Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Rotary adenosine triphosphate (ATP)ases are ubiquitous, membrane-bound enzyme complexes involved in biological energy conversion. The first subtype, the so-called F1Fo ATP synthase, predominantly functions as an ATP synthesizing machinery in most bacteria, mitochondria and chloroplasts. The vacuolar subtype of enzyme, the V1Vo ATPase, operates as an ATP driven ion pump in eukaryotic membranes. The subtype found in archaea and some bacteria is called A1Ao ATP (synth)ase and is capable of working in both directions either to synthesize ATP or to generate an ion motive force by consuming the same.
All the three above-mentioned subtypes of rotary ATPases work as nanomolecular machines sharing a conserved mechanism to perform the energy conservation process. The simplest form of these enzymes is the bacterial F1Fo ATP synthase. Here, ions are channelled via the membrane stator subunit a to the rotor ring of the enzyme. After almost a complete rotation of the ring the ions are released again on the other side of the membrane. This rotation is further transmitted via the central stalk to the soluble part of the enzyme, the F1-complex, where conformational changes within the nucleotide binding sites result in the synthesis of ATP from ADP and Pi.
The rotor or c-ring of the enzyme is the key protein complex in mediating transmembrane ion translocation. Several structural and biochemical methods have been applied in the past years to study the rotor rings from many different organisms. The results revealed that the stoichiometry of a c-ring of a given species is constant while it can vary between different species within a range of 8 to 15 c subunits. The c-ring stoichiometry determines directly the number of ions transported through Fo per rotation whereby three molecules of ATP are concurrently synthesized in the water-soluble F1 headgroup. Hence the number of c subunits has an important influence on the bioenergetics of the corresponding enzyme and thus the entire organism.
The c-ring of a rotary ATPase is able to specifically bind either protons (H+) or sodium ions (Na+) as the coupling ion for the enzyme. Several structures are already available revealing the coordination network of both types of rotor rings. In each case ion binding includes a highly-conserved carboxylic acid residue (glutamate or aspartate), in addition to a more varying combination of amino acid residues, whereby Na+ coordination is structurally more demanding than H+ binding.
In the first part of my PhD thesis, I aimed to characterize the F1Fo ATP synthase rotor ring of the opportunistic pathogenic bacterium Fusobacterium nucleatum on a functional and structural level. F. nucleatum is an anaerobic bacterium which uses peptides and amino acids as a primary energy source. It is one of the most frequently occuring bacteria in human body infections and involved in human periodontal diseases.
The protein complex was heterologously expressed within a hybrid ATP synthase in Escherichia coli and purified without an affinity tag for further analysis. Two high resolution X-ray structures of the c-ring were solved at low (5.3) and high (8.7) pH to 2.2 and 2.64 Å, respectively. In both structures, the conserved glutamate is in an ion-locked conformation, revealing that the conformational state of the ion binding carboxylate is not depending on the pH of the crystallization condition, which is in good agreement with previous structural and biochemical studies of other c-rings.
A Na+ ion is present within the c-ring binding site and directly coordinated by four amino acid residues and a structural water molecule. Remarkably, the Na+ is bound by two glutamate residues instead of one as is the case in the I. tartaricus Na+ binding c-ring, of which the first high resolution X-ray structure of a c-ring has been solved in 2005. Thus, a new type of Na+ coordination in an ATP synthase rotor ring with a two-carboxylate ion binding motif is described here, which also occurs in other bacteria, including several pathogens. Na+ specificity of the investigated c-ring was further confirmed by a competitive biochemical labeling reaction performed with a fluorescent ATP synthase inhibitor molecule (N-cyclohexyl-N`-[4(dimethylamino)-α-naphtyl] carbodiimide, NCD-4).
We furthermore complemented our functional and structural data of the F. nucleatum c-ring by computational studies to explore the ion translocation mechanism of this enzyme in more details. We therefore analyzed the protonation state of the second, additional glutamate in the ion binding site. Molecular dynamics (MD) simulations and free-energy calculations indicated that this glutamate is constitutively protonated, in the ion-locked as well as in a simulated, more hydrated open-conformation of the ion binding glutamate as when it is travelling through the a/c-ring interface upon c-ring rotation.
Structural analysis of the enzyme N-formylmethanofuran:tetrahydromethanopterin formyltransferase
(2008)
Archaea represent a third domain of life and some archaea exhibit a high degree of tolerance to extreme environmental conditions. Several members are methanogens and present in many anaerobic environments. Most methanogens are able to maintain growth simply on H2 and CO2 via the enzymatically catalyzed reaction 4H2 + CO2 > CH4 + 2 H2O. The archaeon Methanopyrus kandleri grows optimally at temperatures of 84°C to 110°C, pH values of 5.5 to 7.0 and NaCl concentrations 0.2% to 4%. The enzyme N-formylmethanofuran tetrahydromethanopterin formyltransferase (MkFTR) catalyzes the transfer of a formyl group from the cofactor N-formylmethanofuran (FMF) to the cofactor tetrahydromethanopterin (H4MPT), the second step of the above reaction. X-ray crystallographic analysis yielded insights into the structure and function of MkFTR, (1) the MkFTR monomer exhibits a pseudo-two fold structure suggestive of an evolutionary gene duplication. (2) The structure is a D2 homo-tetramer with prominent cleft-like surface features. Analysis of the interface contacts showed that the tetramer is best described as a dimer of dimers. The clefts were associated with the monomer:monomer interface and were weakly occupied by extra electron density which might be attributed to the H4MPT analog folate. (3) This suggested that the clefts are active sites and their association with oligomer interfaces suggested a basis for the dependence of activity on oligomerization. (4) The thermal stability of MkFTR most likely arises from the greater number of H- and ionic-bonds within the monomer and between monomers with respect to mesophilic protein structures. (5) The structure showed a large number of surface exposed negatively charged, glutamate and aspartate residues. These residues explain the salt dependent oligomerization, as only at high enough salt concentration is the electrostatic charge compensated by cation binding and neutralized allowing oligomerization. (6) These residues also improve the solubility of MkFTR at high salt concentration by increased charge repulsion. (7) Comparison of MkFTR structures from low and hight salt conditions showed that surface glutamate residues bind slightly more water molecules at high salt conditions further contributing to MkFTR solubility at high salt concentration.
Die Cytochrom c Oxidase von Paracoccus denitrificans katalysiert die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser und „pumpt“ zusätzlich vier Protonen von der cytoplasmatischen Seite auf die periplasmatische Seite der Cytoplasmamembran. Die Spaltung des molekularen Sauerstoffes im binuklearen Zentrum erfolgt im katalytischen Zyklus des Enzyms bei der Umwandlung des Intermediates A, in welchem molekularer Sauerstoff an das Häm a3 Eisen gebunden ist, in das Intermediat PM durch spontane elektronische Umorganisation. Drei der dazu benötigten vier Elektronen werden von den Metallzentren geliefert. Das vierte Elektron wird sehr wahrscheinlich von einer Aminosäure in der Nähe des binuklearen Zentrums durch Bildung eines Aminosäureradikals beigesteuert. Dieses Radikal sollte in den Intermediaten PM und F• des katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase vorhanden sein. Durch Reaktion von stöchiometrischen Mengen an Wasserstoffperoxid mit dem vollständig oxidierten Enzym lassen sich PM; F• und F-Intermediate künstlich erzeugen und durch ihre Maxima in Absorptionsdifferenzspektren charakterisieren. Mit paramagnetischer Elektronenresonanzspektroskopie (EPR-Spektroskopie) können Struktur und Dynamik paramagnetischer Zentren in Proteinmolekülen untersucht werden. Mit dieser Methode konnte in mit Wasserstoffperoxid generierten PM und F•-Intermediaten ein Tyrosinradikal nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Identifikation dieses Tyrosins mittels einer Mutagenesestudie. Dazu wurden Tyrosinvarianten (Y35F, Y167F, Y267F, Y280H, Y328F und Y414F) aus Untereinheit I, die einen maximalen Abstand von 25 Angström vom binuklearen Zentrum aufweisen, mit Hilfe von Absorptions- und EPR-Spektroskopie charakterisiert. Auf diese Weise konnte nachgewiesen werden, dass Tyrosin 167 eindeutig der Ursprungsort des Tyrosinradikals ist, das bei der Generierung von PM- und F•-Intermediaten der Cytochrom c Oxidase mit Wasserstoffperoxid entsteht. Da die Variante Y167F jedoch eine hohe katalytische Aktivität aufwies und in der Lage war, die Oxoferrylintermediate PM; F• und F zu bilden, konnte gleichzeitig gezeigt werden, dass dieses Tyrosin nicht der primäre Donor des vierten Elektrons sein kann, das im katalytischen Zyklus des Enzyms für die Spaltung der Sauerstoffbindung benötigt wird. Diese Ergebnisse wurden dahingehend interpretiert, dass Tyrosin 167 eine thermodynamische Senke darstellt, in die das von einem unbekannten kurzlebigen Elektronendonor bei der Wasserstoffperoxidreaktion gebildete Radikal verschoben wird. Als Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung kommt auch Tryptophan 272 infrage. Daher wurde auch die Variante W272M spektroskopisch charakterisiert. Diese Variante war katalytisch inaktiv und nicht in der Lage in Reaktion mit Wasserstoffperoxid die Intermediate PM, F• und F zu bilden. Es ließen sich weder das Tyrosin-167-Radikal noch ein anderes Radikal nachweisen. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Tryptophan 272 möglicherweise der ursprüngliche Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase sein könnte. Während des PM zu F-Übergangs im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase werden zwei Protonen gepumpt. Diese können vom Enzym entweder über den D-Weg oder den K-Weg aufgenommen werden. Eine Untersuchung des PM zu F-Übergangs von D-Weg- und K-Weg-Varianten der Cytochrom c Oxidase kann Aufschluss über die Beteiligung der beiden Protonenaufnahmewege des Enzyms an diesem Schritt des katalytischen Zyklus geben. Daher wurde die Reaktion der D-Weg Varianten D124N, N131D, Y35F und E278Q und der K-Weg Variante K354M mit Wasserstoffperoxid absorptionsspektroskopisch untersucht. Durch diese Experimente konnte die zentrale Bedeutung des D-Weges für die Protonentranslokation im PM zu F-Übergangs bestätigt, aber auch ein gewisser Einfluss des K-Weges nicht ausgeschlossen werden. Außerdem wurde der PM zu F-Übergang der Variante R437N, die eventuell Teil des noch nicht konkret identifizierten Protonenaustrittsweg der Cytochrom c Oxidase ist, untersucht.
Periplasmic Sud protein encoded by the Wolinella succinogenes catalyses the transfer of bound polysulfide-sulfur to the active site of the membrane bound polysulfide reductase. The homodimeric protein consists of 131 residues per monomer, each with one cysteine residue in the active site. Polysulfide-sulfur is covalently bound to the catalytic Cys residues of the Sud protein. In order to understand the structure-function relationship of this protein, the features of its solution structure determined by heteronuclear multidimensional NMR techniques are reported here. The first step of structure determination leads to resonance assignments using 15N/13C/2H- and 15N/13C-labeled protein. The sequential backbone and side chain resonance assignments have been successfully completed. Structure calculations were carried out using the ARIA program package. The structure is based on 2688 NOE-derived distance restraints, 68 backbone hydrogen bond restraints derived from 34 slow-exchanging backbone amide protons and 334 torsion angle restraints obtained from the TALOS program as well as 158 residual dipolar coupling restraints for the refinement of relative vector orientations. The three-dimensional structure of the Sud protein was determined with an averaged rootmean- square deviation of 0.72 Å and 1.28 Å for the backbone and heavy atoms, respectively, excluding the terminal residues. Without the poorly defined segment between residues 90-94 the average r.m.s.d. value drops down to 0.6 Å and 1.14 Å. The ensemble refined with residual dipolar coupling (rdc) restraints shows good convergence. The r.m.s.d. value for the backbone heavy atoms, excluding residues 90- 94, drops down from 0.97 to 0.66 for the rdc-refined ensemble. The relative orientation of the two monomers in the protein structures refined with residual dipolar coupling restraints are also different from those without residual dipolar coupling restraints. The structure determination of the dimeric protein has been hampered by the high molecular mass (30 kDa), severe peak degeneracy, and by the small number of experimental intermonomer NOEs (relative orientation problem of two monomers). For the resonance assignments of aliphatic side chain, many resonances were ambiguously assigned because of severe overlap of signals. The Sud dimer protein contains 17 Lys, 14 Leu and one His tag for each monomer. It complicated the resonance assignments. The conventional 3D 15N-separated TOCSY HSQC experiment failed because of the large molecular weight which results in line broadening and hence made the resonance assignments of side chains more difficult. The determined structure contains a five-stranded parallel ß-sheet enclosing a hydrophobic core, a two-stranded anti-parallel ß-sheet and seven a-helices. The dimer structure is stabilized predominantly by hydrophobic residues. Sud catalyses the transfer of the polysulfide-sulfur to cyanide, similar to rhodanese encoded by Azotobacter vinelandii (Bordo et al., 2000). The two proteins are similar in the active site environment primarily owing to the main-chain conformation of the active-site loop with the cysteine residue and with respect to the surrounding positively charged residues. The active-site loop (residues 89-95) in the Sud protein appears to be flexible, reflected by few assigned proton resonances of residues 90-94 in the active site. Despite their similarity in function and their similar structure in active site, the amino acid sequences and the folds of the two proteins are remarkably different. The negatively charged polysulfide interacts with positively charged R46, R67, and R94 and hence may be stabilized in structure. The mutation of one of the three arginines that are also conserved in rhodanese from A. vinelandii leads to a loss of sulfur-transfer activity. The polysulfide chain extends from inside of Sud protein to outside, where Sud may form contacts with polysulfide reductase. These contacts provide the possible polysulfide-sulfur transfer from Sud protein to the active site of polysulfide reductase.
In the recent years, high-resolution conditions have been established in solid-state NMR by the combination of magic angle spinning, state-of-the-art r.f. pulse schemes and the introduction of ultra-high magnetic fields. Similar to what is now routine in solution-state NMR, this has opened the way for structure determination by HR-SSNMR methods. Complete structural or dynamical characterization of the biomolecule of interest is most easily achieved if multiple or even uniformly [13C, 15N]-labeled versions are studied. In a first step, experiments that allow the complete assignment of the 13C and 15N resonances have been recently designed. To date, nearly complete chemical shift assignments were reported for two well-ordered proteins, the ±-spectrin SH3 domain and the Crh protein. The SSNMR analysis of the later protein has been presented in Section 4.1. For SSNMR applications, not the molecular size or solubility, but the spectral resolution can be of crucial importance. Experimental parameters and sample inherent conditions such molecular disorder may reduce the overall spectral dispersion. In these circumstances, techniques that allow for spectral simplification without the need of elaborated biochemical procedures (of isotopelabeling) are of special importance. In Section 2, several spectral editing methods have been proposed. These methods not only select resonances due to changesin the physical and chemical environment of the nucleus but they can also directly probe molecular properties such as dynamics and conformational heterogeneity. Once the chemical shifts are available for the biomolecule of interest, methods that permit to obtain structural restraints can be applied. In the case of multiply isotope labeled proteins, such techniques can in principle result in multiple structural parameters. In Section 3.1, we have shown that, similar to solution-state NMR, secondary chemical shifts can be readily employed to study the local backbone conformation. Inaddition, distance constraints between protons may be encoded in high-resolution on rare spins like 13C and 15N and measured. Finally, carbon-carbon constraints may be probed by employing frequency selective r.f. pulse schemes. These dihedral and distance constraints may subsequently lead to the determination of protein secondary to tertiary structure from a single protein sample. In Section 4.2,we have shown that high-affinity ligand binding to membrane proteins can be investigated with solid-state NMR. Here, the neuropeptide neurotensin which binds to the Gprotein coupled receptor NTS1 in sub-nanomolar affinity was investigated.Except for the case of rhodopsin, there is currently no information on the high-resolution structure of any other GPCR or a corresponding high-affinity ligand.Our SSNMR results identify, for the first time, a distinct binding mode of neurotensin that could be of considerable relevance for further pharmacological studies. As exemplified in section 4.3, HR-SSNMR based structural studies can also assist in refining existing (X-ray or solution-state NMR) membrane-protein structures. The presented results provide, for the first time, direct experimental evidence for a double occupancy of the Q0 binding site in the ubiquinone-bc1 complex and may provide the basis for the complete 3D structural determination of the ubiquinone binding pocket. Advancements regarding sample preparation (for example, including modular labeling, in vitro expression and intein technology) and improvements in NMR hardware instrumentation could open up new areas of solid-state NMR research such as the investigation of large protein-protein complexes or the complete 3D characterization of larger membrane proteins. Solid-state NMR studies of multiply-labeled biomolecules will furthermore profit from improved procedures for calculating 3D structures, in particular in the presence of ambiguousor a limited number of structural constraints. Unlike X-ray crystallography, protein motion does not hinder solid-state NMR methods. In fact, complementary to solution-state NMR, it may provide a very efficient means to study protein folding, flexibility and function under biologically relevant conditions. Hand in hand with solution-state techniques and crystallographic methods, solid-state NMR could provide insight into protein function and the chemistry of life with unprecedented accuracy and flexibility.
Die Gentherapie bietet eine interessante alternative Behandlungsoption bei der Therapie der HIV-Infektion und könnte langfristig die Standardmedikation mit antiretroviralen Substanzen ergänzen oder ersetzen. Antivirale Genprodukte, die frühe Schritte im HIV-Replikationszyklus hemmen, bevor sich das Virus in das Genom der Zielzelle integriert hat, sind dabei besonders vielversprechend. Hierzu zählen insbesondere die von der C-terminalen heptad repeat Region des HIV-Hüllglykoproteins gp41 abgeleiteten C-Peptide, die hochwirksame Inhibitoren des Viruseintritts sind. Während des HIV-Eintrittsprozesses interagieren sie mit den viralen gp41 N-Helices und verhindern somit die Ausbildung des zur Fusion von viraler und zellulärer Membran erforderlichen Sechs-Helix-Bündels. Die Sekretion antiretroviraler C-Peptide durch genmodifizierte T-Lymphozyten in vivo birgt großes therapeutisches Potential: Nach Freisetzung in den extrazellulären Raum können die Peptide nicht nur genmodifizierte sondern auch unbehandelte Nachbarzellen vor HIV-Infektion schützen (Bystander-Effekt). Somit könnte selbst mit den heute zur Verfügung stehenden Methoden, mit denen lediglich ein Teil aller potentiellen HIV-Zielzellen modifiziert werden kann, die Virusreplikation effektiv unterdrückt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden daher C-Peptid-basierte in vivo sezernierte antivirale Eintrittsinhibitoren (iSAVE) für die HIV-Gentherapie entwickelt. Kurze Peptide, wie die antiviralen C-Peptide, werden von eukaryotischen Zellen aufgrund von Größenbeschränkungen beim Eintritt in den Sekretionsweg jedoch nur schlecht sezerniert. Um die effiziente Sekretion von iSAVE-Peptiden durch genmodifizierte humane Zellen zu erreichen, wurde das C-Peptid daher verlängert. Hierbei wurde das therapeutische Peptid einerseits um nicht antiviral aktive Gerüstelemente ergänzt. Andererseits wurden Concatemer-Konstrukte generiert, in denen zwei C-Peptide jeweils über einen flexiblen oder proteolytisch spaltbaren Linker verbunden sind. Die unterschiedlichen iSAVE-Peptid-Varianten wurden in vitro in transfizierten und transduzierten Zelllinien und in primären humanen T-Lymphozyten charakterisiert. Hierbei wurden Sekretionseffizienz und Prozessierung sowie antivirale Aktivität und Bystander-Inhibition der sezernierten Peptide untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Effizienz der C-Peptidsekretion stark mit der Peptidlänge korreliert, so dass durch Sequenzverlängerungen die Sekretion deutlich gesteigert werden konnte. Darüber hinaus waren N-Glykane für die effiziente Sekretion der C-Peptide unerlässlich. Die antiretrovirale Aktivität hingegen reduzierte sich mit zunehmender Peptidlänge dramatisch und wurde auch durch N-Glykane leicht beeinträchtigt, so dass weder die durch Gerüstelemente verlängerten C-Peptide, noch die ungespaltenen C-Peptid-Concatemere antiretrovirale Wirkung zeigten. Durch die Generierung proteolytisch spaltbarer C-Peptid-Concatemere konnten die strukturellen Erfordernisse für effiziente Sekretion mit hoher inhibitorischer Aktivität vereinbart werden. Die Prozessierung der Concatemere durch die Proprotein-Convertase Furin war allerdings nicht einfach zu erreichen. Nur das Einfügen eines flexiblen Linkers mit optimierter Furinerkennungssequenz zwischen den beiden C-Peptiden erlaubte die effiziente Spaltung in monomere Peptide mit hoher antiretroviraler Aktivität. Therapeutisch wirksame Peptidkonzentrationen dieser optimierten iSAVE-Peptide wurden sowohl von transfizierten und transduzierten Zelllinien als auch von primären humanen T-Zellen sezerniert. Nach Freisetzung in den extrazellulären Raum konnten die Peptide nicht nur genmodifizierte sondern auch unbehandelte Nachbarzellen in vitro vor HIV-1 Eintritt und Infektion schützen. Die generierten iSAVE-Peptide bilden damit eine hervorragende Grundlage für die weitere präklinische und klinische Entwicklung eines neuen Gentherapieansatzes zur Behandlung der HIV-Infektion.
Screening und Charakterisierung von Peptidliganden für den BCR-ABL mRNA Translokationsbereich
(2005)
Die reziproke Translokation t(9;22) ist in 95% der chronischen myeloischen Leukämie vorhanden. Bei der Translokation entsteht ein Fusionsprotein BCR-ABL, welches ausreichend für die Entstehung von Leukämien ist. 30% aller akuten lymphatischen Leukämien sind ebenfalls positiv für diese Translokation. Durch die Translokation entsteht am Translokationsbruchpunkt eine einzigartige RNA-Sequenz, welche als Ziel für eine RNA-Liganden Suche dienen kann. Ziel dieser Arbeit war es, Peptidliganden zu finden, welche die BCR-ABL mRNA binden können. Zunächst wurde die bcr-abl mRNA nach Sekundärstruktur-Elementen durchsucht, welche als Interaktionspartner mit Peptiden in Fragen kommen. Hierzu wurde die BCR-ABL mRNA durch das MFold-Programm von Zuker analysiert. Durch die Auswertung der errechneten Diagramme für die thermodynamische Stabilität und die kinetische Prävelanz der Basenpaarinteraktion, wurden zehn verschiedene BCR-ABL mRNA-Bereiche ausgewählt, welche die Möglichkeit besitzen, sich in stabile Sekundärstruktur-Elemente zu falten. Um diese strukturellen Gegebenheiten am BCR-ABL Translokationsbruchpunkt b2a2 im Experiment zu überprüfen, wurden in Kooperation mit Prof. Göbel und Dr. Scheffer RNase-Mapping und Mapping mit einer künstlichen Nuklease durchgeführt. Es konnte im Experiment das Vorhandensein einer Sekundärstruktur nachgewiesen werden. Diese Struktur wird aus einem Stamm mit einer Fehlpaarung, einem asymmetrischen internen Loop, einem weiteren Stamm und durch einen Loop definiert. Gegen diese b2a2-Struktur und gegen neun weitere mRNA-Bereiche wurde eine Phage-Display-Selektion durchgeführt, welche zum Ziel hat, Peptide zu gewinnen, welche die entsprechende RNA-Struktur spezifisch binden können. Nach der Sequenzierung der Phagen, konnten insgesamt 14 verschiedene Peptid-Sequenzen für die zehn unterschiedlichen RNA-Bereiche gefunden werden, welche die Möglichkeit besitzen, mit der jeweiligen Ziel-RNA zu interagieren. Die Phagen-RNA Interaktion wurde durch Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie ermittelt. Bei dieser Meßmethode werden Diffusionszeiten von markierten Molekülen in Lösung bestimmt. Zwei von den 14 Phagen-Präsentierten-Peptiden zeigen eine Interaktion mit der Ziel RNA. Die gefundenen Peptide besitzen die folgenden AS-Sequenz: das Peptid 12, KHLHLHK und das Peptid 14, NPEKVKMLYVEF. Die Interaktion mit der RNA wurde in nicht kompetitiven und in kompetitiven FCS Experimenten gezeigt. Kompetiert wurde die Phagen-RNA Interaktion mit kompetitor RNA und in einem weiteren Experiment mit den synthetisierten Peptiden. Beide Peptide zeigten im FCS eine Interaktion mit dem b2a2 BCR-ABL Translokationsbruchpunkt. Die kD-Werte der Peptid-RNA Interaktion wurde durch CDTitration ermittelt. Peptid 12 bindet die b2a2-RNA mit einem kD-Wert von 42 μM und Peptid 14 bindet diese RNA mit einem kD-Wert von 52 μM. Durch die CD-Titration wurde auch der Interaktionsort der beiden Peptide mit der b2a2-RNA ermittelt. Ausgehend von unserem b2a2-Strukturmodell, wurden RNA-Mutanten generiert und in Gegenwart von den Peptiden CD-Spektrometrisch untersucht. Die Interaktion von Peptid 12 mit der RNA findet am Loop und am oberen Stamm statt. Das längere Peptid 14 benötigt alle b2a2-RNA Strukturmerkmale, außer dem unteren Stamm, zur Interaktion. Der Einfluß der Peptide auf die Translation wurde durch ein In-vitro-Translationssystem ermittelt. Demnach bindet Peptid 14 an die b2a2-RNA-Struktur und verringert auf diese Weise die Translation. Peptid 12 bindet zwar ebenfalls an die b2a2-RNA, jedoch konnte eine Verringerung der Translation bei diesem Peptid nicht beobachtet werden.
Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common malignant tumor and third leading cause of cancer-related death worldwide. Most cases arise as a consequence of underlying liver disease, e.g. developed from chronic hepatitis B or C infectionsalcohol abuse or obesity, and are most often associated with liver cirrhosis. Hypoxiand the hypoxia inducible factors (HIF)-1α and -2α promote tumor progression of HCC, not only affecting tumor cell proliferation and invasion, but also angiogenesis and lymphangiogenesis and thus, increasing the risk of metastasis.
HCC is characterized as one of the most vascularized solid tumors. While HIF-1α and HIF-2α are frequently up-regulated in HCC only HIF-2α is correlated with high patientlethality. HIF-dependent regulation of HCC angiogenesis is controversially discussed.VEGFA, for example, as the most prominent factor inducing tumor angiogenesis represents not only a HIF-1 target, but also a HIF-2 target gene in HCC. This questions whether both isoforms have overlapping functions in regulating the angiogenic switch in HCC.
Besides angiogenesis also tumor-associated lymphangiogenesis significantly influences patient survival in HCC. Lymphatic spread is an important clinical determinant for the prognosis of HCC, but little is known how lymphangiogenesis is controlled in this context. To date, mainly HIF-1α was positively correlated with olymphatic invasion and metastasis in HCC, while a defined role of HIF-2α is missing. Thus, although HIF-1α and HIF-2α are structurally alike and regulate overlapping but not identical sets of target genes, they promote highly divergent outcomes in cancer progression and may even have counteracting roles. The aim of my work was to characterize the specific role of HIF-1α and HIF-2α in the angiogenic switch and lymphangiogenesis induction during HCC development.
Therefore, I created a stable knockdown of HIF-1α and HIF-2α in HepG2 cells and generated cocultures of HepG2 spheroids and embryonic bodies derived from embryonic mouse stem cells as an in vitro tumor model mimicking the cancer microenvironment to analyze which HIF isoform has key regulatory functions in HCC (lymph)angiogenesis. In cocultures with a HIF-2α knockdown angiogenesis was attenuated but lymphangiogenesis increased, while the knockdown of HIF-1α was without effect. Microarray analysis identified plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1)and insulin-like growth factor binding protein 1 (IGFBP1) as HIF-2 target genes.However, prominent angiogenic and lymphangiogenic factors such as VEGFs, PDGFB, ANG and their receptors were not regulated in a HIF-dependent manner. As PAI-1 was linked to angiogenesis in literature and IGF-signaling, which is negatively regulated by IGFBP-1, was correlated with lymphangiogenesis, I decided to investigate their HIF-2α-dependent influence on HCC (lymph)angiogenesis. The knockdown of PAI-1 in HepG2 cells also lowered angiogenesis in PAI-1k/d cocultures similar to the HIF-2α k/d phenotype. PAI-1 as the potent inhibitor of tPA and uPA, both inducing the conversion of plasminogen to plasmin, also inhibits plasmin directly. Therefore, I assumed an increase of plasmin in HIF-2α k/d and PAI-1 k/d cocultures as a result of the reduced PAI-1 levels. Blocking plasmin with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored angioge nesis, suggesting that HIF-2α increases PAI-1 to lower concentrations of active plasmin, thereby supporting angiogenesis. In further experiments I could exclude PAI-1 to reduce angiogenesis by inducing plasmin-mediated apoptosis of differentiating stem cells in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, but demonstrated an increase of VEGFA165 degradation in these cocultures, suggesting plasmin-catalyzed proteolysis of VEGF as an additional layer of regulation required to explain the angiogenic phenotype. Besides the pivotal role of PAI-1 in angiogenesis I also investigated its potentialinfluence in lymphangiogenesis. Indeed, the knockdown of PAI-1 reduced lymphaticstructures and implied an important but opposing role in lymphangiogenesis comparedto induced lymphangiogenesis in HIF-2α k/d cocultures. However, blocking plasmin again with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored lymphangiogenesis to the level of control virus, which indicates a divergent lymphangiogenic role of plasmin in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, possibly because of other essential pathways masking the lymphangiogenic effects of PAI-1 in HIF-2α k/d cocultures.
HIF-2α resulting in reduced IGFBP1 expression induced the differentiation of stem cells toward a lymphatic cell type and significantly enhanced the assembly of human dermal lymphatic endothelial cells into tubes. These data point the first time to an important impact of HIF-2 in the regulatin of lymphangiogenesis in vitro by inducing IGFBP1 and thus, scavenging IGF-1. Furthermore, matrigel plug assays to investigate the in vivorelevance of these observations confirmed HIF-2α as a crucial factor in the regulation of lymphangiogenesis in vivo
In conclusion, this work provides evidence that HIF-2α is a key regulator of angiogenesis and lymphangiogenesis in HCC by regulating PAI-1 and IGFBP1. HIF-2α positively influences the angiogenic switch via PAI-1 and negatively affects lymphangiogenesis via IGFBP1 expression. Targeting HIF-2α in HCC to reduce tumor angiogenesis should be approached carefully, as it might be overcome by induced lymphangiogenesis and metastasis.
Life and biological resilience rely on the execution of precise gene expression profiles. A key mechanism to ensure cellular homeostasis is the regulation of protein synthesis. Recent studies have unveiled an intrinsic regulatory capacity of ribosomes, previously considered mere executors of mRNA translation. Neurons in particular finely regulate protein synthesis, at both global and local levels. This sustains their complex morphology and allows them to rapidly transmit, integrate, and respond to external stimuli. In this thesis, I investigated the neuronal ribosome and how subcellular environments and physiological perturbations shape it, by profiling its molecular composition, functional interconnections, and cellular distribution.
First, I used genetic engineering, biochemical purification, and mass spectrometry, to characterize in an unbiased manner the translation machinery specifically from excitatory and inhibitory neurons of the mouse cortex. I found that neuronal ribosomes commonly interact with RNA-binding proteins, components of the cytoskeleton, and proteins associated with the endoplasmic reticulum and vesicles. In line with the requirement for local protein synthesis in the distal parts of neurons, we observed that neuronal ribosomes preferentially interact with proteins involved in cellular transport. Remarkably, I observed a strong association between ribosomes and pre-synaptic vesicles, which suggests a potential regulatory interaction between local translation and neuronal activity.
Intriguingly, I and others have observed mRNAs encoding for core ribosomal proteins (RPs) among the genes most enriched in neuronal processes. This observation challenges two historical assumptions of ribosome biology: (1) new RPs are incorporated only into newly forming ribosomes, and (2) this incorporation occurs only in the nucleus and perinuclear region. In my PhD, I aimed to directly test these two assumptions and if proven wrong ask whether and why neurons would localize RP mRNAs far from their known assembly site.
Employing a combination of metabolic labeling and highly sensitive mass spectrometry techniques, I discovered that a subset of RPs rapidly and dynamically binds on and off mature ribosomes. Strikingly, this incorporation does not depend on the supply of new ribosomes from the nucleus. Therefore, my data refuted the assumption that ribosomes are built and degraded as a unit and revealed a more dynamic view of these machines, which can actively exchange core components. In particular, I found that the association of certain exchanging RPs is influenced by location (e.g., cell body versus neurites) and cellular state (e.g., post-oxidative stress). Neurons may use this mechanism to repair and/or specialize their protein synthesis machinery in a rapid and context-dependent manner.
Finally, I asked whether some steps of ribosome biogenesis could also take place in distal processes. Although most steps of ribosome assembly occur within the nucleus, the final stages of maturation are known to occur in the cytosol. By combining several imaging and biochemical approaches, I found that cytosolic (but not nuclear) pre-ribosomal particles are present in neuronal processes. Through the incorporation of new RPs into these immature particles, neurons may be able to locally “turn on” previously incompetent ribosomes. This may enable regions near synapses to enhance and customize their translational capacity, independently of the central pool of ribosomes from the cell body. Indeed, I observed that synaptic plasticity induces a maturation of cytosolic pre-ribosomes.
In summary, this thesis shows how neuronal ribosomes can sense cellular states, respond by adjusting their core composition, and in doing so influence the local capacity for protein synthesis. By overturning long-held assumptions in ribosome biology, this work highlights new molecular mechanisms of gene expression and enriches our understanding of the rapid and dynamic strategies cells employ to operate, thrive, and adaptively respond to environmental changes.
Sequenz-spezifische DNA-Rekombination (SSR) bewirkende Systeme aus niederen Organismen, wie z.B. das Cre/loxP-System aus dem P1-Phagen oder das Flp/FRT-System aus Hefe, sind in den letzten Jahren als wichtige und weitverbreitete Werkzeuge zur Modifikation des Säugergenoms etabliert worden. Dies hängt unter anderem mit der Vielfalt an Reaktionen zusammen, welche diese Systeme in der Lage sind durchzuführen. Dazu zählen Exzisions/Deletions-, Integrations-, Inversions- und Translokationsreaktionen. Die hier vorgestellte Arbeit fokussiert auf die Integrationsreaktion, welche aus thermodynamischen Gründen bisher keine breite Anwendung finden konnte, und ihren Einsatz bei der Etablierung allelischer Serien in embryonalen Stammzellen (ES Zellen) oder frühen Embryonen der Maus. Eine solche Methodik wäre ideal für Fragestellungen zu Funktionen von Genen in vivo (Functional Genomics) geeignet. Zur Anwendung kam ein als „Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch“ (recombinase-mediated cassette exchange, RMCE) bezeichnetes Verfahren. RMCE ist ein Zwei-Schritt-Verfahren: Zuerst wird der interessierende Genort durch homologe Rekombination derart verändert, daß 5’ und 3’ des Genlocus SSR-Erkennungsstellen eingeführt werden. Durch das Einbringen eines die gleichen Erkennungsstellen tragenden Austauschplasmides und die Bereitstellung der entsprechenden Rekombinase kann die im Genom residierende gegen die eingebrachte Kassette (von Erkennungsstellen flankiertes DNA-Segment) ausgetauscht werden. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Ansätze für RMCE vorgestellt: Der erste Ansatz basiert auf der Verwendung heterospezifischer lox-Sequenzen, welche sich in einer Base unterscheiden (lox511/loxP). Diese Mutation sollte eine effektive Integration durch Verhinderung der Exzision gewährleisten. Es konnte hier gezeigt werden, daß RMCE unter Verwendung einer solchen Methodologie in ES Zellen und frühen Mausembryonen effizient möglich ist, daß das Produkt der Integration jedoch instabil ist und nachfolgender Exzision unterliegt. Diese Deletionsreaktionen sind durch promiskuitive Rekombination der verwendeten lox511 und loxP bedingt. Aus diesen Erkenntnissen wurde ein zweiter Ansatz entwickelt, welcher auf dem simultanen Einsatz des Cre/lox- und des Flp/FRT-Systems basiert. Diese Methodik umgeht die Nachteile promiskuitiver Erkennungssequenzen und ihre Anwendbarkeit, Funktionsfähigkeit und Effizienz in ES Zellen konnten demonstriert werden. Ein solches Verfahren, welches sowohl in Zellkultur als auch in frühen Mausembryonen zum Einsatz kommen könnte, bietet insbesondere im Hinblick auf zukünftige Bedürfnisse in der Functional Genomics viele Optionen.
Metabotropic glutamate receptor subtype 7 (mGluR7) belongs to the family of G-protein coupled receptors. mGluR7 is widely distributed in the brain and primarily localized at presynaptic terminals, where it is thought to regulate neurotransmitter release and synaptic plasticity. Studies have shown that the intracellular C-terminal tail of mGluR7 binds a variety of proteins in addition to trimeric G-proteins. These newly identified protein interactions are believed to play a key role in the synaptic targeting and G-protein dependent signaling of mGluR7. Protein interacting with C kinase 1 (PICK1), a PDZ-domain protein, is a strong interaction partner of mGluR7a. In order to investigate the role of PICK1 in the synaptic trafficking and signaling of mGluR7a, a knock-in mouse line in which the interaction of mGluR7a and PICK1 is disrupted was generated. Analysis of the mutant mice by immunocytochemistry and immunoelectron microscopy showed that the synaptic targeting and clustering of mGluR7a was not altered, indicating that PICK1 is not required for mGluR7a receptor membrane trafficking and synaptic localization. However, when the spontaneous synaptic activity of cerebellar granule cell cultures prepared from both wild-type and knock-in mice was monitored, and L-AP4 (400μm) was found to decrease the frequency, but not the amplitude, of spontaneous excitatory currents in wild-type neurons, while no effect of L-AP4 on spontaneous synaptic activity was observed in knock-in neurons. This indicates that PICK1 binding to the C-terminal region of mGluR7a plays an essential role in mGluR7a mediated G-protein signaling. We examined the threshold sensitivity for the convulsant pentetrazole (PTZ) in knock-in mice. It was found that mGluR7a knock-in mice had a greater sensitivity to PTZ than wild-type mice. Moreover, the surface parietal cortex EEG recordings of the mutant mice revealed spontaneous synchronous oscillation, or "spike-and-wave discharges" (SWD), which displayed similar characteristics to absence-like seizures. It was also observed that the knock-in mice responded to pharmacology as human absence epilepsy. These data suggests that the knock-in mice displayed the phenotype of absencelike epilepsy. Furthermore, the behavioral analysis of the mGluR7a knock-in mice showed no deficits in motor coordination, pain sensation, anxiety as well as spatial learning and memory, thus the interaction of mGluR7a and PICK1 appears not to contribute to these physiological processes. Taken together, our data provides evidence for an important role of PICK1 in Gprotein dependent signaling of mGluR7a, whereas PICK1 is not required for synaptic targeting and clustering of mGluR7a. Our results also provide an animal model of absencelike epilepsy generated by disruption of a single mGluR7a-PDZ interaction, thus creating a novel therapeutic target against this neurological disease.
Epidermal growth factor (EGF) receptor belongs to the broad family of enzymatic receptors called receptor tyrosine kinases (RTKs). Generally, the binding of a ligand to these receptors leads to activation of their intracellular kinase activity that sets in motion a cascade of signaling events. In order to ensure appropriate responses to physiological stimuli, the cell is endowed with the ability to regulate signal transduction via numerous mechanisms such as dephosphorylation of the RTK and its substrates as well as downregulation of the RTK. Activation of EGFR is a potent mitogenic (proliferative) and motogenic (cell motility) signal that plays crucial roles during embryonic development and maintenance of adult tissue. EGFR signaling is primarily regulated by ligand-induced receptor internalization with subsequent degradation in lysosomes. While the complex of proteins that are recruited to EGFR after its activation is well understood, proteins that interact with the receptor in the absence of ligand binding are still not systematically studied. With the goal of identifying novel binding partners of non-activated EGFR, a membrane based yeast-two hybrid screen (MYTH) was conducted. MYTH is based on the principle of in vivo reconstitution of the N-terminus (Nub) and C-terminus (Cub) halves of ubiquitin once brought into close proximity. A chimeric protein consisting of EGFR fused to Cub and a transcription factor was used as a bait to screen Nub-tagged cDNA library. Analysis of resultant yeast transformants revealed a total of 87 proteins to interact with EGFR. Of these only 11 were previously shown to bind to EGFR. A majority of the other proteins were shown to interact with the receptor by yeast retransformation. Fifteen were confirmed to bind to EGFR by coimmunoprecipitation assays in mammalian cells. One of the novel EGFR interactors identified in the screen was histone deacetylase 6 (HDAC6). This deacetylase is localized in the cytoplasm and known to deacetylate alpha-tubulin, HSP90 and cortactin. The juxtamembrane region of EGFR binds to the Cterminus of HDAC6. Functionally, overexpression of wild type HDAC6 stabilized ligand-induced degradation of the receptor. On the other hand, deacetylase deficient or EGFR binding compromised mutants of HDAC6 were able to stabilize EGFR only partially. Downmodulation of HDAC6 expression by RNAi markedly accelerated degradation of the receptor. Taken together, HDAC6 is a negative regulator of EGFR downregulation that is dependent on its deacetylase activity and ability to bind to the receptor. Imaging studies revealed that HDAC6 does not affect internalization of EGFR from the plasma membrane but rather influences the post-endocytic trafficking of the receptor-ligand complex to lysosomes. Pulse-chase experiments using fluorophoretagged EGF showed that EGFR is transported faster towards the peri-nuclear region and delivered to late endosomes rapidly in HDAC6 depleted cells. HDAC6 is demonstrated to act, at least partly, by regulating the acetylation of alpha-tubulin. Upon EGFR activation, acetylation of alpha-tubulin on lysine 40 is progressively increased as shown by mass spectrometry and immunoblotting. Forced expression of a dominant negative mutant of alpha-tubulin, but not wild type alpha-tubulin, led to reduced speed and processive movement of early endosomes in GFP-Rab5 expressing cells. In a surprising twist, EGFR is able to phosphorylate HDAC6 on Tyr570. Phosphorylation of Tyr570 and Ser568 leads to inactivation of the deacetylase function of HDAC6 as shown by in vivo and in vitro assays. In summary, HDAC6 diminishes EGFR downregulation by slowing the transport of intracellular vesicles. The inhibitory effect is removed once HDAC6 is phosphorylated on key residues. In line with these findings, two recent reports have shown that hyper-acetylation of alpha-tubulin induced by inhibition of HDAC6 increases the transport of brain derived neurotrophic factor and JNK interacting protein-1 in different cell systems. Acetylated microtubules are more efficient in recruiting motor proteins like kinesin-1 and dynein. These findings indicate that HDAC6 plays an important regulatory role in intracellular trafficking pathways. However, several outstanding issues still remain unresolved. How does acetylation of microtubules influence vesicular trafficking? In this regard, the temporal and spatial dynamics of alpha-tubulin acetylation following EGFR activation should be studied. Furthermore, whether HDAC6 affects the trafficking of other endocytic cargos and additional organelles is an interesting question to address.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine Variante des Anti-Thrombin-Aptamers HD1 entwickelt, die vor Belichten aktiv war und sich durch Belichten deaktivieren ließ. Dazu wurde das Wildtyp-Aptamer am 5'-Ende um eine GAAA-Schleife und eine Gegenstrangregion, bestehend aus vier Nukleotiden, erweitert. Dies reichte für eine vollständige Inaktivierung des Aptamers aus. In die Gegenstrangregion wurde ein photolabil geschütztes Nukleotid eingebaut, das die Bildung einer Haarnadelstruktur vorübergehend verhindert. Dazu wurde ein Desoxycytidin-Derivat synthetisiert, das an seiner N4-Position mit einer 1-(2-Nitrophenyl)ethyl-Gruppe modifiziert war. Durch die Maskierung der Antisense-Region wies das Aptamer vor Belichtung blutgerinnungshemmende Aktivität auf, allerdings in geringerem Maße als das Wildtyp-Aptamer. Durch Belichten wurde die Gegenstrangregion freigesetzt und dadurch die aktive Konformation des Aptamers zerstört, sodass es keine blutgerinnungshemmende Wirkung mehr besaß. In einem daran anknüpfenden Projekt sollte eine mit Licht ausschaltbare HD1-Variante mit verbessertem Schaltverhalten entwickelt werden, deren Aktivität vor dem Belichten mit der des Wildtyp-Aptamers vergleichbar ist. Tests zeigten, dass eine 5'-Erweiterung des Aptamers stets einen Aktivitätsverlust zur Folge hatte. Getestet wurden verschiedene Linker-Sequenzen, D-Spacer (Abasic Sites) und nicht nukleotidische Linker wie Glykollinker oder alkylische Linker. Eine Erweiterung am 3'-Ende brachte dagegen fast immer Aptamervarianten hervor, deren Aktivität die des Wildtypaptamers überstiegen. Um diese verbesserten Aptamervarianten zu deaktivieren, war eine Antisense-Region bestehend aus bis zu neun Nukleotiden nötig. Für eine photolabil geschützte Variante wurde zusätzlich ein Desoxyadenosinderivat mit N6-1-(2-Nitrophenyl)ethylmodifikation synthetisiert. Es zeigte sich, dass eine photolabile Schutzgruppe nicht ausreichte um die Antisense- Region zu neutralisieren. Aptamervarianten mit vier oder fünf photolabilen Schutzgruppen in der Antisenseregion waren vor dem Belichten aktiver als das Wildtyp-Aptamer HD1 und konnten durch Belichten vollständig deaktiviert werden. In einem weiteren Projekt dieser Arbeit wurde eine photolabil geschützte Glukosamin-6- phosphat-Variante synthetisiert, um eine lichtabhängige Spaltung des glmS-Ribozyms aus Bacillus subtilis zu induzieren. Dazu wurde GlcN6P an der Aminofunktion über eine Carbonyllinker mit einer 2-(2-Nitrophenyl) propylgruppe modifiziert. In vitro konnte gezeigt werden, dass mit dieser Verbindung durch Belichten die Spaltung eines glmS-EGFP-mRNA-Konstrukts induziert werden konnte. In HeLa-Zellen wurde untersucht, ob sich dieses System zur Regulation der EGFP-Expression eignet. Da erste Versuche erfolglos blieben, wurde eine lipophile, zellgängige Variante des photolabil geschützten GlcN6Ps synthetisiert. Versuche, in denen dieses Derivat getestet wird, werden zur Zeit von unseren Kooperationspartnern durchgeführt. In einem weiteren Projekt wurden Desoxyguanosinderivate für die DNA-Festphasensynthese synthetisiert, die an ihrer O6-Position mit einer p-Hydroxyphenacylgruppe bzw. mit einer 1-(3-Nitrodibenzofuran-2-yl)ethylgruppe modifiziert wurden. Diese wurden in ein Desoxyoligonukleotid eingebaut und es konnte gezeigt werden, dass die photolabilen Schutzgruppen durch Belichten abgespalten werden. Beide photolabilen Modifikationen waren allerdings unter den basischen DNA-Abspaltbedingungen zu instabil, als dass sie sich für den routinemäßigen Einsatz zur Herstellung lichtaktivierbarer Nukleinsäuren eignen würden. Im letzten Teil der Arbeit wurde eine photolabile Schutzgruppe entwickelt, die über einen zusätzlichen Aminolinker verfügt [2-(4-(Aminomethyl)-2-nitrophenyl)-propanol]. Die Aminofunktionalität war für die Dauer der DNA/RNA-Festphasensynthese mit einer Trifluoracetylgruppe geschützt, die unter den basischen Abspaltbedingungen ebenfalls entfernt wird. Mit dieser photolabilen Schutzgruppe wurden ein Thymidinderivat an der O4-Position und ein Desoxyguanosinderivat an der O6-Position modifiziert. Das Desoxyguanosinderivat wurde erfolgreich in der Oligonukleotidfestphasensynthese eingesetzt. Die photolabile Schutzgruppe konnte durch Belichten vollständig von der synthetisierten Nukleinsäure abgespalten werden. Darüber hinaus gelang es, über die Aminofunktionalität die heterobifunktionalen Crosslinker SMCC und SMPB mit der Nukleinsäure zu verknüpfen. Auf diese Weise ist eine reversible Vernküpfung der Nukleinsäure mit einem nahezu beliebigen Bindungspartner möglich. Durch Belichten kann die Nukleinsäure in ihrer ursprünglichen Form wiederhergestellt werden.
Die 5-Lipoxygenase ist das Schlüsselenzym der Bildung proentzündlicher Leukotriene. Diese Mediatoren sind assoziiert mit Erkrankungen des entzündlichen Formenkreises wie beispielsweise Arteriosklerose [6]. Durch die Veröffentlichungen von Qiu et. al. [248] und Gredmark-Russ et. al. [650] konnte gezeigt werden, dass die Infektion mit humanen Cytomegalovirus in vitro und in vivo zur Induktion der 5-LO in HPASMCs und SMCs (smooth muscle cells) führt. HCMV ist ein ß-Herpesvirus, welches nach einer zumeist asymptomatischen Primärinfektion, dauerhaft im Wirt persisiert und bei Schwächung des Immunsystems oder entzündliche Prozessen reaktiviert werden kann [256]. Geht das Virus in die lytische Replikationsphase über, werden Entzündungsprozesse gefördert, die zur Ausprägung von Krankheitsbildern wie Retinitis, rheumatoider Arthritis oder auch Psoriasis führen. Es besteht demnach ein Zusammenhang zwischen der aktiven HCMV-Infektion und Erkrankungen des entzündlichen Formenkreises, welche unter anderem durch die Induktion der 5-LO vermittelt wurden.
Ziel der Arbeit war es, den molekularen Mechanismus der viral induzierten 5-LO-Promotoraktivierung aufzuklären. Dazu wurde zunächst überprüft, ob die Infektion mit HCMV in HFF, einer Zelllinie die äußerst permissiv für die Infektion ist und daher zumeist als Testsystem für HCMV herangezogen wird, eine verstärkte 5-LO-Expression hervorruft, oder ob es sich um einen zelltypspezifischen Effekt der smooth muscle cells handelt. Es konnte gezeigt werden, dass es nach Infektion zu einer verstärkten Promotoraktivierung, mRNS- sowie Proteinexpression der 5-LO kam (Abb. 19, 23, 24). Weitere Untersuchungen charakterisierten, welches virale Protein die Effektvermittlung bedingte. Aufgrund der sequentiellen Genexpression des Virus unterscheidet man nach Zeitpunkt der Expression in Immediate Early, Early und Late Proteine, wobei letztere erst nach Replikation des viralen Genoms exprimiert werden. Der Zusatz von Foscavir als Replikationsinhibitor verdeutlichte, dass ein Immediate Early oder Early Protein die Induktion hervorruft (Abb. 16). Reportergenassay-Experimente unter Überexpression einzelner viraler Proteine zeigten, dass Immediate Early 1 essentiell an der Erhöhung der 5-LO-Promotoraktivität beteiligt ist (Abb. 18). Weitergehende Versuche unter Verwendung des IE1-Deletionsvirus CR208 bestätigten, dass die Induktion der 5-LO-Promotoraktivität sowie der mRNS-Expression durch dieses virale Protein vermittelt wird (Abb. 18, 20-22). Auf Proteinebene konnte ebenfalls nach IE1-Überexpression beziehungsweise nach Infektion mit HCMV eine erhöhte 5-LO-Expression detektiert werden (Abb. 23 und 24). Aktivitätsuntersuchungen, bei denen die Konzentration der 5-LO-Produkte LTB4 und 5-HETE gemessen wurden, bestätigten, dass das Enzym funktionsfähig ist (Abb. 25). Nach Infektion mit HCMV kommt es demnach zur IE1-vermittelten Induktion der 5-LO auf mRNS- und Proteinebene sowie nachgeordnet zur verstärkten Produktion von inflammatorischen Leukotrienen, die an der Ausbildung der entzündlichen Symptomatik einer lytischen Infektion beteiligt sind.
Immediate Early 1 ist ein potenter Transaktivator, der sowohl virale als auch zelluläre Promotorstrukturen aktivieren kann [387]. Funktionell wird dies reguliert über die Förderung der Transkriptionsfaktor-Expression, aber auch durch Beeinflussung histonmodifizierender Enzyme wie Histondeacetylasen [464]. Für den 5-LO-Promotor ist bekannt, dass dessen Aktivität über Bindung von Sp1, sowie durch HDAC-Inhibition beeinflusst werden kann [9, 171]. Diese beiden Regulationsmechanismen stellen demnach mögliche Verknüpfungspunkte in der viral induzierten Induktion des 5-LO-Promotors dar. Zunächst wurde die Expression von Transkriptionsfaktoren, welche charakterisierte Bindungsstellen im 5-LO-Promotor besitzen, nach IE1-Überexpression untersucht. Es zeigte sich, dass der zelluläre Sp1-mRNS-Spiegel durch IE1 80fach induziert werden kann (Abb. 27). Im Reportergenassay mit 5-LO-Promotordeletionskonstrukten, bei denen gezielt einzelne Sp1-Bindungsstellen, sogenannte GC-Boxen, mutiert wurden, konnte bestätigt werden, dass die IE1-vermittelte Induktion essentiell von Sp1-abhängt, da die Mutation der GC4-Box die Aktivierung nahezu komplett inhibiert (Abb. 30, 31). Auch der Zusatz von Mithramycin, einem DNS-Interkalator, welcher die Bindung von Sp1 an die DNS unterdrückt, ist in der Lage die Induktion abzuschwächen (Abb. 33) [651]. Um die direkte Sp1-Bindung an den 5-LO-Promotor nachzuweisen wurden sowohl EMSA- als auch ChIP-Experimente durchgeführt. Es zeigte sich, dass in vitro und in vivo die Sp1-Bindung an den proximalen 5-LO-Promotor nach IE1-Überexpression beziehungsweise nach Infektion zunimmt (Abb. 49, 50). Interessanterweise wird dieser Effekt nicht durch Immediate Early 2, einer Spleißvariante von IE1, welche eine große strukturelle Ähnlichkeit aufweist, hervorgerufen. Da Veröffentlichungen gezeigt haben, dass beide Immediate Early Proteine in der Lage sind, Sp1 auf mRNS-Level zu induzieren, muss ein weiterer regulatorischer Mechanismus in die Sp1-Promotorbindung involviert sein [410]. In Co-Immunopräzipitations Versuchen zeigten beide IEPs eine Interaktion mit Sp1 (Abb. 38), wonach der Unterschied in der transaktivierenden Fähigkeit des 5-LO-Promotors nicht durch Protein-Protein-Bindung mit Sp1 bedingt wird. Strukturell unterscheiden sich die beiden Proteine in ihrer carboxyterminalen Sequenz. Für IE1 ist hier eine intrinsische Kinaseaktivität beschrieben, die zur Autophosphorylierung, aber auch zur Phosphorylierung von Bindungsproteinen führen kann. Western Blot Analysen auf den zellulären phospho-Sp1-Gehalt nach viraler Überexpression konnten zeigen, dass IE1, nicht aber IE2 die posttranslationale Modifikation des Transkriptionsfaktors fördert (Abb. 39). Auch die Testung viraler Deletionsmutanten, denen einzelne Exons beziehungsweise die ATP-Bindungsstelle der Kinasedomäne fehlen, bestätigten die Schlüsselfunktion dieses Strukturelements (Abb. 37). Ob es sich um eine direkte oder indirekte Phosphorylierung von Sp1 durch IE1 handelt wurde durch in vitro Kinase-Assays und die Testung unterschiedlicher Proteinkinase-Inhibitoren bestimmt (Abb. 40, 42, 45). Obwohl die beiden Proteine miteinander interagieren können, kam es nicht zu einer direkten Phosphorylierung, sondern zelluläre Kinasen wie Tyrosinkinasen und nachgeordnet die Mitglieder des MAPK-Signalweges sind in die Phosphorylierung von Sp1 involviert. Die finale Bestätigung der essentiellen Funktion von Sp1 in der IE1-vermittelten Aktivierung des 5-LO-Promotors lieferte ein Reportergenassay-Experiment mit Sp1-Knock-down Zellen, welche nach viraler Überexpression keine 5-LO-Promotoraktivität und mRNS-Expression mehr zeigten (Abb. 47, 48). Für die Vermittlung der IE1-induzierten 5-LO-Promotoraktivierung sind dessen transaktivatorische Fähigkeiten demnach essentiell, durch Erhöhung der Sp1-mRNS-Expression und nachfolgender Phosphorylierung wird die DNS-Bindung des Transkriptionsfaktors an die GC4-Box des 5-LO-Promotors erhöht und dieser damit transkriptionell aktiviert.
Neben der Regulation über verstärkte phospho-Sp1-Bindung an die GC4-Box Region muss die Induktion von 5-LO durch IE1 noch über weitere Interaktionen vermittelt werden, da die reine Sp1-Überexpression ohne IE1 keine Promotoraktivierung hervorrufen konnte (Abb. 34). Überprüft wurde daher die HDAC-inhibitorische Fähigkeit von IE1, da der 5-LO-Promotor über diese epigenetischen Mechanismen reguliert werden kann. Pull-down-Experimente zeigten zunächst eine Protein-Protein-Interaktion zwischen IE1 und HDAC1/2/3 (Abb. 51). Nachfolgend konnte in einem HDAC-Aktivitätsassay gezeigt werden, dass diese Interaktion die Enzymaktivität der HDACs drastisch reduziert (Abb. 52). Durch HDAC-Inhibition liegen Promotorstrukturen zunehmend acetyliert vor und sind damit transkriptionell aktiv. Für den funktionellen Nachweis auf den 5-LO-Promotor diente ein Reportergenassay-Experiment in dem IE1 und in steigenden Mengen HDAC überexprimiert wurde (Abb. 53). Die Überexpression von HDAC1 und HDAC3 konnten den aktivierenden Einfluss von IE1 auf den 5-LO-Promotor teilweise konzentrationsabhängig revertieren und scheinen damit an der Effektvermittlung beteiligt zu sein. Die Charakterisierung der HDAC-vermittelten 5-LO-Promotorregulation von Pufahl et. al. bestätigte durch Knock-down Experimente, dass HDAC3 entscheidenden Einfluss auf den 5-LO-Promotor hat [172]. HDAC1 dagegen reguliert über die verstärkte Deacetylierung von Sp1 dessen DNS-Bindungsaffinität. Eine Hemmung dieser beiden Histondeacetylasen durch das virale Protein erhöht damit die Aktivität des 5-LO-Promotors.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Ziel der Arbeit erreicht wurde und ein detaillierter Mechanismus der 5-LO-Promotoraktivierung durch HCMV aufgeklärt wurde. Immediate Early 1 induziert dabei zunächst die Expression und Phosphorylierung von Sp1. Ebenso interagiert das virale Protein mit HDAC1/2/3 und hemmt deren Aktivität, wodurch es zur Öffnung der 5-LO-Promotorstruktur kommt. Entscheiden ist hierbei vor allem die Hemmung von HDAC3. HDAC1 Inhibition sorgt im getesteten Zellsystem zusätzlich für verstärkte Acetylierung des Transkripti-onsfaktors Sp1, welcher aufgrund der dadurch erhöhten DNS-Bindungsaffinität an die GC4-Box-Region binden und so die Transkription fördern kann. Interessanterweise ist die Bindung an andere beschriebene GC-Boxen des 5-LO-Promotors nicht induktiv, was die Annahme nahelegt, dass nicht Sp1 alleine, sondern ein transaktivatorischer Komplex an diese Region bindet. Die Aktivierung des Promotors führt nachfolgend zur mRNS- und Proteinexpression, welche eine verstärkte Leukotrienbildung zur Folge hat. Diese Mediatoren sind in die Entstehung der entzündlichen Charakteristik einer aktiven HCMV involviert. Das Virus macht sich demnach generelle Prinzipien der Transaktivierung zu Nutze und fördert so zum einen seine Reaktivierung aus der Latenz, zum anderen die produktive Verbreitung der Infektion.
Purification and characterization of heterologously produced cannabinoid receptor 1 and G proteins
(2007)
G protein coupled receptors form the largest group of transmembrane proteins, which are involved in signal transduction and are targeted directly or indirectly by 40-50% of the drugs in the market. Even though a lot of biochemical and pharmacological information was acquired for these receptors in the past decades, structural information is still insufficient. G protein coupled receptors are expressed in a very minute scale in the tissues. Purification of G protein coupled receptors, in amounts needed for structural studies, from native tissue is tedious and almost impossible. To overcome this first hurdle of insufficient protein, several heterologous protein expression systems are being used. Another difficulty in structural determination of a G protein coupled receptor is that it is a membrane protein. Membrane proteins are difficult targets for structural studies. One of the possible reasons is the little hydrophilic surface area on the membrane protein, reducing the chances of crystal contact between the molecules. The present work is an attempt to investigate possible ways to overcome these problems. Aim of the project was to use G proteins to increase the hydrophilic area of the G protein coupled receptor. G protein is a physiological partner to the G protein coupled receptor which makes the complex functionally relevant. In the present work five G alpha proteins were purified to homogeneity by a two step purification using metal affinity and ion-exchange chromatography. The G alpha subunits purified were tested for their detergent susceptibility. It was found that only some G proteins were active in the presence of detergent. Observation from contemporary reports also suggest that the G alpha proteins expressed in Escherichia coli, alone may not be sufficient to bind to the G protein coupled receptors in solution. So the project was extended towards expressing a G protein coupled receptor which was reported to exist in a complex with the G proteins, in the cells. Purifying such a functional complex could be more beneficial to use for crystallization. Cannabinoid receptors were chosen for heterologous expression and purification. Production of recombinant cannabinoid receptor 2 was investigated in Pichia pastoris. The protein obtained was highly heterogenous. There were several oligomeric forms as well as degradation products in the cell membranes. Most of the protein was lost in the purification steps leading to a poor yield. Several oligomeric forms and other impurities were still present in the protein sample after purification. Alternatively, a baculovirus mediated insect cell expression system was investigated, to produce the receptors. Cannabinoid receptor 1 was investigated in insect cell expression system because of its better biochemical understanding and pharmacological importance than cannabinoid receptor 2. Cannabinoid receptor 1 was produced in two forms, a full length and a distal carboxy terminal truncated version. All the several gene constructs made could be expressed in the Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells. Expression levels (Bmax) for the constructs with a decahistidine tag at the amino terminus and Strep-tagII at the carboxy terminus were 40 pmol/mg and 53 pmol/mg respectively, for full length and truncated versions. These expression levels are 2 fold higher than the levels reported till now in the literature. As was quite evident from previous experiences of other research groups, purification of this receptor was a challenge. Protein purified from immobilized metal affinity chromatography (Ni-nitrilo tri acetate)(Ni-NTA) was not even 50% pure. A second purification by immobilized monomeric avidin or Streptactin agarose, making use of Biotag and StreptagII respectively, drastically reduced the protein recovery. Later on, purification of receptor was investigated on different metal chelating resins. His-Select, a Ni-NTA based matrix from Sigma, with much lesser density than Ni-NTA from Qiagen, showed a better purification profile. Purification was optimized to get 80% homogeneity but with low yield (20%). Further efforts are needed to improve the yield and purity of the receptor, to use it for crystallization. Cannabinoid receptors are known to exist in a precoupled form to G proteins in the cells. The existence of such precoupled forms of the receptor was investigated using the fluorescence techniques. Guanosine-5-triphosphate binding assay on the cell membranes, in the absence of agonists confirmed the active precoupled form of the receptor. It was found that it is possible to co-immunoprecipitate the complex. These results show that the truncated cannabinoid receptor can be produced in functional form in insect cells in much higher yields than reported. This receptor exists as a complex with G proteins even in the absence of ligands. It was also shown that the receptor/G protein complex can be coimmunoprecipitated. Further work is required to investigate the possibility of purifying this complex to use it for co-crystallization.
Pulsed electron–electron double resonance (PELDOR) spectroscopy is a powerful tool for measuring nanometer distances in spin-labeled systems and recently is increasingly applied to membrane proteins. However, after reconstitution of labeled proteins into liposomes, spin labels often exhibit a much faster transversal relaxation (Tm) than in detergent micelles, thus limiting application of the method in lipid bilayers. In the first part of the thesis, optimization of transversal relaxation in phospholipid membranes was systematically investigated by use of spin-labeled derivatives of stearic acid and phosphatidylcholine as well as spin-labeled derivatives of the channel-forming peptide gramicidin A under the conditions typically employed for PELDOR distance measurements. Our results clearly show that dephasing due to instantaneous diffusion that depends on dipolar interaction among electron spins is an important contributor to the fast echo decay in cases of high local concentrations of spin labels in membranes. The main difference between spin labels in detergent micelles and membranes is their local concentration. Consequently, avoiding spin aggregation and suppressing instantaneous diffusion is the key step for maximizing PELDOR sensitivity in lipid membranes. Even though proton spin diffusion is an important relaxation mechanism, only in samples with low local concentrations does deuteration of acyl chains and buffer significantly prolong Tm. In these cases, values of up to 7 μs have been achieved. Furthermore, our study revealed that membrane composition and labeling position in the membrane can also affect Tm, either by promoting the segregation of spin-labeled species or by altering their exposure to matrix protons. Effects of other experimental parameters including temperature (<50 K), presence of oxygen, and cryoprotectant type are negligible under our experimental conditions.
In the second part of the thesis, inhomogeneous distribution of spin-labels in detergent micelles has been studied. A common approach in PELDOR is measuring the distance between two covalently attached spin labels in a macromolecule or singly-labeled components of an oligomer. This situation has been described as a spin-cluster. The PELDOR signal, however, does not only contain the desired dipolar coupling between the spin-labels of the molecule or cluster under study. In samples of finite concentration the dipolar coupling between the spin-labels of the randomly distributed molecules or spin-clusters also contributes significantly. In homogeneous frozen solutions or lipid vesicle membranes this second contribution can be considered to be an exponential or stretched exponential decay, respectively. In this study, it is shown that this assumption is not valid in detergent micelles. Spin-labeled fatty acids that are randomly partitioned into different detergent micelles give rise to PELDOR time traces which clearly deviate from stretched exponential decays. As a main conclusion a PELDOR signal deviating from a stretched exponential decay does not necessarily prove the observation of specific distance information on the molecule or cluster. These results are important for the interpretation of PELDOR experiments on membrane proteins or lipophilic peptides solubilized in detergent micelles or small vesicles, which often do not show pronounced dipolar oscillations in their time traces.
In the third part, PELDOR has been utilized to study the structural flexibility of the Toc34 GTPase homodimer, a preprotein receptor of the translocon of the outer envelope of chloroplasts (TOC). Toc34 belongs to GAD subfamily of G-proteins that are regulated and activated by nucleotide-dependent dimerization. However, the function of Toc34 dimerization is not yet fully understood. Previous structural investigations of the Toc34 dimer yielded only marginal structural changes in response to different nucleotide loads. PELDOR revealed a nucleotide-dependent transition of the dimer flexibility from a tight GDP to a flexible GTP-loaded state. Substrate-binding stabilizes the dimer in the transition state mimicked by GDP-AlFx, but induces an opening in the GDP or GTP-loaded state. Thus, the structural dynamics of bona fide GTPases induced by GTP hydrolysis is replaced by substrate-dependent dimer flexibility, which represents the regulatory mode for dimerizing GTPases.
In the fourth part of the thesis, conformational flexibility and relative orientation of the N-terminal POTRA domains of a cyanobacterial Omp85 from Anabaena sp. PCC 7120, a key component of the outer membrane protein assembly machinery, were investigated by PELDOR spectroscopy. Membrane proteins of the Omp85-TpsB superfamily are composed of a C-terminal β-barrel and a different number of N-terminal POTRA domains, three in the case of cyanobacterial Omp85. It has been suggested that the N-terminal POTRA domains (P1 and P2) might have functions in substrate recognition. Molecular dynamics (MD) simulations predicted a fixed orientation for P2 and P3 and a flexible hinge between P1 and P2. The PELDOR distances measured between the P2 and P3 POTRA domains are in good agreement with the structure determined by X-ray, and compatible with the MD simulations suggesting a fixed orientation between these domains. PELDOR constraints between the P1 and P2 POTRA domains imply a rather rigid structure with a slightly different relative orientation of these domains compared with the X-ray structure. Moreover, the large mobility predicted from MD is not observed in the frozen solution. The PELDOR results further highlight the restricted relative orientation of the POTRA domains of the Omp85-TpsB proteins as a conserved characteristic feature that might be important for the processive sliding of the unfolded substrate towards the membrane.
The endothelin B receptor belongs to the rhodopsin-like G-protein coupled receptors family. It plays an important role in vasodilatation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. During the course of this work, the production of recombinant human ETB receptor in yeast, insect and mammalian cells was evaluated. A number of different receptor constructs for production in the yeast P. pastoris was prepared. Various affinity tags were appended to the receptor N-and C-termini to enable receptor detection and purification. The clone pPIC9KFlagHisETBBio, with an expression level of 60 pmol/mg, yielded the highest amount of active receptor (1.2 mg of receptor per liter of shaking culture). The expression level of the same clone in fermentor culture was 17 pmol/mg, and from a 10L fermentor it was possible to obtain 3 kg of cells that contained 20-39 mg of the receptor. For receptor production in insect cells, Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with the recombinant baculovirus pVlMelFlagHisETBBio. The peak of receptor production was reached at 66 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed 30 pmoL of active receptor /mg of membrane protein. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing the active receptor was evaluated. N-dodecyl-beta-D-maltoside (LM), lauryl-sucrose and digitonine/cholate performed best, and LM was chosen for further work. The ETB receptor was produced in mammalian cells using the Semliki Forest Virus expression system. Radioligand binding assays on membranes from CHO cells infected with the recombinant virus pSFV3CAPETBHis showed 7 pmol of active receptor /mg of membrane protein. Since the receptor yield from mammalian cells was much lower than in yeast and insect cells, this system was not used for further large-scale receptor production. After production in yeast and insect cells, the ETB receptor was saturated with its ligand, endothelin-1, in order to stabilize its native form. The receptor was subsequently solubilized with n-dodecyl-beta-D-maltoside and subjected to purification on various affinity matrices. Two-step affinity purification via Ni2+-NTA and monomeric avidin proved the most efficient way to purify milligram amounts of the receptor. The purity of the receptor preparation after this procedure was over 95%, as judged from silver stained gels. However, the tendency of the ETB receptor produced in yeast to form aggregates was a constant problem. Attempts were made to stabilize the active, monomeric form of the receptor by testing a variety of different buffer conditions, but further efforts in this direction will be necessary in order to solve the aggregation problem. In contrast to preparations from yeast, the purification of the ETB receptor produced in insect cells yielded homogeneous receptor preparations, as shown by gel filtration analysis. This work has demonstrated that the amounts of receptor expressed in yeast and insect cells and the final yield of receptor, isolated by purification, represent a good basis for beginning 3D and continuing 2D crystallization trials.
Die Verfügbarkeit synthetischer Oligonukleotide hat der Entwicklung einer Vielzahl molekularbiologischer, biochemischer und medizinischer Anwendungen den Weg geebnet. Und sind viele diese Anwendungen für sich genommen schon hochinteressant, so eröffnet die Kombination mehrerer Methoden oft noch ganz neue Möglichkeiten. In der vorliegenden Doktorarbeit ist es gelungen, die Technik der photolabilen Schützung auf die Anwendungen von siRNAs und molecular beacons zu übertragen und diesen damit die Option der orts- und zeitaufgelösten Aktivierung zu ermöglichen. Durch die Einführung eines Nukleotids mit 2-(2-nitrophenyl)propyl-geschützter Nukleobase in eine siRNA, konnte der katalytische Schritt der RNA-Interferenz, die mRNA-Spaltung, unterbunden werden. Hierzu wurde das photolabil modifizierte Nukleotid so in der siRNA positioniert, dass es gegenüber der mRNA-Schnittstelle bzw. in unmittelbarerer Nachbarschaft zu dieser lag. Dabei war das modifizierte Nukleotid selbst kein Ribonukleotid sondern ein Desoxynukleotid. Zuvor konnte gezeigt werden, dass die Einführung einzelner Desoxynukleotide in eine siRNA keinerlei Einfluss auf deren Aktivität hat. Als Modellsystem diente der RFP/eGFP-Reportergenassay, wobei die Plasmide mit der siRNA in die verwendeten HeLa-Zellen kotransfiziert wurden. Die verwendete siRNA regulierte dabei die eGFP-mRNA, die gemessene Fluoreszenz wurde auf die RFP-Fluoreszenz normiert. In der Studie gelang es, ein sauberes „An/Aus-Verhalten“ zu erzielen, das heißt, die modifizierte siRNA zeigte zunächst keinerlei Einfluss auf die eGFP-mRNA. Bestrahlte man diese siRNA jedoch für drei Minuten bei 366 nm, erzielte man eine Unterdrückung der eGFP-Expression, die der einer unmodifizierten siRNA entsprach. Dies funktionierte für vor der Transfektion bestrahlte siRNAs ebenso, wie für solche, die erst nach der Transfektion in der Zelle entschützt wurden. Vereinfachte Darstellung der lichtaktivierbaren RNA Interferenz. Links: solange die Photoschutzgruppe (rot) auf dem Führungsstrang sitzt wird das Substrat des RISC nicht geschnitten. Rechts: Bestrahlung mit UV-Licht entfernt die Photoschutzgruppe und aktiviert die RNAi-Maschinerie. Ein bis jetzt ungeklärtes und noch näher zu untersuchendes Phänomen ist die Stabilität der Modifikationen in der Zelle. Aus bisher nicht eindeutig zu benennender Ursache fand nach einer definierten Zeit eine Aktivierung der ausgeschalteten siRNA statt, ohne dass diese bestrahlt wurde. Versuche mit photolabil modifizierten Nukleotiden an anderen Positionen innerhalb der siRNA, sowie eine Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Studie mit fluoreszenzmarkierter siRNA und fluoreszenzmarkiertem RISC erlaubten es Rückschlüsse auf den Schritt der RNAi zu ziehen, der durch die Einführung der Basenmodifikation blockiert wird. Offenbar handelt es sich tatsächlich um den katalytischen Schritt der mRNA-Spaltung, ein Einbau der modifizierten siRNA in den RISC findet statt. Zudem zeigte die erfolgreiche Inaktivierung der für die FCS-Studie genutzten anti-TK siRNA, dass der Ansatz, die Modifikation im Bereich der Schnittstelle einzubauen, von der anti-eGFP siRNA auf andere siRNAs übertragbar ist. Im zweiten erfolgreichen Projekt gelang es, molecular beacons durch Einführung zahlreicher photolabiler Basenmodifikationen lichtaktivierbar zu machen. Hierzu wurde ein bereits beschriebener GAPDH-molecular beacon verwendet. Modifiziert man die Schleife dieses molecular beacon mit sieben photolabilen Basenschutzgruppen (NPP und NPE) so gelingt es die Bindung desselben an seine komplementäre Ziel-RNA komplett zu unterbinden, während ein GAPDH-beacon mit drei oder fünf Modifikationen noch in verringertem Maße bindungsfähig ist. Dieses Verhalten wurde sowohl mittels einfachen Auslesens der Fluoreszenzintensität, als auch anhand eines PA-Geles belegt. Eine große Herausforderung bei diesem Projekt stellte die Aufreinigung des hochmodifizierten molecular beacon dar, der neben Fluorophor und Quencher auch zahlreiche Photoschutzgruppen trägt. Diese gelang schließlich durch den Einsatz einer extra densely bond-RP-HPLC-Säule und wiederholter HPL-Chromatographie. Ebenfalls konnte der große Vorteil eines lichtaktivierbaren molecular beacon, die Möglichkeit der präzisen Ortsauflösung der Aktivierung, dargestellt werden. Hierzu wurde modellhaft die Ziel-RNA auf einer Objektträgeroberfläche immobilisiert. Die dann aufgetragene molecular beacon-Lösung zeigte zunächst keine Fluoreszenz. Diese trat erst nach Bestrahlung und auch nur begrenzt auf den wenige Quadratmikrometer großen Bestrahlungsbereich auf.
Ein bekanntes Beispiel für regulatorische RNA-Protein-Wechselwirkung stellt der Komplex der TAR-RNA von HIV-1 und dem viralen Protein Tat dar. Dieser Komplex ist wichtig für die effiziente Transkription des viralen Genoms. Essentiell für die Erkennung der Stem-Loop Struktur ist die Wechselwirkung des Tat-Proteins mit dem aus drei Nukleotiden bestehenden Bulge der TAR-RNA. Das Wissen über die Prinzipien der Erkennung von Tat zu TAR-RNA sollte es möglich machen, spezifische Liganden zu designen, die als antivirale Tat Antagonisten angreifen können. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese von RNA Liganden für die Festphasenpeptidsynthese (FPPS) basierend auf heteroaromatischen Bausteinen. Als Strategie wurde gewählt, die heteroaromatischen Reste über Amid-Bindungen an ein Fmoc geschütztes (2-Aminoethyl)glycin-Rückgrat einzufügen. Die peptidomimetischen Bausteine X konnten in der FPPS zur Synthese von Tripeptiden mit der allgemeinen Struktur Arg-X-Arg und Modifikationen mit Lysin eingesetzt werden. Die Bindungsaffinitäten der Tripeptide und kleinen Moleküle zur TAR-RNA von HIV-1 wurden über einen fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Der Assay verwendet ein doppelt endmarkiertes Tat-Peptid mit Fluorescein und Rhodamin als Farbstoff. Durch Verdrängung des Tat-Peptides durch einen konkurrierenden Liganden kommt es zur Konformationsänderung des Peptides, die zur Löschung der Lichtemmission führt. Dabei zeigen die Tripeptide H2N-(D)Arg-Lactam-(D)Arg-CONH2 (154) und H2N-(D)Arg-Amidin-(D)Arg-CONH2 (158) IC50-Werte von 2-3 mikroM, die auch durch Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) bestätigt wurden. In massenspektrometrischen Untersuchungen von 158 bzw. Tat-Protein mit TAR-RNA konnten bei beiden Peptiden 1:1 und 1:2-Komplexe beobachtet werden. 158 zeigt antivirale Eigenschaften (IC50 = 10-50 mikroM) in HeLa P4-Zellassays. Durch NMR-Untersuchungen und molekulardynamische Berechnungen war es möglich, eine Konformationsänderung der TAR-RNA durch eine Wechselwirkung mit Guanidinium-Gruppen festzustellen. Ein weiteres Ziel der Arbeit war daher ausgehend von den gewonnenen Daten die Untersuchung des Bindungskonzeptes von Diaminopyrazolen und Indazolen. Diaminopyrazole mit kleinen Resten und Triaminopyrazol übertreffen im protonierten Zustand den dikationischen Liganden Argininamid. In Übereinstimmung mit dem Bindungsmodell verhalten sich protonierte Aminopyrazole wie „Super-Guanidine“ hinsichtlich der TAR-RNA. Das Einfügen des Triaminopyrazols in ein Phenazin-Grundgerüst führt zu Verbindungen, die im protonierten und reduzierten Zustand zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können und nicht planar, aber lipophil sind. Der Austausch von Stickstoff zu Sauerstoff im Phenazinring sollte den reduzierten Zustand stabilisieren. Die resultierende Struktur ist jedoch zersetzlich, so dass auf weitere Untersuchungen verzichtet wurde.
Hsp90 ist ein äußerst vielseitiges Protein, welches nicht strikt cytosolisch anzusiedeln ist. Es besitzt eine Vielzahl von Partnerproteinen zu denen stetig neue hinzukommen und deren Interaktionen längst nicht alle hinreichend untersucht und verstanden wurden. Worin der Unterschied in der Funktionalität von Hsp90 in Eukaryoten und HtpG in Prokaryoten besteht, das Hsp90 für Eukaryoten (auch einzellige) derart essentiell werden lässt, ist absolut unklar. Ein möglicher Grund könnte die Beteiligung von Hsp90 an Transportprozessen in und um den Zellkern darstellen. Der Einfluss von Hsp90 auf den Export von 60S rUE aus dem Zellkern konnte manifestiert werden. Die Einwirkung Hsp90 spezifischer Inhibitoren wie Geldanamycin, Radicicol und Novobiocin zeigten deutliche Effekte in den Transportmessungen sowohl in vitro als auch in vivo. Durch Coinjektionen von Novobiocin und Radicicol in die Oocyten von Xenopus laevis ließ sich der Export von 125J markierten 60S rUE aus dem Zellkern gegenüber den Kontrollen deutlich reduzieren. Damit konnte der mittel- oder unmittelbare Zusammenhang zwischen Hsp90 und dem Export von 60S rUE in vivo erneut bewiesen werden. Hsp90 besitzt mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen für die Casein Kinase II. Untersuchungen zeigten, dass die Phosphorylierung von Hsp90 den Effekt auf den in vitro Export von 60S rUE aufzuheben vermag. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII könnte somit eine potentielle Regulationsmöglichkeit von Hsp90 darstellen. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII ließ sich durch die Zugabe von Radicicol deutlich reduzieren. Es ist durchaus möglich, dass die potentielle Phosphorylierungsstelle im Bereich der Bindungsstelle von Radicicol am N-Terminus von Hsp90 zu suchen ist, da auch die Phosphorylierung des N-terminalen Fragments über Radicicol beeinflusst werden konnte. Über Quervernetzungsversuche zwischen Hsp90 und isolierten Zellkernen, konnten Proteine der Kernmembran spezifisch markiert werden. Aufgrund der äußerst geringen Proteinausbeute war eine Analyse sehr schwierig. Lediglich eine Proteinbande konnte schließlich partiell N-terminal ansequenziert werden. Die ermittelten Sequenzen deuten auf ein zu scNup57p homologes Protein der Ratte hin, welches bisher jedoch noch nicht über eine der Proteindatenbanken ermittelbar ist. Transmissionselektronenmikrokopische Aufnahmen von isolierten Rattenleberzellkernen, welche mit einem Anti-Hsp90 Antikörper inkubiert wurden, konnten zeigen, dass Hsp90 neben Komponenten im Bereich des Kernporenkomplex auch an Bestandteile im Nukleoplasma bindet. Da aufgrund der in vitro Messungen bisher ein rein cytosolische Effekt von Hsp90 in Bezug auf den Export von 60S rUE vermutet wurde, könnte dieser Befund nahe legen, dass die Einflussnahme von Hsp90 auf den Transport von 60S rUE wesentlich früher bereits im Nukleoplasma oder in den Nukleoli einsetzen könnte. Wenn dies der Fall ist, könnte Hsp90 auch im Zusammenhang mit den ribosomalen Untereinheiten eine Begleiterfunktion zukommen, welche den Transport vom Ort der Biosynthese bis an die spätere Wirkungsstätte unter Aufrechterhaltung der Funktion gewährleistet. Hierfür könnte auch sprechen, dass Hsp90 mit den 60S rUE interagiert, wie es in Copräzipitationsversuchen gezeigt wurde. Zudem konnte Hsp90 gezielt über proteinäre Bestandteile im Transport befindlicher 60S rUE radioaktiv markiert werden. Es spricht demnach vieles dafür, dass Hsp90 unmittelbar in den Transportprozess der großen ribosomalen Untereinheiten eingreift, und hierbei der Effekt nicht lediglich in der Unterstützung bei der Translokation zu suchen wäre, sondern eventuell schon sehr viel früher im inneren des Nukleoplasmas.