Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Rotary adenosine triphosphate (ATP)ases are ubiquitous, membrane-bound enzyme complexes involved in biological energy conversion. The first subtype, the so-called F1Fo ATP synthase, predominantly functions as an ATP synthesizing machinery in most bacteria, mitochondria and chloroplasts. The vacuolar subtype of enzyme, the V1Vo ATPase, operates as an ATP driven ion pump in eukaryotic membranes. The subtype found in archaea and some bacteria is called A1Ao ATP (synth)ase and is capable of working in both directions either to synthesize ATP or to generate an ion motive force by consuming the same.
All the three above-mentioned subtypes of rotary ATPases work as nanomolecular machines sharing a conserved mechanism to perform the energy conservation process. The simplest form of these enzymes is the bacterial F1Fo ATP synthase. Here, ions are channelled via the membrane stator subunit a to the rotor ring of the enzyme. After almost a complete rotation of the ring the ions are released again on the other side of the membrane. This rotation is further transmitted via the central stalk to the soluble part of the enzyme, the F1-complex, where conformational changes within the nucleotide binding sites result in the synthesis of ATP from ADP and Pi.
The rotor or c-ring of the enzyme is the key protein complex in mediating transmembrane ion translocation. Several structural and biochemical methods have been applied in the past years to study the rotor rings from many different organisms. The results revealed that the stoichiometry of a c-ring of a given species is constant while it can vary between different species within a range of 8 to 15 c subunits. The c-ring stoichiometry determines directly the number of ions transported through Fo per rotation whereby three molecules of ATP are concurrently synthesized in the water-soluble F1 headgroup. Hence the number of c subunits has an important influence on the bioenergetics of the corresponding enzyme and thus the entire organism.
The c-ring of a rotary ATPase is able to specifically bind either protons (H+) or sodium ions (Na+) as the coupling ion for the enzyme. Several structures are already available revealing the coordination network of both types of rotor rings. In each case ion binding includes a highly-conserved carboxylic acid residue (glutamate or aspartate), in addition to a more varying combination of amino acid residues, whereby Na+ coordination is structurally more demanding than H+ binding.
In the first part of my PhD thesis, I aimed to characterize the F1Fo ATP synthase rotor ring of the opportunistic pathogenic bacterium Fusobacterium nucleatum on a functional and structural level. F. nucleatum is an anaerobic bacterium which uses peptides and amino acids as a primary energy source. It is one of the most frequently occuring bacteria in human body infections and involved in human periodontal diseases.
The protein complex was heterologously expressed within a hybrid ATP synthase in Escherichia coli and purified without an affinity tag for further analysis. Two high resolution X-ray structures of the c-ring were solved at low (5.3) and high (8.7) pH to 2.2 and 2.64 Å, respectively. In both structures, the conserved glutamate is in an ion-locked conformation, revealing that the conformational state of the ion binding carboxylate is not depending on the pH of the crystallization condition, which is in good agreement with previous structural and biochemical studies of other c-rings.
A Na+ ion is present within the c-ring binding site and directly coordinated by four amino acid residues and a structural water molecule. Remarkably, the Na+ is bound by two glutamate residues instead of one as is the case in the I. tartaricus Na+ binding c-ring, of which the first high resolution X-ray structure of a c-ring has been solved in 2005. Thus, a new type of Na+ coordination in an ATP synthase rotor ring with a two-carboxylate ion binding motif is described here, which also occurs in other bacteria, including several pathogens. Na+ specificity of the investigated c-ring was further confirmed by a competitive biochemical labeling reaction performed with a fluorescent ATP synthase inhibitor molecule (N-cyclohexyl-N`-[4(dimethylamino)-α-naphtyl] carbodiimide, NCD-4).
We furthermore complemented our functional and structural data of the F. nucleatum c-ring by computational studies to explore the ion translocation mechanism of this enzyme in more details. We therefore analyzed the protonation state of the second, additional glutamate in the ion binding site. Molecular dynamics (MD) simulations and free-energy calculations indicated that this glutamate is constitutively protonated, in the ion-locked as well as in a simulated, more hydrated open-conformation of the ion binding glutamate as when it is travelling through the a/c-ring interface upon c-ring rotation.
Structural analysis of the enzyme N-formylmethanofuran:tetrahydromethanopterin formyltransferase
(2008)
Archaea represent a third domain of life and some archaea exhibit a high degree of tolerance to extreme environmental conditions. Several members are methanogens and present in many anaerobic environments. Most methanogens are able to maintain growth simply on H2 and CO2 via the enzymatically catalyzed reaction 4H2 + CO2 > CH4 + 2 H2O. The archaeon Methanopyrus kandleri grows optimally at temperatures of 84°C to 110°C, pH values of 5.5 to 7.0 and NaCl concentrations 0.2% to 4%. The enzyme N-formylmethanofuran tetrahydromethanopterin formyltransferase (MkFTR) catalyzes the transfer of a formyl group from the cofactor N-formylmethanofuran (FMF) to the cofactor tetrahydromethanopterin (H4MPT), the second step of the above reaction. X-ray crystallographic analysis yielded insights into the structure and function of MkFTR, (1) the MkFTR monomer exhibits a pseudo-two fold structure suggestive of an evolutionary gene duplication. (2) The structure is a D2 homo-tetramer with prominent cleft-like surface features. Analysis of the interface contacts showed that the tetramer is best described as a dimer of dimers. The clefts were associated with the monomer:monomer interface and were weakly occupied by extra electron density which might be attributed to the H4MPT analog folate. (3) This suggested that the clefts are active sites and their association with oligomer interfaces suggested a basis for the dependence of activity on oligomerization. (4) The thermal stability of MkFTR most likely arises from the greater number of H- and ionic-bonds within the monomer and between monomers with respect to mesophilic protein structures. (5) The structure showed a large number of surface exposed negatively charged, glutamate and aspartate residues. These residues explain the salt dependent oligomerization, as only at high enough salt concentration is the electrostatic charge compensated by cation binding and neutralized allowing oligomerization. (6) These residues also improve the solubility of MkFTR at high salt concentration by increased charge repulsion. (7) Comparison of MkFTR structures from low and hight salt conditions showed that surface glutamate residues bind slightly more water molecules at high salt conditions further contributing to MkFTR solubility at high salt concentration.
Die Cytochrom c Oxidase von Paracoccus denitrificans katalysiert die Reduktion von Sauerstoff zu Wasser und „pumpt“ zusätzlich vier Protonen von der cytoplasmatischen Seite auf die periplasmatische Seite der Cytoplasmamembran. Die Spaltung des molekularen Sauerstoffes im binuklearen Zentrum erfolgt im katalytischen Zyklus des Enzyms bei der Umwandlung des Intermediates A, in welchem molekularer Sauerstoff an das Häm a3 Eisen gebunden ist, in das Intermediat PM durch spontane elektronische Umorganisation. Drei der dazu benötigten vier Elektronen werden von den Metallzentren geliefert. Das vierte Elektron wird sehr wahrscheinlich von einer Aminosäure in der Nähe des binuklearen Zentrums durch Bildung eines Aminosäureradikals beigesteuert. Dieses Radikal sollte in den Intermediaten PM und F• des katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase vorhanden sein. Durch Reaktion von stöchiometrischen Mengen an Wasserstoffperoxid mit dem vollständig oxidierten Enzym lassen sich PM; F• und F-Intermediate künstlich erzeugen und durch ihre Maxima in Absorptionsdifferenzspektren charakterisieren. Mit paramagnetischer Elektronenresonanzspektroskopie (EPR-Spektroskopie) können Struktur und Dynamik paramagnetischer Zentren in Proteinmolekülen untersucht werden. Mit dieser Methode konnte in mit Wasserstoffperoxid generierten PM und F•-Intermediaten ein Tyrosinradikal nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Identifikation dieses Tyrosins mittels einer Mutagenesestudie. Dazu wurden Tyrosinvarianten (Y35F, Y167F, Y267F, Y280H, Y328F und Y414F) aus Untereinheit I, die einen maximalen Abstand von 25 Angström vom binuklearen Zentrum aufweisen, mit Hilfe von Absorptions- und EPR-Spektroskopie charakterisiert. Auf diese Weise konnte nachgewiesen werden, dass Tyrosin 167 eindeutig der Ursprungsort des Tyrosinradikals ist, das bei der Generierung von PM- und F•-Intermediaten der Cytochrom c Oxidase mit Wasserstoffperoxid entsteht. Da die Variante Y167F jedoch eine hohe katalytische Aktivität aufwies und in der Lage war, die Oxoferrylintermediate PM; F• und F zu bilden, konnte gleichzeitig gezeigt werden, dass dieses Tyrosin nicht der primäre Donor des vierten Elektrons sein kann, das im katalytischen Zyklus des Enzyms für die Spaltung der Sauerstoffbindung benötigt wird. Diese Ergebnisse wurden dahingehend interpretiert, dass Tyrosin 167 eine thermodynamische Senke darstellt, in die das von einem unbekannten kurzlebigen Elektronendonor bei der Wasserstoffperoxidreaktion gebildete Radikal verschoben wird. Als Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung kommt auch Tryptophan 272 infrage. Daher wurde auch die Variante W272M spektroskopisch charakterisiert. Diese Variante war katalytisch inaktiv und nicht in der Lage in Reaktion mit Wasserstoffperoxid die Intermediate PM, F• und F zu bilden. Es ließen sich weder das Tyrosin-167-Radikal noch ein anderes Radikal nachweisen. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Tryptophan 272 möglicherweise der ursprüngliche Donor des vierten Elektrons für die Sauerstoffspaltung im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase sein könnte. Während des PM zu F-Übergangs im katalytischen Zyklus der Cytochrom c Oxidase werden zwei Protonen gepumpt. Diese können vom Enzym entweder über den D-Weg oder den K-Weg aufgenommen werden. Eine Untersuchung des PM zu F-Übergangs von D-Weg- und K-Weg-Varianten der Cytochrom c Oxidase kann Aufschluss über die Beteiligung der beiden Protonenaufnahmewege des Enzyms an diesem Schritt des katalytischen Zyklus geben. Daher wurde die Reaktion der D-Weg Varianten D124N, N131D, Y35F und E278Q und der K-Weg Variante K354M mit Wasserstoffperoxid absorptionsspektroskopisch untersucht. Durch diese Experimente konnte die zentrale Bedeutung des D-Weges für die Protonentranslokation im PM zu F-Übergangs bestätigt, aber auch ein gewisser Einfluss des K-Weges nicht ausgeschlossen werden. Außerdem wurde der PM zu F-Übergang der Variante R437N, die eventuell Teil des noch nicht konkret identifizierten Protonenaustrittsweg der Cytochrom c Oxidase ist, untersucht.
Periplasmic Sud protein encoded by the Wolinella succinogenes catalyses the transfer of bound polysulfide-sulfur to the active site of the membrane bound polysulfide reductase. The homodimeric protein consists of 131 residues per monomer, each with one cysteine residue in the active site. Polysulfide-sulfur is covalently bound to the catalytic Cys residues of the Sud protein. In order to understand the structure-function relationship of this protein, the features of its solution structure determined by heteronuclear multidimensional NMR techniques are reported here. The first step of structure determination leads to resonance assignments using 15N/13C/2H- and 15N/13C-labeled protein. The sequential backbone and side chain resonance assignments have been successfully completed. Structure calculations were carried out using the ARIA program package. The structure is based on 2688 NOE-derived distance restraints, 68 backbone hydrogen bond restraints derived from 34 slow-exchanging backbone amide protons and 334 torsion angle restraints obtained from the TALOS program as well as 158 residual dipolar coupling restraints for the refinement of relative vector orientations. The three-dimensional structure of the Sud protein was determined with an averaged rootmean- square deviation of 0.72 Å and 1.28 Å for the backbone and heavy atoms, respectively, excluding the terminal residues. Without the poorly defined segment between residues 90-94 the average r.m.s.d. value drops down to 0.6 Å and 1.14 Å. The ensemble refined with residual dipolar coupling (rdc) restraints shows good convergence. The r.m.s.d. value for the backbone heavy atoms, excluding residues 90- 94, drops down from 0.97 to 0.66 for the rdc-refined ensemble. The relative orientation of the two monomers in the protein structures refined with residual dipolar coupling restraints are also different from those without residual dipolar coupling restraints. The structure determination of the dimeric protein has been hampered by the high molecular mass (30 kDa), severe peak degeneracy, and by the small number of experimental intermonomer NOEs (relative orientation problem of two monomers). For the resonance assignments of aliphatic side chain, many resonances were ambiguously assigned because of severe overlap of signals. The Sud dimer protein contains 17 Lys, 14 Leu and one His tag for each monomer. It complicated the resonance assignments. The conventional 3D 15N-separated TOCSY HSQC experiment failed because of the large molecular weight which results in line broadening and hence made the resonance assignments of side chains more difficult. The determined structure contains a five-stranded parallel ß-sheet enclosing a hydrophobic core, a two-stranded anti-parallel ß-sheet and seven a-helices. The dimer structure is stabilized predominantly by hydrophobic residues. Sud catalyses the transfer of the polysulfide-sulfur to cyanide, similar to rhodanese encoded by Azotobacter vinelandii (Bordo et al., 2000). The two proteins are similar in the active site environment primarily owing to the main-chain conformation of the active-site loop with the cysteine residue and with respect to the surrounding positively charged residues. The active-site loop (residues 89-95) in the Sud protein appears to be flexible, reflected by few assigned proton resonances of residues 90-94 in the active site. Despite their similarity in function and their similar structure in active site, the amino acid sequences and the folds of the two proteins are remarkably different. The negatively charged polysulfide interacts with positively charged R46, R67, and R94 and hence may be stabilized in structure. The mutation of one of the three arginines that are also conserved in rhodanese from A. vinelandii leads to a loss of sulfur-transfer activity. The polysulfide chain extends from inside of Sud protein to outside, where Sud may form contacts with polysulfide reductase. These contacts provide the possible polysulfide-sulfur transfer from Sud protein to the active site of polysulfide reductase.
In the recent years, high-resolution conditions have been established in solid-state NMR by the combination of magic angle spinning, state-of-the-art r.f. pulse schemes and the introduction of ultra-high magnetic fields. Similar to what is now routine in solution-state NMR, this has opened the way for structure determination by HR-SSNMR methods. Complete structural or dynamical characterization of the biomolecule of interest is most easily achieved if multiple or even uniformly [13C, 15N]-labeled versions are studied. In a first step, experiments that allow the complete assignment of the 13C and 15N resonances have been recently designed. To date, nearly complete chemical shift assignments were reported for two well-ordered proteins, the ±-spectrin SH3 domain and the Crh protein. The SSNMR analysis of the later protein has been presented in Section 4.1. For SSNMR applications, not the molecular size or solubility, but the spectral resolution can be of crucial importance. Experimental parameters and sample inherent conditions such molecular disorder may reduce the overall spectral dispersion. In these circumstances, techniques that allow for spectral simplification without the need of elaborated biochemical procedures (of isotopelabeling) are of special importance. In Section 2, several spectral editing methods have been proposed. These methods not only select resonances due to changesin the physical and chemical environment of the nucleus but they can also directly probe molecular properties such as dynamics and conformational heterogeneity. Once the chemical shifts are available for the biomolecule of interest, methods that permit to obtain structural restraints can be applied. In the case of multiply isotope labeled proteins, such techniques can in principle result in multiple structural parameters. In Section 3.1, we have shown that, similar to solution-state NMR, secondary chemical shifts can be readily employed to study the local backbone conformation. Inaddition, distance constraints between protons may be encoded in high-resolution on rare spins like 13C and 15N and measured. Finally, carbon-carbon constraints may be probed by employing frequency selective r.f. pulse schemes. These dihedral and distance constraints may subsequently lead to the determination of protein secondary to tertiary structure from a single protein sample. In Section 4.2,we have shown that high-affinity ligand binding to membrane proteins can be investigated with solid-state NMR. Here, the neuropeptide neurotensin which binds to the Gprotein coupled receptor NTS1 in sub-nanomolar affinity was investigated.Except for the case of rhodopsin, there is currently no information on the high-resolution structure of any other GPCR or a corresponding high-affinity ligand.Our SSNMR results identify, for the first time, a distinct binding mode of neurotensin that could be of considerable relevance for further pharmacological studies. As exemplified in section 4.3, HR-SSNMR based structural studies can also assist in refining existing (X-ray or solution-state NMR) membrane-protein structures. The presented results provide, for the first time, direct experimental evidence for a double occupancy of the Q0 binding site in the ubiquinone-bc1 complex and may provide the basis for the complete 3D structural determination of the ubiquinone binding pocket. Advancements regarding sample preparation (for example, including modular labeling, in vitro expression and intein technology) and improvements in NMR hardware instrumentation could open up new areas of solid-state NMR research such as the investigation of large protein-protein complexes or the complete 3D characterization of larger membrane proteins. Solid-state NMR studies of multiply-labeled biomolecules will furthermore profit from improved procedures for calculating 3D structures, in particular in the presence of ambiguousor a limited number of structural constraints. Unlike X-ray crystallography, protein motion does not hinder solid-state NMR methods. In fact, complementary to solution-state NMR, it may provide a very efficient means to study protein folding, flexibility and function under biologically relevant conditions. Hand in hand with solution-state techniques and crystallographic methods, solid-state NMR could provide insight into protein function and the chemistry of life with unprecedented accuracy and flexibility.
Die Gentherapie bietet eine interessante alternative Behandlungsoption bei der Therapie der HIV-Infektion und könnte langfristig die Standardmedikation mit antiretroviralen Substanzen ergänzen oder ersetzen. Antivirale Genprodukte, die frühe Schritte im HIV-Replikationszyklus hemmen, bevor sich das Virus in das Genom der Zielzelle integriert hat, sind dabei besonders vielversprechend. Hierzu zählen insbesondere die von der C-terminalen heptad repeat Region des HIV-Hüllglykoproteins gp41 abgeleiteten C-Peptide, die hochwirksame Inhibitoren des Viruseintritts sind. Während des HIV-Eintrittsprozesses interagieren sie mit den viralen gp41 N-Helices und verhindern somit die Ausbildung des zur Fusion von viraler und zellulärer Membran erforderlichen Sechs-Helix-Bündels. Die Sekretion antiretroviraler C-Peptide durch genmodifizierte T-Lymphozyten in vivo birgt großes therapeutisches Potential: Nach Freisetzung in den extrazellulären Raum können die Peptide nicht nur genmodifizierte sondern auch unbehandelte Nachbarzellen vor HIV-Infektion schützen (Bystander-Effekt). Somit könnte selbst mit den heute zur Verfügung stehenden Methoden, mit denen lediglich ein Teil aller potentiellen HIV-Zielzellen modifiziert werden kann, die Virusreplikation effektiv unterdrückt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden daher C-Peptid-basierte in vivo sezernierte antivirale Eintrittsinhibitoren (iSAVE) für die HIV-Gentherapie entwickelt. Kurze Peptide, wie die antiviralen C-Peptide, werden von eukaryotischen Zellen aufgrund von Größenbeschränkungen beim Eintritt in den Sekretionsweg jedoch nur schlecht sezerniert. Um die effiziente Sekretion von iSAVE-Peptiden durch genmodifizierte humane Zellen zu erreichen, wurde das C-Peptid daher verlängert. Hierbei wurde das therapeutische Peptid einerseits um nicht antiviral aktive Gerüstelemente ergänzt. Andererseits wurden Concatemer-Konstrukte generiert, in denen zwei C-Peptide jeweils über einen flexiblen oder proteolytisch spaltbaren Linker verbunden sind. Die unterschiedlichen iSAVE-Peptid-Varianten wurden in vitro in transfizierten und transduzierten Zelllinien und in primären humanen T-Lymphozyten charakterisiert. Hierbei wurden Sekretionseffizienz und Prozessierung sowie antivirale Aktivität und Bystander-Inhibition der sezernierten Peptide untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Effizienz der C-Peptidsekretion stark mit der Peptidlänge korreliert, so dass durch Sequenzverlängerungen die Sekretion deutlich gesteigert werden konnte. Darüber hinaus waren N-Glykane für die effiziente Sekretion der C-Peptide unerlässlich. Die antiretrovirale Aktivität hingegen reduzierte sich mit zunehmender Peptidlänge dramatisch und wurde auch durch N-Glykane leicht beeinträchtigt, so dass weder die durch Gerüstelemente verlängerten C-Peptide, noch die ungespaltenen C-Peptid-Concatemere antiretrovirale Wirkung zeigten. Durch die Generierung proteolytisch spaltbarer C-Peptid-Concatemere konnten die strukturellen Erfordernisse für effiziente Sekretion mit hoher inhibitorischer Aktivität vereinbart werden. Die Prozessierung der Concatemere durch die Proprotein-Convertase Furin war allerdings nicht einfach zu erreichen. Nur das Einfügen eines flexiblen Linkers mit optimierter Furinerkennungssequenz zwischen den beiden C-Peptiden erlaubte die effiziente Spaltung in monomere Peptide mit hoher antiretroviraler Aktivität. Therapeutisch wirksame Peptidkonzentrationen dieser optimierten iSAVE-Peptide wurden sowohl von transfizierten und transduzierten Zelllinien als auch von primären humanen T-Zellen sezerniert. Nach Freisetzung in den extrazellulären Raum konnten die Peptide nicht nur genmodifizierte sondern auch unbehandelte Nachbarzellen in vitro vor HIV-1 Eintritt und Infektion schützen. Die generierten iSAVE-Peptide bilden damit eine hervorragende Grundlage für die weitere präklinische und klinische Entwicklung eines neuen Gentherapieansatzes zur Behandlung der HIV-Infektion.
Screening und Charakterisierung von Peptidliganden für den BCR-ABL mRNA Translokationsbereich
(2005)
Die reziproke Translokation t(9;22) ist in 95% der chronischen myeloischen Leukämie vorhanden. Bei der Translokation entsteht ein Fusionsprotein BCR-ABL, welches ausreichend für die Entstehung von Leukämien ist. 30% aller akuten lymphatischen Leukämien sind ebenfalls positiv für diese Translokation. Durch die Translokation entsteht am Translokationsbruchpunkt eine einzigartige RNA-Sequenz, welche als Ziel für eine RNA-Liganden Suche dienen kann. Ziel dieser Arbeit war es, Peptidliganden zu finden, welche die BCR-ABL mRNA binden können. Zunächst wurde die bcr-abl mRNA nach Sekundärstruktur-Elementen durchsucht, welche als Interaktionspartner mit Peptiden in Fragen kommen. Hierzu wurde die BCR-ABL mRNA durch das MFold-Programm von Zuker analysiert. Durch die Auswertung der errechneten Diagramme für die thermodynamische Stabilität und die kinetische Prävelanz der Basenpaarinteraktion, wurden zehn verschiedene BCR-ABL mRNA-Bereiche ausgewählt, welche die Möglichkeit besitzen, sich in stabile Sekundärstruktur-Elemente zu falten. Um diese strukturellen Gegebenheiten am BCR-ABL Translokationsbruchpunkt b2a2 im Experiment zu überprüfen, wurden in Kooperation mit Prof. Göbel und Dr. Scheffer RNase-Mapping und Mapping mit einer künstlichen Nuklease durchgeführt. Es konnte im Experiment das Vorhandensein einer Sekundärstruktur nachgewiesen werden. Diese Struktur wird aus einem Stamm mit einer Fehlpaarung, einem asymmetrischen internen Loop, einem weiteren Stamm und durch einen Loop definiert. Gegen diese b2a2-Struktur und gegen neun weitere mRNA-Bereiche wurde eine Phage-Display-Selektion durchgeführt, welche zum Ziel hat, Peptide zu gewinnen, welche die entsprechende RNA-Struktur spezifisch binden können. Nach der Sequenzierung der Phagen, konnten insgesamt 14 verschiedene Peptid-Sequenzen für die zehn unterschiedlichen RNA-Bereiche gefunden werden, welche die Möglichkeit besitzen, mit der jeweiligen Ziel-RNA zu interagieren. Die Phagen-RNA Interaktion wurde durch Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie ermittelt. Bei dieser Meßmethode werden Diffusionszeiten von markierten Molekülen in Lösung bestimmt. Zwei von den 14 Phagen-Präsentierten-Peptiden zeigen eine Interaktion mit der Ziel RNA. Die gefundenen Peptide besitzen die folgenden AS-Sequenz: das Peptid 12, KHLHLHK und das Peptid 14, NPEKVKMLYVEF. Die Interaktion mit der RNA wurde in nicht kompetitiven und in kompetitiven FCS Experimenten gezeigt. Kompetiert wurde die Phagen-RNA Interaktion mit kompetitor RNA und in einem weiteren Experiment mit den synthetisierten Peptiden. Beide Peptide zeigten im FCS eine Interaktion mit dem b2a2 BCR-ABL Translokationsbruchpunkt. Die kD-Werte der Peptid-RNA Interaktion wurde durch CDTitration ermittelt. Peptid 12 bindet die b2a2-RNA mit einem kD-Wert von 42 μM und Peptid 14 bindet diese RNA mit einem kD-Wert von 52 μM. Durch die CD-Titration wurde auch der Interaktionsort der beiden Peptide mit der b2a2-RNA ermittelt. Ausgehend von unserem b2a2-Strukturmodell, wurden RNA-Mutanten generiert und in Gegenwart von den Peptiden CD-Spektrometrisch untersucht. Die Interaktion von Peptid 12 mit der RNA findet am Loop und am oberen Stamm statt. Das längere Peptid 14 benötigt alle b2a2-RNA Strukturmerkmale, außer dem unteren Stamm, zur Interaktion. Der Einfluß der Peptide auf die Translation wurde durch ein In-vitro-Translationssystem ermittelt. Demnach bindet Peptid 14 an die b2a2-RNA-Struktur und verringert auf diese Weise die Translation. Peptid 12 bindet zwar ebenfalls an die b2a2-RNA, jedoch konnte eine Verringerung der Translation bei diesem Peptid nicht beobachtet werden.
Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most common malignant tumor and third leading cause of cancer-related death worldwide. Most cases arise as a consequence of underlying liver disease, e.g. developed from chronic hepatitis B or C infectionsalcohol abuse or obesity, and are most often associated with liver cirrhosis. Hypoxiand the hypoxia inducible factors (HIF)-1α and -2α promote tumor progression of HCC, not only affecting tumor cell proliferation and invasion, but also angiogenesis and lymphangiogenesis and thus, increasing the risk of metastasis.
HCC is characterized as one of the most vascularized solid tumors. While HIF-1α and HIF-2α are frequently up-regulated in HCC only HIF-2α is correlated with high patientlethality. HIF-dependent regulation of HCC angiogenesis is controversially discussed.VEGFA, for example, as the most prominent factor inducing tumor angiogenesis represents not only a HIF-1 target, but also a HIF-2 target gene in HCC. This questions whether both isoforms have overlapping functions in regulating the angiogenic switch in HCC.
Besides angiogenesis also tumor-associated lymphangiogenesis significantly influences patient survival in HCC. Lymphatic spread is an important clinical determinant for the prognosis of HCC, but little is known how lymphangiogenesis is controlled in this context. To date, mainly HIF-1α was positively correlated with olymphatic invasion and metastasis in HCC, while a defined role of HIF-2α is missing. Thus, although HIF-1α and HIF-2α are structurally alike and regulate overlapping but not identical sets of target genes, they promote highly divergent outcomes in cancer progression and may even have counteracting roles. The aim of my work was to characterize the specific role of HIF-1α and HIF-2α in the angiogenic switch and lymphangiogenesis induction during HCC development.
Therefore, I created a stable knockdown of HIF-1α and HIF-2α in HepG2 cells and generated cocultures of HepG2 spheroids and embryonic bodies derived from embryonic mouse stem cells as an in vitro tumor model mimicking the cancer microenvironment to analyze which HIF isoform has key regulatory functions in HCC (lymph)angiogenesis. In cocultures with a HIF-2α knockdown angiogenesis was attenuated but lymphangiogenesis increased, while the knockdown of HIF-1α was without effect. Microarray analysis identified plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1)and insulin-like growth factor binding protein 1 (IGFBP1) as HIF-2 target genes.However, prominent angiogenic and lymphangiogenic factors such as VEGFs, PDGFB, ANG and their receptors were not regulated in a HIF-dependent manner. As PAI-1 was linked to angiogenesis in literature and IGF-signaling, which is negatively regulated by IGFBP-1, was correlated with lymphangiogenesis, I decided to investigate their HIF-2α-dependent influence on HCC (lymph)angiogenesis. The knockdown of PAI-1 in HepG2 cells also lowered angiogenesis in PAI-1k/d cocultures similar to the HIF-2α k/d phenotype. PAI-1 as the potent inhibitor of tPA and uPA, both inducing the conversion of plasminogen to plasmin, also inhibits plasmin directly. Therefore, I assumed an increase of plasmin in HIF-2α k/d and PAI-1 k/d cocultures as a result of the reduced PAI-1 levels. Blocking plasmin with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored angioge nesis, suggesting that HIF-2α increases PAI-1 to lower concentrations of active plasmin, thereby supporting angiogenesis. In further experiments I could exclude PAI-1 to reduce angiogenesis by inducing plasmin-mediated apoptosis of differentiating stem cells in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, but demonstrated an increase of VEGFA165 degradation in these cocultures, suggesting plasmin-catalyzed proteolysis of VEGF as an additional layer of regulation required to explain the angiogenic phenotype. Besides the pivotal role of PAI-1 in angiogenesis I also investigated its potentialinfluence in lymphangiogenesis. Indeed, the knockdown of PAI-1 reduced lymphaticstructures and implied an important but opposing role in lymphangiogenesis comparedto induced lymphangiogenesis in HIF-2α k/d cocultures. However, blocking plasmin again with aprotinin in HIF-2α k/d cocultures restored lymphangiogenesis to the level of control virus, which indicates a divergent lymphangiogenic role of plasmin in PAI-1 k/d and HIF-2α k/d cocultures, possibly because of other essential pathways masking the lymphangiogenic effects of PAI-1 in HIF-2α k/d cocultures.
HIF-2α resulting in reduced IGFBP1 expression induced the differentiation of stem cells toward a lymphatic cell type and significantly enhanced the assembly of human dermal lymphatic endothelial cells into tubes. These data point the first time to an important impact of HIF-2 in the regulatin of lymphangiogenesis in vitro by inducing IGFBP1 and thus, scavenging IGF-1. Furthermore, matrigel plug assays to investigate the in vivorelevance of these observations confirmed HIF-2α as a crucial factor in the regulation of lymphangiogenesis in vivo
In conclusion, this work provides evidence that HIF-2α is a key regulator of angiogenesis and lymphangiogenesis in HCC by regulating PAI-1 and IGFBP1. HIF-2α positively influences the angiogenic switch via PAI-1 and negatively affects lymphangiogenesis via IGFBP1 expression. Targeting HIF-2α in HCC to reduce tumor angiogenesis should be approached carefully, as it might be overcome by induced lymphangiogenesis and metastasis.
Life and biological resilience rely on the execution of precise gene expression profiles. A key mechanism to ensure cellular homeostasis is the regulation of protein synthesis. Recent studies have unveiled an intrinsic regulatory capacity of ribosomes, previously considered mere executors of mRNA translation. Neurons in particular finely regulate protein synthesis, at both global and local levels. This sustains their complex morphology and allows them to rapidly transmit, integrate, and respond to external stimuli. In this thesis, I investigated the neuronal ribosome and how subcellular environments and physiological perturbations shape it, by profiling its molecular composition, functional interconnections, and cellular distribution.
First, I used genetic engineering, biochemical purification, and mass spectrometry, to characterize in an unbiased manner the translation machinery specifically from excitatory and inhibitory neurons of the mouse cortex. I found that neuronal ribosomes commonly interact with RNA-binding proteins, components of the cytoskeleton, and proteins associated with the endoplasmic reticulum and vesicles. In line with the requirement for local protein synthesis in the distal parts of neurons, we observed that neuronal ribosomes preferentially interact with proteins involved in cellular transport. Remarkably, I observed a strong association between ribosomes and pre-synaptic vesicles, which suggests a potential regulatory interaction between local translation and neuronal activity.
Intriguingly, I and others have observed mRNAs encoding for core ribosomal proteins (RPs) among the genes most enriched in neuronal processes. This observation challenges two historical assumptions of ribosome biology: (1) new RPs are incorporated only into newly forming ribosomes, and (2) this incorporation occurs only in the nucleus and perinuclear region. In my PhD, I aimed to directly test these two assumptions and if proven wrong ask whether and why neurons would localize RP mRNAs far from their known assembly site.
Employing a combination of metabolic labeling and highly sensitive mass spectrometry techniques, I discovered that a subset of RPs rapidly and dynamically binds on and off mature ribosomes. Strikingly, this incorporation does not depend on the supply of new ribosomes from the nucleus. Therefore, my data refuted the assumption that ribosomes are built and degraded as a unit and revealed a more dynamic view of these machines, which can actively exchange core components. In particular, I found that the association of certain exchanging RPs is influenced by location (e.g., cell body versus neurites) and cellular state (e.g., post-oxidative stress). Neurons may use this mechanism to repair and/or specialize their protein synthesis machinery in a rapid and context-dependent manner.
Finally, I asked whether some steps of ribosome biogenesis could also take place in distal processes. Although most steps of ribosome assembly occur within the nucleus, the final stages of maturation are known to occur in the cytosol. By combining several imaging and biochemical approaches, I found that cytosolic (but not nuclear) pre-ribosomal particles are present in neuronal processes. Through the incorporation of new RPs into these immature particles, neurons may be able to locally “turn on” previously incompetent ribosomes. This may enable regions near synapses to enhance and customize their translational capacity, independently of the central pool of ribosomes from the cell body. Indeed, I observed that synaptic plasticity induces a maturation of cytosolic pre-ribosomes.
In summary, this thesis shows how neuronal ribosomes can sense cellular states, respond by adjusting their core composition, and in doing so influence the local capacity for protein synthesis. By overturning long-held assumptions in ribosome biology, this work highlights new molecular mechanisms of gene expression and enriches our understanding of the rapid and dynamic strategies cells employ to operate, thrive, and adaptively respond to environmental changes.
Sequenz-spezifische DNA-Rekombination (SSR) bewirkende Systeme aus niederen Organismen, wie z.B. das Cre/loxP-System aus dem P1-Phagen oder das Flp/FRT-System aus Hefe, sind in den letzten Jahren als wichtige und weitverbreitete Werkzeuge zur Modifikation des Säugergenoms etabliert worden. Dies hängt unter anderem mit der Vielfalt an Reaktionen zusammen, welche diese Systeme in der Lage sind durchzuführen. Dazu zählen Exzisions/Deletions-, Integrations-, Inversions- und Translokationsreaktionen. Die hier vorgestellte Arbeit fokussiert auf die Integrationsreaktion, welche aus thermodynamischen Gründen bisher keine breite Anwendung finden konnte, und ihren Einsatz bei der Etablierung allelischer Serien in embryonalen Stammzellen (ES Zellen) oder frühen Embryonen der Maus. Eine solche Methodik wäre ideal für Fragestellungen zu Funktionen von Genen in vivo (Functional Genomics) geeignet. Zur Anwendung kam ein als „Rekombinase vermittelter Kassettenaustausch“ (recombinase-mediated cassette exchange, RMCE) bezeichnetes Verfahren. RMCE ist ein Zwei-Schritt-Verfahren: Zuerst wird der interessierende Genort durch homologe Rekombination derart verändert, daß 5’ und 3’ des Genlocus SSR-Erkennungsstellen eingeführt werden. Durch das Einbringen eines die gleichen Erkennungsstellen tragenden Austauschplasmides und die Bereitstellung der entsprechenden Rekombinase kann die im Genom residierende gegen die eingebrachte Kassette (von Erkennungsstellen flankiertes DNA-Segment) ausgetauscht werden. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Ansätze für RMCE vorgestellt: Der erste Ansatz basiert auf der Verwendung heterospezifischer lox-Sequenzen, welche sich in einer Base unterscheiden (lox511/loxP). Diese Mutation sollte eine effektive Integration durch Verhinderung der Exzision gewährleisten. Es konnte hier gezeigt werden, daß RMCE unter Verwendung einer solchen Methodologie in ES Zellen und frühen Mausembryonen effizient möglich ist, daß das Produkt der Integration jedoch instabil ist und nachfolgender Exzision unterliegt. Diese Deletionsreaktionen sind durch promiskuitive Rekombination der verwendeten lox511 und loxP bedingt. Aus diesen Erkenntnissen wurde ein zweiter Ansatz entwickelt, welcher auf dem simultanen Einsatz des Cre/lox- und des Flp/FRT-Systems basiert. Diese Methodik umgeht die Nachteile promiskuitiver Erkennungssequenzen und ihre Anwendbarkeit, Funktionsfähigkeit und Effizienz in ES Zellen konnten demonstriert werden. Ein solches Verfahren, welches sowohl in Zellkultur als auch in frühen Mausembryonen zum Einsatz kommen könnte, bietet insbesondere im Hinblick auf zukünftige Bedürfnisse in der Functional Genomics viele Optionen.
Metabotropic glutamate receptor subtype 7 (mGluR7) belongs to the family of G-protein coupled receptors. mGluR7 is widely distributed in the brain and primarily localized at presynaptic terminals, where it is thought to regulate neurotransmitter release and synaptic plasticity. Studies have shown that the intracellular C-terminal tail of mGluR7 binds a variety of proteins in addition to trimeric G-proteins. These newly identified protein interactions are believed to play a key role in the synaptic targeting and G-protein dependent signaling of mGluR7. Protein interacting with C kinase 1 (PICK1), a PDZ-domain protein, is a strong interaction partner of mGluR7a. In order to investigate the role of PICK1 in the synaptic trafficking and signaling of mGluR7a, a knock-in mouse line in which the interaction of mGluR7a and PICK1 is disrupted was generated. Analysis of the mutant mice by immunocytochemistry and immunoelectron microscopy showed that the synaptic targeting and clustering of mGluR7a was not altered, indicating that PICK1 is not required for mGluR7a receptor membrane trafficking and synaptic localization. However, when the spontaneous synaptic activity of cerebellar granule cell cultures prepared from both wild-type and knock-in mice was monitored, and L-AP4 (400μm) was found to decrease the frequency, but not the amplitude, of spontaneous excitatory currents in wild-type neurons, while no effect of L-AP4 on spontaneous synaptic activity was observed in knock-in neurons. This indicates that PICK1 binding to the C-terminal region of mGluR7a plays an essential role in mGluR7a mediated G-protein signaling. We examined the threshold sensitivity for the convulsant pentetrazole (PTZ) in knock-in mice. It was found that mGluR7a knock-in mice had a greater sensitivity to PTZ than wild-type mice. Moreover, the surface parietal cortex EEG recordings of the mutant mice revealed spontaneous synchronous oscillation, or "spike-and-wave discharges" (SWD), which displayed similar characteristics to absence-like seizures. It was also observed that the knock-in mice responded to pharmacology as human absence epilepsy. These data suggests that the knock-in mice displayed the phenotype of absencelike epilepsy. Furthermore, the behavioral analysis of the mGluR7a knock-in mice showed no deficits in motor coordination, pain sensation, anxiety as well as spatial learning and memory, thus the interaction of mGluR7a and PICK1 appears not to contribute to these physiological processes. Taken together, our data provides evidence for an important role of PICK1 in Gprotein dependent signaling of mGluR7a, whereas PICK1 is not required for synaptic targeting and clustering of mGluR7a. Our results also provide an animal model of absencelike epilepsy generated by disruption of a single mGluR7a-PDZ interaction, thus creating a novel therapeutic target against this neurological disease.
Epidermal growth factor (EGF) receptor belongs to the broad family of enzymatic receptors called receptor tyrosine kinases (RTKs). Generally, the binding of a ligand to these receptors leads to activation of their intracellular kinase activity that sets in motion a cascade of signaling events. In order to ensure appropriate responses to physiological stimuli, the cell is endowed with the ability to regulate signal transduction via numerous mechanisms such as dephosphorylation of the RTK and its substrates as well as downregulation of the RTK. Activation of EGFR is a potent mitogenic (proliferative) and motogenic (cell motility) signal that plays crucial roles during embryonic development and maintenance of adult tissue. EGFR signaling is primarily regulated by ligand-induced receptor internalization with subsequent degradation in lysosomes. While the complex of proteins that are recruited to EGFR after its activation is well understood, proteins that interact with the receptor in the absence of ligand binding are still not systematically studied. With the goal of identifying novel binding partners of non-activated EGFR, a membrane based yeast-two hybrid screen (MYTH) was conducted. MYTH is based on the principle of in vivo reconstitution of the N-terminus (Nub) and C-terminus (Cub) halves of ubiquitin once brought into close proximity. A chimeric protein consisting of EGFR fused to Cub and a transcription factor was used as a bait to screen Nub-tagged cDNA library. Analysis of resultant yeast transformants revealed a total of 87 proteins to interact with EGFR. Of these only 11 were previously shown to bind to EGFR. A majority of the other proteins were shown to interact with the receptor by yeast retransformation. Fifteen were confirmed to bind to EGFR by coimmunoprecipitation assays in mammalian cells. One of the novel EGFR interactors identified in the screen was histone deacetylase 6 (HDAC6). This deacetylase is localized in the cytoplasm and known to deacetylate alpha-tubulin, HSP90 and cortactin. The juxtamembrane region of EGFR binds to the Cterminus of HDAC6. Functionally, overexpression of wild type HDAC6 stabilized ligand-induced degradation of the receptor. On the other hand, deacetylase deficient or EGFR binding compromised mutants of HDAC6 were able to stabilize EGFR only partially. Downmodulation of HDAC6 expression by RNAi markedly accelerated degradation of the receptor. Taken together, HDAC6 is a negative regulator of EGFR downregulation that is dependent on its deacetylase activity and ability to bind to the receptor. Imaging studies revealed that HDAC6 does not affect internalization of EGFR from the plasma membrane but rather influences the post-endocytic trafficking of the receptor-ligand complex to lysosomes. Pulse-chase experiments using fluorophoretagged EGF showed that EGFR is transported faster towards the peri-nuclear region and delivered to late endosomes rapidly in HDAC6 depleted cells. HDAC6 is demonstrated to act, at least partly, by regulating the acetylation of alpha-tubulin. Upon EGFR activation, acetylation of alpha-tubulin on lysine 40 is progressively increased as shown by mass spectrometry and immunoblotting. Forced expression of a dominant negative mutant of alpha-tubulin, but not wild type alpha-tubulin, led to reduced speed and processive movement of early endosomes in GFP-Rab5 expressing cells. In a surprising twist, EGFR is able to phosphorylate HDAC6 on Tyr570. Phosphorylation of Tyr570 and Ser568 leads to inactivation of the deacetylase function of HDAC6 as shown by in vivo and in vitro assays. In summary, HDAC6 diminishes EGFR downregulation by slowing the transport of intracellular vesicles. The inhibitory effect is removed once HDAC6 is phosphorylated on key residues. In line with these findings, two recent reports have shown that hyper-acetylation of alpha-tubulin induced by inhibition of HDAC6 increases the transport of brain derived neurotrophic factor and JNK interacting protein-1 in different cell systems. Acetylated microtubules are more efficient in recruiting motor proteins like kinesin-1 and dynein. These findings indicate that HDAC6 plays an important regulatory role in intracellular trafficking pathways. However, several outstanding issues still remain unresolved. How does acetylation of microtubules influence vesicular trafficking? In this regard, the temporal and spatial dynamics of alpha-tubulin acetylation following EGFR activation should be studied. Furthermore, whether HDAC6 affects the trafficking of other endocytic cargos and additional organelles is an interesting question to address.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine Variante des Anti-Thrombin-Aptamers HD1 entwickelt, die vor Belichten aktiv war und sich durch Belichten deaktivieren ließ. Dazu wurde das Wildtyp-Aptamer am 5'-Ende um eine GAAA-Schleife und eine Gegenstrangregion, bestehend aus vier Nukleotiden, erweitert. Dies reichte für eine vollständige Inaktivierung des Aptamers aus. In die Gegenstrangregion wurde ein photolabil geschütztes Nukleotid eingebaut, das die Bildung einer Haarnadelstruktur vorübergehend verhindert. Dazu wurde ein Desoxycytidin-Derivat synthetisiert, das an seiner N4-Position mit einer 1-(2-Nitrophenyl)ethyl-Gruppe modifiziert war. Durch die Maskierung der Antisense-Region wies das Aptamer vor Belichtung blutgerinnungshemmende Aktivität auf, allerdings in geringerem Maße als das Wildtyp-Aptamer. Durch Belichten wurde die Gegenstrangregion freigesetzt und dadurch die aktive Konformation des Aptamers zerstört, sodass es keine blutgerinnungshemmende Wirkung mehr besaß. In einem daran anknüpfenden Projekt sollte eine mit Licht ausschaltbare HD1-Variante mit verbessertem Schaltverhalten entwickelt werden, deren Aktivität vor dem Belichten mit der des Wildtyp-Aptamers vergleichbar ist. Tests zeigten, dass eine 5'-Erweiterung des Aptamers stets einen Aktivitätsverlust zur Folge hatte. Getestet wurden verschiedene Linker-Sequenzen, D-Spacer (Abasic Sites) und nicht nukleotidische Linker wie Glykollinker oder alkylische Linker. Eine Erweiterung am 3'-Ende brachte dagegen fast immer Aptamervarianten hervor, deren Aktivität die des Wildtypaptamers überstiegen. Um diese verbesserten Aptamervarianten zu deaktivieren, war eine Antisense-Region bestehend aus bis zu neun Nukleotiden nötig. Für eine photolabil geschützte Variante wurde zusätzlich ein Desoxyadenosinderivat mit N6-1-(2-Nitrophenyl)ethylmodifikation synthetisiert. Es zeigte sich, dass eine photolabile Schutzgruppe nicht ausreichte um die Antisense- Region zu neutralisieren. Aptamervarianten mit vier oder fünf photolabilen Schutzgruppen in der Antisenseregion waren vor dem Belichten aktiver als das Wildtyp-Aptamer HD1 und konnten durch Belichten vollständig deaktiviert werden. In einem weiteren Projekt dieser Arbeit wurde eine photolabil geschützte Glukosamin-6- phosphat-Variante synthetisiert, um eine lichtabhängige Spaltung des glmS-Ribozyms aus Bacillus subtilis zu induzieren. Dazu wurde GlcN6P an der Aminofunktion über eine Carbonyllinker mit einer 2-(2-Nitrophenyl) propylgruppe modifiziert. In vitro konnte gezeigt werden, dass mit dieser Verbindung durch Belichten die Spaltung eines glmS-EGFP-mRNA-Konstrukts induziert werden konnte. In HeLa-Zellen wurde untersucht, ob sich dieses System zur Regulation der EGFP-Expression eignet. Da erste Versuche erfolglos blieben, wurde eine lipophile, zellgängige Variante des photolabil geschützten GlcN6Ps synthetisiert. Versuche, in denen dieses Derivat getestet wird, werden zur Zeit von unseren Kooperationspartnern durchgeführt. In einem weiteren Projekt wurden Desoxyguanosinderivate für die DNA-Festphasensynthese synthetisiert, die an ihrer O6-Position mit einer p-Hydroxyphenacylgruppe bzw. mit einer 1-(3-Nitrodibenzofuran-2-yl)ethylgruppe modifiziert wurden. Diese wurden in ein Desoxyoligonukleotid eingebaut und es konnte gezeigt werden, dass die photolabilen Schutzgruppen durch Belichten abgespalten werden. Beide photolabilen Modifikationen waren allerdings unter den basischen DNA-Abspaltbedingungen zu instabil, als dass sie sich für den routinemäßigen Einsatz zur Herstellung lichtaktivierbarer Nukleinsäuren eignen würden. Im letzten Teil der Arbeit wurde eine photolabile Schutzgruppe entwickelt, die über einen zusätzlichen Aminolinker verfügt [2-(4-(Aminomethyl)-2-nitrophenyl)-propanol]. Die Aminofunktionalität war für die Dauer der DNA/RNA-Festphasensynthese mit einer Trifluoracetylgruppe geschützt, die unter den basischen Abspaltbedingungen ebenfalls entfernt wird. Mit dieser photolabilen Schutzgruppe wurden ein Thymidinderivat an der O4-Position und ein Desoxyguanosinderivat an der O6-Position modifiziert. Das Desoxyguanosinderivat wurde erfolgreich in der Oligonukleotidfestphasensynthese eingesetzt. Die photolabile Schutzgruppe konnte durch Belichten vollständig von der synthetisierten Nukleinsäure abgespalten werden. Darüber hinaus gelang es, über die Aminofunktionalität die heterobifunktionalen Crosslinker SMCC und SMPB mit der Nukleinsäure zu verknüpfen. Auf diese Weise ist eine reversible Vernküpfung der Nukleinsäure mit einem nahezu beliebigen Bindungspartner möglich. Durch Belichten kann die Nukleinsäure in ihrer ursprünglichen Form wiederhergestellt werden.
Die 5-Lipoxygenase ist das Schlüsselenzym der Bildung proentzündlicher Leukotriene. Diese Mediatoren sind assoziiert mit Erkrankungen des entzündlichen Formenkreises wie beispielsweise Arteriosklerose [6]. Durch die Veröffentlichungen von Qiu et. al. [248] und Gredmark-Russ et. al. [650] konnte gezeigt werden, dass die Infektion mit humanen Cytomegalovirus in vitro und in vivo zur Induktion der 5-LO in HPASMCs und SMCs (smooth muscle cells) führt. HCMV ist ein ß-Herpesvirus, welches nach einer zumeist asymptomatischen Primärinfektion, dauerhaft im Wirt persisiert und bei Schwächung des Immunsystems oder entzündliche Prozessen reaktiviert werden kann [256]. Geht das Virus in die lytische Replikationsphase über, werden Entzündungsprozesse gefördert, die zur Ausprägung von Krankheitsbildern wie Retinitis, rheumatoider Arthritis oder auch Psoriasis führen. Es besteht demnach ein Zusammenhang zwischen der aktiven HCMV-Infektion und Erkrankungen des entzündlichen Formenkreises, welche unter anderem durch die Induktion der 5-LO vermittelt wurden.
Ziel der Arbeit war es, den molekularen Mechanismus der viral induzierten 5-LO-Promotoraktivierung aufzuklären. Dazu wurde zunächst überprüft, ob die Infektion mit HCMV in HFF, einer Zelllinie die äußerst permissiv für die Infektion ist und daher zumeist als Testsystem für HCMV herangezogen wird, eine verstärkte 5-LO-Expression hervorruft, oder ob es sich um einen zelltypspezifischen Effekt der smooth muscle cells handelt. Es konnte gezeigt werden, dass es nach Infektion zu einer verstärkten Promotoraktivierung, mRNS- sowie Proteinexpression der 5-LO kam (Abb. 19, 23, 24). Weitere Untersuchungen charakterisierten, welches virale Protein die Effektvermittlung bedingte. Aufgrund der sequentiellen Genexpression des Virus unterscheidet man nach Zeitpunkt der Expression in Immediate Early, Early und Late Proteine, wobei letztere erst nach Replikation des viralen Genoms exprimiert werden. Der Zusatz von Foscavir als Replikationsinhibitor verdeutlichte, dass ein Immediate Early oder Early Protein die Induktion hervorruft (Abb. 16). Reportergenassay-Experimente unter Überexpression einzelner viraler Proteine zeigten, dass Immediate Early 1 essentiell an der Erhöhung der 5-LO-Promotoraktivität beteiligt ist (Abb. 18). Weitergehende Versuche unter Verwendung des IE1-Deletionsvirus CR208 bestätigten, dass die Induktion der 5-LO-Promotoraktivität sowie der mRNS-Expression durch dieses virale Protein vermittelt wird (Abb. 18, 20-22). Auf Proteinebene konnte ebenfalls nach IE1-Überexpression beziehungsweise nach Infektion mit HCMV eine erhöhte 5-LO-Expression detektiert werden (Abb. 23 und 24). Aktivitätsuntersuchungen, bei denen die Konzentration der 5-LO-Produkte LTB4 und 5-HETE gemessen wurden, bestätigten, dass das Enzym funktionsfähig ist (Abb. 25). Nach Infektion mit HCMV kommt es demnach zur IE1-vermittelten Induktion der 5-LO auf mRNS- und Proteinebene sowie nachgeordnet zur verstärkten Produktion von inflammatorischen Leukotrienen, die an der Ausbildung der entzündlichen Symptomatik einer lytischen Infektion beteiligt sind.
Immediate Early 1 ist ein potenter Transaktivator, der sowohl virale als auch zelluläre Promotorstrukturen aktivieren kann [387]. Funktionell wird dies reguliert über die Förderung der Transkriptionsfaktor-Expression, aber auch durch Beeinflussung histonmodifizierender Enzyme wie Histondeacetylasen [464]. Für den 5-LO-Promotor ist bekannt, dass dessen Aktivität über Bindung von Sp1, sowie durch HDAC-Inhibition beeinflusst werden kann [9, 171]. Diese beiden Regulationsmechanismen stellen demnach mögliche Verknüpfungspunkte in der viral induzierten Induktion des 5-LO-Promotors dar. Zunächst wurde die Expression von Transkriptionsfaktoren, welche charakterisierte Bindungsstellen im 5-LO-Promotor besitzen, nach IE1-Überexpression untersucht. Es zeigte sich, dass der zelluläre Sp1-mRNS-Spiegel durch IE1 80fach induziert werden kann (Abb. 27). Im Reportergenassay mit 5-LO-Promotordeletionskonstrukten, bei denen gezielt einzelne Sp1-Bindungsstellen, sogenannte GC-Boxen, mutiert wurden, konnte bestätigt werden, dass die IE1-vermittelte Induktion essentiell von Sp1-abhängt, da die Mutation der GC4-Box die Aktivierung nahezu komplett inhibiert (Abb. 30, 31). Auch der Zusatz von Mithramycin, einem DNS-Interkalator, welcher die Bindung von Sp1 an die DNS unterdrückt, ist in der Lage die Induktion abzuschwächen (Abb. 33) [651]. Um die direkte Sp1-Bindung an den 5-LO-Promotor nachzuweisen wurden sowohl EMSA- als auch ChIP-Experimente durchgeführt. Es zeigte sich, dass in vitro und in vivo die Sp1-Bindung an den proximalen 5-LO-Promotor nach IE1-Überexpression beziehungsweise nach Infektion zunimmt (Abb. 49, 50). Interessanterweise wird dieser Effekt nicht durch Immediate Early 2, einer Spleißvariante von IE1, welche eine große strukturelle Ähnlichkeit aufweist, hervorgerufen. Da Veröffentlichungen gezeigt haben, dass beide Immediate Early Proteine in der Lage sind, Sp1 auf mRNS-Level zu induzieren, muss ein weiterer regulatorischer Mechanismus in die Sp1-Promotorbindung involviert sein [410]. In Co-Immunopräzipitations Versuchen zeigten beide IEPs eine Interaktion mit Sp1 (Abb. 38), wonach der Unterschied in der transaktivierenden Fähigkeit des 5-LO-Promotors nicht durch Protein-Protein-Bindung mit Sp1 bedingt wird. Strukturell unterscheiden sich die beiden Proteine in ihrer carboxyterminalen Sequenz. Für IE1 ist hier eine intrinsische Kinaseaktivität beschrieben, die zur Autophosphorylierung, aber auch zur Phosphorylierung von Bindungsproteinen führen kann. Western Blot Analysen auf den zellulären phospho-Sp1-Gehalt nach viraler Überexpression konnten zeigen, dass IE1, nicht aber IE2 die posttranslationale Modifikation des Transkriptionsfaktors fördert (Abb. 39). Auch die Testung viraler Deletionsmutanten, denen einzelne Exons beziehungsweise die ATP-Bindungsstelle der Kinasedomäne fehlen, bestätigten die Schlüsselfunktion dieses Strukturelements (Abb. 37). Ob es sich um eine direkte oder indirekte Phosphorylierung von Sp1 durch IE1 handelt wurde durch in vitro Kinase-Assays und die Testung unterschiedlicher Proteinkinase-Inhibitoren bestimmt (Abb. 40, 42, 45). Obwohl die beiden Proteine miteinander interagieren können, kam es nicht zu einer direkten Phosphorylierung, sondern zelluläre Kinasen wie Tyrosinkinasen und nachgeordnet die Mitglieder des MAPK-Signalweges sind in die Phosphorylierung von Sp1 involviert. Die finale Bestätigung der essentiellen Funktion von Sp1 in der IE1-vermittelten Aktivierung des 5-LO-Promotors lieferte ein Reportergenassay-Experiment mit Sp1-Knock-down Zellen, welche nach viraler Überexpression keine 5-LO-Promotoraktivität und mRNS-Expression mehr zeigten (Abb. 47, 48). Für die Vermittlung der IE1-induzierten 5-LO-Promotoraktivierung sind dessen transaktivatorische Fähigkeiten demnach essentiell, durch Erhöhung der Sp1-mRNS-Expression und nachfolgender Phosphorylierung wird die DNS-Bindung des Transkriptionsfaktors an die GC4-Box des 5-LO-Promotors erhöht und dieser damit transkriptionell aktiviert.
Neben der Regulation über verstärkte phospho-Sp1-Bindung an die GC4-Box Region muss die Induktion von 5-LO durch IE1 noch über weitere Interaktionen vermittelt werden, da die reine Sp1-Überexpression ohne IE1 keine Promotoraktivierung hervorrufen konnte (Abb. 34). Überprüft wurde daher die HDAC-inhibitorische Fähigkeit von IE1, da der 5-LO-Promotor über diese epigenetischen Mechanismen reguliert werden kann. Pull-down-Experimente zeigten zunächst eine Protein-Protein-Interaktion zwischen IE1 und HDAC1/2/3 (Abb. 51). Nachfolgend konnte in einem HDAC-Aktivitätsassay gezeigt werden, dass diese Interaktion die Enzymaktivität der HDACs drastisch reduziert (Abb. 52). Durch HDAC-Inhibition liegen Promotorstrukturen zunehmend acetyliert vor und sind damit transkriptionell aktiv. Für den funktionellen Nachweis auf den 5-LO-Promotor diente ein Reportergenassay-Experiment in dem IE1 und in steigenden Mengen HDAC überexprimiert wurde (Abb. 53). Die Überexpression von HDAC1 und HDAC3 konnten den aktivierenden Einfluss von IE1 auf den 5-LO-Promotor teilweise konzentrationsabhängig revertieren und scheinen damit an der Effektvermittlung beteiligt zu sein. Die Charakterisierung der HDAC-vermittelten 5-LO-Promotorregulation von Pufahl et. al. bestätigte durch Knock-down Experimente, dass HDAC3 entscheidenden Einfluss auf den 5-LO-Promotor hat [172]. HDAC1 dagegen reguliert über die verstärkte Deacetylierung von Sp1 dessen DNS-Bindungsaffinität. Eine Hemmung dieser beiden Histondeacetylasen durch das virale Protein erhöht damit die Aktivität des 5-LO-Promotors.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Ziel der Arbeit erreicht wurde und ein detaillierter Mechanismus der 5-LO-Promotoraktivierung durch HCMV aufgeklärt wurde. Immediate Early 1 induziert dabei zunächst die Expression und Phosphorylierung von Sp1. Ebenso interagiert das virale Protein mit HDAC1/2/3 und hemmt deren Aktivität, wodurch es zur Öffnung der 5-LO-Promotorstruktur kommt. Entscheiden ist hierbei vor allem die Hemmung von HDAC3. HDAC1 Inhibition sorgt im getesteten Zellsystem zusätzlich für verstärkte Acetylierung des Transkripti-onsfaktors Sp1, welcher aufgrund der dadurch erhöhten DNS-Bindungsaffinität an die GC4-Box-Region binden und so die Transkription fördern kann. Interessanterweise ist die Bindung an andere beschriebene GC-Boxen des 5-LO-Promotors nicht induktiv, was die Annahme nahelegt, dass nicht Sp1 alleine, sondern ein transaktivatorischer Komplex an diese Region bindet. Die Aktivierung des Promotors führt nachfolgend zur mRNS- und Proteinexpression, welche eine verstärkte Leukotrienbildung zur Folge hat. Diese Mediatoren sind in die Entstehung der entzündlichen Charakteristik einer aktiven HCMV involviert. Das Virus macht sich demnach generelle Prinzipien der Transaktivierung zu Nutze und fördert so zum einen seine Reaktivierung aus der Latenz, zum anderen die produktive Verbreitung der Infektion.
Purification and characterization of heterologously produced cannabinoid receptor 1 and G proteins
(2007)
G protein coupled receptors form the largest group of transmembrane proteins, which are involved in signal transduction and are targeted directly or indirectly by 40-50% of the drugs in the market. Even though a lot of biochemical and pharmacological information was acquired for these receptors in the past decades, structural information is still insufficient. G protein coupled receptors are expressed in a very minute scale in the tissues. Purification of G protein coupled receptors, in amounts needed for structural studies, from native tissue is tedious and almost impossible. To overcome this first hurdle of insufficient protein, several heterologous protein expression systems are being used. Another difficulty in structural determination of a G protein coupled receptor is that it is a membrane protein. Membrane proteins are difficult targets for structural studies. One of the possible reasons is the little hydrophilic surface area on the membrane protein, reducing the chances of crystal contact between the molecules. The present work is an attempt to investigate possible ways to overcome these problems. Aim of the project was to use G proteins to increase the hydrophilic area of the G protein coupled receptor. G protein is a physiological partner to the G protein coupled receptor which makes the complex functionally relevant. In the present work five G alpha proteins were purified to homogeneity by a two step purification using metal affinity and ion-exchange chromatography. The G alpha subunits purified were tested for their detergent susceptibility. It was found that only some G proteins were active in the presence of detergent. Observation from contemporary reports also suggest that the G alpha proteins expressed in Escherichia coli, alone may not be sufficient to bind to the G protein coupled receptors in solution. So the project was extended towards expressing a G protein coupled receptor which was reported to exist in a complex with the G proteins, in the cells. Purifying such a functional complex could be more beneficial to use for crystallization. Cannabinoid receptors were chosen for heterologous expression and purification. Production of recombinant cannabinoid receptor 2 was investigated in Pichia pastoris. The protein obtained was highly heterogenous. There were several oligomeric forms as well as degradation products in the cell membranes. Most of the protein was lost in the purification steps leading to a poor yield. Several oligomeric forms and other impurities were still present in the protein sample after purification. Alternatively, a baculovirus mediated insect cell expression system was investigated, to produce the receptors. Cannabinoid receptor 1 was investigated in insect cell expression system because of its better biochemical understanding and pharmacological importance than cannabinoid receptor 2. Cannabinoid receptor 1 was produced in two forms, a full length and a distal carboxy terminal truncated version. All the several gene constructs made could be expressed in the Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells. Expression levels (Bmax) for the constructs with a decahistidine tag at the amino terminus and Strep-tagII at the carboxy terminus were 40 pmol/mg and 53 pmol/mg respectively, for full length and truncated versions. These expression levels are 2 fold higher than the levels reported till now in the literature. As was quite evident from previous experiences of other research groups, purification of this receptor was a challenge. Protein purified from immobilized metal affinity chromatography (Ni-nitrilo tri acetate)(Ni-NTA) was not even 50% pure. A second purification by immobilized monomeric avidin or Streptactin agarose, making use of Biotag and StreptagII respectively, drastically reduced the protein recovery. Later on, purification of receptor was investigated on different metal chelating resins. His-Select, a Ni-NTA based matrix from Sigma, with much lesser density than Ni-NTA from Qiagen, showed a better purification profile. Purification was optimized to get 80% homogeneity but with low yield (20%). Further efforts are needed to improve the yield and purity of the receptor, to use it for crystallization. Cannabinoid receptors are known to exist in a precoupled form to G proteins in the cells. The existence of such precoupled forms of the receptor was investigated using the fluorescence techniques. Guanosine-5-triphosphate binding assay on the cell membranes, in the absence of agonists confirmed the active precoupled form of the receptor. It was found that it is possible to co-immunoprecipitate the complex. These results show that the truncated cannabinoid receptor can be produced in functional form in insect cells in much higher yields than reported. This receptor exists as a complex with G proteins even in the absence of ligands. It was also shown that the receptor/G protein complex can be coimmunoprecipitated. Further work is required to investigate the possibility of purifying this complex to use it for co-crystallization.
Pulsed electron–electron double resonance (PELDOR) spectroscopy is a powerful tool for measuring nanometer distances in spin-labeled systems and recently is increasingly applied to membrane proteins. However, after reconstitution of labeled proteins into liposomes, spin labels often exhibit a much faster transversal relaxation (Tm) than in detergent micelles, thus limiting application of the method in lipid bilayers. In the first part of the thesis, optimization of transversal relaxation in phospholipid membranes was systematically investigated by use of spin-labeled derivatives of stearic acid and phosphatidylcholine as well as spin-labeled derivatives of the channel-forming peptide gramicidin A under the conditions typically employed for PELDOR distance measurements. Our results clearly show that dephasing due to instantaneous diffusion that depends on dipolar interaction among electron spins is an important contributor to the fast echo decay in cases of high local concentrations of spin labels in membranes. The main difference between spin labels in detergent micelles and membranes is their local concentration. Consequently, avoiding spin aggregation and suppressing instantaneous diffusion is the key step for maximizing PELDOR sensitivity in lipid membranes. Even though proton spin diffusion is an important relaxation mechanism, only in samples with low local concentrations does deuteration of acyl chains and buffer significantly prolong Tm. In these cases, values of up to 7 μs have been achieved. Furthermore, our study revealed that membrane composition and labeling position in the membrane can also affect Tm, either by promoting the segregation of spin-labeled species or by altering their exposure to matrix protons. Effects of other experimental parameters including temperature (<50 K), presence of oxygen, and cryoprotectant type are negligible under our experimental conditions.
In the second part of the thesis, inhomogeneous distribution of spin-labels in detergent micelles has been studied. A common approach in PELDOR is measuring the distance between two covalently attached spin labels in a macromolecule or singly-labeled components of an oligomer. This situation has been described as a spin-cluster. The PELDOR signal, however, does not only contain the desired dipolar coupling between the spin-labels of the molecule or cluster under study. In samples of finite concentration the dipolar coupling between the spin-labels of the randomly distributed molecules or spin-clusters also contributes significantly. In homogeneous frozen solutions or lipid vesicle membranes this second contribution can be considered to be an exponential or stretched exponential decay, respectively. In this study, it is shown that this assumption is not valid in detergent micelles. Spin-labeled fatty acids that are randomly partitioned into different detergent micelles give rise to PELDOR time traces which clearly deviate from stretched exponential decays. As a main conclusion a PELDOR signal deviating from a stretched exponential decay does not necessarily prove the observation of specific distance information on the molecule or cluster. These results are important for the interpretation of PELDOR experiments on membrane proteins or lipophilic peptides solubilized in detergent micelles or small vesicles, which often do not show pronounced dipolar oscillations in their time traces.
In the third part, PELDOR has been utilized to study the structural flexibility of the Toc34 GTPase homodimer, a preprotein receptor of the translocon of the outer envelope of chloroplasts (TOC). Toc34 belongs to GAD subfamily of G-proteins that are regulated and activated by nucleotide-dependent dimerization. However, the function of Toc34 dimerization is not yet fully understood. Previous structural investigations of the Toc34 dimer yielded only marginal structural changes in response to different nucleotide loads. PELDOR revealed a nucleotide-dependent transition of the dimer flexibility from a tight GDP to a flexible GTP-loaded state. Substrate-binding stabilizes the dimer in the transition state mimicked by GDP-AlFx, but induces an opening in the GDP or GTP-loaded state. Thus, the structural dynamics of bona fide GTPases induced by GTP hydrolysis is replaced by substrate-dependent dimer flexibility, which represents the regulatory mode for dimerizing GTPases.
In the fourth part of the thesis, conformational flexibility and relative orientation of the N-terminal POTRA domains of a cyanobacterial Omp85 from Anabaena sp. PCC 7120, a key component of the outer membrane protein assembly machinery, were investigated by PELDOR spectroscopy. Membrane proteins of the Omp85-TpsB superfamily are composed of a C-terminal β-barrel and a different number of N-terminal POTRA domains, three in the case of cyanobacterial Omp85. It has been suggested that the N-terminal POTRA domains (P1 and P2) might have functions in substrate recognition. Molecular dynamics (MD) simulations predicted a fixed orientation for P2 and P3 and a flexible hinge between P1 and P2. The PELDOR distances measured between the P2 and P3 POTRA domains are in good agreement with the structure determined by X-ray, and compatible with the MD simulations suggesting a fixed orientation between these domains. PELDOR constraints between the P1 and P2 POTRA domains imply a rather rigid structure with a slightly different relative orientation of these domains compared with the X-ray structure. Moreover, the large mobility predicted from MD is not observed in the frozen solution. The PELDOR results further highlight the restricted relative orientation of the POTRA domains of the Omp85-TpsB proteins as a conserved characteristic feature that might be important for the processive sliding of the unfolded substrate towards the membrane.
The endothelin B receptor belongs to the rhodopsin-like G-protein coupled receptors family. It plays an important role in vasodilatation and is found in the membranes of the endothelial cells enveloping blood vessels. During the course of this work, the production of recombinant human ETB receptor in yeast, insect and mammalian cells was evaluated. A number of different receptor constructs for production in the yeast P. pastoris was prepared. Various affinity tags were appended to the receptor N-and C-termini to enable receptor detection and purification. The clone pPIC9KFlagHisETBBio, with an expression level of 60 pmol/mg, yielded the highest amount of active receptor (1.2 mg of receptor per liter of shaking culture). The expression level of the same clone in fermentor culture was 17 pmol/mg, and from a 10L fermentor it was possible to obtain 3 kg of cells that contained 20-39 mg of the receptor. For receptor production in insect cells, Sf9 (S. frugiperda) suspension cells were infected with the recombinant baculovirus pVlMelFlagHisETBBio. The peak of receptor production was reached at 66 h post infection, and radioligand binding assays on insect cell membranes showed 30 pmoL of active receptor /mg of membrane protein. Subsequently, the efficiency of different detergents in solubilizing the active receptor was evaluated. N-dodecyl-beta-D-maltoside (LM), lauryl-sucrose and digitonine/cholate performed best, and LM was chosen for further work. The ETB receptor was produced in mammalian cells using the Semliki Forest Virus expression system. Radioligand binding assays on membranes from CHO cells infected with the recombinant virus pSFV3CAPETBHis showed 7 pmol of active receptor /mg of membrane protein. Since the receptor yield from mammalian cells was much lower than in yeast and insect cells, this system was not used for further large-scale receptor production. After production in yeast and insect cells, the ETB receptor was saturated with its ligand, endothelin-1, in order to stabilize its native form. The receptor was subsequently solubilized with n-dodecyl-beta-D-maltoside and subjected to purification on various affinity matrices. Two-step affinity purification via Ni2+-NTA and monomeric avidin proved the most efficient way to purify milligram amounts of the receptor. The purity of the receptor preparation after this procedure was over 95%, as judged from silver stained gels. However, the tendency of the ETB receptor produced in yeast to form aggregates was a constant problem. Attempts were made to stabilize the active, monomeric form of the receptor by testing a variety of different buffer conditions, but further efforts in this direction will be necessary in order to solve the aggregation problem. In contrast to preparations from yeast, the purification of the ETB receptor produced in insect cells yielded homogeneous receptor preparations, as shown by gel filtration analysis. This work has demonstrated that the amounts of receptor expressed in yeast and insect cells and the final yield of receptor, isolated by purification, represent a good basis for beginning 3D and continuing 2D crystallization trials.
Die Verfügbarkeit synthetischer Oligonukleotide hat der Entwicklung einer Vielzahl molekularbiologischer, biochemischer und medizinischer Anwendungen den Weg geebnet. Und sind viele diese Anwendungen für sich genommen schon hochinteressant, so eröffnet die Kombination mehrerer Methoden oft noch ganz neue Möglichkeiten. In der vorliegenden Doktorarbeit ist es gelungen, die Technik der photolabilen Schützung auf die Anwendungen von siRNAs und molecular beacons zu übertragen und diesen damit die Option der orts- und zeitaufgelösten Aktivierung zu ermöglichen. Durch die Einführung eines Nukleotids mit 2-(2-nitrophenyl)propyl-geschützter Nukleobase in eine siRNA, konnte der katalytische Schritt der RNA-Interferenz, die mRNA-Spaltung, unterbunden werden. Hierzu wurde das photolabil modifizierte Nukleotid so in der siRNA positioniert, dass es gegenüber der mRNA-Schnittstelle bzw. in unmittelbarerer Nachbarschaft zu dieser lag. Dabei war das modifizierte Nukleotid selbst kein Ribonukleotid sondern ein Desoxynukleotid. Zuvor konnte gezeigt werden, dass die Einführung einzelner Desoxynukleotide in eine siRNA keinerlei Einfluss auf deren Aktivität hat. Als Modellsystem diente der RFP/eGFP-Reportergenassay, wobei die Plasmide mit der siRNA in die verwendeten HeLa-Zellen kotransfiziert wurden. Die verwendete siRNA regulierte dabei die eGFP-mRNA, die gemessene Fluoreszenz wurde auf die RFP-Fluoreszenz normiert. In der Studie gelang es, ein sauberes „An/Aus-Verhalten“ zu erzielen, das heißt, die modifizierte siRNA zeigte zunächst keinerlei Einfluss auf die eGFP-mRNA. Bestrahlte man diese siRNA jedoch für drei Minuten bei 366 nm, erzielte man eine Unterdrückung der eGFP-Expression, die der einer unmodifizierten siRNA entsprach. Dies funktionierte für vor der Transfektion bestrahlte siRNAs ebenso, wie für solche, die erst nach der Transfektion in der Zelle entschützt wurden. Vereinfachte Darstellung der lichtaktivierbaren RNA Interferenz. Links: solange die Photoschutzgruppe (rot) auf dem Führungsstrang sitzt wird das Substrat des RISC nicht geschnitten. Rechts: Bestrahlung mit UV-Licht entfernt die Photoschutzgruppe und aktiviert die RNAi-Maschinerie. Ein bis jetzt ungeklärtes und noch näher zu untersuchendes Phänomen ist die Stabilität der Modifikationen in der Zelle. Aus bisher nicht eindeutig zu benennender Ursache fand nach einer definierten Zeit eine Aktivierung der ausgeschalteten siRNA statt, ohne dass diese bestrahlt wurde. Versuche mit photolabil modifizierten Nukleotiden an anderen Positionen innerhalb der siRNA, sowie eine Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie-Studie mit fluoreszenzmarkierter siRNA und fluoreszenzmarkiertem RISC erlaubten es Rückschlüsse auf den Schritt der RNAi zu ziehen, der durch die Einführung der Basenmodifikation blockiert wird. Offenbar handelt es sich tatsächlich um den katalytischen Schritt der mRNA-Spaltung, ein Einbau der modifizierten siRNA in den RISC findet statt. Zudem zeigte die erfolgreiche Inaktivierung der für die FCS-Studie genutzten anti-TK siRNA, dass der Ansatz, die Modifikation im Bereich der Schnittstelle einzubauen, von der anti-eGFP siRNA auf andere siRNAs übertragbar ist. Im zweiten erfolgreichen Projekt gelang es, molecular beacons durch Einführung zahlreicher photolabiler Basenmodifikationen lichtaktivierbar zu machen. Hierzu wurde ein bereits beschriebener GAPDH-molecular beacon verwendet. Modifiziert man die Schleife dieses molecular beacon mit sieben photolabilen Basenschutzgruppen (NPP und NPE) so gelingt es die Bindung desselben an seine komplementäre Ziel-RNA komplett zu unterbinden, während ein GAPDH-beacon mit drei oder fünf Modifikationen noch in verringertem Maße bindungsfähig ist. Dieses Verhalten wurde sowohl mittels einfachen Auslesens der Fluoreszenzintensität, als auch anhand eines PA-Geles belegt. Eine große Herausforderung bei diesem Projekt stellte die Aufreinigung des hochmodifizierten molecular beacon dar, der neben Fluorophor und Quencher auch zahlreiche Photoschutzgruppen trägt. Diese gelang schließlich durch den Einsatz einer extra densely bond-RP-HPLC-Säule und wiederholter HPL-Chromatographie. Ebenfalls konnte der große Vorteil eines lichtaktivierbaren molecular beacon, die Möglichkeit der präzisen Ortsauflösung der Aktivierung, dargestellt werden. Hierzu wurde modellhaft die Ziel-RNA auf einer Objektträgeroberfläche immobilisiert. Die dann aufgetragene molecular beacon-Lösung zeigte zunächst keine Fluoreszenz. Diese trat erst nach Bestrahlung und auch nur begrenzt auf den wenige Quadratmikrometer großen Bestrahlungsbereich auf.
Ein bekanntes Beispiel für regulatorische RNA-Protein-Wechselwirkung stellt der Komplex der TAR-RNA von HIV-1 und dem viralen Protein Tat dar. Dieser Komplex ist wichtig für die effiziente Transkription des viralen Genoms. Essentiell für die Erkennung der Stem-Loop Struktur ist die Wechselwirkung des Tat-Proteins mit dem aus drei Nukleotiden bestehenden Bulge der TAR-RNA. Das Wissen über die Prinzipien der Erkennung von Tat zu TAR-RNA sollte es möglich machen, spezifische Liganden zu designen, die als antivirale Tat Antagonisten angreifen können. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese von RNA Liganden für die Festphasenpeptidsynthese (FPPS) basierend auf heteroaromatischen Bausteinen. Als Strategie wurde gewählt, die heteroaromatischen Reste über Amid-Bindungen an ein Fmoc geschütztes (2-Aminoethyl)glycin-Rückgrat einzufügen. Die peptidomimetischen Bausteine X konnten in der FPPS zur Synthese von Tripeptiden mit der allgemeinen Struktur Arg-X-Arg und Modifikationen mit Lysin eingesetzt werden. Die Bindungsaffinitäten der Tripeptide und kleinen Moleküle zur TAR-RNA von HIV-1 wurden über einen fluoreszenzbasierten Assay bestimmt. Der Assay verwendet ein doppelt endmarkiertes Tat-Peptid mit Fluorescein und Rhodamin als Farbstoff. Durch Verdrängung des Tat-Peptides durch einen konkurrierenden Liganden kommt es zur Konformationsänderung des Peptides, die zur Löschung der Lichtemmission führt. Dabei zeigen die Tripeptide H2N-(D)Arg-Lactam-(D)Arg-CONH2 (154) und H2N-(D)Arg-Amidin-(D)Arg-CONH2 (158) IC50-Werte von 2-3 mikroM, die auch durch Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) bestätigt wurden. In massenspektrometrischen Untersuchungen von 158 bzw. Tat-Protein mit TAR-RNA konnten bei beiden Peptiden 1:1 und 1:2-Komplexe beobachtet werden. 158 zeigt antivirale Eigenschaften (IC50 = 10-50 mikroM) in HeLa P4-Zellassays. Durch NMR-Untersuchungen und molekulardynamische Berechnungen war es möglich, eine Konformationsänderung der TAR-RNA durch eine Wechselwirkung mit Guanidinium-Gruppen festzustellen. Ein weiteres Ziel der Arbeit war daher ausgehend von den gewonnenen Daten die Untersuchung des Bindungskonzeptes von Diaminopyrazolen und Indazolen. Diaminopyrazole mit kleinen Resten und Triaminopyrazol übertreffen im protonierten Zustand den dikationischen Liganden Argininamid. In Übereinstimmung mit dem Bindungsmodell verhalten sich protonierte Aminopyrazole wie „Super-Guanidine“ hinsichtlich der TAR-RNA. Das Einfügen des Triaminopyrazols in ein Phenazin-Grundgerüst führt zu Verbindungen, die im protonierten und reduzierten Zustand zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können und nicht planar, aber lipophil sind. Der Austausch von Stickstoff zu Sauerstoff im Phenazinring sollte den reduzierten Zustand stabilisieren. Die resultierende Struktur ist jedoch zersetzlich, so dass auf weitere Untersuchungen verzichtet wurde.
Hsp90 ist ein äußerst vielseitiges Protein, welches nicht strikt cytosolisch anzusiedeln ist. Es besitzt eine Vielzahl von Partnerproteinen zu denen stetig neue hinzukommen und deren Interaktionen längst nicht alle hinreichend untersucht und verstanden wurden. Worin der Unterschied in der Funktionalität von Hsp90 in Eukaryoten und HtpG in Prokaryoten besteht, das Hsp90 für Eukaryoten (auch einzellige) derart essentiell werden lässt, ist absolut unklar. Ein möglicher Grund könnte die Beteiligung von Hsp90 an Transportprozessen in und um den Zellkern darstellen. Der Einfluss von Hsp90 auf den Export von 60S rUE aus dem Zellkern konnte manifestiert werden. Die Einwirkung Hsp90 spezifischer Inhibitoren wie Geldanamycin, Radicicol und Novobiocin zeigten deutliche Effekte in den Transportmessungen sowohl in vitro als auch in vivo. Durch Coinjektionen von Novobiocin und Radicicol in die Oocyten von Xenopus laevis ließ sich der Export von 125J markierten 60S rUE aus dem Zellkern gegenüber den Kontrollen deutlich reduzieren. Damit konnte der mittel- oder unmittelbare Zusammenhang zwischen Hsp90 und dem Export von 60S rUE in vivo erneut bewiesen werden. Hsp90 besitzt mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen für die Casein Kinase II. Untersuchungen zeigten, dass die Phosphorylierung von Hsp90 den Effekt auf den in vitro Export von 60S rUE aufzuheben vermag. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII könnte somit eine potentielle Regulationsmöglichkeit von Hsp90 darstellen. Die Phosphorylierung von Hsp90 durch die CKII ließ sich durch die Zugabe von Radicicol deutlich reduzieren. Es ist durchaus möglich, dass die potentielle Phosphorylierungsstelle im Bereich der Bindungsstelle von Radicicol am N-Terminus von Hsp90 zu suchen ist, da auch die Phosphorylierung des N-terminalen Fragments über Radicicol beeinflusst werden konnte. Über Quervernetzungsversuche zwischen Hsp90 und isolierten Zellkernen, konnten Proteine der Kernmembran spezifisch markiert werden. Aufgrund der äußerst geringen Proteinausbeute war eine Analyse sehr schwierig. Lediglich eine Proteinbande konnte schließlich partiell N-terminal ansequenziert werden. Die ermittelten Sequenzen deuten auf ein zu scNup57p homologes Protein der Ratte hin, welches bisher jedoch noch nicht über eine der Proteindatenbanken ermittelbar ist. Transmissionselektronenmikrokopische Aufnahmen von isolierten Rattenleberzellkernen, welche mit einem Anti-Hsp90 Antikörper inkubiert wurden, konnten zeigen, dass Hsp90 neben Komponenten im Bereich des Kernporenkomplex auch an Bestandteile im Nukleoplasma bindet. Da aufgrund der in vitro Messungen bisher ein rein cytosolische Effekt von Hsp90 in Bezug auf den Export von 60S rUE vermutet wurde, könnte dieser Befund nahe legen, dass die Einflussnahme von Hsp90 auf den Transport von 60S rUE wesentlich früher bereits im Nukleoplasma oder in den Nukleoli einsetzen könnte. Wenn dies der Fall ist, könnte Hsp90 auch im Zusammenhang mit den ribosomalen Untereinheiten eine Begleiterfunktion zukommen, welche den Transport vom Ort der Biosynthese bis an die spätere Wirkungsstätte unter Aufrechterhaltung der Funktion gewährleistet. Hierfür könnte auch sprechen, dass Hsp90 mit den 60S rUE interagiert, wie es in Copräzipitationsversuchen gezeigt wurde. Zudem konnte Hsp90 gezielt über proteinäre Bestandteile im Transport befindlicher 60S rUE radioaktiv markiert werden. Es spricht demnach vieles dafür, dass Hsp90 unmittelbar in den Transportprozess der großen ribosomalen Untereinheiten eingreift, und hierbei der Effekt nicht lediglich in der Unterstützung bei der Translokation zu suchen wäre, sondern eventuell schon sehr viel früher im inneren des Nukleoplasmas.
Recently, two of the most common types of bone cancers in children and young adults have been proven to exhibit vulnerability to poly(ADP)-ribose polymerase, (PARP) inhibitors (e.g. olaparib, talazoparib). Ewing’s sarcoma (ES) are reported to harbor a fusion gene EWS-FLI1 (85%), inducing tumorigenesis. Additional, as the fusion gene acts as aberrant transcription factor, it similarly induces elevated PARP expression levels sensitizing ES to PARP inhibition. Second, by an exome sequencing approach in a set of primary osteosarcomas (OS) we identified mutation signatures being reminiscent of BRCA deficiency. Therefore, the sensitivity of a panel of OS cell lines to either talazoparib single treatment or in combination with several chemotherapeutic drugs was investigated.
To screen ES tumor cell lines against PARP inhibitors we applied four different PARP inhibitors (talazoparib, olaparib, niraparib and veliparib) that are frequently being used for clinical studies. We combined those PARP inhibitors with a set of chemotherapeutics (temozolomide (TMZ), SN-38, etoposide, ifosfamide, doxorubicin, vincristine and actinomycin D) that are part of the first-line therapy of ES patients. Here, we demonstrate how PARP inhibitors synergize with TMZ or SN-38 to induce apoptosis, whereas the combination of PARP inhibitors with the other drugs are not favorable. By investigation of key checkpoints in the molecular mechanisms of cell death, the pivotal role of the mitochondrial pathway of apoptosis mediating the synergy between olaparib and TMZ was revealed.
Employing talazoparib monotherapy in combination with or without several chemotherapeutic drugs (TMZ, SN-38, cisplatin, doxorubicin, methotrexate and etoposide/carboplatin), the correlation between homologous recombination (HR) repair deficiency (BRCAness) and the response to talazoparib as prototypical PARP inhibitor was validated in different OS cell lines. By calculation of combination indices (CI) and fraction affected (Fa) values, we identified TMZ as the most potent chemotherapeutic drug in combination with talazoparib inducing the mitochondrial apoptotic pathway in OS.
In our studies of two independent tumor entities with contrary genetic background we identified the combination of PARP inhibitor and TMZ as being most effective. Our studies point out that after TMZ induced DNA methylation and concomitant PARP trapping, DNA damage-imposed checkpoint kinase activation consequently induces G2-cell cycle arrest. Subsequent, PARP inhibitor/TMZ causes MCL-1 degradation, followed by activation of BAK and BAX, succeeding in loss of mitochondrial outer membrane potential (LMMP) and activation of downstream effector-caspases in mitochondrial apoptosis. Our findings emphasize the importance of PARP inhibition in order to chemosensitize ES, which express high PARP levels, or OS that bear features of BRCAness.
The retinoic acid related orphan receptor alpha (RORalpha) regulates the expression of various target genes by binding to specific response elements in their promoter region. RORalpha is an interesting pharmaceutical target since it positively affects several pathophysiological processes of clinical relevance. RORalpha enhances the expression of Apo-AI protein, the major constituent of HDL, which is responsible for the cholesterol transportation. RORalpha notably contributes to the bone mineralization and generation of the extracellular bone matrix, demonstrating its involvement in osteoporosis, and by up-regulating the gene for IKBalpha, RORalpha has anti-inflammatory effects. Moreover, RORalpha is necessary for cerebellar development and the maintenance of the mammalian day-night periodicity governed by the core-clock within the suprachiasmatic nuclei. RORalpha receptors have been reported to bind cholesterol, melatonin, or to function ligand-independent. By monomeric binding to the recognition motif AGGTCA preceded by an A/T-rich sequence (ROR response element, RORE), RORalpha constitutively activates gene transcription. However, RORalpha activity is passively suppressed by its opponents RevErbalpha and RevErbbeta, which both bind to the same target sequence. ...
By translocating proteasomal degradation products into the endoplasmic reticulum (ER) for loading of major histocompatibility complex (MHC) class I molecules, the ATP binding cassette (ABC) transporter associated with antigen processing (TAP) plays a pivotal role in the adaptive immunity against infected or malignantly transformed cells. A key question regarding the transport mechanism is how the inter-domain communication and conformational dynamics of the TAP complex are connected during the peptide transport. To identify residues involved in this processes, we evolved a Trojan horse strategy in which a small artificial protease is inserted into antigenic epitopes. After binding, the TAP backbone in contact is cleaved, allowing the peptide sensor site to be mapped by mass spectrometry. Within this study, the peptide sensor and transmission interface have been identified. This region aligns with the cytosolic loop 1 (CL1) of Sav1866 and MsbA. Based on a number of experimental data and the homology to the bacterial ABC exporter Sav1866, we constructed a 3D structural model of the core TAP complex. According to this model, the CL1 and CL2 of TAP1 are extended cytosolic loops connecting the transmembrane helices (TMH) 2 and 3, and TMH4 and 5 respectively, and contact both nucleotide binding domains (NBDs) of the opposite subunit. In contrast to exporters, the cytosolic loop (named L-loop) of BtuCD importer is much shorter, and contacts only one NBD. The data confirm that the CL1 of TAP1 functions as signal transducer in ABC exporters, because it does not interfere with substrate binding but with substrate transport. The peptide contact site identified herein is restructured during the ATP hydrolysis cycle. Importantly, TAP showed a structural change trapped in the ATP hydrolysis transition state, because direct contact between peptide and CL1 is abolished. By cysteine scanning, the most conserved residues within CL1 were identified, which disrupted the tight coupling between peptide binding and transport. Together with Val-288, these residues are essential in sensing the bound peptide and inter-domain signal transmission. To characterize the molecular architecture of CL1, a convenient and minimally perturbing approach was used, which combined cysteine substitution in the CL1 region and determination of accessibility to thiol specific compounds with different properties. These studies revealed that the N-terminal region of CL1 has a good accessibility for hydrophilic (iodoacetamidofluorescein, IAF) and amphiphilic probes (BODIPY maleimide, BM), whereas the C-terminal region is accessible for hydrophobic probe (coumarin maleimide, CM). Kinetic studies of fluorescence labeling suggest that this region displayed a different accessibility to probes when the protein undergoes distinct conformations (e. g. nucleotide free state), thereby reflecting conformational transitions. Fluorescence labeling with BM induces a lost of peptide transport, whereas the peptide binding remains unaffected. These results indicate that covalent modifications of the CL1 residues influenced the inter-domain communication between transmembrane domain (TMD) and NBD. The X-loop is a recently discovered motif in the NBD of ABC exporters, which stays in close contact to the CLs. Moreover, because the X-loop precedes the ABC signature motif, it probably responds to ATP binding and hydrolysis and may transmit conformational changes to the CLs. By substitution of the highly conserved Glu-602 of TAP2 with residues that have different chemical properties, it was shown for the first time that the X-loop is a functional important element, which plays an key role in coupling substrate binding to downstream events in the transport cycle. We further verified domain swapping in the TAP complex by cysteine cross-linking. The TAP complex can be reversibly arrested either in a binding or translocation incompetent state by cross-linking of the X-loop to CL1 or CL2, respectively. These results resolve the structural arrangement of the transmission interface and point to different functions of the cytosolic loops in substrate recognition, signaling and transport.
The RAF family of kinases constitutes the members A, B and CRAF. They mediate RAS signaling by linking it to the MEK/ERK transduction module, which regulates cellular processes such as cell proliferation, migration, survival and cell death. As the RAS/RAF/MEK/ERK (MAPK) pathway is found to be activated in human cancers, the RAF kinases have been exploited as valuable therapeutic targets and RAF inhibitors show promising results in the clinic, esp. with tumors harboring an activating BRAFV600E mutation. However, RAF inhibitors paradoxically accelerate metastasis in RAS mutant and BRAF wildtype tumors. They also become ineffective over time in BRAFV600E tumors because of reactivation of downstream mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling by promoting RAF dimerization. Aims of the present work were 1) to investigate the role of ARAF kinase in the paradoxical activation of the enzymatic cascade by RAF inhibitors downstream of mutated RAS and 2) to study the consequences of the loss of ARAF function on signal transduction in vitro and in vivo (nude mice). We have engineered several cell lines that would allow the study of basal and RAF inhibitor induced effects on MAPK activation, tumor cell migration and invasion.
In summary, we were able to show that the RAF isoform ARAF has an obligatory role in promoting MAPK activity and tumor cell invasion in a cell type dependent manner. In these cell types, ARAF depletion prevented the activation of MAPK kinase 1 (MEK1) and extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2) and led to a significant decrease of protrusions growing out of tumor cell spheroids in a three-dimensional (3D) culture that were otherwise induced by BRAFV600E-specific or BRAF/CRAF inhibitors (GDC-0879 and sorafenib, respectively). RAF inhibitors stimulated homodimerization of ARAF and heteromerization of BRAF with CRAF and the scaffolding protein KSR1. However, induced oligomerization was not sufficient to activate MAPK signaling if ARAF was depleted. By employing full length recombinant kinases, we were able to show for the first time that the three RAF isoforms competed for the binding to MEK1. In cell culture models, the overexpression of dimer-deficient ARAF mutants impaired the interaction between ARAF and endogenous MEK1 and thus prevented the subsequent phosphorylation of MEK1 and ERK1/2. Our findings reveal a new role for ARAF in directly activating the MAPK cascade through homodimerization and thereby promoting tumor cell invasion, suggesting the conserved RAF-dimer interface as a target for RAS- and RAF mediated cancer therapy.
Collectively, we provide evidence for the dual role ARAF plays in controlling MAPK signaling and cancer as loss of ARAF promoted strong lung metastasis formation in nude mice. Preliminary data describing the underlying mechanisms behind ARAF-regulated metastases have been presented and discussed.
The following thesis is concerned with the elucidation of structural changes of RNA molecules during the time course of dynamic processes that are commonly denoted as folding reactions. In contrast to the field of protein folding, the concept of RNA folding comprises not only folding reactions itself but also refolding- or conformational switching- and assembly processes (see chapter III). The method in this thesis to monitor these diverse processes is high resolution liquid-state NMR spectroscopy. To understand the reactions is of considerable interest, because most biological active RNA molecules function by changing their conformation. This can be either an intrinsic property of their respective sequence or may happen in response to a cellular signal such as small molecular ligand binding (like in the aptamer and riboswitch case), protein or metal binding. The first part of the thesis (chapters II & III) provides a general overview over the field of RNA structure and RNA folding. The two chapters aim at introducing the reader into the current status of research in the field. Chapters II is structured such that primary structure is first described then secondary and tertiary structure elements of RNA structure. A special emphasis is given to bistable RNA systems that are functionally important and represent models to understand fundamental questions of RNA conformational switching. RNA folding in vitro as well as in vivo situations is discussed in Chapter III. The following chapters IV and V also belong to the introduction part and review critically the NMR methods that were used to understand the nature and the dynamics of the conformational/structural transitions in RNA. A general overview of NMR methods quantifying dynamics of biomolecules is provided in chapter IV. A detailed discussion of solvent exchange rates and time-resolved NMR, as the two major techniques used, follows. In the final chapter V of the first part the NMR parameters used in structure calculation and structure calculation itself are conferred. The second part of the thesis, which is the cumulative part, encompasses the conducted original work. Chapter VI reviews the general NMR techniques applied and explains their applicability in the field of RNA structural and biochemical studies in several model cases. Chapter VII describes the achievement of a complete resonance assignment of an RNA model molecule (14mer cUUCGg tetral-loop RNA) and introduces a new technique to assign quaternary carbon resonances of the nucleobases. Furthermore, it reports on a conformational analysis of the sugar backbone in this RNA hairpin molecule in conjunction with a parameterization of 1J scalar couplings. Achievements: • Establishment of two new NMR pulse-sequences facilitating the assignment of quaternary carbons in RNA nucleobases • First complete (99.5%) NMR resonance assignment of an RNA molecule (14mer) including 1H, 13C, 15N, 31P resonances • Description of RNA backbone conformation by a complete set of NMR parameters • Description of the backbone conformational dependence in RNA of new NMR parameters (1J scalar couplings) Chapters VII & VIII summarize the real-NMR studies that were conducted to elucidate the conformational switching events of several RNA systems. Chapter VIII gives an overview on the experiments that were accomplished on three different bistable RNAs. These molecules where chosen to be good model systems for RNA refolding reactions and so consequently served as reporters of conformational switching events of RNA secondary structure elements. Achievements: • First kinetic studies of RNA refolding reactions with atomic resolution by NMR • Application of [new] RT-NMR techniques either regarding the photolytic initiation of the reaction or regarding the readout of the reaction • Discovery of different RNA refolding mechanisms for different RNA molecules Deciphering of a general rule for RNA refolding methodology to conformational switching processes of RNA tertiary structure elements. The models for these processes were a) the guanine-dependent riboswitch RNA and b) the minimal hammerhead ribozyme. Achievements: • NMR spectroscopic assignment of imino-resonances of the hypoxanthine bound guanine-dependent riboswitch RNA • Application of RT-NMR techniques to monitor the ligand induced conformational switch of the aptamer domain of the guanine-dependent riboswitch RNA at atomic resolution • Translation of kinetic information into structural information • Deciphering a folding mechanism for the guanine riboswitch aptamer domain • Application of RT-NMR techniques to monitor the reaction of the catalytically active mHHR RNA at atomic resolution In the appendices the new NMR pulse-sequences and the experimental parameters are described, which are not explicitly treated in the respective manuscripts.
NMR-spektroskopische Untersuchungen zur Bindung kleiner Moleküle an das Zellzyklusprotein CDC25A
(2010)
Viele verschiedene Funktionen der Zelle werden durch posttranslationale Modifikationen von Proteinen reguliert. Die reversible Phosphorylierung der OH-Gruppen der Aminosäuren Serin, Threonin und Tyrosin ist eine der Möglichkeiten die Aktivität von Proteinen an- und abzuschalten und Interaktion mit Bindungspartnern zu ermöglichen oder zu verhindern. Die Phosphatase CDC25A übernimmt eine zentrale Rolle in der Steuerung des Zellzyklus, unterliegt selbst wiederum einer differenzierten Kontrolle durch Änderung des Expressionslevel, Phosphorylierung und Lokalisation innerhalb der Zelle. Da eine Überfunktion von CDC25A mit einer Vielzahl von verschiedenen Krebserkrankungen assoziiert ist, wird die Entwicklung starker und selektiver Inhibitoren, die auch in vivo wirksam sind, vorangetrieben. Die strukturellen Grundlagen selektiver Inhibition sind allerdings noch unzureichend erforscht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Grundlagen für eine erfolgreiche Durchführung von NMR-Experimenten gelegt, für die Proteinproben mit hoher Konzentration und Langzeitstabilität benötigt werden. CDC25A kann nicht in der vollen Länge exprimiert werden und wäre als Vollkonstrukt auch zu groß, um effektiv per NMR untersuchbar zu sein. Durch Erzeugung diverser Konstrukte der katalytischen Domäne von CDC25A konnte ein Expressionslevel erreicht werden, der die Erzeugung ausreichender Mengen an Protein praktikabel macht. Neben des oftmals geringen Expressionslevels ist ein weiteres Problem bei NMR-spektroskopischen Untersuchungen vieler Phosphatasen deren geringe Stabilität während der Aufreinigung und in der endgültigen Probe. Durch Optimierung der Pufferbedingungen für den Zellaufschluss in Bezug auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Kations per „Incomplete Factorial Design“ konnte die Ausbeute an löslichem Protein erheblich gesteigert werden. Die Verwendung dieser Pufferbedingungen während der ersten Aufreinigungsschritte verminderte auch die Tendenz des Proteins während der Chromatografie auszufallen. Die Zusammensetzung des Puffers für die endgültige NMR-Probe wurde schließlich durch das aus der Kristallografie entlehnte Verfahren der Dampfdiffusion ebenso in Hinblick auf pH-Wert, Salzkonzentration und Art des Anions optimiert. Unter diesen optimierten Pufferbedingungen wurde die katalytische Aktivität des Proteinkonstrukts anhand der Hydrolyse von para-Nitrophenylphosphat nachgewiesen. Acht Substanzen wurden auf Inhibition dieser katalytischen Aktivität getestet. Das natürliche Substrat Phosphotyrosin zeigte eine kompetitive Hemmung, zwei starke und ein schwacher Inhibitor zeigten entsprechend verminderte Reaktionsraten. Von den restlichen 4 Substanzen (Inhibitoren anderer Protein-Tyrosin-Phosphatasen und strukturelle Verwandte) zeigten 3 weitere eine starke Wirkung. Diese hohe Promiskuität gegenüber Inhibitoren stellt ein großes Problem für die strukturgetriebene Wirkstoffentwicklung bei CDC25A und generell aller Phosphatasen dar. Nach Erhalt der fertigen Proben zeigten erste 2D-NMR-Spektren eine geringer als zu erwartende Zahl von Signalen und starke Überlappungen der sichtbaren Signale. Um auszuschließen, das Dimerisierung oder unspezifische Aggregation hierfür verantwortlich sind, wurden DOSY-Spektren gemessen. Aus der Eigendiffusionsrate ergibt sich ein hydrodynamischer Radius, der mit durch HYDROPRO simulierten Werten übereinstimmt und sich deutlich von dem des putativen Dimers absetzt. Daher wird davon ausgegangen, dass die Signalverluste im NMR nicht durch Dimerisierung oder Aggregation ausgelöst werden. Um die Bindung von Inhibitoren auch durch NMR-Spektroskopie nachzuweisen, wurden Saturation-Transfer-Difference-Experimente (STD) durchgeführt. In diesen war aber sowohl für das natürliche Substrat Phosphotyrosin als auch für alle im Enzymtest aktiven Inhibitoren kein Effekt nachweisbar. Dies weist auf eine sehr hohe koff-Rate der Bindung an das Protein hin oder auf eine irreversible chemische Modifikation des aktiven Zentrums, die bis zum Zeitpunkt der Messung bereits abgeschlossen war. Für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung werden spezifische Interaktionspunkte auf der Proteinoberfläche gesucht. Hierfür wurden 15N-HSQC-Spektren mit und ohne Bindungspartner gemessen und die Veränderungen der chemischen Verschiebung bestimmt („chemical shift perturbation“). Es konnten für Phosphotyrosin und die beiden starken Inhibitoren BN82002 und NSC663284 signifikante Veränderungen nachgewiesen werden. Für alle drei Moleküle gab es sowohl komplett einzigartige Veränderungen als auch paarweise übereinstimmende als auch ein Signal das für alle 3 übereinstimmt. Neben den Inhibitoren wurden drei Peptide auf spezifische Interaktion getestet. Das erste entspricht der Zielsequenz des natürlichen Substrats CDK, die anderen beiden sind Teile der Sequenz von CDK an einer nachgewiesenen als auch einer putativen sekundären Interaktionsfläche der beiden Proteine. Auch für die drei Peptide konnten wie für die Inhibitoren individuelle als auch übereinstimmende Signalveränderungen nachgewiesen werden. Als Voraussetzung für die Bestimmung der Oberflächenkontakte, die für die spezifische Bindung von Substrat, Inhibitoren und Interaktionspeptiden nötig sind, wird eine Zuordnung der Signale des 15N-HSQC-Spektrums zu den Aminosäureresten des Proteins benötigt. Hierzu wurden 3D-Tripelresonanz-NMR-Experimente an 15N, 13C-markierten Proben (zusätzlich auch noch 2H-markierte Proben zur Unterdrückung von Relaxationseffekten) durchgeführt. Um die Zuordnung zu unterstützen wurden außerdem Proben mit individuell 15N-markierten Aminosäuren hergestellt, um einem Signal im HSQC zumindest den Typ der Aminosäure zuordnen zu können. Aufgrund der trotz Pufferoptimierung, Deuterierung des Proteins und verringerter Signalüberlagerung in den Spektren der individuell markierten Proben zu geringen Anzahl an Signalen konnten nur kurze Bereiche der Aminosäuresequenz zugeordnet werden. Aufgrund dieser Basis konnte kein aussagekräftiges Mapping erzielt werden.
In der vorliegenden Doktorarbeit wurden die folgenden fünf biochemischen Fragestellungen zu Enzymen und deren Wechselwirkungen mit ihren Substraten mit NMR spektroskopischen Methoden untersucht: (1) Die spontane Bildungsrate von NCarboxymethanofuran (Carbamat) aus CO 2 und Methanofuran im Gleichgewicht und die Beeinflussung der Geschwindigkeit durch FormylmethanofuranDehydrogenase aus Methanosarcina barkeri wurden über 2D ProtonenaustauschSpektroskopie (EXSY) bestimmt. Mit Hilfe der berechneten Geschwindigkeitskonstanten und der bekannten physiologischen Konzentrationen von CO 2 und Methanofuran konnte erstmals gezeigt werden, daß die spontane Carbamatbildungsrate ausreicht, um die in vivoCO 2 Reduktionsraten in methanogenen Archaea erklären zu können. (2) Die Konformation von N 5 ,N 10 Methylentetrahydromethanopterin (Methylen H 4 MPT) in Anwesenheit und in Abwesenheit H 2 bildender MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methanothermobacter marburgensis wurde über TransferNOEMessungen bestimmt. Es wurde nachgewiesen, daß die Bindung zu einer Konformationsänderung des Substrats führt, welche die ReSeitenStereospezifität des Enzyms erklären kann. (3) Die Stereospezifität des Hydridtransfers von MethylenH 4 MPT auf NADP , katalysiert von NADPabhängiger MethylenH 4 MPTDehydrogenase aus Methylobacterium extorquens AM1, wurde NMRspektroskopisch untersucht. In Übereinstimmung mit der unter (2) entwickelten Theorie zum Übergangszustand des Hydridtranfers wurde gefunden, daß auch der Transfer auf NADP ReSeitenspezifisch in Bezug auf MethylenH 4 MPT verläuft. Zusätzlich wurde gezeigt, daß das Enzym das Hydrid auf die ReSeite von NADPH überträgt. (4) Die spontane Rate der Kondensationsreaktion von Glutathion und Formaldehyd zu SHydroxymethylglutathion wurde mit EXSYMessungen bestimmt. In Zellextrakten des methylotrophen Proteobakteriums Paracoccus denitrificans wurde eine Enzymaktivität nachgewiesen, die diese Reaktion beschleunigt. Bislang wurde vermutet, daß es eine solche Enzymaktivität nicht gibt. Mit EXSYMessungen konnte nicht nur diese Enzymaktivität nachgewiesen werden, sondern es gelang auch das verantwortliche Enzym, das Glutathion abhängiges FormaldehydaktivierendesEnzym (Gfa) genannt wurde, erstmals zu reinigen und das kodierende Gen zu identifizieren. (5) Die Anzahl der UbichinonBindungsstellen des Cytochrom bc 1 Komplexes aus Bos bovis wurde bestimmt. Dafür wurde eine NMRMethode entwickelt, die es ermöglicht, Bindungsstudien von wasserunlöslichen Cofaktoren an membranständigen Proteinen durchzuführen. Über die Aufnahme und Integration von 1 H, 13 CHSQCSpektren unter Verwendung von HRMASNMR konnte die Konzentration des Ubichinons, das in der Proteoliposomenmembran frei beweglich ist, quantifiziert werden. Verdrängungsstudien mit spezifischen Inhibitoren ermöglichten es dann, durch den Vergleich der freigesetzten Ubichinonkonzentrationen relativ zu der Cytochrom bc 1 Komplexkonzentration nachzuweisen, daß insgesamt drei Ubichinone spezifisch an den Cytochrom bc 1 Komplex binden. Die Ergebnisse werden in 5 Abschnitten beschrieben. Im Anhang zu jedem Abschnitt finden sich die Abdrucke der bereits erschienenen Veröffentlichungen (Abschnitte 1 bis 3) und ein zur Veröffentlichung akzeptiertes Manuskript (Abschnitt 5). In der Einleitung werden die Möglichkeiten aufgezeigt, mit modernen NMRspektroskopischen Methoden Protein LigandWechselwirkung zu studieren. In der Diskussion werden anhand der Ergebnisse die Limitierung, aber auch das noch nicht ausgeschöpfte Potential dieser Methoden erläutert. Während der Doktorarbeit wurden auch Untersuchungen zu den katalytischen Eigenschaften einer energiekonservierenden Hydrogenase aus M. barkeri durchgeführt. Die daraus entstandene Publikation ist im Anhang zu finden.
Die genetische Information innerhalb einer Zelle kodiert nicht nur die spezifische Struktur und Funktion von Proteinen, sondern auch die Entstehung dieser Struktur durch den Prozess der Proteinfaltung. Aus zahlreichen experimentellen und theoretischen Studien wurde offensichtlich, dass Faltung und Entfaltung von Proteinen in vielen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielt. Diese Beobachtungen führten zu der zwangsläufigen Erkenntnis, dass das Unvermögen von Proteinen sich korrekt zu falten oder korrekt gefaltet zu bleiben der Auslöser für viele verschiedene Arten biologischen Fehlverhaltens ist und infolgedessen unterschiedliche Krankheitsformen mit sich bringt. Die strukturelle und dynamische Charakterisierung von nicht-nativen Proteinzuständen ist daher eine wichtige Grundlage einerseits zur Erforschung der krankheitsauslösenden Prozesse, andererseits aber auch zum generellen Verständnis der Proteinfaltung an sich. Allein hochauflösende NMR-Experimente können detaillierte Informationen über Struktur und Dynamiken solcher Zustände auf atomarer Ebene liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde die C-terminale Domäne des humanen Prionenproteins [hPrP(121-230)] unter Bedingungen untersucht, bei denen dieses Protein permanent in einem nicht-nativen Zustand vorliegt. Dies wurde durch die Verwendung einer hochmolaren Harnstofflösung (8 M, pH 2,0) erreicht. Zur Untersuchung dieses nicht-nativen Zustands mittels NMR wurde das PrP(121-230) in E.coli-Zellen isotopenmarkiert exprimiert und in Mengen von einigen Milligramm aufgereinigt. Nach der sequentiellen Zuordnung der 13Ca-, 13Cb-, 13CO-, 1Ha- und 1HN-Resonanzen konnte aus den sekundären chemischen Verschiebungen auf Regionen innerhalb der Polypeptidkette geschlossen werden, die erhöhte b-faltblattartige Konformationsanteile enthalten. Heteronukleare Relaxa-tionsraten wurden zur Untersuchung der konformationellen Dynamik herangezogen. Auch hier konnten Regionen verminderter Mobilität (hydrophobe Cluster) nachgewiesen werden, die mit den zuvor entdeckten Bereichen aus der Analyse der chemischen Verschiebungen übereinstimmten. Die Messung von R1r-Relaxationsraten erbrachte zudem keine Hinweise auf konformationellen Austausch auf der μs-ms-Zeitskala. Weiterhin wurde der Einfluss der Disulfidbrücke auf Konformation und Dynamik des hPrP(121-230) untersucht. Dies wurde durch die Reduktion der Disulfidbrücke und die anschließende Methylierung der beiden Cysteine erreicht. Im Gegensatz zu der Analyse der chemischen Verschiebungen zeigte die Auswertung der konformationellen Dynamiken dramatische Unterschiede zwischen den oxidierten und reduzierten Zuständen des hPrP(121-230). Insbesondere im Bereich um die beiden Cysteine konnten große Unterschiede festgestellt werden; im reduzierten Zustand führte die zusätzliche Bewegungsfreiheit zu erhöhten Dynamiken und gab den Blick auf zusätzliche hydrophobe Bereiche frei, die im oxidierten Zustand durch hohe Relaxationsraten verdeckt geblieben waren. Ein weiterer wesentlicher Unterschied zwischen dem oxidierten und dem reduzierten Zustand des hPrP(121-230), der mit Hilfe des Fluoreszenzfarbstoffes Thioflavin T beschrieben werden konnte, bestand in der Fähigkeit Fibrillen auszubilden; während das oxidierte hPrP diese Eigenschaft besaß, führte der Verlust der intakten Disulfidbrücke zu einer Proteinkonformation, die nicht mehr zur Bildung von fibrillären Strukturen im Stande war. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurden die strukturellen, dynamischen und kinetischen Charakteristika des hPrP(121-230) mit denen des murinen Prionenproteins mPrP(121-232) sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand verglichen. Auf der Basis der chemischen Verschiebungen und der heteronuklearen Relaxationsdaten konnte gezeigt werden, dass beide Proteine in den jeweiligen komplementären Zuständen (oxidiert bzw. reduziert) sehr ähnliche strukturelle und dynamische Eigenschaften besitzen. Aufgrund einiger Aminosäureaustausche in den beiden Proteinsequenzen kommt es jedoch zu kleineren Unterschieden, die jedoch nur in lokalen Bereichen der Polypeptidkette zum Tragen kommen. Somit konnte gezeigt werden, dass das mPrP(121-232) als ein geeignetes Modellsystem für das humane Prionenprotein dienen kann. Abschließend wurde der Einfluss von insgesamt zwölf verschiedenen Punktmutationen, die beim Menschen mit Prionenerkrankungen assoziiert sind, auf das Aggregationsverhalten des mPrP(121-232) untersucht. Dabei fiel zum einen auf, dass die Aggregation mit zunehmender Proteinkonzentration schneller verlief, zum anderen aber auch, dass es insbesondere bei geringen Proteinkonzentrationen zu signifikanten Unterschieden in der Aggregationsgeschwindigkeit der verschiedenen mutierten Proteinkonstrukte kommt. Zusammenfassend ist festzustellen, dass in dieser Arbeit strukturelle und dynamische Eigenschaften der nicht-nativen Zustände von hPrP(121-230) und mPrP(121-232) sowohl im oxidierten als auch im reduzierten Zustand durch die Verwendung von NMRspektroskopischen Experimenten charakterisiert werden konnten. Zudem konnte mit Hilfe von Fluoreszenzspektroskopie das Aggregationsverhalten der einzelnen Proteinzustände beschrieben und in einem ersten Schritt der Einfluss von verschiedenen Punktmutationen auf die Aggregationsgeschwindigkeit ermittelt werden.
Ziel dieser Arbeit war es, mit der Methode der NMR-Spektroskopie strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Fettsäurebindungsproteinen zu untersuchen. NMR-Spektren von Proteinen mit hohem -Faltblattanteil, wie H-FABP, zeigen häufig eine große Dispersion mit einer typischen Verteilung tief- und hochfeldverschobener Signale. Es wurden 1D/2D 1H-NMR Spektren für den Wildtyp und mehrere Mutanten (F4E, F4S, F4S/W8E, W8E, F16E, F16S, K21I, F64S, L66G und E72S) des humanen H-FABP aufgenommen und so weit wie möglich zugeordnet. Auf diese Weise ließ sich bestimmen, ob die typische -Faßstruktur des Wildtyp bei den Mutanten noch intakt ist. Fast alle Mutanten wiesen eine Signalaufspaltung von 10,2 bis 0,4 ppm wie der Wildtyp auf, nur die W8- Mutanten W8E und F4S/W8E zeigen keine Struktur mehr. H-FABP zeigt in NMR-Spektren sogenannte Spinsystem-Heterogenitäten, die auf mehrere parallel existierende konformationelle Zustände zurückzuführen sind und im NMR- Zeitfenster ( < 200 ms) nicht untereinander austauschen. Diese Spinsystem-Heterogenitäten werden nicht direkt durch Liganden verursacht, da sie auch in delipidierten H-FABP-Spektren vorhanden sind. Noch sind sie abhängig von der Position der in räumlicher Nachbarschaft befindlichen Seitenkette des F57, da sie auch in den Spektren einer F57S-Mutante anwesend sind. Eine Relipidierung der H-FABP Proben mit unterschiedlichen Fettsäuren führte zu einer selektiven Bevorzugung einzelner Spinsysteme. So konnte gezeigt werden, daß die Ligandenbindung beim H-FABP nach einem ,,selected-fit" Mechanismus abläuft, bei dem je nach gebundenem Liganden (Palmitin-, Palmitolein-, Stearin- oder Ölsäure) unterschiedliche, schon vorher vorliegende Konformationen des Proteinrückgrates bevorzugt werden. Ein weiterer Teil der hier vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der Lösungsstruktur des humanen B-FABP. Es wurde zur Strukturaufklärung die holo-Form des Proteins verwendetet, die ein Fettsäuregemisch endogener Fettsäuren enthielt. Durch den Einsatz mehrdimensionaler homonuklearer und 15N-editierter NMR-Experimente gelang es, nahezu alle 1H und 15N Resonanzen der Aminosäuren zuzuordnen. Lediglich für K37 konnten in den Spektren keine Signale gefunden werden. Nach einer automatisierten Zuordnung der aus den NOESY-Spektren gewonnenen Abstandsbeschränkungen wurde zur Verfeinerung der Lösungsstruktur des humanen B-FABP ein strukturgefilterter Iterationsprozeß durchlaufen. Mit 2490 Abstandsrandbedingungen zwischen Protonenpaaren sowie 106 stereospezifischen Zuordnungen wurden Torsionswinkeldynamikrechnungen mit abschließender Energieminimierung durchgeführt. Ein mittlerer globaler RMSD-Wert der Proteinrückgratatome von 0,85 ± 0,12 Å erfüllt die Ansprüche einer hochaufgelösten Struktur. Die Tertiärstruktur entspricht einem -Faß bzw. einer -Muschel. Sie besteht aus zehn antiparallelen -Faltblattsträngen und einer kurzen Helix-Turn-Helix Domäne. Die - Faltblattstränge bilden zwei nahezu orthogonale -Faltblätter von jeweils fünf Strängen. Die Lösungsstruktur ähnelt trotz teilweise niedriger Sequenzhomologie den bereits bekannten Strukturen der FABPs aus unterschiedlichsten Organismen. Eine sehr gute Übereinstimmung wurde im Vergleich mit der Lösungsstruktur des H-FABP beobachtet. Die enge Verwandtschaft beider zur Unterfamilie IV gehörenden Proteine äußert sich durch die hohe Sequenzhomologie (67%), die Ähnlichkeit der Konformation und Bindungsaffinität der Liganden, die helikale Konformation am N-Terminus (V1-F4) und ein vergleichbares Wasserstoffbrückennetzwerk innerhalb der Bindungstasche.
Ziel dieser Arbeit war es, mit den Methoden der NMR-Spektroskopie die elektrostatischen Eigenschaften der Xylanase aus Bacillus agaradhaerens in Abhängigkeit vom pH-Wert zu charakterisieren. Für die vorliegende Arbeit wurde das Strukturgen der Xylanase in verschiedene Expressionsvektoren des pET-Systems kloniert, wobei das Enzym auf 207 Aminosäuren verkürzt wurde. Diese Länge entspricht der publizierten Kristallstrukur von Sabini et al. (1999). Die Expression in pET3a und die Aufreinigung des Genproduktes mit Ionenaustauschchromatographie wurde optimiert, sodass homogenes Protein mit guten Ausbeuten erhalten werden konnte. Die Xylanase wurde mit den Isotopen 15N und 13C markiert und heteronukleare, mehrdimensionale NMR-Spektren wurden für die Zuordnung der Resonanzen des Proteins aufgenommen. Die chemischen Verschiebungswerte des Proteinrückgrats und die der aliphatischen Seitenketten wurden vollständig zugeordnet. Als eine weitere Voraussetzung für eine pH-Titration wurden sequenzspezifisch die Resonanzen der Histidin- bzw. Carboxylatgruppen bestimmt. Die Lösungsstruktur der Xylanase wurde anhand mehrerer automatisierter Prozeduren errechnet, um die Zuordnung der Resonanzen zu validieren. Alle Strukturelemente, die bereits aus der Kristallstruktur bekannt sind, wurden korrekt wiedergegeben. Da die Lösungsstruktur mit einem backbone RMSD-Wert von 2.44 ± 0.29 Å hoch 2 als vorläufig zu betrachten war, wurde im Folgenden ausschließlich die Kristallstruktur zur Bewertung der Distanzbeziehungen verwendet. In Abwesenheit des Substrats wurden die pH-abhängigen Resonanzen der Histidin- und Carboxylatgruppen sowie der Amide des Proteinrückgrats gemessen. Die Auswertung ergab 220 Titrationsprofile der 15N- and 13C-Resonanzen in einem pH-Bereich von 3.2 bis 8.7. Durch nichtlineare Regression der gemessenen Werte an eine modifizierte Henderson-Hasselbalch Gleichung wurden die pK S-Werte der Seitenketten von Aspartat und Glutamat, sowie für das C-terminale Carboxylat und für die Histidingruppen bestimmt. Die Titrationskurven der katalytischen Dyade zeigten eine ausgeprägte gegenseitige Wechselwirkung. Die korrespondierenden pK S-Werte stimmen gut mit dem vorhergesagten enzymatischen Mechanismus überein (Sabini et al., 1999) und belegen, dass das Nukleophil Glu94 bei einem neutralem pH-Wert deprotoniert ist, während die Bronsted Säure/Base GIu184 zu ca. 30% protoniert ist. Um die Untersuchungen zur katalytischen Aktivität zu vervollständigen, wurden alle pH-abhängigen [15N]-Resonanzen der Amide des Proteinrückgrats wie auch die der lndolstickstoffe in der Substratbindungsspalte analysiert. Die Wendepunkte konnten dem Titrationsverhalten der benachbarten sauren Aminosäure-Seitenketten zugeordnet werden. Aber es erscheint sehr wahrscheinlich, dass ein wesentlich komplexerer Ablauf stattfindet. Die asymmetrische Wechselwirkung von Trptophan-Seitenketten bezüglich der katalytischen Dyade wie auch das wechselnde Monotonieverhalten der Titrationskurven deuten auf eine simultane Reorganisation der Seitenkettenkonformere bei pH ungefähr gleich 6 und/oder auf eine Änderung des Wasserstoffbrückennetzwerkes innerhalb der Bindungsspalte.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung von kleinen, nicht isotopenmarkierten Proteinen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie. Ziel ist die Aufklärung der Struktur und der biologisch relevanten Wechselwirkung mit anderen Molekülen. Konkret wird die strukturelle Aufklärung der zweiten KunitzDomäne des Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI), TFPI2 beschrieben. Dieses Molekül spielt eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung (Kapitel 2.2) in Säugetieren, in dem es bei kleinsten Verletzungen die Gerinnung unterbindet und so die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen des betroffenen Bezirks aufrecht erhält (Kapitel 2.3). Die untersuchte zweite Domäne des TFPI lagert sich direkt und spezifisch an ein zentrales Molekül der Gerinnungskaskade, den Faktor Xa, an. Neben dieser bio logischen Funktion trägt die Entdeckung des TFPI dazu bei, die strikte Trennung der Gerinnung in zwei voneinander unabhängige Reaktionswege bis zur Bildung des Fibrinpolymers aufzuheben. Zur Bestimmung der Struktur des unmarkierten Proteins wurden NMRSpektren aufgenommen. Neben den im Kapitel 3 beschriebenen Standardexperimenten wur den im Rahmen der Untersuchungen das TACSYExperiment in neuer Art und Weise genutzt (Kapitel 4.2), da die Probe ein ungünstige Relaxationseigenschaften auf wies. Mit dem entwickelten Experimenten ist ein neuer Ansatz zur Bestimmung von Kopplungskonstanten in nichtmarkierten Molekülen nun auch in solchen Proben möglich, da die Güte der abgelesenen Konstanten nicht mehr von der Signalbreite beeinflußt wird. Ausgehend von diesen Untersuchungen wurde ein neues Experiment zur Bestim mung von 3 J(HNH)Kopplungskonstanten entwickelt. Das SIAMTACSY (Kapitel 4.3), ermöglicht die Bestimmung der Kopplungskonstanten nach der DISCOMe thode, für die bislang die Aufnahme von wenigstens zwei Spektren mit unter schiedlichen Methoden nötig war, mit nur einem einzigen Spektrum. Beide Methoden, SIAM--TACSY als auch die in dieser Arbeit näher beschriebene Me thode, umgehen die Notwendigkeit der Aufnahme verschiedener Spektren mit un terschiedlichen Pulssequenzen und Aufnahmebedingungen. Während SIAM--TACSY mit nur einem Experiment auskommt, dessen Daten durch unterschiedliches Post-Processing alle Kopplungskonstanten liefern, müssen mit der in Kapitel 4.2.2 be schriebenen Methode mehrere Spektren desselben Typs aufgenommen werden. Im Verlauf der Arbeit wurden die Resonanzen von 52 von 58 Aminosäuren eindeu tig und vollständig zugeordnet (Kapitel 3.4). Die Spektren liefern die für die Struk turrechnungen notwendigen Parameter (Kapitel 5). Die berechnete Struktur basiert auf 762 DistanzRestraints, 20 DihedralWinkel des ProteinRückgrats und 15 Wasserstoffbrückenbindungen. Diese Parameter wurden zunächst in Distance-Geometry-Berechnungen (Kapitel 6.2) eingesetzt. Zur Verfeinerung der Struktur wurde in den späteren Rechnungen das SimulatedAnnealingVerfahren (Kapitel 6.1) genutzt. In einem iterativen Ver fahren werden die gewonnenen Strukturen -- es wurden immer 100 Strukturen gleichzeitig aus einem Parametersatz berechnet -- analysiert und die korrigierten und überprüften Parameter wieder in die Berechnungen eingesetzt (Kapitel 6.3). Die Struktur der zweiten Domäne des Tissue Factor Pathway Inhibitor ist durch dieses Verfahren sehr gut definiert, was sich in den Werten der Standardabwei chung für die 10 besten Strukturen für den Backbone (1,4 Å) niederschlägt (Kapitel 6.4). Die so bestimmte Struktur beweist die Annahme, daß es sich bei der zweiten Do mäne des TFPI auch strukturell um einen typischen KunitzInhibitor (Kapitel 2.1) handelt, was durch punktuelle Mutationen im Bereich der reactive site bereits funktionell bewiesen war. Die Stabilität der ProteaseInhibitoren gegenüber Verdau und Entfaltung begründet sich in der kompakten Struktur, die durch 3 Disul fidbrücken stabilisiert wird. Die sechs stets 1 gleichweit voneinander in der Sequenz entfernten Cysteine verbinden N und CTerminus (Cys5 -- Cys55 in der BPTI Numerierung), stabilisieren die reactive site (Cys14 -- Cys38) und binden das zentrale Faltblatt an den Rest des Moleküls. Die für KunitzInhibitoren typische Struktur ist im untersuchten Protein bewahrt; weniger gut definiert ist die in eini gen Inhibitoren dieses Typs zu findenden N-terminale AlphaHelix, sie ist in den Struk turen des TFPI2 lediglich angedeutet. Ein Vergleich der Struktur des TFPI2, so wie es in dieser Arbeit untersucht wurde, und der Struktur eines Homologen findet in Kapitel 6.4.3 statt. In dieser Arbeit wird gezeigt, daß die strukturelle Untersuchung des kleinen, un markierten Proteins erfolgreich durchgeführt werden kann. Die Struktur des phar makologisch interessanten Moleküls sollte ein Hilfsmittel bei der Auffindung von neuen, den körpereigenen ähnlichen und damit besser verträglichen Gerinnungs inhibitoren sein. Die neuen NMRMethoden bieten ein innovatives Werkzeug zur Gewinnung von skalaren Kopplungskonstanten mit hoher Effizienz und unter Umgehung der Probleme, die in COSYSpektren mit hohen Linienbreiten auftreten.
Die Untersuchung von RNA mittels NMR-Spektroskopie hat in den letzten Jahren an Bedeutung gewonnen, weil die Zahl der neu entdeckten RNA-Funktionen, wie z.B. RNA-Schalter in Bakterien, stark gestiegen ist. Ziel dieser Arbeit war es, mithilfe der NMR-Spektroskopie einen Beitrag zum besseren Verständnis der biochemischen Prozesse, in die RNA-Moleküle involviert sein können, zu leisten.
Im ersten Teil dieser Arbeit (Kapitel 2, 3 und 4) werden zum einen die Entwicklung neuer Methoden für die RNA-Strukturbestimmung vorgestellt und zum anderen die Leistungsfähigkeit der modernen NMR-spektroskopischen Strukturaufklärung demonstriert.
Im zweiten Teil dieser Arbeit (Kapitel 5) wird die NMR-Spektroskopie zur Untersuchung der RNA-Schalter-Funktion eingesetzt. Die biologische Funktion von RNA oder Proteinen setzt oftmals eine dynamische Struktur voraus und involviert Konformationsänderungen infolge biochemischer Signalweiterleitung. Für die Charakterisierung solcher Prozesse eignet sich die NMR-Spektroskopie insbesondere gut, weil sie in Lösung unter verschiedenen Reaktionsbedingungen angewandt wer-den kann. Durch den direkten NMR-spektroskopischen Nachweis von Basenpaarungen können wichtige strukturelle Eigenschaften (Faltung, Strukturhomogenität und Dynamik) entschlüsselt und in einen Zusammenhang mit der Funktion gebracht werden.
Im Folgenden werden die einzelnen Kapitel vorgestellt.
Nachdem das erste Kapitel eine allgemeine Einleitung in die NMR-Spektroskopie, RNA-Struktur und Funktion der RNA-Schalter darstellt, folgt im Kapitel 2 die Einführung einer neuen Methode, die eine quantitative Bestimmung der Torsionswinkel alpha und zeta in RNA/DNA mittels NMR-Spektroskopie ermöglicht (Abb. 1). Sie basiert auf der Wechselwirkung zwischen dem CH-Dipol und der 31P-CSA, die von der relativen Orientierung abhängig ist. Die Methode wurde für die CH- und CH2-Gruppen in Form von zwei Pulssequenzen (2D- und 3D-G-HCP) zur Messung von insgesamt fünf kreuz-korrelierten Relaxationsraten entlang des RNA/DNA-Rückgrats optimiert. Die Funktionsfähigkeit der Methode wurde zunächst an der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA getestet und zur Bestimmung der Torsionswinkel alpha und zeta genutzt. Die Ergebnisse flossen in die Strukturrechnung der 14mer RNA, die im Kapitel 3 vorgestellt wird, mit ein. Des Weiteren gelang es die Anwendbarkeit der Experimente an einer größeren 27mer RNA zu demonstrieren. Die neue Methode ist deswegen von Bedeutung, weil die Winkel alpha und zeta nicht über 3J-Kopplungskonstanten gemessen werden können.
(Nozinovic, S., Richter, C., Rinnenthal, J., Fürtig, B., Duchardt-Ferner, E., Weigand, J. E., Schwalbe, H. (2010), J. Am. Chem. Soc. 132, 10318-10329.)
Im Kapitel 3 wird die NMR-spektroskopische Bestimmung der Struktur einer Model-RNA, der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA, vorgestellt. Die Strukturrechung wurde mit verschiedenen NMR-Datensätzen, die in der Arbeitsgruppe einschließlich dieser Doktorarbeit gesammelt wurden, durchgeführt. Zusammen mit den Ergebnissen aus dem Kapitel 2 konnte eine sehr präzise Struktur mit einem RMSD von 0,37 Å (20 Strukturen) in sehr guter Übereinstimmung mit experimentellen Daten ermittelt werden. Die gerechnete Struktur repräsentiert eine der gegenwärtig genauesten und umfassendsten Strukturbestimmungen einer RNA, bei der jeder Torsionswinkel quantitativ bestimmt wurde. Einen besonderen Höhepunkt stellt die strukturelle Analyse der 2’OH-Gruppen dar, die im anschließenden Kapitel 4 weiter vertieft wurde.
(Nozinovic, S., Fürtig, B., Jonker, H. R. A., Richter, C., Schwalbe, H. (2010), Nucleic Acids Res. 38, 683-694)
Über Jahre war bekannt, dass die Größe der 1J(C1’,H1’)- und 1J(C2’,H2’)-Kopplungskonstanten innerhalb der Ribonukleotide von der lokalen Struktur des Zuckers und der Orientierung der Nukleobase beeinflusst wird. In dieser Arbeit (Kapitel 4) wurde zum ersten Mal ein systematischer Vergleich zwischen NMR-Messungen und DFT-Rechnungen durchgeführt, der eine eindeutige Zuordnung der Hauptkonformationen des Zuckers (C3’- oder C2’-endo) und der Nukleobase (anti oder syn) anhand der 1J(C,H)-Kopplungskonstanten erlaubt. Die beschriebene Methode wurde an einer größeren 27mer RNA erfolgreich erprobt. Weiterhin wurde erstmalig entdeckt, dass zudem die Orientierung der 2’OH-Gruppe einen signifikanten Einfluss auf die 1J(C,H)-Kopplungen hat (Abb. 3). Mithilfe von NMR-Messungen und DFT-Rechnungen konnte aus 1J(C,H)-Kopplungskonstanten die Orientierung von allen 2’OH-Gruppen in der 14mer cUUCGg-Tetraloop RNA bestimmt werden. Die Methode hat den großen Vorteil, dass 2’OH-Gruppen, die aufgrund des schnellen Austauschs mit Wasser oder D2O keine NMR-Signale liefern, analysiert werden kön-nen.
(Nozinovic, S., Gupta, P., Fürtig, B., Richter, C., Tüllmann, S., Duchardt-Ferner, E., Holthausen, M. C., Schwalbe, H. (2011), Angew. Chem. Int. Ed. 50, 5397-5400)
Im Kapitel 5 wird eine NMR-spektroskopische Untersuchung an der Aptamerdomäne des Adenin-bindenden RNA-Schalters (pbuE) vorgestellt. Im Fokus der Forschung stand die Frage: Welchen Einfluss hat die Länge der P1-Helix auf die Struktur und die Ligandbindung der freien Aptamer-domäne?
Durch den Vergleich von zwei Konstrukten mit unterschiedlich langer P1-Helix war es möglich, intrinsische Scherkräfte, die durch die Ausbildung der P1-Helix in der freien Aptamerdomäne entstehen, festzustellen. Es hat sich im Konstrukt mit der verlängerten P1-Helix gezeigt, dass diese zur Destabilisierung der P3-Helix und des Schlaufenkontakts führen. Diese strukturellen Änderungen haben außerdem zur Folge, dass die Bindungsstärke des Liganden reduziert wird. Die Ergebnisse zeigen, dass ein strukturelles Gleichgewicht zwischen Sekundärstrukturelementen die tertiäre Faltung beeinflusst und die Funktion moduliert.
(Nozinovic, S., Reining, A., Noeske, J., Wöhnert, J., Schwalbe, H. (2011), in Vorbereitung)
The formation and maintenance of a defined three-dimensional structure is a prerequisite for most proteins in order to fulfill their function in the native context. However, there are proteins, which are intrinsically unstructured and thus natively unfolded. In addition, the misfolding and aggregation of many proteins can lead to severe diseases. The investigation of non-native states of proteins significantly contributes to the understanding of protein folding and misfolding. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is the only known technique that can provide information on structure and dynamics of non-native states of proteins at atomic resolution. Unfolded and non-native states of proteins have to be treated as ensembles of rapidly interconverting conformers and their observed properties are ensemble and time averaged. In this thesis, hen egg white lysozyme (HEWL) and mutants thereof have been investigated by NMR spectroscopy. The reduction of its four disulfide bridges and the successive methylation of the cysteine residues renders HEWL permanently non-native (‘HEWL-SMe’). Alternatively, the exchange of the eight cysteines for alanines results in very similar states (‘all-Ala-HEWL’). Under these conditions, HEWL-SMe and all-Ala-HEWL do not resemble random coil conformations, but exhibit residual secondary and tertiary structure. The presence of hydrophobic clusters and long-range interactions around the proteins six tryptophan residues and the modulation of these properties by single-point mutants has been observed. For the NMR spectroscopic investigation, HEWL has been isotopically labelled in E. coli by expression into inclusion bodies. After purification, the 1HN, 15NH, 13Calpha, 13Cbeta, 13C’, 1Halpha and 1Hbeta resonances of HEWL-SMe and all-Ala-HEWL have been assigned almost completely using three-dimensional NMR experiments. The analysis of secondary chemical shifts revealed regions in the proteins sequence — particularly around the six tryptophan residues—with significantly populated alpha-helix like conformations. In order to further elucidate the influence of the tryptophan side chains, a set of two new pulse sequences has been developed that allowed for the successful assignment of the 13Cg, 15Ne and 1HNe resonances in these side chains. This knowledge was eventually exploited in the interpretation of two-dimensional 15N-1H photo-CIDNP spectra, which revealed a differential solvent accessibility of the tryptophan residues in all-Ala-HEWL but not in the single point mutant W62G-all-Ala-HEWL. In addition, heteronuclear R2 relaxation rates have been determined for the indole 15Ne nuclei of all-Ala-HEWL and W62G. While in the wild-type like all-Ala-HEWL, the rates are different among the six tryptophan residues, in W62G they are more uniform. Together with relaxation data from the amide backbone, these results indicate the significant destabilization of the hydrophobic clusters in the absence of W62. In contrast, in the W108G mutant the profile of the R2 relaxation rates was not found to be significantly altered. No evidence was found by R1rho relaxation rates and relaxation dispersion measurements for conformational exchange on slower (micro- to millisecond) timescales. Residual dipolar couplings have been determined for non-native HEWL in order to retrieve structural information of these states. The differences of the W62G and the wild-type like non-native HEWL is also picked up in NH-RDCs of these proteins aligned in polyacrylamide gels. Significant positive RDCs are observed in the regions of the hydrophobic clusters in all-Ala-HEWL, but to a much lesser degree in W62G. So far, all attempts to simulate RDCs from generated non-native ensembles failed even when including long-range contacts or specific phi/psi backbone angle propensities. However, the measured RDCs can be used to cross-validate structural ensembles of non-native HEWL generated by molecular dynamics simulations that are based on restraints from the other experimental data, such as the differential solvent accessibilities from the photo-CIDNP experiments and the data on the hydrophobic clustering gained from the combined mutational and relaxation studies. Finally, non-native HEWL has been investigated for the first time using two-dimensional NMR in organic solvents, which are able to induce secondary structures and ultimately lead to amyloid formation. Under these conditions severe line broadening was observed, which was attributed to exchange between different — mostly a-helical— conformations. In summary, in this thesis methods have been developed, optimized and successfully applied for the structural and dynamical characterization of non-native states of proteins and the effect of single-point mutants on the properties of such ensembles has been investigated. Data has been gained that can considerably contribute to the further elucidation of the nature of non-native states of HEWL by molecular dynamics simulations.
Starke allergische Reaktionen gegen nicht spezifische Lipidtransfer Proteine sind im Mediterranen Raum weit verbreitet. LTPs besitzen als Klasse 1 Nahrungsmittelallergene vermutlich die Fähigkeit über den oralen Weg, durch den Verzehr von Nahrung, eine Sensibilisierung auszulösen. Zu Beginn dieser Arbeit wurde jedoch in der Literatur die Möglichkeit diskutiert, ob auch bei einer LTP-Sensibilisierung eine Pollen-assozierte Nahrungsmittelallergie vorliegen könnte. Untersuchungen zur IgE-Bindungskapazität von Lebensmittel- und Pollen-LTPs zeigten partielle Kreuzreaktivitäten. Eine Aussage über eine einheitliche Tendenz zur stärkeren IgE-Bindungskapazität konnte anhand der derzeitigen Ergebnisse weder für die Lebensmittel- noch für die Pollen-LTP-Gruppe getroffen werden. Dementsprechend lag kein eindeutiger Hinweis zur Korrelation zwischen der Sensibilisierung gegen Pollen- und Nahrungsmittel-LTPs vor, wodurch die Frage zur Fähigkeit der einzelnen LTPs kausal eine Allergie auszulösen weiterhin offen bleibt. Die Untersuchungen dieser Arbeit fokussierten sich auf die Lebensmittelallergene und sollten ihre klinische Bedeutung analysieren und Aufschluss über die Fähigkeit dieser Allergene eine Allergie kausal auszulösen bringen. Hierbei sollte untersucht werden, ob jedes Nahrungsmittel-LTP die Fähigkeit besitzt eine IgE-Sensibilisierung auszulösen oder ob ein LTP als primär sensibilisierendes Agens wirkt und nachfolgend immunologische Kreuzreaktionen zu anderen LTPs auftreten. Aufgrund der großen Häufigkeit von Patienten mit einer Pfirsichallergie im mediterranen Raum mit einer Sensibilisierung gegen das Pfirsich-LTP (Pru p 3), sowie einer schweren Symptomatik, wird vermutet, dass dieses Allergen eine wichtige Rolle spielt und eventuell als primär sensibilisierendes Agens fungieren könnte. Zur Identifizierung eines primär sensibilisierenden Agens sollte das Ausmaß der Antikörper-Kreuzreaktivität, die Aufschluss über die Affinität und Vorkommen gemeinsamer Epitope liefern soll, untersucht werden. Weiterhin sollte die IgE-Prävalenz der einzelnen Allergene, ihre Immunogenität (T-Zell-Kreuzreaktivität und in vivo Antikörperinduktion) und die biologische Potenz untersucht werden. Um der Fragestellung nachzugehen wurden die LTPs aus taxonomisch verwandten (Kirsche, Pru av 3 und Pfirsich, Pru p 3) und nicht verwandten (Haselnuss, Cor a 8 und Salat, Lac s 1) Lebensmitteln in die Studie einbezogen. Für die Untersuchungen standen 51 Seren von spanischen Lebensmittelallergikern zur Verfügung, deren Allergien gegen Pfirsich, Salat, Haselnuss und Kirsche anamnestisch und serologisch erfasst wurden. Die Relevanz der LTPs wurde durch die Schwere der klinischen Symptomatik deutlich. LTPs besitzen eine hohe Stabilität gegenüber thermischer und proteolytischer Prozessierung. Natürliches Pru p 3 zeigte bei einer Erhitzung auf 90°C zum größten Teil eine intakte Sekundärstruktur. Diese Eigenschaften könnten die Aufnahme von intakten Allergenen im gastrointestinalen Trakt begünstigen, wodurch die teilweise starken allergischen Reaktionen erklärt werden können. Bei der Untersuchung zur Relevanz von Pru p 3 im Vergleich zu Lac s 1, Cor a 8 und Pru av 3 wurde die IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität und biologische Potenz untersucht. Spezifisches IgE gegen Lac s 1 (93%), Pru p 3 (90%), Cor a 8 (88%) und Pru av 3 (85%) wurde mittels ImmunoCAP-FEIA in der jeweiligen Lebensmittelallergikergruppe gefunden und quantitativ bestimmt. Alle untersuchten Lebensmittel-LTPs erwiesen sich als Hauptallergene in der jeweiligen Patientengruppe. Bei Untersuchungen der IgE-Bindekapazität zeigten alle untersuchten Patienten, mit Ausnahme von einem, eine stärkere IgE-Bindungen gegen Pru p 3 im Vergleich zu Cor a 8. Demnach korreliert eine IgE-Sensibilisierung gegen Cor a 8 mit der gegen Pru p 3. Lac s 1 zeigte in einigen Fällen eine stärkere IgE-Bindung im Vergleich zu Pru p 3 und umgekehrt. Mit Ausnahme eines Patienten war eine IgE-Sensibilisierung gegen Lac s 1 immer mit der gegen Pru p 3 assoziiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in Einzelfällen spezies-spezifische Epitope beobachtet wurden, während IgE-Reaktivitäten gegen LTPs, die nicht zu der Familie der Rosengewächse gehören, in seltenen Fällen ohne eine begleitende Sensibilisierung gegen Pru p 3 auftraten. Die IgE-Bindung an Pru p 3 konnte durch Cor a 8 und Lac s 1 maximal bis 60% inhibiert werden, während Pru p 3 eine komplette Inhibition der Cor a 8 und Lac s 1 IgE-Bindung bewirkte. Demnach besitzt Pru p 3 alle IgE-Epitope von Lac s 1 und Cor a 8 und/oder eine stärkere Affinität zu den IgE-Antikörpern. Cor a 8 zeigte, trotz der Fähigkeit schwere Symptome auszulösen, eine relativ geringe biologische Potenz. Lediglich bei einem von fünf untersuchten Patienten zeigte Lac s 1 eine starke maximale Histaminfreisetzung. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten die stärkste biologische Potenz bei allen untersuchten Pfirsichallergikern. Ein Salatallergiker ohne Pfirsichallergie zeigte durch die Stimulation mit Pru p 3 eine geringe Mediatorfreisetzung, wodurch dem Allergen Pru p 3 in Einzelfällen ohne klinische Symptomatik gegen das Allergen nicht zwangsläufig die stärkste biologische Potenz zugeschrieben werden kann. Pru p 3 und Pru av 3 zeigten aufgrund einer hohen Sequenzidentität von 85% nahezu identische IgE-Bindekapazitäten, IgE-Kreuzreaktivitäten, sowie eine ähnliche biologische Potenz. Eine Kreuzreaktivität auf T-Zell-Ebene wurde ebenfalls zwischen Pru p 3 und Pru av 3 detektiert, während im murinen System mittels RBL-2H3-Mediatorfreisetzungstest keine Kreuzreaktivität unter allen untersuchten Lebensmittel-LTPs nachweisbar war. Fehlende T-Zell-Kreuzreaktivitäten zwischen Pru p 3/Cor a 8 und Pru p 3/Lac s 1 deuten auf unterschiedliche T-Zell-Epitope der untersuchten Proteine hin. Um eine generelle Aussage über die T-Zell-Kreuzreaktivität treffen zu können, wären weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien erforderlich. Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass dem Allergen Pru p 3 hinsichtlich IgE-Prävalenz, IgE-Bindekapazität, IgE-Kreuzreaktivität im Inhibitions-ELISA und der biologischen Potenz im Mediatorfreisetzungstest die bedeutendste Rolle unter den untersuchten LTPs zukommt. In Einzelfällen konnten jedoch spezies-spezifische Epitope nachgewiesen werden, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass Pru p 3 nicht das alleinige Immunogen sein kann. Weiterhin waren alle untersuchten LTPs im murinen System immunogen, wodurch die Annahme verstärkt wird, dass jedes untersuchte LTP eine Allergie kausal auslösen kann. Unterstützt wird diese Vermutung durch die fehlende Kreuzreaktivtität der murinen IgE-Antikörper. Eine eindeutige Aussage kann aufgrund der erhaltenen Ergebnisse derzeit noch nicht getroffen werden, da weitere systematische T-Zell-Proliferationsstudien und Inhibitions-ELISA der Maus-Immunsera in dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt werden konnten.
Im ersten Abschnitt der Doktorarbeit wurden kurze alpha-helikale Modellpeptide mit Oligosacchariden, die Teile der Core-Region der N-Glycane bilden, N-glycosyliert, um den konformationellen Effekt der N-Glycosylierung auf das Peptidrückgrat zu untersuchen. CD- und NMR-Untersuchungen ergaben, daß die Konformation der N-Glycopeptide durch die Größe der angehängten N-Glycanreste und die Wahl der Aminosäurereste nahe der Glycosylierungsstelle beeinflußbar war. Die signifikantesten konformationellen Änderungen ergaben die N-Glycosylierung mit einem Monosaccharid beziehungsweise einem Pentasaccharid. Die Kombination von organischer Synthese mit biologischen Methoden ermöglicht es heute, neben den 20 natürlichen Aminosäuren, auch unnatürliche Aminosäuren ortsspezifisch in Proteine einzubauen. Dabei wird das Codon für die jeweilige Aminosäure durch Oligonucleotid-Mutagenese durch das Nonsense-Codon UAG ersetzt. Für dieses spezielle Codon wird eine Suppressor-tRNA hergestellt und in vitro chemisch mit der gewünschten unnatürlichen Aminosäure aminoacyliert. Mit dem späteren Ziel einer in vitro-N-Glycoproteinsynthese wurde hier die Darstellung von N-glycosylierten Aminosäuren und der Versuch der Anknüpfung an ein Dinukleotid pdCpA beschrieben. Die für die Aminoacylierung des Dinukleotids geeigneten Zuckeraminosäuren trugen Nterminal die photochemisch abspaltbare NVOC-Schutzgruppe, Acetylgruppen an den Zucker-OH-Funktionen und eine Cyanomethylaktivesterfunktion am C-Terminus. Die Aminoacylierungsreaktionen führten nicht zu dem gewünschten N-Glycosylaminoacyldinukleotid. Insbesondere durch die Wahl anderer Zuckerschutzgruppen sollte dennoch die Acylierung des Dinukleotids pdCpA mit einer N-glycosylierten Aminosäure gelingen. Der dritte Teil der Doktorarbeit beinhaltete die Synthese eines Prionen-N-Glycoproteins über chemische Ligation eines Thioesters mit einem Cystein-Peptid. Die Verknüpfung von Peptidfragmenten erlaubt die selektive Isotopen-Markierung, was die Strukturaufklärung mit Hilfe der NMR-Spektroskopie enorm vereinfacht. Die Funktion der Glycosylierung des Prionenproteins scheint in wenigen Aspekten geklärt zu sein. Unklar ist, ob die N-Glycosylierung auch die Konformation des Prionenproteins verändern kann. Ein kurzes Prionen-N-Glycopeptidfragment SHA PrP172-194 aus der Helix B des Prionenproteins wurde der Strukturanalyse unterzogen, wobei ein Effekt der NGlycosylierung auf die Konformation des Peptidrückgrats verzeichnet werden konnte. Motiviert durch diese Ergebnisse wurden in der Doktorarbeit das Prionenproteinfragment SHA PrP12l-178 als N-terminales Thioesterfragment und das Fragment SHA PrP179-231 als C-terminales Cystein-Peptid mit Festphasenpeptidsynthese dargestellt. Mit diesen wasserlöslichen Proteinfragmenten wurde erfolgreich eine chemische Ligation unter denaturierenden Bedingungen durchgeführt. Da man selektiv Isotopen-markierte Proteine herstellen wollte, war man auf die biochemische Expression des N-terminalen Thioesterfragments SHA PrPl2l-178 angewiesen. Dr. S. Becker (Max-Planck-Institut für Biophysikalische Chemie, Göttingen) gelang die Expression eines unmarkierten Prionen-Inteinfusionsproteins, aus dem durch Thiol-vermittelte Inteinspaltung ein Thioester generiert werden konnte. Auch mit diesem biochemischen Ligationsansatz konnte das Fragment SHA PrP121-23l erhalten werden. Ein N-glycosyliertes Prionenfragment SHA PrP179-231 wurde in der vorliegenden Doktorarbeit ebenfalls dargestellt und steht für Intein-vermittelte Ligationsreaktionen zur Verfügung.
C-Typ Lektin-ähnliche Rezeptoren (CTLRs) auf Lymphozyten des Immunsystems modulieren deren Effektorfunktionen wie Zytotoxizität oder Zytokinsekretion. Die Gene dieser Immunrezeptoren befinden sich in einer definierten genomischen Region, dem Natürlichen Killer Genkomplex (NKC), welcher im Menschen auf Chromosom 12 und in der Maus auf Chromosom 6 lokalisiert ist. Namensgebend für diesen Gencluster ist die erste Beschreibung von CTLRs auf Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen), den Effektorlymphozyten des angeborenen Immunsystems. Einige NKC-kodierte CTLR, insbesondere Vertreter der C-Typ Lektin Familie 2 (CLEC2)-Rezeptorfamilie, werden jedoch auch in nicht-lymphozytären Zellen (z.B. humanes KACL in Keratinozyten, Maus Clr-f in Darmepithelzellen) vorgefunden und in Zusammenhang mit einer gewebsspezifischen Immunüberwachung gebracht. Bemerkenswerterweise sind die Lymphozytenassoziierten Rezeptoren dieser CLEC2-Proteine ebenso CTLRs, welche zudem eng benachbart zu den CLEC2-Proteinen im NKC kodiert sind, sodass es sich um genetisch gekoppelte Rezeptor-Liganden-Paare mit immunologischer Funktion handelt.
Zu Beginn der vorliegenden Arbeit richtete sich das Interesse auf ein bislang uncharakterisiertes Mitglied der CLEC2-Proteinfamilie (CLEC2L), das jedoch außerhalb des NKC und in unmittelbarer Nachbarschaft zu einem weiteren und ebenso uncharakterisierten CTLR (KLRG2) kodiert ist. Im Unterschied zu anderen Mitgliedern der CLEC2-Familie ist CLEC2L (wie auch KLRG2) in Säugetieren hochkonserviert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob CLEC2L wie andere Mitglieder der CLEC2-Proteinfamilie eine gewebsspezifische Expression aufweist, mit einem genetisch gekoppelten CTLR, d. h. mit KLRG2, interagiert und funktionell in Verbindung mit dem Immunsystem gebracht werden kann. Ziel dieser Arbeit war es somit, eine detaillierte Expressions- und Funktionsstudie zu CLEC2L durchzuführen.
Mittels quantitativer Echtzeit-PCR und in situ Hybridisierung konnte CLEC2L-RNA im humanen und Maus-Gehirn nachgewiesen werden. Da die Mengen dort das Expressionsniveau in anderen Organen bei Weitem überstiegen, wurde das CLEC2L-kodierte Protein als BACL (engl. Brain-Associated C-type Lectin) neu benannt. Ektop exprimiertes BACL bildet ähnlich wie viele andere CLEC2-Mitglieder ein disulfid-verknüpftes Homodimer auf der Zellmembran von Säugetierzellen. Um die endogene Proteinexpression dieses gehirnassoziierten „Waisen"-Rezeptors zu charakterisieren, wurde die BACL-Ektodomäne rekombinant produziert und als Immunogen zur Herstellung BACLspezifischer Antikörper eingesetzt. Mit diesen Antikörpern und einer Kombination immunologischer Techniken wie Immunhistochemie, Immunfluoreszenz und Immunpräzipitation konnte die Präsenz von BACL auf humanen und Maus-Neuronen des Gehirns mit einer besonders ausgeprägten Expression in Purkinje-Zellen zum ersten Mal gezeigt werden. Neben dem Gehirn wurden andere Bereiche des Nervensystems, darunter Spinalganglien und Retina, auf die Expression des BACL-Proteins untersucht. Hierbei konnte mittels Immunfluoreszenz und hochauflösender konfokaler Mikroskopie gezeigt werden, dass BACL mit Neuronenmembranen assoziiert ist. Die durchflusszytometrische Analyse von in vitro kultivierten Neurosphären untermauerte die Expression von endogenem BACL als membranständiges Oberflächenprotein.
Diverse Ansätze zur Identifizierung von Interaktionspartnern von BACL erbrachten letztlich keine eindeutigen Ergebnisse. KLRG2 wurde ursprünglich aufgrund seiner benachbarten genomischen Lokalisation als möglicher Rezeptor von BACL favorisiert, jedoch konnten weder Reporterassays noch durchflusszytometriebasierte Bindungsanalysen eine Interaktion dieser beiden Proteine aufzeigen. Auch die aus den massenspektrometrischen Analysen von humanen und Maus BACL-Immunpräzipitaten erhaltenen Kandidatenproteine konnten letztendlich nicht als Interaktionspartner von BACL eindeutig verifiziert werden.
Eine mögliche immunologische Bedeutung von BACL in vivo wurde im Rahmen von Tumorimplantationsexperimenten mit BACL-exprimierenden Tumorzellen untersucht. Hierbei wurde das Tumorwachstum von BACL- mit Kontroll-Transfektanten in C57BL/6 Mäusen verglichen. Der beobachtete Effekt des verlangsamten Tumorwachstums nach BACL-Überexpression war jedoch nicht auf BACL-Erkennung durch Lymphozyten zurückzuführen, wie anhand von immundefizienten Rag1-k.o. und NOD-SCID-gammak.o. Mäusen gezeigt werden konnte.
Insgesamt liefert diese Arbeit die Erstbeschreibung des bislang uncharakterisierten CTLRs BACL. Das Protein teilt strukturelle Merkmale mit Mitgliedern der CLEC2-Familie, unterscheidet sich jedoch deutlich durch (i) seine hohe Konservierung in Säugetieren, (ii) seine Kodierung außerhalb des NKC und (iii) seine pan-neuronale Expression. Die Erkenntnis, dass BACL in Maus- und in humanen Neuronen exprimiert wird, wirft die Frage nach seiner funktionellen Relevanz auf. Als Membranprotein könnte es eine wichtige Rolle in der neuronalen Kommunikation und bei zellulären Kontakten spielen. Die Frage nach der Funktion von BACL wird in zukünftigen Forschungsarbeiten zu klären sein.
Das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO) spielt eine entscheidende Rolle in der Generierung von Leukotrienen. Diese fungieren als wichtige proinflammatorische Mediatoren. Darüber hinaus ist die 5-LO anhand ihrer N-terminalen Domäne in der Lage mit verschiedenen Proteinen zu interagieren. Unter den Interaktionspartnern befindet sich Dicer, ein Enzym welches für den finalen Schritt der microRNA (miRNA)-Biosynthese verantwortlich ist. MiRNA sind kurze, nicht kodierende RNA Stränge mit einer typischen Länge von etwa 23 Nukleotiden, die an der posttranskriptionalen Regulierung der Proteinbiosynthese beteiligt sind.
Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss der 5-LO auf die miRNA-Prozessierung im zellulären Kontext zu untersuchen. Als Modellsystem wurde die MonoMac6 (MM6) Zelllinie ausgewählt. MM6-Zellen exprimieren im undifferenzierten Grundzustand nur geringe Mengen an 5-LO. Erst nach Differenzierung mittels transformierenden Wachstumsfaktors ß (TGFß) und Calcitriol kommt es zur Induktion der 5-LO Proteinbiosynthese. Darüber hinaus war es Basavarajappa et al. möglich die 5-LO-Expression in diesen Zellen mittels RNA-Interferenz stark herunter zu regulieren (Δ5-LO).
Um die Frage der Auswirkungen des 5-LO knockdowns auf die miRNA-Expression analysieren zu können, wurde ein Microarray in differenzierten Kontroll-und Δ5-LO-Zellen durchgeführt.Es wurden 37 miRNAs identifiziert deren Expression 5-LO abhängig ist. Dabei war das Niveau von 30 Vertretern in Abwesenheit der 5-LO erhöht, wohingegen die Expression von sieben miRNAs reduziert war. Unter diesen sieben herunter regulierten miRNAs befanden sich miR-99b-5p und miR-125a-5p, die einem gemeinsamen Cluster entstammen. Als Cluster wird eine Gruppe von miRNAs bezeichnet, die aus einem gemeinsamen primären Transkript (pri-miRNA) hervorgeht. Diese Eigenschaft führte zur Vermutung, dass bereits die Expression dieser pri-miRNA durch die 5-LO reguliert wird. Allerdings zeigte sichim Verlauf dieser Arbeit, dass die Expression der pri-miRNA 5-LO unabhängig verläuft. Im Gegensatz dazu wies die Zwischenstufe zwischen pri-miRNA und reifer miRNA eine reduzierte Expression in Δ5-LO Zellen auf. Für die Prozessierung dieser sogenannten precursor miRNAs (pre-miRNA) ist die Ribonuklease III Drosha verantwortlich, welche die pre-miRNA aus der jeweiligen pri-miRNAs chneidet. Das verringerte pre-miR-99b-und pre-miR-125a-Niveau ist daher ein Hinweis darauf, dass überDicerhinausmöglicherweise ebenfalls die Drosha Aktivität mittels 5-LO reguliert wird.
Des Weiteren wurde untersucht iniefern Leukotriene beziehungsweise 5-LO-Inhibitoren die Expression von miR-99b-5p und miR-125a-5p beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass das miRNA-Niveau unabhängig von der vorhandenen Leukotrien-Menge ist. Das 5-LO aktivierende Protein (FLAP) besitzt dahingegen einen mit der 5-LO vergleichbaren Einfluss auf die reife miRNA. FLAP ist ein weiterer Interaktionspartner der 5-LO und essentiell für die Leukotrien-Biosynthese in vivo. Anhand von Protein-Lokalisationsstudien mittels Immunofluoreszenz konnte gezeigt werden, dass FLAP außerdem in der Lage zu sein scheint die Relokalisation der 5-LO aus dem Zytoplasma in den Nukleus einzuschränken. Im Zytoplasma ist die 5-LO in der Lage mit Dicer zu interagieren. Daten bezüglich einer Interaktion zwischen Drosha und 5-LO im Zellkern liegen bisher nicht vor. Eine etwaige Interaktion könnte allerdings helfen die reduzierten pre-miRNA Spiegel in Abwesenheit der 5-LO zu erklären.
Im Laufe dieser Arbeit wurden weiterhin die Auswirkungen von proinflammatorischen Lipopolysacchariden (LPS) auf die Prozessierung von miR-99b-5p und miR-125a-5p analysiert. Ausschließlich in Anwesenheit von 5-LO zeigte sich eine differenzierungsunabhängig gesteigerte Biosynthese der pri-und der reifen miRNA. Allerdings konnte kein Einfluss von LPS auf die 5-LO-Lokalisation beziehungsweise Expression festgestellt werden. Aufgrund dessen sind weiterführende Studien, die den Zusammenhang zwischen LPS induzierter miR-99b-5p- beziehungsweise miR-125a-5p-Biosynthese und 5-LO herstellen, nötig.
Abschließend hat sich diese Arbeit mit den Zielgenen der durch 5-LO regulierten miRNAs auseinandergesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von miR-99b-5p und miR-125a-5p die Freisetzung der beiden durch LPS stimulierten Zytokine Interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor α (TNFα) gesteigert ist. Interessanterweise besitzt TNFα einen stimulierenden Effekt auf die Leukotrien-Biosynthese. Allerdings konnte kein direkter Zusammenhang zwischen miR-99b-5p/miR-125a-5p Expression, TNFα und der 5-LO Aktivität hergestellt werden. Der Einsatz von miR-99b-5p-und miR-125a-5p-Inhibitoren zeigte keine Auswirkungen auf die Leukotrien-Biosynthese nach LPS Stimulation. Im Gegensatz dazu konnte in unstimulierten Zellen eine signifikante Aktivitätssteigerung in Abwesenheit von miR-125a-5p festgestellt werden. Diese Beobachtungen legen nahe, dass miR-125a-5p einen TNFα unabhängigen Einfluss auf die 5-LO Aktivität besitzt. In LPS stimulierten Zellen kommt es möglicherweise zu Überlagerungen dieses Effektes.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass 5-LO eine regulierende Funktion auf die Reifung der beiden miRNAs miR-99b-5p und miR-125a-5p aufweist. Dieser Effekt könnte einer direkten Interaktion zwischen 5-LO und Dicer zuzuschreiben sein. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Regulierung der Expression bestimmter miRNAs mittels 5-LO nicht auf deren kanonischer enzymatischer Aktivität beruht. Diese Ergebnisse schlagen eine neue Richtung der 5-LO-Forschung ein und können in Zukunft dazu beitragen 5-LO vermittelte Effekte besser charakterisieren zu können.
Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen an GXG Modellpeptiden konnten eindeutig zeigen, dass diese Peptide, auch ohne das Vorhandensein von langreichweitigen Wechselwirkungen, bestimmte Sekundärstrukturen präferieren. Ein Teil der beobachteten, auftretenden Strukturmotive lässt sich hierbei über den sterischen Anspruch der Seitenkette erklären, ein anderer Teil über die Ladung der Seitenkette. In Kombination mit anderen Spektroskopischen Methoden konnten zehn dieser Peptide genauestens untersucht werden. Hierbei zeigte sich, dass diese Peptide nicht nur die favorisierten Regionen des Ramachandran-Diagramms besetzen. Ein Vergleich mit dem Vorkommen bestimmter Aminosäuren, beispielsweise in loop Regionen von Proteinen, zeigt dass die Sequenz dieser loops nicht zufällig ist. Tatsächlich besitzt ein Teil der Aminosäuren, die besonders häufig an bestimmten loop Positionen vorkommen, bereits die intrinsische Vorliebe, die notwendige Konformation einzunehmen. Diese Aminosäuren und die umgebenden loops sind somit eventuell nicht nur das simple Verbindungsglied zwischen zwei Sekundärstrukturen, sondern kommen selbst als Ausgangspunkte für Peptid- bzw. Proteinfaltung in Frage.
Ein weiteres Augenmerk der Arbeit lag auf der Messung von skalaren und dipolaren Kopplungen an isotopenmarkierter RNA. Es wurden vier Pulssequenzen entwickelt, die es ermöglichen, 1J skalare bzw. dipolare Kopplungen in der Zuckerregion von 13C- markierter RNA mit hoher Präzision zu messen. Die entwickelten J-modulierten Experimente ermöglichen die Messung von 1J(H2’C2’), 1J(C1’C2’) sowie 1J(C2’C3’) Kopplungen selbst für größere RNA Moleküle. Die Detektion erfolgt hierbei auf den C1’H1’ Signalen, die Zuordnung der Kerne, deren Kopplung gemessen wird, ist nicht einmal erforderlich. Die Anwendbarkeit konnte für verschiedene Systeme mit 14 bis 70 Nukleotiden demonstriert werden. Die erreichte Präzision ermöglichte es außerdem auch sehr kleine Effekte, wie beispielsweise die Ausrichtung von RNA im Magnetfeld zu detektieren.
Diese Arbeit zeigt außerdem zwei Beispiele für die gezielte Modifikation, um Lanthanid Bindungsstellen einführen zu können. Auf chemischen und biochemischen Weg konnte isotopenmarkierte, in vitro transkribierte RNA modifiziert werden. Die Ergebnisse zeigen eindeutig eine Bindung von Lanthanid-Ionen an die modifizierte RNA. Die auftretenden, eher kleinen Effekte, sind vermutlich auf die noch zu hohe Flexibilität der eingeführten Modifikationen. Vor allem bei der chemischen Modifikation besteht hier noch Potential zur Optimierung, nachdem die generelle Anwendbarkeit der Methode demonstriert wurde.
Der letzte Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Analyse von Kopplungsmustern zur Analyse und zum Vergleichen von Naturstoffen. Hier konnten aus einer Reihe von Derivaten eindeutig die identifiziert werden, die verglichen mit der Ausgangsstruktur, die gleiche Konformation besitzen. Die gewonnenen Ergebnisse decken sich hier mit durchgeführten biologischen Tests, die ebenfalls dasselbe Derivat als aktiv identifizieren konnten, was klar für eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung spricht.
In der vorliegenden Arbeit werden Methoden und Anwendungen gezeigt, um skalare und dipolare Kopplungen im Bereich von Peptiden, Nukleinsäuren und kleinen Molekülen zu nutzen. Die durchgeführten Arbeiten reichen dabei von der speziellen Probenpräparation zur Messung von dipolaren Kopplungen bis hin zur Entwicklung neuer NMR-spektroskopischer Methoden zur Messung von Kopplungen mit höherer Präzision und an größeren Systemen als bisher.
Type 1 diabetes (T1D) is a chronic T cell-mediated autoimmune disorder that results in the destruction of insulin-producing pancreatic ß cells leading to life-long dependence on exogenous insulin. Attraction, activation and transmigration of inflammatory cells to the site of ß-cell injury depend on two major molecular interactions. First, interactions between chemokines and their receptors expressed on leukocytes result in the recruitment of circulating inflammatory cells to the site of injury. In this context, it has been demonstrated in various studies that the interaction of the chemokine CXCL10 with its receptor CXCR3 expressed on circulating cells plays a key role in the development of T1D. Second, once arrived at the site of inflammation adhesion molecules promote the extravasation of arrested cells through the endothelial cell layer to penetrate the site of injury. Here, the junctional adhesion molecule (JAM) JAM-C expressed on endothelial cells is involved in the process of leukocyte diabedesis. It was recently demonstrated that blocking of JAM-C efficiently attenuated cerulein-induced pancreatitis in mice. In my thesis I studied the influence of the CXCL10/CXCR3 interaction on the one hand, and of the adhesion molecule JAM-C on the other hand, on trafficking and transmigration of antigen-specific, autoaggressive T cells in the RIP-LCMV mouse model. RIP-LCMV mice express the glycoprotein (GP) or the nucleoprotein (NP) of the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) as a target autoantigen specifically in the ß cells of the islets of Langerhans and turn diabetic after LCMV-infection. In my first project I found that pharmacologic blockade of CXCR3 during development of virus-induced T1D results in a significant delay but not in an abrogation of overt disease. However, neither the frequency nor the migratory properties of islet-specific T cells was significantly changed during CXCR3 blockade. In the second project I was able to demonstrate that JAM-C was upregulated around the islets in RIP-LCMV mice after LCMV infection and its expression correlated with islet infiltration and functional ß-cell impairment. Blockade with a neutralizing anti-JAM-C antibody slightly reduced T1D incidence, whereas overexpression of JAM-C on endothelial cells did not accelerate virus-induced diabetes. In summary, our data suggest that both CXCR3 as well as JAM-C are involved in trafficking and transmigration of antigen-specific autoaggressive T cells to the islets of Langerhans. However, the detection of only a moderate influence on the onset of clinical disease during CXCR3 or JAM-C blockade reflects the complex pathogenesis of T1D and indicates that several different inflammatory factors need to be neutralized in order to achieve a stable and persistent protection from disease.
Der bc1-Komplex ist eine Komponente der Atmungskette und damit essentiell für den Energiestoffwechsel vieler Organismen, die zum aeroben Wachstum befähigt sind. Im Vergleich zu mitochondrialen bc1-Komplexen, die bis zu elf unterschiedliche Untereinheiten besitzen, ist das Enzym aus Paracoccus denitrificans mit nur drei Untereinheiten einfach aufgebaut. Vergleicht man die Sequenz des P. denitrificans Cytochrom c1 Genproduktes mit denen anderer prokaryotischer und mitochondrialer Cytochrom c1 Untereinheiten, so fällt auf, dass dieses prokaryotische Protein eine für Paracoccus charakteristische zusätzliche N-terminale Domäne von ca. 150 Aminosäuren trägt, die zudem eine sehr auffällige Zusammensetzung besitzt (40% saure Reste, 40% Alanine, keine einzige positiv geladene Aminosäure). Diese saure Domäne wird in anderen Organismen durch zusätzliche Untereinheiten innerhalb des bc1-Komplexes dargestellt, die in direkter Assoziation mit dem Cytochrom c1 vorliegen. Bis dato konnte für Paracoccus jedoch noch kein eindeutiger Beweis für eine Beteiligung dieser sauren Domäne an der Wechselwirkung zwischen bc1 und den Substraten des Komplexes geführt werden. Ziel dieser Arbeit war es zunächst, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu konstruieren und in E. coli heterolog zu exprimieren. Durch zielgerichtete Mutagenese am Cytochrom c1 und anschließende kinetische Charakterisierung der Produkte sollte die funktionelle Bedeutung einzelner Aminosäurereste dargestellt werden. Es ist im Rahmen dieser Arbeit gelungen, zwei lösliche Fragmente des Cytochrom c1 aus P. denitrificans zu exprimieren. Für das saure Fragment (SF) wurde lediglich der Membrananker deletiert, während das Kernfragment (KF) durch die zusätzliche Deletion der sauren Domäne als eine Art minimalisiertes Cytochrom c1 anzusehen ist. Beide Fragmente konnten nach erfolgreicher Aufreinigung durch pre-steady-state-Kinetiken in ihrer Wechselwirkung mit dem homologen Reaktionspartner Cytochrom c552 sowie mit drei weiteren c-Typ Cytochromen funktionell charakterisiert werden. Des weiteren wurden zahlreiche Mutanten von KF hergestellt und ebenfalls hinsichtlich ihrer Wechselwirkung mit Cytochrom c552 getestet. Die Untersuchungen zur Ionenstärkeabhängigkeit des Cytochrom c1 zeigten, dass das saure Fragment unter den gewählten Versuchsbedingungen im Vergleich zu KF keine erhöhte Spezifität gegenüber Cytochrom c552 besitzt. Es konnte jedoch eindeutig gezeigt werden, dass die Interaktion der beiden untersuchten Elektronentransportpartner von der Wechselwirkung geladener Aminosäureseitenketten auf beiden Proteinen abhängt und somit elektrostatischer Natur ist. Dieser Sachverhalt wird zusätzlich durch die Ergebnisse bestätigt, die mit der Negativkontrolle (Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa) erzielt wurden. Dieses negativ geladene Protein zeigte nur eine schwach affine Wechselwirkung mit dem ebenfalls stark negativ geladenen Cytochrom c1 aus P. denitrificans. Zusätzliche kinetische Untersuchungen mit weiteren Cytochromen im Bereich mittlerer Ionenstärke zeigten, dass die beiden löslichen Fragmente SF und KF keine erhöhte Spezifität gegenüber homologen Elektronenakzeptoren (Cyt c552 und Cyt c550 aus P. denitrificans) im Vergleich zu dem nicht-homologen Reaktionspartner (Pferdeherz Cyt c) besitzen. Bei diesen drei Cytochromen handelt es sich um Proteine, die eine basische Interaktionsfläche aufweisen. In Hinblick auf die Ergebnisse zur Wechselwirkung von KF und SF mit dem löslichen Cytochrom c551 aus Ps. aeruginosa wird jedoch deutlich, dass die Spezifität des Cytochrom c1 gegenüber möglicher Substrate alleinig durch das Kriterium des Oberflächenpotentials bedingt ist. Keine der eingeführten Punktmutationen führte zu einem vollständigen Aktivitätsverlust des Proteins. Vielmehr zeigten die meisten Mutanten eine im Vergleich zum Wildtyp leicht herabgesetzte Geschwindigkeitskonstante der Elektronentransport-Reaktion. Der deutlichste Effekt wurde für die Mutanten E243K (36 % der WT-Aktivität) und E243Q (78 % der WT-Aktivität) bestimmt. Dieser Rest ist am oberen, dem Periplasma zugewandten Rand der Hämspalte positioniert, wodurch eine direkte Interaktion mit dem Cytochrom c552 während der Elektronentransport-Reaktion sehr gut möglich ist. Die im Rahmen dieser Arbeit bestimmten Geschwindigkeitskonstanten der Reaktion zwischen Cytochrom c1 und Cytochrom c552 lassen eindeutig auf einen diffusionskontrollierten Prozess schließen. Ein solches Verhalten schließt eine spezifische Oberflächen-Wechselwirkung der beiden Proteine nicht aus Die Ergebnisse der Mutagenesestudie verdeutlichen jedoch, dass die Substratspezifität nicht primär durch definierte gegensätzliche Ladungspaare auf der Oberfläche von Cytochrom c1 und Cytochrom c552 definiert wird.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuer Algorithmus für die automatische Optimierung einer NMR-Zuweisung des back bones in gelabelten Proteinen und seine Implementierung vorgestellt. Der Algorithmus ermöglicht eine Zuweisungsstrategie, die sich näher an der manuellen Vorgehensweise orientiert als vergleichbare Implementierungen von Lukin (LUK 11 ) [Lukin97] oder Leutner (PASTA) [Leutner98], da er die Entscheidung über konkurrierende Protospinsysteminterpretationen in die globale Optimierung der Zuweisung verlegt und die Benutzer nicht zwingt, sich vorzeitig auf eine Interpretation pro Aminosäure und Peak zu beschränken. Der Algorithmus löst daher nicht nur das Reihenfolgenproblem für einen schon vorgegebenen Satz von Protospinsystemen, sondern auch das Auswahlproblem zwischen verschiedenen, sich widersprechenden, Interpretationen der gleichen Peakgruppe. Durch das zusätzliche Auswahlproblem erhöht sich die Komplexität der Optimierungsaufgabe, der Lösungsraum wächst daher um mehrere Größenordnungen. Dies verlängert die Laufzeit für den einfachen RANDOM Algorithmus gegenüber einem vergleichbaren Reihenfolgeproblem. Es wurden daher verschiedene Methoden untersucht, um die Laufzeit wieder zu reduzieren. Die erzielten Verbesserungen führen nicht nur zu einer besseren Konvergenz, sondern ermöglichen auch erstmals eine echte parallele Implementierung des Algorithmus. Die algorithmischen Verbesserungen sind die Reduktion des Protospinsystemcaches und der GENETISCHe Algorithmus. Zusätzlich wurde eine verbesserte Konfiguration zur Kontrolle der Suboptimierer gefunden. Die Implementierung der zugrundeliegenden Datenstrukturen ermöglicht die Umsetzung zusätzlicher Nebenbedingungen für die Positionen der Protospinsysteme innerhalb der Zuweisung. Ein Beispiel für die Nebenbedingungen sind die knotenlokalen Filter und die Strukturfilter aus Kapitel 2. Ihre Effizienz wird am besten durch die Aminosäuretypenerkennung demonstriert, die die Größe des Lösungsraumes um 168 Größenordnungen für Trigger reduziert. Dadurch verringert sich die Laufzeit des RANDOM Algorithmus bis zu einem Faktor von 132. Für PASTA wurde in [Leutner98] statt dessen der umgekehrte Effekt auf die Laufzeit festgestellt. In ihrer Implementierung verlängert sich die Laufzeit auf das Doppelte. Der Unterschied kann nur durch eine unterschiedliche Nutzung der Aminosäuretypenerkennung im Protospinsystempool erklärt werden. PASTA nutzt diese Information anscheinend nicht, um den Pool und damit den Lösungsraum zu reduzieren, sondern nur bei der Bewertung der Zuweisung. Diese Konfiguration kann in RANDOM näherungsweise nachvollzogen werden, wenn man im AS-Cache jeder Aminosäure jedes Protospinsystem zuweist. Die Bewertung der Aminosäuretypen und den Austausch zwischen Pool und Individuum kann man aber nicht abschalten. Ein möglicher Nachteil der Reduktion des AS-Caches mittels der Aminosäuretypenerkennung ist die Möglichkeit, daß Aminosäuren mit untypischen Frequenzen der falschen Aminosäure zugewiesen werden oder nicht in den Cache für die theoretische Aminosäure aufgenommen werden. Um eine falsche Zuweisung durch die Reduktion auszuschließen oder zu überprüfen, kann man zuerst mit einem AS-Cache mit Typenerkennung optimieren und das Ergebnis in einer zweiten Optimierung mit einem AS-Cache ohne Typenerkennung nachoptimieren. Diese Möglichkeit wurde bei der Zuweisung von Trigger demonstriert. Für Trigger konnte durch den Wechsel des Caches gezeigt werden, daß auch mit dem reduzierten Cache eine stabile Zuweisung gefunden wird, die der Zuweisung ohne Aminosäuretypenerkennung weitgehend entspricht. Die Zuweisungen unterscheiden sich in Aminosäuren mit unsicherer Typenzuweisung. In Trigger wird nur ein Protospinsystem (Phe66,Ile67) aufgrund der Typeninformation von der Position im AS-Cache ausgeschlossen, der es in der manuellen und der Zuweisung ohne Reduktion zugewiesen wurde. In anderen Fällen führt erst die Typeninformation zur richtigen Zuweisung (zB. Thr60,Ile61), während die Zuweisung ohne Typenerkennung eine Fehlzuweisung erzeugt. Man sollte daher immer beide Versionen berechnen und dann vergleichen, da eine manuelle Zuweisung beide Defekte aufweisen kann, weil sie die Zuweisungsregeln nicht so strikt optimiert, wie es ein automatischer Algorithmus kann. Für beide Algorithmen wurde der Parameterraum untersucht und eine sowohl optimale als auch robuste Konfiguration gesucht. Dabei wurde der Einfluß jedes Parameters des Algorithmus auf die Laufzeit bis zur Konvergenz zum globalen theoretischen Maximum bestimmt. Bei RANDOM waren hauptsächlich die Zusammensetzung des Aktionsprofils und die minimale und maximale Lebenszeit der veränderten Zustände, minTTL und maxTTL, für die Laufzeit entscheidend. Alle drei kontrollieren, welche Pfade durch den Lösungsraum ab einem Zustand erlaubt sind. Die gleiche Untersuchung wurde auch für die Parameter der zu berechnenden Probleme (Proteine) durchgeführt. Für den Datensatz wurde sowohl der Einfluß der Proteingröße, des maximalen CA Abstandes zwischen den Peaks der benachbarten Aminosäuren und der Aufbereitung des Protospinsystemcaches auf die Laufzeit, als auch der Einfluß eines unvollständigen Datensatzes auf die Konvergenz untersucht. Der Algorithmus zeigte sich dabei sehr robust gegen fehlende Peaks, da bis zu 45% der theoretischen Peaks fehlen können, ohne daß die Konvergenz zum theoretischen Optimum verloren geht. Unterhalb von 55% hängt die Übereinstimmung der gefundenen Lösung mit der theoretischen Lösung von der Zusammensetzung der gebildeten Protospinsystemfragmente ab. Proteingröße und maximaler CA Abstand haben dagegen großen Einfluß auf die Laufzeit. Während die Parametrisierung des RANDOM Algorithmus sich auf die Untersuchung des Wertebereichs der Kontrollparameter beschränken kann, muß die Parametrisierung des GENETISCHen Algorithmus auch die verschiedenen Crossover Operatoren und die Kontrolle der Suboptimierer umfassen. In Kapitel 3 wurden die verschiedene Crossover Algorithmen und unterschiedliche Konfigurationsvarianten für den Suboptimierer im GENETISCHen Algorithmus untersucht. Die aus der Literatur bekannten Crossover Operatoren waren dabei den spezialisierten G Operatoren unterlegen. Auch die Varianten elitär und statistisch, die keinen genetischen Austausch zwischen verschiedenen Individuen zulassen, waren den speziellen Operatoren immer unterlegen. Selbst kleine Anteile eines Genaustausches bewirkten eine Verbesserung der Laufzeit und die Qualität der Lösung. Dabei verbesserte sich besonders die Konvergenz durch den genetischen Austausch. Die speziellen G Operatoren übertragen nur die Differenz der Eltern statt, wie im klassischen Crossover, blind irgendeinen zusammenhängenden Bereich zu kopieren. Dadurch vermeiden sie es, hauptsächlich identische Bereiche zu kopieren, sondern übertragen nur Protospinsysteme, die sich in den Eltern unterscheiden. Außerdem wurde die Effizienz der speziellen Operatoren noch weiter gesteigert, indem die übertragenen Informationen mit Hilfe von Filtern gezielt auswählt wurden. Die übertragene Differenz wird dazu aufgrund ihrer Nachbarn und der Verknüpfung mit den Nachbarn ausgewählt. Mit unterschiedlichen Filtern wurden so Bereiche mit einem unterschiedlich hohen lokalen Optimierungsgrad für die Übertragung ausgesucht. Die Laufzeituntersuchungen in Kapitel 3 zeigen, daß es eine Grenze für die Effizienzsteigerung durch die Übertragung lokal voroptimierter Bereiche gibt. Während es beim Wechsel von unkoordinierten, punktförmigen Übertragungen (s1) zur Übertragung von kurzen Strecken aus benachbarten Protospinsystemen, mit oder ohne Verknüpfung (s2), noch zu einer geringen Verbesserung der Laufzeit und der Konvergenz kommt, führt die zusätzliche Koordinierung der übertragenen Nachbarn durch die Nebenbedingung der Verknüpfung in den s3 Algorithmen sogar zu einer geringen Verschlechterung der Laufzeit. Die Gründe für die Verschlechterung konnten nicht eindeutig nachgewiesen werden. Möglicherweise verringert sich die Anzahl der kopierbaren Bereiche durch die zusätzlichen Nebenbedingungen so sehr, daß nicht genügend unterschiedliche Differenzen für die Übertragung in die neuen Individuen gebildet werden. Die neuen Individuen erhalten dann hauptsächlich die gleichen neuen Gene. Dadurch kann es zu einer Verarmung des genetischen Pools, d.h. zum Verlust der genetischen Diversität in der Population kommen. Die neuen Individuen suchen dann identische Bereiche im Lösungsraum ab und nehmen dadurch die lokale Optimierung doppelt vor. Dadurch verschwendet diese Konfiguration CPU Zeit auf schon untersuchte Bereiche. Neben der direkten Übertragung zusammenhängender Bereiche gibt es noch einen weiteren Faktor der die spezialisierten Operatoren, gegenüber dem klassischen Crossover, verbessert. Die Differenzbildung im Crossover nimmt auf die Konkurrenz um die Peaks zwischen den Protospinsystemen keine Rücksicht. Dadurch befinden sich die neuen Individuen zuerst meist im illegalen Teil des Zustandsraumes S n . Nach dem Crossover wird daher ein Teil der ursprünglichen Protospinsysteme des neuen Individuums durch den Reparaturmechanismus gelöscht und dadurch schon optimierte Bereiche zerstört. Daher kommt dem Reparaturmechanismus für illegale Zustände die entscheidende Rolle zu, denn er erzwingt die Neuberechnung der Positionen, die vor dem Crossover durch einen Konkurrenten eines übertragenen Protospinsystems belegt waren. Die ehemaligen Zuweisungen in den zerstörten Bereichen sind dabei nur über die Resourcenkonkurrenz mit den im Crossover neu injizierten korreliert. Das Crossover mit Zerstörungen erweitert dadurch den erreichbaren Lösungsraum, statt ihn, wie beim klassischen Crossover, auf den Raum zwischen den Eltern einzuschränken! Die Zerstörungen sind für die Optimierung daher von Vorteil. Außerdem zeigte sich in Kapitel 3, daß für die speziellen Operatoren eine besondere Konfiguration des Suboptimierers besonders effizient ist, die den einzelnen Individuen nur die CPU-Zeit zuteilt, die sie, effizienter als ihre Konkurrenten, zu einer Verbesserung nutzen können. Diese Verteilung der Rechenzeit wird durch die sogenannte Ratenbegrenzung erreicht. Die veränderlichsten Individuen erhalten dabei die meiste Rechenzeit. Dies sind normalerweise die Individuen, die in einem der letzten genetischen Zyklen neu erzeugt wurden. Sobald ein Individuum in ein tiefes lokales Optimum, d.h. eine Sackgasse, geraten ist, erhält es weniger Rechenzeit, da seine Verbesserungsrate unter den Schwellwert sinkt. Dadurch darf man den einzelnen Individuen eine höhere maximale Laufzeit zuteilen, da sie sie nur nutzen können, wenn sie sich währenddessen verbessern. Die Kombination "ratenbegrenzt" mit Operator Gs2p2A verbraucht trotz des komplexeren Algorithmus weniger CPU-Zeit bei gesteigerter Konvergenzwahrscheinlichkeit und geringerer paralleler Laufzeit als jede andere Konfiguration. Sie ist damit die beste bekannte Konfiguration für GENETISCH. Im Praxistest in Kapitel 5 mit dem Proteinabschnitt Trigger M bestanden zwischen den automatischen Zuordnungen und der manuellen Zuweisung nur geringe Unterschiede. Die Unterschiede zwischen den Optimierungen mit unterschiedlichen Caches entstehen hauptsächlich in den Bereichen, die an einem Ende keinen verknüpften Nachbarn haben oder bei denen die manuelle Zuweisung unsicher ist, wie im Bereich 10 - 20. Durch die automatische Zuweisung konnte die manuelle Zuweisung sogar an einigen Stellen vervollständigt werden. Sie ist daher einer manuellen Zuweisung gleichwertig. Darüber hinaus entsteht bei der automatischen Zuweisung immer eine Dokumentation über die Verwendung der Peaks, so daß man ungenutzte Spinsysteme leichter finden kann. Der genetische Algorithmus kann optimal auf einem Netzwerkcluster implementiert werden, daher bietet sich ein echte parallele Implementierung an. GENETISCH braucht dabei keine besondere Hardware, wie Vektorrechner, shared memory oder besonders schnelle Netzwerkverbindungen, sondern kann auf einer Gruppe von normalen Rechnern mit einer üblichen Ethernet100 Netzwerkverbindung implementiert werden, da nur zum Austausch der Individuen, bzw. ihrer Differenz, eine Kommunikation zwischen den Rechnern notwendig ist. Dadurch kann die Kommunikation auf wenige KB alle paar Sekunden beschränkt bleiben. GENETISCH sollte außerdem leicht zu skalieren sein, da man die Anzahl der Individuen leicht an größere Probleme anpassen kann. Eine echte parallele Implementierung erlaubt daher sowohl die Rechenzeit für komplexere Problem auf wenige Minuten zu reduzieren als auch größere und mehrdeutigere Spektren zuzuweisen. Außerdem kann man die Wahl der Prozessparameter selbst auch dem selben Optimierungsprozeß unterwerfen, der bisher für die Optimierung der Zuweisung verwendet wurde. Dadurch sollte es möglich sein, die Optimierungsparameter, analog dem Profil der Abkühlung im simulated annealing, dynamisch an die Phase der Optimierung anzupassen und den Individuen immer die optimalsten Optimierungsparameter zu bieten, ohne diese vorher von Hand suchen zu müssen. Diese Veränderung erfordert aber eine große Anzahl an Individuen und damit die echte parallele Implementierung.
In dieser Arbeit wurden die neuronalen Glutamattransporter EAAT4 (Excitatory Amino Acid Transporter) und EAAT3 in einem HEK (Human Embryonic Kidney) Zellsystem untersucht, in dem die Transporter transient exprimiert wurden. Diese Proteine katalysieren den Transport von Glutamat entgegen des Konzentrationsgradienten aus dem Extrazellulärraum in das Zytosol. Die Energie des Transports, stammt aus dem Kotransport von Natriumionen und Protonen und dem Gegentransport von Kaliumionen. Für EAAT3 ist bekannt, dass das Verhältnis 3 Na+:1 H+:1 Glutamat:1 K+ beträgt, wodurch 2 positive Ladungen pro Transportzyklus verschoben werden. Das führt zu einem messbaren positiven Einwärtststrom. Dieser Strom ist für EAAT4 wesentlich schwächer und die Stöchiometrie ist unbekannt. Beide Proteine besitzen eine Anionenkanaleigenschaft, die bei der Bindung von Na+ und der Bindung von Glutamat voll aktiviert wird. Diese Eigenschaft ist bei EAAT4 besonders ausgeprägt. Die Transporter wurden in Abhängigkeit von verschiedenen intra- und extrazellulären Ionen- und Substratkompositionen, sowie bestimmter Potentialen und der Temperatur elektrophysiologisch charakterisiert. Die Charakterisierung der stationären Eigenschaften des wenig bekannten Transporters EAAT4 brachten Erkenntnisse zu Tage, die 1) Klarheit über die apparenteAffinitäten der Substrate, insbesondere Glutamat und Na+ bringen 2) neu in Bezug auf die Spannungsabhängigkeit der apparenten Affinität von Glutamat sind. Die Untersuchung der vorstationären Ableitungen waren fruchtbar in Bezug auf a) die Ähnlichkeit des Transports, der durch EAAT4 katalysiert wird, zu anderen Glutamattransporter b) spezifische Parameter des Transports, wie den Unterschied in der Transportgeschwindigkeit c) die neuartige Kinetik der Anionenleitfähigkeit. Aus den Daten ergibt sich folgendes Bild über den Mechanismus des Transports. Die Substrate binden an EAAT4, im Vergleich zu den anderen Transportern, mit wesentlich höheren Km [ (0,6 ± 0,1)µM für Glutamat und (42,3 ± 5,2)mM für Na+]. Die Bindung von Glutamat, die schnell verläuft, ist, wie bei EAAT3, stark Na+ abhängig, genau wie die Leckleitfähigkeit, die ebenfalls durch Na+ aktiviert wird. Die folgenden glutamatabhängigen, vorstationären Reaktionen, inklusive der Translokation der Substrate verläuft wesentlich langsamer, als in anderen Transportersubtypen. Die Folge ist eine geringe Umsatzrate (<3 1/s) und daher ein geringer Transportstrom [(-3,6 ± 2,8)pA]. Die Daten zeigen, dass EAAT4 trotzallem denselben prinzipiellen Mechanismus, wie die anderen Subtypen folgt. Das Verhalten der Anionenleitfähigkeit zeigt allerdings erhebliche Unterschiede zu anderen Subtypen, da die Anionenleitfähigkeit durch negative Membranpotentiale inhibiert wird. Dies wird durch die Inhibierung der K+-Relokationsreaktion des Transporters erklärt. Zusammengenommen spricht die geringe Umsatzrate und die hohe apparente Affinität für Glutamat dafür, dass EAAT4 ein hochspezialisierter Transporter für die schnelle Pufferung von Glutamat und den langfristigen Transport von Glutamat bei niedrigen Konzentrationen ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Temperaturabhängigkeit des Glutamattransports durch EAAT3 untersucht. Die Temperaturabhängigkeit des Transports unter stationären Bedingungen zeigte interessante neue Ergebnisse. Die Ergebnisse lassen Aussagen zu bezüglich 1) der Thermodynamik der Bindung der Substrate und 2) der molekularen Natur bestimmter Teilreaktionen im Zyklus Die Bindung eines nicht-transportierbaren Glutamatanalogons zeigt, dass die Inhibitorbindung exotherm ist (H = 30,0 ± 3,3)kJ/mol. Die Bindung von Na+ an den unbeladenen Transporter ist im Gegensatz dazu nicht signifikant von der Temperatur abhängig mit H = (20,8 ± 21,5)kJ/mol. Es ist ebenfalls interessant, dass die Freie Enthalpie des Gesamtzyklus beiEAAT4 signifikant grösser ist als bei EAAT3, was in Übereinstimmung mit der höheren, apparenten Glutamataffinität ist [GEAAT4 = (35 ± 1)kJ/mol vs. .GEAAT3 = (30 ±1)kJ/mol]. Die Temperaturabhängigkeit der vorstationären Kinetik von EAAT3 enthüllt gleichfalls neue Ergebnisse. Zum einen ist die Bindung des Na+ Ions and den unbeladenen Transporter mit einer Konformationsänderung begleitet. Im Gegensatz dazu hat die Reaktion, die der Glutamatbindung zugeordnet wurde, nur eine moderate Aktivierungsenthalpie [H‡ = (39 ± 23 )kJ/mol], wie für eine diffusionskontrollierte Reaktion erwartet wird. Die nachfolgenden zwei langsameren Phasen des Transportstroms, die in der Literatur der Aktivierung der Anionenleitfähigkeit und der Glutamattranslokation zugeordnet wurden, sind mit hohen Aktivierungsenthalpien verbunden [H‡ = (121 ± 12)kJ/mol bzw. (94 ± 4)kJ/mol]. Dies bedeutet zum einen, dass zur Öffnung des Anionenkanals und der Translokation von Glutamat eine grössere Umstrukturierung des Transporters notwendig ist. Durch die hier gefundenen, neuen Daten für die Translokationsgeschwindigkeit bei physiologischen Temperaturen kann die Hypothese in Frage gestellt werden, die besagt, dass Glutamattransporter nicht schnell genug seien, um zur schnellen Entfernung des Glutamats nach der synaptischen Transmission beizutragen. Es scheint vielmehr so, dass bei physiologischen Temperaturen und Membranpotentialen, die Translokation von Glutamat hinreichend schnell verläuft.
Protonen gekoppelter Elektronentransfer ist ein zentraler Bestandteil der chemiosmotischen Theorie. Die Beschreibung seiner Natur ist aufgrund seines transienten Charakters eine komplexe Aufgabe. Elektrometrische Messungen stellen hier eine große Hilfe in der Erfassung von Ladungsverschiebungen dar. Sie erlauben die zeitliche Beschreibung des Elektronen- und Protonentransportes, der mit kaum einer geeigneten Methode beobachtet werden kann, und geben Einblick in deren molekularen Mechanismus. Diese Technik wurde hier an drei verschiedenen Membrankomplexen der Atmungskette angewandt: der Cytochrom c Oxidase (COX) aus Paracoccus denitrificans, der Quinol-Fumarat-Reduktase (QFR) aus Wolinella succinogenes und dem bc(1)-Komplex aus Saccharomyces cerevisiae. Hinsichtlich der experimentellen Vorgehensweise für kinetische Untersuchungen stellte sich ein übergreifendes Problem. Neben einer schnellen Aktivierung der Enzymsysteme bedurfte es eines definierten Ausgangszustands. Ziel dieser Arbeit war das Etablieren von Bedingungen, die elektrometrische Messungen am bc(1) und der QFR erlauben, sowie die Fortführung dieser Methodik am bereits vorhandenen System der COX. Cytochrom c Oxidase Elektrometrische Untersuchungen an der COX wurden basierend auf Vorarbeiten weitergeführt. Insbesondere die Ladungsverschiebungen nach Photoreduktion ausgehend vom völlig oxidierten Zustand rückten in den Fokus. In diesem Schritt wird ein Proton aufgenommen, während Häm a vom angeregten Zustand eines Rutheniumkomplexes reduziert wird. Dieses Verhalten ist unabhängig vom heterogenen Ausgangszustand der COX, er wird jedoch durch eine Änderung des pH-Wertes beeinflußt. Der heterogene Ausgangszustand im O-E-Übergang wurde in einem sequentiellen Modell diskutiert. Dabei wurde auf die Diskrepanz zwischen den elektrometrischen und den publizierten spektroskopischen Messungen hingewiesen. Während spektroskopisch die Cu(A)-Oxidation und Häm a-Reduktion in einer Phase verliefen, wurde in den elektrometrischen Messungen eine zweite deutlich langsamere Phase für den Protonentransfer beobachtet. Ein sequentielles Reaktionsmodell führte hier zu einem Widerspruch. Die Auswirkungen auf die Natur der Kopplung von Häm a und dem aufgenommenen Proton wurden diskutiert. Die Kinetik der Ladungsverschiebung wurde detailliert anhand der Temperaturabhängigkeit und des Isotopeneffektes untersucht und mit den Ergebnissen aus den Messungen an einem thermophilen Enzym, der ba(3)-Oxidase aus Thermus thermophilus, verglichen. Quinol-Fumarat-Reduktase Für eine schnelle Aktivierung der QFR wurde ein caged Fumarat synthetisiert, das nach Photolyse zu einer schnellen Erhöhung der Fumaratkonzentration führte. Die neue Substanz wurde bezüglich einer möglichen Verwendung für die QFR charakterisiert. Die Freisetzung erfolgte mit einer Zeitkonstante von 0,1 ms und aktivierte die QFR nur im photolysierten Zustand. Aufgrund der Photochemie der metallischen Kofaktoren in der QFR konnten jedoch keine kinetischen Messungen durchgeführt werden. Da die photochemisch induzierten Elektronenbewegungen in der QFR mit zunehmender Wellenlänge abnahmen, wurde eine neue Substanz vorgeschlagen, die im sichtbaren Spektralbereich gespalten werden kann. bc(1)-Komplex Der bc(1)-Komplex kann wie die COX durch einen Rutheniumkomplex aktiviert werden. Ein dimerer sowie ein an Cytochrom c gekoppelter Rutheniumkomplex wurde hierfür anhand von Literaturdaten synthetisiert, und die Verbindungen wurden hinsichtlich ihrer Eigenschaften nach Lichtanregung charakterisiert. Für die elektrometrischen Messungen wurde der bc(1)-Komplex in Proteoliposomen rekonstituiert, und der Ausgangszustand des bc(1)-Komplexes unter reduktiven und oxidativen Bedingungen eingestellt. Mit dem dimeren Rutheniumkomplex wurden elektrometrische Experimente durchgeführt, die zu zwei Phasen in der Spannungsantwort führten. Die Daten wurden zusammen mit den publizierten spektroskopischen diskutiert. Dabei wurde eine schnelle elektrogene Phase einem Elektronentransfers zwischen Häm c(1) und dem Eisen-Schwefel-Cluster des Rieske-Proteins zugeordnet. Eine langsamere Phase erwies sich sensitiv gegenüber Antimycin und spiegelt Vorgänge unter der Kontrolle der Q(i)-Bindungsstelle wider.
In the past century, scientists have realized that venoms are a source of a number of natural substances presenting a wide range of pharmacological properties and often displaying a high specificity for their targets. Thus, the field of toxinology came into being, which is defined as the study of toxic substances of biological origin. Toxins are found in a wide variety of animals, including fish, cone snails, scorpions, snakes, and even some mammals. To be classified as venom, these must contain substances, i.e. toxins, which disturb physiological processes and must be deliberately delivered to the target animal. Snakes have evolved one of the most sophisticated mechanisms for venom delivery. Envenomation by snakebite can induce and inhibit aggregation/agglutination of platelets as well as inhibit/activate hemostasis, but also disrupt other physiological functions via neurotoxins and angioneurin growth factors. Snake venoms contain a substantial amount of C-type lectin-related proteins (CLRPs) which are known to function, notably, as integrin inhibitors. CLRPs are heterodimers composed of homologous α and β subunits which can assemble either covalently or noncovalently to oligomers, resulting in αβ, (αβ)2 and (αβ)4 structures. Some of the main targets of CLRPs are membrane receptors, coagulation factors, and proteins essential to hemostasis. The platelet collagen receptors GPVI and α2β1 integrin as well as the von Willebrand factor receptor GPIb play important roles in platelet activation and aggregation and are considered main targets of antithrombotic drugs. In this thesis, the integrin α2β1 is particularly considered as it is the sole collagen-binding integrin on platelets. Reduced expression of this platelet receptor results in dysfunction of platelet responses. Equivalently, overexpression of α2β1 integrin results in an increased risk of thrombosis. As a result, selective inhibitors of the collagen-α2β1 interaction could give rise to effective antithrombotic drugs. Integrins are large receptors which mediate cell-cell contacts and the binding of cells to the extracellular matrix (ECM). Therefore, they play a role in physiological processes, e.g. hemostasis and immunity, as well as in pathological processes, e.g. tumor angiogenesis and atherosclerosis. 18 α and 8 β integrin subunits, with nine α subunits containing an additional A domain, associate non-covalently to form 24 heterodimers with distinct binding specificities. Integrin collagen receptors are a subclass of four receptors which all utilize the β1 subunit. The α2β1 integrin is a collagen-binding receptor expressed not only on platelets, but also on endothelial and epithelial cells. Consequently, this integrin is also essential for cell adhesion and migration playing a role in angiogenesis as well as tumor metastasis. To date, there are five known antagonists of α2β1 integrin: EMS16, rhodocetin, vixapatin, and most recently rhinocetin and flavocetin-A. The first four have been shown to be specific for the integrin α2A domain, the major collagen-binding domain. All these antagonists are CLRPs and present new leads for drug design. In the past few years, many insights into the structure and function of rhodocetin were obtained. Monoclonal antibodies proved to be advantageous in disclosing this information, making them not only useful as therapeutic agents, but also as tools for protein characterization. The venom of the Vipera palaestinae snake was recently shown to contain an α2β1 integrin inhibitor, which prevented the integrin from binding collagen. This inhibitor, called vixapatin, was the initial focus of this dissertation. Vixapatin’s interaction with the α2β1 integrin needed further characterization on a molecular and cellular level to assess its medical potential and monoclonal antibodies were to be used as a tool. Originally, vixapatin had been isolated by reversed-phase high-performance liquid chromatography. To avoid the stringency of this method, for this study, it was replaced with gentler chromatographic methods. First, the α2β1 integrin inhibitor was isolated from the crude snake venom with affinity chromatography using the α2A domain as bait, establishing a method to quickly screen venoms for α2β1-binding proteins which affect the collagenintegrin interaction. The applicability of this method to other snake venoms was shown by isolating an α2A domain-specific toxin from the venom of Trimeresurus flavoviridis. To allow further characterization of both these toxins, gel filtration and ion exchange chromatography were employed to purify the protein without the α2A domain. These classical protein purification methods resulted in similar separation patterns of both the V. palaestinae and T. flavoviridis venom proteins. Purified proteins exhibiting the potential of inhibiting integrinbinding to collagen were analyzed by two-dimensional gel electrophoresis. Both VP-i and flavocetin-A, the integrin inhibitors from V. palaestinae and T. flavoviridis, respectively, were shown to have more complex structures than was evident from the purification. Each consisted of four low-molecular-weight proteins which assembled into two bands (for VP-i) or one single band (for flavocetin-A) under non-reducing conditions. Mass spectrometry analyses revealed VP-i to belong to the family of CLRPs, just like vixapatin does. However, these two proteins differed in their primary sequences and only showed homology to one another. The toxin purified from T. flavoviridis revealed this toxin to be flavocetin-A, a heterodimeric CLRP which had so far only been shown to have GPIb-binding activity. At the time of flavocetin-A’s purification, flavocetin-B was co-purified; flavocetin-B consists of the same two α and β subunits, plus an additional γ subunit. As no sequence information is known to date for the γ subunit, it may be one of the additional proteins purified here, along with an additional δ subunit. Therefore, the toxin isolated here may actually consist of four different subunits forming a tetramer of two different heterodimers, generating an (αβ)2(γδ)2 structure. This proposed (αβ)2(γδ)2 flavocetin-A structure has binding sites for both α2β1 integrin and GPIb, with no sterical overlap, as shown by affinity chromatography using the α2A domain and the extracellular domain of the GPIb receptor. The potential of VP-i and flavocetin-A to inhibit integrin-binding to type I collagen was shown during purification: Both toxins efficiently bind to the integrin α2A domain; also, VP-i and vixapatin bind to the A domain with the same affinity. Surface plasmon resonance showed the interaction of flavocetin-A with the α2β1 integrin to be extremely strong and association to be very fast. Furthermore, both toxins were shown to inhibit binding of the wildtype integrin to collagen: VP-i and flavocetin-A acted antagonistically on cell adhesion and cell migration. Initially, the interaction between VP-i and α2β1 integrin was to be further characterized with the help of monoclonal antibodies. However, this proved problematic, the procedure requiring various optimizations. Although, after expert consultation, some monoclonal antibodies could be obtained, the cells were extremely sensitive and gave unsatisfactory results when tested as detection tools in Western blot and immunoassays. Concluding, two novel α2β1 integrin inhibitors were discovered: VP-i and flavocetin-A, which were purified using the same procedure and which have similar functions. Both are Ctype lectin-related proteins which effectively inhibit cell adhesion and migration. This underlines that nature has instrumentalized CLRPs to specifically inhibit α2β1 integrin. Further characterization of VP-i and flavocetin-A will be able to provide leads for future drug development.
The present work wishes to contribute with information on two members of the primary active transporter group, which differ both in structure and function: Wilson Disease Protein which uses the energy released by ATP hydrolysis to transport copper across cell membranes, and Proteorhodopsin, which uses the energy of light to build up a proton gradient across the bacterial cell membrane, both heterologously expressed in Xenopus laevis oocytes. The surface detection experiments using HA-tagged WNDP confirm the proposed topology of WNDP. The HA-tag per se does not interfere with the function of WNDP, as shown for WNDP HA56 by ATP-dependent phosphorylation after expression in Sf9 cells. Sequence modifications within the WNDP HA56 template-construct reveal some interesting features: i) the N-terminal domain, which contains the 6 metal binding sites, is not necessary for plasma membrane targeting; ii) elevated surface expression of WNDP was observed when the carboxy terminus containing the tri-Leu motif is missing, which suggests that this motif might be involved in the retrieval of the protein from the plasma membrane; iii) the mutations TGE>AAA (proposed to lock the protein in the E1 conformation and lead to constitutive plasma membrane localisation) and D1027A (phosphorylation deficient) did not interfere with the surface localisation of the protein; iv) the mutations CPC>SPS (copper transport deficient) and H1069Q (phosphorylation deficient, most common mutation in Wilson Disease) reduced plasma membrane expression to less then 50%. Western blot analysis shows that the overall expression level of all constructs is similar to that of the reference construct WNDP HA56. These findings suggest that motifs involved in copper binding and catalytic activity do not interfere with plasma membrane targeting of WNDP in Xenopus oocytes. However, the H1069Q mutation could interfere with the distribution of WNDP protein within the cells. In the case of Proteorhodopsin, data presented in this work support earlier observations according to which proteorhodopsin can operate as an outwardly and inwardly directed light-driven ion pump. The residues proposed to play the roles of proton donor (E108) and acceptor (D97) are important for proton translocation. In the absence of an anionic residue at position 97 no outward pumping takes place, but inward charge translocation may occurs under appropriate conditions. An M-like state similar to that known from BR detectably accumulates under neutral pH conditions or under conditions where reprotonation of the Schiff base from the cytoplasmic side is slowed down, as in case of the mutants at position 108. Under acidic conditions PR pumps inwardly under the concerted action of pH and transmembrane potential. The experiments performed in parallel with PR and BR wild-types brought not only interesting information about similarities and differences between the two retinylidene ion pumps, but also led to the observation that the life-time of the M state in BR wild-type can be extended in addition to hyperpolarising transmembrane potentials also by extracellular acidic pH, when the proton gradient through the cell membrane is directed opposite to the ion transport (i.e. when the electrochemical gradient opposing the direction of proton transport increases). Direct photocurrent measurements of HA-tagged PR and BR have shown that the inserted tag may interfere with the functionality of the protein. Next to E108 and D97 in PR other residues in the vicinity of the retinal binding pocket contribute to the translocation of protons, as exemplified by the mutant L105Q: additionally to changing the absorption maximum of the protein, this mutant is a less effective proton pump than the wild type. The example of PR suggests that transduction of light energy by – and reaction mechanisms of retinylidene ion pumps have not been entirely deciphered by the extensive studies of bacteriorhodopsin.
Proton-translocating NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) transports two electrons from NADH to membranal ubiquinone: in this process protons are translocated across the membrane, producing 40% of the total proton gradient between matrix side and intermembrane space. Mitochondrial complex I contains at least 46 subunits in mammals, and has a molecular weight of around 1000 kDa. Electronic microscopy analysis showed that complex I has an L-form, which consists of two domains: a peripheral “arm” (hydrophilic domain) and a membrane “arm” (hydrophobic domain). The peripheral domain, which protrudes into the matrix, contains one non-covalently bound flavin mononucleotide (FMN) and the iron-sulfur clusters N1a, N1b, N2, N3, N4 and N5 as redox active groups. They transport electrons from NADH to ubiquinone. Cluster N2 is supposed to be the immediate electron donor to ubiquinone by virtue of its highest and pH dependent redox midpoint potential (Em,7 –150 mV). The exact location of the tetra-nuclear cluster N2 is still object of discussion. The TYKY and the PSST subunits contain three binding motifs for tetranuclear clusters which are formed by twelve cysteins. In an effort to investigate the “ubiquinone reduction module” of complex I, in the first part of this work site directed mutagenesis of the TYKY and PSST subunits has been carried out. Mutant strains were characterised in terms of complex I content, catalytic activity and EPR signature of cluster N2. The second part of this work was aimed at developing a substrate inducible version of the internal alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (NDH2i). A substrate inducible NDH2i is expected to offer a “switch” between complex I activity dependent (no NDH2i activity) and independent (NDH2i activity) cell growth, by changing between activating and non-activating substrates. This strategy would allow the screening for two types of complex I mutants, which is a prerequisite for realising a random PCR mutagenesis of single subunits of complex I, that allows the production of a high number of point mutations in relatively short time. Y. lipolytica complex I deficiency mutant strains could be easily identified, by virtue of their inability to survive under complex I dependent growth conditions (no NDH2i activity). By this way, amino acids that have an important role for complex I structure or function could be identified by subsequent sequence analysis. Each of the twelve cysteines that form the above mentioned three binding motifs for iron-sulfur cluster have been mutagenised. In mutant mitochondrial membranes, no assembled complex I could be detected. From these data one may conclude that the mutagenised 6 SUMMARY 92 cysteines play an important role for complex I stability, or that are a prerequisite for complex I assembly in Y. lipolytica, but there is not direct evidence indicating that any of the four mutagenised residues acts as a ligand. Two aspartates in the PSST subunit, Asp-99 and Asp-115, were found to be essential for complex I catalytic activity. EPR spectroscopic analysis indicated that the electron transfer to N2 cluster was not blocked and implied that this was not the reason for the loss of catalytic activity. From these data it can be concluded that D99 and D115 play a vital role for complex I NADH:ubiquinone reductase activity, but are not ligands for cluster N2 and that their position is not close enough to the cluster to influence directly its electromagnetic environment. Three mutations, identified in the PSST and TYKY homologous subunits of patients affected with Leigh syndrome (V119M in PSST, P78L and R101H in TYKY) were reconstructed in the obligate aerobic yeast Y. lipolytica. This approach may help to understand the aetiology of the Leigh syndrome, in terms of the ability of complex I to oxidize NADH and to transport electrons. In fact, all three mutations showed effects on electron transport, reducing the VMax by about 50%. Mutant V119M in the PSST subunit, which had a lethal effect in two patients that were homozygous for this mutation, affects a fully conserved residue. Overall, the results from site directed mutagenesis carried out so far support the theory that the “catalytic core ” (N2 cluster and quinone binding site) of complex I has been evolved from the electron transfer module of the [Ni-Fe] hydrogenases. In fact, mutagenesis of residues that are fully conserved between complex I and [Ni-Fe] hydrogenases, showed dramatic effects on complex I in terms of assembly (cysteine mutants) or catalytic activity (D99-D115). Differently, changing aspartate 174 and glutamic acid 185 (not fully conserved, Fig 4.1A) had little or no effect on the Michaelis-Menten parameters and N2 EPR signal. In recent years Y. lipolytica has been developed as a yeast genetic system to study mitochondrial complex I. The present work introduced the promoter for the isocitrate lyase (pICL1) as a useful tool for the substrate selective expression of the internal version of the alternative NADH:ubiquinone oxidoreductase (pICL1-NDH2i). This allows to rescue complex I deficiencies “in vivo” selectively by growth on acetate (or ethanol) medium. The integration of the pICL1-NDH2i construct into the genome of Y. lipolytica and subsequent deletion of nuclear-coded subunits like PSST, TYKY and 49 kDa, would contribute to further develop this organism as a useful genetic model for studying subunits of mitochondrial complex I by site directed mutagenesis.
Um Materie mit Nanometergenauigkeit anzuordnen, ist Selbstorganisation die mächtigste Strategie. DNA (Desoxyribonukleinsäure) ist hierfür ein hervorragendes Baumaterial, da sie ein billiges, programmierbares, biokompatibles und gut verstandenes Polymer ist. Aus diesen Gründen ist DNA zur Basis für ein schnell wachsendes Gebiet geworden: die DNA-Nanotechnologie. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue Interaktionsmöglichkeiten für die DNA-Nanotechnologie zu entwickeln und neuartige Strukturen aus DNA-minicircles aufzubauen, einem bislang vernachlässigten Konstruktionselement. ...
Die 5-Lipoxygenase (5-LO) ist das Schlüsselenzym in der Biosynthese proinflammatorischer Leukotriene, die maßgeblich an der Entstehung allergischer und entzündlicher Erkrankungen wie Arthritis, Asthma und kardiovaskulären Erkrankungen beteiligt sind (23). Humane 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 77,8 kDa (25). Das Protein besteht aus einer größeren katalytischen Domäne, die ein zentrales Eisen(II)-Atom enthält, dass für die zweistufige LTA4-Bildung aus Arachidonsäure benötigt wird, und einer kleineren C2-ähnlichen Domäne, die Bereiche für die Membran- sowie Ca2+-Bindung enthält. Durch Stimulation von intakten Zellen kommt es zu einer Translokation der 5-LO an die Kernmembran. Die Wechselwirkung mit dem membranständigen FLAP fördert die 5-LO-Leukotrienbildung. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit niedermolekularen Modifikationen der 5-LO durch U-73122 und Glutathion sowie mit der Charakterisierung von 5-LO-Inhibitoren. U-73122 ist ein Inhibitor, der in vitro und in vivo mit einem IC50-Wert von 30 nM bzw. 2,4 µM die 5-LO-Aktivität hemmt (2). U-73122 verfügt über eine thiol-reaktive Maleinimid-Gruppe, wodurch die Substanz kovalent an einige 5-LO-Cysteine (Cys-99, -159 und weitere) binden kann. Entsprechende U-73122-5-LO-Peptide konnten nach Trypsin-Verdau der 5-LO mit MALDI-MS-Messungen nachgewiesen werden. Für diesen Zweck musste eine effiziente Aufreinigung für native 5-LO (Reinheit > 95%) entwickelt werden. Um die Veränderung der 5-LO-Aktivität nach U-73122-Zugabe zu untersuchen, wurden Cystein/Serin-5-LO-Mutanten hergestellt. Es konnte festgestellt werden, dass die Mutante C416S-5-LO nicht mehr effektiv durch U-73122 gehemmt werden konnte. Daher ist anzunehmen, dass U-73122 an Cystein-416 der 5-LO bindet und die 5-LO-Produktbildung hemmt. Auf der 5-LO-Oberfläche kann ein Bereich lokalisiert werden, der einen Zugang für das Substrat zum aktiven Zentrum der 5-LO bilden könnte (238,239). Dieser Bereich liegt in unmittelbarer Nähe zu Cystein-416. Daher besteht die Möglichkeit, dass U-73122, nachdem es an Cystein-416 gebunden hat, diesen Bereich hemmend beeinflussen kann. Es konnte nachgewiesen werden, dass Glutathion an mehrere Cysteine der 5-LO (Cystein-99, -264 und -449) kovalent binden kann. Um Veränderungen der 5-LO-Aktivität durch in vivo Glutathionylierungen zu zeigen, wurden HeLa-Zellen mit 5-LO, Cystein-/Serin-5-LO-Mutanten sowie FLAP transfiziert und mit Diamid inkubiert. Es konnte festgestellt werden, dass die native sowie FLAP-gesteigerte 5-LO-Produktbildung durch Diamid gehemmt wird. Dies konnte ebenfalls für die Mutante 3W-5-LO beobachtet werden. Zusätzlich wurden verschiedene Cystein-/Serin-5-LO-Punktmutanten sowie eine 4fach Mutante (C159S/C300S/C416S/C418S-5-LO = 2D-5-LO) untersucht. Das Verhalten dieser Mutanten konnte in drei Gruppen eingeteilt werden. Gruppe A (C159S-, C300S- und C418S-5-LO) wurde durch Diamid nicht beeinflusst. Gruppe B (C416S- und 2D-5-LO) zeigte eine sehr starke Stimulation der 5-LO±FLAP-Leukotrienbildung nach Zugabe von Diamid. Bei Gruppe C (C99S-, C264S- und C449S-5-LO) konnte eine FLAP-gesteigerte 5-HETE-Bildung beobachtet werden. Durch Diamid kommt es zu Glutathionylierungen von zellulären Proteinen, da reduziertes Glutathion (GSH) zu reaktiveren oxidierten Glutathion (GSSG) umgesetzt wird. An der 5-LO-Oberfläche können in Folge an verschiedenen Cysteinen Glutathione binden. Durch die Glutathion-Bindung wird eine stark polare Struktur auf der 5-LO-Oberfläche eingebracht. Dadurch kommt es zu einer verminderten Membranbindung und Produktbildung der nativen 5-LO. Die 5-LO-Oberfläche der 2D-5-LO-Mutante kann an verschiedenen Positionen keine Glutathione mehr binden, es kommt es zu einer stärkeren Wechselwirkung mit Membranbestandteilen und zu einer erhöhten 5-LO-Leukotrienbildung. Für Celecoxib konnte gezeigt werden, dass neben der COX2-Hemmung auch die 5-LO-Aktivität mit einem IC50-Wert von 3-10 µM gehemmt werden kann (268). Im Rahmen dieser Arbeit wurden HeLa-Zellen mit 5-LO±FLAP transfiziert, um den Einfluss von Celecoxib auf FLAP zu untersuchen. Celecoxib führt zu einer direkten Hemmung der 5-LO. ML3000 (Licofelon) wurde als dualer COX/5-LO-Inhibitor entwickelt und hemmt die 5-LO-Aktivität in intakten Zellen, aber nicht im Homogenat. Daher wurden Versuche mit 5-LO±FLAP-tranfizierten HeLa-Zellen durchgeführt, um den Einfluss von ML3000 auf die FLAP-gesteigerte 5-LO-Leukotrienbildung zu zeigen. Aus diesen und weiteren Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe konnte gefolgert werden, dass ML3000 ein FLAP-Inhibitor ist (277). Garsubellin A ist strukturverwandt zu Hyperforin, einem dualen COX/5-LO-Inhibitor (204). Garsubellin A hemmt die 5-LO-Aktivität im Homogenat von PMNL und am gereinigten Enzym mit einer IC50 von 10-30 µM. Verbindungen, die den Bicyclo[3.3.1]nonan-Grundkörper des Garsubellin A und Hyperforin enthalten, wurden auf ihr inhibitorisches Potential getestet. Es konnte gezeigt werden, dass der Bicyclo[3.3.1]nonan-Grundkörper alleine nicht für eine 5-LO-Hemmung ausreicht, sondern eine freie Carbonsäure sowie eine bis zwei Prenylierungen vorliegen müssen, um eine 5-LO-Hemmung zu erzielen. Sind diese Voraussetzungen vorhanden, wird die 5-LO-Aktivität in intakten PMNL mit einer IC50 von 10 µM und an gereinigter 5-LO mit 0,3-1 µM gehemmt.
To overcome poor treatment response of pediatric high-risk acute lymphoblastic leukemia (ALL), novel treatment strategies are required to reactivate programmed cell death in this malignancy. Therefore, we take advantage of using small-molecule antagonists of Inhibitor of apoptosis (IAP) proteins, so called Smac mimetics such as BV6, which are described to overcome apoptosis resistance and thereby sensitize tumor cells for several apoptotic stimuli. To address the question whether redox alterations can sensitize leukemic cells for Smac mimetic-mediated cell death, we interfered with the cellular redox status in different ALL cell lines. Here, we show for the first time that redox alterations, mediated by the glutathione depleting agent Buthioninesulfoximine (BSO), prime ALL cells for BV6-induced apoptosis. Besides ALL cell lines, BV6/BSO cotreatment similarly synergizes in cell death induction in patient-derived primary leukemic samples. In contrast, the combination treatment does not exert any cytotoxicity against peripheral blood lymphocytes (PBLs) or mesenchymal stroma cells (MSCs) from healthy donors, suggesting some tumor selectivity of this treatment. We also identify the underlying molecular mechanism of the novel synergistic drug interaction of BSO and BV6. We demonstrate that both agents act in concert to increase reactive oxygen species (ROS) production, lipid peroxidation and finally apoptotic cell death. Enhanced ROS levels in the combination treatment account for cell death induction, since several ROS scavengers, like NAC, MnTBAP and Trolox attenuate BSO/BV6-induced apoptosis. BSO/BV6-induced ROS can be mainly classified as lipid peroxides, since the vitamin E derivate α-Tocopherol as well as Glutathione peroxidase 4 (GPX4), which both specifically reduce lipid-membrane peroxides, prevent lipid peroxidation, caspase activation and cell death induction. Vice versa, GPX4 knockdown and pharmacological inhibition of GPX4 by RSL3 or Erastin enhance BV6-induced cell death. Importantly, cell death induction critically depends on the formation of a complex consisting of RIP1/FADD/Caspase-8, since all complex components are required for ROS production, lipid peroxidation and cell death induction. Taken together, we demonstrate that BSO and BV6 cooperate to induce ROS production and lipid peroxidation which are eventually required for caspase activation and cell death execution. Collectively, findings of this study indicate that BV6-induced apoptosis is mediated via redox alterations offering promising new treatment strategy to overcome apoptosis resistance in ALL.