Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Die Onkogenese geht mit einer Deregulation des Zellzyklus einher. Dabei spielt unter anderem die Regulation verschiedener krebsrelevanter Transkriptionsfaktoren eine wichtige Rolle. Ein Interaktionspartner und Regulator vieler dieser Faktoren ist das LIM-only Protein FHL2. Es ist bereits bekannt, dass sich der FHL2-Status zwischen normalen und entarteten Zellen in allen bisher untersuchten Geweben unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass dies auch im Brustgewebe der Fall ist. FHL2 wird in fast allen aggressiven Mammakarzinomen überexprimiert, nicht aber im Normalgewebe und nur schwach in nicht-invasiven "DCIS". Dies weist darauf hin, dass die FHL2-Menge mit der Aggressivität des Tumors korreliert. Weiterhin konnte hier zum ersten Mal nachgewiesen werden, dass FHL2 in die Zellzyklusregulation involviert ist. Am G1/S-Übergang kann FHL2 die Cyclin D1-Expression induzieren, was letztendlich zu einer Phosphorylierung des RB-Proteins und zum Eintreten der Zelle in die S-Phase führt. Wichtiger aber ist die hier gezeigte FHL2-abhängige Induktion von p21CIP/WAF, ein Zellzyklusinhibitor, der unter anderem auch in der G2/M-Kontrollpunkregulation involviert ist und normalerweise über p53 reguliert wird. Diese Induktion resultiert dort in einem verlangsamten Kontrollpunktübergang, wogegen eine Reduktion des FHL2-Gehalts einen beschleunigten G2/M-Übergang zur Folge hat. Zusätzlich zeigten Expressionsanalysen mit synchronisierten Brustkrebszellextrakten dass FHL2 zellzyklusabhängig exprimiert wird, mit einem Maximum am G2/M-Kontrollpunkt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die p21-Expression in den hier verwendeten Brustkrebszelllinien p53-unabhängig ist und ausschließlich von FHL2 abhängt. Hierbei wird die FHL2-abhängige p21 Expression wahrscheinlich über die Aktivierung des c-jun-Transkriptionsfaktors im MAPK-Signaltransduktionsweg induziert. In vivo und in vitro Interaktionsstudien haben eine Interaktion von FHL2 mit c-jun gezeigt, wobei die Interaktion über die ersten beiden LIM-Domänen vermittelt wird. Der FHL2-c-jun-Komplex bindet an die AP-1-Sequenz innerhalb des p21-Promotors und induziert dadurch p21. Dies führt zu einer Inhibition verschiedener CDE/CHR-regulierter Proteine wie CDC25C oder Plk1 und zu einer verzögerten Zellzyklusprogression. In diesem Zusammenhang konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die FHL2-Expression nicht nur zu einer verlangsamten Proliferation führt, sondern auch zur Fähigkeit der Zelle zum zellmatrixunabhängigen Wachstum beisteuert. Es scheint auf den ersten Blick widersprüchlich, dass FHL2 für einen intakten G2/M-Kontrollpunkt und eine geringere Proliferationsrate sorgt, gleichzeitig aber zur Tumorentwicklung beiträgt. Es ist allerdings bekannt, dass Tumore ihr Wachstum verlangsamen bevor sie metastasieren. Auch führt ein erhöhter p21-Gehalt im Cytosol zu einer Inhibition der Apoptose, einer weiteren Eigenschaft von Tumoren. FHL2 ist daher ein signifikanter Faktor in der Onkogenese des Mammakarzinoms und aufgrund der differentiellen Expression in vielen Tumoren ein interessantes Ziel für Krebstherapien.
RNA hat neben der Rolle als Informationsüberträger wichtige Aufgaben in regulatorischen Prozessen. Sie kann komplexe Strukturen ausbilden und ähnlich wie Proteine Liganden binden oder enzymatische Reaktionen katalysieren. Im Rahmen dieser Arbeit sollten zwei Beispiele von RNA-Liganden-Interaktionen untersucht werden. Im ersten Abschnitt wurde die Interaktion des TetR-bindenden Aptamers 12-1 mit dem Tetracyclin-Repressorprotein (TetR) biochemisch charakterisiert. Über Gelverzögerungs- experimente wurde gezeigt, dass das Aptamer 12-1K delta A TetR mit hoher Affinität und Spezifität bindet. Es wurde ein KD von 22 nM bestimmt. Die Bindung ist dabei ebenso stark wie die Bindung von TetR an die Operatorsequenz tetO. In Anwesenheit von Tetracyclin (Tc) nimmt die Affinität des TetR/Aptamer-Komplexes um das sechsfache ab. Des Weiteren konnten die Bindeepitope des Aptamers durch eine Analyse von verschiedenen TetR-Mutanten im DNA-Bindebereich bestimmt werden. Die Aminosäuren T27, N47 und K48 sind dabei essentiell für die RNA-Bindung und führen bei einem Austausch zum Verlust der RNA-Bindung. Der Bindebereich des Aptamers überlappt mit Aminosäureresten, die für die tetO-Bindung essentiell sind. Die Stöchiometrie der TetR/Aptamer-Bindung wurde durch LILBID-Messungen auf eine molare Verteilung von 2:1 festgelegt. Ein TetR-Dimer bindet dabei ein Aptamermolekül. Durch die umfassende biochemische Analyse der TetR/Aptamer-Bindung kann das Aptamer 12-1 nun als Expressionssonde für RNAs in bakteriellen Zellen genutzt werden. Des Weiteren kann das Aptamer als alternativer, artifizieller Transkriptionsregulator im tet on / tet off-System verwendet werden. Im zweiten Teil der Arbeit sollten miRNAs identifiziert werden, die an der posttrans- kriptionellen Regulation der 5-Lipoxygenase (5-LO) und der Cyclooxygenase-2 (COX-2) beteiligt sind. Mit bioinformatischen Vorhersageprogrammen wurden die 3’-UTR- Bereiche von 5-LO und COX-2 nach putativen Bindestellen abgesucht. Im Fall der 5-LO wurden durch eine zusätzliche Microarray-Expressionsanalyse miRNAs ausgewählt, welche in 5-LO positiven Zellen hoch exprimiert sind und Bindestellen im 3’-UTR aufweisen. Es konnten verschiedene miRNAs detektiert werden, jedoch keine Regulation der 5-LO Aktivität beobachtet werden. Für COX-2 wurde neben der Suche nach putativen miRNA-Bindestellen zudem die Stabilität des 3’-UTR untersucht. Mit Hilfe des auf Perl basierenden Programms SignificanceScoreAssignment (Florian Groher, Diplomarbeit 2011) konnte der 3’-UTR von COX-2 als generell destabilisierend analysiert werden. In Colonkarzinom- spezifischen HT-29-Zellen wurden miRNAs untersucht, welche Bindestellen im 3’-UTR von COX-2 aufweisen. In diesem Kontext sollte der Einfluss einer Interaktion von HT- 29-Zellen mit aktivierten Thrombozyten sowie daraus isolierten Bestandteilen wie Mikropartikeln und PDGF analysiert werden. MiR-16, miR-26b, miR-199a und miR- 199a* konnten in HT-29-Zellen nachgewiesen werden. Bei einer Stimulation von HT-29- Zellen mit PDGF-BB werden miR-16 und miR-26b konzentrationsabhängig stärker exprimiert, während die Expression von miR-199a und miR-199a* signifikant abnimmt. Eine direkte Regulation von COX-2 durch die untersuchten miRNAs konnte durch Überexpressions- und Reportergenanalysen jedoch nicht festgestellt werden. Die Analysen der 5-LO- und COX-2-Regulation durch miRNAs stellen Vorarbeiten dar. Die etablierten Methoden können nun für eine detaillierte Betrachtung weiterer miRNAs verwendet werden.
Humanpharmaka stellen eine permanente Belastung von Gewässern dar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gemäß dem von der Europäischen Arzneimittelagentur EMEA entwickelten Konzept zur Durchführung von Umweltrisikobewertungen von Humanpharmaka mit mehreren ausgewählten Substanzen Umweltrisikobewertungen durchgeführt. Die hierfür ausgewählten Pharmaka sind das Antiepileptikum Carbamazepin (CBZ), das Antibiotikum Sulfamethoxazol (SMX) und das synthetische Östrogen 17a-Ethinylöstradiol (EE2). Als Vertreter der Inhaltsstoffe von Körperpflegeprodukten wurde der polyzyklische Moschusduftstoff Tonalid (AHTN) in die Untersuchungen mit einbezogen. Mit Hilfe von Literaturrecherchen wurde die Datengrundlage für Expositions- und Wirkungsabschätzungen bereitgestellt. Der vorhandene recherchierte Datensatz wurde mit entsprechenden Kurz- und Langzeitstudien ergänzt. Die mit den Ergebnissen der Expositions- und Wirkungsabschätzungen vorgenommenen Umweltrisikobewertungen ergaben im ersten Schritt basierend auf Kurzzeitstudien unter den ausgewählten Substanzen lediglich für den Moschusduftstoff AHTN ein erhöhtes Umweltrisiko für Oberflächengewässer. Basierend auf weiterführenden Langzeitstudien konnte das zunächst erkannte, durch AHTN indizierte Umweltrisiko entkräftet werden, jedoch ergaben die Risikocharakterisierungen für EE2 und SMX ein erhöhtes Risiko für das aquatische Kompartiment. Auf Grund der erhöhten Adsorptionspotenziale von CBZ, EE2 und AHTN wurden für diese Substanzen kompartimentspezifische Umweltrisikocharakterisierungen durchgeführt. Dabei wurde ein erhöhtes Umweltrisiko durch CBZ für das Kompartiment Sediment angezeigt. Basierend auf den Ergebnissen einer Sediment-Bioakkumulationsstudie mit dem endobenthischen Oligochaeten Lumbriculus variegatus, welche in einen unerwartet hohen Akkumulationsfaktor resultierte, und aus der Literatur verfügbaren Fisch-Biokonzentrationsfaktoren wurde anhand der Nahrungskette Wasser-Sediment-Wurm-Fisch die Möglichkeit des ‚secondary poisonings’ durch EE2 bei wurmfressenden Fischen unter natürlichen Bedingungen aufgezeigt. Zur Verwendung dieses Ergebnisses in einer Umweltrisikobewertung zum Zwecke der Zulassung von Pharmaka sollten weitergehende Untersuchungen zur Bestätigung durchgeführt werden. Bezugnehmend auf die Resultate der eigenen Studien und auf die besonderen Eigenschaften von Humanpharmaka wurde der EMEA-Richtlinienentwurf diskutiert und Verbesserungsvorschläge erarbeitet. Bis auf wenige Anpassungen geht das EMEA-Bewertungsschema nicht auf die Besonderheiten und spezifischen Eigenschaften von Humanpharmaka ein. Hauptkritikpunkte bezogen sich auf (1) die Anwendung eines konzentrationsabhängigen Schwellenwertes als Entscheidungsgrundlage zur Durchführung einer Risikocharakterisierung, (2) das stufenweise Vorgehen bei der Wirkungsabschätzung mit zuerst ausschließlich auf Kurzzeitstudien basierenden Effektdaten, und (3) unzureichende Angaben zu Vorgehensweisen in der höheren Stufe des Bewertungsschemas, vor allem bei Substanzen mit außergewöhnlichem ökotoxikologischen Potenzial. Trotz der zur Zeit intensiven internationalen Diskussion über mögliche Auswirkungen durch endokrine Disruptoren auf Mensch und Umwelt sieht der EMEA-Richtlinienentwurf nicht ausdrücklich vor, die Umweltgefährdung durch potenziell endokrin wirksame Substanzen mit spezifischen Testmethoden festzustellen und zu bewerten. Die Erkenntnis, dass spezifische Wirkmechanismen bei Chemikalien, speziell bei Arzneimitteln und Bioziden, auch in sehr niedrigen Konzentrationen zu Wirkungen in der Umwelt führen können, bleibt im EMEA-Richtlinienentwurf auf Grund der Einführung eines expositionsbezogenen Schwellenwertes und der Wirkungsabschätzung mittels Akutstudien nur unzureichend berücksichtigt. Zur Schließung dieser Lücke, die durch Untersuchungen zu endokrinen Wirkungen in der Umwelt offensichtlich wurde, müssen neue und bessere ökotoxikologische Instrumente entwickelt werden und das Umweltrisikobewertungsschema entsprechend erweitert und angepasst werden.
Es wird davon ausgegangen, dass das ehemalige Larven-Mikrohabitat der Asiatische Tigermücke Aedes albopictus (synonym: Stegomyia albopicta) die Phytotelmata in den Waldgebieten von Südostasien darstellte. In den letzten vier Jahrzehnten adaptierte sich die Art jedoch an urbanere Regionen und ihre Antrotelmata. Dank ihrer Eigenschaft, Eier mit einer gewissen Trocken- und Kältetoleranz zu produzieren, verbreitete sich die Art zusammen mit den international gehandelten Waren weltweit. Zudem ist Ae. albopictus ein theoretischer Vektor für mindestens 27 Viren sowie Parasiten und spielt eine Hauptrolle bei der Übertragung von Dengue-Viren und Chikungunya-Viren und Zika-Vieren. Daher wird die Art als große Gefahr für die öffentliche Gesundheit betrachtet.
Die vorliegende Arbeit thematisiert drei Untersuchungen zum Anpassungs- und Etablierungs-potential der invasiven Asiatischen Tigermücke.
In einem ersten Ansatz wurde das Problem behandelt, dass es lediglich zwei standardisierte toxikologische Testverfahren für Culicidae gab. Daher wurde ein Dosis-Wirkungs-Testsystem entwickelt, das den Weg für weitere biologische Endpunkte und ihre integrativen Parameter freimachte und dadurch ein besseres Verständnis für die Wirkweisen von Insektiziden ermöglicht. Hierdurch konnte nun der Frage nachgegangen werden, ob es Unterschiede in der ökotoxikologischen Reaktion zwischen der invasiven tropisch-subtropischen Asiatischen Tigermücke und der einheimischen nördlichen Hausstechmücke Culex pipiens auf das Insektizid λ-Cyhalothrin gibt. Weiter wurde der Einfluss von Temperatur und die Verfügbarkeit von Nahrung auf die Insektizidsensitivitäten der Arten getestet. Schließlich konnte in einer Risikobewertung festgestellt werden, dass bei falsch angewendeten Bekämpfungsmaßnahmen höhere Temperaturen sowie der Ausfall von aquatischen Top-Prädatoren zu Fitnessvorteilen für die Art führen können.
In einer zweiten Untersuchung wurde der Mechanismus der Kältetoleranz der Eier (Kälteakklimatisierung und Diapause) näher untersucht, da dieser für die erfolgreiche Invasion in gemäßigten Breitengraden verantwortlich gemacht wird. Nachdem eine lang vorherrschende Hypothese verworfen wurde, dass die Einlagerung von Polyolen die Frosttoleranz bewirken würde, war der aktuelle Stand der Wissenschaft, dass eine Verdickung der Wachsschicht des Chorions dafür verantwortlich sei. Jedoch lag keine detaillierte Evaluierung von Stechmücken-Eihüllen vor. Mittels einer transmissionselektronenmikroskopischen Studie konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Wachsschicht nicht in der Serosa-Cuticula zu verorten ist, sondern im Endochorion und sie zudem im Zuge der Diapause in der Mächtigkeit schrumpft. Daher wird auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse auf eine Kompaktierung der Schicht geschlossen.
Die dritte Untersuchung schließlich hatte das hohe Adaptationspotential in gemäßigten Breiten zum Gegenstand. Eine Adaptation auf genetischen Level gilt als unwahrscheinlich, da Gründerpopulationen in den neu besiedelten Gebieten eine niedrige genetische Diversität aufwiesen und ein regelmäßiger Neueintrag von Allelen unwahrscheinlich ist. Jedoch bietet das Konzept der epigenetischen Temperatur-Adaptation einen Erklärungsansatz für dieses Phänomen. Daher wurde die Frage gestellt, ob es möglich ist, eine vererbbare Diversifizierung dieses kältetoleranten Phänotyps nach einer randomisierten epigenetischen Behandlung der DNA zu detektieren. Es wurde eine transgenerationale Untersuchung der Effekte von zwei epigenetischen Agenzien (und einem Lösemittel) auf die Kältetoleranz der Eier durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten ein Korrelationsmuster, das den durch die Agenzien veränderten Methylierungsgrad der DNA mit der Forsttoleranz verband, was die gestellte Hypothese unterstützte.
In Folge dieser drei Untersuchungen wurde festgestellt, dass Ae. albopictus ein hohes Potential hat, in weiteren Ländern – vor allem in gemäßigten Breiten – ein Gesundheitsrisiko darzustellen. Da die Art einerseits Fitnessvorteile durch falsche Bekämpfungsmaßnahmen und andererseits möglicherweise eine hohes epigenetisches Adaptationspotential besitzt, kann zusammenfassend empfohlen werden, dass der Fokus für weitere Forschung maßgeblich auf der Entwicklung von Impfstoffen für die übertragenen Viren und Pathogene liegen sollte. Dadurch kann die Bevölkerung geschützt werden, ohne Ökosysteme und ihre Dienstleistungen zu gefährden, und dies wäre zudem ökonomisch gesehen die effektivere Lösung.
In den letzten Jahren findet die Wirkung von Polyphenolen auf den Alterungsprozess oder zur Behandlung von Krankheiten immer mehr Beachtung. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Wirkmechanismen der Polyphenole Gossypol, Curcumin und Quercetin, um Hinweise für neue oder verbesserte Therapieansätze zu erhalten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen lieferten folgende Ergebnisse:
1. Der Ascomycet "P. anserina" eignet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Wirkmechanismen verschiedener Polyphenole, da die bereits aus der Literatur bekannten Effekte auf das Überleben höherer Organismen auch in "P. anserina" beobachtet wurden.
2. Die Mitochondrienfunktion spielt auf unterschiedliche Art eine Rolle in der Kompensation von Dysfunktionen oder Stressbedingungen in der Zelle und wirkt somit positiv auf die Regulation der Lebensspanne von "P. anserina". In der "PaSod3"-Deletionsmutante wurde eine Verschiebung der mitochondrialen Atmung von einer Komplex I-abhängigen hin zu einer vermehrt Komplex II-abhängigen Atmung festgestellt. Die damit verbundene Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials dient neben der bereits bekannten hohen Superoxid-Menge als Signal zur Mitophagie-Induktion. Auch die Anpassung der Mitochondrienfunktion durch die erhöhte Bildung von mtRSCs, wie im Falle von Gossypol oder Quercetin, kann zur Kompensation von Dysfunktionen beitragen bzw. sie abschwächen.
3. Es gibt keinen grundlegenden gemeinsamen Wirkmechanimus der drei untersuchten Polyphenole. Zwar spielt Wasserstoffperoxid bei verschiedenen Stoffen eine Rolle, aber nicht bei allen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Wasserstoffperoxid abhängig von der vorherrschenden Konzentration wirkt und daher auch keine Allgemeingültigkeit des Effektes vorherzusagen ist. In niedrigen Konzentrationen sorgt Wasserstoffperoxid z. B. für eine Induktion der Autophagie und damit einhergehende eine Lebensverlängerung. Im Gegensatz dazu wirken hohe Wasserstoffperoxid-Konzentrationen lebensverkürzend und lösen verschiedene Formen von Zelltod aus.
4. Die Curcumin-vermittelte Langlebigkeit wurde das erste Mal in Verbindung mit einer funktionellen Autophagie gebracht. Im Detail führt die Behandlung mit Curcumin durch eine PaSOD1-abhängige leichte Erhöhung der Wasserstoffperoxid-Menge zu einer Induktion von nicht-selektiver Autophagie. Die induzierte Autophagie ist Ursache der Lebensverlängerung durch Curcumin.
5. Gossypol wirkt in Abhängigkeit der mitochondrialen Permeabilitäts-Transitionspore bzw. von ihrem Regulator Cyclophilin D. Hierbei verstärkt die deutlich erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge wahrscheinlich die Induktion von programmiertem Zelltod. Gleichzeitig wird eine cytoprotektive Form von Autophagie und ein scheinbar ATG-unabhängiger Abbau von Mitochondrien induziert.
6. Quercetin wirkt in "P. anserina" abhängig vom Methylierungs-Status. Untersuchungen mit Mutanten der "O"-Methyltransferase PaMTH1 ergaben die Notwendigkeit der Anwesenheit von PaMTH1 für den lebensverlängernden Effekt von Quercetin. Analysen mit dem methylierten Derivat Isorhamnetin verdeutlichten diese Abhängigkeit und zeigten zudem, dass Quercetin sowohl in der methylierten als auch unmethylierten Form Effekte hervorruft. Jedoch sind nur die Effekte des unmethylierten Quercetin unabhängig von der Lebensverlängerung und eher schädlich für die Zelle.
In der vorliegenden Arbeit wurden Tauben daraufhin trainiert, in einer Außenvoliere verstecktes Futter zu finden. Nachdem die Tauben diese Aufgabe erlernt hatten, fand keine weitere Verbesserung des Wiederfindeverhaltens statt. Die komplexe Aufgabe, drei aus 48 möglichen Bechern auszuwählen, wurde mit einer überraschend hohen Präzision von den Tauben gelöst. Zudem erwies sich das Ortsgedächtnis als zeitlich äußerst stabil. Die Ergebnisse meiner Arbeit belegen zum ersten mal, dass Brieftauben (Columba livia) in der Lage sind, sich über einen Zeitraum von mindestens 5 Jahren einmal erlernte Orte zu merken, ohne dabei vermehrt Fehler zu machen. Unterschiedliche Fehlerquoten konnten infolge der unterschiedlichen Anordnung der Futterverstecke gefunden werden. Dabei war es für Tauben offensichtlich schwieriger, Futterverstecke in einer flächigen Anordnung aufzusuchen. Die Taubengruppen, deren Zielbecher in einer Reihe angeordnet waren, zeigten eine stärkere Reihenfolgepräferenz beim Aufsuchen der Futterverstecke. Diese Reihenfolgepräferenz führte zu einer geringeren Fehlerquote. Der Sonnenkompass scheint beim Aufsuchen der Futterverstecke für die Brieftauben eine wichtige Rolle zu spielen. Alle vier untersuchten Taubengruppen reagierten auf eine Verstellung der inneren Uhr mit einer Abweichung ihrer Richtungspräferenzen in die erwartete Richtung. Dabei sind Unterschiede in der Stärke dieser Abweichung zwischen den Gruppen und zwischen einzelnen Individuen feststellbar. Diese Abweichung ging wieder zurück, sobald die innere Uhr der Tiere wieder dem natürlichen Tagesrhythmus angepasst war. Diese Beobachtung kann als weiterer Beleg für das Nutzen des Sonnenkompasses in der Voliere zum Auffinden von Futterorten gewertet werden. Aber auch die Landmarken in der Umgebung der Versuchsvoliere werden als Orientierungsparameter von den Tauben genutzt. So erhöhte sich die Fehleranzahl deutlich, wenn die Voliere nach außen hin abgeschirmt wurde. Dieser Effekt verstärkt sich, wenn zusätzlich zur Abschirmung bei bedecktem Himmel die Sonne nicht mehr sichtbar ist. Offensichtlich nutzen die Tauben zur Orientierung im extremen Nahbereich, genau wie in der Fernorientierung, ein multifaktorielles System. Fällt einer der Faktoren aus, wie beispielsweise die Sonne, kann auf ein anderes System zurückgegriffen werden. Die Tauben waren auch bei der Manipulation zweier Orientierungssysteme, wie dies bei der Abschirmung der Voliere von den äußeren Landmarken bei gleichzeitigem bedecktem Himmel der Fall war, immer noch in der Lage, Futterorte zu finden. Dies spricht für das Vorhandensein weiterer Orientierungsfaktoren. Welcher Art diese Faktoren sind, könnte Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Maligne Gliome sind die häufigsten Neoplasien des Zentralen Nervensystems. Sie zählen zu den hypoxischsten Tumoren und entwickeln u.a. durch die Adaption an niedrige Sauerstoffbedingungen Apoptose-resistente Phänotypen. Darüber hinaus zeichnen sie sich durch schnelle Proliferation und ein diffuses, infiltratives Wachstum in das umliegende Neuropil aus, was eine vollständige Tumor-Resektion unmöglich macht. Entsprechend liegt die mediane Überlebenszeit nach der Diagnose trotz chirurgischen Eingriffs bei anaplastischen Astrozytomen (WHO Grad III) zwischen 18 und 20 Monaten und bei Glioblastomen (WHO Grad IV) zwischen 12 und 15 Monaten. Im ersten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurden 17 Gliomzelllinien in einem in vitro-Anoxiemodell auf ihre Hypoxie-Sensitivität hin untersucht. Dabei wurde eine hohe Variabilität hinsichtlich der Hypoxie-Toleranz festgestellt, sowie die Tendenz zu einer ausgeprägter Anpassung an niedrige Sauerstoffverhältnisse, begleitet von der Fähigkeit, das mitochondriale Membranpotential (delta psi m) aufrecht zu erhalten. Der durch Hypoxie induzierte Zelltod wurde als Caspase-unabhängig und Nekrose-ähnlich charakterisiert. Apoptose wurde hingegen auch in den Hypoxie-sensitiven Zelllinien nach 48 stündigem Sauerstoffentzug nur in sehr geringem Ausmaß beobachtet. Funktionelle Analysen mit den synthetischen BH3-Mimetika HA14-1 und BH3I 2’, die selektiv Bcl-2 bzw. Bcl xL/Bcl-2 inhibieren, lassen darauf schließen, dass die für Gliomzellen typische Bcl-2- und Bcl xL-Überexpression eine Blockade des mitochondrialen Signalwegs verursacht und so entscheidend zur Apoptose-Resistenz der Zellen beiträgt. Der Todesligand TRAIL, der selektiv in Tumorzellen Zelltod aktiviert, ist ein vielversprechender Kandidat für neue Apoptose-induzierende Krebstherapien. Da jedoch einige Krebszelltypen einschließlich maligner Gliome weitgehend gegen TRAIL resistent sind, richtet sich das Interesse verstärkt auf kombinatorische Therapieansätze, die Tumorzellen für TRAIL resensitivieren sollen. Nur zwei von sechs untersuchten Gliomzelllinien reagierten auf die Behandlung mit TRAIL, wobei eine Korrelation zwischen Hypoxie- und TRAIL-Resistenz deutlich wurde und die Hypothese einer ausgeprägten Kreuzresistenz stärkt. Ein Zusammenhang zwischen TRAIL-Sensitivität und TRAIL-Todes- bzw. –Decoy-Rezeptor-Expression konnte indes nicht hergestellt werden. Der Vergleich von konventionellen Therapienansätzen (Gamma-Bestrahlung) mit neuartigen Wirkstoffklassen (BH3-Mimetika und Proteasomeninhibitoren) zeigte, dass Gamma-Bestrahlung lediglich in TRAIL-sensitiven Zellen synergistisch mit TRAIL wirkte, während die BH3-Mimetika den TRAIL-induzierten Zelltod sowohl in TRAIL-sensitiven als auch –resistenten Zellen signifikant erhöhten. Diese Befunde legen nahe, dass die hohen Bcl-2- und Bcl xL-Proteinlevel verschiedene Signalwege hemmen, die an den Mitochondrien konvergieren und dadurch die Apoptose- bzw. Therapie-Resistenz maligner Gliome steigern. Der Einsatz der Proteasomeninhibitoren MG132 und Epoxomicin erwies sich vergleichsweise als am effizientesten: Beide Substanzen vervielfachten p53-unabhängig den TRAIL-induzierten Zelltod in TRAIL-sensitiven Gliomzellen und reaktivierten darüber hinaus potent die TRAIL-induzierte Apoptose in den TRAIL-resistenten Zelllinien. Microarray- und semi-quantitative RT-PCR-Analysen ergaben eine potente transkriptionelle Aktivierung des TRAIL-Rezeptors DR5 und der Stress-induzierten Transkriptionsfaktoren CHOP und c-Jun. Weitere Untersuchungen mit Hilfe von chemischen Inhibitoren und RNA-Interferenz zeigten, dass die CHOP-unabhängige, JNK/c-Jun-Signalwegs-vermittelte Aktivierung von DR5 eine maßgebliche Rolle bei der Proteasomeninhibitor-induzierten Sensitivierung von Gliomzellen für TRAIL spielt. Zusammengenommen legen die vorgelegten Befunde nahe, dass neue Ansätze basierend auf TRAIL oder agonistischen TRAIL-Rezeptor-Antikörpern in Kombination mit Proteasomeninhibitoren oder BH3-Mimetika vielversprechende Strategien zur Überwindung der Therapieresistenz maligner Gliome darstellen.
Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Rolle der i-AAA Protease in P. anserina, besonders während des Alterns des Ascomyceten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen:
1. Unter Standardbedingungen ist der PaIap-Deletionsstamm langlebiger als der Wildstamm, ohne feststellbare physiologische Beeinträchtigungen aufzuweisen. Dass dies auf den Verlust von PaIap zurückzuführen ist, bestätigen die PaIap-Revertantenstämme, in denen das Gen wieder eingeführt wurde, wodurch deren Lebensspanne wieder Wildtyp-artig ist. Dies zeigt, dass PaIAP zelluläre Prozesse beeinflusst, die die Lebensspanne kontrollieren.
2. Bei Hitzestress weist der PaIap-Deletionsstamm dagegen eine höhere Hitzesensitivität auf als der Wildstamm, was sich in einer verkürzten Lebensspanne und der Störung vitaler Funktionen äußert. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von PaIAP bei der Hitzestressantwort hin.
3. Im Einklang mit dem hitzesensitiven Phänotyp des PaIap-Deletionsstamms konnte in mitochondrialen Extrakten des Wildtyps gezeigt werden, dass die Proteinmenge von PaIAP durch Hitzestress signifikant zunimmt. Gleichzeitig weisen mitochondriale Proteinextrakte von PaIap-Deletionsstämmen nach Hitzestress signifikant geringere Mengen an PaHSP60 und PaCLPP auf, zwei weiteren Komponenten der mitochondrialen Proteinqualitätskontrolle. Dies unterstreicht die Beteiligung von PaIAP an der Hitzestressantwort von P. anserina.
4. Darüber hinaus beeinflusst der Verlust von PaIap die Zusammensetzung der mitochondrialen Atmungskette und führt bei 27°C zu einer vermehrten Organisation der Komplexe in stabilere Superkomplexe. Dieser Mechanismus wird beim Wildstamm erst nach Hitzestress beobachtet, wogegen der PaIap-Deletionsstamm die Superkomplexmenge nicht mehr weiter steigern kann.
5. Die Genexpression von proteolytisch inaktiven Varianten von PaIAP (PaIAPE540Q bzw. PaIAPE540QG) kann den Phänotyp des PaIap-Deletionsstamms bei 27°C nicht komplementieren und führt ebenfalls zu einer Verlängerung der Lebensspanne von P. anserina. Dies liefert wichtige Informationen über den Mechanismus wie PaIAP die Lebensspanne von P. anserina beeinflusst, da dazu die proteolytische Aktivität von PaIAP benötigt wird.
6. Darüber hinaus zeigt die Analyse des PaIap/PaClpP-Deletionsstamms, dass sich die Mechanismen, wie PaIAP und PaCLPP die Lebensspanne von P. anserina beeinflussen, unterscheiden. Die unterschiedlichen zellulären Aufgaben werden auch bei Hitzestress deutlich, wovon der PaIap/PaClpP-Deletionsstamm noch stärker betroffen ist als durch die Deletion von PaIap bzw. PaClpP. Dies verdeutlicht, dass sich die Effekte der Deletionen der beiden Gene addieren.
Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die i-AAA Protease PaIAP auch bei P. anserina wichtige zelluläre Funktionen besitzt, die sich auf den Alterungsprozess des Ascomyceten auswirken. Dabei war es möglich verschiedene neue Mechanismen zu identifizieren, wie die i-AAA Protease diese Funktionen ausübt. Dazu gehören z.B. der Einfluss der proteolytischen Aktivität auf die Lebensspanne, die durch die Abwesenheit der i-AAA Protease ausgelöste Reorganisation der Atmungskettenkomplexe in stabile Superkomplexe, und die Induktion der Hitzestressantwort durch PaIAP. Diese Befunde tragen zum besseren Verständnis der zellulären Funktion der i-AAA Protease bei und stellen einen entscheidenden Ausgangspunkt für weiterführende Analysen der bislang wenig verstandenen Aufgaben der Protease dar.
Ziel dieser Arbeit war es, einen genaueren Einblick in die Rolle von PaCLPXP für den Energiemetabolismus von P. anserina zu erhalten und mögliche Komponenten zu identifizieren, welche wichtig für die Langlebigkeit der PaClpP-Deletionsmutante sind. Folgende neue Erkenntnisse konnten hierbei gewonnen werden:
1. Die Substrat-Analyse durch eine Cycloheximid-Behandlung und anschließender Proteom-Analyse legte erfolgreich eine Reihe potentieller bisher nicht bekannter Substrate von PaCLPP offen. Interessanterweise waren unter den identifizierten Proteinen viele ribosomale Untereinheiten und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege des Energiemetabolismus zu finden. Am auffälligsten unter diesen Substraten war die extreme Anreicherung eines Retikulon-ähnlichen Proteins, das einen neuen Aspekt der möglichen molekularbiologischen Rolle von PaCLPP in P. anserina andeutet.
2. Durch die Zugabe von Butyrat zum Medium, konnte erfolgreich die Autophagie sowohl im P. anserina Wildtyp als auch in der PaClpP-Deletionsmutante reduziert werden. Diese Verminderung der Autophagie sorgt bei ΔPaClpP für eine Verkürzung der Lebensspanne. Dieser Effekt ist spezifisch für die PaClpP-Deletionsmutante, während die Auswirkung von Butyrat auf den Wildtyp nur marginal ist. Dieses Ergebnis untermauert frühere Analysen dieser Deletionsmutante, welche besagen, dass die Langlebigkeit von ΔPaClpP Autophagie abhängig ist (Knuppertz und Osiewacz, 2017).
3. Die Metabolom-Analyse von ΔPaClpP im Vergleich zum Wildtyp zeigt, dass das Fehlen der PaCLPP zu Veränderungen in der Menge der Metaboliten der Glykolyse und des Citratzyklus kommt. Außerdem sind die Mengen der meisten Aminosäuren und der Nukleotide betroffen. Diese Analyse beweist, dass das Fehlen dieser mitochondrialen Protease weitreichende Folgen für die ganze Zelle hat. Durch die signifikante Verringerung von ATP und die Anreicherung von AMP in jungen ΔPaClpP-Stämmen und durch den Umstand der gesteigerten Autophagie in dieser Mutante, fiel das Augenmerk auf die AMPK. Dieses veränderte AMP/ATP-Verhältnis ist ein Indiz für eine gesteigerte AMPK-Aktivität und könnte auch den Umstand der gesteigerten Autophagie in ΔPaClpP erklären.
4. Das Gen codierend für die katalytische α-Untereinheit der AMPK (PaSnf1) konnte erfolgreich in P. anserina deletiert werden. Das Fehlen von PaSNF1 führt zu einer reduzierten Wuchsrate, eine beeinträchtige weibliche Fertilität und eine verzögerte Sporenreifung. Es konnte gezeigt werden, dass die Autophagie infolge einer PaSnf1-Deletion nicht gänzlich unterdrückt wird, PaSNF1 allerdings für die Stress-induzierte Autophagie notwendig ist. Überraschenderweise führt die Abwesenheit von PaSNF1 zu einer verlängerten Lebensspanne im Vergleich zum Wildtyp. Die meisten Effekte infolge einer PaSnf1-Deletion konnten durch die Einbringung eines FLAG::PaSNF1-Konstrukts komplementiert werden.
5. Eine gleichzeitige PaSnf1 und PaClpP-Deletion führt zu eine unerwarteten, extremen Lebenspannenverlängerung, die die Verlängerung der Lebensspanne bei der PaClpP-Deletionsmutante noch übertrifft. Interessanterweise geht dieser Phänotyp nicht mit einer erhöhten Autophagie einher. Des Weiteren konnte beobachtet werden, dass das Fehlen von PaSNF1 sowohl in ΔPaSnf1 als auch in ΔPaSnf1/ΔPaClpP zu einer veränderten Mitochondrien-Morphologie im Alter führt. Die Abwesenheit von PaSNF1 verursacht, dass die Stämme auch im Alter (20d) noch überwiegend filamentöse Mitochondrien aufweisen. Zudem zeigen die drei analysierten Deletionsstämme (ΔPaSnf1, ΔPaClpP und ΔPaSnf1/ΔPaClpP) massive Einschränkungen wenn sie auf die mitochondriale Funktion angewiesen sind.
6. Auffallend war, dass bei ΔPaSnf1, ΔPaClpP und bei ΔPaSnf1/ΔPaClpP die Stämme mit dem Paarungstyp „mat-“ langlebiger sind als die Stämme mit dem Paarungstyp „mat+“. Dieser Effekt ist bei der ΔPaSnf1/ΔPaClpP-Doppelmutante am stärksten ausgeprägt. Weitere Untersuchungen dazu ergaben, dass die Paarungstypen immer dann eine Rolle spielen, wenn die Stämme mitochondrialem Stress ausgesetzt, oder aber auf die mitochondriale Funktion angewiesen sind. Verantwortlich für diese Unterschiede sind zwei rmp1-Allele, die mit den unterschiedlichen Paarungstyp-Loci gekoppelt sind und mit dem jeweiligen Paarungstyp-Locus vererbt werden (rmp1-1 mit „mat-“; rmp1-2 mit „mat+“).
Untersuchungen zur Bedeutung selektiver Autophagie für Alterungsprozesse von Podospora anserina
(2022)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, die Funktion und die Rolle von Autophagie-assoziierten Proteinen im Alternsmodell Podospora anserina zu untersuchen und einen Einblick in die nicht-selektive Autophagie, die Mitophagie und die Bildung und den Abbau von Autophagosomen im Zusammenhang zur Alterung von P. anserina zu analysieren. Dabei wurden folgende Erkenntnisse erhalten:
1. Die Untersuchungen zu ΔPaAtg8 bestätigen, dass die PaATG8-abhängige Autophagosomenbildung zur Aufrechterhaltung der Lebensspanne benötigt wird. In ΔPaAtg8 kommt es zu einem Verlust der nicht-selektiven Autophagie. Die Mitophagie hingegen ist auch ohne PaATG8 partiell möglich und es liegt ein PaATG8-unabhängiger Abbau von mitochondrialen Proteinen in P. anserina vor.
2. In P. anserina ist PaATG11 an der nicht-selektiven Autophagie beteiligt und auch die Mitophagie erfolgt in Abhängigkeit dieses Gerüstproteins. Während der PaAtg11-Deletionsstamm unter Normalbedingungen keinen zum Wildtyp veränderten Phänotyp zeigt, führt eine Kultivierung auf M2-Medium mit Glycerin als einziger Kohlenstoffquelle zu einer starken Verkürzung der Lebensspanne. Eine mikroskopische Untersuchung der Mitochondrien zeigte, dass im juvenilen Altersstadium von ΔPaAtg11 stark fragmentierte Mitochondrien vorliegen. Während der Alterung normalisiert sich die Mitochondrienmorphologie wieder. Der mitochondriale Funktionsverlust wird möglicherweise von den fragmentierten Mitochondrien ausgelöst, denn eine Kultivierung von älteren ΔPaAtg11-Stämmen auf M2-Medium mit Glycerin führt zu einer Normalisierung der Lebensspanne.
3. Die initialen Untersuchungen zur ΔPaAtg11/ΔPaAtg24-Doppelmutante zeigen, dass es bei der Kultivierung unter Normalbedingungen zu einem additiven Effekt der beiden Genverluste kommt. Bei der Anzucht auf M2-Medium mit Glycerin hingegen kann eine im Vergleich zum ΔPaAtg11-Stamm längere Lebensspanne festgestellt werden. Die Mikroskopie der Mitochondrien in ΔPaAtg11/ΔPaAtg24 zeigt, dass im juvenilen Alter zum Wildtyp vergleichbare filamentöse Mitochondrien vorhanden sind.
4. In P. anserina ist PaATG24 kein Mitophagierezeptorprotein, da im PaAtg24-Deletionsstamm eine Beeinträchtigung der nicht-selektiven Autophagie vorliegt. Auch die Mitophagie ist in diesem Stamm geschädigt. Die mikroskopische Betrachtung der Mitochondrien zeigt keinen Unterschied zum Wildtyp. Bei der Untersuchung zur Mitochondrienfunktion durch M2-Medium mit Glycerin ist wie unter Normalbedingungen eine verkürzte Lebensspanne feststellbar.
5. Der Abbau von GFP::PaATG8 ist in der PaAtg24-Deletionsmutante signifikant verringert und es kommt zu einer Akkumulation von Autophagosomen, somit liegt in diesem Stamm eine Beeinträchtigung des autophagosomalen Flusses vor. Bei der mikroskopischen Untersuchung von PaATG24 zeigt sich, dass dieses Protein in P. anserina im Bereich der Vakuolen lokalisiert ist. Die Analyse der Vakuole-Autophagosomen-Fusion zeigt jedoch, dass dieser Mechanismus unabhängig von PaATG24 ist. Die Vakuolenmorphologie und Vakuolengröße ist in ΔPaAtg24 beeinträchtigt und dadurch kommt es zu dem beobachteten Defekt der nicht-selektiven und selektiven Autophagie.
Untersuchungen zur Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für die Alterung von Podospora anserina
(2012)
Im Rahmen dieser vorliegenden Doktorarbeit sollte die Bedeutung von Superoxid-Dismutasen für das Resistenzverhalten und den Alterungsprozess bei P. anserina untersucht werden. Folgende Befunde aus den Analysen konnten erhalten werden:
1. Lokalisationsstudien der drei PaSods: Aus den biochemischen und fluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen der drei verschiedenen PaSODs geht hervor, dass PaSOD1, eine Cu/ZnSOD, überwiegend im Cytosol und zu einem geringen Anteil im mitochondrialen Intermembranraum lokalisiert ist. Eine der beiden MnSODs, PaSOD2, wird vermutlich zur Abwehr von exogenem Superoxid sekretiert. Bei PaSOD3 handelt es sich um eine mitochondriale MnSOD.
2. Generierung von verschiedenen PaSod-Mutanten: Im Rahmen dieser Arbeit wurden von jeder PaSod mindestens drei unabhängige Überexpressionsstämme, ein GFP-Stamm- und ein Deletionsstamm hergestellt. Weiterhin wurden alle möglichen Doppel-Deletionsstämme und die Dreifach-Deletionsmutante erzeugt. Alle Stämme wurden auf DNA-Ebene verifiziert, zusätzlich wurde die Proteinmenge bzw. –Aktivität überprüft.
3. Einfluss der PaSODs auf die ROS-Toleranz: Die Analysen der ROS-Resistenzen haben gezeigt, dass PaSODs eine wichtige Rolle in der Entgiftung von Superoxiden spielt. So ließ sich bei den Deletionsstämmen der PaSods eine gesteigerte Sensitivität gegenüber Paraquat feststellen. Eine Aufsummierung der Sensitivität gegenüber Paraquat ist bei der PaSod-Tripelmutante (ΔPaSod1/2/3) zu erkennen.
Überraschenderweise kann durch die gesteigerten Mengen an aktiver PaSOD in den Überexpressionsstämmen (PaSod1-3_OEx) keine verbesserte Resistenz gegenüber Paraquat erzielt werden. Darüber hinaus führt die Überexpression des Gens für die mitochondriale SOD, PaSOD3, zu massiven negativen Effekten.
4. Einfluss auf die Lebensspanne: Durch eine fehlende Entgiftung von Superoxid in den PaSod-Deletionsmutanten ist eine Verminderung der Lebensspanne nicht festzustellen. Bei PaSod-Mutantenstämme, die eine erhöhte PaSOD-Aktivität und damit eine gesteigerte Abbaurate des Superoxids aufweisen, kann bei den PaSod1- und PaSod2-Überexpressionsstämmen keine verbesserte Lebensspanne unter den gewählten Standardbedingungen erzielt werden. Vielmehr noch ist die Lebensspanne der PaSod3-Überexpressionsstämme stark reduziert.
5. Einfluss der PaSod-Modulation auf andere Komponenten des ROS-Abbausystems: Die PaSOD-Aktivitäten scheinen miteinander co-reguliert zu werden. Des Weiteren scheint es ein Zusammenhang zwischen den beiden sekretierten Enzymen PaSOD2 und PaCATB zu geben. Deutlich wird auch, dass die Modulation der Superoxid-Dismutasen eine weitreichende Auswirkung auf andere Schutzsysteme hat. Beispielweise konnte gezeigt werden, dass Komponenten des mitochondrialen ROS-Schutzsystems und der Protein-Qualitätskontrolle in den PaSod3-Überexpressionsstämmen verändert sind.
Zusammenfassend lassen die Analysen der PaSod-modulierten Stämme den Schluss zu, dass die Superoxid-Dismutase in P. anserina ein wichtiges Enzym zum Abbau des schädlichen Superoxids darstellt, welches aber nur eine untergeordnete Rolle bei der Kontrolle der Lebensspanne unter den gewählten Wachstumsbedingungen im Labor ausübt. Des Weiteren haben die Analysen gezeigt, dass es durch die Modulation der PaSod-Gene zu weitreichenden Änderungen, die das ROS-Schutzsystem (PaSOD, PaCATB und PaPRX1) sowie die Protein-Qualitätskontrolle (PaHSP60, PaLON und PaCLPP) betreffen, kommt. Welche Auswirkung dabei diese Veränderungen in Bezug auf die Lebensspanne hat, kann nur schwer abgeschätzt werden und muss mit weiteren Untersuchungen geklärt werden.
Die Zusammensetzung der Plasmamembran tierischer Zellen kann unter anderem durch regulierte Exozytose und durch hydrolytische Abspaltung von Ektodomänen membran-assoziierter Proteine (Ectodomain Shedding) modifiziert werden. Regulierte Exozytose spezialisierter Vesikel, den sogenannten GSVs (GLUT4 containing small vesicles), dient der intrazellulären Speicherung des Glucosetransporters4 (GLUT4) sowie seinem insulin-abhängigen Einbau in die Plasmamembran. Die proteolytische Abspaltung der Ektodomänen von Zelloberflächenproteinen wie z.B. des Heparin-bindenden epidermalen Wachstums-faktors (heparin binding-epidermal growth factor = HB-EGF) führt zur Modifikation der Plasmamembranzusammensetzung. Wir zeigten, dass GSVs in vielen Säugerzellen für die intrazelluläre Speicherung spezifischer Plasmamembranproteine und deren stimulations-abhängigen Transfer in die Plasmamembran zuständig sind. Um GSVs eindeutig identifizieren zu können, wurden Rat1-Zellen stabil mit GLUT4myc als heterologem Marker für dieses spezifische Speicherkompartiment transfiziert. Die intrazelluläre GLUT4-Lokalisation in den als positiv identifizierten Rat1/GLUT4myc-Klonen entsprach dem für CHO/GLUT4-Zellen beschriebenen Verteilungsmuster. In der Folge wurden mehrere potentiell vesikel-assoziierte Membranproteine in die Untersuchungen zur Membran-zusammensetzung einbezogen: eine endogene proHB-EGF hydrolysierende Proteaseaktivität und die Metalloproteasen ADAM10 und TACE. Es zeigte sich, dass GSVs eine Proteaseaktivität enthielten, die VSVG-proHB-EGF hydrolysierte. Eine Colokalisation der beiden endogenen Metalloproteasen ADAM10 und TACE mit GLUT4 in GSVs konnte gezeigt werden. Untersuchungen zeigten, dass beide endogenen Proteasen ADAM10 und TACE in Rat1/GLUT4myc-Zellen mit einer Subpopulation von GSVs assoziiert zu sein scheinen. Die Stimulation des G-Protein-gekoppelten Thrombinrezeptors löste in diesen Zellen eine regulierte Exozytose der GSVs aus. Die Metalloproteasen-enthaltenden GSVs reagierten jedoch nicht auf diese Art der Stimulation. Sie bildeten möglicherweise eine Reservepopulation von GSVs, die erst bei stärkerer Stimulation mobilisiert werden kann. Unter Ruhebedingungen schien auch diese Vesikelpopulation über andere intrazelluläre Kompartimente, nicht jedoch über die Plasmamembran, zu rezirkulieren.
Der Pilz Podospora anserina ist seit mehr als fünf Jahrzehnten ein wichtiger Modellorganismus für die Alternsforschung. Insbesondere die Mitochondrien, essentielle eukaryotische Zellorganellen – wegen ihrer Funktion im Energiestoffwechsel häufig auch als „zelluläre Kraftwerke“ bezeichnet, sind Schlüsselfaktoren für den Alterungsprozess dieses Organismus.
Im Rahmen einer vorangegangenen Diplomarbeit wurde daher der Einfluss der mitochondrialen CLPXP-Protease, einem bisher noch wenig erforschten Bestandteil der Proteinqualitätskontrolle in Mitochondrien, auf die Alterung von P. anserina untersucht. Mitochondriale CLPXP-Proteasen sind, wie auch ihre bakteriellen Pendants, aus zwei verschiedenen Untereinheiten aufgebaut: der Protease-Komponente CLPP und der Chaperon-Komponente CLPX. Die Deletion des Gens PaClpP, kodierend für CLPP in P. anserina, führte zu einer überraschenden Verlängerung der gesunden Lebensspanne der Mutante. Darüber hinaus war es möglich, den pilzlichen PaClpP-Deletionsstamm durch Einbringen von CLPP des Menschen zu komplementieren. Dies beweist, dass die Proteasen CLPP des Menschen und von P. anserina funktionell homolog sind. Dadurch eröffnete sich die Perspektive, diesen einfachen Modellorganismus für die Gewinnung potenziell auf den Menschen übertragbarer Erkenntnisse einzusetzen. Bedeutenderweise ist die menschliche CLPXP-Protease wahrscheinlich involviert in die Entstehung verschiedener Krankheiten, darunter das Perrault-Syndrom sowie einige Krebsarten. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch weitestgehend unverstanden.
Ziel des in dieser Dissertation beschriebenen Forschungsprojektes war daher die Gewinnung genauerer Einsichten in die molekulare Funktion und die daraus folgende biologische Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease von P. anserina. Der wohl wichtigste Punkt für das detaillierte Verständnis einer Protease ist die Kenntnis ihres Substratspektrums, d. h. der von ihr abgebauten Proteine. Tatsächlich wurde aber bis heute noch in keinem eukaryotischen Organismus eine umfassende Analyse der Substrate einer mitochondrialen CLPXP-Protease vorgenommen. Um diese Wissenslücke zu füllen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine ursprünglich in Bakterien entwickelte Verfahrensweise, der sogenannte CLPP „Substrat-trapping Assay“, in P. anserina implementiert. Dafür mussten zunächst die notwendigen handwerklichen Voraussetzungen für den Assay geschaffen werden, insbesondere die effiziente Affinitätsaufreinigung von Proteinen aus isolierten Mitochondrien – einer bisher in P. anserina noch nicht angewandten Technik. Unter Verwendung verschiedener neu hergestellter Varianten der menschlichen Protease-Komponente CLPP, darunter einer proteolytisch inaktiven Variante zum „Einfangen“ von Substraten, konnte der CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina erfolgreich durchgeführt werden. Insgesamt wurden, in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Julian D. Langer (Max-Planck-Institut für Biophysik; Durchführung von massenspektrometrischen Analysen) nahezu 70 spezifische Proteine erstmalig als potenzielle Substrate oder Interaktionspartner einer mitochondrialen CLPXP-Protease identifiziert. Bei einem Großteil dieser Proteine handelt es sich um Enzyme und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege – vor allem um solche, die eine zentrale Rolle im mitochondrialen Energiestoffwechsel spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen somit folgende Arbeitsthese als Schlussfazit und gleichzeitig Ausganspunkt für zukünftige Untersuchungen nahe:
Die hauptsächliche molekulare Funktion der mitochondrialen CLPXP-Protease in P. anserina ist die Degradation von Stoffwechselenzymen und ihre biologische Rolle demnach die Kontrolle und Aufrechterhaltung des mitochondrialen und zellulären Energiestoffwechsels.
Insgesamt ist die auf Grundlage des CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina anzunehmende Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease als regulatorische Komponente des mitochondrialen Energiestoffwechsels erstaunlich gut mit Beobachtungen in anderen eukaryotischen Organismen, gerade bezüglich der Relevanz der CLPXP-Protease des Menschen für diverse Krankheiten, zu vereinbaren. Somit erscheint es überaus sinnvoll und vielversprechend, dass in dieser Doktorarbeit erstellte und bisher beispiellose Kompendium potenzieller in vivo Substrate und Interaktionspartner dieser Protease auch als Referenz für zukünftige Untersuchungen außerhalb von P. anserina anzuwenden.
Untersuchungen zur molekularen Kontrolle der Kupferhomöostase in dem Ascomyceten Podospora anserina
(2007)
Das essentielle Spurenelement Kupfer ist Co-Faktor mehrerer Schlüsselenzyme (z B. Cu/Zn-SOD, Cytochrom c Oxidase). Da Kupfer leicht Elektronen aufnehmen und abgeben kann, eignet es sich besonders gut für Redox-Reaktionen. Wenn Kupfer jedoch mit Sauerstoff reagiert, entstehen hoch cytotoxische reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die nach der „freien Radikaltheorie des Alterns“ (nach D. Harman 1956) ursächlich für Alterung und Zelltod sind. Um deren Bildung zu vermeiden, erfolgen alle Aspekte des Kupferstoffwechsels – Aufnahme, Transport und Speicherung - stets proteingebunden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich bis auf drei Ausnahmen die gesamte bislang bekannte Maschinerie der molekularen Kupferhomöostase aus anderen Modellorganismen (z.B. S. cerevisiae oder H. sapiens) auch im Genom des Ascomyceten Podospora anserina mit Homologen bzw. Orthologen wiederfindet. Die drei Ausnahmen betreffen jeweils Proteine, für die in anderen Organismen mehrere Isoformen existieren und P. anserina nur jeweils ein Homolog/Ortholog besitzt. Für mehrere der neu vorhergesagten Gene (PaAtx1, PaCcc2, PaCcs1, PaCox11, PaCox19, PaCox23, PaSco1) konnte eine Expression im Wildstamm nachgewiesen werden. Dazu wurden Standardtechniken (Northern Blot Analyse, RT-PCR) und auch neu etablierte eGFP-Reporterkonstrukte verwendet. In Podospora anserina scheint Kupfer auf zwei verschiedene Arten Einfluss auf die Lebensspanne zu nehmen: Zum einen mittelbar darüber, dass die Verfügbarkeit von Kupfer über die in der mitochondrialen Atmung verwendete Endoxidase entscheidet. Bei Kupfermangel wird eine Eisen-abhängige alternative Oxidase (AOX) induziert. Durch Atmung über die AOX entstehen weniger ROS, was die Lebensspanne verlängert. Anhand einer Vielzahl langlebiger Mutanten konnte dieser Zusammenhang bereits mehrfach demonstriert werden. Zum anderen scheint Kupfer auch eine unmittelbare Rolle in der Seneszenz von P. anserina zu spielen. In früheren Arbeiten konnten mehrere indirekte Hinweise (Transkript- und Aktivitätsanalysen) gesammelt werden, dass im Alter die cytoplasmatische Kupferkonzentration drastisch ansteigt. Durch Messung der Kupferkonzentration mittels einer direkten chemisch-analytische Methode (TXRF) in fraktionierten Zellbestandteilen (Cytoplasma und Mitchondrien) konnten in dieser Arbeit diese Hinweise weiter untermauert werden. Experimente mit in die mitochondriale Matrix geleitetem eGFP brachten zusätzliche Indizien dafür, dass das mitochondriale Kupfer-Reservoir die Quelle des sich in seneszenten Pilzstämmen im Cytoplasma wiederfindenden Kupfers ist. Durch einen Prozess, der größenabhängig reguliert und in anderen Organismen als „Mitochondrial Permeability Transition – MPT“ zu Beginn der Apoptose bekannt ist, ergiesst sich beim Eintritt in die Seneszenz der Inhalt der mitochondrialen Matrix in das Cytosol. Die Bedeutung dieses Vorgangs und v.a. die Folgen der Umverteilung von Kupfer innerhalb der Zelle bleiben im Detail weiter zu klären. Durch die durchgeführten Arbeiten konnte ein weiterer deutlicher Beweis für das Ablaufen apoptotischer Mechansimen im Alterungsprozeß des Ascomyceten P. anserina erbracht werden.
An die Signalübertragung im ZNS werden in bestimmten Entwicklungsstadien sehr unterschiedliche Anforderungen gestellt. Im adulten Gehirn dient sie nicht nur der Nachrichtenübermittlung, sondern auch der aktivitätsbasierten Umgestaltung neuronaler Verbindungen bei Lernprozessen und der regenerativen Umgestaltung nach Verletzungen. Im sich entwickelnden Gehirn werden schon frühzeitig Nervenzellen elektrisch erregbar und spontan aktiv. Diese elektrische Aktivität und die dadurch verursachte Transmitterausschüttung spielen bei der selektiven Stabilisierung von Synapsen und damit bei der Ausgestaltung des neuronalen Netzwerks eine große Rolle. Im ZNS von Vertebraten beruht die Wirkung des Neurotransmitters und Neuromodulators Acetylcholin auf den nikotinischen und muskarinischen Acetylcholinrezeptoren. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChRen) koppeln, abhängig von den fünf identifizierten Rezeptorsubtypen (M1- M5), an unterschiedliche intrazelluläre Signalketten an. Dabei interagieren für gewöhnlich die M1, M3 und M5 Rezeptoren mit einem G-Protein des Typs Gq/11, während M2 und M4 ein G-Protein des Typs Gi/o aktivieren. Der Colliculus inferior (IC) ist eine wichtige Verschaltungsstation im auditorischen Mittelhirn von Säugetieren. Inhibitorische und exzitatorische Eingänge werden dort während der Entwicklung mit großer Präzision angelegt und konvergieren auf einzelne ICNeurone. Die physiologische Bedeutung von mAChRen im IC ist weitgehend unerforscht und die Subtypen die im juvenilen IC eine Rolle spielen wurden noch nicht charakterisiert. Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit mittels elektrophysiologischer Untersuchungen im IC der juvenilen Ratte (P5-P12) folgende Fragen zu klären: i) Gibt es im IC der jungen Ratte eine Modulation der GABAergen Transmission durch muskarinische Acetylcholinrezeptoren? ii) Welcher muskarinische Rezeptorsubtyp spielt dabei eine Rolle? iii) Welcher intrazelluläre Signalmechanismus ist der Aktivierung des muskarinischen Acetylcholinrezeptors nachgeschaltet? Unter Wirkung von Muskarin kam es bei 41,2% der untersuchten Neurone des Colliculus inferior zu einer Erhöhung der Frequenz der spontanen IPSCs. Die sIPSCs wurden durch Bicucullin blockiert, somit handelt es sich um GABAerge IPSCs. Die Wirkung von Muskarin nahm zu, wenn die Tiere älter als 9 Tage waren. Es wurde gezeigt, dass nAChRen keine Rolle spielen bei der Erhöhung der sIPSC-Frequenz, während eine selektive Blockade der M3-(M5-) mAChRen durch 4-DAMP die Muskarinwirkung blockierte. In der Regel sind die M3-Rezeptoren über folgende Signalkaskade aktiv: Phospholipase C, Kalzium-Calmodulin, NO-Synthase, Guanylatzyklase, die NO-Konzentration und cGMP. Alle Glieder dieser Kaskade wurden untersucht, sie hatten aber keinen Einfluss auf die Muskarinwirkung. Im Gegensatz dazu führte die Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels zu einer vergleichbaren Frequenzsteigerung der sIPSCs wie sie unter der Wirkung von Muskarin gemessen wurde. Weiterhin ließ sich die Erhöhung der sIPSC-Frequenz durch Muskarin vollständig aufheben, wenn die intrazelluläre Adenylatzyklase blockiert wurde. Es ist bekannt, dass der M3-(M5-) mAChR über verschiedenste Signalwege den intrazellulären cAMP-Spiegel verringern oder erhöhen kann und dass die Spezifizierung des Rezeptors vom Grad der Rezeptorexpression, dem Zelltyp und der Kombination der Effektormoleküle abhängig ist. Die Abweichung der juvenilen Kaskade vom im erwachsenen Tier üblichen Signalweg hat dabei den Vorteil, dass eine Aufgabentrennung zwischen Netzwerkbildung und Synapsenstabilisierung einerseits und Signalweiterleitung andererseits erfolgt. Beim juvenilen Tier steht die Netzwerkbildung im Vordergrund, beim erwachsenen Tier wird die Signalweiterleitung moduliert. Der sekundäre Botenstoff NO, der weit diffundieren kann, spielt beim juvenilen Signalweg keine Rolle und dies ermöglicht eine klare Trennung der aktivierten von den umgebenden Synapsen. Dadurch wird eine starke Selektion innerhalb der vorhandenen Synapsen ermöglicht und eine aktivitätsbasierte Netzwerkbildung vereinfacht. Die Etablierung funktioneller GABAerger Synapsen ist ausschlaggebend für die Entwicklung des neuronalen Netzwerks. Innerhalb der ersten postnatalen Wochen führt die Aktivierung von GABAA-Rezeptoren zur Depolarisierung der IC-Neurone und zu einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration. Acetylcholin potenziert also letztlich den GABA-aktivierten Einstrom von Ca2+ und führt damit zur Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration im postsynaptischen Neuron des IC. Diese modulatorische Wirkung von Acetylcholin könnten damit eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Stabilisierung von inhibitorischen Synapsen im sich entwickelnden IC der Ratte spielen.
1. Das Wachstum und die Fähigkeit zur Butyratproduktion von E. callanderi KIST612 wurde in geschlossenen Batch-Kulturen mit den Substraten Glukose, Methanol, Formiat, H2 + CO2 und CO untersucht. E. callanderi KIST612 zeigte sich nur bei Wachstum auf 20 mM Glukose oder 20 mM Methanol in der Lage, Butyrat in größeren Mengen (3,7 – 4,3 mM) zu produzieren. Das Hauptprodukt bei allen untersuchten Wachstumssubstraten war jedoch Acetat.
2. In bioinformatischen Analysen des Genoms von E. callanderi KIST612 konnte nur eine A1AO-ATP-Synthase gefunden werden, welche eine V-typ c-Untereinheit bestehend aus 4 TMH‘s mit nur einer Na+-Bindestelle aufweist. Diese konnte aus gewaschenen Membranen von E. callanderi durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation, Anionenaustausch-Chromatographie (DEAE) sowie einer Größenausschluss-Chromatographie (Superose 6) bis zur apparenten Homogenität gereinigt werden. Nach Produktion einzelner Untereinheiten (A, B, C, D, E, F und H) in E. coli und Generierung von Antikörpern, konnten alle Untereinheiten (A, B, C, D, E, F, H, a sowie c) in der gereinigten Enzympräparation immunologisch oder mittels „Peptide-Mass-Fingerprinting“ nachgewiesen werden. Es konnte somit erstmals eine A1AO-ATP-Synthase aus einem mesophilen Organismus ohne Verlust von Untereinheiten gereinigt werden.
3. Der Gesamtkomplex wies unter nativen Bedingungen eine molekulare Masse von ca. 670 kDa auf. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen zeigte sich anhand der hantelförmigen Strukturen, dass die A1AO-ATP-Synthase als intakter Gesamtkomplex gereinigt werden konnte.
4. Die gereinigte A1AO-ATP-Synthase wurde zunächst anhand ihrer ATP-Hydrolyse-Aktivität biochemisch charakterisiert. Die ATP-Hydrolyse-Aktivität hatte ein pH-Optimum von 7 – 7,5 und ein Temperaturoptimum bei 37 °C. Durch Messung der ATPase-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Mengen an Na+ konnte die vorhergesagte Na+-Abhängigkeit des Enzyms nachgewiesen werden. Zudem zeigten Hemmstoffexperimente mit DCCD, dass dieser Inhibitor mit Na+ um die gemeinsame Bindestelle in der c-Untereinheit konkurriert. Dies bestätigte nochmals, dass das Enzym funktionell gekoppelt gereinigt werden konnte.
5. Zur weiteren Untersuchung der Ionenspezifität wurde der an die ATP-Hydrolyse gekoppelte Ionentransport durch Rekonstitution des Enzyms in Liposomen und anschließender Messung des Na+- oder H+-Transports gemessen. In den Proteoliposomen konnte mit Hilfe von 22Na+ gezeigt werden, dass das Enzym Natriumionen translozieren kann. Während in Anwesenheit des Natriumionophors ETH 2120 kein 22Na+-Transport beobachtet werden konnte, führte die Anwesenheit des Protonophors TCS zu einer geringfügigen Stimulation der 22Na+-Translokation. Insgesamt konnte ein primärer Na+-Transport nachgewiesen werden, welcher von der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi katalysiert wird.
6. Durch Rekonstitution der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi in Liposomen konnte erstmals biochemisch nachgewiesen werden, dass ein solches Enzym trotz seiner V-Typ c-Untereinheit in der Lage ist, ATP zu synthetisieren. Durch die Zugabe von Ionophoren (ETH 2120 und TCS) konnte der elektrochemische Ionengradient aufgehoben werden, wodurch keine ATP-Synthese beobachtet werden konnte. Der erstmalige Nachweis der ATP-Synthese wurde bei einem ΔµNa+ von 270 mV erbracht.
7. Die ATP-Synthese zeigte sich ebenfalls abhängig von der Na+-Konzentration. Der KM-Wert lag bei 1,1 ± 0,4 mM und war vergleichbar mit dem für die ATP-Hydrolyse ermittelten Wert. Ebenso konnte für die ATP-Synthese-Richtung gezeigt werden, dass DCCD mit Na+ um die gemeinsame Bindestelle in der c-Untereinheit konkurriert.
8. Um den biochemischen Nachweis zu erbringen, dass die A1AO-ATP-Synthase auch unter physiologisch relevanten Potentialen zur ATP-Synthese befähigt ist, wurde der energetische Schwellenwert der ATP-Synthese bestimmt. Dieser betrug 87 mV als Triebkraft für ΔpNa, 94 mV als Triebkraft für Δψ und 90 mV als Triebkraft für ΔµNa+. Erstaunlicherweise konnte die ATP-Synthese der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi KIST612 sowohl durch Δψ als auch ΔpNa angetrieben werden. Unterschiedliche Kombinationen von Δψ und ΔpNa führten zu dem gleichen energetischen Schwellenwert; Δψ und ΔpNa waren im Enzym aus E. callanderi KIST612 äquivalente Triebkräfte.
9. Der energetische Schwellenwert der A1AO-ATP-Synthase aus E. callanderi KIST612 wurde mit dem der F1FO-ATP-Synthasen aus A. woodii, E. coli und P. modestum verglichen. Dazu wurden die Enzyme im ATP-Synthase-defizienten E. coli-Stamm DK8 produziert und anschließend durch Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie gereinigt. Nach Einbau der Enzyme in Liposomen waren alle Enzyme in der Lage, ATP als Reaktion auf ΔµNa+ (A. woodii und P. modestum) oder ΔµH+ (E. coli) zu synthetisieren. Im Vergleich zum Enzym aus E. callanderi zeigten sich zwei auffällige Unterschiede. Erstens war keine der F1FO-ATP-Synthasen in der Lage, ΔpNa/ΔpH als alleinige Triebkraft zu nutzen. Während die ATP-Synthese in den Enzymen aus E. coli und P. modestum nur durch ΔµH+ bzw. ΔµNa+ angetrieben werden konnte, konnte das Enzym aus A. woodii zusätzlich auch durch Δψ als einzige Triebkraft angetrieben werden.
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Der Verzehr von radioaktiv belasteten Pilzfruchtkörpern stellt ein Gesundheitsrisiko für den Menschen dar und auch fast 35 Jahre nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986 sind Pilze aus Waldökosystemen zum Teil noch stark durch das ausgetretene radioaktive 137Cs belastet. Die Einschätzung der Belastung und somit des Gesundheitsrisikos ist aufgrund einer Vielzahl von Einflussfaktoren, wie z. B. der Pilzart, der Tiefe des Myzels, der Bodenkontamination und der Feuchtigkeit des Bodens, schwierig. Ziel dieser Arbeit war es die Variabilität, den Einfluss verschiedener Faktoren sowie die effektive Halbwertszeit der 137Cs-Aktivität in Pilzfruchtkörpern zu ermitteln. Des Weiteren wurde überprüft, ob die Bodenkontamination für eine Abschätzung der 137Cs-Aktivität von Pilzfruchtkörpern herangezogen werden kann. Für die Untersuchungen wurden über mehrere Jahre Proben von Maronenröhrlingen (Imleria badia) und Steinpilzen (Boletus edulis) aus vier Waldgebieten in Mittel- und Süddeutschland mit unterschiedlichem Aktivitätseintrag nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986 analysiert. Die Gebiete waren Eichenzell, Wülfersreuth, Oberschönenfeld und der Nationalpark Bayerischer Wald. Als Ergänzung dienten zugesendete Proben derselben Pilzarten von Mitgliedern aus Pilzvereinen aus ganz Deutschland. Zusätzlich zu den Pilzproben wurden Bodenproben gemessen, um zum einen die aktuelle Bodenkontamination zu bestimmen und zum anderen zu überprüfen, ob der Großteil des 137Cs weiterhin im Bereich des Pilzmyzels zu finden ist.
Für die Untersuchung der örtlichen Variabilität der 137Cs-Aktivität wurden Maronenröhrlinge (Imleria badia) aus dem Waldgebiet Eichenzell in den Jahren 2017 bis 2019 analysiert. Innerhalb eines Sammeltages variierten die Messwerte verschiedener Proben innerhalb des Waldgebietes teilweise um den Faktor sechs. Dabei ist die Variabilität innerhalb eines Teilgebietes größer als zwischen beiden Teilgebieten des Waldgebietes Eichenzell. Für ein repräsentatives Ergebnis eines Gebietes ist es aufgrund der Variabilität erforderlich, eine ausreichende Menge an Fruchtkörpern zu analysieren.
Um die effektive Halbwertszeit der 137Cs-Aktivität in Maronenröhrlingen (Imleria badia) zu ermitteln, wurden Proben aus drei Waldgebieten über fünf bis neun Jahre analysiert. Die Wahl der drei Waldgebiete erfolgte anhand des 137Cs-Aktivitätseintrags nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl im Jahr 1986. Die Bodenkontaminationswerte variieren von 3.000 Bq/m² in Eichenzell über 12.500 Bq/m² in Wülfersreuth bis 35.000 Bq/m² in Oberschönenfeld. Die effektiven Halbwerts-zeiten liegen in einem engen Bereich von 5,2 bis 5,8 Jahre mit einem Mittelwert von 5,4 ± 0,3 Jahren. Damit reduziert sich die radioaktive Belastung der Pilzfruchtkörper in etwa fünfmal schneller als durch die rein physikalische Halbwertszeit des 137Cs von 30,08 Jahren. Durch die Hinzunahme von bereits im Jahr 1990 veröffentlichten Daten ergab sich eine längere effektive Halbwertszeit von 7,7 ± 0,6 Jahren.
Für die Untersuchung der zwei Einflussfaktoren Exposition des Sammelgebiets (Hangausrichtung nach Ost oder West) und Höhenlage wurden sowohl Maronenröhrlinge (Imleria badia) als auch Steinpilze (Boletus edulis) hinsichtlich der 137Cs-Aktivität gemessen, um die Auswirkung auf Pilzarten mit unterschiedlichem Akkumulationsvermögen zu analysieren. Als Untersuchungsgebiet diente der Nationalpark Bayerischer Wald, da dieser ein großes Gebiet umfasst und verschiedene Ausprägungen der beiden Faktoren abbildet. Zudem wurde das Gebiet in Folge der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl stark kontaminiert und der Park ist ein beliebtes Pilzsammelgebiet. Anhand der 137Cs-Aktivität von Bodenproben konnte das Gebiet in zwei Regionen (Cluster) eingeteilt werden: eine Region mit hohem und eine mit niedrigem Aktivitätseintrag. Im Vergleich wiesen Maronenröhrlinge (Imleria badia) durchschnittlich eine um den Faktor fünf höhere 137Cs-Aktivität als Steinpilze (Boletus edulis) auf. Der Faktor Höhenlage zeigte im Gegensatz zur Exposition einen Einfluss auf die Kontamination der Pilzfruchtkörper. In Bezug auf die Höhenlage war der Einfluss nur im Falle eines hohen Aktivitätseintrags signifikant, wobei die Pilzproben aus der niedrigsten Höhenlage am höchsten belastet waren.
Zur Ermittlung der vertikalen Verteilung des 137Cs im Boden wurden in den Waldgebieten Eichenzell und Nationalpark Bayerischer Wald Proben bis zu einer Tiefe von 24 cm entnommen und anschließend in 2 cm Schichten analysiert. Alle Verteilungen konnten mit einem Gauß-Fit oder einem multiplen Gauß-Fit mit 2 bis 3 Maxima abgebildet werden. Das erste Maximum lag in allen Fällen in den organischen Horizonten oder im Übergangsbereich zum Ah-Horizont. Folglich befindet sich der Großteil des 137Cs fast 35 Jahre nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl immer noch im Bereich des Pilzmyzels und kann somit von den Pilzen aufgenommen und in den Fruchtkörpern angereichert werden.
Der Vergleich der 137Cs-Aktivität der Pilz- und Bodenproben aus dem Nationalpark Bayerischer Wald ergab sowohl für Maronenröhrlinge (Imleria badia) als auch für Steinpilze (Boletus edulis) eine positive Korrelation. Nach Unterteilung der Proben anhand der Höhenlage zeigte sich eine noch stärkere Korrelation. Dies zeigt, dass neben der Bodenkontamination auch die Höhenlage einen Einfluss auf die 137Cs-Aktivität der Fruchtkörper hat.
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Hypoxie entsteht, wenn das Sauerstoffangebot bzw. die Sauerstoffversorgung unter ein Niveau sinkt, das benötigt wird, um physiologische O2-Drücke des betreffenden Gewebes aufrecht zu erhalten. Sinkt der Sauerstoff-Partialdruck, so werden adaptive Mechanismen aktiviert. Neben der Anpassung durch das kardiovaskuläre System werden auch verschiedene Gene aktiviert. Die Forschung der letzten Jahre hat gezeigt, dass Hypoxieinduzierte Genexpression insbesondere von zwei Transkriptionsfaktoren, HIF (hypoxia inducible factor) -1 und -2 , gesteuert wird. Man kennt über 70 Gene, die von HIF transaktiviert werden. Dabei handelt es sich um Modulatoren von Angiogenese und Vasodilatation, Erythropoese sowie der Umstellung des Stoffwechsels von oxidativer Phosphorylierung auf Glykolyse. Die Hypoxie-induzierbare Genexpression wird sowohl über eine Steigerung der Transaktivierungsaktivität als auch der Proteinmenge der HIF- -Untereinheiten reguliert. Die Regulation der HIF-Proteinmenge erfolgt über eine vom O2-Partialdruck abhängige Stabilisierung der -Untereinheit des Proteins. Unter normoxischen Bedingungen wird das Protein durch die Prolylhydroxylasen (PHD) O2-abhängig hydroxyliert, pVHL-vermittelt (VHL = von Hippel-Lindau), ubiquitiniert und proteosomal abgebaut. Unter hypoxischen Bedingungen dagegen wird das Protein stabilisiert, akkumuliert im Zellkern und bindet an eine spezifische Zielsequenz, das Hypoxia-responsive element oder HRE, imPromotor von Hypoxie-aktivierten Genen. Die PHDs gehören zu einer Familie von Eisen- und 2-Oxoglutarat-abhängigen Dioxygenasen. Neben diesen Faktoren wird eine Regulation von HIF durch Sauerstoffradikale (ROS, reactive oxygen species) in der Literatur sehr kontrovers diskutiert, da die Wirkung von ROS auf HIF sich unter Normoxie, Hypoxie oder dem Einfluss von Wachstumsfaktoren unterscheidet. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Frage, welche Rolle die PHDs bei der ROS-vermittelten HIF-Regulation spielen, beantwortet werden. Der zugrunde liegende Mechanismus wurde anhand von Glioblastom-Zelllinien untersucht. Die vorliegende Arbeit zeigt eine Stabilisierung von HIF nach Verringerung der ROS-Konzentration unter Normoxie. Eine Erhöhung der ROS-Konzentration führt dagegen zu einer dosisabhängigen Verminderung von HIF und der HIF-Targetgen-Expression. Es konnte eine direkte Abhängigkeit der Destabilisierung von VHL und den Prolylhydroxylasen gezeigt werden, da sowohl eine VHL-Defizienz als auch eine Mutation der Prolylreste oder eine Inhibition der PHDs zu einer Aufhebung des Effekts führen. Eine vergleichbare destabilisierende Wirkung auf HIF übt Ascorbat aus. Überraschenderweise führt sowohl die Zugabe von H2O2 mit seiner oxidativen Wirkung als auch die Zugabe des Reduktionsmittels Ascorbat zu einer Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes. Dieser Befund kann durch eine Aktivierung von Enzymen mit eisenreduzierenden Eigenschaften erklärt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Proteinfamilie der Ferrireduktasen (FR) identifiziert und fünf Enzyme, die eine Homologie zur cytb561-Domäne aufweisen, kloniert. Eine detaillierte Charakterisierung zeigte, dass die Enzyme tatsächlich eine eisenreduzierende Aktivität aufweisen, die durch die exogene Zugabe von ROS noch erhöht wird. Eine Überexpression der FR führt zu einem erhöhten Abbau von HIF. Ein knock down mittels siRNA führt dagegen zu einer Akkumulation von HIF und die destabilisierende Wirkung von ROS ist nach einemknock down der FR deutlich reduziert. Aufgrund der in dieser Doktorarbeit gezeigten Daten kann folgendes Modell aufgestellt werden: Die primäre oxidative Wirkung von ROS führt vermutlich zu einer Aktivierung der Ferrireduktasen, die in Abhängigkeit von Ascorbat dann vermehrt Eisen reduzieren, so dass dies den PHDs als Substrat zur Verfügung steht. Der regulierende Einfluss auf HIF wird somit vermutlich über eine erhöhte Aktivität der Prolylhydroxylasen durch eine Erhöhung des intrazellulären Fe2+-Gehaltes vermittelt. Die erhobenen Daten deuten an, dass die Familie der Ferrireduktasen ein zentrales Bindeglied im O2-Sensing darstellt, das in Abhängigkeit von Redox-Signalen homeostatische Antworten auf Hypoxie moduliert.
Die soziale Arbeitsteilung bei Honigbienen ist ein komplexes selbstorganisatorisches System, welches auf zwei Ebenen der biologischen Organisation zu verorten ist: dem Individuum und der Kolonie. Die Regulation der Bruttemperatur ist ebenfalls diesen Gesetzmäßigkeiten unterworfen. Die Arbeits-bereitschaft einzelner Bienen bildet die Grundlage für die Temperaturregulierung des kolonialen Brutnestes.
In dieser Arbeit wird dieses Zusammenspiel aus individuellen Beteiligungen der Arbeiterinnen sowie der erbrachten Gesamtleistung der Kolonie während des Brutwärmens untersucht. Dazu wird eine kleine Bienengruppe auf einer Brutwabe einer thermischen Belastung ausgesetzt. Ein speziell für diese Untersuchungen entwickelter Versuchsaufbau integriert erstmals die Infrarot-Thermografie mit den Temperaturmessungen einer Brutfläche. Somit ist es möglich, die Thoraxtemperaturen der einzelnen, am Brutwärmen beteiligten Arbeiterinnen störungsfrei zu messen und gleichzeitig das erzeugte räumliche und zeitliche Temperaturmuster der Brutwabe zu ermitteln. Zusätzlich wird der Temperaturverlauf der Außentemperatur sowie der zellumgebenden Luft untersucht.
Es kann gezeigt werden, dass die Lufttemperatur im Innenraum eines Bienenstocks ein wichtiger Faktor in der Temperaturregulierung des Brutnestes ist, da sie die untere Temperaturgrenze im Bienenstock bildet. Weiterhin wird der Einfluss der brutwärmenden Arbeiterinnen auf die Temperaturentwicklung einer Brutfläche sichtbar. Durch das flexible Verhalten der Arbeiterinnen kann einer Brutfläche bei thermischer Belastung durch lokal wechselndes Brutwärmen optimal Wärme zugeführt werden. Es gibt es Hinweise auf eine zyklische Periodizität im zeitlichen Temperaturverlauf der Brutzellen, welche auf einen Brutwärmrhythmus durch die Bienen schließen lässt. Durch den Einsatz zweier Unterarten (Apis mellifera carnica & Apis mellifera mellifera) wird sichtbar, dass es zwischen den Gruppen Unterschiede in der Aufrechterhaltung der Lufttemperatur über der Wabe gibt.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollte der Sphingolipid-Biosyntheseweg der Hefe Pichia ciferrii näher charakterisiert werden, um die Entwicklung einer fermentativen Route zur Sphingosin-Produktion zu ermöglichen. Darüber hinaus galt es patentierbare Selektionssysteme für diese Hefe zu etablieren. Durch Sequenzvergleiche mit nahe verwandten Hefen und das Ableiten degenerierter Primer wurden elf für die Sphingolipid-Biosynthese von Pichia ciferrii relevante Gene isoliert und sequenziert: LCB1 (codiert für eine UE der Serin-Palmitoyltransferase), TSC10 (3-Ketosphinganin-Reduktase), LAG1 und LAF1 (Ceramid-Synthasen), LIP1 (UE der Ceramid-Synthasen), DES1 (Dihydroceramid-delta4-Desaturase), YXC1 (Ceramidase), 8DES (Sphingolipid-delta8-Desaturase), 9MTR (Sphingolipid-C9-Methyltransferase), GCS1 (Ceramid-Glycosyltransferase) und LCB4 (LCB-Kinase). Bioinformatische Analysen, sowie in vivo-Experimente dienten der Einordnung der korrespondierenden Genprodukte in den Stoffwechselweg. Die Bestimmung der Substratspezifität einzelner Enzyme aus der Sphingolipid-Biosynthese erfolgte durch Überexpression der korrespondierenden Gene und anschließende Analyse des Einflusses auf die Zusammensetzung der Sphingolipidfraktion von Pichia ciferrii. Zusammengenommen wurde durch die Ergebnisse ein deutlich geschärftes Bild der Biosynthese von Sphingolipiden in Pichia ciferrii erstellt. Die gewonnenen Erkenntnisse über die Sphingolipid-Biosynthese in Pichia ciferrii fanden Anwendung auf die rationale Stammentwicklung eines Sphingosin-Produzenten. Durch die kombinierte Überexpression der die Dihydroceramid-delta4-Desaturase aus Pichia ciferrii, die Ceramid-Synthase aus Coccolithovirus und eine alkalische Ceramidase aus Mus musculus kodierenden Gene wurde eine 8,5-fache Erhöhung der Sphingosin-Konzentration von 7,5 mg/L in vom Wildtyp abgeleiteten Syringomycin-E-resistenten Stämmen auf 64,0 mg/L erzielt. Die Codon-Optimierung der heterolog exprimierten Gene zur Anpassung an die sehr eingeschränkte Codon-Verwendung von Pichia ciferrii erwies sich hierbei als essentiell. Zur Nutzbarmachung von rekombinanten Pichia ciferrii-Stämmen für die industrielle Anwendung wurden darüber hinaus drei neue Selektionssysteme etabliert. Zum einen wurde eine codon-optimierte Form des nat1-Gens genutzt, um eine Nourseothricin-Resistenz zu vermitteln. Zum anderen wurden stabile Uracil- bzw. Lysin-auxotrophe Pichia ciferrii-Stämme erzeugt, die mittels eines entsprechenden Integrationsvektors mit den Auxotrophie-Markergenen URA3 bzw. LYS2 aus Pichia ciferrii zu prototrophen Stämmen komplementiert werden konnten. Zusammengenommen mit der ersten gezielten Disruption eines Gens in Pichia ciferrii (SYR2, codiert für die Sphinganin-Hydroxylase) konnte somit auch die molekularbiologische Handhabbarkeit von Pichia ciferrii deutlich verbessert werden.
Die vorliegende Arbeit untersucht die Systematik und phylogenetischen Beziehungen der Familie der Bromeliaceae auf der Basis chloroplastidärer DNA-Sequenzdaten des trnT-trnL-Intergenischen Spacers (33 untersuchte Arten aus 28 Gattungen), des trnL-Introns (129 untersuchte Arten aus 48 Gattungen) und des trnL-trnF-Intergenischen Spacers (120 Arten aus 48 Gattungen). Untersucht wurden Vertreter aller Untergattungen der artenreichsten Gattungen Aechmea (Bromelioideae) und Tillandsia (Tillandsioideae). Mit den editierten Alignments der drei Sequenzdatensätze wurden Analysen zu den Verwandtschaftsverhältnissen durchgeführt. Alle drei untersuchten Marker lieferten phylogenetisch informative Signale. Die Pitcairnioideae erwiesen sich als polyphyletisch. Ayensua und Brocchinia sind nah verwandt und nehmen innerhalb der Familie eine basale Position ein. Hechtia und Navia stellen jeweils eigene Gruppen dar, aber ohne ausreichende Auflösung ihrer Beziehungen zu den übrigen Bromeliaceae. Fosterella und Puya sind gut gestützte Gruppen mit möglicher Schwestergruppenbeziehung zu den Bromelioideae. Die Gattungen Pitcairnia/Pepinia und Deuterocohnia/Dyckia bilden als Pitcairnioideae s.str. einen gut gestützten Ast. Die Tillandsioideae sind monophyletisch, nur die einzige untersuchte Akzession der Gattung Mezobromelia liegt außerhalb dieses statistisch gut gestützten Astes. Innerhalb der Tillandsioideae nehmen Catopsis, Glomeropitcairnia erectiflora und Alcantarea regina/Vriesea racinae basale Positionen ein. Die Gattungen Guzmania, Racinaea, Tillandsia und Vriesea sind keine natürlichen Gruppen. Für die Bromelioideae liegt die Sequenzdivergenz bei 0,1 bis max. 2%. Die beste Auflösung erreichte hier die kombinierte Analyse des trnL-Introns und des trnL-trnF Intergenischen Spacers bei Polarisierung der Daten mit den Tillandsioideae als Außengruppe. Bromelia, Deinacanthon, Greigia, Fascicularia-Ochagavia-Fernseea und eine wenig aufgelöste Kerngruppe der übrigen Bromelioideae bilden eine basale Polytomie. Mit höheren Wiederfindungswahrscheinlichkeiten gestützt sind Ananas, Greigia und von der Gruppe Fascicularia-Ochagavia-Fernseea die Gattung Fascicularia und die kontinentale Ochagavia litoralis. Die Gattungen Fascicularia-Ochagavia-Greigia (Bromelioideae) und Abromeitiella- Deuterocohnia (Pitcairnioideae) wurden mit Fragmentanalysen (AFLPs, RAPDs) untersucht. Analysen der RAPD- und AFLP-Daten mit UPGMA (Unweigthed pair group method using arithmetic averages) und NJ (Neighbor-Joining) stützen die Fassung der Gattung Fascicularia als eine Art (Fascicularia bicolor) mit zwei Unterarten (F. bicolor ssp. bicolor und F. bicolor ssp. canaliculata). F. bicolor ssp. canaliculata weist 28 Fragmente auf, die in keiner untersuchten Akzession von F. bicolor ssp. bicolor vorkommen. Die 5 untersuchten Akzessionen von F. bicolor ssp. bicolor sind durch 13 Fragmente charakterisiert, die in den 4 untersuchten Akzessionen von F. bicolor ssp. canaliculata fehlen. Die AFLP-Analysen der Gattungen Abromeitiella- Deuterocohnia stützen die Vereinigung der Gattungen Abromeitiella und Deuterocohnia in der älteren Deuterocohnia. Alle untersuchten Akzessionen der Artengruppe Abromeitiella-Deuterocohnia besitzen 11 gemeinsame charakteristische Banden, die Arten der Gattung Abromeitiella und Deuterocohnia für sich alleine genommen jedoch keine. Die größten genetischen Unterschiede bestehen zwischen der in Chile isoliert vorkommenden Deuterocohnia chrysantha und allen übrigen Arten der Gruppe. Der Informationsgehalt der analysierten chloroplastidären Sequenzen erwies sich für eine Auflösung der phylogenetischen Beziehungen von offenbar schnell evolvierenden Gattungsgruppen der Bromelioideae und Tillandsioideae als unzureichend. Fragmentanalysen, besonders AFLPs, zeigten auf der taxonomischen Ebene nah verwandter Gattungen eine gute Auflösung.
Bei Cryptochromen handelt es sich um Blaulichtrezeptoren der Cryptochrom-Photolyase-Proteinfamilie (CPF). Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen Domänen des Lebens zu finden und haben eine essentielle Rolle in der Reparatur der DNA sowie der lichtgesteuerten Regulation der Expression. Cryptochrome sind in der Regel keine DNA-reparierenden Proteine. Sie sind regulativ an der Steuerung der inneren Uhr und des Zellzyklus der Organismen beteiligt. In der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum konnten bisher sechs phylogenetisch unterschiedliche Mitglieder der CPF identifiziert werden. Bei CryP handelt es sich um das einzige pflanzenähnliche Cryptochrom der photoautotrophen Diatomee. Für das Protein CryP konnte bereits ein blaulichtinduzierter Photozyklus durch die Absorption der Chromophore 5-Methenlytetrahydrofolat (MTHF) und Flavinadenindinukleotid (FAD) gezeigt werden. Außerdem ist eine regulative Wirkung des Proteins auf die Lichtsammelkomplexe (Lhc) der Diatomee bekannt. Für eine weitere Charakterisierung des CryPs wurde in dieser Arbeit zunächst das Absorptionsverhalten unter verschiedenen Wellenlängen beobachtet, um so einen Einblick in eine mögliche Aktivierung und Deaktivierung des Proteins durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen zu erlangen. Es zeigte sich hierbei eine mit pflanzlichen Cryptochromen vergleichbare Anreicherung verschiedener Redoxzustände des FADs in Abhängigkeit von der Wellenlänge.
Für eine Aufklärung der Wirkungsweise des CryP-Proteins wurden verschiedene Hypothesen untersucht: Die phylogenetische Nähe und ein ähnliches Absorptionsverhalten des CryPs zu Cryptochromen mit Reparaturfähigkeit für einzelsträngige DNA (Cry-DASH) führte zu einer Untersuchung des Proteins als möglicher Transkriptionsfaktor. Hierfür konnte eine Kernlokalisation des Proteins nachgewiesen werden, was Rückschlüsse auf eine potentielle Regulation der Expression mittels DNA-Bindung zulässt. Außerdem wurde gezeigt, dass CryP DNA-Bindefähigkeit besitzt. Die bisher nachgewiesenen Bindungen waren jedoch unspezifischer Art. Dies konnte auch für die Promotersequenz eines der durch CryP regulierten Gene lhcf1 festgestellt werden. Auf Grund der unspezifischen DNA-Bindung wurde eine zweite Hypothese für CryP untersucht: CryP wirkt regulativ auf die Expression verschiedener Gene durch Protein-Protein-Interaktionen und ist Teil einer Reaktionskaskade zur Signalweiterleitung in P. tricornutum.
Durch die Untersuchung der zweiten Hypothese konnten drei Interaktionspartner für CryP identifiziert und eine Interaktion verifiziert werden. Hierbei handelt es sich um das Protein AAA mit einer bisher unbekannten Funktion und das Protein BolA, welches Teil der zuerst in Escherichia coli identifizierten BolA-like-Proteinfamilie ist. Außerdem konnte eine Interaktion mit dem Cold-Shock-Domänen-Protein CSDP gezeigt werden. Bei den Proteinen BolA und CSDP handelt es sich um potentiell regulierende Faktoren der Transkription und Translation, was Teil einer Reaktionskaskade sein kann. Die aus anderen Organismen bekannten Funktionen des BolA-Proteins überschneiden sich mit den in CryP-Knockdown-Mutanten beobachteten Effekten. Sie zeigen eine erhöhte Sensitivität für Stresssituationen wie abweichende Nährstoffkonzentration, Osmolaritäten und Temperaturen. Diese Beobachtungen stellen einen Zusammenhang der durch einen CryP-Knockdown beobachteten Effekte und der CryP-BolA-Interaktion her. Durch Homologien zu Cold-Shock-Proteinen aus Chlamydomonas reinhardtii gibt die CryP-Interaktion mit dem Protein CSDP Hinweise auf einen potentiellen Mechanismus zur Regulation der Lhc-Proteine, für welche zuvor ein CryP-abhängiger Effekt beschrieben war.
Über die Protein-Protein-Interaktionen hinaus wurde die Phosphorylierung des CryPs als Möglichkeit der Signalweiterleitung untersucht. Es konnte eine reversible Phosphorylierung des heterolog aus E. coli isolierten CryPs gezeigt werden. Diese zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten Phosphorylierungen pflanzlicher Cryptochrome und gibt Hinweise auf einen Mechanismus der Signalweiterleitung.
Durch die Untersuchung der CryP-regulierten Transkription mit P. tricornutum CryP-Knockdown-Mutanten durch Next-Generation-Sequencing (NGS) konnte die Hypothese der regulativen Proteinkaskade und der Signalweiterleitung weiter bestätigt werden. Die Auswirkungen des CryPs auf die Transkription erwiesen sich als nicht auf einen Teilbereich des Metabolismus begrenzt, sondern sind in einem großen Teil der funktionellen Gengruppen in P. tricornutum zu sehen. Außerdem konnten drei Klassen CryP-regulierter Gene festgestellt werden. Kategorie 1: die ausschließlich unter Blaulicht regulierten Gene; Kategorie 2: die sowohl unter Blaulicht als auch im Dunkeln regulierten Gene und Kategorie 3: die ausschließlich im Dunkeln regulierten Gene. Ein im Dunkeln und unter Blaulicht jeweils unterschiedlicher regulativer Effekt deutet auf eine Doppelfunktion des CryPs hin. Möglicherweise hat das Cryptochrom unterschiedliche lichtabhängige und lichtunabhängige Funktionen.
Durch die Analyse der CryP-regulierten Genexpression konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen CryP und weiteren Photorezeptoren gezeigt werden. Der CryP-Proteingehalt in der Zelle hat einen regulativen Einfluss auf das CPF1-Protein, eine Photolyase mit dualer Funktion aus der gleichen Proteinfamilie. Zusätzlich konnte auch ein Einfluss auf die Lichtsensitivität der Genexpression des Rotlichtrezeptors Phytochrom (DPH) durch CryP gezeigt werden. Vergleichbar mit höheren Pflanzen scheint ein regulatives Netzwerk der Photorezeptoren auch in der Diatomee P. tricornutum vorhanden zu sein.
In der vorliegenden Untersuchung wurden Populationen der Gattung Corbicula im Rhein mit Individuen aus der Mosel, der Weser sowie aus Frankreich, Spanien, Nordamerika und dem Nahen und Fernen Osten sowohl mit genetischen als auch morphologischen Methoden untersucht. Aus diesen Daten sollte ermittelt werden, wie viele Taxa bei der rezenten Besiedelung Europas auftraten und welche Migrationsrouten hierbei nachgewiesen werden konnten. Es konnte gezeigt werden, dass im Rhein zwei hybridisierende genetische Linien auftraten, wobei keine Rückkreuzung mit den Eltern nachgewiesen werden konnte. Die Hybride waren morphologisch nicht zu unterscheiden. Hinweise auf einen unterschiedlichen Chromosomensatz dieser Linien bzw. eine Polyploidie konnte nicht gefunden werden. In der Rhone wurde eine weitere Linie entdeckt. Eine der genetischen Linien im Rhein konnte im Vergleich zu Individuen aus Fernost als C. fluminea identifiziert werden. Die Herkunft der beiden Linien aus Rhein und Rhone blieb unklar, da sie nicht Individuen aus Israel oder Nordamerika zugeordnet werden konnten. Eine Polytomie der MP- und ML-Analysen war nicht auf einen zu geringen Datensatz zurückzuführen, vielmehr konnte gezeigt werden, dass Corbicula im Pleistozän eine Radiation durchief. Schalenmorphologisch konnten die genetischen Linien aus dem Rhein nicht durchgehend den zwei auftretenden Morphen zugeordnet werden. Gleichzeitig schienen diese Individuen die Extreme einer weltweiten Variabilität der Schalenform darzustellen. Ein morphologischer Vergleich von Schalen aus der Sammlung Senckenberg zeigte keine Unterschiede zwischen Individuen, die als C. fluminalis und C. fluminea bezeichnet waren. Vielmehr scheint die Schalenform nicht genügend conchologischen Merkmale zu besitzen, um die genetischen Linien zu unterscheiden. Die Besiedelung Europas durch die Körbchenmuschel erfolgte mehrfach unabhängig in verschiedenen Flusssystemen Südwest- und Mitteleuropas Anfang der 1980er Jahre. Auf- grund der hier nachgewiesenen Isolationswirkung von Stauwehren der Bundeswasserstrassen auf Makroinvertebraten und der Ergebnisse der DAF-Fingerprints von Corbicula- Populationen wurde die Mosel vermutlich von Frankreich aus besiedelt.
Anthropogenic activities have a major impact on our planet and rapidly drive biodiversity loss in ecosystems at a global scale. Particularly over the last century, rising CO2 emissions significantly raised global temperatures and increased the intensity and frequency of droughts and heatwaves. Additionally, agricultural land use and fossil fuel combustion contribute to the continuous release of nitrogen (N) and phosphorus (P) into ecosystems worldwide through extensive fertilization and deposition from the atmosphere. It is important to understand how these rapid changes affect the evolution of plant populations and their adaptive potential. Adaptation by natural selection (i.e., adaptive evolution) within a few generations is an essential process as a response to rapid environmental changes. Rapid evolution of plant populations can be detected by using the so-called resurrection approach. Here, diaspores (i.e., seeds) from a population are collected before (ancestors) and after (descendants) a potential selection pressure (e.g., consecutive years of drought or changes in nutrient supply). Comparing phenotypes of ancestors and descendants in a common environment such as an outside garden, greenhouse, or climate chamber, may then reveal evolutionary changes. Ideally, plants are first grown in a common environment for an intermediate refresher generation to reduce parental and storage effects.
The aim of this thesis was to investigate the occurrence of adaptive evolution in natural plant populations in response to rapidly changing environments over the past three decades. I conducted three experiments using the resurrection approach to generate comprehensive data on the adaptive processes that acted on three plant populations from three different species over the last three decades. Furthermore, I filled knowledge gaps in plant evolutionary ecology and conceptually developed the resurrection approach further.
In Chapter I, I performed a novel approach by testing for adaptive evolution in natural plant populations using the resurrection approach in combination with in-situ transplantations. I cultivated seedlings from ancestors (23 – 26 years old) and contemporary descendants of three perennial species (Melica ciliata, Leontodon hispidus and Clinopodium vulgare) from calcareous grasslands in the greenhouse and In Chapter III, I assessed the reproducibility of phenotypic differences between genotypes among three different growth facilities (climate chamber, greenhouse, and outdoor garden). I also evaluated differences in phenotypic expression between plants grown after one vs. two intermediate generations (i.e., refresher generations). I performed this experiment within the framework of the resurrection approach and compared ancestors and descendants of the same population of Leontodon hispidus.
I observed very strong differences among plants growing in the different growth facilities. I found a significant interaction between the growth facility and the temporal origin (ancestors vs. descendants): descendants had significantly larger rosettes than ancestors only in the greenhouse and they flowered significantly later than ancestors exclusively in the climate chamber. I did not find significant differences between intermediate generations within the growth facilities. Overall, Chapter III shows that the use of a particular experimental system can dictate the presence and magnitude of phenotypic differences. This implies that absence of evidence is not evidence of absence when it comes to investigating genetically based trait differentiation among plant origins (in space or time). Experimental systems should be carefully designed to provide meaningful conditions, ideally mimicking the environmental conditions of the population’s origins. Finally, growing a second intermediate generation did not impact the genetic differences of ancestors and descendants within the environments, supporting the idea that only one intermediate generation may be sufficient to reduce detectable parental and storage effects.
The resurrection approach allows a better understanding of rapid plant adaptation, but some limitations deserve to be highlighted. I only studied one population per species, and Chapters II and III only focus on one population of L. hispidus, which is also hampering generalizations, as adaptive potential can vary greatly among populations of the same species. I only compared the ancestral genotypes to one descendant sample with a long time span in between (26 – 28 years), which makes it hard to pinpoint the selection agents that caused the genetic differentiation among the sampling years. Hence, closely monitoring biotic and abiotic factors of the studied populations between the ancestral and descendant sampling in future studies, would make identifying the responsible selection pressures more precise. I also recommend sampling multiple populations over consecutive years to improve the robustness of results and make generalizations more approachable.Furthermore, combining the resurrection approach with other methods such as in-situ transplantations will be valuable to offset the limitation that adaptations cannot be proven under artificial conditions (e.g., in the greenhouse).
Using walls to navigate the room: egocentric representations of borders for spatial navigation
(2021)
Spatial navigation forms one of the core components of an animal’s behavioural repertoire. Good navigational skills boost survival by allowing one to avoid predators, to search successfully for food in an unpredictable world, and to be able to find a mating partner. As a consequence, the brain has dedicated many of its resources to the processing of spatial information. Decades of seminal work has revealed how the brain is able to form detailed representations of one’s current position, and use an internal cognitive map of the environment to traverse the local space. However, what is much less understood is how neural computations of position depend on distance information of salient external locations such as landmarks, and how these distal places are encoded in the brain.
The work in this thesis explores the role of one brain region in particular, the retrosplenial cortex (RSC), as a key area to implement distance computations in relation to distal landmarks. Previous research has shown that damage to the RSC results in losses of spatial memory and navigation ability, but its exact role in spatial cognition remains unclear. Initial electrophysiological recordings of single cells in the RSC during free exploration behaviour of the animal resulted in the discovery of a new population of neurons that robustly encode distance information towards nearby walls throughout the environment. Activity of these border cells was characterized by high firing rates near all boundaries of the arena that were available to the animal, and sensory manipulation experiments revealed that this activity persisted in the absence of direct visual or somatosensory detection of the wall.
It quickly became apparent that border cell activity was not only modulated by the distance to walls, but was contingent on the direction the animal was facing relative to the boundary. Approximately 40% of neurons displayed significant selectivity to the direction of walls, mostly in the hemifield contra-lateral to the recorded hemisphere, such that a neuron in left RSC is active whenever a wall occupies proximal space on the right side of the animal. Using a cue-rotation paradigm, experiments initially showed that this egocentric direction information was invariant to the physical rotation of the arena. Yet this rotation elicited a corresponding shift in the preferred direction of local head-direction cells, as well as a rotation in the firing fields of spatially-tuned cells in RSC. As a consequence, position and direction encoding in RSC must be bound together, rotating in unison during the environmental manipulations, as information about allocentric boundary locations is integrated with head-direction signals to form egocentric border representations.
It is known that the RSC forms many anatomical connections with other parts of the brain that encode spatial information, like the hippocampus and para-hippocampal areas. The next step was to establish the circuit mechanisms in place for RSC neurons to generate their activity in respect to the distance and direction of walls. A series of inactivation experiments revealed how RSC activity is inter-dependent with one of its communication partners, the medial entorhinal cortex (MEC). Together they form a wider functional network that encodes precise spatial information of borders, with information flowing from the MEC to RSC but not vice versa. While the conjunction between distance and heading direction relative to the outer walls was the main driver of neural activity in RSC, border cells displayed further behavioural correlates related to movement trajectories. Spiking activity in either hemisphere tended to precede turning behaviour on a short time-scale in a way that border cells in the right RSC anticipated right-way turns ~300 ms into the future.
The interpretation of these results is that the RSC’s primary role in spatial cognition is not necessarily on the early sensory processing stage as suggested by previous studies. Instead, it is involved in computations related to the generation of motion plans, using spatial information that is processed in other brain areas to plan and execute future actions. One potential function of the RSC’s role in this process could be to act correctly in relation to the nearby perimeter, such that border cells in one hemisphere are involved in the encoding of walls in the contralateral hemifield, after which the animal makes an ipsilateral turn to avoid collision. Together this supports the idea that the MEC→RSC pathway links the encoding of space and position in the hippocampal system with the brain’s motor action systems, allowing animals to use walls as prominent landmarks to navigate the room.
Savannas provide essential ecosystem services for human well-being in West Africa. Thus, ecosystem change not only directly affects biodiversity but also human livelihoods. Human land use considerably shaped these savanna ecosystems for millennia, particularly agriculture, livestock grazing, logging and the collection of non-timber forest products (NTFPs). NTFPs are wild plant products and comprise all organic matter from herbaceous plants, shrubs, and trees (excluding timber). Current increasing land use pressure through fast demographic changes is widely esteemed as a severe threat for savanna biodiversity and the socio-economy of rural communities. In consideration of the pivotal role of NTFP species for biodiversity and livelihoods, it is important to evaluate the effect of increasing land use change on savanna vegetation and on its provisioning service for human well-being. Thus, the major aim of this thesis is to investigate the impacts of land use intensification on vegetation composition, diversity and function and its consequences for provisioning ecosystem services (NTFPs) and human well-being in a West African savanna.
The research for this study was conducted in the North Sudanian vegetation zone of south-eastern Burkina Faso, where population growth exceeds the nationwide trend. Generally, Burkina Faso belongs to the worldwide poorest countries, where nearly one quarter of the population suffers from malnutrition (FAO 2014). The integration of NTFPs and particularly wild food species into rural household economies is, thus, an important measure in the national combat against poverty and food insecurity (FAO 2014). Against this background, I focus on vegetation changes, the economic importance of NTFPs as well as the decrease and substitution of wild food species in this study.
Vegetation resurveys of different vegetation types since the early 1990s showed that land use change led to more pronounced changes in the herbaceous than in the woody vegetation layer. Most woody vegetation types stayed stable in species composition and richness, even though some highly useful tree species (Vitellaria paradoxa, Parkia biglobosa) declined in some woody vegetation types. In contrast, in most herbaceous vegetation types species richness increased and species composition considerably changed. This change might be explained by a general ruderalisation process through a pronounced increase of wide-ranging herbaceous species. However, in spite of a general species increase in the herbaceous layer, a decrease of preferred herbaceous fodder species was found. Thus, the decline of useful species in both layers is alarming. Herbaceous vegetation types also showed more pronounced changes in plant functional trait characteristics in comparison to woody vegetation types. However, an increase of smaller plant species and species with a high diaspore terminal velocity (VTerm) was found in both vegetation layers. Since these two trait responses are generally related to grazing and browsing, the strong increase of livestock herds is likely to be responsible for the detected vegetation changes.
In addition to the vegetation study, interviews showed that all useful food species were widely considered to decline. The two economically most important tree species, the shea tree (Vitellaria paradoxa) and the locust bean tree (Parkia biglobosa) that contribute with 70% to wild food income, were considered among the most declining species of all cited wild food species. On this matter, local perceptions of species decline and results from field observations are in accordance. However, a wide range of cited substitutes indicated a great knowledge on alternative plant species in the area. Most wild food species are, however, substituted by other highly valued wild food species. Although our results suggest that rural communities are able to cope with the decrease or absence of wild food species, growing decline of one species would concurrently increase the pressure on other native food species. Therefore, the need to counteract the decrease of highly useful wild food species should be of high priority in management measures. In general, I showed that NTFPs are an essential component in rural households, since it contributed with 45 % to total household income. Significant differences in NTFP dependency between the two investigated villages and across the three main ethnic groups were detected, reflecting different traditional uses and harvesting practices. In general, it was shown that poorer households depend more on NTFP income than wealthier households. Against the background of this study, management strategies for agroforestry systems and poverty alleviation should consider local differences, and ethnicity-dependent NTFP-use patterns.
Overall, the combination of field studies on temporal and functional vegetation change with socio-economic and ethno-botanic interviews increases the knowledge on qualitative and quantitative vegetation changes and on the consequences for rural populations. This thesis gives a thorough insight into decreasing trends of economically valued plant species and thus gives evidence on the consequences of vegetation changes for ecosystem services of West African savanna ecosystems. Further, different NTFP-dependencies and use preferences according to socio-economic and cultural variables, such as ethnicity, present a valuable basis for specific decision-making and should be considered in management plans.
Snake bite envenoming often results in disability or death of breadwinners of poor families in the rural tropics and the subtropics of Nepal. Identification of the medically relevant snake species, circumstances of venomous snake bites, prehospital care of their bites and human responses to snakes and snake bite is, therefore, crucial to enable victims or first aider to select the appropriate first aid measures, physicians to anticipate complications and to use appropriate treatment protocols as well as the local community to implement prevention strategies. Inadequate educational gaps exist in Nepal and hinder identification of snakes involved in bites. To fill this gap, I aim to provide an evidence-based list of medically relevant snake species. Snake specimens brought by patients bitten or their attendants from the tropical and subtropical regions in southeastern, southcentral, and southwestern Nepal to snake bite treatment centres over a period from 2010 through 2014, were taxonomically identified and medical records of envenoming were evaluated.
In Nepal, the epidemiology of snake bite is poorly known. Here I describe the ecological circumstances of proven krait (Bungarus spp.) and Russell´s Viper (Daboia russelii) bites to elucidate and examine, whether environmental circumstances or human behaviour contributed to envenoming. In a cross-sectional study, data about prehospital care, environmental circumstances of 46 krait and 10 Russell´s Viper bites were evaluated. Patients were interviewed using structured interview forms. Snake bite prone communities were surveyed to test people´s knowledge on snakes and their attitude towards venomous snakes in general.
Of 349 snakes involved in bites, 199 (57%) specimens were found to be medically relevant venomous snakes that included 11 species belonging to six genera and two families. Among them, Naja naja (n = 76, 22%), Bungarus caeruleus (n = 65, 19%) and Trimeresusurs albolabris (n = 10, 3%) were the most widely distributed snakes. Daboia russelii (n = 10, 3%) was found to be restricted to the southwestern part of Nepal. For B. walli, a previously poorly known species, 13 voucher specimens represent the first country records of this species as well as the first documented cases of involvement in snake bite envenoming by this species in Nepal.
Numerous snake bites (33%) occurred at night, during the rainy season, and are mainly due to Bungarus species, particularly B. caeruleus. Bites of cobras and Russell’s Vipers are a risk at daytime. Evaluation of data regarding the place where the bite happened, indicates that the snake bite risks appear to be as high in residential areas, in and around houses, as in rural areas. In cases of kraits (n = 46), 61% of the bites occurred while the victim was sleeping indoors, those of Russell´s Vipers mainly during agricultural activities in the fields. Analysis of socio-demographic data revealed that both krait and viper bites predominantly affected farmers or their family members. However, snake bites involved also people of higher socio-economic status, which suggests that it is not a health problem of poor people only living in the rural areas of Nepal.
A small number of snake bite victims (n = 7) sought help from traditional healers, but most patients went to hospitals for medical treatment using motorbikes (65%) or were transferred by ambulance cars (22%). As a first aid measure, most patients (78%) had used a tourniquet, which is of doubtful value and has often severe sequelae, instead of applying the WHO recommended pressure immobilisation bandage or local compression pad. The overall case fatality rate was calculated to be 10%, but up to 17% in cases of Bungarus spp. bites.
Rural community people were found to be extremely afraid of snakes, a major reason for indiscriminate killing of even harmless snakes, e.g., Lycodon aulicus, which were wrongly considered to be venomous. This is mainly due to the poor knowledge on snakes in general and on their role in providing ecological services, which may eventually lead to a decline in snake populations and even the extinction of rare species.
The results of the present study strongly emphasize that snake bite is an important public health issue in Nepal. There is an urgent need to improve the knowledge of people on snakes and to try changing their attitudes towards these reptiles, in addition to documenting the biodiversity and distribution of medically relevant snakes, the epidemiology and circumstances of their bites. Avoiding high-risk behaviour (e.g., killing of snakes), using screened doors and windows are some of the suggested measures preventing snake bite. Early and accurate identification of the snakes involved should help physicians to apply timely treatment, eventually referring the patient to the appropriate hospital. This also has important implications in developing public health and conservation strategies, to the benefit of the people of Nepal.
Wie andere Vögel auch, verfügen Hühner über zwei verschiedene Magnetfeldrezeptoren. In der vorliegenden Arbeit werden diese beiden Rezeptoren, vor allem unter dem Aspekt Verhaltensontogenie eingehender untersucht. Meine Ergebnisse werden durch histologische Untersuchungen gestützt. Ich untersuchte zwei Hühnerrassen, einen braunen und einen weißen Legehuhn Stamm. Mit der Standardmethode konnte ich die Befunde der Literatur bestätigen. Zur Untersuchung des Magnetkompasses im Auge, habe ich Hühner darauf trainiert einen roten Tischtennisball, auf den sie geprägt wurden, in einer bestimmten magnetischen Richtung zu suchen. Im unbelohnten“ Test ist das Magnetfeld um 90 Grad gedreht, so dass der magnetische Norden nun im geographischen Osten liegt. Die braunen Hühner benutzen den Magnetkompass zum Lösen der gestellten Aufgabe, die weißen Hühner wählen zufällig eine Richtung. Eine Veränderung der Trainingsmethode, ein Training im gedrehten Magnetfeld und eine „Bestrafung“, haben das Ergebnis verändert. Die weißen Hühner sind nun in der Lage, die magnetisch richtige Richtung zu finden, die braunen Hühner reagieren verängstigt und wählen nur zufällig eine Richtung. Beide Hühnerrassen können also - unter verschiedenen Voraussetzungen - einen magnetischen Kompass für die Orientierung benutzen.
Bisher konnte allein für den Magnetkompass der Vögel ein Mechanismus der Magnetperzeption identifiziert werden. In Verhaltensversuchen, die Zugorientierung als Kriterium einsetzten, ob Magnetrezeption ungestört abläuft oder nicht, konnte dieser Mechanismus analysiert werden. Die Experimente zeigten, dass der Magnetrezeptionsmechanismus lichtabhängig ist. Vögel die im blau bis grünen Teil des Spektrums in Orientierungstrichtern getestet wurden bevorzugten signifikant ihre der Jahreszeit entsprechende Zugrichtung. Führte man diese Tests mit längerwelligerem Licht durch, zeigten die Tiere Desorientierung. Durch die gezielte Manipulation des umgebenden Erdmagnetfeldes durch künstliche Felder, ergab sich ein Wirkprinzip des Magnetkompasses der Vögel, welches nichts mit dem der uns bekannten technischen Kompasse gemein hat. Die Tiere richten sich nicht nach der Polarität des Feldes, sondern detektieren vielmehr den Neigungsgrad und den Verlauf der magnetischen Feldlinien. Durch den Einsatz von Hochfrequenzfeldern als diagnostisches Werkzeug, konnte gezeigt werden, dass der Inklinationskompass der Vögel auf einem Radikalprozess basiert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass der Sitz des lichtabhängigen Magnetkompasses im rechten Auge lokalisiert ist. Unter bestimmten künstlichen Lichtbedingungen wurden von Rotkehlchen allerdings Verhaltensantworten gezeigt, die von der normalen Zugorientierung abwichen. In der vorliegenden Arbeit werden gerade jene Phänomene genauer analysiert, die in der Vergangenheit zu Nicht-Kompass-Antworten geführt haben. Die Intensitätserhöhung kurzwelliger Lichter hatte zu vermehrt axialem Verhalten geführt, eine Kombination aus langwelligem, gelben Licht mit einer kurzwelligen Komponente hatte zu Fixrichtungen geführt, d.h. die Vögel zeigten nicht mehr die saisontypische Zugumkehr. Auf biogenem Eisen (Magnetit) basierende Rezeptoren der Magnetfeld-wahrnehmung werden als zweites System der Perzeptionsmöglichkeit diskutiert, wobei ihnen im Zusammenhang mit dem ‚Kartensinn’ eher eine Intensitätssensibilität zugeschrieben wird. In der vorliegenden Arbeit wurden Versuche durchgeführt, die das komplexe Zusammenspiel unterschiedlicher Perzeptionsmechanismen des Erdmagnetfeldes untersuchen. Mischlichtbedingungen wurden daraufhin untersucht, ob sie einem radikalpaar-basierenden Inklinationskompass unterliegen, oder nicht. Für türkis-gelbes Mischlicht wird gezeigt, dass die eingeschlagene Fixrichtung nicht mit Hilfe eines Inklinationskompasses aufgesucht wird. Darüber hinaus beruht die Richtungswahl des getesteten Vogels nicht auf einem Radikalpaarmechanismus, ist aber abhängig vom vorliegenden Magnetfeld. Da Magnetit bei Vögeln in der Oberschnabelregion lokalisiert werden konnte, wurden Betäubungsversuche mit einem Lokalanästhetikum durchgeführt. Die Fixrichtung bricht zusammen und die Vögel zeigen desorientiertes Verhalten. Im Gegensatz dazu bleiben Vögel unter Grün und Weisslicht, Bedingungen wo ein Inklinationskompass zum Einsatz kommt, mit Oberschnabelbetäubung unbeeindruckt und suchen die jahreszeitlich passende Richtung auf. Für kurzwellige Lichter wird eine Intensitätsabhängigkeitsstudie durchgeführt, die analysiert ab wann Zugorientierung in Nicht-Kompass-Antworten umschlägt. Die Wellenlängenabhängigkeit der Intensitätssensitivität, die beobachtet wird, lässt auf die Beteiligung des optischen Systems schliessen. Deshalb wurden Versuche durchgeführt, die über die Lateralisation des Magnetkompasses hinaus die Rechtsdominanz des Rotkehlchenauges genauer untersucht haben. Mittels einer Brille, die die gleiche Lichtintensität auf beide Augen fallen ließ, aber in klare und unscharfe Wahrnehmung der Umgebung unterschied, konnte herausgefunden werden, dass über die reine Aktivierung von Licht hinaus Formensehen eine entscheidene Rolle zu spielen scheint. Versuche in absoluter Dunkelheit zeigen, dass von Rotkehlchen trotz der Abwesenheit von Licht signifikant eine Vorzugsrichtung aufgesucht wird, die keiner saisonalen Zugumkehr unterläuft. Die Fixrichtung beruht nicht auf einem Inklinationskompass und sie bricht nach Oberschnabelbetäubung zusammen. Alle bisher analysierten Nicht-Kompass-Antworten scheinen auf einem zweiten, magnetit-basierenden Mechanismus zu beruhen. Diese Rezeptoren scheinen neben Intensitätsinformationen des Erdmagnetfeldes auch Richtungsinformationen zu generieren. Die biologische Relevanz der ihnen unterliegenden Fixrichtungen bleibt allerdings ungeklärt.
In dieser Arbeit wurde erstmals ein monokolonaler Antikörper gegen die GlyRbeta-Untereinheit (GlyRbeta) hergestellt. Zur Immunisierung der Mäuse wurde die 120 AS lange große cytoplasmatische Schleife (engl. loop) zwischen den transmembranen Domänen 3 und 4 von GlyRbeta gewählt, da diese nur geringe Sequenzhomologie zu GlyRalpha-Untereinheiten aufweist. Diese Schleifenregion wurde als GST-Fusionsprotein in Bakterien exprimiert und affinitätsgereinigt. Sowohl die Immunisierung der Mäuse als auch die Herstellung der Hybridoma-Klone wurde in Zusammenarbeit mit Synaptic Systems GmbH (Göttingen) durchgeführt. Die Spezifität der Antikörperbindung an GlyRbeta wurde zunächst in Western Blot-Experimenten mit affinitätsgereinigtem GlyR aus Rattenrückenmark demonstriert. Eine nachfolgende Untersuchung der Antikörperbindestelle führte zur Identifikation der ersten 20 AS des beta-loop (GlyRbeta336-355) als Epitop. Ein 20 AS kurzes, synthetisches Peptid, welches die Epitop-Sequenz enthielt, war ausreichend, um Färbungen von Western Blots und Gewebeschnitten durch den Antikörper effizient zu verhindern. Außerdem wurden Protokolle für die Antikörperfärbung von GlyRbeta in transfizierten Zelllinien und primären Neuronen aus Rattenrückenmark etabliert. Weiterhin ermöglichte die Herstellung dieses Antikörpers erstmals die direkte immunhistochemische Färbung von GlyRbeta-Protein im ZNS von Mäusen. GlyRbeta konnte hierbei im Hirnstamm, Rückenmark, dem Bulbus olfactorius und der Retina von Mäusen nachgewiesen werden, was zeigt, dass GlyRbeta-Protein weit weniger verbreitet ist als aufgrund von in situ Hybridisierungs-Studien vermutet. Die gefundene Verteilung von GlyRbeta-Protein unterscheidet sich demnach stark von der Verteilung der GlyRbeta-mRNA, was für eine posttranskriptionelle Regulation der GlyRbeta-Proteinmenge spricht. Weiterführende immunhistochemische Untersuchungen an der Retina von Mäusen zeigten, dass GlyRbeta in diesem Gewebe wie erwartet mit Gephyrin an inhibitorischen Synapsen kolokalisiert ist. In Bezug auf GlyRalpha-Untereinheiten geht man bislang davon aus, dass sie an Synapsen des adulten ZNS immer mit GlyRbeta assoziiert sind, und somit indirekt mit Gephyrin verbunden werden, wodurch das Clustering der Rezeptoren gewährleistet wird. Entgegen dieser Hypothese wurde in Doppelfärbungen von GlyRbeta und GlyRalpha-Untereinheiten gefunden, dass eine Ansammlung von GlyRalpha4-Clustern in der Retina adulter Mäuse vermutlich eine Ausnahme hierzu bildet. Für GlyRalpha4-Cluster in Stratum 3 und 4 der IPL konnte gezeigt werden, dass sie teilweise nicht mit GlyRbeta, und zu ebenso großem Teil nicht mit Gephyrin kolokalisiert sind. Dennoch scheinen diese GlyRalpha4-Untereinheiten in Clustern angereichert und zudem synaptisch lokalisiert zu sein. Der Mechanismus, durch den GlyRalpha4 in Abwesenheit dieser beiden Proteine an Synapsen immobilisiert wird, ist bislang völlig unklar. Funktionell wäre denkbar, dass derartige Rezeptorkomplexe den synaptischen Eingängen von ON-Starburst-Amakrinzellen besondere Leitungseigenschaften verleihen und somit maßgeblich an der Verarbeitung richtungsselektiver Signale in der Retina beteiligt sein könnten. In dieser Arbeit wurden außerdem Mutagenesestudien durchgeführt, um zu klären, über welchen Mechanismus die Inhibition der Proteinphosphatasen 1 und 2A (PP1 und PP2A) zum Verlust von synaptischem Gephyrin führt. Es konnte gezeigt werden, dass eine direkte Dephosphorylierung von Gephyrin durch PP1 hierfür wahrscheinlich nicht verantwortlich ist, da die Mutation etablierter Phosphorylierungsstellen von Gephyrin keinen, oder nur einen marginalen Einfluss auf dessen synaptische Lokalisation und das Clustering von GABAARs hatte. Dies spricht dafür, dass PP1/PP2A abhängige Dephosphorylierungs-/Phosphorylierungsprozesse wahrscheinlich andere Gephyrin- oder Cytoskelett-assoziierte Proteine beeinflussen, jedoch nicht direkt an Gephyrin wirken. Die Erstellung von genomweiten Expressionsprofilen ist eine effiziente Methode zur Identifikation neuer Regulationsmechanismen und potentieller Interaktionspartner von Genprodukten und wurde in dieser Arbeit auf Vorderhirnproben von WT- und Gephyrin-KO-Mäusen vergleichend angewendet. Hierbei wurde gefunden, dass die Transkription bekannter Gephyrin-Interaktionspartner durch den Verlust des Gephyrin-Gens nicht messbar verändert wird. Weil die ermittelten Unterschiede in Transkriptmengen generell sehr gering waren, ist zu vermuten, dass Gephyrin keine wesentlichen genregulatorischen Funktionen im Mausgehirn ausübt. Andererseits ergab die Expressionchip-Analyse Hinweise auf neue Genprodukte, für die in WT- und Gephyrin-KO-Mäusen signifikant verschiedene Transkriptionsmengen gefunden wurden. Die Validierung dieser Daten mit anderen Methoden steht jedoch noch aus.
Die forensische Entomologie nutzt nekrophage Insekten, hauptsächlich Dipteren und ihre juvenilen Stadien, zur Schätzung der minimalen Leichenliegezeit. Dem liegt zugrunde, dass nekrophage Dipteren binnen Minuten nach dem Todeseintritt potentiell in der Lage sind, einen Leichnam zu detektieren und zu besiedeln. Das anschließende Wachstum und die Entwicklung der juvenilen Stadien erfolgt als Funktion von der Art und der Umgebungstemperatur.
Mit Hilfe von Laborstudien konnten bislang für einige forensisch relevante Fliegenarten Entwicklungsdaten erhoben werden, die eine Altersbestimmung der sich an einem Leichnam entwickelnden Larven und Puppen erlauben und so eine Schätzung der minimalen Leichenliegezeit ermöglichen. Als Nährsubstrat für Laborstudien werden tierische Gewebe verwendet. Eine Übertragbarkeit der Daten auf humanes Gewebe wurde aber bislang nicht verifiziert. In der vorliegenden Arbeit wurde das larvale Wachstum und die juvenile Entwicklungsgeschwindigkeit der forensisch relevanten Schmeißfliege Calliphora vicina (Diptera: Calliphoridae) auf humanem Muskelgewebe untersucht und mit dem Wachstum auf Schweineleber, magerem Schweinemuskelfleisch und Schweinehackfleisch verglichen. Die auf humanem Gewebe heranwachsenden Individuen waren mit bis zu 3,5 mm signifikant länger als die Individuen, die sich auf Leber und dem mageren Schweinemuskelfleisch entwickelten. Bei der Verwendung von Hackfleisch vom Schwein zeigte sich kein Unterschied. Darauf basierend wird die Empfehlung ausgesprochen, für zukünftige Entwicklungsstudien Schweinehackfleisch als Ersatz für humanes Gewebe zu verwenden.
Zahlreiche Anleitungen zur Asservierung forensisch-entomologischer Spuren empfehlen das Sammeln getrennt nach Körperregionen eines Leichnams. Dies soll eine mögliche gewebespezifische Entwicklungsrate berücksichtigen. Das für die vorliegende Arbeit durchgeführte systematische Absammeln von Fliegenlarven von 51 Leichnamen getrennt nach Körperregionen zeigte keine artspezifischen Präferenzen für bestimmte Gewebe oder Körperregionen. Das Artenspektrum entsprach größtenteils dem aufgrund von Studien an Schweinekadavern zu erwartendem Artenspektrum für Deutschland und Mitteleuropa. Insgesamt konnten 15 Schmeißfliegenarten nachgewiesen werden, von denen in der Regel mehrere gleichzeitig an einem Leichnam zu finden waren. Dies zeigt, dass ein Faktor wie interspezifische Konkurrenz in Zukunft mehr Beachtung in der Forschung erhalten sollte.
Bislang wurde in der forensischen Entomologie die minimale Leichenliegezeit durch die Untersuchung juveniler Stadien von Fliegen eingegrenzt. Eine eventuell mögliche Ausweitung dieses Zeitfensters könnte durch eine Altersbestimmung der adulten Fliegen oder der leeren Puparien gelingen. Der Nachweis, dass die dafür untersuchten Fliegen bzw. Puparien tatsächlich von dem fraglichen Leichnam stammen, war bislang nicht möglich. Die forensische relevante Schmeißfliege Lucilia sericata wurde in der vorliegenden Arbeit auf humanem Gewebe und Gewebe von elf weiteren Tierarten großgezogen. Durch die Analyse stabiler Kohlen- und Stickstoffisotope konnte ein von diesen elf Tierarten abgrenzbares humanes Isotopenprofil sowohl für die adulten Fliegen von L. sericata, als auch für ihre leeren Puparien detektiert werden. Dieses Profil spiegelte die Nahrungszusammensetzung der Wirte wider.
Die vorliegende Arbeit erhebt Daten zur Entwicklung einer forensisch relevanten Schmeißfliegenart auf humanem Gewebe, belegt das bislang lediglich am tierischen Modell erhobene Schmeißfliegeninventar als für menschliche Leichen relevant und hinterfragt die gewebespezifische Asservierungsempfehlung als ein akademisches Artefakt. Auf dieser Basis konnten Empfehlungen für die Weiterzucht fallrelevanter entomologischer Spuren ausgesprochen werden, die gerichtsverwertbar sind und die Verwendung von tierischem Gewebe oder Tierkadaver in der forensisch-entomologischen Forschung legitimieren. Die Analyse stabiler Isotope legt darüber hinaus einen neuen, innovativen Grundstein für die routinemäßige Spurenzuordnung älterer Entwicklungsstadien und ist damit Vorreiter auf dem Gebiet der forensischen Entomologie.
Durch die Forschung der letzten Jahre wurde zunehmend deutlich, dass die Tumorumgebung einen starken Einfluss auf Wachstum und Progression eines Tumors ausübt. Ein Schlüsselereignis ist dabei die veränderte Expression von Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren im Tumor selbst oder im Tumor-Stroma und somit eine Veränderung in der Interaktion zwischen Tumor- und Stroma-Zellen. Eine solche de novo Expression der hämatopoetischen Wachstumsfaktoren G-CSF und GM-CSF konnte in der Tumorprogression humaner Plattenepithelkarzinome der Haut ausschließlich im Tumorgewebe hochgradig maligner, schnell und invasiv wachsender und metastasierender Tumore mit einer ausgeprägten Vaskularisierung nachgewiesen werden (Mueller & Fusenig 1999). Um die Wirkung von G-CSF und GM-CSF getrennt analysieren zu können, wurde eine benigne Keratinozyten-Zelllinie, die die Rezeptoren für G-CSF und GM-CSF exprimiert, nicht jedoch die Faktoren selbst, mit G-CSF oder GM-CSF transfiziert. Die Konsequenz der Faktorexpression wurde in je 2 transfizierten Zelllinien in vitro und in vivo analysiert. Beide Faktoren wirkten autokrin stimulierend auf die Tumorzell-Proliferation und Migration in vitro. Darüber hinaus induzierte GM-CSF die Expression von IL-6 in Tumorzellen, welches dann wiederum die Expression von GM-CSF verstärkte. Untersuchungen der transfizierten Zelllinien in vivo demonstrierten einen deutlichen Beitrag von G-CSF und GM-CSF zur Tumormalignisierung. So ergab die subkutane Injektion der G-CSF exprimierenden Zellen in die Nacktmaus nach einer Latenzzeit von 50 Tagen schnell und invasiv wachsende Tumore mit ausgeprägter Vaskularisierung, während GM-CSF exprimierende Zellen nur ein transientes Tumorwachstum zeigten. Subkutane Injektion von Gemischen der G-CSF mit den GM-CSF transfizierten Zellen demonstrierten eine frühere Häufung der Tumorbildung in Abhängigkeit von der Höhe der GM-CSF Produktion durch die eingesetzte Zelllinie. Die in vivo Progression mittels Rekultivierung von Tumorgewebe der mit G-CSF transfizierten Zellen resultierte in Zellen, die ein sehr schnelles und aggressives Tumorwachstum ohne Latenz zeigten. Diese Progression war assoziiert mit einer de novo Expression von GM-CSF, was auf einen synergistischen Effekt beider Faktoren hinweist. Für die Progressions fördernde Wirkung von G-CSF und GM-CSF spielt neben der autokrinen Stimulation der Tumorzellen vor allem die parakrine Beeinflussung des Tumor-Stromas eine Rolle. Die Analyse der Kinetik der Tumor-Stroma Interaktionen im Oberflächentransplantat ergab eine deutlich schnellere und stärkere, zum Tumor hin gerichtete permanente Angiogenese in den G-CSF exprimierenden Zellen. Diese setzte in den durch in vivo Passage entstandenen, G-CSF und GM-CSF positiven Zellen deutlich früher ein. Die Faktor negativen parentalen Zellen und die mit GM-CSF transfizierten Zellen wiesen dagegen nur eine transiente Angiogenese auf. Die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten in die Tumorumgebung war bei allen transfizierten Zelllinien beschleunigt, blieb jedoch bei GM-CSF exprimierenden Zellen wie auch bei den parentalen und Kontroll transfizierten Zellen transient, während G-CSF exprimierende und G-CSF und GM-CSF ko-exprimierende Zellen eine anhaltende Rekrutierung zeigten. Die Analyse der Kinetik der Makrophagen-Rekrutierung ergab eine deutliche Beschleunigung nur in den GM-CSF exprimierenden und den G-CSF und GM-CSF ko-exprimierenden Zellen. Die sehr frühe Gegenwart von Makrophagen in Transplantaten der GM-CSF positiven Zellen ohne die Präsenz von Granulozyten deutet im Zusammenhang mit der sehr unregelmäßigen und blasigen Epithelbildung und dem nur transienten Tumorwachstum dieser Zellen nach subkutaner Injektion auf eine durch Makrophagen ausgeübte frühe Anti-Tumor Immunität hin. Als Schlüsselenzyme der Tumorinvasion und Angiogenese wurde weiterhin die Expression Matrix degradierender Enzyme, der Matrix Metalloproteinasen, in Tumor und Stroma untersucht. Dabei konnte mit zunehmender Tumorprogression eine ansteigende Expression von MMP-2 in Tumoren, von MMP-13 in Tumor und Stroma und von MMP-3 und MMP-9 im Tumor-Stroma in direkter Nähe zum Tumor festgestellt werden, wobei die Proteasen eine der Tumor-Invasion vorangehende Deposition am Rand invasiver Bereiche des Tumors zeigten. Ein Teil der stromalen (murinen) MMP-9 positiven Zellen konnte über Immunfluoreszenz-Färbungen als neutrophile Granulozyten identifiziert werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ko-Expression von G-CSF, GM-CSF und ihren Rezeptoren in humanen Plattenepithelkarzinomen der Haut einen wesentlichen Beitrag zur Tumorprogression zu einem hochmalignen Tumor-Phänotyp leistet. Dies geschieht zum einen durch eine autokrine Stimulation von Proliferation und Migration der Tumorzellen. Zum anderen stimulieren diese Faktoren parakrin die Induktion einer Tumor fördernden stromalen Umgebung und tragen so zu verstärktem Tumorwachstum und Invasion bei.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gram-negatives, mikroaerophiles Bakterium. Es kolonisiert die menschliche Magenschleimhaut, wobei mehr als 50% der Menschheit befallen sind. Als Pathogen begünstigt es die Entstehung von Magengeschwüren und –krebs. Experimentelle Befunde deuten darauf hin, dass H. pylori während der Infektion Kontakt zu Membranproteinen der Wirtszellen aufnimmt, um ein Typ IV Sekretionssystem aufzubauen und den primären Virulenzfaktor CagA (Cytotoxin Associated Antigen A) in die Wirtszelle zu translokieren. Diese Integrine genannten Membranproteine werden bei polaren Epithelzellen allerdings bevorzugt basolateral expremiert. Außerdem können extrazellulär geschnittene E-Cadherinfragmente im Medium mit H. pylori infizierter Zellkulturen nachgewiesen werden. Beide Beobachtungen legen den Schluss nahe, dass eine Protease von H. pylori sekretiert wird und die Zell-Zell-Kontakte degradiert, um H. pylori den Zugang zur basolateralen Seite der Wirtszellen zu ermöglichen. Das vom Gen hp1019 des Stammes H. pylori 26695 codierte Protein HtrA konnte im Rahmen einer Kooperation mit dem Paul-Ehrlich-Institut in Langen im Überstand von H. pylori mit proteolytischer Aktivität nachgewiesen werden. Um den Einfluss dieser extrazellulären Protease auf die Infektion von Kulturzellen mir H. pylori zu untersuchen, sollte ein niedermolekularer Inhibitor für HtrA gefunden werden. Ein Homologiemodell als Grundlage für ein strukturbasiertes virtuelles Screening wurde berechnet, wobei die aktive Konformation der Protease DegP von Escherichia coli als Vorlage diente (PDB Identifikation 3cs0). Für einen neue, im Rahmen dieser Untersuchung entwickelten Methode wurde PocketPicker eingesetzt, um Größe und Form der die Bindetaschen auf der Proteinoberfläche vorherzusagen. Durch die komplementäre Projektion von Proteinatomtypen auf diese definierte Volumen kann so für eine von PocketPicker vorgesagte Bindetasche ein potentielles Pharmakophormodell berechnet und für Datenbanksuchen eingesetzt werden. In retrospektiven Studien konnte die Funktion dieser Berechungen für eine Auswahl an pharmakologisch wichtigen Proteinen aus verschiedenen Strukturklassen validiert werden. Dabei stellte sich vor allem eine Abhängigkeit der Güte der Modelle von der Güte der Vorhersage von PocketPicker heraus, was den Schluss zulässt, dass eine möglichst genaue Definition der Bindetasche für das Gelingen eines strukturbasierten virtuellen Screening unerlässlich ist. Für die Protease HtrA von H. pylori konnten erfolgreich drei strukturabgeleitete Pharmakophormodelle berechnet werden, wobei jeweils verschiedene von PocketPicker vorhergesagte Bindetaschen einbezogen wurden. Die Molekülkataloge der Firmen Asinex und Specs wurden nach Ähnlichkeit zu diesen Modellen sortiert und nach Begutachtung der jeweils ähnlichsten 100 Substanzen wurden 26 Substanzen ausgewählt und bestellt. In einem in vitro Assay mit der rekombinanten Protease HtrA inhibierten 6 Substanzen den Verdau eines rekombinanten Substrats. Die beste Verbindung erreichte in dem Assay eine maximale Inhibition von ca. 77 % bei einer mittleren inhibitorischen Konzentration bei halbmaximaler Inhibition (IC50) von ca. 26 µM.
Die Komplementarität der molekularen Oberflächen und der Pharmakophorpunkte ist ein verbreiteter Konzept im rechnergestützen Moleküldesign. Diesem Konzept folgend wurde die Software SQUIRREL neu entwickelt und in der Programmiersprache Java implemetiert. Die Software generiert die Vorschläge für den bioisosteren Ersatz von Molekülen und Molekülfragmenten. SQUIRREL kombiniert Oberflächen- und Pharmakophoreigenschaften bioaktiver Substanzen und kann im virtuellen Screening und fragment-basierten de novo Design eingesetzt werden. In einer prospektiven Studie wurde SQUIRREL verwendet, um neue selektive PPARalpha-Agonisten aus einer kommerziellen Moleküldatenbank zu identifizieren. Die Software lieferte eine potente Substanz (EC50 = 44 nM) mit über 100facher Selektivität gegenüber PPARgamma. In einer zweiten Studie wurde eine Leitstruktur de novo generiert und synthetisiert. Als Ausgangstruktur diente der bekannte PPARalpha-Agonist GW590735. Während des Designvorgangs wurden zwei Teilstrukturen, die für die Aktivität von GW590735 verantwortlich sind, durch bioisostere Gruppen ersetzt, die von SQUIRRELnovo vorgeschlagen wurden. Die neue Leitstruktur aktiviert PPARalpha in einem zellbasierten Reportergen-Testsystem bei einem EC50 von 0.51 µM.
Durch Längenmessungen an Exuvien wurden die Größenverhältnisse von Beinlängen, Drehachsenlängen der Beingelenke und der Fläche des Carapax bei C. salei ermittelt. Für die hydraulisch gestreckten Femoro- Patellar- und Tibio-Metatarsalgelenke wurden die Volumen-Winkel-Kennlinien bestimmt. Das Sprungverhalten wurde durch Hochgeschwindigkeits-Videoaufnahmen (Bildfrequenz 500 Hz) mit drei Kameras dokumentiert. Aus den volumetrischen, kinematischen und morphometrischen Daten wurden die Volumenverschiebungen berechnet, die bei Sprungbewegungen auftreten. Aus der prosomalen Volumenverschiebung konnte der korrespondierende Carapaxhub berechnet werden. Mit einer Miniatur- Kraftmeßplattform und einem mit Schrittmotoren getriebenen "x-y-z-Tisch" wurden Steifigkeiten des Prosomas von Perania nasuta Schwendinger, 1989 und ausgewählten anderen Taxa bestimmt. Bei Cupiennius salei gibt es zwei unterschiedliche Sprungtypen: Unvorbereitete Sprünge als Reaktion auf sehr plötzliche Störungen zeichnen sich durch eine große Vielfalt der Bewegungsmuster aus. Vorbereitete Sprünge zeigen charakteristische Beinstellungen und Kontaktphasenmuster: Zunächst erfolgt eine etwa 20 ms dauernde Ausholbewegung, anschließend beginnt die 22 - 42 ms dauernde Beschleunigungsphase. Die Körperlängsachse vollzieht während der Beschleunigungsphase eine Vorwärtsrotation um etwa 50°, die nach dem Verlust des Bodenkontaktes der Beine gestoppt und umgekehrt wird. Dies erfolgt wohl durch ein kontrolliertes Bremsen des Ausstoßes des Sicherheitsfadens. Bei vorbereiteten Sprüngen konnten Sprungweiten bis zu 0.43 m beobachtet werden, die maximalen vertikalen Geschwindigkeiten betrugen 0.07 - 0.82 ms-1, maximale horizontale Geschwindigkeiten lagen bei 0.65 - 1.25 ms-1. Bei vorbereiteten Sprüngen wurden vertikale Beschleunigungen von 0.74 – 33.70 ms-2 und horizontale Beschleunigungen von 20.5 – 68.4 ms-2 erreicht. Die Kontaktphasen der Beine enden in einer charakteristischen Reihenfolge: Die Vorderbeine haben meist keinen Bodenkontakt, die dritten Beine heben nach durchschnittlich 37 % und die vierten Beine nach durchschnittlich 69 % der Dauer der Beschleunigungsphase ab. Zuletzt verlieren die zweiten Beine den Bodenkontakt. Zu Beginn der Beschleunigungsphasen richten sich innerhalb von durchschnittlich 4.6 ms Stacheln auf der Oberfläche der Beine auf. Die Stachelaufrichtung erfolgt bei Drucken von etwa 35 bis etwa 65 kPa. Dies zeigt einen Druckanstieg in den Beinen auf Werte von ³ 65 kPa während der Beschleunigungsphase an. Der Hauptanteil der Volumenverschiebungen in den Beinen wird durch Bewegungen der Femoro-Patellargelenke verursacht. Die Bewegungen der Tibio-Metatarsalgelenke bewirken nur geringe Volumenverschiebungen. Aufgrund der anatomischen Struktur der Trochantero- Femoralgelenke sind die bei Bewegung dieser Gelenke verschobenen Volumina vernachlässigbar klein. Die Abschätzung der zur Beinstreckung bei Sprüngen erforderlichen Carapaxverschiebungen ergab sehr geringe Werte, es sind nur Verschiebungen um wenige 1/100 bis 1/10 mm erforderlich. Für die vollständige Streckung aller Beine muß der Carapax nur um 10% der aufgrund der anatomischen Gegebenheiten maximal möglichen Strecke verschoben werden. Bei den Untersuchungen an Perania nasuta wurden prosomale Steifigkeiten von mehr als 3500 Nm-1 für Weibchen und mehr als 6500 Nm-1 für Männchen ermittelt. Das Prosoma von Perania nasuta ist sehr viel rigider als bei anderen Spinnen (Pholcus: 131 Nm-1, Zelotes: 79 Nm-1, Pardosa: 72 Nm-1, Dysdera: 1900 Nm-1). Die Carapaxverschiebung, die den zur vollständigen Beinstreckung erforderlichen Volumentransport bewirkte, würde bei Perania eine Verformungsarbeit von bis zu 27.56 myJ erfordern, bei den anderen Spinnen nur maximal 1.67 myJ (Dysdera). Das Sprungverhalten von Cupiennius salei läßt sich keinem der bislang beschriebenen Sprungtypen zuordnen. Hinsichtlich der Sprungweite und Geschwindigkeiten sind die Sprungleistungen von Cupiennius mit denjenigen von Salticiden vergleichbar. Die geringen Carapaxverschiebungen beim Sprung lassen sich im Sinne einer Optimierung der Arbeit extrinsischer coxaler Muskeln interpretieren. Eine Minimierung von Carapaxverschiebungen sollte die Koordinierbarkeit der Bewegungen der Coxae erhöhen, weil ein stärker formkonstanter Bezugsrahmen gegeben ist. Dementsprechend lassen sich Bein- und Carapaxdimensionen bei verschiedenen Spinnentaxa im Hinblick auf die jeweiligen Lokomotionsstrategien interpretieren. Die Untersuchungen an Perania nasuta bestätigen die von Kropf (in Vorb.) aufgestellte Hypothese einer starken Versteifung des Prosoma. Die Druckpumpe scheint hier im Opisthosoma lokalisiert zu sein. Hinsichtlich der möglichen Vorteile einer solchen Entwicklung lassen sich einerseits die besseren Bedingungen der Arbeit extrinsischer coxaler Muskeln im vollständig steifen "Gestell" des Prosoma nennen, andererseits könnte aufgrund entsprechender Lokomotionsmodi bei Perania keine Notwendigkeit zur schnellen Verschiebung großer Haemolymphvolumina aus dem Prosoma bestehen, so daß eine leistungsfähige prosomale Druckpumpe wegfallen konnte.
Weiterentwicklung und Evaluation eines drei-dimensionalen Hautmodelles zur pharmakologischen Testung
(2008)
In der vorliegenden Arbeit wurden 10 Typen der Gehölzvegetation und 14 Typen der Krautvegetation für das Untersuchungsgebiet Atakora vorgestellt. Dabei konnten nur Sonderstandorte, wie Galeriewälder und Lateritkrusten, klar abgetrennt werden. Viele Arten besitzen keine eindeutigen ökologischen Präferenzen, was sich gut mit der Einschätzung der lokalen Bevölkerung deckt, die für den Großteil der Arten angaben, dass diese wüchsen wo sie wollten. Dabei fällt auf, dass sich die Typen (vor allem in Gehölzschicht aber auch in Krautschicht) in den einzelnen Dörfern oft nur in Teilen entsprechen. Gründe dafür konnten nur teilweise in den unterschiedlichen ökologischen Gegebenheiten und unterschiedlichen Nutzungspräferenzen einzelner wichtiger Trennarten gegeben werden. Selten findet sich ein hundertprozentiges Zusammentreffen eines Gehölztyps mit einem Krauttyp. Damit bestätigt sich die Annahme unterschiedlicher Entwicklungsbedingungen und teilweise unabhängiger Entwicklung dieser beiden Elemente in der westafrikanischen Savanne. Gesellschaften, in denen eine Krautschicht mit einer Gehölzschicht eng korreliert sind, konnten nur für landwirtschaftlich nicht genutzte Sonderstandorten wie Galeriewälder und Lateritkrusten gebildet werden. Zudem zeigt sich, dass die Vegetation in der dichter besiedelten Ebene klarer strukturiert ist, als in der Bergregion. Dies trifft vor allem auf die Gehölzvegetation zu. Dennoch sind erstaunlich viele Gehölzarten auch in der intensiver genutzten Ebene anzutreffen, was für große Regenerationsfähigkeit und die Anpassung der hauptsächlichen Savannengehölze an das menschliche Wirken spricht. Die geringere Zahl an Gehölzarten in der Ebene ist hauptsächlich Resultat der wesentlich stärker degradierten Galeriewälder. In den Berggebieten sind zudem mehr Gehölzschichttypen und mehr krautige Arten angetroffen worden. Hier zeigt sich, dass Berggebiete auch in dieser Untersuchungsregion als Refugium für Vegetationsformationen und Arten gelten können. Die Nutzung von Wildpflanzen für verschiedene Zwecke wurde dokumentiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass Präferenzen für diverse Nutzungen auf ethnischen, teilweise auch auf persönlichen Präferenzen, sowie auf der Verfügbarkeit der Pflanzen basieren. Dabei zeigte sich, dass die Präferenzen von Arten als Bau- und Brennholz eher auf der Verfügbarkeit basieren, während die Präferenzen für Medizinalpflanzen eher auf ethnischnen Vorstellungen von Wirksamkeit und teilweise auch auf kollektiven Erfahrungen basieren. Es erwies sich, dass die traditionelle Nutzung von Wildpflanzen als Brenn- und Bauholz und zu zusätzlichen Ernährung in dem Untersuchungsgebiet einen geringen Einfluß auf die Biodiversität hat, solange diese Pflanzen nicht kommerzialisiert werden. Es gibt genügend Pflanzenarten, die leicht zu finden sind und gute Eigenschaften für die eingesetzten Zwecke aufweisen, so dass man meist auf die jeweiligen in einem Dorfgebiet häufig anzutreffenden Arten ausweichen kann. Für diese geringe Auswirkung der traditionellen Nutzung von Gehölzpflanzen auf die Biodiversität sprechen auch die Aussagen der Bevölkerung über die geringere Verfügbarkeit von Gehölzpflanzen zu bestimmten Nutzungen. Dabei ergab sich eine Reihung von Nennungen, die von weniger Bauholz über weniger Brennholz zu weniger Gehölzpflanzen für die traditionelle Medizin abnahmen. Zudem wurde in allen Befragungen verneint, dass eine Art aus dem Dorfgebiet verschwunden wäre. Daraus läßt sich schließen, dass ein Großteil der wichtigen Gehölzpflanzen in dem Untersuchungsgebiet noch vorhanden ist, aber auf Grund der intensivierten Landwirtschaft nicht mehr in der Lage ist, sich zu richtigen Bäumen zu entwickeln. Da sich dadurch einige Gehölzpflanzen nur noch vegetativ vermehren können, kann eine genetische Verarmung von Populationen bestimmter Arten angenommen werden. Dies wäre ein interessanter Ansatzpunkt für zukünftige Forschungen. Ein negativer Einfluß auf die Biodiversität durch traditionelle Nutzungen ist bei der Nutzung von Gehölzpflanzen für die traditionellen Medizin größer, vor allem wenn Wurzeln verwendet werden. Dennoch lässt sich erkennen, dass der Einfluß der traditionellen Nutzungen von Wildpflanzen im Vergleich zu der landwirtschaftlichen Nutzung der Flächen einen marginalen Effekt auf die Vegetation hat. Im Rahmen der ethnobotanischen Befragungen wurden Pflanzennamen, Umweltwahrnehmung und die Vorstellungen von Krankheit der Bétamaribè und Wama dokumentiert. Diese weisen im Gegensatz zu den Vorstellungen anderer afrikanischer Völker kaum Differenzen auf. Die Vorstellungen von Krankheit sind dabei von einem starken Wandel betroffen, da man sich immer stärker auf westliche Konzepte und Medikamente verläßt. Ein positiver Effekt hiervon auf die Phytodiversität ist jedoch nicht zu erwarten, da die Medikamentkosten eine Intensivierung der Landwirtschaft erfordern. Über 240 traditionelle Heilrezepte wurden gesammelt. Die wichtigste Rolle spielen dabei Gehölzpflanzen. Dabei zeigt sich, dass sich die Präferenzen zwischen den einzelnen Dörfern stärker unterscheiden als bei der Nutzung von Pflanzen zu Brenn- und Bauholzzwecken. Auch erweisen sich große Unterschiede zu Verwendungen von Medizinalpflanzen in anderen Untersuchungsgebieten. Dies liegt an unterschiedlichen Vorstellungen und Erfahrungen zur Wirksamkeit von Pflanzen vor allem bei Krankheiten, die auch von alleine wieder vergehen wie Magen-Darm-Erkrankungen. Das Wissen über Heilpflanzen ist in der Ebene geringer ausgeprägt, als in den beiden Bergdörfern. Gründe hierfür können jedoch nicht alleine in den geringeren pflanzlichen Ressourcen gesehen werden. Ein Wandel in der Landwirtschaft bezieht sich hauptsächlich auf die Anbauprodukte. Während traditionelle angepaßte Cerealien seltener angebaut werden, baut man viele Produkte für den Verkauf an. Die herausragende Stellung darunter nimmt die anspruchsvolle und arbeitsintensive Baumwolle ein. Die Auszahlungsmodalitäten der halbstaatlichen Baumwollgesellschaft kommen dabei den bäuerlichen Bedürfnissen am ehesten entgegen. Um den finanziellen Ansprüchen der Verwandtschaft zu entgehen werden kurzfristige Strategien zur Geldbeschaffung angenommen. Es zeigt sich also, dass die Ursachen von Degradation eher in dem Kulturwandel und einer zunehmenden Abhängigkeit der Bauern von Bareinkünften zu sehen ist als in der oft pauschal genannten Überbevölkerung. Zukünftige Forschungen über Biodiversität und Vegetationswandel sollten auch den Kulturwandel stärker berücksichtigen. Die Degradation zeigt sich in dem Untersuchungsgebiet mehr in der Verarmung der Böden als in einem Rückgang der Biodiversität. Obwohl schon historische Vegetationsbeschreibungen von einer starken Beeinträchtigung der vermuteten natürlichen Wälder sprechen, ist nicht davon auszugehen, dass sich die Vegetation in dem Untersuchungsgebiet die letzten 50 Jahre stark verändert hat. Das in nördlicheren Gebieten von der lokalen Bevölkerung beobachtete Verschwinden von Arten wird kategorisch verneint. Bei den genannten zurückgehenden Arten handelt es sich hauptsächlich um wichtige Nutzarten. Da hierzu historische Daten fehlen, kann es sich auch um selektive Wahrnehmung der Bauern handeln. Dennoch ist anzunehmen, dass sich in Zukunft die Degradationsphänomene verschlimmern werden. Da die Bargeldbedürfnisse der Bauern nicht mehr zurückzuschrauben sind und zudem die Experimentiefreudigkeit in der recht unsicheren Umweltsituation gering ist, muss auf bestehende Produkte zurückgegriffen werden, um sowohl diese Bargeldbedürfnisse zu befriedigen, als auch die Umwelt zu schonen. Eine Chance hierfür könnte eine Vermarktung von Fonio, wie bereits in Mali geschehen, darstellen. Dieses anspruchslose, noch auf sehr ausgelaugten Böden wachsende und zudem sehr nahrhafte und wohlschmeckende Getreide sollte wieder vermehrt angebaut werden und auf lange Sicht die anspruchsvolle und Boden auslaugende Baumwolle ersetzten. Dies ist jedoch nur möglich, wenn Fonio über internationale Strukturen auch in Europa und Amerika vermarktet wird. Eine weitere finanziell nicht ausgeschöpfte Ressource bieten die Mangobäume. In der Hochzeit der Mangoernte werden die Bäume vielfach nicht mehr abgeerntet, weil die Preise für die Früchte stark sinken. Die Früchte fallen dann meist Flughunden und Vögeln zum Opfer. Wie das Beispiel Burkina Faso zeigt, könnten diese Früchte getrocknet, zu Marmelade oder Saft verarbeitet werden und selbst in Europa in dieser haltbaren Form verkauft werden. Leider sind bislang die entsprechenden Initiativen und Strukturen dazu in Benin noch nicht geschaffen. Eine weitere, wenn auch langfristigere Möglichkeit wäre die Ersetzung der Baumwollfelder durch Cashjew-Pflanzungen. Diese werden von der Bevölkerung immer mehr angenommen. Dabei könnten neue Gehölzresourcen geschaffen und die Bodenfruchtbarkeit erhöht werden. Einige Initiativen von kleinen NGO's, die das Pflanzen von Bäumen befürworten, finden großen Anklang. Es muß nur eine Möglichkeit gefunden werden, solche Produkte auch international zu kommerzialisieren, um die Böden stark belastende und zudem arbeitsaufwendige Baumwolle zu ersetzten. Zudem sind Initiativen von einzelnen Dörfern in der Atakoraregion, Teile des Dorfgebietes unter Schutz zu stellen und damit Ressourcen und Wissen vor allem für die traditionelle Medizin zu sichern, ermutigend. Es zeigt, dass die lokale Bevölkerung Bedrohungen ihrer Umwelt ernst nimmt und versucht mit Hilfe von NGO's Gegenmaßnahmen zu schaffen. In diesem Hinblick wäre es wichtig, dass sich zukünftige Forschungen mehr den pharmazeutischen Inhaltsstoffen von Heilpflanzen widmen, so wie dies in Südamerika bereits geschieht. Dabei sollten jedoch die Rechte der autochtonen Bevölkerung gewahrt werden. Zudem wäre es wichtig, mehr über die Ökologie einzelner Gehölzpflanzen unter Berücksichtigung der jeweiligen Nutzungsverhältnisse zu kennen. Hierbei wäre es auch interessant über die Naturverjüngung ausgewählter Arten zu arbeiten. Zudem sollten Forscher, die über Degradationsprobleme arbeiten, vor allem in angewandten Bereichen, mehr auf die Erfahrungen der lokalen Bevölkerung hören und weniger scheinbar offensichtliche und populäre Theorien wie Überbevölkerung strapazieren. Dabei sollten auch vermehrt historische Quellen zu Rate gezogen werden, da es scheint, dass die westafrikanische Savanne nicht so degradiert ist, wie es oft behauptet wird und noch große Potentiale besitzt, wenn diese richtig genutzt werden. Abschließend sei bemerkt, dass, wenn man Berichte aus anderen afrikanischen Regionen hört und sieht, der Norden Benins als "Insel der Glückseeligen" betrachtet werden kann. Die politische Lage ist stabil, die Bevölkerung aufgeschlossen und freundlich, es gibt kaum Kriminalität, große Krankheitsepedemien sind in den letzten Jahren ausgeblieben, Hunger wird selten erlitten und auch die Umweltdegradation hält sich in Grenzen. Möge die hier vorliegende Arbeit dazu beitragen, diese Region und die Bétamaribè ein wenig mehr ins Bewußtsein der Öffentlichkeit bringen und ein wenig dazu beitragen, dass die Situation der Region und ihrer Bevölkerung sich nicht verschlechtert.
Anti-T-Lymphozyten-Globuline (ATG) sind Immunglobuline zur Anwendung am Menschen. Sie werden aus den Seren von Kaninchen oder Pferden gewonnen, die zuvor mit humanen Thymozyten oder einer etablierten humanen T-Zell-Linie immunisiert wurden. ATG besitzen ein sehr starkes immunsuppressives Potenzial. In der klinischen Anwendung werden sie überwiegend bei Organtransplantationen, Knochenmarktransplantationen und zur Behandlung einzelner Autoimmunerkrankungen, wie z. B. der aplastischen Anämie, eingesetzt. Wissenschaftliches Ziel der Arbeit war, einen umfangreichen Beitrag zur immunologischen Charakterisierung und Spezifizierung unterschiedlicher ATG-Präparate zu erbringen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die Entwicklung und Validierung experimenteller Methoden, sodass die bisher verwendeten Praktiken der Wirksamkeitsprüfung von ATG entsprechend dem Stand der Wissenschaft abgelöst und der Tierversuch (Affenhaut-Transplantationstest; Balner H et al., 1968) ersetzt werden können. Darüber hinaus wurde in diesem Zusammenhang der Entwurf einer Arzneibuch-Monografie für ATG vorgelegt. Der immunsuppressive Wirkmechanismus von ATG ist selbst nach 40 Jahren klinischer Erfahrung nicht eindeutig geklärt. Ihre Wirksamkeit vermitteln sie über ihre spezifische Bindung an Lymphozyten, woraus sich modellhaft vier Effekte unterscheiden lassen: Die Reihe der Fc-abhängigen zytotoxischen Mechanismen, eine von ATG ausgelöste Aktivierung, eine über Todesrezeptoren (z.B. Fas/Apo-1) von ATG direkt induzierte Apoptose sowie die Maskierung von Rezeptoren. Die zytotoxische Wirkung von ATG und die Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) wurde am Durchflusszytometer (FACS) nach Färbung der toten Zellen bzw. durch den Nachweis von DNA-Fragmentierung analysiert. Der Einfluss von ATG auf die Lymphozyten-Aktivierung in vitro sowie auf die gemischte Lymphozyten-Reaktion (mixed lymphocyte reaction, MLR) wurde durch Messung der Lymphozyten-Proliferation anhand des Einbaus von radioaktiv markiertem Thymidin bestimmt. Biochemisch wurden die in ATG enthaltenen anti-Lymphozyten-Antikörper durch den sog. Kinase-Assay charakterisiert. In einer nicht radioaktiven Methode wurden Zelloberflächenmoleküle zunächst biotinyliert. Nach Lyse der Zellen wurden die Proteine mit ATG präzipitiert, gelelektrophoretisch aufgetrennt sowie mittels Streptavidin und Chemilumineszenz im Westernblot nachgewiesen. Für das Verständnis der klinischen Wirksamkeit von ATG ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen der komplement-unabhängigen, zytotoxischen Wirkung von erheblicher Bedeutung, da die enorme zytolytische, aber auch die breite immunsuppressive Wirkung von ATG nicht allein durch die Fc-abhängige Zytotoxizität erklärt werden kann. ATG können bei bestimmten Zielzellen Fas-abhängige Apoptose auslösen; darüber hinaus sind ATG aber auch in der Lage, einen komplement-unabhängigen Zelltod in Fas-resistenten Zell-Linien und T-Zell-Klonen, die resistent gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (AICD) sind, auszulösen. In Kompetitionsversuchen konnte gezeigt werden, dass ATG entsprechende Antikörper-Spezifitäten gegen das Molekül CD95 (Fas/Apo-1) enthalten. Ferner konnten wir nachweisen, dass die durch ATG initiierte Fas-abhängige Apoptose und/oder der AICD durch Fas-neutralisierende Antikörper inhibiert werden können, was auch von anderen Arbeitsgruppen gezeigt wurde (Genestier L et al., 1998). Die DNA-Fragmentierung, als Nachweis von Apoptose, lässt sich nach der ATG-Inkubation von Fas-sensitiven Zielzellen durch Inhibitoren der Caspase-1 (Z-VAD-FMK) komplett sowie durch Inhibitoren der Caspase-3 (Ac-DMQD-CHO) und -6 (Ac-VEID-CHO) teilweise inhibieren. Die zytotoxische Wirkung von ATG lässt sich jedoch nicht in gleichem Maße durch Inhibitoren der Caspase-1 reduzieren, wie bei einem Apoptose induzierenden mAk gegen Fas. Es wird deutlich, dass ATG eine breit gefächerte zytotoxische Wirkung auf verschiedene Zellpopulationen ausüben, die alle mehr oder weniger eine Rolle in der klinischen Wirksamkeit von ATG spielen können. ATG sind in der Lage, periphere blutmononukleäre Zellen (PBMC) zu aktivieren, wobei der Proliferationsindex in etwa dem eines Standardmitogens, wie z. B. Phytohämagglutinin (PHA), entspricht. Isolierte T-Lymphozyten werden ebenfalls aktiviert, zeigen jedoch eine geringere Proliferationsrate. In PHA-Blasten lassen sich schwache Veränderungen im Muster der Protein-Tyrosin-Phosphorylierung erkennen, wobei eine gewisse Ähnlichkeit im Bandenmuster sowie in der Intensität zwischen der Stimulation mit ATG und dem anti-CD2 mAk zu erkennen ist. Im Unterschied zu publizierten Studien konnte in dieser Arbeit kein spezifisch hemmender Effekt der ATG auf die MLR nachgewiesen werden. Aus den Untersuchungen zur Charakterisierung der ATG hat sich der komplement-abhängige Zytotoxizitätstest, gemessen am Durchflusszytometer, als die Methode herausgestellt, die, bezogen auf den Wirkmechanismus der ATG und im Hinblick auf eine Routineanwendung in der Chargenprüfung, am besten geeignet ist. Eine Evaluierung der Methode wurde im Rahmen eines Ringversuches, an dem sich sieben verschiedene Labore beteiligten, durchgeführt. Die mittlerweile gültige Arzneibuch-Monografie für ATG (Ph. Eur.: 1928) sieht diese in vitro Methode zur Wirksamkeitsprüfung von ATG vor, womit die Voraussetzungen zur Abschaffung des Affenhaut-Transplantationstests geschaffen wurden. Neben einer zellulären Charakterisierung der ATG konnte gezeigt werden, dass sich insbesondere biochemische Methoden, wie z. B. der Kinase-assay oder die Biotinylierung von Zelloberflächenmolekülen, sehr gut zur Identitätsprüfung von ATG eignen. Mit beiden Methoden ließen sich produktspezifische Bande nachweisen. Im Rahmen der Entwicklung von ATG sind diese Methoden geeignet, die Konsistenz der Chargenproduktion zu überprüfen, sodass auch hier Alternativen zum Tierversuch vorhanden sind.
Es ist bekannt, dass Curcumin in einer Vielzahl verschiedener Zellarten die Proliferation hemmt und Apoptose induziert. In der Literatur werden Konzentrationen von 10 bis 150 µM (3.7-55 µg/ml) als dafür notwendig beschrieben. Da Curcumin nach oraler Aufnahme, aufgrund seiner schlechten Resorption aus dem Magen-Darm-Trakt, eine geringe Bioverfügbarkeit im Organismus aufweist, sind therapeutische Lösungen erforderlich um Curcumin besser nutzen zu können. Aus diesem Grund wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Wirkung von geringen Mengen Curcumin, die allein keine Effekte zur Folge haben, in Zusammenwirkung mit Licht untersucht. Es wurde gezeigt, dass bereits Konzentrationen von 0,2-1 µg/ml in Keratinozyten die Proliferation hemmen, wenn sie mit UVA- oder sichtbarer Licht-Bestrahlung kombiniert werden. Desweiteren wurde belegt, dass diese Behandlung Apoptose in HaCaT-Zellen induziert, wobei der mitochondriale Apoptoseapparat aktiviert wird. Dies belegen die Freisetzung von Cytochrom c und die frühe Spaltung der Caspase-9 wohingegen Caspase-8 zeitverzögert aktiviert wurde. Weiterhin wurde dargelegt, dass Erk1/2, PKB/Akt und PKC durch Curcumin/Licht gehemmt werden, wohingegen p38 durch diese Behandlung eine Aktivierung erfährt. Zusätzlich ergab sich ein inhibierender Einfluss auf den EGF-Rezeptor, einem “upstream”-Regulator all dieser Kinasen, und den Transkriptionsfaktor NF-kappaB. Bei in vivo-Studien an immundefizienten Mäusen mit A431-Xenografts hatte eine Behandlung mit i.p. verabreichtem Curcumin und anschließender Bestrahlung mit sichtbarem Licht einen signifikanten inhibitorischen Effekt auf das Tumorwachstum zur Folge. In diesen Tumoren fand eine Reduktion der Ki-67-Expression sowie eine Induktion von „apoptotic bodies“ statt. Western Blot-Analysen bestätigten die Apoptoseinduktion durch eine verstärkte Aktivierung der Caspase-9. Zusätzlich zeigte sich auch eine Hemmung von Erk1/2 sowie EGF-R nach beschriebener Behandlung in den Tumoren. Die Wirkungsweise des Curcumins in Kombination mit Licht in vitro wie auch in vivo weisen auf einen neuen therapeutischen Ansatz einer photodynamischen Therapie hin. Dabei kann durch die Verwendung von sichtbarem Licht auf den Einsatz der karzinogenen UV-Bestrahlung, wie sie in üblichen Phototherapien angewandt wird, verzichtet werden.
Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss sowohl akuter als auch chronischer Aufnahme subletaler Mengen des Insektizids Thiacloprid auf Einzelbienen und Bienenvölker untersucht. Anlass für diese Art an Untersuchungen gibt ein seit Jahren in Nordamerika und Europa auftretendes unerklärliches Phänomen, „Colony Collapse Disorder“ genannt, bei dem Bienenvölker durch einen plötzlichen Verlust der Flugbienen zusammenbrechen. Als Ursache für das Völkersterben stehen neben anderen Faktoren wie Parasiten, Pathogenen und Umweltfaktoren die Insektizide aus der Gruppe der Neonikotinoide und deren Auswirkungen auf Bienen in subletalen Mengen im Verdacht. Basierend auf Studien der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) wurde der zugelassene Einsatz der drei Neonikotinoide Clothianidin, Imidacloprid und Thiamethoxam im Pflanzenschutz für zunächst zwei Jahre durch die EU-Kommission stark eingeschränkt.
Thiacloprid, ein weiteres Insektizid, welches zur Gruppe der Neonikotinoide gehört, ist weiterhin für den Einsatz im Pflanzenschutz zugelassen. Es wirkt in ähnlicher Weise wie die zuvor genannten Neonikotinoide als Agonist am nikotinischen Acetylcholinrezeptor, wobei es jedoch als weniger toxisch für Bienen gilt. Trotzdem sind subletale Auswirkungen dieses Neonikotinoids auf Bienen denkbar, die sich in Verhaltensänderungen der Bienen äußern und als Folge Einfluss auf das gesamte Bienenvolk nehmen könnten.
In der hier vorliegenden Arbeit wurden in chronisch mit Thiacloprid eingefütterten Völkern über mehrere Monate regelmäßige Populationsschätzungen durchgeführt, um die Entwicklung der Bienenvölker unter Aufnahme von Thiacloprid festzustellen. In einem weiteren Versuch wurde die Entwicklung der Brut unter chronischer Fütterung mit Thiacloprid beobachtet. Zusätzlich wurde eine große Zahl an Bienen mit RFID-Transpondern ausgestattet, um das Flugverhalten zu dokumentieren. Insbesondere wurden hier der Zeitpunkt des ersten Ausflugs und die Lebensdauer der Bienen zu Vergleichen herangezogen. Nach akuter Fütterung einer subletalen Einzeldosis Thiacloprid wurden Versuche zum Heimkehrvermögen von Bienen durchgeführt.
Unter feldrelevanten und bis zu zehnfach höheren Thiacloprid-Konzentrationen wurden keine beeinträchtigenden Einflüsse auf die Volksentwicklung beobachtet. Bei Konzentrationen, die um ein 25faches bzw. ein 40faches höher als die feldrelevante Konzentration waren, wurde festgestellt, dass die Brutzellenanzahl im Verhältnis zur Bienenanzahl verringert war. Bienen aus chronisch mit Thiacloprid eingefütterten Völkern starteten mit höherem Alter zu ihrem ersten Flug aus dem Bienenstock. Die Zeit, die die Bienen als Sammlerinnen verbrachten, änderte sich nicht. Durch Beobachtungen der Brutflächen konnte festgestellt werden, dass sich die Brut in Thiacloprid-gefütterten Völkern entsprechend der Brut in Kontrollvölkern entwickelte. Aufgrund weiterer Ergebnisse wurde eine Störung der olfaktorischen Wahrnehmung von Bienen aus Thiacloprid-gefütterten Völkern vermutet. Die akut verabreichte subletale Dosis an Thiacloprid führte zu einem erheblichen Verlust an heimkehrenden Bienen und deutet auf eine Beeinträchtigung des Orientierungs- bzw. Navigationsvermögens der Bienen hin.
In den durchgeführten Versuchen wurden sowohl direkte Auswirkungen von chronischer und akuter Aufnahme subletaler Mengen an Thiacloprid, als auch indirekte Auswirkungen auf Honigbienen beobachtet. Da teilweise erst bei hohen, nicht feldrelevanten Konzentrationen in den Versuchen Effekte beobachtet wurden, kann nur bedingt durch die Verhaltensänderung von Einzelbienen auf daraus resultierende Auswirkungen auf ein gesamtes Bienenvolk unter realistischen Bedingungen geschlossen werden.
Human GLUTs represent a family of specialized transporters that facilitate the diffusion of hexoses through membranes along a concentration gradient. The 14 isoforms share high sequence identity but differ in substrate specificity and affinity, and tissue distribution. According to their structure similarity, GLUTs are divided into three classes, with class 1 comprising the most intensively studied isoforms GLUTs1 4. An abnormal function of different GLUT members has been related to the pathogenesis of various diseases, including cancer and diabetes. Hence, GLUTs are the subject of intensive research, and efforts concentrate on identifying GLUT-selective ligands for putative medical purposes and their application in studies aiming to further unravel the metabolic roles of these transporters.
The hexose transporter deficient (hxt0) yeast strain EBY.VW4000 is devoid of all its endogenous hexose transporters and unable to grow on glucose or related hexoses. This strain has proven to be a valuable platform to investigate heterologous transporters due to its easy handling, increased robustness, and versatile applications. However, the functional expression of GLUTs in yeast requires certain modifications. Single point mutations of GLUT1 and GLUT5 led to their functional expression in EBY.VW4000, whereas the native GLUT1 was actively expressed in EBY.S7, a hxt0 strain carrying the fgy1 mutation that putatively reduces the phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P) content in the plasma membrane. GLUT4 was only actively expressed in the hxt0 strain SDY.022, which also contains the fgy1 mutation and in which ERG4 is additionally deleted. Erg4 is one of the late enzymes in the ergosterol pathway, and therefore SDY.022 probably has an altered sterol composition in its membrane.
The goal of this thesis was to actively express GLUT2 and GLUT3 in a hxt0 yeast strain, providing a convenient system for their ligand screening. A PCR-derived amino acid exchange in the sequence of GLUT3 enabled its functional expression in EBY.VW4000 and the unmodified GLUT3 protein was active in EBY.S7. Functional expression of GLUT2 was achieved by rational design. The extracellular loop between the transmembrane regions 1 and 2 is significantly larger in GLUT2 than in other class 1 GLUTs. By truncating this loop by 34 amino acids and exchanging an alanine for a serine, a GLUT3-like loop was implemented. The resulting construct GLUT2∆loopS was functional in EBY.S7. With an additional point mutation in the transmembrane region 11, GLUT2∆loopS_Q455R was also actively expressed in EBY.VW4000. Inhibition studies with the known GLUT inhibitors phloretin and quercetin showed a reduced transporter activity for GLUT2 and GLUT3 in uptake assays and growth tests when inhibitors were present, demonstrating that both systems are amenable for ligand screening experiments.
The newly established GLUT2 yeast system was then used to screen a library of compounds pre-selected by in silico screening. Thereby, eleven identified GLUT2 inhibitors exhibited strong potencies with IC50 values ranging from 0.61 to 19.3 µM. By employing the other yeast systems, these compounds were tested for their effects on GLUT1, and GLUTs3-5, revealing that nine of the identified ligands were GLUT2-selective. In contrast, one was a pan-class 1 inhibitor (inhibiting GLUTs1-4), and one affected GLUT2 and GLUT5, the two fructose transporting isoforms. These compounds will serve as useful tools for investigations on the role of GLUT2 in metabolic diseases and might even evolve into pharmaceutical agents targeting GLUT2-associated diseases.
Due to the beneficial effect of the putatively changed sterol composition in SDY.022 (by ERG4 deletion) on the functional expression of GLUT4, it was hypothesized that the presence of the human sterol cholesterol, or cholesterol-like sterols, might have a beneficial effect on GLUT expression, too. Thus, it was attempted to generate hxt0 strains that synthesize these sterols by genetic modifications targeting the ergosterol pathway. In the scope of these experiments, several strains with different sterol compositions were generated. Drop tests on glucose medium with the different strains expressing GLUT1 or GLUT4 revealed that the deletion of ERG6 is clearly advantageous for a functional expression of GLUT1 (but not GLUT4). This indicates that the methyl group at the ergosterol side chain (introduced by Erg6 and reduced by Erg4) negatively influences GLUT1 activity. However, this effect on GLUT1 activity was less pronounced than the putative altered PI4P content in EBY.S7.
Additionally, in this thesis, a new tool to measure glucose transport rates of transporters expressed in the hxt0 yeast system was developed to facilitate their kinetic characterization. For this, the pH-sensitive GFP variant pHluorin was employed as a biosensor for the cytosolic pH (pHcyt) by measuring the ratio (R390/470) of emission intensities at 512 nm from two different excitation wavelengths (390 and 470 nm). Sugar-starved cells exhibit a slightly acidic pHcyt because ATP production is depleted, reducing the activity of ATP-dependent proton pumps.
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Glioblastoma is the most common and most aggressive type of brain tumor in adults. In contrast to epithelial cancers, glioblastomas do not metastasize. While the major treatment challenge in epithelial cancers is not the primary tumor but metastasis, glioblastoma patients die of the primary tumor.
However, there is a common theme which underlies the malignant properties of progressed epithelial cancers and glioblastoma: invasion from the primary tumor into the surrounding tissue. In the case of epithelial cancers this is the first and necessary step to metastasis, whereas invasion leads inevitably to tumor recurrence after resection in the case of glioblastoma, causing it to be incurable.
A cellular program which has been described in detail to promote the invasive phenotype in epithelial tumors, is the epithelial-mesenchymal-transition (EMT). Differentiated neural cells are not epithelial, thus, strictly speaking, EMT does not occur in glioblastoma. However, the traits acquired in the process of EMT, especially invasiveness and stemness, are highly relevant to glioblastoma. One of the key transcription factors known to induce EMT in epithelial cancers is ZEB1, which has been described only marginally in the central nervous system so far. Here, I investigate the expression and function of ZEB1 in glioblastoma and during human fetal neural development.
ZEB1 mRNA was significantly upregulated in all histological types of glioma, including glioblastoma, when compared to normal brain. There was no correlation between ZEB1 mRNA levels and tumor grade. Immunohistochemical staining of glioma samples demonstrated that ZEB1 was highly expressed in the great majority of tumor cells. In the developing human brain, intense staining for ZEB1 could be observed in the ventricular and subventricular zone, where stem- and progenitor cells reside. ZEB1 positive cells included cells stained with stem- and progenitor markers like PAX6, GFAP and Nestin. In contrast, ZEB1 was never found in early neuronal cells as identified by TUBB3 staining.
To gain insight into ZEB1 function I generated a human fetal neural stem cell line and a glioblastoma cell line with ZEB1 knockdown, which were compared with their respective control cell lines. First, I found that ZEB1 does not regulate the micro RNA 200 family in either cell line, which has been described as an essential ZEB1 target in epithelial cancers. Second, regulated target genes were identified with a genome wide microarray. The third approach was to directly identify genomic binding sites of ZEB1 by chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq). All three approaches showed that the ZEB1 transcriptional program is surprisingly similar in the neural stem cell line and the glioblastoma cell line. In contrast, it bears only little resemblance to the program described in epithelial cancers.
The most interesting, previously unrecognized ZEB1 target gene identified in this study is integrin b1. It was regulated after ZEB1 knockdown detected by microarray analysis, and has a ZEB1 binding site in its promoter region detected by ChIP-seq. Finally, I addressed the question whether ZEB1 influences tumor growth and invasiveness in a glioblastoma model. After intracranial xenotransplantation in mice, ZEB1 knockdown glioblastoma cells formed significantly smaller and less invasive tumors than control glioblastoma cells.
This study demonstrates that ZEB1 is widely expressed in glioma and relevant for glioblastoma growth and invasion. In contrast to what is known about ZEB1 function in epithelial cancers, ZEB1 is not associated with glioma progression, but instead seems to be an early and necessary event in tumorigenesis. Also with regard to ZEB1 target genes, ZEB1 functions differently in glioblastoma than in epithelial cancers. The two most important ZEB1 targets in epithelial cancers are E-cadherin and the miR-200 family members. Both are not relevant to ZEB1 function in glioblastoma. Interestingly, while the ZEB1 transcriptional program is different from the one described in epithelial cancers, it is highly similar in glioblastoma cells and fetal neural stem cells. This suggests that an embryonic pathway restricted to stem- and progenitor cells during development is reactivated in glioblastoma.
Previously known ZEB1 target genes were tissue specific and therefore seemed unlikely to mediate ZEB1 function in the central nervous system. However, the newly identified ZEB1 target gene integrin b1 is well known to play pivotal roles in both glioblastoma tumorigenesis and invasion as well as in neural stem cells. Additionally, integrin b1 is widely expressed and seems a likely ZEB1 target in other organs than the brain.
Taken together, I demonstrate that ZEB1 is a new regulator of glioblastoma growth and invasion. The transcriptional program of ZEB1 differs from the one in epithelial cancers but is strikingly similar to the one in neural stem cells. The newly identified ZEB1 target gene integrin b1 is likely to mediate crucial ZEB1 functios. Thus, this study identifies ZEB1 as a yet unrecognized player in glioblastoma and neural development. Furthermore, it sets the stage for more research which will help to deepen our understanding of ZEB1 function in the central nervous system and beyond.
Echoortende Fledermäuse verfügen über ein hochauflösendes Gehör. Sie können anhand einer geringen Zeitverzögerung zwischen ausgesendetem Echoortungsruf und dem Echo die Entfernung von Objekten bestimmen. Je nach Spezies und deren spezifischer Ortungsstrategie gibt es unterschiedliche Typen von Ortungslauten. Die meisten Fledermäuse verwenden frequenzmodulierte (FM) Ortungssignale und zählen zu den FM-Fledermäusen. CF-FM-Fledermäuse verwenden dagegen zusätzlich zu FM-Komponenten konstantfrequente Signalelemente (CF-FM). Diese sind besonders zur Detektion flügelschlagender Beuteinsekten in dichter Vegetation von Vorteil. Im auditorischen Kortex (AC) von Fledermäusen existieren so genannte FM-FM-Neurone, die auf die Auswertung der Verzögerungszeiten zwischen Rufaussendung (FM-Ruf) und Echo (FM-Echo) spezialisiert sind. Eine Besonderheit von FM-FM-Neuronen ist, dass sie bei CF-FM-Fledermäusen systematisch, entsprechend ihrer bevorzugten Echoverzögerungen, im AC angeordnet sind. Somit sind die FM-FM-Neurone chronotop entlang einer rostro-kaudalen Achse organisiert. Solche FM-FM-Neurone wurden bislang auch in FM-Fledermäusen nachgewiesen, jedoch waren sie nicht chronotop organisiert. Ein Ziel dieser Promotionsarbeit war es, FM-FM-Neurone bei der FM-Fledermaus Carollia perspicillata hinsichtlich ihrer Eigenschaften und ihrer räumlichen Anordnung im AC zu untersuchen. Die Befunde der vorliegenden Studie an C. perspicillata zeigen, dass alle untersuchten Neurone im dorsalen AC sowohl auf hochfrequente Reintöne als auch auf FM-FM-Stimulation reagierten. Die Echoverzögerungen, auf welche die Neurone im Areal reagierten, lagen zwischen 1 und 32 ms, was einer Distanz zwischen Fledermaus und Objekt von 16 cm bis 5,3 m entspricht. Überraschenderweise waren die kortikalen FM-FM-Neurone bei C. perspicillata chronotop organisiert, ähnlich wie bei insektenfressenden CF-FM-Fledermäusen. Warum eine chronotope Anordnung von FM-FM-Neuronen im AC bei CF-FM-Fledermäusen von Nutzen sein kann, ist nicht geklärt. Bislang wurde vermutet, dass eine systematische Anordnung die Zeitverarbeitungsprozesse optimiert und vor allem beim Insektenjagen in dichter Vegetation vorteilhaft sein könnte. Der vorliegende Befund ist außergewöhnlich, da er zeigt, dass auch bei der überwiegend frugivoren Fledermaus C. perspicillata FM-FM-Neurone chronotop angeordnet sind, und damit verdeutlicht, dass der funktionelle Rückschluss hinsichtlich des Beutefangs neu diskutiert werden muss. Neben der Charakterisierung von FM-FM-Neuronen bei adulten C. perspicillata war Ziel der vorliegenden Arbeit, die postnatale Entwicklung des AC im Hinblick auf die Frequenzrepräsentation zu untersuchen. Während der Entwicklung von C. perspicillata wurden drei wichtige Veränderungen festgestellt: (1) Das Audiogramm zeigt, dass der Hörbereich von Neugeborenen charakteristische Frequenzen (CF) zwischen 15 und 80 kHz aufweist. Dieser Frequenzbereich entspricht etwa 72% des Hörbereichs von Adulten. Während der ersten vier postnatalen Entwicklungswochen findet eine Frequenzverschiebung um etwa 0,4 Oktaven hin zu höheren Frequenzen statt. Insgesamt erhöhen sich die CF der Neurone im dorsalen AC von Neugeborenen bis hin zu Adulten um 30 kHz. (2) Die Sensitivität der hochfrequenten Neurone nimmt während der ersten postnatalen Woche um 15 dB zu und bleibt ab dieser Entwicklungsphase relativ konstant. (3) Die Sensitivität der tieffrequenten Neurone im ventralen AC nimmt im Laufe der Entwicklung um etwa 30 dB zu. Die CF der tieffrequenten Neurone sinken unerwartet während der postnatalen Entwicklung von Juvenilen zu Adulten um etwa 10 kHz. Diese Ergebnisse könnten auf eine bidirektionale Ausreifung der Cochlea hinweisen. Eine dritte ontogenetische Teilstudie der vorliegenden Arbeit befasste sich erstmalig mit den FM-FM-Neuronen und deren Organisation während der postnatalen Entwicklung. Die Befunde zeigen, dass während der Ontogenese drei wichtige Modifikationen auftreten: (1) Bereits bei Neugeborenen liegt der Anteil an FM-FM-Neuronen bei 21% im Vergleich zur Aktivität auf Reintöne. Dieser Anteil nimmt in der ersten Entwicklungswoche auf 56% zu und steigt einhergehend mit der beginnenden Flugtüchtigkeit der Tiere in der dritten Entwicklungswoche abrupt auf 84%. (2) Bei Neugeborenen werden im Vergleich zu älteren Entwicklungsphasen ausschließlich Entfernungen zwischen Fledermaus und Objekt von 50 cm bis 2,5 m auf neuronaler Ebene mittels FM-FM-Neurone codiert. Bereits nach der ersten postnatalen Woche sind die CD ähnlich verteilt wie bei adulten Tieren. Die Sensitivität an den CD nimmt während der Entwicklung vom Neugeborenen zum Adulten um etwa 20 dB zu. (3) Bereits bei Neugeborenen sind die FM-FM-Neurone im dorsalen AC chronotop angeordnet und über alle Altersgruppen hinweg bleibt die Chronotopie bestehen. Die Befunde der vorliegenden Studie zeigen erstmalig, dass die kortikalen Zeitverarbeitungsareale und die Chronotopie pränatal angelegt werden.
Neuere Daten weisen p53 eine wichtige Rolle in der Verarbeitung von Mangelsignalen zu und deuten darauf hin, dass p53-abhängige molekulare Mediatoren des Warburg-Effektes Glukoseverbrauch und mitochondriale Funktion regulieren. Wir stellten deshalb die Hypothese auf, dass p53-wildtyp (p53wt) in Gliomzellen den metabolischen Bedarf reduzieren kann, der durch deregulierte Signaltransduktionsprozessen unter Mangelbedingungen zu Stande kommt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl die shRNA-vermittelte p53-Gensuppression als auch die Temperatur-sensitive dominant-negative p53V135A Mutante in humanen p53wt-Gliomzellen Glukoseverbrauch und Laktatproduktion erhöht, den Sauerstoffverbrauch reduziert und den Hypoxie-induzierten Zelltod steigert. Überdies konnte beobachtet werden, dass eine zelluläre p53-Suppression die Expression von Synthesis of Cytochrome c Oxidase 2 (SCO2), eines Effektors, der in der Atmungskette benötigt wird, reprimiert. Die Restoration von SCO2 in p53wt-defizient-Zellen konnte Glukoseverbrauch, Laktatproduktion und Sauerstoffverbrauch wieder normalisieren, und vermittelte zugleich eine Resistenz gegenüber Hypoxie von Rotenone, einem Inhibitor des Komplex I der Atmungskette, abhängige Weise. Dies zeigte, dass die SCO2-vermittelten Effekte von einer intakten oxidativen Phosphorylierung abhängig waren. Schließlich vermittelte eine Gensuppression von SCO2 in p53wt-Gliomzellen eine Sensibilisierung dieser Zellen gegenüber moderater Hypoxie. Es konnte auch gezeigt werden, dass p53 und HIF-1alpha miteinander kooperieren, um SCO2 unter Hypoxie zu induzieren, was suggeriert, dass i) SCO2 ein neues HIF-1alpha Zielgen sein könnte und ii) SCO2 ein neues Zielprotein darstellen könnte, um Atmung und ROS-Prävention über HIF-alpha zu modulieren. Diese Befunde deuten darauf hin, dass Gliomzellen einen Nutzen aus dem Aufrechterhalten eines p53wt-Status erzielen können, da dies ihre Vulnerabilität gegenüber moderater Tumor-Hypoxie reduzieren kann, und dass dieser Effekt SCO2-vermittelt ist. Dennoch konnte die Sensitivität von p53wt-defizient-Zellen gegenüber hochgradiger Hypoxie-induziertem Zelltod nicht über die Effekte von SCO2 erklärt werden, da diese Oxidase ihre Funktionen nur unter ausreichend oxyschen Bedingungen erfüllen kann. Um die Mechanismen aufzuklären, die p53wt-Zellen vor hochgradiger Hypoxie Schutz verleihen, wurde die Rolle von TIGAR (Tp53 Induced Glycolysis and Apoptosis Regulator), eines weiteren kürzlich charakterizierten metabolischen p53-Zielgens, untersucht. TIGAR zeigt Ähnlichkeit mit der Fruktose-Bisphosphatase-2-Domäne des bifunktionalen Enzyms 6-Phosphofrukto-2-Kinase/Fruktose-2,6-Biphosphatase 2, und reduziert die intrazellulären Konzentrationen von Fruktose-2,6-Bisphosphat (FBP-2). FBP-2 ist ein Glykolyse-Regulator, der in höheren Konzentrationen die Glykolyse hemmt und den Pentose-Phosphat-Weg (PPP) induziert, was zu einer Verringerung der intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies-Konzentrationen (ROS) führt. Die Überexpression von TIGAR in p53wt-Zellen verstärkte die Glykolyse-Hemmung unter normoxischen Bedingungen und erlaubte oxidative Phosphorylierung als kompensatorischen metabolischen Mechanismus. Zudem förderte TIGAR die Expression von Lon, einer Protease, die Untereinheiten der Atmungskette modulieren kann, und zugleich als Radikalfänger fungiert. Jedoch reduzierte TIGAR die Expression von SCO2. Die Restoration von TIGAR in p53wt-defizient-Zellen konnte die Sensibilität gegenüber hochgradiger Hypoxie aufheben. TIGAR reduzierte auch die ROS-Menge und verringerte die Sensitivität gegenüber oxidativen Stress. Zugleich sensibilisierte die Gensuppression von TIGAR in p53wt-Gliomzellen diese Zellen vor hochgradiger Hypoxie. Zudem korrelierte die Expression von HIF-1alpha mit der TIGAR-Expression, was eine neue Rolle von HIF-1alpha in der Regulation des Hypoxie-induzierten Zelltodes und der Protektion vor ROS vermuten ließ. Die Expression der Transketolase-Like-1 (TKTL1), eines Isoenzym der Transketolase im Pentose-Phosphat-Weg, ist in vielen Tumoren hochreguliert. Es wurde spekuliert, dass TKTL1 Zellen Schutz vor oxidativem Zellstress vermitteln kann. Zugleich ist bekannt, dass TKTL1 mit hohen phospho-Akt-Mengen in Gliomen korreliert. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass TKTL1 ein indirektes p53-Zielgen ist, welches über TIGAR reguliert werden kann. Eine Suppression der TKTL1-Expression in TIGAR-exprimierenden Zellen konnte die über TIGAR vermittelten protektiven Effekte gegenüber endogenen ROS, oxidativem Stress und Hypoxie-induziertem Zelltod aufheben. Folglich wurde hier ein bis jetzt unbekannter Zusammenhang zwischen TIGAR, TKTL1 und HIF-1alpha entdeckt. Ebenso konnte eine TKTL1-Suppression mittels siRNA wie die TIGAR-Suppression die HIF1-alpha-Transaktivierungsfähigkeit reduzieren, was zu der Vermutung Anlass gab, dass TKTL1 HIF1-alpha unter Hypoxie reguliert.
Der tägliche und jahreszeitliche Wechsel in den Lichtverhältnissen bedeutet für alle Lebewesen eine regelmäßige und fundamentale Veränderung ihrer Lebensbedingungen. Mit Hilfe einer Inneren Uhr können Lebewesen regelmäßige Veränderungen ihrer Umwelt antizipieren. Diese Innere Uhr gewährleistet die Generierung eines endogenen, zirkadianen Rhythmus und dessen Synchronisation mit der Umwelt. Bei Wirbeltieren werden diese Funktionen durch einen spezifischen neuronalen Schaltkreis im Gehirn, dem photoneuroendokrinen System (PNS), erfüllt. Das Pinealorgan ist ein essenzieller Bestandteil des PNS. Dort werden photoperiodische Reize und Signale vom endogenen Oszillator in die Synthese des Neurohormons Melatonin umgesetzt. Die vom zentralen Oszillator im SCN gesteuerte Freisetzung von Noradrenalin (NA) aus sympathischen-postganglionären Nervenfasern in das Pinealorgan ist der entscheidende Reiz zur nächtlichen Ankurbelung der Melatoninbiosynthese. Melatonin wird ausschließlich in der Nacht gebildet und fungiert daher als ein Zeithormon. Unmittelbar nach der Synthese wird das Melatonin in die Blutbahn abgegeben und liefert allen Zellen, die mit spezifischen Melatoninrezeptoren ausgestattet sind, die entsprechenden Licht- und Zeitinformationen. NA bewirkt in allen untersuchten Säugetierarten die Aktivierung des Schlüsselenzyms der Melatoninbiosynthese, der AANAT. Die zellulären und molekularen Regulationsmechanismen für die AANAT unterscheiden sich jedoch artspezifisch. So ruft NA in Pinealozyten der Ratte die cAMP/PKA/pCREB-vermittelte Aktivierung der Transkription des Aanat Gens hervor, wogegen in Pinealozyten des Rindes NA die Regulation der proteasomalen Proteolyse des AANAT Proteins kontrolliert. Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit war es, zelluläre und molekulare Mechanismen der noradrenergen Signaltransduktionskaskade zu identifizieren, welche für die Steuerung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan von Säugetieren verantwortlich sind. Deshalb wurden in kultivierten Pinealozyten der Ratte und des Rindes sowohl transkriptionale als auch posttranslationale Regulationsmechanismen untersucht, welche durch NA gesteuert und an der Regulation des Schlüsselenzyms der Melatoninbiosynthese, der AANAT, beteiligt sind. Mit Hilfe der Immunzytochemie konnte erstmalig das subzelluläre Verteilungsmuster sämtlicher bekannter regulatorischer (R)-Untereinheiten der PKA Typ I und II in Pinealozyten der Ratte nachgewiesen werden. Ebenso wurden die A Kinase Anker Proteine (AKAP) 95 und 150 immunzytochemisch dargestellt, wobei zwischen der AKAP 150-Immunreaktivität (IR) und der IR von RII alpha bzw. RII beta eine weitgehende Kolokalisation in der Nähe der Zellmembran der Pinealozyten vorlag. Diese Kolokalisationen deuten eine funktionelle Interaktion der PKA Typ II mit AKAP 150 in Pinealozyten der Ratte an. Keine Funktion bei der Steuerung der Melatoninbiosynthese scheinen der cAMPregulierte Austauschfaktor EPAC und die monomere GTPase Rap zu besitzen. So konnte eine Stimulation kultivierter Pinealorgane mit 8-CPT-2'-O-Me-cAMP, einem EPAC-spezifischen cAMP-Analog, einzeln oder in Kombination mit Noradrenalin (NA) weder den AANAT Proteingehalt noch die Freisetzung von Melatonin beeinflussen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass die cAMP-vermittelte Aktivierung der Melatoninbiosynthese ausschließlich auf die PKA zurückzuführen ist. Ebenso beeinflussten weder NA noch 8- CPT-2'-O-Me-cAMP den Aktivitätszustand von ERK 1 und 2. Eine Erhöhung des cAMP-Spiegels in Pinealozyten der Ratte scheint somit keinen Einfluss auf den Aktivitätszustand von ERK 1 und 2 im Pinealorgan der Ratte auszuüben. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die schnelle Dephoshorylierung von pCREB eine entscheidende Funktion bei der akuten Herabregulation des CRE-tragenden Aanat Gens darstellt und somit eine wichtige Rolle für die Beendigung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan der Ratte spielt. Nach Entzug des NA-Stimulus kam es innerhalb von 30 Minuten zu einer fast vollständigen pCREB Dephosphorylierung, die mit einer Abnahme der Aanat mRNA, des AANAT Proteingehalts und der Melatoninbiosynthese einherging. Die pCREB Dephosphorylierung und die Abnahme der Melatoninbiosynthese konnten durch PSP-Inhibitoren verhindert werden. Aufgrund der pharmakologischen Untersuchungen und des intrazellulären Verteilungsmusters scheint die PSP 1 die pCREB Dephosphorylierung im Zellkern der Rattenpinealozyten zu steuern. Mit Hilfe eines Ko-Immunpräzipitationsansatzes wurde erstmalig eine NA-abhängige Komplexbildung von AANAT und Protein 14-3-3 in Pinealozyten der Ratte und des Rindes dargestellt. Die vorliegenden Untersuchungen belegen somit, dass Tierarten, welche generell eine unterschiedliche molekulare Strategie zur Regulation der Melatoninbiosynthese entwickelt haben, mit der NA-abhängigen Ausbildung des AANAT/Protein 14-3-3 Komplexes jedoch einen gemeinsamen Mechanismus zur Regulation des AANAT Proteins besitzen. Ferner wurde die funktionelle Bedeutung des Cannabinoidsystems für die Steuerung der Melatoninbiosynthese im Pinealorgan der Ratte untersucht. Mit Hilfe der Immunhistochemie und des Immunoblotverfahrens konnten erstmalig CB 1- und 2 Rezeptorproteine im Pinealorgan der Ratte dargestellt werden. Die Stimulation kultivierter Pinealorgane der Ratte mit THC hatte keinen Einfluss auf den pCREB- und AANAT Proteingehalt, konnte jedoch die NA-induzierte Aktivierung des AANAT Proteins und die Melatoninfreisetzung hemmen. Das Pinealorgan der Ratte und des Rindes dient als ein gut geeignetes Modellsystem zum Studium von Signalskaskaden, da hier Noradrenalinreize in ein definiertes, einfach messbares Endprodukt, die Biosynthese und Sekretion des Neurohormons Melatonin, umgewandelt werden. Die in dieser Arbeit aufgedeckten Signaltransduktionsprozesse liefern daher nicht nur neue Einblicke in die Regulationsprozesse der Melatoninbiosynthese, sondern dienen ebenso dem besseren Verständnis von Signalübertragungs- und Signalverarbeitungsprozessen in komplexeren neuronalen und neuroendokrinen Systemen.
Protease-aktivierbare Retroviren bieten die Möglichkeit des gezielten Gentransfers in solche Tumorzellen, die an der Zelloberfläche proteolytisch aktive Proteasen, wie beispielsweise Matrix Metalloproteasen (MMP), exprimieren. Hierfür wird zunächst der Zelleintritt der Retroviren durch eine mit den Hüllproteinen fusionierte Blockierungsdomäne verhindert. Zwischen dieser Blockierungsdomäne und dem Hüllprotein befindet sich ein für eine zelluläre Protease fungierender Substratlinker, worüber die Blockierung entfernt und der natürliche Infektionsmechanismus der Retroviren wieder hergestellt wird. In Bezug auf die Tumortherapie mittels eines solchen Gentransfers ist es jedoch unmöglich vorherzusagen, welches Protease- Substrat für einen bestimmten Tumortyp am besten geeignet ist. Deshalb wurden im Rahmen dieser Arbeit retrovirale Protease-Substrat-Bibliotheken entwickelt, um erstmalig die Substrate der tumorassoziierten MMPs in lebenden Tumorzellen zu selektionieren und damit verbunden MMP-aktivierbare Retroviren mit verbesserten molekularen Eigenschaften für den gezielten Gentransfer zu evolvieren. Hiefür wurden, ausgehend von einem Protease-aktivierbaren Retrovirus, welches als Substratlinker das MMP-Standardsubstrat P-L-G-L-W-A präsentiert, Retroviren erzeugt, in denen dieses Substrat kombinatorisch diversifiziert wurde. In einer ersten retroviralen Protease-Substrat-Bibliothek wurde zunächst an drei Stellen zu P-X-G-L-X-X unter Ausschluss der Aminosäure Arginin diversifiziert, um die Selektion durch Proprotein-Konvertasen wie Furin zu vermeiden. Anschließend erfolgte die Selektion der Virus-Bibliothek in der Modell-Tumorzelllinie HT1080, wofür hier das entsprechende Protokoll etabliert wurde. Die Substratlinker der am häufigsten selektionierten Retroviren enthielten die beiden Konsensusmotive P-QG- L-Y-[Q/K] und P-Q-G-L-Y-[A/S]. Zur Identifizierung der optimalen Aminosäuren an allen sechs Positionen des Substrates wurden in einer zweiten Bibliothek die variierten Positionen auf Grundlage der selektionierten Konsensusmotive fixiert und die zuvor konstanten Positionen zu X-Q-X-X-Y-[Q/A] diversifiziert. Die aus dieser Bibliothek selektionierten Retroviren enthielten das Konsensusmotiv P-Q-G-[L/I/V]-Y-[Q/A], womit die zuvor selektionierten MMP-aktivierbaren Retroviren bestätigt wurden. Die biochemische Charakterisierung von mit den selektionierten Substratlinkern rekonstituierten Retroviren zeigte, dass ihre Substratlinker eine bemerkenswerte Verbesserung der Spaltung durch MMP-2 und eine erhöhte Inkorporation der dazugehörigen Hüllproteine in die Partikel aufwiesen. Außerdem ermöglichten die selektionierten Substratlinker den entsprechenden Retroviren sich schneller innerhalb der Zellpopulation auszubreiten, ohne dabei die Abhängigkeit von der MMP-Aktivierung zu verlieren. Darüber hinaus konnte sowohl die Kinetik des Zelleintritts bis zu 10-fach als auch die Infektiosität bis zu 1000-fach gegenüber dem parentalen Virus, das den Standard-Substratlinker trug, gesteigert werden. Letztendlich waren hierfür nur zwei selektionierte Aminosäureaustausche gegenüber dem MMP-Standardsubstrat verantwortlich, nämlich Glutamin (Q) und Tyrosin (Y), die zu dem Motiv P-Q-G-L-Y-A führten. Ausschlaggebend für die beschriebenen Selektionen waren die mehrfache Abdeckung der kombinatorischen Vielfalt der Substratlinker auf Partikel-Ebene bereits vor Selektion sowie die langsame Erhöhung des angelegten Selektionsdrucks während der Selektion. Dadurch konnte eine Deletion des kodierenden Bereichs der Blockierungsdomäne (EGF) im Virusgenom vermieden werden. Als treibende Kraft der Selektion stellte sich die proteolytische Aktivierung der selektionierten Retroviren an der Zelloberfläche heraus. Die Ergebnissen führen schließlich zu einem Modell der MMP-Aktivierung EGF-blockierter Retroviren. Danach binden die Partikel an die EGF-Rezeptoren der Zelloberfläche und gelangen so in die räumliche Nähe des MMP-Aktivierungskomplexes. Daraufhin werden sie proteolytisch aktiviert und infizieren die Zielzellen. Die hier selektionierten Substratlinker bzw. die entsprechenden Viren sind in Bezug auf die proteolytische Aktivierung optimal an die gewählte Tumorzelllinie angepasst.
Holzkohlen aus archäologischen Grabungen im Sahel von Burkina Faso belegen die regionale Geschichte der Gehölzvegetation über die letzten 2000 Jahre. Der Bodenbau, den die sesshaft lebende Bevölkerung seit Beginn unserer Zeitrechnung intensiv betreibt, veränderte die Zusammensetzung der Gehölzvegetation vor allem auf den Dünen der Region. Im Vergleich mit der heutigen Vegetation lassen sich zudem klimatische Veränderungen nachweisen. Untersucht wurden über 9000 Fragmente aus sieben verschiedenen archäologischen Grabungen. Sechs Inventare stammen aus Siedlungshügeln. Bei einem Fundplatz handelt es sich um einen Hausgrundriss. Insgesamt wurden 37 Holzkohletypen erkannt und dokumentiert. Die untersuchten Inventare der Siedlungshügel zeigen, dass vor allem die Gehölzvegetation der Dünen und der Galeriewälder zur Brennholzentnahme genutzt wurde. Je nach Lage der Siedlung und dem Schwerpunkt der Wirtschaftsweise können verschiedene Taxa mit höheren Anteilen vertreten sein, möglicherweise zusätzlich verstärkt durch die anthropogene Auswahl von verfügbarem Brennholz. Im Vergleich der Holzkohleinventare lassen sich für die Eisenzeit regionale Entwicklungen erkennen. Die natürlichen Gehölzbestände auf den Dünen, unter anderem aus verschiedenen Akazienarten, wurden, zumindest in der Umgebung der Siedlungen, verdrängt. Stattdessen nahmen aufgrund der selektiven Förderung durch den Menschen die Anteile der Gehölze der Kulturbaumparks, Vitellaria paradoxa und Faidherbia albida zu. Die Landwechselwirtschaft förderte zudem Brachearten insbesondere aus der Familie der Combretaceae. In der späten Eisenzeit nahm Guiera senegalensis zu, die von starker Beweidung der Brachen profitiert. Der Unterwuchs der Galeriewälder an den mares und Wasserläufen wurde mit zunehmender Besiedlungsdauer in der Umgebung der einzelnen Fundplätze aufgelichtet, die Anteile von Combretum micranthum gehen in den Inventaren der einzelnen Siedlungsplätzen jeweils zurück. Klima und Vegetation waren während der Eisenzeit sudano-sahelisch. Auf feuchteres Klima verweisen Vitellaria paradoxa und Detarium microcarpum, die deutlich höhere Niederschläge benötigen, als sie die Region heute erhält. Der hohe Anteil von Taxa, die heute weiter südlich verbreitet sind, belegt zudem den sudanischen Aspekt der Gehölzvegetation. Der Vergleich der anthrakologischen mit den palynologischen und karpologischen Ergebnissen zeigt, dass die Gehölzvegetation sich unter zunehmend arideren Bedingungen in den letzen 2000 Jahren anthropozoogen stark verändert hat. Das Klima scheint aber während der Eisenzeit von 0-1500 AD vergleichsweise stabil gewesen zu sein. Erst danach haben die Niederschläge sich soweit verringert, dass in den letzten 500 Jahren einige sudanische Taxa aus der Region verschwanden, die noch während der Eisenzeit zur regionalen Flora gehört hatten, zum Beispiel Vitellaria paradoxa, Detarium microcarpum und Lannea sp. Der Vergleich der eisenzeitlichen Holzkohleflora mit der rezenten Dynamik der Vegetation und mit der Verbreitung einiger Arten um die Mitte des 20. Jahrhunderts zeigt, dass einige Taxa, wie Terminalia sp. möglicherweise erst in den letzten fünfzig Jahren aus der Region verschwunden sind.
Zur Evolution der Hirnmorphologie und Anpassungen an Extremhabitate im Taxon Poecilia (Teleostei)
(2020)
Diese Dissertation befasst sich mit den Auswirkungen kontrastierender Umweltbedingungen auf die Gehirnmorphologie von neotropischen Fischen der Gattung Poecilia, welche unterschiedlichen abiotischen sowie biotischen Stressoren ausgesetzt sind. Da das Gehirn der Teleostei ein energetisch kostspieliges Organ und viel plastischer ist als z. B. bei Säugetieren, stellt sich die Frage, wie die Gehirnanatomie durch divergierende ökologische Faktoren in verschiedenen Umgebungen geformt wird, die ´extreme´, ´ressourcenbeschränkte und günstige´ Umgebungen repräsentieren. Zur Beantwortung dieser Frage wurden intraspezifische Studien an freilebenden und Laborindividuen von Poecilia-Arten durchgeführt, um die evolutionäre und ökologische Formgebung des Gehirns besser verstehen zu lernen. Im ersten Teil der Arbeit wurden Gehirnvolumina verglichen zwischen reproduktiv isolierten Populationen des neotropischen Fisches Poecilia mexicana (Ntotal = 95), die in Dunkelheit leben (Cueva Luna Azufre), in einem nahegelegenen Oberflächenhabitat (El Azufre), welcher giftigen Schwefelwasserstoff enthält und einer Kombination aus beiden Stressoren Dunkelheit und H2S (Cueva del Azufre). In einer zweiten Studie wurde auf anatomische („konvergente“) Veränderungen im Teleost-Gehirn entlang eines natürlichen Gradienten von Sulfidkonzentrationen getestet. Hierfür wurden Gehirne (Ntotal = 100) von P. mexicana verglichen, die in drei Flusssystemen im Süden Mexikos unabhängig voneinander eine erhöhte Toleranz gegenüber Schwefelwasserstoff (H2S) entwickelt haben. Dazu gehörten eine phylogenetisch alte H2S-adaptierte Form (P. sulphuraria) und zwei P. mexicana Formen, welche frühere Stufen der Anpassung an H2S darstellen. Zur Überprüfung des Einflusses anderer abiotischer und biotischer Faktoren auf die Morphologie der Gehirnregionen wurde eine weitere Studie durchgeführt. Hierbei wurden die phänotypischen Variationen der Gehirnregionen und der Körpermorphologie von Poecilia vivipara-Populationen (Ntotal = 211) aus Lagunen des Restinga de Jurubatiba Nationalpark untersucht, die sich in abiotischen Umgebungsbedingungen, insbesondere in Salzgehalt, Wassertransparenz, Phosphat und Nitrat sowie biotischen Faktoren wie Prädatorendichte unterschieden. Die erste Studie zeigte lebensraumabhängige Unterschiede bei freilebenden Fischen. Bei Fischen, die in Dunkelheit ohne H2S (LA) oder in Oberflächenhabitaten mit H2S lebten, wurden vergrößerte telenzephale Lappen, kleinere Augen und optische Tekta gefunden. Fische aus der sulfidischen Höhle (CA) zeigten zusätzlich vergrößerte Corpus cerebelli. Der Vergleich mit den Gehirnen von Labor aufgezogenen weiblichen Fischen (Ntotal = 25) zeigt eine allgemeine Verringerung der Gehirngröße sowie eine geringe Abweichung der Gehirngröße zwischen Labor aufgezogenen und freilebenden Fischen. Auch in der zweiten Studie zeigten alle in H2S-haltigen Lebensräumen lebenden Fische kleinere Augen, ein kleineres optisches Tektum und ein kleineres Gehirnvolumen, jedoch größere Corpus cerebelli und Hypothalamusvolumen als Fische aus nicht-sulfidischen Lebensräumen. Flusssystem-spezifische Effekte wurden für die telenzephalen Lappen, das gesamte Gehirn und die Augengröße festgestellt, da die Geschlechter je nach Quelle des Flusssystems unterschiedlich auf das Vorhandensein von H2S reagierten. Die dritte Studie zeigt auch, dass andere Umwelteinflüsse bemerkenswerte Verschiebungen im Gehirn und in den Gehirnregionen verursachen können. Fische, die im Süßwasser leben, zeigten eine verringerte Gesamthirngröße, telenzephale Lappen, Corpus cerebelli und Hypothalamusvolumen. Darüber hinaus zeigten Fische aus Salzwasserlagunen (hypersalin), ein verringertes Volumen des optischen Tektum, während telenzephale Lappen, Corpus cerebelli und Hypothalamusvolumen im Vergleich zu Süßwasserfischen vergrößert waren. Im Brackwasser lebende Fische wiesen im Vergleich zu Süß- und Salzwasserfischen die größten Gehirnregion-Volumen auf. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse über die Lagunen hinweg auch Unterschiede in der Morphologie der Kopf- und Augendurchmesser. Bei Augengröße, Kopfgröße, optischem Tektum Volumen, Hypothalamusvolumen und dem Gesamthirnvolumen wurde ein sexueller Dimorphismus beobachtet. Die dargestellten Ergebnisse verdeutlichen, dass die gefundenen Muster nahezu mit denen von H2S-Fischen identisch sind. Die ausgeprägten Unterschiede in den Hirnregionen zwischen freilebenden Fischen können als Teil der Mosaikentwicklung interpretiert werden. Die Ergebnisse der Laborpopulation zeigen jedoch eine hohe phänotypische Plastizität. Diese Studie unterstreicht damit die Bedeutung der Kombination der Untersuchung von freilebenden mit im Labor lebenden Individuen zur Beantwortung von Fragen der Gehirnentwicklung. Kleinere Augen und ein kleineres optisches Tektum, aber größere telenzephale Lappen wurden auch bei Fischen aus einem sulfidischen Oberflächenhabitat in der Nähe einer der Höhlen gefunden und sind den Ergebnissen zufolge das Resultat begrenzter Sehkraft in trüben sulfidischen Lebensräumen.
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Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Modellierung der neuronalen Prozesse, die auditorischen Lokalisationsleistungen zugrunde liegen. Viele der hierzu aktuell diskutierten Modellvorstellungen lassen sich auf ein von L. Jeffress bereits in der Mitte des letzten Jahrhunderts vorgeschlagenes Netzwerkmodell zurückführen: Nach Jeffress werden interaurale Laufzeitunterschiede (ITDs) zwischen beiden auditorischen Pfaden in einem Netzwerk von Detektorneuronen (Koinzidenzdetektoren) ausgewertet. Systematische Laufzeitunterschiede resultieren aus der Architektur des Netzwerks, die sogenannte Delay-Lines realisieren soll. Trotz einer Reihe von Evidenzen für das im auditorischen Diskurs inzwischen als Paradigma geltende Modell, findet Kritik am Jeffress-Modell in jüngerer Zeit zunehmend Beachtung und Interesse. So argumentieren B. Grothe und D. McAlpine gegen die Übertragung des Delay-Line Modells auf die Verhältnisse bei Säugern. Zentrales Moment ihrer Kritik ist eine Afferenz der MSO aus einem weiteren Teilgebiet der Olive (MNTB). Wesentlicher Effekt der von der Projektion gebildeten inhibitorischen Synapse ist eine relative Verschiebung der Best-Delays der MSO-Zellen zur Präferenz contralateraler Delays. Damit besteht nicht nur zu der nach dem Jeffress-Modell notwendigen Aufteilung der Best-Delays ein Widerspruch, die ITDs liegen bei tiefen Frequenzen für kleine Säuger aufgrund deren geringer Kopfgröße außerhalb des Bereichs physiologisch auftretender Delays. In dieser Arbeit werden die Ergebnisse von Grothe und McAlpine durch Compartmental Modeling analysiert. Gegenüber einer Simulationsstudie aus den Gruppen von Grothe und McAlpine werden von uns durch explizite Modellierung der Dendriten zusätzliche Effekte der Inhibiton beschrieben. Wir stellen dar, wie die Topographie von Inhibiton und Excitation die Verarbeitungsprozesse in Bipolar-Zellen durch dendritische Low-Pass Filterung und Kontrastverst ärkung zwischen minimaler und maximaler Spikerate unterstützt. Unsere Ergebnisse können die empirisch nachgewiesene Verteilung excitatorischer (distaler) und inhibitorische (proximaler) Synapsen erklären. In der abschliessenden Analyse der von den Bipolar-Zellen generierten Spike Trains wird das von Grothe und McAlpine entworfene alternative ITD-Codierungsmodell auf der Basis von Ratencodes problematisiert: Bislang erklärt ihr Vorschlag nicht, wie organismische Lokalisationsleistungen auf der Basis weniger Spikes realisiert werden können.