vermutlich wesentlich durch KChIP2 gehemmt. KChIP2 spielt eine nachweisliche Rolle in der Pathogenese von Herzrhythmusstörungen und zeigt im Vergleich zu Kv1.5 und Kv4.3 eine höhere Gewebespezifität. KChIP2-Blocker könnten in der Entwicklung vorhofselektiver Antiarrhythmika vielversprechende Ergebnisse liefern.