Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Myxobacteria are on order of Gram-negative, soil dwelling bacteria that feature an impressive number of properties: they can glide on solid surfaces by using two different motility motors, subsist by preying on other microorganisms, are often producers of multiple natural products, and upon adverse environmental conditions, they are able to form multicellular structures called “fruiting bodies”. The process, in which these macroscopically visible structures arise from independent single cells, has been the predominant subject of myxobacterial research for many decades. More precisely, researchers have strived for the discovery of genes, proteins and small molecules that act as signals, receivers or modulators of this complex process. In this regard, the species Myxococcus xanthus has evolved into the model organism due to its relatively simple and reliable handling in a laboratory environment. The research underlying this thesis focused on the identification and biosynthesis of lipids that may act as intercellular signaling molecules during the course of fruiting body formation of the myxobacterium Myxococcus xanthus as part of the “E-signal” system. In general, lipids containing branched-chain fatty acids with an uneven number of carbon atoms were found to be important players in this particular process. Nevertheless, their exact roles remain largely unknown as of this day. The first publication that is part of this thesis deals with an aspect that even strengthened the importance of role of iso-branched compounds in myxobacteria: myxobacterial metabolism is able to transform precursors of iso-lipids to isoprenoids. It addresses the question whether isoprenoids in general are important for fruiting body formation. Phenotypic analysis of mutants impaired in the biosynthesis of the central isoprenoid precursor 3-hydroxymethylglutaryl-Coenzyme A (3-HMG-CoA) from acetate and/or branched chain keto acids and their genetic and metabolic complementation clearly showed that isoprenoids are essential for fruiting body formation and confirmed that leucine derived isovalerate is an important source for isoprenoid precursors in myxobacteria. The second, and by far and away most tedious and sophisticated study, addressed the question as to how myxobacteria form fatty acid derived iso-branched ether lipids and to what extent they are important for fruiting body formation and sporulation. In a previous study, those unusual lipids were identified as specific biomarkers for myxobacterial development. No biochemical pathways to ether lipids specific for prokaryotes were known by then. In this study, a putative candidate gene that may be in involved in ether lipid biosynthesis was investigated. A combination of gene disruption and complementation experiments, phenotypic analysis and monitoring of ether lipid formation by means of GC-MS demonstrated its involvement in myxobacterial ether lipid biosynthesis and the importance of these lipids for the developmental process. Heterologous expression and biochemical testing of this gene together with in-silico sequence analysis and docking experiments confirmed the functions of its predicted domains. The discussion section provides an additional suggestion on how the ether bond formation is performed. Furthermore and most importantly, iso-branched ether lipids were found to be essential for sporulation but not for fruiting body formation. In summary, one or several molecules derived from an iso-branched alkylglycerol seem to play a role during sporulation in M. xanthus and a multidomain enzyme unique for myxobacteria is involved in their biosynthesis. The last manuscript addresses the complexity of lipid metabolism in myxobacteria. Prior to this work, there was limited knowledge about the exact composition of the myxobacterial lipidome and no method was available to monitor putative changes in the myxobacterial lipidome down to the single molecular species for studying lipid biosynthesis or regulation. An ultra-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry based method with electrospray ionization (UPLC-ESI-MS) utilizing standard equipment and a water/acetonitrile/isopropanol based eluent system proved to be geared for the construction of lipid profiles for wild type and mutant cells of M. xanthus and to show their differences. Fragmentation spectra based structure elucidation of lipid molecular species resulted in the identification of 99 molecular species comprising glycerophosphoethanolamines, glycerophosphoglycerols, glycerolipids, ceramides and ceramide phosphoinositols. The latter have never been described for any prokaryotes before. Three dimensional plots were created from the relative intensity differences of the single molecular ion species between the different samples to provide an efficient and versatile visualization of the data and enable the researcher to quickly detect differences.
The phylogeny of the genus Gazella and the phylogeography and population genetics of arabian species
(2014)
Biodiversity is caused by a fundamental evolutionary process: speciation. When species can spread into new habitats and are allowed to colonize new ecological niches, speciation can become accelerated and is then called radiation. This can happen, e.g., when formerly separated land masses become connected. A prime example of such a scenario is the Arabian Peninsula that connects Africa and Asia since the Oligocene (approx. 30 Ma ago). Since then, the peninsula promoted several faunal exchanges between both continents. The mammalian genus Gazella is an excellent candidate for investigating this faunal exchange. Species are distributed on both, the African and Asian continent as well as on the Arabian Peninsula that is located in between. The aim of my thesis was to cast new light on the evolution and speciation of the genus and, furthermore, to evaluate the currently problematic taxonomy to infer suggestions for improved conservation actions for threatened gazelle species. Therefore, I investigated the taxon Gazella genetically and identified factors that promoted the speciation of this diverse genus. I assessed intraspecific genetic variability for species that inhabited the Arabian Peninsula to infer the past demography of those species and to estimate the history of species divergence and past population parameters.
In the first part of my thesis I inferred a mitochondrial phylogeny based on cytochrome b gene sequences using samples of all nine extant species of Gazella and also of closely related taxa (chapter 2). Besides the monophyly of the genus Gazella two reciprocally monophyletic clades were detected that evolved in allopatry: one predominantly African and one predominantly Asian clade. Within both clades species pairs could be inferred with species being ecologically adapted to different habitats: one species is a desert-dweller (probably the ancestral character state combination), while the other one is adapted to rather mountainous and humid habitats. These adaptations also correlate with the behavior of the species with the mountainous forms being sedentary, territorial and living in small groups and the desert forms being migratory, non-territorial and living in larger herds.
The second part of my thesis focuses on the Arabian gazelle species. In a study about G. subgutturosa I could show that the Arabian form G. marica (sand gazelle)—previously recognized as a subspecies of G. subgutturosa—is genetically distinct from the nominate form (chapter 3). Moreover, a phylogenetic tree based on cytochrome b gene sequences revealed a polyphyly of G. subgutturosa and G. marica with sand gazelles being more closely related to G. leptoceros and G. cuvieri of North Africa. Consequently, I suggested the restoration to full species level for G. marica corroborating earlier conservation practices of breeding both taxa separately in captivity.
In case of G. dorcas such a genetic differentiation could not be detected (chapter 4). Despite the large distribution range from Mali in the west to Saudi Arabia in the east only low genetic variation was detectable in mitochondrial sequence data. Statistically parsimony network analyses revealed pronounced haplotype sharing across regions. Using a coalescence approach I observed a steep population decline that started about 25,000 years ago and which is still ongoing. The decline could be correlated with human hunting activities in the Sahara. Hence, hunting of G. dorcas (already in ancient times) had a much larger impact on gazelle populations than previously thought and even led to the extinction of the Arabian form of G. dorcas.
In chapter 5 of my thesis I provided a rigorous test to genetically distinguish between the potential species G. gazella and G. arabica. Previously recognized as a single species mitochondrial sequence analyses provided first hints for the separation of both taxa. But without the investigation of nuclear loci the observed pattern could also be the result of male biased dispersal combined with female philopatry. Therefore, I amplified mitochondrial sequence markers and nuclear microsatellite loci for both taxa and found support for the earlier view of two separate species. No signs of recurrent gene flow could be detected between neighboring populations of G. arabica and G. gazella. The split of both species could be estimated one million years ago and the recommendation of breeding both taxa separately in captivity for conservation purposes is fully justified.
Several populations of G. arabica suffer from a severe decline. In chapter 6 I asked whether the population occurring on the Farasan archipelago—being at stable individual numbers for decades—may serve as potential source for future reintroduction on the Arabian mainland, although the gazelles show a reduced body size. Analyzing the genetic differentiation of Farasan gazelles, a genetic cluster could be inferred being endemic to the archipelago. However, only approx. 70% of Farasan individuals were assigned to this specific cluster, while the others showed at least intermediate or even complete assignment to the mainland cluster. This indicates ongoing introgression that is probably mediated by human translocations of gazelles from and onto the islands. Considering the uniform dwarfism of Farasan gazelles, reasons for the smaller body size might be direct consequences of resource limitations, i.e., phenotypic plasticity. If the population decline on the mainland will hold on Farasan gazelles could serve as stocks for future reintroductions.
Drought stress is one of the major abiotic factors diminishing crop productivity world wide. In the course of climate change, regions which already experience dry seasons nowadays will suffer from elongated drought periods and water shortage. These climatic changes will not only have an impact on the regional flora and fauna but also on the people inhabiting these areas. It is therefore of great importance to understand the reactions of plants to drought stress to help breeding and biotechnological approaches for the benefit of new robust cereal cultures growing under low water regimes. In this dissertation four grasses of the genus Panicum, P. bisulcatum (C3), P. laetum, P. miliaceum and P. turgidum (all C4 NAD-ME) were subjected to drought stress. The plants diverse reactions were investigated on a physiological as well as on a molecular level to deepen the understanding of drought stress responses. Drought stress was imposed for a species-specific period until a relative leaf water content (RWC) of ~50 % was reached in each grass. Physiological measurements were conducted on leaves with a RWC of ~50 % investigating chlorophyll a fluorescence parameters with a Plant Efficiency Analyzer (PEA) and gas exchange parameters like the photosynthesis rate and stomatal conductance with a Gas Fluorescence Chamber (GFS-3000). Subsequent molecular analysis were conducted on leaf samples taken (RWC = 50 %) analysing different proteins and the transcriptome of the Panicum species. The physiological measurements revealed a higher photosynthesis rate for the C4 grasses under drought stress with no significant differences between the C4 species. Also the water use efficiency was significantly higher in the C4 species in comparison to the C3 species independent from the water regime supporting results from the literature. The chlorophyll a measurements revealed the strongest adaptation to water shortage in the C4 species P. turgidum followed by the C3 species P. bisulcatum. It has been shown before (GHANNOUM 2009) that the C4 photosynthesis apparatus is more prone to drought stress than the C3 apparatus – despite the higher water use efficiency. Results also suggested that the great adaptation of P. turgidum to drought stress arose from its ability to recover from drought stress (all JIP test parameters showed no significant differences between control and recovery samples). The additional down-regulation of PS II but not of PS I under drought stress also helped the plant to endure times of water shortage and facilitated the recovery when water was available again. Protein analyses on the content of PEPC, OEC and RubisCO (LSU and SSU) revealed no changes. Dehydrin 1 in contrast was strongly up-regulated under drought stress and Summary 108 recovery in all four Panicum species. The stable content of the OEC protein was therefore not the catalyst of rising K peaks measured by chlorophyll a fluorescence and a reduced OEC activity was supposed. Transcriptomic analyses revealed a myriad of differentially regulated tags. Due to unsequenced genomes, tags could only be partially (8 % maximum for P. turgidum) annotated to their specific genes. Diverse methods were therefore used to annotate the most highly regulated tags to their genes and their products. Special emphasis was put on the regulation of five gene products confirming the regulation schemata from the HT-SuperSAGE analyses. Interestingly one protein – the NCED1 – was down-regulated under stress conditions, in contrast to results from the literature. It is therefore of great importance to investigate longer lasting drought to understand the full range of drought stress adaptation. Future genome sequencing projects might also include the Panicum species investigated in this dissertation and important gene candidates with no hits (maybe completely new to the research community) might help breeding and biotechnology approaches to produce more drought resistant crop species.
Physical Biology is a field of life sciences dealing with the extraction of quantitative data from biophysical or molecular biological experiments with different levels of complexity. Such data are further used as parameters for mathematical models of the biological system. These models allow to predict reactions on external stimuli by describing the relevant molecular interactions and are therefore used for example to generate a deeper comprehension of complex human diseases. An essential technique in biophysical research on human diseases is fluorescence microscopy. This is a constantly developed toolbox comprising a large number of specific labeling strategies, as well as a broad spectrum of fluorescent probes. It is further minimal invasive and therefore suitable for measurements in living cells or organisms. The sensitivity of modern photo-detectors even allows for the detection of a single fluorescent probe with an accuracy of approximately 10 nm.
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The model-prediction was further verified by two color SMLM experiments. In this work the development and application of imaging-systems are described which provide quantitative data with single-molecule resolution for systems biological model approaches with a low degree of abstractness. In the near future, the impact of mathematical models in the research field of complex human diseases will increase. The predictions of these models will be more exact, the more detailed and accurate the input parameters will become. This work gives an impression of how quantitative data obtained by SMLM may serve as input parameters for mathematical models at the single-cell level.
Nach der Entdeckung und strukturellen Aufklärung des Ribosoms war bekannt, dass neben den Proteinen auch regulatorische RNA Sequenzen für die Steuerung biologischer Prozesse im Organismus verantwortlich sind. Dazu zählt unter anderem das trans-activation responsive element (TAR) aus HIV-1, welches am terminalen 5' Bereich (1-59) aller HIV-1 mRNAs eine identische bulge-loop Struktur ausbildet. Die basale Trans-kription des integrierten HIV Promotors ist in Abwesenheit des viralen trans-activator of transcription (Tat) sehr gering (und abhängig von zellulären Transkriptionsfaktoren). Sobald Tat exprimiert wird, bindet es zusammen mit dem humanen positive trancription elongation factor b (p-TEFb) spezifisch an TAR und aktiviert die Transkriptionsrate des viralen Genoms und die Bildung von volllängen Transkripten drastisch. Die Notwendigkeit der Tat-vermittelten Aktivierung als Grundlage einer funktionierenden HIV Replikation macht dieses System zu einem hoch interessanten Target für eine antivirale HIV Therapie. Basierend auf der Hemmung des Tat/TAR Komplexes wurde in den vergangen Jahren eine Reihe von Verbindungen identifiziert, die zwar in-vitro eine inhibierende Wirkung zeigten, aber keine von ihnen konnte bis jetzt als Therapeutikum Verwendung finden. So wäre die noch ausstehende Entdeckung eines effizienten Tat Antagonisten, der ohne die zelleigene Transkription zu beeinträchtigen eine Reduzierung der Virusreplikation von 80 - 90 % akut infizierter Zellen bewirkt, ein bedeutender Durchbruch in der HIV Forschung. Durch eine längere Behandlung von chronisch infizierten Zellen könnte so die Transkription des viralen Genoms abgeschaltet und dadurch eine Eliminierung latenter HIV Reservoirs ermöglichen werden.
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung neuartiger TAR Liganden, zunächst auf Grundlage eines nicht auf Strukturmodellen beruhenden Ligandenscreenings, gefolgt von einem strukturbasierten Ligandendesign. Bei der Suche nach potentiellen Wirkstoffen, beschränkte man die Auswahl der untersuchten Verbindungen auf Guanidin- und Amidinanaloga. Dazu zählten einfache Guanidinderivate mit unterschiedlichen aromatischen Resten sowie heterocyclische Verbindungen, wie Isochinoline, Chinazoline, Perimidine und Phenanthridine. Die Bindungsaffinitäten dieser Wirkstoffkandidaten in Bezug zu TAR wurden über einen FRET Assay nach Matsumoto[1] bestimmt. Eine Auswahl an Verbindungen wurde zudem über eine NMR Titration charakterisiert (AK Schwalbe). Dadurch konnte beobachtet werden, an welcher Position die Liganden mit der TAR RNA in Wechselwirkung treten. Bei diesen Untersuchungen zählten 1,7-
Diaminochinolin (IC50 = 150 µM), 2,4,6-Triaminochinazolin (IC50 = 40 µM) sowie 6,8-Diaminophenanthridin (IC50 = 15 µM) zu den aktivsten Verbindungen.
Um eine Aussage über die Bindungsposen treffen zu können, wurde mittels HF-docking Methoden die Komplexgeometrie energetisch optimiert. Ausgehend von diesen Bindungsmodellen entwickelte man eine Leitstruktur, die als Grundlage eines strukturbasierten Ligandendesigns diente. Im Fokus stand hierbei die Entwicklung einer GC-Basenpaar erkennenden Untereinheit. Mit 3,5-Diamino-9-methyl-3,4,9,10-tetrahydro-1H-pyrrolo[3,4-b]phenanthridin-8(2H)-on (IC50 = 45 µM) konnte ein Ligand identifiziert werden, der im NMR Titrationsexperiment ausschließlich am Basenpaar G26/C39 von TAR eine Verschiebung der Iminoprotonen induzierte. In einem weiteren Projekt versuchte man eine Selektivitätssteigerung durch simultane Adressierung zweier Bindungsstellen zu erreichen. Nachdem im NMR Experiment gezeigt werden konnte, dass 2,4,6-Triaminochinazolin mit hoher Affinität an zwei verschiedenen Bereichen der RNA bindet, wurden eine Reihe dimerer 2,4,6-Triaminochinazolinderivate mit unterschiedlich langen Linkern hergestellt. Mit diesem Ansatz gelang es den hoch affinen Liganden N6,N6'-(1,4-phenylenbis(methylen))bis(chinazolin-2,4,6-triamin) (IC50 = 150 nM) zu identifizieren.
Alzheimer’s disease (AD) is a common, age associated neurodegenerative disease that manifests as progressive dementia and is characterized by accumulation of the amyloid beta (Aβ) peptide which is a processing product of a transmembrane protein termed Alzheimer Amyloid Precursor Protein (APP). The Aβ peptide is generated by a sequential proteolytic processing of APP by two distinct proteases that are termed β- and γ-secretase. The β-secretase, also called BACE-1 or memapsin 2, belongs to the family of aspartyl proteases. BACE-1 evidently cleaves APP in an acidic endosomal compartment after endocytosis of APP, thereby facilitating Aβ peptide generation.
Sorting of transmembrane proteins is generally controlled by sorting signals in the cytoplasmic domains of the cargo proteins. The short cytoplasmic tail of BACE-1 with 23 amino acids contains a sorting signal of the acidic cluster, di-leucine (ACDL) type. The two Leu residues in this determinant are important for the clathrin mediated endocytosis of BACE-1, whereas the acidic residues together with the Leu are required for the endosomal sorting and recycling of BACE-1 back to the plasma membrane. The ACDL motif binds to the members of the GGA (Golgi-localized γ ear-containg ARF- binding proteins) family (GGA1-GGA3) that are involved in the sorting of BACE-1.
One of the major aims of this study was to address the role of flotillins in the intracellular sorting of BACE-1. This study shows that flotillin-1 directly binds to the di-leucine motif in the cytoplasmic tail of BACE-1, whereas flotillin-2 only shows an association mediated by flotillin-1. Flotillin-1 competes with GGA2 for the binding to BACE-1 tail, and thus influences the endosomal sorting of BACE-1. Importantly, depletion of flotillins results in an altered localization of the wildtype BACE-1, whereas the plasma membrane resident Leu to Ala (LLAA) mutant is not affected. Flotillin knockdown results in an accumulation of BACE-1, implicating reduced degradation and enhanced stability of this protease. Thus, flotillins appear to be important for the cellular targeting of BACE-1 and also influence the amyloidogenic processing of APP, as demonstrated by an increase in the amyloidogenic C-99 processing fragments.
When flotillin depleted cells were subjected to apoptotic stresses including Aβ25-35 synthetic peptide (inducer of the extrinsic apoptosis pathway) or several chemotherapeutic agents (staurosporine, brefeldin A, doxorubicin, carboplatin and paclitaxel: intrinsic apoptosis pathway) and cytotoxicity was determined, various apoptotic markers were activated in flotillin depleted cells. Caspase-3 and GGA3 are well accepted apoptosis markers and an enhanced caspase-3 cleavage was detected upon STS induced apoptosis in SH-SY5Y, HeLa, and HaCaT cell lines and increased GGA3 cleavage was observed in MCF7 cell line.
One of the major reasons for the apoptotic sensitivity in the absence of flotillins was a PI3K/Akt signaling defect. Neuroblastoma cells depleted of flotillins showed diminished levels of total Akt, phospho-Akt and phospho-ERK upon STS induced apoptosis. Since PI3K/Akt was the primary survival pathway affected upon STS induced apoptosis, ectopic expression of Akt in neuroblastoma cell line reduced caspase-3 cleavage and retarded apoptosis.
The direct downstream target of Akt is FOXO3a, whose localization was investigated in flotillin depleted cells. A major proportion of FOXO3a was localized in the nucleus of flotillin knockdown cells, implicating that FOXOs are active in these cells and subsequently trigger the transcription of death genes. Strikingly, an essential anti-apoptotic molecule and a major cancer target, Mcl-1, was inherently downregulated in flotillin knockdown cells. Mcl-1 is a chief member of the Bcl-2 family as it plays a pivotal role in cell survival and it is a critical protein in cancer therapeutics as suppression of Mcl-1 protein can curtail the survival and growth of tumorous cells.
Neuroblastoma cells were rescued from undergoing permanent damage due to STS induced apoptosis by overexpression of anti-apoptotic Bcl-2. Phorbol esters are well known PKC activators, and pre-treatment of neuroblastoma cells with phorbol esters along with staurosporine reduced caspase-3 cleavage.
These results demonstrate that absence of flotillins can sensitize cellular systems to apoptosis induction. The two main characteristics of cancer cells include resistance to apoptosis and unresponsiveness to chemotherapeutic agents. It is a well established fact that impaired apoptosis is central to tumour development. This study implicates that the downregulation of flotillin function can trigger cellular susceptibility and enhances apoptosis in response to conventional chemotherapeutic agents. Therefore, flotillins can serve as vital regulators in providing a more rational approach in molecular-targeted therapies for receding cancer growth and survival.
Die Arachidonsäurekaskade spielt bei Entzündungsprozessen und der Schmerzentstehung eine wichtige Rolle. Deren primäre Produkte, die Leukotriene und die Prostaglandine, sind entzündungsfördernde Mediatoren und nehmen Einfluss auf den Entzündungs-auflösendenprozess und sind bei einer Dysregulation für diverse Erkrankungen wie z.B. Asthma bronchiale und allergische Rhinitis mitverantwortlich. Die Kaskade gliedert sich mit ihren beiden Hauptenzymen, Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase (5-LO), in zwei Wege auf. Beide Enzyme sind außerdem in der Lage entzündungsauflösenden Mediatoren zu bilden. Die Mediatoren wie z.B. Lipoxin können im Zellstoffwechsel einerseits über die Lipoxygenase-Route, oder andererseits wie „aspirin-triggered“-Lipoxin von der durch geeignete Wirkstoffe acetylierten Cyclooxygenase-2 (COX-2) katalysiert werden. Diese Mediatoren werden benötigt, um (chronische) Entzündungen und beschädigtes Gewebe zurück zur Homöostase zu führen.
Die Pharmakotherapie chronisch entzündlicher Erkrankungen mit guter Wirksamkeit und verträglichem Profil bei Langzeiteinnahme stellt jedoch eine Herausforderung dar. Die Therapie verzögern oft, z. B bei Einnahme von nicht-steroidalen Antirheumatika (NSAR), die Entzündungsauflösung, da die Bildung von entzündungshemmenden und entzündungs-auflösenden Lipidmediatoren gehemmt werden. Die gezielte Modulation und Einflussnahme auf die Arachidonsäurekaskade an einem der beiden Enzyme, stellt daher einen guten Ansatz für eine verbesserte Therapiemöglichkeit von (chronischen) entzündlichen Krankheiten dar. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Synthese von Modulatoren und Inhibitoren der Arachidonsäurekaskade. Zum einen befasst sie sich mit der Entwicklung von irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen als neues anti-entzündliches und entzündungsauflösendes Prinzip. Zum anderen mit der Untersuchung der Struktur-Wirkungsbeziehung (SAR) von 2-Aminothiazolen als direkte 5-LO-Inhibitoren ausgehend von SKI-II, welches zuvor als Leitstruktur zur Entwicklung von 5-LO-Inhibitoren entdeckt wurde.
Als Leitstrukturen für die irreversiblen COX-2-acetylierenden Substanzen wurden bekannte COX-2 selektive Substanzen ausgewählt sowie vereinzelte nicht-selektive NSAR. Es wurden an der COX-2 Kristallstruktur Docking-Studien durchgeführt, um die geeignetsten Positionen für die Einführung einer (labilen) Acetylgruppe zu identifizieren. Aufgrund dieser Studien wurden drei Positionen ausgewählt zur Derivatisierung. Es wurden daraufhin zahlreiche Derivate synthetisiert von Celecoxib, Valdecoxib, Rofecoxib, Etericoxib, als Vertreter der (COX-2) selektive Inhibitoren, sowie von Acetylsalicylsäure, Diclofenac und Nimesulid-Analoga als Vertreter der nicht-selektiven NSARs. Zusätzlich wurden Derivate synthetisiert mit Michael-Akzeptoren als kovalente bindende Komponente. Alle synthetisierten Substanzen wurden sukzessiv auf ihre COX inhibitorischen Eigenschaften hin untersucht und auf COX-2 Selektivitäten überprüft. Weiterhin wurden von allen Derivaten Auswaschungs-Studien durchgeführt als Vorversuche welche Derivate eine irreversible COX-2-Inhibition hervorrufen. In den Vorversuchen zeigte die Verbindung ST-1650 am deutlichsten eine COX-2-Selektivität sowie eine starke irreversible Inhibition der COX-2. Die Verbindung ST-1650 wurde weiterhin auf indirekte Hinweise zur Entstehung von heilungsfördernden Mediatoren untersucht anhand von: M1-Macrophagen Polarisation und einem Schmerzmodell, dem Zymosan-Überempfindlichkeit Pfotenmodell. Im Makrophagen-Modell konnte ST-1650 keine Phänotypverschiebung hinzu entzündungsauflösenden M2-Makrophagen bewirken, sowie in den Schmerzmodellen leider keine schnellere Schmerzauflösung als die Kontrollgruppe. Ob diese Effekte durch mangelnde oder zu geringer Entstehung von entzündungshemmenden Mediatoren zurückzuführen ist, ist noch unklar.
Für die SAR der 2-Aminothiazole als direkte 5-LO-Inhibitoren wurden über 60 Verbindungen synthetisiert und untersucht. Zu Beginn erfolgte eine Optimierung der Grundstruktur als 5-LO-Inhibitor. Es wurden die Einflüsse der Substituenten des Thiazolsrings und des Aminolinkers auf die 5-LO-Aktivität ermittelt, um die SAR initialer Arbeiten zu vertiefen. Nach der SAR-Untersuchung im intakten Zellsystem konnten durch Kombination bevorzugter Strukturelemente die zwei Verbindungen ST-1853 und ST-1906, als neue potente 5-LO-Inhibitoren entwickelt werden, die sich als nicht-toxisch herausstellten. Diese beiden 5-LO-Inhibitoren wirken um einen Faktor 10 potenter und sind weniger toxisch verglichen mit der Leitstruktur SKI-II. ST-1853 wurde innerhalb der Arachidonsäurekaskade auch auf Off-targets getestet, deren Aktivitäten sie erst bei 100-fach höherer Konzentration beeinflusst, sowie in humanem Vollblut, wo sie sich ihre 10-fach bessere Wirksamkeit im Vergleich zu SKI-II bestätigte. Darüber hinaus erwies sich ST-1853 bei den ersten Überprüfungen seiner Stabilität unter physiologischen Bedingungen wie bei der in vitro Metabolisierung durch Rattenlebermikrosomen als ausreichend stabil und daher zur weiteren Charakterisierung gut geeignet.
Habituation ist eine der einfachsten Formen des Gedächtnisses. Hierbei handelt es sich um die erlerne Gewöhnung an einen harmlosen Reiz. Dies bedeutet, dass nach mehrfacher wiederholter Repräsentation eines harmlosen Reizes die Reaktion darauf stetig abnimmt, bis sie völlig zum erliegen kommt. Je nach Trainingsprotokoll kann diese Gewöhnung bis zu mehren Tagen andauern. Habituation ist hoch konserviert und ein Verhaltensmuster, dass auch bei sehr einfachen vielzelligen Organismen zu finden ist und untersucht werden kann. Zur Untersuchung des Zusammenspiels innerhalb eines neuronalen Netzwerkes, welches für die Habituation des Rückzugsreflexes (Ausweichreaktion nach Berührung) verantwortlich ist wurde hier der Fadenwurm Caenohabditis elegans (C. elegans) als Modell Organismus verwendet. Aufgrund seines einfachen, nur 302 Zellen umfassenden, Nervensystems eignet sich C. elegans sehr gut für Grundlagenforschung in diesem Bereich. Das neuronale Netzwerk, das verantwortlich ist für den Rückzugsreflex ist in drei Ebenen organisiert. Wahrgenommen wird der Reiz von sensorischen Neuronen (ASH, ALM, AVM, PLM, PVM). Die Weiterleitung erfolgt über verschiedene Interneuronen (AVA, AVB, AD, AVE, PVC) hin zu den Motorneuronen, welche die Muskeln enervieren und somit die Reaktion auf den in erster Ebenen wahrgenommen Reiz auslösen.
Mit Hilfe von optogenetischen Werkzeugen wurde hier Untersucht welche Rolle einzelne Zellen innerhalb dieses Netzwerkes innehaben und an welcher Stelle innerhalb des Netzwerkes die kurzzeitige Habituation des Reizes, nach einem Einfachen Lernprotokoll stattfindet. Zuerst musste eine Möglichkeit gefunden werden die zur Verfügung stehenden optogenetischen Werkzeuge zellspezifisch zu exprimieren. In dieser Arbeit wurden hierfür Rekombinasesysteme verwendet, die es ermöglichten zur Expression eine Kombination aus 2 verschiedenen Promotoren zu verwenden. Beide Promotoren dürfen hierbei nur in einer Zelle, der Zielzelle, überlappen. Es konnte zellspezifische Expression des Kationenkanals Chanelrhodopsin 2 (ChR2) in den beiden Zellparen AVAL/R und ASHL/R (nimmt aversive Reize wahr) erreicht werden.
Zur Untersuchung der Habituation wurde zusätzlich noch ein Wurmstamm verwendet, welcher ChR2 unter dem mec-4 Promotor exprimiert. ChR2 ist hier in den Mechanorezeptorneuronen (MRN) ALM, AVM, PLM und PVM exprimiert. Die hier durchgeführten Experimente deuten darauf hin das den MRNs die Größte Rolle bei der Ausbildung einer Habituation zukommt. Es gibt jedoch auch Hinweise darauf, dass AVA zusätzlich eine Rolle spielt.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Rolle von AVA genauer untersucht. AVA gilt als der Hauptsignalgeber für eine Rückwärtsbewegung (spontan und nach Reizempfang). Es konnte gezeigt werden dass eine Unterbrechung der ’Gap Junktionen’ zwischen AVA und PVC eine stärkere Reaktion zur Folge haben. AVA scheint also durch PVC inhibiert zu werden. Ebenfalls mit AVA direkt interagierende Neuronen sind AVD und AVE. Mit den hier zur Verfügung stehenden Mitteln konnte die genaue Modulation von AVA durch diese Zellen jedoch nicht gezeigt werden.
In dieser Arbeit konnte der Grundstein für eine funktionale Aufklärung des Nervensystems von C. elegans gelegt werden. Vor allem durch die Möglichkeit der zellspezifischen Expression kann es zukünftig gelingen das Zusammenspiel der einzelnen Nervenzellen und ihren Anteil an einem bestimmtem Verhalten zu Untersuchen.
Terrestrische Säugetiere werden von unterschiedlichen Parasiten als Wirte genutzt. Dabei kann ihre Parasitenfauna je nach Art, Lebensweise, Verbreitung, Gesundheitszustand und Reproduktionsstatus des Wirts abweichen. Ein weiterer bestimmender Faktor, ist der Einfluss des Menschen in Form von Regulierungsmaßnahmen und Schaffung urbaner Lebensräume. Domestizierte Haustiere bzw. Nutztiere weisen daher in der Regel andere Parasiten auf als ihre wildlebenden Artgenossen. Gleichzeitig können sich sowohl Wildtiere als auch domestizierte Tiere und Menschen gegenseitig Parasitenarten teilen und wechselseitig aufeinander übertragen. Daraus resultierende Krankheiten werden als Zoonosen bezeichnet.
Insbesondere Fledermäuse (Unterordnung Microchiroptera) zeigen weltweit eine enorme Parasitendiversität, die noch weitgehend unerforscht ist. Ebenfalls Forschungsbedarf besteht für die Sandfloh-Gattung Tunga in Süd- und Mittelamerika in Hinblick auf ihr Wirtsspektrum, welches auch Menschen einschließt. Die Art Tunga penetrans und zahlreiche weitere Parasitenarten, parasitieren gleichzeitig auch bei Hunden. Daher stellen diese Wirte eine direkte Gesundheitsgefahr für Menschen in ihrer unmittelbaren Umgebung dar.
Die vorliegende Dissertation ist in kumulativer Form zusammengefasst und beinhaltet drei Einzelpublikationen sowie einen Reviewartikel.
Ziel war es, die Parasitendiversität von Hunden aus urbanen tropischen Gebieten und die Parasitendiversität des Großen Ameisenbären (Myrmecophaga tridactyla) mit Hilfe morphologischer und molekularbiologischer Methoden zu analysieren. Die jeweiligen Parasitenfaunen wurden in Hinblick auf die soziale bzw. solitäre Lebensweise der beiden Wirtsarten verglichen und ihr zoonotisches Potenzial bewertet.
Ein weiteres Ziel war die Zusammenfassung der Ektoparasitennachweise süd- und mittelamerikanischer Microchiroptera und für die europäischen Arten der Fledermaus-Gattung Myotis (hier Endo- und Ektoparasiten) auf Basis der verfügbaren Literatur. Des Weiteren sollten eigene Parasitennachweise aus Bolivien bzw. Deutschland erfolgen. Für die Nachweise aus Deutschland wurden M. myotis untersucht, deren Artzugehörigkeit vorher bestimmt wurde. Zusätzlich wurden diese Individuen auf humanpathogene Lyssaviren untersucht.
Die Nachweise erfolgten über molekularbiologische und morphologische Methoden.
Stechmücken (Dipteren: Culicidae) sind weltweit mit über 3500 Arten und mit Ausnahme der arktischen Regionen ubiquitär vertreten. Die medizinische Relevanz dieser Tiergruppe, begründet durch die hämatophage Lebensweise der Weibchen, erschloss sich bereits Ende des 19. Jh. und hat bis heute Bestand. Jedes Jahr sterben rund 600.000 Menschen an den Folgen der Malaria und fast 100 Mio. Menschen infizieren sich mit dem Denguefieber. Zwar beziehen sich diese Zahlen fast ausschließlich auf die Entwicklungsländer, aber im Zuge des Klimawandels und des immer stärkeren Welthandels kommt es auch in Europa und den USA immer wieder zu Ausbrüchen vorher nicht relevanter Krankheiten. So hat sich das West-Nil- Virus seit 1999 in Nordamerika rasant verbreitet. Im Jahr 2013 gab es dort rund 2500 Fälle, von denen 119 zum Tod führten. In Europa traten hingegen Krankheiten wie das Chikungunyafieber (Italien 2007) oder das Denguefieber (Frankreich 2010/2013) auf. Die Gründe für diese Ausbrüche sind vor allem in der Einschleppung neuer Vektorspezies und Krankheitserreger sowie in den veränderten Wirtspräferenzen einheimischer Stechmückenarten zu suchen. Das Wissen um das Vektorpotential der in Deutschland heimischen Stechmücken konnte vor allem durch die seit 2009 initiierten Monitoring-Programme stetig erweitert werden. Auch die Veränderung der heimischen Fauna durch invasive Arten wie Ochlerotatus japonicus japonicus oder Aedes albopictus wird intensiv erforscht. Dennoch ist hinsichtlich der Biologie, Ökologie sowie Genetik vieler Arten noch immer wenig bekannt.
Die vorliegende Dissertation, welche auf Basis von vier (ISI-) Einzelpublikationen kumulativ angefertigt wurde, beschäftigte sich mit der Analyse der genetischen Variabilität sowie der Zoogeographie der untersuchten Arten und der Etablierung einer schnellen und kostengünstigen Methode zur Artdiagnostik. Besonderes Augenmerk wurde bei den Analysen auf die beiden heimischen Arten Culex pipiens und Culex torrentium sowie die invasive Art Ochlerotatus japonicus japonicus gelegt. Ziel war es, die noch bestehenden Wissenslücken zu füllen, um zukünftige Monitoring-Programme besser koordinieren sowie Analysen zur Vektorkompetenz und Genetik dieser Arten gezielter durchführen zu können.
Es konnte gezeigt werden, dass Cx. pipiens und Cx. torrentium deutliche Unterschiede in ihren Populationsstrukturen aufwiesen welche auf verschiedene evolutive Prozesse hindeuten. Die geringere genetische Variabilität in Cx. pipiens lässt auf positive Selektion durch z.B. Insektizidresistenz im Zuge durchgeführter Bekämpfungsmaßnahmen oder die Infektion mit Wolbachien schließen. Die analysierte Populationsstruktur von Cx. torrentium spricht hingegen für eine geringe Ausbreitung, wodurch der genetische Austausch reduziert wurde und so die untersuchten Populationen genetisch stärker voneinander abwichen. Des Weiteren ließen die Analysen des Cytochrom c Oxidase Untereinheit 1-Fragmentes (cox1) Rückschlüsse auf die Zoogeographie dieser Arten in Deutschland zu - wobei beide Arten über das Untersuchungsgebiet verteilt waren, Cx. torrentium jedoch in den neuen Bundesländern weniger häufig nachgewiesen wurde als in den alten und eine geringere gefangene Individuenzahl aufwies. Basierend auf der ökologischen Nischenmodellierung konnten potentiell neue Verbreitungsgebiete für die Art Ochlerotatus japonicus japonicus identifiziert werden. Als klimatisch besonders günstig zeigten sich dabei Südhessen, das Saarland sowie nördliche Teile Nordrhein-Westfalens. Mit Hilfe der etablierten Methode der direct-PCR wird in Zukunft eine schnellere und kostengünstigere Identifizierung von Stechmücken erfolgen können, welche aufgrund bestimmungsrelevanter Merkmale nicht mehr morphologisch zu identifizieren sind.
Um das Wissen über die Stechmücken in Deutschland fortlaufend zu intensivieren, ist sowohl das Weiterführen der Monitoring-Programme als auch die molekularbiologische Aufarbeitung der Proben nötig. Durch die Anwendung neuer Techniken und weiterer molekularer Marker wird es möglich sein, weitere Krankheitserreger sowie genetische Besonderheiten der heimischen Stechmückenfauna nachzuweisen. Aber auch die Überwachung invasiver Stechmückenarten durch die Modellierung potentieller Verbreitungsgebiete und die Anwendung molekularbiologischer Analysemethoden zum Detektieren der Arten und möglicher Krankheitserreger wird ein wichtiger Bestandteil der weiteren Forschung sein.
Termites are important ecosystem engineers of the savanna biome, with the large mounds of fungus-cultivating termites being sources of habitat heterogeneity and structural complexity in African savanna landscapes. Studies from different localities throughout Africa have shown that termite mounds have a strong influence of diversity and composition of plant communities. However, most research has been conducted only at the local scale, and integrating knowledge across Africa is hampered by different methodology of studies and differing environmental context. Little is known about the variation in vegetation composition on termite mounds compared to the surrounding savanna at the regional scale and at the landscape scale, and the main determinants of plant communities on mounds are yet to be ascertained.
This thesis aimes at better understanding the influence of termite mounds on vegetation compared to the surrounding savanna across spatial scales. Three research projects analyse vegetation data and soil data from paired mound and savanna plots in West Africa. The first project examines the influence of termite-induced heterogeneity on plant diversity and vegetation composition at a regional scale, following a bioclimatic gradient from the Sahel of Burkina Faso to the Sudanian vegetation zone in North Benin. The second Project analysed variation of vegetation on and off mounds at the landscape scale in Pendjari National Park, North Benin. The third is a monitoring study over the course of two years, exploring dynamics of juvenile woody plant communities on mounds and in the surrounding savanna at a local scale. The thesis thus provides the first comparative quantitative analysis across scales of mound and savanna vegetation and the drivers of the mound–savanna difference in vegetation.
Synthesizing across scales, its results confirm that termite mounds strongly contribute to savanna plant diversity, even though mounds are not generally more species rich than the surrounding savanna. Variation in mound vegetation is much higher along climatic and soil gradients than previously acknowledged. Mound vegetation differs from the surrounding savanna in the whole study area and in each sampled savanna type, with the strongest differences occurring at the most humid study sites. A large proportion of the differences between mound and savanna vegetation is explained by clay enrichment and related soil factors, such as cation concentrations. Plants on mounds thus benefit from favourable soil conditions, including higher fertility and higher water availability, which is also mirrored by the higher abundance and basal area of juvenile woody plants found on mounds. The variation in mound vegetation between study sites across scales results in part from local differences in soil composition and from climatic differences that influence the regional distribution of species. Different sets of characteristic mound species are identified in each project. Specific plant families and traits like succulency, lianescence, and adaptations to zoochory are found to be overrepresented in mound communities.
In addition to the findings in this thesis, remaining parts of the variation in mound vegetation between study sites could likely be explained by investigating further factors. Specifically, mound vegetation depends on habitat context, which includes available species pools, spatial distribution of mounds, biotic interactions with dispersers and herbivores, fire, and also anthropogenic influence. The high proportion of species with adaptations to zoochory found on mounds, for example, indicates that animal dispersers should be of particular importance for vegetation on termite mounds. Herbivory and fire regime, which are known to contribute to the diversity and community composition of the mound–savanna system, also show strong local variation, not least because of anthropogenic influence.
In conclusion, termite mounds play a crucial role in maintaining heterogeneity and plant diversity in the savanna across scales. Ecosystem services provided by termites, especially considering long-term effects on soil fertility and ecosystem resilience, are most likely undervalued. Mounds should be considered in management plans from local to regional, transnational scales as a matter of course, accompanied by further research on the role of termite mounds in savanna ecology on a longer temporal scale. The research presented here thus provides a basis for future studies on termite mound vegetation that should specifically consider the biotic and abiotic context of the mound–savanna system.
The mammalian family of bears (Ursidae) comprises eight extant species, occurring on four different continents. Among them are the iconic and well-known brown and polar bears, both widely distributed across the Northern hemisphere. Their intraspecific genetic structuring has been extensively investigated, albeit with a focus on genetic markers from maternally inherited parts of their genomes (mitochondrial DNA). The evolutionary relationship and divergence time between brown and polar bears have recently triggered an extensive debate, while less focus has been put on to other parts of the ursid phylogeny, particularly to a clade of three Asian bear species. To date, whole genomes of more than 100 bear individuals from four different species have been sequenced. Yet, one fundamental part of the genome has been largely omitted from specific analyses, in bears as well as in most other mammals: the Y chromosome.
The mammalian Y chromosome provides a unique perspective on the evolutionary history of organisms due to its distinct features, and specifically reflects the patriline because of its male-specific inheritance. The characteristics of this chromosome make it well suited to complement and contrast evolutionary inferences based on other genetic markers, and to uncover processes like sex-biased gene flow and hybridization. The unique insights that can be gained from analyses of Y-linked genetic variation made me utilize this part of the genome to investigate the evolution of male lineages in bears. Studying the patriline is particularly promising in this taxonomic group because of male-biased dispersal and a complex and fast radiation of bears. The analysis of Y-chromosomal genetic markers is thus the common theme of this dissertation: I present the identification of large amounts of Y-chromosomal sequence, the development of male-specific markers from such sequences, and the application of these markers to trace the evolution of male lineages of different bear species.
Specifically, I developed a molecular sex determination system based on the detection of two Y-linked fragments that allows to reliably discriminate between females and males from seven different bear species (Bidon et al. 2013). The approach is highly sensitive, bear-specific, and can be applied in standard molecular laboratories. This makes it valuable in conservation genetics and forensic applications, e.g. to analyze non-invasively collected samples.
Furthermore, I used Y-linked markers in a comprehensive and range-wide sample of brown and polar bears, and show that male-biased gene flow plays an important role in distributing genetic material throughout the ranges of both species (Bidon et al. 2014). In brown bears, I detected a lack of paternal population structuring which is in strong contrast to the detailed structuring of the matriline.
Analyzing Y-chromosomal sequences from all eight bear species, I present a phylogeny of the patriline that largely resembles the topology from other nuclear markers but is different from the topology of the mitochondrial gene tree (Kutschera et al. 2014). This discordance among loci generates interesting hypotheses about inter-species gene flow, particularly among American and Asiatic black bears.
With the identification of almost two million basepairs of Y-chromosomal sequence and the analysis of an unprecedented large male-specific dataset in polar bears, a high-resolution view on the distribution of their intraspecific variation was obtained (Bidon et al. 2015). In particular, two clades that are divergent but do not show pronounced phylogeographic structure were detected, confirming the great dispersal capacity of males of this high arctic species.
This dissertation thus represents a comprehensive investigation of Y-linked genetic variation on the intra- and interspecific level in a non-model organism. With my research, I contribute to an increased understanding of the complex evolutionary history of bears. In particular, I show that male-biased gene flow strongly influences the distribution of nuclear genetic variation, and that the contrast between phylogenies of differentially inherited markers can help to understand interspecific hybridization between closely related species. Moreover, my findings demonstrate the potential of Y-chromosomal markers to uncover unknown evolutionary patterns and processes. This applies not only to bears but to many species, even such that are generally well known and well described.
Die Spinozerebelläre Ataxie Typ 2 (SCA2) ist eine autosomal dominant vererbte neurodegenerative Krankheit, welche durch die Expansion des Trinukleotids Cytosin-Adenin-Guanin von ~22/23 auf >32 im Ataxin-2 Gen (ATXN2) verursacht wird. Dieses Trinukleotid codiert für die Aminosäure Glutamin weshalb SCA2 auch zu den Polyglutaminerkrankungen zählt. Zu dieser Gruppe zählen außerdem fünf weitere SCA-Subtypen sowie drei weitere neurodegenerative Erkrankungen, darunter die Huntington-Krankheit.
SCA2 wurde 1971 zum ersten Mal von Wadia und Swami beschrieben und unterscheidet sich von den anderen SCAs aufgrund der typischen Störung der sakkadischen Augenbewegungen. Weitere klinische Symptome von SCA2 sind Ataxie, Tremor, Dysmetrie, Dysarthrie, Hyporeflexie und Dysdiadochokinese. Die Symptome gehen auf einen neuronalen Verlust insbesondere im Cerebellum, aber auch in anderen Hirnregionen wie zum Beispiel dem Hirnstamm zurück.
Atxn2 wird in weiten Teilen des Zentralnervensystems aber auch in vielen nicht-neuronalen Geweben exprimiert. Es handelt sich um ein überwiegend cytoplasmatisch lokalisiertes Protein, welches im Gegensatz zu vielen anderen SCA-Proteinen cytoplasmatische und nur selten nukleäre Aggregate bildet. Die exakte Funktion von Atxn2 ist bisher unklar, es wurde allerdings mehrfach gezeigt, dass es in die mRNA Translation involviert ist aufgrund seiner Interaktion mit dem PolyA-bindenden Protein PABPC1.
Eine Expansion des Trinukleotids in Ataxin-2 kann nicht nur zu SCA2 führen, sondern stellt bei Wiederholungen zwischen 27 und 32 CAGs auch ein erhöhtes Risiko für eine Erkrankung an Amyotropher Lateralsklerose (ALS) und anderen neurodegenerativen Krankheiten dar. Eine Interaktion zwischen ATXN2 und dem ALS-verursachenden TDP43 (Tardbp) wurde bereits zahlreich beforscht, da Aggregate von ATXN2 in Motoneuronen des Rückenmarks von ALS-Patienten und aggregiertes TDP43 in SCA2-Neuronen beobachtet wurden.
Generell sind die Mechanismen, die zur Pathologie von SCA2 und ALS führen, noch weitgehend unklar. Ziel dieser Arbeit war es daher auf der einen Seite einen Einblick in den Pathomechanismus von SCA2 zu erhalten, indem mögliche oder bereits bekannte Interaktoren in etablierten Atxn2-Mausmodellen untersucht wurden. Auf der anderen Seite wurden zwei neue Mausmodelle charakterisiert, um ihre Eignung für die Erforschung von ALS und SCA2 zu prüfen.
Für den ersten Teil der Arbeit dienten Daten aus mehreren Transkriptomstudien von Atxn2-Knock-Out (KO) und Atxn2-CAG42-Knock-In (KIN) Mäusen als Grundlage. Konnten die Daten mit einer unabhängigen Methode bestätigt werden, folgten weitere Untersuchungen auf mRNA und Proteinebene sowie unter zusätzlicher Verwendung von Zellkultur und Patientenmaterial. Dadurch konnten neue Interaktionspartner von ATXN2 identifiziert und bereits bekannte in diesen Mausmodellen bestätigt werden.
So wurde zum Beispiel eine Interaktion von ATXN2 mit der E3-Ubiquitin-Protein-Ligasekomponente FBXW8 gezeigt und deren Beteiligung am Abbau von expandiertem ATXN2. Außerdem wurde eine Interaktion von FBXW8 mit dem bereits bekannten ATXN2-degradierenden Protein PARK2 gezeigt. Eine Hochregulierung des Fbxw8 Transkripts wurde sowohl im Atxn2-CAG42-KIN-Mausmodell als auch in SCA2-Patientenfibroblasten gefunden, während Park2 in keinem der Modelle signifikant veränderte Transkriptspiegel aufwies. Diese Daten belegen die Relevanz von Fbxw8 für den Abbau von moderat-expandiertem Atxn2 und begründen weitere Studien zur genauen Funktion dieses Proteins im Pathomechanismus von Atxn2.
Des Weiteren wurden diverse Kalziumhomöostasefaktoren untersucht, welche eine konsistente Herunterregulierung der Transkripte in beiden Mausmodellen aufwiesen. Auf Proteinebene zeigten sich jedoch Unterschiede zwischen den Modellen. Diese Daten belegen, dass zwar ähnliche Transkriptveränderungen im KIN- und KO-Modell auftreten, diesen aber vermutlich verschiedene Mechanismen zugrunde liegen. Welche Mechanismen dies genau sind bleibt zu klären, es ist jedoch wahrscheinlich, dass im KIN-Modell die Aggregatbildung sowie in beiden Modellen die Beteiligung von ATXN2 an der Translationregulation eine Rolle spielen. Die Ergebnisse dieser Studie unterstreichen die Relevanz des Ca2+ Signalwegs für die Entwicklung von SCA2.
Der zweite Teil der Arbeit beinhaltet die Charakterisierung einer ATXN2/TDP43 Doppelmutante auf Verhaltensebene sowie die gründliche Evaluierung des Phänotyps einer vollkommen neuen SCA2 Mausmutante. Während in der Doppelmutante trotz doppelter Genmutation nur ein sehr schwacher Phänotyp auf Verhaltensebene festgestellt werden konnte und bis zu einem Alter von 12 Monaten keine Potenzierung der Mutationen zu beobachten war, zeigte die Atxn2-CAG100-KIN Maus signifikante und früh auftretende Pathologie. Neben einer verminderten Überlebensrate, einem Gewichtsverlust und diversen motorischen Störungen, konnten auch Aggregate des mutierten Proteins in diversen Hirnregionen identifiziert werden. Der Atxn2-CAG100-KIN Phänotyp spiegelt die humanen Symptome daher recht gut wider, weshalb diese Mausmutante ein wertvolles Modell für die weitere SCA2-Forschung darstellt.
Zusammengefasst zeigt diese Arbeit die Bedeutung des ATXN2-Interaktors FBXW8 im SCA2-Mausmodell als auch im Patientenmaterial. Sie betont die Relevanz des Atxn2-KO-Modells in Bezug auf Störungen der Kalziumhomöostase und dokumentiert die Alters- und Gewebespezifität dieser Veränderungen. Außerdem beinhaltet sie die vorläufige Beschreibung eines kombinierten Atxn2/TDP43-Mausmodells und schließlich die ausführliche Charakterisierung eines vollkommen neuen und äußerst wertvollen SCA2-Mausmodells.
Die Endometriose ist eine gynäkologische Erkrankung, bei der epitheliale und stromale Zellen des Endometriums Läsionen außerhalb des Uterus bilden, die in ihrem Aufbau dem Endometrium gleichen. Diese Läsionen, sowie deren zyklische Proliferation, führen zu Schmerzen bei betroffenen Frauen. In isolierten, invasiven Epithelzellen (EEC145T) einer Endometriose-Läsion konnte die Expression von Shrew-1 gezeigt werden. Auch in anderen zellulären Zusammenhängen fördert die Expression von Shrew-1 den invasiven Phänotyp. Shrew-1 ist ein Transmembranprotein, das in Epithelzellen mit den Adhärenzverbindungen assoziiert ist und Interaktionen mit β-Catenin und E-Cadherin eingeht. In MCF7-Zellen fördert die Expression von Shrew-1 die EGF-induzierte Internalisierung von E-Cadherin, welche zur Verminderung der Zell-Zell-Adhäsion führt. In 12Z- und HT1080-Zellen konnte eine Interaktion mit CD147 gezeigt werden. CD147 fördert die Aktivität von MMPs und in Shrew-1-überexprimierenden HT1080-Zellen konnte eine erhöhte Aktivität der MMP9 gezeigt werden. Shrew-1 wirkt somit auf die Invasivität von Zellen und ist gleichzeitig Teil der Adhärenzverbindung. Aus diesem Grund wird Shrew-1 eine modulatorische Rolle in diesem Kontext zugeschrieben.
In immunhistologischen Färbungen von Shrew-1 und E-Cadherin konnte in Adenomyose-Läsionen eine inverse Expression der beiden Proteine in einigen epithelialen Zellen gezeigt werden, die im Endometrium nicht detektiert werden konnten. In den epithelialen Endometriose-Zelllinien 12Z und 49Z, die kein E-Cadherin exprimieren und äquivalent zu der Zelllinie EEC145T sind, führte die Herunterregulation von Shrew-1 (Shrew-1 KD) zur Reexpression von E-Cadherin. E-Cadherin ist in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen an der Plasmamembran lokalisiert und interagiert mit β-Catenin, wodurch seine Assoziation mit den Adhärenzverbindungen wahrscheinlich ist. Die Herunterregulation von Shrew-1 führt zu einer verminderten Motilität und Invasivität der 12Z-Zellen, wobei die reduzierte Invasivität nicht alleine auf die Reexpression von E-Cadherin zurückgeführt werden kann. Es ist zu vermuten, dass das verminderte invasive Verhalten mit der ausbleibenden Interaktion von Shrew-1 mit CD147 zusammenhängt, welches die Aktivität von MMPs fördert.
Da Shrew-1 eine direkte Interaktion mit β-Catenin eingehen kann, ist es möglich, dass die Herunterregulation von Shrew-1 zu Veränderungen in der Lokalisation von β-Catenin und weiteren Proteinen, die mit den Adhärenzverbindungen assoziiert sind (p120 Catenin und Aktin), führen. Dies konnte jedoch nicht beobachtet werden. Eine verstärkte Lokalisation von Vinculin an den Enden von Aktin-Stressfasern sowohl in Zellausstülpungen als auch an Zell-Zell-Kontakten konnte in 12Z-Zellen nach der Herunterregulation von Shrew-1 beobachtet werden. Dies könnte eine Folge der E-Cadherin-Reexpression oder entscheidend für die Lokalisation von E-Cadherin an der Membran sein.
Die Reexpression von E-Cadherin, die in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen auf mRNA- und Protein-Ebene nachgewiesen werden kann, erfolgt in den 12Z-Zellen vermutlich hauptsächlich über Veränderungen von Histon-Acetylierungen, da die Behandlung mit dem HDAC-Inhibitor TSA die Expression von E-Cadherin in den 12Z-Zellen induziert. Eine verstärkte H3K9-Acetylierung am CDH1-Promotor konnte in ChIP-Analysen in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen gezeigt werden. Die gesteigerte Acetylierung resultiert vermutlich aus der verminderten Assoziation von HDAC1 und HDAC2 mit dem CDH1-Promotor in diesen Zellen. Eine Beteiligung der Repressoren Snail, Slug, Twist und ZEB1 an der Reexpression von E-Cadherin in den 12Z Shrew-1 KD-Zellen konnte nicht gezeigt werden. Ebenso scheinen Veränderungen am Methylierungsstatus des CDH1-Promotors nach der Herunterregulation von Shrew-1 nicht zu erfolgen.
TSA induziert auch in weiteren epithelialen Endometriose-Zelllinien (10Z und 49Z) die Expression von E-Cadherin. In stromalen Zellen führt hingegen weder TSA noch die Herunterregulation von Shrew-1 zur Expression von E-Cadherin (17B, 18B und 22B). Dies weist darauf hin, dass die Herunterregulation von Shrew-1 über die Veränderungen von Histon-Acetylierungen wirkt und dass dieser Mechanismus in epithelialen Endometriose-Zellen entscheidend ist. In den stromalen Zellen muss die Expression von E-Cadherin über einen anderen und/oder weitere Mechanismen blockiert sein.
Auch der Wnt-Signalweg scheint an der Reexpression von E-Cadherin in 12Z-Zellen beteiligt zu sein. Die Inhibierung der GSK3β (LiCl und SB216763) führt zur Expression von geringen Mengen an E-Cadherin. In 12Z Shrew-1 KD-Zellen führt die Stabilisierung von Axin (XAV939) zur verminderten Expression von E-Cadherin. Dies lässt darauf schließen, dass Shrew-1 auch einen Einfluss auf den Wnt-Signalweg hat, was vor allem durch dessen Interaktion mit β-Catenin wahrscheinlich ist.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Interaktion von A. baumannii mit humanem Plasminogen untersucht. Mit dem Translations-Elongationsfaktor TufAb, dem äußeren Membranprotein OmpW sowie dem Lipoprotein p41 konnten insgesamt drei Plasminogen-bindende Proteine von A. baumannii identifiziert werden. Außerdem wurde ein grundlegender Beitrag zur funktionellen Charakterisierung von TufAb sowie p41 von A. baumannii erbracht.
Es konnte nachgewiesen werden, dass gereinigtes TufAb humanes Plasminogen bindet und diese Interaktion teilweise durch Lysin-Reste vermittelt und von der Ionenstärke beeinflusst ist. An TufAb-gebundenes Plasminogen war für den Plasminogen-Aktivator u-PA zugänglich und konnte zu Plasmin aktiviert werden, welches das chromogene Substrat S-2251, das physiologische Substrat Fibrinogen und die zentrale Komplementkomponente C3b proteolytisch spaltete. Schließlich konnte TufAb als „Moonlighting“-Protein auf der Zelloberfläche von A. baumannii identifiziert werden.
Für das Lipoprotein p41 konnte ebenfalls gezeigt werden, dass dieses an Plasminogen bindet. Die Bindung von Plasminogen an p41 erfolgte ebenfalls über Lysin-Reste, zeigte sich allerdings von der Ionenstärke unbeeinflusst. Im Fall von p41 konnte mit Hilfe von C-terminal verkürzten p41-Konstrukten gezeigt werden, dass C-terminale Lysin-Reste an der Bindung von Plasminogen beteiligt sind. Weitere Versuche mit p41-Proteinen, bei welchen vier C-terminale Lysin-Reste durch Alanin-Reste substituiert wurden, ergaben, dass die beiden Lysin-Reste K368 und K369 essentiell für die Bindung von Plasminogen an p41 sind. Zudem konnte gezeigt werden, dass sowohl Kringle-Domäne 1 als auch Kringle-Domäne 4 von Plasminogen bei der Interaktion mit p41 involviert sind. An p41 gebundenes Plasminogen ließ sich durch u-PA zu Plasmin aktivieren, welches Fibrinogen sowie die zentrale Komplementkomponente C3b degradierte. p41 ist außerdem in der Lage, die Komplementkomponenten C3, C3b und C5 zu binden und den alternativen Weg zu inhibieren. Zudem ergaben Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit erste Hinweise darauf, dass zumindest die Plasminogen-bindende Region auf der Zelloberfläche von A. baumannii lokalisiert ist.
Die Inaktivierung des p41-kodierenden Gens führte zu einer signifikanten Abnahme im Überleben von A. baumannii-Zellen in der Gegenwart von NHS. Zudem zeigte die Mutante Δp41 einen Defekt in der Plasmin-abhängigen Transmigration durch einen Endothelzell-Monolayer. Beide Versuche untermauern die physiologische Relevanz für die Interaktion von A. baumannii mit Plasminogen.
Biodiversity is unevenly distributed on Earth. Highly diverse biotas are particularly expected in mountain systems, because altitudinal zonation provides a number of habitat alternatives, which could lead to lower extinction rates during climatic changes. Nevertheless, the impact of environmental changes on plant diversification (especially for sub-alpine taxa) in the course of mountain orogenesis remains poorly understood. This is also true for the highest and largest plateau on Earth, the Qinghai-Tibetan Plateau (QTP) and its surrounding areas.In this doctoral thesis, I investigated the impact of environmental changes on plant diversification and the floristic exchange between the QTP region and biodiversity hotspots of Southeast Asia as well as other parts of the world by using the sub-alpine genera Agapetes and Vaccinium (Vaccinieae, Ericaceae) as well as Tripterospermum (Gentianinae, Gentianaceae) as model systems. Furthermore, I examined the role of niche evolution and conservatism in a changing environment over time, and detected possible beneficial morphological traits of plants in the surroundings of the QTP by investigating subtropical Gentianinae (Crawfurdia, Kuepferia, Metagentiana, Sinogentiana, and Tripterospermum; Gentianaceae).
Flow hemodynamics regulates endothelial cell (EC) responses and laminar shear stress induces an atheroprotective and quiescent phenotype. The flow-responsive transcription factor KLF2 is a pivotal mediator of endothelial quiescence, but the precise mechanism is unclear. In this doctoral study, we assessed the hypothesis that laminar shear stress and KLF2 regulate endothelial quiescence by controlling endothelial metabolism.
Laminar flow exposure and KLF2 over expression in HUVECs reduced glucose uptake. Endothelial specific deletion of KLF2 (EC-KO) in mice and subsequent infusion of labeled glucose in Langendorff perfused hearts induced glucose uptake in ECs lacking KLF2. Bioenergetic measurements revealed that KLF2 reduces and glycolytic acidification in vitro.
Mechanistically, RNA sequencing analysis of shear stimulated ECs showed reduced expression of key glycolytic enzymes Hexokinase 2, PFKFB3 and PFK-1. KLF2 also reduced expression of these enzymes at protein level. KLF2 knockdown in shear stimulated ECs reversed the reduction in expression of PFKFB3 and PFK-1, indicating KLF2-dependency. Promoter analysis revealed KLF binding sites in the promoter of PFKFB3 and KLF2 over expression markedly reduced PFKFB3 promoter activity which was abolished on mutation of the KLF binding site. In addition, PFKFB3 knockdown reduced glycolysis while over expression increased glycolysis. Over expression of PFKFB3 along with KLF2 partially reversed the KLF2-mediated reduction in glycolysis. Importantly, PFKFB3 over expression reversed KLF2-mediated reduction in angiogenic sprouting and network formation in vitro. Ex-vivo aortic ring assays revealed an increase in endothelial sprouting from aortas from KLF2 EC-KO mice, which was partially reversed upon PFKFB3 inhibition by 3-PO.
In conclusion, work performed during this doctoral thesis demonstrates that laminar shear stress and KLF2 mediated repression of endothelial metabolism via regulation of PFKFB3 contributes to the anti-angiogenic and quiescent properties of the endothelium.
Vascular tumors associated with chronic B. henselae infections are unique examples of infection-associated pathological angiogenesis. The chaotic vascular architecture and prominent myeloid infiltrate of B. henselae induced vascular lesions show many similarities with malignant tumors.
In human cancers infiltrating myeloid cells play a decisive role in tumor progression and vascularization. In particular, tumor associated macrophages (TAMs) transform the tumor microenvironment, drive tumor invasion and vascularization through secretion of pro-angiogenic and immune modulatory cytokines and participation in matrix remodeling processes.
Myeloid angiogenic cells (MACs) are a subset of circulating myeloid progenitors with important roles in regenerative and pathological angiogenesis and a critical involvement in tumor vascularization. The phenotypic plasticity and importance of MACs in pathological angiogenic processes, position these cells as key potential players in B. henselae associated vascular tumor formation.
To investigate the possible role of MACs in B henselae induced pathological angiogenesis, the objective of this study was to examine the interaction of B. henselae with MACs and determine how this may affect their angiogenic capacity.
Building on previous work by Mӓndle (2005) this study has demonstrated that MACs are susceptible to infection with B. henselae and reside in intracellular vacuoles. As in endothelial cells, infection of MACs with B. henselae was associated with inhibition of apoptosis and activation of endogenous angiogenic programs including activation of the angiogenic transcription factor HIF-1.
In addition to angiogenic re-programming on a molecular level B. henselae infection increases MAC functional angiogenic capacity. B. henselae infected MACs were found to integrate into growing endothelium and increase the rate of angiogenic sprouting in a paracrine manner.
When cultured in a Matrigel capillary formation assay, infected MACs were also found to form networks of capillary-like structures that were stable over long periods of time. The B. henselae pathogenicity factor BadA was essential for the induction of this vascular mimicry phenotype as well as the activation of HIF-1 in infected MACs indicating that this factor may play an important role in MAC angiogenic re-programming.
Examination of infected MACs via FACS analysis, cytospin immunohistochemistry and qRT-PCR revealed that endothelial differentiation does not play a role in the B. henselae induced pro-angiogenic phenotype. Instead, MACs were shown to be myeloid in phenotype displaying typical macrophage markers which were upregulated upon B. henselae infection and maintained over long-term culture.
The increased angiogenic activity of B. henselae infected MACs was found to be associated with a broad phenotypic reprogramming in infected cells. In particular, gene expression programs related to angiogenesis, structural organization, apoptosis, sterol metabolism and immune regulation, were upregulated. Further examination of microarray gene expression profiles revealed that B. henselae infected MACs display a predominantly M2 anti-inflammatory macrophage activation status.
Finally, examination of the paracrine microenvironment created by B. henselae infected MACs revealed a diverse cytokine secretion profile dominated by inflammatory-angiogenic cytokines and matrix remodeling elements and lacking expression of some of the most important cytokines involved in the expansion of the inflammatory response. This B. henselae induced activation status was demonstrated to be distinct from the general inflammatory response induced by E. coli LPS treatment.
Comparison of B. henselae infected MACs to TAMs revealed many parallels in functional and phenotypic characteristics. Both TAMs and B. henselae infected MACs demonstrate increased angiogenic capacity, invasive, and immune modulatory phenotypes and the ability to participate in the formation of vascular mimicry phenotypes under angiogenic pressure. Furthermore, the pro-angiogenic paracrine microenvironment created by B. henselae infected MACs shows many similarities to the TAM-created tumor-microenvironment.
In conclusion, these investigations have demonstrated that the infection of MACs with B. henselae results in the phenotypic re-programming towards TAM-like cells with increased pro-angiogenic, invasive and immune-modulatory qualities. The results of this study elucidate new aspects of B. henselae pathogenicity in myeloid cells and highlight the role of these cells as paracrine mediators of B. henselae induced vascular tumor formation. In addition, these findings demonstrate that manipulation of myeloid cells by pathogenic bacteria can contribute to microenvironmental regulation of pathological tissue growth and suggest parallels underlying bacterial infections and cancer.
Effekte von Neonikotinoiden auf die Aktivität des Muskels M17 und das Lernverhalten der Honigbiene
(2015)
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Auswirkung von Neonikotinoiden auf die Muskelspikeaktivität des Muskels M17 und auf das Lernvermögen in einer komplexen Aufgabe an der Honigbiene (Apis mellifera carnica) durchgeführt. Dabei wurden drei verschiedene Substanzen verwendet: Clothianidin, Thiacloprid und Imidacloprid. Neonikotinoide stehen häufig im Verdacht, für das Sterben von Bienenvölkern verantwortlich zu sein, da die Bienen bei ihrer Nahrungssuche an behandelten Pflanzen den Substanzen ausgesetzt sind und diese möglicherweise damit auch an ihr Volk weitergeben. Die vorliegende Arbeit soll dazu beitragen, diese mögliche Gefährdung der Honigbiene durch Neonikotinoide weiter aufzuklären und deren Risiken zu beurteilen. Der Hintergrund für die Versuche zur Muskelspikeaktivität waren vorangegangene Versuche, die Auswirkungen von Neonikotinoiden auf die Motorik von sich frei bewegenden Individuen dokumentierten. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob sich diese Effekte auch an der Spikeaktivität des Muskels M17 widerspiegeln. Dafür wurden Elektromyogramme des Muskels M17 zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Gabe der Substanzen erstellt und deren mediane Anzahl mit einer Kontrollgruppe verglichen.
In einem ersten Versuch wurden Clothianidin (1 µM), Thiacloprid (1 µM), Imidacloprid (1 µM) oder eine Kontrollsubstanz (PBS) in die Kopfkapsel appliziert. Beim Vergleich mit der Kontrollgruppe zeigten sich für Imidacloprid keine Auswirkungen. Clothianidin verursachte eine deutlich erhöhte mediane Spikerate des Muskels M17, während Thiacloprid diese absenkte, beides im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auch bei einer um 30 Minuten versetzten Doppelapplikation von Clothianidin (1 µM) und Thiacloprid (10 µM) stellten sich diese Effekte ein, wobei Clothianidin eine dominante Rolle einzunehmen scheint. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Untersuchungen zur Laufaktivität, welche sich ebenfalls durch Clothianidin erhöhte und durch Thiacloprid absenkte.
Ein weiteres Experiment untersuchte die Auswirkung einer akuten Fütterung mit Clothianidin (1 ng in 1 µl) bzw. Thiacloprid (250 ng in 1 µl) auf die Anzahl der Muskelaktionspotenziale. Auch hier zeigt sich eine deutliche Erhöhung der Spikeanzahl durch Clothianidin und eine Absenkung der Spikeanzahl durch Thiacloprid, was die Ergebnisse des ersten Versuchs nochmals bestätigt.
Des Weiteren wurden Untersuchungen zur Auswirkung einer chronischen Fütterung mit Clothianidin (50 ppb) bzw. Thiacloprid (5000 ppb) auf die Anzahl an Spikes durchgeführt. Die Bienen wurden dabei über mehrere Wochen im Volk mit den jeweiligen Substanzen gefüttert. Dabei zeigte sich, dass auch eine chronische Fütterung der Bienen mit Clothianidin ihre Anzahl an Muskelaktionspotenzialen deutlich erhöht, während eine chronische Fütterung mit Thiacloprid diese absenkt. In einer Kombination der chronischen Fütterung mit einer zusätzlichen akuten Fütterung des jeweils anderen Neonikotinoids zeigte sich, dass auch hier Clothianidin eine dominante Rolle gegenüber Thiacloprid einnimmt und auch keine synergistischen oder Gewöhnungseffekte der beiden Substanzen eintreten. Die chronisch eingefütterten Völker entwickelten sich dagegen wie die Kontrollvölker, sodass die hier beschriebenen Auswirkungen auf die Einzelbiene keine sichtbaren Effekte auf ganze Völker zu haben scheinen.
Zusätzlich wurden Versuche zum Duftlernen in einer komplexen Lernaufgabe, dem positiven Patterning, unter Einfluss von Clothianidin durchgeführt. Die Bienen müssen dabei zwischen unbelohnten Einzeldüften und einem belohnten Duftgemisch, bestehend aus den beiden Einzeldüften, unterscheiden. In verschiedenen Versuchsdurchläufen wurden 0,25 ng oder 1 ng Clothianidin (jeweils 1 µl) in den Thorax injiziert, entweder vor der Akquisitionsphase oder vor dem ersten Abruftest nach drei Stunden. In keinem der Versuchsdurchläufe zeigten sich Effekte des Clothianidins auf den Lernvorgang, weder in der Akquisitionsphase noch in den Abruftests. Somit wurden weder das Lernen an sich, noch die Konsolidierung und damit die Überführung des Gelernten in das Langzeitgedächtnis durch das Clothianidin beeinflusst. Allerdings könnte die Immunabwehr der Bienen nach längerer Einwirkung des Clothianidins (24 h) in der höheren Konzentration herabgesetzt sein, da viele Bienen starben.
Insgesamt ergaben sich Effekte von Clothianidin und Thiacloprid auf die Anzahl der Aktionspotenziale des Muskels M17, die sich aber im gesamten Volk nicht widerspiegeln. Der Lernvorgang in der hier durchgeführten komplexen Lernaufgabe wird durch Clothianidin nicht beeinflusst. Möglicherweise entsteht dieser Unterschied in den Ergebnissen durch eine Bindung der Substanzen an verschiedene Rezeptorsubtypen, die pharmakologisch unterschiedliche Eigenschaften besitzen und somit auch unterschiedliche Auswirkungen zeigen.
Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss sowohl akuter als auch chronischer Aufnahme subletaler Mengen des Insektizids Thiacloprid auf Einzelbienen und Bienenvölker untersucht. Anlass für diese Art an Untersuchungen gibt ein seit Jahren in Nordamerika und Europa auftretendes unerklärliches Phänomen, „Colony Collapse Disorder“ genannt, bei dem Bienenvölker durch einen plötzlichen Verlust der Flugbienen zusammenbrechen. Als Ursache für das Völkersterben stehen neben anderen Faktoren wie Parasiten, Pathogenen und Umweltfaktoren die Insektizide aus der Gruppe der Neonikotinoide und deren Auswirkungen auf Bienen in subletalen Mengen im Verdacht. Basierend auf Studien der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) wurde der zugelassene Einsatz der drei Neonikotinoide Clothianidin, Imidacloprid und Thiamethoxam im Pflanzenschutz für zunächst zwei Jahre durch die EU-Kommission stark eingeschränkt.
Thiacloprid, ein weiteres Insektizid, welches zur Gruppe der Neonikotinoide gehört, ist weiterhin für den Einsatz im Pflanzenschutz zugelassen. Es wirkt in ähnlicher Weise wie die zuvor genannten Neonikotinoide als Agonist am nikotinischen Acetylcholinrezeptor, wobei es jedoch als weniger toxisch für Bienen gilt. Trotzdem sind subletale Auswirkungen dieses Neonikotinoids auf Bienen denkbar, die sich in Verhaltensänderungen der Bienen äußern und als Folge Einfluss auf das gesamte Bienenvolk nehmen könnten.
In der hier vorliegenden Arbeit wurden in chronisch mit Thiacloprid eingefütterten Völkern über mehrere Monate regelmäßige Populationsschätzungen durchgeführt, um die Entwicklung der Bienenvölker unter Aufnahme von Thiacloprid festzustellen. In einem weiteren Versuch wurde die Entwicklung der Brut unter chronischer Fütterung mit Thiacloprid beobachtet. Zusätzlich wurde eine große Zahl an Bienen mit RFID-Transpondern ausgestattet, um das Flugverhalten zu dokumentieren. Insbesondere wurden hier der Zeitpunkt des ersten Ausflugs und die Lebensdauer der Bienen zu Vergleichen herangezogen. Nach akuter Fütterung einer subletalen Einzeldosis Thiacloprid wurden Versuche zum Heimkehrvermögen von Bienen durchgeführt.
Unter feldrelevanten und bis zu zehnfach höheren Thiacloprid-Konzentrationen wurden keine beeinträchtigenden Einflüsse auf die Volksentwicklung beobachtet. Bei Konzentrationen, die um ein 25faches bzw. ein 40faches höher als die feldrelevante Konzentration waren, wurde festgestellt, dass die Brutzellenanzahl im Verhältnis zur Bienenanzahl verringert war. Bienen aus chronisch mit Thiacloprid eingefütterten Völkern starteten mit höherem Alter zu ihrem ersten Flug aus dem Bienenstock. Die Zeit, die die Bienen als Sammlerinnen verbrachten, änderte sich nicht. Durch Beobachtungen der Brutflächen konnte festgestellt werden, dass sich die Brut in Thiacloprid-gefütterten Völkern entsprechend der Brut in Kontrollvölkern entwickelte. Aufgrund weiterer Ergebnisse wurde eine Störung der olfaktorischen Wahrnehmung von Bienen aus Thiacloprid-gefütterten Völkern vermutet. Die akut verabreichte subletale Dosis an Thiacloprid führte zu einem erheblichen Verlust an heimkehrenden Bienen und deutet auf eine Beeinträchtigung des Orientierungs- bzw. Navigationsvermögens der Bienen hin.
In den durchgeführten Versuchen wurden sowohl direkte Auswirkungen von chronischer und akuter Aufnahme subletaler Mengen an Thiacloprid, als auch indirekte Auswirkungen auf Honigbienen beobachtet. Da teilweise erst bei hohen, nicht feldrelevanten Konzentrationen in den Versuchen Effekte beobachtet wurden, kann nur bedingt durch die Verhaltensänderung von Einzelbienen auf daraus resultierende Auswirkungen auf ein gesamtes Bienenvolk unter realistischen Bedingungen geschlossen werden.
Die Parkinson Erkrankung ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung in industrialisierten Ländern. Die charakteristischen Symptome sind schwere Beeinträchtigungen des Bewegungsablaufes welche auf den Verlust dopaminerger Neurone der Substantia nigra und der damit einhergehenden Reduktion des striatalen Dopamin Gehaltes zurückzuführen sind. Alpha-Synuklein (SNCA) ist ein Protein welches zum einen mit sporadischen aber auch mit idiopathischen Erkrankungen assoziiert ist. Mutationen welche einen Funktionsgewinn von SNCA zur Folge haben konnten mit autosomal dominanten Varianten der Parkinson Erkrankung assoziiert werden und genetische Veränderungen an beiden Genenden agieren als Risikofaktor für sporadische Formen der Erkrankung. Des Weiteren wird SNCA als Hauptbestandteil der Lewy Körperchen gefunden, einem pathologischen Kennzeichen der parkinsonschen Erkrankung. Die charakteristischen Bewegungsstörungen können mittels L-DOPA, einer metabolischen Vorstufe von Dopamin, behandelt werden. Neben dem enorm positiven Effekt auf die Bewegungsstörungen, geht die Behandlung mit L-DOPA jedoch auch mit ernsten Nebenwirkungen einher, welche als Levodopa induzierte Dyskinesien (LID) beschrieben werden.
Ziel der Arbeit war die Analyse von Effekten eines SNCA Funktionsgewinns sowie des Pink1 Funktionsverlustes auf molekulare Signalwege der synaptischen Plastizität unter Verwendung dreier PD Mausmodelle (A53T-SNCA überexprimierendes Modell (PrPmtA), Pink1KO Modell sowie A53T-SNCA + Pink1KO Doppelmutante (DM)). Es wurden Kandidatengene welche eine Rolle für synaptische Plastizität spielen in 6 Monate alten Mäusen aller drei PD Mauslinien untersucht. Die Analyse von PrPmtA zeigte erhöhte mRNA Spiegel von Glutamatrezeptor-Untereinheiten und von Kandidatengenen welche eine Rolle bei der synaptischen Signalweiterleitung spielen, sowie reduzierte mRNA Spiegel von IEGs und Transkriptionsfaktoren. Die Analyse der DM zeigte nur geringe Expressionsänderungen der Glutamatrezeptor-Untereinheiten und die Analyse von IEGs und Transkriptionsfaktoren zeigte erneut reduziert mRNA Spiege. In Pink1KO Tieren konnten nur minimale Expressionsveränderungen der Kandidatengene gefunden werden, was den Schluss zulässt, dass die zuvor beschriebenen Expressionsveränderungen in PrPmtA und DM Mäusen eindeutig auf den SNCA Funktionsgewinn zurückzuführen sind. Um frühe Effekte des SNCA Funktionsgewinns zu studieren wurde die Analyse auf 3 Monate alte PrPmtA Mäuse ausgeweitet. Diese ergab, Expressionsveränderungen für Homer1, cFos, NOR1, Nurr1 und Nur77.
In einem weiteren Versuchsansatz wurde die Auswirkung des SNCA Funktionsgewinns auf das Verhalten sowie auf molekulare Parameter nach Apomorphin Behandlung analysiert. Die Analyse ergab ein erhöhtes Niveau an unwillkürlichen Bewegungsmustern mit stereotypen und dystonischen Eigenschaften in PrPmtA im Vergleich zu Wildtypen (wt). Die molekulare Analyse von striatalem Gewebe wurde zu zwei Zeitpunkten durchgeführt, 30 min nach Apomorphin Injektion und 100 min nach Injektion. Die Analyse von striatalem Gewebe welches zum Zeitpunkt 30 min nach Injektion entnommen wurde ergab eine erhöhte Apomorphin abhängige Phosphorylierung von ERK1/2, sowie eine erhöhte Apomorphin abhängige Expression von Dusp1, Dusp6 und cFos in transgenen und wt Tieren. Genotyp abhängige Unterschiede ergaben sich für cFos, welches signifikant höher in PrPmtA induziert wurde. 100 min nach Apomorphin Injektion ergab die gleiche Analyse eine erhöhte Apomorphin abhängige Phosphorylierung von ERK1 und eine erhöhte Apomorphin abhängige Expression von Dusp1, Dusp6, cFos und Nur77 in PrPmtA im Vergleich zu wt. Die Daten unterstreichen die fundamentale Rolle von SNCA auf die Neurotransmission und synaptische Plastizität und zeigen auf, dass PrPmtA ein zuverlässiges Modell für die Analyse von präsynaptischer Dysfunktion in Frühstadien der Parkinson Erkrankung darstellt.
Der letzte Versuchsansatz stellt die Charakterisierung des DM-Mausmodells welches sich durch einen starken Phänotyp auszeichnet, sowie die Analyse des Pink1 Effektes auf die SNCA induzierte Neurotoxizität dar. DM-Tiere zeigen deutlich reduzierte Spontanmotorik im Alter von 3 Monaten sowie einer progressiven Lähmung der Hinterläufe, was Anlass zu einer immunhistologischen Charakterisierung mittels Schnitten des Gehirns und Rückenmarks gab. Die histologische Analyse zeigte pSer129-SNCA, p62/SQSTM1 und Ubiquitin positive Aggregate innerhalb der grauen Substanz des Rückenmarks sowie innerhalb einer neuronalen Zellpopulation welche dorsal der Substantia nigra angeordnet ist. Das histologische Erscheinungsbild wurde spezifisch in gelähmten DM-Tieren gefunden und nicht in Einzelmutanten oder DM-Tieren ohne Lähmung. Dieses Modell stellt ein wertvolles Instrument für die Identifizierung von pathologischen Mechanismen und Signalkaskaden welche beiden Parkinson relevanten Genen gemeinsam sind, dar.
Die hier vorliegende Dissertation befasst sich mit der Synthese von Naturstoffen aus Xenorhabdus und Photorhabdus spp. Da 6,0 - 7,5% ihres Genoms Sekundärmetabolit Clustern zuzuordnen sind, gelten diese entomopathogenen Bakterien als vielversprechende Naturstoffproduzenten. Die Palette der von ihnen produzierten Naturstoffe reicht von Antibiotika über Insektizide bis hin zu potentiellen Zytostatika. Die im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten und charakterisierten Substanzen lassen sich in vier Kategorien einteilen: kleine Sekundärmetabolite (Phurealipide), zyklische Makrolaktame (Xenotetrapeptide, GameXPeptide und Ambactin), zyklische Makrolaktone (Szentiamide, Xentrivalpeptide und Xenephematide) und methylierte lineare Peptide (Rhabdopeptide und Rhabdopeptid-ähnliche Moleküle).
Diese Dissertation befasst sich mit den Auswirkungen von nicht letalen Dosen von Neonikotinoiden auf Bienen. Neonikotinoide stellen eine Klasse von Insektiziden dar, die auf den nikotinischen Acetylcholin Rezeptor wirken. In dieser Dissertation wurden die Neonikotinoide Imidacloprid, Clothianidin und Thiacloprid benutzt. Die beiden erst genannten unterliegen zum Zeitpunkt des Verfassens dieser Arbeit einem temporären Verkaufs- und Ausbringungs-Stopp. Damit sind die Ergebnisse dieser Arbeit wichtig für die Bewertung der Gefahren von Neonikotinoiden. Neonikotinoide werden im großen Maße in der Landwirtschaft als Spritzmittel und Saatgutbeize eingesetzt. Dabei können sie in Rückständen von Bienen beim Sammeln von Nektar und Pollen aufgenommen und zum Stock gebracht werden. Um einen weiten Blick auf die Auswirkungen der Stoffe zu werfen wurden deshalb Experimente an einzelnen Sammlerinnen durchgeführt, ebenso wie an Bienenvölkern, bei denen die Substanzen verfüttert wurden. Als neuronal aktive Substanzen können sie die normale Funktion des Nervensystems von Bienen beeinflussen, was Veränderungen im Verhalten hervorrufen kann. Dies zeigt sich in Veränderungen in der Bewegung, Orientierung oder auch Interaktion mit anderen Bienen. Die Wirkung am Rezeptor variiert, trotz gleichen molekularen Ziels, stark zwischen den verwendeten Neonikotinoiden. Clothianidin wurde als Agonist beschrieben, der sogar stärkere Ströme als Acetylcholin bei gleicher Konzentration hervorrufen kann. Imidacloprid dagegen wurde bereits als partieller Agonist beschrieben, der geringere Ströme über den Rezeptor auslöst. In dieser Arbeit wurde ein erster Versuch durchgeführt um Thiacloprid ebenfalls als Agonist am nikotinischen Acetylcholin Rezeptor der Biene zu beschreiben. Hierbei wurde an einer Zelle in Kultur ein geringerer Strom ausgelöst.
Bienenvölker wurden unter kontrollierten Bedingungen gehalten, bei denen je eins der Neonikotinoide Clothianidin, Imidacloprid oder Thiacloprid in das Futter gemischt wurden. Hierfür wurden Dosen gewählt, bei denen davon ausgegangen werden konnte, dass keine akute Beeinflussung der Sammlerinnen bestand. Es konnte festgestellt werden, dass chronisches Füttern mit einer Zuckerlösung mit 8,876 mg/kg Thiacloprid zu einer verringerten Sammelleistung führte. Ebenso wurde die Entwicklung der Eier stark eingeschränkt, wobei die Königin weiterhin Eier legte. Es konnten nur vereinzelte verdeckelte Brutzellen, die ein spätes Entwicklungsstadium der Bienen darstellen, gefunden werden. Damit konnte gezeigt werden, dass geringe Dosen die Larval-Entwicklung von Bienen beeinflussen, eventuell durch Einflüsse auf die Kommunikation zwischen Ammenbienen und der Brut.
Um Auswirkungen auf einzelne Tiere zu zeigen, wurden unterschiedliche Parameter im Heimflug von Bienen nach Fütterung mit je einem der Neonikotinoide analysiert. Bienen mussten sich nach der Fütterung orientieren und von einer neuen Position den Heimweg zum Stock finden. Der Heimflug wurde per Radar verfolgt und so ein Flugprofil erstellt, das aus zwei Flugphasen bestand. Diese wurden durch die Navigation nach Vektorintegration und durch Landmarken unterteilt. Aus dem Flugprofil konnte abgelesen werden, wie lange die Bienen für die Phasen des Flugs benötigten, in welchem Hauptflugwinkel sie die erste Flugphase absolvierten, in welche Richtung sie am Ende der ersten Flugphase flogen und wie gerichtet der Flug war. Auch wurde erfasst, ob die Bienen überhaupt in der Lage waren zum Stock zurückzukehren. Hier zeigte sich, dass die Fütterung mit Zuckerwasser mit 0,6 µM und 0,9 µM Imidacloprid, ebenso wie mit 0,1 mM Thiacloprid zu einer verringerten Heimkehrwahrscheinlichkeit führte. In der ersten Flugphase konnte auch gezeigt werden, dass 0,2 µM Clothianidin im Zuckerwasser zu einem schnelleren Flug führte und dass der Flugwinkel im Vergleich zur Kontrolle in Richtung der wahren Position des Stocks verschoben war. Beide Imidacloprid-Gruppen zeigten eine ähnliche, signifikante Verschiebung des Flugwinkels, ebenso konnte im Flug selbst eine häufige Änderung der Richtung festgestellt werden. In der zweiten Flugphase zeigte sich, dass Bienen, welche mit Thiacloprid behandelt wurden häufiger eine inkorrekte Heimflugrichtung wählten, was in längeren Heimflügen resultierte. Die mit Clothianidin behandelten Bienen legten eine längere Flugstrecke zurück. Bienen, welche Imidacloprid beider Konzentrationen konsumierten, zeigten einen häufigen Wechsel ihrer Flugrichtung. Damit konnten bei allen drei gewählten Neonikotinoiden Einflüsse auf spezifische Komponenten der Navigation von Bienen gefunden und Einschränkungen im Heimkehr- und Orientierungsverhalten einzelner Sammlerinnen gezeigt werden. Somit konnten die eingehenden Fragen zumindest teilweise beantwortet werden und die Datenlage zur Frage der Schädlichkeit der, auch politisch umstrittenen, Substanzen erweitert werden.
Amphibians have existed on the planet for over 300 million years and are today one of the most diverse vertebrate classes in the world with over 7000 known species and still many more to be discovered. However, several studies assume that approximately one third of the world´s known living amphibians are directly threatened with extinction, making it the most endangered vertebrate class. In relation to the relatively small land mass that is occupied by the state of Panama, it supports one of the most diverse amphibian faunas. However, in many cases the ecological role of single species in a wider context and their habitat preferences are still poorly understood and subject to ongoing research. Modern taxonomic approaches in other tropical regions have shown that former assumptions of amphibian diversity were distinct underestimations of the actual species diversity; a situation that is probably also true for Panama. Concurrently, the collection of amphibian diversity data and the description of new species is a race against time. The amphibian fauna of the world and that of Panama in particular, has suffered from an unprecedented loss of diversity over the last 30 years. The reasons are manifold and include destruction, alteration, and fragmentation of their natural habitats as the main causes, but also the deadly amphibian disease chytridiomycosis caused by the fungal pathogen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd). In Panama and Costa Rica, this Emerging Infectious Disease (EID) spread in a wave-like manner from west to east causing mass die-offs and reduced amphibian diversity even in well-preserved habitats. The disease has primarily affected stream-associated highland species. The last large-scale evaluation of the conservation status of Panama´s amphibians through the IUCN Red List of Threatened Species in 2004 concluded that approximately 30% of the known species are acutely threatened with extinction. Furthermore, around 17% of the amphibian species that have been known back then lacked adequate data to be assessed. In view of Panama´s already overwhelming amphibian diversity, as well as the variety of habitats and the large number of sites that have not been examined with regard to amphibians before, I started this study with the conviction that the inventory of Panama´s amphibian diversity is far from being completed. Furthermore, when I started this study, it was uncertain if there would be any surviving amphibian species in areas where chytridiomycosis had emerged. The loss of whole amphibian communities in upland western Panama following Bd arrival led to a shift of amphibian research to lowland sites in central and eastern Panama aiming primarily on pathogen arrival and the documentation of epizootic outbreak and subsequent population decline. The situation of amphibian communities in areas post-decline was therefore largely unknown. Accordingly, the main goals of my study were to add to the taxonomic inventory of amphibians in Panama and to assess the situation of amphibian populations in habitats where chytrid-driven declines have been observed. To address these tasks I conducted fieldwork in western Panama with a focus on mountainous elevations between 1000 and 3475 m asl. Additionally, I visited different lowland sites between sea level and 1000 m asl to collect comparative material. In the period between 2008 and 2013, I conducted five collection trips to Panama that add up to a total of approximately 13 months in the field. I have sampled nine regions in western Panama and collected 767 specimens together with student collaborators, 531 of which were collected under my personal field number. Additional data obtained from those specimens include 68 male anuran call recordings, 102 standardized color descriptions of specimens in life, and 259 tissue samples that to date yielded 185 16S mtDNA sequences. This comprises the most comprehensive data set for amphibians of Panama and the first large-scale DNA barcoding approach for western Panama to date. After a preliminary DNA barcoding and subsequent comparative examination of morphological und bioacoustic data of all specimens collected, the number of taxonomic problems that needed to be addressed was higher than I previously anticipated. For most genetic lineages deeper taxonomic analyses were required to reach conclusive results. A selection had to be made with which lineages to proceed in the analyses, in view of the substantial financial and time expenditure that would be needed for a complete taxonomic revision. Therefore, I chose to run deeper analyses on one genus from each of the three amphibian orders in Panama. The genera selection depended largely on the availability of sufficient material and the scientific relevance of the respective genus.
I selected the genus Diasporus from the order Anura. These small frogs are omnipresent in many habitats and thus relatively easy to find. In addition, the genus is underrepresented in taxonomic studies. This is the first taxonomic study on the genus Diasporus to include a molecular phylogeny and the first comparison of advertisement calls between several populations from western Panama. In total, I collected 67 Diasporus specimens throughout western Panama and compared them morphologically with 49 additional specimens from Central America in collections, including the primary types of D. diasporus and D. hylaeformis. Additional comparative data were taken from literature. The DNA barcoding analysis of a fragment of the 16S rRNA gene included 43 own sequences that were complemented with 15 relevant GenBank sequences. In addition, I compared the advertisement calls of 26 male individuals among each other and with call descriptions from the literature. The DNA barcoding approach revealed several unnamed genetic lineages, but in some cases also resulted in the lumping of morphologically and bioacoustically distinct specimens. Generally, the morphological examination of the collected material revealed almost no specific characters that could be used to distinguish between genetic lineages. However, it was possible to identify species using a combination of several morphological characteristics. Which ones are relevant in the individual case depends on the respective species. My extensive collection of call recordings made it possible to test for the first time the intraspecific call variation of D. hylaeformis in dependency of various parameters. This analysis showed that the dominant frequency depends significantly on the body size of the calling male; the smaller the calling male, the higher the frequency of the call. A similar relationship was observed between the call rate and temperature: the lower the temperature during calling, the lower the call rate. I suppose that these general patterns, which have already been observed in other anuran genera, are also true in other Diasporus species that could not be tested in this study. Taking into account the intraspecific variation of Diasporus advertisement calls, I consider comparative call analyses to be the best way to distinguish between species. This is especially true in syntopic species. Integration of the three lines of evidence (i.e., morphology, DNA barcoding, and bioacoustics) led to the identification of four new species, two of which (i.e., D. citrinobapheus and D. igneus) colleagues and I have already formally described.
I conducted an integrative taxonomic analysis of the western Panamanian representatives of the genus Bolitoglossa from the order Caudata, the larger of the two Panamanian salamander genera. Bolitoglossa is very species-rich with a centre of diversification in the high mountains of Costa Rica and western Panama. I collected 53 Bolitoglossa specimens and compared them to twelve specimens in collection, including the holotype and one paratype of B. gomezi. The dataset was complemented with information from the literature. Among the sampled specimens were two species considered to be endangered that have not been collected or observed for several decades; B. magnifica has not been seen for 34 years and B. anthracina has not been seen for 22 years. Further, I collected salamanders at several new locations. To date, my 16S mtDNA barcoding analysis represents the densest taxon sampling for Panamanian Bolitoglossa composed of 21 own sequences that were combined in the final alignment with 47 GenBank sequences. Even though the molecular phylogeny is based only on a single marker, the received trees largely coincide with previous studies and the nodes received high statistical support. In these trees, I retrieve all previously defined subgenera and species groups. On the basis of this molecular phylogeny, I placed B. anthracina, here sequenced for the first time, in the B. subpalmata species group. Due to the fact that B. anthracina is a large and dark colored species it had previously been placed by implication in the B. schizodactyla species group along with other large black salamanders of the B. nigrescens species complex. Moreover, I found deep divergent genetic lineages among geographically separated populations of B. minutula. However, until now there were no additional morphological characteristics detectable to distinguish between these lineages. Additionally, my colleagues and I described a new deep divergent lineage in the B. robinsoni species group as B. jugivagans, a species new to science. In contrast, I found only minor genetic differences between specimens of B. sombra and B. nigrescens. After combining morphometric data and tooth counts from literature of both species with additional data from specimens of B. sombra that I collected near the type locality, the distinguishing features blurred. In particular, including much larger specimens of B. sombra, not yet known at the time of its description, showed that the tooth count difference is dependent on the size and age of the specimen examined. Larger specimens have more maxillary and vomerine teeth. Based on this evidence I regard B. sombra as a junior synonym of B. nigrescens. Further, I revised the Panamanian distribution of the two relatively common lowland salamanders, B. colonnea and B. lignicolor. Besides filling the gaps in the fragmentary known distributions of these species, I assessed the molecular and morphological variation of both species among populations in Panama. While there was little variation in B. lignicolor, I found divergent genetic lineages among geographically distinct populations of B. colonnea that require further taxonomic examination.
Caecilians (order Gymnophiona) are among the least investigated terrestrial vertebrates. After I received a first specimen of the predominantly South American genus Oscaecilia (family Caeciliidae) in western Panama, I started to work more extensively on the taxonomy of Caeciliidae in Central America. The specimens from western Panama were not readily assignable to a single described species, but shared characters with O. elongata and O. osae. While O. osae was only known from the holotype, the type material of O. elongata was destroyed during World War II. On the basis of the original description, the unique feature in O. elongata within Oscaecilia is the absence of subdermal scales in the posterior part of the body. In a referred specimen of O. elongata mentioned in the original description from eastern Panama, this characteristic cannot be examined as it consists of head and neck only. Therefore, I used non-destructive high-resolution, synchrotron-based X-ray micro CT imaging (HRμCT) to examine cranial characters in the specimens in question and took normal radiographs to count vertebrae and to make subdermal scales visible. I found that the fragmented specimen from eastern Panama likely belongs to the well-sampled species O. ochrocephala and has not much in common with O. osae or the specimens from western Panama. Contrarily, O. osae and the specimens from western Panama share many morphological characters, but also show some differences. Genetic barcoding revealed that both species are close relatives, but the genetic distance could not be finally resolved, because 16S sequences obtained from blood samples of living O. osae were of poor quality. Thus, I compare the Oscaecilia from western Panama to O. osae in this study, but postpone a taxonomic decision until further material becomes available. Further, I designate O. elongata a nomen dubium, because the type material is lost, the type locality is not defined in more detail than “Panama”, and the original description does not allow for a definite assignment. Since previous molecular studies only considered O. ochrocephala, the monophyly of Oscaecilia was never tested before. So far, the genus Oscaecilia is based largely on a single cranial character, the eyes covered with bone. Here, I combined two 16S mtDNA sequences of O. osae from Costa Rica and two sequences from O. sp. from western Panama with two sequences of O. ochrocephala and ten sequences of four species of the genus Caecilia, the sister genus of Oscaecilia. The resulted phylogeny contains two well-supported clades, one clade containing two species of Caecilia, one from Panama and one from western Ecuador and all species of Oscaecilia tested. The other clade consists of two species of Caecilia from the Amazon basin. I therefore assume that the split in both clades is due to the rise of the Andes, what led to today’s cis-trans-Andean distribution of the two clades. For now, to restore monophyly, I suggest to place Oscaecilia within the synonymy of Caecilia until more taxa have been tested. When assessing the conservation status of the amphibian species in mountainous western Panama, I first compiled a list of known species that I potentially could have found during my fieldwork. Using the IUCN categories, I analyzed how many of the endangered species I actually found and how these are distributed over families and species groups. Surprisingly, my rediscoveries of lost species were not equally distributed among the four families that comprise most endangered amphibian species (i.e., Bufonidae, Craugastoridae, Hylidae, and Plethodontidae). While I discovered ten of eleven endangered hylids and six of nine endangered plethodontids, I found only one of four endangered bufonids and none of the nine endangered craugastorids. I assume that the secretive living plethodontids, for which no Bd related declines have been documented, were just overlooked in the past decades. In contrast, I propose that hylids, in which Bd related population decline is well documented, developed distinct evolutionary solutions permitting coexistence with the pathogen. The situation is obviously different in bufonids and craugastorids, where I found no signs of population recoveries at present. So far, the only surviving populations of species from these families exist in climatic or physiographic niches that have probably shielded them from Bd. My data confirm the current view that the risk for naïve amphibian populations to decline during Bd epizootics is predicted by ecological traits (e.g., aquatic index, vertical distribution) and not dependent on taxonomic affiliation. However, I propose that only certain amphibian families (e.g., hylids and centrolenids) have the ability to acquire immunity solutions to coexist with the pathogen during enzootic stages. This is a very new perspective on the worst infectious disease in amphibians worldwide, allowing for new research approaches to understand the host-pathogen dynamics. Moreover, I examined where the share of surviving endangered amphibian species is particularly high in mountainous western Panama. As was to be expected, most of the endangered species are found within the boundaries of protected areas. One exception is the unprotected Cerro Colorado region in the Comarca Ngöbe-Buglé that provides habitat for a wide variety of endangered and undiscovered amphibian species. Nonetheless, planned open pit mining would destroy the forests in a large part of the area. This demonstrates once again that human activities are the biggest threat to amphibians in Panama and elsewhere.
Background. There is growing public and scientific concern about the occurrence of anthropogenic chemicals in the aquatic environment. Surface and groundwater serve as main drinking water resource. Especially in metropolitan areas these water reservoirs are impacted by organic pollutants predominantly originating from wastewater treatment plant (WWTP) effluents. The impact of wastewater derived anthropogenic chemicals is therefore related to environmental and human health concerns. In order to lower the potential environmental and human health risk from wastewater associated pollutants, strategies for enhanced pollutant removal are applicable in a medium-term perspective. Ozonation and powdered activated carbon treatment are the two advanced wastewater treatment technologies, which are technically mature as well as economically feasible for the application in large-scale wastewater treatment plants. While powdered activated carbon removes substances by adsorption, ozonation degrades a parent compound into oxidation products. Most of the available research has been done at lab-scale while onsite ecotoxicity tests and chemical analyses are rare.
Objectives. For a comparative evaluation of advanced wastewater treatments' potential to alter toxicity, a broad spectrum of ecotoxicological data need to be collected. The focus has been set on three major objectives: A) Evaluation of the endocrine activity; B) Evaluation of the unspecific toxicity; C) Evaluation of genotoxicity and mutagenicity.
Methods. The advanced treatment methods, ozonation and powdered activated carbon treatment of secondary wastewater effluents, – each equipped with subsequent sand filtration as additional post treatment step – were ecotoxico-logically characterized at a pilot-scale WWTP. For process control the elimination of 35 selected pharmaceuticals was identified by chemical analyses using HPLC-MS/MS.
The endocrine activity ((anti-)estrogenic, (anti-)androgenic, dioxin-like activity)) was characterized by yeast-based in vitro bioassays and cytotoxicity by cell based assays. Genotoxicity and mutagenicity was assessed using umuC'assay and Ames assay, respectively. All in vitro assays were performed using extracts of the wastewater samples. In vivo toxicity was assessed with the fish early life stage test with rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Ozonation was additionally assessed at a full-scale WWTP with in-vitro tests on endocrine activity and cytotoxicity and in vivo toxicity tests using five aquatic model organisms: Lemna minor, Daphnia magna, Chironomus riparius, Lumbriculus variegatus, Potamopyrgus antipodarum.
Results. In conventional activated sludge treated effluents the residual estrogenicity, antiandrogenicity, aryl hydrocarbon receptor agonistic activity and cytotoxicity were considerably reduced while antiestrogenicity was increased by both advanced treatment technologies. Ozonation led to an increase in genotoxic effects detected with Ames assay and with single cell gel electrophoresis of rainbow trout erythrocytes. Furthermore, mortality of rainbow trout was increased and reproduction of L. variegatus was decreased. Sand filtration lessened the genotoxic effects and adjusted reproduction of L. variegatus and mortality of rainbow trout to a similar level as conventional treatment.
Conclusions. This work demonstrates that conventional activated sludge treatment induces in vitro and in vivo toxicity. Advanced wastewater treatment combined with subsequent sand filtration can reduce in vitro and in vivo toxicity. An observed increase of endocrine activity after advanced wastewater treatment is an indication for different removal efficiencies of chemicals causing agonistic or antagonistic activity, respectively. Ozonation of wastewater generates ecotoxicity, which is largely removed by subsequent sand filtration. After a comprehensive investigation and after assurance of the removal of adverse effects, advanced treatment technologies could have beneficial effects on the ecological quality of the receiving water.
Die Substitution von klassischen, mit der Nahrungsmittelproduktion in Konkurrenz stehenden, Substraten wie Glukose durch alternative Kohlenstoffquellen in der Biotechnologie ist sowohl aus ethischer, als auch aus ökonomischer Sicht erstrebenswert. Diese Arbeit beschreibt die Synthese von Bulkchemikalien in Form zweier Dicarboxylsäuren und einer Feinchemikalie in Form eines Sesquiterpens aus dem alternativen Substrat Methanol mit Hilfe genetisch veränderter Stämme des methylotrophen α-Proteobakteriums Methylobacterium extorquens.
Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure sind Dicarboxylsäurederivate der CoA-Ester Mesaconyl- und (2S)-Methylsuccinyl-CoA, die als Intermediate im Ethylmalonyl-CoA- Weg (EMCP) vorkommen. M. extorquens nutzt den EMCP für die Regeneration von Glyoxylat, das für das Wachstum auf C1-Substraten wie Methanol obligatorisch ist. In dieser Arbeit konnte erstmals Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure de novo durch die Expression einer für die Vorstufen Mesaconyl- und (2S)-Methylsuccinyl-CoA aktiven Thioesterase produziert werden. Ein kobaltlimitiertes Wachstum von M. extorquens führte aufgrund mangelnder Cofaktorversorgung zweier Vitamin-B12-abhäniger Mutasen im EMCP zu einer Akkumulation der beiden CoA-Ester-Vorstufen, womit eine Produktion von 0.65 g/l Mesacon- und (2S)-Methylsuccinsäure erreicht wurde. Weitergehende Untersuchungen belegten außerdem einen positiven Effekt eines ausgeschalteten PHB-Zyklusses auf die Produktion der beiden EMCP- Dicarboxylsäurederivate.
Diese Arbeit beinhaltet zusätzlich grundlagenwissenschaftliche Untersuchungen zur Substitution der EMCP-katalysierten Glyoxylatregeneration durch einen heterologen Glyoxylatzyklus in EMCP-negativen M. extorquens-Stämmen. Dabei konnte erstmals ein methanolverwertendes, methylotrophes Bakterium identifiziert werden, das einen Serin-Zyklus in Kombination mit dem Glyoxylat-Zyklus zur Kohlenstoffassimilation verwendet, ohne dabei zusätzliche Stoffwechselwege zur CO2-Fixierung wie den EMCP, RuMP oder CBB-Zyklus zu verwenden.
Die Präsenz einer nativen C30-Carotinoidbiosynthese, ausgehend von der Vorstufe Farnesylpyrophosphat (FPP), empfiehlt M. extorquens als Produktionsorganismus für (Sesqui-)Terpene. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe einer induzierbar gesteuerten Expression einer Terpensynthase in Form einer α-Humulen-Synthase, einer FPP-Synthase und eines prokaryontischen Mevalonatweges, erstmals die de novo Synthese eines Terpens aus Methanol am Beispiel des α-Humulens etabliert. Durch optimierte Expressionen der Terpensynthase, FPPS und einzelner MVA-Gene mit Hilfe angepasster Translationsinitiationsraten der jeweiligen ribosomalen Bindestellen und der Verwendung eines in der nativen Carotinoidbiosynthese inhibierten M. extorquens-Stammes wurden finale Produkttiter von bis zu 1.65 g/l α-Humulen in Fed-Batch-Fermentationen erreicht.
Diese kumulative Dissertation beinhaltet außerdem einen Reviewartikel, in dem der verwendete Mikroorganismus M. extorquens in mikrobiologischer, genetischer, biochemischer und auch biotechnologischer Hinsicht ausführlich beschrieben wird. Zudem gibt ein Buchkapitel eine Übersicht über die Verwendung von Methanol in der Biotechnologie.
Seit mehr als 200 Jahren gibt es durch die Wissenschaftler der Wetterstation auf dem Hohenpeißenberg systematische Wetterbeobachtungen, doch erst seit wenigen Jahren gibt es unter den Klimaforschern einen Konsens, dass sich das Klima durch anthropogene Einflüsse schon verändert hat – und weiter verändern wird. Die bisherigen Auswirkungen, wie zum Beispiel ein globaler Temperaturanstieg von 0,85°C seit Beginn der Industrialisierung, sind heute gut belegbar. Mögliche zukünftige Entwicklungen des Klimas werden heute ebenso erforscht wie die Auswirkungen des Klimawandels auf Mensch und Umwelt. Zu diesen Auswirkungen gehören unter anderem Folgen für die Landwirtschaft. Durch veränderte Niederschläge und den Temperaturanstieg werden sich die Lebensbedingungen von Bodenorganismen und Anbaubedingungen für Pflanzen ändern. Letztendlich ist aufgrund dieser Veränderungen auch ein verstärkter Einsatz von Pestiziden zu erwarten. Allerdings wurde bisher kaum untersucht, ob der Einsatz von Pestiziden in der Landwirtschaft unter den Bedingungen des Klimawandels (konkret durch die Interaktion von klimatischen und chemischen Faktoren) ein erhöhtes Umweltrisiko für Bodenorganismen darstellt. Bisher werden klimatische Faktoren bei den Tests für die Zulassung von Pestiziden nicht berücksichtigt.
Daher wurde diese Fragestellung in der hier vorliegenden Dissertation am Beispiel der Effekte von zwei zugelassenen Pestiziden auf Bodenorganismen unter verschiedenen klimatischen Bedingungen untersucht. Konkret wurden dazu mit Labor- und Halbfreilandversuchen die Wirkung eines Insektizids und eines Fungizids in Interaktion von Temperatur und Bodenfeuchte auf Vertreter zweier Invertebratengruppen (Collembola: zwei Arten; Enchytraeidae: eine Art) untersucht.
In einem modifizierten Standardtest mit Collembolen erhöhte sich die Toxizität des Insektizids Lambda-Cyhalothrin, wenn die Exposition der beiden Arten bei einer erhöhten Bodenfeuchte stattfindet. Die kühl adaptierte Art Folsomia candida reagierte bei erhöhter Testtemperatur am empfindlichsten auf diese Testsubstanz: Die EC50 aus diesem Experiment lag bei 2,84 mg (a.s.)/kg Boden Trockengewicht (dw). Unter Standardbedingungen, wie sie in Tests für die Zulassung von Pestiziden angewandt werden, lag die EC50 von F. candida dagegen bei 8,65 mg a.s./kg dw.
Unter den gleichen Versuchsbedingungen wurde auch das Fungizid Pyrimethanil an Collembolen getestet. Hier erwies sich die Testsubstanz für beide Arten bei
gleichzeitigem Trockenstress und / oder erhöhter Temperatur als toxischer im Vergleich zu den Standard-Testbedingungen. Dabei zeigte F. candida mit einer EC50 von 28,3 mg a.s./kg dw die höchste Empfindlichkeit. Ohne die veränderten klimatischen Faktoren, betrug die EC50 von F. candida 52,3 mg a.s./kg dw.
In Reproduktionstests mit der Enchytraeen-Art Enchytraeus bigeminus wurde die Bodenfeuchte als klimatischer Faktor in Kombination mit jeweils einer Testsubstanz untersucht. Bei beiden Chemikalien reagierte E. bigeminus in trockenem Boden empfindlicher. Die ermittelten EC50 betrugen 1,34 mg a.s./kg dw für Lambda-Cyhalothrin und 437 mg a.s./kg dw für Pyrimethanil. Getestet unter Standardbedingungen lagen die EC50-Werte bei 3,79 bzw. 499 mg a.s./kg dw.
Neben den Laborexperimenten wurden Tests in „Terrestrischen Modellökosystemen“ (TME) mit den gleichen Chemikalien in Kombination mit variierender Bodenfeuchte als klimatischer Faktor vorgenommen. Diese Experimente wurden in Deutschland und in Portugal durchgeführt, um die Reaktion einer zentraleuropäischen und einer mediterranen Artengemeinschaft zu untersuchen. Aus der terrestrischen Lebensgemeinschaft wurden verschiedene Organismengruppen untersucht. Die Effekte auf Enchytraeen aus dem Experiment mit Pyrimethanil waren als Veröffentlichung Teil dieser Dissertation. In der portugiesischen Halbfreilandstudie wurden keine Effekte auf die Enchytraeen durch Pyrimethanil bei umweltrelevanten Konzentrationen festgestellt, jedoch beeinflusste die Bodenfeuchte die Zusammensetzung der Artengemeinschaft. Im deutschen TME-Experiment wurde eine verstärkte Wirkung des Fungizids in trockenem Boden festgestellt, d.h. die jeweiligen Effektkonzentrationen (niedrigste EC50 3,48 mg a.s./kg dw für Fridericia connata in trockenem Boden) lagen deutlich unterhalb der aus den Labortests mit Enchytraeus bigeminus bekannten Werten (499 mg a.s./kg dw).
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass klimatische Faktoren die Effekte von Pflanzenschutzmittel auf Bodenorganismen beeinflussen können. Für Laborversuche ist eine generelle Berücksichtigung von klimatischen Faktoren im Zulassungsverfahren aus heutiger Sicht zu weit gegriffen. Die TME-Versuche zeigten sich als geeignetes Testverfahren, interaktive Effekte von Pestiziden und Klima bzw. multiplen Stressoren generell auf Artengemeinschaften zu untersuchen. Für TME-Experimente wäre unter Beachtung der Vielzahl möglicher Fragestellungen, Endpunkte und moderner statistischer Auswerteverfahren eine internationale Richtlinie wünschenswert.
Resistance in glucocorticoid-induced apoptosis is associated with poor prognosis for long term survival in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). As Smac mimetics have been shown to reactivate apoptosis by antagonizing Inhibitor of Apoptosis (IAP) proteins, we investigate the potential of the Smac mimetic BV6 to overcome glucocorticoid-resistance in ALL. This study shows that BV6 synergistically cooperates with glucocorticoids to trigger apoptosis and to suppress clonogenic growth of pediatric ALL cells. Of note, the BV6/glucocorticoid combination treatment also induces cell death in cells having defects in the apoptotic signaling cascade by inducing a switch from apoptotic to necroptotic cell death. The clinical relevance of our novel combination treatment is underscored by parallel experiments in primary pediatric ALL samples, in which glucocorticoids and BV6 act together to induce cell death in a synergistic manner. Importantly, the addition of BV6 enhances the anti-leukemic effects of glucocorticoids in an in vivo mouse model of pediatric ALL without causing substantial side effects, highlighting the potency of a BV6/glucocorticoid combination treatment. In contrast, BV6 does not increase cytotoxicity of glucocorticoids against several non-malignant cell types of the lympho-hematopoietic system. Furthermore, we have identified the novel underlying mechanism of BV6/glucocorticoid-induced apoptosis by showing that BV6 and glucocorticoids synergistically act together to promote assembly of the ripoptosome, a RIP1/FADD/caspase-8-containing cell death complex. Ripoptosome assembly is critically required for BV6/Dexamethasone-induced cell death, since genetic silencing of its members, i.e. RIP1, reduces ROS production, caspase activation and most importantly cell death induction. BV6/glucocorticoid combination treatment promotes ripoptosome assembly by inhibition of both of its negative regulators, IAP proteins and cFLIP. Thus, we identify that BV6 and glucocorticoids cooperate together to reduce cIAP1, cIAP2 and XIAP protein levels and cFLIP expression. Ripoptosome formation occurs independently of autocrine/paracrine loops of death receptor ligands, since blocking antibodies for TNFα, TRAIL or CD95L or genetic silencing of their corresponding receptors fail to rescue BV6/glucocorticoid-induced cell death. In summary, this study shows that the Smac mimetic BV6 sensitizes for glucocorticoid-induced apoptosis by promoting ripoptosome assembly with important implications for the treatment of childhood ALL.
Reading is an essential ability to master everyday life in our society. The ability to read is based on specific connections between brain regions involved in the reading process – so-called cortical networks for reading. These cortical networks for reading allow us to learn the correct identification of visual words. The use of visual words is based on knowledge about the orthography (lexical) and the meaning of words (semantic). This knowledge must be acquired by beginning readers (first grader), i.e. beginning readers learn in a first step to link letters to a whole word and in a second step associate this whole word with meaning. To retrieve this knowledge during visual word recognition (VWR) a cortical network for lexical-semantic process must be activated. However, it is currently unclear whether beginning readers and reading experts activate the same neuronal network during VWR. Therefore, the aim of this thesis was to investigate the question whether beginning readers (first grader, children) and reading experts (adults) use different cortical networks for the lexical-semantic processing in VWR.
To address this question we recorded electroencephalographic (EEG) activity during VWR in children and adults. Children and adults were instructed to read a visualizable word to compare this word with a following picture stimulus. The first part of this thesis is concerned with the analysis of ERPs for visual word recognition in children and adults at sensor level. For both groups we observed the typical ERP components P100 and N170 for visual word recognition. These components differed in amplitude and time course between both groups. The second part of this thesis investigated the neuronal generators (brain areas) of ERPs during VWR and possible differences between children and adults at source level. We observed a high overlap in brain areas involved during VWR in children and adults. However, the brain areas differed in activation and time course between children and adults. Finally, the third and most important part of the thesis investigated the question whether children and adults use different cortical networks for the lexical-semantic processing in VWR over time. To address this question Dynamic Causal Modeling (DCM) and Bayesian model comparison were used. We compared nine biologically plausible cortical network models underlying the ventral lexical-semantic path in VWR. In addition, increasing time intervals were used to consider possible changes of network structure during VWR. The network models included eight brain regions (four bilateral pairs) involved in the lexical-semantic processing in VWR: occipital cortex (OC), temporo-occipital part of inferior temporal gyrus (ITG), temporal pole (TP), and inferior frontal gyrus (IFG). In almost all time intervals we found evidence that children and adults use the same cortical networks for the lexical-semantic processing in VWR. However, we found differences between adults and children in the connection strengths of the favoured model. Interestingly, we found a stronger direct connection from OC to IFG in adults compared to children.
In conclusion, our results suggest that children and adults activate largely the same lexical-semantic networks during VWR over time. This supports the notion that children and adults use the same biological fiber connections for VWR. However in contrast to children, adults showed increased use of the shortcut pathway from OC to IFG. The increased use of the shortcut pathway from OC to IFG in adults can be interpreted as consequence of learning. Learning causes in accordance with the Hebbian learning rule (“neurons that fire together, wire together” (Hebb, 1949)) synaptic change. Consequently the frequent coactivation of the input and output stage of OC and IFG during the lexical-semantic process facilitates the stronger direct connection between both brain areas. The stronger direct connection from OC to IFG most likely allows adult reading experts to speed up the lexical-semantic process during VWR. Accordingly, we conclude that the stronger direct connections from OC to IFG in adults compared to children underlay the different reading capabilities in both groups.
In conclusion our data show, that Flightless I function is essential for striated muscle development in zebrafish. Myofibrillar bundling and focal adhesion formation represent the basis for this development, and are ultimately a prerequisite for cardiac trabeculation. Future analysis of Actin polymerization in trabeculation will provide addition knowledge about the sensitivity of the developing and adult heart to a disequilibrium in F-actin versus G-actin availability.
In this study we found a novel ErbB2-dependent cardiomyocyte maturation process which affects both cardiac chambers. It will be of great interest to further study the nature of the Memo1-GFP cell-cell junctions and other junction proteins in order to unravel the significance of this maturation process for heart development.
Interestingly we found, that memo1bns4 homozygous mutant animals, which we generated with CRISPR/Cas9 technology, develop indistinguishable from siblings, suggesting that zygotic memo1 expression is dispensable for zebrafish development. Future studies will address the question if maternal zygotic memo1bns4 mutants will develop a heart or vascular phenotype as reported form Memo1 knockout mice or as observed in memo1 morphants in this study.
In cultured C2 mouse skeletal muscle cells the Golgi-apparatus relocalizes dependent on centrosomal proteins and independent of microtubules. We describe here that zebrafish cardiomyocytes have a similar Golgi-complex distribution suggesting a similar differentiation-dependent reorganization. This striated muscle specific, fragmented Golgi distribution might be an advantage for these cells in order to shuttle vesicles through the densely packed sarcomere structures. Future studies could address the timing of the Golgi-reorganization in cardiomyocytes during development and possibly use this Golgi-zebrafish line as a tool to study cardiomyocyte maturation in disease models and in heart regeneration.
Dissecting the complexities of mammalian heart development and regenerative capacity require thorough understanding of the underlying molecular mechanisms through the expression pattern of proteins and post-translational modifications. To obtain insights intoactivated signaling pathways that control the cellular phenotype during postnatal heart development, we generated a comprehensive map of phosphorylation sites. In total we identified 21,261 phosphorylation sites and 8985 proteins in developing mouse hearts by mass spectrometry. The in-vivo SILAC (stable isotope labeling of amino acids in cell culture) approach allowed robust quantification of phosphorylation sites and proteins, which are regulated during heart development. We found several activated pathways involved in cell cycle regulation and detected numerous kinases and transcription factors to be regulated on protein and phosphopeptide level. Most strikingly, we identified a novel mitochondrial protein, known previously as Perm1, as a highly phosphorylated factor regulated during heart development. We renamed Perm1 as MICOS complex subunit Mic85 since it shows robust physical interaction with MICOS complex subunits, including Mitofilin (Mic60), Chchd3 (Mic19), Chchd6 (Mic25) and the outer membrane protein Samm50. Moreover, Mic85 is localized to the mitochondrial inner membrane facing the intermembrane space and the dynamics of Mic85 protein expression is regulated by the ubiquitin-proteasomal system through phosphorylation of casein kinase 2 on its PEST motif. Silencing of Mic85 in cultured neonatal cardiomyocytes impairs mitochondrial morphology and compromises oxidative capacity. Our findings support a clear role for Mic85 in the maintenance of mitochondrial architecture and in its contribution to enhanced energetics during developing and adult mouse cardiomyocytes. The transgenic Mic85 knockout mouse generated with a GFP knock-in will support future in vivo investigations on the integrity of mitochondria and the function of Mic85 in cardiac development.
The metabolome of any live cell consists of several hundred, if not thousands of different molecules at any given moment, be it a relatively small bacterial cell or a whole multicellular organism. Although there are continuous attempts to differentiate between primary and secondary metabolites, the borders often blur in the eye of almost perfect interconvertability of all such matter. With chemistry and physics dominating this domain of biology it is an interdisciplinary endeavor to tackle the questions surrounding the workings of the metabolic pathways involved, searching for answers that ultimately help us to better understand life and find solutions to problems that affect us humans. One area of biochemistry that serves as a formidable example of the intertwined primary and secondary metabolic pathways are fatty acids, essential components of bacterial membranes, sources of energy and carbon but also important building blocks of several natural products. The second area to be mentioned is the metabolism of amino acids, the basic components of proteins and enzymes, which also serve as precursors to a diverse set of metabolites with many biological purposes.
This work focuses on these two areas of biochemistry, as several intermediates of their metabolism serve as building blocks for complex secondary metabolites whence many interesting and bioactive natural products are derived. The powerful and relatively novel tool of click-chemistry is employed to track azide-labeled precursors of primary and secondary metabolism in various bacterial strains to observe biochemistry at work and adds to the knowledge gained through other methods. The methods presented in this work serve the observation of fatty acid biosynthesis, degradation, modification and transport through direct ligation of azido fatty acids with cyclooctynes on one hand, leading to a revision of fatty acid transport in general. On the other hand a cleavable azide-reactive resin is devised to generally track the fate of azidated compounds through the myriads of metabolic pathways offered by entomopathogenic bacteria possessing a rich secondary metabolism. The resulting findings led to the identification of several antimicrobial peptides, amides and other compounds of which many had remained so far undetected in the strains that underwent investigation, underlining the worth of this method for future metabolomic research and beyond.
Cyanobacteria belong to the most widely distributed microorganisms in the biosphere and contribute significantly to global primary production. Their metabolism is based on oxygenic photosynthesis and some cyanobacteria can fix elemental nitrogen. Obligate photosynthetic diazotrophs have a particularly high iron demand in comparison to heterotrophic bacteria. Nevertheless the understanding of iron acquisition in cyanobacteria is just beginning to emerge. Iron acquisition in bacteria comprises highly specific transport of siderophore-iron complexes over the outer membrane by TonB-dependent transporter (TBDT). The transport itself is active and energized by a multi-complex localized to the inner membrane termed the TonB-system (TonB-ExbB-ExbD). The siderophore-iron complexes are further transported into the cytosol by a binding protein dependent ABC-transporter. Cyanobacterial iron acquisition response has most extensively been studied in unicellular, non-siderophore synthesizing cyanobacteria in the genus Synechococcus and Synechocystis. Anabaena sp. PCC 7120, however, is a different model organism as it is a freshwater living, siderophore synthesizing and, truly multicellular microorganism. It can be assumed that siderophore synthesis and siderophore-dependent iron uptake are tightly coordinated processes, therefore Anabaena represents a different model organism as compared to non-siderophore producing cyanobacteria. Moreover the surprisingly abundant protein family of 22 putative TBDTs in Anabaena indicates a high complexity of TonB-dependent uptake systems. Sequence similarity analysis revealed 4 putative tonB encoding genes (alr0248, all3585, all5036, alr5329), 2 putative exbB-exbD encoding gene cluster (alr0643-alr0644, all5047-all5046), one single standing putative exbB encoding gene (alr4587) and several hypothetical binding-protein-dependent ATP binding cassette (ABC)-type transporter encoding genes (fhu-, fec- and fut-type transporter).
In this study the respond of the predeicted systems to iron-limiting conditions was analysed by qRT-PCR. The expression analysis revealed on the one hand an enhanced transcription of all5036 (tonB3), all5047-all5046 (exbB3-exbD3) and the fhu-like encoding genes (all0387-all0389) under iron-limitation and at the same time down-regulation of expression under enhanced iron concentrations. Summerizing the transcription profile of the tonB3- and the fhu-system showed an expression regulated by iron-availability. To further characterize the role of TonB3-, ExbB3- and the Fhu-system, mutants thereof were generated. None of the generated mutants, except for the exbB3 mutant, could be fully segregated, suggesting an essential character of the genes. Characterization of the mutants revealed enhanced expression of iron-starvatrion indicator genes (isiA, fhuA) and altered growth of the tonB3 mutant under iron-limiting conditions. The iron starvation phenotype was further strengthened by enhanced siderophore secretion in the tonB3, exbB3 and fhuC mutants. Taken as a whole the results strongly indicate involvement of the tonB3- and the fhu-system in siderophore-dependnet iron uptake in Anabaena.
Investigation of the tonB2 (all3585) mutant under iron and citric acid limitation resultated in altered growth of the mutant. However, growth could be restored by addition of iron chlorid. Therefore a connection of the TonB2 protein to iron uptake is implied and further supported by ressitance to toxic iron concentrations. Lastly, mutation of tonB1 (alr0248) reuslted in insensibility to toxic manganese and copper concentrations and macrolid antibiotics. The altered permeability of the outer membrane may be a result of decreased expression of seven putative porin encoding genes in the mutant. A possible role in transcriptional regulation of porin expression is discussed.
Snake bite envenoming often results in disability or death of breadwinners of poor families in the rural tropics and the subtropics of Nepal. Identification of the medically relevant snake species, circumstances of venomous snake bites, prehospital care of their bites and human responses to snakes and snake bite is, therefore, crucial to enable victims or first aider to select the appropriate first aid measures, physicians to anticipate complications and to use appropriate treatment protocols as well as the local community to implement prevention strategies. Inadequate educational gaps exist in Nepal and hinder identification of snakes involved in bites. To fill this gap, I aim to provide an evidence-based list of medically relevant snake species. Snake specimens brought by patients bitten or their attendants from the tropical and subtropical regions in southeastern, southcentral, and southwestern Nepal to snake bite treatment centres over a period from 2010 through 2014, were taxonomically identified and medical records of envenoming were evaluated.
In Nepal, the epidemiology of snake bite is poorly known. Here I describe the ecological circumstances of proven krait (Bungarus spp.) and Russell´s Viper (Daboia russelii) bites to elucidate and examine, whether environmental circumstances or human behaviour contributed to envenoming. In a cross-sectional study, data about prehospital care, environmental circumstances of 46 krait and 10 Russell´s Viper bites were evaluated. Patients were interviewed using structured interview forms. Snake bite prone communities were surveyed to test people´s knowledge on snakes and their attitude towards venomous snakes in general.
Of 349 snakes involved in bites, 199 (57%) specimens were found to be medically relevant venomous snakes that included 11 species belonging to six genera and two families. Among them, Naja naja (n = 76, 22%), Bungarus caeruleus (n = 65, 19%) and Trimeresusurs albolabris (n = 10, 3%) were the most widely distributed snakes. Daboia russelii (n = 10, 3%) was found to be restricted to the southwestern part of Nepal. For B. walli, a previously poorly known species, 13 voucher specimens represent the first country records of this species as well as the first documented cases of involvement in snake bite envenoming by this species in Nepal.
Numerous snake bites (33%) occurred at night, during the rainy season, and are mainly due to Bungarus species, particularly B. caeruleus. Bites of cobras and Russell’s Vipers are a risk at daytime. Evaluation of data regarding the place where the bite happened, indicates that the snake bite risks appear to be as high in residential areas, in and around houses, as in rural areas. In cases of kraits (n = 46), 61% of the bites occurred while the victim was sleeping indoors, those of Russell´s Vipers mainly during agricultural activities in the fields. Analysis of socio-demographic data revealed that both krait and viper bites predominantly affected farmers or their family members. However, snake bites involved also people of higher socio-economic status, which suggests that it is not a health problem of poor people only living in the rural areas of Nepal.
A small number of snake bite victims (n = 7) sought help from traditional healers, but most patients went to hospitals for medical treatment using motorbikes (65%) or were transferred by ambulance cars (22%). As a first aid measure, most patients (78%) had used a tourniquet, which is of doubtful value and has often severe sequelae, instead of applying the WHO recommended pressure immobilisation bandage or local compression pad. The overall case fatality rate was calculated to be 10%, but up to 17% in cases of Bungarus spp. bites.
Rural community people were found to be extremely afraid of snakes, a major reason for indiscriminate killing of even harmless snakes, e.g., Lycodon aulicus, which were wrongly considered to be venomous. This is mainly due to the poor knowledge on snakes in general and on their role in providing ecological services, which may eventually lead to a decline in snake populations and even the extinction of rare species.
The results of the present study strongly emphasize that snake bite is an important public health issue in Nepal. There is an urgent need to improve the knowledge of people on snakes and to try changing their attitudes towards these reptiles, in addition to documenting the biodiversity and distribution of medically relevant snakes, the epidemiology and circumstances of their bites. Avoiding high-risk behaviour (e.g., killing of snakes), using screened doors and windows are some of the suggested measures preventing snake bite. Early and accurate identification of the snakes involved should help physicians to apply timely treatment, eventually referring the patient to the appropriate hospital. This also has important implications in developing public health and conservation strategies, to the benefit of the people of Nepal.
The timing and duration of leaf deployment strongly regulate earth-atmosphere interactions and biotic processes. Leaf dynamics therefore have major implications for life on earth, including the global energy balance, carbon and water cycles, feedbacks to climate, species extinction risk and agriculture. Evidence of shifts in the timing of leaf deployment and senescence (leaf phenology) as a result of climate change has been accumulating over the past decades, particularly in relation to spring phenology in the northern hemisphere. However, leaf phenological change in other parts of the world has received less attention. This thesis quantifies global phenological change over the past three decades using remotely sensed data. Phenological change was found to be widespread and severe, also in the southern hemisphere. While the detected change testifies of the phenological plasticity of many plant species, it is not clear if the duration of leaf deployment (leaf habit) is equally sensitive to environmental change. Since evergreen and deciduous leaf habits are often distinctly sorted along environmental gradients, ecologists have hypothesised that these patterns result from natural selection for an optimal leaf habit, under a given environmental regime. Such evolutionary convergence can be examined by testing if the physiological niche that is occupied by a particular leaf habit (evergreen or deciduous) is similar among regions with distinct evolutionary histories. Using a process-based model of plant growth and a constructed map of evergreen and deciduous vegetation, the physiological niche of leaf habits was quantified in four global biogeographic realms. Substantial niche overlap was found between the same leaf habit in different realms, suggesting evolutionary convergence of the physiological niche. This implies a sensitivity of leaf habit to environmental change, as environmental variables determine the geographic space where the physiological niche allows a positive carbon balance, and therefore occurrence of the leaf habit. Since the physiological niche consists of the integrated effects of physiological traits and trade-offs, environmental dependencies and leaf habit and phenology, an understanding of the carbon economy of individual plants requires decomposing the physiological niche into its components. Using empirical data on leaf phenology, leaf habit and physiological processes from woody species in a seasonally dry African savanna, a simple carbon balance model was parametrised. Carbon gain varied considerably between species as a result of substantial variation in leaf habit, leaf phenology and physiological traits. The multiple lines of evidence in this thesis therefore suggest that, while convergent selective forces may determine the dominant leaf habit in a particular environment, inter-specific variation is substantial, potentially as a consequence of historical contingencies or competitive interactions.
Der Pilz Podospora anserina ist seit mehr als fünf Jahrzehnten ein wichtiger Modellorganismus für die Alternsforschung. Insbesondere die Mitochondrien, essentielle eukaryotische Zellorganellen – wegen ihrer Funktion im Energiestoffwechsel häufig auch als „zelluläre Kraftwerke“ bezeichnet, sind Schlüsselfaktoren für den Alterungsprozess dieses Organismus.
Im Rahmen einer vorangegangenen Diplomarbeit wurde daher der Einfluss der mitochondrialen CLPXP-Protease, einem bisher noch wenig erforschten Bestandteil der Proteinqualitätskontrolle in Mitochondrien, auf die Alterung von P. anserina untersucht. Mitochondriale CLPXP-Proteasen sind, wie auch ihre bakteriellen Pendants, aus zwei verschiedenen Untereinheiten aufgebaut: der Protease-Komponente CLPP und der Chaperon-Komponente CLPX. Die Deletion des Gens PaClpP, kodierend für CLPP in P. anserina, führte zu einer überraschenden Verlängerung der gesunden Lebensspanne der Mutante. Darüber hinaus war es möglich, den pilzlichen PaClpP-Deletionsstamm durch Einbringen von CLPP des Menschen zu komplementieren. Dies beweist, dass die Proteasen CLPP des Menschen und von P. anserina funktionell homolog sind. Dadurch eröffnete sich die Perspektive, diesen einfachen Modellorganismus für die Gewinnung potenziell auf den Menschen übertragbarer Erkenntnisse einzusetzen. Bedeutenderweise ist die menschliche CLPXP-Protease wahrscheinlich involviert in die Entstehung verschiedener Krankheiten, darunter das Perrault-Syndrom sowie einige Krebsarten. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch weitestgehend unverstanden.
Ziel des in dieser Dissertation beschriebenen Forschungsprojektes war daher die Gewinnung genauerer Einsichten in die molekulare Funktion und die daraus folgende biologische Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease von P. anserina. Der wohl wichtigste Punkt für das detaillierte Verständnis einer Protease ist die Kenntnis ihres Substratspektrums, d. h. der von ihr abgebauten Proteine. Tatsächlich wurde aber bis heute noch in keinem eukaryotischen Organismus eine umfassende Analyse der Substrate einer mitochondrialen CLPXP-Protease vorgenommen. Um diese Wissenslücke zu füllen, wurde in der vorliegenden Arbeit eine ursprünglich in Bakterien entwickelte Verfahrensweise, der sogenannte CLPP „Substrat-trapping Assay“, in P. anserina implementiert. Dafür mussten zunächst die notwendigen handwerklichen Voraussetzungen für den Assay geschaffen werden, insbesondere die effiziente Affinitätsaufreinigung von Proteinen aus isolierten Mitochondrien – einer bisher in P. anserina noch nicht angewandten Technik. Unter Verwendung verschiedener neu hergestellter Varianten der menschlichen Protease-Komponente CLPP, darunter einer proteolytisch inaktiven Variante zum „Einfangen“ von Substraten, konnte der CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina erfolgreich durchgeführt werden. Insgesamt wurden, in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Julian D. Langer (Max-Planck-Institut für Biophysik; Durchführung von massenspektrometrischen Analysen) nahezu 70 spezifische Proteine erstmalig als potenzielle Substrate oder Interaktionspartner einer mitochondrialen CLPXP-Protease identifiziert. Bei einem Großteil dieser Proteine handelt es sich um Enzyme und Komponenten verschiedener Stoffwechselwege – vor allem um solche, die eine zentrale Rolle im mitochondrialen Energiestoffwechsel spielen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen somit folgende Arbeitsthese als Schlussfazit und gleichzeitig Ausganspunkt für zukünftige Untersuchungen nahe:
Die hauptsächliche molekulare Funktion der mitochondrialen CLPXP-Protease in P. anserina ist die Degradation von Stoffwechselenzymen und ihre biologische Rolle demnach die Kontrolle und Aufrechterhaltung des mitochondrialen und zellulären Energiestoffwechsels.
Insgesamt ist die auf Grundlage des CLPP „Substrat-trapping Assay“ in P. anserina anzunehmende Rolle der mitochondrialen CLPXP-Protease als regulatorische Komponente des mitochondrialen Energiestoffwechsels erstaunlich gut mit Beobachtungen in anderen eukaryotischen Organismen, gerade bezüglich der Relevanz der CLPXP-Protease des Menschen für diverse Krankheiten, zu vereinbaren. Somit erscheint es überaus sinnvoll und vielversprechend, dass in dieser Doktorarbeit erstellte und bisher beispiellose Kompendium potenzieller in vivo Substrate und Interaktionspartner dieser Protease auch als Referenz für zukünftige Untersuchungen außerhalb von P. anserina anzuwenden.
Das Enzym 5-Lipoxygenase (5-LO) spielt eine entscheidende Rolle in der Generierung von Leukotrienen. Diese fungieren als wichtige proinflammatorische Mediatoren. Darüber hinaus ist die 5-LO anhand ihrer N-terminalen Domäne in der Lage mit verschiedenen Proteinen zu interagieren. Unter den Interaktionspartnern befindet sich Dicer, ein Enzym welches für den finalen Schritt der microRNA (miRNA)-Biosynthese verantwortlich ist. MiRNA sind kurze, nicht kodierende RNA Stränge mit einer typischen Länge von etwa 23 Nukleotiden, die an der posttranskriptionalen Regulierung der Proteinbiosynthese beteiligt sind.
Ziel dieser Arbeit war es den Einfluss der 5-LO auf die miRNA-Prozessierung im zellulären Kontext zu untersuchen. Als Modellsystem wurde die MonoMac6 (MM6) Zelllinie ausgewählt. MM6-Zellen exprimieren im undifferenzierten Grundzustand nur geringe Mengen an 5-LO. Erst nach Differenzierung mittels transformierenden Wachstumsfaktors ß (TGFß) und Calcitriol kommt es zur Induktion der 5-LO Proteinbiosynthese. Darüber hinaus war es Basavarajappa et al. möglich die 5-LO-Expression in diesen Zellen mittels RNA-Interferenz stark herunter zu regulieren (Δ5-LO).
Um die Frage der Auswirkungen des 5-LO knockdowns auf die miRNA-Expression analysieren zu können, wurde ein Microarray in differenzierten Kontroll-und Δ5-LO-Zellen durchgeführt.Es wurden 37 miRNAs identifiziert deren Expression 5-LO abhängig ist. Dabei war das Niveau von 30 Vertretern in Abwesenheit der 5-LO erhöht, wohingegen die Expression von sieben miRNAs reduziert war. Unter diesen sieben herunter regulierten miRNAs befanden sich miR-99b-5p und miR-125a-5p, die einem gemeinsamen Cluster entstammen. Als Cluster wird eine Gruppe von miRNAs bezeichnet, die aus einem gemeinsamen primären Transkript (pri-miRNA) hervorgeht. Diese Eigenschaft führte zur Vermutung, dass bereits die Expression dieser pri-miRNA durch die 5-LO reguliert wird. Allerdings zeigte sichim Verlauf dieser Arbeit, dass die Expression der pri-miRNA 5-LO unabhängig verläuft. Im Gegensatz dazu wies die Zwischenstufe zwischen pri-miRNA und reifer miRNA eine reduzierte Expression in Δ5-LO Zellen auf. Für die Prozessierung dieser sogenannten precursor miRNAs (pre-miRNA) ist die Ribonuklease III Drosha verantwortlich, welche die pre-miRNA aus der jeweiligen pri-miRNAs chneidet. Das verringerte pre-miR-99b-und pre-miR-125a-Niveau ist daher ein Hinweis darauf, dass überDicerhinausmöglicherweise ebenfalls die Drosha Aktivität mittels 5-LO reguliert wird.
Des Weiteren wurde untersucht iniefern Leukotriene beziehungsweise 5-LO-Inhibitoren die Expression von miR-99b-5p und miR-125a-5p beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass das miRNA-Niveau unabhängig von der vorhandenen Leukotrien-Menge ist. Das 5-LO aktivierende Protein (FLAP) besitzt dahingegen einen mit der 5-LO vergleichbaren Einfluss auf die reife miRNA. FLAP ist ein weiterer Interaktionspartner der 5-LO und essentiell für die Leukotrien-Biosynthese in vivo. Anhand von Protein-Lokalisationsstudien mittels Immunofluoreszenz konnte gezeigt werden, dass FLAP außerdem in der Lage zu sein scheint die Relokalisation der 5-LO aus dem Zytoplasma in den Nukleus einzuschränken. Im Zytoplasma ist die 5-LO in der Lage mit Dicer zu interagieren. Daten bezüglich einer Interaktion zwischen Drosha und 5-LO im Zellkern liegen bisher nicht vor. Eine etwaige Interaktion könnte allerdings helfen die reduzierten pre-miRNA Spiegel in Abwesenheit der 5-LO zu erklären.
Im Laufe dieser Arbeit wurden weiterhin die Auswirkungen von proinflammatorischen Lipopolysacchariden (LPS) auf die Prozessierung von miR-99b-5p und miR-125a-5p analysiert. Ausschließlich in Anwesenheit von 5-LO zeigte sich eine differenzierungsunabhängig gesteigerte Biosynthese der pri-und der reifen miRNA. Allerdings konnte kein Einfluss von LPS auf die 5-LO-Lokalisation beziehungsweise Expression festgestellt werden. Aufgrund dessen sind weiterführende Studien, die den Zusammenhang zwischen LPS induzierter miR-99b-5p- beziehungsweise miR-125a-5p-Biosynthese und 5-LO herstellen, nötig.
Abschließend hat sich diese Arbeit mit den Zielgenen der durch 5-LO regulierten miRNAs auseinandergesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit von miR-99b-5p und miR-125a-5p die Freisetzung der beiden durch LPS stimulierten Zytokine Interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor α (TNFα) gesteigert ist. Interessanterweise besitzt TNFα einen stimulierenden Effekt auf die Leukotrien-Biosynthese. Allerdings konnte kein direkter Zusammenhang zwischen miR-99b-5p/miR-125a-5p Expression, TNFα und der 5-LO Aktivität hergestellt werden. Der Einsatz von miR-99b-5p-und miR-125a-5p-Inhibitoren zeigte keine Auswirkungen auf die Leukotrien-Biosynthese nach LPS Stimulation. Im Gegensatz dazu konnte in unstimulierten Zellen eine signifikante Aktivitätssteigerung in Abwesenheit von miR-125a-5p festgestellt werden. Diese Beobachtungen legen nahe, dass miR-125a-5p einen TNFα unabhängigen Einfluss auf die 5-LO Aktivität besitzt. In LPS stimulierten Zellen kommt es möglicherweise zu Überlagerungen dieses Effektes.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass 5-LO eine regulierende Funktion auf die Reifung der beiden miRNAs miR-99b-5p und miR-125a-5p aufweist. Dieser Effekt könnte einer direkten Interaktion zwischen 5-LO und Dicer zuzuschreiben sein. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Regulierung der Expression bestimmter miRNAs mittels 5-LO nicht auf deren kanonischer enzymatischer Aktivität beruht. Diese Ergebnisse schlagen eine neue Richtung der 5-LO-Forschung ein und können in Zukunft dazu beitragen 5-LO vermittelte Effekte besser charakterisieren zu können.
Ubiquitin and the ubiquitin-like protein ATG8 are covalently attached to their respective targets via a coordinated cascade involving E1 activating, E2 conjugating and E3 ligating enzymes. Whereas ubiquitin is conferred to proteins as mono- and/or polymer(s) to alter their stability, localization and/or activity, the ubiquitin-like modifier (UBL) ATG8 is conjugated to the phospholipid phosphatidylethanolamine (PE). The best understood function of ATG8 is during autophagy where ATG8-PE conjugates are incorporated into both layers of incipient autophagosomes and serve as multipurpose docking sites for autophagosomal cargo receptors as well as regulatory factors (termed adaptors) that drive formation and maturation of autophagosomes. Mammalian cells harbor six ATG8 family members that can be subclassified into the LC3- and GABARAP-family and that can all be lipidated. However, it is currently unclear to what extent these proteins are functionally redundant or fulfil unique roles.
Cullin-RING ligase complexes (CRLs) are modular E3 ubiquitin ligases that comprise a RING-finger protein that associates with the ubiquitin-charged E2 enzyme, a substrate recruiting module as well as a cullin scaffold as a linker between RING protein and substrate adaptor. Whereas SCF (SKP1-CUL1-F-box protein) complexes, the most studied CRLs, harbor cullin-1 (CUL1) as scaffold and F-box proteins as substrate binding modules, CUL3-containing CRL complexes employ cullin-3 (CUL3), RING-box protein 1 (RBX1) and BTB proteins as substrate adaptors. Here, the BTB domain serves as binding interface for CUL3 and is usually complemented by an additional protein-protein interaction domain such as MATH or Kelch that mediates binding to the substrate of the E3 ligase complex.
Besides ubiquitylation, guanine nucleotide binding is another common way to regulate protein activity and signaling in cells. Here, small Rho GTPases cycle between active and inactive states by binding of the guanine nucleotides GTP or GDP with the help of regulatory proteins. Whereas GTPase-activating proteins (GAP) render RAC1 inactive by facilitating GTP hydrolysis, guanine exchange factors (GEF) such as T-lymphoma invasion and metastasis-inducing protein 1 (TIAM1) activate RAC1 by stimulating the exchange of GDP to GTP. Local control of RAC1 activity is essential to allow a specific cellular response to stimuli such as growth factors or migratory impulses.
This study reports an unexpected link between the GABARAP subfamily of mammalian ATG8 proteins, the ubiquitin proteasome system and RAC1 through the ubiquitylation of the RAC1 GEF TIAM1. The Kelch repeat and BTB domain-containing proteins 6 (KBTBD6) and 7 (KBTBD7) were established as heterodimeric substrate adaptors for CUL3. Interestingly, a thorough proteomic analysis revealed a number of putative substrates but, out of 11 substrate candidates tested, only the RAC1 GEF TIAM1 appeared to be influenced by depletion of CUL3KBTBD6/KBTBD7. Binding studies showed that KBTBD7 binds TIAM1 via the Kelch repeats and that this binding was markedly enhanced when CUL3 activation was abolished upon treatment with the neddylation inhibitor MLN4924. Also, total TIAM1 abundance was increased upon CUL3KBTBD6/KBTBD7 depletion and accumulation of TIAM1 upon proteasome inhibition suggested that TIAM1 is degraded via the proteasome. In vivo ubiquitylation assays and denaturing immunoprecipitations as well as mass spectrometrical analysis confirmed that CUL3KBTBD6/KBTBD7 ubiquitylates TIAM1 at two distinct lysines (K1404 and K1420) close to its C-terminus.
Previously, KBTBD6 and KBTBD7 were found as interactors of several members of the human ATG8 family of proteins in a proteomic study analyzing the human autophagy network. This association was confirmed in the present work. Furthermore, peptide array technology and mutational analysis revealed that KBTBD6 and KBTBD7 employ a classical ATG8-family interacting motif (AIM; also referred to as LC3-interacting region or LIR) as binding interface. The AIMs of KBTBD6 (W-V-R-V) and KBTBD7 (W-V-Q-V) fulfil the consensus AIM sequence motif (F/W/Y1-X2-X3-I/L/V4) and are preceded by several acidic residues and serines. A series of structural and cell biological experiments revealed a binding preference for the GABARAP subfamily of human ATG8 proteins and most importantly, a requirement of the GABARAP-KBTBD6 and -KBTBD7 interaction for TIAM1 ubiquitylation. The finding that TIAM1 binding to KBTBD6 and KBTBD7 AIM mutants was diminished raised the possibility that GABARAP binding mediates the recruitment of CUL3KBTBD6/KBTBD7 to membranes where TIAM1 is localized. Interestingly, colocalization of KBTBD6, GABARAPL1 and TIAM1 in punctuate structures could be observed. Since only a very small fraction of GABARAPL1 colocalized with LC3B, and colocalization between KBTBD6 and LC3B was not observed, these vesicular structures are most likely distinct from autophagosomes. Furthermore, TIAM1 ubiquitylation was reduced when GABARAP, but not LC3B, was depleted or when lipidation of GABARAP was prevented.
Stabilization of TIAM1 upon KBTBD6 and/or KBTBD7 depletion led to elevated TIAM1-dependent RAC1 activity, altered actin morphology with increased cortical actin and loss of vinculin foci. Re-introduction of wild-type KBTBD6 or KBTBD7 but not AIM mutants reverted all these phenotypes. Moreover, depletion of KBTBD6 or KBTBD7 in human breast cancer cells massively increased their invasiveness, whereas TIAM1 knockdown had the opposite outcome. All physiological effects of KBTBD6 and KBTBD7 depletion were inhibited by additional depletion of TIAM1 or RAC1 confirming that the phenotypes observed are indeed mediated by the CUL3KBTBD6/KBTBD7-TIAM1-RAC1 signaling pathway. Intriguingly, KBTBD6 and KBTBD7 were not subject to autophagosomal degradation, thereby establishing a new function for GABARAP proteins beyond autophagosomal degradation in providing a signaling platform for recruitment of the E3 ligase CUL3KBTBD6/KBTBD7 in close proximity to its substrate TIAM1, enabling localized ubiquitylation.
Local restricted control of RAC1 activity by ubiquitylation has been described for TIAM1-RAC1 signaling previously. Examples are HECT, UBA and WWE domain-containing protein 1 (HUWE1)-mediated TIAM1 ubiquitylation that occurs predominantly at cell-cell-junctions in response to hepatocyte growth factor stimulation in MDCKII cells or inhibition of RAC1 activity by the RAC1 GAP protein BCR (breakpoint cluster region) at the leading edge of astrocytes through binding to the TIAM1-Par (polarity) complex. SCFBTRC mediates ubiquitylation of TIAM1 in response to mitogens or DNA damage, though it has not been explored whether this regulation is spatially restricted. Thus, this study adds a novel layer of complexity to the spatial regulation of RAC1 signaling by implicating membrane-bound human ATG8 proteins in this process.
Also, this study is the first report specifically implicating the GABARAP proteins in cellular signaling events. It will be interesting to explore whether the concept of localized signaling mediated by GABARAPs applies to other substrates of CUL3KBTBD6/KBTBD7 and membranerelated signaling processes in which GABARAP proteins are involved. Controlling RAC1 activity at GABARAP-decorated membranes might also be important for trafficking events or autophagy since it was described that RAC1 has an inhibitory function on autophagy. Therefore, spatial restricted ubiquitylation of TIAM1 resulting in specific deactivation of RAC1 could promote the autophagic process when locally needed. Although the catalytic mTOR inhibitor Torin1 and the lysosomal H+ ATPase inhibitor BafilomycinA1 promoted TIAM1 ubiquitylation by increasing the pool of membrane-conjugated GABARAP, but other signals that stimulate GABARAP-KBTBD6/KBTBD7 association and subsequent TIAM1 ubiquitylation are to be identified. Besides, determining the KBTBD6/KBTBD7 binding site in TIAM1 or uncovering a deubiquitylating enzyme (DUB) that locally counteracts the ubiquitylation of TIAM1 will enable a better comprehension of the complete localized signaling cascade.
Die vorliegende Dissertation mit dem Titel: Ecophysiological monitoring of Oaks in Central Europe, introduced in the framework of proactive climate change mitigation beschäftigt sich mit der Anwendung zerstörungsfreier, radiometrischer Methoden zur Bestimmung von Pigment- und Stickstoffkonzentrationen und der photosynthetischen Funktionalität in Blättern von heimischen und gebietsfremden Eichen und ihre Beeinflussung durch Trocken-, Hitze- und Kältestress.
Die Eichenarten Quercus robur L. (Stieleiche), Q. pubescens Willd. (Flaumeiche), Q. frainetto Ten. (Ungarische Eiche), Q. ilex L. (immergrüne Steineiche) und Q. rubra L. (amerikanische Roteiche) wurden im Frühjahr 2011 auf einer Versuchsfläche im Frankfurter Stadtwald gepflanzt, um ihre Nutzung als potentielle Waldbäume in einem sich ändernden Klima zu untersuchen. Über eine Dauer von zwei Jahren wurden diese Arten mit einem hohen Maß an blattspezifischer Merkmalsvariabilität beobachtet und beprobt. Ziel war es, die interspezifischen Unterschiede und die jahreszeitliche Dynamik von morphologischen und chemischen Blattmerkmalen sowie die Beeinflussung der radiometrischen Bestimmung des Chlorophyllgehaltes (und damit assoziierten Komponenten wie z.B. Blattstickstoffgehalt und Karotinoiden) und der photosynthetischen Funktionalität durch klimatische Umweltbelastungen in Eichen zu untersuchen. Die Analyse der Blattproben zielte neben der Bestimmung der Beziehung zwischen absoluten und optisch ermittelten Pigmentgehalten auf die Ermittlung des Einflusses der Blattstruktur auf die Lichttransmission im roten und infrarotem Bereich des Elektromagnetischen Spektrums ab, sowie auf die artspezifische Korrelation von Blattstickstoff zu Blattchlorophyll zu dessen indirekte Quantifizierung. Des Weiteren wurden Versuche zur Trocken- und Hitzestressanpassung durchgeführt, um eine potentiell artspezifische Stressantwort, sowie eine mögliche Beeinflussung der aufgenommenen radiometrischen Messwerte zu ermitteln. Ein zusätzliches Monitoringprogramm im Winter 2012/2013 mit einer Dauer von sechs Monaten ermöglichte die Überprüfung der Anpassungsfähigkeit der immergrünen Steineiche (Q. ilex) an mitteleuropäische Winterbedingungen und die Veränderung der photosynthetischen Funktionalität unter Kältestress. Messungen im Zusammenhang mit der praktischen Anwendbarkeit der zerstörungsfreien, optischen Methode und zur Bereitstellung von Referenzdaten für zukünftige Evaluierungen komplementieren die Untersuchungen.
Signifikante, artspezifische Unterschiede wurden in den blattmorphologischen Schlüsselmerkmalen in den Quercus-Arten ermittelt. Die artspezifischen Unterschiede in den morphologischen Blattmerkmalen beeinflussten auf signifikante Weise die Beziehung zwischen absoluten, massebasierten Pigment- und Stickstoffgehalten und deren radiometrischen Bestimmung. Wurden die Pigmentgehalte hingegen auf die Blattfläche bezogen und die Stickstoffgehalte mittels des Verhältnisses von Blattfläche zu Trockenmasse korrigiert, zeichnete sich eine Beziehung zwischen absoluten und optisch ermittelten Werten ab, der jegliche jahreszeitliche oder artspezifisch morphologische Variabilität fehlte und die somit für alle Quercus-taxa anwendbar ist. Koeffizienten für die Berechnung von flächenbezogenen Gehalten von Gesamtchlorophyll, Chl a, Chl b und Carotinoiden für die jeweiligen Quercus-taxa, wie auch für ein artübergreifendes Modell wurden ermittelt, um die Bestimmung dieser Gehalte während aller Entwicklungsstufen zu ermöglich. Aus der jahreszeitlichen Entwicklung der Pigmentgehalte konnten drei deutliche Phasen abgeleitet werden: Die Phase der Blattentwicklung im Frühling, einer Plateauphase mit geringen Veränderungen (“core vegetation time”) und die Phase des Pigmentabbaus während der Herbstlaubfärbung. Die Übergänge zwischen diesen Phasen variierten zum Teil erheblich zwischen einzelnen Individuen einer Art sowie zwischen den Arten, was Unterschiede in der potentiellen, jährlichen Kohlenstoffaufnahme nach sich zieht. Stressbedingungen, wie Hitze- Kälte- oder Trockenstress, können zu Veränderung von Fluoreszenzparametern ohne gleichzeitige Änderung des Pigmentgehaltes führen, wie auch die indirekte Bestimmung von mit Chl assoziierten Komponenten (Carotinoide, Chl a, Chl b) mittels optischer Bestimmung (durch die Veränderungen von Pigmentverhältnissen) beeinflussen.
Im Rahmen des Forschungsprojektes konnten, Modelle zur Berechnung von Blattpigmenten und Blattstickstoff aus optischem Messdaten, Veränderungen der photosynthetischen Funktionalität, sowie Referenzdaten für die zukünftig nutzbaren Eichenarten hinsichtlich artspezifischer und jahreszeitlicher Variabilität unter mitteleuropäischen Umweltbedingungen ermittelt werden, die eine Nutzung und Einordnung von zerstörungsfreien, optischen Messwerten zur Ermittlung von Vitalitätsunterschieden in Eichen ermöglichen.
The neural crest gives rise to the neurons and glial cells of the peripheral nervous system (PNS) (Bronner-Fraser and Fraser, 1989; Frank and Sanes, 1991). Self-renewing neural crest-derived stem cells (NCSCs) are present in migratory neural crest and various postmigratory locations, including peripheral ganglia (Duff et al., 1992; Morrison et al., 1999; Kruger er al., 2002). It is demonstrated that NCSCs from embryonic mouse dorsal root ganglia (DRG) are reprogrammed in neurosphere (NS) cultures in the presence of EGF and FGF. Reprogrammed NCSCs (rNCSCs) generate exclusively central nervous system (CNS) progeny, both in vitro and upon transplantation into the mouse brain (Binder et al., 2011). In this study the timing and mechanisms underlying the reprogramming were addressed. Most of the cells acquire CNS characteristics at passage 2, reaching a stable proportion of >90% of Olig2-positive cells at passage 3, which is maintained at least up to passage 10. The PNS marker p75 is completely lacking from passage 3 onwards. Furthermore, it was shown that the reprogramming does not involve a transient pluripotency state. This suggests a direct reprogramming of NCSCs to cells with CNS identity. The reprogramming leads to a stable CNS identity as shown by delayed BMP4 application. This result is in agreement with the previous observation that rNCSCs only generate CNS progeny, in particular mature myelinating oligodendrocytes, upon transplantation into embryonic, postnatal and lesioned adult mouse brains (Binder et al., 2011). Genome wide gene expression profiles of rNCSC NS demonstrates already in culture a complete switch to a (spinal cord stem cell) SCSC CNS identity. These results demonstrate a complete reprogramming of PNS progenitors to CNS identity without genetic modification and imply PNS cells as a source for stem cell-based CNS therapy.
The reprogramming of NCSCs is completely blocked in the presence of BMP4 in NS cultures, as shown by the expression of neural crest markers p75 and Sox10. In addition, BMP4 NCSCs generate PNS neurons (Tuj1/Phox2b- and Peripherin/Tuj1-coexpressing cells) and Schwann cells (O4/p75-coexpressing cells). Genome wide gene expression profiles of BMP NCSCs demonstrate that BMP NCSCs express genes at high levels which are characteristic for neural crest/neural crest derivatives, mesenchymal derivatives of neural crest and perivascular pericytes/MSCs. On the other hand CNS marker genes are restricted to rNCSCs and are only expressed at background or undetectable levels in BMP NCSCs. These findings imply that the CNS versus PNS identity is controlled by antagonistic functions of FGF and BMP4.
The use of rNCSCs for cell therapies requires an accessible source of these cells in the adult organism. Since the DRG is not an easily approachable tissue source, the adult mouse palate, containing NCSCs, was chosen. These results suggest that pNCSCs arise from Sox10-positive neural crest-derived stem cells, that downregulate PNS marker gene expression, such as Sox10 and p75, in NS culture. Contrary to rNCSCs, CNS marker upregulation was not observed. Notably, genome wide gene expression profiles of pNCSCs demonstrate an enrichment of genes expressed by mesenchymal derivatives and perivascular pericytes/mesenchymal stem cells. Since the cranial crest gives rise, besides PNS neural progeny and melanocytes, to mesenchymal derivatives, the results demonstrate that pNCSCs have a restricted developmental potential in comparison to rNCSCs and acquire mostly normal fates of the cranial neural crest.
Taken together, the results demonstrate that rNCSCs acquire a SCSC identity in the presence of EGF and FGF and that the reprogramming can be efficiently blocked by BMP4. On the other hand, NCSCs derived from adult palate rather acquire mesenchymal fates and do not acquire a CNS identity under the conditions used.
Rotary adenosine triphosphate (ATP)ases are ubiquitous, membrane-bound enzyme complexes involved in biological energy conversion. The first subtype, the so-called F1Fo ATP synthase, predominantly functions as an ATP synthesizing machinery in most bacteria, mitochondria and chloroplasts. The vacuolar subtype of enzyme, the V1Vo ATPase, operates as an ATP driven ion pump in eukaryotic membranes. The subtype found in archaea and some bacteria is called A1Ao ATP (synth)ase and is capable of working in both directions either to synthesize ATP or to generate an ion motive force by consuming the same.
All the three above-mentioned subtypes of rotary ATPases work as nanomolecular machines sharing a conserved mechanism to perform the energy conservation process. The simplest form of these enzymes is the bacterial F1Fo ATP synthase. Here, ions are channelled via the membrane stator subunit a to the rotor ring of the enzyme. After almost a complete rotation of the ring the ions are released again on the other side of the membrane. This rotation is further transmitted via the central stalk to the soluble part of the enzyme, the F1-complex, where conformational changes within the nucleotide binding sites result in the synthesis of ATP from ADP and Pi.
The rotor or c-ring of the enzyme is the key protein complex in mediating transmembrane ion translocation. Several structural and biochemical methods have been applied in the past years to study the rotor rings from many different organisms. The results revealed that the stoichiometry of a c-ring of a given species is constant while it can vary between different species within a range of 8 to 15 c subunits. The c-ring stoichiometry determines directly the number of ions transported through Fo per rotation whereby three molecules of ATP are concurrently synthesized in the water-soluble F1 headgroup. Hence the number of c subunits has an important influence on the bioenergetics of the corresponding enzyme and thus the entire organism.
The c-ring of a rotary ATPase is able to specifically bind either protons (H+) or sodium ions (Na+) as the coupling ion for the enzyme. Several structures are already available revealing the coordination network of both types of rotor rings. In each case ion binding includes a highly-conserved carboxylic acid residue (glutamate or aspartate), in addition to a more varying combination of amino acid residues, whereby Na+ coordination is structurally more demanding than H+ binding.
In the first part of my PhD thesis, I aimed to characterize the F1Fo ATP synthase rotor ring of the opportunistic pathogenic bacterium Fusobacterium nucleatum on a functional and structural level. F. nucleatum is an anaerobic bacterium which uses peptides and amino acids as a primary energy source. It is one of the most frequently occuring bacteria in human body infections and involved in human periodontal diseases.
The protein complex was heterologously expressed within a hybrid ATP synthase in Escherichia coli and purified without an affinity tag for further analysis. Two high resolution X-ray structures of the c-ring were solved at low (5.3) and high (8.7) pH to 2.2 and 2.64 Å, respectively. In both structures, the conserved glutamate is in an ion-locked conformation, revealing that the conformational state of the ion binding carboxylate is not depending on the pH of the crystallization condition, which is in good agreement with previous structural and biochemical studies of other c-rings.
A Na+ ion is present within the c-ring binding site and directly coordinated by four amino acid residues and a structural water molecule. Remarkably, the Na+ is bound by two glutamate residues instead of one as is the case in the I. tartaricus Na+ binding c-ring, of which the first high resolution X-ray structure of a c-ring has been solved in 2005. Thus, a new type of Na+ coordination in an ATP synthase rotor ring with a two-carboxylate ion binding motif is described here, which also occurs in other bacteria, including several pathogens. Na+ specificity of the investigated c-ring was further confirmed by a competitive biochemical labeling reaction performed with a fluorescent ATP synthase inhibitor molecule (N-cyclohexyl-N`-[4(dimethylamino)-α-naphtyl] carbodiimide, NCD-4).
We furthermore complemented our functional and structural data of the F. nucleatum c-ring by computational studies to explore the ion translocation mechanism of this enzyme in more details. We therefore analyzed the protonation state of the second, additional glutamate in the ion binding site. Molecular dynamics (MD) simulations and free-energy calculations indicated that this glutamate is constitutively protonated, in the ion-locked as well as in a simulated, more hydrated open-conformation of the ion binding glutamate as when it is travelling through the a/c-ring interface upon c-ring rotation.
The brain vascular system is composed of specialized endothelial cells, which regulate the movement of ions, molecules and cells from the blood lumen to the central nervous system (CNS). Endothelial cells in the brain form the blood-brain barrier (BBB) that is essential to maintain the brain homeostasis and protect the CNS from pathogens and toxins for a proper neurological function. Endothelium together with other cellular components such as pericytes, astrocytes and the basement membrane, forms the neurovascular unit (NVU), the structural unit of the BBB. Breakdown of the BBB occurs in various neurological disorders, leading to edema and neuronal damage. Therapeutic strategies focusing on factors that regulate the permeability of the BBB may help to improve neurological disorders and facilitate drug delivery to the brain.
Angiopoietins (Ang) are potential candidates for therapeutic targeting the BBB due to their role in regulating the vascular permeability in periphery. They are key growth factors that control angiogenesis and vessel maturation. Ang-1 and Ang-2 possess similar binding affinities to the Tie2 receptor tyrosine kinase, which is almost exclusively expressed on endothelial cells. Ang-1 is expressed in smooth muscle cells and pericytes, and binds in a paracrine manner to Tie2. This results in phosphorylation of the receptor and induction of downstream signaling pathways leading to vessel maturation via pericyte recruitment and blood vessel stabilization. Ang-2, on the other hand, is stored in Weibel Palade bodies in endothelial cells and is released upon inflammatory or angiogenic stimuli. Therefore, in mature, stabilized blood vessels, Ang-2 expression is low. Increased level of Ang-2 is only observed during development or in pathology such as ischemia, cancer and inflammation. When Ang-2 is released, it acts in an autocrine manner and interferes with Tie2 phosphorylation in a context-dependent way. Antagonizing the receptor results in de-stabilization of the vessels, often accompanied by reduced numbers of pericytes leading to myeloid cell infiltration. In conjunction with the vascular endothelial growth factor (VEGF), Ang-2 contributes to blood vessel sprouting, whereupon in absence of VEGF it promotes vessel regression. ...
Municipal wastewater contains nutrients valuable for a reuse in agriculture and can be the source of a multitude of chemicals used in private households and industry, too. As many of these chemicals are incompletely degraded during wastewater treatment, their residues remain partly in sewage sludge and partly in treated wastewater. Concerns are linked particularly to the so called micropollutants, i.e. anthropogenic organic substances such as personal care products, pharmaceuticals and biocides, for which scarce data on their degradability and environmental fate and particularly on their ecotoxicity are available. Thus, when reusing treated wastewater and sewage sludge for irrigation or as soil amendment for a sustainable land and water management, these wastewater-borne pollutants may enter soil, groundwater and surface water. The present work therefore aimed at assessing potential ecotoxic effects on aquatic and terrestrial organisms of reusing treated wastewater and sewage sludge. To this end, established as well as newly developed experimental approaches were used to investigate the problem on several levels. Individual wastewater-borne substances, samples from field study sites and samples from a soil column experiment simulating prolonged wastewater irrigation were examined.
At the start of the experimental work, the ecotoxicity of climbazole was characterised towards five aquatic and five terrestrial test organisms. Climbazole is an azole antimycotic agent applied in cosmetics and anti-dandruff shampoos and was recently detected in relatively high concentrations in treated wastewater and sewage sludge. In the present work climbazole was found to be particularly toxic towards plants such as water lentils with effective concentrations comparable to those of agricultural azole fungicides. Dwarfism, that is reduced shoot elongation observed in plants, pointed at a specific, phytohormone inhibiting mode of action of climbazole. Furthermore, the expected influence of the soil pH on the phytotoxicity of climbazole was experimentally confirmed.
Based on the findings for climbazole, two additional azole antimycotics, ketoconazole and fluconazole, and the regularly in sewage sludge detected biocide benzyldimethyldodecyl-ammonium chloride (BDDA) were investigated for their toxicity towards plants.
In aqueous medium, an increasing phytotoxicity from fluconazole to BDDA, ketoconazole and climbazole was observed, while in soil, phytotoxicity increased from BDDA to ketoconazole, climbazole and fluconazole. The relatively low terrestrial toxicity of BDDA and ketoconazole probably resulted from their strong binding to soil as well as their good biodegradability. To render the exposure scenario more realistic, sewage sludge was co-applied with the four test substances in a parallel test run. However, as no detectable influence on their effective concentrations was found, it can be assumed that the current practice of assessing sewage sludge borne substances with biotests in standard soil is sufficiently realistic. In a further study, different advanced sludge-treatment technologies were assessed for their efficacy in reducing pollutants. Results from the present work indicated that effects assessed in terrestrial short term biotests only seldom correlated with the concentrations of certain pollutants. Rather, a negative correlation of the stability of the sludges, determined by the ratio of volatile to total solids, to their ecotoxicity was seen.
Another aspect of the present work was the design and performance of an experimental approach to assess the environmental risk of a long-term irrigation with treated wastewater concerning the quality of soil and water in a prospective way, i.e. before the installation at field scale. For the simulation of a continuous irrigation corresponding to approximately 30 years, a percolation apparatus was developed and four different soils were percolated with treated wastewater for three months. Acute and chronic biotests with nine test organisms from different trophic levels (green algae, water lentils and water fleas as well as oilseed rape, oats, bacteria, spring tails, enchytraeids and earthworms) were used to assess the soil percolates as well as the soils with and without percolation. These investigations were accompanied by a comprehensive chemical monitoring conducted by project partners. Results indicated that the soil passage, that is the percolation through the soil, generally improved the quality of the treated wastewater as habitat for aquatic organisms which was visible by a reduction of its phytotoxicity. However, in some cases it deteriorated the water quality, probably resulting from the leaching of metals from pre-contaminated soil. A deteriorated habitat quality of the soil after the percolation with treated wastewater was observed for several test organisms and soils. In the same, mainly peaty soils, the highest accumulation of wastewater-borne micropollutants and of zinc was measured. Yet, their concentrations did not correlate to the observed biological effects. Moreover, data on ecotoxicity were only available for a small fraction of the detected substances so that their concentrations could not successfully be used to predict expected biological effects.
The experimental approach used in the present work demonstrated to be an adequate tool to support the prospective evaluation of environmental risks of treated wastewater irrigation. Overall, it can be concluded that the reuse of treated wastewater on soil can improve the quality of treated wastewater but that this can come at the cost of deteriorating the quality of the soil. As these risks cannot be generalised, a comprehensive biotest battery as well as chemical analysis should be used to assess them on a case-specific basis for each respective wastewater and the respective soil.
Künstliche Ribonucleasen, die sequenzspezifisch und effizient die Spaltung von RNA-Phosphordiesterbindungen katalysieren, könnten potenziell nicht nur als biochemische Werkzeuge dienen, sondern auch als Wirkstoffe gegen eine Vielzahl von Erkrankungen, bei denen mRNA oder miRNA involviert sind, eine wichtige Rolle spielen. Obwohl in den letzten beiden Jahrzehnten zahlreiche sequenzspezifische RNA-Spalter entwickelt wurden, bleibt die Spaltaktivität dieser Verbindungen nach wie vor deutlich hinter der ihrer natürlichen Äquivalente zurück. Die Optimierung künstlicher Ribonucleasen und grundlegend dafür die Erforschung der Faktoren, die die Spaltaktivität einer Verbindung beeinflussen, sind daher weiterhin von großem Interesse. Zwar enthalten die meisten künstlichen Ribonucleasen Metallionen, doch sind auch metallfreie RNA-Spalter, zum Beispiel auf der Basis heterocyclischer Guanidine, bekannt. Prinzipiell kann die Hydrolyse des RNA-Rückgrates durch Deprotonierung der nucleophil am Phosphoratom angreifenden 2‘-OH-Gruppe, durch Protonierung der als Abgangsgruppe fungierenden 5‘-OH-Gruppe sowie durch Stabilisierung des bei der Spaltung durchlaufenen dianionischen Phosphorans katalysiert werden. Daher sollten potenzielle RNA-Spalter in der Lage sein, sowohl als Base als auch als Säure wirken zu können, was bei einem pKa-Wert im Bereich von 7 am besten gegeben ist. Fungiert ein und dasselbe Molekül als Protonenakzeptor und -donor, so kommt es im Fall von Guanidinanaloga zu einer Tautomerisierung vom Amino- zum Iminoisomer. Eine möglichst kleine Energiedifferenz zwischen beiden Formen sollte sich daher positiv auf die Spaltaktivität auswirken. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Reihe heterocyclischer Guanidine synthetisiert, deren pKa-Werte bestimmt und die jeweiligen Energiedifferenzen zwischen Amino- und Iminotautomer grob mittels AM1-Rechnungen abgeschätzt. In Spaltexperimenten wurden Cy5-markierte RNA-Substrate mit den verschiedenen Verbindungen inkubiert (Spalter-Konzentration: 2 bzw. 10 mM). Die Analyse und Quantifizierung der Spaltprodukte erfolgten anschließend mithilfe eines DNA-Sequenziergerätes. Alle untersuchten und ausreichend löslichen Substanzen, die sowohl einen geeigneten pKa-Wert (6 – 8) als auch eine niedrige Energiedifferenz zwischen Amino- und Iminotautomer (≤ 5 kcal/mol) aufwiesen bzw. bei denen nur der pKa-Wert oder nur die Energiedifferenz in geringem Maße vom Idealwert abwich, spalteten RNA, wenn auch teilweise nur mit einer geringen Aktivität. In den Spaltexperimenten erwiesen sich Guanidinanaloga mit einem großen aromatischen System als besonders aktiv, allen voran 2-Aminoperimidin und seine Derivate, die auch bei Konzentrationen unter 50 µM Spaltaktivität zeigten. Gleichzeitig offenbarten diese Verbindungen in Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie Experimenten eine große Tendenz zur Aggregation mit RNA, so dass die Spaltung in diesen Fällen möglicherweise nicht durch Einzelmoleküle, sondern durch Aggregate erfolgte. Um RNA-Substrate auch sequenzspezifisch spalten zu können, wurden PNA-Konjugate des bereits bekannten RNA-Spalters Tris(2-aminobenzimidazol) hergestellt, wobei der Spalter über eine neue, quecksilberfreie Route synthetisiert wurde. Es konnte gezeigt werden, dass diese PNA-Konjugate RNA sequenzspezifisch mit einer Halbwertszeit von etwa 11 h spalten, was im Rahmen der Halbwertszeit vergleichbarer DNA-Konjugate liegt. Um zu untersuchen, ob 2-Aminoperimidine auch als Einzelverbindungen aktiv sind, wurden zwei PNA-Konjugate von am Naphthylring substituierten 2-Aminoperimidin-Derivaten synthetisiert. Beide Konjugate zeigten keinerlei Spaltaktivität, was darauf hindeuten könnte, dass die Hydrolyse des RNA-Rückgrates nur durch mehrere Spalter-Einheiten – kovalent verknüpft oder in Form von Aggregaten – effizient katalysiert werden kann.
The RAF family of kinases constitutes the members A, B and CRAF. They mediate RAS signaling by linking it to the MEK/ERK transduction module, which regulates cellular processes such as cell proliferation, migration, survival and cell death. As the RAS/RAF/MEK/ERK (MAPK) pathway is found to be activated in human cancers, the RAF kinases have been exploited as valuable therapeutic targets and RAF inhibitors show promising results in the clinic, esp. with tumors harboring an activating BRAFV600E mutation. However, RAF inhibitors paradoxically accelerate metastasis in RAS mutant and BRAF wildtype tumors. They also become ineffective over time in BRAFV600E tumors because of reactivation of downstream mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling by promoting RAF dimerization. Aims of the present work were 1) to investigate the role of ARAF kinase in the paradoxical activation of the enzymatic cascade by RAF inhibitors downstream of mutated RAS and 2) to study the consequences of the loss of ARAF function on signal transduction in vitro and in vivo (nude mice). We have engineered several cell lines that would allow the study of basal and RAF inhibitor induced effects on MAPK activation, tumor cell migration and invasion.
In summary, we were able to show that the RAF isoform ARAF has an obligatory role in promoting MAPK activity and tumor cell invasion in a cell type dependent manner. In these cell types, ARAF depletion prevented the activation of MAPK kinase 1 (MEK1) and extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK1/2) and led to a significant decrease of protrusions growing out of tumor cell spheroids in a three-dimensional (3D) culture that were otherwise induced by BRAFV600E-specific or BRAF/CRAF inhibitors (GDC-0879 and sorafenib, respectively). RAF inhibitors stimulated homodimerization of ARAF and heteromerization of BRAF with CRAF and the scaffolding protein KSR1. However, induced oligomerization was not sufficient to activate MAPK signaling if ARAF was depleted. By employing full length recombinant kinases, we were able to show for the first time that the three RAF isoforms competed for the binding to MEK1. In cell culture models, the overexpression of dimer-deficient ARAF mutants impaired the interaction between ARAF and endogenous MEK1 and thus prevented the subsequent phosphorylation of MEK1 and ERK1/2. Our findings reveal a new role for ARAF in directly activating the MAPK cascade through homodimerization and thereby promoting tumor cell invasion, suggesting the conserved RAF-dimer interface as a target for RAS- and RAF mediated cancer therapy.
Collectively, we provide evidence for the dual role ARAF plays in controlling MAPK signaling and cancer as loss of ARAF promoted strong lung metastasis formation in nude mice. Preliminary data describing the underlying mechanisms behind ARAF-regulated metastases have been presented and discussed.
In der vorliegenden Doktorarbeit zur Untersuchung der Rolle der Superoxid-Dismutasen in P. anserina lieferten die durchgeführten Analysen folgende Ergebnisse:
1)Sowohl in P. anserina als auch in S. cerevisiae wurde eine gemeinsame Regulation von SODs nachgewiesen: Stämme, die die mitochondriale MnSod (PaSod3 bzw. ScSod2) überexprimieren zeigen eine erhöhte Cu/ZnSOD-Aktivität (PaSOD1 bzw. ScSOD1).
2)Es konnte keine SOD-Aktivität für die putativen SODs Pa_1_10620, Pa_1_10630 und Pa_1_6300 detektiert werden. Für Pa_1_10620, dessen Überexpression unter Standardbedingungen zu einer Lebensverlängerung führt, wird eine Funktion als mitochondriales ribosomales Protein angenommen.
3)Der ∆PaSod3-Stamm weist keinen Unterschied im Phänotyp, der Wuchsrate und der Lebensspanne unter Standardbedingungen zum Wildtyp auf. Paraquat-Stress führt allerdings zu einer Kurzlebigkeit des ∆PaSod3-Stammes, wohingegen diese Mutante eine höhere Resistenz gegenüber Wasserstoffperoxid aufweist als der Wildtyp.
4)Transkriptomanalysen des Wildtyps und der ∆PaSod3-Mutante lassen vermuten, dass eine Hochregulation von Detoxifizierungs- und Energie-abhängigen Prozessen die durch den Verlust der mitochondrialen PaSOD3 vermuteten negativen Auswirkungen kompensieren.
5)PaSod3_OEx-Stämme weisen unter Standardbedingungen aufgrund der erhöhten intrazellulären Wasserstoffperoxid-Menge, bedingt durch die vermehrte Umsetzung von Superoxid, diverse negative Auswirkungen auf: Eine reduzierte Wuchsrate, verkürzte Lebensspanne, geringere Fertilität, stärkere Pigmentierung, vermehrt fragmentierte Mitochondrien, mehr unprozessierte mitochondriale Proteine und weniger Komplex IV der Atmungskette als der Wildtyp. Zusätzlich wird vermehrt über die alternative Oxidase geatmet, um die ROS-Generierung zu reduzieren.
6)Oxidativer Stress in Form von Paraquat führt in PaSod3_OEx-Stämmen zu einer weiteren Verkürzung der medianen Lebensspanne, während die maximale Lebensspanne von PaSod3_OEx3-Stämmen im Vergleich zum Wildtyp sogar verlängert ist. Wasserstoff-peroxid resultiert in stark verringerten medianen und maximalen Lebensspannen beider PaSod3-überexprimierenden Stämme.
7)Die Anzucht auf Medium mit zusätzlichem Mangan (80 µM MnSO4) kann die beobachteten Defekte der PaSod3_OEx-Stämme fast vollständig auf Wildtyp-Niveau revertieren: Die Wuchsrate, die Lebensspanne, der Phänotyp, die Mitochondrien-morphologie, die Prozessierung mitochondrialer Proteine und die Atmung entsprechen dem Wildtyp. Lediglich die Fertilität erreicht nicht das Wildtyp-Niveau. Diese positiven Effekte von Mangan werden erzielt, da die erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge in PaSod3_OEx-Stämmen entsprechend ihrer Entstehung detoxifiziert wird, denn Mangan führt zu einer gesteigerten Transkription bzw. Aktivität von Katalasen und Peroxidasen sowie zu einer erhöhten Peroxiredoxin-Menge.
8)Die Anzucht des Wildtyps unter Wasserstoffperoxid-Stress resultiert in einer Lebens-spannenverkürzung. Diese kann durch Supplementation mit Mangan revertiert werden. Unter diesen Bedingungen weisen u. a. Peroxidasen eine erhöhte Aktivität auf.
Insgesamt ließen die gewonnenen Daten den Schluss zu, dass das Genom von P. anserina für drei aktive SODs kodiert. Ein Verlust der einzigen mitochondrial lokalisierten SOD kann durch die Induktion von Energie-abhängigen Prozessen sowie von Detoxifizierungsprozessen kompensiert werden. Ferner weisen die durchgeführten Studien darauf hin, dass PaSod3_OEx-Stämme als Modell für erhöhte intrazelluläre Wasserstoffperoxid-Mengen in P. anserina verwendet werden können. Darüber hinaus wurde ein Zusammenhang zwischen Mangan und dem Detoxifizierungs-netzwerk in P. anserina nachgewiesen. Dabei können zwei Mechanismen zur Reduktion der Wasserstoffperoxid-Mengen unterschieden werden: Bei Vorhandensein ausreichender Mengen Mangan kommt es zu einer stärkeren Detoxifizierung von Wasserstoffperoxid. Ist Mangan allerdings limitiert und die Detoxifizierung kann nicht gesteigert werden, wird eine Umstellung der Atmung eingeleitet, um die neu entstehende ROS-Menge zu minimieren.
Identification of disease modulating compounds in juvenile neuronal ceroid lipofuscinosis (JNCL)
(2016)
Mutationen im CLN3 Gen verursachen die neurodegenerative Erkrankung juvenile neuronale Zeroidlipofuszinose (JNCL). Bei dieser Erkrankung sind die Autophagie, der lysosomale pH Wert und der mitochondriale Metabolismus beeinträchtigt. Störungen dieser Prozesse führen zu einer erhöhten Verletzlichkeit neuronaler Zellen gegenüber alters- und umweltbedingten Schäden, einer Anhäufung von Autophagosomen und lysosomalem Speichermaterial, Zelltod und Neurodegeneration. Um die JNCL zu erforschen bedienen wir uns eines Zellmodels aus der Maus, welches die häufigste krankheitsauslösende CLN3 Mutation im Menschen, die Deletion der Exons 7 und 8, nachbildet. Die aus dem Kleinhirn dieser Mäuse stammenden cerebellaren Körnerstammzellen werden als CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen, solche aus wild-typ Mäusen als CbCln3+/+ Zellen bezeichnet. Die JNCL ist nicht heilbar und die Entwicklung von Wirkstoffen steht noch am Anfang.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Durchführung eines Hochdursatzscreenings um Wirkstoffe zu identifizieren, welche eine Anhäufung von Autophagosomen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen verhindern können. Unter 1750 verschiedenen untersuchten Wirkstoffen konnten wir 28 aktive „Hits“ identifizieren und stellten fest, dass Kalziumkanalblocker, Östrogene und HMG-CoA-Reduktase Inhibitoren gehäuft vertreten waren. Eine sorgfältige Untersuchung die möglichen Interaktionen der aktiven Wirkstoffe mit zellulären Signalwegen und die Analyse ihrer Dosis-Wirkungskurven unterstützte uns bei der Auswahl von Verapamil, Nicardipin und Fluspirilen zur näheren Untersuchung. Diese Wirkstoffe sind Kalziumkanalblocker und Fluspirilen blockt auch D2 Dopaminrezeptoren.
Außerdem untersuchten und quantifizierten wir mitochondriale Phänotypen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen. Unsere Untersuchungen ergaben, dass Mitochondrien in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen einer signifikanten Hyperfusion unterliegen und ein schwächeres Membranpotenzial aufweisen. Weiterhin fanden wir eine Verringerung der maximalen der mitochondrialen Elektronentransportkapazität und eine verringerte Aktivität des Enzyms Zitratsynthase, welches die Effizienz des Zitratzyklus bestimmt.
Fluspirilen, Verapamil und, in geringerem Ausmaß, Nicardipin, verbesserten einige krankheitsbedingte lysosomale und mitochondriale Phänotypen. Des Weiteren konnten Verapamil und Nicardipin, nicht aber Fluspirilen, den erhöhten zellulären Kalziumspiegel in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen absenken. Erniedrigungen im Kalziumgehalt können durch die Inhibition der kalziumabhängigen Protease Calpain 1 zu einer Induktion der Autophagie führen. Wir untersuchten, ob eine chemische Inhibition der Calpain 1-Protease die Anzahl der Autophagosomen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen senkt, und stellten fest, dass dies nicht der Fall ist. Eine Inhibition von Calpain 1 führte lediglich zu einem Anstieg der Zahl zellulärer Autophagosomen. Als Nächstes untersuchten wir die Auswirkung der Wirkstoffbehandlung auf den Autophagiefluss. Verapamil und Nicardipin hatten keinen Einfluss auf den Autophagiefluss in der getesteten Konzentration in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen während Fluspirilen die Autophagie induzierte. Gleichzeitig stellten wir fest, dass hohe Dosen von Nicardipin und Verapamil teilweise vor einem Verlust des lysosomalen pH-Werts durch eine Behandlung mit Bafilomycin A1 schützen konnten. Da Fluspirilen auch ein Dopaminrezeptorblocker ist, untersuchten wir die Auswirkung einer erhöhten Dosis von Dopamin auf die Zahl der Autophagosomen. Wir fanden, dass eine mittlere Dosierung von Dopamin einen Trend zu einer leichten Verringerung von Autophagosomen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen zur Folge hat.
Wir vermuten, dass die Kalziumkanalblocker Verapamil und Nicardipin und der Dopaminrezeptorblocker Fluspirilen unterschiedliche zelluläre Signalwege benutzen, aber letztendlich um ähnliche Botenstoffe verwenden, um die Funktion der Lysosomen in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen zu verbessern. Die Verringerung des intrazellulären Kalziumgehalts durch Verapamil und Nicardipin führt zu einer Aktivierung von Adenylatzyklasen, welche eine Erhöhung des intrazellulären cAMP Spiegels herbeiführen. Fluspirilen inhibiert Dopaminrezeptoren vom Typ D2 (D2DR), was zu einer selektiven Aktivierung von Dopaminrezeptoren des Typs D5 (D5DR) führen könnte. Im Gegensatz zu D2 führen D5D Rezeptoren zu einer Aktivierung von Adenylatzyklasen und einer Erhöhung des cAMP Spiegels. cAMP aktiviert die Protein Kinase A (PKA), welche durch eine Proteinphosphorylierung von lysosomalen Chloridkanälen und Protonenpumpen die lysosomale Aktivität erhöht. Dies führt zu einer Verbesserung des Abbaus von Autophagosomen und lysosomalem Speichermaterial und zu einer verbesserten Zellgesundheit in CbCln3Δex7/8/Δex7/8 Zellen.
Eine Verbesserung der lysosomalen Funktion in der JNCL kann einen wirksamen Therapieansatz ergeben. Wir hoffen, dass die hier vorgestellten Methoden und Ergebnisse einen ersten Schritt in diese Richtung darstellen.
Juvenile neuronal ceroid-lipofuscinosis (JNCL) is a rare lysosomal storage disease in children with lethal outcome and no therapy. The origin of JNCL has been traced to autosomal recessive mutations in the CLN3 gene, and ~85% of the JNCL patients harbor a 1.02 kb deletion that removes the exons 7 and 8 and the surrounding intronic DNA (CLN3Δex7/8). So far, structure, function and localization of the CLN3 protein remain elusive. However, there is strong evidence that CLN3 modulates a process or condition that is essential in many cellular pathways. Lipid metabolism and antero-/retrograde transport, two mechanisms CLN3 was previously implicated in, fulfill these requirements. Notably, also a bioactive group of glycosphingolipids referred to as gangliosides is tightly interrelated with these functions. Furthermore, a-series gangliosides have been shown to be involved in the development and sustenance of the brain, where they are essential for neurite outgrowth and cell survival. Defects in ganglioside metabolism were shown to play a crucial role in many lysosomal storage disorders. However, the contribution of gangliosides to NCL pathology is largely unknown.
The present study analyzed central enzymes and metabolites of the a-series ganglioside pathway in a JNCL cell model. The core finding was, thereby, the reduced amount of the neuroprotective ganglioside GM1 in homozygous CbCln3Δex7/8 cells. This was caused by the enhanced action of the GM1-degrading multimeric enzyme complex and in particular, by the upregulation of protein levels and increased enzyme activity of β-galactosidase (Glb1).
Improved binding of Glb1 to substrate-carrying membranes was provided by an increase in LBPA levels. In combination with other smaller alterations in the ganglioside pattern, a shift towards less complex gangliosides became present. The resulting loss of neuroprotection may be the reason for the multifocal pathology in homozygous CbCln3Δex7/8 cells.
The second part of the present study investigated the cellular mechanisms behind the altered ganglioside profile with regard to the potential role of CLN3. Here, the anterograde transport of GM1 to the plasma membrane presented a positive correlation with the amount of full-length CLN3. In case of the truncated protein this correlation was missing, resulting in reduced PM staining with CTxB-FITC. However, transfection of full-length CLN3 in these cells restored the CTxB-FITC intensity. Based on the neuroprotective role of GM1, the corresponding increase in GM1 levels may be the cause for the restoration effects observed in previous studies using full-length CLN3. Hence, administration of GM1 was expected to improve cell viability of homozygous CbCln3Δex7/8 cells and beyond that to rescue potentially some disease phenotypes. However, no effect could be observed. The reason for this may be reduced caveolar uptake and the mislocalization of ganglioside GM1 to the trans-Golgi network (TGN) and redirection towards degradative compartments.
Both are in line with the idea of an impaired endocytic flux in CLN3 deficiency. The observed localization of CLN3 in the TGN suggests a potential role for CLN3 in the lipid sorting machinery, subsequently altering membrane composition and its regulatory functions. The resulting imbalance may affect many of the cellular processes impaired in JNCL.
Recently, two of the most common types of bone cancers in children and young adults have been proven to exhibit vulnerability to poly(ADP)-ribose polymerase, (PARP) inhibitors (e.g. olaparib, talazoparib). Ewing’s sarcoma (ES) are reported to harbor a fusion gene EWS-FLI1 (85%), inducing tumorigenesis. Additional, as the fusion gene acts as aberrant transcription factor, it similarly induces elevated PARP expression levels sensitizing ES to PARP inhibition. Second, by an exome sequencing approach in a set of primary osteosarcomas (OS) we identified mutation signatures being reminiscent of BRCA deficiency. Therefore, the sensitivity of a panel of OS cell lines to either talazoparib single treatment or in combination with several chemotherapeutic drugs was investigated.
To screen ES tumor cell lines against PARP inhibitors we applied four different PARP inhibitors (talazoparib, olaparib, niraparib and veliparib) that are frequently being used for clinical studies. We combined those PARP inhibitors with a set of chemotherapeutics (temozolomide (TMZ), SN-38, etoposide, ifosfamide, doxorubicin, vincristine and actinomycin D) that are part of the first-line therapy of ES patients. Here, we demonstrate how PARP inhibitors synergize with TMZ or SN-38 to induce apoptosis, whereas the combination of PARP inhibitors with the other drugs are not favorable. By investigation of key checkpoints in the molecular mechanisms of cell death, the pivotal role of the mitochondrial pathway of apoptosis mediating the synergy between olaparib and TMZ was revealed.
Employing talazoparib monotherapy in combination with or without several chemotherapeutic drugs (TMZ, SN-38, cisplatin, doxorubicin, methotrexate and etoposide/carboplatin), the correlation between homologous recombination (HR) repair deficiency (BRCAness) and the response to talazoparib as prototypical PARP inhibitor was validated in different OS cell lines. By calculation of combination indices (CI) and fraction affected (Fa) values, we identified TMZ as the most potent chemotherapeutic drug in combination with talazoparib inducing the mitochondrial apoptotic pathway in OS.
In our studies of two independent tumor entities with contrary genetic background we identified the combination of PARP inhibitor and TMZ as being most effective. Our studies point out that after TMZ induced DNA methylation and concomitant PARP trapping, DNA damage-imposed checkpoint kinase activation consequently induces G2-cell cycle arrest. Subsequent, PARP inhibitor/TMZ causes MCL-1 degradation, followed by activation of BAK and BAX, succeeding in loss of mitochondrial outer membrane potential (LMMP) and activation of downstream effector-caspases in mitochondrial apoptosis. Our findings emphasize the importance of PARP inhibition in order to chemosensitize ES, which express high PARP levels, or OS that bear features of BRCAness.
Weltweit sind ca. 130–180 Millionen Menschen mit HCV infiziert und jährlich sterben etwa 500.000 Menschen an dessen Folgen. Die neuartigen Therapien versprechen zwar eine sehr hohe Heilungsrate, sind aber aufgrund ihrer enorm hohen Kosten nur in Industrieländern verfügbar. Noch immer gibt es keine prophylaktische Vakzinierung gegen HCV. Deshalb ist es wichtig, den HCV-Lebenszyklus und die Interaktion zwischen Wirtszelle und Virus detailliert zu verstehen, um die Entwicklung von Therapien und Impfungen zu ermöglichen. Außerdem kann ein fundiertes Wissen von HCV translatiert werden und auf neuartige Erreger der Familie der Flaviviridae, wie Denguevirus und Zikavirus, angewendet werden. Während der Zelleintritt und die Replikation von HCV relativ gut charakterisiert sind, bleiben die Assemblierung und Freisetzung der viralen Partikel schlecht verstandene Schritte des HCV-Lebenszyklus. In dieser Arbeit sollte die Rolle des zellulären Proteins α-Taxilin im Lebenszyklus von HCV untersucht werden. In einer späteren Phase der Arbeit wurde der endosomale Freisetzungsweg von HCV untersucht. Dazu wurden HCV Varianten generiert und charakterisiert, die Fluoreszenz-Proteine im NS5A- und E1-Protein enthalten, durch die es möglich ist, den Replikationskomplex und die Viruspartikel zu visualisieren und zu quantifizieren und den viralen Lebenszyklus dadurch besser untersuchen zu können...
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, vor- und nachbereitenden Unterricht zu Biodiversitätsführungen an den vier außerschulischen Lernorten Palmengarten, Senckenbergmuseum, Stadtwaldhaus und Zoo Frankfurt zu evaluieren. Durch den Unterricht mithilfe neu entwickelter Arbeitsmaterialien sollte die aktuelle Motivation der Schüler und weitere pädagogisch-psychologische Lernvariablen gefördert werden. Es stellte sich die Frage, ob so eine erhöhte Auseinandersetzung mit dem Themenkomplex Biodiversität erreicht werden kann und welche Einflussfaktoren dabei eine Rolle spielen.
Theoretische Grundlage war dabei das Risikowahlmodell der Leistungsmotivation nach Atkinson, das von Rheinberg zum handlungstheoretischen Modell der Motivation erweitert wurde (Rheinberg & Vollmeyer, 2012). Auf dieses bezieht sich der von Rheinberg et al. (2001) entwickelte und hier eingesetzte Fragebogen zur aktuellen Motivation (FAM).
Die Stichprobe setzte sich aus insgesamt 523 Schülern der Klassen 5 bis 9 zusammen. Davon nahm jeweils die Hälfte mit (Versuchsgruppe) und die andere ohne (Kontrollgruppe) vor- und nachbereitendem Unterricht an den Biodiversitätsführungen teil. Die Erhebung der aktuellen Motivation, des erworbenen Fachwissens und weiterer Variablen erfolgte in einem Pre/Post/Follow-Up-Design mit Fragebögen, deren Auswertung analytisch statistisch durgeführt wurde.
Es zeigte sich, dass in der Gesamtstichprobe die Teilnahme an der Biodiversitätsführung die aktuelle Motivation der Schüler erhöhte. Dauerhafte Lernparameter wie die Biologieeinstellung und die Interessenshandlung wurden jedoch nicht signifikant verändert. Ein eindeutiger Effekt der unterrichtlichen Vorbereitung konnte jedoch nicht ermittelt werden. Einzig beim gemessen Fachwissen zu den Führungsinhalten schnitt die Versuchsgruppe signifikant besser ab. Insgesamt wird angenommen, dass der Effekt des Besuchs des außerschulischen Lernortes an sich den Effekt der Vor- und Nachbereitung überdeckt oder vom Einfluss anderer Parameter beeinflusst wird. Hier stach besonders das Alter der Jugendlichen hervor, das vor allem in der hier evaluierten Schülergruppe bedingt durch die Pubertät eine große Rolle spielt. Weitere Einflussfaktoren waren die Biologieeinstellung und die Unterrichtsvariablen der Führung. In den Stichproben der einzelnen außerschulischen Lernorte zeigten sich leichte Abweichungen von der Gesamtstichprobe. Diese waren meist auf die leicht unterschiedliche Zusammensetzung der Stichproben zurückzuführen. Aber auch Besonderheiten der Lernorte hatten dabei ein bedeutendes Gewicht.
Bezüglich der Lernbedingungen für die Lernorte ließen sich aus den Ergebnissen vor allem zwei Komponenten ermitteln: Zum einen die Architektur/räumliche Struktur der Lernorte. Hier können Faktoren wie drinnen/ draußen, Größe und die räumliche Orientierung unterschieden werden. All dies hat Auswirkungen auf das physische Wohlbefinden der Schüler, was wiederum eine Voraussetzung für eine hohe Lernmotivation ist. Die andere Hauptkomponente ist das am Lernort behandelte Thema. Hier kann grob zwischen Pflanzen und Tieren unterschieden werden. Pflanzen wurden dabei in mehreren Studien von den Schülern als weniger attraktiv eingeschätzt. Trotzdem sollten aber die Möglichkeiten, auch botanische Themen außerhalb der Schule zu behandeln, von den Lehrkräften zur Vermittlung biologischer Vielfalt genutzt werden.
Als Konsequenz der Ergebnisse kann der Besuch eines außerschulischen Lernrotes im Biologieunterricht bezüglich der Förderung der Lernmotivation unbedingt empfohlen werden. Da kein klarer Effekt des vor- und nachbereitenden Unterrichts der Biodiversitätsführungen erkennbar war, wären hier weitere Untersuchungen vonnöten, um genauere Aussagen machen zu können. Hier böten sich Studien mit Schülern anderer Altersgruppen und der Vergleich nur zweier außerschulischer Lernorte an.
The transition from the marine to the terrestrial realm is one of the most fascinating issues in evolutionary biology for it required the appearance, in different organisms, of several novel adaptations to deal with the demands of the new realm. Adaptations include, for instance, modifications in different metabolic pathways, development of body structures to facilitate movement and respiration, or tolerance to new conditions of stress. The transition to the land also gives an extraordinary opportunity to study whether evolution used similar changes at the genomic level to produce parallel adaptations in different taxa. Mollusks are among taxa that were successful in the conquest of the land. For instance, several lineages of the molluscan clade Panpulmonata (Gastropoda, Heterobranchia) invaded the intertidal, freshwater and land zones from the marine realm. In my dissertation, using tools from bioinformatics, phylogenetics, and molecular evolution, I used panpulmonates as a suitable model group to study the independent invasions into the terrestrial realm and the adaptive signatures in genes that may have favored the realm transitions. My work includes two peer-reviewed published papers and one manuscript under review. In Publication 1 (Romero et al., 2016a), I used mitochondrial and nuclear molecular markers to resolve the phylogeny of the Ellobiidae, a family that possesses intertidal and terrestrial species. The phylogeny provided an improved resolution of the relationships within inner clades and a framework to study the tempo and mode of the land transitions. I showed that the terrestrialization events occurred independently, in different lineages (Carychiinae, Pythiinae) and in different geological periods (Mesozoic, Cenozoic). In addition, the diversification in this group may not have been affected by past geological or climate changes as the Cretaceous-Paleogene (K-Pg) event or the sea-level decrease during the Oligocene. In Publication 2 (Romero et al., 2016b), I generated new mitochondrial genomes from terrestrial species and compared them with other panpulmonates. I used the branch-site test of positive selection and detected significant nonsynonymous changes in the terrestrial lineages from Ellobioidea and Stylommatophora. Two genes appeared under positive selection: cob (Cytochrome b) and nad5 (NADH dehydrogenase 5). Surprisingly, I found that the same amino acid positions in the proteins encoded by these genes were also under positive selection in several vertebrate lineages that transitioned between different habitats (whales, bats and subterranean rodents). This result suggested an adaptation pattern that required parallel genetic modifications to cope with novel metabolic demands in the new realms. In Manuscript 1 (Romero et al., under review), I de novo assembled transcriptomes from several panpulmonate specimens resulting in thousands of genes that were clustered in 702 orthologous groups. Again, I applied the branch-site test of positive selection in the terrestrial lineages from Ellobioidea and Stylommatophora and in the freshwater lineages from Hygrophila and Acochlidia. Different sets of genes appeared under positive selection in land and freshwater snails, supporting independent adaptation events. I identified adaptive signatures in genes involved in gas-exchange surface development and energy metabolism in land snails, and genes involved in the response to abiotic stress factors (radiation, desiccation, xenobiotics) in freshwater snails. My work provided evidence that supported multiple land invasions within Panpulmonata and provided new insights towards understanding the genomic basis of the adaptation during sea-to-land transitions. The results of my work are the first reports on the adaptive signatures at the codon level in genes that may have facilitated metabolic and developmental changes during the terrestrialization in the phylum Mollusca. Moreover, they contribute to the current debate on the conquest of land from the marine habitat, a discussion that has been only based in vertebrate taxa. Future comparative genome-wide analyses would increase the number of genes that may have played a key role during the realm transitions.
Primäre Tumore werden nach ihrem Entstehungsort benannt. Selbst Metastasen zeigen eine gewisse Ähnlichkeit mit ihrem ursprünglichen Gewebe. Somit gehören alle Geschwülste, die ursprünglich der Harnblase entstammen, zu den Harnblasenkarzinomen.
Das Harnblasenkarzinom geht meist (90-95%) von der Schleimhaut der ableitenden Harnwege aus und wird als Urothel bezeichnet. Dementsprechend haben die meisten Patienten mit der Diagnose Blasenkarzinom ein Urothel-Blasenkarzinom. Die restlichen Blasenkarzinome entfallen auf Adenokarzinome, Plattenepithelkarzinome, kleinzellige Karzinome, Sarkome, Paragangliome, Melanome oder Lymphome (Humphrey A. et al. 2016, Moch H. et al 2016).
Die Urothel-Blasenkarzinome können sowohl flach, als auch warzenförmig wachsen. Je nach Diagnostik „oberflächlich“ oder „muskelinvasiv“ lassen sich die Urothel-Blasenkarzinome in zwei Hauptgruppen unterteilen;
Etwa 70% der Erkrankten haben dabei ein oberflächliches Urothel-Blasenkarzinom, das auf die Blasenschleimhaut begrenzt ist und durch eine Basistherapie, sog. Transurethrale Resektion (TUR-B) behandelt wird. Dabei werden die in der Schleimhaut gewachsenen Tumore getrennt reseziert. Therapieergänzend und/oder prophylaktisch wird die Blase danach mit einem Chemotherapeutikum gespült (intravesikale Instillation). Diese Zytostatika-Behandlung soll das Wiederauftreten eines Rezidivs verhindern bzw. eventuell verlangsamen (Iida K. et al. 2016, Celik O. et al. 2016).
The lung comprises more than 40 different cell types, from epithelial cells to resident mesenchymal cells. These cells arise from the foregut endoderm and differentiate into specialized cell types that form the respiratory and conducting airways, and the trachea. However, the molecular pathways underlying these differentiation processes are poorly understood, and may be relevant to pathological conditions. According to the World Health Organization (WHO), while the respiratory disease rate is increasing, limited treatment and therapies are available. Thus, there is a growing need for new treatment strategies and alternative therapies. Various in vivo and in vitro studies in the model organism mus musculus have already provided valuable information on lung cell lineages and their differentiation and/ or dedifferentiation during development and pathological conditions. However, there remain many questions regarding the key regulators and molecular machinery driving lung cell differentiation and underlying lung progenitor/stem cell biology.
Aiming to develop new animal models for lung diseases, we used a forward genetic careening approach, which provides an unbiased method for identifying genes with important roles in lung cell differentiation, and thus probable contributors to pathological conditions. We conducted an N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) mutagenesis screen in mice and used several histological and immunohistochemical approaches to identify and isolate mutants, focusing on mutations associated with cell differentiation rather than those affecting early development and patterning of the respiratory system. Thus, we screened for phenotypes in the respiratory system of pups from the F2 generation at postnatal day 7 and 0 (P7; P0). I specifically screened 114 families. Each F1 male animal is the founder of 5 to 6 F2 female daughters. For each family, at least 4 F2 females per male founder were analyzed. In total, I screened 630 litters at P7 and P0 with 7 pups on average for each litter. As a result of this extensive screening, 11 different phenotypes in 42 different F2s were discovered at primary screen and later just 2 phenotypes recovered in F3 generation of identified carriers. To identify the causative genes for each of these phenotypes, whole exome sequencing will be conducted in the future to identify recurring SNPs; these can subsequently be linked causatively to the resultant phenotype(s) via complementation studies. In turn, these linkages would enable the creation of mutant mice using CRISPR/Cas9 genomic engineering, which would be invaluable to the further study of respiratory development and disease.
The development of the atrioventricular (AV) canal and the cardiac valves is tightly linked and a critically regulated process. Anomalies in components of the involved pathways can lead to congenital valve malformations, a leading cause of morbidity and mortality in neonates. Myocardial Bmp as well as endocardial Notch and Wnt signaling have been identified as critical factors for the induction of EMT during the formation of the endocardial cushions and cardiac valves. Of these, canonical Wnt signaling positively regulates endocardial proliferation and EMT but negatively regulates endocardial differentiation. Further, elevated Wnt signaling leads to the ectopic expression of myocardial Bmp ligands suggesting a high level of integration of the involved pathways and crosstalk amongst the different cardiac tissues.
Here we have identified a novel role for Id4 as a mediator between Bmp and Wnt signaling. Id4 belongs to the Id family of proteins and is known to be involved in bone and nervous system development. We found that in zebrafish, id4 is expressed in the endocardium of the AV canal at embryonic stages and throughout the atrial chamber in addition to AV canal, in adults. Using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) we established an id4 mutant allele. Our analysis shows that id4 mutant larvae are susceptible to retrograde blood flow, and show aberrant expression of developmental valvular markers. These include expanded expression domains of markers like bmp4, cspg2a and Alcam. In contrast, valve maturation as assessed by the expression of spp1 is considerably reduced in id4 mutants. Using conditional transgenic systems, along with elegant in vivo imaging of transgenic reporter lines, we further found that id4 is a transcriptional target of Bmp signaling, and it is capable of dose dependently restricting Wnt signaling in the endocardium of the Atrioventricular Canal.
Taken together, our data identifies Id4 as a novel player in Atrioventricular Canal and valve development. We show that Id4 function is important in valve development acting downstream of Bmp signaling by restricting endocardial Wnt to allow valve maturation
Fungi are an important component of every ecosystem but hardly considered in biodiversity monitoring projects. This thesis aims at characterizing fungal diversity, with an emphasis on epigeous fungi, encompassing different biogeographic zones and points in time. A main sampling area was established in the Taunus mountain range in Germany, which was sampled monthly over three years.
For testing species richness on spatial scale, the Taunus transect was compared with four other areas, which were assessed with lower sampling effort. One of these areas was Bulau in Germany, in which four excursions were made. Furthermore, two sampling events were performed in Somiedo in Spain and one sampling event in Kleinwalsertal in Austria. Already existing data of a two-year monitoring project in Panama next to the river Majagua were additionally used for comparison.
All these areas were investigated with a standardized sampling protocol focusing on macroscopically evident fungi and vascular plants using a time-restricted transect design. The transects consisted of strips, which were 500 m long and about 20 m broad, and were sampled for 2 hours at each single sampling event....
Xenorhabdus and Photorhabdus bacteria are gaining more and more attention as a subject of research because of their unique yet similar life cycle with nematodes and insects. This work focused on the secondary metabolites that are produced by Xenorhabdus and Photorhabdus. With the help of modern HPLC-MS methodologies and increasingly available bacterial genome sequences, the structures of unknown secondary metabolites could be elucidated and thus their biosynthesis pathways could be proposed, too.
The first paper reported 17 depsipeptides termed xentrivalpeptides produced by the bacterium Xenorhabdus sp. 85816. Xentrivalpeptide A could be isolated from the bacterial culture as the main component. The structure of xentrivalpeptide A was elucidated by NMR and the Marfey´s method. The remaining xentrivalpeptides were exclusively identified by feeding experiments and MS fragmentation patterns.
The second paper described the discovery and isolation of xenoamicin A from Xenorhabdus mauleonii DSM17908. Additionally, other xenoamicin derivatives from Xenorhabdus doucetiae DSM17909 were analyzed by means of feeding experiments and MS fragmentation patterns. The xenoamicin biosynthesis gene cluster was identified in Xenorhabdus doucetiae DSM17909.
The manuscript for publication focused on the biosynthesis of anthraquinones in Photorhabdus luminescens. The Type II polyketide synthase for the biosynthesis of anthraquinone derivatives was discovered in P. luminescens in a previous publication by the Bode group,1 in which a partial reaction mechanism for the biosynthesis has been proposed. The manuscript reported in this thesis however elucidated the biosynthetic mechanisms in a greater detail as compared to the previous publication. Particularly, the biosynthetic mechanism was deciphered through heterologous expression of anthraquinone biosynthesis (ant) genes in E. coli. Additionally, deactivation of the genes antG encoding a putative CoA ligase and antI encoding a putative hydrolase, was performed in P. luminescens. Selected ant genes were over-expressed in E. coli as well as the corresponding proteins purified for in vitro assays. Model compounds were chemically synthesized as possible substrates of AntI and were used for in vitro assays. Here, it was revealed that the CoA ligase AntG played an essential role in the activation of the ACP AntF. Furthermore, a chain shortening mechanism by the hydrolase AntI was identified and was further confirmed by in vitro assays using model compounds. Additionally, this chain shortening mechanism was supported by homology based structural modeling of AntI.
Tulasnella species (Tulasnellaceae, Cantharellales, Basidiomycota) form inconspicuous basidiomata on rotten branches or trunks of trees, difficult to find and recognize in nature. However, according to ultrastrucural and molecular data, species of Tulasnellaceae are the most frequent mycorrhriza forming fungi (mycobionts) of green, photosynthetic orchids worldwide. Species of Tulasnellaceae were also found as prominent mycobionts of the extraordinary diverse orchids in tropical montane rainforest of Southern Ecuador. Orchids obligately depend on mycobionts during the juvenile stage when the fungi have to deliver carbon to the non-photosynthetic protocorm and thus the fungi substantially influence the establishment of orchids in the wild. Species of Tulasnellaceae can acquire carbon from decaying bark or wood by specific saprotrophic capabilities as was recently proven through comparative genomics that included data on decay enzymes from Tulasnella cf. calospora isolated from orchid mycorrhizae (Anacamptis laxiflora, Italy). Thus, species of Tulasnellaceae can be saprotrophs and symbionts simultaneously.
It is currently under discussion, whether specific species of Tulasnella are required for seed germination and establishment of distinct terrestrial and epiphytic orchids in nature or if species of Tulasnella are generalists concerning their association with orchids. The inconsistences in species concepts and taxonomy of Tulasnella spp., however, strongly impede progress in this field of research. The aim of the present study was, therefore, to revise the species concepts by combining, for the first time, morphological and molecular data from basidiomata.
Specimens were collected in tropical Andean forest in Southern Ecuador and in temperate forests in Germany. Additional specimens were loaned from fungaria. In total, 205 specimens, corresponding to 16 own samples and 189 specimens from fungaria were analyzed. The mycobiont relationships of Tulasnella spp. with orchids from the sampling area in Ecuador were studied in populations of Epidendrum rhopalostele. The basis for molecular-phylogenetic analysis was completed by data obtained from own previous investigations on mycobionts from the investigation area and Tulasnella isolates from Australia.
30 morphospecies are illustrated and delimited by a morphological key based on traditional species concepts. Tulasnella andina from Ecuador and Tulasnella kirschneri from China are presented as species new to science. Tulasnella cruciata is described from herbarium material for the first time. Tulasnella aff. eichleriana and T. violea are reported for the first time from Ecuador. Molecular sequences of two Tulasnella spp. isolated from mycobionts of Epidendrum rhopalostele cannot be related to any morphological species concept. Statistical analyses suggest that conventional diagnostic using morphological characteristics is ambiguous for delimiting morphologically similar species.
For the first time sequences of the ITS-5.8S rDNA region were obtained after cloning from fresh basidiomata. Extraction of DNA from herbarium specimens was, however, unsuccessful. Sequences from 16 fresh basidiomata, six pure cultures, and sequences of orchids mycorrhizae (e.g. from Epidendrum rhopalostele) available in the database GenBank were analyzed. Proportional
variability of ITS-5.8S rDNA sequences within and among cultures and within and among specimens were used to designate morphospecies. Results suggest an intragenomic variation of less than 2 %, an intraspecific variation of up to 4 % and an interspecific divergence of more than 9 % for Tulasnella spp.
Four percent of intraspecific divergence was defined as a minimum threshold for delimiting phylogenetic species. This threshold corroborates the so far used 3 % to 5 % divergence in delimitation of operational taxonomic units of Tulasnella mycobionts.
Quite a number of sequences of Tulasnella are available in GenBank, mostly obtained from direct PCR amplification from orchid mycorrhizae. By including closely related sequences in the phylogenetic analysis, several morphological cryptic species of Tulasnella, mostly from Ecuador, were found. Arguments are given for molecular support of the new species Tulasnella andina and the established species Tulasnella albida, T. asymmetrica, T. eichleriana, T. tomaculum, and T. violea. Thus, by combining molecular and morphological data species concepts in Tulasnella are improved. The definitions of Tulasnella calospora and T. deliquescens, however, remain phylogenetically inconsistent.
The present investigation is a first step to expand our knowledge on the intraand interspecific morphological and molecular variability of Tulasnella spp. and to delimit species relevant for studies on ecology and communities of orchids and Tulasnellaceae.
The human Long Interspersed Nuclear Element-1 (LINE-1, L1) is a member of the group of autonomous non-LTR retrotransposons found in almost every eukaryotic genome. L1 elements generate copies of themselves by reverse transcription of an RNA intermediate and integrate into the host genome by a process called Target Primed Reverse Transcription (TPRT). They are responsible for the generation of approximately 35% of the human genome, cover about 17% of the genome and represent the only group of active autonomous transposable elements in humans. L1 activity bears several risks for the integrity of the human genome, since the L1-encoded protein machinery generates DNA double-strand breaks (DSBs) and is capable of conducting numerous genome-destabilizing effects, e.g. causing deletions at insertion sites, disrupting or rearranging coding sequences and deregulating transcription of functional host genes. On the other side, L1 elements have had and still exert a great impact on human genome structure and evolution by increasing the genome size and rearranging and modulating gene expression. Furthermore, due to its endogenous and generally non-pathogenic nature, L1 is a promising candidate as vector for gene delivery in somatic gene therapy. The structure of the flanking regions between de novo L1 integrants and the genomic sequence suggests an involvement of cellular DSB repair pathways in L1 mobilization. To elucidate the role of DSB repair proteins in L1 retrotransposition, I disabled DSB repair factors ATM, ATR, DNA-PK, p53 and Ku70 by knock down (KD) using short hairpin RNA (shRNA) expression constructs. To inhibit the function of DSB repair factors PARP and Rad51, I used dominant negative (DN) PARP and Rad51 mutants. Applying a well established L1-retrotransposition reporter assay in HeLa cells, de novo retrotransposition events were launched in order to test L1 for its retrotransposition activity in the context of altered DSB repair conditions. I could show that L1 retrotransposition frequency after ATM KD had increased by 3-fold, while ATR and p53 KD reduced L1 retrotransposition by approximately one third. Unfortunately, the cytotoxic effects of the DNA-PK and Ku70 shRNA expression constructs were too strong to determine potential effects of DNA-PK and Ku70 KD on L1 retrotransposition. Inhibition of PARP function by expression of the DN mutant and overexpression of wild type PARP were found to increase L1 retrotransposition by 1.8 and 1.5, respectively, while Rad51 DN had no detectable effect. Interestingly, overexpression of wild type Rad51 seemed to roughly double L1 retrotransposition frequencies. Since in my experiments KD or expression of DN mutants was time-delayed to the onset of L1 retrotransposition after transfection into the cells, I developed a temporally controllable, tetracyclin transactivator (tTA)-dependent L1 retrotransposition reporter assay which will be of great value for future L1 retrotransposition studies that rely on temporally controllable retrotransposition. Due to a previously published hypothesis of L1 playing a role in brain development by contributing to somatic mosaicism in neuronal precursor cells, I generated a transgenic mouse (LORFUS) using the tTA-dependent L1 construct to further test this hypothesis. LORFUS harbors a bidirectional cassette driving simultaneous expression of a GFP-tagged L1 retrotransposition reporter and beta-galactosidase. It was bred to another transgenic mouse line expressing tTA in the forebrain. The double transgenic offspring was used to characterize L1 expression and retrotransposition patterns in the brain at postnatal day 15 (P15). General transgene expression indicated by beta-galactosidase activity was found in hippocampus, cortex and striatum, while retrotransposition events revealed by GFP expression were found in hippocampus, cortex, striatum, olfactory bulb and brainstem. These results suggested L1 retrotransposition in the granule layer of the dentate gyrus earlier than P15 and migration of cells carrying these events along the rostral migratory stream into the olfactory bulb. To facilitate the use of L1 as gene delivery tool in gene therapy or genetic engineering, I furthermore intended to manipulate the L1 target site recognition to allow the site-specific integration into defined genomic locations. To this end, I performed crystal structure-guided mutational analysis exchanging single amino acid residues within the endonuclease (EN) domain of L1 to identify residues influencing target site recognition. However, individual point mutations did not change the nicking pattern of L1-EN, but resulted in a reduction of endonucleolytic activity reflected by a reduced retrotransposition frequency. This suggests that additional factors other than the DNA nicking specificity of L1-EN contribute to the targeted integration of non-LTR retrotransposons in the host genomes.
The fungal genus Pestalotiopsis s.l. contains approximately 300 described species and is globally distributed. The monotypic genus Pestalotia is considered the closest relative of Pestalotiopsis s.l. This study aims to investigate the diversity and systematics within Pestalotiopsis s.l. and its relation to Pestalotia. Therefore, an integrative approach is used considering molecular phylogeny methods as well as examination of morphological characters.
Recently, Pestalotiopsis s.l. was split into three genera with the addition of the newly erected Neopestalotiopsis and Pseudopestalotiopsis. The species of these genera are usually saprotrophic, phytoparasitic, or endophytic, and have been isolated from soil, air, and many kinds of anorganic material. The asexual fruiting bodies appear on infected plant material as black acervuli that release conidia. The conidia are important to examine for morphological taxon recognition. The number of conidial cells is the feature that distinguishes Pestalotiopsis s.l. spp. with five celled conidia, from Pestalotia pezizoides with six celled conidia. However, the significance of morphological characters is controversially discussed among mycologists. In recent years, 55 new species were described based on minor genetic distances and marginal or no morphological differences. Thus, the value of certain morphological characters and genetic markers need to be reconsidered.
In this study, 102 herbarium specimens of 26 described species, with an emphasis on plant pathogenic species from North America, have been morphologically examined and documented through drawings and photographs. Morphological examination was complemented with a comprehensive molecular dataset obtained from 191 cultures representing the genera Neopestalotiopsis, Pestalotia, Pestalotiopsis, Pseudopestalotiopsis, and Truncatella. One novelty of this work is that, besides the well-established markers ITS, TEF1, and ß-tubulin, the protein-coding genes MCM7 and TSR1 were successfully sequenced and included in the analyses. Phylogenies using Maximum Likelihood and Bayesian inference methods of single loci and the combined dataset were calculated. By comparison of these phylogenies, MCM7 was identified as the most powerful one in terms of phylogenetic resolution and statistical support of nodes and is proposed as an additional barcoding marker in Pestalotiopsis s.l.
In Pestalotiopsis, species delimitation was tested using the Baysian Phylogenetics and Phylogeography (BP&P) program that tests an existing species scenario against Bayesian inference methods under a multispecies coalescent model. The program supported only ten species out of the predetermined 19 species scenario. Measurements of conidia for species detected by BP&P were explored using a TukeyHSD-Test in the program R to find means that are significantly different from each other. This test revealed that combinations of morphological characters are required to distinguish between the ten species found by BP&P.
Another purpose of this work was to clarify the status of Pestalotia with regard to Pestalotiopsis s.l. Therefore, fresh epitypic material of Pestalotia pezizoides, was collected, isolated, and cultivated. The molecular analysis of a combined dataset of the gene regions ITS and LSU for species of Amphisphaeriales nested P. pezizoides in the genus Seiridium. Thus, synonymy of Pestalotia with Seiridium is proposed here. This is supported by morphology of the conidia. Further, an epitype is proposed for the type species of Pestalotiopsis, P. maculans. On the other hand, the recently proposed epitype of P. adusta is rejected here as it conflicts with the taxonomic hypothesis obtained in this study and its introduction is inconsistent with the formal requirements for epitypification. A new topotypic specimen is proposed instead. Additionally, several nomenclatural changes become necessary in many species examined. These include three new combinations and six synonyms of species of Pestalotiopsis s.l.
The conclusion of this work is that morphological data have potential as a valuable, inexpensive and easy way to recognize species. However, it is not the best method for species discovery and delimitation bearing in mind that in microfungi and many other organisms, individual plasticity and analogous structures are inadequately investigated. By phylogenetic analyses of molecular sequence data, it is possible to compare a great amount of equivalent characters and to delimit species that are morphologically cryptic. This is especially important since species of Pestalotiopsis s.l. mostly lack sexual structures that are helpful for morphological species delimitation in other groups of fungi. Thus, the Genealogical Concordance Species Concept (GCSC) finds its application in many fungal taxa. Conflicts in the genealogy between phylogenetic trees of different markers are interpreted as recombination of the genetic material within a linage. Accordingly, the change from conflict to congruence in a set of different phylogenetic trees can be seen as the species limit. It can be expected that increased application of the GCSC will lead to further approximation of described species numbers to the real number of species, especially in complicated groups like asexual microfungi.
Saccharomyces cerevisiae is a natural producer of isobutanol, which has more advantages as biofuel than ethanol, i.e. superior combustion energy, weaker corrosive action and reduced aqueous miscibility. Isobutanol is produced by the combination of the valine biosynthesis and the Ehrlich pathway. In this work, an industrial strain was employed for isobutanol production, in which the valine pathway was relocated into the cytosol. The valine pathway in yeast has a cofactor imbalance, since the glycolysis produces NADH, while Ilv5 employs NADPH for the reaction. Therefore, the cofactor specificity of the pathway was rebalanced with exchange of Ilv5 by an NADH-consuming mutant, IlvC6E6. Furthermore, Ilv6, which regulates the feed-back inhibition of the valine biosynthesis, was tested to boost isobutanol production; however, none of these Ilv6 alternatives could greatly enhance isobutanol production. Therefore, due to a still low production yield, the bottlenecks of the isobutanol pathway were deeper studied.
The major observed bottleneck concerned the conversion of DIV into KIV, since high concentrations of acetoin, 2,3-butandiol and, specially, DIV were observed in the fermentation supernatant, while neither KIV nor isobutyraldehyde were detected. This step is performed by the dihydroxy-acid dehydratase, Ilv3, which needs iron-sulfur clusters for its activity. Therefore, the first approach to circumvent this limitation was to increase the FeS assembly and its transference into the cytoplasm; however, Ilv3Δ19 activity was not improvement. Afterwards, Ilv3 alternatives were screened for substitution of Ilv3Δ19. Heterologous ILV3 orthologous with possible advantages were investigated, but Ilv3Δ19 was still the most promising alternative. Furthermore, sugar-acid enolases were tested as Ilv3Δ19 substitutes. These enolases also catalyze the dehydration of the substrate in the same way as Ilv3, but uses Mg2+ as cofactor. One of the employed enolases could complement valine auxotrophy; however, it allowed just a very slow growth of the Δilv3 strain and its activity could not be enhanced by mutagenesis studies.
Interestingly, we observed that once DIV is secreted out of the cell, it cannot be re-uptaken from the medium and this possibly further aggravates the pathway flux and Ilv3Δ19 activity. In order to suppress DIV waste, two strategies were formulated: the deletion of the possible DIV transporter, and the substrate channeling of DIV from IlvC6E6 to Ilv3Δ19. In order to find possible DIV export proteins, a transcriptome analysis of a strain producing high amounts of DIV against a strain producing no detected DIV were compared. Several transporters were found upregulated in the DIV producing strain, but, alone, none of these were responsible for the DIV efflux. For the substrate channeling, an artificial enzymatic net was constructed by the fusion of IlvC6E6 and Ilv319 with synthetic zippers, which have high affinity to each other, and as both enzymes are alone organized as oligomers. The use of this enzymatic net enhanced not only the isobutanol production in about 17%, but also 3-methyl-butanol production yield was 25% increased.
Nevertheless, together with bottlenecks arising from Ilv3 activity, the isobutanol production is limited by the ethanol production, which is the main product of S. cerevisiae. Therefore, in order to abolish ethanol production, PDC1 and PDC5 were deleted. Moreover, BDH1 and BDH2 were also deleted to create an NADH-driving force towards isobutanol production. However, the isobutanol yield of this mutant was even lower than that of the strain without the mentioned deletions. As a high production of isobutyric acid was observed, and it could be produced directly from KIV, different KIV decarboxylases and isobutanol dehydrogenases were investigated; but without improvement. Then, alternative pathways were abolished in other to favor isobutanol production, e.g. valine, leucine, isoleucine and panthotenate biosyntheses. Nevertheless, isobutanol yields were still low and the main byproducts were glycerol, acetoin, DIV and isobutyric acid. Despite the outcomes were not enough to enhance isobutanol production up to commercially required yields, these results help in the comprehension of the bottlenecks surrounding the isobutanol production pathway and serve as basis for further studies within the branched-chain amino acids biosynthesis and Ehrlich pathway.
Das Hören hat für den Menschen eine maßgebliche Bedeutung hinsichtlich Kommunikation und Orientierung. Auch wenn sich der Mensch stark auf seinen visuellen Sinn verlässt, wird mit dem Ausfall des Hörvermögens deutlich, wie viele Informationen oft unterbewusst über die Analyse von Schallsignalen gezogen werden. Trotz dieser grundlegenden Relevanz sind bis heute noch nicht alle Komponenten, die dem Hörprozess zugrunde liegen, entschlüsselt.
Um sich diesen offenen Fragestellungen anzunähern, müssen Forscher oft auf Tiermodelle zurückgreifen. Auf Grund ihres exzellenten Gehörs haben sich hier in den letzten Jahrzehnten Fledermäuse als taugliche Versuchstiere qualifiziert. Diese Tiere sind in der Lage sich ohne Verwendung des visuellen Systems in absoluter Dunkelheit zu orientieren, indem sie mit Hilfe der wiederkehrenden Echos ihrer ausgesendeten Ultraschalllaute die Umgebungsstrukturen analysieren. Weiterhin umfasst der zur Kommunikation und Ortung verwendete Frequenzbereich bei Fledermäusen ein Vielfaches von dem des menschlichen, was ebenfalls verschiedene Aspekte der Hörforschung begünstigt. Die in dieser Studie verwendete fruchtfressende Fledermausart Carollia perspicillata eignet sich hervorragend für akustische Untersuchungen, da ihr Innenohr keine speziellen morphologischen Spezialisierungen aufweist.
Anhand der Fledermausart C. perspicillata sollen innerhalb der vorliegenden Studie verschiedene offene Fragestellungen bezüglich der Innenohrmechanik näher beleuchtet werden. Um sich diesen Fragestellungen anzunähern, wurde eine Kombination aus zwei etablierten Methoden verwendet. Zum einen die Messung von Distortions-Produkt otoakustischen Emissionen (DPOAEs), welche auf Grund ihrer Generierung durch aktive Prozesse innerhalb der Kochlea die Möglichkeit bietet, Veränderungen im Innenohr festzustellen und zum anderen kontralaterale akustische Stimulation (KAS), welche eine erprobte Methode zur Aktivierung des efferenten Systems darstellt. Dadurch, dass die äußeren Haarsinneszellen in der Kochlea direkte synaptische Kontakte mit efferenten Fasern der absteigenden Hörbahn eingehen, kann eine Aktivierung des efferenten Systems Modulationen des kochleären Verstärkers bewirken, wodurch sich wiederum die Antworteigenschaften der Kochlea verändern. Mit einer Kombination dieser beiden Methoden lassen sich demnach zum einen höhere Zentren der Hörbahn aktivieren, die über efferente Fasern einen direkten Einfluss auf das Innenohr nehmen, zum anderen die induzierten Modulationen in Form von DPOAEs mit Hilfe eines sensitiven Mikrofons aufnehmen. Die Grundvoraussetzung für die Funktionalität dieser Methodenkombination ist das Vorhandensein von efferenten Fasern innerhalb der Kochlea. Da das efferente System verschiedener Säuger eine große Diversität aufweist, wurden innerhalb dieser Arbeit zusätzlich zu den akustischen Untersuchungen histologische Schnittserien der Kochlea von C. perspicillata angefertigt. Hierbei lag das Hauptaugenmerk auf dem Verlauf der efferenten Fasern innerhalb der Kochlea. Mit Hilfe der Thiocholinmethode wurde der Ort der Umsetzung des Achetylcholinabbauenden Enzyms Achetylcholin-esterase angefärbt. Achetylcholin ist der vorranig vorkommende Transmitter an den efferenten Synapsen.
Diese Studie untersucht weiter den Einfluss der Narkose auf das Innenohr. In zahlreichen Studien, die Innenohrmechanik betreffend, wurden die Untersuchungen an narkotisierten Tieren durchgeführt. Oftmals wird zwar die Problematik der möglichen Beeinflussung des Innenohres durch das verwendete Narkosemittel diskutiert, aber meisthin als unumgänglich eingestuft. Innerhalb der vorliegenden Studie wurde ein Großteil der Experimente an narkotisierten und auch wachen Tieren durchgeführt, um die Auswirkungen der häufig verwendeten Ketamin-Xylazin-Narkose auf die Innenohr-aktivität zu verdeutlichen.
In der Literatur lässt sich eine Vielzahl von akustischen Untersuchungen finden, in denen artifizielle Stimuli wie Reintöne oder Rauschen verwendet werden. Die Problematik dahinter ergibt sich daraus, dass diese Art der Töne in der Natur selten zu finden sind. Derartige Studien werfen daher die Frage auf, ob das Innenohr beispielsweise Rauschstimuli auf die gleiche Weise verarbeitet wie natürliche, komplexere Stimuli. Innerhalb der vorliegenden Studie wurden demzufolge im Vergleich zu artifiziellen Stimuli arteigene Rufe der Fledermausspezies C. perspicillata aufgenommen und als akustische Stimuli während der Messungen verwendet.
Im Zuge dieser Fragestellung wurde in einem weiteren Teilprojekt versucht ein neues Verfahren zur Messung von OAEs zu etablieren, mit dem es möglich ist das Ohr nicht ausschließlich mit den herkömmlich verwendeten Reintönen zu stimulieren, sondern ebenfalls mit komplexen Lauten, wie arteigenen Kommunikations- und Echo-ortungsrufen. Hierfür wurde ein von Douglas Keefe vorgestelltes Paradigma zur Messung von OAE-Residualen herangezogen, welches die am Trommelfell gemessenen akustischen Signale von den Trommelfellantworten auf einzelne Komponenten dieser Signale subtrahiert.
Anhand der in dieser Studie gewonnenen Ergebnisse kann deutlich gezeigt werden, dass eine akustische Stimulation der kontralateralen Kochlea mit verschiedenen artifiziellen sowie arteigenen Stimuli zuverlässig eine Änderung des Pegels der 2f1-f2 DPOAE von bis zu 37,3 dB in der ipsilateralen Kochlea bei wachen Tieren bewirkt. Dabei unterscheidet sich die Art der Beeinflussung deutlich je nach verwendetem kontralateralem Stimulus. Die Stimulation mit artifiziellem Breitbandrauschen supprimiert den Emissionspegel über den gesamten getesteten Frequenzbereich um etwa 11,6 dB, während die verwendeten arteigenen Laute eine vergleichbare Beeinflussung des DPOAE-Pegels ausschließlich in einem Frequenzbereich zwischen 50 und 70 kHz bewirken. Im Frequenzbereich von 20 bis 30 kHz verursachen die arteigenen Laute nahezu keine Pegelabsenkung, was im deutlichen Kontrast zu den Ergebnissen unter KAS mit Breitbandrauschen steht. Unter Narkoseeinfluss konnte, unabhängig vom verwendeten Stimulus, keine Beeinflussung des DPOAE-Pegels festgestellt werden, was die Annahme bestätigt, dass die verwendete Ketamin-Xylazin-Narkose einen drastischen Einfluss auf den Hörprozess und insbesondere auf das efferente System nimmt. Die Ursache dafür, dass arteigene Stimuli anders verarbeitet werden als artifizielle Stimuli (wie z. B. Breitbandrauschen) konnte zwar nicht abschließend geklärt werden, aber die Vermutung liegt nahe, dass in diesem Verarbeitungsprozess höhere Zentren der Hörbahn involviert sind und selektiven Einfluss auf die ablaufenden Prozesse nehmen.
Die Etablierung des OAE-Residual-Messparadigmas auf der Basis der Methode von Keefe und Ling (1998) sollte die Möglichkeit bieten sowohl Reintöne als auch komplexe, arteigene Stimuli zu verwenden und so eine Erweiterung des herkömmlich verwendeten Messverfahrens darstellen. Über verschiedene Vorversuche unter Anwendung einer Zweitonreizung konnte gezeigt werden, dass die Ergebnisse des neu entwickelten Paradigmas mit denen der herkömmlichen DPOAE-Messungen hinsichtlich Reintonstimuli vergleichbar sind. Anhand der gewonnenen Ergebnisse mit einer Stimulation mit komplexen Signalen zeigen sich allerdings die Schwierigkeiten der neuen Methode. Die bisher erhobenen Daten zeigen keine klaren, reproduzierbare Ergebnisse, sollten aber die Grundbedingungen für die weiterführenden Versuche ebnen.
Invasive non-native species are key components of human-induced global environmen-tal change and lead to a loss of biodiversity, alterations of species interactions and changes of ecosystem services. Freshwater ecosystems in particular are strongly affect-ed by biological invasions, since they are spatially restricted environments and often already heavily impacted by anthropogenic activities. Recent human-induced species invasions are often characterized by long-distance dispersal, with many species having extended their native distribution range within a very short time frame. However, a long term view into the past shows that biological invasions are common phenomena in nature—representing the arrival of a species into a location in which it did not originally evolve—as a result of climatic changes, geotectonic activity or other natural events. Once a species arrives in a new habitat, it may experience an array of novel selection pressures resulting from abiotic and biotic environmental factors and simultaneously act as a novel selective agent on the native fauna. Consequences of species invasions are manifold. My thesis, which combines seven studies on different aspects of biological invasions, aims to explore the influence of abiotic stressors and biotic interactions during species introductions and range expansions, as well as the consequences of biological invasions on evolutionary and ecosystem processes.
The first part of my thesis examines human-induced biological invasions, dealing with basic ecological characteristics of invaded ecosystems, novel predator-prey interactions, functional consequences of species invasions and certain behavioral traits that may contribute to the invasiveness of some species. The second part of my thesis examined distribution patterns and phenotypic trait divergence in species that historically invaded new geographical areas. I investigated variation of abiotic and biotic selection factors along a stream gradient as well as ecological and evolutionary consequences of species invasions to extreme habitats. The results highlight the importance of simultaneously considering processes involved in natural invasions and during human-induced invasions to understand the success of invading species.
We often lack detailed information on the impacts of historical biological inva-sions. Also, we are currently lacking crucial knowledge about the time scales during which different mechanisms (behavioral flexibility, plastic phenotypic changes, and ge-netic adaptation) play a role during biological invasions and affect species exchange and establishment. Comparative analyses of historical, natural invasion and recent (man-made) invasions can provide insights into the relative importance of the processes governing adaptation to abiotic stressors and selection resulting from biotic interactions. Beyond their negative effects, the establishment of invasive species and the subsequent range expansion represent “natural experiments” to investigate fundamental questions in ecology and evolution. My comparison of natural and human-induced biological invasions revealed that in many cases preadaptation to altered abiotic conditions plays a key role during early stages of invasions and range expansions. Considering the evolutionary history of invasive species and the evolutionary history of the recipient native fauna might therefore help predict the consequences of biological invasions for the ecosystem under consideration and the future success of the invading species. This knowledge can also be implemented when formulating conservation strategies, including methods to mitigate and manage human-induced biological invasions.
Rhythms, i.e. periodic sequences of events or states, are a ubiquitous feature of physiological systems such as the heart, the lungs or the brain. For the brain in particular, the diversity of rhythms is remarkable, ranging from low frequency rhythms in the slow/delta band (0.5-4 Hz) during sleep to gamma band oscillations (30-120 Hz) rhythms during alert behavior, all expressed in various brain areas and at various spatial scales. To understand whether these rhythms subserve a function for the organism it is important to also understand the underlying mechanisms that generate them. While the generation of some rhythms appear to be well-understood, e.g. sleep spindles, others such as the cortical beta rhythm (13-30 Hz) have remained elusive.
Understanding the generation of a brain rhythm involves multiple spatial scales, from identifying intracellular mechanisms such as the contribution of individual transmembrane currents to studying how specific neuronal populations or areas affect the full physiological rhythm present in the intact, highly interconnected brain. The aim of this work has been to delineate the mechanistic contributions of individual brain areas to the in vivo generation of two particular rhythms present in efferent areas: (1) The first part of this work studies the influence of thalamocortical neurons on cortical slow/delta waves (0.5-4 Hz) of sleep that are sometimes also present in awake animals. (2) The second part is about the contribution of primary visual cortex to the beta rhythm (13-30 Hz) in extrastriate cortex of awake behaving animals.
Embryonale Stammzellen (ESCs) sind ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung der frühen embryonalen Entwicklung. ESCs können mit Hilfe neuer Technologien zur Modifikation von Genen (z.B. mit dem CRISPR/Cas9 System) genetisch manipuliert werden. Daraus resultierende „knockout“ ES Zelllinien können helfen, die physiologische Rolle von Proteinen während der Differenzierung zu verstehen.
Transkriptionsfaktoren, die schnell und spezifisch Signalwege regulieren, spielen während der Embryonalentwicklung und während der Differenzierung von ESCs in vielen verschiedenen Zelltypen eine essentielle Rolle. Der Transkriptionsregulator „Far Upstream Binding Protein 1“ (FUBP1) ist ein Protein, welches eine ganz bestimmte einzelsträngige DNA Sequenz, das „Far Upstream Sequenz Element“, erkennt, bindet, und dadurch Gene wie z.B c-myc oder p21 reguliert. Mit der Entwicklung zweier Fubp1 Genfallen Mausstämme (Fubp1 GT) sollte die Frage nach der physiologischen Funktion von FUBP1 beantwortet werden. Die homozygoten FUBP1-defizienten GT Embryonen sterben im Mutterleib ungefähr am Tag E15.5 der Embryonalentwicklung. Sie sind kleiner als Wildtypembryonen und zeigen ein anämisches Aussehen. Daher wurden diese Mausmodelle hinsichtlich der Hämatopoese untersucht, die zu diesem Zeitpunkt vor allem in der Leber stattfindet. Es konnte eine signifikante Reduktion der hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) festgestellt werden und zusätzlich war die langfristige Repopulation der FUBP1-/--Stammzellen im Knochenmark in Transplantationsexperimenten reduziert.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von FUBP1 in einem weiteren Stammzellsystem analysiert und gleichzeitig seine Bedeutung in anderen Zelltypen der frühen Embryonalentwicklung untersucht.
Die Quantifizierung der FUBP1 Expression in den ESCs und während der Differenzierung zu sogenannten `embryoid bodies` (EBs) zeigten eine starke Expression auf mRNA- und auf Proteinebene. Nach der erfolgreichen Optimierung der Differenzierung von murinen ESCs wurden Fubp1 „knockout“ (KO) ESC Klone mit Hilfe der CRISPR/Cas9 Technologie etabliert. Die molekularbiologische Analyse der ESCs zeigte eine signifikante Erhöhung der Oct4 mRNA-Expression, während Nanog und die Differenzierungsmarker Brachyury, Nestin und Sox17 unverändert und in vergleichbarer Menge zu den Kontrollen vorhanden waren. Während der Differenzierung der Fubp1 KO Klone zu EBs zeigte sich eine signifikante Reduktion mesodermaler Marker wie Flk-1, SnaiI, Snai2, Bmp4 und FgfR2. Mit Hilfe durchflusszytometrischer Analysen bestätigte sich die verzögerte Bildung mesodermaler Zellen (Brachyury- und Flk-1-exprimierender Zellen) in den Fubp1 KO Klonen der EBs an den Tagen 3, 4 und 5 nach Beginn der Differenzierung.
Die Anwendung einer Ko-Kultivierung auf OP9 Zellen zur Differenzierung der ESCs in hämatopoetische Linien sollte zeigen, ob der Fubp1 KO ESCs ein Defekt in der frühen Entwicklung hämatopoetischer Stammzellen zu beobachten ist. Erneut konnte am Tag 5 der ESC-Differenzierung in der OP9 Ko-Kultur eine signifikante Reduktion der mesodermalen (Flk-1+) Zellen festgestellt werden. Die weitere Differenzierung zu hämatopoetischen CD45+ Zellen zeigte jedoch keinen Unterschied im prozentualen Anteil CD45+ Zellen am Tag 12 der Differenzierung. Auch die gezielte Differenzierung zu erythroiden Zellen durch Zugabe des Zytokins EPO zum Medium zeigte keinen signifikanten Unterschied im Differenzierungsgrad der erythroiden Zellen zwischen Kontroll- und Fubp1 KO Klonen.
In weiteren Experimenten habe ich in dieser Arbeit die Expression von FUBP1 in WT Embryos an den Tagen E9.5 und E13.5 der Embryonalentwicklung untersucht. Hierbei zeigte sich in beiden Entwicklungsstadien eine immunhistochemische Anfärbung von FUBP1 in den meisten Zellen des Embryos. Die Annahme, dass die Abwesenheit von FUBP1 in der Embryonalentwicklung zu verstärkten apoptotischen Vorgängen führen könnte und gleichzeitig die massive Expansion von Zellen gestört sein könnte wurde mit Hilfe immunhistochemischer Färbung von „cleaved Caspase 3“ (Apoptosemarker) und „Ki-67“ (Proliferationsmarker) in den homozygoten Fubp1 GT Embryos an den Tagen E9.5 und E13.5 nicht bestätigt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die Regulation von Apoptose und Proliferation durch FUBP1 während der Embryonalentwicklung nicht die Hauptrolle von FUBP1 darstellt. Es zeigte sich jedoch, dass FUBP1 als Transkriptionsregulator wichtig für die mesodermale Differenzierung von ESCs ist. Zu beobachten war, dass es in den FUBP1-defizienten ESCs zu einer Verzögerung der mesodermalen Differenzierung kommt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass FUBP1 essenziell für die Selbsterneuerung von HSCs ist. Dies macht deutlich, dass FUBP1 neben der Proliferation und Apoptose ein breiteres Spektrum an Signalwegen reguliert, die für Stammzellen und deren Differenzierung von Bedeutung sind.
Die vorliegende Studie vermittelt einen epidemiologischen Überblick über das mit Haut- und Nagelläsionen assoziierte Pilzspektrum im Westen Panamas. Hierzu wurden Proben von vermutlich durch Pilzinfektionen verursachten Haut- sowie Nagelläsionen gesammelt und zum Anlegen von Kulturen verwendet. Die isolierten Pilze wurden basierend auf dem D-H-S System (Rieth), anhand morphologischer Merkmale, rDNA Sequenzdaten sowie phylogenetischen Analysen klassifiziert und mit Hilfe von Literaturdaten sowie physiologischen Eigenschaften als saprotrophe, opportunistische oder pathogene Organismen beurteilt. In Panama wurden 52 Proben von 51 Personen gesammelt, wobei das Material von 42 Haut- und Nagelläsionen der Füße, vier Läsionen der Fingernägel, zwei Chromomykosen, einer Tinea nigra und drei sonstigen Hautläsionen stammt. Bei 75 Prozent (n = 39) der Proben konnten Pilze kultiviert und insgesamt 201 Pilzstämme isoliert und subkultiviert werden. Hiervon wurden 50 Isolate (24,9 %) als Dermatophyten, 24 Stämme (11,9 %) als Hefen und 127 Isolate (63,2 %) als Schimmelpilze klassifiziert. Bei 19 Probanden (48,7 %) konnten Dermatophyten isoliert werden, wobei aus dem Probenmaterial von 12 Personen (63,2 %) ebenfalls andere Pilzarten nachgewiesen wurden. Von zwei Läsionen (5,1 %) wurden nur Hefen isoliert, wobei einmal eine Schwarze Hefe kultiviert wurde. In dem Material acht weiterer Proben (20,5 %) wurden Schimmelpilze und Hefestämme nachgewiesen und bei zehn Probanden (25,6 %) konnten aus dem Probenmaterial nur Schimmelpilze kultiviert werden. 172 Isolate wurden taxonomisch klassifiziert und 44 Arten aus 25 Gattungen, 17 Familien, 15 Ordnungen, sechs Klassen sowie den Abteilungen Ascomycota oder Basidiomycota zugeordnet. Die Ascomyceten stellen mit 164 Stämmen 40 verschiedener Arten aus 23 Gattungen, 15 Familien, 11 Ordnungen und vier Klassen die am häufigsten isolierte und vielfältigste Gruppe dar, während die Basidiomycota nur mit acht Isolaten vier verschiedener Arten zwei unterschiedlicher Gattungen, Familien, Ordnungen und Klassen nachgewiesen wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden in Panama die anthropophilen Dermatophyten Trichophyton rubrum und T. interdigitale dokumentiert, wobei T. rubrum die am häufigsten isolierte Art darstellt. Kultivierte Hefen waren Candida albicans, C. duobushaemulonii, C. tropicalis, Hortaea werneckii, Sporobolomyces sp., Trichosporon asahii, T. japonicum und T. montevideense. Die Schimmelpilze stellen die größte und ökologisch diverseste Organismengruppe der kultivierten Pilze dar. So wurden von den untersuchten Läsionen sowohl humanpathogene Erreger, als auch opportunistische Arten und rein saprotrophe Pilze sowie mehrere Vertreter wahrscheinlich bisher nicht wissenschaftlich beschriebener Arten bzw. Gattungen nachgewiesen. Aus dem Probenmaterial wurden die Pilze Acremonium collariferum, Aspergillus awamori, A. clavatus, A. flavus, A. giganteus, A. heteromorphus, A. niger, A. ochraceus, A. sclerotiorum, A. versicolor, Chaetomium globosum, Chrysosporium tuberculatum, Cladosporium sphaerospermum, C. tenuissimum, Curvularia geniculata, C. lunata, Fonsecaea pedrosoi, Fusarium oxysporum, F. solani, Lophotrichus bartlettii, Microascus cinereus, Neoscytalidium dimidiatum, Penicillium commune, Scolecobasidium sp., Scopulariopsis carbonaria, S. croci, Verticillium cf. epiphytum und Wardomycopsis litoralis isoliert. Zudem wurden vier Isolate von zwei vermutlich neuen Arten der Gattung Acremonium (Bionectriaceae, Hypocreales), zwei Stämme mit einer genetischen Affinität zu der Gattung Cryptendoxyla (Cephalothecaceae, Sordariales) und jeweils ein mit den Gattungen Fusicladium (Venturiaceae, Venturiales), Knufia (Trichomeriaceae, Chaetothyriales) bzw. Rhexothecium (Eremomycetaceae, Dothideomycetidae) assoziierter Stamm kultiviert. Im Rahmen dieser Studie wurden A. giganteus, C. tenuissimum, L. bartlettii, S. carbonaria, S. croci, V. epiphytum und W. litoralis erstmalig von Mykosen des Menschen dokumentiert und die in der Literatur als Verursacher sowie Besiedler von Haut- und Nagelläsionen beschriebenen Organismen A. clavatus, A. flavus, A. niger, A. ochraceus, C. tropicalis, C. globosum, C. sphaerospermum, C. lunata, F. oxysporum, M. cinereus, P. commune, T. asahii, T. japonicum und T. montevideense wurden das erste Mal in klinischem Probenmaterial aus Panama nachgewiesen. Die Arten A. awamori, A. heteromorphus, C. globosum, C. tenuissimum, L. bartlettii, M. cinereus, P. commune, S. croci, T. asahii, T. japonicum, T. montevideense, V. epiphytum, W. litoralis und die Gattung Scolecobasidium wurden zudem erstmalig für Panama dokumentiert. Die Isolation von W. litoralis ist ebenfalls der erste Nachweis dieses Pilzes außerhalb von Spanien und auf dem amerikanischen Kontinent. Die große Anzahl im Rahmen dieser Arbeit beschriebener, bisher für die Wissenschaft unbekannter bzw. nicht in Panama dokumentierter Pilzarten lässt auf eine große mykologische Biodiversität in Panama schließen und zeigt den Bedarf weiterer Forschung.
Mikroalgen wird aufgrund ihrer photoautotrophen Lebensweise, ihrer meist einfachen Anzucht und ihres schnellen Wachstums ein großes Potential als Produzenten verschiedener Stoffe, wie beispielsweise den Sekundärmetaboliten der Carotinoidbiosynthese, zugesprochen. Zur Produktion solcher Stoffe bedarf es der Aufklärung der in einem Biosyntheseweg operierenden Enzyme und ihrer zugehörigen Gene.
In dieser Arbeit sollte einerseits durch genetische Modifikation der Carotinoidbiosynthese der Fucoxanthingehalt erhöht und andererseits die Produktion von Astaxanthin in P. tricornutum erreicht werden. Bisher fehlen experimentelle Nachweise über die Funktion, Regulation und die limitierenden Eigenschaften daran beteiligter Gene und deren Enzyme. Um dem Ziel der Arbeit näher zu kommen, wurden zuerst potentiell an der Regulation der Carotinoidbiosynthese beteiligte Gene ausgewählt und deren Enzyme funktionell charakterisiert. Eines dieser Enzyme ist das Eingangsenzym der Carotinoidbiosynthese, die Phytoen-Synthase. Die entsprechend annotierte putative Sequenz (psy #Pt56881) wurde zur Analyse herangezogen. Nachdem im Rahmen dieser Arbeit über die Komplementation in einem dafür ausgerichteten E. coli Stamm der funktionelle Nachweis der Phytoen-Synthase erbracht werden konnte, wurde untersucht, ob die Phytoen-Synthase einer lichtabhängigen Expression unterliegt und somit die Carotinoidsynthese im WT von P. tricornutum limitiert. Durch die Inhibierung der Phytoen-Desaturase mittels Norflurazon konnte die verstärkte Akkumulation des Produktes der Phytoen-Synthase, Phytoen, bei einem Transfer der P. tricornutum-Kulturen von Schwach- in Starklicht gezeigt werden. Die Expression der Phytoen-Synthase von P. tricornutum wird demnach durch die Lichtbedingungen reguliert und limitiert auch die Carotinoidsynthese. Ein weiteres an der Carotinoidsynthese beteiligtes Enzym ist die Zeaxanthin-Epoxidase. Sie bietet zugleich eine Möglichkeit, an dieser Stelle die Carotinoidsynthese in Richtung Astaxanthinproduktion umzulenken. Für P. tricornutum sind drei potentielle Genkandidaten (zep1: #Pt45845; zep2: #Pt56488; zep3: #Pt56792) annotiert, welche ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit funktionell charakterisiert wurden. Der funktionelle Nachweis erfolgte dabei ebenfalls mittels eines Komplementationsansatzes in einem damit neu etablierten Expressionssystem mit npq2-Mutanten aus der Modellpflanze A. thaliana. Die Analyse der Transformanden zeigte eine Epoxidase-Aktivität des Produktes aus zep2 und zep3. Das Enzym Zeaxanthin-Epoxidase 2 weist dabei eine andere Spezifität auf als die Zeaxanthin-Epoxidase 3, welche funktionell betrachtet der Zeaxanthin-Epoxidase aus A. thaliana am nächsten kommt. Die Zeaxanthin-Epoxidase 2 akzeptiert im Unterschied zu Zeaxanthin-Epoxidase 3 neben Zeaxanthin auch andere Substrate wie Lutein mit nur einem 3 Hydroxy-β-Iononring und stellt damit einen validen Kandidaten für die Umwandlung von Diatoxanthin in Diadinoxanthin in P. tricornutum dar. Obwohl die Transkriptanalysen ausreichende Mengen an RNA von zep1 in A. thaliana zeigen und anhand eines zusätzlichen mit der Sequenz für GFP markierten zep1-Konstruktes in WT-Protoplasten von A. thaliana der Import in den Chloroplasten und die Expression nachgewiesen werden konnte, weist die Zeaxanthin-Epoxidase 1 zumindest in den A. thaliana-Transformanden keine Epoxidase-Aktivität auf. Des Weiteren zeigt die diurnale Expression in P. tricornutum, dass die Regulation der Zeaxanthin-Epoxidasen an den Bedarf photoprotektiver Pigmente angepasst wird. Während die Regulation des Transkript-Levels von zep2 und zep3 nahezu parallel laufen und ein gemeinsames Maximum aufweisen, zeigt das Transkript-Level von zep1 ein anderes Maximum.
Die gewonnenen Erkenntnisse wurden dann zur Steigerung der Synthesekapazität mittels genetischer Modifikation des Carotinoidsyntheseweges in P. tricornutum angewendet. Durch das Einbringen zusätzlicher Genkopien der Phytoen-Synthase in P. tricornutum konnte dabei eine deutliche Steigerung des Fucoxanthingehalts unter Schwachlichtbedingungen erreicht werden. Gleichzeitig konnte durch weitere inhibitorische Versuche mittels Norflurazon beim Transfer von Schwach- zu Starklicht demonstriert werden, dass die Carotinoidsynthese durch die Kombination der genetischen Modifikation mit der Phytoen-Synthase und Starklicht per se weiterhin gesteigert werden kann. Zusammen mit den Transkriptanalysen zeigen die Pigmentanalysen, dass es einen nicht-linearen Zusammenhang zwischen RNA-Menge und gebildeter Phytoenmenge gibt, welcher durch eine zusätzliche Substratlimitierung der Phytoen-Synthase erklärt werden kann.
Bevor das Herunterregulieren der Zeaxanthin-Epoxidasen in P. tricornutum durchgeführt und damit ein verstärkter Fluss zur Astaxanthinbildung erreicht werden sollte, wurde das Potential von P. tricornutum zur Astaxanthinproduktion überprüft. Hierfür wurde die β-Carotin-Ketolase (bkt #CrAEA35045.1) aus C. reinhardtii einmal ohne und zusätzlich mit verschiedenen Präsequenzen fusioniert separat in P. tricornutum eingebracht. Astaxanthin konnte trotz Nutzung funktionell bestätigter Präsequenzen aus der Literatur nicht nachgewiesen werden. Die Versuche zeigen damit, dass hier noch weitere Untersuchungen nötig sind, um mittels eines geeigneten Transportsystems Fremd-Proteine in den Chloroplasten von P. tricornutum einzubringen. Das Ausbleiben der Astaxanthinproduktion konnte an dieser Stelle nicht hinreichend geklärt werden.
Insgesamt schaffen die Ergebnisse dieser Arbeit eine weitere Grundlage, um die Carotinoidbiosynthese in P. tricornutum besser zu verstehen und diese mittels genetischer Modifikationen biotechnologisch nutzbar zu machen.
This thesis primarily covers a systematic assessment of quantum chemical methods to predict accurate 19F NMR shifts for fluoroarenes and magnetic exchange coupling constant (J) in organic spin dimers which are basic building blocks for rational designing of organic magnetic materials.
One of the most important goals in chemistry is to design and synthesize molecules with optimum properties. This thesis is divided into two parts: the first part comprises of a systematic effort to find an inexpensive quantum chemical method to predict accurate 19F NMR chemical shifts (within an accuracy of 2 ppm) for perfluoraromatics. Essentially, these strenuous efforts have been devoted to find best DFT functional and basis set combination to predict accurate 19F shifts. In addition,the influence of geometrical parameters, solvents, chemical environment was also analyzed. Various correction approaches were tested to correct the calculated shifts. The influence of various functionals and basis sets was also analyzed on the correction efficiency of an individual scheme. All the NMR calculation methods already being used and correction approaches were verified to predict shifts of three different fluorine-substituted molecular sets. These structure sets include fluorobenzenes, substituted benzenes and fluorine substituted aromatic fused rings (e.g. fluorine substituted anthracene).
In the second part of this thesis, we investigated the accurate prediction of magnetic exchange couplings (J) for organic spin dimers using quantum chemical methods. We analyzed the performance of various DFT methods and various post-HF methods, such as the CASSCF, CASPT2, MSTDISD, DDCI1, DDCI2, DDCI3, and FCI to predict magnetic exchange couplings (J).
Overview of the Chapters:
Chapter 1, presents a brief theoretical introduction to the Schrödinger equation and its application in quantum mechanical calculations, the Hartree-Fock approximation, basis sets, electron correlation energy, and density functional theory (using pure and hybrid functionals).
In chapters 2 and 3, an introduction is given for quantum chemical approaches used to calculate NMR parameters and magnetic exchange coupling constants. We discuss an effective spin Hamiltonian, the Breit-Pauli Hamiltonian (BPH), chemical shielding tensor and total energy relationship, measuring of the NMR spectra, and different techniques to deal with gauge origin problem. In addition, the theoretical background of magnetic exchange coupling constant calculation for spin dimers, the Heisenberg-Dirac-van-Vleck Hamiltonian (HDVV) and the Noodelman's broken-symmetry approach for calculating J values are briefly discussed.
Chapter 4, presents a benchmark study of various DFT functionals and basis sets to calculate accurate C-F bond lengths and 19F chemical shifts. High-resolution NMR spectral data of complex molecules are often difficult to interpret. Great scientific efforts have been devoted to search for a computational approach to interpret experimental NMR data. Quantum chemical methods such as the CCSD(T) method offer high accuracy in calculation of NMR parameters but being computationally too demanding they cannot be applied to large chemical systems. On the other hand, density functional theory (DFT) is achieving a steady progress among diversity of computational techniques. An accuracy within 2 ppm deviation from the experimental values in 19F chemical shifts can be achieved if the NMR calculation is performed using accurate equilibrium geometries, GIAO is used to tackle gauge origin problem and electron correlation is properly treated by employing a high level of theory (e.g. CCSD (T)/cc-pVQZ). We found that the calculation of 19F shielding tensors with the density-functional theory does not provide any noticeable improvement over the HF method. Post-HF theory demands too much computational resources that makes them impossible to use for large systems [35] .
We found that a quantitative prediction of NMR shifts can be made as the errors introduced by theoretical methods are cancelled out while calculating shifts. Various benchmark studies in this thesis show that 19F chemical shifts calculated for perfluoraromatics with the M06-L, BHandH, BHandHLYP in combination with the 6-311+G (2d,p) basis set are within 4 ppm deviation from the experiments. Furthermore, we noted that NMR calculations on accurate
C-F (e.g. PBE/6-311G (d, p)) bond lengths does not show any improvement if the NMR calculation and optimization are performed at the same level of theory. A significant improvement can be achieved on calculated 19F NMR shifts, if some correction schemes are used.
In chapter 4 we discuss various correction schemes applied to correct the calculated 19F chemical shifts. A multi-standard approach (MSTD) was used to minimize the error that may occur due to the difference in the nature of the reference compound and test molecules [122]. We propose another approach to correct shielding constants which is the reference corrected approach. This approach makes a correction similar to the MSTD. We also tested a Linear Regression Correction Approach and we noted that this is the best approach amongst all. This is found to be less dependent on the theoretical method. We use conformation averaging corrections to correct the calculated shifts[126].
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In der vorliegenden Arbeit werden funktionale Details der Okklusion während der Mastikation bei ausgewählten fossilen und rezenten Primaten quantitativ vergleichend untersucht. Dazu wurden die Okklusionsflächen von antagonistischen Molarenpaaren mit modernen virtuellen Verfahren eingescannt und anhand von 3D Kronenmodellen kartiert und funktional ausgewertet. Die in der Forschergruppe DFG FOR 771 entwickelte Software „Occlusal Fingerprint Analyser“ (OFA) kam erstmals bei einer großen Stichprobe von Primaten zum Einsatz.
Aus dem ursprünglichen tribosphenischen Molarentyp der frühen eozänen Primaten haben einige Nahrungsspezialisten im Laufe der Evolution Modifikationen entwickelt um ihre Nahrung mechanisch besser aufzubereiten. So sind neue Funktionselemente auf den Molaren entstanden, wie z.B. ein distolingualer Höcker (Hypoconus) auf den Oberkiefermolaren.
Die Auswertung der Parametermessungen, wie die Facettenlage und -größe, der Okklusale Kompass, der Mastikationskompass und die Messungen der Okklusionsreliefs ergaben, dass die basalen Primatenvertreter aus dem Eozän einen flachen Hypoconus als vergrößerte Fläche zum Quetschen der Nahrung genutzt haben. Das weist auf eine frugivore Nahrungspräferenz hin. Der distolinguale Höcker ist unter den rezenten Spezies mit insektivorer Nahrungspräferenz besonders häufig ausgebildet. Es konnte gezeigt werden, dass eine zweite Kauphase, die nach der maximalen Verzahnung mit der Öffnung des Kiefers eintritt, unter den rezenten Strepsirrhini mit Hypoconus nur sehr schwach ausgeprägt ist.
Eine weitere evolutionäre Modifikation sind buccolingual ausgerichtete komplementäre Kantenpaare auf den Molaren, die sogenannte Bilophodontie, die sich in der Familie der Cercopithecidae entwickelt hat. Die Unterfamilie der Colobinae zeigt eine besonders stark reliefgeführte Okklusion und hat deshalb während der Mastikation weniger Bewegungsspielraum als die der Cercopithecinae. Die zweite Kauphase der Cercopithecinae ist gegenüber den folivoren Colobinae zum Teil auffällig verlängert. Da die Colobinae Vormagenverdauer und die Cercopithecinae Monogastrier sind, kann vermutet werden, dass die Zahnmorphologie eng mit der entsprechenden chemischen Verdauungsweise verknüpft ist. Das dryopithecine Höckermuster der Hominoidea hat eine wesentlich flachere Höckermorphologie als die bilophodonten Molaren. Daher war ein höherer Bewegungsspielraum während der Mastikation beobachtbar. Es konnte gezeigt werden, dass steilere Facetten bei den folivoren Nahrungsspezialisten zu finden sind, wie den Colobinae bei den bilophodonten, oder den Gorillas unter dem dryopithecinen Molarentyp. Mit einem flacheren Molarenrelief kann auf ein breiteres Nahrungsspektrum zugegriffen werden.
Mit den OFA-Analysen und den Ergebnissen der Quantifizierung des Kronenreliefs von rezenten und fossilen Primatenzähnen konnte in der vorliegenden Untersuchung eine relevante Vergleichsbasis für ein funktionelles Verständnis der Evolution der vielfältigen Kronenformen bei Primaten erarbeitet werden. Für zukünftige Studien sollte die innerartliche Stichprobe erweitert werden um die Variabilität näher zu untersuchen.
Ischemic injuries of the cardiovascular system are still the leading cause of death worldwide. They are often accompanied by loss of cardiomyocytes (CM) and their replacement by non-functional heart tissue. Cardiac fibroblasts (CF) play a major role in the recovery after ischemic injury and in the scar formation. In the last few years researchers were able to reprogram fibroblasts into CM in vitro and in murine models of myocardial infarction using various protocols including a cocktail of microRNAs (miRs). These miRs can target hundreds of messenger RNAs and inhibit their translation into proteins, potentially regulating multiple cellular signaling pathways. Because of this, there has been a rising interest in the use of miRs for therapeutic purposes. However, as different miRs have different effects in different cells, there is the danger of causing serious side effects. These could be alleviated by enacting a cell-specific transport of miRs, for example by using aptamers. Aptamers are usually short strands of DNA or RNA, which can fold into a specific three-dimensional confirmation which allows them to bind specifically to target molecules. Aptamers are commonly selected from a large library for their ability to bind to target molecules using a procedure called SELEX. Aptamers have already been used to transport miRs into cancer cells.
In this thesis, we first established the transport of miRs into cells of the cardiovascular system using aptamers. MiR-126 is an important part of the signaling in endothelial cells (EC), protects from atherosclerosis and supports angiogenesis, which is why we chose it as a candidate to transport into the vasculature. We first tested two aptamers for their ability to internalize into EC and fibroblasts. Both the aptamer for the ubiquitously expressed transferrin receptor (TRA) and a general internalizing RNA motif, but not a control construct, could internalize efficiently into all cell types tested. We then designed three chimeras (Ch) using different strategies to connect TRA to miR-126. While all chimeras could internalize efficiently, only Ch3, which connects TRA to Pre-miR-126 using a sticky bridge structure, had functional effects in EC. Ch3 reduced the protein expression of VCAM-1 in EC and increased the VEGF induced sprouting of EC in a spheroid-sprouting assay. Treatment of breast cancer cells with Ch3 emulated the effects of treatment with classical miR-126-3p and miR-126-5p mimics. In the SK-BR3 cell line Ch3 and miR-126-3p reduce the viability of the cells while they reduce recruitment of EC by the MCF7 cell line. miR-126-5p had no apparent effect in the SK-BR3 line, but increased viability of MCF7 cells, as did Ch3. This implies that Ch3 can be processed to both functional miR-126-3p and miR-126-5p in treated cells.
We were unable to achieve a reprogramming of adult murine cardiac fibroblasts into cells resembling CM using the cocktail of 4 miRs. This indicates that the miR-mediated transdifferentiation is only possible in neonatal fibroblasts. The effects in mice after an AMI might possibly be caused by an enhanced plasticity of fibroblasts in and close to the infarcted area.
We also screened to find aptamers specifically binding to cells of the cardiovascular system. We used two oligonucleotide libraries in a cell-SELEX to select candidates which bind to CF, but not EC. We observed that only the library which contains two randomized regions of 26 bases showed an enrichment of species binding to fibroblasts. We then sequenced rounds 5-7 of the SELEX and analyzed the data bioinfomatically to select 10 candidate aptamers. All candidates showed a strong binding not only to CF, but also EC. This indicates that the selection pressure against species binding to EC was not high enough and would have to be increased to find true CF-aptamers. Four promising candidates were also analyzed for their potential to be internalized and we surprisingly found that all of them were internalized by EC and CF more efficiently than TRA. The similar behavior of the candidates implies that they possibly share a ligand, which is expressed both by EC and CF, but more prominently by the latter.
This work demonstrates the possibility of using aptamers to transport miRs into cells of the cardiovascular system. It also shows that it is possible to select aptamers for non-cancerous mammalian cells, which has not been done before. It is reasonable to assume that a refinement of the cell-SELEX will allow selection of cell-specific aptamers. Due to the failure of reprogramming of adult fibroblasts into induced cardiomyocytes we were unable to test whether a miR-mediated reprogramming might be inducible using aptamer transported-miRs. Ultimately, aptamer mediated transport of miRs is a feasible and promising therapeutic option for the treatment of cardiovascular diseases and other disorders like cancer.
Panama, a small country between the major continents of North and South America, is one of the lesser studied regions in Central America, but is recognized for its mega-biodiversity. This is particularly true for Eastern Panama, which I am considering as the easternmost portion of the country, covering the area from the Chepo, which is also the beginning of the San Blas mountain range, towards east, up to the Darien Mountain range on the border with its neighboring country Colombia. In the lowland region I visited two physiographic areas: the Isthmian-Atlantic Moist Forests (IAMF) and the Chocó-Darién Moist Forests (CDMF). In the IAMF I worked at the localities of Río Mono, Wacuco, La Moneda, Arretí, Metetí, Filo del Tallo, and Laguna de Matusagaratí. In the CDMF I visited the localities of Cruce de Mono, Cana, Garachiné, Sambú, and Pavarandó. And I have worked in the highlands of Darién (DM), Majé (MM), Jingurudó-Sapo (JSM), Pirre (PM) and San Blas (SSM) in the highlands.
Before my research, 138 reptile and 104 amphibian species had been reported for EP. From 2008 to 2013, I collected specimens to evaluate the diversity of amphibians and reptiles for this region. I applied an integrative approach to evaluate the taxonomy, diversity, biogeography, and conservation of the herpetofauna of EP. I included analyses of morphometrics, molecular genetics (e.g. barcoding), biogeography, bioacoustics (in anurans), hemipenial morphology (in squamates), and ecology. This is the first regional evaluation of the biodiversity in EP applying integrative taxonomy. Aside from morphological and bioacoustic data, my work is based on the barcoding of 608 specimens, from which I obtained 16S mtDNA for 486 specimens and COI mtDNA for 455. In total I have got sequences for 69.2 %of the amphibian and 48.6 % of the reptile species present in EP. For the morphological analyses, I compared 1597 specimens, including my samples complemented by specimens obtained from various museums. The bioacoustic data were obtained from the analysis of 1504 calls of 27 species of frogs. Based on specimens collected in EP and according to external morphology, I could identify 65 species of amphibians and 72 reptiles, but after applying an integrative approach these numbers increased to 79 amphibians and 88 reptiles described species within my collected specimens. Additionally, I uncovered 33 taxonomic units that could not be assigned to any described species until now, 22 of them represent confirmed candidate species (CCS), and 11 were classified as Unconfirmed candidate species (UCS). Thus, increasing the known species of amphibian by 19.4 % and of reptiles by 4.8 %. Currently, there are 145 reptiles and 129 amphibians known to occur in EP. Based on my results, I have initiated several projects to solve taxonomic uncertanties, including the species of the genera Bolitoglossa, Diasporus, Dactyloa, Ecnomiohyla, Lepidoblepharis, and the taxonomic status of the species Pristimantis caryophyllaceus and Norops tropidogaster.
Out of the 22 CCS I found, I described nine species new to science with type locality in EP, six amphibians and four reptiles. Among these is a new species of Bolitoglossa described from Cerro Chucantí, Cordillera de Majé, Provincia de Darién, Panama. Additionally, I include comments on the other species of congeneric salamanders known to occur in the region. Among the tink frogs, only Diasporus quidditus was known to occur in EP. During my field work I collected six additional species of this genus, four of which are new to science, plus two species new for this region.
I also described one new species of Dactyloa (giant anole lizards) related to the former D. chocorum. I synonymized D. chocorum with D. purpurescens, and included information about the other species of the group from EP. The new species of Dactyloa resembles D. ibanezi, D. limon, and D. purpurescens in external morphology but differs from these species in dewlap coloration, dorsal color pattern, morphometrics, and scalation. I discovered one species of the genus Ecnomiohyla, which exhibits significant genetic distances (16S mtDNA gene) and morphological differences to all known Ecnomiohyla species. Along with the description of the new Ecnomiohyla species, I provide detailed comparisons of morphological and molecular characters of almost all members of the genus in Lower Central America, as well as an identification key for the entire genus. Two new species of the genus Lepidoblepharis from EP were described. In the corresponding work, I include an analysis of Lepidoblepharis spp. in the region, including phylogeography and taxonomy. One of the new species, Lepidoblepharis emberawoundule, can be differentiated from most species in the genus by its small size and its low number of lamellae under the fourth toe and finger. The other species described from EP, Lepidoblepharis rufigularis, can be differentiated from all species in the genus by its small size and the reddish throat in males.
The baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae is a valuable and increasingly important microorganism for industrial applications (Hong and Nielsen, 2012). Its robustness concerning process conditions like low pH, osmotic and mechanical stress as well as toxic compounds is an advantage. Moreover, S. cerevisiae is ‘generally regarded as safe’ (GRAS). The model organism has been studied intensively. The collected data, including genomic, proteomic and metabolic information, can be used to genetically modify and improve its metabolism. Fatty acids and fatty acid derivatives have wide applications as biofuels, biomaterials, and other biochemicals. Several studies have been dealing with the overproduction of fatty acids and derivatives thereof in S. cerevisiae. The fatty acid biosynthesis starting with acetyl-CoA requires two enzymes, the acetyl-CoA carboxylase (Acc1p) and the fatty acid synthase complex (FAS), to produce acyl-CoA esters with predominantly 16 to 18 carbon atoms chain length (Lynen et al., 1980). For the synthesis of monounsaturated fatty acids in S. cerevisiae the ER bound acyl-CoA desaturase, Ole1p is essential (Tamura et al., 1976; Certik and Shimizu, 1999).
Using S. cerevisiae, the first section of this work dealt with the heterologous characterization of potential ω1-desaturases. Due to the fact that unsaturated fatty compounds can be modified further by hydrosilylations, hydrovinylations, oxidations to epoxides, acids, aldehydes, ketones or metathesis reactions, the interest in ω1-fatty acids is tremendous (Behr and Gomes, 2010). With the intention to find enzymes in fungi, that have a terminal desaturase activity a search in different genome databases was performed. The sequences of Pex-Desat3 and Obr-TerDes were used as reference sequences. The analysed proteins from Schizophyllum commune (EFI94599.1), Schizosaccharomyces octosporus (EPX72095.1), Wallemia mellicola (EIM20316.1), Wallemia ichthyophaga (EOR00207.1) and Agaricus bisporus var. bisporus (EKV44635.1), however, finally turned out to be Δ9 desaturases. A fungal desaturase with ω1-activity could not be found. The Δ9 desaturase SCD1 from Mus musculus was crystallized by Bai et al. (2015) and the information for specific amino acids responsible for the substrate specificity or enzyme activity were allocated. In combination with sequence and enzyme activity data form ChDes1 from Calanus hyperboreus, Desat2 from Drosophila melanogaster, Pex-Desat3 from Planotortrix excessana and Obr-TerDes from Operophtera brumata single amino acid exchanges were performed in the Δ9 desaturase Ole1p from S. cerevisiae. For all mutants, only fatty acids (C16 - C18) with a double bond between carbon C9 and C10 could be found. This indicates, that all inserted amino acid exchanges do not affect the substrate specificity or the position of the introduced double bond.
In the second section the focus was in the development of a production system for fatty acids in S. cerevisiae with regard to the previously established procedures by metabolic engineering. The combination of cytosolic malate dehydrogenase (MDH3), cytosolic malate enzyme (MAE1) and a citrate- α-ketoglutarate- carrier (YHM2) should improve the availability of acetyl-CoA in the cytosol, which is an important precursor for the fatty acid biosynthesis. If the major pathway (acetyl-CoA carboxylase and fatty acid synthase) was already optimized by high expression levels than no positive effect on increased fatty acid synthesis was detectable. Only non-optimized strains, with the additional overexpression of ATP-citrate lyase and cytosolic malate dehydrogenase, lead to a 41 % (20 mg/g dcw) improvement of fatty acid synthesis. In order to increase the fatty acid content further, the additional overexpression of DGA1 and TGL3 was performed. Hence, the highest amount of fatty acids could be observed with the strain S. cerevisiae WRY1ΔFAA1ΔFAA4 (2.5 g/L ± 0.8 g/L). The additional elimination of acyl-CoA synthetase Fat1p did not improve the yield.
It was recently reported, that chain length control of the fatty acid synthesis of bacterial FAS can be changed by rational engineering (Gajewski et al., 2017a). The knowledge about bacterial FAS was transferred in this work to S. cerevisiae FAS. Mutating up to five amino acids in the FAS complex enabled S. cerevisiae to produce medium chain fatty acids (C6 - C12). Further improvement was done by metabolic pathway engineering (promoter of alcohol dehydrogenase II from S. cerevisiae (pADH2), deletion of acyl-CoA synthetase FAA2) and optimization of fermentation conditions (YEPD-bacto medium buffered with potassium phosphate). The production of medium chain fatty acids resulted in the highest yield of 464 mg/L (C6 to C12 fatty acids). Furthermore, strains were created specifically overproducing hexanoic acid (158 mg/L) and octanoic acid (301 mg/L). The characterization of transferases, which could be responsible for the de-esterification of CoA-bound fatty acids, was analysed in an additional approach. It could be shown, that the genes EHT1, EEB1 and MGL2 have an influence on the MCFA yield in the supernatant. Generally speaking, the data from the single and double deletion strains suggest that Eeb1p has a selective hydrolytic activity for hexanoic acid-CoA ester, while Eht1p shows selective hydrolytic activity for octanoic acid-CoA ester, which is in line with Saerens et al. (2006).
Es wird davon ausgegangen, dass das ehemalige Larven-Mikrohabitat der Asiatische Tigermücke Aedes albopictus (synonym: Stegomyia albopicta) die Phytotelmata in den Waldgebieten von Südostasien darstellte. In den letzten vier Jahrzehnten adaptierte sich die Art jedoch an urbanere Regionen und ihre Antrotelmata. Dank ihrer Eigenschaft, Eier mit einer gewissen Trocken- und Kältetoleranz zu produzieren, verbreitete sich die Art zusammen mit den international gehandelten Waren weltweit. Zudem ist Ae. albopictus ein theoretischer Vektor für mindestens 27 Viren sowie Parasiten und spielt eine Hauptrolle bei der Übertragung von Dengue-Viren und Chikungunya-Viren und Zika-Vieren. Daher wird die Art als große Gefahr für die öffentliche Gesundheit betrachtet.
Die vorliegende Arbeit thematisiert drei Untersuchungen zum Anpassungs- und Etablierungs-potential der invasiven Asiatischen Tigermücke.
In einem ersten Ansatz wurde das Problem behandelt, dass es lediglich zwei standardisierte toxikologische Testverfahren für Culicidae gab. Daher wurde ein Dosis-Wirkungs-Testsystem entwickelt, das den Weg für weitere biologische Endpunkte und ihre integrativen Parameter freimachte und dadurch ein besseres Verständnis für die Wirkweisen von Insektiziden ermöglicht. Hierdurch konnte nun der Frage nachgegangen werden, ob es Unterschiede in der ökotoxikologischen Reaktion zwischen der invasiven tropisch-subtropischen Asiatischen Tigermücke und der einheimischen nördlichen Hausstechmücke Culex pipiens auf das Insektizid λ-Cyhalothrin gibt. Weiter wurde der Einfluss von Temperatur und die Verfügbarkeit von Nahrung auf die Insektizidsensitivitäten der Arten getestet. Schließlich konnte in einer Risikobewertung festgestellt werden, dass bei falsch angewendeten Bekämpfungsmaßnahmen höhere Temperaturen sowie der Ausfall von aquatischen Top-Prädatoren zu Fitnessvorteilen für die Art führen können.
In einer zweiten Untersuchung wurde der Mechanismus der Kältetoleranz der Eier (Kälteakklimatisierung und Diapause) näher untersucht, da dieser für die erfolgreiche Invasion in gemäßigten Breitengraden verantwortlich gemacht wird. Nachdem eine lang vorherrschende Hypothese verworfen wurde, dass die Einlagerung von Polyolen die Frosttoleranz bewirken würde, war der aktuelle Stand der Wissenschaft, dass eine Verdickung der Wachsschicht des Chorions dafür verantwortlich sei. Jedoch lag keine detaillierte Evaluierung von Stechmücken-Eihüllen vor. Mittels einer transmissionselektronenmikroskopischen Studie konnte gezeigt werden, dass nicht nur die Wachsschicht nicht in der Serosa-Cuticula zu verorten ist, sondern im Endochorion und sie zudem im Zuge der Diapause in der Mächtigkeit schrumpft. Daher wird auf Basis der gewonnenen Erkenntnisse auf eine Kompaktierung der Schicht geschlossen.
Die dritte Untersuchung schließlich hatte das hohe Adaptationspotential in gemäßigten Breiten zum Gegenstand. Eine Adaptation auf genetischen Level gilt als unwahrscheinlich, da Gründerpopulationen in den neu besiedelten Gebieten eine niedrige genetische Diversität aufwiesen und ein regelmäßiger Neueintrag von Allelen unwahrscheinlich ist. Jedoch bietet das Konzept der epigenetischen Temperatur-Adaptation einen Erklärungsansatz für dieses Phänomen. Daher wurde die Frage gestellt, ob es möglich ist, eine vererbbare Diversifizierung dieses kältetoleranten Phänotyps nach einer randomisierten epigenetischen Behandlung der DNA zu detektieren. Es wurde eine transgenerationale Untersuchung der Effekte von zwei epigenetischen Agenzien (und einem Lösemittel) auf die Kältetoleranz der Eier durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten ein Korrelationsmuster, das den durch die Agenzien veränderten Methylierungsgrad der DNA mit der Forsttoleranz verband, was die gestellte Hypothese unterstützte.
In Folge dieser drei Untersuchungen wurde festgestellt, dass Ae. albopictus ein hohes Potential hat, in weiteren Ländern – vor allem in gemäßigten Breiten – ein Gesundheitsrisiko darzustellen. Da die Art einerseits Fitnessvorteile durch falsche Bekämpfungsmaßnahmen und andererseits möglicherweise eine hohes epigenetisches Adaptationspotential besitzt, kann zusammenfassend empfohlen werden, dass der Fokus für weitere Forschung maßgeblich auf der Entwicklung von Impfstoffen für die übertragenen Viren und Pathogene liegen sollte. Dadurch kann die Bevölkerung geschützt werden, ohne Ökosysteme und ihre Dienstleistungen zu gefährden, und dies wäre zudem ökonomisch gesehen die effektivere Lösung.
Heutzutage unterliegen insbesondere aquatische Ökosysteme durch den permanenten Anstieg nicht-heimischer Arten einem folgenreichen Wandel. Dabei stellt der Biodiversitätsverlust nur den Endpunkt einer biologischen Invasion dar. Dazwischen wirken sich Faktoren wie Konkurrenz-, Prädationsdruck oder die Übertragung von Krankheitserregern wie z.B. Parasiten auf den Rückgang der Arten aus. Als integraler Bestandteil eines jeden Ökosystems spielen Parasiten bei Invasionsprozessen eine entscheidende Rolle und können durch ihren Einfluss auf heimische und nicht-heimischen Arten Invasionen begünstigen. Fische übernehmen aufgrund ihrer vielseitigen Bedeutung im Nahrungsnetz eine Schlüsselfunktion als Wirte diverser Parasitenarten und sind deshalb ausgezeichnete Untersuchungsobjekte, um durch nicht-heimische Arten verursachte Veränderungen in Nahrungsnetzstrukturen oder Parasitenfaunen aquatischer Ökosysteme aufzudecken.
Vor diesem Hintergrund wurde die vorliegende kumulative Dissertation angefertigt, welche auf drei (ISI-) Einzelpublikationen basiert. Die Arbeit beschäftigte sich unter Verwendung morphologischer und molekularbiologischer Methoden schwerpunktmäßig mit der Parasitendiversität und Nahrungsökologie zweier eingeschleppter Fischarten in stark anthropogen beeinflussten deutschen Fließgewässern. Dabei handelte es sich um die hauptsächlich durch das Ballastwasser von Schiffen verbreitete invasive Schwarzmundgrundel Neogobius melanostomus aus den Flüssen Rhein und Main sowie den von Hobby-Aquarianern in den durch Industrieabwässer thermisch belasteten Gillbach ausgesetzten Zebrabuntbarsch Amatitlania nigrofasciata. Unter Berücksichtigung nahrungsökologischer und räumlich-zeitlicher Aspekte sollten die parasitologischen Risiken und Konsequenzen, welche durch das Einschleppen nicht-heimischer Fischarten auftreten, aufgezeigt werden, um übergeordnet die Folgenabschätzung auf dem Gebiet der Invasionsbiologie zu verbessern. Das Nahrungsspektrum beider Fischarten wies sowohl räumliche (zwischen den Flüssen und Standorten), als auch zeitliche (monatlich) Variationen auf, was die Anpassungsfähigkeit bzw. die optimale Nutzung zur Verfügung stehender Ressourcen von invasiven Arten verdeutlicht. Ebenso wurden Unterschiede in der Parasitierung nachgewiesen, was die Notwendigkeit räumlicher und zeitlicher Analysen zur Erfassung der vollständigen Parasitenfauna einer invasiven Art, inklusive aller Variationen der Befallszahlen, unterstreicht. Beide Fischarten bilden zudem Zwischenwirte für heimische, als auch nicht-heimische Parasitenarten, wobei die direkte Einschleppung von nicht-heimischen Parasiten aus dem ursprünglichen Verbreitungsgebiet der Fische auszuschießen ist und somit die Enemy-Release-Hypothese (Verlust ursprünglicher Gegenspieler wie Prädatoren oder Parasiten) unterstützt. Dies könnte zusammen mit der opportunistischen Ernährungsweise ein Grund für die starke Ausbreitung sowie die anhaltend hohen Individuenzahlen dieser Arten im jeweils betrachteten Verbreitungsgebiet (Rhein, Main sowie Gillbach) sein.
Besonders hervorzuheben ist der Nachweis der nicht-heimischen Nematoden Anguillicoloides crassus und Camallanus cotti. Durch die Aufdeckung einer besonderen Form von Hyperparasitismus konnten erstmalig hohe Befallszahlen von A. crassus in N. melanostomus dokumentiert werden. Die hoch abundante Grundelart gilt somit potentiell als entscheidender Überträger des invasiven Parasiten auf den Europäischen Aal. Der durch seine hohe Virulenz in der Aquaristik bekannte C. cotti gelangte durch das Aussetzen von Zierfischen in den Gillbach und trat mit hohen Befallszahlen in A. nigrofasciata auf und wird bereits auf die heimische Fischfauna übertragen (z.B. auf den Gründling Gobio gobio und den Döbel Squalius cephalus). Ebenso ist der starke Befall der heimischen Parasiten Pomphorhynchus sp. (Acanthocephala) und Raphidascaris acus (Nematoda) bei N. melanostomus sowie A. anguillae (Acanthocephala) bei A. nigrofasciata zu nennen. Durch die zusätzliche Wirtfunktion der Neozoen und die hohen Befallsintensitäten ist mit einem verstärkten Spillback-Effekt (Rückinfizierung) auf heimische Fischarten zu rechnen.
Die stetig steigende Anzahl biologischer Invasionen führt zu immer weitreichenderen Veränderungen heimischer Ökosysteme. Für den Erhalt der Biodiversität sowie einhergehender Ökosystemfunktionen rückt auch die Forschung über Neobiota immer mehr in den Mittelpunkt. In diesem Zusammenhang gewinnen auch Pathogene wie Parasiten immer mehr an Bedeutung, welche durch gebietsfremde Arten eingeschleppt werden und die bestehende Biodiversität gefährden können. Die Ergebnisse der durchgeführten Studien haben gezeigt, dass die Verknüpfung von parasitologischen und nahrungsökologischen Untersuchungen Einblicke in die hoch dynamischen Prozesse der Invasionsbiologie geben können, was ein Vorantreiben der Forschung und Folgenabschätzungen auf diesem Gebiet ermöglicht.
This thesis reports on the results obtained by expression photoactivatable adenylyl cyclase from Beggiatoa spp. (bPAC) in cholinergic neurons from Caenorhabditis elegans (C. elegans) and the characterization of the role of a single neuron, RIS, during locomotion in the adult animal.
Pharmacological activation of adenylyl cyclases through Forskolin is known to induce increased neuronal output in diverse model organisms through a protein kinase A (PKA) dependent mechanism. Nevertheless, pharmacological assays are not spatially restricted, do not allow for precise and acute activation nor to cessation of the signal. Thus, an optogenetic approach for was selected trough the expression of photoactivatable adenylyl cyclase from Beggiatoa spp. (bPAC) in cholinergic neurons of Caenorhabditis elegans (C. elegans). This model organism was chosen due to its transparency, ease of maintenance, fast generation cycles as well as for being an eutelic animal. Further, its genome has been fully sequenced and the connectome of the neuronal network is known, thus allowing for precise analysis of neuronal function. Furthermore, the molecular mechanisms governing neuronal functions are well conserved up to primates. Mainly two optogenetical tools were applied, bPAC and the light gated cation channel channelrhodopsin 2 (ChR2).
Behavioral assays of bPAC photostimulation in cholinergic neurons recapitulated previous work performed with the photoactivatable adenylyl cyclase from Euglena gracilis (EuPACa), in which swimming frequency and speed on solid substrate were increased. Electrophysiological recordings of body wall muscle (BWM) cells by Dr. Jana F. Liewald showed that bPAC photoactivation led to an increase in miniature postsynaptic current (mPSC) rate and, in contrast to ChR2 invoked depolarization, also amplitude. Analysis of mutants deficient in neuropeptidergic signaling (UNC- 31) via electrophysiology performed by Dr. Jana F. Liewald showed that the increase in mPSC amplitude due to bPAC photoactivation requires neuropeptide release. This was confirmed by co-expression of bPAC with the neuropeptide marker NLP-21::Venus and subsequent fluorescence analysis of release, exploiting the fact that released neuropeptides are ultimately degraded by scavenger cells (coelomocytes). These were enriched with NLP-21::Venus after bPAC photostimulation, but no fluorescence could be observed in the UNC-31 mutants.
Additional analysis of the electrophysiological data performed by myself showed no modulation of mPSC kinetics dues to neuropeptidergic release induced by bPAC. Hence, neuropeptide release and action sites were in the cholinergic neurons, the latter including cholinergic motoneurons.
Dr. Szi-chieh Yu provided electron microscopy images of high pressure frozen, bPAC or ChR2 expressing animals. These were tagged by myself for automatic analysis of ultrastructural properties of the cholinergic presynapse, also during photoactivation of both optogenetic tools. Photoactivation of both induced a reduction of synaptic vesicles, with ChR2 showing a more severe effect. In contrast to ChR2, though, bPAC also reduced the amount of dense core vesicles (DCV), the neuropeptide transporters. Additionally, long bPAC photoactivation as well as ChR2 photoactivation led to the appearance of large vesicles (LV), presumably in response to the increased SV fusion rate. bPAC photostimulation also induced an increase in SV size, not observed after ChR2 photostimulation. In UNC-31 mutants, bPAC photostimulation could not lead to the SV size increase, a further argument for the presynaptic effect of the released neuropeptide. Additional analysis of electrophysiology paired with pharmacology, performed by Dr. Jana F. Liewald, showed that mPSC amplitude increase requires the function of the vesicular acetylcholine transporter.
A further effect observed in the ultrastructure of bPAC photostimulated cholinergic presynapses was a shift in the distribution of SV regarding the dense projection. An analysis of cAMP pathway mutants showed that synapsin is required for bPAC induced behavior effects. Synapsin is known to mediate SV tethering to the cytoskeleton. Here, I show evidence for a new role of synapsin in controlling the availability of DCVs for fusion and thus, in neuropeptidergic signaling.
In the second part of my thesis I characterized the function of the GABAergic interneuron RIS in the neuronal network of C. elegans. RIS was shown to induce lethargus, a sleep-like state, during all larval molts, but its function in the adult animal was not yet described. Specific RIS expression of ChR2 achieved by a recombinase based system allowed to acutely depolarize the neuron during locomotion, which led to an acute behavioral stop. Diverse signal transduction pathway mutants were analyzed showing that the phenotype was induced by neuropeptidergic signaling. Through mutagenesis followed by whole genome sequencing data analysis as well as analysis of RIS specific RNA sequencing data further narrowed the signal transduction pathway to mediate the locomotion stop behavior. Since the neuropeptide and, to some extent, the neuron are conserved across nematodes, an argument is outlined in favor of the conservation of this sleep-like state.
In addition, since ChR2 could induce neuropeptidergic signaling from RIS, secretion of vesicles is regulated by variable pathways depending on the neuronal identity. Nevertheless, expression of bPAC in RIS allowed to optogenetically increase the probability of short stops, as observed by expression of a calcium sensor (GCaMP) in RIS and analysis of its intrinsic activity in the adult animal.
Die Etablierung der Festphasensynthese innerhalb der letzten Jahrzehnte macht hoch modifizierte Oligonukleotide verfügbar. Damit werden Methoden wie Einzelmolekül-aufgelöstes Tracking möglich, um beispielsweise den Weg einer einzelnen RNA von der Transkriptionsstelle im Nukleus bis zur Proteinbiosynthese im Cytoplasma verfolgen und kritische Stelle verstehen zu können. In den letzten Jahren entwickelten sich auch vermehrt Fragen zur lokalen Proteinsynthese. Dabei nimmt man besonders im Fall von polaren Zellen wie Neuronen an, dass die Proteinbiosynthese nicht global im Cytosol stattfindet, sondern es einen Transport der „ruhenden“ RNA bis zu dem Ort geben muss, an dem das entsprechende Protein lokal benötigt wird. In dieser vorliegenden Arbeit sollen nun in zwei Hauptprojekten molekulare Werkzeuge entwickelt werden, mit deren Hilfe oben genannte Fragestellungen in Zukunft beantwortet werden könnten. Im ersten Hauptprojekt wurde dazu eine neue Generation lichtaktivierbarer Molecular Beacons (von engl.: molekulare Leuchtfeuer) entwickelt. Dabei handelt es sich um Oligonukleotide, die komplementär zu einer intrazellulären RNA-Sequenz (Target-RNA) sind und mit Fluorophor und Fluoreszenz-Quencher modifiziert werden. Bei den lichtaktivierbaren Designs kann Fluoreszenz detektiert werden, wenn der Molecular Beacon an seine Targetsequenz gebunden und zusätzlich zuvor eine Lichtaktivierung stattgefunden hat. Im Gegensatz zu früheren Designs wurde bei diesem hier vorgestellten Molecular Beacon der Fluorophor mit Hilfe eines zweiten photoabspaltbaren Quenchers verbunden. Dadurch kann der Beacon an seine Targetsequenz binden, obwohl noch keine Lichtaktivierung stattgefunden hat. Fluoreszenz kann allerdings erst nach photoinduzierter Abspaltung des zusätzlichen Quenchers detektiert werden. In der vorliegenden Studie konnten dadurch extrem gute Signal-zu-Rausch-Verhältnisse von bis zu 170:1 erreicht werden. Zusätzlicher Vorteil dieses Designs ist die Tatsache, dass eine Vielzahl kommerziell erhältlicher Fluorophor-Quencher-Paare verwendet werden kann. Dabei ist es nicht relevant, ob der entsprechende Farbstoff co-synthetisch während der Festphasensynthese oder post-synthetisch durch die Modifikation funktioneller Gruppen angebracht wird. Nach anfänglichen in vitro Tests wurden die besten Molecular Beacons in vivo in der Zuckmücken-Art Chironomus tentans getestet. Dieser Organismus ist aufgrund seiner Polytänchromosomen, der sog. Balbiani Ringe, interessant. Dabei handelt es sich um ein Chromosom, das viele Chromatiden mit jeweils identischen Gensequenzen enthält. Diese Balbiani Ringe haben eine sehr charakteristische Struktur. Die Molecular Beacons wurden in den Zellkern injiziert und anschließend photoinduziert. Auch in den in vivo Messungen zeigte sich die Überlegenheit des neuen Design mit Signal-zu-Rausch-Verhältnissen von bis zu 80:1. Im zweiten Hauptprojekt war es das Ziel, lokale mikroRNA-Reifung in Neuronen nachzuweisen bzw. sichtbar zu machen. MikroRNA (kurz miRNA) ist einer der wichtigsten zellulären Werkzeuge, um Genregulation auf post-transkriptioneller Ebene zu ermöglichen. Für dieses Projekt wurde eine Sonde entwickelt, die den nativen miRNA-Vorläufer – die sog. prä-miRNA – nachbildet. Der enzymatische Reifungsprozess durch die RNase Dicer sollte durch Fluoreszenz nachweisbar sein. Dies gelang durch Modifikationen der Sequenz um die enzymatische Schnittstelle herum. Durch den Dicer-vermittelten, enzymatischen Verdau wurde ein Fluorophor von einem Quencher getrennt, wobei der fluoreszente Farbstoff an der reifen mikroRNA verblieb. Nach der Etablierung der in vitro Tests und Auswahl des optimalen Fluorophor-Quencher-Paars zeigte sich in einem Kontrollexperiment, dass bei Verwendung von neuronalen Ganglien aus Dicer-Knock-Out Mäusen kein Fluoreszenzanstieg zu beobachten war. Dieses Experiment bewies, dass bisher beobachtete Fluoreszenzanstiege Dicer-spezifisch waren. Im nächsten Schritt wurden in vivo Messungen durchgeführt. Es zeigte sich dabei, dass die sog. Patch Clamp Technik herkömmlichen Transfektionsmethoden überlegen war. Unter normalen Bedingungen zeigte sich sowohl im Soma als auch in den Dendriten ein Fluoreszenzanstieg. Durch Depolarisation des Neurons konnte dieser Effekt noch verstärkt werden, wobei das somatische Signal grundsätzlich als höher einzustufen war. Interessanterweise führte eine Blockade der NMDA-Rezeptoren auch bei gleichzeitiger Depolarisation zu einer verringerten Fluoreszenz. Dies lässt darauf schließen, dass die Reifung der untersuchten prä-miRNA in Dendriten von der Aktivität des NMDA-Rezeptors bzw. einem als Konsequenz ansteigenden Ca2+-Spiegels in der Zelle abhängig ist. In einem weiteren Experiment wurde nach „Beladung“ eines Neurons mit der prä-miRNA-Sonde Dendriten punktuell aktiviert. Dies konnte durch Licht-aktivierbares Glutamat erreicht werden. Im zentralen Nervensystem gilt Glutamat als der wichtigste aktivierende Neurotransmitter. Es konnte beobachtet werden, wie einerseits Fluoreszenz lokal an der aktivierten Stelle anstieg und gleichzeitig sog. dendritische Spines wuchsen. Zum Teil war auch ein Wachstum benachbarter Spines zu beobachten. Dabei handelt es sich um pilzförmige Aussackungen der Dendriten an Stellen, an denen Vernetzungen zu Synapsen anderer Neuronen existieren. Als Ergebnis kann geschlussfolgert werden, dass es eine lokale Reifung der untersuchten prä-miRNA durch Dicer in Dendriten gibt. Dieser Prozess kann sehr spezifisch und lokal durch die Aktivierung einzelner synaptischer Verbindungen initiiert werden.
Entwicklung neuer Multikomponentenreaktionen zur Synthese von Amin- und α-Aminosäurederivaten
(2016)
Die Entwicklung neuer Synthesemethoden ist von enormer Bedeutung hinsichtlich der Darstellung von neuen Verbindungen mit speziellen, anwendungsorientierten Eigenschaften und in Bezug auf die Suche nach ökologisch verträglicheren und effizienteren Herstellungsmethoden. Multikomponentenreaktionen (MCRs) bieten hierbei eine gute Ansatzmöglichkeit. Gegenüber den klassischen, linear verlaufenden 2-Stufen-Reaktionen weisen MCRs eine hohe Atom-Ökonomie und effiziente Bindungsbildung auf, können zur Minimierung von Zeit-, Energie-, Material- und Kostenaufwand sowie zur geringeren Generierung von Abfallmengen beitragen und ermöglichen einen schnellen Aufbau diverser Molekülstrukturen. Vor diesem Hintergrund gelang im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Entwicklung mehrerer 3-Komponentenreaktionen basierend auf der nukleophilen Addition von Arylboronsäuren an in situ gebildete N-Acyl- bzw. N-Sulfonylimine, womit die Synthese von diversen alpha-substituierten Amiden, chiralen, alpha-substituierten Sulfonamiden, chiralen alpha-Arylglycinen sowie von Arylmethylsulfonamiden erfolgte. Der Schlüssel zu einer erfolgreichen Umsetzung hinsichtlich der Methode mit Amiden war die Verwendung eines dualen Katalysatorsystems aus Lewis-Säure und Pd(II) sowie die Anwesenheit von Wasser. Die enantioselektiven Varianten konnten mittels Sulfonamide anstelle der Amide sowie unter Einsatz von Pd(II) und einem chiralen Oxazolin-Liganden erreicht werden. Die neuen Methoden sind einfach in der Durchführung, weisen einen breiten Substrat-bereich auf und im Falle der asymmetrischen Varianten hohe Enantioselektivitäten.
Allerdings besitzt die Reaktionsführung über Organoboronsäuren zwei entscheidende Nachteile: Zum einen bedarf es der Verwendung vorfunktionalisierter Boronsäuren und zum anderen werden stöchiometrische Mengen borhaltiger Abfälle erzeugt. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit auch Prozesse untersucht, bei denen hinsichtlich der Atom-Ökonomie keine unnötig vorfunktionalisierten Startmaterialien eingesetzt werden und bei denen keine oder nur ökologisch vollkommen unbedenkliche Nebenprodukte entstehen. Ein erster Ansatz in diese Richtung gelang dabei mit der Entwicklung einer neuen 3-Komponentenreaktion basierend auf einer Brønsted-Säurekatalysierten, benzylischen C–H-Bindungsfunktionalisierung von 2-Alkylazaarenen.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der vergleichenden funktionalen Charakterisierung der E.coli Transporter LacY, FucP und XylE und des Glucose-Transporters GlcP aus Staphylococcus epidermidis sowie funktionsrelevanter Mutanten. Sie katalysieren in vivo den PMF-gekoppelten Zuckertransport und repräsentieren die major facilitator superfamily (MFS), einer der größten Transporter-Familien überhaupt. Die Studien wurden mithilfe einer elektrophysiologischen Methode auf Basis Festkörper-unterstützter Membranen (SSM) durchgeführt. Komplementär dazu wurden radioaktive Transportassays, fluorometrische Messungen, kinetische Simulationen und theoretische Berechnungen auf Basis der 3D-Strukturen durchgeführt. Experimentell bestimmte Zucker- und pH-Abhängigkeiten elektrogener steady-state und pre steady-state Reaktionen wurden verwendet, um ein allgemeingültiges kinetisches Modell aufzustellen.
Insgesamt konnten bei allen Transportern zwei elementare elektrogene Reaktionen identifiziert werden. Eine schnelle Zucker-induzierte Konformationsänderung wurde dem induced fit des Zuckermoleküls zugeordnet. Die Elektrogenität im steady-state wird dagegen durch den langsamen Transfer der negativ geladenen Protonenbindestelle bestimmt. Die für den Symport ratenlimitierende Reaktion ist abhängig von den äußeren Bedingungen wie pH-Werten, Zuckerkonzentrationen, Substrat-Spezies und Membranpotential meist die Konformationsänderung des leeren (P) oder des beladenen (PSH) Carriers, welche die Substratbindestellen im Zuge des Alternating Access über die Membran transferieren. Ein Wechsel zwischen hohen Protonenbindungs-pK-Werten und niedrigen Protonenfreisetzungs-pK-Werten durch weitere lokale Konformationsänderungen ist zentraler Bestandteil des Transportmechanismus. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist die Kopplung zwischen Zucker- und Protonen-Translokation, die sich zwischen E.coli Transportern und GlcP strikt unterscheidet. In E.coli Transportern erfolgt eine kooperative Bindung von Zucker und Proton. Zudem erfolgt keine Konformationsänderung im Zucker-gebundenen, unprotonierten Carrier (PS). In GlcP ist die Kopplung erheblich reduziert. Der Transport-Modus selbst ist abhängig von den äußeren Bedingungen. So katalysiert GlcP abhängig vom pH-Gradienten Uniport, Symport oder Antiport.
Die vorliegende Arbeit leistet einen wichtigen Beitrag zum Verständnis des PMF-gekoppelten Zuckertransports und zeigt die Grenzen des für LacY formulierten 6-Zustands-Modells mit nur zwei Konformationsänderungen auf. Ein erweitertes 8-Zustands-Modell mit vier Konformationsänderungen, die unterschiedliche Ratenkonstanten aufweisen können, erklärt sowohl Symport, Antiport als auch Uniport und berücksichtigt zudem die zahlreichen Ergebnisse für LacY aus der Literatur.
Die mitochondriale Innenmembran (IM) besteht aus zwei Subkompartimenten. Der Cristae Membran (CM) und der inneren Grenzmembran (IBM), welche durch die runden und schlitzartige Strukturen der Christa Junctions (CJs) verbunden werden Der MICOS-Komplex ist an den CJs lokalisiert und besteht aus mindestens 6 Komponenten, Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 und Mic10. Es ist bekannt, dass der MICOS-Komplex essentiell für die Stabilität der CJs ist. Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse, geben Aufschluss darüber, wie sich einzelne MICOS-Komponenten auf die Stabilität von Cristae und CJs im Modellsystem Hefe (S cerevisiae) auswirken. Zu Beginn dieser Arbeit war zum einen bekannt, dass die MICOS-Komponente Mic60 essentiell für die Bildung von CJs ist. Zum Anderen wurden im Vorfeld dieser Arbeit Interaktionen von Mic60 mit Proteinen in der mitochondrialen Außenmembran, vor allem Proteinkomplexe mit β-barrel-Proteinen identifiziert. Diese Interaktionen werden über den evolutionär, konservierten C-Terminus von Mic60 vermittelt.
β-barrel Proteine besitzen eine charakteristische Peptidsequenz, die β-Sequenz. Diese dient nach dem Import der β-barrel Proteine in die Mitochondrien als Signalpeptid für den SAM-/TOB-Komplex, welcher daraufhin die Proteine in die Außenmembran insertiert. In dieser Arbeit wurde ebenfalls eine β-Sequenz im C-Terminus von Mic60 identifiziert, diese zeigte einen Einfluss auf die Cristae-Stabilität. Zellen die eine Mic60-Variante mit einer Deletion oder Punktmutation der β- Domäne exprimieren, zeigten eine reduzierte Anzahl an CJs. Auch das Verkürzen des C-Terminus von Mic60 hatte diesen Effekt auf die mitochondriale Ultrastruktur. So konnte gezeigt werden, dass die β-Domäne und die Integrität des C-Terminus essentiell für die Stabilität von CJs sind.
Der Fokus dieser Arbeit lag in der Charakterisierung der MICOS-Komponenten Mic26 und Mic27. Es konnte bewiesen werden, dass beide Proteine genetisch mit der MICOS-Kernkomponente Mic60 interagieren. Die Untersuchung der mitochondrialen Ultrastruktur von Δmic26- und Δmic27-Zellen zeigte, dass eine Deletion vom Mic26 keinen Einfluss auf die Organisation der mitochondrialen Innenmembran hat. Im Gegensatz dazu, ist im Vergleich zum Wildtyp die Anzahl an CJs in Δmic27-Zellen um zwei Drittel reduziert. Auch die Innenmembranoberfläche ist in diesen Zellen stark vergrößert. Die Untersuchung der Morphologie der mitochondrialen Innenmembran in Zellen ohne Mic27 durch Kryo-Elektronentomographie isolierter Mitochondrien, veranschaulichte die Struktur der CJs in diesen Zellen genauer. Es zeigten sich hier breitere CJs, und der Übergang von der Cristaemembran in den Bereich der inneren Grenzmembran ist sehr flach und undefiniert. In Wildtyp-Mitochondrien waren die CJs schmal und schlitzartig und haben einen scharfkantigen Übergang von der Cristaemembran zur inneren Grenzmembran. Des Weiteren wies die Cristaemembran in Δmic27-Zellen unregelmäßige zackige Strukturelemente auf, was auf eine Anhäufung an Dimeren der F1FO-ATP Synthase hinweist.
Diese Beobachtungen in den Kryo-Tomogrammen, wurde durch Analysen des Oligomerisierungszustands der F1FO-ATP Synthase in Δmic27-Zellen, bestätigt. Hier fanden sich deutlich weniger höhere Oligomere und vermehrt Dimere. So kann aus diesen Befunden geschlossen werden, dass Mic27 die Oligomere der F1FO-ATP Synthase stabilisiert.
Um zu untersuchen, wie der MICOS-Komplex mit der F1FO-ATP Synthase in Verbindung steht, wurde mittels 2D-BNE-Analysen und einem Complexome Profiling die Komplexierung der nativen Komplexe in Wildtyp- und Δmic27-Mitochondrien analysiert. Zum einen konnte durch diese Untersuchungen gezeigt werden, dass Mic27 neben der F1FO-ATP Synthase auch stabilisierend auf den MICOS-Komplex wirkt. Die Komplexe im hochmolekularen Bereich der MICOS-Komponenten zerfielen in Δmic27-Zellen, was darauf hinweist, dass die anderen MICOS-Komponenten hier nicht mehr assemblieren können. Mic10 war die einzige MICOS-Komponente die in Δmic27-Zellen noch stabile Komplexe im hohen Massenbereich ausbildete. Mic10 findet sich zudem nicht nur in Klustern mit anderen MICOS-Komponenten sondern auch mit der F1FO-ATP Synthase.
Die Interaktion von Mic10 und der F1FO-ATP Synthase wurde auch biochemisch, mittels chemischer Quervernetzern und Ko-Immunpräzipitationsexperimenten bestätigt. Dies legt nahe, dass Mic10 die CJs mit hoher Wahrscheinlichkeit, durch die Verbindung mit der F1FO-ATP Synthase, mit der Cristaemembran verbindet und so stabilisiert.
Aufgrund der Erkenntnisse dieser Arbeit konnte ein neuartiges Modell postuliert werden. Die MICOS-Komponente Mic60 stabilisiert die CJs durch eine Interaktion seines C-Terminus mit Proteinen in der Außenmembran. Mic27 vermittelt über Mic10 die Interaktion zur F1FO-ATP Synthase. Somit ist diese neu identifizierte Interaktion des MICOS-Komplex zur F1FO-ATP Synthase essentiell für die Stabilität von CJs ist, indem es den MICOS-Komplex mit den Oligomeren der F1FO-ATP Synthase verbindet.
Mitochondrial membrane dynamics is increasingly implicated in various human diseases. Numerous studies show that the protein OPA1 plays a central role in determining mitochondrial ultrastructure and apoptotic remodeling of the inner mitochondrial membrane during Cytochrome c release and apoptosis. Crista junctions are crucial for the regulation of apoptotic Cytochrome c release. Previous publications suggest that OPA1 is required to maintain a normal structure of the inner mitochondrial membrane. The protein MIC60 (Mitofilin) appears to be an essential physical constituent of crista junctions and is also crucial for the general determination of mitochondrial ultrastructure. Furthermore, recent studies suggest that MIC60 is also implicated in Cytochrome c release during apoptosis.
In this regard, the question whether OPA1 is essential for crista junction formation was investigated. In addition to that, the interplay between OPA1 and MIC60 and its physiological role were analyzed. Electron microscopy of OPA1+/- and OPA1+/+ mice, as well as of OPA1-/- and OPA1+/+ MEFs clearly showed that OPA1 plays a role but is not essential for crista junction formation. In contrast to that, the results indicate that OPA1 is crucial to maintain a normal structure of the inner mitochondrial membrane. Immunogold experiments fit well to these observations as OPA1 was found equally distributed throughout the cristae membrane with only a minor part located at crista junctions. MIC60 localization studies showed a clear enrichment at crista junctions. Interaction studies revealed that endogenous OPA1 and MIC60 physically interact with each other. Analysis of protein levels upon OPA1 or MIC60 depletion indicate that both proteins play a dual role in cristae- and crista junction formation in which MIC60 is a physical constituent of crista junctions essential for their formation while OPA1 primarily has a regulatory impact on MIC60 function. Finally, apoptosis assays and cell viability measurements showed that knockout of OPA1 in MEFs leads to increased cellular resistance suggesting that the interplay of these proteins is important for the regulation of crista junction remodeling during apoptosis.
Besides its role in determining mitochondrial ultrastructure, OPA1 mediates inner membrane fusion of mitochondria thereby contributing to mitochondrial quality control. Additionally, proteolytic processing is crucial for the ability of OPA1 to distinguish between functional and dysfunctional mitochondria. Functional mitochondria are fused while dysfunctional mitochondria are not, a process termed selective mitochondrial fusion. Dysfunctional mitochondria were shown to be degraded by mitophagy in a fission-dependent manner. Numerous studies suggest that OPA1 and mitophagy are directly linked. However, this idea is still under debate. Mitophagy is also crucial for mitochondrial quality control, which directly impacts mitochondrial integrity. Furthermore, mitochondrial quality control has been linked to neurodegeneration as demonstrated by the observation that mutations in OPA1 cause the disorder ADOA-1.
In order to analyze a potential link between OPA1 and mitophagy, mitochondrial colocalization with LC3 was analyzed microscopically in primary adult skin fibroblasts isolated from OPA1+/- and OPA1+/+ mice in an age-dependent manner. Fibroblasts from young OPA1+/- mice showed increased colocalization of mitochondria with autophagosomes compared to fibroblasts from young wild type mice suggesting that OPA1 exerts an inhibitory role in mitophagy. This effect was even more pronounced in old mice, which also displayed higher mitophagy levels in general than young mice, consistent with the finding that old mice had higher Parkin levels than young mice. Mitochondrial fragmentation was elevated in fibroblasts from young and old OPA1+/- mice compared to control fibroblasts. However, extensive mitochondrial fusion, which occurred in fibroblasts from old wild type mice, was prevented in old OPA1+/- mice. Furthermore, old wild type mice had decreased numbers of crista junctions compared to young wild type mice, an effect that was not observed in OPA1+/- mice. Despite the observed age-dependent phenotypes in mitochondrial quality control and mitochondrial integrity, deletion of one allele of OPA1 had no influence on the life span in vivo. Analysis of the OPA1-dependent proteome of aging mice, which was performed in collaboration with Ansgar Poetsch and Carina Ramallo-Guevara from Bochum, showed that OPA1-dependent aging is accompanied by a reduction of proteins involved in autophagy. In contrast to that, a switch from glucose to fatty acid metabolism and alterations in apoptotic proteins were observed in both OPA1+/- and OPA1+/+ mice in an age-dependent manner indicating that the changes in proteins implicated in autophagy could be a compensatory response to the diminished inhibitory effect of OPA1 on mitophagy. On the other hand, increased mitochondrial degradation by mitophagy could be a cellular response to itself compensating for the loss of OPA1 mediated fusion thereby contributing to the observation that OPA1+/- and OPA1+/+ mice had no differences in life span. Furthermore, analysis of the OPA1-dependent proteome of aging mice revealed that OPA1, besides its role in mitochondrial fusion, could interact with the fission machinery: MFF and Neuronal pentraxin 1, two proteins involved in mitochondrial fission, were up-regulated in 12-month-old OPA1+/- mice suggesting that a reduced fission activity could contribute to mitochondrial hyperfusion in aged wild- type mice. Nonetheless, the exact nature of the possible interplays between OPA1 and these candidates remains to be investigated.
In the adult mammalian brain stem cells within defined neurogenic niches retain the capacity for lifelong de novo generation of neurons. The subventricular zone (SVZ) of the lateral ventricles and the subgranular layer (SGL) of the hippocampal dentate gyrus (DG) have been identified as the two major sites of adult neurogenesis. Moreover, the third ventricle in the hypothalamus is emerging as a new neurogenic niche in the adult brain. Extracellular purine and pyrimidine nucleotides are involved in the control of both embryonic and adult neuro-genesis. These nucleotides act via ionotropic P2X or metabotropic P2Y receptors and studies of the adult SVZ and the DG provide strong evidence that ATP promotes progenitor cell proliferation in this stem cell rich regions. Previous studies have shown that the extracellular nucleotide-hydrolyzing enzyme NTPDase2 is highly expressed by adult neural stem and progenitor cells of the SVZ and the rostral migratory stream (RMS), the hippocampal SGL, and the third ventricle. NTPDase2 preferentially hydrolyzes extracellular nucleoside triphosphates (NTPs) and, to a lower extent, diphosphates, thus modulating their effect on nearby nucleotide receptors. Deletion of the enzyme increases extracellular NTP concentrations, and might indicate roles of purinergic signaling in adult neurogenesis. As shown by enzyme histochemistry, genetic deletion of NTPDase2 essentially eliminates ATPase activity in neurogenic niches but does not affect protein expression levels and activity of other ectonucleotidases. Lack of NTPDase2 leads to expansion of the hippocampal stem cell pool as well as of the inter-mediate progenitor type-2 cells. Cell expansion is lost at around type-3 stage, paralleled by increased labeling for caspase-3, indicating increased apoptosis, and decreased levels in CREB phosphorylation in doublecortin-expressing cells, diminishing survival in this cell population. In line with increased cell death, P2Y12 receptor-expressing microglia is enriched at the hilus orientated side of the granule cell layer. These data strongly suggest that NTPDase2 functions as central homeostatic regulator of nucleotide-mediated neural progenitor cell proliferation and expansion in the adult brain by balancing extracellular nucleotide concentrations and activation of purinergic receptors.
In order to further characterize the role of purinergic signaling in adult neurogenesis, the ADP-sensitive P2Y13 receptor was identified as a potential candidate whose activation might inhibit neurogenesis in the hippocampal dentate gyrus and the newly identified neurogenic niche at the third ventricle. Deletion of P2ry13 increased progenitor cell proliferation and long-term progenitor survival as well as new neuron formation in the hippocampal neurogenic niche. This was further paralleled by increased thickening of the granule cell layer, CREB phosphorylation, and expression of the neuronal activity marker c-Fos. Increased progenitor cell proliferation and progenitor survival persist in aged P2ry13 knockout animals. However, in the ventral dentate gyrus proliferation and expansion levels of progenitor cells did not differ significantly from the wild type. This study strongly supports the notion that extracellular nucleotides significantly contribute to the control of adult neurogenesis in the dentate gyrus in situ. Data in this work suggest that activation of the P2Y13 receptor dampens progenitor cell proliferation, new neuron formation, and neuronal activity. In contrast to several in vitro studies and studies in the SVZ in situ, a contribution of the ATP/ADP-sensitive P2Y1 receptor could not be confirmed in the dentate gyrus in vivo.
To unravel implications of purinergic signaling and P2Y13 receptor action in the control of adult hypothalamic neurogenesis a pilot study was performed. Mice null for P2ry13 revealed increased progenitor cell proliferation at the third ventricle as well as long-term progeny survival and new neuron formation in the hypothalamus. In contrast to results obtained in the dentate gyrus expression of the neuronal activity marker c-Fos was significantly decreased in hypothalamic nuclei, indicating increased inhibition of appetite-regulating neuronal circuits by surplus neurons in knockout animals. These data provide first evidence that extracellular nucleotide signaling contributes to the control of adult hypothalamic neurogenesis in situ. Activation of the P2Y13 receptor inhibits progenitor cell proliferation, long-term survival and neuron formation and therefore controls inhibition of appetite-regulating circuits in the adult rodent hypothalamus.
Bei Cryptochromen handelt es sich um Blaulichtrezeptoren der Cryptochrom-Photolyase-Proteinfamilie (CPF). Mitglieder dieser Proteinfamilie sind in allen Domänen des Lebens zu finden und haben eine essentielle Rolle in der Reparatur der DNA sowie der lichtgesteuerten Regulation der Expression. Cryptochrome sind in der Regel keine DNA-reparierenden Proteine. Sie sind regulativ an der Steuerung der inneren Uhr und des Zellzyklus der Organismen beteiligt. In der Kieselalge Phaeodactylum tricornutum konnten bisher sechs phylogenetisch unterschiedliche Mitglieder der CPF identifiziert werden. Bei CryP handelt es sich um das einzige pflanzenähnliche Cryptochrom der photoautotrophen Diatomee. Für das Protein CryP konnte bereits ein blaulichtinduzierter Photozyklus durch die Absorption der Chromophore 5-Methenlytetrahydrofolat (MTHF) und Flavinadenindinukleotid (FAD) gezeigt werden. Außerdem ist eine regulative Wirkung des Proteins auf die Lichtsammelkomplexe (Lhc) der Diatomee bekannt. Für eine weitere Charakterisierung des CryPs wurde in dieser Arbeit zunächst das Absorptionsverhalten unter verschiedenen Wellenlängen beobachtet, um so einen Einblick in eine mögliche Aktivierung und Deaktivierung des Proteins durch Licht unterschiedlicher Wellenlängen zu erlangen. Es zeigte sich hierbei eine mit pflanzlichen Cryptochromen vergleichbare Anreicherung verschiedener Redoxzustände des FADs in Abhängigkeit von der Wellenlänge.
Für eine Aufklärung der Wirkungsweise des CryP-Proteins wurden verschiedene Hypothesen untersucht: Die phylogenetische Nähe und ein ähnliches Absorptionsverhalten des CryPs zu Cryptochromen mit Reparaturfähigkeit für einzelsträngige DNA (Cry-DASH) führte zu einer Untersuchung des Proteins als möglicher Transkriptionsfaktor. Hierfür konnte eine Kernlokalisation des Proteins nachgewiesen werden, was Rückschlüsse auf eine potentielle Regulation der Expression mittels DNA-Bindung zulässt. Außerdem wurde gezeigt, dass CryP DNA-Bindefähigkeit besitzt. Die bisher nachgewiesenen Bindungen waren jedoch unspezifischer Art. Dies konnte auch für die Promotersequenz eines der durch CryP regulierten Gene lhcf1 festgestellt werden. Auf Grund der unspezifischen DNA-Bindung wurde eine zweite Hypothese für CryP untersucht: CryP wirkt regulativ auf die Expression verschiedener Gene durch Protein-Protein-Interaktionen und ist Teil einer Reaktionskaskade zur Signalweiterleitung in P. tricornutum.
Durch die Untersuchung der zweiten Hypothese konnten drei Interaktionspartner für CryP identifiziert und eine Interaktion verifiziert werden. Hierbei handelt es sich um das Protein AAA mit einer bisher unbekannten Funktion und das Protein BolA, welches Teil der zuerst in Escherichia coli identifizierten BolA-like-Proteinfamilie ist. Außerdem konnte eine Interaktion mit dem Cold-Shock-Domänen-Protein CSDP gezeigt werden. Bei den Proteinen BolA und CSDP handelt es sich um potentiell regulierende Faktoren der Transkription und Translation, was Teil einer Reaktionskaskade sein kann. Die aus anderen Organismen bekannten Funktionen des BolA-Proteins überschneiden sich mit den in CryP-Knockdown-Mutanten beobachteten Effekten. Sie zeigen eine erhöhte Sensitivität für Stresssituationen wie abweichende Nährstoffkonzentration, Osmolaritäten und Temperaturen. Diese Beobachtungen stellen einen Zusammenhang der durch einen CryP-Knockdown beobachteten Effekte und der CryP-BolA-Interaktion her. Durch Homologien zu Cold-Shock-Proteinen aus Chlamydomonas reinhardtii gibt die CryP-Interaktion mit dem Protein CSDP Hinweise auf einen potentiellen Mechanismus zur Regulation der Lhc-Proteine, für welche zuvor ein CryP-abhängiger Effekt beschrieben war.
Über die Protein-Protein-Interaktionen hinaus wurde die Phosphorylierung des CryPs als Möglichkeit der Signalweiterleitung untersucht. Es konnte eine reversible Phosphorylierung des heterolog aus E. coli isolierten CryPs gezeigt werden. Diese zeigt Ähnlichkeiten zu bekannten Phosphorylierungen pflanzlicher Cryptochrome und gibt Hinweise auf einen Mechanismus der Signalweiterleitung.
Durch die Untersuchung der CryP-regulierten Transkription mit P. tricornutum CryP-Knockdown-Mutanten durch Next-Generation-Sequencing (NGS) konnte die Hypothese der regulativen Proteinkaskade und der Signalweiterleitung weiter bestätigt werden. Die Auswirkungen des CryPs auf die Transkription erwiesen sich als nicht auf einen Teilbereich des Metabolismus begrenzt, sondern sind in einem großen Teil der funktionellen Gengruppen in P. tricornutum zu sehen. Außerdem konnten drei Klassen CryP-regulierter Gene festgestellt werden. Kategorie 1: die ausschließlich unter Blaulicht regulierten Gene; Kategorie 2: die sowohl unter Blaulicht als auch im Dunkeln regulierten Gene und Kategorie 3: die ausschließlich im Dunkeln regulierten Gene. Ein im Dunkeln und unter Blaulicht jeweils unterschiedlicher regulativer Effekt deutet auf eine Doppelfunktion des CryPs hin. Möglicherweise hat das Cryptochrom unterschiedliche lichtabhängige und lichtunabhängige Funktionen.
Durch die Analyse der CryP-regulierten Genexpression konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen CryP und weiteren Photorezeptoren gezeigt werden. Der CryP-Proteingehalt in der Zelle hat einen regulativen Einfluss auf das CPF1-Protein, eine Photolyase mit dualer Funktion aus der gleichen Proteinfamilie. Zusätzlich konnte auch ein Einfluss auf die Lichtsensitivität der Genexpression des Rotlichtrezeptors Phytochrom (DPH) durch CryP gezeigt werden. Vergleichbar mit höheren Pflanzen scheint ein regulatives Netzwerk der Photorezeptoren auch in der Diatomee P. tricornutum vorhanden zu sein.
Phenology is the study of periodic life cycle events of living organisms and how these are influenced by environmental factors. Late phenological phases such as the timing of seed release and subsequent seed dispersal considerably affect ecology and evolution in plants. Since plants are mostly sessile organisms, seed dispersal is a crucial life cycle event for the ecology and evolution of plants. In fact, long-distance seed dispersal (LDD) is a very complex process in plant biology and significantly shapes the spatial and temporal dynamics of plant populations. For example, wind dispersal in plants is influenced by a variety of factors such as plant traits, habitat type and environmental conditions (e.g. wind speed). Considering the variability of wind conditions throughout the year, the timing of seed release and dispersal is known to have considerable effects on LDD. Even though late phenologies such as ripening duration and timing of seed release and subsequent dispersal are vital in estimating ecologically highly relevant LDD, these phenologies are not appropriately addressed in ecological research. The aim of this thesis is to gain insights into the factors that shape late plant phenologies. In particular, we address the following questions: which ecologically or evolutionary parameters drive the ripening process of plant species? How does the seasonal variability of wind affect the seed release phenology of plant species? How do these factors interact for plant species in different habitat types?
In order to address these questions, we applied different methodological approaches, ranging from fieldwork and monitoring phenology to computational simulation studies and statistical modeling. To study the ripening process of species, we monitored the flowering, ripening and seed release phenology of more than 100 Central European plant species. We conducted computational simulation studies for estimating LDD by wind to study the phenology of seed release and the parameters determining LDD by wind. In conjunction with phenological data from literature, we used the obtained simulation results to investigate evidence for the existence of phenological adaptations towards LDD in 165 plant species. Further, we used the results from simulation studies of LDD by wind to disentangle the effects of species, habitat types and meteorological conditions and their interactions on the spatial spread of plant species.
The results of the relationship between plant traits, phylogeny, the ripening process and climatic factors provide insights into the basic understanding of the ripening process of plants. We identified ecological factors that shape species’ ripening phenology and seed release timing. In particular, we suggest that the species’ seed weight, life form and phylogeny shapes ripening and seed release phenology. With the statistical models on species’ temperature demands for reproduction, we introduce data that that are well suitable for parametrization and further development of plant dispersal models. The results from the simulation study based on a seasonal perspective showed that heavier seeded tree species with medium wind dispersal potential (including genera Abies, Acer, Fraxinus and Larix) have a clear synchronisation of seed abscission with periods favouring LDD. These species, which are both ecologically and economically important, showed significant synchronisation of the highest rate of seed release with high wind-speed that promoted LDD by wind in wintertime. For the tree species mentioned, we suggest strong seasonal synchronisation as evidence for phenological adaptations in order to match favourable conditions during seed release. With a closer look at the wind conditions that promote LDD by wind, our results showed considerable differences in how specific wind conditions affect LDD in different species and habitat types. We suggest that LDD by wind in species from open habitats with high wind dispersal potential is likely to be driven by thermal updrafts that are mainly driven by the sun providing energy to the ground. By contrast, LDD of heavier-seeded species from open and forested habitats is more likely to be driven by storms that produce shear-driven turbulence. The results from this thesis contribute to an increased understanding of the complete dispersal process of plants and to making more realistic projections of (future) plant distribution.
The results obtained on factors driving ripening and release phenology provide valuable insights into their ecological and phylogenetic factor constraints. The implementation of more realistic assumptions in assessing species’ dispersal potential throughout the year could help considerably in improving landscape management (e.g. timing of mowing) and in the conservation of plant populations. The evidence found for phenological adaptations towards LDD in plants is an important step in understanding the evolutionary basis of LDD in these species.
Riboswitches are an important class of regulatory RNA elements that respond to cellular metabolite concentrations to regulate gene expression in a highly selective manner. 2’-deoxyguanosine-sensing (2’dG) riboswitches represent a unique riboswitch subclass only found in the bacterium Mesoplasma florum and are closely related to adenine- and guanine-sensing riboswitches. The I-A type 2’dG-sensing riboswitch represses the expression of ribonucleotide reductase genes at high cellular concentrations of 2’dG as a result of premature transcription termination.
Increasing evidence within the last decade suggests that transcriptional regulation by riboswitches is controlled kinetically and emphasizes the importance of co-transcriptional folding.2–4 Addition of single nucleotides to nascent transcripts causes a continuous shift in structural equilibrium, where refolding rates are competing with the rate of transcription.5,6
For transcriptional riboswitches, both ligand binding and structural rearrangements within the expression platform are precisely coordinated in time with the rate of transcription. The current thesis investigates the mechanistic details of transcriptional riboswitch regulation using the I-A 2’dG-sensing riboswitch as an example for a riboswitch that acts under kinetic control.
Die humane 5-LO ist das Schlüsselenzym in der LT-Biosynthese. LTs sind wichtige Entzündungsmediatoren und sind in einer Vielzahl von Krankheiten involviert, u. a. Asthma, Atherosklerose, rheumatische Arthritis, Sepsis, allergischen Reaktionen und in vielen Krebsarten. Die Struktur der 5-LO besteht aus 673 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 78 kDa. Sie ist in zwei Domänen unterteilt: die kleinere C2-ähnliche regulatorische Domäne (C2ld) und der größeren katalytischen Domäne. Die 5-LO besitzt NIS und NES, die für die zelluläre Lokalisation der 5-LO verantwortlich sind. Außerdem wird die Lokalisation noch von Phosphorylierungsstellen reguliert, die auf der katalytischen Domäne identifiziert werden konnten. 2011 konnten Häfner et al. zeigen, dass die 5-LO in der Lage ist Homodimere zu bilden.
Wie für die meisten anderen humanen Gene konnten auch bei der 5-LO alternative Spleißvarianten identifiziert werden. Schon 1992 konnten die ersten unterschiedlich gesüleißten Transkripte in Hirntumoren und differenzierten HL-60-Zellen gefunden werden. Später konnten weitere Isoformen in verschiedenen Zelllinien entdeckt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden die alternativen Spleißvarianten 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht und charakterisiert. Auf mRNA-Ebene wurde die Expression des 5-LO-WT und deren Isoformen sowohl in B- und T-Zelllinien als auch primären B- und T-Zellen, monozytären Zelllinien und primäre Monozyten aus Patientenproben (RA und Sepsis) untersucht. Es wurde festgestellt, dass das Expressionsprofil der 5-LO-Varianten zellspezifisch ist. Im Vergleich zu den T-Zellen konnte in B-Zelllinien ein höheres Expressionslevel detektiert werden. Des Weiteren zeigte sich interessanterweise ein stark erhöhtes Expressionslevel in primären Monozyten von RA- und Sepsis-Patienten.
Untersuchungen der 5-LO-Aktivität ergaben unterschiedliche Ergebnisse, abhängig von der Transfektionsmethode. Als transiente Transfektion diente die Calciumphosphat-Methode. Für die stabile Integration der HEK293T-Zellen wurde die Sleeping Beauty-Methode gewählt. Hierfür wurden Proteine mit einem GFP bzw. mCherry-Tag (GFP-5-LO-WT, mCherry∆13, mCherry∆4, mCherryp12) verwendet, um diese mittels Konfokalmikroskop visualisieren zu können. Nach transienter Transfektion konnte eine Inhibition der 5-LO-Aktivität nach Kotransfektion mit jeweils einer Isoform gemessen werden. Nach stabiler Integration jedoch zeigte sich eine Steigerung der 5-LO-Produktbildung. Mit Hilfe von Western Blots wurden Expressionskontrollen angefertigt und die Menge des 5-LO-WT quantifiziert. In transient transfizierten Zellen wurde eine Erniedrigung der Expression des 5-LO-WT bestimmt, wohingegen in stabil integrierten Zellen ein Anstieg des 5-LO-WT als auch der Isoformen beobachtet werden konnte. Einerseits könnte dies einem Artefakt der Transfektionmethode zugrunde liegen, andererseits könnte es ein Hinweis darauf sein, dass sich die Proteine gegenseitig in ihrer Expression beeinflussen.
Ebenso wurde die Lokalisation der 5-LO und deren Isoformen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die 5-LO überwiegend im Zellkern lokalisiert ist, während alle alternativen Protein-Isoformen im Zytosol zu finden waren. Durch Ionophor-Behandlung wurde eine Translokation des 5-LO-WT an die Kernmembran detektiert, die Isoformen verblieben im Zytosol. Überraschenderweise konnte beobachtet werden, dass die Spleißvariante 5-LO∆13 mit höherer Ionophor-Konzentration ebenso in der Lage ist an die Kernmembran zu translozieren. Um eine mögliche Interaktion der 5-LO mit den Isoformen zu untersuchen, sollten alle Proteine im selben Zellkompartiment lokalisiert sein. Dafür wurden verschiedene Stimuli und Mutationen getestet. Mit der Mutante GFP-5-LO-S271A und dem Stressstimulus Sorbitol und den CaMKII/p38-Inhibotoren KN-93/SB203580 konnte eine Translokation in das Zytosol erreicht werden. Die Ergebnisse der anschließenden Aktivitätsassays zeigten, dass die Isoformen keinen Einfluss auf die Aktivität der 5-LO ausüben.
Des Weiteren wurden die Phosphorylierungen an S523 und S271 von 5-LO-WT, 5-LO∆13, 5-LO∆4 und 5-LOp12 untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die 5-LO-Proteine unterschiedliche Phosphorylierungsmuster aufweisen. Während 5-LO-WT und 5-LO∆4 eine schwache Phosphorylierung an S271 aufzeigen, konnte eine starke Phosphorylierung der 5-LO∆13 und 5-LOp12 detektiert werden. Im Vergleich dazu zeigte lediglich die Isoform 5-LOp12 eine sehr starke Bande an der Phosphorylierungsstelle S523. Bei beiden Phosphorylierungen konnten deutlich stärkere Signale nach Kotransfektion gemessen werden. Durch Klonierung eines P2A-Linkers zwischen 5-LO und des GFP-Tags, konnten die Isoformen vom 5-LO-WT in Western Blots voneinander getrennt werden. Dies zeigte, dass es zu einer Hochregulation der Expression der alternativen 5-LO-Varianten nach Kotransfektion mit dem WT führte, aber auch, dass die stärkere Phosphorylierung nach Kotransfektion unabhängig von der Proteinmenge ist.
Echolocation allows bats to orientate in darkness without using visual information. Bats emit spatially directed high frequency calls and infer spatial information from echoes coming from call reflections in objects (Simmons 2012; Moss and Surlykke 2001, 2010). The echoes provide momentary snapshots, which have to be integrated to create an acoustic image of the surroundings. The spatial resolution of the computed image increases with the quantity of received echoes. Thus, a high call rate is required for a detailed representation of the surroundings.
One important parameter that the bats extract from the echoes is an object’s distance. The distance is inferred from the echo delay, which represents the duration between call emission and echo arrival (Kössl et al. 2014). The echo delay decreases with decreasing distance and delay-tuned neurons have been characterized in the ascending auditory pathway, which runs from the inferior colliculus (Wenstrup et al. 2012; Macías et al. 2016; Wenstrup and Portfors 2011; Dear and Suga 1995) to the auditory cortex (Hagemann et al. 2010; Suga and O'Neill 1979; O'Neill and Suga 1982).
Electrophysiological studies usually characterize neuronal processing by using artificial and simplified versions of the echolocation signals as stimuli (Hagemann et al. 2010; Hagemann et al. 2011; Hechavarría and Kössl 2014; Hechavarría et al. 2013). The high controllability of artificial stimuli simplifies the inference of the neuronal mechanisms underlying distance processing. But, it remains largely unexplored how the neurons process delay information from echolocation sequences. The main purpose of the thesis is to investigate how natural echolocation sequences are processed in the brain of the bat Carollia perspicillata. Bats actively control the sensory information that it gathers during echolocation. This allows experimenters to easily identify and record the acoustic stimuli that are behaviorally relevant for orientation. For recording echolocation sequences, a bat was placed in the mass of a swinging pendulum (Kobler et al. 1985; Beetz et al. 2016b). During the swing the bat emitted echolocation calls that were reflected in surrounding objects. An ultrasound sensitive microphone traveling with the bat and positioned above the bat’s head recorded the echolocation sequence. The echolocation sequence carried delay information of an approach flight and was used as stimulus for neuronal recordings from the auditory cortex and inferior colliculus of the bats.
Presentation of high stimulus rates to other species, such as rats, guinea pigs, suppresses cortical neuron activity (Wehr and Zador 2005; Creutzfeldt et al. 1980). Therefore, I tested if neurons of bats are suppressed when they are stimulated with high acoustic rates represented in echolocation sequences (sequence situation). Additionally, the bats were stimulated with randomized call echo elements of the sequence and an interstimulus time interval of 400 ms (element situation). To quantify neuronal suppression induced by the sequence, I compared the response pattern to the sequence situation with the concatenated response patterns to the element situation. Surprisingly, although the bats should be adapted for processing high acoustic rates, their cortical neurons are vastly suppressed in the sequence situation (Beetz et al. 2016b). However, instead of being completely suppressed during the sequence situation, the neurons partially recover from suppression at a unit specific call echo element. Multi-electrode recordings from the cortex allow assessment of the representation of echo delays along the cortical surface. At the cortical level, delay-tuned neurons are topographically organized. Cortical suppression improves sharpness of neuronal tuning and decreases the blurriness of the topographic map. With neuronal recordings from the inferior colliculus, I tested whether the echolocation sequence also induced neuronal suppression at subcortical level. The sequence induced suppression was weaker in the inferior colliculus than in the cortex. The collicular response makes the neurons able to track the acoustic events in the echolocation sequence. Collicular suppression mainly improves the signal-to-noise ratio. In conclusion, the results demonstrate that cortical suppression is not necessarily a shortcoming for temporal processing of rapidly occurring stimuli as it has previously been interpreted.
Natural environments are usually composed of multiple objects. Thus, each echolocation call reflects off multiple objects resulting in multiple echoes following the calls. At present, it is largely unexplored how neurons process echolocation sequences containing echo information from more than one object (multi-object sequences). Therefore, I stimulated bats with a multi-object sequence which contained echo information from three objects. The objects were different distances away from each other. I tested the influence of each object on the neuronal tuning by stimulating the bats with different sequences created from filtering object specific echoes from the multi-object sequence. The cortex most reliably processes echo information from the nearest object whereas echo information from distant objects is not processed due to neuronal suppression. Collicular neurons process less selectively echo information from certain objects and respond to each echo.
For proper echolocation, bats have to distinguish between own biosonar signals and the signals coming from conspecifics. This can be quite challenging when many bats echolocate adjacent to each other. In behavioral experiments, the echolocation performance of C. perspicillata was tested in the presence of potentially interfering sounds. In the presence of acoustic noise, the bats increase the sensory acquisition rate which may increase the update rate of sensory processing. Neuronal recordings from the auditory cortex and inferior colliculus could strengthen the hypothesis. Although there were signs of acoustic interference or jamming at neuronal level, the neurons were not completely suppressed and responded to the rest of the echolocation sequence.
In der vorliegenden Arbeit wurde ein integrativer Netzwerkmodellierungsansatz gewählt, um die Rolle des Endothels im Kontext der Arteriosklerose zu untersuchen. Hierbei wurden bioinformatische Analysen, laborexperimentelle Versuche und klinische Daten vereinigt und aus dieser Synthese neue klinisch relevante Gene identifiziert und beschrieben.
Das Endothel trägt maßgeblich zur Homöostase des vaskulären Systems bei und eine Dysfunktion des Endothels fördert die Entstehung der Arteriosklerose. Im Zuge der Atherogenese entstehen vermehrt reaktive Sauerstoffspezies, die Lipide in der Membran von Plasma-Lipoprotein-Partikeln und in der zellulären Plasmamembran oxidieren. Eine Gruppe solcher oxidierter Membranlipide ist oxPAPC, das in erhöhter Konzentration in arteriosklerotischen Plaques und lokal an Orten chronischer Entzündung im vaskulären System vorkommt. Weitherhin findet sich diese Gruppe von oxidierten Phospholipiden in oxidierten LDL-Partikeln, in denen oxPAPC die Bindung an Makrophagen vermittelt und hierdurch maßgeblich zur Bildung der Schaumzellen und damit zum arteriosklerotischen Prozess beiträgt. Die durch oxPAPC verursachte Veränderung der Endothelzelle ist bisher wenig erforscht. Es ist jedoch bekannt, dass oxPAPC die Transkriptionslandschaft in Endothelzellen tiefgreifend verändert. Um der Komplexität der Endothelzellveränderung gerecht zu werden, wurde ein bayesscher Ansatz angewendet.
In einem ersten Schritt wurden Expressionsprofile von humanen Aortenendothelzellen (HAEC) aus 147 Herztransplantatspendern verwendet. Diese Expressionprofile enthalten Transkriptionsinformationen der 147 HAEC, die mit oxPAPC oder Kontrollmedium behandelt worden waren. Es wurden signifikant koexprimierte Gene identifiziert und hiervon Gen-Paare berechnet, die einen differentiellen Vernetzungsgrad zwischen Kontroll- and oxPAPC-Status aufweisen. Dieses Netzwerkmodell gibt darüber Aufschluss, welche Gene miteinander in Verbindung stehen. 26759 Gene-Paare, die differentiell verbunden und signifkant koexprimiert waren, wurden hierarchisch gruppiert. Es wurden neun Gen-Gruppen mit einer erhöhten und elf Gen-Gruppen mit einer verminderten Konnektivität nach oxPAPC identifiziert. Gruppe 6 der erhöhten Konnektvitäts-Gruppen wies hierbei die höchste kohärente Konnektivität von allen Gruppen auf. Eine Analyse signifikant überrepräsentierter kanonischer Gensätze ergab, dass diese Gruppe insbesondere Serin-Glycin-Aminosäuremetabolismus, tRNA- und mTOR-Aktivierung wiederspiegelte. Der hier gewählte Netzwerkmodellierungsansatz zeigte auf, dass der Aminosäuremetabolismus durch oxidizerte Phospholipide massiven Veränderungen unterworfen ist.
Um den Mechanismus der Veränderung des Aminosäuremetabolismus näher zu untersuchen, wurden bayessche Netzwerkmodelle verwendet. Dieses Netzwerkmodell enthält im Gegensatz zum differentiellen Koexpresssionsmodell gerichtete Informationen innerhalb des Netzwerkgraphes. Die Gen-Gen Verbindungen sind kausal, wodurch sich eine Hierarchie bildet und Schlüsselfaktoren innerhalb des Netzwerks bestimmt werden können. Durch die Integrierung von Expressionsprofilen und Genomprofilen derselben HAEC-Kohorte und der Inferenz von kausalen Gen-Gen-Verbindungen ergaben sich zwei bayessche Netze: Kontroll- und oxPAPC-Netzwerk. Permutationsuntersuchungen und systematische Beurteilung im Vergleich zu Gen-Gen-Verbindungen in Online-Datenbanken zeigten eine erhöhte Prognosefähigkeit der beiden HAEC bayesschen Netze. Es wurden die Schlüsselfaktoren und deren Teilnetzwerke berechnet und auf biologische Wege hin untersucht. Hierbei wurde das mitochondriale Protein MTHFD2 als ein Schlüsselfaktor für ein Teilnetzwerk des oxPAPC bayesschen Netzes identifiziert. Dieses Teilnetz zeigte eine ähnliche Gensatzanreicherung wie GOC-AA und überlappte mit diesem signifikant.
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The objectives of this thesis were to understand how distinct classes of cell types interact to shape oscillatory activity in cortical circuits of the turtle. We chose the turtle cortex as a model system for cortical computations for two reasons. One is that the phylogenetic position of turtles makes their cortex functionally and anatomically particularly interesting. The second is that reptilian brains present several unique experimental advantages. Turtles have a three-layered cortex that forms the dorsalmost part of their pallium and receives direct input from visual thalamus. Thus turtle cortex, while sharing several features with mammalian cortices, constitutes a simpler system for studying cortical computations and dynamics. Freshwater turtles are semiaquatic species, that dive for hours and hibernate for months without breathing. Their brains are adapted to these behaviors so that they can operate under severe anoxia. This property allows for ex vivo wholebrain and whole-cortex (”cortical slab”) preparations in vitro, enabling the use of many sophisticated techniques for monitoring activity in parallel.
I thus set out to utilize the advantages of our model system, by using optogenetic methods to reliably evoke oscillations in an ex vivo whole-cortex preparation while observing activity in parallel with planar multi-electrode arrays (MEA), linear silicon depth-electrodes and patch-clamp recording techniques. This required several technical aspects to be solved. Prior work in turtle cortex (Prechtl, 1994; Prechtl et al., 1997; Senseman and Robbins, 2002) indicated that visual stimuli evoke complex activity patterns (e. g. wave patterns) in dorsal cortex. The goal was to examine these dynamics in detail and to provide mechanistic explanations for them whenever possible. The recent advent of optogenetics, the development of microelectrode arrays, and the possibility to combine these techniques with classical electrophysiological approaches on a resistant, accessible and stable preparation led me to explore a number of technical avenues.
First I had to establish gene delivery methods in reptiles. I settled on recombinant viruses, and show results from several serotypes of adeno-associated virus (AAV), i lentivirus and rabies virus. I report successful gene expression of genes of interest with several subtypes of AAV, including the commonly used AAV2/1 and AAV2/5 serotypes. Second I had to find promoters enabling global and cell-type specific gene expression in reptiles. Ubiquitous high-yield promoters such as CAG/CB7 or CMV drive high levels of expression in turtles; cell-type specific promoters such as hSyn (expression limited to neurons) and CaMKIIa (expression limited exclusively o mostly to excitatory neurons) appear similarly biased in turtles. Other cell-type specific promoters reported in the literature (fNPY, fPV, fSST) failed to express in turtles.
A second major aspect of my work focused on electrophysiological recordings using microelectrode arrays and the interpretation of extracellular signals recorded from cortex in ex vivo preparations. We observed that spike signals produced by pyramidal and inhibitory neurons were very often followed by a slower potential. We identified these slower potentials as reflections of synaptic currents, and thus of the axonal projections of the neurons, at least within the deep layers of cortex. This also resulted in a means to classify neurons as excitatory or inhibitory with much higher reliability than classical methods (e. g. spike width). The final aspect of my work concerns the use of optogenetics to dissect the mechanisms of cortical oscillations and wave propagation. I show that oscillations can be induced by light in turtle cortex after transfection with AAV2/1 carrying the gene for channelrhodopsin 2 (ChR2). By using the CaMKIIa promoter, ChR2 induced currents are limited to LII/III excitatory cells; we can therefore control excitatory drive to cortical networks. If this drive is strong enough, layer III inhibitory interneurons are recruited and fire in a concerted fashion, silencing the excitatory population. The visually evoked 20 Hz oscillations observed in chronically recorded animals (Schneider, 2015) or in anaesthetized animals (Fournier et al., in press) thus appear to result from a feedback loop between E and I cells within layers II & III. Details of these interactions are being investigated but - layer I interneurons, by contrast, do not seem to be involved. By pulsing light I could control the frequency of the oscillations within a range of several Hz around the natural oscillation frequency. Above this range, cortex could only follow the stimulus at a fraction (1/2, 1/3,...) of the light pulse frequency. Using a digital micromirror device, I limited activation of the cortical networks spatially, enabling the study of wave propagation in this system.
Reptilian cortex offers a relatively simple model system for a reductionist and comparative strategy on understanding cortical computations and dynamics. Turtle dorsal cortex could thus give fundamental insights to the primordial organization tional, computational and functional principles of cortical networks. These insights are relevant to our understanding of mammalian brains and may prove valuable to decipher fundamental questions of modern neuroscience.
Die Entwicklung von neuartigen, funktionellen Materialien ist eine komplexe Aufgabe, da die Gesamteffizienz der zu entwickelnden Materialien von einer Vielzahl von Faktoren abhängt. Während die auf einer molekularen Ebene durchgeführte Funktionalisierung via chemischer Reaktionsführung genauso wichtig ist wie die makromolekulare Anordnung, kann die Frage nach einer geeigneten Verbesserung von gegenwärtigen Materialien nicht nur auf einer dieser beiden Ebenen beantwortet werden. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse basieren auf der mirkoskopischen aber auch markoskopischen Betrachtung von neuartigen, funktionellen Nanomaterialien und den daraus gewonnenen Erkenntnissen. Das übergeordnete Ziel ist dabei das Verständnis und die Charakterisierung von Ladungsseparationsprozessen und die daraus resultierende Erzeugung von elektrischen Strömen in organischen photovoltaischen Materialien.
Die relevanten Ladungsseparationsprozesse werden oft im Kontext der Dissoziation von Exzitonen, gebundenen Elektron-Loch Paaren, beschrieben, welche innerhalb der Donordomäne eines beliebigen Donor-Akzeptor-Materials erzeugt werden. Dabei ist der Prozess der Exzitonengenerierung abhängig von der Nanomorphologie des entsprechenden Materials, typischerweise so genannten Bulk-Heterojunctions. Dahingehend ist es notwendig, die Effekte von intermolekularen Wechselwirkungen sowohl mittels quantenmechanischer als auch dynamischer Methoden zu betrachten. Um alle relevanten Zeitskalen und Prozesse zu betrachten ist es weiterhin notwendig, auf sowohl eine deterministische Darstellung im Rahmen von quantendynamischen Methoden als auch statistischen Methoden zurückzugreifen.
Um die oft ultraschnellen und kohärenten Exzitonendissoziationsprozesse zu untersuchen wurde eine Kombination aus high-level ab initio Methoden und zeitabhängiger Dichtefunktionaltheorie (TDDFT) angewandt, um geeignete Modellhamiltonians zu parametrisieren, welche schließlich mittels der Multi-Configurational Time-Dependent Hartree (MCTDH) und der Multilayer (ML-MCTDH) variante propagiert wurden. Die MCTDH Methode hat sich als geeignete Methode erwiesen um eine voll quantendynamische Beschreibung von bis zu 100 Freiheitsgraden durchzuführen; die ML-MCTDH Methode erlaubt gar bis zu 1000 Freiheitsgrade quantendynamisch zu behandeln. Die Parametrisierung der Modellhamiltonians, auf welchen die quantendynamische Behandlung basiert, wurde dabei für kleine, jedoch repräsentative Fragmente durchgeführt. Die geeignete Wahl dieser Fragmente sollte sicherstellen, dass zum einen alle relevanten intermolekularen als auch intramolekularen Wechselwirkungen enthalten sind, jedoch gleichzeitig eine möglichst akkurate Beschreibung mittels high-level elektronenstrukturtheoretischer Methoden in gegebener Zeit möglich ist.
Mit Hilfe dieser Methodenkombination wurden zwei Arten von funktionellen organischen Materialien untersucht. Das erste untersuchte System ist ein neuartiges Donor-Akzeptor System, bestehend aus selbstorganisierenden Oligothiophen-Perylenediimid Dimeren, welche in der Gruppe von S. Haacke und S. Mery der Universität Straßburg synthetisiert und spektroskopisch untersucht wurden. Die quantendynamischen Simulationen an diesem System sollten die Ergebnisse der experimentellen, zeitaufgelösten pump-probe Spektroskopie validieren und die dürftige Effizienz im Hinblick auf eine effektive Ladungstrennung erklären. Dabei konnte gezeigt werden, dass nach der Exzitonendissoziation Elektron und Loch auf räumlich benachbarten Donor- und Akzeptorfragmenten lokalisiert werden, was schließlich zu einem Rekombinationsprozess führen wird. Das zweite untersuchte System ist eine Kombination von Poly(3-Hexylthiophen-2,5-diyl) (P3HT) als Elektronendonor und [6,6]-Phenyl-C61 Butansäure Methyl-Ester (PCBM) als Elektronenakzeptor, welches schon hinreichend stark in diversen theoretischen und experimentellen Studien untersucht wurde. Aufbauend auf einem Gittermodell, welches in unserer Gruppe entwickelt wurde, wurde das Modellsystem um Charge Transfer Exzitonen in der Donordomäne erweitert. Die Bedeutung von solchen Charge Transfer Exzitonen in regioregulären Oligothiophenaggregaten ist ein aktuelles Thema in der Wissenschaft, sowohl in experimentellen aber auch theoretischen Abhandlungen. Neben der theoretischen Beschreibung zur Entstehung solcher Charge Transfer Exzitonen liegt ein besonderes Augenmerk auf dem Einfluss dieser predissoziierten Elektron-Loch Paaren auf die Ladungsseparationsdynamik zwischen Donor und Akzeptor sowie die Generierung von freinen Ladungsträgern. Dieser Aspekt der Ladungsseparation in einem P3HT-PCBM System wurde in dieser Art und Weise in dieser Arbeit zum ersten mal untersucht.
Neben dem zuvor erwähnten Donor-Akzeptor System erster Generation der Universität Straßburg wurde eine zweite Variante dieses Systems entwickelt, welches sich bei bisherigen experimentellen Untersuchungen als wesentlich effizienter erwies. Der interessante Prozess der Ladungsseparation ist dabei allerdings auf einer Zeitskala von mehreren hundert Pikosekunden angesiedelt, sodass kinetische Monte Carlo Methoden verwendet werden mussten um diese Prozesse zu modellieren. Dazu wurde ein Fortran90 Code entwickelt, welcher den First Reaction Method Algorithmus verwendet und explizite Delokalisationsprozesse behandelt, welche in dieser Form in kommerziellen Programmpaketen nicht enthalten ist. In vorangehenden Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Delokalisation von Exzitonen zu einer effektiven Herabsetzung der energetischen Barriere der Ladungsseparation führt und somit die Effizienz zur Stromumwandlung gesteigert werden konnte. Erste Simulationen mit diesem Code an idealisierten und zufällig generierten Donor-Akzeptor Morphologien lieferten realistische Werte für makroskopische Observablen wie Ladungsträgermobilitäten. Weiterhin wurden Simulationen einer coarse-grained Struktur zur zweiten Generation des Donor-Akzeptor Systems durchgeführt, ebenfalls mit Hinblick zur Untersuchung der Ladungsträgermobilität.
Tissue integrity is defined by the composition and connection of cells as a structural and functional unit. It is modulated by a magnitude of processes including differentiation, survival, controlled death and adhesion of cells. Besides, external factors such as physical forces are also involved. A suitable model system to study all modalities of tissue integrity is the mammary gland. Postnatally and within the reproductive phase, the mammary gland undergoes morphological and functional modifications that periodically loosen or strengthen tissue integrity. An important point in the development of the mammary gland is the regression during weaning, also termed involution. The transition from lactation to involution is important for a controlled loss of tissue integrity. In this transition, collective cell death is initiated but not yet prominent enabling the mammary gland to fully recover lactation.
In this thesis, modalities of tissue integrity were investigated using three-dimensional cell cultures (i.e. spheroids) and the mammary gland as model systems. In the context of this thesis, I established (1) an immunofluorescence staining protocol and its detailed evaluation. Furthermore, I studied (2) the role of cell survival during mammary gland development, (3) the effect of physical forces that modulate tissue integrity and (4) the contribution of proteins to cell adhesion and growth.
Since a homogeneous fluorescence stain of the specimen is necessary for quantitative analysis, an immunofluorescence staining protocol was established to stain large spheroids in toto. The evaluation contributes qualitative and quantitative criteria that judge the specificity, intensity and homogeneity of the stain. Based on this approach, it was possible to demonstrate the morphological and functional characteristics that spheroids share with the mammary gland in vivo. These characteristics included the synthesis of extracellular matrix, the development of polarized acinar structures and lactogenic differentiation.
The role of cell survival during mammary gland development was analyzed by means of the expression profile of the pro-survival protein BAG3. The expression of BAG3 differed in the progress of mammary gland development. While the expression was low during pregnancy, it rose in the lactation phase and peaked within the first days of involution, indicating that BAG3 is associated with early involution in the mammary gland. In vitro experiments related the expression of BAG3 to cell survival in mammary epithelial cells.
Physical forces naturally occur during developmental processes influence tissue integrity during the initiation of mammary gland involution. The influence of physical force applied as compression on mammary epithelial spheroids was investigated. A morphological analysis showed that following a lag, the cell nuclei volume changed upon compression. A short-term compression induced the activation of caspases. A prolonged compression reduced the activity of caspases. This suggests the induction of a process that allows cells the adaption to changing environmental conditions. BAG3 is known to be involved in mechanical stress-induced autophagy, also known as chaperone assisted selective autophagy (CASA). Compression of spheroids did not induce CASA. The experimentally applied strain was not comparable to the strain found in the alveolar cells during involution in vivo. Thus, whether or not CASA is activated during mammary gland involution remains elusive. Nevertheless, the methodical approach to apply compression on spheroids in vitro is a model to study the influence of physical forces on cell aggregates.
Apart from cell survival and physical forces, growth and adhesion of cells affect tissue integrity. A spheroid formation assay and subsequent data analysis and computational modeling enabled the investigation of these processes in a non-adhesive environment. The analysis suggested that spheroid formation follows a reaction-controlled process, in which cells do not necessarily form a connection when they collide. The loss of function of either E-cadherin or actin strongly inhibited the formation of a spheroid. The analysis further revealed that neither E-cadherin nor actin influence the chance of the cells to form a connection when they collide. Both molecules are more important in stabilizing established connections. Depolymerization of microtubules still allowed spheroids to form, but the formation was decelerated and growth of the final spheroids was inhibited. The results from computational modeling suggested that microtubules act on cell adhesion through different mechanisms, which also vary among different cell types. The inhibition of FAK phosphorylation at Y397, a downstream target of integrin signaling, and the analysis of FAK protein levels in spheroids showed that integrin-mediated signaling is not prominent in three-dimensional spheroids formed from non-invasive cells. A deletion of BAG3 gene expression increased the number of dead cells in forming spheroids suggesting that BAG3 predominantly affects cell survival.
The results of this thesis identified and characterized adhesion- and survival-associated proteins that are important for tissue integrity. This thesis suggests that a BAG3-dependent cell survival mechanism is prominent at the beginning of mammary gland involution. Future studies will have to identify the related factors and inducers of tissue integrity loss in the mammary gland. This will shed light on the physiology of the organ and could explain the disorders that destroy its integrity. In addition, this thesis contributes to a better understanding of spontaneous cell aggregation, the aggregate organization and implies a role of cell migration in these processes. Future studies that focus on three-dimensional cell migration could explain, how cell migration is promoted and to which extent it supports tissue integrity.
Cardiovascular disease is the leading cause of death worldwide. Aging is among the greatest risk factors for cardiovascular disease. Cardiovascular disease comprises several diseases, for example myocardial infarction, elevated blood pressure and stroke. Many processes are known to promote or worsen cardiovascular disease and in the present study, cellular senescence and inflammatory activation were of special interest, as they have a strong association to aging and can be seen as hallmarks of cellular aging.
Long noncoding RNAs (lncRNAs) are noncoding RNAs with a length of more than 200 nucleotides. In recent years, numerous regulatory functions were shown for these transcripts and lncRNAs were shown to directly interact with DNA, RNA and proteins. The long noncoding RNA H19 was among the first described noncoding RNAs and was initially shown to act as a tumor suppressor. More recently, several studies showed oncogenic roles for H19. In regards to the cardiovascular system, H19 was not analyzed before.
We show that H19 is the most profoundly downregulated lncRNA in endothelial cells of aged mice compared to young littermates. Microarray analysis of human primary endothelial cells upon pharmacological H19 depletion revealed an involvement of H19 in cell cycle regulation. Loss of H19 in human endothelial cells in vitro led to reduced proliferation and to increased senescence. H19 depletion was shown to counteract proliferation before, but none of the described mechanisms applied to endothelial cells. We show that the reduction in proliferative capacity and the pro-senescent function of H19 is most probably mediated by an upregulation of p16ink4A and p21 upon H19 depletion.
When we compared the angiogenic capacity of aortic endothelial cells from young and aged mice in an aortic ring assay, rings from aged mice showed a reduced cumulative sprout length. Interestingly, pharmacological inhibition of H19 in aortic rings of young animals, where H19 is highly expressed, was sufficient to reduce the cumulative sprout length to levels we observed from aged animals. Furthermore, overexpression of human H19 in aortic rings of aged mice, where H19 is poorly expressed, rescued the impaired angiogenic capacity of aged endothelial cells.
We generated inducible endothelial-specific H19 knockout mice (H19iEC-KO) and subjected these animals to hind limb ischemia surgery followed by perfusion analysis in the hind limbs by laser-doppler velocimetry and histological analysis. Perfusion in the operated hind limb was increased in H19iEC-KO compared to Ctrl littermates, which was in contrast to a reduction in capillary density in the operated hind limbs of H19iEC-KO animals compared to Ctrl littermates and to our previous results. Analysis of arteriogenesis revealed an increase in collateral growth upon EC-specific H19 depletion in the ischemic hind limbs, which explains the increase in perfusion despite the reduction in capillary density. Further characterization of the animals revealed an increase in leukocyte infiltration into the tissue in the ischemic hind limbs upon endothelial-specific H19 depletion, indicating a potential role of H19 in inflammatory tissue activation.
Reanalysis of the microarray data from human primary endothelial cells upon H19 depletion revealed an association of H19 with inflammatory signaling and more specifically with IL-6/JAK2/STAT3 signaling. Analysis of cell surface adhesion molecule expression revealed an upregulation of ICAM-1 and VCAM-1 on mRNA level and an increase of the abundance of the two proteins on the cell surface of human primary endothelial cells. Consequently, adhesion of isolated human monocytes to human primary endothelial cells was increased upon H19 depletion in vitro. Interestingly, TNF-α mediated inflammatory activation of primary human endothelial cells repressed H19 expression. H19 did not function via previously described mechanisms. We excluded a competitive endogenous RNA (ceRNA) function for H19 in endothelial cells and showed that miR-675, which is processed from H19, does not play a role in the endothelium. Furthermore, H19 did not regulate previously described genes or pathways.
Analysis of transcription factor activity upon H19 depletion and overexpression revealed a differential activity of STAT3. STAT3 phosphorylation at TYR705 and thus activation was increased upon H19 depletion. Inhibition of STAT3 activation using a small compound inhibitor abolished the effects of H19 depletion on mRNA expression of p21, ICAM-1 and VCAM-1 and on proliferation, indicating that the effects of H19 are at least partially mediated via STAT3. STAT3 was shown to have positive effects on the cardiovascular system before, most likely due to upregulation of VEGF in a STAT3-dependent manner. We were not able to confirm previously described mechanisms for STAT3 in the present study and propose a new mechanism of action for the H19-dependent regulation of STAT3. Taken together, these results identify the long noncoding RNA H19 as a pivotal regulator of endothelial cell function. Figure 38 summarizes the described functions of H19 in endothelial cells.
Heat stress transcription factors (Hsfs) play essential role in heat stress response and thermotolerance by controlling the transcriptional activation of heat stress response (HSR) genes including molecular chaperones. Plant Hsf families show a striking multiplicity, with more than 20 members in the many plant species. Among Hsfs, HsfA1s act as the master regulators of heat stress (HS) response and HsfA2 becomes one of the most abundant Hsfs during HS. Using transgenic plans with suppressed expression of HsfA2 we have shown that this Hsf is involved in acquired thermotolerance of S. lycopersicum cv Moneymaker as HsfA2 is required for high expression and maintenance of increased levels of Hsps during repeated cycles of HS treatment.
Interestingly, HsfA2 undergoes temperature-dependent alternative splicing (AS) which results in the generation of seven transcript variants. Three of these transcripts (HsfA2-Iα-γ), generated due to alternative splicing of a second, newly identified intron encode for the full length protein involved in acquired thermotolerance. Another 3 transcripts (HsfA2-IIIα-γ) are generated due to alternative splicing in intron 1, leading in all cases to a premature termination codon and targeting of these transcripts for degradation via the non-sense mRNA decay mechanism (NMD).
Interestingly, excision of intron 2, results into the generation of a second previously unreported protein isoform, annotated as HsfA2-II. HsfA2-II shows similar transcriptional activity to the full-length protein HsfA2-I in the presence of HsfA1a but lacks the nuclear export signal (NES) required for nucleocytoplasmic shuttling which allows efficient nuclear retention and stimulation of transcription of HS-induced genes. Furthermore, stability assays showed that HsfA2-II exhibits lower protein stability compared to HsfA2-I.
The presence of a second intron and the generation of a second protein isoform we identified in other Solanaceae species as well. Remarkably, we observed major differences in the splicing efficiency of HsfA2 intron 2 among different tomato species. Several wild tomato accessions exhibit higher splicing efficiency that favors the generation of HsfA2-II, while in these species the splice variant HsfA2-Iγ is absent. This natural variation in splicing efficiency specifically occurring at temperatures around 37.5oC is associated with the presence of 3 intronic polymorphisms. In the case of wild species these polymorphisms seemingly restrict the binding of RS2Z36, identified as a putative splicing silencer for HsfA2 intron 2.
Tomato accessions with the polymorphic “wild” HsfA2 show enhanced thermotolerance against a direct severe heat stress incident due to the stronger increase of Hsps and other stress induced genes. Introgression of the “wild” S. pennellii HsfA2 locus into the cultivar M82, resulted in enhanced seedling thermotolerance highlighting the potential use of the polymorphic HsfA2 for breeding.
We conclude that alterations in the splicing efficiency of HsfA2 have contributed to the adaption of tomato species to different environments and these differences might be directly related to natural variation in their thermotolerance.
The adult mammalian heart is unable to regenerate lost myocardial tissue after injury. In contrast, some lower vertebrates including zebrafish are able to undergo complete epimorphic regeneration following multiple types of cardiac injury. During the process of regeneration, spared zebrafish cardiomyocytes in the vicinity of the injured area undergo dedifferentiation and proliferation, thereby giving rise to new cardiomyocytes which replace the injured muscle. Insights into the molecular networks controlling these regenerative processes might help to develop novel therapeutic strategies to restore cardiac performance in humans.
While TGF-β signaling has been implicated in zebrafish cardiac regeneration, the role of individual TGF-β ligands remains to be determined. Here, I report the opposing expression response of two TGF-β ligand genes, mstnb and inhbaa, during zebrafish heart regeneration. Using gain- and loss-of-function approaches, I show that these ligands exert opposite effects on cardiac regeneration and specifically on cardiomyocyte proliferation. Notably, I show that overexpression of mstnb and loss of inhbaa negatively regulate cardiomyocyte proliferation and therefore disturb cardiac regeneration. In contrast, loss of mstnb and activation of inhbaa not only promote physiological cardiomyocyte proliferation but also enhance cardiac regeneration. I also identify Inhbaa as a mitogen which promotes cardiomyocyte proliferation independent of the well-established Nrg-ErbB signaling. Mechanistically, I unraveled that Mstnb and Inhbaa function through alternate Activin type 2 receptor complexes to control the activities of the signal transducers, Smad2 and Smad3, thereby regulating cardiomyocyte proliferation.
Altogether, I reveal novel and unidentified opposite functions of two TGF-β ligands during cardiac development and regeneration, resulting in a pro-mitogenic as well as an anti-mitogenic effect on cardiomyocytes. This study should therefore stimulate further research on targeting specific TGF-β family members to generate novel regenerative therapeutic strategies.
Taxonomy, phylogeny and zoogeography of the hexaploid Torini of the Middle East and North Africa
(2017)
Fishes of the tribe Torini Karaman, 1971 (Teleostei: Cyprinidae) are a diverse group of primary freshwater fishes, distributed in Africa, the Middle East, and Indomalaya. They are an important component of the native freshwater-fish fauna of the Middle East and North Africa, and occur in most large river systems of the Levant, Arabia, Mesopotamia, southern Iran, and Morocco. They belong to the subfamily Cyprininae, are characterised by being tetraploid or hexaploid, having large scales, and a smooth and ossified last unbranched ray in the dorsal fin. As primary freshwater fishes they are not able to tolerate marine conditions and depend on direct freshwater connections for their dispersal. This makes them an ideal model for zoogeographic studies.
Prior to this study, the diversity of the Torini species in the Middle East and North Africa was not well understood. The validity of several genera and species was unclear, and the generic assignment of several species changed frequently.
In this PhD project the taxonomy, phylogeny, and zoogeography of the Torini of the Middle East and North Africa were investigated with morphological, as well as molecular methods. More than 1550 fish specimens were examined morphologically. Some of the specimens, including the types of most nominal species, were already available from museum collections. The remaining specimens were collected during expeditions to Ethiopia, Iran, Jordan, Morocco and Syria. Tissue samples were collected for molecular genetic analyses. The mitochondrial genes for cytochrome b, NADH dehydrogenase subunit 4 and the tRNAs for serine and histidine were sequenced from more than 120 specimens, representing 20 species of Torini and two small, diploid African barbs (Cyprinidae, tribe Smiliogastrini). Molecular data were analysed with Bayesian inference and other methods.
The analyses confirmed that the hexaploid Torini of Africa and the Middle East form a monophyletic group. In the Middle East and North Africa the Torini are represented by the genera Arabibarbus, Carasobarbus, Mesopotamichthys, and Pterocapoeta. These genera are each morphologically diagnosable, monophyletic, and genetically distinct. The species 'Labeobarbus' reinii cannot be assigned to any of these genera, because it is morphologically dissimilar and genetically clearly separated from each of them. A generic name for this species is presently not available and until the description of a new genus it is preliminarily assigned to the genus 'Labeobarbus'.
Out of the 28 species-group taxa described from the Middle East and North Africa until now, 15 are valid: Arabibarbus arabicus, A. grypus, A. hadhrami, Carasobarbus apoensis, C. canis, C. chantrei, C. exulatus, C. fritschii, C. harterti, C. kosswigi, C. luteus, C. sublimus, Mesopotamichthys sharpeyi, Pterocapoeta maroccana, and 'Labeobarbus' reinii.
The phylogenetic relationships between the Middle Eastern and North African Torini are well resolved, based on the analysis of mitochondrial DNA sequences from nearly all relevant species.
The interspecific and intraspecific morphological and genetic diversity is shaped by the zoogeographic history. Conclusions can be drawn about the events that shaped the evolution of this group. The Torini originated in the Indomalayan biogeographical realm and colonised the Middle East and Africa during the Miocene via the Gomphotherium landbridge. The Indomalayan Torini are tetraploid, whereas those of the Middle East and Africa are hexaploid. Molecular phylogenetic analyses showed that the hexaploid Torini cluster within the tetraploid Torini. This makes the tetraploid Torini a paraphyletic group with respect to the hexaploid Torini. Morocco was colonised in two independent waves. The first came from sub-Saharan Africa and is represented by Pterocapoeta maroccana. The second originated in the Middle East and gave rise to C. fritschii, C. harterti, and probably 'L.' reinii. The Tigris-Euphrates system is the largest freshwater system in the Middle East. Its central position between the Orontes River and Jordan River in the West, the Iranian tributaries to the Persian Gulf in the East, and the Arabian Peninsula in the South made it an important crossroad for the colonisation of the Middle East by Torini and other freshwater biota. During the Miocene the predecessors of the Jordan and Orontes rivers were connected to the Tigris-Euphrates system. The Jordan River was separated from the Euphrates before the Orontes. Arabia was colonised in two waves. The first (A. arabicus, A. hadhrami, C. exulatus) dates to the Pliocene, whereas the second (C. apoensis) ended as recently as the late Pleistocene or early Holocene.
Tissue size regulation is critical for the normal functioning of the organ as well as to prevent unwanted pathogenesis such as cancer. The Hippo signaling pathway is well known for its robust regulation of tissue growth by the negative regulation of its nuclear effectors YAP1 and WWTR1. In this study, I have described the role of Yap1/Wwtr1 in zebrafish development, with a primary emphasis on the cardiovascular system.
I have generated zebrafish yap1 and wwtr1 mutants by CRISPR/CAS9. The mutant alleles are likely to be nonfunctional due to a premature stop codon and they show evidence of nonsense-mediated decay. Given that Yap1 and Wwtr1 are closely related proteins and have overlapping functions, I am given the opportunity to perform combinatorial analysis of the mutations on zebrafish development. Together with molecular probing tools, high-throughput sequencing and high-resolution imaging, I showed that
1. Double yap1;wwtr1 mutants exhibit severe posterior elongation phenotype, but somitogenesis appears to proceed as usual.
2. Yap1 and Wwtr1 may play an important role in PCV development and secondary angiogenic sprouting. However, key experiments will be needed to elucidate the direct role of Yap1 and Wwtr1 on these processes.
3. wwtr1-/- larvae hearts have a reduction in trabeculation, but in mosaic WT hearts, mutant cardiomyocytes prefer to populate the trabecular layer. My studies revealed that the mutant compact wall could not support trabeculation, which explains the hypotrabeculation phenotype of wwtr1-/- hearts. Additionally, Wwtr1 is required for myocardial Notch activity and can inhibit compact wall cardiomyocytes from entering the trabecular layer.
In summary, the Hippo signaling pathway, through Yap1/Wwtr1 has important regulatory functions in growth control. My work has revealed a surprising role for Yap1/Wwtr1 in tissue morphogenesis such as posterior tail morphogenesis and specific developmental processes of the cardiovascular system. It will be of interest to elucidate the regulation of Yap1/Wwtr1 in individual cells that translates into the complex cellular behaviors that drives morphogenesis.
Gepulste dipolare EPR-Spektroskopie ist eine wertvolle Methode, um Abstände von 1.5 bis 10 nm zwischen zwei Spinmarkern zu messen. Diese Information kann für Strukturbestimmungen hilfreich sein, wo traditionelle Methoden wie Kristallstrukturanalyse und NMR nicht angewendet werden können. Zusätzlich ist es möglich, Änderungen in Konformation und Flexibilität zu verfolgen. Für diese Studien haben sich stabile Nitroxidradikale als Spinmarker etabliert. Diese werden spezifisch durch die site-directed spin labelling Methode (SDSL) kovalent an das zu untersuchende Biomolekül gebunden. In den letzten Jahren wurden weitere Spinmarker für Abstandsbestimmungen mittels EPR-Spektroskopie entwickelt. Besonders interessant sind Triarylmethylradikale (im Folgenden abgekürzt als Trityl) und paramagnetische Metallzentren.
Im Vergleich zu Nitroxidradikalen hat das Tritylradikal einige Vorteile: Eine höhere Stabilität in einer reduzierenden Umgebung wie im Inneren von Zellen, längere Elektronenspin-Relaxationszeiten bei Raumtemperatur und ein schmaleres EPR-Spektrum. Deswegen ist dieses organische Radikal ein alternativer Spinmarker, der besonders gut für die Forschung von Biomolekülen in einer nativen Umgebung unter physiologischen Bedingungen geeignet ist. Auch paramagnetische Metallzentren sind weniger reduktionsempfindlich als Nitroxidradikale. Zusätzlich sind diese Spinmarker interessant in biologischen Fragestellungen. Zum Beispiel besitzen zahlreiche Enzyme paramagnetische Manganzentren als Cofaktoren. Zudem kann Magnesium, ein wesentlicher Cofaktor in Enzymen, Nukleinsäuren und Nukleotid-Bindungsdomänen der G- und Membranproteine, oft durch das paramagnetische Mangan ersetzt werden. Um Abstandsmessungen an Biomolekülen, die nur ein Metallzentrum besitzen, durchzuführen, können zusätzliche Spinmarker in Form eines Nitroxid-, Tritylradikals oder eines anderen paramagnetischen Metallkomplexes mithilfe der SDSL-Methode kovalent gebunden werden.
Nitroxidradikale, Tritylradikale und Metallzentren haben deutlich unterschiedliche EPR-spektroskopische Eigenschaften, welche oft als orthogonale Spinmarker bezeichnet werden. Solche Spinmarker sind nützlich für die Untersuchung von verschiedenen Untereinheiten bei makromolekularen Komplexen. Somit können die intramolekularen Abstände innerhalb einer Untereinheit sowie intermolekularen Abstände zwischen den unterschiedlichen Untereinheiten mit nur einer einzigen Probe bestimmt werden. Zusätzlich können die orthogonalen Marker sehr effektiv genutzt werden, um Metallzentren in Biomolekülen mithilfe der Trilateration-Strategie genau zu lokalisieren.
Die hier vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Nutzung dieser neuen Spinmarker für Abstandsmessungen. Solche Spinmarker sind noch kaum erforscht, obwohl sie für biologische Anwendungen eine große Rolle spielen könnten.
Das erste Ziel dieser Doktorarbeit war eine Studie über Tritylradikale mithilfe der dipolaren EPR-Spektroskopie. Zu diesem Zweck wurden sowohl double quantum coherence (DQC) und single frequency technique for refocussing dipolar couplings (SIFTER) Experimente als auch Hochfrequenz pulsed electron electron double resonance (PELDOR) Experimente mit einem Trityl-Modellsystem durchgeführt. Dabei wurden die Besonderheiten der unterschiedlichen dipolaren Spektroskopiemethoden mit diesem Spinmarker untersucht, um die Empfindlichkeit und Robustheit für die Abstandsmessungen zu optimieren.
Das zweite Ziel war eine Studie über den Einfluss der Hochspin-Multiplizität des Mangans auf die Abstandsbestimmungen. Für diesen Zweck wurde zuerst ein Modellsystem mit einem orthogonalen Mn2+ Ion und Nitroxidradikal mithilfe der PELDOR-Spektroskopie untersucht. Anschließend wurde ein weiteres Modellsystem mit zwei Mn2+-Ionen untersucht, um PELDOR und relaxation-induced dipolar modulation enhancement (RIDME) Experimente bezüglich ihrer Empfindlichkeit und Robustheit sowie Genauigkeit der Datenanalyse zu optimieren.
Das Trityl-Modellsystem wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Sigurdsson synthetisiert. Die EPR Messungen wurden bei zwei verschiedenen Mikrowellenfrequenzen (34 und 180 GHz) durchgeführt. Es wurde gezeigt, dass die Auswahl der optimalen Methode von den EPR-spektroskopischen Eigenschaften des Systems bei den jeweiligen Mikrowellenfrequenzen abhängig ist. Das EPR-Spektrum des Trityls ist bei 34 GHz so schmal, dass das ganze Spektrum von einem üblichen Mikrowellenpuls angeregt werden kann. In diesem Fall sind die DQC und SIFTER Experimente am besten geeignet. Der mit diesen Methoden bestimmte Abstand von 4.9 nm ist in guter Übereinstimmung mit Werten aus der Literatur. Es wurde festgestellt, dass die SIFTER Messung eine höhere Empfindlichkeit als DQC besitzt, da das Signal-zu-Rausch Verhältnis um den Faktor vier größer ist. Außerdem ist die SIFTER-Methode experimentell weniger anspruchsvoll, da ein deutlich kürzerer Phasenzyklus für die Mikrowellenpulse benötigt wird. ...
Research in cell and developmental biology requires the application of three-dimensional model systems that reproduce the natural environment of cells. Processes in developmental biology are therefore studied in entire systems like insects or plants. In cell biology, three-dimensional cell cultures (e.g. spheroids or organoids) model the physiology and pathology of cells, tissues or organs. In all systems, the cellular neighborhood and interactions, but also physicochemical influences, are realistically presented. The production and handling of these model systems is rather simple and allows for reproducible characterization.
Confocal and light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) enable the observation of these systems while maintaining their three-dimensional integrity. LSFM is applicable to imaging live samples at high spatio-temporal resolution over long periods of time. The quality of the acquired datasets enables the extraction of quantitative features about morphology, functionality and dynamics in the context of the complete system. This approach is referred to as image-based systems biology. Exploiting the potential of the generated datasets requires an image analysis pipeline for data management, visualization and the retrieval of biologically meaningful values.
The goal of this thesis was to identify, develop and optimize modules of the image analysis pipeline. The modules cover data management and reduction, visualization, reconstruction of multiview image datasets, the segmentation and tracking of cell nuclei and the extraction of quantitative features. The modules were developed in an application-driven manner to test and ensure their applicability to real datasets from three-dimensional fluorescence microscopy. The underlying datasets were taken from research projects in developmental biology in insects and plants, as well as from cell biology.
The datasets acquired in fluorescence microscopy are typically complex and require common image processing steps in order to manage, visualize, and analyze the datasets. The first module accomplishes automatic structuring of large image datasets, reduces the data amount by image cropping and compression and computes maximum projection images along different spatial directions. The second module corrects for intensity variations in the generated maximum projection images that occur as a function of time. The program was published as a part of an article in Nature Protocols. Another developed module named BugCube provides a web-based platform to visualize and share the processed image datasets.
In LSFM, samples can be rotated in-between two acquisitions enabling the generation of multiview image datasets. Prior to my work, Frederic Strobl and Alexander Ross acquired the complete embryogenesis of the red flour beetle, Tribolium castaneum, and the field cricket, Gryllus bimaculatus, with LSFM. I evaluated a plugin for the software FIJI as a module for the reconstruction of such datasets. The plugin was optimized for automation and efficiency. We obtained the first high quality three-dimensional reconstructions of Tribolium and Gryllus datasets.
Optical clearing increases the penetration depth into samples, thus providing endpoint images of entire three-dimensional objects with cellular detail. This work contributes a quantitative characterization module that was applied to endpoint images of optically cleared spheroids. A program for the generation of ground truth datasets was developed in order to evaluate the cell nuclei segmentation performance. The program was part of a paper that was published in BMC Bioinformatics. Using the program, I could show that the cell nuclei segmentation is robust and accurate. Approaches from computational topology and graph theory complete the segmentation of cell nuclei. Thus, the developed module provides a comprehensive quantitative characterization of spheroids on the level of the individual cell, the cell neighborhood and the whole cell aggregate. The module was employed in four applications to analyze the influence of different stress conditions on the morphology and cellular arrangement of cells in spheroids. The module was accepted for publication in Scientific Reports along with the results for one application. The cell nuclei segmentation further provided a data source for simulation models that used correlation functions to identify structural zones in spheroids. These results were published in Royal Society Interface.
The final part of this work presents a module for cell tracking and lineage reconstruction. In collaboration with Dr. Alexis Maizel, Dr. Jens Fangerau and Dr. Daniel von Wangenheim, I developed a module to track the positions of all cells involved in lateral root formation in Arabidopsis thaliana and used the extracted positions for extensive data analysis. We reconstructed the cell lineages and established the first atlas of all founder cells that contribute to the formation. The analysis of the retrieved data allowed us to study conserved and individual patterns in lateral root formation. The atlas and parts of the analysis presented in this thesis were published in Current Biology.
In this thesis, I developed modules for an image analysis pipeline in three-dimensional fluorescence microscopy and applied them in interdisciplinary research projects. The modules enabled the organization, processing, visualization and analysis of the datasets. The perspective of the image analysis pipeline is not restricted to image-based systems biology. With ongoing development of the image analysis pipeline, it can also be a valuable tool for medical diagnostics or industrial high-throughput approaches.
The cardiovascular system (CVS) consists of heart and blood vessels, forming a close circulatory loop. All tissues depend on the nutrients and molecular oxygen (O2) delivered by the blood. Therefore, it is not surprising that the CVS is one of the first working systems and the heart is the first functional organ in the forming embryo (Baldwin 1996). The building blocks of blood vessels are endothelial cells (ECs), which form the endothelium, a specialized epithelium that defines the luminal surface of the vessels (Pugsley and Tabrizchi 2000). The process of blood vessel development comprises several steps. The first events occurring are the formation of new vessels de novo to constitute the primary vascular loop known as vasculogenesis. During vasculogenesis the vascular precursors, known as angioblasts, migrate and coalesce to form the axial vessels. Subsequently, the main vessels undergo a specification step where they acquire either arterial or venous identity. As the embryo increases in size, the main vascular loop needs to increase in complexity. In order to reach all the different parts of the developing organs, new blood vessels are formed from pre-existing ones, a phenomenon known as angiogenesis (Gore et al. 2012).
Mature blood cells have a short lifespan. Therefore, hematopoietic stem cells (HSCs) are required throughout lifetime to constantly form new blood cells in a process called hematopoiesis. Interestingly, endothelial and immune cells development have been shown to converge at different points during their development, one of which is developmental hematopoiesis. During embryogenesis, definitive hematopoiesis occurs in a tissue called hemogenic endothelium (HE), a specialized subset of ECs at the ventral wall of the dorsal aorta (DA). HE acquires hematopoietic potentials and gives rise to HSCs, through a process known as endothelial-to-hematopoietic transition (EHT). During EHT, these specialized ECs extrude from DA and colonize the so-called aorta-gonadmesonephros (AGM) region, forming the native HSCs (Paik and Zon 2010).
As vascular development requires different steps, the molecular pathways involved are many. The Notch signaling pathway has been demonstrated to be one of the main players in vascular development. Among other functions, Notch signaling has been shown to be important during EHT. In the murine model, Runx1, a master regulator of HSC formation, has been shown to be transcriptionally regulated by NOTCH1 through GATA2 activation. This observation was later corroborated by knockdown studies for notch1a and notch1b in zebrafish (Butko, Pouget, and Traver 2016). Another essential pathway for vascular development is the HIF pathway. Hif-1α, Hif-1β and Hif-2α mouse mutants show severe vascular defects that result in early embryonic lethality (Simon and Keith 2008), which hinders a deep analysis of the phenotypes incurring in the mutant embryos. In addition, deletion of Hif-1α specifically in myeloid cells showed abnormalities in the motility, invasiveness, and adhesion of macrophages (Cramer et al. 2003). Intriguingly, Hif-1α deletion in vascular endothelial cadherin-expressing cells led to a significant but partial reduction of HSC number, suggesting that other players may be involved in this pathway (Imanirad et al. 2014).
Zebrafish embryos have been shown to be tolerant to hypoxia at very early stages of development (Padilla and Roth 2001). Also, zebrafish embryos develop externally and this allows to finely manipulate the environment where they grow (Lieschke and Currie 2007). These features make zebrafish an ideal model to investigate how hypoxia and Hif transcription factors affect vertebrate vascular development. In this study, I will examine the impact of hypoxia on zebrafish vascular development. Specifically, I will dissect the role of hif-1α in macrophage-EC interactions during vascular development and repair. Moreover, I show redundant functions for hif-1α and hif-2α in HSC development upstream of Notch signaling.
In der vorliegenden dreiteiligen Studie werden Mongolische Wüstenrennmäuse untersucht, deren Hörspektren im tieffrequenten Bereich und deren Unterscheidungsfähigkeiten von Kommunikationsrufen denen des Menschen ähneln. Die extrazelluläre Aktivität im primären auditorischen Kortex (AI) der narkotisierten Versuchstiere, evoziert durch Reintöne und arteigene Kommunikationsrufe, wird in der linken (LH) und rechten Gehirnhemisphäre (RH) aufgenommen. Es werden Multikanalelektroden (16 Eingangskanäle) verwendet, welche eine simultane Aufnahme der neuronalen Aktivitäten aller kortikalen Schichten ermöglichen. Zur Analyse der neuronalen Mechanismen werden Wellenformen einzelner Elektrodenkanäle und Aktivitätsprofile, bestehend aus den Wellenformen aller Elektrodenkanäle in einem Zeitfenster von 600 ms, auf Ebene von Aktionspotentialen (MUA), lokalen Feldpotentialen (LFP) und Current-source-density (CSD) Analysen, untersucht. Während MUAs die neuronalen Aktionspotentiale im Nahfeld der Elektrode reflektieren, umfassen die LFPs die summierten Potentiale (inhibitorisch und exzitatorisch) von Neuronen eines größeren Areals. Die CSDs hingegen werden durch die Integration von LFP-Wellenformen benachbarter, linear angeordneter Elektrodenkanäle berechnet und ermöglichen so eine Lokalisation der Ursprünge geräuschspezifischer Aktivitätsflüsse.
Im ersten Teilprojekt werden CSD-Profile in Antwort auf unterschiedliche Reintöne untersucht, um die Aktivitätskomponenten, die so genannten Sinks, für weiterführende Analysen zu quantifizieren. Es können zwei primäre (s1 und s2), drei mittlere (s3-s5) und vier späte (s6-s9) Sinks in einem Zeitfenster von 600 ms definiert werden. Eine Veränderung der Stimulusfrequenz eine Oktave über und unter der charakteristischen Frequenz (CF), beziehungsweise des Lautstärkepegels = 24 dB über der minimalen Schwelle, führt zu qualitativen Veränderungen in der CSD-Profilstruktur. Die Sink s7 wird durch Stimuli mit niedrigem Lautstärkepegel weniger verlässlich evoziert, wohingegen die Sink s9 bei Stimuli eine Oktave über der CF verlässlicher evoziert wird. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass im AI die spektralen Informationen eine Oktave über und unter der CF asymmetrisch integriert werden.
Auf Einzelschichtebene konnte bereits gezeigt werden, dass spektrotemporale Eigenschaften von Stimuli durch MUAs schlechter reflektiert wurden als durch LFPs, was vermutlich eine direkte Konsequenz der unterschiedlichen Ursprünge der Signaltypen ist. Daher werden im zweiten Teilprojekt die spezifischen Unterschiede der MUA-, LFP- und CSD-Antworten auf Ebene kortikaler Schichten und kompletter laminarer Profile untersucht, um die Unterschiede und den Informationsgehalt der drei Signaltypen zu charakterisieren. Signifikante Unterschiede, welche durch zwei Reintöne und sieben Kommunikationssignale evoziert werden, können verstärkt im mittleren und späten Latenzbereich und in granulären und infragranulären Schichten vorgefunden werden. Der Grad der Rufspezifizität ist in LFP und CSD-Antworten im Vergleich zu demjenigen in MUA-Antworten größer. Die Segregationsleistung ist im Vergleich zu einzelnen kortikalen Schichten in den von kortikalen Kolumnen abgeleiteten laminaren Profilen um den Faktor 1,8-2,6 erhöht. Die Neuronenpopulationen einzelner kortikaler Kolumnen sind vermutlich wichtig für die Kodierung von Geräuschen, welche sich in ihren spektrotemporalen Eigenschaften unterscheiden.
Viele vorangegangene Studien konnten zeigen, dass die Gehirnhemisphären akustische Signale asymmetrisch verarbeiten. Daher werden im dritten Hauptteil die laminaren Profile der LH und RH quantitativ und statistisch verglichen. Die MUA-, CSD-Profile und im geringeren Maße auch die LFP-Profile zeigen systematische Unterschiede auf signifikantem Niveau in der Dauer, Onset Latenz und vertikalen Ausdehnung bestimmter Aktivitäten. Kommunikationsrufe evozieren in der LH, welche beim Menschen auf Sprachstimuli spezialisiert ist, im Vergleich zur RH komplexere CSD-Profile. Die neuronale MUA-, LFP- und CSD-Aktivitätsstärke ist in der RH für weniger komplexe Stimuli teilweise signifikant erhöht. Die Asymmetrie in der Auftrittsverlässlichkeit der Sink s6 lässt vermuten, dass sich die intrakolumnäre Vernetzung in Schicht VIa zwischen der LH und RH unterscheidet. Die wenigen, signifikanten und nicht systematischen Unterschiede zwischen den Sink-Parametern der LH und RH nach kortikaler Ausschaltung mit dem GABAA-Rezeptor Agonist Muscimol weisen darauf hin, dass die Hemisphärenasymmetrie durch Prozesse des ipsilateralen Kortex maßgeblich beeinflusst wird.
Structural biology often employs a combination of experimental and computational approaches to unravel the structure-function paradigm of biological macromolecules. This thesis aims to approach this combination by the application of Pulsed Electron-Electron Double Resonance (PELDOR/DEER) spectroscopy and structural modelling. In this respect, PELDOR spectroscopy in combination with site-directed spin labelling (SDSL) of proteins is frequently used to gain distance restraints in the range from 1.8 to 8 nm. The inter-spin distance and the flexibility of the spin labelled protein domains are encoded in the oscillation and the dampening of the PELDOR signal. The intrinsic flexibility of the commonly used MTSSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrroline-3-methyl) spin label itself can be an obstacle for structural modelling if the flexibility of the label is large compared to the flexibility of the protein domains. In this thesis the investigation of two multi-domain proteins by the 4-pulse PELDOR sequence is presented. At first, the N-terminal polypeptide transport-associated (POTRA) domains of anaOmp85, a rigid three domain protein, giving well-defined PELDOR distance restraints, is investigated. The experimental restraints are used for structure refinement of the X-ray structure and reveal a strong impact of the intrinsic flexibility of MTSSL on the accuracy of structural refinement. The second example, K48-linked diubiquitin, is a highly flexible multi-domain protein on which the flexibility of MTSSL is of minor impact on structural modelling. In this case, the distance restraints are utilized to determine conformational ensembles. Due to the high intrinsic flexibility already characterizing diubiquitin the recently developed 7-pulse Carr-Purcell (CP) PELDOR sequence was applied to investigate longer ubiquitin chains. This sequence enables to measure dipolar oscillations with an extended time window, allowing a good separation between inter- and intramolecular contributions even for long distance and broad conformational distributions, thereby providing an increased accuracy of the obtained distance distributions.