Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Heterologe Expression des humanen ß-2-adrenergen Rezeptors in Semliki-Forest-Virus-Expressionssystem
(2005)
Der humane ß2-adrenerge Rezeptor besitzt sieben Transmembrandomänen und gehört zur Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs). Der Rezeptor ist an der Zelloberfläche lokalisiert und kann nach Bindung extrazellulärer Signalstoffe intrazelluläre Antworten auslösen. Als physiologische Liganden des ß2-adrenergen Rezeptors dienen hauptsächlich die Katecholamine wie Noradrenalin. Nach der Bindung des Liganden kann der Rezeptor an ein stimulatorisches G-Protein (Gs) koppeln und durch Aktivierung der Adenylatzyklase die intrazelluläre cAMP-Konzentration regulieren. Aufgrund der großen pharmakologischen Bedeutung von GPCRs ist es wichtig, die dreidimensionale Struktur dieser Rezeptoren aufzuklären. Da die GPCRs im nativen Gewebe nur in geringen Mengen vorkommen, müssen sie heterolog überproduziert und zur Strukturaufklärung gereinigt werden. In dieser Arbeit wurde das Semliki Forest Virus (SFV)-Expressionssystem zur Produktion des ß2-adrenergen Rezeptors etabliert und optimiert. Die Optimierung des SFV-Expressionssystems erfolgte zunächst bei der Produktion von rekombinanten Viren. Die in vitro Transkriptionsreaktion wurde zur Verbesserung der RNA-Ausbeute untersucht. Anschließend wurde eine optimale Bedingung für die Elektroporation gefunden. Dabei konnte einen Virustiter von 7,5 × 108 infektiöse Partikel pro ml erreicht werden. Zur Produktion des Rezeptors in Säugerzellen wurden sieben rekombinante Viren hergestellt. Verschiedene N- und C-terminale Fusionen wurden im Hinblick auf einen möglichen Einfluss auf die Rezeptorproduktion untersucht. Für das Gen des Kapsid-Proteins (CAP) des Semliki-Forest-Virusgenoms konnte eine deutliche Steigerung der Rezeptorproduktion gefunden werden. Auch die Kozak-Sequenz und das Hämagglutinin (HA)-Signal-Peptid zeigten einen positiven Einfluss auf die Rezeptorproduktion. Die heterologe Proteinexpression wurde in verschiedenen Zelllinien durchgeführt. Es zeigte sich, daß die BHK-21-Zellen für die Produktion in großen Mengen am besten geeignet sind. Die Expressionsrate des Rezeptors in BHK-21-Zellen stieg mit zunehmender Infektionsmultiplizität (MOI). Durch Zugabe von Liganden Alprenolol ins Kulturmedium konnte eine weitere signifikante Steigerung von Rezeptorproduktion erzielt werden. So konnte in adhärenten BHK-21-Zellen 20 Stunden nach der Infektion bei einer MOI von 150 und 2 µM Alprenolol im Medium eine Produktionsrate von 49,6 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. In Suspensionskultur konnte eine Produktionsrate von 36,0 pmol Rezeptor pro mg Membranprotein erreicht werden. Damit konnten 0,2 mg Rezeptoren aus 1 Liter Suspensionskultur produziert werden. Die Rezeptorproduktion in Suspensionskultur könnte jedoch weiter verbessert werden. Mit Immunogoldmarkierung konnte eine überwiegende Lokalisation des Rezeptors im endoplasmatischen Retikulum festgestellt werden. Ein N-Glykosylierung des Rezeptors konnte nachgewiesen werden. Die Glykosylierung gehört zum mannosereichen Typ. Für den Rezeptor wurde eine Dissoziationskonstante von 2,7 nM konnte für Liganden [3H]-CGP-12177 bestimmt. Durch Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurde die vollständige Funktionalität des rekombinanten Rezeptors nachgewiesen. Für die Membranpräparation wurde ein Protokoll erarbeitet, womit ca. 120 mg Membranprotein aus 1 Liter Zellkultur gewonnen werden konnten. Bei der anschließenden Solubilisierung des Rezeptors mit 1,5 % n-Dodecyl-ß-D-maltosid bei pH 7,4 und 100 mM NaCl konnte eine Ausbeute von ca. 100% erreicht werden. In dieser Arbeit konnte nach verschiedenen Versuchen gezeigt werden, daß eine Reinigung über Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) in einem einzigen Schritt nicht möglich war.
Das Ziel dieser Arbeit war, Unterschiede bezüglich der Körperbautypen an Elitekarateka zu eruieren. Hierzu wurden die Konstitutionstypologien nach Conrad, Knußmann, Parnell sowie Heath und Carter, Proportionsfiguren, und das Phantom stratagem verwendet, ebenso wie die Hautfettfalten-Dickenmessungen, die Bioelektrische-Impedanz-Analyse (BIA) und der Body-Mass-Index (BMI). Unter der Annahme Großmeisters Funakoshis, dass es durch ständiges Karatetraining zu körperbaulichen Konstitutionstypusänderungen kommt, wurde diese sportanthropologische Studie durchgeführt. Es sollte geklärt werden, ob innerhalb der Karatewettkampfdisziplinen Kata und Kumite unterschiedliche Körperbautypen, unter Einbeziehung des Sexualdimorphismus, zu finden sind. Die 80 untersuchten männlichen und weiblichen Karateka kamen aus den Disziplinen Kata (Schattenboxen) und Kumite (Freikampf). Im Vergleich dazu wurden 62 und 66 Breitensportkarateka als Kontrollgruppe gegenübergestellt. Das Vergleichskollektiv wurde aus zwei Fitnessstudios rekrutiert, in denen die Probanden 2 - 4 mal pro Woche trainierten. Die Messungen wurden unter standardisierten Bedingungen vom Verfasser dieser Arbeit (und einer Kollegin) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden statistisch geprüft. Die Konstitutionstypognosen von Conrad, die durch die Betrachtungen der Somatocharts von Parnell bzw. Heath und Carter bestätigt wurden, zeigten Unterschiede der Leistungssportler gegenüber den Kontrollgruppen. Demnach ist der typische Kata- und Kumiteathlet kleiner und wiegt weniger als die Sportler des Vergleichskollektivs der Fitnessprobanden. Er ist athletischer gebaut und weist ein günstiges Verhältnis von aktiver und passiver Körpermasse auf. Des Weiteren sind innerhalb der Karatedisziplinen die Katasportler endomorpher als ihre Kollegen. Die Kumiteathleten nehmen mehr ektomorphe Positionen in den Somatocharts (Parnell, Heath und Carter) ein. Anhand der Ergebnisse lässt sich die ursprüngliche Vermutung Funakoshis nach differenzierten Konstitutionstypen sowohl für die beiden Untersuchungskollektive als auch innerhalb des Karate für die Wettkampfdisziplinen Kata und Kumite bestätigen. Die vorliegende Studie lässt den Schluss zu, dass es sowohl den Kata- als auch den Kumite-Konstitutionstypus im Karate gibt. Weiterer Forschungsbedarf besteht hinsichtlich longitudinaler Datenerhebungen des Konstitutionswandels jugendlicher Karateka im Laufe ihrer Wettkampfkarriere. Die Karriere beeinflussende Faktoren wie Trainingshäufigkeit, „Trainingsalter“ und Verletzungshäufigkeit, bezogen auf das Leistungsniveau, lassen Spielraum für weiterführende Untersuchungen. Dies gilt auch für eventuelle ethnische Körperbauunterschiede und das Leistungsniveau der Athleten.
Reggie-1 und Reggie-2 stellen eine über diverse Spezies konservierte Proteinfamilie dar und werden in den meisten Geweben exprimiert. Die physiologische Funktion dieser Proteine ist bisher nicht geklärt. Die Reggie-Proteine wurden zunächst im Zusammenhang mit der Regeneration von Axonen retinaler Ganglienzellen des Goldfisches beschrieben. In diesen Zellen wird die Expression beider Proteine nach Läsion des Nervs hochreguliert. Unabhängig davon wurden Reggies aufgrund ihres Sedimentationsverhaltens in Dichtegradienten als Flotilline beschrieben. Dabei ist Reggie-1 identisch mit Flotillin-2 und Reggie-2 mit Flotillin-1. Beide Reggie-Proteine sind Raft-assoziiert. Bei Rafts handelt es sich um Membran-Mikrodomänen, deren Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen wie Signaltransduktion, Endozytose und dem Transport von Proteinen beschrieben wurde. Strukturell zeichnen sich Rafts durch einen im Vergleich zur restlichen Membran erhöhten Anteil an Cholesterol und Sphingolipiden aus, der unter anderem in einer herabgesetzten lateralen Beweglichkeit der beteiligten Moleküle resultiert, und so Sortierungs- und Signalvorgänge innerhalb der Zelle begünstigt. Aus der Beobachtung, dass Reggie-2 mit dem Struktur-Vorläuferprotein des Rotavirus interagiert, ergab sich die Fragestellung zu dieser Arbeit. Das Ausschleusen von Rotaviren aus infizierten Zellen ist von Rafts abhängig. Die strukturellen Eigenschaften des Rotavirus-Proteins ähneln Gag, dem Struktur-Vorläuferprotein des Humanen Immundefizienz-Virus und verwandter Retroviren. Das HIV Gag-Protein ist außerhalb des viralen Kontext nach Expression in der Lage, an zellulären Membranen zu assemblieren und Virus-ähnliche Partikel zu bilden. Die molekularen Abläufe dieses Vorgangs, der als budding bezeichnet wird, sind noch nicht im Detail verstanden. Sie werden jedoch sowohl für Gag allein, als auch für die Virusproduktion in infizierten Zellen mit Rafts in Verbindung gebracht. Ein Hinweis darauf ergibt sich aus der Tatsache, dass HIV-infizierte Zellen nach Cholesterol-Depletion kein produktives Virus mehr abschnüren. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Reggie-2 mit HIV-1 Gag interagiert und sich Veränderungen der Reggie-2 Expressions sowohl auf die zelluläre Lokalisation von Gag als auch auf die Produktion Virus-ähnlicher Partikel auswirkt. Die Überexpression von Reggie-2 in HeLa-Zellen führt zu einer Umverteilung von Gag mit erhöhter Lokalisation an der Plasmamembran, an der es dann stark mit Reggie-2 kolokalisiert. Die Verminderung der Reggie-2 Expression mittels siRNA resultiert in einer erhöhten Freisetzung Virus-ähnlicher Partikel aus Gag-transfizierten HeLa-Zellen und in einer eher löslichen Lokalisation des viralen Proteins im Zytoplasma. Der Ort des buddings von HIV ist Zelltyp-abhängig und involviert die zelluläre ESCRT-Maschinerie, die physiologisch für das Sortieren von Proteinen in multivesicular bodies (MVBs) zuständig ist. Gag rekrutiert das ESCRT-System, indem es über ein kurzes Aminosäuremotif an das ESCRT-I Protein TSG101 bindet und dabei die Eigenschaft des zellulären Proteins HRS nachahmt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Reggie-2 in HeLa-Zellen mit Komponenten der ESCRT-Maschinerie kolokalisiert. Dabei ist denkbar, dass eine Verbindung zwischen ESCRT und Reggie-Proteinen besteht, da Rafts als Signal- und Sortier-Plattformen die physiologischen Prozesse begünstigen könnten, die bei der Funktion von MVBs eine Rolle spielen. Im Gegensatz zu Reggie-2 findet keine Interaktion von Gag mit Reggie-1 statt. Beide Reggie-Proteine sind jedoch biochemisch in produktiven Viren infizierter primärer T-Zellen nachweisbar. Des Weiteren zeigen Immunfluoreszenz-Studien infizierter Lymphozyten, dass beide Reggies in diesen Zellen in einem großen Ausmaß mit Gag kolokalisieren. Der Grund dafür ist wahrscheinlich die Fähigkeit der Reggies zur Homo- und Heterooligomerisierung. Die direkte und spezifische Interaktion von Gag mit dem Raft-assozierten Protein Reggie-2 konnte mit verschiedenen Methoden gezeigt werden. Dabei können die Ergebnisse als Grundlage für ein besseres Verständnis der HIV-Pathogenese dienen, und zusätzlich gibt die mögliche Verbindung von Reggies zum ESCRT-Komplex neue Hinweise auf die zelluläre Funktion dieser Raft-Proteine.
Die postnatale Neovaskularisierung ist eine wichtige Vorraussetzung um Gewebe vor kritischer Ischämie zu schützen. Eine der Grundlagen dieses Prozesses bilden die Angiogenese, bei der neue Kapillaren durch Proliferation und Migration von Endothelzellen aus bereits vorhandenen Blutgefäßen entstehen. Ein zweiter Eckpfeiler ist die Vaskulogenese, die unter anderem durch zirkulierende endotheliale Vorläuferzellen (EPC) vermittelt wird. Homeobox-Gene der Klasse 1 (Hox) sind Transkriptionsfaktoren, die während der Embryonalentwicklung an der Organogenese und der Entwicklung des kardiovaskulären Systems beteiligt sind. Verschiedene Studien weisen darauf hin, dass Homeobox-Proteine auch im adulten Organismus bei der transkriptionellen Regulation von Genen der Angio- und Vaskulogenese eine wichtige Rolle spielen. Die in dieser Arbeit vorliegenden Ergebnisse zeigen eine essentielle Rolle von HoxA9 für die postnatale Neovaskularisierung sowie für die funktionelle Integrität von Endothelzellen und endothelialen Progenitorzellen. HoxA9-defiziente Mäuse hatten einen signifikant verringerten Blutfluss nach einer Hinterlauflauf-Ischämie. Für die reduzierte Neovaskularisierung des ischämischen Gewebes, genügte der Verlust eines einzigen HoxA9-Wildtypallels. Außerdem zeigen HoxA9-defiziente Endothelzellen in vitro eine stark gehemmte Migration sowie eine verringerte Gefäßstrukturbildung. Zusätzlich war auch deren Interaktion mit EPC im Matrigel verschlechtert. Eine Bestätigung dieser Beobachtung zeigten Untersuchungen an endothelialen Vorläuferzellen, die ebenfalls einen Verlust angiogener Funktionen bei verminderter HoxA9-Expression aufwiesen. Neben der postnatalen Neovaskularisierung konnten erste Untersuchungen embryonaler Allantois zeigen, das HoxA9 vermutlich auch in der embryonalen Gefäßbildung beteiligt ist. Diese Theorie wird durch eine nicht-Mendelsche Verteilung der postnatalen Genotypen nach Kreuzung heterozygoter HoxA9-Mäuse unterstützt. Als molekulare Ursachen der Hemmung angiogener Funktionen bei Endothelzellen, konnte die Regulation verschiedener Gene nachgewiesen werden. So ist HoxA9 für die Expression der endothelialen Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS), des VEGF-Rezeptors 2 (VEGF-R2), der Adhäsionsmoleküle VE-Cadherin und Integrin v3 sowie des EphB4-Rezeptors von essentieller Bedeutung. Diese von HoxA9 regulierten Gene spielen für die Angio- und Vaskulogenese alle eine entscheidende Rolle. Der EphB4-Rezeptor, die eNOS und der VEGF-R2 werden durch eine direkte Bindung von HoxA9 an den jeweiligen Promotor auf transkriptioneller Ebene reguliert. Bei den Genen Integrin v3 und VE-Cadherin erfolgt die Regulation durch HoxA9 indirekt über andere Gene oder posttranskriptionell. Zusätzlich zum Nachweis der Kontrolle der Genexpression, konnte für den EphB4-Rezeptor nachgewiesen werden, dass dieser von großer Bedeutung für die HoxA9-regulierte Migration ist. Außerdem besitzt der EphB4-Promotor eine für die Regulation der EphB4-Expression durch HoxA9 wichtige Bindungsstelle. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass HoxA9 Schubspannungs-abhängig reguliert wird und dabei auch in die Regulation der Schubspannungs-induzierten Migration und die Schubspannungs-abhängige Expression der untersuchten Zielgene von HoxA9 eingreift. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass HoxA9 endotheliale Gene vielfältig reguliert, eine entscheidende Rolle bei der Modulation verschiedener endothelialer Funktionen spielt und essentiell für die postnatale Neovaskularisierung ist.
Hodgkin-Lymphom-Biopsien und abgeleitete Zelllinien sind charakterisiert durch die konstitutive Aktivität verschiedener Komponenten des JAK/STAT-Signalweges. Dennoch ist die Bedeutung dieser Signalvermittler für die Pathogenese des klassischen Hodgkin-Lymphoms nicht vollständig geklärt. Gegenstand dieser Arbeit war die Bedeutung der JAK/STAT-Signalkaskade, sowie insbesondere die zellulären Funktionen von STAT3 und STAT6 zu untersuchen. Zu diesem Zweck kamen zwei verschiedene synthetische Kinase-Inhibitoren (AG490, Cucurbitacin I) zum Einsatz. Beide Substanzen blockieren die Kaskade auf Ebene der Kinasen und sind als JAK2/STAT3-spezifische Inhibitoren beschrieben. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit beiden Substanzen das Wachstum der malignen Zellen hemmte. Gelretardierungsexperimente ergaben jedoch, dass beide Inhibitoren in allen HL-Zelllinien immer mehr als nur ein STAT-Molekül hemmten. Somit konnte keine Aussage über die Bedeutung einzelner STATs getroffen werden. Um die zellulären Funktionen von STAT3 und STAT6 zu untersuchen wurden daher spezifische siRNAs mittels lentiviraler Vektoren exprimiert. Die Rolle von STAT3 bei der Entstehung verschiedenster Krebsarten ist bereits gut charakterisiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass STAT3 auch in HL-Zellen ein wichtiger Regulator von Proliferation und Apoptose ist. Darüber hinaus konnte auch STAT6 als Vermittler proliferations-fördernder, anti-apoptotischer Signale identifiziert werden. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass eine alleinige Hemmung von STAT6 ausreicht um Apoptose in einigen HL-Zellen auszulösen. Diese Induktion von Apoptose wurde durch Caspasen vermittelt. Um den genauen Mechanismus aufzuklären und um STAT6-Zielgene zu identifizieren, die anti-apoptotisch wirken, wurde eine Microarray-Analyse durchgeführt. Eine weitere Möglichkeit die Aktivierung der JAK/STAT-Signalkaskade zu beeinflussen bieten die SOCS-Proteine. Diese sind direkte Zielgene der STATs und regulieren die Signalvermittlung in einer negativen Rückkopplung. In vielen unterschiedlichen Krebsarten ist diese Negativregulation ausgefallen oder fehlerhaft. Das kann zu einer konstitutiven Aktivierung des JAK/STAT-Signalweges beitragen. Die Bedeutung der SOCS-Proteine im klassischen Hodgkin-Lymphom ist noch unbekannt und wurde in dieser Arbeit untersucht. Es wurden unterschiedliche Mengen endogenes SOCS1 und SOCS3 in verschiedenen HL-Zelllinien und in HL-Biopsien detektiert. In Überexpessionsexperimenten mit SOCS1 und SOCS3 konnte gezeigt werden, dass sowohl SOCS1, als auch SOCS3 nur in Zellen, die wenig endogene SOCS besitzen, die Aktivität von STAT3 und STAT6 inhibieren konnten. Die Überexpression resultierte in einem Wachstumsarrest und einem erhöhten Anteil toter Zellen. In Zellen, die bereits viel SOCS besaßen, konnten weder STAT3 noch STAT6 inhibiert werden. In diesem Zusammenhang wurde ein Modell, das potentielle Möglichkeiten zum Umgehen einer Negativregulation durch die SOCS-Proteine darstellt, diskutiert. Darüber hinaus konnte in Gelretardierungsexperimenten gezeigt werden, dass SOCS3 zusätzlich zu STAT3 und STAT6 in Zellen, die wenig SOCS besaßen, auch NF?B-Aktivierung hemmte. Da NF?B bereits als wichtiger Überlebensfaktor für HL-Zellen beschrieben wurde, trägt dessen Inhibition wahrscheinlich zu einer Hemmung des Wachstums bei. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit STAT3 und STAT6 als potentielle Ziele für therapeutische Ansätze für das klassische Hodgkin-Lymphom identifiziert werden. Einen weiteren Angriffspunkt für zukünftige Strategien liefern die SOCS-Proteine, die eine signalweg-übergreifende Hemmung von Transkritionsfaktoren erlauben.
Lesion of the rat entorhinal cortex denervates the outer molecular layer of the fascia dentata followed by layer-specific axonal sprouting of uninjured fibers in the denervated zone. One of the candidate molecules regulating the laminar-specific sprouting response in the outer molecular layer is the transmembrane chondroitin sulfate proteoglycan NG2. NG2 is found in glial scars and has been suggested to impede axonal regeneration following injury of the spinal cord. The present study adressed the question whether NG2 could also regulate axonal growth in denervated areas of the brain. Therefore, (1) changes in NG2 mRNA and NG2 protein levels, (2) the cellular and the extracellular localisation of the molecule, (3) the identity of NG2 expressing cells, and (4) the generation of NG2-positive cells were studied in the rat fascia dentata before and following entorhinal deafferentation. Laser microdissection was employed to selectively harvest the denervated molecular layer and combined with quantitative reverse transcription-PCR to measure changes in NG2 mRNA amount (6h, 12h, 2d, 4d, 7d post lesion). The study revealed increases of NG2 mRNA at day 2 (2.5-fold) and day 4 (2-fold) post lesion. Immunocytochemistry was used to detect changes in NG2 protein distribution (1d, 4d, 7d, 10d, 14d, 30d, 6 months post lesion). NG2 staining was increased in the denervated outer molecular layer at 1 day post lesion, reached a maximum at 10 days post lesion, and returned to control levels within 6 month. Interestingly, the accumulation of NG2 protein was strongly restricted to the denervated outer molecular layer forming a border to the unaffected inner molecular layer. Using electron microscopy, NG2-immunoprecipitate was localized not only on glial surfaces and in the extracellular matrix but also in the vicinity of neuronal profiles indicating that NG2 is secreted following denervation. Double-labelings of NG2-immunopositive cells with markers for astrocytes, microglia/macrophages, and oligodendrocytes suggested that NG2-cells are a distinct glial subpopulation before and after entorhinal deafferentation. Bromodeoxyuridine-labeling revealed that some of the NG2-positive cells are postlesional generated. Taken together, the data revealed a layer-specific upregulation of NG2 in the denervated outer molecular layer of the fascia dentata that coincides with the sprouting response of uninjured fibers. This suggests that NG2 could regulate lesion-induced axonal growth in denervated areas of the brain.
Die Dissertation liefert einen Beitrag zur Identifizierung und Charakterisierung der an der Komplementresistenz von Borrelien beteiligten CRASP-Proteine aus Isolaten der Genospezies B. burgdorferi s.s. und B. afzelii. Im Rahmen der Arbeit gelang es mittels Identifizierung und immunologischer Charakterisierung die Zugehörigkeit der spezifisch Faktor H-bindenden BbCRASP-Proteine BbCRASP-3, BbCRASP-4 und BbCRASP-5 zur Erp-Proteinfamilie zu beweisen. Weiterhin konnten die Faktor H- und FHL-1-bindenden BbCRASP-Proteine BbCRASP-1 und BbCRASP-2 von B. burgdorferi s.s. identifiziert werden. Mit dem BbCRASP-2-Protein wurde ein bis dahin unbekanntes Faktor H- und FHL-1-bindendes CRASP-Protein aus den äußeren Membranen des B. burgdorferi s.s.-Isolates B31 isoliert und charakterisiert. BbCRASP-2 stellt innerhalb der CRASP-Proteinfamilie ein neues eigenständiges Lipoprotein dar und unterscheidet sich deutlich von den Sequenzen der anderen CRASP-Proteine. Es ist weder ein Mitglied der gbb54- oder der Erp-Proteinfamilie, noch gehört es zu einer anderen bekannten Proteinfamilie von B. burgdorferi s.s. In Ligandenaffinitätsblot-Analysen konnte mit Hilfe von rekombinantem FHL-1 sowie Deletionsmutanten von Faktor H und FHL-1 gezeigt werden, dass die Bindung von Faktor H und FHL-1 an das BbCRASP-2-Protein ausschließlich über die SCR 7-Domäne vermittelt wird. Die Analysen C terminaler Deletionsmutanten von BbCRASP-2 unterstrichen die Bedeutung der letzten 16 Aminosäuren des BbCRASP-2-Proteins für die Interaktion mit Faktor H und FHL-1.
An die Signalübertragung im ZNS werden in bestimmten Entwicklungsstadien sehr unterschiedliche Anforderungen gestellt. Im adulten Gehirn dient sie nicht nur der Nachrichtenübermittlung, sondern auch der aktivitätsbasierten Umgestaltung neuronaler Verbindungen bei Lernprozessen und der regenerativen Umgestaltung nach Verletzungen. Im sich entwickelnden Gehirn werden schon frühzeitig Nervenzellen elektrisch erregbar und spontan aktiv. Diese elektrische Aktivität und die dadurch verursachte Transmitterausschüttung spielen bei der selektiven Stabilisierung von Synapsen und damit bei der Ausgestaltung des neuronalen Netzwerks eine große Rolle. Im ZNS von Vertebraten beruht die Wirkung des Neurotransmitters und Neuromodulators Acetylcholin auf den nikotinischen und muskarinischen Acetylcholinrezeptoren. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChRen) koppeln, abhängig von den fünf identifizierten Rezeptorsubtypen (M1- M5), an unterschiedliche intrazelluläre Signalketten an. Dabei interagieren für gewöhnlich die M1, M3 und M5 Rezeptoren mit einem G-Protein des Typs Gq/11, während M2 und M4 ein G-Protein des Typs Gi/o aktivieren. Der Colliculus inferior (IC) ist eine wichtige Verschaltungsstation im auditorischen Mittelhirn von Säugetieren. Inhibitorische und exzitatorische Eingänge werden dort während der Entwicklung mit großer Präzision angelegt und konvergieren auf einzelne ICNeurone. Die physiologische Bedeutung von mAChRen im IC ist weitgehend unerforscht und die Subtypen die im juvenilen IC eine Rolle spielen wurden noch nicht charakterisiert. Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit mittels elektrophysiologischer Untersuchungen im IC der juvenilen Ratte (P5-P12) folgende Fragen zu klären: i) Gibt es im IC der jungen Ratte eine Modulation der GABAergen Transmission durch muskarinische Acetylcholinrezeptoren? ii) Welcher muskarinische Rezeptorsubtyp spielt dabei eine Rolle? iii) Welcher intrazelluläre Signalmechanismus ist der Aktivierung des muskarinischen Acetylcholinrezeptors nachgeschaltet? Unter Wirkung von Muskarin kam es bei 41,2% der untersuchten Neurone des Colliculus inferior zu einer Erhöhung der Frequenz der spontanen IPSCs. Die sIPSCs wurden durch Bicucullin blockiert, somit handelt es sich um GABAerge IPSCs. Die Wirkung von Muskarin nahm zu, wenn die Tiere älter als 9 Tage waren. Es wurde gezeigt, dass nAChRen keine Rolle spielen bei der Erhöhung der sIPSC-Frequenz, während eine selektive Blockade der M3-(M5-) mAChRen durch 4-DAMP die Muskarinwirkung blockierte. In der Regel sind die M3-Rezeptoren über folgende Signalkaskade aktiv: Phospholipase C, Kalzium-Calmodulin, NO-Synthase, Guanylatzyklase, die NO-Konzentration und cGMP. Alle Glieder dieser Kaskade wurden untersucht, sie hatten aber keinen Einfluss auf die Muskarinwirkung. Im Gegensatz dazu führte die Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels zu einer vergleichbaren Frequenzsteigerung der sIPSCs wie sie unter der Wirkung von Muskarin gemessen wurde. Weiterhin ließ sich die Erhöhung der sIPSC-Frequenz durch Muskarin vollständig aufheben, wenn die intrazelluläre Adenylatzyklase blockiert wurde. Es ist bekannt, dass der M3-(M5-) mAChR über verschiedenste Signalwege den intrazellulären cAMP-Spiegel verringern oder erhöhen kann und dass die Spezifizierung des Rezeptors vom Grad der Rezeptorexpression, dem Zelltyp und der Kombination der Effektormoleküle abhängig ist. Die Abweichung der juvenilen Kaskade vom im erwachsenen Tier üblichen Signalweg hat dabei den Vorteil, dass eine Aufgabentrennung zwischen Netzwerkbildung und Synapsenstabilisierung einerseits und Signalweiterleitung andererseits erfolgt. Beim juvenilen Tier steht die Netzwerkbildung im Vordergrund, beim erwachsenen Tier wird die Signalweiterleitung moduliert. Der sekundäre Botenstoff NO, der weit diffundieren kann, spielt beim juvenilen Signalweg keine Rolle und dies ermöglicht eine klare Trennung der aktivierten von den umgebenden Synapsen. Dadurch wird eine starke Selektion innerhalb der vorhandenen Synapsen ermöglicht und eine aktivitätsbasierte Netzwerkbildung vereinfacht. Die Etablierung funktioneller GABAerger Synapsen ist ausschlaggebend für die Entwicklung des neuronalen Netzwerks. Innerhalb der ersten postnatalen Wochen führt die Aktivierung von GABAA-Rezeptoren zur Depolarisierung der IC-Neurone und zu einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Acetylcholin potenziert also letztlich den GABA-aktivierten Einstrom von Ca2+ und führt damit zur Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration im postsynaptischen Neuron des IC. Diese modulatorische Wirkung von Acetylcholin könnten damit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Stabilisierung von inhibitorischen Synapsen im sich entwickelnden IC der Ratte spielen.
Die Hitzestressantwort stellt einen universellen Schutzmechanismus aller lebenden Organismen dar. Infolge einer Temperaturerhöhung werden Hitzestresstranskriptionsfaktoren (Hsf) aktiviert und bewirken eine gesteigerte Expression von Hitzestressproteinen (Hsp). Als molekulare Chaperone schützen diese die Zelle vor durch Hitze verursachten Schäden. In höheren Pflanzen ist dieses Phänomen sowohl auf der Ebene der Hsf als auch der Hsp besonders komplex. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Funktion von Komponenten des Chaperonsystems in der pflanzlichen Thermotoleranz. Zur Untersuchung der Thermotoleranz wurde ein transientes Expressionsystem mit Mesophyllprotoplasten aus steril angezogenen Tomatenpflanzen (Lycopersicon esculentum) zweier Linien (WT und CS) verwendet. CS-Pflanzen zeigen Cosuppression von HsfA1 und zeichnen sich durch eine Integration zweier direkt aufeinander folgender Transgenkassetten in invertierter Orientierung aus. Die fehlende Expression von HsfA1 in CS-Pflanzen ist die Folge eines Prozesses, der als RNA-interference (RNAi) bezeichnet wird. In unserem transienten Expressionssystem wurden Mesophyllprotoplasten mit einem Expressionsplasmid transformiert, das für Luciferase aus Photinus pyralis als thermosensitivem, leicht nachweisbarem Reporterprotein kodiert. Mit Hilfe dieses Testsystems konnten wir den Schutz der Luciferase gegen eine thermische Denaturierung bei 41°C (30 min) und die nachfolgende Renaturierung für 120 min bei 25°C in Abhängigkeit von endogenen und transient exprimierten Hsp und Hsf beobachten. Mit Hilfe der RNAi-Technologie und unter Verwendung von genspezifischen inverted repeat-Konstrukten konnten wir weiterhin die Bildung einzelner Komponenten des endogenen Chaperonsystems verhindern und damit ihre Funktion untersuchen. Es zeigte sich, dass in Protoplasten aus CS-Pflanzen praktisch alle hitzestressinduzierten Proteine fehlten und diese nicht in der Lage waren, Thermotoleranz auszuprägen, wie unter Verwendung des Reporterproteins Luciferase nachgewiesen werden konnte. Weiterhin fand keine Bildung cytoplasmatischer Multichaperonkomplexe, der sogenannten Hitzestressgranula (HSG), statt. Dieser Defekt in der Ausprägung von Thermotoleranz konnte durch Expression von HsfA2, HsfA3 und HsfA4b repariert werden. Die Überexpression dieser Hsf führte gleichermaßen zu (1) einer Expression von Chaperonen, (2) Thermoprotektion des Reporterenzyms Photinus pyralis-Luciferase und (3) Bildung von HSG-Komplexen. In weiteren Analysen lag unser Augenmerk insbesondere auf Vertretern der sHsp, sowie der Hsp70- und Hsp101-Chaperonfamilien. Hierbei erwies sich, dass vor allem Klasse CI-sHsp und Vertreter der Hsp70-Famile beim Schutz der Luciferase gegen Denaturierung während eines Hitzstresses eine Rolle spielen, während hauptsächlich Hsp101 und Vertreter der Hsp70-Familie in der darauf folgenden Erholungsphase von Bedeutung sind. Die Untersuchung der Interaktionen von drei Klassen cytoplasmatischer sHsp und ihrer intrazellulären Verteilung im Rahmen meiner Arbeit zeigte, dass jeder dieser Klassen eine unterschiedliche Funktion im Netzwerk cytoplasmatischer sHsp zukommt. Unter Verwendung nativer Gelelektrophorese und indirekter Immunfluoreszenz konnte nachgewiesen werden, dass sHsp der Klassen CI, CII und CIII in der Lage sind, auf der Ebene oligomerer Komplexe zu interagieren und ihre intrazelluläre Lokalisation wechselseitig zu beeinflussen. Proteine der Klasse CII zeigten eine starke Tendenz zur Bildung von Aggregaten, in die Klasse CIII-sHsp rekrutiert wurden. Im Unterschied dazu verfügten Klasse CI-Proteine über die Fähigkeit, diese Aggregate aufzulösen. Die detaillierte Untersuchung von fünf Isoformen der Klasse CI und zwei Isoformen der Klasse CII aus Lycopersicon esculentum ergab, dass diese oligomere Komplexe einer unterschiedlichen Anzahl von Untereinheiten bilden. Nach Coexpression waren Proteine beider Klassen in heterooligomeren Komplexe zu finden. Allerdings deuteten sich bei der Analyse der Fähigkeit einzelner Isoformen der Klasse CI, Heterooligomere mit Klasse CII-Proteinen zu bilden, Unterschiede an. sHsp kommt weiterhin eine Funktion in der Kontrolle der Aktivität von HsfA2 zu. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass sHsps der Klassen CI und CII völlig unterschiedliche Rollen in der Regulation der intrazellulären Verteilung von HsfA2 spielen. Nach Überexpression in Mesophyllprotoplasten bildete LpHsp17.4-CII, nicht aber das nahe verwandte LpHsp17.3-CII mit HsfA2 große, cytoplasmatische Aggregate. Hsp17-CI dagegen verhinderte die Coaggregation von Hsp17.4-CII mit HsfA2.
Here I analyse 23 populations of D. galeata, a large-lake cladoceran, distributed mainly across the Palaearctic. I detected high levels of clonal diversity and population differentiation using variation at six microsatellite loci across Europe. Most populations were characterised by deviations from H-W equilibrium and significant heterozygote deficiencies. Observed heterozygote deficiencies might be a consequence of simultaneous hatching of individuals produced during different times of the year or of the coexistence of ecologically and genetically differentiated subpopulations. A significant isolation by distance was only found over large geographic distances (> 700 km). This pattern is mainly due to the high genetic differentiation among neighbouring populations. My results suggest that historic populations of Daphnia were once interconnected by gene flow but current populations are now largely isolated. Thus local ecological conditions which determine the level of biparental sexual reproduction and local adaptation are the main factors mediating population structure of D. galeata. The population genetic structure and diversity in D. galeata was investigated at a European scale using six microsatellite loci and 12S rDNA sequence data to infer and compare historical and contemporary patterns of gene flow. D. galeata has the potential for long-distance dispersal via ephippial resting eggs by wind and other dispersing vectors (waterfowl), but shows in general strong population differentiation even among neighbouring populations. A total of 427 individuals were analysed for microsatellite and 85 individuals for mitochondrial (mtDNA) sequence data from 12 populations across Europe. I detected genetic differentiation among populations across Europe and locations within sampling regions for both genetic marker systems (average values: mtDNA FST = 0.574; microsatellite FST = 0.389), resulting in a lack of isolation by distance. Furthermore, several microsatellite alleles and one haplotype were shared across populations. Partitioning of molecular variance was inconsistant for both marker systems. Microsatellite variation was higher within than among populations, whereas mtDNA data yielded an inverse pattern. Relative high levels of nuclear DNA diversity were found across Europe. The amount of mitochondrial diversity was low in Spain, Hungary and Denmark. Gene flow analysis at a European scale did not reveal typical pattern of population recolonization in the light of postglacial colonization hypotheses. Populations, which recently experienced an expansion or population-bottleneck were observed both in middle and northern Europe. Since these populations revealed high genetic diversity in both marker systems, I suggest these areas to represent postglacial zones of secondary contact among divergent lineages of D. galeata. In order to reveal the relationship between population genetic structure of D. galeata and the relative contribution of environmental factors, I used a statistical framework based on canonical correspondence analysis. Although I detected no single ecological gradient mediating the genetic differentiation in either lake regions, it is noteworthy that the same ecological factors were significantly correlated with intra- and interspecific genetic variation of D. galeata. For example, I found a relationship between genetic variation of D. galeata and differentiation with higher and lower trophic levels (phytoplankton, submerged macrophytes and fish) and a relationship between clonal variation and species diversity within Cladocera. Variance partitioning had only a minor contribution of each environmental category (abiotic, biomass/density and diversity) to genetic diversity of D. galeata, while the largest proportion of variation was explained by shared components. My work illustrates the important role of ecological differentiation and adaptation in structuring genetic variation, and it highlights the need for approaches incorporating a landscape context for population divergence.
Mitochondial NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) the largest multiprotein enzyme of the respiratory chain, catalyses the transfer of two electrons from NADH to ubiquinone, coupled to the translocation of four protons across the membrane. In addition to the 14 strictly conserved central subunits it contains a variable number of accessory subunits. At present, the best characterized enzyme is complex I from bovine heart with a molecular mass of about 980 kDa and 32 accessory proteins. In this study, the subunit composition of mitochondrial complex I from the aerobic yeast Y. lipolytica has been analysed by a combination of proteomic and genomic approaches. The sequences of 37 complex I subunits were identified. The sum of their individual molecular masses (about 930 kDa) was consistent with the native molecular weight of approximately 900 kDa for Y. lipolytica complex I obtained by BN-PAGE. A genomic analysis with Y. lipolytica and other eukaryotic databases to search for homologues of complex I subunits revealed 31 conserved proteins among the examined species. A novel protein named “X” was found in purified Y. lipolytica complex I by MALDI-MS. This protein exhibits homology to the thiosulfate sulfurtransferase enzyme referred to as rhodanese. The finding of a rhodanese-like protein in isolated complex I of Y. lipolytica allows to assume a special regulatory mechanism of complex I activity through control of the status of its iron-sulfur clusters. The second part of this study was aimed at investigating the possible role of one of these extra subunits, 39 kDa (NUEM) subunit which is related to the SDRs-enzyme family. The members of this family function in different redox and isomerization reactions and contain a conserved NAD(P)H-binding site. It was proposed that the 39 kDa subunit may be involved in a biosynthetic pathway, but the role of this subunit in complex I is unknown. In contrast to the situation in N. crassa, deletion of the 39 kDa encoding gene in Y. lipolytica led to the absence of fully assembled complex I. This result might indicate a different pathway of complex I assembly in both organisms. Several site-directed mutations were generated in the nucleotide binding motif. These had either no effect on enzyme activity and NADPH binding, or prevented complex I assembly. Mutations of arginine-65 that is located at the end of the second b-strand and responsible for selective interaction with the 2’-phosphate group of NADPH retained complex I activity in mitochondrial membranes but the affinity for the cofactor was markedly decreased. Purification of complex I from mutants resulted in decrease or loss of ubiquinone reductase activity. It is very likely that replacement of R65 not only led to a decrease in affinity for NADPH but also caused instability of the enzyme due to steric changes in the 39 kDa subunit. These data indicate that NADPH bound to the 39 kDa subunit (NUEM) is not essential for complex I activity, but probably involved in complex I assembly in Y. lipolytica.
The thesis entitled „Investigations on the significance of nucleo-cytoplasmic transport for the biological function of cellular proteins" aimed to unreveal molecular mechanisms in order to improve our understanding of the impact of nucleo-cytoplasmic transport on cellular functions. Within the scope of this work, it could be shown that regulated nucleo-cytoplasmic transport of a subfamily of homeobox transcription factors controlled their intra- and intercellular transport, and thereby influencing also their transcriptional activity. This study describes a novel regulatory mechanism, which could in general play an important role for the ordered differentiation of complex organisms. Besides cis-active transport Signals, also post-translational modifications can influence the localization and biological activity of proteins in trans. In addition to the known impact of phosphorylation on the transport and activity of STAT1, experimental evidence was provided demonstrating that acetylation affected the interaction of STAT1 with NF-kB p65, and subsequently modulated the expression of apoptosis-inducing NF-kB target genes. The impact of nucleo-cytoplasmic transport on the regulation of apoptosis was underlined by showing that the evolutionary conservation of a NES within the anti-apoptotic protein survivin plays an essential role for its dual function in the inhibition of apoptosis and ordered cell division. Since survivin is considered a bona fide cancer therapy target, these results strongly encourage future work to identify molecular decoys that specifically inhibit the nuclear export of survivin as novel therapeutics. In order to further dissect the regulation of nuclear transport and to efficiently identify transport inhibitors, cell-based assays are urgently required. Therefore, the cellular assay Systems developed in this work may not only serve to identify synthetic nuclear export and Import inhibitors but may also be applied in systematic RNAi-screening approaches to identify novel components of the transport machinery. In addition, the translocation based protease- and protein-interaction biosensors can be applied in various biological Systems, in particular to identify protein-protein interaction inhibitors of cancer relevant proteins. In summary, this work does not only underline the general significance of nucleo-cytoplasmic transport for cell biology, but also demonstrates its potential for the development of novel therapies against diseases like cancer and viral infections.
Calcium-activated potassium channels are fundamental regulators of neuron excitability. SK channels are activated by an intracellular increase of Ca++ (such as occurs during an action potential). They have a small single channel conductance (less than 20pS) and show no voltage dependence of activation. To date, there are only a few examples of high-resolution structures of eukaryotic membrane proteins. All of them were purified from natural sources. Since no abundant natural sources of eukaryotic K+ channels are available we overexpressed rSK2 in order to produce the quantities necessary for structural analysis. Unfortunately the Pichia pastoris expression system did not yield sufficient amount of pure protein, mainly because most of the protein was retained by in the ER and was only partially soluble. Subsequently, two constructs were expressed: SK2-FCYENE (containing a specific sequence that promotes surface expression), and SK2-q-CaM a concatamer of SK2 and calmodulin. Although these proved an improvement in terms of solubilisation, little improvement was found in terms of amounts of purified material obtained. For this reason we tested the Semliki Forest virus expression system, since the protein is expressed in a mammalian system where we hoped that it would be trafficked in the same way as in vivo. Using this system it was possible to express rSK2 and solubilise it with several detergents and to achieve much better purification. However, the levels were still not sufficient for high-resolution structural studies, although sufficient for single particle electron microscopy analysis.
Holzkohlen aus archäologischen Grabungen im Sahel von Burkina Faso belegen die regionale Geschichte der Gehölzvegetation über die letzten 2000 Jahre. Der Bodenbau, den die sesshaft lebende Bevölkerung seit Beginn unserer Zeitrechnung intensiv betreibt, veränderte die Zusammensetzung der Gehölzvegetation vor allem auf den Dünen der Region. Im Vergleich mit der heutigen Vegetation lassen sich zudem klimatische Veränderungen nachweisen. Untersucht wurden über 9000 Fragmente aus sieben verschiedenen archäologischen Grabungen. Sechs Inventare stammen aus Siedlungshügeln. Bei einem Fundplatz handelt es sich um einen Hausgrundriss. Insgesamt wurden 37 Holzkohletypen erkannt und dokumentiert. Die untersuchten Inventare der Siedlungshügel zeigen, dass vor allem die Gehölzvegetation der Dünen und der Galeriewälder zur Brennholzentnahme genutzt wurde. Je nach Lage der Siedlung und dem Schwerpunkt der Wirtschaftsweise können verschiedene Taxa mit höheren Anteilen vertreten sein, möglicherweise zusätzlich verstärkt durch die anthropogene Auswahl von verfügbarem Brennholz. Im Vergleich der Holzkohleinventare lassen sich für die Eisenzeit regionale Entwicklungen erkennen. Die natürlichen Gehölzbestände auf den Dünen, unter anderem aus verschiedenen Akazienarten, wurden, zumindest in der Umgebung der Siedlungen, verdrängt. Stattdessen nahmen aufgrund der selektiven Förderung durch den Menschen die Anteile der Gehölze der Kulturbaumparks, Vitellaria paradoxa und Faidherbia albida zu. Die Landwechselwirtschaft förderte zudem Brachearten insbesondere aus der Familie der Combretaceae. In der späten Eisenzeit nahm Guiera senegalensis zu, die von starker Beweidung der Brachen profitiert. Der Unterwuchs der Galeriewälder an den mares und Wasserläufen wurde mit zunehmender Besiedlungsdauer in der Umgebung der einzelnen Fundplätze aufgelichtet, die Anteile von Combretum micranthum gehen in den Inventaren der einzelnen Siedlungsplätzen jeweils zurück. Klima und Vegetation waren während der Eisenzeit sudano-sahelisch. Auf feuchteres Klima verweisen Vitellaria paradoxa und Detarium microcarpum, die deutlich höhere Niederschläge benötigen, als sie die Region heute erhält. Der hohe Anteil von Taxa, die heute weiter südlich verbreitet sind, belegt zudem den sudanischen Aspekt der Gehölzvegetation. Der Vergleich der anthrakologischen mit den palynologischen und karpologischen Ergebnissen zeigt, dass die Gehölzvegetation sich unter zunehmend arideren Bedingungen in den letzen 2000 Jahren anthropozoogen stark verändert hat. Das Klima scheint aber während der Eisenzeit von 0-1500 AD vergleichsweise stabil gewesen zu sein. Erst danach haben die Niederschläge sich soweit verringert, dass in den letzten 500 Jahren einige sudanische Taxa aus der Region verschwanden, die noch während der Eisenzeit zur regionalen Flora gehört hatten, zum Beispiel Vitellaria paradoxa, Detarium microcarpum und Lannea sp. Der Vergleich der eisenzeitlichen Holzkohleflora mit der rezenten Dynamik der Vegetation und mit der Verbreitung einiger Arten um die Mitte des 20. Jahrhunderts zeigt, dass einige Taxa, wie Terminalia sp. möglicherweise erst in den letzten fünfzig Jahren aus der Region verschwunden sind.
Die Medusen der metagenetischen Cnidarier (Nesseltiere) werden je nach Kultur- und Sprachraum z. B. mit einer weiblichen Gestalt mit schlangenartigen Haaren (Medusa), mit stark brennenden Quaddeln auf der Haut oder mit Stränden verklebenden Gallertmassen in Verbindung gebracht. Diese Assoziationen fußen hauptsächlich auf Merkmalen der Scheibenquallen (Scyphozoa), deren bisexuelle Medusen in Größe, Tentakellängen, Nematocytenbesatz und Mesogloeagehalt gegenüber der relativ unauffälligen ungeschlechtlichen Polypengeneration beeindrucken. Häufig ist die Medusengeneration der Scheibenquallen namensgebend. Die Medusen der Ohrenqualle Aurelia aurita (Fahnenquallen, Semaeostomeae) sind an den durchscheinenden, ohrenförmig um den Gastralraum angeordneten Gonaden erkennbar. In gemäßigten Klimazonen ist die bisexuelle Vermehrung - und das anschließende oft massenhafte Absterben in Küstennähe - auf den Sommer beschränkt (Lucas 1996), so daß die Medusen der Ohrenqualle häufige spätsommerliche Gäste an Stränden z. B. der Nord- und Ostsee (mit für den Menschen harmloser Nesselwirkung) sind. Vertreter der von Linné (1758) und Lamarck (1816) typologisierten Aurelia aurita sind weltweit verbreitet und bezüglich der Morphologie, Physiologie, Ethologie und Ökologie gut untersucht (z. B. Fautin & Lowenstein 1992; Costello & Colin 1994; Hammer et al. 1994; Lucas 1994). Unter ökologischen Gesichtspunkten ist das breite Spektrum der Ohrenqualle bezüglich abiotischer Umweltfaktoren hervorzuheben. Die häufig massenhaften Medusenaggregationen und der daraus resultierende Predationsdruck gegenüber dem Mikrozooplankton (Copepoden, Invertebratenund Fischlarven) weist der Ohrenqualle eine wichtige - und gelegentlich dominierende - Stellung in marinen Plankton-Lebensgemeinschaften zu (Janas & Witek 1993; Schneider & Behrends 1994; Sullivan et al. 1994; Tsikhon-Lukanina et al. 1996). Die breite Anpassungsfähigkeit und hohe Vermehrungsrate wird anekdotenhaft durch eine kürzlich erfolgte Meldung bekräftigt, nach der offensichtlich Aurelia-Schwärme die Kühlwasserleitungen eines Kraftwerks in Australien verstopften und lahmlegten (Cnidaria-List-Server). Das ubiquitäre Vorkommen läßt sich auf eine große ökologische Toleranz gegenüber Klima und Salzgehalt zurückführen, so daß die Ohrenqualle als Bewohner aller Meere von 40° südlicher bis 70° nördlicher Breite und Habitaten mit Salinitäten von 6-41‰ gilt (Kramp 1961). Dabei werden geographische Populationen, Unterarten und Arten der Gattung Aurelia anhand morphologischer Medusenmerkmale sowie auf Basis von Allozymunterschieden in unterschiedlicher Konsequenz teilweise in eine Art, Aurelia aurita zusammengefaßt, oder in mehrere distinkte Spezies voneinander abgegrenzt (Mayer 1910; Kramp 1961; Russell 1970; Kozloff 1987; Greenberg et al. 1996). Der nicht konsistente taxonomische Status der Ohrenqualle beruht entweder auf phylogenetisch uninformativen diagnostischen Merkmalen oder spiegelt Differenzierungen wider, die mit Artbildungsprozessen erklärt werden können. In der vorliegenden Arbeit sollen die phylogenetischen Beziehungen zwischen Aurelia-Populationen auf einer weltweiten geographischen Skala unter organismischen und molekularen Aspekten untersucht werden. Die möglichen Speziationsprozesse orientieren sich an den von Avise (2000) klassifizierten beiden Kategorien, nach denen die gängigen Spezieskonzepte auf Basis phylogenetischer und biologischer Kriterien, oder analog von Ridley (1996) nach evolutionären und zeitlich unabhängigen Kriterien eingeteilt werden. Die DNA-Sequenzinformationen eines mitochondrialen Gens (16S rDNA) sowie eines auf dem Kerngenom liegenden ribosomalen Locus (ITS-1/5.8S rDNA) sollen verwendet werden, um die genealogischen Beziehungen verschiedener Aurelia- Populationen sowohl phylogeographisch (Avise 1994) als auch bezüglich der phylogenetischen Artkonzepte zu untersuchen (Eldredge & Cracraft 1980; Wiley 1981; Cracraft 1989; Übersicht in Hull 1997). Mittels morphologischer Merkmale, Lebenszyklusdaten und den molekulargenetischen Daten soll gleichzeitig geprüft werden, ob sich die von Avise (2000) genannte Kategorie der biologisch definierten Spezieskonzepte in phänetisch (Sneath & Sokal 1973; Whittemore 1993), ökologisch (van Valen 1976; Schluter 1996) oder reproduktiv (Mayr 1963) getrennte Einheiten bei der Ohrenqualle widerspiegeln. Der Beitrag verschiedener Diversifizierungsfaktoren wie geographische Verbreitung, Selektion und genetische Drift wird in diesem Zusammenhang unter besonderer Berücksichtigung ökologischer Aspekte in Kapitel 2 dargestellt. Nicht zuletzt auch aufgrund ihrer besonderen ökologischen Plastizität empfiehlt sich die Ohrenqualle zur Nutzung als Biomonitor zur Untersuchung von Umweltbeeinträchtigungen auf Individuumebene. Eine in diesem Zusammenhang nützliche Besonderheit im Lebenszyklus von Aurelia betrifft den Übergang von der sich ungeschlechtlich vermehrenden Polypengeneration in die bisexuelle Medusengeneration, bei dem an der Oralseite des Polypen Medusenlarven (Ephyren) in Form einer polydisken Strobilation abgeschieden werden. Die Strobilation wird extrinsisch durch natürliche Faktoren ausgelöst und kann bei den Polypen der Ohrenqualle künstlich durch Temperaturabsenkung oder Erhöhung der Iod-Ionenkonzentration induziert werden (Spangenberg 1967). Dieses experimentell beeinflußbare Lebenszyklusstadium wurde im Rahmen von ökotoxikologischen Studien verwendet, um den Einfluß von Chemikalien auf die verzögerte Strobilation nach künstlicher Auslösung oder die Störung des Strobilationsverlaufs zu testen (Spangenberg 1984; Thiel & Jarms 1986). Black & Bloom (1984) untersuchten die Beziehung zwischen der Strobilationsinduktion und der Produktion von Hitzeschockproteinen (HSP) nach Temperaturerhöhung und konnten die Induzierbarkeit von Hitzeschockproteinen als Reaktion auf Temperaturstreß immunologisch nachweisen. Diese Studien zeigen, daß die Ohrenqualle ein hohes Reaktionspotential gegenüber variablen Umweltbedingungen besitzt. Die Charakterisierung dieses Reaktionspotentials soll in der vorliegenden Arbeit mittels der Analyse organismischer Reaktionen gegenüber anthropogen verursachten Streßfaktoren durchgeführt werden. Im Rahmen von experimentellen Schadstoff- expositionen sollen an Aurelia-Polypen genetische Reaktionen auf der Ebene der mRNATranskription untersucht werden. Der Schwerpunkt liegt auf der Etablierung von Biomarkern (van Gestel & van Brummelen 1996) mittels molekulargenetischer Methoden, wobei die Durchführbarkeit und Effektivität verschiedener Methodenansätze verglichen werden sollen. Die identifizierten Biomarker sollen im Hinblick auf die Analyse der Dosis-Wirkungsbeziehungen zwischen Schadstoffkonzentrationen und dem Ausmaß der genetischen Reaktion mittels quantitativer PCR-Verfahren näher charakterisiert werden. Ein anschließender Test der im Labor charakterisierten Biomarker auf die Anwendbarkeit im Freiland soll entsprechende Hinweise für die Sensitivität und Durchführbarkeit des in Kapitel 3 ausgeführten Biomarker-Assays liefern. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Verknüpfung verschiedener biologischer Organisationsebenen im Kontext ökologischer und ökotoxikologischer Forschung (Clements 2000). Erkenntnisse zum Wirken von Umwelteinflüssen auf molekularer Ebene bieten sich als Basis einer Bewertung individueller Reaktionen für Veränderungen auf Populationsebene an. Dieser Zusammenhang wird in Kapitel 4 anhand der Relevanz von Biomarkern für Aussagen auf Populationsund Speziesebene besprochen.
Durch Längenmessungen an Exuvien wurden die Größenverhältnisse von Beinlängen, Drehachsenlängen der Beingelenke und der Fläche des Carapax bei C. salei ermittelt. Für die hydraulisch gestreckten Femoro- Patellar- und Tibio-Metatarsalgelenke wurden die Volumen-Winkel-Kennlinien bestimmt. Das Sprungverhalten wurde durch Hochgeschwindigkeits-Videoaufnahmen (Bildfrequenz 500 Hz) mit drei Kameras dokumentiert. Aus den volumetrischen, kinematischen und morphometrischen Daten wurden die Volumenverschiebungen berechnet, die bei Sprungbewegungen auftreten. Aus der prosomalen Volumenverschiebung konnte der korrespondierende Carapaxhub berechnet werden. Mit einer Miniatur- Kraftmeßplattform und einem mit Schrittmotoren getriebenen "x-y-z-Tisch" wurden Steifigkeiten des Prosomas von Perania nasuta Schwendinger, 1989 und ausgewählten anderen Taxa bestimmt. Bei Cupiennius salei gibt es zwei unterschiedliche Sprungtypen: Unvorbereitete Sprünge als Reaktion auf sehr plötzliche Störungen zeichnen sich durch eine große Vielfalt der Bewegungsmuster aus. Vorbereitete Sprünge zeigen charakteristische Beinstellungen und Kontaktphasenmuster: Zunächst erfolgt eine etwa 20 ms dauernde Ausholbewegung, anschließend beginnt die 22 - 42 ms dauernde Beschleunigungsphase. Die Körperlängsachse vollzieht während der Beschleunigungsphase eine Vorwärtsrotation um etwa 50°, die nach dem Verlust des Bodenkontaktes der Beine gestoppt und umgekehrt wird. Dies erfolgt wohl durch ein kontrolliertes Bremsen des Ausstoßes des Sicherheitsfadens. Bei vorbereiteten Sprüngen konnten Sprungweiten bis zu 0.43 m beobachtet werden, die maximalen vertikalen Geschwindigkeiten betrugen 0.07 - 0.82 ms-1, maximale horizontale Geschwindigkeiten lagen bei 0.65 - 1.25 ms-1. Bei vorbereiteten Sprüngen wurden vertikale Beschleunigungen von 0.74 – 33.70 ms-2 und horizontale Beschleunigungen von 20.5 – 68.4 ms-2 erreicht. Die Kontaktphasen der Beine enden in einer charakteristischen Reihenfolge: Die Vorderbeine haben meist keinen Bodenkontakt, die dritten Beine heben nach durchschnittlich 37 % und die vierten Beine nach durchschnittlich 69 % der Dauer der Beschleunigungsphase ab. Zuletzt verlieren die zweiten Beine den Bodenkontakt. Zu Beginn der Beschleunigungsphasen richten sich innerhalb von durchschnittlich 4.6 ms Stacheln auf der Oberfläche der Beine auf. Die Stachelaufrichtung erfolgt bei Drucken von etwa 35 bis etwa 65 kPa. Dies zeigt einen Druckanstieg in den Beinen auf Werte von ³ 65 kPa während der Beschleunigungsphase an. Der Hauptanteil der Volumenverschiebungen in den Beinen wird durch Bewegungen der Femoro-Patellargelenke verursacht. Die Bewegungen der Tibio-Metatarsalgelenke bewirken nur geringe Volumenverschiebungen. Aufgrund der anatomischen Struktur der Trochantero- Femoralgelenke sind die bei Bewegung dieser Gelenke verschobenen Volumina vernachlässigbar klein. Die Abschätzung der zur Beinstreckung bei Sprüngen erforderlichen Carapaxverschiebungen ergab sehr geringe Werte, es sind nur Verschiebungen um wenige 1/100 bis 1/10 mm erforderlich. Für die vollständige Streckung aller Beine muß der Carapax nur um 10% der aufgrund der anatomischen Gegebenheiten maximal möglichen Strecke verschoben werden. Bei den Untersuchungen an Perania nasuta wurden prosomale Steifigkeiten von mehr als 3500 Nm-1 für Weibchen und mehr als 6500 Nm-1 für Männchen ermittelt. Das Prosoma von Perania nasuta ist sehr viel rigider als bei anderen Spinnen (Pholcus: 131 Nm-1, Zelotes: 79 Nm-1, Pardosa: 72 Nm-1, Dysdera: 1900 Nm-1). Die Carapaxverschiebung, die den zur vollständigen Beinstreckung erforderlichen Volumentransport bewirkte, würde bei Perania eine Verformungsarbeit von bis zu 27.56 myJ erfordern, bei den anderen Spinnen nur maximal 1.67 myJ (Dysdera). Das Sprungverhalten von Cupiennius salei läßt sich keinem der bislang beschriebenen Sprungtypen zuordnen. Hinsichtlich der Sprungweite und Geschwindigkeiten sind die Sprungleistungen von Cupiennius mit denjenigen von Salticiden vergleichbar. Die geringen Carapaxverschiebungen beim Sprung lassen sich im Sinne einer Optimierung der Arbeit extrinsischer coxaler Muskeln interpretieren. Eine Minimierung von Carapaxverschiebungen sollte die Koordinierbarkeit der Bewegungen der Coxae erhöhen, weil ein stärker formkonstanter Bezugsrahmen gegeben ist. Dementsprechend lassen sich Bein- und Carapaxdimensionen bei verschiedenen Spinnentaxa im Hinblick auf die jeweiligen Lokomotionsstrategien interpretieren. Die Untersuchungen an Perania nasuta bestätigen die von Kropf (in Vorb.) aufgestellte Hypothese einer starken Versteifung des Prosoma. Die Druckpumpe scheint hier im Opisthosoma lokalisiert zu sein. Hinsichtlich der möglichen Vorteile einer solchen Entwicklung lassen sich einerseits die besseren Bedingungen der Arbeit extrinsischer coxaler Muskeln im vollständig steifen "Gestell" des Prosoma nennen, andererseits könnte aufgrund entsprechender Lokomotionsmodi bei Perania keine Notwendigkeit zur schnellen Verschiebung großer Haemolymphvolumina aus dem Prosoma bestehen, so daß eine leistungsfähige prosomale Druckpumpe wegfallen konnte.
Bei Nicht-Säugern, speziell beim Vogel, kommt es nach einem durch Schall oder ototoxische Substanzen verursachten Innenohrtrauma, zu einer spontanen Regeneration der Haarzellen und weitreichender funktioneller Erholung des Hörvermögens. In bisherigen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß beim Vogel die funktionelle Erholung des Hörvermögens nach Innenohrtrauma, trotz spontaner Regeneration der Haarzellen, nicht vollständig ist. Ziel dieser Studie war es herauszufinden, ob die nach Haarzellschädigung und Regeneration beobachtete unvollständige Restitution des Hörvermögens nach alleiniger Nervenfaserschädigung ausbleibt. In einem ersten Schritt wurde mit immunhistochemischen Methoden untersucht, ob AMPA-Rezeptoruntereinheiten im Innenohr der Taube exprimiert werden. Durch die Verwendung von polyklonalen Antikörpern gegen GluR1, GluR2, GluR3 und GluR4 konnte gezeigt werden, daß diese AMPA-Rezeptoruntereinheiten im Innenohr des Vogels exprimiert werden. Eine punktförmige immunreaktive Färbung konnte sowohl auf den Ganglienzellen als auch unterhalb der Haarzellen, in der Region der Synapsen, für GluR2/3 und GluR4, nicht aber für GluR1 festgestellt werden. Auf den Haarzellen selbst konnte eine immunreaktive Färbung für GuR4 nachgewiesen werden. Die Immunoblotanalyse zeigte für die Antikörper gegen GluR1, GluR2/3 und GluR4 Banden bei dem Molekulargewicht der Proteine von 100 kDa. In einem zweiten Schritt wurden die Auswirkungen von AMPA auf die afferenten Hörnervenfaserendigungen morphologisch und physiologisch untersucht. Es zeigte sich, daß die afferenten Hörnervenfaserendigungen durch Applikation von AMPA in den Recessus scalae tympani (30µl/15 min.) geschädigt wurden. Der Verlauf der CAP (Compound action potential)-Hörschwellenkurven wurde sowohl über einen Zeitraum von 8 Stunden, als auch über einen Zeitraum von mehreren Monaten ermittelt. In ebenfalls durchgeführten Kontrollversuchen, bei denen künstliche Perilymphe ohne AMPA infundiert wurde, traten keine Hörverluste auf. Somit konnte eine Schädigung des Innenohres bzw. Hörverluste durch den operativen Eingriff oder durch die Infusion ausgeschlossen werden. Die beobachteten Hörverluste sind also spezifisch auf die Wirkung von AMPA zurückzuführen. Bei der Applikation von 1 mM AMPA-Lösung konnte eine Erhöhung der Hörschwellen um bis zu 80 dB im hochfrequenten Bereich und bis zu 30 - 40 dB im tieffrequenten Bereich über den Zeitraum von mehreren Stunden beobachtet werden. Am dritten Tag nach der AMPA-Applikation zeigten alle untersuchten Tiere eine Verbesserung der Hörschwellen um 20 - 40 dB. Weitere Messungen über den Zeitraum von zwei bis drei Monate zeigten, daß bei einigen Tieren innerhalb von 7 - 21 Tagen die Hörschwellenkurven die Ausgangswerte des unbehandelten Ohres erreichten, daß aber bei der Mehrheit der Tiere eine Anhebung der Hörschwellen von ca. 20 - 30 dB im hochfrequenten Bereich bestehen blieb. Die mittlere bleibende Schwellenanhebung, gemittelt für alle Frequenzen, betrug 8 dB + 5 dB. Bei den Tieren, bei denen ein hochfrequenter Verlust bestehen blieb, erreichten auch die ermittelten CAP-Amplituden bei den hohen Frequenzen ihre Ausgangswerte nicht mehr. Zusätzlich zu den CAP-Schwellenkurven wurden 13 - 15 Wochen nach AMPA-Instillation die Antworteigenschaften einzelner Hörnervenfasern erhoben. Fasern, deren charakteristische Frequenz (CF) über 0,3 kHz lag, zeigten signifikant erhöhte CF-Schwellen. Für Fasern mit CF-Werten über 0,4 kHz wurden verminderte Q10dB-Werte gefunden, während die Spontanentladungsrate für Fasern mit CF-Werten über 0,18 kHz erhöht war. Die maximale Entladungsrate war bei allen Fasern, für die dieser Wert ermittelt wurde (n = 20), ebenfalls erhöht. Neurone, deren CF über einem Wert von 1,5 kHz lag, konnten, methodisch bedingt, nicht untersucht werden. Diese beobachteten funktionellen Veränderungen in der Aktivität und Sensitivität der auditorischen Neurone weisen darauf hin, daß es bei der Wiederherstellung der Verbindung zwischen Haarzelle und neuraler Synapse zu dauerhaften Schäden kommt. Mittels elektronenmikroskopischer Darstellung konnten bei den Tieren, die direkt nach der Infusion (nach 10 min.) der AMPA-Lösung dekapitiert wurden, große vakuolisierte afferente Terminalien unterhalb der Haarzellen gefunden werden. Die efferenten Nervenendigungen waren nicht beschädigt. Während im apikalen Bereich der Papilla basilaris sehr viele Vakuolen bzw. zerstörte afferente Nervenfaserendigungen zu sehen waren, konnten deutlich weniger Vakuolen im medialen Teil und nur sehr wenige Vakuolen im basalen Teil gefunden werden. Dieser Befund korreliert mit der Verteilung der afferenten Nervenfasern entlang der Papilla basilaris. Bei Tieren, die zwei Wochen nach der AMPA-Applikation dekapitiert wurden, konnten keine morphologischen Veränderungen mehr gefunden werden. Die untersuchten Papillen waren von den Kontrollohren nicht mehr zu unterscheiden. Dies zeigt, daß auf struktureller Ebene scheinbar eine vollständige Rekonstitution der Verbindung zwischen Haarzelle und Synapse stattfindet. Dieser Befund steht im Widerspruch zu den elektrophysiologisch erhobenen Daten. Festzuhalten bleibt, daß auch bei ausschließlicher Schädigung der afferenten Nervenendigungen und trotz deren Neubildung ein residualer Hörverlust bestehen bleibt. Als Ursache für die mangelhafte funktionelle Erholung des Hörvermögens könnten durch die längere Abwesenheit der Nervenfaserendigungen hervorgerufene Veränderungen der Eigenschaften der Haarzellen oder eine veränderte Expression und Funktion der Glutamatrezeptoren in Frage kommen.
Die Grundlage dieser Arbeit bilden Befunde über den Kupfer-Metabolismus des Ascomyceten Podospora anserina. In der Kupfermangel-Mutante grisea ist der Transkriptionsfaktor GRISEA inaktiv, welcher die Aktivität der hochaffinen Kupfer(I)-Permease PaCTR3 kontrolliert. Der Kupfer-Mangel aller Zellkompartimente führt zu pleiotropen Effekten und zu einer moderaten Verlängerung der mittleren Lebensspanne (60%). Um Effekte des Kupfermangels, die positiven bzw. negativen Einfluß auf die Lebensspanne zeigen, voneinander zu trennen, erschien es vielversprechend, den Kupfermangel auf ein Kompartiment der Zelle zu beschränken. In Hefe komplexiert COX17 Kupfer und gibt es im mitochondrialen Intermembranraum an SCO1 und COX11 (Assemblierungsfaktoren der Cytochrom-c-Oxidase) weiter. Zur Aufschlüsselung Kupfer-abhängiger Stoffwechsel-Wege wurde in dieser Arbeit eine PaCox17-Nullmutante konstruiert und charakterisiert. Die PaCox17::ble-Deletionsmutante ist durch AOX-Respiration, hohe Aktivität der Cu/Zn-SOD und ein stabilisiertes Chondriom charakterisiert. Eine vergleichende Analyse von Mutante und Wild-Stamm führte zu folgenden Ergebnissen: 1. Die Disruption des PaCOX17-Weges verhindert die Assemblierung der COX beinahe völlig. COX-Respiration kann nur in sehr geringem Umfang nachgewiesen werden. 2. Der Ausfall der COX induziert die alternative Oxidase und führt zu AOX-Respiration. 3. Die Atmungsrate der Mutante PaCOX17::ble ist, aufgrund der AOX-Respiration, gegenüber dem Wild-Stamm annähernd verdreifacht. 4. Weiterhin zeigen PaCox17::ble-Stämme ein stabilisiertes mitochondriales Genom, normalerweise wird weder plDNA amplifiziert noch wird beta-senDNA gebildet. 5. Der Kupfer-Spiegel des Zytoplasmas ist gegenüber Wild-Stämmen stark erhöht. 6. PaCox17::ble-Stämme sind durch konstant starke Expression der Cu/Zn-SOD charakterisiert. Die Mn-SOD spielt eine untergeordnete Rolle. 7. Die beschriebenen Effekte führen zu einer enormen Verlängerung der mittleren Lebensspanne (1250% des Wild-Stammes). Neben der Isolation und Charakterisierung der Mutante PaCox17::ble wurde PaSco1 isoliert und initial charakterisiert. PaSco1 liegt in P. anserina wahrscheinlich in einer Kopie vor. Es kodiert das Kupferbindeprotein PaSCO1, welches Kupfer vermutlich von PaCOX17 übernimmt und an die Untereinheit 2 der COX weitergibt. In dieser Arbeit wurden Teilaspekte des Kupfermetabolismus von P. anserina untersucht. Von besonderem Interesse waren Zusammenhänge zwischen Kupfer-Metabolismus und mitochondrialen Funktionen. Einen weiteren Schwerpunkt bildeten entwicklungsbiologische Prozesse, der Alterungsprozess war von übergeordneter Bedeutung. Es konnte gezeigt werden, daß Störungen der Kupfer-Homöostase die Respiration, den zellulären oxidativen Stress, die Stabilität des Chondrioms und diverse Entwicklungsprozesse, wie beispielsweise Fortpflanzung und Alterung des Hyphenpilzes beeinflussen.
Das Gerät: Es wurde eine neue Methodik entwickelt zum Messen und Speichern der Flugwege von Brieftauben, die viele Nachteile vorher verwendeter Flugwegeaufzeichnungssysteme vermeidet. Diese Nachteile sind hauptsächlich die begrenzten Reichweite, der hohe Arbeitsaufwand beim Messen, die geringe zeitliche und räumliche Auflösung und die Unmöglichkeit viele vollständige Flugwege zu erhalten. Die gängigen Navigationssysteme wurden auf ihre Eignung zum Messen von Flugwegen bei Brieftauben geprüft. Die Wahl fiel auf das Satellitennavigationssystem GPS, Global Positioning System wegen seiner weltweiten Verfügbarkeit, der unter freiem Himmel unbegrenzten Reichweite, der Meßrate von 1 Position / Sekunde und der räumlichen Genauigkeit von 10-30 m in der horizontalen Position. Die Hauptaufgabe bei der Entwicklung bestand in der Miniaturisierung von GPS, damit die Tauben mit dem Gerät fliegen konnten. Es gelang, ein kleines, funktionsfähiges Gerät von 8,5*4*1.5 cm Größe mit einem Gewicht von 33g zu bauen, das aus einer Hybrid-GPS-Empfängerplatine mit Positionsspeicherung, einer Patchantenne, einer Stromversorgung, einem DC-DC-Konverter und einer Hülle besteht. Die Betriebszeit beträgt 3 - 3,5 Stunden, begrenzt durch die Batteriekapazität. Es können bis zu 90.000 Positionen, jede mit sekundengenauer Zeitangabe und Geschwindigkeit, gespeichert werden. Bei Stromausfall bleiben die Daten erhalten. Das Gerät hat ein Restmagnetfeld von 1500 nT. Nach Flug und Wiederfang der Tiere werden die Daten vom Flugschreiber auf einen Rechner übertragen. Das Tragegeschirr einer anderen Arbeitsgruppe wurde für Tauben abgewandelt, weiterentwickelt und getestet. Die theoretische Genauigkeit der GPS-Positionsbestimmungen konnte in eigenen Tests bei Autofahrten und mit Tauben bestätigt werden. Auswertung: Zur Beschreibung der Flugwege wird ein Satz von Auswerteparametern theoretisch beschrieben. Zu den Parametern werden Berechnungsverfahren angegeben. Es wurde eine Datenkonvertierungs- und eine Auswertesoftware entwickelt, die die Original-NMEA-Nachrichten verwendet. Die Auswertesoftware berechnet die Länge der Flugwege mit unterschiedlicher räumlicher und zeitlicher Schrittweite, die mittlere Geschwindigkeit, Anzahl und Länge der Nichtflugphasen, Verschwinderichtungen und Landeanflugsrichtungen, Abstände von definierten Punkten des Flugwegs zur Luftlinie, Flugwegpunkte in der Nähe der Luftlinie und der Punkt im Flugweg, an dem der Release Site Bias kompensiert ist. Versuchsergebnisse Der Flugschreiber wurde am Boden und auf alten, erfahrenen Brieftauben getestet. Es wurden 125 Flugwege von Brieftauben mit 12 Flugschreibern an 2 Auflaßorten aufgezeichnet und ausgewertet. In den Tests funktionierten die Flugschreiber zuverlässig und erwiesen sich in der Handhabung als robust. Der personelle Aufwand beim Flugwegeaufzeichnen ist klein gegenüber anderen Verfahren. Es wurde ein hoher Anteil von über 90% von vollständigen Flugwegen aufgezeichnet. Die erzielten Flugwege haben eine sehr gute räumliche und zeitliche Auflösung und liefern eine Fülle von Details. Die Menge und Qualität der erzielten Daten ist deutlich besser als die von bisher verwendeten Verfahren. Die Brieftauben konnten das Gerät tragen und mit ihm heimkehren. Die Leistungen der Tauben, die den GPS-Flugschreiber trugen, wurden mit den Leistungen von Kontrolltieren, die entweder nichts oder ein Plastikgewicht trugen, verglichen. Obwohl die Heimkehrzeiten der GPS-Tauben im Bereich der Werte der Kontrolltiere lagen, gab es Beeinträchtigungen bei der Heimkehrleistung und der Heimkehrzeit. Die Heimkehrzeit war zum Teil bei den GPS-Tauben und den Tauben mit Gewicht signifikant länger, wesentlich verursacht durch das Gewicht. Die mittleren Geschwindigkeiten in Flugphasen lagen zwischen 50-70 km/h und und damit im Schnitt unter den von anderen Autoren beobachteten Geschwindigkeiten über Grund für Brieftauben. An einem von zwei Auflaßorten zeigten sich kleine, aber statistisch signifikante Richtungsunterschiede in den Verschwinderichtungen zwischen den GPS-Tauben und Kontrolltauben und zwischen den Tauben mit Gewicht und den Kontrolltauben. Ein Einfluß des Restmagnetfeldes des Gerätes auf die Tauben kann nicht ausgeschlossen werden. Die Flugwege wiesen eine hohe Variabilität auf; aber es gab von beiden Auflaßorten bevorzugte Routen der Tauben. Der in den Vorjahren beobachtete Auflaßort Bias wurde an beiden Orten erneut in den Verschwinderichtungen beobachtet. In den Flugwegen gab es deutliche Entsprechungen zum Auflaßort Bias. In den Landeanflugsrichtungen in Obermörlen gab es ein Landeanflug Bias spiegelbildlich zum Bias am Auflaßort, das es bei den Landeanflugsrichtungen aus Büdesheim nicht gab. Im Verlauf beider Versuchsserien konnte eine Optimierung der Flugwege festgestellt werden, die durch eine Verkürzung der Flugweglängen erzielt wurde. Dies bedeutet, daß auch bei alten, erfahrenen, ortskundigen Tauben eine zunehmende Ortskenntnis und Erfahrung zu immer weiteren Anpassungen beim Heimflug führt. Die Ursache sehr langer Heimkehrzeiten sind längere Pausen. Mittellange Heimkehrzeiten kommen eher durch Schleifenflug und Umwege zustande. Viele Tauben flogen ausgedehnte Schleifen in den Anfangsabschnitten der Flugwege über dem nächsten Dorf oder nahe dem Auflaßort ein Stück in Richtung heim. Spiralige Schleifen um den Auflaßort gab es dagegen fast nie, die Anzahl der geflogenen Schleifen zu Beginn der Flugwege nahm im Verlauf der Versuchsserien nicht ab. Daraus läßt sich schließen, daß der Schleifenflug bei alten, erfahrenen Tauben nicht der Orientierung dient. Vielleicht dient er sozialen Bedürfnissen. Die Anfangsabschnitte der Flugwege in Obermörlen wurden durch die Topografie am Auflaßort beeinflußt. Die Tauben vermieden den Überflug eines bewaldeten Hügels. Es hat den Anschein, daß die Tauben den Überflug von Ortschaften bevorzugten.
Einige Vogelarten verstecken im Herbst Samen, um die Samenverstecke im darauffolgenden Winter wieder auszubeuten. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, wie sich der Kiefernhäher (Nucifraga columbiana), der Eichelhäher (Garrulus glandarius) und die Sumpfmeise (Parus palustris) beim Schaffen und Ausbeuten ihrer Wintervorräte orientieren. Bei den beiden Häherarten sollte herausgefunden werden, ob der Sonnenkompaß eine Rolle bei der Orientierung spielt, wie schon bei dem Buschblauhäher (WILTSCHKO & BALDA 1989) gezeigt werden konnte. Bei den Sumpfmeisen wurde zum einen untersucht, ob eine experimentelle Veränderung des Erdmagnetfeldes eine Rolle bei der Orientierung spielt. Weiterhin wurde untersucht, ob eine Veränderung der Position von zwei starken Scheinwerfern eine Rolle bei der Orientierung der Meisen spielt. Die Versuche mit Kiefernhähern wurden in Flagstaff (Arizona), die mit Eichelhähern und Sumpfmeisen in Frankfurt am Main durchgeführt. Die Versuche mit Kiefernhähern und Eichelhähern fanden in gleichartigen Volieren unter der natürlichen Sonne statt. Die Vögel durchliefen eine Serie von klassischen Zeitumstellungsversuchen. Die Kiefernhäher wurden darüber hinaus unter verschiedenen Licht- und Schattenverhältnissen getestet. Die Sumpfmeisen wurden in einem Versuchskäfig in einer Holzhütte unter Kunstlichtbedingungen getestet. In einer Versuchsserie wurde die Horizontalkomponete des den Versuchskäfig umgebenden Erdmagnetfeldes um 120° gedreht. In einer weiteren Versuchsserie wurde mit zwei Halogenscheinwerfern gearbeitet, deren Position während der Versuche verändert wurde. Es konnte gezeigt werden, daß sowohl beim Kiefernhäher als auch beim Eichelhäher die Sonne eine entscheidende Rolle bei der Orientierung beim Samenverstecken und der Samensuche spielt. Bei beiden Corvidenarten ist die Sonne hier in einem redundanten, multifaktoriellen System eingebunden wie es auch schon für Zugvögel und Brieftauben nachgewiesen werden konnte. Es gibt Anzeichen dafür, daß Kiefernhäher, die den Tageslauf der Sonne länger nicht mehr mitverfolgen konnten, den Sonnenkompaß erst wieder erlernen müssen. Es konnte gezeigt werden, daß die Genauigkeit, mit der die Kiefernhäher ihre versteckten Samen finden, in mehreren, aufeinander folgenden Versuchen abnimmt. Kiefernhäher besitzen ein komplizierteres Orientierungssystem als der in der Vorstudie (WILTSCHKO & BALDA 1989) untersuchte Buschblauhäher, da sie auch ökologisch mehr auf die versteckten Samen angewiesen sind, als die Buschblauhäher. Desweiteren konnte gezeigt werden, daß Eichelhäher in der Lage sind, die Position von Orten, die ihnen in einer Trainigsphase antrainiert wurde, auch nach einer versuchsfreien Phase von drei Monaten fehlerfrei wiederzufinden. Bei Sumpfmeisen konnte gezeigt werden, daß sie in der Lage sind, sich nichtvisuell zu orientieren. Ob das Erdmagnetfeld hierbei eine Rolle spielt, konnte weder bestätigt noch ausgeschlossen werden. Es konnte gezeigt werden, daß die Position der Halogenscheinwerfer bei der Orientierung der Sumpfmeisen während der Samensuche eine Rolle spielt. Es gelang in dieser Arbeit, die Hypothese zu bestätigen, daß Vögel Kompaßmechanismen nicht nur zur Orientierung während des Vogelzuges oder dem Rückflug zum Nest sondern auch in ihrem unmittelbaren Umgebungsbereich benutzen.
Tunikaten produzieren eine Vielzahl an cytotoxischen und antimikrobiellen Verbindungen, die ihnen in ihrem Ökosystem zu überlebenswichtigen Vorteilen verhelfen. Wegen ihrer strukturellen Diversität und ihrer spezifischen Eigenschaften haben bislang einige dieser Sekundärstoffe Eingang in die pharmazeutische Industrie gefunden. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine umfassende Untersuchung des chemischen Potentials benthischer Ascidien der Nordsee. Die Eigenschaften der organischen Ascidienextrakte wurden anhand von vier Bioassays beschrieben. Die Assays fungierten gleichzeitig als Wegweiser zur Isolierung der aktiven Sekundärmetaboliten, der sich eine Strukturaufklärung mit spektroskopischen Methoden (NMR, MS, IR) anschloss. Es wurden Tests auf bewuchshemmende, antimikrobielle, cytotoxische und enzymhemmende Eigenschaften durchgeführt. Eingesetzt wurden organische Extrakte von 13 solitären und koloniebildenden Ascidienarten der nördlichen und südlichen Nordsee. In allen vier Assays zeigten mehrere oder alle Ascidienarten Aktivität. Es ließen sich keine Hinweise auf eine mit der Wuchsform der Arten korrelierte biologische Aktivität sammeln. In einem Freilandversuch zur Untersuchung der besiedlungshemmenden Wirkung der Extrakte konnte gezeigt werden, dass einige Ascidien eine chemische Abwehr von Algensporen oder Epibionten aufweisen, die artspezifisch unterschiedlich stark ausgeprägt ist. Alle Ascidienarten bewiesen antimikrobielle Aktivität, es ergaben sich aber sowohl in der Hemmhofbreite als auch in der Anzahl der gehemmten Bakterienstämme große artspezifische Unterschiede. Auffallend war, dass deutlich mehr Gram-positive sowie marine Bakterienstämme als Gram-negative bzw. nicht-marine Bakterienstämme inhibiert wurden. Im Gegensatz zur antimikrobiellen Aktivität wurden in den Assays zur Cytotoxizität und zur spezifischen Enzymhemmung lediglich bei jeweils vier Ascidienarten positive Effekte festgestellt. Durch die spezifische Anfärbung von Zellorganellen konnten morphologische Veränderungen, die durch die Ascidienmetaboliten in den Mausfibroblasten induziert wurden, sichtbar gemacht und der Einfluß der Extrakte auf das Cytoskelett und spezifische Zellfunktionen dokumentiert werden. Im Protein-Tyrosin-Kinase-Assay führte eine Bioassay-guided Fractionation von Extrakten der Ascidie Dendrodoa grossularia zur Isolierung der aktiven Substanz. Über spektroskopische Methoden sowie den Vergleich mit Literaturdaten konnte der enzymhemmende Metabolit als das Guanidinostyren Tubastrin identifiziert werden. Tubastrin wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals in Tunikaten nachgewiesen. Der Metabolit zeigte als Reinsubstanz nur geringe cytotoxische Effekte und keine antimikrobiellen Eigenschaften. Als weitere Metaboliten der Ascidien Dendrodoa grossularia und Ascidiella aspersa wurden Homarin, Betain, Adenosin und Inosin identifiziert. Keiner dieser Substanzen konnte in der vorliegenden Arbeit eine biologische Aktivität zugeordnet werden. Während Betain, Adenosin und Inosin Funktionen innerhalb des Primärmetabolismus besitzen oder als Zwischenprodukte in Synthesewege eingebunden sein können, stellt Homarin einen Sekundärmetaboliten dar, der in einer Vielzahl von marinen Organismen unterschiedliche Funktionen erfüllt. Seine Aufgabe in Tunikaten muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden. Dass antimikrobielle Aktivität bei allen Ascidienarten gefunden wird, lässt auf eine grundlegende Bedeutung prokaryontischer Abwehr schließen. Die Unterschiede in der Stärke der Effekte aller Bioassays legen nahe, dass jede Ascidienart eine eigene Gesamtstrategie zur Verteidigung gegen Bewuchs und Fraßfeinde ausgebildet hat. Die aus den Laborversuchen erhaltenen Daten verdeutlichen eine weitreichende biologisch-chemische Aktivität von Aplidium punctum, Dendrodoa grossularia und Didemnum candidum, die neben der antimikrobiellen auch starke cytotoxische und/oder enzymhemmende Wirkung gezeigt haben. Die Lokalisation der aktiven Substanzen im Tier sowie eingehendere Versuche zur molekularen Wirkungsweise sind notwendig, die beobachteten Aktivitäten umfassend zu deuten und ihre Nutzbarkeit unter pharmakologischen Gesichtspunkten zu evaluieren.
Die mittelamerikanische Jagdspinne Cupiennius salei Keys. zeigt nach Reizung ventraler Tasthaare auf den proximalen Beingliedern in freier Natur und auch im Labor das relativ einfache, reflektorische Verhalten des „Körperanhebens“. Ziel der vorliegenden Arbeit war, den am Körperanheben maßgeblich beteiligten Coxamuskel c2 hinsichtlich seiner Anatomie, seiner funktionellen Faserzusammensetzung und Innervation sowie seiner Aktivität beim „Körperanheben“ und bei weiteren Bewegungsweisen der Spinne zu untersuchen. (1) Der c2-Muskel liegt im Prosoma der Spinne und setzt für jedes Bein am anterioren Coxarand an. In den 1. - 3. Beinpaaren liegt c2 zweigeteilt (apodemaler und tergaler Anteil), im Hinterbeinpaar dagegen einteilig (nur tergaler Anteil) vor. (2) Histochemische Nachweisreaktionen (Glykogengehalt, relative Succinatdehydrogenase- und relative myofibrilläre Adenosintriphosphatase-Aktivität) ergeben eine heterogene Faserzusammensetzung des c2-Muskels aus 4 Muskelfasertypen (A, B, C, D). Der apodemale c2-Anteil besteht homogen aus A-Fasern. (3) Messungen mit Laserdiffraktometrie zeigen für die A- und B-Fasern signifikant kürzere Sarkomerlängen als für die C- und D-Fasern. (4) Sodium-Dodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese weist als Besonderheit für die A- und B-Fasern eine Paramyosin-Isoform P1 (107 kDa), eine Isoform der leichten Ketten des Myosins LC2 (22 kDa) und vermehrt eine Troponin-Isoform T4 (46 kDa) nach. In den Cund D-Fasern kommt allein eine 43-kDa-Bande und vermehrt eine Troponin-Isoform T2 (50 kDa) vor. (5) Der c2-Muskel der Vorder- und Hinterbeine wird durch einen eigenen Nerv innerviert. Retrograde Anfüllungen („Backfills“) des Nervs mit neuronalen Tracern legen eine polyneurale Innervation des c2-Muskels aller Beine dar, höchstwahrscheinlich jeweils durch 6 Motoneurone. Zwei davon sind jeweils positiv GABA (Gamma-Amino-Buttersäure) -immunreaktiv; dies ist ein Hinweis auf eine mögliche inhibitorische Innervation des c2-Muskels. (6) Wie Elektromyogramme freilaufender Spinnen zeigen, besteht das Körperanhebeverhalten aus zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen: einer lokalen c2-Kontraktion im taktil gereizten Bein, die eine Bewegung im zugehörigen Prosoma-Coxa-Gelenk verursacht, und einer durch diese aktive Bewegung hervorgerufenen plurisegmentalen Reaktion im c2 der übrigen 7 Beine. Wird eine Coxa passiv bewegt, kann auch in festgelegten Spinnen eine plurisegmentale Reaktion aller 8 Beine ausgelöst werden. (7) Sowohl bei der lokalen als auch bei der plurisegmentalen Reaktion des „Körperanhebens“ rekrutiert c2 die gleichen neuromuskulären Einheiten. Dies deutet auf die gleiche zentalnervöse Endstrecke beider Reaktionen hin. Die Anzahl der elektrophysiologisch unterscheidbaren neuromuskulären Einheiten stimmt mit der der anatomisch nachgewiesenen Motoneuronen und Fasertypen überein. (8) Der tergale c2-Anteil ist immer, der apodemale Anteil nur bei schnellem Körperanheben, schnellen Laufstarts und bei Schreckreaktionen (Flucht) der Spinne aktiv. Hierbei rekrutiert der apodemale Teil nur zu Beginn der Verhaltensweise schnelle phasische Einheiten. (9) Ich diskutiere bei welchen Bewegungsweisen der Spinne die 4 Fasertypen vermeindlich zum Einsatz kommen, wie sie höchstwahrscheinlich innerviert werden und welche Konsequenzen die c2-Zweiteilung in den vorderen Beinpaaren (1 - 3) auf die Beinbewegung im Verhalten haben könnte. Am wahrscheinlichsten ist eine verstärkte Druckerhöhung zur Beinextension durch schnelle anfängliche Kontraktionen des „apodemalen Hebels“ und eine vektorielle Kräfteaddition der zwei Muskelteile. (10) Anhang II behandelt den internen Gelenkrezeptor R0 im Prosoma-Coxa-Gelenk. Ausschaltversuche weisen R0 als unentbehrlich für das Zustandekommen der plurisegmentalen Reaktion aus. Lage und Anordnung der R0-Sinneszellen sind in den Beinpaaren 1 - 3 und den Hinterbeinen verschieden.
Extrazelluläre Nukleotide fungieren als auto- und parakrine Signalstoffe aus. Im peripheren und zentralen Nervensystem dienen Nukleotide als Neurotransmitter und Neuromodulatoren. Die nahezu ubiquitäre Expression von Purin-Rezeptoren läßt auf umfassende physiologische Funktionen schließen. Nukleotide konnen über ionotrope P2X-Rezeptoren oder metabotrobe P2Y-Rezeptoren ihre Signalwirkung vermitteln. Via P1-Rezeptoren kann Adenosin, ein Baustein bzw. Abbauprodukt von ATP, seine neuromodulatorische und neuroprotektive Wirkung entfalten. Alkalische Phosphatasen, die Ekto-Nukleotid-Pyrophosphatase/Phosphodiesterase Familie (NPP-Familie) und die Ekto-Nukleosid-Triphosphat-Diphosphohydrolase-Familie (E-NTPDasen) können Nukleosiddiphosphate und Nukleosidtriphosphate hydrolysieren. Die E-NTPDasen sind die wahrscheinlichsten Kandidaten für die Moduluation purinerger Signale im Nervensystem. In dieser Arbeit wurde die Klonierung und Charakterisierung der NTPDase3 der Ratte beschrieben. Ein vollständiger cDNA-Klon der NTPDase3 wurde aus einer Rattenhirnbank isoliert, sequenziert und anhand der familientypischen Sequenzmuster (ACRŽs) als E-NTPDase identifiziert. Die Sequenz enthielt einen offenen Leserahmen der für ein 529 Aminosäuren großes Protein kodierte. Sequenzvergleiche zeigten eine große Ähnlichkeit des Proteins mit den NTPDasen 1, 2 und 8, welche plasmamembranständige Ekto-Enzyme sind. Eine plasmamembranständige Lokalisation konnte in NTPDase3-transfizierten CHO-Zellen und in PC12-Zellen mit endogener NTPDase3-Expression nachgewiesen werden. Anhand von Computeranalysen und Sequenzvergleichen wurden Überlegungen zur Sekundär- und Tertiärstruktur angestellt und Ähnlichkeiten zur Zuckerkinase/ Hitzeschock-Protein 70/Aktin-Superfamilie aufgezeigt. Das Protein war entsprechend der in silico-Analyse glykosiliert und ließ sich über das Lektin ConcavalinA anreichern. Messungen an Membranfraktionen heterelog transfizierter CHO-Zellen zeigten die Hydrolyse verschiedener Nukleosidtriphosphate und Nukleosiddiphosphate mit einer Präferenz für Nukleosidtriphosphate. Das Enzym ist primär Kalziumabhängig und a rbeitet optimal im physiologischen pH-Bereich von pH 7,5 bis pH 8,0. Mit einem ATPase:ADPase-Verhältnis von 5:1 liegt die NTPDase3 zwischen der NTPDase1 und der NTPDase2. Seine biochemischen Eigenschaften machen das Ekto-Enzym zu einem Kandidaten für die Modulation purinerger Signale. Nukleotid-vermittelte Signale können via Hydrolyse durch die NTPDase3, möglicherweise in Kombination mit anderen E-NTPDasen, beendet werden. Als Bestandteil einer Enzymkette mit der Ekto-5Ž-Nukleotidase kann das Enzym zur Produktion des neuromodulatorisch und neuroprotektiv wirkenden Adenosins beitragen. Mögliche Rollen bei der Regulation autokriner, parakriner und synaptischer Signale in nichtneuronalen wie neuronalen Geweben wurden für die Gewebe diskutiert, in denen die NTPDase3 per Westernblot nachgewiesen werden konnte. Neben Dünndarm, Prostata, Pancreas, Nebenhoden und Samenleiter wurde ein NTPDase3-Band vor allem im zentralen Nervensystem gefunden. In allen geprüften Hirnteilen (Bulbus olfactorius, Cerebellum, Cortex, Mesencephalon, Diencephalon, Hippocampus, Striatum, Medulla oblongata), dem Rückenmark und der Hypophyse wurde die NTPDase3 im Westernblot detektiert. Das Enzym könnte an der Regulation exokriner Drüsenfunktionen im Pancreas und am epithelialem Ionentransport involviert sein oder auch bei endokrinen Funktionen des Pankreas und der Hypophyse mitwirken. Möglicherweise hat die NTPDase3 funktionelle Bedeutung bei der Termination und Modulation purinerger Neurotransmission im enterischen Nervensystem, im Rückenmark und in verschiedenen Hirnregionen. An verschiedenen zentralnervösen Funktionen, wie Schmerzwahrnehmung, Atmungs- und Kreislauf-Regulation sowie Gedächtnis- und Lernprozessen sind purinerge Signale maßgeblich beteiligt und es ist wahrscheinlich, daß E-NTPDasen an der Modulation dieser Signale mitwirken. Die in dieser Arbeit beschriebene NTPDase3 ist ein viel versprechender Kandidat für die Regulation purinerger Signale im peripheren und zentralen Nervensystem.
Ein gentherapeutischer Ansatz für die Behandlung der HIV-Infektion ist die "intrazelluläre Immunisierung" von CD4+-Zellen die den Hauptangriffspunkt des HI-Virus darstellen. Potentiell therapeutische Gene zur Hemmung der HIV-Replikation sind in großer Zahl und für praktisch jeden schritt des Replikationszyklus des Virus publiziert. Ein Problem war allerdings bisher das Fehlen eines einheitlichen und reproduzierbaren Vergleichssystems zur Identifizierung erfolgversprechender Gene für Studien im Tiermodell und in der Klinik. In dieser Arbeit wurde ein solches auf die Gentherapie abgestimmtes Zellkultursystem entwickelt, das auf stabilem Transfer von HIV-inhibitorischen Genen durch retrovirale Transduktion von T-Zellen und Belastungsversuchen mit replikationsfähigen Viren beruht. Dazu wurden auf Basis der humanen T-Zellinie PM1 Zellinien etabliert, die das Markergen egfp sowie ein therapeutisches Gen stabil exprimieren. Für den Gentransfer wurden [MLV(GaLV)]-Vektoren verwendet, die sich für die Transduktion von hämatopoetischen Zellen besonders eignen. Mit Hilfe der etablierten HIV-inhibitorischen Gene RevM10 und STHM (membrangebundenes T20) wurden Methoden zur Generierung dieser stabilen Zellinien optimiert. Um eine höchstmögliche Vergleichbarkeit zu erreichen, müssen die Voraussetzungen für eine HIV-Replikation in allen Zellinien in gleicher Weise gegeben sein. Deshalb wurden Zellinien bei mit praktisch gleicher Zellteilungsrate und HIV-Rezeptorexpression etabliert. Die untrschiedliche Hemmwirkung der Kontrollgene konnte so in Belastungsexperimenten mit drei verschiedenen, repräsentativen HIV-1-Laborstämmen reproduzierbar gezeigt werden. Das erarbeitete Zellkultursystem wurde dann zur Evaluierung verschiedener Gene eingesetzt. Zunächst wurden zwei neue Ansätze für die HIV-Gentherapie getestet. Die hohe Wirksamkeit von APOBEC3Gagm gegen HIV-1, die zuvor in einem "single-round"-Infektionssystem gezeigt worden war, konnte bestätigt werden. Der Versuch, das als natürlicher HIV-Inhibitor in humanem Hämofiltrat gefundene Peptild VIRIP auf der Zelloberfläche zu exprimieren, bewirkte hingegen keine HIV-Hemmung. Zusätzlich wurden mehrere potentiell therapeutische Gene getestet, die von Kooperationspartnern im Rahmen eines HIV-Netzwerkes entwickelt worden waren. Für die humanisierte transdominant-negative Gag-Mutante TDsg Delta 2 konnte eine HIV-Hemmwirkung nachgewiesen werden, während weder die Wildtyp-Mutante TDwt Delta 2 noch das minimale GAG-Fragment L2GAL2-V3 eine signifikante Wirkung zeigten. Für die beiden HIV-1 p6-Konstrukte L4 und L6 war eine HIV-Hemmung ebensowenig wie für die gp41 c-tail-Konstrukte 9/1 und 9/2 feststellbar. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, daß sich die Hemmwirkung der unterschiedlichen Gene gegen HIV-1-Primärisolate im wesentlichen der gegen die Laborstämme entspricht. Nach Infektion der Zellinien mit HIV-2 wurde wie erwartet die Virusreplikation nur durch STHM und TDsg Delta 2 gehemmt. Schließlich wurde getestet, ob sich die Hemmeffekte auch in primären humanen Lymphozyten nachvollziehen lassen. Obwohl aufgrund der in diesen Zellen niedrigen erreichbaren Transduktionseffizienzen und einer starken Donorabhängigkeit keine Standardisierung möglich war, konnte gezeigt werden, daß es prinzipiell möglich ist, Hemmeffekte sichtbar zu machen.
Humanpharmaka stellen eine permanente Belastung von Gewässern dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gemäß dem von der Europäischen Arzneimittelagentur EMEA entwickelten Konzept zur Durchführung von Umweltrisikobewertungen von Humanpharmaka mit mehreren ausgewählten Substanzen Umweltrisikobewertungen durchgeführt. Die hierfür ausgewählten Pharmaka sind das Antiepileptikum Carbamazepin (CBZ), das Antibiotikum Sulfamethoxazol (SMX) und das synthetische Östrogen 17a-Ethinylöstradiol (EE2). Als Vertreter der Inhaltsstoffe von Körperpflegeprodukten wurde der polyzyklische Moschusduftstoff Tonalid (AHTN) in die Untersuchungen mit einbezogen. Mit Hilfe von Literaturrecherchen wurde die Datengrundlage für Expositions- und Wirkungsabschätzungen bereitgestellt. Der vorhandene recherchierte Datensatz wurde mit entsprechenden Kurz- und Langzeitstudien ergänzt. Die mit den Ergebnissen der Expositions- und Wirkungsabschätzungen vorgenommenen Umweltrisikobewertungen ergaben im ersten Schritt basierend auf Kurzzeitstudien unter den ausgewählten Substanzen lediglich für den Moschusduftstoff AHTN ein erhöhtes Umweltrisiko für Oberflächengewässer. Basierend auf weiterführenden Langzeitstudien konnte das zunächst erkannte, durch AHTN indizierte Umweltrisiko entkräftet werden, jedoch ergaben die Risikocharakterisierungen für EE2 und SMX ein erhöhtes Risiko für das aquatische Kompartiment. Auf Grund der erhöhten Adsorptionspotenziale von CBZ, EE2 und AHTN wurden für diese Substanzen kompartimentspezifische Umweltrisikocharakterisierungen durchgeführt. Dabei wurde ein erhöhtes Umweltrisiko durch CBZ für das Kompartiment Sediment angezeigt. Basierend auf den Ergebnissen einer Sediment-Bioakkumulationsstudie mit dem endobenthischen Oligochaeten Lumbriculus variegatus, welche in einen unerwartet hohen Akkumulationsfaktor resultierte, und aus der Literatur verfügbaren Fisch-Biokonzentrationsfaktoren wurde anhand der Nahrungskette Wasser-Sediment-Wurm-Fisch die Möglichkeit des ‚secondary poisonings’ durch EE2 bei wurmfressenden Fischen unter natürlichen Bedingungen aufgezeigt. Zur Verwendung dieses Ergebnisses in einer Umweltrisikobewertung zum Zwecke der Zulassung von Pharmaka sollten weitergehende Untersuchungen zur Bestätigung durchgeführt werden. Bezugnehmend auf die Resultate der eigenen Studien und auf die besonderen Eigenschaften von Humanpharmaka wurde der EMEA-Richtlinienentwurf diskutiert und Verbesserungsvorschläge erarbeitet. Bis auf wenige Anpassungen geht das EMEA-Bewertungsschema nicht auf die Besonderheiten und spezifischen Eigenschaften von Humanpharmaka ein. Hauptkritikpunkte bezogen sich auf (1) die Anwendung eines konzentrationsabhängigen Schwellenwertes als Entscheidungsgrundlage zur Durchführung einer Risikocharakterisierung, (2) das stufenweise Vorgehen bei der Wirkungsabschätzung mit zuerst ausschließlich auf Kurzzeitstudien basierenden Effektdaten, und (3) unzureichende Angaben zu Vorgehensweisen in der höheren Stufe des Bewertungsschemas, vor allem bei Substanzen mit außergewöhnlichem ökotoxikologischen Potenzial. Trotz der zur Zeit intensiven internationalen Diskussion über mögliche Auswirkungen durch endokrine Disruptoren auf Mensch und Umwelt sieht der EMEA-Richtlinienentwurf nicht ausdrücklich vor, die Umweltgefährdung durch potenziell endokrin wirksame Substanzen mit spezifischen Testmethoden festzustellen und zu bewerten. Die Erkenntnis, dass spezifische Wirkmechanismen bei Chemikalien, speziell bei Arzneimitteln und Bioziden, auch in sehr niedrigen Konzentrationen zu Wirkungen in der Umwelt führen können, bleibt im EMEA-Richtlinienentwurf auf Grund der Einführung eines expositionsbezogenen Schwellenwertes und der Wirkungsabschätzung mittels Akutstudien nur unzureichend berücksichtigt. Zur Schließung dieser Lücke, die durch Untersuchungen zu endokrinen Wirkungen in der Umwelt offensichtlich wurde, müssen neue und bessere ökotoxikologische Instrumente entwickelt werden und das Umweltrisikobewertungsschema entsprechend erweitert und angepasst werden.
The mammalian retina contains around 30 morphological varieties of amacrine cell types. These interneurons receive excitatory glutamatergic input from bipolar cells and provide GABA- and glycinergic inhibition to other cells in the retina. Amacrine cells exhibit widely varying light evoked responses, in large part defined by their presynaptic partners. We wondered whether amacrine functional diversity is based on a differential expression of glutamate receptors among cell populations and types. In whole cell patch-clamp experiments on mouse retinal slices, we used selective agonists and antagonists to discriminate responses mediated by NMDA/ non-NMDA (NBQX) and AMPA/ KA receptors (cyclothiazide, GYKI 52466, GYKI 53655, SYM 2081). We sampled a large variety of individual cell types, which were classified by their dendritic field size into either narrow-field or wide-field cells after filling with Lucifer yellow or neurobiotin. In addition, we used transgenic GlyT2-EGFP mice, whose glycinergic neurons express EGFP. This allowed us to classify amacrines on basis of their neurotransmitter into either glycinergic or GABAergic cells. All cells (n = 300) had good responses to non-NMDA agonists. Specific AMPA receptor responses could be obtained from almost all cells recorded: 94% of the AII (n = 17), 87% of the narrow-field (n = 45), 81% of the wide-field (n = 21), 85% of the glycinergic (n = 20) and 78% of the GABAergic cells (n = 9). KA receptor selective drugs were also effective on the majority of the AII (79%, n = 14), narrow-field (93%, n = 43), wide-field (85%, n = 26), glycinergic (94%, n = 16) and GABAergic amacrine cells (100%, n = 6). Among the cells tested for the two receptors (n = 65), we encountered both exclusive expression of AMPA or KA receptors and co-expression of the two types. Most narrow-field (70%, n = 27), glycinergic (81%, n = 16) and GABAergic cells (67%, n = 6) were found to have both AMPA and KA receptors. In contrast, only less than half of the wide-field cells (43%, n = 14) were found to co-express AMPA and KA receptors, most of them expressing exclusively AMPA (36%) or KA receptors (21%). We could elicit small NMDA responses from most of the wide-field (75%, n = 13) and GABAergic cells (67%, n = 3), whereas only 47% of the narrow-field (n = 15), 14% of the AII (n = 22) and no glycinergic cell (n = 2) reacted to NMDA. Abstract 83 Our data suggest that AMPA, KA and NMDA receptors are differentially expressed among different types of amacrine cells rather than among populations with different neurotransmitters or different dendritic coverage of the retina. Selective expression of kinetically different glutamate receptors among amacrine types may be involved in generating transient and sustained inhibitory pathways in the retina. Since AMPA and KA receptors are not generally clustered at the same postsynaptic sites, a single amacrine cell expressing both AMPA and KA receptors may provide inhibition with different temporal characteristics to individual synaptic partners.
Life of Varroa destructor, Anderson and Trueman, an ectoparasitic mite of honeybees, is divided into a reproductive phase in the bee brood and a phoretic phase during which the mite is attached to the adult bee. Phoretic mites leave the colony with workers involved in foraging tasks. Little information is available on the mortality of mites outside the colony. Mites may or not return to the colony as a result of death of the infested foragers, host change by drifting of foragers, or removal of mites outside the colony. That mites do not return to the colony was indicated by substantially higher infestation of outflying workers compared to the infestation of returning workers (Kutschker, 1999). The main objective of the study was to provide information whether V. destructor influences flight behaviour of foragers and consequently returning frequency of foragers to the colony. I first repeated the experiment of Kutschker (1999) examining the infestation of outflying and returning workers. Further, I registered flight duration of foragers using a video method. In this experiment I compared also the infestation and flight duration of bees of different genetic origin, Carnica from Oberursel and bees from Primorsky region. I investigated returning time of workers, returning frequency until evening, drifting to other colonies and orientation toward the nest entrance in the experiments in which workers were released in close vicinity of the colony. At last, I measured the loss of foragers in relation to colony infestation using a Bee Scan. Results from this study, listed below, showed considerable influence of V. destructor on flight behavior of foragers translating into loss of mites. Loss of mites with foragers add substantial component to mite mortality and was underestimated in previous studies. Such loss might be viewed as a mechanism of resistance against V. destructor. a) The mean infestation of outflying workers (0.019±0.018) was twice as the mean infestation of returning workers (0.009±0.018). The difference in the infestation between outflying and returning workers was more marked in highly infested colonies. b) Investigation of individually tagged workers by use of a two camera video recording device showed significantly higher infestation of outflying workers compared to returning workers. Mites were lost by the non returning of infested foragers (22%) and by loss of mites from foragers that returned to the colony without the mite (20%). A small portion of mites (1.8%) was gained. Loss of mites significantly exceeded mite gain. c) The flight duration of infested workers determined by using the same two camera video system was significantly higher in infested compared to uninfested workers of the same age that flew closest at time. The median flight duration of infested workers was 1.7 higher (214s) than the median duration of unifested workers (128s). d) Infested workers took 2.3 times longer to return to the colony than uninfested workers of the same age when released from the same locations, closest at time. The returning time increased with the distance of release. In a group of bees released simultaneously the infestation was higher in bees returning later and in those that did not return in the observation period of 15 min. e) Released workers did not return to the colony 1.5 more frequently than uninfested workers in evening. The difference in returning was significant for locations of 20 and 50m from the colony. No difference in returning between infested and uninfested workers were observed for the most distant location of 400m. f) No significant difference was found in returning time and/or in the returning frequency until evening between workers artificially infested overnight and naturally infested workers. Artificially infested workers returned later and less frequently than a control group indicating rapid influence of V. destructor on flight behavior of foragers. g) The orientation ability of infested workers toward the nest entrance was impaired. Infested workers compared to uninfested workers twice as often approached a dummy entrance before finding the nest entrance. h) No significant differences were found in drifting between infested and uninfested workers. Drifting in the neighboring nucleus colony occurred in about 1% occasions after release of marked workers. Similarly, more infested, but not significantly more infested workers (2.6%) entered a different colored hive than the same colored hive (1.9%). However, the number of drifting bees were to low to make results conclusive. i) The comparison between Carnica and Primorsky workers revealed higher infestation in Carnica compared to Primorsky. Further, Primorsky workers lost more mites during foraging due to mite loss from foragers and non returning of infested workers. No significant differences in flight duration were observed between the two bee stocks. j) Loss of foragers, as determined by the Bee Scan counts of outflying and returning foragers, and the infestation of outflying bees increased significantly over a period of 70 days. A colony with 7.7. higher infestation of outflying foragers lost 2.2. time more bees per flight per day compared to a low infested colony. k) The estimates of mite loss with foragers from mite population per day up to 3.1% exceeds approximately mite mortality of 1% within the colony as represented by counting dead mites on bottom board inserts.
In contrast to the class A heat stress transcription factors (Hsfs) of plants, a considerable number of Hsfs assigned to classes B and C have no evident function as transcription activators on their own. In the course of my PhD work I showed that tomato HsfB1, a heat stress induced member of class B Hsf family, is a novel type of transcriptional coactivator in plants. Together with class A Hsfs, e.g. tomato HsfA1, it plays an important role in efficient transcrition initiation during heat stress by forming a type of enhanceosome on fragments of Hsp promoter. Characterization of promoter architecture of hsp promoters led to the identification of novel, complex heat stress element (HSE) clusters, which are required for optimal synergistic interactions of HsfA1 and HsfB1. In addition, HsfB1 showed synergistic activation of the expression of a subset of viral and house keeping promoters. CaMV35S promoter, the most widely expressed constitutive promoter turned out to be the the most interesting candidate to study this effect in detail. Because, for most house-keeping promoters tested during this study, the activators responsible for constitutive expression are not known, but in case of CaMV35S promoter they are quite well known (the bZip proteins, TGA1/2). These proteins belong to the acidic activators, similar to class A Hsfs. Actually, on heat stress inducible promoters HsfA1 or other class A Hsfs are the synergistic partners of HsfB1, whereas on house-keeping or viral promoters, HsfB1 shows synergistic transcriptional activation in cooperation with the promoter specific acidic activators, e.g. with TGA proteins on 35S promoter. In agreement with this the binding sites for HsfB1 were identified in both house-keeping and 35S promoter. It has been suggested during this study that HsfB1 acts in the maintenance of transcription of a sub-set of house-keeping and viral genes during heat stress. The coactivator function of HsfB1 depends on a single lysine residue in the GRGK motif in its CTD. Since, this motif is highly conserved among histones as the acetylation motif, especially in histones H2A and H4,. It was suggested that the GRGK motif acts as a recruitment motif, and together with the other acidic activator is responsible for corecruitment of a histone acetyl transferase (HAT). So, the effect of mammalian CBP (a well known HAT) and its plant orthologs (HAC1) was tested on the stimulation of synergistic reporter gene activation obtained with HsfA1 and HsfB1. Both in plant and mammalian cells, CBP/HAC1 further stimulated the HsfA1/B1 synergistic effect. Corecruitment of HAC1 was proven by in vitro pull down assays, where the NTD of HAC1 interacted specifically both with HsfA1 and HsfB1. Formation of a ternary complex between HsfA1, HsfB1 and CBP/HAC1 was shown via coimmunoprecipitation and electrophoretic mobility shift assays (EMSA). In conclusion, the work presented in my thesis presents a new model for transcriptional regulation during an ongoing heat stress.
In an attempt to search for potential candidate molecules involved in the pathogenesis of endometriosis, a novel 2910 bp cDNA encoding a putative 411 amino acid protein, shrew-1 was discovered. By computational analysis it was predicted to be an integral membrane protein with an outside-in transmembrane domain but no homology with any known protein or domain could be identified. Antibodies raised against the putative open-reading frame peptide of shrew-1 labelled a protein of ca. 48 kDa in extracts of shrew-1 mRNA positive tissues and also detected ectopically expressed shrew-1. In the course of my PhD work, I confirmed the prediction that shrew-1 is indeed a transmembrane protein, by expressing epitope-tagged shrew-1 in epithelial cells and analysing the transfected cells by surface biotinylation and immunoblots. Additionally, I could show that shrew-1 is able to target to E-cadherin-mediated adherens junctions and interacts with the E-cadherin-catenin complex in polarised MCF7 and MDCK cells, but not with the N-cadherin-catenin complex in non-polarised epithelial cells. A direct interaction of shrew-1 with beta-catenin could be shown in an in vitro pull-down assay. From this data, it could be assumed that shrew-1 might play a role in the function and/or regulation of the dynamics of E-cadherin-mediated junctional complexes. In the next part of my thesis, I showed that stable overexpression of shrew-1 in normal MDCK cells. causes changes in morphology of the cells and turns them invasive. Furthermore, transcription by ²-catenin was activated in these MDCK cells stably overexpressing shrew-1. It was probably the imbalance of shrew-1 protein at the adherens junctions that led to the misregulation of adherens junctions associated proteins, i.e. E-cadherin and beta-catenin. Caveolin-1 is another integral membrane protein that forms complexes with Ecadherin- beta-catenin complexes and also plays a role in the endocytosis of E-cadherin during junctional disruption. By immunofluorescence and biochemical studies, caveolin-1 was identified as another interacting partner of shrew-1. However, the functional relevance of this interaction is still not clear. In conclusion, it can be said that shrew-1 interacts with the key players of invasion and metastasis, E-cadherin and caveolin-1, suggesting its possible role in these processes and making it an interesting candidate to unravel other unknown mechanisms involved in the complex process of invasion.
Die frühe Entwicklung und Differenzierung der sympathischen Ganglien wird durch ein Netzwerk von proneuralen (Mash1/Cash1) und autonomen (Phox2a/b, dHand) Transkriptionsfaktoren kontrolliert. Diese Transkriptionsfaktoren induzieren direkt oder indirekt die Expression neuronaler (SCG10) und subtypspezifischer noradrenerger (TH, DBH) oder cholinerger (ChAT, VAChT) Gene. Die Analyse der frühen Genexpression im Ciliarganglion zeigte ein bemerkenswert ähnliches zeitliches Expressionsschema. Zwei bedeutende Unterschiede sind einerseits die nur transiente Expression noradrenerger Gene und andererseits die Abwesenheit des bHLH-Transkriptionsfaktors dHand, der selektiv in den sympathischen Ganglien exprimiert ist. Das Netzwerk der Transkriptionsfaktoren in den sympathischen Ganglien ist abhängig von einem BMP-Signal aus der dorsalen Aorta. BMPs sind notwendig und ausreichend für die Expression der genannten Transkriptionsfaktoren und damit für die Bildung der sympathischen Ganglien. Diese Arbeit zeigt, daß BMPs auch für die Entwicklung des Ciliarganglions notwendig und ausreichend sind. Fehlen BMPs, differenzieren die Vorläuferzellen nicht, wird BMP4 überexprimiert, differenzieren sie, anders als sympathische Vorläuferzellen im Brachialnerv, zu Zellen mit parasympathischem Phänotyp. Die vorliegenden Ergebnisse weisen auf eine Präspezifizierung von Ciliarvorläuferzellen und sympathischen Vorläuferzellen hin. Der bHLH-Transkriptionsfaktor dHand ist differentiell in sympathischen Vorläuferzellen exprimiert. Seine Expression ist notwendig für die noradrenerge Differenzierung, und die Überexpression im Ciliarganglion reicht aus, um in den Ciliarneuronen die Expression von TH/DBH zu erhalten. Verschiedene Arbeiten schlagen als möglichen Wirkmechanismus eine synergistische Interaktion von dHand und Phox2-Transkriptionsfaktoren vor. Ektopische BMP4-Expression induziert in einem Teil der generierten Neuronen die Expression von dHand. Interessanterweise reicht diese, durch BMP4 induzierte, dHand-Expression nicht aus, den relativen Anteil noradrenerger Neuronen innerhalb der ektopischen und der Ciliarneuronen zu erhöhen. Diese scheinbare Diskrepanz kann erklärt werden, wenn man annimmt, daß ein bestimmter Schwellenwert in der dHand-Funktion erreicht werden muß. Dieser Schwellenwert könnte durch unterschiedliche dHand-Expression, induziert durch BMPs, durch posttranskriptionelle Kontrolle der dHand-Funktion, oder durch unterschiedliche Expression von Cofaktoren in unterschiedlich präspezifizierten Vorläuferzellen reguliert werden. In Zellen, in denen die Konzentration an aktivem dHand einen gewissen Schwellenwert übersteigt, würde dann gemeinsam mit Phox2a/b die noradrenerge Genexpression induziert oder erhalten werden.
Inhibition des Stat3-Signalweges durch Peptid-Aptamere : ein neuer Ansatzpunkt für die Tumortherapie
(2004)
In der vorliegenden Arbeit konnten durch den Einsatz modifizierter Hefe-zwei-Hybrid-Screens erstmals Peptid-Aptamere isoliert werden, die spezifisch mit verschiedenen funktionellen Domänen von Stat3 interagieren und dadurch den Stat3-Signalweg auf unterschiedlichen Ebenen inhibieren. Als Zieldomänen im Hefe-zwei-Hybrid-System wurden die Dimerisierungs- bzw. die DNA-Bindedomäne von Stat3 verwendet. Nach der erfolgreichen Identifikation von Peptid-Aptameren im modifizierten Hefe-zwei-Hybrid-System war es zunächst notwendig, die spezifische Interaktion der isolierten Peptid-Aptamere mit Stat3 zu demonstrieren. Die in vitro Interaktion der isolierten Peptid-Aptamere mit dem gesamten Stat3-Molekül wurde in Ko-Immunopräzipitationsexperimenten gezeigt. Im Folgenden bestätigte sich die spezifische Interaktion der isolierten Peptid-Aptamere mit ihren jeweiligen funktionellen Domänen von Stat3 in Hefen mittels Mating-Experimenten. In den nächsten Schritten sollte die Bioaktivität der isolierten Peptid-Aptamere bei der Inhibition des Stat3-Signalweges in verschiedenen Zellsystemen validiert werden. Zunächst konnten in Herc-Zellen, die den Stat3-Signalweg nach exogenem Stimulus (EGF) aktivieren, die molekularen Wirkungs-mechanismen, die der Inhibition des Stat3-Signalweges durch die Peptid-Aptamere zugrunde liegen, aufgeklärt werden. Durch den Einsatz eines biochemisch-molekularbiologischen Methodenrepertoires (Western Blot Analysen, Reportergen-Analysen, und Gelretardierungsexperimente) zeigte sich, dass die verschiedenen selektionierten Peptid-Aptamere mit dem Aktivierungsszenario des Stat3-Signalweges auf zwei unterschiedlichen Ebenen, der Phosphorylierung bzw. der DNA-Bindung von Stat3, interferieren. Um die mögliche Anwendung der isolierten Peptid-Aptamere als potentielle Stat3-Inhibitoren in Tumorerkrankungen zu analysieren, wurden die Untersuchungen auf Tumorzelllinien mit konstitutiv-aktivem Stat3 (murine Melanomazelllinie B16 und humane Myelomazelllinie U266) ausgeweitet. Durch die zelluläre Applikation der für die isolierten Peptid-Aptamere codierenden DNA mittels Transfektion ergaben sich erste Einblicke über den Einfluss der isolierten Peptid-Aptamere auf die transkriptionelle Aktivität von Stat3. In weiteren Untersuchungen konnte eindrucksvoll gezeigt werden, dass durch die transiente Expression eines Peptid-Aptamers (DBD-1) Apoptose in murinen Melanomazellen induziert wird. Die biologische Aktivität des DBD-1 Peptid-Aptamers wurde dann mit Hilfe einer innovativen Methode zur zellulären Applikation von potentiell wirksamen Bio-Molekülen in eukaryotische Zellen studiert. Dabei konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Methode der Proteintransduktion für die Applikation von Peptid-Aptameren etabliert werden. Durch den Einsatz der Proteintransduktion ließ sich die Funktionalität des isolierten DBD-Peptid-Aptamers nicht nur in murinen, sondern auch in humanen Stat3-abhängigen Tumorzellen verifizieren. Dabei konnte auch eine Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen der Überlebensrate von Stat3-abhängigen Tumorzellen und der Menge an applizierten Peptid-Aptamer hergestellt werden. Darüber hinaus demonstrieren weitere Ergebnisse, dass das DBD-1 Peptid-Aptamer keinen Einfluss auf die Überlebensrate von nicht-Stat3-abhängigen Tumorzellen hat, wodurch die hohe Spezifität des DBD-1 Peptid-Aptamers bestätigt wird. Zusätzlich zu diesen funktionellen Analysen konnte der durch das Peptid-Aptamer induzierte Signalweg, der die Einleitung des programmierten Selbstmordes der Stat3-abhängigen Tumorzellen auslöst, charakterisiert werden. Die vorliegenden Daten zeigen zudem die Funktionalität der rekombinant exprimierten Peptid-Aptamere fusioniert mit einer Proteintransduktionsdomäne in einem in vivo Tumormodell in der Maus. Für diesen tierexperimentellen Ansatz fanden B16-Tumorzellen Verwendung, die nach subkutaner Injektion in Mäusen lokale Tumore bilden. In diesem Tumormodell wurde mittels intratumorale Injektion des transduzierbaren DBD-Peptid-Aptamers ein viel versprechender, wachstumshemmender Effekt auf Tumorzellen erzielt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass Stat3 ein ideales Zielprotein für die Entwicklung neuer Tumortherapeutika ist. Dabei stellt nicht nur die Dimerisierungsdomäne, sondern auch die DNA-Bindungsdomäne ein attraktives Ziel für die Inhibition des Transkriptionsfaktors Stat3 dar. Die viel versprechenden Daten sowohl an Tumorzellen als auch im Gesamtorganismus des Maustumormodells, verbunden mit der hier herausgearbeiteten innovativen Applikationstechnik, lassen auf einen Einsatz der isolierten Peptid-Aptamere in der Tumortherapie hoffen. Zudem eröffnen die Daten zur Protein-transduktion von Peptid-Aptameren neue Perspektiven für die Applikation von Bio-Molekülen mittels „Protein-Therapie“ in der molekularen Bio-Medizin.
Das peroxsimale Enzym Katalase wird durch Blaulichtabsorption der prosthetischen Häm- Gruppe im sichtbaren Licht und in Anwesenheit von Sauerstoff in vitro und in vivo inaktiviert. Unter physiologischen Bedingungen wird das inaktivierte Enzym in vivo durch Neusynthese ersetzt. Ist der Proteinbiosyntheseapparat jedoch durch zusätzliche Stressoren wie z. B. Kälte gehemmt, kommt es zu einem Verlust von Katalaseaktivität im Blatt. Alpenpflanzen sind an ihrem natürlichen Standort sowohl hohen Lichtintensitäten, als auch niedrigen Temperaturen ausgesetzt. Streb et al. (1997) identifizierten in Blättern der Alpenpflanze Homogyne alpina eine lichtstabile Katalase. Nach Isolierung von Katalase-cDNAs der Alpenpflanzen Soldanella alpina und Homogyne alpina, sowie der Flachlandpflanze Secale cereale (durchgeführt und zu Verfügung gestellt von M. Schmidt, Universität Frankfurt) sollten diese heterolog exprimiert und auf Lichtstabilität untersucht werden. In Hefen gelang es jedoch nicht, pflanzliche Katalasen funktionell zu exprimieren. Daher wurde die heterologe Katalase-Expression im Baculovirussystem durchgeführt. Nach Infektion von Spodoptera frugiperda Insektenzellen mit rekombinantem Baculovirus, der die jeweilige Katalase-cDNA-Sequenz enthielt, gelang es, aktive pflanzliche Katalasen zu extrahieren. Die rekombinanten Katalasen von Soldanella alpina und Secale cereale waren, ebenso wie die aus Blättern gereinigten Enzyme, lichtsensibel. Die rekombinante Katalase der Alpenpflanze Homogyne alpina war dagegen lichtstabil. Die Ermittlung der Michaelis- Menten-Kinetiken, der peroxidatischen Aktivitäten und der Empfindlichkeit gegen Inhibitoren der lichtsensiblen und lichtstabilen Katalasen ergaben, dass sich die Katalasen in ihren katalytischen Eigenschaften nicht wesentlich voneinander unterschieden. Lediglich die spezifische Aktivität der rekombinanten lichtstabilen Katalase von Homogyne alpina war signifikant herabgesetzt. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenz der Katalase von Homogyne alpina mit Katalasesequenzen anderer mono- und dikotyler Pflanzen und Rinderleberkatalase zeigte sechs auffällige Aminosäuresubstitutionen in stark konservierten Bereichen: Val124Thr, Leu135Ile, Leu189Trp, Gly206Ser, His225Thr und Lys291Met. An einer computergestützten Darstellung des Modells einer 3dimensionalen Katalaseuntereinheit der lichtstabilen Katalaseuntereinheit von Homogyne alpina ist zu sehen, dass die auffälligen Aminosäuresubstitutionen in einer Region am Eingang eines seitlichen Kanals, der zum Reaktionszentrum führt, lokalisiert sind. Diese Region repräsentiert bei tierischen Katalasen eine NADPH-Bindungsstelle. NADPH schützt Rinderleberkatalase, im Gegensatz zu den rekombinanten pflanzlichen Katalasen von Secale cereale und Homogyne alpina, komplett vor der Inaktivierung durch Superoxid und partiell vor Starklichtinaktivierung. Der NADPH-vermittelte Schutz der Rinderleberkatalase ist auf eine spezifische NADPH-Bindung zurückzuführen. Die in dieser Arbeit untersuchten Katalasen von Secale cereale und Homogyne alpina binden NADPH nicht. Die aus Blättern isolierte lichtsensible Katalase von Secale cereale wird durch Superoxid nicht inaktiviert, die rekombinante lichtstabile Katalase von Homogyne alpina dagegen schon. Daher liegt der oxidativen Photoinaktivierung ein anderer Mechanismus zu Grunde, als der Superoxid-vermittelten Katalaseinaktivierung. Die Aminosäuresequenz von CATA3 von Helianthus annuus zeigte die gleichen auffälligen Aminosäuresubstitutionen wie CAT-1 von Homogyne alpina. Heterologe Expression von CATA3 mit anschließender Lichtinkubation ergab, dass CATA3, ebenso wie CAT-1 von Homogyne alpina, lichtstabil ist. In Blättern von Helianthus annuus sind Katalasen mit erhöhter Lichtstabilität als semikristalline Einschlüsse, sogenannten Cores, organisiert. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass in den Peroxisomen von Homogyne alpina-Blättern ebenfalls Cores vorhanden sind. Während der Lichtinaktivierung von Katalasen soll die Oxidation von Histidinresten ausgelöst werden. Daher ist die bei den lichtstabilen Katalasen vorkommende Aminosäuresubstitution von His zu Thr (Pos. 225) in einer bei eukaryotischen Katalasen konservierten Region besonders auffällig. Deshalb wurde bei der lichtsensiblen Katalase von Soldanella alpina durch in vitro Mutagenese das His225 durch ein Thr ersetzt. Die mutagenisierte Katalase von Soldanella alpina war noch lichtempfindlicher, als das nichtmutagenisierte rekombinante Emzym. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Region um das His225 eine wichtige Rolle für die Lichtstabilität bzw. –empfindlichkeit von pflanzlichen Katalasen einzunehmen scheint; die His225Thr Substitution ist allerdings nicht alleine für die Lichtstabilität ausreichend.
Anthropogene Landnutzung in ariden Savannen verändert die strukturelle Diversität der Vegetation und bedroht damit die Artenvielfalt der Flora und Fauna von etwa 20% der Landoberfläche der Erde. Ziel meiner Dissertation war es, den Einfluss von Landnutzung auf die Abundanz und Diversität von Kleinkarnivoren und ihrer Beutetiere zu untersuchen. Dabei sollten Bioindikatoren identifiziert werden, die eine Einschätzung der Diversität im Farmmosaik der südlichen Kalahari ermöglichen. Entlang eines Weideintensitätsgradienten analysierte ich mit Hilfe freilandökologischer Methoden die komplexen Zusammenhänge zwischen Beweidungsintensität, struktureller Diversität der Vegetation, Beuteverfügbarkeit und Diversität von Kleinkarnivoren. Nach den Ergebnissen dieser Studie in der südlichen Kalahari kann ich folgende Aussagen über die anthropogene Störung der Integrität von ariden Savannensystemen durch Beweidung treffen: 1. Eine Steigerung der Bestockungsdichten von Weidetieren führte zu drastischen Veränderungen der Zusammensetzung und strukturellen Diversität der Vegetation. Dabei sank mit zunehmendem Beweidungsdruck der Anteil an Gräsern an der Vegetationsbedeckung bei gleichzeitigem Anstieg der Strauchvegetation. Die Heterogenität des Habitats, gemessen in Anzahl von Strauchpatches (ø>4m) pro Hektar, zeigte einen unimodalen Verlauf bei steigender Strauchbedeckung und damit bei steigender Weideintensität. Maximale Habitatheterogenität wurde bei einer Strauchbedeckung von ca. 20% festgestellt. 2. Die beobachteten Veränderungen der Vegetation wirkten sich sowohl auf Tierarten aus, die sich direkt von pflanzlicher Kost ernähren als auch auf solche am Ende einer Nahrungskette: Die Effekte zunehmender Strauchbedeckung (und damit steigender Beweidungsintensität) auf die relative Häufigkeit der wichtigsten Beutetiere von Kleinkarnivoren unterschieden sich zwischen den einzelnen Gruppen. Es bestand eine lineare negative Korrelation für Orthopteren, während unimodale Antwortmuster für Käfer mit maximaler Abundanz bei einer Strauchbedeckung von ca. 15% und für Nagetiere bei ca. 12,5% festgestellt wurden, wohingegen keine Korrelation für Termiten ermittelt werden konnte. 3. Am Beispiel der Nagetiergemeinschaft konnte die wesentliche Bedeutung der räumlichen Skala für das Auflösungsvermögen von Abundanz- und Diversitätsmuster gezeigt werden. Ihre Muster und damit die Auswirkungen von Beweidung wurden ausschließlich auf einer großen räumlichen Skala (250ha) identifiziert, nicht jedoch auf der Skala des mittleren Aktionsraums (1ha). Ein wichtiges Fazit dieser Ergebnisse ist, dass zuerst diejenige räumliche Skala identifiziert werden muss, auf der ein Organismus mit Habitatstrukturen (Z.B. geeigneten Nahrungsplätzen) interagiert, um die Effekte von Veränderungen der strukturellen Zusammensetzung von Habitaten verstehen zu können. Dabei führte steigende Grasbedeckung zu einer exponentiellen Sättigung der Gesamtabundanz sowie der Diversität der Nagetiere. Dagegen wurde bei Zunahme der Strauchbedeckung ein unimodales Muster für Gesamtabundanz und Diversität festgestellt. 4. Obwohl ein hoher Strauchanteil sich durchgehend negativ auf die Beuteverfügbarkeit auswirkte, haben Sträucher eine besondere Bedeutung für die Artenvielfalt in diesem Lebensraum, da sie als Schutz- und Nistplatz wichtige Funktionen erfüllen. Am Beispiel von Fuchsmangusten (Cynictis penicillata) konnte ich exemplarisch die zentralen Funktionen von Sträuchern und ihren Einfluss auf den Reproduktionserfolg dieser Art zeigen. Interessanterweise waren die Auswirkungen von Sträuchern inkonsistent für unterschiedliche räumliche Skalen. Im Mikrohabitat haben Strauchstrukturen positive Eigenschaften (Schutzfunktionen). Fuchsmangusten legten ihre Bauten meistens unter Sträuchern an, um ein Einstürzen durch Huftrampeln zu verhindern und ihr Prädationsrisiko durch Greifvögel zu reduzieren. Für die Anlage ihrer Reproduktionsbauten wählten sie Strauchstrukturen mit einem Durchmesser von mindestens sechs Metern (bevorzugt der Art Acacia hebeclada) und außerdem, wenn sich im Umkreis von 10 Metern kein weiterer Strauchpatch befand. Auf einer größeren räumlichen Skala (im Umfeld von einem Hektar um Reproduktionsbauten) wurden Flächen mit einer Strauchbedeckung präferiert, die geringer war, als zufällige Flächen im Habitat. Dabei wirkte sich zunehmende Strauchbedeckung auch negativ auf die Gruppengröße und den Reproduktionserfolg dieser Art aus. Für eine erfolgreiche Reproduktion bei Fuchsmangusten scheint die Strauchbedeckung im Umfeld von einem Hektar um die Reproduktionsbauten einen Schwellenwert zwischen 10 und 15% nicht überschreiten zu dürfen. Dies ist mit der sinkenden Beuteverfügbarkeit (Nagetiere und Arthropoden) bei zunehmender Strauchbedeckung zu begründen. 5. Aufgrund der dramatischen Auswirkungen von Verbuschung auf die Beuteverfügbarkeit von Kleinkarnivoren unterschieden sich die Abundanzen der einzelnen Kleinkarnivoren deutlich zwischen diesen Farmen. Die Abundanz der jeweiligen Einzelarten konnte über Regressionsmodelle mit Vegetationsparameter oder Beutetierverfügbarkeit erklärt werden. Im Gegensatz dazu war die Strauchbedeckung die beste erklärende Variable für Gesamtabundanz und Diversität der Gilde. Sie integriert habitatspezifische Eigenschaften, wie die Verfügbarkeit von vier Beutetiergruppen, die Konnektivität von Nahrungspatches mit hoher Qualität, das Prädationsrisiko durch Greifvögel sowie das Nistplatzangebot. Dabei sank mit zunehmender Strauchbedeckung die Gesamtabundanz, während für die Diversität ein unimodales Muster mit maximaler Diversität bei einer Strauchbedeckung von ca. 12,5% festgestellt wurde. Für eine Einschätzung der Diversität von Kleinkarnivoren eignet sich die Ginsterkatze (Genetta genetta) als Indikatorart. Interessanterweise war die Strauchbedeckung ein noch besserer Bioindikator für die Einschätzung der Diversität von Kleinkarnivoren. 6. Die Schlussfolgerung meiner Ergebnisse ist, dass die Diversität der Kleinkarnivoren einen Großteil der Biodiversität der Untersuchungsflächen in der südlichen Kalahari widerspiegelt. Dabei integriert die Kleinkarnivorengilde als Indikatorvariable neben der zoologischen Diversität (i) auch die strukturelle Diversität der Vegetation (ii) sowie die strukturelle Organisation im Nahrungsnetz (iii). Kleinkarnivoren erhalten dadurch einen Status einer Indikatorgilde und eignen sich damit sehr gut zur Beurteilung der südlichen Kalahari oder einer anderen Weidelandschaft arider Savannen. 7. Das für den Naturschutz wichtigste Ergebnis meiner Arbeit ist, dass höchste Diversität aller Untersuchungsorganismen bei einer Strauchbedeckung zwischen 10 und 15%, also einer mittleren Beweidungsintensität von ca. 3,5 LSU/ l00ha, festgestellt wurde. Daher wirken sich mäßige Bestockungsdichten durchaus positiv auf die Diversität aus, während eine Überbeweidung einen dramatischen Rückgang der Artenvielfalt in diesem Lebensraum verursacht.
Die thrombotisch thrombozytopenische Purpura (TTP) ist ein schweres, heterogenes Syndrom, bei welchem es zu einer lebensbedrohlichen, disseminierten Mikrothrombosierung in den arteriellen Kapillaren kommt. Bei Patienten mit TTP wurde 1997 erstmalig ein Mangel an der Von Willebrand Faktor (VWF)-spaltenden Protease entdeckt. Diese Protease wurde 2001 als ein neues Mitglied der "a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs"-Familie identifiziert und als ADAMTS-13 bezeichnet. Der ADAMTS-13-Mangel soll eine Anreicherung großer VWF-Multimere verursachen, welche für die pathologische Thrombenbildung bei Patienten mit TTP verantwortlich gemacht wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität entwickelt. Mittels des neuen Verfahrens wurde die Bedeutung von ADAMTS-13 in der Pathophysiologie der erworbenen TTP und in der Genese anderer Erkrankungen untersucht. Bei der hier entwickelten Methode wird eine beliebige Testprobe mit einem ADAMTS-13-freien VWF-Substrat versetzt und nach entsprechender Inkubation die ADAMTS-13-Aktivität ermittelt, indem der Abfall der VWF-vermittelten Aggregation von Thrombozyten gemessen wird. Das neuartige Verfahren zeigt eine gute Reproduzierbarkeit und wurde durch extensiven Vergleich mit der herkömmlichen Immunoblotting-Methode validiert. Zudem wurde die Richtigkeit der Methode durch erfolgreiche Teilnahme an einer internationalen Multicenterstudie bestätigt. Die neue Methode ist im Gegensatz zu den herkömmlichen Verfahren im klinisch-diagnostischen Routinelabor anwendbar, da das Verfahren auf der Verwendung eines routineerprobten, automatisierten Testes zur Bestimmung der VWF:Ristocetin-Kofaktor-Aktivität beruht. Der Test ist bei hohem Probendurchsatz schnell und einfach durchführbar und benötigt keine spezielle Laborausrüstung oder besondere Expertise. In den untersuchten Patientenkollektiven war der schwere ADAMTS-13-Mangel mit einer Spezifität von 100% und einer Sensitivität von 89% mit einer akuten TTP korreliert. Bei 85% der Plasmaproben mit hochgradig erniedrigter ADAMTS-13-Aktivität konnte in vitro eine inhibitorische Aktivität gegen ADAMTS-13 detektiert werden. Die Plasmapherese-Therapie (PP-Therapie) führte in 75% der untersuchten TTP-Episoden zu einer letztendlichen Eliminierung des Inhibitors mit einer korrespondierenden Erhöhung der ADAMTS-13-Aktivität. Der Anstieg der ADAMTS-13-Aktivität war in diesen Fällen eng mit dem Anstieg der Thrombozyten assoziert. In 15% der untersuchten Episoden führte die PP-Therapie zu einer Erniedrigung des Inhibitortiters ohne messbare Rekonstitution der ADAMTS-13-Aktivität. Bei 10% der untersuchten Episoden kam es unter PP-Therapie zu einem permanenten Anstieg des Inhibitortiters. Trotz fehlender Rekonstitution der ADAMTS-13-Aktivität in den letztgenannten Fällen induzierte die PP-Therapie eine klinische Remission. Zwei Patienten zeigten nach Splenektomie bzw. Rituximab-Gabe ohne nachweisbare Rekonstitution der ADAMTS-13-Aktivität ebenfalls eine konsistente, klinische Remission. Die Ergebnisse zeigen, dass die in vitro gemessene ADAMTS-13-Aktivität die pathophysiologisch wirksamen Prozesse der akuten TTP nicht immer eindeutig erklären. Dies weist auf bislang unentdeckte pathogene Mechanismen hin. Zudem könnten die derzeit gängigen Methoden zur Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität (einschließlich des hier entwickelten Verfahrens) die tatsächliche in vivo VWF-Proteolyse durch ADAMTS-13 nicht ausreichend widerspiegeln. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass ein ADAMTS-13-Mangel als ein Risikofaktor, und nicht als der alleinige Auslöser, für die akute TTP betrachtet werden sollte. Die Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität bei den unterschiedlichsten hämatologischen Erkrankungen offenbarte eine moderat erniedrigte ADAMTS-13-Aktivität in einer Vielzahl von schweren, zumeist intensivpflichtigen Erkrankungen. Bei einigen Patienten konnte nachgewiesen werden, dass sich die ADAMTS-13-Aktivität in Remission normalisiert. Daraus lässt sich möglicherweise vermuten, dass sich die ADAMTS-13-Aktivität generell bei einer Akut-Phasen-Reaktion erniedrigt. Die Untersuchungen der ADAMTS-13-Aktivität bei Patienten mit malignen Erkrankungen zeigte bei 21% der getesteten Patienten einen milden ADAMTS-13 Mangel. Bei den untersuchten Patienten mit Hirn- und Prostatatumoren konnte, im Gegensatz zu vorhergehenden Studien mit anderen Tumortypen, keine Korrelation zwischen erniedrigter ADAMTS-13-Aktivität und dem Grad der Malignität bzw. der Dissemination des Tumors gefunden werden. Die Bestimmung der ADAMTS-13-Aktivität bei einem umfangreichen Patientenkollektiv mit thromboembolischen Erkrankungen zeigte, dass der ADAMTS-13 Mangel kein häufig vorkommender Risikofaktor für das Auftreten von arteriellen oder venösen Thrombosen darstellt. In der vorliegenden Studie wurde jedoch der weltweit erste Fall eines milden, congenitalen ADAMTS-13 Mangels bei einer Patientin mit familiären, rezidivierenden, ischämischen Schlaganfällen gefunden. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit ein neuartiges Verfahren zur Bestimmung der VWF-spaltenden Proteaseaktivität von ADAMTS-13 entwickelt, welchem durch seine klinische Anwendbarkeit in Zukunft eine weitreichende Bedeutung zufallen könnte. Die klinischen Studien dieser Arbeit belegen zum einen den Zusammenhang zwischen ADAMTS-13 und TTP und weisen zum anderen auf andere bislang nicht identifizierte Mechanismen hin, welche das klinische Bild der TTP determinieren. Des weiteren konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass ADAMTS-13 neben einer Beteiligung an der Akut-Phasen-Reaktion, eine möglicherweise sehr bedeutsame Rolle bei malignen und thromboembolischen Erkrankungen spielt. Dies sollte in zukünftigen Studien, insbesondere im Hinblick auf neuartige therapeutische Möglichkeiten durch die Gabe von ADAMTS-13, näher untersucht werden.
Die vorliegende Arbeit wurde partiell als Bestandteil eines von der EU geförderten TME-Projektes angefertigt. Das vorrangige Ziel war die Weiterentwicklung der Methodik, die Ring-Testung und die Freiland-Validierung eines offenen und ungestörten terrestrischen Modellökosystems (TMEs). Hierzu wurden die Auswirkungen der Modellchemikalie Carbendazim (fungizider Wirkstoff der Formulierung Derosal®) auf die Enchytraeidenzönose mit TMEs im Labor und in Freiland- Validierungsstudien untersucht. Die Familie Enchytraeidae (Annelida, Oligochaeta) unterlag auf Grund ihrer hohen ökologischen Wertigkeit und einer bekannten Sensitivität gegenüber Carbendazim, im Rahmen dieser Arbeit einer weitergehenden und vertiefenden Auswertung. Im Detail wurde analysiert, welcher der mittels TMEs für die Enchytraeen erhobenen Parameter gegenüber der Exposition von Carbendazim am sensitivsten reagiert und bei der statistischen Auswertung den niedrigsten NOEC- bzw. EC50-Wert liefert. Darüber hinaus wurde die Frage geklärt, welche der in einer TME-Studie generierten ökotoxikologischen Kenngrößen, NOEC oder EC50, am sinnvollsten in der Risikobeurteilung eingesetzt werden sollte. Die Versuche wurden in Amsterdam (Niederland), Bangor (Wales, England), Coimbra (Portugal) und Flörsheim (Deutschland) durchgeführt. An allen Standorten wurde mit dem gleichen Equipment gearbeitet. Die TMEs bestanden aus intakten Bodensäulen (Ø = 17.5 cm, Länge = 40 cm) mit ungestörter Schichtung, indigener Bodenfauna und natürlichem Pflanzenbewuchs. Die Entnahme der TMEs erfolgte auf den Flächen, auf denen auch die entsprechenden Freiland-Validierungsstudien durchgeführt wurden. Es handelte sich dabei um Grünland bzw. in einem Fall (Coimbra) um eine landwirtschaftliche Nutzfläche. Unabhängig von den jeweiligen Bodeneigenschaften konnten an allen Standorten mit den angewandten Methoden intakte Bodensäulen im Freiland entnommen und über eine dreimonatige Versuchsdauer als TMEs im Labor oder im Gewächshaus installiert werden. Zumindest für diesen Versuchszeitraum war die Aufrechterhaltung einer natürlichen Zönose der Enchytraeen in den TMEs unter den beschriebenen Versuchsbedingungen möglich. Untersucht wurden die Parameter Gesamtabundanz, Artenanzahl, Shannon-Wiener Index, Dominanzspektrum, Abundanz der Gattungen Fridericia und Enchytraeus, Anteil der Juvenilen an der Gesamtabundanz sowie die Vertikalverteilung der Enchytraeidae. Mittels einer multivariaten Statistik (PRC, Principal Response Curve) wurden die Auswirkungen auf den Endpunkt Enchytraeidae-Artengemeinschaft bestimmt. An allen Standorten kam es im TME-Vortest, im TME-Ringtest und in der Freiland-Validierungsstudie bei allen Probennahmezeitpunkten zu einer hohen Variabilität der Messwerte, die durch die heterogene räumliche Verteilung der Enchytraeidae bedingt ist. Traten Unterschiede zwischen den Kontrollen der verschiedenen Probennahmezeitpunkte im TME-Vortest und im TME-Ringtest auf, waren sie meist auf eine hohe Variabilität des jeweiligen Endpunktes zurückzuführen. Nur in wenigen Ausnahmefällen kam es zu einer kontinuierlichen Zunahme während der Versuchsdurchführung. In der Freiland-Validierungsstudie nahmen die jeweiligen Messwerte in den Kontrollen während der Versuchsdauer ab. Dies war die Folge der hohen Sommertemperaturen und der dadurch bedingten Austrocknung des Bodens, die in der Freiland-Validierungsstudie, wie alle Umweltbedingungen, nicht zu kontrollieren war. Beim Vergleich TME-Ringtest versus Freiland-Validierungsstudie lagen die Kontrollwerte der einzelnen Parameter in den beiden Studien in vergleichbaren Größenordnungen. Zwischen den Standorten konnten im TME-Vortest, im TME-Ringtest und in der Freiland- Validierungsstudie für alle Parameter keine prinzipiellen Differenzen bezüglich der Entwicklung der Kontrollen über die Probennahmezeitpunkte beobachtetet werden. An allen Standorten zeigten die untersuchten Parameter im TME-Vortest, im TME-Ringtest und in der Freiland-Validierungsstudie eine gute Übereinstimmung mit in der Literatur veröffentlichten Ergebnissen. Insgesamt lässt sich für die Entwicklung der Kontrollen über die Zeit ableiten, dass sich die Enchytraeenzönosen in den TMEs sowie am entsprechenden Freilandstandort hinsichtlich der untersuchten Parameter und ihrer räumlichen Heterogenität unabhängig von den Bodeneigenschaften nicht unterschieden. Aufgrund dieser Tatsache können systembedingte methodische Fehler bei der Erfassung von Chemikalienwirkungen auf die Enchytraeenzönosen unterschiedlicher Standorte mittels TMEs ausgeschlossen werden. Die grundlegenden Voraussetzungen für den Einsatz von TMEs als ökotoxikologisches Testsystem und Instrument in der Ökotoxikologie sind somit gegeben. An den unterschiedlichen Standorten waren die Auswirkungen von Carbendazim auf die untersuchten Parameter an den unterschiedlichen Probennahmezeitpunkten im TME-Ringtest ähnlich wie in der Freiland-Validierungsstudie. Zum Probennahmezeitpunkt w+16 waren die Effekte im TME-Ringtest und in der Freiland-Validierungsstudie vergleichbar denen im TME-Vortest. Die zwischen den Standorten festgestellten Unterschiede hinsichtlich des zeitlichen Verlaufs der Effekte sind auf die unterschiedlichen Bodeneigenschaften und die speziellen Substanzeigenschaften von Carbendazim zurückzuführen. Daher sollten bei der Planung einer TME-Studie neben den Charakteristika der zu testenden Substanz auch die standortspezifischen pedologischen Gegebenheiten berücksichtigt werden. Dabei sollten die Versuchdauer und das Raster der Probennahmen so angelegt sein, dass die maximalen Auswirkungen einer Testsubstanz sowie eine eventuelle Regeneration festgestellt werden können. Zwischen dem TME-Vortest, dem TME-Ringtest und der Freiland-Validierungsstudie sowie zwischen den verschiedenen Standorten konnten bezüglich der Sensitivität der untersuchten Endpunkte keine Unterschiede beobachtet werden. Die niedrigsten NOEC-Werte wurden im TME-Vortest, im TME-Ringtest und in der Freiland-Validierungsstudie am häufigsten mit den Parametern Dominanzspektrum und Enchytraeidae-Artengemeinschaft bestimmt. Die niedrigsten EC50-Werte (inklusive enger 95 % Vertrauensbereiche) wurden für die mit Hilfe der PRC ermittelten sensitivsten Taxa berechnet. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass multivariate statistische Verfahren wie die PRC am besten geeignet sind, um Multispezies-Testsysteme wie die TMEs auszuwerten. Darüber hinaus lassen sich mittels PRC die jeweils empfindlichsten Taxa ermitteln, für welche dann wiederum EC50-Werte mit sehr engen 95 % Vertrauensbereichen berechnet werden können. Eine einfachere Alternative ist die Auswertung des Parameters Dominanzspektrum. Mit diesem Endpunkt lassen sich sowohl NOEC-Werte bestimmen als auch sensitive Taxa ermitteln für die anschließend EC50-Werte zu berechnet werden können. EC50-Werte waren an allen Standorten sowohl im TME-Vortest und im TME-Ringtest als auch in der Freiland-Validierungsstudie häufiger bestimmbar als NOEC-Werte. Die EC50- Werte lagen meist unter den entsprechenden NOEC-Werten. Der Faktor zwischen den an den einzelnen Standorten ermittelten Minimum- bzw. Maximumwerten war für die EC50-Werte niedriger als für die NOEC-Werte. Die im TME-Ringtest ermittelten NOEC- und EC50-Werte entsprachen denen der Freiland-Validierungsstudie. Beim Vergleich der Standorte zeigten die EC50-Werte eine geringere Streuung als die NOEC-Werte. Der Variationskoeffizient der für den TME-Vortest und den TME-Ringtest berechneten EC50- Werte sowie der Faktor zwischen Minimum- und Maximumwert der unterschiedlichen Institute war denen anderer Ringtests, die mit Labormethoden durchgeführt wurden, vergleichbar, obwohl hier unterschiedliche Böden mit unterschiedlichen Enchytraeenzönosen verwendet wurden. Die im TME-Vortest und im TME-Ringtest festgestellten EC50-Werte sind mit den in der Literatur für Enchytraeen und Lumbriciden angegebenen LC/EC50-Werten sehr gut vergleichbar und liegen im unteren Bereich dieser Angaben. Damit konnte im Rahmen dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass die mittels TME generierten Ergebnisse replizierbar und reproduzierbar sind, was eine wichtige Bedingung für die Verwendung als Testsystem in der Ökotoxikologie darstellt. Gleichzeitig wurde mittels der Freiland-Validierungsstudie die ökologische Relevanz der TME-Resultate belegt. TMEs können als sinnvolles Instrument zur Verbesserung der Risikobewertung für das Kompartiment Boden für neue/existierende Chemikalien, Biozide und Pflanzenschutzmittel betrachtet werden. Strukturelle Parameter wie z.B. die Enchytraeidae-Artengemeinschaft oder das Dominanzspektrum sollten in die Auswertung mit einbezogen und multivariate Verfahren wie die PRC verwendet werden. Damit ist es möglich, die sensitivsten Taxa zu identifizieren, Zusammenfasssung 178 für welche EC50-Werte berechnet werden können. Anstelle von NOEC-Werten sollten bei der Auswertung von TME-Studien bevorzugt EC50-Werte als ökotoxikologische Kenngröße in die Risikobewertung eingehen (z.B. zur Berechnung von TER-Werten). Die dabei zu verwendenden Sicherheitsfaktoren sind entsprechend anzupassen. Mit der Kombination Enchytraeidae und TME ist neben der Untersuchung von ökotoxikologischen Effekten zudem eine gute Möglichkeit gegeben, das Bioakkumulationspotential von Chemikalien zu bestimmen. Damit stehen für ökotoxikologische Untersuchungen auf den unterschiedlichsten Ebenen (Labor, Modellökosystem, Freiland, Bioakkumulation) standardisierte Testsysteme mit Enchytraeen zur Bestimmung der Wirkungen und des Verhaltens von Chemikalien zur Verfügung.
Pflanzenfunde aus archäologischen Ausgrabungen im Norden Burkina Fasos dokumentieren die regionale Geschichte der Pflanzennutzung und damit zusammenhängende Wechselwirkungen zwischen Mensch und Umwelt. Das untersuchte Material besteht überwiegend aus verkohlten Früchten und Samen, die durch das Schlämmen von Kultursedimenten aus mehr als 20 Fundplätzen gewonnen wurden. Sie decken einen Zeitraum von etwa 4000 Jahren ab, der von der Endsteinzeit bis in die jüngste Neuzeit reicht. Die Analysen der archäobotanischen Inventare ermöglichen es, mehrere Phasen der Pflanzennutzung auszuweisen, die mit spezifischen Lebens- und Siedlungsweisen der Bevölkerung assoziiert sind. Eine ausschließlich wildbeuterische Wirtschaftsform wird für die älteste der untersuchten Fundstellen, den Lagerplatz Corcoba, angenommen. Dort nutzten mobile Gesellschaften um 2000 BC reiche Fischressourcen und sammelten systematisch die Früchte von Gehölzen. Im Inventar des Fundplatzes Tin Akof ist um 1800 BC erstmals eine Kulturpflanze, die Perlhirse (Pennisetum glaucum) nachweisbar. Sie markiert den Beginn der produzierenden Wirtschaftsweise. Es wird ein Anbau in kleinem Maßstab rekonstruiert, wobei Feldbau nur eine von mehreren praktizierten Subsistenzstrategien war. Vermutlich handelte es sich bei den Bewohnern von Tin Akof um seminomadische Viehhalter, die aus dem Sahararaum einwanderten und das bereits domestizierte Getreide einführten. Ab der Zeitenwende tritt in der Eisenzeit eine neue, sesshafte Kultur in Erscheinung. Ihre Siedlungen befanden sich vorzugsweise auf sandigen, leicht kultivierbaren Böden in der Nähe permanenter Gewässer. Die Nahrungsproduktion basierte auf der Kultivierung von Perlhirse, daneben wurden Hibiscus cf. sabdariffa und die Hülsenfrüchte Vigna subterranea und V. unguiculata angebaut. Als Anbausysteme lassen sich Mischkulturen mit Perlhirse als Hauptfrucht und Kulturbaumparks, die vom Menschen geschätzte Gehölze (u.a. Vitellaria paradoxa) aus der ursprünglichen Savannenvegetation einbeziehen, rekonstruieren. Die gemischte Wirtschaftsweise umfasste Viehhaltung, aber auch wildbeuterische Praktiken wie das Sammeln von Wildpflanzen, insbesondere von Baumfrüchten. Hinweise auf Handelskontakte liegen aus der zweiten Hälfte des ersten Jahrtausends AD vor. Sie lassen sich zum Teil mit dem Ausbau transsaharischer Handelsnetze im Verlauf der Islamisierung Westafrikas verknüpfen. Sorghum bicolor und die Wassermelone (Citrullus lanatus) wurden möglicherweise auf diese Weise eingeführt. Die Eisenzeit erweist sich insgesamt als stabile Epoche mit langer Siedlungskontinuität. Gleichwohl zeigen die detailliert untersuchten Fundsequenzen sich wandelnde Nutzungsmuster und eine Intensivierung der Landwirtschaft. Im 14. Jahrhundert werden die für die Epoche typischen Siedlungshügel im gesamten Gebiet verlassen. Mögliche Ursachen sind politische Veränderungen in benachbarten Regionen. Erst aus der jüngsten Neuzeit liegen wieder archäobotanische Belege vor. Die Ergebnisse aus Burkina Faso bestätigen die archäobotanischen Forschungen in anderen Gebieten Westafrikas, nach denen Feldbau relativ spät um 2000 BC begann und Perlhirse die erste domestizierte Kulturpflanze darstellt. Die stabile Bedingungen in der Eisenzeit führten vielerorts zur Entstehung von Städten und Handelszentren. Diese Entwicklung ist im ländlichen Raum, zu der auch die Arbeitsregion zählt, weniger deutlich ausgeprägt, aber dennoch fassbar. Die archäobotanischen Inventare der Endsteinzeit und Eisenzeit dokumentieren ein, im Vergleich zu heute, niederschlagsreicheres Klima und einen geringeren anthropozoogenen Einfluss auf die natürliche Vegetation.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde in den drei für die Weidewirtschaft Westafrikas wichtigsten Naturräumen das Umweltklassifikationssystem von Weidewirtschaft betreibenden und für die Region repräsentativen autochthonen und allochthonen Fulbegruppen erfaßt. Motiv für diese Untersuchung war dabei, im Zuge der derzeit stattfindenden Neubewertung mobiler pastoraler Betriebssysteme das diesen Strategien zugrundeliegende traditionelle Wissen zu dokumentieren und so einen Beitrag zum besseren Verständnis der jahrhundertealten Weidestrategien zu leisten. In den drei Gebieten wurden bei den autochthonen Gruppen jeweils zwischen 70 und 100 Einheiten erhoben, mittels derer die Fulbe die natürliche sowie die anthropogen beeinflußte Umwelt klassifizieren. Für jede Einheit wurde die genaue Beschreibung durch die Fulbe ermittelt. Der Klassifikation liegt ein dichtes Kriteriengefüge zugrunde, dessen Grundkriterien - Relief, Hydrologie, Böden, Vegetation, anthropogene und zoogene Beeinflussung - durch eine große Zahl weiterer Kriterien verfeinert werden. Das hieraus resultierende Gesamtsystem ist ein von allen Mitgliedern der jeweiligen Gemeinschaft geteiltes geoökologisches System, mit dem sich alle für einen Standort relevanten Umweltfaktoren präzise und vollständig beschreiben lassen, und das sämtliche Größenordnungen von Einheiten einbezieht. Gleichzeitig enthält es implizit die für Pastoralisten besonders wichtige Information über den Weidewert einer Einheit. Parallel zum Klassifikationssystem der Fulbe wurde mittels pflanzensoziologischer Aufnahmen die Vegetation der drei Untersuchungsgebiete dokumentiert. Die Aufnahmen wurden in allen traditionellen, von den Fulbe mit Namen bezeichneten Einheiten durchgeführt. Im Sahel wurden 4 Gehölz- und 22 Krautgesellschaften ausgeschieden, im Nordsudan 5 Gehölz- und 12 Krautgesellschaften und im Südsudan 7 Gehölz- und 12 Krautgesellschaften. Die pflanzensoziologischen Aufnahmen ermöglichen eine botanische Referenzierung der Fulbe-Einheiten: Ihnen konnten die jeweils für sie typischen Vegetationseinheiten zugeordnet werden. In zahlreichen Fällen zeigte sich eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß einer Fulbe-Einheit eine oder einige wenige Pflanzengesellschaften entsprechen. Eine vollständige Übereinstimmung zwischen Fulbe-Einheiten und pflanzensoziologischen Gesellschaften, d.h., einer Fulbe-Einheit entspricht zu 100 % einer Pflanzengesellschaft und gleichzeitig tritt letztere ausschließlich in dieser Fulbe-Einheit auf, ist aber selten. Im Rahmen der ethnobotanischen Untersuchungen wurde die Bedeutung der Vegetation für die Bevölkerung der drei Regionen untersucht. Es wurden bei allen Fulbegruppen Namen und Nutzungen der angetroffenen Arten erhoben. Der Schwerpunkt lag dabei auf Weidearten, die für die Fulbe als Pastoralisten einen besonders wichtigen Aspekt darstellen, Medizinalpflanzen für human- und tiermedizinische Zwecke sowie sonstigen Verwendungen als Nahrungsmittel, Werkstoffe etc. Bei den Weidearten zeigte sich, daß der Anteil der auf diese Weise genutzten Arten und Pflanzenfamilien im artenarmen Sahel im Vergleich zu den anderen beiden Regionen am höchsten ist. Im artenreichen Südsudan umfaßt die Weidenutzung dagegen die wenigsten Arten. Dieses Ergebnis belegt die Bedeutung breitgefächerter Nutzungsstrategien gerade in Regionen mit prekärer Ressourcensituation. Die Erhebung der traditionellen Heilpflanzen stellt einerseits einen Beitrag zur Bewahrung traditionellen Wissens dar, das in allen drei Regionen durch sich rasch veränderte Lebensumstände bedroht ist. Außerdem hat sie gezeigt, daß eine traditionelle Lebensweise nicht immer den Erhalt dieser Kenntnisse garantiert. Im Rahmen der Arbeiten wurden 896 sicher bestimmte Arten und Unterarten aus insgesamt 104 Familien dokumentiert. Dies ist ein wichtiger Beitrag zur Erfassung der Biodiversität Westafrikas. Auch die Benennung der Arten wurde erhoben und analysiert: Für insgesamt 752 Arten konnte mindestens ein Vernakulärname erhoben werden. Im einzelnen wurden in den verschiedenen Dialekten erfaßt: Jelgoore (Sahel) 210 Vernakulärnamen, Jelgoore (Nordsudan) 259, Nommaare (Nordsudan) 348, Gu-urmaare (Südsudan) 97, Jugureere (Südsudan) 452. Anhand einer Analyse dieser Bezeichnungen sowie der bei den verschiedenen Fulbe-Gruppen gebräuchlichen Bezeichnungen der Umwelteinheiten wurde untersucht, wie bei Migration zwischen verschiedenen Naturräumen sprachlich mit der vorgefundenen neuen Umgebung und ihren Elementen (Landschaftseinheiten, Arten) umgegangen wird. Die Erhebungen zu Umweltwahrnehmung und -kenntnissen der Fulbe ergaben, daß diese die Standortansprüche zahlreicher Arten genau kennen und nach dem Prinzip der Indikatorarten anhand der Vegetation auf den Zustand des Bodens und sonstige Umweltbedingungen rückschließen. Gleichzeitig sind viele in der Umwelt ablaufenden Prozesse genau bekannt. Auch Faktoren, die die Böden von außen beeinflussen und unter deren Einwirkung es zu Degradationserscheinungen kommt, werden genau analysiert. Bezüglich der Degradation der Vegetation werden im Sahel mit Abstand die meisten zurückgehenden Arten genannt, die meisten von ihnen wichtige Nutzarten. Abschließend konnte durch den regionalen Vergleich der Weidepraktiken festgestellt werden, daß Umweltbedingungen und deren Wahrnehmung durch die Fulbe sich weniger als erwartet auf die Weidestrategien auswirken. Sie beeinflussen hauptsächlich Route und Dauer der Tageswanderungen. Ob und wie dagegen Transhumanz (saisonale Weidewanderungen) praktiziert wird, hängt mindestens ebenso sehr von sozialen und ökonomischen Faktoren wie von den ökologischen Bedingungen ab.
Proton-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) transports two electrons from NADH to membranal ubiquinone: in this process protons are translocated across the membrane, producing 40% of the total proton gradient between matrix side and intermembrane space. Mitochondrial complex I contains at least 46 subunits in mammals, and has a molecular weight of around 1000 kDa. Electronic microscopy analysis showed that complex I has an L-form, which consists of two domains: a peripheral “arm” (hydrophilic domain) and a membrane “arm” (hydrophobic domain). The peripheral domain, which protrudes into the matrix, contains one non-covalently bound flavin mononucleotide (FMN) and the iron-sulfur clusters N1a, N1b, N2, N3, N4 and N5 as redox active groups. They transport electrons from NADH to ubiquinone. Cluster N2 is supposed to be the immediate electron donor to ubiquinone by virtue of its highest and pH dependent redox midpoint potential (Em,7 –150 mV). The exact location of the tetra-nuclear cluster N2 is still object of discussion. The TYKY and the PSST subunits contain three binding motifs for tetranuclear clusters which are formed by twelve cysteins. In an effort to investigate the “ubiquinone reduction module” of complex I, in the first part of this work site directed mutagenesis of the TYKY and PSST subunits has been carried out. Mutant strains were characterised in terms of complex I content, catalytic activity and EPR signature of cluster N2. The second part of this work was aimed at developing a substrate inducible version of the internal alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (NDH2i). A substrate inducible NDH2i is expected to offer a “switch” between complex I activity dependent (no NDH2i activity) and independent (NDH2i activity) cell growth, by changing between activating and non-activating substrates. This strategy would allow the screening for two types of complex I mutants, which is a prerequisite for realising a random PCR mutagenesis of single subunits of complex I, that allows the production of a high number of point mutations in relatively short time. Y. lipolytica complex I deficiency mutant strains could be easily identified, by virtue of their inability to survive under complex I dependent growth conditions (no NDH2i activity). By this way, amino acids that have an important role for complex I structure or function could be identified by subsequent sequence analysis. Each of the twelve cysteines that form the above mentioned three binding motifs for iron-sulfur cluster have been mutagenised. In mutant mitochondrial membranes, no assembled complex I could be detected. From these data one may conclude that the mutagenised 6 SUMMARY 92 cysteines play an important role for complex I stability, or that are a prerequisite for complex I assembly in Y. lipolytica, but there is not direct evidence indicating that any of the four mutagenised residues acts as a ligand. Two aspartates in the PSST subunit, Asp-99 and Asp-115, were found to be essential for complex I catalytic activity. EPR spectroscopic analysis indicated that the electron transfer to N2 cluster was not blocked and implied that this was not the reason for the loss of catalytic activity. From these data it can be concluded that D99 and D115 play a vital role for complex I NADH:ubiquinone reductase activity, but are not ligands for cluster N2 and that their position is not close enough to the cluster to influence directly its electromagnetic environment. Three mutations, identified in the PSST and TYKY homologous subunits of patients affected with Leigh syndrome (V119M in PSST, P78L and R101H in TYKY) were reconstructed in the obligate aerobic yeast Y. lipolytica. This approach may help to understand the aetiology of the Leigh syndrome, in terms of the ability of complex I to oxidize NADH and to transport electrons. In fact, all three mutations showed effects on electron transport, reducing the VMax by about 50%. Mutant V119M in the PSST subunit, which had a lethal effect in two patients that were homozygous for this mutation, affects a fully conserved residue. Overall, the results from site directed mutagenesis carried out so far support the theory that the “catalytic core ” (N2 cluster and quinone binding site) of complex I has been evolved from the electron transfer module of the [Ni-Fe] hydrogenases. In fact, mutagenesis of residues that are fully conserved between complex I and [Ni-Fe] hydrogenases, showed dramatic effects on complex I in terms of assembly (cysteine mutants) or catalytic activity (D99-D115). Differently, changing aspartate 174 and glutamic acid 185 (not fully conserved, Fig 4.1A) had little or no effect on the Michaelis-Menten parameters and N2 EPR signal. In recent years Y. lipolytica has been developed as a yeast genetic system to study mitochondrial complex I. The present work introduced the promoter for the isocitrate lyase (pICL1) as a useful tool for the substrate selective expression of the internal version of the alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (pICL1-NDH2i). This allows to rescue complex I deficiencies “in vivo” selectively by growth on acetate (or ethanol) medium. The integration of the pICL1-NDH2i construct into the genome of Y. lipolytica and subsequent deletion of nuclear-coded subunits like PSST, TYKY and 49 kDa, would contribute to further develop this organism as a useful genetic model for studying subunits of mitochondrial complex I by site directed mutagenesis.
Charakterisierung der alternativen NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (NDH2) aus Yarrowia lipolytica
(2004)
Neben dem protonenpumpenden Komplex I (NDH-1) der Atmungskette besitzt die obligat aerobe Hefe Yarrowia lipolytica eine alternative NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH-2). Diese Enzyme, die in den Atmungsketten von Pflanzen, Pilzen und Bakterien vorkommen, bestehen aus nur einer Untereinheit, führen jedoch dieselbe Reaktion aus wie Komplex I, nämlich die Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon, wobei allerdings keine Protonen über die Membran transloziert werden. Nur peripher mit der Membran assoziiert, können alternative Dehydrogenasen entweder zur cytosolischen Seite (extern) oder zur Matrixseite (intern) orientiert sein. Y. lipolytica besitzt im Gegensatz zu anderen Ascomyceten nur eine einzige extern orientierte alternative Dehydrogenase mit einer vorhergesagten Masse von ca. 60 kD und einem nicht kovalent gebundenem Molekül FAD als Cofaktor. Durch Fusion des Leserasters mit der Präsequenz der 75 kD Untereinheit von Komplex I war die interne Expression des Enzyms (NDH2i) gelungen, die das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten ermöglichte. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die alternative Dehydrogenase von Y. lipolytica innerhalb ihrer natürlichen Membranumgebung charakterisiert. Das Enzym reagierte mit verschiedenen Chinonanaloga, wobei mit dem hydrophilen Q1 eine höhere katalytische Rate erzielt wurde als mit DBQ, das dem natürlich vorkommenden Q9 am ähnlichsten ist. Da hydrophobe Substrate fast ausschließlich in der Lipidphase der Membranen gelöst vorliegen, musste bei der Bestimmung von kinetischen Parametern (ebenso wie bei Komplex I) auf eine gleichbleibend große Membranphase im Messvolumen geachtet werden. Mit dem standardmäßig benutzten Substrat DBQ reagierte YLNDH2 nach einem Ping-Pong Reaktionsmechanismus. Dieser beschreibt eine abwechselnde Bindung der beiden Substrate, wobei das Enzym die Elektronen von NADH aufnimmt (E-FADH2) und an Ubichinon weitergibt (E-FAD); es existiert kein ternärer Enzym-Substrat Komplex. Gestützt durch Kristallstrukturen des analogen Enzyms QR1 mit NADPH bzw. mit Durochinon, liegt die Vermutung nahe, dass beide Substrate in ähnlicher Weise und sehr wahrscheinlich in der gleichen Bindungstasche binden. Ein Ping-Pong Reaktionsmechanismus wurde bereits für die NADH:DCPIP Oxidoreduktase Aktivität von zwei weiteren alternativen Enzymen postuliert, jedoch noch nie für ein physiologisches Substrat. Als bislang wirksamster Inhibitor für alternative Dehydrogenasen wurde 1-hydroxy-2-dodecyl-4(1H)chinolon (HDQ) entdeckt. HDQ hemmte NDH2 in Membranen aus Y. lipolytica mit einer I50 von 200 nM, was der 500fachen Hemmwirkung des gängig verwendeten Flavon auf das isolierte Enzym NDI1 von S. cerevisiae entspricht. Allerdings hemmte HDQ auch Komplex I mit einer I50 von 2 µM, ähnlich wie es bei Platanetin in Pflanzenmitochondrien der Fall war [Roberts et al., 1996]. Mit dem Ziel, ein polyklonales Antiserum gegen die native YLNDH2 zu generieren, wurde das Enzym in E. coli heterolog exprimiert. Die Expression führte zur Bildung von Einschlusskörpern, aus denen das rekombinante Enzym unter denaturierenden Bedingungen gereinigt und zur Immunisierung eines Kaninchens verwendet werden konnte. Das Antiserum kreuzreagierte mit der nativen und der internen Version von YLNDH2 und zeigte nur wenige unspezifische Bindungen. Es wurde gezeigt, dass Y. lipolytica Stämme ohne NDH2 und Komplex I mit NDH2i als einziger Dehydrogenase erzeugt werden konnten. In N. crassa war der Versuch, NDE2 und Komplex I gleichzeitig zu deletieren, gescheitert, was zu der Schlussfolgerung führte, dass sich die beiden Enzyme in diesem Organismus möglicherweise kompensieren könnten. Dies war in Y. lipolytica ausgeschlossen worden, da wahrscheinlich kein (oder nur unzureichender) Austausch zwischen matrixständigem und cytosolischem NADH stattfindet. Die zielgerichtete Mutagenese hochkonservierter Bereiche im offenen Leserahmen von YLNDH2 lieferte das eindeutige Ergebnis, dass die zweite der beiden beta-alpha-beta-Bindungsdomänen NADH binden muß, da sich der KM Wert für NADH bei Mutation des essentiellen sauren Restes E320 dratisch erhöhte. Alle Mutationen, die die Dinukleotid Bindungsdomäne I betrafen, die danach folgerichtig den Cofaktor FAD binden muß, führten zu einem vollständigen Verlust von NDH2. Dieselbe Zuordnung der Bindungsstellen war bereits von Björklöf et al. [2000] vorgeschlagen worden. Eine Chinonbindungstelle konnte durch Mutagenese der beiden apolar/aromatischen Bereiche der Sequenz nicht identifiziert werden. Die Modifikation des C-Terminus von NDH2i führte zu nicht mehr messbarer Aktivität und stark verringerter Expression des Enzyms in mitochondrialen Membranen (siehe Anhang 7.5.1.1). Es kann daher vermutet werden, dass der C-Terminus für die korrekte Faltung eine wichtige Rolle spielt, möglicherweise sogar bei der Membranassoziation, wie bei Rasmusson [1999] vorgeschlagen wurde. Interessant war in diesem Zusammenhang, dass die C-terminal modifizierte NDH2i trotzdem das Überleben von Komplex I Deletionsmutanten bzw. das Wachstum auf DQA ermöglichte. In Membranen, die einen unterschiedlichen Gehalt an NDH2, jedoch die gleiche Gesamtmenge an Protein enthielten, wurde eine unerwartete lineare Abhängigkeit zwischen KM und Vmax Werten beobachtet. Dieses Phänomen wurde mit dem Modell der externen Diffusionslimitierung beschrieben, die in ähnlicher Weise auch bei immobilisierten Enzymen auftritt. Danach wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion von YLNDH2 sowohl durch die kinetisch kontrollierte Rate, als auch durch die Transportrate des Ubichinons bestimmt, das aus der Membran heraus in die wässrige Umgebung des katalytischen Zentrums gelangen muss. Aus diesem Grund ist nicht nur die Maximalgeschwindigkeit, sondern auch die Michaelis Menten Konstante KM abhängig vom Gehalt des Enzyms in Membranen. Dies führte bei niedrig exprimierten mutanten Enzymen zur gleichzeitigen Abnahme von KM und Vmax. Eine externe Diffusionskontrolle der enzymatischen Reaktion wurde auch für Komplex I, dessen Reaktionszentrum im peripheren Arm vermutet werden kann, aber nicht für Komplex III aus S. cerevisiae, dessen Chinonbindungsstellen sich definitiv in hydrophober Umgebung befinden, beobachtet.
Das humane Genom besteht zu etwa 8% aus retroviralen Sequenzen. Davon sind ca. 1-2% dem humanen endogenen Retrovirus K (HERV-K) zuzuordnen. Das Virus ist mit ca. 30-50 Proviren und ca. 10.000 sLTRs im humanen Genom vertreten. HERV-K besitzt intakte ORFs für alle retroviralen Proteine und zusätzlich ein ORF für das akzessorische Protein Rec. Obwohl eine basale Transkription in verschiedenen Geweben nachgewiesen werden konnte, ist eine Expression von HERV-K Proteinen und Viruspartikeln nur in Keimzelltumoren nachgewiesen worden. In dieser Arbeit wurde die transkriptionelle Regulation des gewebespezifischen Promotors von HERV-K näher charakterisiert. Hierbei wurden regulatorisch wichtige Sequenzen mit Hilfe des Luziferase-Assays eingegrenzt. Transkriptionell sensitive Regionen wurden daraufhin im EMSA auf die Bindung von Transkriptionsfaktoren untersucht. Durch transiente Transfektionen von Luziferasereporterkonstrukten in verschiedenen Zelllinien stellte sich heraus, dass HERV-K LTRs in Keimzelltumorzellen aktiv sind, dass es aber auch inaktive LTRs gibt, die im Zuge der Evolution durch Punktmutationen ihre transkriptionelle Aktivität verloren haben. Aktive und inaktive LTRs unterscheiden sich durch Punktmutationen, die sich in verschiedenen Sequenzabschnitten häufen. Chimäre Konstrukte aus aktiven und inaktiven Sequenzabschnitten und gezielte Mutationen und Deletionen in aktiven HERV-K LTRs enthüllten verschiedene DNA-Bereiche, die transkriptionelle Sensitivität aufweisen. Die LTR-Bereiche bps 572-578, bps 757-798 und bps 809-823 waren im Aktivitäts-Assay besonders empfindlich gegenüber Mutation. In diesen Bereichen liegen zum einen GC/GT-Boxen, also Konsensussequenzen für die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3, zum anderen Konsensussequenzen für ein Inr und ein DPE. Das Binden von Sp1 und Sp3 auf den GC/GT-Boxen der bps 757-798 konnte durch eine EMSA-Analyse bewiesen werden. Der transkriptionell sensitive Bereich der bps 572-578 weist eine weitere putative GC/GT-Box auf. Die TATA-Box bei bp 532 zeigte sich unempfindlich gegenüber Mutation. Eine Beteiligung dieser Konsensussequenz am basalen Promotor wurde deshalb ausgeschlossen. Unterstützt durch die Ergebnisse einer 5’-RACE, ein Verfahren, dass den Transkriptionsstart eines bestimmten Gens bestimmen kann, konnte gezeigt werden, dass der basale HERV-K Promotor aus Konsensusequenzen für die Transkriptionsfaktoren Sp1 und Sp3 , einem Inr und einem DPE besteht. Sp1 und Sp3 sind ubiquitäre Transkriptionsfaktoren, die durch ihr Mengenverhältnis in einem bestimmten Gewebe oder durch posttranslationale Modifikationen unterschiedliche Auswirkungen auf die Transkription haben können. Diese Eigenschaften könnten zur Gewebespezifität von HERV-K beitragen. Die Core Promotor Komponenten Inr und DPE sind für die korrekte Positionierung von TFIID und damit der PolII verantwortlich. Des weiteren wurde eine starke Beteiligung des Testis-spezifischen Transkriptionsfaktors SRY an der Transkription von HERV-K belegt. Im Luziferase-Assay konnte ein SRY-Expressionsplasmid die Transkription eines aktiven LTRs in GH- wie auch in HeLa-Zellen steigern. Ein Indiz dafür, dass es sich um einen für die Transkription von HERV-K essentiellen Faktor handelt. Verschiedene SRY-Konsensussequenzen auf der HERV-K LTR machen eine Wirkung in cis wahrscheinlich, doch könnte auch in trans ein für die Transkription wichtiger Transkriptionsfaktor in seiner Expression verstärkt werden. Ebenfalls konnte bewiesen werden, dass epigenetische Mechanismen eine starke Rolle bei der Transkription von HERV-K spielen. Die Methylierung eines LTR-haltigen Luziferase-Reportervektors führte zum fast vollständigen Verlust der transkriptionellen Aktivität. Es bleibt abzuwarten, in welcher Weise die Schlüsselkomponenten Sp1, Sp3, SRY und Hypermethylierung des HERV-K Genoms zur Gewebespezifität von HERV-K beitragen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Modellierung der neuronalen Prozesse, die auditorischen Lokalisationsleistungen zugrunde liegen. Viele der hierzu aktuell diskutierten Modellvorstellungen lassen sich auf ein von L. Jeffress bereits in der Mitte des letzten Jahrhunderts vorgeschlagenes Netzwerkmodell zurückführen: Nach Jeffress werden interaurale Laufzeitunterschiede (ITDs) zwischen beiden auditorischen Pfaden in einem Netzwerk von Detektorneuronen (Koinzidenzdetektoren) ausgewertet. Systematische Laufzeitunterschiede resultieren aus der Architektur des Netzwerks, die sogenannte Delay-Lines realisieren soll. Trotz einer Reihe von Evidenzen für das im auditorischen Diskurs inzwischen als Paradigma geltende Modell, findet Kritik am Jeffress-Modell in jüngerer Zeit zunehmend Beachtung und Interesse. So argumentieren B. Grothe und D. McAlpine gegen die Übertragung des Delay-Line Modells auf die Verhältnisse bei Säugern. Zentrales Moment ihrer Kritik ist eine Afferenz der MSO aus einem weiteren Teilgebiet der Olive (MNTB). Wesentlicher Effekt der von der Projektion gebildeten inhibitorischen Synapse ist eine relative Verschiebung der Best-Delays der MSO-Zellen zur Präferenz contralateraler Delays. Damit besteht nicht nur zu der nach dem Jeffress-Modell notwendigen Aufteilung der Best-Delays ein Widerspruch, die ITDs liegen bei tiefen Frequenzen für kleine Säuger aufgrund deren geringer Kopfgröße außerhalb des Bereichs physiologisch auftretender Delays. In dieser Arbeit werden die Ergebnisse von Grothe und McAlpine durch Compartmental Modeling analysiert. Gegenüber einer Simulationsstudie aus den Gruppen von Grothe und McAlpine werden von uns durch explizite Modellierung der Dendriten zusätzliche Effekte der Inhibiton beschrieben. Wir stellen dar, wie die Topographie von Inhibiton und Excitation die Verarbeitungsprozesse in Bipolar-Zellen durch dendritische Low-Pass Filterung und Kontrastverst ärkung zwischen minimaler und maximaler Spikerate unterstützt. Unsere Ergebnisse können die empirisch nachgewiesene Verteilung excitatorischer (distaler) und inhibitorische (proximaler) Synapsen erklären. In der abschliessenden Analyse der von den Bipolar-Zellen generierten Spike Trains wird das von Grothe und McAlpine entworfene alternative ITD-Codierungsmodell auf der Basis von Ratencodes problematisiert: Bislang erklärt ihr Vorschlag nicht, wie organismische Lokalisationsleistungen auf der Basis weniger Spikes realisiert werden können.
In der vorliegenden Arbeit sollten mittels eines Hefe zweihybrid screens neue Interaktionspartner von ARVCF, einem cadherinbindenden armadillo repeat Protein, gefunden werden. Hierbei wurde aus einer cDNA-Bank differenzierender Myoblasten das Cytoskelettprotein Alpha-actinin als Bindungspartner des armadillo repeat Proteins identifiziert. Der Befund aus dem Hefesystem wurde durch Immunofluoreszenzaufahmen, in welchen gezeigt wurde dass die beiden Proteine kolokalisieren, bestätigt. Auch eine Coimmunopräzipitation bestätigte eine Interaktion der beiden Proteine. Weiterhin konnte eine direkte Interaktion von ARVCF mit Alpha-actinin in in vitro Pull-Down assays gezeigt werden, wobei eine Eingrenzung der Bindungsregion von ARVCF für Alpha-actinin jedoch nicht möglich war. Als nächstes wurde ARVCF im Rahmen dieser Arbeit mittels Computeranalysen auf potentielle Phosphorylierungsstellen hin untersucht. In in vitro Kinase assays wurde eine Phosphorylierung des Proteins durch die Proteinkinase C (PKC) festgestellt. Es konnte gezeigt werden, dass sich die subzelluläre Lokalisation von ARVCF nach Behandlung der Zellen mit den PKC stimulierenden Cytokinen TNF-alpha und EGF, sowie mit dem Phorbolester PMA ändert. Hierbei wurde ein Ablösen des Proteins von der Plasmamembran und eine Lokalisation in cytoplasmatischen Aggregaten beobachtet. Dieser Effekt erwies sich als Zelltypunabhängig und Spezies übergreifend. Es konnte gezeigt werden, dass der N-Terminus der Splicevariante 5'alt ARVCF notwendig und ausreichend für den beobachteten Effekt ist. p120(ctn), das dem ARVCF am nächsten verwandte Protein, zeigte bei einer Behandlung von Zellen mit PMA oder den oben genannten Cytokinen keinen Effekt in Bezug auf Lokalisationsänderung. Ebenso wenig konnte eine Änderung der Lokalisation nach Behandlung für die Proteine Beta-catenin sowie E-cadherin beobachtet werden. Der erhaltene Effekt nach Stimulation der Zellen war somit spezifisch für ARVCF und konnte nicht für ein anderes hier untersuchtes Catenin oder Cadherin gezeigt werden. Eine stark abgeschwächte Cadherinbindung von ARVCF nach Inkubation der Zellen mit den Cytokinen oder PMA konnte im MOM-recruitment assay beobachtet werden. Auch dieser Effekt erwies sich als ARVCF spezifisch und konnte nicht mit p120(ctn) gezeigt werden. Weiterhin wurden chimäre Moleküle mit dem N-Terminus von ARVCF und dem Rest von p120(ctn) und vice versus hergestellt. Hierbei konnte die abgeschwächte Cadherinbindung im MOM-recruitment assay durch den N-Terminus von ARVCF auf p120(ctn) übertragen werden. Die chimären Moleküle ARVCF/p120(ctn) fanden sich nach Behandlung von Zellen nicht mehr in Aggregaten wieder, waren aber über das Cytoplasma verteilt. Es konnte kein Effekt auf Stimulation der Zellen mit dem chimären Protein p120(ctn)/ARVCF gezeigt werden. Durch diese Art von "gain of function" Experiment konnte noch einmal die Wichtigkeit und Spezifität des N-Terminus von ARVCF in Bezug auf die Reaktion auf PMA- oder Cytokinstimulation gezeigt werden. Auch die Punktmutante T50A, bei welcher eine potentielle Phosphorylierungsstelle der PKC von Threonin nach Alanin mutiert war, löste sich nach Stimulation der Zellen von den Cadherinen, wie im MOM-recruitment assay gezeigt werden konnte. Allerdings lokalisierte diese Mutante nach Behandlung der Zellen nicht in Aggregaten, sondern, wie zuvor schon das chimäre Protein ARVCF/p120(ctn), über das Cytoplasma verteilt. So konnte gezeigt werden, dass es sich bei der abgeschwächten Cadherinbindung und bei der Aggregatbildung um zwei klar voneinander trennbare Eigenschaften des Moleküls handelt.
Protease-aktivierbare Retroviren bieten die Möglichkeit des gezielten Gentransfers in solche Tumorzellen, die an der Zelloberfläche proteolytisch aktive Proteasen, wie beispielsweise Matrix Metalloproteasen (MMP), exprimieren. Hierfür wird zunächst der Zelleintritt der Retroviren durch eine mit den Hüllproteinen fusionierte Blockierungsdomäne verhindert. Zwischen dieser Blockierungsdomäne und dem Hüllprotein befindet sich ein für eine zelluläre Protease fungierender Substratlinker, worüber die Blockierung entfernt und der natürliche Infektionsmechanismus der Retroviren wieder hergestellt wird. In Bezug auf die Tumortherapie mittels eines solchen Gentransfers ist es jedoch unmöglich vorherzusagen, welches Protease- Substrat für einen bestimmten Tumortyp am besten geeignet ist. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit retrovirale Protease-Substrat-Bibliotheken entwickelt, um erstmalig die Substrate der tumorassoziierten MMPs in lebenden Tumorzellen zu selektionieren und damit verbunden MMP-aktivierbare Retroviren mit verbesserten molekularen Eigenschaften für den gezielten Gentransfer zu evolvieren. Hiefür wurden, ausgehend von einem Protease-aktivierbaren Retrovirus, welches als Substratlinker das MMP-Standardsubstrat P-L-G-L-W-A präsentiert, Retroviren erzeugt, in denen dieses Substrat kombinatorisch diversifiziert wurde. In einer ersten retroviralen Protease-Substrat-Bibliothek wurde zunächst an drei Stellen zu P-X-G-L-X-X unter Ausschluss der Aminosäure Arginin diversifiziert, um die Selektion durch Proprotein-Konvertasen wie Furin zu vermeiden. Anschließend erfolgte die Selektion der Virus-Bibliothek in der Modell-Tumorzelllinie HT1080, wofür hier das entsprechende Protokoll etabliert wurde. Die Substratlinker der am häufigsten selektionierten Retroviren enthielten die beiden Konsensusmotive P-QG- L-Y-[Q/K] und P-Q-G-L-Y-[A/S]. Zur Identifizierung der optimalen Aminosäuren an allen sechs Positionen des Substrates wurden in einer zweiten Bibliothek die variierten Positionen auf Grundlage der selektionierten Konsensusmotive fixiert und die zuvor konstanten Positionen zu X-Q-X-X-Y-[Q/A] diversifiziert. Die aus dieser Bibliothek selektionierten Retroviren enthielten das Konsensusmotiv P-Q-G-[L/I/V]-Y-[Q/A], womit die zuvor selektionierten MMP-aktivierbaren Retroviren bestätigt wurden. Die biochemische Charakterisierung von mit den selektionierten Substratlinkern rekonstituierten Retroviren zeigte, dass ihre Substratlinker eine bemerkenswerte Verbesserung der Spaltung durch MMP-2 und eine erhöhte Inkorporation der dazugehörigen Hüllproteine in die Partikel aufwiesen. Außerdem ermöglichten die selektionierten Substratlinker den entsprechenden Retroviren sich schneller innerhalb der Zellpopulation auszubreiten, ohne dabei die Abhängigkeit von der MMP-Aktivierung zu verlieren. Darüber hinaus konnte sowohl die Kinetik des Zelleintritts bis zu 10-fach als auch die Infektiosität bis zu 1000-fach gegenüber dem parentalen Virus, das den Standard-Substratlinker trug, gesteigert werden. Letztendlich waren hierfür nur zwei selektionierte Aminosäureaustausche gegenüber dem MMP-Standardsubstrat verantwortlich, nämlich Glutamin (Q) und Tyrosin (Y), die zu dem Motiv P-Q-G-L-Y-A führten. Ausschlaggebend für die beschriebenen Selektionen waren die mehrfache Abdeckung der kombinatorischen Vielfalt der Substratlinker auf Partikel-Ebene bereits vor Selektion sowie die langsame Erhöhung des angelegten Selektionsdrucks während der Selektion. Dadurch konnte eine Deletion des kodierenden Bereichs der Blockierungsdomäne (EGF) im Virusgenom vermieden werden. Als treibende Kraft der Selektion stellte sich die proteolytische Aktivierung der selektionierten Retroviren an der Zelloberfläche heraus. Die Ergebnissen führen schließlich zu einem Modell der MMP-Aktivierung EGF-blockierter Retroviren. Danach binden die Partikel an die EGF-Rezeptoren der Zelloberfläche und gelangen so in die räumliche Nähe des MMP-Aktivierungskomplexes. Daraufhin werden sie proteolytisch aktiviert und infizieren die Zielzellen. Die hier selektionierten Substratlinker bzw. die entsprechenden Viren sind in Bezug auf die proteolytische Aktivierung optimal an die gewählte Tumorzelllinie angepasst.
Ligands of Iron-Sulphur Cluster N2: In this work the ubiquinone reducing catalytic core of NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from Y. lipolytica was studied by a series of point mutations replacing conserved histidines or arginines in the 49-kDa subunit. Although the missing 4th ligand of cluster N2 could not be found in the 49-kDa subunit of complex I, it was clearly demonstrated that iron-sulphur cluster N2 resides directly on the interface between the PSST and 49-kDa subunits. The results presented in this work show that residues in the 49-kDa subunit have strong influence on this redox centre and also on catalytic activity. The strong influence of Arg-141 and His-226 residues in 49-kDa subunit on this cluster can be deducted from complete loss of N2 signals in EPR spectra such as in case of mutants H226A and R141A. In the case of mutant H226M the EPR signal from cluster N2 was shifted and cluster N2 even lost the pH dependence of its redox midpoint potential and became more similar to the other so called 'isopotential' clusters. Specifically in the case of mutants R141M and R141K the characteristic signature of cluster N2 became undetectable in EPR spectra. However, specific dNADH:DBQ oxidoreductase activity that could be inhibited with the specific complex I inhibitors DQA and rotenone was not absolutely abolished but rather reduced. These reductions in complex I activity did not correspond to similar reductions in the specific EPR signal of cluster N2 as it was observed in the His-226 mutant series. No indications could be found that these mutations had modified the magnetic properties of cluster N2, resulting in different EPR spectra. From these observations it could be concluded that both mutants R141K and R141M virtually or entirely lack iron-sulphur cluster N2. The rates in complex I activity could be reconciled with electron transfer theory: After removal of a single redox centre in a chain, electron transfer rates are predicted to be still much faster than steady-state turnover of complex I. These results from mutants R141K, R141M and also the result from mutant H226M that protons are being pumped even if the redox midpoint potential of cluster N2 is not pH dependent questions the prominent role in the catalytic mechanism of complex I that has been ascribed to cluster N2. Histidine 91 and 95 were found to be absolutely essential for activity of complex I since in both mutants complex I was fully assembled and artificial NADH:HAR activity was parental whereas complex I specific dNADH:DBQ activity was abolished. The signal from cluster N2 in EPR spectra was parental for all His-91 and -95 mutants. Mutations at the C-terminal arginine 466 affected ubiquinone affinity and inhibitor sensitivity but also destabilised complex I. All these results provide further support for a high degree of structural conservation between the 49-kDa subunit of complex I and the large subunit of water soluble [NiFe] hydrogenases. Remodelling of Human Pathogenic 49-kDa Mutations in Y. lipolytica: Y. lipolytica has been proven a good system for studying complex I properties and thus also for studying defects that occur in humans. In this work pathogenic mutations in the 49-kDa subunit of complex I were recreated and studied. The P232Q mutant showed non-assembly of complex I and this is probably the cause why this mutation was lethal in patients. The mutants R231Q and S416P were parental for the content, artificial and also specific complex I activity, Km for DBQ and IC50 for DQA. From these results we can conclude that these two residues Arg-228 and Ser-413 in mammalian cells have specific structural importance for the 49-kDa subunit even if they are not directly involved in catalytic process.
Der metasomale Lichtsinn des Skorpions : eine immunhistologische und feinstrukturelle Untersuchung
(2003)
Extraretinale Photorezeption im Bauchmark des Skorpions war seit mehr als 30 Jahren aus elektrophysiologischen und verhaltensbiologischen Untersuchungen bekannt. Von den zugehörigen Sinneszellen waren aber weder ihre Struktur und Lage noch ihre neuronale Verschaltung bekannt. Mit immunhistologischen und feinstrukturellen Untersuchungen konnten in dieser Arbeit in den letzten Abdominalganglien des Skorpions Paruroctonus mesaensis Zellgruppen identifiziert werden, die vermutlich das strukturelle Korrelat dieser extraretinalen Photorezeption, des metasomalen Lichtsinns (ML), sind. In meiner Arbeit konnten folgende Befunde erhoben werden: Immunhistologische Erkenntnisse: - In den metasomalen Ganglien des Skorpions gibt es wenige Zellen, die immunhistologisch mit Antikörpern gegen Proteine der Phototransduktionskaskade (Opsin, Transducin und Arrestin) reagieren. - Der metasomale Lichtsinn ist kein geschlossenes Sinnesorgan sondern ist aus mehreren Zellclustern mit jeweils etwa 5-7 spindelförmigen kleinen Zellen zusammengesetzt. - Diese ML-Zellgruppen sind bilateralsymmetrisch auf der Ventralseite der Ganglien jeweils an den Übergängen in die Konnektive angeordnet. - Die Zellen sind - wie alle Invertebraten-Photorezeptoren - histaminerg. Ihre kurzen afferenten Axone enden ipsilateral im gleichen Ganglion auf ebenfalls histaminergen Inteneuronen, die bis in das Unterschlundganglion reichen. Feinstrukturelle Erkenntnisse: - Nach den bisherigen Untersuchungen haben alle ML-Zellen die gleiche Feinstruktur. Das Cytoplasma ist sehr reichhaltig mit Mitochondrien und rauhem endoplasmatischen Retikulum gefüllt, was erkennen lässt, dass diese Zellen hochaktiv sind. Sie haben kein Schirmpigment. - Sie besitzen einen länglichen, häufig gelappten Zellkern mit viel Heterochromatin. - Besonders charakteristisch für die ML-Zellen sind Lysosomen, die rhabdomere Abbauprodukte beinhalten. Diese Abbauprodukte verändern sich in Abhängigkeit vom Licht und unter der Kontrolle der inneren Uhr. Es lassen sich die für Arthropodenaugen charakteristischen Abbaustufen für diese exogenen und endogenen Abbauvorgänge feststellen. - An der apikalen Seite der potentiellen Photorezeptorzellen befinden sich lange rhabdomere Mikrovilli, die sich unregelmäßig um eine Lakune winden. Gemeinsam mit Nachbarzellen bilden diese Mikrovilli eine Haube, die von einer Kapsel umschlossen wird. - Das andere Zellende setzt sich in ein kurzes Axon fort. - Efferente Fasern innervieren die afferenten Endigungen der Rezeptorzellen nahe an ihren Terminalen. - Als Besonderheit ist in den ML-Zellen eine einzelne intrazelluläre Cilie zu finden. Sie ist meist zwischen dem Zellkern und einem Golgi-Apparat lokalisiert. Eine potentielle Funktion des Metasomalen Lichtsinns im Skorpion wird insbesondere im Zusammenhang mit der Perzeption natürlicher Zeitgeberreize durch den retinalen und extraretinalen Photorezeptorkomplex.
Durch Integration beziehungsweise Deletion einzelner oder mehrerer Gene der Carotinoidbiosynthese wurden Cyanobakterien-Transformanten mit einem vom Wildtyp abweichenden Carotinoidgehalt oder einer veränderten Carotinoidzusammensetzung hergestellt. Anhand dieser Transformanten wurden die Auswirkungen der geänderten Carotinoidkomposition auf die Photosyntheseleistung und besonders auf den Schutz der Photosynthese vor Schädigungen durch Starklicht untersucht. Die Integration des Zeaxanthin Epoxidase-Gens aus Gentiana lutea in das Genom von Synechococcus PCC 7942 PIM8 führte zu einer Transformante Synechococcus PCC 7942 PIM8 pFP1ZE in der erstmalig die am Xanthophyllzyklus der höheren Pflanzen beteiligten Carotinoidepoxide Violaxanthin und Antheraxanthin gebildet wurden. Diese beiden zusätzlich gebildeten Carotinoidepoxide hatten keine Auswirkungen auf die Photosyntheseleistung und die Quantenausbeute von Synechococcus PCC 7942 PIM8 pFPlZE unter Schwachlichtbedingungen. Allerdings ging in dieser Transformante die maximale Photosyntheseleistung nach Inkubation im Starklicht deutlich stärker zurück als in der Kontroll-Transformante. Diese erhöhte Sensitivität gegenüber Starklicht korreliert mit dem signifikant niedrigeren Zeaxanthingehalt dieser Transformante. Die wichtige Schutzfunktion von Zeaxanthin vor Starklichtschädigungen des Photosyntheseapparates wurde durch Experimente mit Synechocystis PCC 6803 bestätigt. Es wurden durch Inaktivierung des Ketolase-Gens, des b-Carotin Hydroxylase-Gens bzw. beider Gene zusammen, Mutanten hergestellt. die entweder kein Echinenon, kein Zeaxanthin oder keines der beiden Carotinoide synthetisieren konnten. Darüber hinaus wurde in den b-Carotin Hydroxylase-defizienten Mutanten ein nicht hydroxyliertes Myxoxanthophyllderivat anstelle von Myxoxanthophyll gebildet. In den Zeaxanthin defizienten Synechocystis Mutanten ist die Photosynthese nach Inkubation in Starklicht deutlich stärker inhibiert als im Wildtyp und der Mutante ohne Echinenon. Besonders empfindlich gegenüber Starklicht erwiesen sich die Kulturen ohne Zeaxanthin und Myxoxanthophyll, wenn in Gegenwart von Methylenblau oder Methylviologen verstärkt 1O2 bzw. O2.-, H2O2 und OH. generiert wurden, In diesen Mutanten war ein drastisch erhöhter Chlorophyll- und Carotinoidabbau messbar. Um den verstärkten Abbau an Carotinoiden unter Starklichtbedingungen zu kompensieren, muss die Carotinoidbiosynthese unter diesen Bedingungen erhöht werden. In Hemmstoffversuchen konnte nachgewiesen werden, dass die Bildung von Phytoen, dem ersten Carotinoid im Syntheseweg, unter Starklichtbedingungen erhöht ist. Messungen der Transkriptmenge aller Carotinoidgene aus Synechococcus zeigten, dass die Gene der Phytoen Synthase (crtB), der Phytoen Desaturase (crtP), z-Carotin Desaturase (crtQb) sowie der b-Carotin Hydroxylase (crtR) im Starklicht hochreguliert werden. Die Gene der Lycopin lsomerase (crtH) und der Lycopin Zyklase (crtL) werden nicht auf Ebene der Transkription reguliert. Während die Erhöhung der Transkriptmenge von crtR bereits nach 15 min erfolgt und somit bereits nach 60 min eine deutlich gesteigerte Umwandlung von b-Carotin in das antioxidativ wirksamere Zeaxanthin nachgewiesen wurde, erfolgt ein Anstieg der Transkriptmenge der Gene crtB, crtP und crtQb erst nach ca. 60 min und führt damit erst wesentlich später zu einer generellen Steigerung der Carotinoidbiosynthese, um den verstärkten Carotinoidabbau im Starklicht zu kompensieren. lnkubationen von Synechococcus in Gegenwart von Substanzen, die den Redoxzustand der photosynthetischen Elektronentransportkette oder des Thioredoxinsystems modulieren, zeigten, dass nicht Licht direkt der auslösende Reiz für die Hochregulation der Carotinoidsynthese im Starklicht ist. Ein funktionierender photosynthetischer Elektronentransport ist für eine Hochregulation der Carotinoidbiosynthese erforderlich. Weder die Reduktion des Plastochinonpools noch die der zellulären Thioldisulfid-Gruppen erwiesen sich als Signal, dass in Synechococcus PCC 7942 zur Hochregulation der Carotinoidbiosynthese im Starklicht führt. Möglicherweise ist der Redoxzustand des Cytochromb6/f-Komplexes oder eine der unter Starklichtbedingungen verstärkt gebildeten ROS, wie z. B. O2- oder OH, der Reiz, der eine Steigerung der Carotinoidbiosynthese auslöst.
Zahnwale sind die einzige Säugetiergruppe, die umfassend an ein Leben im Wasser angepasst ist und dabei ein aktives Sonarsystem zur Orientierung nutzt. Wahrscheinlich produzieren alle Zahnwalarten sonische oder ultrasonische Klicklaute, deren Echos die Tiere zu einem drei-dimensionalen "akustischen Bild" zusammensetzen. Im Gegensatz zu den meisten anderen Säugetieren produzieren Zahnwale diese Laute im Nasen-Komplex durch einen pneumatisch betriebenen Mechanismus. Jedoch spielt auch der Kehlkopf dabei eine wichtige Rolle, indem er den nötigen Luftdruck in der Nase erzeugt. Die Ergebnisse werden in Bezug auf die physikalischen Voraussetzungen eines Bio-Sonars in einer aquatischen Umwelt interpretiert. Um die morphologischen Eigenschaften (Struktur, Form, Topographie) der Organe im Kopf verschiedener Zahnwalarten vollständig zu erfassen, wurden diese mittels Computertomographie und Magnetresonanztomographie gescannt. Daraufhin wurden die Köpfe makroskopisch präpariert und histologische Schnitte von Gewebeproben angefertigt. Schließlich wurden die Ergebnisse durch digitale dreidimensionale Rekonstruktionen vervollständigt. Diese Studie basiert zum größten Teil auf der Untersuchung von Schweinswalen (Phocoena phocoena) und Pottwalen (Physeter macrocephalus). Zum Vergleich wurden fetale und postnatale Individuen anderer Zahnwalarten herangezogen wie Delphinartige (Delphinus delphis, Stenella attenuata, Tursiops truncatus), Flussdelphinartige (Pontoporia blainvillei, Inia geoffrensis) und der Zwergpottwal (Kogia breviceps). Im Allgemeinen konnte durch die morphologischen Daten dieser Studie die einheitliche "phonic lips-Hypothese der Schallproduktion bei Zahnwalen, wie sie von Cranford, Amundin und Norris [J. Morphol. 228 (1996): 223-285] aufgestellt wurde, bestätigt werden. Diese Hypothese beschreibt eine ventilartige Struktur in der Nasenpassage, den sogenannten "monkey lips/dorsal bursae complex" (MLDB) als Schallgenerator. Der pneumatische Mechanismus lässt die beiden Hälften des MLDB aufeinanderschlagen und erzeugt damit die initiale Schallschwingung im Gewebe ("phonic lips"). Diese Vibration wird über die Melone, einen großen Fettkörper in der vorderen Nasenregion der Zahnwale, fokussiert und in das umgebende Wasser übertragen. Die akzessorischen Nasensäcke und spezielle Schädel- und Bindegewebestrukturen können zu der Fokussierung beitragen. Obwohl die Echolotsignale der Schweinswale sehr spezialisiert zu sein scheinen, weisen die Übereinstimmungen in der Topographie und in der Form der Nasenstrukturen im Vergleich zu Delphinen und Flussdelphinartigen (Pontoporia und Inia) auf eine ganz ähnliche Funktion der Nase bezüglich der Produktion und Emission von Echolotschall hin. Allerdings gibt es einige anatomische Besonderheiten im Nasenkomplex des Schweinswals, welche die besondere Pulsstruktur der Sonarsignale erklären könnte. Diese werden in der Dissertation diskutiert. Bei einem Vergleich der Nasenmorphologie der Pottwale einerseits und der nicht-pottwalartigen Zahnwale andererseits fällt vor allem der Grad der Asymmetrie ins Auge. Im Gegensatz zu dem oben für Delphine und Schweinswale beschrieben Mechanismus betreiben Pottwale die Schallproduktion an den "monkey lips" mit Luft, die im rechten Nasengang unter Druck gesetzt wird (und nicht im nasopharyngealen Raum). Zudem könnte durch Änderung des Luftvolumens im rechten Nasengang die Schalltransmission zwischen den Fettkörpern, und somit die Schallemission, kontrolliert werden. In diesem theoretischen Szenario fungiert der breite rechte Nasengang als eine Art "akustische Schranke", welche zwischen zwei verschiedenen Modi der Klickproduktion wechselt: Der erste Modus mit luftgefülltem Nasengang führt zur Produktion der Kommunikationsklicks ("coda clicks") und der zweite Modus zur Aussendung von Echolotklicks, wenn der Nasengang kollabiert ist. Somit scheinen die zentrale Position und die nahezu horizontale Orientierung des rechten Nasengangs im Kopf der Pottwale als Schnittstelle (Schranke) zwischen den beiden großen Fettkörpern mit dem Mechanismus der Schallproduktion bei veränderten Luftvolumina korreliert zu sein. Die hier beschriebenen und andere Ergebnisse dieser Dissertation deuten darauf hin, dass die Gestalt und das Ausmaß der Nasenasymmetrie nicht mit der systematischen Zugehörigkeit der jeweiligen Art korrelieren, sondern durch den jeweiligen Typus des Sonarsystems als Ausdruck einer bestimmten ökologischen Anpassung bedingt sind. Bei Zahnwalen ist der Kehlkopf charakterisiert durch eine rostrale Verlängerung des Kehldeckels und der beiden Stellknorpel, die ein gänseschnabelartiges Rohr bilden, das von einem starken Sphinktermuskel umrundet und dabei in Position gehalten wird. Auf diese Weise ist das Atemrohr vollständig vom Digestionstrakt getrennt. Aus anatomischer Sicht ist es wahrscheinlich, dass die Schallerzeugung bei Zahnwalen durch eine Kolbenbewegung des Kehlkopfes in Richtung der Choanen zustande kommt, wodurch der Luftdruck im Nasenbereich erzeugt wird. Die Kontraktion des Sphinktermuskels als einem muskulösen Schlauch erzeugt wahrscheinlich die größte Kraft für diese Kolbenbewegung. Jedoch dürften die Muskelgruppen, die den Kehlkopf und das Zungenbein am Unterkiefer und an der Schädelbasis aufhängen, signifikant zur Druckerhöhung beitragen.
Der Elektronentransfer von NADH zu Sauerstoff ist ein essentieller Bestandteil im Energiehaushalt der Zelle und wird durch transmembrane Enzymkomplexe vermittelt. Hohe Geschwindigkeit und Spezifität dieser Reaktionen sind dabei von großer Bedeutung. In der Atmungskette von Paracoccus denitrificans und Thermus thermophilus wird Sauerstoff durch Cytochrom c Oxidasen umgesetzt. Beide Enzymkomplexe erhalten die für diese Reaktion notwendigen Elektronen von einem Cytochrom c552 in einer sehr schnellen bimolekularen Reaktion bei hoher Selektivität für das Partnerprotein. Hauptziel dieser Arbeit war es, lösliche Module der elektronenakzeptierenden CuA-Domäne der Cytochrom c Oxidasen zu generieren, das Kupferzentrum zu rekonstituieren und die Proteine für Wechselwirkungsstudien mit den Cytochrom c-Partnern zugänglich zu machen. Die Charakterisierung der Elektronentransferreaktionen erfolgte durch stopped-flow Spektroskopie und ermöglichte die Bestimmung der bimolekularen Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten unter verschiedenen Ionenstärkebedingungen. Ein Vergleich zwischen dem mesophilen Reaktionspaar aus P. denitrificans mit dem thermophilen aus T. thermophilus zeigte die unterschiedlichen Interaktionsmechanismen auf. Während die Reaktion in T. thermophilus weitgehend auf Ladungsinteraktionen verzichtet, wurde für die Reaktanden aus P. denitrificans eine Beteiligung von 2 - 3 Ladungen mit entgegengesetztem Vorzeichen auf jedem Protein festgestellt. Die Interaktionen wurden weiterhin durch chemical-shift-perturbation Experimente mittels NMR-Spektroskopie charakterisiert. Durch Isotopenanreicherung des Cytochroms c552 aus P. denitrificans konnten für dieses Protein Aminosäurereste identifiziert werden, die an einer direkten Bindung mit dem CuA-Partnerprotein beteiligt sind. In einem ähnlichen Ansatz wurde auch die Interaktionsfläche der löslichen CuA-Domäne aus T. thermophilus charakterisiert. Für das Cytochrom c552 aus P. denitrificans konnte gezeigt werden, daß bei direkten Kontakten zwischen den Proteinen fast keine Ladungen beteiligt sind und primär ungeladene Reste die Wechselwirkung dominieren. Ein ähnliches Bild wurde auch für die Interaktion der löslichen CuA-Domäne aus T. thermophilus mit ihrem Substrat ermittelt. Für die lösliche CuA-Domäne aus P. denitrificans konnte aufgrund der geringen Stabilität keine Zuordnung durchgeführt werden, so daß eine Charakterisierung der Interaktionsfläche nicht möglich war. Weiterhin wurde ein für T. thermophilus bisher nicht beschriebener Komplex III aufgrund von Sequenzdaten identifiziert. Eine lösliche Domäne des membranständigen Cytochrom c1 wurde in E. coIi heterolog exprimiert, aufgereinigt und charakterisiert. Die Elektronentransferkinetiken zum Cytochrom c552 wurden durch stopped-flow Spektroskopie aufgenommen, und das Cytochrom c1 wurde als effizienter Elektronendonor für das Protein identifiziert. Für spätere Mutageneseansätze wurde ein Plasmid-basiertes Expressionssystem für das extrem thermophile Eubakterium T. thermophilus etabliert, um Schwierigkeiten, die bei der Expression von Cofaktor-tragenden Membranproteinen auftreten können, zu umgehen. Durch Expression eines löslichen c-Typ Cytochroms und der ba3-Cytochrom c Oxidase in T. thermophilus konnte gezeigt werden, daß dieses homologe Expressionssystem funktional ist und damit rekombinante Proteine exprimiert werden können. Durch die Konstruktion von Histidin-Tags konnte die Aufreinigung der Proteine erleichtert werden und eine notwendige Abgrenzung von chromosomal kodierten Wildtyp-Formen erfolgen.
The endothelin B receptor belongs to the rhodopsin-like G-protein coupled receptors family. It plays an important role in vasodilatation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. During the course of this work, the production of recombinant human ETB receptor in yeast, insect and mammalian cells was evaluated. A number of different receptor constructs for production in the yeast P. pastoris was prepared. Various affinity tags were appended to the receptor N-and C-termini to enable receptor detection and purification. The clone pPIC9KFlagHisETBBio, with an expression level of 60 pmol/mg, yielded the highest amount of active receptor (1.2 mg of receptor per liter of shaking culture). The expression level of the same clone in fermentor culture was 17 pmol/mg, and from a 10L fermentor it was possible to obtain 3 kg of cells that contained 20-39 mg of the receptor. For receptor production in insect cells, Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with the recombinant baculovirus pVlMelFlagHisETBBio. The peak of receptor production was reached at 66 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed 30 pmoL of active receptor /mg of membrane protein. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing the active receptor was evaluated. N-dodecyl-beta-D-maltoside (LM), lauryl-sucrose and digitonine/cholate performed best, and LM was chosen for further work. The ETB receptor was produced in mammalian cells using the Semliki Forest Virus expression system. Radioligand binding assays on membranes from CHO cells infected with the recombinant virus pSFV3CAPETBHis showed 7 pmol of active receptor /mg of membrane protein. Since the receptor yield from mammalian cells was much lower than in yeast and insect cells, this system was not used for further large-scale receptor production. After production in yeast and insect cells, the ETB receptor was saturated with its ligand, endothelin-1, in order to stabilize its native form. The receptor was subsequently solubilized with n-dodecyl-beta-D-maltoside and subjected to purification on various affinity matrices. Two-step affinity purification via Ni2+-NTA and monomeric avidin proved the most efficient way to purify milligram amounts of the receptor. The purity of the receptor preparation after this procedure was over 95%, as judged from silver stained gels. However, the tendency of the ETB receptor produced in yeast to form aggregates was a constant problem. Attempts were made to stabilize the active, monomeric form of the receptor by testing a variety of different buffer conditions, but further efforts in this direction will be necessary in order to solve the aggregation problem. In contrast to preparations from yeast, the purification of the ETB receptor produced in insect cells yielded homogeneous receptor preparations, as shown by gel filtration analysis. This work has demonstrated that the amounts of receptor expressed in yeast and insect cells and the final yield of receptor, isolated by purification, represent a good basis for beginning 3D and continuing 2D crystallization trials.
In der vorliegenden Arbeit wurden Tauben daraufhin trainiert, in einer Außenvoliere verstecktes Futter zu finden. Nachdem die Tauben diese Aufgabe erlernt hatten, fand keine weitere Verbesserung des Wiederfindeverhaltens statt. Die komplexe Aufgabe, drei aus 48 möglichen Bechern auszuwählen, wurde mit einer überraschend hohen Präzision von den Tauben gelöst. Zudem erwies sich das Ortsgedächtnis als zeitlich äußerst stabil. Die Ergebnisse meiner Arbeit belegen zum ersten mal, dass Brieftauben (Columba livia) in der Lage sind, sich über einen Zeitraum von mindestens 5 Jahren einmal erlernte Orte zu merken, ohne dabei vermehrt Fehler zu machen. Unterschiedliche Fehlerquoten konnten infolge der unterschiedlichen Anordnung der Futterverstecke gefunden werden. Dabei war es für Tauben offensichtlich schwieriger, Futterverstecke in einer flächigen Anordnung aufzusuchen. Die Taubengruppen, deren Zielbecher in einer Reihe angeordnet waren, zeigten eine stärkere Reihenfolgepräferenz beim Aufsuchen der Futterverstecke. Diese Reihenfolgepräferenz führte zu einer geringeren Fehlerquote. Der Sonnenkompass scheint beim Aufsuchen der Futterverstecke für die Brieftauben eine wichtige Rolle zu spielen. Alle vier untersuchten Taubengruppen reagierten auf eine Verstellung der inneren Uhr mit einer Abweichung ihrer Richtungspräferenzen in die erwartete Richtung. Dabei sind Unterschiede in der Stärke dieser Abweichung zwischen den Gruppen und zwischen einzelnen Individuen feststellbar. Diese Abweichung ging wieder zurück, sobald die innere Uhr der Tiere wieder dem natürlichen Tagesrhythmus angepasst war. Diese Beobachtung kann als weiterer Beleg für das Nutzen des Sonnenkompasses in der Voliere zum Auffinden von Futterorten gewertet werden. Aber auch die Landmarken in der Umgebung der Versuchsvoliere werden als Orientierungsparameter von den Tauben genutzt. So erhöhte sich die Fehleranzahl deutlich, wenn die Voliere nach außen hin abgeschirmt wurde. Dieser Effekt verstärkt sich, wenn zusätzlich zur Abschirmung bei bedecktem Himmel die Sonne nicht mehr sichtbar ist. Offensichtlich nutzen die Tauben zur Orientierung im extremen Nahbereich, genau wie in der Fernorientierung, ein multifaktorielles System. Fällt einer der Faktoren aus, wie beispielsweise die Sonne, kann auf ein anderes System zurückgegriffen werden. Die Tauben waren auch bei der Manipulation zweier Orientierungssysteme, wie dies bei der Abschirmung der Voliere von den äußeren Landmarken bei gleichzeitigem bedecktem Himmel der Fall war, immer noch in der Lage, Futterorte zu finden. Dies spricht für das Vorhandensein weiterer Orientierungsfaktoren. Welcher Art diese Faktoren sind, könnte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Funktionelle und strukturelle Untersuchungen an der Diisopropylfluorophosphatase aus L.vulgaris
(2003)
Das Ziel dieser Arbeit war, mittels gezielter Mutagenese den postulierten Reaktionsmechanismus der durch die DFPase katalysierten Reaktion zu untermauern und gegebenenfalls weitere an der Hydrolysereaktion beteiligte Reste zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde zunächst die Rolle der Ca-1 Liganden untersucht. Hierbei ergab sich, dass sowohl die Nettoladung an der Ca-1-Bindungsstelle als auch die Positionen der Ladungen für den Erhalt der katalytischen Aktivität des Enzyms von Bedeutung sind. Die Einführung einer dritten negativen Ladung in der Bindungsstelle führte zum nahezu kompletten Aktivitätsverlust, was, wie die kristallographischen Untersuchungen der N175D-Mutante ergaben, hauptsächlich auf die veränderte Elektrostatik in der Bindungsstelle zurückzuführen ist. Durch eine Reihe von Mutationen des für die katalytische Aktivität als essentiell beschriebenen His287-Restes konnte gezeigt werden, dass auch andere, hydrophobe Reste an dieser Position die Katalyse ermöglichen. Die Fähigkeit dieser Reste, Wasserstoffbrücken mit Trp244 auszubilden, könnte für die Katalyse zwar förderlich sein, ist aber nicht unbedingt notwendig. Außerdem scheint die vom His287 vermutlich durchgeführte Aktivierung des hydrolytischen Wassermoleküls ebenfalls nicht essentiell für die enzymatische DFP-Spaltung zu sein. Anhand der in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen konnte der von Scharff et al. (2001a) vorgeschlagene Reaktionsmechanismus zumindest teilweise bestätigt werden. Gleichzeitig konnte jedoch gezeigt werden, dass die katalytische Reaktion auch ohne einige der in der Wildtyp-DFPase gegebenen Voraussetzungen - wie das Bestehen einer Wasserstoffbrücke zwischen His287 und Trp244, sowie eine durch das His287 durchgeführte Wasseraktivierung - ablaufen kann. Es konnte außerdem mittels gezielter Mutagenese gezeigt werden, dass die hydrophoben Anteile in der gesamten Substratbindungstasche und speziell an der Position 173 für die Substratbindung und -umsetzung eine wichtige Rolle spielen. Wie bereits bekannt, ist das Ca-2 Ion für die Stabilität der DFPase von großer Bedeutung. Mit Hilfe einer Mutation an der Ca-2-Bindungsstelle konnte gezeigt werden, dass der Verlust einer negativen Ladung die Koordination des Ca-2 Ions offensichtlich abschwächt. Die Position des Calciumions konnte in der D232S-Mutante nicht eindeutig definiert werden, obwohl die Struktur und die Aktivität des Enzyms intakt geblieben sind. Außerdem wurden, bedingt durch die Einführung dieser Mutation, geringe strukturelle Veränderungen im aktiven Zentrum des Enzyms hervorgerufen, was auf Wechselwirkungen zwischen den beiden Calciumbindungsstellen hindeutet. Dies könnte auf das ausgedehnte Wasserstoffbrückennetzwek im Inneren des die DFPase durchspannenden Tunnels zurückzuführen sein. Die Untersuchung verschiedener anderer, im zentralen Tunnel der DFPase gelegener Reste deutet ebenfalls auf die Existenz eines solchen Wasserstoffbrückennetzwerks hin, welches für die Aufrechterhaltung der katalytischen Funktion sowie der Strukturstabilität der DFPase von erheblicher Bedeutung zu sein scheint. Die für die Reste His287, Glu37, Ser271 postulierte Beteiligung an der katalytischen Reaktion konnte durch die Bestimmung der kinetischen Parameter dieser Mutanten untermauert werden. Die H287N-Mutante besitzt sehr niedrige KM- und Vmax-Werte, was die Bedeutung dieses Restes für die Katalyse unterstreicht. Kinetische Messungen wurden im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal mit dem rekombinanten Enzym und außerdem auch den DFPase-Substraten Sarin, Soman und Tabun durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Messungen haben gezeigt, dass die DFPase auch zur Dekontamination dieser letztgenannten Organophosphate effizient eingesetzt werden kann. Schließlich konnte mittels Gleichgewichtsdialyse das niederaffin gebundene Calciumion der DFPase gegen Co2+ und Tm3+ ausgetauscht werden. Da die Verwendung dieser Metalle für NMR-spektroskopische Messungen von "residual dipolar couplings" gedacht war, wurden 15N-angereicherte Proben des derivatisierten Proteins hergestellt, welche die für die NMR-Experimente notwendige Stabilität besassen.
Der tägliche und jahreszeitliche Wechsel in den Lichtverhältnissen bedeutet für alle Lebewesen eine regelmäßige und fundamentale Veränderung ihrer Lebensbedingungen. Mit Hilfe einer Inneren Uhr können Lebewesen regelmäßige Veränderungen ihrer Umwelt antizipieren. Diese Innere Uhr gewährleistet die Generierung eines endogenen, zirkadianen Rhythmus und dessen Synchronisation mit der Umwelt. Bei Wirbeltieren werden diese Funktionen durch einen spezifischen neuronalen Schaltkreis im Gehirn, dem photoneuroendokrinen System (PNS), erfüllt. Das Pinealorgan ist ein essenzieller Bestandteil des PNS. Dort werden photoperiodische Reize und Signale vom endogenen Oszillator in die Synthese des Neurohormons Melatonin umgesetzt. Die vom zentralen Oszillator im SCN gesteuerte Freisetzung von Noradrenalin (NA) aus sympathischen-postganglionären Nervenfasern in das Pinealorgan ist der entscheidende Reiz zur nächtlichen Ankurbelung der Melatoninbiosynthese. Melatonin wird ausschließlich in der Nacht gebildet und fungiert daher als ein Zeithormon. Unmittelbar nach der Synthese wird das Melatonin in die Blutbahn abgegeben und liefert allen Zellen, die mit spezifischen Melatoninrezeptoren ausgestattet sind, die entsprechenden Licht- und Zeitinformationen. NA bewirkt in allen untersuchten Säugetierarten die Aktivierung des Schlüsselenzyms der Melatoninbiosynthese, der AANAT. Die zellulären und molekularen Regulationsmechanismen für die AANAT unterscheiden sich jedoch artspezifisch. So ruft NA in Pinealozyten der Ratte die cAMP/PKA/pCREB-vermittelte Aktivierung der Transkription des Aanat Gens hervor, wogegen in Pinealozyten des Rindes NA die Regulation der proteasomalen Proteolyse des AANAT Proteins kontrolliert. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es, zelluläre und molekulare Mechanismen der noradrenergen Signaltransduktionskaskade zu identifizieren, welche für die Steuerung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan von Säugetieren verantwortlich sind. Deshalb wurden in kultivierten Pinealozyten der Ratte und des Rindes sowohl transkriptionale als auch posttranslationale Regulationsmechanismen untersucht, welche durch NA gesteuert und an der Regulation des Schlüsselenzyms der Melatoninbiosynthese, der AANAT, beteiligt sind. Mit Hilfe der Immunzytochemie konnte erstmalig das subzelluläre Verteilungsmuster sämtlicher bekannter regulatorischer (R)-Untereinheiten der PKA Typ I und II in Pinealozyten der Ratte nachgewiesen werden. Ebenso wurden die A Kinase Anker Proteine (AKAP) 95 und 150 immunzytochemisch dargestellt, wobei zwischen der AKAP 150-Immunreaktivität (IR) und der IR von RII alpha bzw. RII beta eine weitgehende Kolokalisation in der Nähe der Zellmembran der Pinealozyten vorlag. Diese Kolokalisationen deuten eine funktionelle Interaktion der PKA Typ II mit AKAP 150 in Pinealozyten der Ratte an. Keine Funktion bei der Steuerung der Melatoninbiosynthese scheinen der cAMPregulierte Austauschfaktor EPAC und die monomere GTPase Rap zu besitzen. So konnte eine Stimulation kultivierter Pinealorgane mit 8-CPT-2'-O-Me-cAMP, einem EPAC-spezifischen cAMP-Analog, einzeln oder in Kombination mit Noradrenalin (NA) weder den AANAT Proteingehalt noch die Freisetzung von Melatonin beeinflussen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass die cAMP-vermittelte Aktivierung der Melatoninbiosynthese ausschließlich auf die PKA zurückzuführen ist. Ebenso beeinflussten weder NA noch 8- CPT-2'-O-Me-cAMP den Aktivitätszustand von ERK 1 und 2. Eine Erhöhung des cAMP-Spiegels in Pinealozyten der Ratte scheint somit keinen Einfluss auf den Aktivitätszustand von ERK 1 und 2 im Pinealorgan der Ratte auszuüben. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die schnelle Dephoshorylierung von pCREB eine entscheidende Funktion bei der akuten Herabregulation des CRE-tragenden Aanat Gens darstellt und somit eine wichtige Rolle für die Beendigung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan der Ratte spielt. Nach Entzug des NA-Stimulus kam es innerhalb von 30 Minuten zu einer fast vollständigen pCREB Dephosphorylierung, die mit einer Abnahme der Aanat mRNA, des AANAT Proteingehalts und der Melatoninbiosynthese einherging. Die pCREB Dephosphorylierung und die Abnahme der Melatoninbiosynthese konnten durch PSP-Inhibitoren verhindert werden. Aufgrund der pharmakologischen Untersuchungen und des intrazellulären Verteilungsmusters scheint die PSP 1 die pCREB Dephosphorylierung im Zellkern der Rattenpinealozyten zu steuern. Mit Hilfe eines Ko-Immunpräzipitationsansatzes wurde erstmalig eine NA-abhängige Komplexbildung von AANAT und Protein 14-3-3 in Pinealozyten der Ratte und des Rindes dargestellt. Die vorliegenden Untersuchungen belegen somit, dass Tierarten, welche generell eine unterschiedliche molekulare Strategie zur Regulation der Melatoninbiosynthese entwickelt haben, mit der NA-abhängigen Ausbildung des AANAT/Protein 14-3-3 Komplexes jedoch einen gemeinsamen Mechanismus zur Regulation des AANAT Proteins besitzen. Ferner wurde die funktionelle Bedeutung des Cannabinoidsystems für die Steuerung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan der Ratte untersucht. Mit Hilfe der Immunhistochemie und des Immunoblotverfahrens konnten erstmalig CB 1- und 2 Rezeptorproteine im Pinealorgan der Ratte dargestellt werden. Die Stimulation kultivierter Pinealorgane der Ratte mit THC hatte keinen Einfluss auf den pCREB- und AANAT Proteingehalt, konnte jedoch die NA-induzierte Aktivierung des AANAT Proteins und die Melatoninfreisetzung hemmen. Das Pinealorgan der Ratte und des Rindes dient als ein gut geeignetes Modellsystem zum Studium von Signalskaskaden, da hier Noradrenalinreize in ein definiertes, einfach messbares Endprodukt, die Biosynthese und Sekretion des Neurohormons Melatonin, umgewandelt werden. Die in dieser Arbeit aufgedeckten Signaltransduktionsprozesse liefern daher nicht nur neue Einblicke in die Regulationsprozesse der Melatoninbiosynthese, sondern dienen ebenso dem besseren Verständnis von Signalübertragungs- und Signalverarbeitungsprozessen in komplexeren neuronalen und neuroendokrinen Systemen.
Die Infrarotspektroskopie in Verbindung mit photoaktivierbaren Substraten wurde zur Untersuchung von Substrat-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt. Dabei wurden Konformationsänderungen der Ca2+-ATPase des Sarkoplasmatischen Retikulums bei Bindung des Nukleotids, der Phosphorylierung der ATPase und der Hydrolyse des Phosphoenzyms beobachtet. Verwender wurden das native Substrat ATP und seine Analoga ADP, AMPPNP, 2'-deoxyATP, 3'-deoxyATP, ITP, AMP, Pyrophosphat, Ribosetriphosphat und TNP-AMP beobachtet. Diese Analoga waren an spezifischen funktionellen Gruppen des Substrats ATP modifiziert. Modifikation der 2'- und 3'-OH Gruppe des Ribosetriphosphats, der beta- und gamma-Phosphatgruppe und der Aminogruppe des Adenins reduzieren das Ausmaß an bindungsinduzierten Konformationsänderungen. Ein besonders starker Effekt wird für die 3'-OH Gruppe und die Aminogruppe des Adenins beobachtet. Dies zeigt die strukturelle Empfindlichkeit des Nukleotid-ATPase Komplexes auf einzelne Wechselwirkungen zwischen dem Nukleotid und der ATPase. Die Wechselwirkungen einer bestimmten Ligandengruppe mit der ATPase hängen von Wechselwirkungen anderer Ligandengruppen mit die ATPase ab. Die TNP-AMP Bindung verursacht teilweise gegenläufige und kleinere Konformationsänderungen verglichen mit ATP. Die Bindungweise von TNP-AMP ist unterschiedlich zu der von ATP, AMPPNP und anderen Tri- und Diphosphat Nucleotiden. Die Phosphorylierung der ATPase wurde mit ITP und 2'-deoxyATP beobachtet. Ca2E1P wurde in gleichem Ausmaß mit ITP und 2'-deoxyATP wie mit ATP akkumuliert, obwohl das Ausmaß der Konformationsänderungen bei Ca2E1P-Bildung geringer ist. Änderungen der 2'- und 3'-OH des Ribosetriphosphats und der Aminogruppe des Adenins beeinflussen die Reaktionsgeschwindigkeit der Phosphorylierung der ATPase. Es gibt keine direkte Verbindung zwischen dem Ausmaß der Konformationsänderung bei Nukleotid- Bindung und der Rate der Phosphorylierung. Das volle Ausmaß der ATP-induzierten Konformationsänderung ist nicht zwingend für die Phosphorylierung. Die Konformationen von Ca2E1N und Ca2E1P hängen vom Nukleotid ab. Dies weist darauf hin, dass die Struktur von ATPase Zuständen heterogener ist, als bisher erwartet. Die Aussagekraft und der Reichtum an Informationen in den Infrarotspektren zeigen, dass hiermit eine leistungsfähige Methode für die Untersuchung von Enzym-Substrat-Wechsel-Wirkungen und das räumliche Abtasten von Bindungstaschen zur Verfügung steht.
Die extrazelluläre Matrix (ECM) dient in mehrzelligen Organismen nicht nur als mechanische Stütze, sondern nimmt direkten Einfluss auf eine Vielzahl zellulärer Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Migration. Die Discoidin-Domain-Rezeptoren (DDR) 1 und 2 sind die bisher einzig bekannten ECM-bindenden Rezeptoren mit einer intrinsischen Kinaseaktivität. Rezeptor- Tyrosinkinasen spielen bei der Signaltransduktion eine wichtige Rolle. Sie nehmen durch Bindung spezifischer Liganden Signale außerhalb der Zelle auf und initiieren eine Signalkaskade, die letzlich zur Transkription oder Repression von Zielgenen führt. Nach Bindung von nativem Kollagen an die Rezeptoren DDR1 und DDR2 kommt es zu einer Homodimerisierung, die zur Autophosphorylierung der Rezeptoren führt. Eine generierte DDR1-Knock-out-Maus zeigt einen Defekt in der Differenzierung der Brustdrüse und ist nicht in der Lage, ihre Jungen zu säugen, die genauen Ursachen hierfür sind jedoch bislang unbekannt. Ebenso sind die Zielgene der aktivierten Rezeptoren und insbesondere die Rolle von DDR1 in der Brustdrüse bislang wenig erforscht. In der vorliegenden Arbeit wurde nach Zielgenen, die durch die Signalkaskade von DDR1 und DDR2 in ihrer Transkription beeinflusst werden, gesucht. Außerdem wurde die Rolle von DDR1 in der Brustdrüse im Detail analysiert. Zur Auffindung von Zielgenen wurden Zelllinien generiert, in denen die Expression von DDR durch Doxycyclin reprimierbar ist und mit Hilfe von Microarrays auf die Deregulation von Matrixgenen sowie Matrix-assoziierten und -modifizierenden Genen untersucht. Agrin und alpha 3-Integrin konnten als gemeinsame, reprimierte Zielgene von DDR1 und 2 identifiziert werden. Der P-Selectin-Ligand PSGL-1 und das Proteoglykan Decorin wurden von beiden Rezeptoren induziert. Weiterhin wurde das Brustdrüsengewebe trächtiger DDR1-Knock-out-Mäuse mit dem Brustdrüsengewebe heterozygoter Mäuse verglichen. Dazu wurden Microarrays verwendet, auf denen 15.000 Gene abgebildet waren. Die Analyse zeigte eine Repression von MDGI (Mammary derived growth inhibitor), Osteopontin und WDNMI in DDR1-Knock-out-Mäusen, während die Transkription des IGF-Bindeprotein IGFBP-5 erhöht war. Die Deregulationen konnten mittels Real-time-PCR verifiziert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle von DDR1 in der nichttransformierten Brustepithelzelllinie HC11 und in primären Brustepithelzellen aus DDR1-Knock-out Mäusen untersucht. Dabei konnte ein Defekt von DDR1-Knock-out Zellen in der terminalen Differenzierung beobachtet werden. Im Gegensatz hierzu differenzierten DDR1 überexprimierende HC11-Zellen schneller als HC11-Wildtyp-Zellen und bildeten größere Mengen des Differenzierungsmarkers beta-Kasein. Die Analyse verschiedener Signalwege, die bei der Differenzierung von Brustepithelzellen angeschaltet werden, zeigte, dass DDR1 eine entscheidende Rolle in der Signaltransduktion von Stat5a/b spielt. Die Prolaktin induzierte Stat5a/b-Phosphorylierung war in DDR1 exprimierenden HC11 Zellen stärker und länger anhaltend als in parentalen HC11 Zellen. Dieser Effekt konnte nach Aktivierung von DDR1 durch Typ I Kollagen noch verstärkt werden. In der vorliegenden Arbeit konnten PSGL-1, Decorin, Agrin und Integrina3 als Zielgene in DDR1 und DDR2 überexprimierenden Zellen identifiziert werden. Ferner wurde im Brustdrüsengewebe von DDR1-Knock-out-Mäusen eine Repression von MDGI, Osteopontin und WDNMI sowie eine Induktion von IGFBP-5 gefunden. Die Analyse DDR1 überexprimierender HC11 Zellen und primärer DDR1-Knock-out-Brustepithelzellen zeigte, dass DDR1 eine essentielle Rolle in der terminalen Differenzierung von Brustepithelzellen hat. Dabei konnte erstmals ein Einfluss von DDR1 auf die Prolaktin-induzierte Aktivierung von Stat5a/b gezeigt werden.
Die hier vorgelegte Arbeit hatte zur Aufgabe, funktionellen Einflüsse auf den Neurotransmittertransporter GAT-1 zu erhellen, welche durch eine N-Glykosilierung des Transportproteins hervorgerufen werden. Frühere Untersuchungen deuteten bereits darauf hin, daß der Glykosilierung der drei extrazellulär vorhandenen N-Glykosilierungsstellen des GAT- 1 neben einer expressionellen Bedeutung auch eine funktionelle zukam. So zeigten sich bei Arbeiten anderer Gruppen, welche N-Glykosilierungsmutanten des GAT-1 verwendeten, um die Glykosilierung des Transportproteins zu beeinträchtigen, daß fehlende Oligosaccharide an den N-Glykosilierungsstellen des GAT-1 durchaus in eine Reduktion der GABA-Aufnahme in die Zellen mündete, was zumindest bei Oozyten des Xenopus laevis auf eine verminderte Transportrate zurückgeführt werden konnte. An CHO-Zellen konnte nun auf gleiche Weise eine Reduktion der GABA-Aufnahme beobachtet werden, und es galt, mit elektrophysiologischen Methoden die Ursachen dieser Reduktion zu erkunden. Die hier vorgelegte Arbeit vermochte nun bei CHO-Zellen, eine Verminderung der Transportrate als Ursache jener reduzierten GABA-Aufnahme auszumachen. Zu diesem Zwecke wurden die CHO-Zellen entweder mit der DNA des mGAT1 Wild-Typs (einem aus der Maus klonierten GAT-1-Transporter) oder mit der DNA von N-Glykosilierungsmutanten des mGAT1 transfiziert. Es fanden zwei verschiedene N-Glykosilierungsmutanten Verwendung, an denen jeweils zwei der drei N-Glykosilierungsstellen Asparagin durch Aspartat bzw. Glycin ersetzt wurden: (Asp176, Gly181, Asn184) bzw. DDN (Asp176, Asp181, Asn184). Wie indes die durch eine beeinträchtigte N-Glykosilierung verminderte Transportrate zustande kam, und wie sich eine entsprechende Erklärung in die bisherige Annahme den GAT-1 Reaktionszyklus betreffend einfügen und mit dessen Struktur verbinden ließe, vermochte die hier vorgelegte Arbeit zu einem großen Teil einsichtig zu machen. Zwei Phänomene konnten die Transportrate vermindern: Zunächst waren die Zeitkonstanten transienter Ströme, welche bei Abwesenheit von GABA auftreten, verlangsamt. Weil diese Ströme den ratenlimitierenden Schritt im Reaktionszyklus zu repräsentieren scheinen, mußte also jener Schritt, welcher die Okklusion des ersten Natriums oder die darauffolgende Konformationsänderung beinhaltet, verlangsamt sein. Im weiteren zeigten Analysen der bei den transienten Strömen auftretenden Ladungsverschiebungen, daß die Natrium-Transporter-Interaktion auf extrazellulärer Seite durch das Fehlen von Oligosacchariden an den N-Glykosilierungsstellen des GAT-1 beeinträchtigt war, wobei als Grund hierfür eine Verstärkung der dimensionalen bzw. elektrogenen Schranke zu sehen ist, welche sich vor der Natriumbindungsstelle des GAT-1 befindet. Eine Veränderung der Expressionsrate als tragende Ursache verminderter Transportraten bzw. reduzierter GABA-Aufnahmen konnte hingegen ausgeschlossen werden. Experimente mit dem N-Glykosilierungs-Inhibitor dMM sowie Vergleiche von Experimenten verschiedener Mutanten vermochten die oben beschriebenen Effekte hauptsächlich auf die durch die Mutationen fehlenden Oligosaccharide zurückzuführen und weniger auf andere durch die Mutation hervorgerufene strukturelle Änderungen des GAT-1-Proteins.
Durch Substitution der vier Cysteine des a-Amylase-Inhibitors Tendamistat wurden Disulfidmutanten erzeugt. Zur Herstellung wurde im Rahmen dieser Arbeit die statistische Mutagenese angewandt. Die beiden Mutanten 11H27I45R73T und 11H27N45S73D wurden mit einem kombinierten Verfahren aus Olignukleotidsynthese und PCR erzeugt. Dieses hat als Grundlage die Genkassette, die in pT136 und pAX5a enthalten ist. Durch die gleichzeitige Veränderung beider Cysteine einer Disulfidbrücke sind Probleme mit der Einschränkung in der Variantenvielfalt nicht vorhanden, sowie mehrfache Mutationszyklen nicht notwendig. Die 4-fach-Mutanten wurden in Streptomyces lividans kloniert und exprimiert. Dabei konnte gezeigt werden, daß stabiles Tendamistat erhalten wird. Damit wurde Disulfidbrücken-freies Tendamistat erhalten, ohne zusätzliche Mutationen einführen zu müssen.
In the recent years, high-resolution conditions have been established in solid-state NMR by the combination of magic angle spinning, state-of-the-art r.f. pulse schemes and the introduction of ultra-high magnetic fields. Similar to what is now routine in solution-state NMR, this has opened the way for structure determination by HR-SSNMR methods. Complete structural or dynamical characterization of the biomolecule of interest is most easily achieved if multiple or even uniformly [13C, 15N]-labeled versions are studied. In a first step, experiments that allow the complete assignment of the 13C and 15N resonances have been recently designed. To date, nearly complete chemical shift assignments were reported for two well-ordered proteins, the ±-spectrin SH3 domain and the Crh protein. The SSNMR analysis of the later protein has been presented in Section 4.1. For SSNMR applications, not the molecular size or solubility, but the spectral resolution can be of crucial importance. Experimental parameters and sample inherent conditions such molecular disorder may reduce the overall spectral dispersion. In these circumstances, techniques that allow for spectral simplification without the need of elaborated biochemical procedures (of isotopelabeling) are of special importance. In Section 2, several spectral editing methods have been proposed. These methods not only select resonances due to changesin the physical and chemical environment of the nucleus but they can also directly probe molecular properties such as dynamics and conformational heterogeneity. Once the chemical shifts are available for the biomolecule of interest, methods that permit to obtain structural restraints can be applied. In the case of multiply isotope labeled proteins, such techniques can in principle result in multiple structural parameters. In Section 3.1, we have shown that, similar to solution-state NMR, secondary chemical shifts can be readily employed to study the local backbone conformation. Inaddition, distance constraints between protons may be encoded in high-resolution on rare spins like 13C and 15N and measured. Finally, carbon-carbon constraints may be probed by employing frequency selective r.f. pulse schemes. These dihedral and distance constraints may subsequently lead to the determination of protein secondary to tertiary structure from a single protein sample. In Section 4.2,we have shown that high-affinity ligand binding to membrane proteins can be investigated with solid-state NMR. Here, the neuropeptide neurotensin which binds to the Gprotein coupled receptor NTS1 in sub-nanomolar affinity was investigated.Except for the case of rhodopsin, there is currently no information on the high-resolution structure of any other GPCR or a corresponding high-affinity ligand.Our SSNMR results identify, for the first time, a distinct binding mode of neurotensin that could be of considerable relevance for further pharmacological studies. As exemplified in section 4.3, HR-SSNMR based structural studies can also assist in refining existing (X-ray or solution-state NMR) membrane-protein structures. The presented results provide, for the first time, direct experimental evidence for a double occupancy of the Q0 binding site in the ubiquinone-bc1 complex and may provide the basis for the complete 3D structural determination of the ubiquinone binding pocket. Advancements regarding sample preparation (for example, including modular labeling, in vitro expression and intein technology) and improvements in NMR hardware instrumentation could open up new areas of solid-state NMR research such as the investigation of large protein-protein complexes or the complete 3D characterization of larger membrane proteins. Solid-state NMR studies of multiply-labeled biomolecules will furthermore profit from improved procedures for calculating 3D structures, in particular in the presence of ambiguousor a limited number of structural constraints. Unlike X-ray crystallography, protein motion does not hinder solid-state NMR methods. In fact, complementary to solution-state NMR, it may provide a very efficient means to study protein folding, flexibility and function under biologically relevant conditions. Hand in hand with solution-state techniques and crystallographic methods, solid-state NMR could provide insight into protein function and the chemistry of life with unprecedented accuracy and flexibility.
Im ersten Teil dieser Arbeit sind Protein-Protein Docking-Studien dokumentiert. Bis heute konnten die meisten Protein-Komplex-Strukturen nicht experimentell aufgeklärt werden, so auch die beiden oben genannten Elektrontransfer-Komplexe. Nach einem erfolgreichen Test wurden verschiedene Cytochrom c Oxidase:Cytochrom c Paare mit der gleichen Methode gedockt: COX aus Paracoccus denitrificans mit Pferdeherz Cytochrom c und COX mit dem löslichen Fragment des membrangebundenen Cytochrom C552 (beide aus P. denitrificans). Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die diffusive Annäherung des Cytochrom c an die Cytochrom c Qxidase mit der Brownschen Dynamik Methode simuliert. Die Diffusionsbewegung eines Brownschen Teilchens in wässriger Lösung wird durch die Langevin-Gleichung bestimmt. Der auf dieser Gleichung fußende Ermak-McCammon-Algorithmus ist Grundlage der Simulationsmethode. Die so ermittelten Raten für COX und Pferdeherz, sowie für COX und Cytochrom C552, wurden dann mit experimentell gewonnenen Raten verglichen. Da die Elektrostatik für den Annäherungsprozeß dieser Proteine eine so gewichtige Rolle spielt, wirken sich Mutationen, die mit einer Ladungsänderung einhergehen, merklich aus. Dies ist vor allem dann der Fall, wenn sich die Mutation in der Nähe der Bindungsstelle befindet. Aus dem gleichen Grund ist die Assoziationsrate auch stark von der Ionenstärke der umgebenden Lösung abhängig. Steigt die Ionenkonzentration wird die elektrostatische Komplementarität der Bindingsstellen der beiden Makromoleküle stärker abgeschirmt, und die Rate sinkt. Diese beiden relativen Trends konnten durch die Simulationen gut reproduziert und bestätigt werden. Allerdings liegen die absoluten Resultate merklich über den experimentell gemessenen Raten. Es ist sehr gut möglich, daß post-diffusive Effekte, die nicht in einer Brownschen Dynamik Simulation von starren Körpern berücksichtigt werden können, die Raten erniedrigen. Um den Einfluß der Membranumgebung auf die Wechselwirkung des Elektrontransportsystems zu untersuchen. wurde eine DPPC Doppelschicht um die Oxidase modelliert und energieminimiert. Mit Poisson-Boltzmann Rechnungen wurde das elektrostatische Potential dieses Nanosystems untersucht und mit dem der einzelnen Oxidase verglichen. Durch einen modifizierten Set-up konnten dann auch für dieses Membransystem Brownsche Dynamik Simulationen durchgeführt werden. Der Vergleich mit den vorhergehenden Simulationen ohne Membran erbrachte bemerkenswerte Ergebnisse. Während die Assoziationsraten für Pferdeherz Cytochrom c durch den Membraneinfluß erniedrigt wurden, stiegen sie im Fall des physiologischen Transferpartners c552. Pferdeherz Cytochrom c weist eine positive Nettoladung und einen ausgeprägten bipolaren Charakter auf. Eine große Zahl positiv geladener Seitenketten befindet sich auf der gleichen Hemisphäre wie die Bindungsstelle. Obwohl die DPPC Lipidmoleküle neutral sind, zeigten die Elektrostatikrechnungen, daß die Membranoberfläche abstoßend auf positive Ladungen wirkt. Da sich nun die Bindungsstelle der Oxidase für Cytochrom c nur etwa 10 Å oberhalb der Membran befindet, verringert sich die Wahrscheinlichkeit der Assoziation.
Lipophile, sedimentgebundene Substanzen sind für endobenthische Tiere in hohem Maße bioverfügbar und können von diesen aufgenommen und angereichert werden. Für benthivore Fische besteht damit das Risiko, diese Chemikalien mit der Nahrung aufzunehmen. Die Aufkonzentrierung sedimentgebundener Chemikalien über zwei oder mehr trophische Ebenen (Biomagnifikation) kann somit durch die Bestimmung der Biokonzentration von Chemikalien in Fischen nach der OECD-Richtlinie 305 (OECD 1996) nicht adäquat erfasst werden. Zur standardisierten Bestimmung der Bioakkumulation und Biomagnifikation wurde eine einfache, zwei trophische Stufen umfassende Labornahrungskette etabliert. Diese bestand aus dem endobenthischen Oligochaeten Tubifex tubifex (MÜLLER) als Beute und dem Dreistachligen Stichling (Gasterosteus aculeatus LINNÉ) als Prädator. Die Experimente wurden mit 14C-markiertem Hexachlorbenzol und Terbutryn in dotiertem künstlichem Sediment und rekonstituiertem Wasser durchgeführt. Um den Einfluss einzelner Expositionspfade an der Gesamtanreicherung der Modellchemikalien zu quantifizieren, wurden die Fische gegenüber dotiertem Wasser bzw. dotiertem Sediment (Biokonzentrationsszenario), vorexponierten Würmern (Biomagnifikationsszenario) und Kombinationen dieser Aufnahmepfade (Bioakkumulationsszenario) exponiert. Sedimentgebundenes HCB wurde im Bioakkumulationsszenario sowohl in den Tubificiden (BAFWurm/Sediment (FG/FG) = 7,8) als auch in den Fischen (AFFisch/Wasser (FG/FG) = 52500; AFFisch/Sediment (FG/FG) = 47; AFFisch/Wurm (FG/FG) = 3,2) deutlich angereichert. Da die Gewebekonzentration von HCB im Räuber, auch auf Basis lipidnormierter Konzentrationen, die Konzentration in seiner Beute überstieg (AFFisch/Wurm (lipidnormiert) = 1,3), kann von einer Aufkonzentrierung der Chemikalie entlang der Labornahrungskette ausgegangen werden (Biomagnifikation). Es konnte gezeigt werden, dass die Exposition gegenüber der Kombination sämtlicher Aufnahmepfade zu deutlich höherer Anreicherung in den Fischen führte als im Falle einzelner Expositionspfade. Ein Vergleich der Ergebnisse der einzelnen Expositionsszenarien erlaubt den Schluss, dass HCB von den Fischen im Bioakkumulationsszenario zu ungefähr gleichen Teilen über das Wasser (45%) und über die Nahrung (41%) aufgenommen wurde, während die Anwesenheit kontaminierten Sediments nur mit 14% zur Gesamtanreicherung beitrug. 14C-Terbutryn wurde im Bioakkumulationsszenario - auf Basis der Gesamtradioaktivität - sowohl in den Tubificiden (AF Wurm/Sediment (FG/FG) = 4,4) als auch in den Fischen (AFFisch/Wasser (FG/FG) = 323; AFFisch/Sediment (FG/FG) = 10; AFFisch/Wurm (FG/FG) = 1,4) angereichert. Allerdings wurde Terbutryn in den Stichlingen zum überwiegenden Teil zu einem polareren Metaboliten transformiert (84%). Daher müssen zur Abschätzung der Anreicherung von Terbutryn die auf den Gehalt an Ursubstanz korrigierten Gewebekonzentrationen und Anreicherungsfaktoren betrachtet werden. Hierbei wird deutlich, dass Terbutryn nicht entlang der Labornahrungskette aufkonzentriert wurde (AFFisch/Wurm = 0,09). Ein Vergleich der Ergebnisse der einzelnen Expositionsszenarien zeigt, dass der Hauptaufnahmepfad von 14C-Terbutryn in Stichlingen das umgebende Wasser ist, während die Anwesenheit kontaminierten Sediments und die Aufnahme über die Nahrung eine untergeordnete Rolle spielen. Da die Messung der Bioakkumulation und Biomagnifikation von sedimentassoziierten Substanzen sehr aufwendig ist, werden zur Abschätzung ihres Risikopotentials vermehrt mathematische Modelle entwickelt und eingesetzt, die eine Chemikalienanreicherung in Nahrungsketten vorhersagen sollen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Vorhersagen dreier Modelle mit den experimentell ermittelten Daten verglichen. Hierdurch sollte sowohl die Eignung des entwickelten Testsystems als auch der verwendeten Modelle als nützliche Instrumente des environmental risk assessment überprüft werden. Die Vorhersagen der drei Modelle bei Applikation auf die Daten der Labornahrungskette stimmen gut mit den experimentell bestimmten Konzentrationen von HCB und Terbutryn in den Tubificiden und Fischen überein. Für HCB sagen alle drei Modelle eine Biomagnifikation in der Labornahrungskette vorher. Die Modelle unterschätzen die gemessenen Konzentrationen in den Fischen mit einem Faktor von 1,1 - 1,7 nur geringfügig. Die Konzentration in den Tubificiden wird vom Gobas/Morrison-Modell sehr präzise vorhergesagt (Unterschätzung um Faktor 1,1), während sie im Campfens/Mackay-Modell (Faktor 2,1) und Gobas-Modell (Faktor 6,3) deutlicher unterschätzt wird. Speziell die dem Campfens/Mackay- und Gobas-Modell zugrunde liegenden Annahmen zur Anreicherung in benthischen Organismen erwiesen sich für HCB und Tubificiden als unzureichend zu sein, da die Modelle hierbei nur die Aufnahme aus dem Porenwasser berücksichtigen. Für Terbutryn sind die Modellvorhersagen sehr viel ungenauer als für HCB, da vor allem die starke Metabolisierung von Terbutryn in den Stichlingen unterschätzt wird. Dies resultiert in einer Überschätzung der Terbutryn-Konzentration in den Fischen (Faktor 5,8 - 6,4). Allerdings bleiben zwei Punkte festzuhalten: 1) Die Modelle sagen keine Biomagnifikation von Terbutryn in der Labornahrungskette vorher. 2) Die Modellvorhersagen bestärken die Annahme, dass die Anreicherung von Terbutryn in den Fischen dominiert ist von der Aufnahme aus dem umgebenden Wasser über die respiratorische Oberfläche. Die analysierten Modelle können bei entsprechender Weiterentwicklung als nützliche Instrumente für eine erste Abschätzung des Risikos der Bioakkumulation sedimentgebundener, hoch lipophiler Substanzen in aquatischen Nahrungsketten im Rahmen der Risikoabschätzung (environmental risk assessment) dienen. Zum gegenwärtigen Entwicklungsstand ist die Labornahrungskette jedoch den Modellen vorzuziehen, da sie die konservativeren Daten liefert. Für eine abschließende Beurteilung der vorgestellten Methoden bedarf es allerdings einer Verbreiterung der Datenbasis.
Untersucht wurde die spätpleistozäne und holozäne Diatomeenflora aus drei Teilgebieten der westlichen Ostsee, dem Kattegat, der Kieler Bucht und der Pommerschen Bucht. Die Ergebnisse bestätigen die hervorragende Eignung der Diatomeen als Indikatororganismen in der Paläoökologie. Anhand der Mikroflora war es möglich, die wechselhafte Geschichte der verschiedenen Ostsee-Teilgebiete detailliert nachzuvollziehen. Es konnten Lage und Ausdehnung der Paläogewässer während der verschiedenen Stadien der Ostsee-Entwicklung sowie verschiedene abiotische Faktoren der Paläoumwelt - Salinität, pH-Wert, Trophie, Temperatur und Wassertiefe - rekonstruiert werden. Zur Rekonstruktion von Salinität, Trophie und pH-Wert kamen erstmals verschiedene Indikationssysteme - der Halobienindex nach ZIEMANN (1971), das Trophie-Indikationssystem nach HOFMANN (1994) und die pH-Rekonstruktion nach ARZET (1987) - zur Anwendung. Kattegat Der Schwerpunkt der Untersuchung lag auf dem südwestlich der Insel Anholt gelegenen Teil des Kattegats. In den 22 Kernprofilen konnten insgesamt 596 Diatomeentaxa registriert werden. In den Ablagerungen des Spätglazials waren im gesamten Untersuchungsgebiet keine silifizierten Mikrofossilien nachweisbar. Die anhand der seismoakustischen Untersuchungen aufgestellte Gliederung der holozänen Sedimente in die Abschnitte Holozän 1 (H1), Holozän 2 (H2) und Holozän 3 (H3) konnte durch die Analyse der Diatomeenfloren bestätigt werden. Die Ablagerungen des Sedimentabschnitts H1 entstanden während einer Transgressionsphase. Das in Alleröd und Jüngerer Dryas trockengefallene Untersuchungsgebiet wurde zu Beginn des Präboreals vollständig transgrediert. Durch das Auftreten halobionter Diatomeentaxa konnte der Beginn der Transgression im Untersuchungsgebiet auf den Anfang des Präboreals und ein Alter von 10.200 Jahren BP datiert werden. Für die Hauptphase der Transgression wurde ein Alter von rund 9.700 bis 9.300 Jahren BP ermittelt. In Übereinstimmung mit den seismoakustischen Befunden und den Ergebnissen der Makrofossil-Analyse konnte der Sedimentabschnitt H2 als Ablagerung aus dem Mündungsgebiet eines Fließgewässers identifiziert und auf ein Alter von rund 9.300 bis 8.300 Jahren BP datiert werden; wahrscheinlich entwässerte der Ancylus-See zumindest zeitweilig über den großen Belt in diesen Abschnitt des Paläokattegats. Die Diatomeenflora indiziert eine überwiegend durch den Einstrom von Süßwasser beeinflusste Paläoumwelt und ein alkalisches und eutrophes Milieu. Das charakteristische Merkmal der Thanathozönosen ist der hohe Anteil an allochthonen Schalen. Die Analyse der autökologischen Präferenzen zeigt, dass durchschnittlich 30 % der Taxa ursprünglich aus anderen Gewässertypen stammen. Mithilfe der Diatomeenflora konnte der Sedimentabschnitt H2 in drei Abschnitte untergliedert werden. Der Abschnitt H2a wurde während der Bildung einer Landzunge abgelagert, die die Mündung des Fließgewässers vom Paläokattegat trennte. Die Thanathozönosen indizieren die zunehmende Beeinflussung durch den Einstrom von Süßwasser. Der Abschnitt H2b wurde vor rund 8.800 Jahren BP deponiert, während die Landzunge ihre größte Ausdehnung und Isolationskraft erreichte. Die Diatomeenflora indiziert die maximale Beeinflussung durch den Zustrom von Süßwasser. Im Sedimentabschnitt H2c indizieren die Thanathozönosen die Verlagerung der Landzunge infolge küstendynamischer Prozesse und eine zunehmende Beeinflussung durch Meerwasser. Der Sedimentabschnitt H3, der während einer erneuten Transgression vor ca. 8.300 Jahren BP deponiert wurde, ist in weiten Bereichen vollständig frei von silifizierten Mikrofossilien. Eine autochthone, aus überwiegend halobionten Taxa zusammengesetzte Diatomeenflora ließ sich lediglich in einem der Kernprofile nachweisen. Das charakteristische Taxon der Transgressionsfloren in den Sedimentabschnitten H1 und H3 ist Paralia sulcata. Typisch sind des Weiteren Actinoptychus senarius, Cymatosira belgica, Dimeregramma minor, Ehrenbergia granulosa und Plagiogramma staurophorum. Kieler Bucht Aus der Kieler Bucht stand ein Kernprofil zur Verfügung. In diesem Profil konnten insgesamt 344 Diatomeentaxa nachgewiesen werden. Die brackischen Ablagerungen entstanden in der Mastogloia-Phase und konnten mithilfe der Diatomeenflora in zwei Abschnitte - Mastogloia 1 (M1) und Mastogloia 2 (M2) - untergliedert werden. Der Sedimentabschnitt M1 wurde deponiert, während das Milieu des Paläogewässers durch sporadische Ingressionen über den Großen Belt beeinflusst wurde. Die Diatomeenflora indiziert einen Paläosalzgehalt von maximal 9 Promille, ein eutrophes und alkalisches Paläomilieu und eine geringe Wassertiefe. Die Veränderungen im Artgefüge der Thanathozönosen innerhalb des Sedimentabschnitts M2 belegen einen kontinuierlichen Anstieg der Salinität um mindestens 8 Promille und das Auftreten starker Strömungen. Die Sedimentation erfolgte während des Übergangs vom brackigen Mastogloia-Stadium zur marinen Littorina-Phase. Mithilfe der Diatomeenflora konnte nachgewiesen werden, dass sich in dem Paläogewässer der Kieler Bucht frühestens vor 7.100 Jahren BP marine Verhältnisse etablierten. Die Flora indiziert einen Anstieg des Paläosalzgehalts auf mindestens 17 und maximal 30 Promille. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Sedimentanalyse konnten die Ablagerungen der Littorina-Phase anhand der Diatomeenflora in zwei Subzonen - Littorina 1 (L1) und Littorina 2 (L2) - untergliedert werden. Während das Artgefüge in dem Abschnitt L1 auf große Strömungsgeschwindigkeiten während der Sedimentation hinweist, belegt die Flora in dem Abschnitt L2 eine deutliche Abnahme der Strömungsintensität. Pommersche Bucht In den neun Kernprofilen aus der Pommerschen Bucht konnten insgesamt 265 Diatomeentaxa identifiziert werden. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen der geologischen Untersuchungen zeigt die Diatomeenflora, dass sich der südliche Abschnitt der Pommerschen Bucht nach dem Rückzug des Eisschildes bis in das Atlantikum hinein unabhängig vom nördlichen Teil entwickelte; erst während der Littorina-Phase wurde auch der südliche Abschnitt transgrediert. Mithilfe der Diatomeenflora wurde belegt, dass sich im Spätglazial vor ca. 12.000 Jahren BP im Süden der Pommerschen Bucht ein alkalischer, meso- bis schwach eutropher Süßwassersee etablierte. Die Thanathozönosen indizieren erhebliche Milieuunterschiede zwischen diesem See und dem Baltischen Eisstausee, der zeitweise den nördlichen Abschnitt der Pommerschen Bucht bedeckte. Im frühen Holozän entwickelte sich im südlichen Abschnitt der Pommerschen Bucht an gleicher Position wie im Spätglazial wiederum ein Süßwassersee, während der nördliche Abschnitt der Pommerschen Bucht vom Ancylus-See bedeckt war. Die Diatomeenfloren belegen, dass sich die Umweltbedingungen in beiden Paläogewässern ähnelten; sowohl im Norden als auch im Süden lag ein alkalisches und überwiegend eutrophes Milieu vor. Der Beginn der Mastogloia-Phase ist durch einen drastischen Wechsel im Artgefüge der Diatomeenflora gekennzeichnet; Taxa mit höherer Salinitätstoleranz, z. B. Epithemia turgida und Diploneis didyma, ersetzten die rein oligohalobe Ancylus-Flora. Die Veränderungen indizieren einen schwachen aber deutlichen Anstieg der Salinität im Norden der Pommerschen Bucht. Das charakteristische Taxon der Littorina-Phase ist die polyhalobe Planktonart Thalassionema nitzschioides. Es indiziert einen Anstieg des Paläosalzgehalts auf mindestens 13 Promille. Des Weiteren belegen die Diatomeen den stetig steigenden Wasserspiegel zu Beginn der Littorina-Phase. Chrysophyceen-Zysten, Chaetoceros-Sporen und die Skelette des Silicoflagellaten Distephanus speculum stellen in der Pommerschen Bucht wichtige Leitfossilien dar. Während Chrysophyceen-Zysten typisch für die Sedimente der Mastogloia-Phase sind, haben Chaetoceros-Sporen und Distephanus speculum charakteristischerweise ihren Verbreitungsschwerpunkt in den Ablagerungen des Littorina-Meers.
Bei der Expression einer Phospholipase A2 aus Soja in Aspergillus oryzae (Probe PL-1007), Trichoderma viride (Probe PL-1008) und Pichia pastoris (Probe PL-1035) wurde neben der erwarteten Phospholipaseaktivität auch eine deutliche Lysophospholipaseaktivität beobachtet. Eine Trennung dieser Aktivitäten war nur mittels einer Free-Flow-Elektrophorese kurzzeitig möglich, bevor sich in jeder Fraktion wieder das ursprüngliche Aktivitätsverhältnis zwischen Phospholipase und Lysophospholipase einstellte. Zur näheren Untersuchung und Charakterisierung dieser Enzymsysteme wurden für einen gaschromatischen Aktivitätstest hochspezifisch substituierte Substrate eingesetzt, die eine parallele Bestimmung der Phospholipase- und Lysophospholipaseaktivitäten ermöglichten. So konnte gezeigt werden, dass nicht in allen Organismen eine Phospholipase A2 exprimiert wird, sondern es in Pichia pastoris (Probe PL-1035) zur Expression einer Phospholipase A1 kommt. Im Falle der Probe PL-1007 konnte die beobachtete Lysophospholipaseaktivität durch Versuche mit veränderten Substratverhältnissen zwischen Lysophospholipase- und Phospholipasesubstrat einem separaten aktiven Zentrum zugeschrieben werden. Durch elektrophoretische Trennungsversuche konnte gezeigt werden, dass es sich nicht nur um separate aktive Zentren, sondern um verschiedene Enzyme handelt. Die Tatsache, dass sich das Aktivitätsverhältnis nach der Trennung selbständig wieder einstellt, lässt das Vorliegen von Faltungsisomeren vermuten. Bezüglich ihrer katalytischen Eigenschaften weisen alle drei Enzymsysteme eine große Ähnlichkeit auf. Sowohl die Phospholipase- wie auch die Lysophospholipaseaktivitäten sind erst ab einer Reaktionstemperatur von über 70°C nicht mehr nachweisbar. Das Aktivitätsmaximum wurde in allen drei Fallen zwischen 45°C und 55°C beobachtet. Auch die pH-Bereiche in denen eine maximale enzymatische Aktivität zu beobachten ist, liegen mit pH 3,6 (PL-1007) bis pH 4,3 (PL-1035) für die Phospholipaseaktivitäten und pH 4,3 (PL-1007 / PL-1008) und pH 4,6 (PL-1035) in ähnlichen Bereichen. Die Aktivität der untersuchten Enzymsysteme zeigt jedoch im beobachteten pH-Bereich von pH 3 bis pH 5 nur eine geringe pH-Abhängigkeit. Deutlichere Unterschiede konnten jedoch für die Substratspezifitäten nachgewiesen werden. Die Phospholipasen A2 zeigen tendenziell höhere Umsätze bei Substraten mit C 12:0 bis C 16:0 Fettsäureresten, während die Phospholipase A1 aus Probe PL-1035 maximale Umsätze bei C 18:0 Fettsäureresten aufweist. Bei allen Enzymproben jedoch bleiben die Umsatzraten der ein- bis mehrfach ungesättigten Fettsäurereste hinter denen der gesättigten zurück. Lediglich bei der Probe PL-1007 sind die Aktivitätsunterschiede zwischen gesättigten und ungesättigten Substraten nicht signifikant. Neben der Untersuchung der katalytischen Eigenschaften konnte im Rahmen dieser Arbeit die in der Literatur mehrfach aufgestellte These der Hemmung der Phospholipaseaktivität in Gegenwart von Uteroglobin bestätigt werden. Ein Hemmungsmechanismus aufgrund direkter Wechselwirkung der Enzyme konnte ausgeschlossen werden. Vielmehr konnte zweifelsfrei bewiesen werden, dass der Hemmungsmechanismus bei den hier eingesetzten Enzymsystemen auf einer Bindung des für die Phospholipasereaktion essentiellen Ca2+ durch das Uteroglobin zurückzuführen ist.
The mechanism of peptide transport has been studied on two different ABC transporters of S. cerevisiae. Thereby, the aim of this PhD thesis was to characterise the transporter function on molecular level and shed light on the physiological role of these transporters. The ABC gene YLL048 encodes a novel intracellular transporter translocating peptides from the cytosol to the lumen of the ER. Deletion of the gene resulted in loss of peptide transport activity. The transport activity was fully restored after transformation of the deletion mutant by plasmid-encoded YLL048. Studying the substrate specificity using randomized peptide libraries it was demonstrated that peptides of the size from 6 to 56 amino acids are recognized. So far, no upper limit of the substrate size was obtained. Introduction of D-amino acids in various positions of a nonamer peptide did not impair transport activity. The physiological function of YLL048p is not well understood. The gene product is not essential for cell viability as the deletion mutant did not show any growth phenotype. To examine the possibility that YLL048 encoded protein is part of a quality control of yeast cells involved in the unfolded protein response (UPR), upregulation of YLL048 transcription by heat shock and stress conditions were investigated. We could not observe an influence of stress factors on YLL048 mRNA level. Upregulation of gene expression by the transcription factors Pdr1p and Pdr3p was excluded. The ABC transporter Mdl1p has been identified as peptide transporter of the inner mitochondrial membrane. This protein is required for the export of peptides with the size of 6 to 21 amino acids from the matrix into the intermembrane space. These peptides are generated by m-AAA proteases degrading non-assembled or missfolded membrane proteins. In order to understand the transport mechanism in detail, Mdl1p was expressed in S. cerevisiae and E. coli. Partially enriched protein was reconstituted into liposomes and was active in ATP binding. The association of the NBDs has been described as a central step of the ATPase cycle of ABC transporters, but it is still controversial how both motor domains cooperate and coordinate ATP hydrolysis. To address this question, the Mdl1p-NBD was overexpressed in E. coli and purified to homogeneity. The isolated NBD was active in ATP binding and hydrolysis with a turnover of 0.5 ATP per min and a Km value of 0.2 mM. Isolated NBDs did not show cooperativity in ATPase activity. However, the ATPase activity was observed to be non-linearly dependent on protein concentration suggesting the active form of this enzyme is not a monomer. Very importantly, for the first time an ATP-induced dimer was observed after trapping the NBD by ortho-vanadate or BeFx. The nucleotide composition of the trapped intermediate state was determined and two ADP molecules were simultaneously bound per dimer. An ATP-induced dimer of the ATPase inactive mutant (E559Q) was observed already in the absence of ATPase inhibitor. The E599Q dimer contained two ATP molecules in the absence of Mg2+ at 4°C. Prolonged incubation at 30°C in the presence of Mg2+ induced a stable dimer in which one ATP and ADP molecule were trapped at the same time. Based on these experiments, a new cycle for ATPase activity of ABC transporters was proposed. Binding of ATP to two NBD monomers induces dimerization. Both nucleotides are hydrolysed sequentially. During the hydrolysis cycle the nucleotides cannot be released from the dimer. After hydrolysis of two ATP molecules the domains dissociate and start a new cycle.
Ziel dieser Arbeit war es, mit den Methoden der NMR-Spektroskopie die elektrostatischen Eigenschaften der Xylanase aus Bacillus agaradhaerens in Abhängigkeit vom pH-Wert zu charakterisieren. Für die vorliegende Arbeit wurde das Strukturgen der Xylanase in verschiedene Expressionsvektoren des pET-Systems kloniert, wobei das Enzym auf 207 Aminosäuren verkürzt wurde. Diese Länge entspricht der publizierten Kristallstrukur von Sabini et al. (1999). Die Expression in pET3a und die Aufreinigung des Genproduktes mit Ionenaustauschchromatographie wurde optimiert, sodass homogenes Protein mit guten Ausbeuten erhalten werden konnte. Die Xylanase wurde mit den Isotopen 15N und 13C markiert und heteronukleare, mehrdimensionale NMR-Spektren wurden für die Zuordnung der Resonanzen des Proteins aufgenommen. Die chemischen Verschiebungswerte des Proteinrückgrats und die der aliphatischen Seitenketten wurden vollständig zugeordnet. Als eine weitere Voraussetzung für eine pH-Titration wurden sequenzspezifisch die Resonanzen der Histidin- bzw. Carboxylatgruppen bestimmt. Die Lösungsstruktur der Xylanase wurde anhand mehrerer automatisierter Prozeduren errechnet, um die Zuordnung der Resonanzen zu validieren. Alle Strukturelemente, die bereits aus der Kristallstruktur bekannt sind, wurden korrekt wiedergegeben. Da die Lösungsstruktur mit einem backbone RMSD-Wert von 2.44 ± 0.29 Å hoch 2 als vorläufig zu betrachten war, wurde im Folgenden ausschließlich die Kristallstruktur zur Bewertung der Distanzbeziehungen verwendet. In Abwesenheit des Substrats wurden die pH-abhängigen Resonanzen der Histidin- und Carboxylatgruppen sowie der Amide des Proteinrückgrats gemessen. Die Auswertung ergab 220 Titrationsprofile der 15N- and 13C-Resonanzen in einem pH-Bereich von 3.2 bis 8.7. Durch nichtlineare Regression der gemessenen Werte an eine modifizierte Henderson-Hasselbalch Gleichung wurden die pK S-Werte der Seitenketten von Aspartat und Glutamat, sowie für das C-terminale Carboxylat und für die Histidingruppen bestimmt. Die Titrationskurven der katalytischen Dyade zeigten eine ausgeprägte gegenseitige Wechselwirkung. Die korrespondierenden pK S-Werte stimmen gut mit dem vorhergesagten enzymatischen Mechanismus überein (Sabini et al., 1999) und belegen, dass das Nukleophil Glu94 bei einem neutralem pH-Wert deprotoniert ist, während die Bronsted Säure/Base GIu184 zu ca. 30% protoniert ist. Um die Untersuchungen zur katalytischen Aktivität zu vervollständigen, wurden alle pH-abhängigen [15N]-Resonanzen der Amide des Proteinrückgrats wie auch die der lndolstickstoffe in der Substratbindungsspalte analysiert. Die Wendepunkte konnten dem Titrationsverhalten der benachbarten sauren Aminosäure-Seitenketten zugeordnet werden. Aber es erscheint sehr wahrscheinlich, dass ein wesentlich komplexerer Ablauf stattfindet. Die asymmetrische Wechselwirkung von Trptophan-Seitenketten bezüglich der katalytischen Dyade wie auch das wechselnde Monotonieverhalten der Titrationskurven deuten auf eine simultane Reorganisation der Seitenkettenkonformere bei pH ungefähr gleich 6 und/oder auf eine Änderung des Wasserstoffbrückennetzwerkes innerhalb der Bindungsspalte.
For palaeotropical regions, only a few anecdotal reports had been published on the existence of 'ant-gardens' before this study started. As opposed to this, 'ant-house epiphytes' (i.e. domatiabearing epiphytes) were reported to be highly abundant in Southeast Asia and were presumed to be a second type of ant-epiphyte interaction. In the much better studied neotropical regions the situation seemed to be the reverse: Many reports on AGs in contrast to very few reports on anthouse epiphytes. In this study, I have presented extensive data which may help towards a better understanding of the 'Southeast Asian part' of this 'ant-epiphyte puzzle'. In Peninsular Malaysia, Borneo, Java, and Southern Thailand, a great variety of formerly unknown AG systems were discovered. 18 ant species (from 5 genera, 4 subfamilies) were identified as true AG ants, i.e. these ants actively retrieved seeds of certain epiphyte species into their carton nests. Another 49 ant species inhabited AGs as secondary, opportunistic settlers. On the epiphyte side, 84 plant species were found growing on AGs, 51 (19 genera, 12 families) of which were probably true AG epiphytes, i.e. ants retrieved the seeds to their arboreal carton nests, on which the epiphytes were then cultivated. Most of the epiphyte flora of lowland forests in Peninsular Malaysia (except for ferns, orchids and facultative epiphytes) seemed to be totally dependent on ants for their establishment in the canopy. Together with the high number of opportunistic AG inhabitants (ants, epiphytes, and many arthropod guests), these facts suggest that AGs function as pioneers in the canopy of Southeast Asian rain forests. Moreover, AG-associations might even have accounted for the unusual species richness in the epiphyte genera Dischidia, Hoya (Asclepiadaceae), Myrmecodia, and Hydnophytum (Rubiaceae). The definition of the term ant-garden only describes the basic interactions. In the ant-garden associations investigated in this study, interactions going beyond these basic ones varied depending on ant and epiphyte species. Ant-gardens initiated by Diacamma spKfmA111 were regarded as the 'most primitive' type, because this ponerine was totally dependent on preformed cavities for nest establishment, did not tend any trophobionts, and was the least selective in its seed-retrieving behavior. On the other end of the scale, Crematogaster spKfmA18 and Camponotus spKfmA9 were rated as 'most advanced' because both lived in free (i.e. cavityindependent) AGs, tended trophobionts underneath their nests, were associated with a couple of other organisms, and were highly selective in their seed-retrieving behavior. Moreover, Camponotus spKfmA9 occurred preferentially with one single epiphyte species, Hoya elliptica (Asclepiadaceae), and Crematogaster spKfmA18 was specialized on some species of giant bamboo as phorophyte. Philidris spKfmA160, which occupied a medium position in relation to the other AGs was particularly interesting for several reasons. This ant species was mainly associated with ant- house epiphytes and occurred in the heath forests of Borneo. However, the major part of the colonies, including the queen, was located underneath carton structures near the surface of the host tree and not inside the domatia of the associated plants. Moreover, very young Philidris spKfmA160 colonies had only small seedlings growing on their carton nests. The ant workers actively retrieved the seeds of their epiphyte partners into the nests. These results indicate that associations with ant-house epiphytes must be regarded as a special case of ant-gardens. I therefore suggest using the term 'ant-house' only to describe the epiphytes, but not to describe the association, and to include this type of association in the group of AGs. Strict species-specificity never occurred, but some epiphytes showed great preference for growing on the nests of certain ant species, while others occurred over a wider range. Vice versa, most ant species had several epiphytes growing on their nests, while others were mostly found with one or very few epiphyte species. These patterns were shown to be the effect of different factors, including common microclimatic preferences of ants and epiphytes, interspecific competition of epiphytes, and selective seed retrieval of AG ants. The main behavioral trait responsible for the establishment of AGs was the selectivity shown by the ants in the epiphyte seeds they carried. However, details of the mechanisms, i.e. what characteristics of the seeds are important and what motivates the ants to retrieve them, varied widely. In many cases, seed compounds located on the surface triggered carrying behavior. Detailed experimental investigations combined with literature data from the two other known 'myrmecochory systems', terricolous myrmecochores and neotropical AGs, suggested that myrmecochory is frequently triggered by a two-stage system. One relatively unspecific compound (or a combination of such compounds) constitutes the basic attractiveness for a number of ant species. Other seed characteristics (elaiosomes, mechanical properties, other surface-compounds) modulate this basic signal, accounting for species-specific preferences of ants towards certain plant species. A comparison of AGs in Southeast Asia and the neotropics shows that the numbers of AG ant and epiphyte species in each case are almost equal. Southeast Asian AG epiphytes might even turn out to outnumber the neotropical ones. Thus, not only was it possible to break down the distinction between ant-house and AG associations, but also to show that AGs in Southeast Asia are present in such high diversity and abundance as to diminish the apparent contrast between the two biogeographical regions yet further. These data help to solve at least the Southeast Asian part of the 'ant-epiphyte puzzle'.
In der vorliegenden Arbeit sollten die in unserer Arbeitsgruppe identifizierten Splice- Varianten des murinen ARVCF (mARVCF) cloniert und charakterisiert werden. Es wurde gezeigt, daß alle 8 putativen Isoformen im gleichen Maße mit den Zelladhäsions-Molekülen M-, E- und N-Cadherin interagieren können und mit diesen an der Plasmamembran bzw. den Zell-Zellkontakten colocalisieren. Dabei nimmt N-Cadherin eine Sonderstellung ein. Zum einen ist die Interaktion mit endogenem N-Cadherin abhängig vom Zellkontext und zum anderen konnte mit Hilfe des MOM recruitment assays gezeigt werden, daß, im Gegensatz zu MOM-M- und MOM-E-Cadherin, eine Assoziation von mARVCF und MOM-N-Cadherin nicht in jeder Zelle stattfindet. Eine mögliche Konkurrenz von mARVCF mit dem nahe verwandten armadillo repeat Protein p120(ctn) um die Bindestelle in N-Cadherin konnte dabei als Ursache ausgeschlossen werden. Als nächstes wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, daß mARVCF eine duale Lokalisation an der Plasmamembran und im Zellkern aufweist. Dabei unterliegt mARVCF einem effektiven Exportmechanismus. Dieser Export kann durch Leptomycin B inhibiert werden, scheint somit also CRM1/exportin1-vermittelt zu sein und wird offenbar durch zwei verschiedene NES (nuclear export signal)-Sequenzen in mARVCF reguliert. Das in der p120(ctn) Subfamilie (zu der auch mARVCF gehört) konservierte NLS (nuclear localisation signal) konnte als für den Protein-Import unwirksam charakterisiert werden. Weiterhin wurde das LIM-only Protein FHL2 als neuer Interaktionspartner von mARVCF identifiziert. Dabei wirkt mARVCF als Mediator zwischen dem Cadherin- Catenin Komplex an der Plasmamembran und dem Interaktionspartner der Integrine FHL2. mARVCF ist in der Lage, FHL2 aus den Fokalkontakten zum Cadherin- Catenin Komplex an der Membran zu translozieren und in den Komplex einzubinden.
Periplasmic Sud protein encoded by the Wolinella succinogenes catalyses the transfer of bound polysulfide-sulfur to the active site of the membrane bound polysulfide reductase. The homodimeric protein consists of 131 residues per monomer, each with one cysteine residue in the active site. Polysulfide-sulfur is covalently bound to the catalytic Cys residues of the Sud protein. In order to understand the structure-function relationship of this protein, the features of its solution structure determined by heteronuclear multidimensional NMR techniques are reported here. The first step of structure determination leads to resonance assignments using 15N/13C/2H- and 15N/13C-labeled protein. The sequential backbone and side chain resonance assignments have been successfully completed. Structure calculations were carried out using the ARIA program package. The structure is based on 2688 NOE-derived distance restraints, 68 backbone hydrogen bond restraints derived from 34 slow-exchanging backbone amide protons and 334 torsion angle restraints obtained from the TALOS program as well as 158 residual dipolar coupling restraints for the refinement of relative vector orientations. The three-dimensional structure of the Sud protein was determined with an averaged rootmean- square deviation of 0.72 Å and 1.28 Å for the backbone and heavy atoms, respectively, excluding the terminal residues. Without the poorly defined segment between residues 90-94 the average r.m.s.d. value drops down to 0.6 Å and 1.14 Å. The ensemble refined with residual dipolar coupling (rdc) restraints shows good convergence. The r.m.s.d. value for the backbone heavy atoms, excluding residues 90- 94, drops down from 0.97 to 0.66 for the rdc-refined ensemble. The relative orientation of the two monomers in the protein structures refined with residual dipolar coupling restraints are also different from those without residual dipolar coupling restraints. The structure determination of the dimeric protein has been hampered by the high molecular mass (30 kDa), severe peak degeneracy, and by the small number of experimental intermonomer NOEs (relative orientation problem of two monomers). For the resonance assignments of aliphatic side chain, many resonances were ambiguously assigned because of severe overlap of signals. The Sud dimer protein contains 17 Lys, 14 Leu and one His tag for each monomer. It complicated the resonance assignments. The conventional 3D 15N-separated TOCSY HSQC experiment failed because of the large molecular weight which results in line broadening and hence made the resonance assignments of side chains more difficult. The determined structure contains a five-stranded parallel ß-sheet enclosing a hydrophobic core, a two-stranded anti-parallel ß-sheet and seven a-helices. The dimer structure is stabilized predominantly by hydrophobic residues. Sud catalyses the transfer of the polysulfide-sulfur to cyanide, similar to rhodanese encoded by Azotobacter vinelandii (Bordo et al., 2000). The two proteins are similar in the active site environment primarily owing to the main-chain conformation of the active-site loop with the cysteine residue and with respect to the surrounding positively charged residues. The active-site loop (residues 89-95) in the Sud protein appears to be flexible, reflected by few assigned proton resonances of residues 90-94 in the active site. Despite their similarity in function and their similar structure in active site, the amino acid sequences and the folds of the two proteins are remarkably different. The negatively charged polysulfide interacts with positively charged R46, R67, and R94 and hence may be stabilized in structure. The mutation of one of the three arginines that are also conserved in rhodanese from A. vinelandii leads to a loss of sulfur-transfer activity. The polysulfide chain extends from inside of Sud protein to outside, where Sud may form contacts with polysulfide reductase. These contacts provide the possible polysulfide-sulfur transfer from Sud protein to the active site of polysulfide reductase.
In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Ca2 -abhängige NDPase (EC 3.6.1.6) kloniert und funktionell charakterisiert werden. Die mRNA der Ca2 -NDPase wurde in allen untersuchten Geweben der Ratte nachgewiesen. UDP, GDP und IDP, jedoch nicht ATP und ADP waren Substrate der Ca2 -NDPase. Ihre Enzymaktivität war strikt von Calciumionen abhängig und zeigte ein breites pH-Optimum zwischen 6,5 und 7,5. Der Km-Wert für UDP lag bei 216 µM. Die Ca2 -NDPase konnte im ER und in Prä-Golgi-Strukturen lokalisiert werden. Sie ist ein Transmembranprotein, dessen katalytische Domäne im Lumen des ER liegt. Dort ist sie vermutlich ein wichtiger Bestandteil der Qualitätskontrolle neu synthetisierter glycosylierter Proteine, in dem sie das die UDP-Glucose:glycoproteinglucosyltransferase inhibierende UDP zu UMP hydrolysiert. Das resultierende UMP dient als Antiporter um UDP-Glucose, das im Zytosol synthetisierte Substrat der UDP-Glucose:glycoproteinglucosyltransferase, in das ER zu transportieren. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die Oligomerstrukturen der zelloberflächenlokalisierten NTPDase1 und NTPDase2 untersucht. Die Enzyme wurden heterolog in Xenopus laevis-Oocyten exprimiert. Nach metabolischer Markierung sowie Zelloberflächenmarkierung wurden die mittels Hexahistidyl-Epitop markierten Proteine durch Digitonin solubilisiert und die Oligomerenkomplexe wurden über Ni2 -NTA-Chromatographie gereinigt. Die gereinigten Proteinkomplexe wurden mittels Cross-Linking-Experimenten und der Blau-nativen Gelelektrophorese analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die NTPDase1 an der Zelloberfläche als Dimer vorlag. Die Dimerisierung erfolgte nicht über intermolekulare S-S-Brücken. Die Dimere der NTPDase1 erwiesen sich als relativ stabil. Inkubation bei 37°C resultierte mit zunehmender Dauer in einer steigenden, jedoch auch nach zwei Stunden noch nicht vollständigen Dissoziation der Dimere. Inkubation unter reduzierenden Bedingungen führte ebenfalls nicht zur vollständigen Dissoziation. Erst eine Inkubation bei 37°C in Gegenwart von DTT und Coomassie Brilliant Blue G250 vermochte eine vollständige Dissoziation der NTPDase1 zu bewirken. Zur vollständigen Dissoziation der Multimerstruktur der NTPDase1 wurden somit das Reduktionsmittel DTT und die unter diesen Bedingungen denaturierende Wirkung des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G250 benötigt. Die NTPDase2 bildete kein distinktes Multimer, sondern lag im nativen Zustand an der Zelloberfläche in Form von nicht intermolekular über S-S-Brücken verknüpften Di-, Tri- und Tetrameren vor. Die Homomultimere der NTPDase2 zeigten im Vergleich zur NTPDase1 eine deutlich höhere Stabilität. Inkubation unter reduzierenden Bedingungen und in Gegenwart von Coomassie Brilliant Blue G250 führte im Gegensatz zur NTPDase1 nur zu einer unwesentlichen Dissoziation der Multimerstrukturen. Die Substratspezifität der NTPDase2 änderte sich mit zunehmender Dauer der heterologen Expression. Die ADPase-Aktivität der NTPDase2 stieg nach sieben Tagen signifikant (p < 0,0001) um das vierfache im Vergleich zum ersten Tag der Expression. Dies erniedrigte das ATP:ADP-Verhältnis von 1 : 0,1 nach 24 h Expression zu 1 : 0,4 nach sieben Tagen. Die Änderung der Substratspezifität der NTPDase2 ging mit einer Änderung des multimeren Verteilungsmusters der NTPDase2 einher. Mit zunehmender Expressionsdauer nahm der relative Anteil an höheren Multimeren zu. Im Gegensatz zur NTPDase2 zeigte die NTPDase1 keine signifikanten Änderungen ihrer Substratspezifität und Multimerstruktur. Die durch unterschiedliche Verteilungsmuster der Multimere bedingte Änderung der Substratspezifität der NTPDase2 eröffnet eine neue Möglichkeit zur Modulation Nukleotid-vermittelter Signalübertragung. Es konnte keine signifikante Tendenz zur Ausbildung von Heteromultimeren aus NTPDase1 und NTPDase2 nachgewiesen werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden 10 Typen der Gehölzvegetation und 14 Typen der Krautvegetation für das Untersuchungsgebiet Atakora vorgestellt. Dabei konnten nur Sonderstandorte, wie Galeriewälder und Lateritkrusten, klar abgetrennt werden. Viele Arten besitzen keine eindeutigen ökologischen Präferenzen, was sich gut mit der Einschätzung der lokalen Bevölkerung deckt, die für den Großteil der Arten angaben, dass diese wüchsen wo sie wollten. Dabei fällt auf, dass sich die Typen (vor allem in Gehölzschicht aber auch in Krautschicht) in den einzelnen Dörfern oft nur in Teilen entsprechen. Gründe dafür konnten nur teilweise in den unterschiedlichen ökologischen Gegebenheiten und unterschiedlichen Nutzungspräferenzen einzelner wichtiger Trennarten gegeben werden. Selten findet sich ein hundertprozentiges Zusammentreffen eines Gehölztyps mit einem Krauttyp. Damit bestätigt sich die Annahme unterschiedlicher Entwicklungsbedingungen und teilweise unabhängiger Entwicklung dieser beiden Elemente in der westafrikanischen Savanne. Gesellschaften, in denen eine Krautschicht mit einer Gehölzschicht eng korreliert sind, konnten nur für landwirtschaftlich nicht genutzte Sonderstandorten wie Galeriewälder und Lateritkrusten gebildet werden. Zudem zeigt sich, dass die Vegetation in der dichter besiedelten Ebene klarer strukturiert ist, als in der Bergregion. Dies trifft vor allem auf die Gehölzvegetation zu. Dennoch sind erstaunlich viele Gehölzarten auch in der intensiver genutzten Ebene anzutreffen, was für große Regenerationsfähigkeit und die Anpassung der hauptsächlichen Savannengehölze an das menschliche Wirken spricht. Die geringere Zahl an Gehölzarten in der Ebene ist hauptsächlich Resultat der wesentlich stärker degradierten Galeriewälder. In den Berggebieten sind zudem mehr Gehölzschichttypen und mehr krautige Arten angetroffen worden. Hier zeigt sich, dass Berggebiete auch in dieser Untersuchungsregion als Refugium für Vegetationsformationen und Arten gelten können. Die Nutzung von Wildpflanzen für verschiedene Zwecke wurde dokumentiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Präferenzen für diverse Nutzungen auf ethnischen, teilweise auch auf persönlichen Präferenzen, sowie auf der Verfügbarkeit der Pflanzen basieren. Dabei zeigte sich, dass die Präferenzen von Arten als Bau- und Brennholz eher auf der Verfügbarkeit basieren, während die Präferenzen für Medizinalpflanzen eher auf ethnischnen Vorstellungen von Wirksamkeit und teilweise auch auf kollektiven Erfahrungen basieren. Es erwies sich, dass die traditionelle Nutzung von Wildpflanzen als Brenn- und Bauholz und zu zusätzlichen Ernährung in dem Untersuchungsgebiet einen geringen Einfluß auf die Biodiversität hat, solange diese Pflanzen nicht kommerzialisiert werden. Es gibt genügend Pflanzenarten, die leicht zu finden sind und gute Eigenschaften für die eingesetzten Zwecke aufweisen, so dass man meist auf die jeweiligen in einem Dorfgebiet häufig anzutreffenden Arten ausweichen kann. Für diese geringe Auswirkung der traditionellen Nutzung von Gehölzpflanzen auf die Biodiversität sprechen auch die Aussagen der Bevölkerung über die geringere Verfügbarkeit von Gehölzpflanzen zu bestimmten Nutzungen. Dabei ergab sich eine Reihung von Nennungen, die von weniger Bauholz über weniger Brennholz zu weniger Gehölzpflanzen für die traditionelle Medizin abnahmen. Zudem wurde in allen Befragungen verneint, dass eine Art aus dem Dorfgebiet verschwunden wäre. Daraus läßt sich schließen, dass ein Großteil der wichtigen Gehölzpflanzen in dem Untersuchungsgebiet noch vorhanden ist, aber auf Grund der intensivierten Landwirtschaft nicht mehr in der Lage ist, sich zu richtigen Bäumen zu entwickeln. Da sich dadurch einige Gehölzpflanzen nur noch vegetativ vermehren können, kann eine genetische Verarmung von Populationen bestimmter Arten angenommen werden. Dies wäre ein interessanter Ansatzpunkt für zukünftige Forschungen. Ein negativer Einfluß auf die Biodiversität durch traditionelle Nutzungen ist bei der Nutzung von Gehölzpflanzen für die traditionellen Medizin größer, vor allem wenn Wurzeln verwendet werden. Dennoch lässt sich erkennen, dass der Einfluß der traditionellen Nutzungen von Wildpflanzen im Vergleich zu der landwirtschaftlichen Nutzung der Flächen einen marginalen Effekt auf die Vegetation hat. Im Rahmen der ethnobotanischen Befragungen wurden Pflanzennamen, Umweltwahrnehmung und die Vorstellungen von Krankheit der Bétamaribè und Wama dokumentiert. Diese weisen im Gegensatz zu den Vorstellungen anderer afrikanischer Völker kaum Differenzen auf. Die Vorstellungen von Krankheit sind dabei von einem starken Wandel betroffen, da man sich immer stärker auf westliche Konzepte und Medikamente verläßt. Ein positiver Effekt hiervon auf die Phytodiversität ist jedoch nicht zu erwarten, da die Medikamentkosten eine Intensivierung der Landwirtschaft erfordern. Über 240 traditionelle Heilrezepte wurden gesammelt. Die wichtigste Rolle spielen dabei Gehölzpflanzen. Dabei zeigt sich, dass sich die Präferenzen zwischen den einzelnen Dörfern stärker unterscheiden als bei der Nutzung von Pflanzen zu Brenn- und Bauholzzwecken. Auch erweisen sich große Unterschiede zu Verwendungen von Medizinalpflanzen in anderen Untersuchungsgebieten. Dies liegt an unterschiedlichen Vorstellungen und Erfahrungen zur Wirksamkeit von Pflanzen vor allem bei Krankheiten, die auch von alleine wieder vergehen wie Magen-Darm-Erkrankungen. Das Wissen über Heilpflanzen ist in der Ebene geringer ausgeprägt, als in den beiden Bergdörfern. Gründe hierfür können jedoch nicht alleine in den geringeren pflanzlichen Ressourcen gesehen werden. Ein Wandel in der Landwirtschaft bezieht sich hauptsächlich auf die Anbauprodukte. Während traditionelle angepaßte Cerealien seltener angebaut werden, baut man viele Produkte für den Verkauf an. Die herausragende Stellung darunter nimmt die anspruchsvolle und arbeitsintensive Baumwolle ein. Die Auszahlungsmodalitäten der halbstaatlichen Baumwollgesellschaft kommen dabei den bäuerlichen Bedürfnissen am ehesten entgegen. Um den finanziellen Ansprüchen der Verwandtschaft zu entgehen werden kurzfristige Strategien zur Geldbeschaffung angenommen. Es zeigt sich also, dass die Ursachen von Degradation eher in dem Kulturwandel und einer zunehmenden Abhängigkeit der Bauern von Bareinkünften zu sehen ist als in der oft pauschal genannten Überbevölkerung. Zukünftige Forschungen über Biodiversität und Vegetationswandel sollten auch den Kulturwandel stärker berücksichtigen. Die Degradation zeigt sich in dem Untersuchungsgebiet mehr in der Verarmung der Böden als in einem Rückgang der Biodiversität. Obwohl schon historische Vegetationsbeschreibungen von einer starken Beeinträchtigung der vermuteten natürlichen Wälder sprechen, ist nicht davon auszugehen, dass sich die Vegetation in dem Untersuchungsgebiet die letzten 50 Jahre stark verändert hat. Das in nördlicheren Gebieten von der lokalen Bevölkerung beobachtete Verschwinden von Arten wird kategorisch verneint. Bei den genannten zurückgehenden Arten handelt es sich hauptsächlich um wichtige Nutzarten. Da hierzu historische Daten fehlen, kann es sich auch um selektive Wahrnehmung der Bauern handeln. Dennoch ist anzunehmen, dass sich in Zukunft die Degradationsphänomene verschlimmern werden. Da die Bargeldbedürfnisse der Bauern nicht mehr zurückzuschrauben sind und zudem die Experimentiefreudigkeit in der recht unsicheren Umweltsituation gering ist, muss auf bestehende Produkte zurückgegriffen werden, um sowohl diese Bargeldbedürfnisse zu befriedigen, als auch die Umwelt zu schonen. Eine Chance hierfür könnte eine Vermarktung von Fonio, wie bereits in Mali geschehen, darstellen. Dieses anspruchslose, noch auf sehr ausgelaugten Böden wachsende und zudem sehr nahrhafte und wohlschmeckende Getreide sollte wieder vermehrt angebaut werden und auf lange Sicht die anspruchsvolle und Boden auslaugende Baumwolle ersetzten. Dies ist jedoch nur möglich, wenn Fonio über internationale Strukturen auch in Europa und Amerika vermarktet wird. Eine weitere finanziell nicht ausgeschöpfte Ressource bieten die Mangobäume. In der Hochzeit der Mangoernte werden die Bäume vielfach nicht mehr abgeerntet, weil die Preise für die Früchte stark sinken. Die Früchte fallen dann meist Flughunden und Vögeln zum Opfer. Wie das Beispiel Burkina Faso zeigt, könnten diese Früchte getrocknet, zu Marmelade oder Saft verarbeitet werden und selbst in Europa in dieser haltbaren Form verkauft werden. Leider sind bislang die entsprechenden Initiativen und Strukturen dazu in Benin noch nicht geschaffen. Eine weitere, wenn auch langfristigere Möglichkeit wäre die Ersetzung der Baumwollfelder durch Cashjew-Pflanzungen. Diese werden von der Bevölkerung immer mehr angenommen. Dabei könnten neue Gehölzresourcen geschaffen und die Bodenfruchtbarkeit erhöht werden. Einige Initiativen von kleinen NGO's, die das Pflanzen von Bäumen befürworten, finden großen Anklang. Es muß nur eine Möglichkeit gefunden werden, solche Produkte auch international zu kommerzialisieren, um die Böden stark belastende und zudem arbeitsaufwendige Baumwolle zu ersetzten. Zudem sind Initiativen von einzelnen Dörfern in der Atakoraregion, Teile des Dorfgebietes unter Schutz zu stellen und damit Ressourcen und Wissen vor allem für die traditionelle Medizin zu sichern, ermutigend. Es zeigt, dass die lokale Bevölkerung Bedrohungen ihrer Umwelt ernst nimmt und versucht mit Hilfe von NGO's Gegenmaßnahmen zu schaffen. In diesem Hinblick wäre es wichtig, dass sich zukünftige Forschungen mehr den pharmazeutischen Inhaltsstoffen von Heilpflanzen widmen, so wie dies in Südamerika bereits geschieht. Dabei sollten jedoch die Rechte der autochtonen Bevölkerung gewahrt werden. Zudem wäre es wichtig, mehr über die Ökologie einzelner Gehölzpflanzen unter Berücksichtigung der jeweiligen Nutzungsverhältnisse zu kennen. Hierbei wäre es auch interessant über die Naturverjüngung ausgewählter Arten zu arbeiten. Zudem sollten Forscher, die über Degradationsprobleme arbeiten, vor allem in angewandten Bereichen, mehr auf die Erfahrungen der lokalen Bevölkerung hören und weniger scheinbar offensichtliche und populäre Theorien wie Überbevölkerung strapazieren. Dabei sollten auch vermehrt historische Quellen zu Rate gezogen werden, da es scheint, dass die westafrikanische Savanne nicht so degradiert ist, wie es oft behauptet wird und noch große Potentiale besitzt, wenn diese richtig genutzt werden. Abschließend sei bemerkt, dass, wenn man Berichte aus anderen afrikanischen Regionen hört und sieht, der Norden Benins als "Insel der Glückseeligen" betrachtet werden kann. Die politische Lage ist stabil, die Bevölkerung aufgeschlossen und freundlich, es gibt kaum Kriminalität, große Krankheitsepedemien sind in den letzten Jahren ausgeblieben, Hunger wird selten erlitten und auch die Umweltdegradation hält sich in Grenzen. Möge die hier vorliegende Arbeit dazu beitragen, diese Region und die Bétamaribè ein wenig mehr ins Bewußtsein der Öffentlichkeit bringen und ein wenig dazu beitragen, dass die Situation der Region und ihrer Bevölkerung sich nicht verschlechtert.
Wolinella succinogenes reduziert Fumarat mit H2 oder Formiat als Elektronendonor. Der Elektronentransport wird von der membranständigen Hydrogenase oder Formiat-Dehydrogenase und der Fumarat-Reduktase katalysiert. Redoxmediator zwischen beiden Enzymen ist Menachinon. Der Elektronentransport ist mit der Erzeugung eines elektro-chemischen Protonenpotentials (Dp) gekoppelt. Ziel dieser Arbeit war, den Mechanismus der Dp-Entstehung durch Rekonstitution der gekoppelten Fumarat-Atmung in Liposomen aufzuklären. Aus Wolinella succinogenes isolierte Hydrogenase und Fumarat-Reduktase wurden in Liposomen eingebaut, die Menachinon enthielten. Die resultierenden Proteoliposomen kataly-sierten die Reduktion von Fumarat mit H2. Die Wechselzahl der Enzyme im Elektronentrans-port von H2 zu Fumarat war etwa 10 % von der in Bakterien. In den Proteoliposomen waren sowohl Hydrogenase als auch Fumarat-Reduktase ausschließlich nach außen orientiert. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass die Proteoliposomen sphärische Vesikel mit einem mittleren Außendurchmesser von 88 nm waren. Die Proteoliposomen enthielten statistisch 8,4 Hydrogenasemoleküle und 72 Fumarat-Reduktasemoleküle. Alle aktiven Enzymmoleküle waren in der Proteoliposomenmembran zufällig verteilt eingebaut und nahmen am Elektronentransport von H2 zu Fumarat teil. Der aus dem Protonenpermeabilitätskoeffizienten (PH = 8,1·10-3 cm·s-1) berechnete unspezifische Protonenfluß über die Proteoliposomenmembran war etwa 20mal langsamer als der durch den Elektronentransport von H2 zu Fumarat katalysierte Protonenfluß. Während der Fumarat-Reduktion mit H2 entstand ein elektrisches Protonenpotential über der Proteoliposomenmembran (Dø = -0,19 V; innen negativ), das die gleiche Richtung und Größe hatte wie das Dø während der Fumarat-Atmung in Zellen von W. succinogenes. Der H /e--Quotient für die Fumarat-Reduktion mit H2 war in Proteoliposomen in Gegenwart von Valinomycin und externem K etwa 1. Das gleiche Dø und der gleiche H /e--Quotient waren mit der Reduktion von 2,3-Dimethyl-1,4-naphthochinon (DMN) durch H2 verbunden, wenn die Proteoliposomen Menachinon und Hydrogenase mit oder ohne Fumarat-Reduktase enthielten. Proteoliposomen, die Menachinon und Fumarat-Reduktase mit oder ohne Hydrogenase enthielten, katalysierten die Reduktion von Fumarat durch DMNH2, die aber nicht mit der Entstehung von Dp gekoppelt war. Proteoliposomen, die Formiat-Dehydrogenase, Menachinon und Fumarat-Reduktase enthielten, katalysierten die Reduktion von Fumarat oder DMN durch Formiat. Beide Reaktionen erzeugten über der Proteoliposomenmembran ein Dø von -0,13 V (innen negativ). Der H /e--Quotient der Formiat-Oxidation durch Menachinon oder DMN war nahezu 1. Die Entstehung von Dø war von der Art des in die Proteoliposomen eingebauten Chinons abhängig. Während der Reduktion von DMN durch H2 entstand ein Dø, wenn die Proteoliposomenmembran Menachinon, Vitamin K2 oder das aus W. succinogenes isolierte Methylmenachinon enthielt. Proteoliposomen ohne Chinon oder mit Vitamin K1 erzeugten kein Dø während der DMN-Reduktion mit H2. Die Fumarat-Atmung mit H2 war nur in Gegenwart von Menachinon oder Vitamin K2 mit der Entstehung von Dø gekoppelt. In dieser Arbeit wurde erstmals die gekoppelte Fumarat-Atmung mit aus W. succinongenes isolierten Elektronentransportenzymen in Lipsomen rekonstituiert. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass das durch die Fumarat-Atmung erzeugt Dp ausschließlich durch die Menachinon-Reduktion mit H2 oder Formiat entsteht, während die Menachinol-Oxidation mit Fumarat ein elektroneutraler Prozeß ist.
An der chemischen Synapse des Nervensystems führt ein präsynaptisches Aktionspotential zur Freisetzung eines Neurotransmitters, der über den synaptischen Spalt diffundiert und an die Rezeptoren der postsynaptischen Membran bindet. Die ionotropen Rezeptoren sind an dieser Membran zu Clustern aggregiert. Entstehung und Dynamik dieser Rezeptoraggregate sind für Funktion und Plastizität der Synapse essentiell. Für die Aggregation der inhibitorischen Glyzin- und der meisten Subtypen der GABAA-Rezeptoren ist das periphere Membranprotein Gephyrin notwendig. Es ist ein Schlüsselfaktor für die Genese und Aufrechterhaltung der glyzinergen postsynaptischen Membran. Dabei bindet es direkt an den GlyR und verbindet diesen über die Bindung von Mikrotubulie an das Zytoskelett. Auch andere Bindungspartner wurden nachgewiesen. Gephyrin ist in einer zweiten Funktion in die Synthese des Molybdän-Cofaktors involviert und weist Sequnezhomologien zu Proteinen anderer Spezies auf, die in diesen Syntheseweg eingebunden sind. Gephyrin ist ubiquitär exprimiert und wird alternativ gespleißt. Möglicherweise existieren verschiedene Varianten mit unterschiedlichen Funktionen. Die Untersuchung der Domänen und Bindungseigenschaften Gephyrins ist daher für das weitere Verständnis über Aufbau und Funktion der Synapse unerlässlich. In dieser Arbeit wurde ein Testsystem etabliert, mit dem sowohl heterolog exprimiertes als auch natives Gephyrin über die hoch-affine Bindung an den GlyR aufgereinigt werden konnte. Mit diesem System konnten erstmals unterschiedliche Varianten Gephyrins nachgewiesen werden. In verschiedenen Organen der adulten Ratte wurden dabei Gephyrinmoleküle mit Molekulargewichten zwischen 52 und den bekannten 93 kDA identifiziert. Auch Bestandteile des GlyR-Komplexes lassen sich mit dieser Methode anreichern. So wurde gezeigt, daß Gephyrin und Collybistin in einem trimeren Komplex mit dem GlyR vorliegen können. Hiermit ist es künftig möglich, in einem proteomischen Ansatz weitere aus dem GlyR-Konmplex anzureichern und zu identifizieren. Mit dem gleichen System wurde auch die Bindungsregion Gephyrins für den GlyR gefunden. Diese diskontinuierliche Bindungsstelle wird aus einer a-Helix der Aminosäuren 164 bis 184, sowie aus hydrophoben Resten gebildet, die von Aminosäure 15 bis 163 unregelmäßig über den gesamten N-Terminus Gephyrins verteilt sind. Zur Bindung an den GlyR werden beide Elemente benötigt. Das kleinste GlyR-bindende Gephyrinfragment erstreckt sich somit über die Aminosäuren 1-184. Mit einem Kosedimentationsassay wurde die Bindung Gephyrins an Mikrotubuli untersucht. Es stellte sich heraus, daß die vermutete Bindungsstelle nicht zur Bindung an Mikrotubuli benötigt wird. Vielmehr ist der C-terminale Abschnitt Gephyrins hierzu ausreichend. Um Regionen Gephyrins zu finden, die die Autoaggregation vermitteln, wurden Bindungsstudien mit dem Zwei-Hybrid-System und ein heterologes Expressionssystem in Zellkulturen durchgeführt. Es wurde gezeigt, daß sowohl die N- als auch der C-terminal gelegene Bereich in der Lage sind, mit Gephyrin zu aggregieren. Im C-Terminus wurde die Domäne auf 62 Aminosäuren eingegrenzt. Zur Erfüllung der verschiedenen Funktionen Gephyrins sind die hierfür notwendigen Domänen offensichtlich in modularer Art organisiert. So lässt sich durch alternatives Spleißen eine Variante exprimieren, die den speziellen Erfordernissen der Zelle gerecht wird. In dieser Arbeit wurden mehrere Domänen und Regionen Gephyrins eingegrenzt, deren Aufgaben von der GlyR-Bindung über die Autoaggregation zur Bildung glyzinerger Proteinkomplexe und der Verknüpfung mit dem Zytoskelett reichen. Somit konnte ein Beitrag zum weiteren Verständnis über die glyzinerge Synapse geleistet werden.
Diese Arbeit beschreibt die Identifizierung, Klonierung und Charakterisierung von zwei neuen humanen S1P-Rezeptoren. Damit wird die Familie der S1P-Rezeptoren um einen hochaffinen und einen niedrig affinen Rezeptor erweitert. Die Untersuchungen der Expressionsprofile aller humanen S1P/LPA-Rezeptoren sowohl in Herz-Kreislauf-relevanten Geweben als auch in Endothelzellen und glatten Muskelzellen erfolgten bisher nicht im Sinne der hier dargestellten familienübergreifenden Betrachtung. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit erstmalig auch der hS1P5-Rezeptor mit eingeschlossen. Wir konnten zeigen, dass zur Beurteilung der S1P- und LPA-Effekte in den untersuchten Gewebe- und Zellarten neben den bisher bekannten sieben Rezeptoren auch der hS1P5-Rezeptor betrachtet werden muss. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da in bisherigen Untersuchungen insbesondere bei der Interpretation der S1P-Wirkungen nur die Rezeptoren S1P1-3 berücksichtigt wurden. In dieser Arbeit wurde außerdem zum ersten Mal eine große Anzahl potentieller Lipidliganden an den S1P-Rezeptoren S1P1-3 und 5 sowie am hGPR63 getestet. Auch wenn hierbei keine neuen Liganden identifiziert werden konnten, grenzen unsere Untersuchungen die Zahl potentieller zusätzlicher Liganden ein. Außerdem konnten wir zeigen, dass Suramin nicht - wie bisher vermutet - ein spezifischer Antagonist des S1P3-Rezeptors ist, sondern auch S1P5-Rezeptor-vermittelte Effekte blockieren kann. Hierdurch kann eine Fehlinterpretation von durch Suramin-hemmbaren Effekten verhindert werden. Ein wichtiger Befund dieser Arbeit, insbesondere für die pharmazeutische Industrie, ist die speziespezifische Expression des S1P5-Rezeptors. Während in der Ratte hauptsächlich eine Verteilung des Rezeptors im ZNS zu beobachten ist, findet sich das humane Homologe hauptsächlich in peripheren und hier insbesondere Herz-Kreislauf-relevanten Geweben. Der Einsatz von Tiermodellen, bei denen es sich in der Regel um Nager handelt, zur Untersuchung der S1P-Effekte muss daher kritisch überdacht werden, da in diesem Fall ein im Menschen potentiell relevanter Rezeptor nicht in den peripheren Geweben der Ratte vorhanden und somit nicht an den S1P-Wirkungen beteiligt ist. Zudem konnten wir auch funktionelle Unterschiede zwischen den beiden Rezeptoren unterschiedlicher Spezies beobachten, was zusätzlich gegen die Verwendung von Tiermodellen zumindest bei Untersuchungen des S1P5-Rezeptors spricht. Neben der erstmaligen Charakterisierung der Signaltransduktionswege des S1P5-Rezeptors konnte im Laufe dieser Arbeiten eine weitere neue Eigenschaft des S1P5-Rezeptors festgestellt werden: Dieser ist in der Lage, ligand-unabhängige Effekte hervorzurufen. Dies ist von Bedeutung, da häufig Rezeptoren, die aufgrund von Mutationen konstitutiv aktiv sind, für die Ausbildung von Krankheiten verantwortlich sind. Wir konnten darüberhinaus zeigen, dass der zweite in dieser Arbeit identifizierte S1P-Rezeptor, der orphan-hGPR63, von relativ hohen Konzentrationen an S1P sowie von doPA angeschaltet wird. Wenngleich die Affinität des hGPR63 zu doPA niedrig ist, ist dies jedoch der erste Rezeptor, der auf dieses Lipid reagiert. Welche physiologische Bedeutung diesem Rezeptor zukommt, ist noch völlig offen, die primäre Expression im Hirn weist jedoch auf eine zumindest partielle zentrale Wirkung hin. Zusätzlich zu den molekularbiologischen Befunden können aus dieser Arbeit wichtige Informationen für das Screenen von GPCRs und hier insbesondere von Lipid-GPCRs abgeleitet werden. Allgemein gilt, dass der Auswahl des richtigen Versuchssytems im Hinblick auf die Fragestellung und das zu untersuchende Protein eine entscheidende Bedeutung zukommt. Während bei Rezeptoren mit einer restriktiven Gewebeverteilung die Suche nach einem geeigneten Zellsystem keine Schwierigkeiten bereitet, stellt dies das Hauptproblem in der Lipidforschung dar. Da es keine Säugerzellen gibt, die nicht auf S1P reagieren, muss jedes Versuchssystem erneut auf Eignung und optimale Zellart untersucht werden. So konnten in transient transfizierten CHO-K1-Zellen hintergrundfreie S1P-Signale im FLIPR-Versuch gemessen werden, während in den MAP-Kinase-Versuchen in CHO-K1-Zellen der hohe endogene Hintergrund das Versuchsfenster auf ein Minimum reduzierte. Während die Messung von LPA-Effekten in CHO-K1-Zellen mit der FLIPR-Technologie aufgrund der endogenen Signale nicht möglich ist, können LPA-Effekte in McARH7777-Zellen ohne störenden Hintergrund gemessen werden. In diesem Zellsystem ist wiederum die Messung von S1P nicht oder nur begrenzt möglich. Auch wenn diese Beispiele spezifisch für Lipidrezeptoren sind, lässt sich doch aus dieser Arbeit die Notwendigkeit ableiten, neben der richtigen Substanz-Bibliothek besonders bei der Suche nach Liganden für orphan-GPCRs das richtige zelluläre System einzusetzen.
One of the most species-rich ant-plant mutualisms worldwide is the palaeotropical Crematogaster-Macaranga system. The pioneer-tree genus Macaranga (Euphorbiaceae) is mainly inhabited by at least nine specific species of Crematogaster (Myrmicinae), of which eight belong to the subgenus Decacrema, as well as several species of Camponotus (Formicinae). Ant species are not randomly distributed among the Macaranga host plants but distinct patterns of associations have been found (Fiala et al., 1999 and references cited therein). The specificity of the associations is maintained in spite of common sympatric distribution of several host-plant species. Associations are, however, usually not species-specific and especially the Decacrema ants, that are the focus of this study, usually colonize several host plant species each. In this study I used a combined approach of ecological data as well as phylogenetic data based on mitochondrial DNA sequences in order to elucidate the factors determining the patterns found in the associations and the evolution of this mutualistic system between the specific Decacrema ant partners and their Macaranga host plants. Life history traits of seven different morphospecies found on the most common Macaranga host plants were compared and colony development was followed from colony founding on saplings to adult trees. Temporal variability of the associations between Decacrema ants and their respective host plants was also examined. Associations between Crematogaster ants of the subgenus Decacrema and their Macaranga host plants were found to be stable over periods of time, long enough to enable reproduction of the ant colony and (in most cases) the host plants, too. Life-expectancy of the ant colony seems to be shorter than that of the host plant in general. All adult trees still provide nesting space as well as food for the ants. Colonies from different morphospecies differed in longevity, the onset of alate production, queen number and mode of colony founding. The examined Decacrema species could be placed into two groups according to their life-history traits as well as on morphological grounds: The decamera-group and the captiosa-group, each named after one species that could be synonymized with one morphospecies included in the group. Members of the captiosa-group have larger colonies, presumably with a longer life-span, and a later onset of reproduction compared to the decamera-group. Additionally, queens of the captiosa-group found colonies on saplings as well as in the crown region of bigger trees, whereas queens of the decamera-group found colonies on saplings and small treelets only. Queens belonging to the captiosa-group are brown with relatively large eyes (= 1/3 of the head length), whereas queens from the decamera-group are smaller in size, are dark brown to black in colour and have smaller eyes (< 1/3 of the head length). On some of the host plants examined in this study lifespan of the host plant and their specific ant partners seemed to be well matched whereas on others an ontogenetic succession of specific Decacrema partner ants was found, when host plants were abandoned due to the death of comparatively short-lived ant colonies, usually from species belonging to the decamera-group. Ant-partners of saplings or young plants often differed from specific partner ants found on bigger trees. Only species belonging to the captiosa-group were found to re-colonize the crown region of adult trees, thus facilitating a change of ant species, when longlived host plant species were colonized by relatively short-lived species from the decamera-group first. When long -lived host plants were colonized by long-lived species from the captiosa-group associations were stabler: I did not find any temporal variation in ant-inhabitants then. Life-span of the ant colony as well colony founding behaviour of the different partner ant species therefore play an important role for these ontogenetic changes and the specificity of the associations over time. For the host plant the ontogenetic changes have a strong impact as uninhabited host plants that are not patrolled by workers of specific ant partners suffer higher herbivore damage. Uninhabited host plants may also be colonized by unspecific arboreal ants that only make use of the nesting space and/ or food offered by the plant but do not confer protection against herbivores. Stable associations with a specific ant partner are therefore most beneficial for the host plants. Usually ant colonies are monogynous, but changes in the colony structure were found locally in two Decacrema species. I found colonies that turned secondarily polygynous, possibly after the death of the original founding queen. Secondary polygyny therefore can prolong the life-span of the antcolony on its host plant, leading to a parallel life-history and stable association as it was the case in Macaranga bancana-Crematogaster captiosa. However, in the other association (Macaranga hypoleuca-Crematogaster cf. decamera) life-expectancy of the ant-colony is still much shorter than that of its host plant species, leading to a change in the specific ant partner at a later stage. Pleometrotic foundress associations that directly led to polygynous colonies in one species were also found locally, a phenomenon hardly ever reported from ants in general. Foundress associations were found to be more successful in establishing colonies than single queens. I found indications that this change in colony founding behaviour might be due to interspecific competition for the same host plant species with another Decacrema species specific to Macaranga. For the phylogenetic analysis partial mitochondrial cytochrome oxidase I and II were sequenced and Neighbor-Joining, Maximum Parsimony, Maximum Likelihood as well as Bayesian analyses were performed. The four different analyses yielded phenetic as well as phylogenetic trees that all had a similar topology. Ants of the subgenus Decacrema formed a monophyletic clade, indicating a single colonization event at the beginning of the Macaranga-Decacrema symbiotic system. In the phylogenetic analysis the decamera-group as well as the captiosa-group were confirmed and clearly separated from each other. However, two species that would have been placed into the decamera-group, due to morphological as well as life-history traits, formed a third separate clade within the Decacrema. These two species (msp. 7- group) as well as the decamera-group came out as the basal groups in the phylogenetic analysis. Thus, life -history traits of these two groups (relatively small colonies, early onset of alate production, colony founding in ground region only) would be the ancestral state for Macarangaassociated ants of the subgenus Decacrema. Changes in colony structure, like secondary polygyny, were found in the captiosa- as well as the decamera-group and are therefore independent of the affiliation within the phylogeny. I did not find evidence for strict cocladogenesis between the subgenus Decacrema and their Macaranga host-plants, although ecological interactions between the two partner groups are close and associations can be rather specific. The phylogenies presented here, along with the known association patterns indicate that host-shifting of the ants is common in some of the species, opening the possibility of sympatric speciation as a result of increased host usage. Additionally, the considerable geographic substructuring found in the phylogenetic trees suggests that allopatric speciation has played a major role in diversification of the Decacrema ants.
Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde der Großteil aller nuklearen Proteine annotiert und klassifiziert. Aus Literatur, Proteinsequenz- und Domänendatenbanken wurden bekannte nukleare Domänen ermittelt, ihre Grenzen unter Zuhilfenahme von Tertiärstrukturen oder Sekundärstrukturvorhersagen bestimmt und multiple Sequenzalignments erstellt. Die handgerfertigten Aligments wurden zur Anfertigung von Hidden Markov Models herangezogen und in das Domänenvorhersageprogramm Simple Modular Architecture Research Tool (Schultz et al. 1998, Schultz et al. 2000) (http://smart.embl-heidelberg.de/) implementiert. Hier sind umfassend Informationen über Literatur, phylogentische Verteilung, Anzahl beteiligter Proteine und Funktion für 164 Domänen (118 entstammen dieser Arbeit) mehr als 35000 Proteine abdeckend zusammengefasst. Aufbauend auf der vollständigen Kollektion nuklearer Proteine wurden ausgewählte nukleare und nicht-nukleare Proteine auf der Grundlage homologiebasierender Sequenzanalyseverfahren untersucht. Die Arbeit führte zur Entdeckung von vier biologisch relevanten neuen Domänen: - L27, eine neue Hetero-Dimer bildende Domäne in den Rezeptor-Targeting-Proteins Lin-2 and Lin-7 (Doerks et al. 2000) - GRAM, eine neue Domäne in Glucosyltransferasen, Myotubularinen und anderen Membran-assoziierten Proteinen (Doerks et al. 2000) - DDT, eine neue DNA-bindende Domäne in unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren, Chromosom-assoziierten und anderen nuklearen Proteinen (Doerks et al. 2001) - BSD, eine neue putativ DNA-bindende Domäne in Transkriptionsfaktoren, Synapsen-assozierten und anderen hypothetischen Proteinen (Doerks et al. submitted) Abschliessend erfolgte die automatische Analyse von 24000 nuklearen Proteinen, aus denen 550 hypothetisch neue Domänen hervorgingen. Die intensive Aufarbeitung dieser 550 konservierten Sequenzbereiche erbrachte die Entdeckung von 28 neuen nuklearen oder teilweise nuklearen Domänen unterschiedlicher Speziesverbreitung, Funktion und biologischer Relevanz (Doerks et al. accepted).
Der Ein-Elektron Transporter Adrenodoxin spielt in der Steroidhormonbiosynthese eine entscheidende Rolle. Bislang konnte der Elektronentransportmechanismus zwischen der Adrenodoxin-Reduktase und dem Cytochrom P450 mittels Adrenodoxin nicht eindeutig nachgewiesen werden. Um die molekularen Wechselwirkungen besser verstehen zu können wurden in der vorliegenden Arbeit strukturelle Untersuchungen am Rinderadrenodoxin durchgeführt. Nachdem es bereits 1998 gelang die Struktur des oxidierten Zustands des Adrenodoxins aufzuklären [Müller et al. 1998], sollte die Struktur des reduzierten Zustands Aufschluss über mögliche redoxbedingte konformationelle Änderungen geben. Die Strukturaufklärung mittels NMR erfordert hohe Expressionsausbeuten und effektive Aufreinigungsstrategien des rekombinant hergestellten Proteins. Deshalb wurde zunächst eine Steigerung der Expression von löslichem Adrenodoxin in E.coli angestrebt. In Minimalmedium lieferte die Expression unter Zusatz von 2,5g Glycerin und 1g Glucose optimale Ergebnisse. So konnte nach Optimierung der Aufreinigungsabfolge aus einem Liter M9-Medium bis zu 50 mg homogenes Protein isoliert werden. Nach Optimierung der Expressionsbedingungen und der Aufreinigungsstrategie konnte das Adrenodoxin mit den NMR aktiven Isotopen 15N sowie 13C angereichert werden. Die Reduktion des Adrenodoxins erfolgte durch Zusatz von Natriumdithionit unter strikt anaeroben Bedingungen. Die strukturelle Untersuchung mittels NMR setzt eine Zuordnung der Proteinresonanzen voraus. Diese erfolgte unter Verwendung verschiedener Tripleresonanzexperimente. Eine Zuordnung war aufgrund des stark ausgeprägten Paramagnetismus nur für solche Reste möglich, die sich mindestens 8 Å vom [2Fe-2S]-Cluster des Adrenodoxins entfernt befinden. Trotzdem konnten wichtige Regionen, die sich außerhalb des Einflussbereichs des [2Fe-2S]- Clusters befinden, zugeordnet und mit dem oxidierten Zustand verglichen werden. Aus den 15N-NOESY-HSQC und 13C-NOESY-HSQC-Spektren wurden für den reduzierten Zustand unter Zuhilfenahme des Programms NMR2st 1300 effektiv abstandsbeschränkende NOESignale eindeutig zugeordnet. Nach Minimierung der Zielfunktion wurden im letzten Schritt 50 Strukturen mit dem Strukturkalkulationsprogramm DYANA berechnet. Die 20 Strukturen mit den besten Targetfunkionen wurden als Strukturensemble dargestellt. Für das Proteinrückrat beträgt der RMSD 2,34 Å. Anhand der chemischen Verschiebungsänderungen konnten erste Unterschiede zwischen oxidierten und reduzierten Zustand des Adrenodoxins festgestellt werden. Besonders markant sind diese Veränderungen im Bereich des C-Terminus und des Loops 80-86. Änderungen konnten auch im "Chemical Shift Index" und beim Vergleich der NOE-Konnektivitäten beider Redoxzustände beobachtet werden. Gerade für die Aminosäurereste Asp76 und Asp79, die für die Wechselwirkung zu den Redoxpartnern essentiell sind, konnten Veränderungen im Aufspaltungsmuster der "NOE-Pattern" nachgewiesen werden, was auf konformationelle Änderungen im Bereich der Wechselwirkungsdomäne hindeutet. Der Vergleich der beiden Tertiärstrukturen lieferte weitere Indizien dafür, dass der C-Terminus redoxbedingte konformationelle Änderungen erfährt. Während des Erstellens dieser Arbeit konnte eine US-amerikanische Gruppe durch Zufall die Existenz eines Adrenodoxin (oxidiert) Dimers bei physiologisch relevanten Konzentrationen nachweisen [Pikuleva et al. 2000]. Bei der Dimerisierung spielt der C-Terminus eine entscheidende Rolle. Zwei intermolekulare Wasserstoffbrücken bilden sich zwischen CTerminus und Protein des jeweils anderen Partners aus. Redoxbedingte konformationelle Änderungen im Bereich des C-Terminus sollten die Auflösung des Dimers begünstigen. Um diese Vermutung zu bestätigen wurden Cross-Linking Experimente mit dem reduzierten und oxidierten Zustand des Adrenodoxins durchgeführt. Die Ergebnisse bestätigten die Annahme, dass sich das Adrenodoxin Dimer nach Reduktion auflöst. Außerdem konnte anhand der voll funktionsfähigen C-terminal verkürzten Mutante Adx(4-108) die tragende Rolle des CTerminus bei der Dimerbildung bewiesen werden. Aus den experimentell erhaltenen Daten wurde ein neuer Elektronentransportmechanismus postuliert, der sowohl Adrenodoxin Dimere als auch Adrenodoxin Monomere als Elektronentransporter annimmt [Beilke et al. 2002]. Die streng kontrollierte Steroidhormonbiosynthese wird durch den Einsatz von Adrenodoxin Dimeren beschleunigt und durch die redoxbedingte Auflösung der Dimere optimert. Die redoxbedingte Auflösung eines Dimers ist in der Biochemie einzigartig und kann zum Verständnis molekularer Wechselwirkungen beitragen. Für die gesamte Gruppe der vertebraten Ferredoxine sind aufgrund der Struktur- und Sequenzhomologie ähnliche Ergebnisse zu erwarten. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Ferredoxin-NADP -Reduktase (FNR) für strukturelle Untersuchungen mittels NMR zugänglich gemacht werden. Durch Verwendung von bakteriellen Expressionssystemen, insbesondere dem pQE30-Expressionssystem, konnte der Anteil an löslichem Protein im Vergleich zum Ursprungssystem um den Faktor 12 erhöht werden. Dabei führten möglichst niedrige Expressionstemperaturen und IPTG Konzentrationen zu den höchsten Proteinausbeuten. Ein verbessertes Isolationsverfahren wurde etabliert und ermöglicht die Darstellung von bis zu 90 mg FNR aus einem Liter LB-Medium. Eine Verlängerung der Expressionsdauer, hervorgerufen durch das Wachstum in M9-Medium und in D2O, verringerte den Anteil an vollständig intaktem Protein, weshalb auf eine kostspielige Proteinpräparation in dreifach angereicherten Minimalmedium verzichtet wurde.
In dieser Arbeit wurde die Kinetik von zwei Ca2-plus-aktivierten Membranproteinen untersucht: zum einen des endogenen Ca2-plus-aktivierten Chloridkanals der Xenopus-Oozytenmembran, zum anderen des heterolog in Oozyten exprimierten Na-plus-Ca2-plus-Austauschers NCX1, kloniert aus dem Meerschweinchen-Herzen. Der Ca2-plus-aktivierte Chloridkanal wird durch intrazelluläres Ca2-plus im submikromolaren Konzentrationsbereich (KD = 0.5 µMCa2-plus) aktiviert und hat eine hohe Permeabilität für Chloridionen. In der ausgereiften Eizelle spielt er eine wichtige Rolle bei der Ausbildung des Fertilisationspotentials und verhindert durch eine Depolarisation der Membran eine Polyspermie. Der Na-plus-Ca2-plus-Austauscher ist in der Herzmuskelzelle für die Ausbildung des Exzitations- Kontraktions-Zyklus von Bedeutung, indem er für die Aufrechterhaltung des Ca2-plus- Gradienten (freies Ca2 intrazellulär ungefähr gleich 100 nm, extrazellulär ungefähr gleich 2 mM) über die Plasmamembran verantwortlich ist. Unter physiologischen Bedingungen transportiert der Na-plus- Ca2-plus-Austauscher ein Ca2-plus-Ion im Austausch gegen drei Na-plus-Ionen aus der Zelle hinaus, und nutzt somit den Na-plus-Gradienten neben dem Membranpotential als treibende Kraft. Als Messmethode wurde die Patch-Clamp-Technik in der inside-out-Makro-Patch- Konfiguration verwendet. Die Patch-Clamp-Technik erlaubt definierte ionale Bedingungen auf beiden Seiten der Membran. Cytoplasmatische Ca2-plus-Konzentrationssprünge wurden zum einen durch Lösungswechsel, insbesondere aber durch die Photolyse von DM-Nitrophen, einem photolabilen Ca2-plus-Chelator, hervorgerufen. Die Photolyse von DM-Nitrophen erlaubte, im Vergleich zum Lösungswechsel, sehr schnelle Ca2-plus- Konzentrationssprünge (Ca2-plus-Freisetzungsrate mindestens 38000 s-1). Die kinetischen Untersuchungen am Ca2-plus-aktivierten Chloridkanal haben neue, über bisherige aus dem Lösungswechselexperiment bekannte hinausgehende, Erkenntnisse ergeben: Nach einem schnellen Ca2-plus-Konzentrationssprung geht dem Signalanstieg auf einen stationären Wert eine deutlich schnellere Verzögerungsphase (lag-phase) voraus. Sowohl der Signalanstieg als auch die Verzögerungsphase zeigen eine starke Ca2-plus-Abhängigkeit, sind aber nur sehr schwach spannungsabhängig. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Signalanstieg den spannungsabhängigen Ca2-plus-Bindungs-/Dissoziationsschritt von mindestens zwei Ca2-plus-Ionen widerspiegelt, während das spannungsunabhängige Kanalöffnen/ -Schließen durch die Verzögerungsphase repräsentiert wird. Bei Spannungssprungexperimenten mit hoher Zeitauflösung konnte eine schnelle Inaktivierung nach einer Depolarisation der Membran gesehen werden, die in Gegenwart von sättigenden intrazellulären Ca2-plus-Konzentrationen zu einer Einwärtsgleichrichtung der Strom-Spannungskennlinie des stationären Stroms führt. Mit diesen Erkenntnissen konnte ein Reaktionsmodell für den Ca2-plus-aktivierten Chloridkanal aufgestellt werden, mit dem sich die experimentellen Daten simulieren ließen. Die heterologe Expression des Na-plus-Ca2-plus-Austauschers in Oozyten hat zu einem deutlich verbesserten Signal-Rausch-Verhältnis im Vergleich zu früheren Messungen am nativen Austauscher in Cardio-Myocyten-Membranen geführt. Mit Hilfe der Photolyse von DM-Nitrophen konnte erstmals eine vollständige Ca2-plus- und Spannungsabhängigkeit des vorstationären Einwärtsstroms, hervorgerufen durch einen cytoplasmatischen Ca2-plus-Konzentrationssprung, durchgeführt werden. Sowohl im Ca2-plus-Ca2-plus- als auch im Na-plus-Ca2-plus- Austauschmodus zeigt sich ein transientes Einwärtsstromsignal (Anstieg messtechnisch nicht auflösbar), das sehr schnell relaxiert. Im Ca2-plus-Ca2-plus-Austauschmodus zeigt sich nur ein transientes Stromsignal (kein Nettoladungstransport im stationären Zustand), während im Na-plus-Ca2-plus-Austausch sich ein stationärer Einwärtsstrom einstellt. Das transiente Stromsignal hat eine deutliche Ca2-plus-Abhängigkeit sowohl für den Spitzenstrom (KM = 30.9 ± 3.0 µM im Na-plus-Ca2-plus-Austausch, KM = 57 ± 10 µM im Ca2-plus- Ca2-plus-Austausch) als auch für die Geschwindigkeitskonstante 1/t des Signalabfalls (KM = 98.5 ± 21.3 µM im Na-plus-Ca2-plus-Austausch, KM = 76 ± 11 µM im Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch) gezeigt. Die Relaxation des Stromtransienten erfolgt sowohl im Ca2-plus-Ca2-plus- als auch im Na-plus-Ca2-plus-Austausch mit einer maximalen Geschwindigkeitskonstanten von ungefähr gleich 10000 s -1 nach sättigenden Ca2-plus-Konzentrationssprüngen. Der Signalabfall hat sich über den gesamten untersuchten Ca2-plus-Konzentrationsbereich als spannungsunabhängig herausgestellt, während der Spitzenstrom bei positiven Membranpotentialen deutlich abnimmt. Dies führt zu einer Spannungsabhängigkeit der verschobenen Ladung (Integral des transienten Stromsignals) im Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch. Aus diesen Erkenntnissen konnte für den Ca2-plus- Translokationszweig (im Rahmen eines konsekutiven Transportmodells) folgendes Reaktionsschema aufgestellt werden: Einem spannungsunabhängigen, sehr schnellen Ca2-plus- Bindungs/-Dissoziationsschritt (diffusionskontrolliert) auf der intrazellulären Membranseite folgt ein ebenfalls spannungsunabhängiger, aber ratenlimitierender Schritt (intrazellulärer Okklusionsschritt, asymmetrische Raten: 10000 vs. 1000 s-1). Der nachfolgende Ca2-plus-Translokationschritt muss sehr hohe Hin- und Rückraten aufweisen (ungefähr gleich 20000 s-1). Die Ca2-plus-Dissoziation/-Bindung auf der extrazellulären wird als sehr schnell (diffusionskontrolliert) und spannungsunabhängig angenommen. Weitergehende Einblicke haben der Sr2-plus-Ca2-plus- und der Ba2-plus-Ca2-plus-Austausch geliefert. Während der Sr2-plus-Ca2-plus-Austausch nahezu das gleiche Verhalten wie der Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch gezeigt hat, konnte nach einem intrazellulären Ca2-plus-Konzentrationssprung im Ba2-plus-Ca2-plus-Austausch erstmals eine zusätzliche langsame Phase im Abklingen des transienten Einwärtsstromsignals beobachtet werden. Das transiente Signal hat im Vergleich zum Ca2-plus-Ca2-plus-Austausch eine signifikant höhere Ladungsverschiebung aufgewiesen. Dies deutet auf einen zusätzlichen elektrogenen Reaktionsschritt hin (extrazelluläre Ca2-plus-Okklusion). Weitere elektrogene Schritte müssen im Na-plus-Translokationszweig (Na-plus-Bindungs- und Na-plus-Translokationsschritt) liegen. Mit den aus diesen Erkenntnissen aufgestellten Reaktionsschemata ließen sich die experimentellen Daten erfolgreich simulieren. Die Gesamttransportrate im Na-plus-Ca2-plus- Austausch liegt demnach bei ungefähr gleich 1000 s-1 bei Raumtemperatur und stimmt damit mit Literaturwerten von mehreren 1000 s-1 bei physiologischer Temperatur überein.
The light-harvesting chlorophyll a/b protein complex (LHC-II) is the major collector of solar energy in all plants and it binds about half of the chlorophyll in green plants. LHCII is a trimer in the photosynthetic membrane; each monomer consists of 232 amino acids, binds and orients a minimum of 12 chlorophyll molecules and three caroteinoids (two luteins and one neoxanthin) for light-harvesting and energy transfer. Although, the structure of LHC-II has been determined at 3.4 Å resolution by electron microscopy of two-dimensional crystals (Kühlbrandt et al., 1994), this is not sufficient to allow a complete understanding of the mechanism of energy transfer from LHC-II to the reaction centre, since the effective resolution in the z dimension is 4.9 Å. In fact, the chemical difference between Chl a and Chl b, which has a formyl group instead of the methyl group at the 7-position in the chlorin ring, is too small to be detected at this level of resolution. In addition, the orientation of the chlorophyll tetrapyrroles have not been determined unambiguously. This information is essential for a detailed understanding of the energy transfer within the complex and to the reaction centres of photosystem II and I (PSII and PSI). X-ray crystallography of three dimensional (3D) crystals may yield a more complete structure at high resolution. 3D crystals have been grown from LHC-II isolated from pea leaves using a standard purification procedure (Burke et al., 1978). The thylakoid membranes are solubilised in Triton X-100 and further purified by sucrose gradient ultra centrifugation. The LHC-II fraction is salt precipitated and pellets resuspended at the chlorophyll a/b ratio 2.8 mg/ml in 0.9 % Nonyl-glucoside. Crystals are currently obtained by vapour diffusion in hanging drops. These crystals are thin hexagonal plates, have a fairly large unit cell and diffract quite weakly. The high level of the background is due both to the detergent, necessary for protein solubilisation, and lipids, required for the trimer and crystals formation. However, three data sets, each from one single crystal have been collected up to 3.2 Å resolution over a rotation range of 135°. The crystals were exposed to a very highly collimated and brilliant beam (ID-14 EH1 at ESRF, Grenoble, France) and were kept under a stream of cold nitrogen to prevent radiation damage. Data were successfully integrated using the program XDS by Kabsch (1993). The crystals were found to belong to the space group P6 22 3 and have unit cell dimensions of a=128.45, b=128.45, c=135.32, a= ß=90º, ?=120. The solution of the phase problem was tackled by molecular replacement using, as a search model, the LHC-II structure solved by electron cryo-microscopy studies of twodimensional crystals (Kühlbrandt et al. 1994). Three different programs were tested: the most used AMoRe (Navaza et al., 1994) and the brute force based program Brute (Fujinaga
Das Genom des Archaeons Halobacterium salinarum kodiert vier Proteine der SMC Protein Superfamilie. Zwei Proteine bilden dabei eine neue Gruppe und werden "SMC-artige Proteine von H. salinarum" (Sph1 und Sph2) genannt. Eine Transkriptanalyse ergab, dass sph1 und das 114 bp stromabwärts gelegene hp24 Gen ausschließlich in exponentiell wachsenden Zellen transkribiert werden. In Zellen der stationären Wachstumsphase ist keines der beiden Transkripte nachweisbar. Die Funktion von Sph1 wurde durch Versuche mit Überproduktions- und Depletionsstämmen von H. salinarum untersucht. Die konditionale Überproduktion von Sph1 inhibiert die weitere Zellteilung und führt zu einer Längenzunahme der Zellen. Erstmals wurde durch ein antisense-mRNA-System in einem Archaeon ein Protein, Sph1, depletiert. Die Depletion führt ebenfalls zur Inhibition der weiteren Zellteilungsereignisse. Beide Phänotypen zeigen, dass Sph1 eine essentielle Rolle im Verlauf des Zellzyklusses einnimmt. Um Zellzyklus spezifische Ereignisse zu analysieren wurde eine Synchronisationsprozedur für H. salinarum entwickelt. Dazu wurde der Effekt von sechs eukaryalen Zellzyklusinhibitoren auf den Zellzyklus von H. salinarum untersucht. Bei geeigneter Konzentration verursacht der effizienten DNA Polymerase Inhibitor Aphidicolin eine schnelle und reversible Zellzyklusblockade, während andere zelluläre Prozesse nicht beeinflusst werden. Durch Ermittlung der Zelldichte, der mittleren Zelllänge und des Anteils an Septum bildenden Zellen wurde festgestellt, dass nach Entfernen des Inhibitors ca. 70 % der in der Kultur vorhandenen Zellen den Zellzyklus synchron durchlaufen. Diese Prozedur erlaubt erstmals die Untersuchung der Zellzyklus abhängigen Regulation der Transkription, Proteinakkumulation sowie der intrazellulären DNA-Lokalisation in einem Archaeon. Transkriptionsstudien mit synchron wachsenden H. salinarum-Kulturen ergaben, dass das sph1 Transkript eindeutig Zellzyklus abhängig reguliert ist. Die maximale Transkriptmenge ist dabei zum Zeitpunkt der Septumbildung nachweisbar. Die Expression des hp24 Gens beginnt etwa eine Stunde vor der Expression des sph1 Gens. Bevor die sph1 Transkriptmenge ihr Maximum erreicht, nimmt die hp24 Expression wieder ab. Das cdcH Gen, das für ein Protein der Cdc48 Familie kodiert, ist wie das sph1 Gen um den Zeitpunkt der Septumbildung stark induziert, während ein ftsZ Allel nicht in Zellzyklus abhängiger Weise reguliert ist. Die Transkriptionsmuster zeigen, dass die Transkription verschiedener Gene im Verlauf des haloarchaealen Zellzyklusses präzise reguliert wird. Die Sph1 Proteinmenge ist ebenfalls während des Zellzyklusses reguliert; sie ist erhöht, wenn die Segregation der neuen Chromosomen nahezu abgeschlossen ist. Folglich hat Sph1 vermutlich eine Funktion in der späten Phase der Replikation, z.B. in der DNA-Reparatur wie auch die eukaryalen Rad18 Proteine. Im Gegensatz zum sph1 Transkript ist das Protein während des gesamten Zellzyklusses in H. salinarum nachweisbar. Es ist daher nicht auszuschließen, dass Sph1 eine weitere Funktion ausübt, die eine Präsenz während des gesamten Zellzyklusses benötigt. Ein Färbeprotokoll mit einem DNA spezifischen Fluoreszenzfarbstoff wurde entwickelt, um die intrazelluläre Lokalisation des Nukleoids in H. salinarum zu bestimmen und seine differenzierte Positionierung im Verlauf des Zellzyklusses in synchronisierten Zellen zu verfolgen. Synchronisierte Kulturen wurden mit Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Es zeigte sich, dass das haloarchaeale Nukleoid nach einer anfänglichen Verteilung auf die gesamte Zelle in der Zellteilungsebene kondensiert. Im weiteren Verlauf wird die DNA zügig an die 1/4 und 3/4 Positionen transportiert. Alle DNA-Strukturen wurden auch in unbehandelten Zellen beobachtet, so dass Synchronisationsartefakte ausgeschlossen werden können. Diese Daten beweisen, dass die DNA in Haloarchaea aktiv zu spezifischen intrazellulären Regionen transportiert wird und legen nahe, dass die Replikation in der Zellteilungsebene erfolgt, wie es in den letzten Jahren für einige bakterielle Arten nachgewiesen wurde. Die Untersuchungen bilden die Grundlage für weitere Untersuchungen molekularer Details des archaealen Zellzyklusses.
Im ersten Abschnitt der Doktorarbeit wurden kurze alpha-helikale Modellpeptide mit Oligosacchariden, die Teile der Core-Region der N-Glycane bilden, N-glycosyliert, um den konformationellen Effekt der N-Glycosylierung auf das Peptidrückgrat zu untersuchen. CD- und NMR-Untersuchungen ergaben, daß die Konformation der N-Glycopeptide durch die Größe der angehängten N-Glycanreste und die Wahl der Aminosäurereste nahe der Glycosylierungsstelle beeinflußbar war. Die signifikantesten konformationellen Änderungen ergaben die N-Glycosylierung mit einem Monosaccharid beziehungsweise einem Pentasaccharid. Die Kombination von organischer Synthese mit biologischen Methoden ermöglicht es heute, neben den 20 natürlichen Aminosäuren, auch unnatürliche Aminosäuren ortsspezifisch in Proteine einzubauen. Dabei wird das Codon für die jeweilige Aminosäure durch Oligonucleotid-Mutagenese durch das Nonsense-Codon UAG ersetzt. Für dieses spezielle Codon wird eine Suppressor-tRNA hergestellt und in vitro chemisch mit der gewünschten unnatürlichen Aminosäure aminoacyliert. Mit dem späteren Ziel einer in vitro-N-Glycoproteinsynthese wurde hier die Darstellung von N-glycosylierten Aminosäuren und der Versuch der Anknüpfung an ein Dinukleotid pdCpA beschrieben. Die für die Aminoacylierung des Dinukleotids geeigneten Zuckeraminosäuren trugen Nterminal die photochemisch abspaltbare NVOC-Schutzgruppe, Acetylgruppen an den Zucker-OH-Funktionen und eine Cyanomethylaktivesterfunktion am C-Terminus. Die Aminoacylierungsreaktionen führten nicht zu dem gewünschten N-Glycosylaminoacyldinukleotid. Insbesondere durch die Wahl anderer Zuckerschutzgruppen sollte dennoch die Acylierung des Dinukleotids pdCpA mit einer N-glycosylierten Aminosäure gelingen. Der dritte Teil der Doktorarbeit beinhaltete die Synthese eines Prionen-N-Glycoproteins über chemische Ligation eines Thioesters mit einem Cystein-Peptid. Die Verknüpfung von Peptidfragmenten erlaubt die selektive Isotopen-Markierung, was die Strukturaufklärung mit Hilfe der NMR-Spektroskopie enorm vereinfacht. Die Funktion der Glycosylierung des Prionenproteins scheint in wenigen Aspekten geklärt zu sein. Unklar ist, ob die N-Glycosylierung auch die Konformation des Prionenproteins verändern kann. Ein kurzes Prionen-N-Glycopeptidfragment SHA PrP172-194 aus der Helix B des Prionenproteins wurde der Strukturanalyse unterzogen, wobei ein Effekt der NGlycosylierung auf die Konformation des Peptidrückgrats verzeichnet werden konnte. Motiviert durch diese Ergebnisse wurden in der Doktorarbeit das Prionenproteinfragment SHA PrP12l-178 als N-terminales Thioesterfragment und das Fragment SHA PrP179-231 als C-terminales Cystein-Peptid mit Festphasenpeptidsynthese dargestellt. Mit diesen wasserlöslichen Proteinfragmenten wurde erfolgreich eine chemische Ligation unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Da man selektiv Isotopen-markierte Proteine herstellen wollte, war man auf die biochemische Expression des N-terminalen Thioesterfragments SHA PrPl2l-178 angewiesen. Dr. S. Becker (Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie, Göttingen) gelang die Expression eines unmarkierten Prionen-Inteinfusionsproteins, aus dem durch Thiol-vermittelte Inteinspaltung ein Thioester generiert werden konnte. Auch mit diesem biochemischen Ligationsansatz konnte das Fragment SHA PrP121-23l erhalten werden. Ein N-glycosyliertes Prionenfragment SHA PrP179-231 wurde in der vorliegenden Doktorarbeit ebenfalls dargestellt und steht für Intein-vermittelte Ligationsreaktionen zur Verfügung.
Das Photosystem II (PSII) und die F1Fo-ATP-Synthase, zwei Membranproteinkomplexen der Energieumwandlung, wurden im Rahmen dieser Dissertation bearbeitet. Mittels zweidimensionaler (2D) Kristallisation und elektronenkristallographischen Methoden sollte die dreidimensionale (3D) Struktur aufgeklärt werden. PSII katalysiert den ersten Schritt der Lichtreaktion der Photosynthese. Es ist für das Einfangen von Lichtquanten, die Anregung von Elektronen, die Freisetzung von Sauerstoff aus Wasser verantwortlich. Über 25 Untereinheiten sind an diesem Prozess in den Thylakoidmembranen der Chloroplasten beteiligt. Ziel des ersten Projekts war die Verbesserung der 8 Å-Struktur des CP47-RC-Subkomplexes durch neue oder bessere 2D-Kristalle. Die Aufreinigung aus Spinat lieferte reproduzierbar eine gute Ausbeute an aktivem PSII. Das solubilisierte PSII enthielt genug endogenes Lipid, um es ohne den Zusatz von weiterem Lipid direkt durch Mikrodialyse zu rekonstituieren. Während der Rekonstitution verlor der PSII-Komplex CP43 und andere Untereinheiten, wahrscheinlich durch das Detergenz begünstigt, und ergab hoch geordnete Membranen aus CP47-RC. Die besten vesikulären 2D-Kristalle hatten eine tubuläre Morphologie und waren bis zu 1 µm breit und 3 µm lang. Elektronenmikroskopische Bilder unter Cryo-Bedingungen von ihnen aufgenommen zeigten nach der Bildverarbeitung Daten bis 6 Å. Durch Erhöhung der Zinkazetatkonzentration im Dialysepuffer konnten dünne 3D-Kristalle gezüchtet werden, die aus 2D-Kristallstapeln bestanden. Obwohl Elektronenbeugungsmuster Reflexe bis 4,5 Å aufwiesen, konnte auf Grund der unbekannten und veränderlichen Anzahl von Schichten keine 3D-Struktur erstellt werden. Weitere Versuche die Qualität der 2D-Kristalle von CP47-RC zu verbessern waren nicht erfolgreich. Durch die kürzliche Veröffentlichung der Röntgenkristallstruktur des dimeren PSII-Komplexes aus Synechococcus elongatus wurden weitere Untersuchungen eingestellt. Im letzten Schritt der Energieumwandlungskette bildet die F1Fo-ATP-Synthase unter Ausnutzung eines elektrochemischen Gradienten schließlich ATP, die universelle Energieeinheit der Zelle. Die Struktur und Funktion des löslichen, katalytischen F1-Teils sind seit einigen Jahren im Detail bekannt. Im Gegensatz zeichnet sich die Struktur des membranintegrierten, Ionen-translozierenden Fo-Teiles aus den Untereinheiten ab2cx erst langsam ab. Der c-Ring besteht in Hefe aus 10 und in Spinatchloroplasten aus 14 Untereinheiten. Ziel des zweiten Projekts war die Aufklärung der 3D-Struktur des sehr stabilen, undecameren c-Rings aus dem Bakterium Ilyobacter tartaricus, welches Na als Kopplungsion nutzt. Große, tubuläre 2D-Kristalle mit einer Einheitszelle von 89,7 x 91,7 Å und p1-Symmetrie bildeten sich nach der Rekonstitution von gereinigten c-Ringen mit dem Lipid Palmitoyl-Oleoyl-Phosphatidylcholin, nachdem das Detergenz durch Mikrodialyse entzogen wurde. Bilder von in Trehalose eingebetteten 2D-Kristallen wurden im Elektronenmikroskop JEOL 3000 SFF bei 4 K aufgenommen. Ein 3D-Datensatz, bestehend aus 58 Bilder bis zu einem Kippwinkel von 45°, ermöglichte die Berechnung einer 3D-Dichtekarte mit einer Auflösung von 4 Å in der Membranebene und 15 Å senkrecht dazu. Die elffach symmetrisierte Karte eines c-Rings zeigt einen taillierten Zylinder mit einer Höhe von 70 Å und einem äußeren Durchmesser von 50 Å, der aus zwei konzentrischen Ringen von transmembranen (-Helices besteht. Ein C-(-Modell der c-Untereinheit, die eine helikale "hair pin" bildet, konnte in die Dichte eingepaßt werden. Die inneren Helices sind nur 6,5 Å (Zentrum-zu-Zentrum-Abstand) von einander entfernt um eine zentrale Öffnung von 17 Å Durchmesser angeordnet. Die dichte Helixpackung wird durch ein konserviertes Motiv aus vier Glycinresten ermöglicht. Jede innere Helix ist mit einer äußeren, C-terminalen Helix über einen kurzen, wohl geordneten Loop auf der cytoplasmatischen Seite verbunden. Die äußere Helix weist in der Nähe der Ionenbindungsstelle einen Knick auf, der gleichzeitig in der Mitte der Membran liegt, wo sich die äußeren und inneren Helices am nächsten kommen. Dadurch wird es möglich, dass die Ionenbindungsstelle aus den Resten von zwei äußeren (Glu65, Ser66) und einer inneren Helix (Pro28) geformt wird. Zur Unterstützung der Ein-Kanal-Modell der Ionentranslokation konnte ein Zugang von der Ionenbindungsstelle zum Cytoplasma durch polare Reste in der c-Untereinheit vorgeschlagen werden. Des Weiteren kann spekuliert werden, dass drei Ionenbrücken zwischen den c-Untereinheiten für die hohe Temperaturstabilität des Oligomers von I. tartaricus verantwortlich sind. Die Vorstellung dieses 3D-Modells des c-Rings ist ein erster Schritt hin zum Verständnis der Kopplung der Ionentranslokation an die Rotation der F1Fo-ATP-Synthase. Wenn die Struktur der a-Untereinheit gelöst worden ist, wird hoffentlich auch der Mechanismus des kleinsten, biologischen Rotationsmotors entschlüsselt werden.
Ressourcennutzung und Sammelverhalten verschiedener Unterarten der Honigbiene Apis mellifera L.
(2002)
1998, 1999 und 2000 wurde der Polleneintrag am Südostrand des Taunus jeweils in den Zeiträumen Juni/Juli bis August/September von 20 (1998, 1999) bzw. 18 (2000) Honigbienenvölkern der europäischen Unterarten Apis mellifera mellifera, Apis mellifera carnica und Apis mellifera igustica sowie der südafrikanischen Unterart Apis mellifera capensis mittels Pollenfallen am Flugloch der Bienenstöcke auf 5 Standplätzen erfasst. Die Auswertung des Polleneintrags und dessen Vergleich zwischen den Unterarten erfolgte auf verschiedenen Ebenen. Zum einen wurden Ordinationsverfahren innerhalb der multivariaten Statistik zur Gesamtanalyse aller Pollenproben angewandt, die der graphischen Darstellung der Pollenspektren der Unterarten und der Ermittlung des Einflusses verschiedener Variablen auf den Polleneintrag dienten. Zum anderen bildete der Unterartenvergleich anhand verschiedener Parameter und berechneter lndices die Grundlage für die Analyse des Polleneintrags. In 647 Pollenproben mit einem Gesamtgewicht von 4008,3 g wurden 214 verschiedene Pollentypen und in geringen Mengen sieben weitere Nicht-Pollen-Bestandteile nachgewiesen. Die Pollentypen mit den höchsten Anteilen am Gesamteintrag waren Zea mays, Brassicaceae, Castanea sativa, Asteraceae Form T, Rosaceae, Plantago spec. und Hedera helix. 90% des Gesamteintrags stammten von 12% der insgesamt nachgewiesenen Pollentypen. Sowohl die untersuchten europäischen Unterarten als auch die südafrikanische Unterart wiesen ein einheitliches Sammelverhalten auf. Sie zeigten die Art-typischen Eigenschaften der Honigbiene, wie polylektische, generalistische und opportunistische Sammelweise sowie die Konzentration auf wenige ergiebige Pollenquellen. Die gesamten Pollenspektren stimmten zwischen den Unterarten weitgehend überein. Aus dem Vergleich der eingetragenen Pollenmenge, der Anzahl verschiedener Pollentypen, Diversität und Evenness sowie der Dominanzstruktur des Polleneintrags pro Pollenprobe konnte keine unterschiedlichen Sammelstrategie der Unterarten abgeleitet werden. Vor dem Hintergrund der Gemeinsamkeiten in Sammelverhalten und Ressourcennutzung wurden bei einer sehr detaillierten Betrachtung des Polleneintrags der vier untersuchten Unterarten der Honigbiene unter den Bedingungen eines diversen Pollenangebots Unterschiede im Eintrag zwischen den Unterarten von einzelnen Pollen- und Blütentypen festgestellt. Die geringen Unterschiede bewirkten einen geschätzten Anteil der Unterart an der Variabilität des Polleneintrags zwischen 1,4% und 4,5%, wobei sich die europäischen Unterarten entsprechend ihrer verwandtschaftlichen Beziehungen absetzten. Ein Zusammenhang der Vegetation und dem Polleneintrag in den Ursprungsgebieten der Unterarten mit dem Mehreintrag spezifischer Pollentypen im Untersuchungsgebiet ließ sich nicht herstellen. Schlussfolgerungen aus den Ergebnissen sind, dass das Sammelverhalten und die Ressourcennutzung kein Kriterium für die Bewertung verschiedener Unterarten der Honigbiene, insbesondere der in Mitteleuropa autochthonen Unterart Apis mellifera mellifera und der aus Südosteuropa eingeführten Unterart Apis mellifera carnica, darstellen. Für eine Beurteilung von Konkurrenz gegenüber anderen blütenbesuchenden Insekten und von Bestäubungsleistungen ist damit das generelle Sammelverhalten der Art Apis mellifera entscheidend.
Obligate Mutualismen gehören zu den bevorzugten Studienobjekten zur Erforschung der Mechanismen und Faktoren, welche Artenvielfalt hervorbringen und erhalten. Die Bestäubung der diözischen Pionierbaumgattung Macaranga (Euphorbiaceae) war bislang unbekannt, und Untersuchungen zur Myrmekophytie in Macaranga beschränkten sich in der Vergangenheit auf die Jugendphase der Assoziation mit Ameisen. Während als gesichert galt, dass die Partnerorganismen in Myrmekophytie- und Bestäubungssystemen voneinander profitieren, blieben Konflikte bzw. Konfliktlösungen in diesen Mutualismen weitgehend unerforscht. Ziel der vorliegenden Untersuchung war es, die Bestäubung der Ameisenpflanzengattung Macaranga aufzuklären und potentielle Konflikte der Fortpflanzung von Macaranga mit dem Myrmekophytiesystem zu analysieren. Die insgesamt 16-monatigen Freilanduntersuchungen in Malaysia und Indonesien wurden in 6 Aufenthalten (1998-2001) durchgeführt. Von 27 Macaranga-Arten wurden Daten zur Blütenbiologie erhoben. Die Hauptuntersuchungsart war M. hullettii. Zusätzlich fanden Untersuchungen der Infloreszenzmorphologie aller westmalesischen Macaranga-Arten in den Herbarien des Forest Research Institute Malaysia (FRIM) und des Nationaal Herbarium Nederland in Leiden statt. 1) Die Bestäubung von Macaranga Von 27 der 61 Macaranga-Arten, welche auf der Halbinsel Malaysia und den großen Sundainseln Borneo und Sumatra vorkommen, wurden insgesamt 28544 Blütenbesucher gesammelt und das Verhalten der dominierenden Blütenbesucher beobachtet. Bei 52% der Arten dominierte eine Thripsart der Gattung Neoheegeria (Phlaeothripinae; Thysanoptera), bei 15% Thripse der Gattung Mesothrips (Phlaeothripinae, Thysanoptera), bei 11% Wanzen (Miridae und Anthocoridae; Heteroptera), bei 4% Thripse der Tribus Terebrantia, bei 4% Rüsselkäfer, und bei 15% diverse andere Insekten der Ordnungen Coleoptera, Hymenoptera und Diptera. Für den dominierenden Blütenbesucher Neoheegeria spec. wird gezeigt, dass er als effektiver Bestäuber von M. hullettii fungiert. Der Pollentransfer von männlichen zu weiblichen Bäumen und der Samenansatz nach ausschließlichem Zugang von Thripsen zu den Blüten konnte nachgewiesen werden. Die Thripse durchlaufen ihre Larvalentwicklung in weiblichen und männlichen Blütenständen. Der Vergleich der Blühzeiten von M. hullettii und der Entwicklungsdauer von Neoheegeria spec. erbrachte, dass die Dauer der Anthese des Wirtes und die der Entwicklung der Thripse aufeinander abgestimmt ist. Männliche Blütenstände öffnen ihre Knospen zeitlich vor den weiblichen Blütenständen, sodass eine Vermehrung der Thrips-Bestäuber-Population in männlichen Bäumen vor dem Beginn der Blühzeiten beider Geschlechter stattfinden kann. Die Analyse der Bestäubungstypen zeigte, dass blütenbedeckende Hüllblättchen mit Trichomnektarien als Belohnung für bestäubende Thripse und Wanzen dienen. Dieses Merkmal wird für thrips- und wanzenbestäubte Macaranga-Arten als homolog angesehen. Die Blütendeckblättchen umschließen die Blüten so eng, dass nur kleinsten Insekten der Zugang zu den Blüten gewährt wird. Neoheegeria-bestäubte Macaranga-Arten zeichnen sich durch ein reduziertes Androeceum und ein wenig strukturiertes Tectum der Pollenkörner aus. Die Bestimmung der Blühzeiten von 7 sympatrischen Macaranga-Arten erbrachte, dass Arten mit den gleichen Bestäubern zeitlich isoliert sind. Dagegen weisen Arten, deren Blühzeiten sich überschneiden, verschiedene Bestäuber auf. 2) Interaktionen der Reproduktion von Macaranga mit der Myrmekophytie Konflikte zwischen den Bestäubern und den Partnerameisen von Macaranga konnten nicht beobachtet werden. Dafür trat ein anderer, schwerwiegender Konflikt in Erscheinung, der drastische, negative Auswirkungen auf die Fortpflanzung von Macaranga hatte. Die Partnerameisen zerstörten zeitweise die Blüten ihrer Wirte. Dieses Kastrations-Verhalten zeigte sich bei mehreren Crematogaster-Arten, die verschiedene Macaranga-Arten besiedeln. Im Gombaktal, ein Hauptuntersuchungsgebiet im Tieflandregenwald Westmalaysias, trat das Kastrationsphänomen am häufigsten bei M. hullettii auf. 56% der Population wurde von ihren Ameisenbesiedlern (hauptsächlich C. msp. 4) kastriert. Das Phänomen wies eine ungleichmäßige Verteilung auf: Blütenzerstörung korrelierte signifikant negativ mit der Baumgröße. Die Analyse verschiedener Kolonie- und WirtspflanzenParameter ergab Hinweise, dass nicht Nahrungs- bzw. Nistraumlimitierung sondern die Koloniegröße ein entscheidender Faktor für dieses Verhalten war. Ab einer bestimmten Koloniegröße setzte nicht nur das Kastrationsverhalten aus, sondern auch die Außenaktivität der Ameisen nahm stark ab. Gleichzeitig stieg die Brutzunahme deutlich an, und die regelmäßige Geschlechtstierproduktion setzte ein. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Crematogaster (Decacrema), welche noch nicht ihre reife Koloniegröße erreicht haben, die Blüten ihres Wirtsbaumes zerstören, wenn dieser vor den Ameisen mit der reproduktiven Phase einsetzt. Aufgrund der daraus resultierenden Kosten für die Wirtspflanze könnte die Crematogaster-Art (msp. 4) als "unpassender" Partner von M. hullettii angesehen werden. Während die Schutzwirkung gegen Herbivorie an jungen Blättern durch C. msp. 4 aus früheren Untersuchungen gut belegt ist, fungiert diese Ameisenart durch ihr Kastrationsverhalten teilweise als Parasit in der Assoziation mit M. hullettii. Es wird ein Modell vorgeschlagen, in dem die Kastration als ein Konflikt zwischen den Partnern über das Einsetzen der Reproduktionsphase angesehen wird. "Passende" Partner sind folglich daran erkennbar, dass sich das Einsetzen ihrer Reproduktionsphasen weitgehend synchronisiert hat. Aus dieser Hypothese ergibt sich, dass der dominierende Ameisenbesiedler C. msp. 4 von M. hullettii im Tiefland des Untersuchungsgebietes nicht als "echter" Mutualist anzusehen ist. In den submontanen Regionen ist M. hullettii ausschließlich mit C. msp. 3 assoziiert. Letztere Crematogaster-Art wird als der eigentliche "passende" Partner vorgeschlagen, während C. msp. 4 als "echter" Mutualist einer zweiten Macaranga-Art, M. bancana, diskutiert wird. Auf der Basis der gewonnenen Ergebnisse und der Grundlage von jüngsten phylogenetischen Analysen von Macaranga werden Überlegungen zur Evolution der Bestäubungs- und Myrmekophytiesysteme vorgestellt.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit unterschiedlichen Aspekten der Faltung von Tendamistat, einem aus 74 Aminosäuren bestehenden a-Amylase lnhibitor aus Streptomyces tendae. Bei der oxidativen Rückfaltung des Tendamistats konnten bisher drei kinetische Phasen (t1, t2 und t3) identifiziert werden. Die mittlere (t2) bzw. langsame (ti) kinetische Phase, resultiert als Folge einer cis/trans lsomerisierung um eine der drei Xaa-Pro Bindungen im Tendamistat. Wie im ersten Teil dieser Arbeit gezeigt werden konnte, entsteht die prolinabhängige lsomerisierungsreaktion während der Rückfaltung (t3) als Folge einer trans -> cis Umlagerung um die A1a49-Pro50 Amidbindung nach Entfaltung des Proteins. Der Nachweis einer solchen lsomerisierung gelang auf rekombinantem Weg, durch gezielten Austausch der einzelnen Proline. Im Gegensatz dazu resultiert die mittlere kinetischen Phase (t2) als Folge einer Prolin-unabhängigen cis/trans-lsomerisierungsreaktion um mindestens eine vorhandenen nicht-Prolinbindungen im Protein. Diese Schlußfolgerung konnte durch Vergleich mit zahlreichen Literaturdaten und Experimenten weiter gestützt werden. Tendamistat ist damit das erste Protein in der Literatur, bei dem es gelang, eine solche Prolin-unabhängige lsomerisierungsreaktion experimentell nachzuweisen. Wie mit Hilfe von weiteren Substitutionsexperimenten im zweiten Teil der Arbeit gezeigt werden konnte, tragen hydrophobe Oberflächencluster entscheidend zur Stabilisierung des lnhibitors bei. Die dabei gemessenen Stabilisierungsbeiträge stehen in einem linearen Verhältnis zum Seitenkettenvolumen der eingeführten Aminosäurereste (Alanin << Valin << Isoleucin). Hierdurch ließ sich zeigen, daß der stabilisierende Einfluß solcher Cluster im Wesentlichen auf das Vorhandensein von hydrophoben Wechselwirkungen zurückzuführen ist. Für die Faltung von Proteinen, die wie das Tendamistat ausschließlich aus ß-Faltblättern bestehen, spielt die Bildung von ß-Hairpinstrukturen eine entscheidende Rolle Die in dieser Arbeit untersuchten ß-Hairpinmutanten L14A bzw. N25A zeigen im Vergleich zum Wildtyp eine extreme Destabilisierung der ß-Faltblattstruktur. Durch Vergleich der Aktivierungsenergien (DeltadeltaGD-TS) mit den freien Enthalpien (DeltadeltaG0N-D) konnte die strukturelle Entwicklung des ß-Hairpins im Übergangszustand an den beiden Positionen 14 bzw. 25 mitverfolgt werden (~-Wert Analyse). Entgegen den Erwartungen zeigen diese Untersuchungen, daß beide Positionen im Übergangszustand noch weitestgehend solvatisiert vorliegen. Damit scheint die nativ-ähnliche Zusammenlagerung des ersten ß-Hairpins erst nach Erreichen des Übergangszustands stattzufinden. Alle in dieser Arbeit vorgelegten Daten über die Faltung des alpha-Amylase lnhibitors sind konsistent mit dem Nukleations-Kondensations Modell. Analog der Tröpfchenbildung bei unterkühlten Gasen kommt es nach dem kollabieren der Proteinkette als Reaktion auf die veränderten Lösungsmittelbedingungen zur intramolekularen Suche nach Nukleationsstellen. Der Übergangszustand wird erreicht, wenn sich eine kritische Zahl stabilisierender Kontakte (unspezifische Nukleation) ausbilden konnte. Ob an einem solchen Nukleationskern stets bestimmte Seitenketten beteiligt sind (spezifische Nukleation), bleibt an dieser Stelle noch offen.
Die Kombination aus proteolytischer Spaltung, massenspektrometrischer Analyse und Datenbanksuche ist eine etablierte Methode zur Identifizierung von Proteinen. Ist die Identität eines Proteins geklärt, dann stellt sich im Anschluß daran häufig die Frage nach den posttranslationalen Modifikationen des Proteins. Auch hierfür ist die Massenspektrometrie eine prädestinierte und häufig angewandte Methode. Eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen eukaryotischer Proteine ist die Phosphorylierung an Ser-, Thr- und Tyr-Resten. In der vorliegenden Arbeit ist die Weiterentwicklung und Anwendung zweier massenspektrornetrischer Methoden zur Analyse der Proteinphosphorylierung beschrieben: i) der Neutralverlust-Scan zur selektiven Detektion von Ser/Thr-phosphorylierten Peptiden, und ii) die Metallaffinitätschromatographie zur selektiven Anreicherung von Phosphopeptiden. Bei der Optimierung der Analytik der Proteinphosphorylierung mittels Neutralverlust-Scan hatte sich am Beispiel der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A gezeigt, dass die Verwendung einer Protease mit geringer Spaltungsspezifität (Elastase) wesentliche Vorteile gegenüber einer Protease mit hoher Spaltungsspezifität (Trypsin) besitzt. Die kleineren Elastase-generierten Phosphopeptide zeigen im Vergleich zu den Trypsin-generierten Phosphopeptiden eine effektivere Phosphorsäure-Abspaltung und lassen sich im Neutralverlust-Scan mit deutlich besserer Empfindlichkeit detektieren. in weiterer Vorteil der Elastase ist in ihrer Eigenschaft partiell überlappende Peptide zu generieren begründet. Die Metallaffinitätschrornatographie wurde eingesetzt, um die Elastase-generierten Phosphopeptide selektiv anzureichern. Es konnte gezeigt werden, dass die Metallaffinitätschromatographie eine geeignete Methode ist, um die Komplexität des Elastase-generierten Peptidgemischs drastisch zu reduzieren, so dass eine automatische Fragmentionen-Analyse aller angereicherten Peptide mittels nanoESl möglich ist. Die Leistungsfähigkeit der Kombination aus Elastase-Verdau, Metallaffinitätschromatographie und Q-TOF- Tandem-MS wurde am Beispiel des Transkriptionsinitiationsfaktors IA unter Beweis gestellt, wo mit Hilfe dieser Analysen-Strategie drei bislang unbekannte in-vivo-Phosphorylierungsstellen nachgewiesen werden konnten. Neben der Proteinphosphorylierung wurden in dieser Arbeit auch eine Reihe anderer kovalenter Modifikationen untersucht. Bei der Analyse der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A konnten neben einer bislang unbekannten fünften Phosphorylierungsstelle an Ser259 auch die Modifikation von Cys343 durch Glutathion und die N-terminale Modifikation durch Gluconsäure nachgewiesen werden. Mittels Q-TOF-Tandem-MS wurde die in-vivo-Myristoylierung des humanen Proteins GAPR 1 nachgewiesen. Mittels der sog Top-Down-Analyse wurde am Beispiel des Proteins Dynamin A gezeigt, wie mittels dieser Strategie eine vollständige Charakterisierung aller kovalenten Modifikationen eines Proteins erreicht werden kann. Im Falle von Dynamin A konnte die Acetylierung des N-terminalen Methionins nachgewiesen werden. Andere kovalente Modifikationen konnten ausgeschlossen werden. Im letzten Kapitel der vorliegenden Arbeit wird am Beispiel von Dynamin A gezeigt, wie sich die Kombination aus partieller proteolytischer Spaltung, Tandem-MS und Datenbanksuche effektiv zur Charakterisierung der Domänenstruktur von Proteinen einsetzen lässt.
Die lösliche Guanylyl Zyklase (sGC) ist das Schlüsselenzym, das die Stickstoffmonoxid (NO)-induzierte Vasodilatation über eine Erhöhung des intrazellulären zyklischen 3´5´-Guanosinmonophosphats (cGMP) vermittelt. Obwohl die sGC oft als "Haushalts"-Gen bezeichnet wurde, dessen Aktivität nur akut durch die verfügbare NO-Menge reguliert wird, zeigen einige neuere Befunde, dass eine Regulation auch auf Ebene der Gen-Expression stattfindet. Z.B. wurde in zwei Rattenmodellen, der Nitrat-Toleranz (Mülsch et al., 2001) bzw. des chronischen Herzversagens (Bauersachs et al., 1999), eine zwei- bis dreifache Induktion der sGC-Expression beobachtet. Bei der Nitrat-Toleranz wurde zudem ein Anstieg der Endothelin- 1 (ET-1)-Expression beobachtet (Münzel et al., 1995). In dieser Arbeit wurde deshalb untersucht, ob ET- 1 einen Einfluss auf die sGC-Expression und die sGC/cGMP vermittelte Relaxation von Rattengefäßen hat. Um den möglichen Einfluss von ET-1 auf die Transkription der sGC zu untersuchen sollten die Promotoren der beiden Untereinheiten (UE) a1 und ß1 der Ratte kloniert werden. Dazu wurde zuerst eine Bestimmung der Transkriptionsstarts für beide UE durchgeführt. Es konnte gezeigt werde, dass die Sequenz der bis dahin bekannten 5´ Untranslatierten Region (5´ UTR) der a1-UE (Nakane et al., 1990) nicht korrekt war. Die ersten 213 bp dieser Sequenz konnten nicht gefunden werden. Für die ß1-UE konnte der 5´ UTR um 30 bp, im Vergleich zu der von Nakane (1990) publizierten Sequenz, verlängert werden. Letztlich konnten mit Hilfe einer PCR-Technik 2864 bp (a1) und 1287 bp (ß1) in 5´ Richtung des Transkriptionsstarts kloniert und sequenziert werden. Beide Promotoren zeigten eine basale Aktivität, die sich mit zunehmender Verkürzung der Bereiche in Richtung Transkriptionsstart erhöhte. Die basale Aktivität der beiden UE-Prornotoren zeigte, dass die Gene der beiden UE nicht in Tandemorganisation, wie im Medakafisch (Mikami et aI., 1999) vorliegen, sondern ähnlich wie bei der Maus (Sharina et al., 2000) beide UE unabhängig voneinander reguliert werden. Beide Promotoren ließen sich durch eine 6 stündige Stimulation mit ET-1 [10nM] um das ca. 1,6 bis l,9fache aktivieren. Bei Verkürzung des a1-Promotors wurde zudem festgestellt, dass das kürzeste Fragment sich nicht mehr durch ET-1 stimulieren ließ. In den 146 bp, die diesem Konstrukt fehlten, befinden sich mögliche Bindestellen für die Transkriptionsfaktoren PEA3, NF-Il6 und E2A. In kultivierten glatten Gefäßmuskelzellen der Ratte konnte mit Hilfe der RT-PCR gezeigt werden, dass ET-I (10 nM, 6 Std.) die Expression beider UE auf mRNA-Ebene um das ca. dreifache erhöht. Zudem konnte für die ß1-UE mit Hilfe der Real-Time-PCR (TaqManTM) und für die ET-Rezeptortypen spezifische Antagonisten gezeigt werden, dass dieser ET-1 Effekt über den ETA-Rezeptor vermittelt wird. Bei isometrischen Kontraktionsmessungen an Endothel-freien Rattengefäßen konnte gezeigt werden, dass eine 4 stündige Vorstimulation mit 10 nM ET-1 die für eine 50%ige Relaxation der Gefäße nötige Konzentration des NO-Donors Natriumnitropussuid (SNP) um ca. eine Zehnerpotenz verringert. ET-1 erzeugt also eine deutliche Sensitivierung der Gefäße gegenüber NO. Durch Versuche mit einem stabilem cGMP-Analogon (8-Bromo-cGMP) konnte zudem gezeigt werden, dass nachfolgenden Elemente der NO/cGMP Signalkette nicht durch die ET-1 Stimulation beeinflusst wurden. Auch Teile der Signalkette, die die cAMP-induzierte Relaxation vermitteln, wurden nicht durch ET-1 beeinflusst. Schließlich konnte in in-vitro Versuchen gezeigt werden, dass ET-1 sowohl in Endothel-freien Rattenaorten und Koronargefäßen des Schweins, als auch in kultivierten, glatten Rattengefäßmuskelzellen eine signifikante Steigerung der spezifischen NO-induzierten sGC-Aktivität bewirkt. Die in dieser Arbeit gezeigte Steigerung der Promotoraktivität, der mRNA-Mengen und der enzymatischen Aktivität der sGC durch ET-1 deutet auf einen biologischen Rückkoppelungsmechanismus hin. Dieser würde einer übermässigen Vasokontraktion und den mitogenen Effekten von ET-l bei einer Überexpression entgegen wirken und wäre somit ein wichtiges Element der Feineinstellung der ET-1 Wirkung.
Termiten (Insecta: Isoptera) sind soziale Insekten und ein wichtiger Bestandteil der Fauna terrestrischer Ökosysteme der Tropen. Dort stellen sie bis zu 25 Prozent der Bodenfauna und sind als Ökosystem-Ingenieure eine sogenannte Keystone-Gruppe (Abe & Higashi, 1997). Untersuchungen zur Rolle in Stoffkreisläufen wurden bisher hauptsächlich in den Savannen Afrikas oder Asiens durchgeführt. Bis heute sind auffallend wenig Daten aus tropischen Wälden vorhanden. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit mehreren Teilaspekten der Termitenökologie in einem amazonischen Festlandregenwald. Die Atmungsaktivität von 24 Termitenarten wurde mittels Infra-Rot-Gas-Absorptions-Messungen (IRGA-Messungen) bestimmt. Hierbei wurde nach Kasten (Arbeiter und Soldaten) differenziert. Das Verhältnis von Körpermasse und CO2-Produktion folgt einem ubiquitären biologischen Gesetz, nach dem die Metabolismusrate mit zunehmender Köpergröße abnimmt. Die untersuchten Termiten konnten in vier verschiedene Nahrungsgilden eingeteilt werden: Holzfresser, OM-Fresser (OM=organisches Material), Interfacefresser und Spezialisten. In Übereinstimmung mit der taxonomischen und funktionellen Einteilung konnte gezeigt werden, dass Holzfresser mit 0,87 g [CO2 g Biomasse -1] signifikant mehr CO2 als OM-Fresser (0,47 g [CO2 g Biomasse -1]) und Spezialisten (0,42 g [CO2 g Biomasse -1]) produzieren. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden verschiedene Einflüsse unterschiedlicher Waldsysteme auf die Termitenaktivität untersucht. Die Präsenz von Termiten an Köderfallen wurde dazu in drei verschiedenen Waldsystemen (Primärwald, Sekundärwald und verschiedene agroforstwirtschaftliche Anbausysteme) für den Zeitraum eines Jahres beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass die Termitenaktivität mit dem Komplexitätsgrad der untersuchten Systeme und der Bodenfeuchte korreliert. Die meisten mit Termiten besetzten Fallen fanden sich im Primärwald. Es war außerdem möglich den Nachweis zu liefern, dass der Vegetationstyp forstwirtschaftlich genutzter Flächen die Termitenaktivität beeinflusst. In vier verschiedenen agroforstwirtschaftlichen Polykulturen wurden sowohl in der Trocken- als auch in der Regenzeit mehr besetzte Köderfallen gezählt als in Monokulturen der untersuchten amazonischen Nutz-Baumarten (Citrus sinensis, Theobroma grandiflorum, Hevea brasilensis, Bactris gasipaes und Cocos nucifera). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Termiten auf Feuchtigkeitsunterschiede im Boden reagieren indem sie zu feuchte (> 28% volum. Wassergehalt) oder zu trockene Standorte (< 23% volum. Wassergehalt) meiden. Auf der Basis der ermittelten Atmungsdaten wurde die Rolle der Termiten im lokalen und globalen Kohlenstoffkreislauf mit Hilfe von Modellen spezifiziert. Erstmalig konnten hierbei die Daten der neotropischen Termiten in ökologische Modelle integriert werden. Zum einen ergab die Modellierung der CO2-Produktion der untersuchten Arten aus Teil A mit dem Makrofaunamodell NEOMITES, dass Termiten in einem tropischem Regenwald in der Lage sind, bis zu 28 Prozent des Bodenkohlenstoffes zu mobilisieren. Zum anderen wurde mit einem im Rahmen dieser Arbeit entwickelten Modell die Nettomenge der Treibhausgase Kohlendioxid und Methan die durch Termiten produziert wird, berechnet. Demnach tragen Termiten tropischer Regenwälder zwischen 0,52 und 2,75 Prozent zur globalen jährlichen Nettoproduktion des Kohlendioxids bei und liegen damit über dem bisher vermuteten Anteil von 0,22-1,56 Prozent. In bezug auf Methan liegen die Ergebnisse der globalen jährlichen Nettoproduktion im Bereich bisheriger Schätzungen (zwischen drei und 19 Prozent). Die durchgeführten Untersuchungen konnten zeigen, dass Termiten auf Bodenqualitätsmerkmale wie Feuchtigkeit reagieren und somit als Monitororganismus bei der nachhaltigen Nutzung tropischer Böden eingesetzt werden können. Durch die Ermittlung der Atmungswerte und der darauf basierenden Modellierung konnte ihre zentralen Rolle im Kohlenstoffkreislauf der Böden tropischer Regenwälder demonstriert werden. Die Modellvorhersagen ihres Beitrags zur Nettoproduktion von Kohlendioxid und Methan zeigen, dass Termiten tropischer Regenwälder keine primäre Quelle des atmosphärischem Kohlendioxids und Methans darstellen. Allerdings liegt ihr Beitrag - insbesondere im Fall von Kohlendioxid - über den bisherigen Annahmen.
In bestimmten methanogenen Archaea wurde vor einigen Jahren eine metallfreie Hydrogenase gefunden, die den reversiblen und stereoselektiven Transfer eines Hydridions von Wasserstoff auf die an den C1-Carrier Tetrahydroniethanopterin (H4MPT) gebundene Methenyl-Gruppe katalysiert. Damit stellt dieses Enzym den ersten und einzigen rein organischen Hydrogenierungskatalysator dar, den man in der Natur kennt. Ziel der vorgelegten Arbeit war die kristallographische Bestimmung der Enzymstruktur. Versuche zur Strukturlösung des in aktiver Form aus M. marburgensis isolierten Enzyms durch mehrfachen isomorphen Ersatz, über die anomale Dispersion an nicht-isomorphen Quecksilberderivaten und die des Selens an mit Selenomethionin markiertem Enzym verliefen nicht erfolgreich. Ursächlich hierfür war die perfekte meroedrische Zwillingsbildung der Kristalle. Für die beiden heterolog produzierten, inaktiven Apoenzyme aus den Hyperthermophilen M. jannaschii und M. kandleri wurden in dieser Arbeit effektive Expressions- und Reinigungsprotokolle entwickelt. Für das Enzym aus M. jannaschii wurden Mikrokristalle erhalten, die lediglich ein Proteolysefragment von etwa der halben Masse des Vollängenproteins enthalten. Kristalle des Enzyms aus M. kandleri konnten durch serielles Microseeding so weit verbessert werden, daß die Durchführung eines MAD-Experiment möglich wurde. Erst unter Verwendung vor kurzem entwickelter direkter Methoden (Shake-and-Bake) gelang die Strukturlösung bei einer Auflösung von 2.8 Å. Die Monomere bilden ein sehr eng assoziiertes Homodimer; zwei dieser Dimere sind zu einem locker assoziierten Tetramer verbunden. Jedes Monomer besitzt zwei Domänen. Die N-terminale Domäne von etwa 255 Resten besitzt eine Faltung, wie sie für Dinukleotid-bindende Enzyme typisch ist, mit einem zentralen, verdrehten achtsträngigen beta-Faltblatt. Die C-terminale Domäne von etwa 100 Resten besitzt dagegen weitgehend alpha-helikale Struktur und ist für die außerordentlich enge Assoziation des Homodimers verantwortlich. Beide Domänen sind durch eine gestreckte, flexible Verbindung verknüpft. Im Dimer entstehen dadurch zwei tiefe Spalten, die von Anteilen der N-terminalen Domäne eines und der C-terminalen Domäne des jeweils anderen Monomers begrenzt werden. Das aktive Zentrum liegt wahrscheinlich in dieser Spalte, wobei postuliert wird, daß der fest gebundene Cofaktor eher mit der größeren N-terminalen Domäne assoziiert ist und das Substrat zwischen den Domänen bindet. An der Bindung dürfte die C-terminale Domäne und möglicherweise auch direkt der Cofaktor beteiligt sein. Die Struktur zeichnet sich durch außergewöhnlich hohe Tenmperaturfaktoren ans. Für das Enzym aus M. marburgensis konnte eine Lösung durch molekularen Ersatz erhalten werden. Da der für die Katalyse benötigte, noch unbekannte Cofaktor nicht in der Struktur enthalten ist, ist eine weitergehende Diskussion des enzymatischen Mechanismus noch nicht möglich. Die Verfügbarkeit eines ersten Strukturmodells der metallfreien Hydrogenase stallt aber bereits einen entscheidenden Schritt auf dem Weg zum Verständnis dieses ungewöhnlichen Hydrogenierungskatalysators dar.
In der vorliegenden Untersuchung wurden Populationen der Gattung Corbicula im Rhein mit Individuen aus der Mosel, der Weser sowie aus Frankreich, Spanien, Nordamerika und dem Nahen und Fernen Osten sowohl mit genetischen als auch morphologischen Methoden untersucht. Aus diesen Daten sollte ermittelt werden, wie viele Taxa bei der rezenten Besiedelung Europas auftraten und welche Migrationsrouten hierbei nachgewiesen werden konnten. Es konnte gezeigt werden, dass im Rhein zwei hybridisierende genetische Linien auftraten, wobei keine Rückkreuzung mit den Eltern nachgewiesen werden konnte. Die Hybride waren morphologisch nicht zu unterscheiden. Hinweise auf einen unterschiedlichen Chromosomensatz dieser Linien bzw. eine Polyploidie konnte nicht gefunden werden. In der Rhone wurde eine weitere Linie entdeckt. Eine der genetischen Linien im Rhein konnte im Vergleich zu Individuen aus Fernost als C. fluminea identifiziert werden. Die Herkunft der beiden Linien aus Rhein und Rhone blieb unklar, da sie nicht Individuen aus Israel oder Nordamerika zugeordnet werden konnten. Eine Polytomie der MP- und ML-Analysen war nicht auf einen zu geringen Datensatz zurückzuführen, vielmehr konnte gezeigt werden, dass Corbicula im Pleistozän eine Radiation durchief. Schalenmorphologisch konnten die genetischen Linien aus dem Rhein nicht durchgehend den zwei auftretenden Morphen zugeordnet werden. Gleichzeitig schienen diese Individuen die Extreme einer weltweiten Variabilität der Schalenform darzustellen. Ein morphologischer Vergleich von Schalen aus der Sammlung Senckenberg zeigte keine Unterschiede zwischen Individuen, die als C. fluminalis und C. fluminea bezeichnet waren. Vielmehr scheint die Schalenform nicht genügend conchologischen Merkmale zu besitzen, um die genetischen Linien zu unterscheiden. Die Besiedelung Europas durch die Körbchenmuschel erfolgte mehrfach unabhängig in verschiedenen Flusssystemen Südwest- und Mitteleuropas Anfang der 1980er Jahre. Auf- grund der hier nachgewiesenen Isolationswirkung von Stauwehren der Bundeswasserstrassen auf Makroinvertebraten und der Ergebnisse der DAF-Fingerprints von Corbicula- Populationen wurde die Mosel vermutlich von Frankreich aus besiedelt.
Die Protoonkogene Ras und Raf spielen eine wichtige Rolle bei der Übertragung eines extrazellulären Signals in den Zellkern. Die direkte Interaktion zwischen GTP-gebundenem, aktiviertem Ras und der Proteinkinase Raf führt zur Aktivierung der Ras/Raf/MEK/ERK-Kaskade, die eine entscheidende, regulatorische Rolle bei onkogenen, mitogenen und entwicklungsabhängigen Signalwegen besitzt. Die Beeinflussung der Kaskade stellt daher einen interessanten Ansatz für die Arzneistoffentwicklung dar. Trotz der bekannten Proteinstrukturen von Ras und Raf sind bisher nur wenige Stoffe gefunden worden, die die Interaktion direkt beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde daher ein Testsystem auf der Basis des Hefe-Zwei-Hybrid-System etabliert, mit dessen Hilfe Effektoren der Ras/Raf-Wechselwirkung schnell und einfach identifiziert werden können. Das erste Ziel der Arbeit war die Etablierung einer Testmethode in 96-well-Microtiterplatten, die einen schnellen Durchsatz verschiedener Proben erlaubt. Insgesamt wurden in der vorliegenden Arbeit 469 Reinsubstanzen und Pflanzenextrakte in verschiedenen Konzentrationen getestet. Durch die Verwendung geeigneter Kontroll-Hefestämme konnte außerdem eine Aussage über die Spezifität der Substanzinteraktion getroffen werden. Bei einigen Ras/Raf-aktivierenden Substanzen konnten über die Testung systematischer Substanzreihen Struktur-Wirkungsbeziehungen aufgestellt werden. Cycloalkylidencarbonsäuren wurden als erste potente Ras/Raf-Aktivatoren identifiziert, deren wahrscheinlicher Interaktionsbereich durch die Expression verkürzter Raf-Mutanten auf den Bereich von AS 131-194 von Raf eingeschränkt werden konnte. Sie stabilisieren nicht nur die Bindung von mutiertem, sondern auch von Wildtyp-Ras an Raf. In einem zweiten, unabhängigen Säugerzell-Testsystem, das auf der Aktivierung der Ras/Raf/MEK/ERK-Kaskade und dem anschließendem Nachweis des phosphorylierten MEK-Proteins beruht, lieferten die aktiven Verbindungen erste Hinweise auf eine Aktivierung der Signalkaskade. Mögliche Optimierungen der beiden verwendeten Testsystem, sowie Alternativen, weitergehende Experimente und Einsatzgebiete von Ras/Raf-Effektoren werden abschließend diskutiert.
Der Cytochrom-bc1-Komplex katalysiert die Elektronenübertragung von Ubihydrochinon auf Cytochrom c in der Atmungskette und in der bakteriellen Photosynthese. Das Enzym stellt somit das Bindeglied zwischen den Ubihydrochinon bildenden Dehydrogenasen und der Cytochrom c oxidierenden Cytochrom-c-Oxidase dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen des Cytochrom-bc1-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae mit seinen Substraten Ubichinon und Cytochrom c sowie mit Phospholipiden der inneren Mitochondrienmembran untersucht. Durch Analyse von Gesamtlipidextrakten aus Proben des Cytochrom-bc1-Komplexes konnte gezeigt werden, daß das Enzym in Anwesenheit von vier verschiedenen Phospholipiden gereinigt und kristallisiert werden kann. In der Kristallstruktur des Enzyms bei 2,3 Å Auflösung wurden fünf Bindungsstellen für Phospholipide und eine Bindungsstelle für ein Detergensmolekül identifiziert. Die Bindungsstelle für eines der Phospholipide, ein Cardiolipin-Molekül, liegt am Eingang eines von zwei Protonierungspfaden für die Ubichinon-Reduktionsstelle (Qi-Bindungsstelle). Ein Phosphatidylinosit-Molekül befindet sich in einer außergewöhnlichen Position unweit der flexiblen "Linker"-Region des Rieske Eisen-Schwefel-Proteins und trägt vermutlich zur Stabilisierung dieser katalytischen Untereinheit bei. Durch Röntgenbeugung an Kokristallen bestehend aus Cytochrom-bc1-Komplex und gebundenem Cytochrom c konnte die dreidimensionale Struktur dieses transienten Enzym-Substrat-Komplexes bei 2,97 Å ermittelt werden. Die Kristallstruktur ist die erste Struktur des Cytochrom c im Komplex mit einem seiner beiden Redoxpartner aus der Atmungskette. Sie zeigt, daß das Cytochrom c hauptsächlich durch hydrophobe Wechselwirkungen an das Cytochrom c1 bindet und daß die Nähe der beiden c-Typ Hämgruppen eine schnelle Reduktion des Cytochrom c erlaubt. Im homodimeren Cytochrom-bc1-Komplex ist nur eine der beiden Bindungsstellen für Cytochrom c besetzt. Diese hälftige Substratbindung zeigte sich auch für das Ubichinon in der Qi- Bindungsstelle und weist darauf hin, daß die beiden Monomere des Enzyms unabhängig voneinander oder sequentiell arbeiten können. Möglicherweise dient dies der Regulation der Enzymaktivität des Cytochrom-bc1-Komplexes. Durch partielle Reduktion des Cytochrom-bc1-Komplexes in Anwesenheit von Ubichinon konnte ein proteingebundenes Ubisemichinonradikal erzeugt und durch Schockgefrieren stabilisiert werden. Die spektralen Eigenschaften dieses Radikals sind typisch für ein Ubisemichinon an der Qi-Bindungsstelle. Durch Spektroskopie an einer Probe, die einem Wasserstoff/Deuterium-Austausch unterzogen wurde, konnte gezeigt werden, daß dieses Radikal von Protonen koordiniert wird, die mit dem Solvens im Austausch stehen. Dies steht in Übereinstimmung mit der Theorie des Q-Zyklus und wurde durch die hochauflösenden Kristallstruktur des Enzyms bei 2,3 Å vorhergesagt. Die erzielten Ergebnisse zeigen neue Informationen zum Wechselspiel des Cytochrom- bc1-Komplexes mit Phospholipiden aus der inneren Mitochondrienmembran. Die Bestimmung der Struktur des transienten Komplexes bestehend aus Enzym und Cytochrom c erweitert das Bild über den Elektronentransfer durch Cytochrom c zwischen dem Cytochrom-bc1-Komplex und der Cytochrom-c-Oxidase. Das mögliche Zusammenwirken der Bindungstellen für Cytochrom c und Ubichinon ist ein neuer mechanistischer Aspekt, der auf eine Regulation der Enzymaktivität schließen läßt.
Weltweit stellen die tropischen Tieflandregenwälder die Zentren der Artenvielfalt und Biodiversität dar. Sie sind das komplexeste aller terrestrischen Ökosysteme. Zu der Frage nach den Ursachen ihrer Artenvielfalt und deren Aufrechterhaltung gibt es neben theoretischen Erklärungsansätzen bisher kaum Studien, die versuchen, die Artenvielfalt eines Taxons bedingende ökologischen Faktoren kausal zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, diese Thematik mit Hilfe eines neuen Forschungsansatzes aufzugreifen. Die Artenabnahme eines Taxons und die sie potentiell verursachenden Faktoren sollten entlang eines Höhengradienten aufgenommen werden, um im Umkehrschluß Hinweise zu finden, welche Bedingungen für die Aufrechterhaltung der Artenvielfalt entscheidend sind. Ameisen boten sich aufgrund ihrer starken Artenabnahme mit zunehmender Höhe besonders als Untersuchungsobjekt an. Sie nehmen zudem eine Schlüsselrolle im Ökosystem Tieflandregenwald ein, stellen unter den Invertebraten eine der taxonomisch mit am besten bearbeiteten Gruppen dar, und selbst einzelne Individuen können aufgrund ihrer eusozialen und seßhaften Lebensweise definitiv dem Fundort bzw. der Fundhöhe zugeordnet werden. Der grundlegende Versuchsansatz bestand darin, alle Untersuchungen vergleichend in Boden- und Vegetationsstratum durchzuführen. Dementsprechend wurden entlang des Höhengradienten in beiden Straten die Artenabnahme der Ameisen sowie abiotische und biotische Parameter aufgenommen. Weiterhin wurde eine Art (Diacamma sp.) exemplarisch herausgegriffen, um eventuelle Veränderungen ihrer Ökologie zu erfassen. Die Abnahme der Artenvielfalt von Ameisen am Boden und in der niederen Vegetation verläuft unterschiedlich. Dieser Unterschied ist jedoch nicht auf grundlegend unterschiedliche Faktoren zurückzuführen, sondern auf deren unterschiedliche Ausprägung entlang des Höhengradienten. Es handelt sich hier in beiden Straten zusammenfassend vor allem um vier Faktoren: Temperatur, Feuchtigkeit (umfaßt relative Luftfeuchtigkeit, Nebel, Regen und Staunässe), Nistraumverknappung und Nahrungsverknappung. Die in dieser Studie festgestellte signifikant positive Korrelation von Arten- und Temperaturabnahme betont die besondere Bedeutung des Parameters Temperatur. Diese wirkt einerseits durch eine Beeinträchtigung des Stoffwechsels direkt auf adulte Tiere und Brut und andererseits indirekt über die Veränderung abiotischer (Feuchtigkeit und Nistraum) und biotischer (Nahrung) Parameter. Die jeweiligen relativen Anteile von direktem und indirektem Temperatureinfluß, die mit zunehmender Höhe zur Artenabnahme führen, sind mit den vorliegenden Daten nicht quantifizierbar. Zudem verändern sich die Relationen entlang des Höhengradienten. Anhand ökologischer Überlegungen kann dennoch eine Einschätzung der jeweiligen Bedeutung der Einzelfaktoren vorgenommen werden. Der direkte Einfluß von Temperatur wird in der vorliegenden Studie mehrfach verdeutlicht. Diacamma sp. zeigt beispielsweise eine verminderte Leistungsfähigkeit durch eine signifikant geringere Bauaktivität mit steigender Höhe. Zudem scheint Diacamma sp. in der Lage zu sein, die Architektur ihrer Nester so zu verändern, daß sie thermoregulatorisch der Temperaturabnahme entgegenwirkt. Diese ethologische Flexibilität ermöglicht Diacamma sp., ihr Vorkommen über ihre physiologische Toleranz hinaus auszudehnen. Ein weiterer Hinweis auf einen direkten Temperatureinfluß ergibt sich aus der generellen Reduktion der Koloniegrößen mit zunehmender Höhe. Sie könnte unter anderem durch eine verringerte Fouragieraktivität begründet sein. Weiterhin nimmt die Nestdichte in beiden Straten in dem Höhenbereich signifikant ab, in dem die Durchschnittstemperaturen unter den ökologisch für Ameisen kritischen Schwellenwert von 20°C sinken. Der überwiegende Teil der Ameisen beider Straten nistet in thermoregulatorisch ungünstigem Nistraum (z.B. kleines Totholz, Laub, Humusschicht, Karton). Daher kann die Temperaturabnahme direkt zu einer Nistraumverknappung führen. Am Boden hat die temperaturinduzierte Zunahme von Staunässe mit steigender Höhe einen zusätzlichen negativen Effekt auf die Ressource Nistraum. Insbesondere die Schicht, in der die meisten Nester gefunden wurden (Humus-Wurzel-Schicht), ist davon betroffen. Zudem führt die signifikant an Höhe zunehmende Humus-Wurzel-Schicht dazu, daß der Oberboden im Übergang zwischen Tiefland- und unterem Bergregenwald immer weniger als Nistraum zur Verfügung steht. Im Bergregenwald hingegen treten durch vermehrten Epiphytenbewuchs für Bodenameisen neue Nistmöglichkeiten in der niederen Vegetation auf. In der Vegetation werden durch zunehmende Feuchtigkeit die Kartonnester instabil und damit in größeren Höhen unbrauchbar. Zudem trägt die temperaturabhängige Veränderung der Wuchsform des unteren Bergregenwaldes durch eine räumliche Verkleinerung des Gesamtlebensraumes zu einer Reduzierung der Nist- und Nahrungsressourcen bei. Die Nahrungsverfügbarkeit für Ameisen wird am Boden und in der niederen Vegetation ebenfalls negativ von Temperatur und Feuchtigkeit beeinflußt. Am Boden wird die Nahrungsverknappung z.B. durch den signifikant zunehmenden Nistabstand und den signifikant abnehmenden Beuteeintrag / Zeit von Diacamma sp. Kolonien deutlich. Es ist anzunehmen, daß Nahrungsmangel bei ihrer Verbreitungsgrenze von 1050 m eine wichtige Rolle spielt. Die Nahrungsverknappung für die räuberisch lebenden Bodenameisen wird vermutlich vor allem durch die Abnahme wichtiger Beutegruppen (z.B. Termiten) verursacht. Weiterhin hindert (Stau)Nässe kleine Ameisenarten (die große Mehrheit der hier gesammelten Arten) an der Nahrungssuche. In der niederen Vegetation verursacht der Wechsel des Florentyps auf Familienniveau zwischen Tieflandregenwald und Bergregenwald mit großer Wahrscheinlichkeit eine entscheidende Verknappung der Nahrungsressourcen über die Abnahme von Pflanzen mit extrafloralen Nektarien und der mit Ameisen assoziierten Trophobionten. Die Arten- und Abundanzabnahme der Ameisen verstärkt diese Tendenz wiederum durch negative Rückkopplung, da eine geringere Nachfrage das Angebot bzw. die Produktion der Nahrungssubstrate reduziert. Die vorliegenden Ergebnisse geben weiterhin Hinweise, welche Faktoren bei der Faunenverarmung in anthropogen veränderten Habitaten eine wichtige Rolle spielen können. Der größte Teil der Artenvielfalt des untersuchten primären Regenwaldes wird von kleinen Arten gestellt. Diese wiederum weisen in besonderem Maße eine Sensibilität gegenüber mikroklimatischen Veränderungen auf. Insbesondere abiotische Extreme wie Nässe und niedrige Temperaturen oder Trockenheit in Kombination mit hohen Temperaturen sind Faktoren, die sie am Fouragieren und Nisten hindern können. Daher trägt eine gut ausgebildete Laubstreu- bzw. Humusschicht grundsätzlich zur Artenvielfalt der Bodenameisen bei. Die Laubstreuschicht dient als Fouragierstratum, die Humusschicht als Hauptniststratum, und beide zusammen wiederum sind ein Schutz gegen die Austrocknung des Oberbodens. Ihre Bewahrung sowie die eines möglichst ausgewogenen Mikroklimas sind Grundvoraussetzung für die Vermeidung einer Artenverarmung. Für die niedrige Ausbreitungsgrenze von Ameisen an feucht-tropischen Höhengradienten (ca. 2300 m) scheinen spezielle Charakteristika ihrer eusozialen Lebensweise entscheidend zu sein. Hier sind insbesondere die ökologische Notwendigkeit geschützten Nistraums, energieaufwendiger Fouragierleistung und hoher Brut-Entwicklungstemperatur sowie die Unfähigkeit zur aktiven Nest- Temperaturerhöhung zu nennen. Historisch tiergeografische Gründe scheinen für die starke Abnahme der Ameisenvielfalt mit zunehmender Höhe bzw. für ihre Ausbreitungsgrenzen eine eher untergeordnete Rolle zu spielen. Temperaturabnahme allein bedingt jedoch nicht zwingend eine Artenabnahme, wie im unteren Bergregenwald an der gleichbleibenden Artenzahl des Bodenstratums deutlich wird. Die Bodenameisen müssen hier Lösungswege gefunden haben, dauerhaft mit weit unter 20°C liegenden Temperaturen, starker Nässe und geringer Sonneneinstrahlung zurecht zu kommen. Insofern können in den submontanen und montanen Bereichen der Regenwälder Höhenspezialisten vermutet werden, die jedoch nicht die subalpinen Regionen erreichen. Zusammenfassend ist festzuhalten, daß für eine hohe Artenvielfalt von Ameisen eine relativ hohe Temperatur, ausgewogen hohe Feuchtigkeit, Nistraumvielfalt und Nahrungsmenge sowie -qualität von entscheidender Bedeutung sind. Eine nähere experimentelle Analyse ihres jeweiligen relativen Gewichtes und ihrer konkreten Wirkweise auf einzelne Arten bzw. Artengruppen wäre für die Zukunft wünschenswert.
Die Kichererbse (C. arietinum L.) ist eine der ältesten kultivierten Leguminosen und stellt eine Nahrungsgrundlage in vielen Ländern mit semiaridem Klima dar. Seit einigen Jahren unterstützen molekulare Marker sowohl die Züchtungsforschung als auch die Genomanalyse dieser Pflanze, so daß bereits eine genetische Karte des Kichererbsengenoms erstellt werden konnte. Da repetitive Komponenten einen Großteil des Genoms ausmachen können, ist ihre Charakterisierung zum Verständnis der Organisation des Kichererbsengenoms unerläßlich. Insgesamt konnten sieben repetitive Sequenzfamilien aus C. arietinum isoliert und identifiziert werden, von denen einige direkt in der Genomanalyse bzw. für taxonomische Fragen Anwendung fanden. Außerdem wurde ein universelles Primerpaar zur schnellen Detektion von DNA-Transposons entwickelt und verwendet. 1. Die beiden Satellitenelemente CaSat1 und CaSat2 sowie das Ty3-gypsy-ähnliche Retrotransposon CaRep stellen vermutlich die abundantesten Familien repetitiver Sequenz dar. Die beiden AT-reichen Satelliten bestehen aus 162-167 bzw. 100 Bp langen, hintereinander (,,head-to-tail") angeordneten Monomeren. CaSat2 ist ein dominanter Bestandteil des pericentrischen Heterochromatins, während CaSat1 hauptsächlich in der Nachbarschaft der 18S-5.8S-25S rDNA-Loci lokalisiert ist. Eine Verwandtschaft von CaSat1 zu IGS-Sequenzen ist nicht auszuschließen. Eine vollständige Kopie des dispersen Retroelements CaRep, das im pericentrischen Heterochromatin konzentriert ist, jedoch den zentralen Bereich von CaSat2 ausspart, konnte rekonstruiert werden. Das Element ist 11.4 Kbp lang und hat relativ lange, flankierende LTRs von je 3.3 Kbp. Alle drei hochrepetitiven Elemente sind spezifisch für die Gattung Cicer. Die genomische Organisation von CaRep wurde offenbar während der Evolution der annuellen Cicer-Spezies mehrfach rearrangiert. 2. Da die beiden Satelliten CaSat1 und CaSat2 in allen untersuchten Spezies der Gattung Cicer (außer C. cuneatum) vorhanden sind, lassen sich ihre Abundanz und Organisation zur Klärung taxonomischer Fragen verwenden. Die Ergebnisse unterstützen die Außenseiterrolle von C. cuneatum innerhalb der annuellen Cicer- Spezies und damit Thesen zu einem separaten Ursprung dieser Annuellen sowie die Forderung nach der taxonomischen Trennung von der Sektion Monocicer. Auch unterstützen und ergänzen die Ergebnisse über die Satellitenelemente bereits vorliegende molekulare Daten, Karyotypisierungen sowie Kreuzbarkeitsdaten und bestätigen die Gruppierung von C. chorassanicum sowie der ersten Kreuzungsgruppe. 3. Das hochabundante Retrotransposon CaRep kann für eine S-SAP (,,sequence-specific amplified polymorphisms")-ähnliche Markertechnik verwendet werden und liefert polymorphe molekulare Marker, die sich in die genetische Karte integrieren lassen. Die damit detektierten Polymorphismen werden vermutlich durch Variabilität innerhalb der LTR-Sequenzen erzeugt. Ein Teil der so generierten Marker ist mit den Resistenzgenloci gegen Fusarium oxysporum f.sp. ciceri gekoppelt. Die Hybridisierung bestätigt, daß durch die Marker tatsächlich Loci des Retrotransposons auf der genetischen Karte lokalisiert werden. 4. Unabhängig davon konnten durch PCR-Ansätze die drei mittelrepetitiven, dispersen Retrotransposonfamilien CaDis, CaTy und CaLin identifiziert werden. Von den beiden LTR-Retrotransposons CaDis und CaTy gehört letztere Familie zur Ty1-copia- Untergruppe, CaLin repräsentiert ein non-LTR-Element der LINE-Klasse. Alle drei Familien sind weniger abundant als CaRep und in den distalen Bereichen einiger oder aller Heterochromatinblöcke bzw. in den angrenzenden euchromatischen Regionen zu finden. Im Gegensatz zu den hochabundanten Familien kommen homologe Sequenzen der drei Familien auch außerhalb der Gattung Cicer vor und deuten auf eine evolutiv frühe Anwesenheit innerhalb der Fabaceen hin. Die sehr heterogenen Sequenzen von CaLin sind vermutlich sehr ursprünglich und haben während der Evolution der Annuellen keine großen Rearrangements erfahren. CaDis-Sequenzen werden in vielen Geweben transkribiert, jedoch ist unklar, ob dies auf eine Aktivität des Elements hinweist oder auf das Durchlesen benachbarter Gene zurückzuführen ist. 5. Um auch transposable Elemente der Klasse II (DNA-Transposons) nachweisen zu können, wurde ein degeneriertes Primerpaar aus dem Bereich der Transposase abgeleitet, mit dessen Hilfe pflanzliche En/Spm-Elemente in über 30 Pflanzenarten aus 20 Gattungen, darunter auch wichtigen Kulturpflanzen wie Zuckerrübe, Weizen und Erbse nachgewiesen werden können. Dieser Ansatz stellt einen Ausgangspunkt für die Charakterisierung solcher Elemente in beliebigen Pflanzengenomen und ihre Verwendung bei der Genomanalyse sowie zur Genidentifikation und -isolation dar. 6. Die niedrig- bis mittelrepetitive, disperse En/Spm-Familie aus C. arietinum (CaEn/Spm) umfaßt drei Subfamilien und ist auf mindestens sechs Chromosomen im distalen Teil der Heterochromatinblöcke angrenzend an euchromatische Bereiche lokalisiert. Die hier vorgelegten Befunde umfassen die erste chromosomale Lokalisation eines DNA-Transposons in Pflanzen durch FISH. Die genomische Organisation homologer Sequenzen in anderen Cicer-Spezies deutet möglicherweise auf transposable Aktivität während der Evolution der Annuellen hin. CaEn/Spm- ähnliche Elemente scheinen bereits in einem Vorgänger von C. arietinum und nahe verwandten Leguminosen vorhanden gewesen zu sein. Durch die vorliegenden Daten war es möglich, ein vorläufiges Modell der Verteilung repetitiver Sequenzen auf den acht Kichererbsenchromosomen zu entwerfen, das für die weitere Genomanalyse von C. arietinum genutzt werden kann. Obwohl vermutlich nur ein Teil aller repetitiven Komponenten dieses Genoms charakterisiert wurde, deutet sich - im Gegensatz zu Pflanzen mit vergleichbarer Genomgröße - durch die Konzentration repetitiver Sequenzen im pericentrischen Heterochromatin eine Ähnlichkeit zur Chromosomen- organisation in Arabidopsis thaliana an.
Bestimmung der Lösungsstruktur von Rinder-Adrenodoxin durch Auswertung hochaufgelöster NMR-Spektren
(2001)
Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Strukturen von RinderAdrenodoxin im oxidierten und im reduzierten Zustand. Die rekombinante Form dieses Elektronentransportproteins aus 128 Aminosäuren und dem [2Fe2S]EisenSchwefel Cluster mit einer Molmasse von 14,4 kDa wurde in E. coli exprimiert. Die hergestellten Proben wurden entweder mit 15 N oder 15 N, 13 Cangereichert, was den Einsatz einer breiten Palette heteronuklearer NMRExperimente ermöglichte. Nach der Zuordnung individueller Werte der chemischen Verschiebung für die NMRaktiven Kerne konnten durch 15 N und 13 Ceditierte dreidimensionale NOESYExperimente 1800 strukturrelevante Interprotonenabstände qualitativ bestimmt werden. Insgesamt konnten 70 Prozent der Resonanzen der NMR aktiven Kerne der jeweiligen Proteinzustände zugeordnet werden. Bedingt durch den paramagnetischen Einfluß des EisenSchwefelClusters waren durch enorme Linienbreiten und sehr schnelle T 1 Relaxationszeiten 30 Prozent der zu erwartenden Signale des Proteins nicht detektierbar. Zusätzlich konnten durch die Anwendung eines ct( 15 N, 1 H)HSQC Experiments weitere 18 Abstandsparameter von Amidprotonen im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster, die aber gerade noch detektiert werden konnten, zu dem jeweiligen näheren Eisenkern gewonnen werden. Für die Strukturrechnung mußte der EisenSchwefelCluster künstlich mit der Aminosäure C46 verbunden werden, da das Programm DYANA keine Eisen Atome erkennt. Anschließend wurde dieser 'künstliche' Aminosäurerest neu benannt (CYSC). Diese neue Aminosäure wurde dann nach Energieminimierung in die DYANA Bausteinbibliothek eingebracht. Es zeigte sich, daß der EisenSchwefelCluster die Struktur wie eine 'Klammer' zusammenhält. Ohne die Einbindung des EisenSchwefelCluster kommt es nach der Strukturrechnung zu keiner Struktur, sondern zu einem ungeordneten 'Knäuel'. Bei der Interpretation der Strukturensembles wurde deutlich, daß Rinder Adrenodoxin ein relativ rigides Protein ist. Scheinbar hohe flexible Bereiche im Protein mußten korreliert werden mit den Bereichen des Proteins, die aufgrund von fehlenden Zuordnungen nicht gut genug definiert werden konnten. Es ist somit nicht definitiv zu bestimmen, woher diese Abweichung in den Strukturen herrührt. Allerdings wurde bei der Betrachtung von Aminosäureresten in der Wechselwirkungsdomäne deutlich, daß an den Positionen der Aminosäurereste D72, E73, D76 und D79 es zu Bewegungen beim Übergang aus dem oxidierten in den reduzierten Zustand kommen muß, da speziell die Aminosäurereste D72 und E73 ihre Position dramatisch verändern. Entsprechende Änderungen der Werte der X1 Diederwinkeleinstellungen wurden beobachtet und lokale Ramachandran Diagramme ergeben sich aus den Rechnungen. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß im reduzierten Zustand S112 mit einer T 1 Relaxationszeit von 62,5 ms im Einflußbereich des EisenSchwefelCluster liegen könnte. Ein Hinweis darauf ist auch die Änderung der Geometrie des C Terminus, da im oxidierten Zustand dieser gerade vom Proteinkörper wegweist, während im reduzierten Zustand das Cterminale Ende sich in Richtung Proteinkörper biegt. Bisher wurde angenommen, daß dem CTerminus keine funktionelle Rolle zukommt. Die Struktur des Adrenodoxins wurde nach der Distanzgeometrierechnung unter Berücksichtigung aller experimenteller Daten erhalten. RinderAdrenodoxin ist klassifiziert als ein (alpha beta)Protein welches 22% betaFaltblatt, 17% alphaHelix und 6% 3 10 Helix besitzt. Für den oxidierten und den reduzierten Zustand konnten jeweils 5 betaFaltblätter und 4 Helices identifiziert werden. Beim oxidierten Zustand erstrecken sich die 5 betaFaltblätter auf die Aminosäurereste 812, 1822, 5759, 8889 und 103106, während beim reduzierten Adrenodoxin sie sich auf die Aminosäurereste 612, 2124, 5758, 8889 und 103106 erstrecken. Die 4 identifizierten Helices erstrecken sich im oxidierten Zustand auf die Reste 2935, 6466, 7229 und 98100. Die 4 Helices für den reduzierten Zustand werden durch die Reste 3336, 6164, 7275 und 98100 charakterisiert. Der EisenSchwefelCluster ist kovalent an die vier CysteinReste 46, 52, 55 und 92 gebunden. Mit einem mittleren globalen RMSDWert der Rückgratatome zur Mittelstruktur für das oxidierte Adrenodoxin von 0,94 Å und für das reduzierte Andrenodoxin von 1,53 Å sind die Anforderungen an relativ gut aufgelöste Strukturen erfüllt. Die hier bestimmten Strukturen entsprechen in ihrer Güte einer Kristallstruktur mit der Auflösung von 2.0 Å (Programm PROCHECK) für den reduzierten und den oxidierten Zustand von RinderAdrenodoxin und sind somit zufriedenstellend aufgelöst.
Rattanpalmen, die kletternden Vertreter der Unterfamilie Calamoideae, sind ein Charakteristikum aller südostasiatischen Regenwälder. Etwa 600 Arten sind gegenwärtig bekannt, ihr Verbreitungsgebiet erstreckt sich von Afrika bis in den Pazifik, mit einem deutlichen Schwerpunkt in Südostasien. Neben seiner ökologischen Rolle ist Rattan das wichtigste kommerzielle Produkt der Wälder Südostasiens nach dem Holz selbst. Da bisher fast der gesamte Bedarf aus den natürlichen Beständen entnommen wurde, werden vor allem die qualitativ hochwertigsten Arten zunehmend seltener und gelten zum Teil bereits als gefährdete Arten. Bereits 1980 wurden in Malaysia die ersten Versuche gestartet, Rattan in großem Umfang in Pflanzungen anzubauen, wobei Pflanzungen in Gummiplantagen eine besonders attraktive Lösung bieten. Mit der Anlage von Pflanzungen ist aber auch mit einer geänderten Schädlingssituation zu rechnen, die früher oder später zu Schädlingsproblemen führen wird. Zur Beurteilung derartiger Entwicklungen ist aber eine möglichst umfassende Kenntnis der natürlichen Verhältnisse, der potentiellen Schadinsekten sowie natürlicher Schutzfaktoren unabdingbar. Gemessen an der Bedeutung von Rattan, ist der Kenntnisstand über seine Ökologie und speziell der mit ihm assoziierten Insektenfauna ausgesprochen gering. Ziel des vorliegenden Projektes war es, eine möglichst breite Datenbasis über die mit Rattan assoziierte herbivore Insektenfauna zu erarbeiten, wobei Calamus manan als wichtigste kommerzielle Art in Malaysia den Schwerpunkt bildet, und durch den Vergleich verschiedener Pflanzungen und des natürlichen Habitats Entwicklungstendenzen aufzuzeigen. Diese Studie wurde auf der Halbinsel Malaysia durchgeführt, Untersuchungsgebiete für Calamus manan waren eine Pflanzung unter Gummibäumen in Kg. Bongsu, Perak, eine Versuchspflanzung in Sekundärwald in Sg. Buloh, Selangor, eine Dorfpflanzung in Sekundärwuchs in Ulu Gombak, Selangor, sowie das natürliche Habitat, ebenfalls in Ulu Gombak. Pflanzungen von Calamus caesius wurden in Sg. Buloh und der Dorfpflanzung in Ulu Gombak bearbeitet, im natürlichen Habitat in Ulu Gombak wurden des weiteren die Rattanarten Calamus scipionum, C. ornatus, C. insignis und Korthalsia rigida untersucht sowie als Vergleichsart die stammbildende Palme Caryota mitis. Über zwei Untersuchungsperioden von zusammen 20 Monaten wurde die markierten Versuchspflanzen monatlich auf herbivore Insekten untersucht sowie Wachstumsdaten erhoben. Die Wachstumsraten zeigten große Unterschiede sowohl zwischen den einzelnen Pflanzen eines Plots als auch zwischen den verschiedenen Plots. Der mittlere jährliche Blattzuwachs für Calamus manan betrug in den Pflanzungen 4,914,2 Blätter, im natürlichen Habitat dagegen nur 1,6. Die Wachstumsraten für Calamus caesius betrugen 10,2 und 12,0 Blätter/Jahr, die im natürlichen Habitat untersuchten Pflanzen legten im Mittel zwischen 0,8 und 2,2 Blätter pro Jahr an. Die festgestellten Blattzuwachsraten umspannen damit fast die gesamte Bandbreite der in der Literatur für Palmen berichteten Blattzuwachsraten von 0,5 bei Arenga obtusifolia bis 14,428,8 bei Elaeis guineensis. Gute Korrelationen zwischen Blattzuwachs und allen aufgenommenen Größenparametern sind für alle bearbeiteten Calamus mananPflanzungen und Calamus caesius in Sg. Buloh gegeben, Wachstumsleistung und verschiedene Größendimensionen der Pflanze zeigen sich hier eng gekoppelt. Die festgestellten Schäden am jüngsten Blatt betrugen im Mittel der Plots zwischen 5,33 % und 12,20 % entfernte Blattfläche. Da die Schäden in 10%-Klassen abgeschätzt wurden, sind die Unterschiede zwischen den Plots als geringfügig anzusehen, sie entsprechen der allgemeinen Beobachtung, daß Schäden durch herbivore Insekten üblicherweise unter 10 % liegen. Verschiedene Schadenstypen wurden identifiziert, wobei hohe Schäden eines Typs fast immer mit einem geringen Anteil an den Gesamtaufnahmen und ein hoher Anteil mit geringen Schäden verbunden ist. Für alle Calamus manan-Pflanzungen, mit Ausnahme der Dorfpflanzung, bestehen signifikante negative Korrelationen zwischen Blattschäden und Pflanzenhöhe, teilweise auch mit dem Blattzuwachs. Ebenso bestehen signifikante negative Korrelationen für die Blattschäden an Calamus caesius mit den Wachstumsraten der zweiten Beobachtungsperiode. Da Literaturangaben zufolge das Wachstum von Palmen sehr tolerant gegenüber Blattflächenreduktionen ist und die meisten gefundenen Herbivoren eher eine Präferenz für größere Pflanzen zeigen, werden diese Korrelationen dahin gehend interpretiert, daß schneller wachsende Individuen weniger Schäden akkumulieren als langsamer wachsende. Im Verlauf dieser Studie wurden etwa 106 Arten auf verschiedensten Palmen festgestellt, davon 60 Arten auf den markierten Palmen der Plots. 51 Arten wurden auf der Hauptuntersuchungsart Calamus manan nachgewiesen. Wie die Zeit-Arten-Beziehung zeigt, ist die Fauna sicher noch nicht vollständig erfaßt. Dem gegenüber stehen 16 Arten, die bisher in der Literatur für die Halbinsel Malaysia berichtet wurden. Insgesamt gefunden wurden in den Plots 5557 Individuen aller Stadien, 79,6 % davon Lepidoptera, 18,0 % Coleoptera und 2,4 % Orthoptera. Bedeutendste Gruppe waren die Hesperiiden mit 56,3 %, gefolgt von den Oecophoridae mit 18,3 % und den Hispinae (Chrysomelidae) mit 17,9 %. Eine ähnliche Faunenzusammensetzung aus Hispinae, Hesperiidae und Psychidae wurde in Pflanzungen von Metroxylon sagu festgestellt; im Gegensatz dazu steht die Ölpalmenfauna in Südostasien, deren wichtigste Vertreter den Familien Psychidae und Limacodidae angehören. In den Plots wurden 11 Arten von Hesperiiden gefunden, weitere 15 Arten wurden außerhalb der Plots und an anderen Palmen gefunden. Häufigste Hesperiide und häufigster Fund überhaupt war mit 1336 Exemplaren Salanoemia sala. Sie stellt 24,0 % aller Funde bzw. 42,7 % aller Hesperiidae und war in 8 der 13 Plots, darunter alle Calamus manan-Plots, vertreten. Über die Biologie dieser Art war bisher nichts bekannt. Wie fast alle Hesperiidenlarven legen die Larven von S. sala Schutzbauten an. Exemplarisch für andere Hesperiiden wird hier die Larvenbiologie dieser Art dargestellt und diskutiert. Ein starker Populationsanstieg in allen drei Kg.-Bongsu-Plots während eines Monats markiert diese Art als potentielle Problemart. Lotongus calathus trat nur in einem einzigen Plot, in Sg. Buloh, auf, stellt mit 30,6 % aller Hesperiidenfunde aber dennoch die zweithäufigste Art. Die Larvenbiologie dieser Art ist insofern einmalig, als die Larven in Symbiose mit einer häufigen Ameisenart, Dolichoderus thoracicus, leben. Die Larven stellen mit ihren Blattrollen Nistraum zur Verfügung, während die Ameisen offensichtlich Schutz gewähren. Dies erlaubt es L. calathus, eine sehr viel höhere Population aufzubauen als alle anderen Hesperiiden in diesem Plot zusammen. Das Zusammenkommen der Symbiosepartner scheint unter natürlichen Bedingungen ein relativ seltenes Ereignis zu sein, das durch die Anlage der Calamus manan-Pflanzung eine große Förderung erhielt. Als weitere regelmäßig an Calamus manan vorkommende Hesperiiden wurden Quedara monteithi, Gangara thyrsis und Erionota hiraca identifiziert. Die beiden erstgenannten sind bereits in der Literatur von Rattan beschrieben, Auflistungen der Arten E. thrax oder E. torus in der Literatur sind mit hoher Wahrscheinlichkeit E. hiraca zuzuschreiben. Eine noch unbeschriebene Art der Gattung Zela wurde nur wenige Male an Calamus manan gefunden, sie neigt jedoch zu Massenbefall und ist daher als weitere Problemart anzusehen. Korthalsia rigida besaß mit Acerbas martini eine eigene Hesperiidenart, ebenso Caryota mitis mit Plastingia naga. Letztere ist nahe mit Salanoemia sala verwandt und besitzt eine sehr ähnliche Larvenbiologie. Die Nymphalidae stellen nur 2,6 % der Gesamtfunde, sind damit aber dritthäufigste Lepidopterenfamilie. In den Untersuchungsplots wurden sechs verschiedene Arten gefunden, zwei Satyrinae und vier Amathusiini. Wichtigste Art war Amathusia ochraceofusca, die fast die Hälfte aller Nymphaliden stellt. Sie trat an Calamus manan in Kg. Bongsu und Sg. Buloh auf, ihre Larven leben, wie die meisten Amathusiini, gesellig. Weitere wichtige Funde waren die beiden Satyrinen Elymnias panthera und Coelites epiminthia, die ebenfalls in den Calamus manan-Pflanzungen auftraten. Während E. hypermnestra, die in dieser Studie nicht an Rattan gefunden wurde, ein bekannter Palmenschädling ist, war die Larvenbiologie von E. panthera ebenso wie von C. epiminthia bisher unbekannt. Die Familie Oecophoridae, vertreten durch eine einzige, bisher noch unidentifizierte Art, stellt mit 18,3 % der Gesamtfunde sowohl die zweithäufigste Art als auch Gruppierung. Sie trat in allen Pflanzungen sowie an Calamus manan und C. scipionum im natürlichen Habitat auf. Analog zu den Hesperiiden legen die Larven Schutzbauten an, die hier aber aus einem durchsichtigen Seidengewebe bestehen. Ein starker Populationsanstieg während der Beobachtungszeit markiert auch diese Art als potentielle Problemart. Andere Arten von geringerer Bedeutung waren die Notodontide Ambadra sp. sowie die beiden Limacodidae Olona gateri und Thosea vetusta. Eine Art der Gattung Batrachedra, die als Schädling der Infloreszenzen von Kokospalmen bekannt ist, wurde exklusiv auf Caryota mitis gefunden, die von ihr verursachten Schäden sind das vorherrschende Schadensbild dieser Palme. Nach den Hesperiiden und der Oecophoride stellt die Unterfamilie Hispinae der Chrysomelidae die dritte bedeutende Herbivorengruppe an Rattanpalmen dar. Auf sie entfallen 17,9 % der Gesamtfunde. Larven und Adulte besiedeln dieselben Wirtspflanzen, wobei die Larven fast ausschließlich auf den jungen, noch nicht vollständig aufgefalteten Blättern zu finden sind. Octodonta nipae stellt ein Drittel aller Hispinae, die Art wurde nur auf Calamus manan in Kg. Bongsu und der Dorfpflanzung gefunden. O. nipae lebt gesellig und scheint eine starke Förderung durch Blätter zu erfahren, die durch Schlingpflanzen im Unterwuchs am Auffalten gehindert werden. Pistosia spp. und Callispa spp. waren mit vier bzw. 12 Morphospezies vertreten und kamen in jeweils 12 der 13 Plots vor. Curculionidenlarven, die nicht aufgezogen werden konnten, kamen in einer Reihe von Pflanzen vor. Ihr Anteil ist eher unbedeutend, da ihr Auftreten aber meist den Tod der ganzen Pflanze bedeutet, stellen sie ebenfalls potentielle Problemarten dar. Cerambycidenlarven, die zwischen Blattscheide und Stamm minieren, wurden ebenfalls nur sehr selten gefunden, vor allem da sie ältere Pflanzen bevorzugen. Ihre Fraßspuren vermindern den Marktwert der geernteten Stämme, sie sind aus ökonomischer Sicht daher momentan einer der bedeutendsten Schädlinge. Eine Reihe von Orthopteren der Familien Acrididae und Chorotypidae wurden vor allem in den Pflanzungen unter Gummibäumen in Kg. Bongsu gefunden. Sie dürften polyphag sein und wohl vor allem an den Pflanzen des Unterwuchses fressen. Bestimmendes Element aller Calamus manan-Plots sind die vier Hesperiiden Salanoemia sala, Quedara monteithi, Erionota hiraca und Gangara thyrsis, dazu die Oecophoride und Pistosia sp. 2. Sg. Buloh erhält durch die massive Präsenz der Hesperiide Lotongus calathus eine Sonderstellung Die Artenzahlen der Plots liegen zwischen 13 und 24, wobei in den artenärmeren Plots relativ viele Funde an unmarkierten Pflanzen dazukommen, so daß die vollständigen Artenzahlen ähnlich liegen dürften. Die Gesamtfundzahlen nehmen mit abnehmender Natürlichkeit des Systems von 0,82 Funden/Pflanze im natürlichen Habitat bis 18,4 in einer der Pflanzungen unter Gummibäumen zu, der Diversitätsindex nimmt in der entsprechenden Richtung ab. Sg. Buloh fällt hierbei, wie bereits erwähnt, mit 25,24 Funden pro Pflanze und dem niedrigsten aller Diversitätsindizes aus der Reihe. Clusteranalysen, basierend auf den reinen Artenlisten, gruppieren die Plots in etwa entsprechend der Natürlichkeit. Clusteranalysen auf Basis von Arten und Abundanzen stellen den Sg.-Buloh- Plot abseits der anderen, die drei Kg.-Bongsu- Plots werden zusammengruppiert, ebenso die Pflanzung und das natürliche Habitat in Ulu Gombak. Die beiden Calamus caesius-Plots sind einander in Artenzahlen, Abundanzen und Diversitätsindex ähnlicher als die C. manan-Plots untereinander. Vergleiche mit den entsprechenden C. manan-Plots in denselben Lokalitäten ergeben weder eine eindeutige Gruppierung nach den Pflanzenarten noch nach den Lokalitäten. Die Fauna an Calamus caesius in Sg. Buloh war durch die Hesperiide Zela zeus und die Oecophoride dominiert. Beide Arten sind auch in der Dorfpflanzung in Ulu Gombak zumindest prinzipiell vorhanden, hier ist jedoch keine Art dominant. Im natürlichen Habitat war die Fauna von Korthalsia rigida durch die Hesperiide Acerbas martini dominiert, Caryota mitis durch die Hesperiide Plastingia naga und durch Batrachedra sp. Die verschiedenen Calamus-Arten wiesen keine dominanten Arten auf. In den Clusteranalysen zeigten die Plots im natürlichen Habitat wenig Beziehungen zueinander. Ausblick Insgesamt sind von den 106 Arten dieser Studie 88 Arten auf Rattan gefunden worden, maximal 11 davon waren bisher von Rattan bekannt. Eindeutig dominiert wird die mit Rattan assoziierte Fauna durch die Ordnung Lepidoptera, insbesondere von den Hesperiiden. Unter den Foliovoren wurden drei der Hesperiiden und die Oecophoride als potentielle Problemarten identifiziert. Allerdings liegen die festgestellten Fundzahlen noch unter allen für andere kommerziell interessante Palmen aufgestellten Schwellenwerten, die für Rattan vermutlich ohnehin höher angesetzt werden müßten.
Hsp90 ist ein äußerst vielseitiges Protein, welches nicht strikt cytosolisch anzusiedeln ist. Es besitzt eine Vielzahl von Partnerproteinen zu denen stetig neue hinzukommen und deren Interaktionen längst nicht alle hinreichend untersucht und verstanden wurden. Worin der Unterschied in der Funktionalität von Hsp90 in Eukaryoten und HtpG in Prokaryoten besteht, das Hsp90 für Eukaryoten (auch einzellige) derart essentiell werden lässt, ist absolut unklar. Ein möglicher Grund könnte die Beteiligung von Hsp90 an Transportprozessen in und um den Zellkern darstellen. Der Einfluss von Hsp90 auf den Export von 60S rUE aus dem Zellkern konnte manifestiert werden. Die Einwirkung Hsp90 spezifischer Inhibitoren wie Geldanamycin, Radicicol und Novobiocin zeigten deutliche Effekte in den Transportmessungen sowohl in vitro als auch in vivo. Durch Coinjektionen von Novobiocin und Radicicol in die Oocyten von Xenopus laevis ließ sich der Export von 125J markierten 60S rUE aus dem Zellkern gegenüber den Kontrollen deutlich reduzieren. Damit konnte der mittel- oder unmittelbare Zusammenhang zwischen Hsp90 und dem Export von 60S rUE in vivo erneut bewiesen werden. Hsp90 besitzt mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen für die Casein Kinase II. Untersuchungen zeigten, dass die Phosphorylierung von Hsp90 den Effekt auf den in vitro Export von 60S rUE aufzuheben vermag. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII könnte somit eine potentielle Regulationsmöglichkeit von Hsp90 darstellen. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII ließ sich durch die Zugabe von Radicicol deutlich reduzieren. Es ist durchaus möglich, dass die potentielle Phosphorylierungsstelle im Bereich der Bindungsstelle von Radicicol am N-Terminus von Hsp90 zu suchen ist, da auch die Phosphorylierung des N-terminalen Fragments über Radicicol beeinflusst werden konnte. Über Quervernetzungsversuche zwischen Hsp90 und isolierten Zellkernen, konnten Proteine der Kernmembran spezifisch markiert werden. Aufgrund der äußerst geringen Proteinausbeute war eine Analyse sehr schwierig. Lediglich eine Proteinbande konnte schließlich partiell N-terminal ansequenziert werden. Die ermittelten Sequenzen deuten auf ein zu scNup57p homologes Protein der Ratte hin, welches bisher jedoch noch nicht über eine der Proteindatenbanken ermittelbar ist. Transmissionselektronenmikrokopische Aufnahmen von isolierten Rattenleberzellkernen, welche mit einem Anti-Hsp90 Antikörper inkubiert wurden, konnten zeigen, dass Hsp90 neben Komponenten im Bereich des Kernporenkomplex auch an Bestandteile im Nukleoplasma bindet. Da aufgrund der in vitro Messungen bisher ein rein cytosolische Effekt von Hsp90 in Bezug auf den Export von 60S rUE vermutet wurde, könnte dieser Befund nahe legen, dass die Einflussnahme von Hsp90 auf den Transport von 60S rUE wesentlich früher bereits im Nukleoplasma oder in den Nukleoli einsetzen könnte. Wenn dies der Fall ist, könnte Hsp90 auch im Zusammenhang mit den ribosomalen Untereinheiten eine Begleiterfunktion zukommen, welche den Transport vom Ort der Biosynthese bis an die spätere Wirkungsstätte unter Aufrechterhaltung der Funktion gewährleistet. Hierfür könnte auch sprechen, dass Hsp90 mit den 60S rUE interagiert, wie es in Copräzipitationsversuchen gezeigt wurde. Zudem konnte Hsp90 gezielt über proteinäre Bestandteile im Transport befindlicher 60S rUE radioaktiv markiert werden. Es spricht demnach vieles dafür, dass Hsp90 unmittelbar in den Transportprozess der großen ribosomalen Untereinheiten eingreift, und hierbei der Effekt nicht lediglich in der Unterstützung bei der Translokation zu suchen wäre, sondern eventuell schon sehr viel früher im inneren des Nukleoplasmas.
Ziel dieser Arbeit war es, mit der Methode der NMR-Spektroskopie strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Fettsäurebindungsproteinen zu untersuchen. NMR-Spektren von Proteinen mit hohem -Faltblattanteil, wie H-FABP, zeigen häufig eine große Dispersion mit einer typischen Verteilung tief- und hochfeldverschobener Signale. Es wurden 1D/2D 1H-NMR Spektren für den Wildtyp und mehrere Mutanten (F4E, F4S, F4S/W8E, W8E, F16E, F16S, K21I, F64S, L66G und E72S) des humanen H-FABP aufgenommen und so weit wie möglich zugeordnet. Auf diese Weise ließ sich bestimmen, ob die typische -Faßstruktur des Wildtyp bei den Mutanten noch intakt ist. Fast alle Mutanten wiesen eine Signalaufspaltung von 10,2 bis 0,4 ppm wie der Wildtyp auf, nur die W8- Mutanten W8E und F4S/W8E zeigen keine Struktur mehr. H-FABP zeigt in NMR-Spektren sogenannte Spinsystem-Heterogenitäten, die auf mehrere parallel existierende konformationelle Zustände zurückzuführen sind und im NMR- Zeitfenster ( < 200 ms) nicht untereinander austauschen. Diese Spinsystem-Heterogenitäten werden nicht direkt durch Liganden verursacht, da sie auch in delipidierten H-FABP-Spektren vorhanden sind. Noch sind sie abhängig von der Position der in räumlicher Nachbarschaft befindlichen Seitenkette des F57, da sie auch in den Spektren einer F57S-Mutante anwesend sind. Eine Relipidierung der H-FABP Proben mit unterschiedlichen Fettsäuren führte zu einer selektiven Bevorzugung einzelner Spinsysteme. So konnte gezeigt werden, daß die Ligandenbindung beim H-FABP nach einem ,,selected-fit" Mechanismus abläuft, bei dem je nach gebundenem Liganden (Palmitin-, Palmitolein-, Stearin- oder Ölsäure) unterschiedliche, schon vorher vorliegende Konformationen des Proteinrückgrates bevorzugt werden. Ein weiterer Teil der hier vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der Lösungsstruktur des humanen B-FABP. Es wurde zur Strukturaufklärung die holo-Form des Proteins verwendetet, die ein Fettsäuregemisch endogener Fettsäuren enthielt. Durch den Einsatz mehrdimensionaler homonuklearer und 15N-editierter NMR-Experimente gelang es, nahezu alle 1H und 15N Resonanzen der Aminosäuren zuzuordnen. Lediglich für K37 konnten in den Spektren keine Signale gefunden werden. Nach einer automatisierten Zuordnung der aus den NOESY-Spektren gewonnenen Abstandsbeschränkungen wurde zur Verfeinerung der Lösungsstruktur des humanen B-FABP ein strukturgefilterter Iterationsprozeß durchlaufen. Mit 2490 Abstandsrandbedingungen zwischen Protonenpaaren sowie 106 stereospezifischen Zuordnungen wurden Torsionswinkeldynamikrechnungen mit abschließender Energieminimierung durchgeführt. Ein mittlerer globaler RMSD-Wert der Proteinrückgratatome von 0,85 ± 0,12 Å erfüllt die Ansprüche einer hochaufgelösten Struktur. Die Tertiärstruktur entspricht einem -Faß bzw. einer -Muschel. Sie besteht aus zehn antiparallelen -Faltblattsträngen und einer kurzen Helix-Turn-Helix Domäne. Die - Faltblattstränge bilden zwei nahezu orthogonale -Faltblätter von jeweils fünf Strängen. Die Lösungsstruktur ähnelt trotz teilweise niedriger Sequenzhomologie den bereits bekannten Strukturen der FABPs aus unterschiedlichsten Organismen. Eine sehr gute Übereinstimmung wurde im Vergleich mit der Lösungsstruktur des H-FABP beobachtet. Die enge Verwandtschaft beider zur Unterfamilie IV gehörenden Proteine äußert sich durch die hohe Sequenzhomologie (67%), die Ähnlichkeit der Konformation und Bindungsaffinität der Liganden, die helikale Konformation am N-Terminus (V1-F4) und ein vergleichbares Wasserstoffbrückennetzwerk innerhalb der Bindungstasche.
In dieser Arbeit, deren Hauptanliegen die Erstellung eines pflanzensoziologischen Systems war, wurde die Segetalvegetation der Sudanzone Westafrikas durch vegetationskundliche Aufnahmen erfasst. Zu den Aufnahmen wurden Bodenproben entnommen und Befragungen über die Anbaumethoden sowie Nutzung der Segetalarten durchgeführt. Um ein repräsentatives Bild der Segetalvegetation zu erreichen, wurden Regionen in Burkina Faso, Nigeria, Benin, Senegal und Mali zur Analyse ausgewählt, die in der Süd-, Nordsudanzone sowie in angrenzenden Gebieten der Sahelzone lagen. 601 Arten aus 70 Familien wurden identifiziert. Vier Familien, nämlich Poaceae, Leguminosae- Papilionaceae, Cyperaceae und Asteraceae dominieren in der Segetalflora und stellen die Hälfte der Arten, während die übrigen Familien, mit oft nur einem Vertreter, weniger repräsentiert sind. Corchorus tridens, Mitracarpus scaber und Leucas martinicensis, die drei häufigsten Segetalarten in der Sudanzone stammen jedoch nicht aus den vier oben genannten Familien. Die meisten Arten sind Therophyten und haben eine in den Tropen eingeschränkte Verbreitung. Es sind entweder pantropische (42 %), afrikanische Arten (32) oder paläeotropische Arten (20 %). Aus den 1120 Aufnahmen wurden 65 Gesellschaften beschrieben. Ein Vergleich dieser Gesellschaften führte zur Erarbeitung einer synoptischen Tabelle, deren Einheiten zur Herausarbeitung von pflanzensoziologischen Syntaxa dienten. Dabei wurden die bis dato beschriebenen Einheiten der Segetal- sowie Ruderalvegetation in den Tropen zum Vergleich einbezogen. Ein pflanzensoziologisches System der Segetalvegetation in der Sudanzone wurde erstellt. Zwei neue Klassen wurden definiert: die Leucetea martinicensis und die Caperonietea palustris. Die Leucetea martinicensis kommen auf den trockenen Böden vor und enthalten zwei Ordnungen: die Commelinietalia benghalensis auf gedüngten und die Polycarpeaetalia corymbosae auf ungedüngten Feldern. Die Commelinietalia benghalensis bestehen aus zwei Verbänden, dem Celosion trigynae und dem Tridaxion procumbentis. Der erste Verband ist sowohl in der Nord- als in der Südsudanzone anzutreffen, während der zweite nur in der Südsudanzone zu beobachten ist. Die Polycarpeaetalia corymbosae beinhalten drei Verbände: das Brachiarion distichophyllae, das Merremion tridentatae und das Jacquemontion tamnifoliae. Das Brachiarion distichophyllae kommt überall in der Sudanzone vor und bevorzugt die häufigen pisolithenreichen Böden. Das Merremion tridentatae ist auch in der gesamten Sudanzone verbreitet. Es ist überwiegend auf ausgesprochen sandigen Böden zu finden. Das Jacquemontion tamnifoliae hat einen eindeutigen Schwerpunkt in der Sahelzone und den Übergangsgebieten zur Sudanzone. Das ist der Verband, der auf den Hirsefeldern der Dünen in der Sahelzone wächst. Die Caperonietea palustris sind eine edaphisch stark geprägte Klasse. Sie wachsen auf den extrem tonreichen Vertisolen. Da diese eine Seltenheit in der Sudanzone sind, stellen die Caperonietea palustris eine ganz besondere Vegetation in der Sudanzone dar. Darin wurden zwei Assoziationen beschrieben: das Sorghetum arundinaceum und das Hygrophiletum auriculatae. Die Segetalvegetation auf den Reisfeldern in den Senken gehört zur neuen Ordnung Melochietalia corchorifoliae, die den Phragmitetea TÜXEN
Hitzestress führt bei allen bisher untersuchten Organismen zu einer transienten Umprogrammierung des Transkriptions- und Translations-apparats. Bei diesem auch als Hitzestressantwort bezeichneten Prozess wird vorrangig eine neue Klasse von Proteinen exprimiert, die als Hitzestressproteine (Hsp) bezeichnet werden. Eine Schlüsselrolle in der Signaltransduktionskette der Hitzestressantwort spielen Hitzestresstrans-kriptionsfaktoren (Hsf). Hsf sind hochkonservierte, modular aufgebaute Proteine mit einer N-terminalen DNA-Bindungsdomäne (DBD), einer zentralen Oligomerisierungsdomäne (HR-A/B Region) und einer C-terminalen Aktivatordomäne (AD). Über ihre DBD sind oligomerisierte Hsf in der Lage an hochkonservierte Motive, sogenannte Hitzestresselemente (HSE), in der Promotorregion von Hsp zu binden und deren Transkription zu initiieren. In hitzegestressten Zellen von Lycopersicon peruvianum (Perutomate) können neben den konstitutiv exprimierten Hitzestresstranskriptionsfaktoren A1 und A3 die beiden stressinduzierten Vertreter HsfA2 und B1 nachgewiesen werden. In präinduzierten Zellen befindet sich HsfA2 trotz einer funktionellen Kernimportsequenz (NLS) überwiegend im Zytoplasma. Dieses Verhalten von HsfA2 wurde bisher durch eine konformationsbedingte Maskierung der NLS erklärt. Der Kotransport von HsfA2 in den Zellkern erfolgt in diesem Modell durch eine heterologe Interaktion mit HsfA1. Mit dem Ziel, die für den Transport und die Interaktion mit HsfA1 verantwortlichen Strukturelemente von HsfA2 näher zu untersuchen, wurden verschiedene Tomaten-Hsf sowohl in Tabakprotoplasten, als auch in CHO-K1 Zellen heterolog exprimiert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sich HsfA2 auch ohne die Interaktion mit HsfA1 im Zellkern anreicherte, wenn der Kernexportrezeptor Crm-1 mit dem Antibiotikum Leptomycin B (LMB) inhibiert wurde. HsfA2 wird demnach permanent zwischen Kern und Zytoplasma hin- und hertransportiert, wobei der Kernexportprozess dominiert. Die für den Export verantwortliche, leucinreiche Kernexportsequenz (NES) konnte am äussersten C-Terminus von HsfA2 identifiziert werden. HsfA2-Mutanten, bei denen dieser Sequenzabschnitt deletiert bzw. die Leucine durch Alanine substituiert wurden, waren überwiegend im Zellkern lokalisiert. Die Fusion der NES von HsfA2 an den ausschliesslich im Zellkern lokalisierten HsfB1 führte zum Export des Fusionsproteins ins Zytoplasma, was durch die Zugabe von LMB wieder umgekehrt wurde. Ferner konnte gezeigt werden, dass für die Interaktion mit HsfA1 und den Kotransport in den Zellkern die HR-A/B Region essentiell ist. Mit Hilfe eines Luciferasereporterassays konnte der Zusammenhang zwischen der Lokalisation von HsfA2 und dessen Transaktivierungspotential in CHO-K1 Zellen demonstriert werden. Hierbei stellte sich heraus, dass die im Zellkern lokalisierte NES-Mutante eine ca. 20-fach höhere Aktivität im Vergleich zum zytoplasmatisch lokalisierten Wildtyp hatte. Ebenso führte die LMB-bedingte Anreicherung von HsfA2 im Zellkern bereits nach 6 h zu einer messbaren Steigerung der Aktivität. Eine synergistische Aktivitätszunahme konnte, wie auch schon in Tabakprotoplasten beobachtet, bei gleichzeitiger Expression mit HsfA1 gemessen werden. In Hitzestressversuchen (41 °C) konnte gezeigt werden, dass HsfA2 in CHO-K1 Zellen selbst unter dem Einfluss von LMB nicht mehr in den Zellkern importiert wurde. Bei Zellen, die sich unter LMB-Einfluss bei 37°C von dem Hitzestress erholten, kam es jedoch bereits nach 15 min zu einer sichtbaren Translokation von HsfA2 in den Zellkern. Dieses Verhalten lässt Rückschlüsse auf eine mögliche, konformationsbedingte Maskierung der NLS unter Hitzestress zu. Insbesondere da die HsfA2-Mutante, bei der die HR-A/B-Region fehlte, sich auch unter Hitzestress im Zellkern anreicherte. Neben der löslichen Form im Zytoplasma kommt HsfA2 in Tomatenzellen unter Hitzestress auch in einer unlöslichen, strukturgebundenen Form vor. Diese als Hitzestressgranula (HSG) bezeichneten Komplexe bestehen überwiegend aus niedermolekularen (lmw)-Hsp. Es konnte gezeigt werden, dass die Koexpression von lmw-Hsp und HsfA2 unabhängig vom Expressionssystem zur Bildung zytoplasmatischer Aggregate führte, in denen beide Proteine nachweisbar waren. Hierbei konnte sowohl eine klassen- als auch eine artspezifische Interaktion von HsfA2 mit Klasse II lmw-Hsp aus Tomate beobachtet werden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die HR-A/B Region für die Interaktion von HsA2 mit lmw-Hsp essentiell ist.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Algorithmus für die automatische Optimierung einer NMR-Zuweisung des back bones in gelabelten Proteinen und seine Implementierung vorgestellt. Der Algorithmus ermöglicht eine Zuweisungsstrategie, die sich näher an der manuellen Vorgehensweise orientiert als vergleichbare Implementierungen von Lukin (LUK 11 ) [Lukin97] oder Leutner (PASTA) [Leutner98], da er die Entscheidung über konkurrierende Protospinsysteminterpretationen in die globale Optimierung der Zuweisung verlegt und die Benutzer nicht zwingt, sich vorzeitig auf eine Interpretation pro Aminosäure und Peak zu beschränken. Der Algorithmus löst daher nicht nur das Reihenfolgenproblem für einen schon vorgegebenen Satz von Protospinsystemen, sondern auch das Auswahlproblem zwischen verschiedenen, sich widersprechenden, Interpretationen der gleichen Peakgruppe. Durch das zusätzliche Auswahlproblem erhöht sich die Komplexität der Optimierungsaufgabe, der Lösungsraum wächst daher um mehrere Größenordnungen. Dies verlängert die Laufzeit für den einfachen RANDOM Algorithmus gegenüber einem vergleichbaren Reihenfolgeproblem. Es wurden daher verschiedene Methoden untersucht, um die Laufzeit wieder zu reduzieren. Die erzielten Verbesserungen führen nicht nur zu einer besseren Konvergenz, sondern ermöglichen auch erstmals eine echte parallele Implementierung des Algorithmus. Die algorithmischen Verbesserungen sind die Reduktion des Protospinsystemcaches und der GENETISCHe Algorithmus. Zusätzlich wurde eine verbesserte Konfiguration zur Kontrolle der Suboptimierer gefunden. Die Implementierung der zugrundeliegenden Datenstrukturen ermöglicht die Umsetzung zusätzlicher Nebenbedingungen für die Positionen der Protospinsysteme innerhalb der Zuweisung. Ein Beispiel für die Nebenbedingungen sind die knotenlokalen Filter und die Strukturfilter aus Kapitel 2. Ihre Effizienz wird am besten durch die Aminosäuretypenerkennung demonstriert, die die Größe des Lösungsraumes um 168 Größenordnungen für Trigger reduziert. Dadurch verringert sich die Laufzeit des RANDOM Algorithmus bis zu einem Faktor von 132. Für PASTA wurde in [Leutner98] statt dessen der umgekehrte Effekt auf die Laufzeit festgestellt. In ihrer Implementierung verlängert sich die Laufzeit auf das Doppelte. Der Unterschied kann nur durch eine unterschiedliche Nutzung der Aminosäuretypenerkennung im Protospinsystempool erklärt werden. PASTA nutzt diese Information anscheinend nicht, um den Pool und damit den Lösungsraum zu reduzieren, sondern nur bei der Bewertung der Zuweisung. Diese Konfiguration kann in RANDOM näherungsweise nachvollzogen werden, wenn man im AS-Cache jeder Aminosäure jedes Protospinsystem zuweist. Die Bewertung der Aminosäuretypen und den Austausch zwischen Pool und Individuum kann man aber nicht abschalten. Ein möglicher Nachteil der Reduktion des AS-Caches mittels der Aminosäuretypenerkennung ist die Möglichkeit, daß Aminosäuren mit untypischen Frequenzen der falschen Aminosäure zugewiesen werden oder nicht in den Cache für die theoretische Aminosäure aufgenommen werden. Um eine falsche Zuweisung durch die Reduktion auszuschließen oder zu überprüfen, kann man zuerst mit einem AS-Cache mit Typenerkennung optimieren und das Ergebnis in einer zweiten Optimierung mit einem AS-Cache ohne Typenerkennung nachoptimieren. Diese Möglichkeit wurde bei der Zuweisung von Trigger demonstriert. Für Trigger konnte durch den Wechsel des Caches gezeigt werden, daß auch mit dem reduzierten Cache eine stabile Zuweisung gefunden wird, die der Zuweisung ohne Aminosäuretypenerkennung weitgehend entspricht. Die Zuweisungen unterscheiden sich in Aminosäuren mit unsicherer Typenzuweisung. In Trigger wird nur ein Protospinsystem (Phe66,Ile67) aufgrund der Typeninformation von der Position im AS-Cache ausgeschlossen, der es in der manuellen und der Zuweisung ohne Reduktion zugewiesen wurde. In anderen Fällen führt erst die Typeninformation zur richtigen Zuweisung (zB. Thr60,Ile61), während die Zuweisung ohne Typenerkennung eine Fehlzuweisung erzeugt. Man sollte daher immer beide Versionen berechnen und dann vergleichen, da eine manuelle Zuweisung beide Defekte aufweisen kann, weil sie die Zuweisungsregeln nicht so strikt optimiert, wie es ein automatischer Algorithmus kann. Für beide Algorithmen wurde der Parameterraum untersucht und eine sowohl optimale als auch robuste Konfiguration gesucht. Dabei wurde der Einfluß jedes Parameters des Algorithmus auf die Laufzeit bis zur Konvergenz zum globalen theoretischen Maximum bestimmt. Bei RANDOM waren hauptsächlich die Zusammensetzung des Aktionsprofils und die minimale und maximale Lebenszeit der veränderten Zustände, minTTL und maxTTL, für die Laufzeit entscheidend. Alle drei kontrollieren, welche Pfade durch den Lösungsraum ab einem Zustand erlaubt sind. Die gleiche Untersuchung wurde auch für die Parameter der zu berechnenden Probleme (Proteine) durchgeführt. Für den Datensatz wurde sowohl der Einfluß der Proteingröße, des maximalen CA Abstandes zwischen den Peaks der benachbarten Aminosäuren und der Aufbereitung des Protospinsystemcaches auf die Laufzeit, als auch der Einfluß eines unvollständigen Datensatzes auf die Konvergenz untersucht. Der Algorithmus zeigte sich dabei sehr robust gegen fehlende Peaks, da bis zu 45% der theoretischen Peaks fehlen können, ohne daß die Konvergenz zum theoretischen Optimum verloren geht. Unterhalb von 55% hängt die Übereinstimmung der gefundenen Lösung mit der theoretischen Lösung von der Zusammensetzung der gebildeten Protospinsystemfragmente ab. Proteingröße und maximaler CA Abstand haben dagegen großen Einfluß auf die Laufzeit. Während die Parametrisierung des RANDOM Algorithmus sich auf die Untersuchung des Wertebereichs der Kontrollparameter beschränken kann, muß die Parametrisierung des GENETISCHen Algorithmus auch die verschiedenen Crossover Operatoren und die Kontrolle der Suboptimierer umfassen. In Kapitel 3 wurden die verschiedene Crossover Algorithmen und unterschiedliche Konfigurationsvarianten für den Suboptimierer im GENETISCHen Algorithmus untersucht. Die aus der Literatur bekannten Crossover Operatoren waren dabei den spezialisierten G Operatoren unterlegen. Auch die Varianten elitär und statistisch, die keinen genetischen Austausch zwischen verschiedenen Individuen zulassen, waren den speziellen Operatoren immer unterlegen. Selbst kleine Anteile eines Genaustausches bewirkten eine Verbesserung der Laufzeit und die Qualität der Lösung. Dabei verbesserte sich besonders die Konvergenz durch den genetischen Austausch. Die speziellen G Operatoren übertragen nur die Differenz der Eltern statt, wie im klassischen Crossover, blind irgendeinen zusammenhängenden Bereich zu kopieren. Dadurch vermeiden sie es, hauptsächlich identische Bereiche zu kopieren, sondern übertragen nur Protospinsysteme, die sich in den Eltern unterscheiden. Außerdem wurde die Effizienz der speziellen Operatoren noch weiter gesteigert, indem die übertragenen Informationen mit Hilfe von Filtern gezielt auswählt wurden. Die übertragene Differenz wird dazu aufgrund ihrer Nachbarn und der Verknüpfung mit den Nachbarn ausgewählt. Mit unterschiedlichen Filtern wurden so Bereiche mit einem unterschiedlich hohen lokalen Optimierungsgrad für die Übertragung ausgesucht. Die Laufzeituntersuchungen in Kapitel 3 zeigen, daß es eine Grenze für die Effizienzsteigerung durch die Übertragung lokal voroptimierter Bereiche gibt. Während es beim Wechsel von unkoordinierten, punktförmigen Übertragungen (s1) zur Übertragung von kurzen Strecken aus benachbarten Protospinsystemen, mit oder ohne Verknüpfung (s2), noch zu einer geringen Verbesserung der Laufzeit und der Konvergenz kommt, führt die zusätzliche Koordinierung der übertragenen Nachbarn durch die Nebenbedingung der Verknüpfung in den s3 Algorithmen sogar zu einer geringen Verschlechterung der Laufzeit. Die Gründe für die Verschlechterung konnten nicht eindeutig nachgewiesen werden. Möglicherweise verringert sich die Anzahl der kopierbaren Bereiche durch die zusätzlichen Nebenbedingungen so sehr, daß nicht genügend unterschiedliche Differenzen für die Übertragung in die neuen Individuen gebildet werden. Die neuen Individuen erhalten dann hauptsächlich die gleichen neuen Gene. Dadurch kann es zu einer Verarmung des genetischen Pools, d.h. zum Verlust der genetischen Diversität in der Population kommen. Die neuen Individuen suchen dann identische Bereiche im Lösungsraum ab und nehmen dadurch die lokale Optimierung doppelt vor. Dadurch verschwendet diese Konfiguration CPU Zeit auf schon untersuchte Bereiche. Neben der direkten Übertragung zusammenhängender Bereiche gibt es noch einen weiteren Faktor der die spezialisierten Operatoren, gegenüber dem klassischen Crossover, verbessert. Die Differenzbildung im Crossover nimmt auf die Konkurrenz um die Peaks zwischen den Protospinsystemen keine Rücksicht. Dadurch befinden sich die neuen Individuen zuerst meist im illegalen Teil des Zustandsraumes S n . Nach dem Crossover wird daher ein Teil der ursprünglichen Protospinsysteme des neuen Individuums durch den Reparaturmechanismus gelöscht und dadurch schon optimierte Bereiche zerstört. Daher kommt dem Reparaturmechanismus für illegale Zustände die entscheidende Rolle zu, denn er erzwingt die Neuberechnung der Positionen, die vor dem Crossover durch einen Konkurrenten eines übertragenen Protospinsystems belegt waren. Die ehemaligen Zuweisungen in den zerstörten Bereichen sind dabei nur über die Resourcenkonkurrenz mit den im Crossover neu injizierten korreliert. Das Crossover mit Zerstörungen erweitert dadurch den erreichbaren Lösungsraum, statt ihn, wie beim klassischen Crossover, auf den Raum zwischen den Eltern einzuschränken! Die Zerstörungen sind für die Optimierung daher von Vorteil. Außerdem zeigte sich in Kapitel 3, daß für die speziellen Operatoren eine besondere Konfiguration des Suboptimierers besonders effizient ist, die den einzelnen Individuen nur die CPU-Zeit zuteilt, die sie, effizienter als ihre Konkurrenten, zu einer Verbesserung nutzen können. Diese Verteilung der Rechenzeit wird durch die sogenannte Ratenbegrenzung erreicht. Die veränderlichsten Individuen erhalten dabei die meiste Rechenzeit. Dies sind normalerweise die Individuen, die in einem der letzten genetischen Zyklen neu erzeugt wurden. Sobald ein Individuum in ein tiefes lokales Optimum, d.h. eine Sackgasse, geraten ist, erhält es weniger Rechenzeit, da seine Verbesserungsrate unter den Schwellwert sinkt. Dadurch darf man den einzelnen Individuen eine höhere maximale Laufzeit zuteilen, da sie sie nur nutzen können, wenn sie sich währenddessen verbessern. Die Kombination "ratenbegrenzt" mit Operator Gs2p2A verbraucht trotz des komplexeren Algorithmus weniger CPU-Zeit bei gesteigerter Konvergenzwahrscheinlichkeit und geringerer paralleler Laufzeit als jede andere Konfiguration. Sie ist damit die beste bekannte Konfiguration für GENETISCH. Im Praxistest in Kapitel 5 mit dem Proteinabschnitt Trigger M bestanden zwischen den automatischen Zuordnungen und der manuellen Zuweisung nur geringe Unterschiede. Die Unterschiede zwischen den Optimierungen mit unterschiedlichen Caches entstehen hauptsächlich in den Bereichen, die an einem Ende keinen verknüpften Nachbarn haben oder bei denen die manuelle Zuweisung unsicher ist, wie im Bereich 10 - 20. Durch die automatische Zuweisung konnte die manuelle Zuweisung sogar an einigen Stellen vervollständigt werden. Sie ist daher einer manuellen Zuweisung gleichwertig. Darüber hinaus entsteht bei der automatischen Zuweisung immer eine Dokumentation über die Verwendung der Peaks, so daß man ungenutzte Spinsysteme leichter finden kann. Der genetische Algorithmus kann optimal auf einem Netzwerkcluster implementiert werden, daher bietet sich ein echte parallele Implementierung an. GENETISCH braucht dabei keine besondere Hardware, wie Vektorrechner, shared memory oder besonders schnelle Netzwerkverbindungen, sondern kann auf einer Gruppe von normalen Rechnern mit einer üblichen Ethernet100 Netzwerkverbindung implementiert werden, da nur zum Austausch der Individuen, bzw. ihrer Differenz, eine Kommunikation zwischen den Rechnern notwendig ist. Dadurch kann die Kommunikation auf wenige KB alle paar Sekunden beschränkt bleiben. GENETISCH sollte außerdem leicht zu skalieren sein, da man die Anzahl der Individuen leicht an größere Probleme anpassen kann. Eine echte parallele Implementierung erlaubt daher sowohl die Rechenzeit für komplexere Problem auf wenige Minuten zu reduzieren als auch größere und mehrdeutigere Spektren zuzuweisen. Außerdem kann man die Wahl der Prozessparameter selbst auch dem selben Optimierungsprozeß unterwerfen, der bisher für die Optimierung der Zuweisung verwendet wurde. Dadurch sollte es möglich sein, die Optimierungsparameter, analog dem Profil der Abkühlung im simulated annealing, dynamisch an die Phase der Optimierung anzupassen und den Individuen immer die optimalsten Optimierungsparameter zu bieten, ohne diese vorher von Hand suchen zu müssen. Diese Veränderung erfordert aber eine große Anzahl an Individuen und damit die echte parallele Implementierung.
Der Cytochrom b6f Komplex vermittelt den Elektronentransport zwischen Photosystem II und Photosystem I und nimmt damit eine zentrale Rolle in der Photosynthese ein. Das im Rahmen dieser Arbeit erstellte Protokoll für die Präparation des Cytochrom b6f Komplexes aus Spinat ermöglichte eine reproduzierbare Reinigung von hochaktivem Enzym. Die spektroskopischen Daten stimmen mit den publizierten Daten für den Komplex überein. SDS-PAGE zeigte alle vier großen Untereinheiten sowie eine Bande der kleinen 4 kDa Untereinheiten. Die Präparation ist mit 450 ± 60 Elektronen pro Sekunde 10 - 15 mal aktiver als in bisherigen Veröffentlichungen für Präparationen aus Pflanzenblättern beschrieben und fast doppelt so aktiv wie die besten Präparationen aus Chlamydomonas reinhardtii. Die Zuverlässigkeit des Aktivitätstests konnte durch den Wechsel des Lösungsmittels für den Elektronendonor von Ethanol zu Dimethylsulfoxid erheblich verbessert werden. Die hohe Effizienz der Proteinreinigung und die hohe Aktivität des Komplexes stellen ideale Voraussetzungen für biophysikalische und strukturelle Studien dar. Versuche zur zweidimensionalen Kristallisation des Cytochrom b6f Komplexes erbrachten Kristalle mit verschiedenen Morphologien, die unterschiedlich gut geordnet waren. Eine Projektionsdichtekarte bis zu einer Auflösung von 20 Å von mehrschichtigen Kristallen zeigte strukturelle Übereinstimmungen, aber auch Unterschiede zu dem verwandten Komplex aus der einzelligen Alge C.reinhardtii. H -ATPase Plasmamembran H -ATPasen wandeln chemische Energie (in Form von ATP) in einen elektrochemischen Gradienten um, der als Energielieferant von sekundären Transportproteinen dient. Es ist gelungen, zweidimensionale Kristalle der heterolog exprimierten und mit einem His-tag ausgestatteten Plasmamembran H -ATPase AHA2 aus Arabidopsis thaliana zu erzeugen. Zwei verschiedene Methoden wurden dabei angewandt. Zum einen wurde das Protein wurde in Proteoliposomen rekonstituiert, und die so gewonnenen Vesikelkristalle resultierten in einer Projektionsdichtekarte mit einer Auflösung von 8 Å. In einer zweiten Methode wurde eine Technik, basierend auf dem Einsatz neu entwickelter, partiell fluorierter und funktionalisierter Lipide, angewandt. Einzelschichten dieser fluorierten Lipide auf der Oberfläche eines Tropfens erwiesen sich auch in Anwesenheit von Detergenz als stabil. Die funktionalisierte Ni2 -NTA-Kopfgruppe der fluorierten Lipide ermöglichte eine Bindung des Proteins über den His-tag. Nach Detergenzentzug bildeten sich in einer Lipiddoppelmembran eingebettete 2D-Kristalle mit einem Durchmesser von bis zu 10 (m, die für die Erstellung einer Projektionsdichtekarte bis 9 Å genutzt wurden. Die beiden elektronenkristallographisch erstellten Projektionskarten waren sehr ähnlich. Sie zeigten drei voneinander abgegrenzte Domänen, die in Zusammenhang mit einer vorliegenden Struktur der verwandten Ca2 -ATPase interpretiert werden konnten. Die Technik der Oberflächenkristallisation eröffnet neue Möglichkeiten für die Kristallisation von Membranproteinen. Kristallisationsexperimente können bei Proteinkonzentrationen von nur 50-150 (g/ml durchgeführt werden und sind für alle Membranproteine, die mit einem His-tag exprimiert werden können, anwendbar. Es wurde ein Homologiemodell der Plasmamembran H -ATPase aus Neurospora crassa in Anlehnung an die atomare Struktur der verwandten Ca2 -ATPase SERCA1 erstellt. Beide Enzyme liegen in unterschiedlichen Konformationen vor, die sie während des Reaktionszyklus durchlaufen. Es konnte gezeigt werden, dass es sich dabei offenbar um die Bewegung ganzer Domänen handelt. Dabei wurde klar, dass in einem solchen Fall schon 3D-Strukturen bei einer mittleren Auflösung von ca. 8 Å, wie sie mit Hilfe der Elektronenkristallographie verhältnismäßig einfach erreicht werden können, viel zum Verstehen von Reaktionszyklen beitragen können, die große Konformationsänderungen beinhalten.