Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Die Analyse früher Entwicklungsstadien von Säugetierembryonen und daraus gewonnener Stammzelllinien kann entscheidende Erkenntnisse im Bereich der Reproduktionsbiologie und der regenerativen Medizin hervorbringen. Dabei spielt die Maus, als geeignetes Modellsystem für die Übertragbarkeit auf den Menschen eine wichtige Rolle, in erster Linie weil die Blastozysten der Maus verglichen mit menschliche Blastozysten eine morphologische Ähnlichkeit aufweisen. Humane embryonale Stammzelllinien haben großes Potential für die Anwendung in der regenerativen Medizin und vergleichend dazu wurde Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen verwendet, um tausende neuer Mausstämme zu generieren. Die Gewinnung embryonaler Stammzellen erfolgt im Blastozystenstadium, diese können dann nach Injektion in eine andere Blastozyste zur Entwicklung aller Gewebearten, einschließlich der Keimbahngewebe, beitragen (Martin, 1981; Evans and Kaufman 1981).
Ursache einer Fehlgeburt können vor allem Defekte in der Entwicklung des Trophoblasten und des primitive Entoderms (PrE) sein, dabei sind ca. 5 % der Paare betroffen die versuchen ein Kind zu bekommen (Stephenson and Kutteh, 2007). Eine Untersuchung dieser Zelllinien im Mausmodell könnte weitere Erkenntnisse für die Gründe einer Fehlentwicklung liefern. Trophoblasten Stammzelllinien können aus den Blastozysten der Maus und dem extraembryonalen Ektoderm von bereits implantieren Embryonen gewonnen werden (Tanaka et al., 1998). Diese Zelllinien geben Aufschluss über die Entwicklung des Trophoblasten, fördern die Entwicklung der Plazenta und sind gleichzeitig ein gutes Modellsystem um die Implantation des Embryos im Uterus näher zu untersuchen. Zellen des primitive Entoderms (PrE) beeinflussen das im Dottersack vorhandene extraembryonale Entoderm, welches dort als “frühe Plazenta” fungiert und für die Versorgung des Embryos mit Nährstoffen zuständig ist (Cross et al., 1994). Des Weiteren besitzt das Entoderm einen induktiven Einfluss auf die Bildung von anterioren Strukturen und die Bildung von Endothelzellen sowie Blutinseln (Byrd et al., 2002).
Extraembryonale Endodermstammzellen (XEN Zellen) können aus Blastozysten gewonnen und in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) umgewandelt werden (Fujikura et al., 2002; Kunath et al., 2005). Es war jedoch nicht bekannt, ob XEN-Zellen auch aus Postimplantations-Embryonen gewonnen werden können. XEN-Zellen tragen in vivo zur Entwicklung des Darmendoderms bei (Kwon et al., 2008; Viotti et al., 2014) und könnten als alternative, selbsterneuernde Quelle für extraembryonale Endoderm-abgeleitete Zellen dienen, die zur Herstellung von Geweben für die regenerative Medizin verwendet werden könnten (Niakan et al., 2013).
In der Embryogenese der Maus zeigt sich an Tag E3.0 eine kompakte Morula die sich allmählich in das Trophektoderm (TE) differenziert, welches wiederum den Embryonalknoten (“innere Zellmasse”) umschließt (Johnson and Ziomek, 1981). Ein wichtiger Schritt im Rahmen der Entwicklung findet an Tag E3.5 statt, in diesem Zeitraum gehen aus dem Embryonalknoten der pluripotente Epiblast und das primitive Entoderm hervor. Im späten Blastozystenstadium an Tag E4.5 liegt das PrE als Zellschicht entlang der Oberfläche der Blastocoel-Höhle. Aus dem Epiblast entwickeln sich im weiteren Verlauf der Embryo, das Amnion und das extraembryonale Mesoderm des Dottersacks. Die Zellen des Trophektoderm führen zur Entwicklung der Plazenta. Das PrE differenziert sich im Zuge der Weiterentwicklung in das viszerale Entoderm (VE) und das parietale Entoderm (PE) des Dottersacks (Chazaud et al., 2006; Gardner and Rossant, 1979; Plusa et al., 2008). VE umgibt den Epiblast und extraembryonisches Ektoderm (ExE). PE-Zellen wandern entlang der inneren Oberfläche von TE und sezernieren zusammen mit Trophoblasten-Riesenzellen Basalmembranproteine, um die Reichert-Membran zu bilden (Hogan et al., 1980). Die Reichert-Membran besteht aus Basalmembranproteinen, einschließlich Kollagenen und Lamininen, die zwischen den parietalen Endoderm- und Trophoblastzellen liegen. Diese Membran wirkt als ein Filter, der dem Embryo den Zugang zu Nährstoffen ermöglicht, während er eine Barriere zu den Zellen der Mutter bildet (Gardner, 1983).
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The enzyme acetyl-CoA carboxylase (ACC) plays a fundamental role in the fatty acid metabolism. It regulates the first and rate limiting step in the biosynthesis of fatty acids by catalyzing the carboxylation of acetyl-CoA to malonyl-CoA and exists as two different isoforms, ACC1 and ACC2. In the last few years, ACC has been reported as an attractive drug target for treating different diseases, such as insulin resistance, hepatic steatosis, dyslipidemia, obesity, metabolic syndrome and nonalcoholic fatty liver disease. An altered fatty acid metabolism is also associated with cancer cell proliferation. In general, the inhibition of ACC provides two possibilities to regulate the fatty acid metabolism: It blocks the de novo lipogenesis in lipogenic tissues and stimulates the mitochondrial fatty acid β-oxidation. Surprisingly, the role of ACC in human vascular endothelial cells has been neglected so far. This work aimed to investigate the role of the ACC/fatty acid metabolism in regulating important endothelial cell functions like proliferation, migration and tube formation.
To investigate the function of ACC, the ACC-inhibitor soraphen A as well as an siRNA-based approach were used. This study revealed that ACC1 is the predominant isoform both in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and in human dermal microvascular endothelial cells (HMECs). Inhibition of ACC via soraphen A resulted in decreased levels of malonyl-CoA and shifted the lipid composition of endothelial cell membranes. Consequently, membrane fluidity, filopodia formation and the migratory capacity were attenuated. Increasing amounts of longer acyl chains within the phospholipid subgroup phosphatidylcholine (PC) were suggested to overcompensate the shift towards shorter acyl chains within phosphatidylglycerol (PG), which resulted in a dominating effect on regulating the membrane fluidity. Most importantly, this work provided a link between changes in the phospholipid composition and altered endothelial cell migration. The antimigratory effect of soraphen A was linked to a reduced amount of PG and to an increased amount of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) within the phospholipid cell membrane. This link was unknown in the literature so far. Interestingly, a reduced filopodia formation was observed upon ACC inhibition via soraphen A, which presumably caused the impaired migratory capacity.
This work revealed a relationship between ACC/fatty acid metabolism, membrane lipid composition and endothelial cell migration. The natural compound soraphen A emerged as a valuable chemical tool to analyze the role of ACC/fatty acid metabolism in regulating important endothelial cell functions. Furthermore, regulating endothelial cell migration via ACC inhibition promises beneficial therapeutic perspectives for the treatment of cell migration-related disorders, such as ischemia reperfusion injury, diabetic angiopathy, macular degeneration, rheumatoid arthritis, wound healing defects and cancer.
Licht ist ein wertvolles Werkzeug zur Regulation biochemischer Reaktionsabläufe. Denn die Applikation von Licht erlaubt eine sehr präzise Einflussnahme auf den Ort und den Startzeitpunkt der zu untersuchenden Reaktionen. Als nichtinvasives Medium bietet die Lichtkontrolle bei der Wahl einer geeigneten Anregungswellenlänge den Vorteil nur minimal in einen lebenden Organismus einzugreifen. Um eine solche lichtbasierte Kontrolle für biologische Anwendungen zu realisieren, ist die Anwesenheit einer lichtsensitiven Verbindung nötig. Ein Konzept der lichtsensitiven Verbindungen ist die sogenannte photolabile Schutzgruppe. Im Allgemeinen handelt es sich hierbei um einen Chromophor der temporär an ein Biomolekül angebracht wurde, um dessen biologische Aktivität zu unterdrücken.
In dieser Arbeit wurde dieses Konzept auf das Antibiotikum Puromycin angewendet, welches durch das synthetische Anbringen der Cumarin-Schutzgruppe DEACM in seiner biologischen Aktivität behindert und durch einen Lichtpuls wieder freigesetzt wurde. DEACM st eine photolabile Schutzgruppe mit breitem Anwendungsspektrum, da es im Vergleich zu anderen Cumarin-Derivaten vorteilhafte photophysikalische Eigenschaften aufweist. Zum einen ist durch den 7-Diethylamino-Substituenten das Absorptionsmaximum dieser Verbindung um etwa 20 nm bathochrom verschoben. Zum anderen zeichnet sich dieses Derivat durch einen erheblich erhöhten Extinktionskoeffizienten aus, sodass eine Freisetzungsreaktion mit einer geringeren Lichtdosis induziert werden kann, was weniger Stress für die Zellen in lebenden Systemen bedeutet.
Die antibiotische Wirkung von Puromycin beruht auf der strukturellen Ähnlichkeit zum5'-Ende von Tyrosyl-tRNA, wodurch sich das Antibiotikum kondonunspezifisch während der Translation der Proteinsynthese an das Ribosom anlagern kann. Anschließend wird die naszierende Polypeptidkette auf das Puromycin transferiert. Da diese neue Bindung unter biologischen Bedingungen nicht spaltbar ist, führt dies zu einer verfrühten Freisetzung des Polypeptid-Puromycin-Fragments. Schließlich ist die Proteinsynthese vollständig abgebrochen.
Die Motivation zur photoinduzierten Kontrolle von Puromycin besteht in der Vielzahl an biologischen Applikationsmöglichkeiten, da die lichtregulierte Freisetzung der biologischen Aktivität als Trigger für sich anschließende biochemische Abläufe verwendet werden kann. Durch das hier gezeigte System kann in Kombination mit anderen Techniken (z.B. NMR) die posttranslationale Proteinfaltung beobachtet werden, welche als hochgradig komplexer Prozess bisher nicht verstanden ist. Eine weitere Motivationsgrundlage ist die Anwendung von DEACM-puromycin in Nervenzellen. Hier kann durch die Photofreisetzung die Proteinsynthese in den Dendriten der Neuronen beobachtet werden, wodurch Rückschlüsse auf neurodegenerative Krankheiten möglich sein sollten, wie z.B. Alzheimer-Krankheit. In dieser Arbeit konnte in-vitro nachgewiesen werden, dass die antibiotische Wirkung von Puromycin mittels Licht kontrollierbar ist. Aus der photophysikalischen Grundcharakterisierung ging hervor, dass DEACM-puromycin einen hohen Extinktionskoeffizienten bei Wellenlängen größer als 380 nm aufweist. Folglich kann zur Induktion der Photolyse eine geringere Lichtdosis mit energiearmer Strahlung als bei dem Vorläufersystem NVOC-puromycin verwendet werden, angesichts dessen ist das hier vorgestellte DEACM-puromycin für Anwendungen in Zellen zu empfehlen.
Über die Kombination von quantenchemischen Rechnungen und spektroskopischen Methoden konnten die frühen Schritte der Freisetzungsreaktion bestimmt und quantifiziert werden. Zudem zeigte sich ein Einfluss der Lösungsmittelzusammensetzung auf die Uncaging-Schritte. In Gegenwart eines protischen Lösungsmittels wird der zum Uncaging in Konkurrenz stehende Prozess der Fluoreszenz unterdrückt, wodurch die Freisetzungsschritte effektiver werden. Zudem führt die Präsenz von Protonen zu einer Stabilisierung des ionischen Intermediates, sodass die Bildung dessen beschleunigt ablaufen kann. Die Spaltung der photolabilen Schutzgruppen vom Puromycin findet mit einer Rate von 0,71*10^8 s-1 statt, welche im Vergleich zu Vorgängersystem um eine Größenordnung größer ist. Die Wiederherstellung der biologischen Aktivität resultiert aber erst nach einem anschließenden Decarboxylierungsschritt. Mithilfe von IR-Messungen konnte die Decarboxylierung beobachtet und daraus die Quantenausbeute zu 2,5% determiniert werden. Die so bestimmte Quantenausbeute entspricht etwa dem Zweifachen von NVOC-puromycin, sodass die hier untersuchte Verbindung eindeutig als das effizientere System zu betrachten ist. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass DEACM-puromycin vorteilhafte photophysikalische Eigenschafen aufweist, die diese Verbindung zu einem wertvollen Hilfsmittel für eine Vielzahl von lichtkontrollierten Untersuchungen in biologischer Umgebung macht. Zudem wurden Einblicke in den Reaktionsmechanismus gegeben, die das Verständnis der photolytischen Spaltung von Carbamat-geschützten Cumarinen erstmals auf der ultrakurzen Zeitskala ermöglicht.
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide nicht nur eine strukturgebende Funktion in der Plasmamembran aufweisen, sondern ebenfalls als Botenstoffe intra- und extrazellulär aktiv sind. Sphingosin-1-Phosphat (S1P) bildet dabei einen Schlüssel-Metaboliten, da es verschiedene Zellfunktionen wie Wachstum und Zelltod beeinflusst. Es wird durch zwei Isoformen der Sphingosinkinasen, SK1 und SK2, gebildet. Die SK1 wurde bereits gut untersucht und es konnte gezeigt werden, dass sie eine wichtige Rolle beim Zellwachstum einnimmt und einen entscheidender Regulator bei inflammatorischen Erkrankungen und Krebs darstellt. Über die SK2 ist soweit wenig bekannt und die Ergebnisse sind zum Teil kontrovers. Sowohl pro-proliferative als auch anti-proliferative Funktionen der SK2 wurden beschrieben. Andererseits handelt meine Arbeit von Nierenfibrose, da beschrieben wurde, dass Sphingolipide einen wichtigen Einfluss auf die Entwicklung chronischer Nierenerkrankungen nehmen. Nierenfibrose stellt das Endstadium chronischer Nierenerkrankungen dar und führt zu einer Akkumulation der Extrazellulärmatrix, Organvernarbung und zum Verlust der Nierenfunktion. Die SK1 spielt dabei eine protektive Rolle bei der Entstehung von Nierenfibrose. Deshalb sollte in dieser Arbeit die Rolle der Sk2 bei der Entstehung von Nierenfibrose untersucht werden.
Im ersten Teil meiner Arbeit wurde das Mausmodell der unilateralen Ureterobstruktion (UUO) verwendet, welches zur Entwicklung einer tubulointerstitiellen Nephritits und nachfolgender Fibrose führt. Es konnte dabei gezeigt werden, dass sowohl die Protein-Expression als auch die Aktivität der SK2 im fibrotischen Nierengewebe gesteigert wurden. Allgemein wiesen die SK2-/--Mäuse eine verminderte Fibrose in Folge des UUO auf im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen. Dies wurde bestätigt durch eine reduzierte Kollagenakkumulation, sowie eine verminderte Protein-Expression von Fibronektin-1, Kollagen-1, α-smooth muscle actin, connective tissue growth factor (CTGF) und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor1 (PAI-1). Diese Effekte gingen einher mit einer gesteigerten Protein-Expression des inhibitorischen Smad7 und erhöhten Sphingosin-Spiegeln in SK2-/--UUO-Nieren. Auf mechanistischer Ebene vermindern die erhöhten Sphingosin-Spiegel die durch transforming growth factor-β (TGFβ) induzierte Kollagenakkumulation, die PAI-1- und CTGF-Expression, aber induzieren die Smad7-Expression in primären Nierenfibroblasten. In einem komplementären Versuch mit hSK2 tg-Mäusen wurde eine verstärkte Entstehung von Nierenfibrose mit erhöhter Kollagenakkumulation, sowie erhöhte Protein-Expressionen von Fibronektin-1, Kollagen-1, α-smooth muscle actin, CTGF und PAI-1 festgestellt. Die Smad7-Expression dagegen war vermindert.
Im zweiten Teil meiner Arbeit stand der glomeruläre Teil der Niere im Fokus und es wurde untersucht, ob die Überexpression der SK2 zu einer phänotypischen Veränderung der glomerulären Mesangiumzellen führt. Mesangiumzellen wurden dazu aus den hSK2 tg-Mäuse isoliert und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass hSK2 und mSK2 in den transgenen Zellen hauptsächlich in der zytosolischen Fraktion lokalisiert sind, während S1P ausschließlich im Kern akkumulierte. Weiterhin konnte eine verminderte Proliferation unter normalen Wachstumsbedingungen der hSK2 tg-Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen beobachtet werden. Die Zellen reagierten auch sensitiver auf Stress-induzierte Apoptose. Auf molekularer Ebene konnte dies durch eine reduzierte ERK- und Akt/PKB-Aktivierung erklärt werden. Nach Staurosporin-Behandlung wurde Apoptose durch den intrinsischen, mitochondrialen Apoptosesignalweg induziert. Dabei konnte eine reduzierte anti-apoptotische Bcl-xL-Expression und vermehrte Prozessierung von Caspase-9 und Caspase-3 und PARP beobachtet werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine verminderte tubulointerstitielle Fibrose-Entstehung durch die Deletion der SK2, sowie anti-proliferative und Apoptose-induzierende Effekte durch die SK2 in Mesangiumzellen nachgewiesen werden konnten. Somit könnten SK2-Inhibitoren die Entstehung tubulointerstitieller Fibrose und mit Proliferation assoziierte Erkrankungen wie mesangioproliferative Glomerulonephritis positiv beeinflussen.
The fungal interaction with plants is a 400 million years old phenomenon, which presumably assisted in the plants’ establishment on land. In a natural ecosystem, all plant-ranging from large trees to sea-grasses-are colonized by fungal endophytes, which can be detected inter- and intracellularly within the tissues of apparently healthy plants, without causing obvious negative effects on their host. These ubiquitous and diverse microorganisms are likely playing important roles in plant fitness and development. However, the knowledge on the ecological functions of fungal root endophytes is scarce. Among possible functions of endophytes, they are implicated in mutualisms with plants, which may increase plant resistance to biotic stressors like herbivores and pathogens, and/or to abiotic factors like soil salinity and drought. Also, endophytes are fascinating microorganisms in regard to their high potential to produce a great spectrum of secondary metabolites with expected ecological functions. However, evidences suggest that the interactions between host plants and endophytes are not static and endophytes express different symbiotic lifestyles ranging from mutualism to parasitism, which makes difficult to predict the ecological roles of these cryptic microorganisms. To reveal the ecological function of fungal root endophytes, this doctoral thesis aims at assessing fungal root endophytes interactions with different plants and their effects on plant fitness, based on their phylogeny, traits, and competition potential in settings encompassing different abiotic contexts. To understand the cryptic implication of nonmycorrhizal endophytes in ecosystem processes, we isolated a diverse spectrum of fungal endophytes from roots of several plant species growing in different natural contexts and tested their effects on different model plants under axenic laboratory conditions. Additionally,we aimed at investigating the effect of abiotic and biotic variables on the outcome of interactions between fungal root endophytes and plants.
In summary, the morphological and physiological traits of 128 fungal endophyte strains within ten fungal orders were studied and artificial experimental systems were used to reproduce their interactions with three plant species under laboratory conditions. Under defined axenic conditions, most endophytes behaved as weak parasites, but their performance varied across plant species and fungal taxa. The variation in the interactions was partly explained by convergent fungal traits that separate groups of endophytes with potentially different niche preferences. According to my findings, I predict that the functional complementarity of strains is essential in structuring natural root endophytic communities. Additionally, the responses of plant-endophyte interactions to different abiotic factors, namely nutrient availability, light intensity, and substrate’s pH, indicate that the outcome of plant-fungus relationships may be robust to changes in the abiotic environment. The assessment of the responses of plant endophyte interactions to biotic context, as combinations of selected dominant root fungal endophytes with different degrees of trait similarity and shared evolutionary history, indicates that frequently coexisting root-colonizing fungi may avoid competition in inter-specific interactions by occupying specific niches, and that their interactions likely define the structure of root-associated fungal communities and influence the microbiome impacts on plant fitness.
In conclusion, my findings suggest that dominant fungal lineages display different ecological preferences and complementary sets of functional traits, with different niche preferences within root tissues to avoid competition. Also, their diverse effects on plant fitness is likely host-isolate dependent and robust to changes in the abiotic environment when these encompass the tolerance range of either symbiont.
Acute myeloid leukemia (AML) is a clonal malignancy of hematopoietic stem cells (HSCs) characterized by expansion of myeloid blasts in the bone marrow. It has been shown that autophagy is a degradative process, which delivers cytoplasmic components to lysosomes to prevent malignant transformation by maintaining HSC integrity. Besides its function as a bulk degradation machinery to recycle cytoplasmic components during limited energy supply, autophagy also serves as an intracellular quality control mechanism. Selective autophagy requires autophagy receptors such as p62 to specifically bridge the targeted cargos into autophagosomes. p62 is known as a central signaling hub involved in pro-oncogenic signaling pathways and autophagic degradation pathways. However, little is known about the role of p62 as a selective autophagy receptor in AML. This study aims to elucidate the precise function of p62 as an autophagy receptor in leukemia development and maintenance.
In silico analysis revealed that high p62 expression was significantly associated with poor overall survival of adult patients with de novo AML, suggesting that p62 may promote leukemia maintenance. To address the functional role of p62 in leukemia, genome editing by CRISPR/Cas9 was used to knockout p62 in four human AML cell lines. Importantly, p62 loss reduced cell proliferation in all four cell lines. This observation could be transferred to a murine leukemia cell model in which leukemic transformation of lineage-depleted bone marrow (ldMBM) cells was induced by overexpression of the human transcriptional coactivator MN1. Knockdown of p62 by shRNA in MN1-driven leukemia cells impaired proliferation and decreased colony forming ability without altering apoptosis. This indicates that p62 is crucial for leukemia proliferation in vitro. To further characterize the role of p62 in leukemia development and maintenance a murine AML transplantation model was established. Therefore, ldMBM cells isolated from WT and p62-/- mice were transduced with MN1 and transplanted into lethally irradiated mice. As expected, all mice developed fatal myeloid proliferation. Notably, p62 loss in MN1-driven leukemia significantly prolonged survival in mice and caused a more immature phenotype. Consistent with the in vitro results, ex vivo analysis of p62-/- leukemic cells displayed decreased colony-forming ability, although p62 loss did not affect composition and function of HSCs. Moreover, re-transplantation of primary MN1-driven leukemia cells attenuated leukemia progression upon p62 loss. These findings support a decisive role of p62 in leukemia development and maintenance.
To gain molecular insight into the function of p62 during myeloid transformation an interactome analysis of murine MN1-driven leukemia cells was performed. This revealed first that p62 predominantly interacts with mitochondrial proteins and second that inhibition of autophagic degradation causes accumulation of p62-bound mitochondria. This leads to the first assumption that loss of p62 may provoke mitochondrial accumulation with increasing mitochondrial damage and second that p62 may mediate degradation of mitochondria by mitophagy. Indeed, in the absence of p62, accumulation of dysfunctional mitochondria was detected by morphological changes of the mitochondria, increased mitochondrial ROS and impaired mitochondrial respiration capacity. Furthermore, induction of PINK1/Parkin-independent mitophagy revealed that loss of p62 caused impaired degradation of mitochondrial proteins and reduced translocation of damaged mitochondria into autophagosomes. Taken together, p62 is required for effective degradation of dysfunctional mitochondria by mitophagy in AML.
Due to the fact that p62 is a multifunctional protein, rescue experiments with different mutants of p62 were performed to clarify if p62-mediated mitophagy contributes to leukemia proliferation. Notably, the autophagy-deficient mutant (disabled to bind autophagosomes) reduced cell growth and colony-forming ability to the same extent as knockdown of p62, as the clustering-deficient mutant (disabled to form aggregates) displayed an intermediate phenotype. Strikingly, only the autophagy-deficient mutant failed to rescue mitophagy.
In conclusion, this study demonstrates the prominent role of p62 as a selective autophagy receptor for mitochondrial quality control which contributes to leukemia development and maintenance. Therefore, targeting selective autophagy opens new venues in the treatment of AML.
Infections with the hepatitis B virus (HBV) or the hepatitis C virus (HCV) lead to complications like the development of cirrhosis or hepatocellular carcinoma. These complications end up in 887,000 and 500,000 deaths per year, respectively. Since the development of new direct acting antiviral agents for HCV in the past years a complete cure of an HCV infection can be achieved in the majority of the patients. In contrast, a complete cure of a chronic HBV infection still remains a challenging problem as current treatment regimens mainly suppress the viral replication and cccDNA as well as integrated DNA still persist in these patients. Several viral and host factors were described to impair the efficacy of treatment regimens or influence the course of the infection. Therefore, in this work viral factors as well as host factors were investigated in HBeAg negative chronic HBV infected patients and in chronic HCV infected patients. In the present study, it was demonstrated that mutations and/or deletions in the HBV basal core promoter (BCP), the precore and the preS domain occur in a genotype-specifc pattern in HBeAg negative HBV infected patients. While the BCP double mutation A1762T/G1764A was found with the highest prevalence in genotype E infected patients, the precore mutation G1896A occurred mostly in genotype B infected patients. Variants in the preS domain could be detected with the highest frequency in patients infected with genotype C. In patients, who had to start an antiviral therapy during the course of the disease, mutations in the precore region could be detected with a higher frequency in the samples right before treatment start in comparison to the baseline sample.
While different HBV genotypes and preS mutations were not associated with HBV-DNA serum levels, precore mutations as well as BCP mutations were significantly associated with HBV-DNA levels. Furthermore, precore mutations showed lower and preS mutations higher HBsAg levels. The HBsAg serum levels varied significantly among the different genotypes. Since HBsAg levels < 1000 IU/ml have been described as a prognostic marker in several studies, the prevalence of patients with HBsAg < 1000 IU/ml was analyzed among the genotypes A - E. While most of the patients infected with HBV genotype B had HBsAg < 1000 IU/ml, only a few patients infected HBV genotype E and A had HBsAg < 1000 IU/ml.
Furthermore, HBV genotype A genomes derived from patients harboring a) A1762T/ G1764A (BCP), b) G1896A/G1899A (precore), c) 15 aa deletion in preS1, d) no mutation (reference genome) were cloned and analyzed in vitro. An enhanced expression but reduced secretion of viral genomes was found in the preS-deletion- and the precore-variant. No differences in the HBsAg production and secretion were observed in the cloned precore- or BCP-variant, while the preS-deletion-variant was characterized with an elevated HBsAg release.
Regarding the secretion of viral and subviral particles, a genotype-specifc pattern of the L/M/SHBs ratio was detected in the serum of patients infected with genotypes A - E. This pattern did not change in the serum of patients, who started antiviral treatment. Secreted HBsAg containing particles displayed a higher density as well as a higher filaments/spheres ratio in genotypes B and D compared to genotypes A, C and E. Population-based and deep sequencing revealed large deletions in the preS domain or preS2 start codon mutations in a certain number of the viral genomes. Theoretically, these mutations/deletions should influence the molecular weight of the expressed protein or abolish the expression of the protein at all. In contrast, LHBs/MHBs were detectable and appeared at the same molecular weight in these patient samples in comparison to patient samples without these mutations. Furthermore, in the in vitro analyses comparing the reference genome and the preS1-deletion genome, it was shown that the deletion indeed influenced the molecular weight of LHBs. Therefore, HBsAg might be expressed from a genetically different source than the released viral genomes, meaning the integrated DNA.
Additionally, in the present study the prevalence of resistance associated substitutions (RASs) in the viral genes NS3, NS5A and NS5B of chronic HCV infected patients was analyzed in correlation to single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the interferon-λ4 (IFNL4) gene of the infected patients. No significant correlation was found between IFNL4 SNPs and RASs within NS3/NS5B in the present cohort. In contrast, the frequently detected NS5A RAS Y93H could be significantly associated with beneficial IFNL4 SNPs and a high baseline viral load in HCV genotype 1-infected patients.
Taken together, the present study demonstrated that viral genome mutations as well as the morphology of secreted particles occur in a genotype-dependent pattern in HBeAg negative HBV infected patients with no need of antiviral therapy. As the amount of serum qHBsAg levels varied among the different genotypes, the HBsAg cut-off < 1000 IU/ml should be adapted individually among the various genotypes. Because the composition of the secreted subviral particles varied between the different genotypes, a genotype-specific immune-response might be induced in these patients. Additionally, the results of the present study indicate that in HBeAg negative HBV infected patients with mutations or deletions in the preS domain MHBs and LHBs might be expressed from the integrated DNA and therefore from a genetically different source than the released viral genomes.
Aside from that, the finding of a significant association of the NS5A RAS Y93H with beneficial IFNL4 SNPs in chronic HCV infected patients may explain a lack of a correlation or an inverse correlation of treatment response with the IFNL4 genotype in some NS5A inhibitor-containing IFN-free regimens.
The continuous conversion of natural wildlife habitats into agricultural areas, as well as the fragmentation of the last wildlife refuges, is increasing the interface between people and wildlife. When wildlife negatively impacts on people and vice versa, we speak about human-wildlife conflicts (HWCs). This definition includes losses on both sides and takes into consideration the rooting of most of these conflicts between different groups of interest, such as advocates for nature conservation and economic groups. The centres of highest biodiversity are located in developing countries, which are also characterized by poverty. In African and Asian countries, people living in the vicinity of national parks and other conservation areas mostly receive only little support through the government or conservation organisations. Especially for those people who are dependent on agriculture, damage to fields and harvests can have catastrophic consequences. If the species causing damage is protected by national or even international law, the farmer is not allowed to use lethal methods, but has to approach the authority in charge. If this agency, however, cannot offer appropriate support, resentment, anger or even hate develops, and the support for wildlife conservation activities declines. For this reason, HWCs were declared as one of the most important conservation topics today, being particularly relevant for large and threatened species such as the African and Asian elephant, hippopotamus and the greater one-horned rhino, as well as for large predators. Up to today, no general assessment scheme has been recommended for damage caused by protected wildlife species.
In my study, HWCs in Asia and Africa are compared, focussing on all herbivorous species identified which damaged crops. For the French NGO Awely, des animaux et des hommes, I developed a detailed assessment scheme suitable for all terrestrial ecosystems, and any type of HWCs and any species (Chapter 2). This HWC assessment scheme was used in four different study areas located in two African countries (South Luangwa/Zambia (SL), Tarangire/Tanzania (TA)) and two Asian countries (Bardia/Nepal (BA) and Manas/India (MA)). This scheme ran for six consecutive years (2009 to 2014) for Zambia, Nepal and India and two years (2010 to 2011) for Tanzania. To carry out the assessments, I trained local HWC officers (Awely Red Caps) to assess HWCs by field observations (measurement of damage, identification of species through signs of presence, landscape attributes etc.) and interviews with aggrieved parties (socio economic data). Results of this assessment are presented in Chapters 2-4.
To determine whether elephants prefer or avoid specific crop species, two field experiments were carried out, one in SL and one in BA (Chapter 5 and 6). For this, two test plots were set up and damage by elephants (and other herbivores) were quantified.
Within this doctoral thesis, 3306 damage events of 7408 aggrieved parties were analysed. In three out of the four study areas (SL, BA, MA), elephants caused the highest number of damage events compared to all other wildlife species, however, in TA, most fields were damaged by zebra. Furthermore, the greater one-horned rhino, hippopotamus, wild boar, bushpig, deer and antelope, as well as primates, caused damage to fields and harvests. Damage to houses and other property were nearly exclusively caused by elephants.
With this doctoral thesis I was able to show that season, crop availability, type and the phenological stage of the crop played an important role for crop damaging behavior of herbivores (Chapter 2). Elephants especially damaged rice, maize and wheat and preferred all crop types in a mature stage of growth. In contrast, rhinos preferred wheat to rice and similar to antelope and deer, they preferred crops at earlier stages of growth, before ripening. Crop damage by wildlife species varied strongly in size; most damages fell below 40% of the total harvest per farmer, but in several cases (3 to 8% depending on the study area), harvests were completely destroyed. Interestingly, during times of low nutritional availability in the natural habitat (dry season), crop damages in all four study areas were significantly less than during other seasons.
In all four study areas, crop protection strategies, such as active guarding in the fields, chasing wildlife with noise or fire torches or erecting barriers, were used. In some cases protection strategies were combined. Analysis of data revealed that traditional protection strategies did not reduce the costs of damage (Chapter 3). In some cases, costs of damage, on protected fields were even higher than for unprotected fields. Only in MA did strategic and cohesive guarding significantly reduce crop damage by wildlife species.
Besides damage in the fields, elephants also caused damage to properties in the villages. In search for stored staple crops, they damaged houses, grain stores and kitchens. Such damage was analysed in three study areas (SL, BA, MA) (Chapter 4). Although property damage occurred less frequently compared to crop damage in the fields, the mean cost of this damage was found to be double in BA/MA and four times higher in SL, compared to the costs of crop damage in the fields. It is further remarkable that property damage significantly increased towards the dry season, when the harvest was brought into the villages.
The findings of this study underpin the assumption that wildlife herbivores, especially elephants, are lured to fields and crops because the highly nutritional food (crop) being readily available. Traditional crop protection is cost and labour intensive and does not reduce the costs of damage. For this reason, crop types, which are thought to be not consumed by elephants were systematically tested on their attractiveness in field experiments in SL and BA (Chapter 5 and 6). In SL, lemon grass, ginger and garlic were proven to be less attractive to African elephants than maize and in BA, basil, turmeric, chamomile, coriander, mint, citronella and lemon grass were found to be less attractive to Asian elephants than rice.
The results of this doctoral thesis are relevant for the management of wildlife conservation as they can lead to new approaches to the mitigation of HWCs in African and Asian countries. Finally, specific needs for more scientific research in this field have been identified.
In den letzten Jahren findet die Wirkung von Polyphenolen auf den Alterungsprozess oder zur Behandlung von Krankheiten immer mehr Beachtung. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Wirkmechanismen der Polyphenole Gossypol, Curcumin und Quercetin, um Hinweise für neue oder verbesserte Therapieansätze zu erhalten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen lieferten folgende Ergebnisse:
1. Der Ascomycet "P. anserina" eignet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Wirkmechanismen verschiedener Polyphenole, da die bereits aus der Literatur bekannten Effekte auf das Überleben höherer Organismen auch in "P. anserina" beobachtet wurden.
2. Die Mitochondrienfunktion spielt auf unterschiedliche Art eine Rolle in der Kompensation von Dysfunktionen oder Stressbedingungen in der Zelle und wirkt somit positiv auf die Regulation der Lebensspanne von "P. anserina". In der "PaSod3"-Deletionsmutante wurde eine Verschiebung der mitochondrialen Atmung von einer Komplex I-abhängigen hin zu einer vermehrt Komplex II-abhängigen Atmung festgestellt. Die damit verbundene Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials dient neben der bereits bekannten hohen Superoxid-Menge als Signal zur Mitophagie-Induktion. Auch die Anpassung der Mitochondrienfunktion durch die erhöhte Bildung von mtRSCs, wie im Falle von Gossypol oder Quercetin, kann zur Kompensation von Dysfunktionen beitragen bzw. sie abschwächen.
3. Es gibt keinen grundlegenden gemeinsamen Wirkmechanimus der drei untersuchten Polyphenole. Zwar spielt Wasserstoffperoxid bei verschiedenen Stoffen eine Rolle, aber nicht bei allen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Wasserstoffperoxid abhängig von der vorherrschenden Konzentration wirkt und daher auch keine Allgemeingültigkeit des Effektes vorherzusagen ist. In niedrigen Konzentrationen sorgt Wasserstoffperoxid z. B. für eine Induktion der Autophagie und damit einhergehende eine Lebensverlängerung. Im Gegensatz dazu wirken hohe Wasserstoffperoxid-Konzentrationen lebensverkürzend und lösen verschiedene Formen von Zelltod aus.
4. Die Curcumin-vermittelte Langlebigkeit wurde das erste Mal in Verbindung mit einer funktionellen Autophagie gebracht. Im Detail führt die Behandlung mit Curcumin durch eine PaSOD1-abhängige leichte Erhöhung der Wasserstoffperoxid-Menge zu einer Induktion von nicht-selektiver Autophagie. Die induzierte Autophagie ist Ursache der Lebensverlängerung durch Curcumin.
5. Gossypol wirkt in Abhängigkeit der mitochondrialen Permeabilitäts-Transitionspore bzw. von ihrem Regulator Cyclophilin D. Hierbei verstärkt die deutlich erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge wahrscheinlich die Induktion von programmiertem Zelltod. Gleichzeitig wird eine cytoprotektive Form von Autophagie und ein scheinbar ATG-unabhängiger Abbau von Mitochondrien induziert.
6. Quercetin wirkt in "P. anserina" abhängig vom Methylierungs-Status. Untersuchungen mit Mutanten der "O"-Methyltransferase PaMTH1 ergaben die Notwendigkeit der Anwesenheit von PaMTH1 für den lebensverlängernden Effekt von Quercetin. Analysen mit dem methylierten Derivat Isorhamnetin verdeutlichten diese Abhängigkeit und zeigten zudem, dass Quercetin sowohl in der methylierten als auch unmethylierten Form Effekte hervorruft. Jedoch sind nur die Effekte des unmethylierten Quercetin unabhängig von der Lebensverlängerung und eher schädlich für die Zelle.
The liver as the biggest endocrine gland of the human body plays a central role in many metabolic pathways such as detoxification, storage of carbohydrates and distribution of lipids. As the liver receives blood supply from the gut by the portal vein, liver cells are often challenged with high concentrations of nutrients and components of our commensal microbiota. Therefore, the immune system of the liver induces a tolerant state, meaning no or low inflammatory reactions to those constant stimuli. Yet, as various pathogens target the liver, the hepatic immune system also needs the capability to induce strong immune responses quickly. Chronical damage to the liver, which can be caused by alcohol, pathogens or toxins, might lead to liver cirrhosis, where the amount of functional liver tissue is decreased dramatically. This pathology can worsen and lead to acute-on-chronic liver failure, whose high mortality is due to high inflammation and multi-organ failure. Interleukin-7 is a cytokine known for its pro-survival functions especially in lymphopoiesis. However, it is also very important for maintenance of mature immune cells in the liver. As mouse experiments have demonstrated an induction of Interleukin-7 in the liver as a response to bacterial lipopolysaccharide, we aimed to characterize the role of Interleukin-7 in hepatic immunoregulation in both health and disease.
The experiments were mostly based on in vitro approaches. Induction of Interleukin-7 in liver cells was analyzed using ELISA, quantitative PCR, and Immunoblotting. Knockdown of signal transduction components was performed by siRNA transfection. Primary immune cells isolated from healthy donor buffy coat were studied for their ability to respond to Interleukin-7. Activation of downstream signal transduction was assessed by Immunoblotting. Functional consequences of Interleukin-7 signaling, such as alterations in cellular metabolism, cellular survival and endotoxin tolerance, were studied in monocyte-derived macrophages. Finally, serum concentrations of Interleukin-7 and frequencies of Interleukin-7 receptor positive immune cells were quantified in patients with compensated or decompensated liver cirrhosis or acute-on-chronic liver failure.
Interleukin-7 expression could be observed in human hepatic cell lines and primary hepatic sinusoidal endothelial cells when stimulated with IFNα or IFNγ, but not IFNλ. IRF-1 was identified as a key regulator of Interleukin-7 expression, as its transcription, translation and nuclear translocation were induced and enhanced upon IFNα or IFNγ, but not IFNλ treatment. We identified LPS-primed macrophages as innate immune target cells of Interleukin-7, which responded by an inhibitory phosphorylation of GSK3. This signal transduction led to enhanced production of pro-inflammatory cytokines and abolished endotoxin tolerance. In parallel, cellular fitness was reduced as demonstrated by reduced intracellular ATP concentration and intracellular WST-1 staining. Finally, we could identify components of the in vitro signal transduction also in liver cirrhosis patients. However, Interleukin-7 serum concentrations were significantly in liver cirrhosis patients compared to healthy controls. In addition, the frequencies of Interleukin-7 receptor positive immune cell populations differed in patients and controls.
We identify Interleukin-7 as a pro-inflammatory cytokine in hepatic immunoregulation. It is part of a cascade where its induction is regulated by type I and type II Interferons and mainly restricted by the presence of IRF1. We demonstrate the importance of Interleukin-7 also for innate immune cells, where the abolishment of endotoxin tolerance may provide an interesting strategy of liver cirrhosis patients. In addition, reduced viability of macrophages in response to Interleukin-7 is a striking contrast to the well-described survival functions in lymphocytes. The decrease of serum Interleukin-7 levels and alterations of Interleukin-7 receptor positive immune cell populations suggest an important role for Interleukin-7 also in the diseased liver. Due to the identified mechanisms of action, Interleukin-7 may be an interesting candidate for immunotherapeutic approaches of liver cirrhosis and acute-on-chronic liver failure.