Biologische Hochschulschriften (Goethe-Universität)
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Die Analyse früher Entwicklungsstadien von Säugetierembryonen und daraus gewonnener Stammzelllinien kann entscheidende Erkenntnisse im Bereich der Reproduktionsbiologie und der regenerativen Medizin hervorbringen. Dabei spielt die Maus, als geeignetes Modellsystem für die Übertragbarkeit auf den Menschen eine wichtige Rolle, in erster Linie weil die Blastozysten der Maus verglichen mit menschliche Blastozysten eine morphologische Ähnlichkeit aufweisen. Humane embryonale Stammzelllinien haben großes Potential für die Anwendung in der regenerativen Medizin und vergleichend dazu wurde Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen verwendet, um tausende neuer Mausstämme zu generieren. Die Gewinnung embryonaler Stammzellen erfolgt im Blastozystenstadium, diese können dann nach Injektion in eine andere Blastozyste zur Entwicklung aller Gewebearten, einschließlich der Keimbahngewebe, beitragen (Martin, 1981; Evans and Kaufman 1981).
Ursache einer Fehlgeburt können vor allem Defekte in der Entwicklung des Trophoblasten und des primitive Entoderms (PrE) sein, dabei sind ca. 5 % der Paare betroffen die versuchen ein Kind zu bekommen (Stephenson and Kutteh, 2007). Eine Untersuchung dieser Zelllinien im Mausmodell könnte weitere Erkenntnisse für die Gründe einer Fehlentwicklung liefern. Trophoblasten Stammzelllinien können aus den Blastozysten der Maus und dem extraembryonalen Ektoderm von bereits implantieren Embryonen gewonnen werden (Tanaka et al., 1998). Diese Zelllinien geben Aufschluss über die Entwicklung des Trophoblasten, fördern die Entwicklung der Plazenta und sind gleichzeitig ein gutes Modellsystem um die Implantation des Embryos im Uterus näher zu untersuchen. Zellen des primitive Entoderms (PrE) beeinflussen das im Dottersack vorhandene extraembryonale Entoderm, welches dort als “frühe Plazenta” fungiert und für die Versorgung des Embryos mit Nährstoffen zuständig ist (Cross et al., 1994). Des Weiteren besitzt das Entoderm einen induktiven Einfluss auf die Bildung von anterioren Strukturen und die Bildung von Endothelzellen sowie Blutinseln (Byrd et al., 2002).
Extraembryonale Endodermstammzellen (XEN Zellen) können aus Blastozysten gewonnen und in embryonale Stammzellen (ES-Zellen) umgewandelt werden (Fujikura et al., 2002; Kunath et al., 2005). Es war jedoch nicht bekannt, ob XEN-Zellen auch aus Postimplantations-Embryonen gewonnen werden können. XEN-Zellen tragen in vivo zur Entwicklung des Darmendoderms bei (Kwon et al., 2008; Viotti et al., 2014) und könnten als alternative, selbsterneuernde Quelle für extraembryonale Endoderm-abgeleitete Zellen dienen, die zur Herstellung von Geweben für die regenerative Medizin verwendet werden könnten (Niakan et al., 2013).
In der Embryogenese der Maus zeigt sich an Tag E3.0 eine kompakte Morula die sich allmählich in das Trophektoderm (TE) differenziert, welches wiederum den Embryonalknoten (“innere Zellmasse”) umschließt (Johnson and Ziomek, 1981). Ein wichtiger Schritt im Rahmen der Entwicklung findet an Tag E3.5 statt, in diesem Zeitraum gehen aus dem Embryonalknoten der pluripotente Epiblast und das primitive Entoderm hervor. Im späten Blastozystenstadium an Tag E4.5 liegt das PrE als Zellschicht entlang der Oberfläche der Blastocoel-Höhle. Aus dem Epiblast entwickeln sich im weiteren Verlauf der Embryo, das Amnion und das extraembryonale Mesoderm des Dottersacks. Die Zellen des Trophektoderm führen zur Entwicklung der Plazenta. Das PrE differenziert sich im Zuge der Weiterentwicklung in das viszerale Entoderm (VE) und das parietale Entoderm (PE) des Dottersacks (Chazaud et al., 2006; Gardner and Rossant, 1979; Plusa et al., 2008). VE umgibt den Epiblast und extraembryonisches Ektoderm (ExE). PE-Zellen wandern entlang der inneren Oberfläche von TE und sezernieren zusammen mit Trophoblasten-Riesenzellen Basalmembranproteine, um die Reichert-Membran zu bilden (Hogan et al., 1980). Die Reichert-Membran besteht aus Basalmembranproteinen, einschließlich Kollagenen und Lamininen, die zwischen den parietalen Endoderm- und Trophoblastzellen liegen. Diese Membran wirkt als ein Filter, der dem Embryo den Zugang zu Nährstoffen ermöglicht, während er eine Barriere zu den Zellen der Mutter bildet (Gardner, 1983).
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The enzyme acetyl-CoA carboxylase (ACC) plays a fundamental role in the fatty acid metabolism. It regulates the first and rate limiting step in the biosynthesis of fatty acids by catalyzing the carboxylation of acetyl-CoA to malonyl-CoA and exists as two different isoforms, ACC1 and ACC2. In the last few years, ACC has been reported as an attractive drug target for treating different diseases, such as insulin resistance, hepatic steatosis, dyslipidemia, obesity, metabolic syndrome and nonalcoholic fatty liver disease. An altered fatty acid metabolism is also associated with cancer cell proliferation. In general, the inhibition of ACC provides two possibilities to regulate the fatty acid metabolism: It blocks the de novo lipogenesis in lipogenic tissues and stimulates the mitochondrial fatty acid β-oxidation. Surprisingly, the role of ACC in human vascular endothelial cells has been neglected so far. This work aimed to investigate the role of the ACC/fatty acid metabolism in regulating important endothelial cell functions like proliferation, migration and tube formation.
To investigate the function of ACC, the ACC-inhibitor soraphen A as well as an siRNA-based approach were used. This study revealed that ACC1 is the predominant isoform both in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and in human dermal microvascular endothelial cells (HMECs). Inhibition of ACC via soraphen A resulted in decreased levels of malonyl-CoA and shifted the lipid composition of endothelial cell membranes. Consequently, membrane fluidity, filopodia formation and the migratory capacity were attenuated. Increasing amounts of longer acyl chains within the phospholipid subgroup phosphatidylcholine (PC) were suggested to overcompensate the shift towards shorter acyl chains within phosphatidylglycerol (PG), which resulted in a dominating effect on regulating the membrane fluidity. Most importantly, this work provided a link between changes in the phospholipid composition and altered endothelial cell migration. The antimigratory effect of soraphen A was linked to a reduced amount of PG and to an increased amount of polyunsaturated fatty acids (PUFAs) within the phospholipid cell membrane. This link was unknown in the literature so far. Interestingly, a reduced filopodia formation was observed upon ACC inhibition via soraphen A, which presumably caused the impaired migratory capacity.
This work revealed a relationship between ACC/fatty acid metabolism, membrane lipid composition and endothelial cell migration. The natural compound soraphen A emerged as a valuable chemical tool to analyze the role of ACC/fatty acid metabolism in regulating important endothelial cell functions. Furthermore, regulating endothelial cell migration via ACC inhibition promises beneficial therapeutic perspectives for the treatment of cell migration-related disorders, such as ischemia reperfusion injury, diabetic angiopathy, macular degeneration, rheumatoid arthritis, wound healing defects and cancer.
Licht ist ein wertvolles Werkzeug zur Regulation biochemischer Reaktionsabläufe. Denn die Applikation von Licht erlaubt eine sehr präzise Einflussnahme auf den Ort und den Startzeitpunkt der zu untersuchenden Reaktionen. Als nichtinvasives Medium bietet die Lichtkontrolle bei der Wahl einer geeigneten Anregungswellenlänge den Vorteil nur minimal in einen lebenden Organismus einzugreifen. Um eine solche lichtbasierte Kontrolle für biologische Anwendungen zu realisieren, ist die Anwesenheit einer lichtsensitiven Verbindung nötig. Ein Konzept der lichtsensitiven Verbindungen ist die sogenannte photolabile Schutzgruppe. Im Allgemeinen handelt es sich hierbei um einen Chromophor der temporär an ein Biomolekül angebracht wurde, um dessen biologische Aktivität zu unterdrücken.
In dieser Arbeit wurde dieses Konzept auf das Antibiotikum Puromycin angewendet, welches durch das synthetische Anbringen der Cumarin-Schutzgruppe DEACM in seiner biologischen Aktivität behindert und durch einen Lichtpuls wieder freigesetzt wurde. DEACM st eine photolabile Schutzgruppe mit breitem Anwendungsspektrum, da es im Vergleich zu anderen Cumarin-Derivaten vorteilhafte photophysikalische Eigenschaften aufweist. Zum einen ist durch den 7-Diethylamino-Substituenten das Absorptionsmaximum dieser Verbindung um etwa 20 nm bathochrom verschoben. Zum anderen zeichnet sich dieses Derivat durch einen erheblich erhöhten Extinktionskoeffizienten aus, sodass eine Freisetzungsreaktion mit einer geringeren Lichtdosis induziert werden kann, was weniger Stress für die Zellen in lebenden Systemen bedeutet.
Die antibiotische Wirkung von Puromycin beruht auf der strukturellen Ähnlichkeit zum5'-Ende von Tyrosyl-tRNA, wodurch sich das Antibiotikum kondonunspezifisch während der Translation der Proteinsynthese an das Ribosom anlagern kann. Anschließend wird die naszierende Polypeptidkette auf das Puromycin transferiert. Da diese neue Bindung unter biologischen Bedingungen nicht spaltbar ist, führt dies zu einer verfrühten Freisetzung des Polypeptid-Puromycin-Fragments. Schließlich ist die Proteinsynthese vollständig abgebrochen.
Die Motivation zur photoinduzierten Kontrolle von Puromycin besteht in der Vielzahl an biologischen Applikationsmöglichkeiten, da die lichtregulierte Freisetzung der biologischen Aktivität als Trigger für sich anschließende biochemische Abläufe verwendet werden kann. Durch das hier gezeigte System kann in Kombination mit anderen Techniken (z.B. NMR) die posttranslationale Proteinfaltung beobachtet werden, welche als hochgradig komplexer Prozess bisher nicht verstanden ist. Eine weitere Motivationsgrundlage ist die Anwendung von DEACM-puromycin in Nervenzellen. Hier kann durch die Photofreisetzung die Proteinsynthese in den Dendriten der Neuronen beobachtet werden, wodurch Rückschlüsse auf neurodegenerative Krankheiten möglich sein sollten, wie z.B. Alzheimer-Krankheit. In dieser Arbeit konnte in-vitro nachgewiesen werden, dass die antibiotische Wirkung von Puromycin mittels Licht kontrollierbar ist. Aus der photophysikalischen Grundcharakterisierung ging hervor, dass DEACM-puromycin einen hohen Extinktionskoeffizienten bei Wellenlängen größer als 380 nm aufweist. Folglich kann zur Induktion der Photolyse eine geringere Lichtdosis mit energiearmer Strahlung als bei dem Vorläufersystem NVOC-puromycin verwendet werden, angesichts dessen ist das hier vorgestellte DEACM-puromycin für Anwendungen in Zellen zu empfehlen.
Über die Kombination von quantenchemischen Rechnungen und spektroskopischen Methoden konnten die frühen Schritte der Freisetzungsreaktion bestimmt und quantifiziert werden. Zudem zeigte sich ein Einfluss der Lösungsmittelzusammensetzung auf die Uncaging-Schritte. In Gegenwart eines protischen Lösungsmittels wird der zum Uncaging in Konkurrenz stehende Prozess der Fluoreszenz unterdrückt, wodurch die Freisetzungsschritte effektiver werden. Zudem führt die Präsenz von Protonen zu einer Stabilisierung des ionischen Intermediates, sodass die Bildung dessen beschleunigt ablaufen kann. Die Spaltung der photolabilen Schutzgruppen vom Puromycin findet mit einer Rate von 0,71*10^8 s-1 statt, welche im Vergleich zu Vorgängersystem um eine Größenordnung größer ist. Die Wiederherstellung der biologischen Aktivität resultiert aber erst nach einem anschließenden Decarboxylierungsschritt. Mithilfe von IR-Messungen konnte die Decarboxylierung beobachtet und daraus die Quantenausbeute zu 2,5% determiniert werden. Die so bestimmte Quantenausbeute entspricht etwa dem Zweifachen von NVOC-puromycin, sodass die hier untersuchte Verbindung eindeutig als das effizientere System zu betrachten ist. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass DEACM-puromycin vorteilhafte photophysikalische Eigenschafen aufweist, die diese Verbindung zu einem wertvollen Hilfsmittel für eine Vielzahl von lichtkontrollierten Untersuchungen in biologischer Umgebung macht. Zudem wurden Einblicke in den Reaktionsmechanismus gegeben, die das Verständnis der photolytischen Spaltung von Carbamat-geschützten Cumarinen erstmals auf der ultrakurzen Zeitskala ermöglicht.
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Sphingolipide nicht nur eine strukturgebende Funktion in der Plasmamembran aufweisen, sondern ebenfalls als Botenstoffe intra- und extrazellulär aktiv sind. Sphingosin-1-Phosphat (S1P) bildet dabei einen Schlüssel-Metaboliten, da es verschiedene Zellfunktionen wie Wachstum und Zelltod beeinflusst. Es wird durch zwei Isoformen der Sphingosinkinasen, SK1 und SK2, gebildet. Die SK1 wurde bereits gut untersucht und es konnte gezeigt werden, dass sie eine wichtige Rolle beim Zellwachstum einnimmt und einen entscheidender Regulator bei inflammatorischen Erkrankungen und Krebs darstellt. Über die SK2 ist soweit wenig bekannt und die Ergebnisse sind zum Teil kontrovers. Sowohl pro-proliferative als auch anti-proliferative Funktionen der SK2 wurden beschrieben. Andererseits handelt meine Arbeit von Nierenfibrose, da beschrieben wurde, dass Sphingolipide einen wichtigen Einfluss auf die Entwicklung chronischer Nierenerkrankungen nehmen. Nierenfibrose stellt das Endstadium chronischer Nierenerkrankungen dar und führt zu einer Akkumulation der Extrazellulärmatrix, Organvernarbung und zum Verlust der Nierenfunktion. Die SK1 spielt dabei eine protektive Rolle bei der Entstehung von Nierenfibrose. Deshalb sollte in dieser Arbeit die Rolle der Sk2 bei der Entstehung von Nierenfibrose untersucht werden.
Im ersten Teil meiner Arbeit wurde das Mausmodell der unilateralen Ureterobstruktion (UUO) verwendet, welches zur Entwicklung einer tubulointerstitiellen Nephritits und nachfolgender Fibrose führt. Es konnte dabei gezeigt werden, dass sowohl die Protein-Expression als auch die Aktivität der SK2 im fibrotischen Nierengewebe gesteigert wurden. Allgemein wiesen die SK2-/--Mäuse eine verminderte Fibrose in Folge des UUO auf im Vergleich zu den Wildtyp-Mäusen. Dies wurde bestätigt durch eine reduzierte Kollagenakkumulation, sowie eine verminderte Protein-Expression von Fibronektin-1, Kollagen-1, α-smooth muscle actin, connective tissue growth factor (CTGF) und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor1 (PAI-1). Diese Effekte gingen einher mit einer gesteigerten Protein-Expression des inhibitorischen Smad7 und erhöhten Sphingosin-Spiegeln in SK2-/--UUO-Nieren. Auf mechanistischer Ebene vermindern die erhöhten Sphingosin-Spiegel die durch transforming growth factor-β (TGFβ) induzierte Kollagenakkumulation, die PAI-1- und CTGF-Expression, aber induzieren die Smad7-Expression in primären Nierenfibroblasten. In einem komplementären Versuch mit hSK2 tg-Mäusen wurde eine verstärkte Entstehung von Nierenfibrose mit erhöhter Kollagenakkumulation, sowie erhöhte Protein-Expressionen von Fibronektin-1, Kollagen-1, α-smooth muscle actin, CTGF und PAI-1 festgestellt. Die Smad7-Expression dagegen war vermindert.
Im zweiten Teil meiner Arbeit stand der glomeruläre Teil der Niere im Fokus und es wurde untersucht, ob die Überexpression der SK2 zu einer phänotypischen Veränderung der glomerulären Mesangiumzellen führt. Mesangiumzellen wurden dazu aus den hSK2 tg-Mäuse isoliert und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass hSK2 und mSK2 in den transgenen Zellen hauptsächlich in der zytosolischen Fraktion lokalisiert sind, während S1P ausschließlich im Kern akkumulierte. Weiterhin konnte eine verminderte Proliferation unter normalen Wachstumsbedingungen der hSK2 tg-Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen beobachtet werden. Die Zellen reagierten auch sensitiver auf Stress-induzierte Apoptose. Auf molekularer Ebene konnte dies durch eine reduzierte ERK- und Akt/PKB-Aktivierung erklärt werden. Nach Staurosporin-Behandlung wurde Apoptose durch den intrinsischen, mitochondrialen Apoptosesignalweg induziert. Dabei konnte eine reduzierte anti-apoptotische Bcl-xL-Expression und vermehrte Prozessierung von Caspase-9 und Caspase-3 und PARP beobachtet werden.
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass eine verminderte tubulointerstitielle Fibrose-Entstehung durch die Deletion der SK2, sowie anti-proliferative und Apoptose-induzierende Effekte durch die SK2 in Mesangiumzellen nachgewiesen werden konnten. Somit könnten SK2-Inhibitoren die Entstehung tubulointerstitieller Fibrose und mit Proliferation assoziierte Erkrankungen wie mesangioproliferative Glomerulonephritis positiv beeinflussen.
The fungal interaction with plants is a 400 million years old phenomenon, which presumably assisted in the plants’ establishment on land. In a natural ecosystem, all plant-ranging from large trees to sea-grasses-are colonized by fungal endophytes, which can be detected inter- and intracellularly within the tissues of apparently healthy plants, without causing obvious negative effects on their host. These ubiquitous and diverse microorganisms are likely playing important roles in plant fitness and development. However, the knowledge on the ecological functions of fungal root endophytes is scarce. Among possible functions of endophytes, they are implicated in mutualisms with plants, which may increase plant resistance to biotic stressors like herbivores and pathogens, and/or to abiotic factors like soil salinity and drought. Also, endophytes are fascinating microorganisms in regard to their high potential to produce a great spectrum of secondary metabolites with expected ecological functions. However, evidences suggest that the interactions between host plants and endophytes are not static and endophytes express different symbiotic lifestyles ranging from mutualism to parasitism, which makes difficult to predict the ecological roles of these cryptic microorganisms. To reveal the ecological function of fungal root endophytes, this doctoral thesis aims at assessing fungal root endophytes interactions with different plants and their effects on plant fitness, based on their phylogeny, traits, and competition potential in settings encompassing different abiotic contexts. To understand the cryptic implication of nonmycorrhizal endophytes in ecosystem processes, we isolated a diverse spectrum of fungal endophytes from roots of several plant species growing in different natural contexts and tested their effects on different model plants under axenic laboratory conditions. Additionally,we aimed at investigating the effect of abiotic and biotic variables on the outcome of interactions between fungal root endophytes and plants.
In summary, the morphological and physiological traits of 128 fungal endophyte strains within ten fungal orders were studied and artificial experimental systems were used to reproduce their interactions with three plant species under laboratory conditions. Under defined axenic conditions, most endophytes behaved as weak parasites, but their performance varied across plant species and fungal taxa. The variation in the interactions was partly explained by convergent fungal traits that separate groups of endophytes with potentially different niche preferences. According to my findings, I predict that the functional complementarity of strains is essential in structuring natural root endophytic communities. Additionally, the responses of plant-endophyte interactions to different abiotic factors, namely nutrient availability, light intensity, and substrate’s pH, indicate that the outcome of plant-fungus relationships may be robust to changes in the abiotic environment. The assessment of the responses of plant endophyte interactions to biotic context, as combinations of selected dominant root fungal endophytes with different degrees of trait similarity and shared evolutionary history, indicates that frequently coexisting root-colonizing fungi may avoid competition in inter-specific interactions by occupying specific niches, and that their interactions likely define the structure of root-associated fungal communities and influence the microbiome impacts on plant fitness.
In conclusion, my findings suggest that dominant fungal lineages display different ecological preferences and complementary sets of functional traits, with different niche preferences within root tissues to avoid competition. Also, their diverse effects on plant fitness is likely host-isolate dependent and robust to changes in the abiotic environment when these encompass the tolerance range of either symbiont.
Acute myeloid leukemia (AML) is a clonal malignancy of hematopoietic stem cells (HSCs) characterized by expansion of myeloid blasts in the bone marrow. It has been shown that autophagy is a degradative process, which delivers cytoplasmic components to lysosomes to prevent malignant transformation by maintaining HSC integrity. Besides its function as a bulk degradation machinery to recycle cytoplasmic components during limited energy supply, autophagy also serves as an intracellular quality control mechanism. Selective autophagy requires autophagy receptors such as p62 to specifically bridge the targeted cargos into autophagosomes. p62 is known as a central signaling hub involved in pro-oncogenic signaling pathways and autophagic degradation pathways. However, little is known about the role of p62 as a selective autophagy receptor in AML. This study aims to elucidate the precise function of p62 as an autophagy receptor in leukemia development and maintenance.
In silico analysis revealed that high p62 expression was significantly associated with poor overall survival of adult patients with de novo AML, suggesting that p62 may promote leukemia maintenance. To address the functional role of p62 in leukemia, genome editing by CRISPR/Cas9 was used to knockout p62 in four human AML cell lines. Importantly, p62 loss reduced cell proliferation in all four cell lines. This observation could be transferred to a murine leukemia cell model in which leukemic transformation of lineage-depleted bone marrow (ldMBM) cells was induced by overexpression of the human transcriptional coactivator MN1. Knockdown of p62 by shRNA in MN1-driven leukemia cells impaired proliferation and decreased colony forming ability without altering apoptosis. This indicates that p62 is crucial for leukemia proliferation in vitro. To further characterize the role of p62 in leukemia development and maintenance a murine AML transplantation model was established. Therefore, ldMBM cells isolated from WT and p62-/- mice were transduced with MN1 and transplanted into lethally irradiated mice. As expected, all mice developed fatal myeloid proliferation. Notably, p62 loss in MN1-driven leukemia significantly prolonged survival in mice and caused a more immature phenotype. Consistent with the in vitro results, ex vivo analysis of p62-/- leukemic cells displayed decreased colony-forming ability, although p62 loss did not affect composition and function of HSCs. Moreover, re-transplantation of primary MN1-driven leukemia cells attenuated leukemia progression upon p62 loss. These findings support a decisive role of p62 in leukemia development and maintenance.
To gain molecular insight into the function of p62 during myeloid transformation an interactome analysis of murine MN1-driven leukemia cells was performed. This revealed first that p62 predominantly interacts with mitochondrial proteins and second that inhibition of autophagic degradation causes accumulation of p62-bound mitochondria. This leads to the first assumption that loss of p62 may provoke mitochondrial accumulation with increasing mitochondrial damage and second that p62 may mediate degradation of mitochondria by mitophagy. Indeed, in the absence of p62, accumulation of dysfunctional mitochondria was detected by morphological changes of the mitochondria, increased mitochondrial ROS and impaired mitochondrial respiration capacity. Furthermore, induction of PINK1/Parkin-independent mitophagy revealed that loss of p62 caused impaired degradation of mitochondrial proteins and reduced translocation of damaged mitochondria into autophagosomes. Taken together, p62 is required for effective degradation of dysfunctional mitochondria by mitophagy in AML.
Due to the fact that p62 is a multifunctional protein, rescue experiments with different mutants of p62 were performed to clarify if p62-mediated mitophagy contributes to leukemia proliferation. Notably, the autophagy-deficient mutant (disabled to bind autophagosomes) reduced cell growth and colony-forming ability to the same extent as knockdown of p62, as the clustering-deficient mutant (disabled to form aggregates) displayed an intermediate phenotype. Strikingly, only the autophagy-deficient mutant failed to rescue mitophagy.
In conclusion, this study demonstrates the prominent role of p62 as a selective autophagy receptor for mitochondrial quality control which contributes to leukemia development and maintenance. Therefore, targeting selective autophagy opens new venues in the treatment of AML.
Infections with the hepatitis B virus (HBV) or the hepatitis C virus (HCV) lead to complications like the development of cirrhosis or hepatocellular carcinoma. These complications end up in 887,000 and 500,000 deaths per year, respectively. Since the development of new direct acting antiviral agents for HCV in the past years a complete cure of an HCV infection can be achieved in the majority of the patients. In contrast, a complete cure of a chronic HBV infection still remains a challenging problem as current treatment regimens mainly suppress the viral replication and cccDNA as well as integrated DNA still persist in these patients. Several viral and host factors were described to impair the efficacy of treatment regimens or influence the course of the infection. Therefore, in this work viral factors as well as host factors were investigated in HBeAg negative chronic HBV infected patients and in chronic HCV infected patients. In the present study, it was demonstrated that mutations and/or deletions in the HBV basal core promoter (BCP), the precore and the preS domain occur in a genotype-specifc pattern in HBeAg negative HBV infected patients. While the BCP double mutation A1762T/G1764A was found with the highest prevalence in genotype E infected patients, the precore mutation G1896A occurred mostly in genotype B infected patients. Variants in the preS domain could be detected with the highest frequency in patients infected with genotype C. In patients, who had to start an antiviral therapy during the course of the disease, mutations in the precore region could be detected with a higher frequency in the samples right before treatment start in comparison to the baseline sample.
While different HBV genotypes and preS mutations were not associated with HBV-DNA serum levels, precore mutations as well as BCP mutations were significantly associated with HBV-DNA levels. Furthermore, precore mutations showed lower and preS mutations higher HBsAg levels. The HBsAg serum levels varied significantly among the different genotypes. Since HBsAg levels < 1000 IU/ml have been described as a prognostic marker in several studies, the prevalence of patients with HBsAg < 1000 IU/ml was analyzed among the genotypes A - E. While most of the patients infected with HBV genotype B had HBsAg < 1000 IU/ml, only a few patients infected HBV genotype E and A had HBsAg < 1000 IU/ml.
Furthermore, HBV genotype A genomes derived from patients harboring a) A1762T/ G1764A (BCP), b) G1896A/G1899A (precore), c) 15 aa deletion in preS1, d) no mutation (reference genome) were cloned and analyzed in vitro. An enhanced expression but reduced secretion of viral genomes was found in the preS-deletion- and the precore-variant. No differences in the HBsAg production and secretion were observed in the cloned precore- or BCP-variant, while the preS-deletion-variant was characterized with an elevated HBsAg release.
Regarding the secretion of viral and subviral particles, a genotype-specifc pattern of the L/M/SHBs ratio was detected in the serum of patients infected with genotypes A - E. This pattern did not change in the serum of patients, who started antiviral treatment. Secreted HBsAg containing particles displayed a higher density as well as a higher filaments/spheres ratio in genotypes B and D compared to genotypes A, C and E. Population-based and deep sequencing revealed large deletions in the preS domain or preS2 start codon mutations in a certain number of the viral genomes. Theoretically, these mutations/deletions should influence the molecular weight of the expressed protein or abolish the expression of the protein at all. In contrast, LHBs/MHBs were detectable and appeared at the same molecular weight in these patient samples in comparison to patient samples without these mutations. Furthermore, in the in vitro analyses comparing the reference genome and the preS1-deletion genome, it was shown that the deletion indeed influenced the molecular weight of LHBs. Therefore, HBsAg might be expressed from a genetically different source than the released viral genomes, meaning the integrated DNA.
Additionally, in the present study the prevalence of resistance associated substitutions (RASs) in the viral genes NS3, NS5A and NS5B of chronic HCV infected patients was analyzed in correlation to single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the interferon-λ4 (IFNL4) gene of the infected patients. No significant correlation was found between IFNL4 SNPs and RASs within NS3/NS5B in the present cohort. In contrast, the frequently detected NS5A RAS Y93H could be significantly associated with beneficial IFNL4 SNPs and a high baseline viral load in HCV genotype 1-infected patients.
Taken together, the present study demonstrated that viral genome mutations as well as the morphology of secreted particles occur in a genotype-dependent pattern in HBeAg negative HBV infected patients with no need of antiviral therapy. As the amount of serum qHBsAg levels varied among the different genotypes, the HBsAg cut-off < 1000 IU/ml should be adapted individually among the various genotypes. Because the composition of the secreted subviral particles varied between the different genotypes, a genotype-specific immune-response might be induced in these patients. Additionally, the results of the present study indicate that in HBeAg negative HBV infected patients with mutations or deletions in the preS domain MHBs and LHBs might be expressed from the integrated DNA and therefore from a genetically different source than the released viral genomes.
Aside from that, the finding of a significant association of the NS5A RAS Y93H with beneficial IFNL4 SNPs in chronic HCV infected patients may explain a lack of a correlation or an inverse correlation of treatment response with the IFNL4 genotype in some NS5A inhibitor-containing IFN-free regimens.
The continuous conversion of natural wildlife habitats into agricultural areas, as well as the fragmentation of the last wildlife refuges, is increasing the interface between people and wildlife. When wildlife negatively impacts on people and vice versa, we speak about human-wildlife conflicts (HWCs). This definition includes losses on both sides and takes into consideration the rooting of most of these conflicts between different groups of interest, such as advocates for nature conservation and economic groups. The centres of highest biodiversity are located in developing countries, which are also characterized by poverty. In African and Asian countries, people living in the vicinity of national parks and other conservation areas mostly receive only little support through the government or conservation organisations. Especially for those people who are dependent on agriculture, damage to fields and harvests can have catastrophic consequences. If the species causing damage is protected by national or even international law, the farmer is not allowed to use lethal methods, but has to approach the authority in charge. If this agency, however, cannot offer appropriate support, resentment, anger or even hate develops, and the support for wildlife conservation activities declines. For this reason, HWCs were declared as one of the most important conservation topics today, being particularly relevant for large and threatened species such as the African and Asian elephant, hippopotamus and the greater one-horned rhino, as well as for large predators. Up to today, no general assessment scheme has been recommended for damage caused by protected wildlife species.
In my study, HWCs in Asia and Africa are compared, focussing on all herbivorous species identified which damaged crops. For the French NGO Awely, des animaux et des hommes, I developed a detailed assessment scheme suitable for all terrestrial ecosystems, and any type of HWCs and any species (Chapter 2). This HWC assessment scheme was used in four different study areas located in two African countries (South Luangwa/Zambia (SL), Tarangire/Tanzania (TA)) and two Asian countries (Bardia/Nepal (BA) and Manas/India (MA)). This scheme ran for six consecutive years (2009 to 2014) for Zambia, Nepal and India and two years (2010 to 2011) for Tanzania. To carry out the assessments, I trained local HWC officers (Awely Red Caps) to assess HWCs by field observations (measurement of damage, identification of species through signs of presence, landscape attributes etc.) and interviews with aggrieved parties (socio economic data). Results of this assessment are presented in Chapters 2-4.
To determine whether elephants prefer or avoid specific crop species, two field experiments were carried out, one in SL and one in BA (Chapter 5 and 6). For this, two test plots were set up and damage by elephants (and other herbivores) were quantified.
Within this doctoral thesis, 3306 damage events of 7408 aggrieved parties were analysed. In three out of the four study areas (SL, BA, MA), elephants caused the highest number of damage events compared to all other wildlife species, however, in TA, most fields were damaged by zebra. Furthermore, the greater one-horned rhino, hippopotamus, wild boar, bushpig, deer and antelope, as well as primates, caused damage to fields and harvests. Damage to houses and other property were nearly exclusively caused by elephants.
With this doctoral thesis I was able to show that season, crop availability, type and the phenological stage of the crop played an important role for crop damaging behavior of herbivores (Chapter 2). Elephants especially damaged rice, maize and wheat and preferred all crop types in a mature stage of growth. In contrast, rhinos preferred wheat to rice and similar to antelope and deer, they preferred crops at earlier stages of growth, before ripening. Crop damage by wildlife species varied strongly in size; most damages fell below 40% of the total harvest per farmer, but in several cases (3 to 8% depending on the study area), harvests were completely destroyed. Interestingly, during times of low nutritional availability in the natural habitat (dry season), crop damages in all four study areas were significantly less than during other seasons.
In all four study areas, crop protection strategies, such as active guarding in the fields, chasing wildlife with noise or fire torches or erecting barriers, were used. In some cases protection strategies were combined. Analysis of data revealed that traditional protection strategies did not reduce the costs of damage (Chapter 3). In some cases, costs of damage, on protected fields were even higher than for unprotected fields. Only in MA did strategic and cohesive guarding significantly reduce crop damage by wildlife species.
Besides damage in the fields, elephants also caused damage to properties in the villages. In search for stored staple crops, they damaged houses, grain stores and kitchens. Such damage was analysed in three study areas (SL, BA, MA) (Chapter 4). Although property damage occurred less frequently compared to crop damage in the fields, the mean cost of this damage was found to be double in BA/MA and four times higher in SL, compared to the costs of crop damage in the fields. It is further remarkable that property damage significantly increased towards the dry season, when the harvest was brought into the villages.
The findings of this study underpin the assumption that wildlife herbivores, especially elephants, are lured to fields and crops because the highly nutritional food (crop) being readily available. Traditional crop protection is cost and labour intensive and does not reduce the costs of damage. For this reason, crop types, which are thought to be not consumed by elephants were systematically tested on their attractiveness in field experiments in SL and BA (Chapter 5 and 6). In SL, lemon grass, ginger and garlic were proven to be less attractive to African elephants than maize and in BA, basil, turmeric, chamomile, coriander, mint, citronella and lemon grass were found to be less attractive to Asian elephants than rice.
The results of this doctoral thesis are relevant for the management of wildlife conservation as they can lead to new approaches to the mitigation of HWCs in African and Asian countries. Finally, specific needs for more scientific research in this field have been identified.
In den letzten Jahren findet die Wirkung von Polyphenolen auf den Alterungsprozess oder zur Behandlung von Krankheiten immer mehr Beachtung. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der Wirkmechanismen der Polyphenole Gossypol, Curcumin und Quercetin, um Hinweise für neue oder verbesserte Therapieansätze zu erhalten. Die dazu durchgeführten Untersuchungen lieferten folgende Ergebnisse:
1. Der Ascomycet "P. anserina" eignet sich als Modellorganismus zur Untersuchung der Wirkmechanismen verschiedener Polyphenole, da die bereits aus der Literatur bekannten Effekte auf das Überleben höherer Organismen auch in "P. anserina" beobachtet wurden.
2. Die Mitochondrienfunktion spielt auf unterschiedliche Art eine Rolle in der Kompensation von Dysfunktionen oder Stressbedingungen in der Zelle und wirkt somit positiv auf die Regulation der Lebensspanne von "P. anserina". In der "PaSod3"-Deletionsmutante wurde eine Verschiebung der mitochondrialen Atmung von einer Komplex I-abhängigen hin zu einer vermehrt Komplex II-abhängigen Atmung festgestellt. Die damit verbundene Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials dient neben der bereits bekannten hohen Superoxid-Menge als Signal zur Mitophagie-Induktion. Auch die Anpassung der Mitochondrienfunktion durch die erhöhte Bildung von mtRSCs, wie im Falle von Gossypol oder Quercetin, kann zur Kompensation von Dysfunktionen beitragen bzw. sie abschwächen.
3. Es gibt keinen grundlegenden gemeinsamen Wirkmechanimus der drei untersuchten Polyphenole. Zwar spielt Wasserstoffperoxid bei verschiedenen Stoffen eine Rolle, aber nicht bei allen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Wasserstoffperoxid abhängig von der vorherrschenden Konzentration wirkt und daher auch keine Allgemeingültigkeit des Effektes vorherzusagen ist. In niedrigen Konzentrationen sorgt Wasserstoffperoxid z. B. für eine Induktion der Autophagie und damit einhergehende eine Lebensverlängerung. Im Gegensatz dazu wirken hohe Wasserstoffperoxid-Konzentrationen lebensverkürzend und lösen verschiedene Formen von Zelltod aus.
4. Die Curcumin-vermittelte Langlebigkeit wurde das erste Mal in Verbindung mit einer funktionellen Autophagie gebracht. Im Detail führt die Behandlung mit Curcumin durch eine PaSOD1-abhängige leichte Erhöhung der Wasserstoffperoxid-Menge zu einer Induktion von nicht-selektiver Autophagie. Die induzierte Autophagie ist Ursache der Lebensverlängerung durch Curcumin.
5. Gossypol wirkt in Abhängigkeit der mitochondrialen Permeabilitäts-Transitionspore bzw. von ihrem Regulator Cyclophilin D. Hierbei verstärkt die deutlich erhöhte Wasserstoffperoxid-Menge wahrscheinlich die Induktion von programmiertem Zelltod. Gleichzeitig wird eine cytoprotektive Form von Autophagie und ein scheinbar ATG-unabhängiger Abbau von Mitochondrien induziert.
6. Quercetin wirkt in "P. anserina" abhängig vom Methylierungs-Status. Untersuchungen mit Mutanten der "O"-Methyltransferase PaMTH1 ergaben die Notwendigkeit der Anwesenheit von PaMTH1 für den lebensverlängernden Effekt von Quercetin. Analysen mit dem methylierten Derivat Isorhamnetin verdeutlichten diese Abhängigkeit und zeigten zudem, dass Quercetin sowohl in der methylierten als auch unmethylierten Form Effekte hervorruft. Jedoch sind nur die Effekte des unmethylierten Quercetin unabhängig von der Lebensverlängerung und eher schädlich für die Zelle.
The liver as the biggest endocrine gland of the human body plays a central role in many metabolic pathways such as detoxification, storage of carbohydrates and distribution of lipids. As the liver receives blood supply from the gut by the portal vein, liver cells are often challenged with high concentrations of nutrients and components of our commensal microbiota. Therefore, the immune system of the liver induces a tolerant state, meaning no or low inflammatory reactions to those constant stimuli. Yet, as various pathogens target the liver, the hepatic immune system also needs the capability to induce strong immune responses quickly. Chronical damage to the liver, which can be caused by alcohol, pathogens or toxins, might lead to liver cirrhosis, where the amount of functional liver tissue is decreased dramatically. This pathology can worsen and lead to acute-on-chronic liver failure, whose high mortality is due to high inflammation and multi-organ failure. Interleukin-7 is a cytokine known for its pro-survival functions especially in lymphopoiesis. However, it is also very important for maintenance of mature immune cells in the liver. As mouse experiments have demonstrated an induction of Interleukin-7 in the liver as a response to bacterial lipopolysaccharide, we aimed to characterize the role of Interleukin-7 in hepatic immunoregulation in both health and disease.
The experiments were mostly based on in vitro approaches. Induction of Interleukin-7 in liver cells was analyzed using ELISA, quantitative PCR, and Immunoblotting. Knockdown of signal transduction components was performed by siRNA transfection. Primary immune cells isolated from healthy donor buffy coat were studied for their ability to respond to Interleukin-7. Activation of downstream signal transduction was assessed by Immunoblotting. Functional consequences of Interleukin-7 signaling, such as alterations in cellular metabolism, cellular survival and endotoxin tolerance, were studied in monocyte-derived macrophages. Finally, serum concentrations of Interleukin-7 and frequencies of Interleukin-7 receptor positive immune cells were quantified in patients with compensated or decompensated liver cirrhosis or acute-on-chronic liver failure.
Interleukin-7 expression could be observed in human hepatic cell lines and primary hepatic sinusoidal endothelial cells when stimulated with IFNα or IFNγ, but not IFNλ. IRF-1 was identified as a key regulator of Interleukin-7 expression, as its transcription, translation and nuclear translocation were induced and enhanced upon IFNα or IFNγ, but not IFNλ treatment. We identified LPS-primed macrophages as innate immune target cells of Interleukin-7, which responded by an inhibitory phosphorylation of GSK3. This signal transduction led to enhanced production of pro-inflammatory cytokines and abolished endotoxin tolerance. In parallel, cellular fitness was reduced as demonstrated by reduced intracellular ATP concentration and intracellular WST-1 staining. Finally, we could identify components of the in vitro signal transduction also in liver cirrhosis patients. However, Interleukin-7 serum concentrations were significantly in liver cirrhosis patients compared to healthy controls. In addition, the frequencies of Interleukin-7 receptor positive immune cell populations differed in patients and controls.
We identify Interleukin-7 as a pro-inflammatory cytokine in hepatic immunoregulation. It is part of a cascade where its induction is regulated by type I and type II Interferons and mainly restricted by the presence of IRF1. We demonstrate the importance of Interleukin-7 also for innate immune cells, where the abolishment of endotoxin tolerance may provide an interesting strategy of liver cirrhosis patients. In addition, reduced viability of macrophages in response to Interleukin-7 is a striking contrast to the well-described survival functions in lymphocytes. The decrease of serum Interleukin-7 levels and alterations of Interleukin-7 receptor positive immune cell populations suggest an important role for Interleukin-7 also in the diseased liver. Due to the identified mechanisms of action, Interleukin-7 may be an interesting candidate for immunotherapeutic approaches of liver cirrhosis and acute-on-chronic liver failure.
Quantenchemische Untersuchungen zu Reaktionsmechanismen reaktiver Carben- und Silylenverbindungen
(2018)
In dieser Arbeit werden Reaktionsmechanismen verschiedener Carben- und Silylenverbindungen mit quantenchemischen Methoden untersucht: Die Zerfallsreaktion acylischer Diaminocarbene, die Reaktion verschiedener Diaminocarbene mit CO, die C-C Kupplung von Benzophenon mit SiCl2, die Reaktion von NHC mit Si2Br6 und die Reaktion von Dimethyltitanocen mit neo-Si5H12
EBV Infektionen nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation sind neben dem Rezidiv eine häufige Komplikation und verbleiben ein häufiger Grund der Morbidität. Langanhaltende Immunsuppression oder die verspätete T-Zell Recovery können EBV Infektionen nach Transplantation begünstigen, welche unter diesen Umständen zu lebensbedrohlichen lymphoproliferativen Erkrankungen (PTLD) führen können. Für die optimale Behandlung der PTLD gibt es keinen Konsens. Adoptive Immuntherapien mit sowohl anti-Tumor Kapazität als auch wiederhergestellter virus-spezifischer zellulärer Immunität könnten, vor allem im Bezug einer PTLD, eine optimale Behandlungs-Option darstellen.
Zytokin-induzierte Killer (CIK)-Zellen repräsentieren einen neuen immuntherapeutischen Ansatz, da sie trotz hoher Mengen an T-Zellen nur ein geringes alloreaktives Potential besitzen und selbst im haploidenten Setting nur ein geringes Risiko zur Induktion einer GvHD besitzen. Der Graft versus Leukämie/Tumor-Effekt nach allogener SZT wird durch die Zellen verstärkt. Durch das dual spezifische zytotoxische Potential der CIK-Zellen über den nicht-MHC restringierten NKG2D Killing-Mechanismus und den MHC restringierten Mechanismus über den T-Zell Rezeptor können sowohl virusinfizierte als auch transformierte Zellen bekämpft werden. In der Literatur gibt es bisher nur eine Arbeit (aus unserer Arbeitsgruppe), in der CIK-Zellen mit spezifischen viralen Antigenen für eine antileukämische und potentielle anti-virale Aktivität stimuliert werden.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde sowohl in prä-klinischen als auch in einem klinischen Ansatz die Durchführbarkeit, Anwendbarkeit, Effektivität und Sicherheit von EBV-spezifischen CIK-Zellen untersucht. Dazu wurde in einem ersten Schritt untersucht, ob sich durch die Modifizierung des konventionellen Herstellungsprotokolls EBV-spezifische CIK-Zellen generieren lassen.
Im präklinischen in vitro Setting wurde eine Modifizierung im CIK Herstellungsprotokoll vorgenommen um EBV-spezifische CIK-Zellen zu generieren, die sowohl ein anti-leukämisches als auch ein spezifisches anti-virales (EBV) Potential besitzen. Die Generierung erfolgte aus peripheren, mononukleären Zellen EBV-seropositiver Spender. Zusätzlich zu den CIK-Stimulanzien wurden die Zellen zweimal mit dem EBV Consensus Peptid Pool stimuliert, der Peptidsequenzen von verschiedenen latenten und lytischen EBV-Proteinen enthält. Durch die Modifikation konnte eine Ko-Expansion an EBV-spezifischen Zellen innerhalb des CD3+CD8+ Kompartiments der CIK-Zellen von bis zu 8% erreicht werden. In Zytotoxizitätsanalysen wurde das effektorische Potential der generierten Zellen überprüft. Gegenüber EBV peptidbeladenen Zielzellen zeigten die zusätzlich mit EBV-Peptid stimulierten CIK-Zellen in allen E:T Ratios (40:1, 20:1 und 5:1) eine signifikant höhere lytische Aktivität im Vergleich zur Aktivität konventioneller CIK-Zellen. Durch Blocking des NKG2D Rezeptors wurde die TCR-vermittelte lytische Aktivität in Bezug auf ein virales Ziel weiter gezeigt. Das anti-leukämische Killing Potential über den nicht-MHC restringierten NKG2D Rezeptor blieb zeitgleich erhalten, was sich in spezifischen Lysen gegenüber K562 und THP-1 Zellen von bis zu knapp 60% wiederspiegelt. Die durchflusszytometrische immunphänotypische Charakterisierung der EBV-stimulierten CIK-Zellen mittels 10-Farb Panel ergab keine signifikanten Unterschiede in Bezug auf Phänotyp und Rezeptor-Repertoire im Vergleich zu den konventionellen CIK-Zellen. Die Zytokin- und Chemokin Analysen der EBV-spezifischen CIK-Zellen spiegelten ein CD8+ TH1 Profil wieder und reflektierten den zytotoxischen Charakter der Zellen. Mit dem modifizierten Protokoll war es möglich für eine Patientin GMP-konforme CIK-Zellen mit EBV-Spezifität zu generieren, die 9,6 x 103 EBV-spezifische T-Zellen/kg Körpergewicht enthielten. Die Infusion der EBV-spezifischen CIK-Zellen resultierte in einer rapiden Beseitigung der Plasma EBV DNA und langanhaltendem Verschwinden des großen (27 cm3) PTLD-malignen Lymphoms. Während des anschließenden Immun-Monitorings der Patientin konnten CD4+ und CD8+ EBV-spezifische CIK-Zellen mittels der Dextramer Technologie in vivo im Blut der Patientin über einen Zeitraum von 32 Tagen nachgewiesen werden. Weitere FACS Analysen ergaben, dass sich im CD8+ Kompartiment der Patientin neben den CD8bright T-Zellen eine wachsende Population an CD8dim Zellen nachweisen ließ. Diese bestand zu einem bemerkenswerten Prozentsatz von bis zu 95% aus TEMRA Zellen, die auf virusspezifische T-Zellen hinweisen. Die Infusion der Zellen induzierte weder ein CRS noch andere Toxizitäten. Zytokin-Analysen aus dem Serum der Patientin reflektierten ein zytotoxisches und anti-virales Potential der infundierten Zellen. In vitro zeigten die unter GMP generierten Zellen im E:T Verhältnis von 40:1 und 20:1 ein 2-fach höheres zytotoxisches Potential gegenüber peptidbeladenen T2 Zellen im Vergleich gegenüber WT T2 Zellen. Der anti-leukämische Effekt gegen K562 Zellen blieb auch hier erhalten. 2 Jahre nach Behandlung ist die Patientin immer noch in Remission.
Die in dieser Arbeit erzielten prä-klinischen und klinischen Ergebnisse zeigen, dass virusspezifische CIK-Zellen eine neue, potentielle Immuntherapie darstellen, da die Zellen eine wirksame anti-leukämische Immunität mit antiviraler Immunrekonstitution vereinen. EBV-spezifische CIK-Zellen erwiesen sich als ein vielversprechender Ansatz für die Prävention von malignen Erkrankungen sowie in der Behandlung von EBV-Komplikationen nach allogener SZT.
Die membranintegrierten, rotierenden F-Typ ATP-Synthasen zählen zu den essentiellen Komponenten der bakteriellen Energieversorgung. Ihre Rolle im zellulären Energiehaushalt bestehtin der Synthese von ATP unter Nutzung des transmembranen, elektrischen Ionengradienten (Mitchell 1961, Duncan et al. 1995, Noji et al. 1997, Kinosita et al. 1998). Die rotierenden ATP-Synthasen werden entsprechend der Kationenselektivität, die sie unter physiologischen Bedingungen zeigen, in zwei verschiedene Klassen eingeteilt, die H+-selektiven, sowiedie Na+-selektiven ATP-Synthasen. Hierbei bildet die Selektivität beider Klassen für einwertige Kationen (H+ oder Na+) eine essenzielle Grundlage für ihre Rolle im Energiehaushalt der bakteriellen Zellen. Jedoch gibt es nur eine begrenzte Anzahl von anaeroben Eubakterien und Archaeen, die noch einen auf Na+- Ionen basierenden Energiehaushalt besitzen. Gut charakterisierte Beispiele für Na+-selektive ATP-Synthasen bilden die F-Typ-Synthasen von I. tartaricus, P. modestum, sowie die V/A-Typ-Enzyme von E. hirae und A. woodii. Trotz der Unterschiede in der Kationenselektivitätder unterschiedlichen F-Typ ATP-Synthasen sind sie jedoch sowohl inihre Organisation, als auch hinsichtlich ihre Wirkungsweisen ähnlich. Das Ziel, der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Forschung, bestand in der Identifizierung der Faktoren, die sowohl die hohen Selektivität, als auch die Affinität des in der Membran-eingebetteten Rotor-C-Rings der ATP-Synthasezu Protonen (H+) und Na+- Ionen beeinflussen. Die Untersuchungen wurden hierbei andem c11-Ring der F-Typ-ATP-Synthase aus dem anaeroben Bakterium Ilyobacter tartaricus durchgeführt, das hierbei als Modellsystem diente. Der untersuchte Ring zeigt unter physiologischen Bedingungen eine hohe Bindungsselektivität für Na+ Ionen, kann jedoch unter nicht-physiologischen Bedingungen auch Li+ und H+ Ionen binden und zur ATP-Synthese verwenden (Neumann et al. 1998).
Das Ziel, der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Forschung, bestand in der Identifizierung der Faktoren, die sowohl die hohen Selektivität, als auch die Affinität des in der Membran-eingebetteten Rotor-C-Rings der ATP-Synthasezu Protonen (H+) und Na+- Ionen beeinflussen. Die Untersuchungen wurden hierbei andem c11-Ring der F-Typ-ATP-Synthase aus dem anaeroben Bakterium Ilyobacter tartaricus durchgeführt, das hierbei als Modellsystem diente. Der untersuchte Ring zeigt unter physiologischen Bedingungen eine hohe Bindungsselektivität für Na+ Ionen, kann jedoch unter nicht-physiologischen Bedingungen auch Li+ und H+ Ionen binden und zur ATP-Synthese verwenden (Neumann et al. 1998). Die Kd- und KM-Werte wurden verwendet, um die Na+ -Bindungsaffinität der C-Ringe bzw. ATP-Synthasen zu quantifizieren. Über die Selektivität wurdebeschrieben, welche Kationen an die C-Ringe und ATP-Synthasen binden können (z. B. H+/Na+/Li+, H+/Na+ - oder nur H+ Ionen).Das Verhältnis der absoluten Bindungsaffinitäten zwischen zwei Kationen (z. B. Kd (Na+)/Kd (H+)) wurde verwendet, um die Präferenz des Enzyms für eines der Ionen zu quantifizieren. Die Faktoren, dieder Kationenselektivität und der Affinität des I. tartaricus c-Rings zugrunde liegen, wurden mit Hilfe von Mutageneseexperimenten der Aminosäuren in der Ionenbindungsstelle untersucht. Im I. tartaricus-c-Ring erfolgt die Na+ Bindung an der Grenzfläche von zwei benachbarten c-Untereinheiten des c-Rings. An der Bindung der Na+-Ionen sind sowohl Aminosäuren aus Helix 1 (Gln32), sowie von Helix 2 (Val63, Ser66, Thr67 und Tyr70) beteiligt, die in der Nähe, des für den Mechanismusessentiellen Glu65 liegen. Insgesamt wurden 19 verschiedene, spezifische Einzel- und Doppelmutationen in die Sequenz des atpE-Gens eingeführt, die für die I. tarticus-ATP-Synthase-c-Untereinheit kodiert. Bei den Experimenten mit dem I. tartaricus c-Ring (Ser66, Thr67 und Tyr70) wurden drei polare Reste der Ionenbindungsstelle durch die polaren Reste (Ser67, Ile67 oder Leu67) oder hydrophobe Reste (Ala66, Gln67 und Phe70) ersetzt, während das geladene Glu65 durch die kürzere, aber immer noch geladene Seitenkette Asp65 ausgetauscht wurde. Zur Charakterisierung der monovalenten Kationenbindung durch die Wildtyp, sowie die mutierten C-Ringe von I.-tartaricus, wurde ein Ansatz verwendet, der biochemische (DCCD-Ionen-Kompetitionsassay) und biophysikalische (ITC) Methoden kombiniert.
Die Daten der in dieser Arbeit durchgeführten Experimente, zeigen, dass c-Ringe selektiv für H+ sind, solange in der Ionenbindungsstelle des c-Rings ein ionisierbarer Glu/Asp-Rest vorhanden ist. Die H+-Bindungsaffinität des c-Rings hängt von der Hydrophobizität der Reste ab, aus der die Ionenbindungsstelle aufgebaut ist.Jedoch ist die Zahl der Faktoren, die die Na+-Selektivität des C-Rings bestimmen, weitaus größer. Von den in dieser Arbeit untersuchten Faktoren war die Zahl der polaren Reste, die Wasserstoffbrücken zu Na+ bilden, die Co-Koordination von Na+ durch strukturell vorhandene Wassermoleküle und die Anwesenheit von negativ geladenen Resten besonders wichtig für die Bindung der Na+-Ionen an den Ring. Die hohe Bindungsaffinität des c-Rings für Na+-Ionen, wird sowohl durch Wechselwirkungen begünstigt die das gebundene Na+-Ion stabilisieren, als auch den gesamten atomaren Aufbau der Ionenbindestelle, der die enthalpiegetriebene Na+-Bindungan den c-Ring begünstigen. Im Rahmen dieser eingehenden Studien konnten zum ersten Mal die thermodynamischen Eigenschaften aufgeklärt werden, die der hohen Na+-Bindungsaffinität des c-Rings zugrunde liegen, sowie der Einfluss von Mutationen auf diese Parameter ermittelt werden. Durch zahlreiche Experimente mit ATP-Synthasen, die mit mutierten c-Ringen zusammengesetzt wurden, sollte eine Verbindung zwischen Veränderungen der H+- und der Na+-Bindungsaffinitäten und Unterschiede im Betrieb der ATP-Synthase aufgeklärt werden. Die wichtigste Schlussfolgerung, die sich aus dieser Arbeit ableiten lässt, ist, besteht darin, dass sich Na+/H+-selektiven ATP-Synthasen durch den Austausch von 1-2 Aminosäureresten innerhalb der rotierenden c-Ring-Ionenbindungsstelle in ausschließlich H+-selektive, vollfunktionelle ATP-Synthasen umwandeln lassen.
In times of a growing world population and the associated demand for high crop yield, the understanding and improvement of plant reproduction is of central importance. One key step of plant reproduction is the development of the male gametophyte, which is better known as pollen. In addition, the development of pollen was shown to be very sensitive to abiotic stresses, such as heat, which can cause crop damage and yield loss. To obtain new insights in the development and heat stress response of pollen, a combined transcriptome and proteome analysis was performed for three pollen developmental stages of non- and heat-stressed tomato plants.
The analysis of the transcriptomes of non-stressed pollen developmental stages enabled the determination of mRNAs accumulated in certain developmental stages. The functional analysis of these mRNAs led to the identification of protein families and functional processes that are important at different times of pollen development. A subsequent comparison of the transcriptomes of non- and heat-stressed pollen revealed a core set of 49 mRNAs, which are upregulated in all three developmental stages. The encoded proteins include among other things different heat stress transcription factors and heat shock proteins, which are known key players of the plant heat stress response.
Furthermore, 793 potential miRNAs could be identified in the transcriptome of non- and heat-stressed pollen. Interestingly, 38 out of the 793 miRNAs have already been identified in plants. For more than half of these miRNAs potential target mRNAs were identified and the interactions between miRNAs and mRNAs linked to the development and heat stress response of pollen. In total, 207 developmentally relevant interactions could be determined, out of which 34 have an effect on transcriptional-networks. In addition, 24 of the interactions contribute the heat stress response of pollen, whereby this mainly affects post-meiotic pollen.
An initial correlation of the proteome and transcriptome of the developmental stages revealed that transcriptome analyses are not sufficient to draw exact conclusions about the state of the proteome. A closer look on the relationship of the transcriptome and proteome during pollen development revealed two translational modes that are active during the development of pollen. One mode leads to a direct translation of mRNAs, while the second mode leads a delayed translation at a later point in time. Regarding the delayed translation, it could be shown that this is likely due to a short-term storage of mRNAs in so-called EPPs. The comparison of the proteome and transcriptome response to heat stress revealed that the proteome reacts much stronger and that the reaction is mainly independent from the transcriptome. Finally, the comparison of the proteome of non- and heat-stressed pollen provided first indications for changes in the ribosome composition in response to heat stress, as 57 ribosomal proteins are differentially regulated in at least one developmental stage.
The endoplasmic-reticulum-associated protein degradation pathway ensures quality control of newly synthesized soluble and membrane proteins of the secretory pathway. Proteins failing to fold into their native structure are processed in a multistep process and finally ubiquitinated and degraded by the proteasome in order to protect the cell from proteotoxic stress. My thesis covers structural as well as functional studies of various protein components that constitute the protein complexes that are responsible for this process.
One sub-project addressed the mechanism of glycan recognition by Yos9 as part of the ERAD substrate selection. NMR solution structures of the mannose-6-phosphate homology (MRH) domain of Yos9 both in a free and glycan bound conformation reveal a gripping movement of loop regions upon binding of correctly processed glycan structures.
The main projects focused on revealing the mechanism of efficient ubiquitin chain assembly by the ERAD ubiquitination machinery. This included the investigation of the role of the ERAD components Cue1 and Ubc7 in processive ubiquitin chain formation, how ubiquitin chain conformations change during elongation, how the conformation of a chain is impacted by interacting proteins and finally understand the activity regulation of the ERAD E2 enzyme Ubc7 by its cognate RING E3 ligases. Nuclear magnetic resonance (NMR) analysis and fluorescence-based ubiquitination assays show that the CUE domain of Cue1 contributes with its proximal binding preference as well as with its position dependent accelerating effect to efficient ubiquitin chain formation. This is required to efficiently drive degradation of substrates. Specific ubiquitin binding events dictate and coordinate the spatial arrangement of the E2 enzyme relative to the distal tip of a chain. This process can be further accelerated by RING E3 ligases that promote Ubc7 activity by more than ~20 fold via inducing allosteric changes around the catalytic cysteine. My results additionally suggest a model where Ubc7 dimerization results in proximity induced activation of the E2. This data ensures rapid diubiquitin formation that is followed by a CUE domain assisted chain elongation mechanism where Cue1 acts in an E4 like fashion.
How ubiquitin binding events can modulate the conformations of a ubiquitin chain were investigated by pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) spectroscopy combined with molecular modeling. This shows that K48-linked diubiquitin samples a broad conformational space which can be modulated in distinct ways. The CUE domain of Cue1 uses conformational selection of pre-populated open conformations to support ubiquitin chain elongation. In contrast, deubiquitinating enzymes shift the conformational distribution to weakly or even non-populated conformations to allow cleavage of the isopeptide bond that connects adjacent ubiquitins. Ubiquitin chain elongation increases the sampled conformational space and suggests that this high conformational flexibility might contribute to efficient proteasomal recognition.
Structured illumination microscopy (SIM) is part of the super-resolution methods developed at the beginning of this century. To produce a super-resolution image SIM requires three things: 1) illumination of the sample with a periodic pattern, 2) acquisition of multiple images per plane under different pattern’s phases and orientations and 3) the processing of these images has to be carried with a reconstruction algorithm. The result of the reconstruction is an image with a resolution gain that is proportional to the frequency of the pattern (po). The typical SIM set-up uses an epi-fluorescence configuration, thus the interference angle of the beams that create the pattern is restricted by the angular aperture of the objective. Under this restriction the maximum value of po is given by the cut-off frequency of the objective lens and sets at 2 the maximum resolution gain of SIM under linear illumination.
In the first part of this thesis we present the implementation and characterization of the 2D-SIM set-up designed by Dr. Bo-Jui Chang (B-J. Chang et al., PNAS 2017), this design exploits the concept introduced by light-sheet microscopy, i.e. separation of illumination and detection paths to obtain resolution gains larger than the usual two-fold (Chapter 3). The set-up is named coherent structured illumination light-sheet based fluorescence microscopy (csiLSFM) and it consists of a triangular array of three objectives, such that two are used for illumination and one for detection. With the independent illumination arms is possible to interfere two coherent light-sheets at angles beyond the angular aperture of the detection lens, attaining the maximum interference angle of 180° when the light-sheets counter-propagate. This condition delivers a pattern with a po 1.4 times larger than the cut-off frequency (ωo), hence our set-up provides generic resolution gains of 2.4.
The extraction of the high spatial frequencies that produce the resolution gain in the csiLSFM is a challenge due to a low pattern modulation. The low modulation inherently arises because the frequency associated to the pattern period lies beyond the cut-off frequency of the detection lens. To overcome this challenge we developed a filtering strategy that facilitates the withdrawal of information from a SIM data set, simultaneously the proposed filtering process optimizes the reconstruction algorithm by reducing the periodic artifacts that are recurrent in SIM images. In this same chapter we also performed an spectral analysis of the artifacts and determined that they originate from irregularities in the power spectrum that occur due to the partial or total lack of certain spatial frequencies (fig.4.2 and 4.3), our reconstruction reduces this information drops and diminishes the artifact occurrence. The relevance of our reconstruction pipeline is that it delivers a standardized process to enhance the SIM image in a current context in which the commonly used reconstruction algorithms employ empirical tuning to improve it (fig.4.13). Moreover, the pipeline is applicable to the csiLSFM data and also to images acquired with any other 2D-/3D-SIM set-up (fig.4.10 and 4.11).
The processing of various image data sets acquired with the csiLSFM exposed us to the question of how low the modulation of the illumination pattern can be before no super-resolution frequencies can be extracted. Answering this question is important to guarantee that the SIM data contains enough spatial frequencies to provide significant resolution gains. Thus in chapter 5 we developed a quantitative metric to indirectly determine the pattern modulation from the SIM data and find its critical value to use it as evaluation criterion. We called this metric the quality factor (Q-factor) and it represents the normalized strength (amplitude) of the extracted frequencies respect to the Gaussian noise contained in the images. Through simulations we estimated that Q=0.11 is a critical value and a SIM data set requires this as minimum value is to deliver a significant resolution gain. Q works then as an assessment tool for classifying SIM data as optimal or sub-optimal, i.e. Q≥0.11 or Q<0.11. We demonstrated such application with data acquired in various SIM commercial set-ups to prove its feasibility in the field (fig.5.6-5.11)
As mentioned at the beginning of this abstract SIM requires a specialized set-up and a processing algorithm to produce super-resolution images. This thesis contributes to these two areas in the following aspects: first, in its linear version a structured illumination microscope is highly associated to a 2-fold resolution gain. Here we demonstrated the possibility of extending this gain to 2.4 using our custom set-up the csiLSFM. Second, a reconstructed SIM image is prone to artifacts due to the mathematical process it undergoes, here we analyzed the artifact sources and identified them with drops of spatial information in the reconstructed spectrum, based on these conclusions we designed a processing pipeline to facilitate the extraction of spatial frequencies and directly reduce artifacts. A third and final outcome of this thesis is the development and practical implementation of a quantitative index to evaluate the quality of SIM data in terms of its relevant information content (Q-factor). Accordingly, the overall contributions of this work were done in the areas of SIM set-up, SIM reconstruction procedure and SIM data evaluation.
Die Analyse von DNA-Sequenzen steht spätestens seit der Feststellung ihrer tragenden Rolle in der Vererbung organismischer Eigenschaften im Fokus biologischer Fragestellungen. Seit Kurzem wird mit modernsten Methoden die Untersuchung von kompletten Genomen ermöglicht. Dies eröffnet den Zugang zu genomweiten Informationen gegenüber begrenzt aussagekräftigen markerbasierten Analysen. Eine Genomsequenz ist die ultimative Quelle an organismischer Information. Allerdings sind diese Informationen oft aufgrund technischer und biologischer Gründe komplex und werfen meist mehr Fragen auf, als sie beantworten.
Die Rekonstruktion einer bislang unbekannten Genomsequenz aus kurzen Sequenzen stellt eine technische Herausforderung dar, die mit grundlegenden, aber in der Realität nicht zwingend zutreffenden Annahmen verbunden ist. Außerdem können biologische Faktoren, wie Repeatgehalt oder Heterozygotie, die Fehlerrate einer Assemblierung stark beeinflussen. Die Beurteilung der Qualität einer de novo Assemblierung ist herausfordernd, aber zugleich äußerst notwendig. Anschließend ist eine strukturelle und funktionale Annotation von Genen, kodierenden Bereichen und repeats nötig, um umfangreiche biologische Fragestellungen beantworten zu können. Ein qualitativ hochwertiges und annotiertes assembly ermöglicht genomweite Analysen von Individuen und Populationen. Diese Arbeit beinhaltet die Assemblierung und Annotation des Genoms der Süßwasserschnecke Radix auricularia und eine Studie vergleichender Genomik von fünf Individuen aus verschiedenen molekularen Gruppen (MOTUs).
Mollusken beherbergen nach den Insekten die größte Artenvielfalt innerhalb der Tierstämme und besiedeln verschiedenste, teils extreme, Habitate. Trotz der großen Bedeutung für die Biodiversitätsforschung sind verhältnismäßig wenige genomische Daten öffentlich verfügbar. Zudem sind Arten der Gattung Radix auch aufgrund ihrer großen geografischen Verbreitung in diversen biologischen Disziplinen als Modellorganismen etabliert. Eine annotierte Genomsequenz ermöglicht über bereits untersuchte Felder hinaus die Forschung an grundlegenden biologischen Fragestellungen, wie z.B. die Funktionsweise von Hybridisierung und Artbildung. Durch Assemblierung und scaffolding von sechs whole genome shotgun Bibliotheken verschiedener insert sizes und einem transkriptbasiertem scaffolding konnte trotz des hohen Repeatgehalts ein vergleichsweise kontinuierliches assembly erhalten werden. Die erhebliche Differenz zwischen der Gesamtlänge der Assemblierung und der geschätzten Genomgröße konnte zum Großteil auf kollabierte repeats zurückgeführt werden.
Die strukturelle Annotation basierend auf Transkriptomen, Proteinen einer Datenbank und artspezifisch trainierten Genvorhersagemodellen resultierte in 17.338 proteinkodierenden Genen, die etwa 12,5% der geschätzten Genomgröße abdecken. Der Annotation wird u.a. aufgrund beinhaltender Kernrthologen, konservierter Proteindomänenarrangements und der Übereinstimmung mit de novo sequenzierten Peptiden eine hohe Qualität zugesprochen.
Das mapping der Sequenzen von fünf Radix MOTUs gegen die R. auricularia Assemblierung zeigte stark verringerte coverage außerhalb kodierender Bereiche der nicht-Referenz MOTUs aufgrund hoher Nukleotiddiversität. Für 16.039 Gene konnten Topologien berechnet werden und ein Test auf positive Selektion ausgeführt werden. Insgesamt konnte über alle MOTUs hinweg in 678 verschiedenen Genen positive Selektion detektiert werden, wobei jede MOTU ein nahezu einzigartiges Set positiv selektierter Gene beinhaltet. Von allen 16.039 untersuchten Genen konnten 56,4% funktional annotiert werden. Diese niedrige Rate wird vermutlich durch Mangel an genomischer Information in Mollusken verursacht. Anschließende Analysen auf Anreicherungen von Funktionen sind deshalb nur bedingt repräsentativ.
Neben den biologischen Ergebnissen wurden Methoden und Optimierungen genomischer Analysen von Nichtmodellorganismen entwickelt. Dazu zählen eigens angefertigte Skripte, um beispielsweise Transkriptomalignments zu filtern, Trainings eines Genvorhersagemodells automatisiert und parallelisiert auszuführen und Orthogruppen bestimmter Arten aus einer Orthologievorhersage zu extrahieren. Zusätzlich wurden Abläufe entwickelt, um möglichst viele vorhandene Daten in die Assemblierung und Annotation zu integrieren. Etwa wurde ein zusätzliches scaffolding mit eigens assemblierten Transkripten mehrerer MOTUs sequenziell und phylogenetisch begründet ausgeführt.
Insgesamt wird eine umfassende und qualitativ hochwertige Genomsequenz eines Süßwassermollusken präsentiert, welche eine Grundlage für zukünftige Forschungsprojekte z.B. im Bereich der Biodiversität, Populationsgenomik und molekularen Ökologie bietet. Die Ergebnisse dieser Arbeit stellen einen Wissenszuwachs in der Genomik von Mollusken dar, welche bisher trotz ihrer Artenvielfalt deutlich unterrepräsentiert bezüglich assemblierter und annotierter Genome auffallen.
Polyploidie in Prokaryoten
(2018)
Diese Arbeit teilt sich in drei Teile auf, die sich mit der Regulation der Polyploidie sowie mit der Genkonversion als evolutionären Vorteil von Polyploidie in Haloferax volcanii beschäftigen.
Im ersten Teil dieser Arbeit, wurde der Einfluss der DNA-Replikationsinitiatorproteine Orc1/Cdc6 auf das Ploidielevel untersucht. Hierbei konnte anhand von Deletionsmutanten zunächst gezeigt werden, dass lediglich drei der 16 Orc1/Cdc6-Proteine in H. volcanii essentiell sind. Bestimmung des Ploidielevels mittels qPCR-Analyse ergab, dass jedes der 12 untersuchten Orc1/Cdc6-Proteine das Ploidielevel mindestens eines Replikons beeinflusst und dementsprechend sowohl die mit einem Replikationsursprung assoziierten als auch die „verwaisten“ Orc1/Cdc6-Proteine eine Funktion haben. Die mit einem Replikationsursprung assoziierten Orc1/Cdc6-Proteine hatten hierbei keinen größeren Einfluss auf das Ploidielevel als die „verwaisten“. Zusätzlich konnte durch Wachstumsanalysen in Mikrotiterplatten gezeigt werden, dass die meisten Deletionsmutanten unter allen getesteten Bedingungen ein mit dem Wildtyp vergleichbares oder besseres Wachstum zeigen. Eine Deletionsmutante eines Orc1/Cdc6-Proteins hingegen zeigte nur verbessertes Wachstum bei Glukose als Kohlenstoffquelle, was ein Hinweis auf die Verwendung verschiedener Orc1/Cdc6-Proteine unter verschiedenen Bedingungen sein könnte. Zusätzlich wurden zwei mit dem Replikationsursprung assoziierte Orc1/Cdc6-Proteine überexprimiert und via ihres N-terminalen His-Tag im Western-Blot nachgewiesen, sodass diese nun für Co-Affinitätsaufreinigungen zur weiteren Charakterisierung des komplexen Zusammenspiels der Orc1/Cdc6-Proteine zur Verfügung stehen.
Im Rahme des zweiten Teils der Arbeit wurde der Einfluss der in der 5‘-Region der der Replikationsursprünge ori1 und ori2 kodierten Proteine auf Wachstum und die Kopienzahl des Hauptchromosoms bestimmt. Zunächst wurde die Expression der drei in Haloarchaea hoch-konservierten oap-Gene upstream von ori1 mittels Nothern-Blot untersucht und es konnte gezeigt werden, dass das oap-Operon tatsächlich als Operon abgelesen wird. Um alle Gene in den 5‘-Regionen von ori1 und ori2 genauer zu charakterisieren, wurden induzierbare Überexpressionsmutanten im Wildtyp-Hintergrund angefertigt. Es konnte mittels Wachstumsversuchen in Mikrotiterplatten gezeigt werden, dass bei Induktion von Beginn an die Überexpression der Hef-Helikase und des oapB-Proteins zu einem starken Wachstumsdefekt führen, die von oapC und HVO_1724 zu einem moderaten Wachstumsdefekt, wohingegen für die Überexpressionsmutante von oapA vergleichbares Wachstum zum Wildtyp und für die Überexpression der Rad25d-Helikase verbessertes Wachstum beobachtet werden konnte. Es konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass sowohl die Deletion als auch die Überexpression der Helikasen keinen Einfluss auf das Ploidielevel hat; die Deletion von oapC führt jedoch zu einer Reduktion der Genomkopienzahl in exponentieller und stationärer Phase, was ein erster Hinweis darauf ist, dass das oap-Operon eine Rolle bei der Regulation des Ploidielevels spielen könnte.
Im dritten Teil der Arbeit wurde eine Methode entwickelt, um Genkonversion farblich sichtbar zu machen. Hierbei wurde sich H. volcaniis Carotinoidbiosynthese zu Nutze gemacht. Es wurden zwei verschiedene, auxotrophe Elternstämme mittels Protoplastenfusion verschmolzen, um eine heterozygote Tochterzelle zu erzeugen. Ein Genkonversionsereignis wurde durch einen roten Keil angezeigt, der aus einer weißen Kolonie wuchs und durch die erfolgreiche Reparatur des Carotinoidbiosynthesegens entstand. Es wurden insgesamt 8525 Klone ausgestrichen und 0,14 % der Kolonien zeigten eine entsprechende rote Färbung. Das Proof-of-Principle dieser Methode ist in damit in dieser Arbeit gelungen. Um die Genkonversion in den weißen Kolonien auf genetischer Ebene genauer zu untersuchen, wurde PCR verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass in den Zellen aller 135 untersuchten Kolonien Genkonversion stattgefunden hatte und zwar so effizient, dass nur in seltenen Fällen Heterozygotie vorlag. Unter Selektionsdruck stehende Loci hatten in beiden untersuchten Fällen eine starke Präferenz in Richtung Homozygotie und Erhalt der Prototrophie. Für nicht unter Selektionsdruck stehende Loci konnte gezeigt werden, dass die Hälfte der untersuchten Kolonien dem Elternstamm 1 glich, während die andere Hälfte dem Elternstamm 2 glich. Auch hier waren die Zellen nur in seltenen Fällen homozygot.
Cardiac trabeculation is one of the essential processes required for the formation of a competent ventricular wall, whereby clusters of ventricular cardiomyocytes (CMs) from a single layer delaminate and expand into the cardiac jelly to form sheet-like projections in the developing heart (Samsa et al., 2013). Several congenital heart diseases are associated with defects in the formation of these trabeculae and lead to embryonic lethality (Jenni et al., 1999; Zhang et al., 2013, Jenni et al., 2001; Towbin 2010). It has been experimentally shown that lack of Nrg1/ErbB2/ErbB4, Angipoetin1/Tie2, EphrinB2/B4, BMP10, or any component of the Notch signaling pathway can cause defective trabeculation. Moreover, changes in blood flow and/or contractility can also affect trabeculation (Samsa et al., 2013). Together, these observations demonstrate that cardiac trabeculation is a highly dynamic and regulated process.
Trabeculation is a morphogenetic process that requires control over cell shape changes and rearrangements, similar to those observed during EMT. Epithelial cells within an epithelium are polarized and establish cell-cell junctions with the neighboring cells (Ikenouchi et al., 2003; Ferrer-vaquer et al., 2010), thus epithelial cell polarity is an important feature to maintain cell shape and tissue structure. During developmental processes such as cell migration and cell division or in disease states epithelial polarity might be disrupted. As a consequence of this alteration, cells lose their tight cell-cell adhesions, undergo cytoskeletal rearrangements, change their shape and gain migratory properties becoming mesenchymal cells (Micalizzi et al., 2010). In epithelial cells, apicobasal polarity is regulated by a conserved set of core complexes, including the PAR, Scribble and Crumbs complexes (Kemphues et al., 1988; Bilder and Perrimon, 2000; Teppas et al., 1984). The polarity proteins composing these complexes interact in a well organized and coordinated-manner creating molecular asymmetry along the apicobasal axis of the cell. In turn, this crosstalk regulates the maturation and stabilization of the junctions between cells and cytoskeleton in order to strengthen cell polarization (Roignot et al., 2013). Amongst the different polarity complex, Crumbs has been shown to be a key regulator of apicobasal polarity during development in both vertebrates and invertebrates (Tepass et al., 1990; Fan et al., 2004).
Here, taking advantage of zebrafish as a model organism, I study in vivo at single cell resolution changes in CM apicobasal polarity during cardiac trabeculation. Moreover, I show which factors regulate CM apicobasal polarity during this process. In addition, I dissect the role of the polarity complex Crumbs in regulating CM junctional rearrangements and the formation of the trabecular network.
Nukleinsäuren besitzen neben der Speicherung und Übertragung der genetischen Information weitere vielfältige Funktionen in einem komplexen und dynamischen Netzwerk von gleichzeitig ablaufenden Prozessen in der Zelle. Die gezielte Kontrolle bestimmter Nukleinsäuren kann helfen, die jeweiligen Prozesse zu studieren oder auch zu manipulieren. Photoaktive Verbindungen, wie photolabile Schutzgruppen oder Photoschalter, sind ideal dazu geeignet die Struktur und Funktion von Nukleinsäuren zu studieren. Photolabile Schutzgruppen werden dazu meistens auf die Nukleobase installiert und stören die Watson-Crick Basenpaarung. Dies verhindert die Ausbildung einer Sekundärstruktur oder die Möglichkeit einen stabilen Doppelstrang zu bilden. Licht ist ein nicht-invasives Trigger-signal und kann mit hoher Orts- und Zeitauflösung angewendet werden, um selektiv die temporär geschützten Nukleinsäuren in der Zelle zu aktivieren.
Das erste Projekt dieser Arbeit ist eine Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Erin Schuman (MPI für Hirnforschung) und beschäftigt sich mit der lichtgesteuerten Regulation der miR-181a Aktivität in hippocampalen Neuronen von Ratten. Die Langzeitpotenzierung (LTP) ist der primäre Mechanismus von synaptischer Plastizität und somit essentiell für Lernen und Gedächtnis. Die langfristige Aufrechterhaltung von LTP erfordert eine gesteigerte (lokale) Proteinbiosynthese, ein Prozess, der noch nicht vollständig aufgeklärt ist. Die miR-181a reguliert die Genexpression von zwei für synaptische Plastizität wichtigen Proteinen, GluA2 und CaMKIIα. Mit einem lichtaktivierbaren AntimiR sollte der Einfluss der miR-181a auf die lokale Proteinsynthese von CaMKIIα und GluA2 untersucht werden. Photolabile Schutzgruppen sollen eine ortsaufgelöste Aktivierung des AntimiRs in den Dendriten ermöglichen. Ein Tracking-Fluorophor sollte die Lokalisierung des AntimiRs und eine gezielte Lichtaktivierung ermöglichen. Die Bindung der miRNA sollte fluoreszent visualisiert werden können, um eine Korrelation zwischen der inhibierten Menge an miR-181a und den neu synthetisierten CaMKIIα-Molekülen zu untersuchen. In diesem Projekt wurden drei Konzepte zur Synthese von lichtregulierbaren AntimiR-Sonden verglichen: Das erste Konzept verwendete eine Thiazolorange-basierte Hybridisierungssonde nach Seitz et al. Allerdings war mit diesem Konzept der Fluoreszenzanstieg zur Visualisierung der Hybridisierung zu gering. Im zweiten Konzept wurde ein dual-Fluorophor markierter Molecular Beacon entwickelt, bei dem die photolabilen Schutzgruppen in der Schleifen-Region die Hybridisierung der miR-181a vor Belichtung verhinderten. Nach Optimierung der Stammlänge, Anzahl und Position der photolabilen Schutzgruppen, sowie Auswahl des idealen Fluorophor-Quencher Paars, konnte nach UV-Bestrahlung in Anwesenheit der miR-181a ein signifikanter Anstieg des Hybridisierungsreporter-Fluorophors gemessen werden. Das dritte Konzept untersuchte lichtaktivierbare Hairpin-Sonden, bei denen ein Gegenstrang (Blockierstrang) über einen photospaltbaren Linker mit dem AntimiR verknüpft wurde. Dabei musste die optimale Länge des Blockierstrangs und die Anzahl der photo-spaltbaren Linker im Blockierstrang ermittelt werden, sodass die miR-181a erst nach Photoaktivierung das AntimiR binden und den Quencher-markierten Strang verdrängen konnte. Die in vitro Experimente vom Arbeitskreis Schuman waren zu dem Zeitpunkt des Einreichens dieser Arbeit noch nicht abgeschlossen. Erste Ergebnisse zeigten, dass der mRNA und Protein-Level von CaMKIIα eines gesamten hippocampalen Neurons durch ein nicht-lichtaktivierbare AntimiR um den Faktor ~1,5 gesteigert werden konnte. Zudem konnte durch die lokale Bestrahlung einer lichtaktivierbaren Hairpin-Sonde die lokale Gen-expression von CaMKIIα in einem Dendriten deutlich gesteigert werden.
Das zweite Projekt dieser Arbeit beschäftigte sich mit der reversiblen Lichtregulation von DNA und RNA durch Azobenzol Photoschalter. Azobenzole eignen sich ideal für die Regulation der Duplexstabilität, denn das planare trans-Azobenzol kann zwischen die Basen interkalieren und somit einen Doppelstrang stabilisieren. UV-Licht überführt das trans-Isomer in das cis-Isomer. Dies ist gewinkelt, benötigt mehr Platz und stört dadurch die Stabilität eines Nukleinsäuredoppelstrangs. Entscheidend für die Effizienz der Regulation der Duplexstabilität ist der Linker, der das Azobenzol mit der Nukleinsäure verknüpft. Während vorangegange Studien von Asanuma et al. unnatürliche Linker (D-Threoninol, tAzo) verwendeten, wurde in dieser Studie das Azobenzol mit der C1‘-Position von (Desoxy-)Ribose C-Nukleoside verknüpft, um Azobenzol (pAzo und mAzo) zu erhalten. Der Riboselinker sollte die helikale Natur der Nukleinsäure optimal nachahmen und möglichst wenig Störung des Ribose-Phosphat-Rückgrats bewirken. Thermische Stabilitätsstudien zeigten, dass UV-Licht induzierte trans-zu-cis Isomerisierung den Schmelzpunkt eines RNA- und DNA-Duplexes um 5,9 und 4,6 °C erniedrigte. Dabei führte der Austausch eines Nukleotids gegen pAzo oder mAzo zu einer effektiveren Regulation der Duplexstabilität als der zusätzliche Einbau eines Azobenzol C-Nukleosids in die Sequenz. Ein Vergleich mit dem in der Literatur etablierten System, tAzo, zeigte, dass pAzo und mAzo teilweise einen stärkeren Duplexdestabilisierungseffekt nach UV-Bestrahlung bewirkten.
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Biologischen Systemen liegen Mechanismen zugrunde, die bis heute nicht vollständig aufgeklärt sind. Für die Untersuchung eignen sich externe Trigger, die eine Regulation von außen auf das System erlauben und Prozesse gezielt steuerbar machen. Eine Möglichkeit ist das System unter optische Kontrolle zu bringen, d.h. durch Licht eine externe Steuerung zu implementieren, was von einem internen Chromophor aufgenommen wird. In der vorliegenden Dissertation werden drei individuelle Projekte vorgestellt, die alle dieses Prinzip auf unterschiedliche Weise anwenden.
RNAs haben eine Vielzahl an verschiedenen Funktionen in der Zelle, die von der Proteinsynthese bis zur Genregulation variieren. Im ersten Projekt wurde der Photoschalter Spiropyran im Kontext von RNA eingesetzt. Mit dem Ziel das Derivat PyBIPS kovalent an ein Oligonukleotid zu binden und damit die Hybridisierung eines Duplexes zu steuern, wurden Strukturmotive gesucht, an die der Photoschalter postsynthetisch gebunden werden kann. Dabei soll die sterisch anspruchsvolle Spiropyran-Form die Watson-Crick-Basenpaarung stören und die planare, konjugierte Merocyanin-Form in den Duplex, zur zusätzlichen Stabilisierung, interkalieren. In Vorarbeiten von Clara Brieke wurde festgestellt, dass erstens nur PyBIPS, nach kovalenter Verknüpfung, noch vollständig photochemisch aktiv ist und zweitens eine Herstellung über Festphasensynthese nur in schlechter Ausbeute realisierbar ist. Ausgehend davon wurde PyBIPS an die drei nicht-nukleosidischen Linker, Aminoglykol, D-Threoninol und Serinol, postsynthetisch über eine Amidbindung angebracht, die zuvor über Oligonukleotidfestphasensynthese in 2´-OMe-RNA eingebaut wurden.
In der photochemischen Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass PyBIPS, gebunden an alle drei Motive, noch photochemisch aktiv ist und im Vergleich zu ungebundenem PyBIPS stabiler ist gegenüber Photolyse. In Untersuchungen im Doppelstrang im Wedge Motiv, d.h. im Gegenstrang befindet sich kein Nukleotid gegenüber dem Photoschalter, wurde ein ähnliches Verhalten festgestellt. Zusätzlich zur charakteristischen Merocyanin-Bande bei 550 nm ist ein zweites, rotverschobenes Absorptionsmaximum entstanden, das die gleichen Eigenschaften besitzt. In Schaltzyklen wurde festgestellt, dass eine Isomerisierung bis 660 nm möglich ist, was eine Anwendung im therapeutischen Fenster zwischen ca. 600 und 1000 nm von Blut ermöglichen würde. Das Auftreten der zweiten Bande hängt stark vom Linker und dem Baustein im gegenüberliegenden Strang ab. Es wird vermutet, dass sich das, sonst nicht-bevorzugte, TTT-Isomer der Merocyanin-Form, durch Stabilisierung durch die Umgebung im Oligonukleotid ausbildet.
Zur Untersuchung, inwiefern die Isomerisierung des Photoschalters die Duplexstruktur beeinflusst, wurden Schmelzpunktstudien und Fluoreszenzmessungen zur KD-Bestimmung durchgeführt, ohne dass eine Veränderung zu erkennen war. In einer größeren NMR-Studie, in Kooperation mit Tom Landgraf (Arbeitsgruppe Prof. Dr. Harald Schwalbe) wurde der Fokus darauf-gelegt mehr Informationen über die strukturelle Integrität zu erhalten. Es findet eine Störung der benachbarten Basenpaarungen durch den Photoschalter statt, jedoch kann die Kraft der Isomerisierung des Photoschalters nicht übertragen warden. Der Einfluss war zunächst geringer als erwartet, was in anderen Anwendungen überprüft warden muss.
Im zweiten Projekt steht das Membranprotein OmpG aus E. Coli K12 im Fokus. Proteine besitzen viele verschiedene funktionelle Gruppen, die für selektive Biokonjugation genutzt werden können in einer Reihe von Anwendungen. OmpG gehört zur Gruppe der Porine, die in der äußeren Membran von Gram-negativen Bakterien sitzen und die seltene ß-Fassstruktur ausbilden. Die Pore besitzt einen großen Innendurchmesser ohne Selektivität. Das Molekül wurde bereits intensiv auf seine Struktur, insbesondere Loop 6, der pH-abhängig die Pore verschließt, untersucht. In Vorarbeiten von Grosse et al. wurde der Loop entfernt, sodass ein ruhiger Kanal entstanden ist, der ein optimales Modellsystem darstellt. Außerdem wurden in der Pore zwei Cysteine, die auf gegenüberliegenden Seiten auf halber Höhe des Kanals sitzen, eingeführt. An die Thiolgruppen wurden photolabile Schutzgruppen angebracht, die erst den Kanal blockieren und nach Abspaltung durch Licht wieder freigeben. Dazu wurde jeweils ein 7-Diethylaminocumarin (DEACM) postsynthetisch angebracht.
Der Linker am Cumarin-Alkohol stellt dabei einen Kompromiss dar, da er zum einen selektiv mit der Thiolgruppe des Cysteins reagieren soll, gleichzeitig aber noch photo-induziert wieder abspalten muss. Durch Belichtung findet eine Hydrolyse des Esters unter Abspaltung des Alkohols statt, der einen Carbonsäurerest am Thiol in der Pore zurück lässt. In spannungsabhängigen Einzelkanal-messungen, durchgeführt von Dr. Philipp Reiß (Universität Marburg), konnte gezeigt werden, dass die zwei DEACM Modifikationen eine Reduktion der Leitfähigkeit bewirkten und durch Licht abgespalten und aus dem Kanal entfernt werden konnten. Dabei war außerdem zu erkennen, dass die Leitfähigkeit aufgrund der Carboxylreste über das Niveau von unmodifiziertem OmpG steigt.
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This dissertation aimed to shed light on changes of the epigenetic landscape in heart and skeletal muscle tissue of the turquoise Killifish N. furzeri, a novel, short-lived animal model for aging research. The following results could be obtained:
1. A global trend towards closed chromatin conformation could be observed; histone markers for H3K27me3, H3K9me3 and H4K20me3 accumulated in skeletal muscle tissue from old N. furzeri. Markers for open chromatin conformation such as H3K4me3, H3K9ac and H4K16ac decreased in old skeletal muscle tissue. In old hearts from N. furzeri an accumulation of H3K27me3 could be detected while H3K9ac was found to increase with age as well. mRNA expression levels of methylating enzymes were higher in skeletal muscle tissue from old N. furzeri when compared to expression levels in skeletal muscle tissue from young N. furzeri.
2. The shift of epigenetic pattern was accompanied by a change of gene expression. Via mRNA sequencing in collaboration with the MPI, Bad Nauheim it could be shown that genes associated with cell cycle and DNA repair were lower expressed in skeletal muscle tissue from old N. furzeri than in tissue from young N. furzeri. Genes, associated with inflammatory signaling and glycolysis, displayed increased mRNA levels in skeletal muscle tissue from old N. furzeri. These results could be confirmed by Western blot and qRT-PCR analyses.
3. Markers for DNA damage and senescence increased in skeletal muscle tissue from old N. furzeri.
4. Cells derived from young and old N. furzeri skeletal muscle could be isolated and cultured for many passages. These cells were a mix of different cell types with properties and features of the native tissue. They could be used for treatment with drugs and/small compounds modulating the epigenetic landscape via specific interference with methylating enzymes.
5. DNA methylation and hydroxy-methylation were found to go in different directions in skeletal muscle and heart tissue from N. furzeri: while increasing in skeletal muscle tissue, a both DNA modifications declined in heart tissue with age.
6. In the heart of N. furzeri microRNA expression changes with age were assed with sequencing in collaboration with the FLI, Jena. It could be demonstrated that miRNA expression is age-dependent. Particular focus was on miR-29 and its target genes: miR-29 was highly upregulated in heart and skeletal muscle tissue, while target genes such as collagens and dnmts were reduced with age in the heart of N. furzeri.
7. Cardiac function remained stable with age and no accumulation of collagens could be found when comparing hearts of young and old N. furzeri despite the increase of markers for oxidative stress.
8. Cell culture experiments with human cardiac fibroblasts revealed that miR-29 is upregulated with increasing age of the donor. In addition to that, it could be shown that miR-29 is positively regulated by oxidative stress.
9. A zebrafish mutant with modified expression of miR-29 that was created in collaboration with the SNS, Pisa, presented a severe hypoxic phenotype and an altered mRNA expression profile compared to wild type control zebrafish. Cardiac dysfunction and hypertrophy were observed as well as an increase in DNA methylation and collagens.
Taken together, it could be shown that the aging process in skeletal muscle and heart tissue from N. furzeri leads to a series of changes on epigenetic levels. It remains to be elucidated whether these changes are result or cause for further changes of mRNA expression, protein levels and pathophysiology, yet the N. furzeri represents a promising research model for further aging studies.
To date, chemicals are used ubiquitous in everyday life and an increasing consumption of pharmaceuticals and personal care products and industrial chemicals results in an increased water pollution. Conventional wastewater treatment plants are not able to completely remove the variety of (polar) organic compounds from today’s wastewater and thus serve as constant key point sources for the unintentional release of (micro-)pollutants into the aquatic environment. Anthropogenic micropollutants are detectable in very low concentrations in almost every aquatic compartment and may cause adverse effects on aquatic organisms. Considering the current situation of water pollution and to enhance water quality with regard to environmental and human health, the implementation of advanced wastewater treatment technologies, such as ozonation and activated carbon filtration was extensively discussed and investigated in recent years. Yet, besides their advantages regarding the efficient removal of a variety of recalcitrant, organic compounds as well as pathogens from the wastewater, it is known that especially the treatment with ozone may lead to the formation of largely unknown ozonation by-products with often unknown toxicity and unknown threats to human and the environment. To address these topics the joint research project TransRisk aimed at the “characterization, communication and minimization of risks originating from emerging contaminants and pathogens in the water cycle”. Within this research project the present thesis focuses on the ecotoxicological investigation of emerging waterborne contaminants, including their potential transformation products (TPs). Additionally, focus was laid on the investigation of combined effects of anthropogenic contaminants and pathogens with effects especially on aquatic invertebrate organisms.
The potential ecotoxicological effects of the antiviral drug acyclovir and two of its structurally identified TPs, were investigated on three aquatic organisms (Raphidocelis subcapitata, Daphnia magna and embryos of Danio rerio). While the parent compound acyclovir caused no acute toxicity up to a tested concentration of 100 mg/l on any of the investigated organisms, both TPs were shown to exhibit an increased aquatic toxicity. Carboxy-acyclovir, the biodegradation product of acyclovir, significantly reduced reproduction of D. magna by 40% at 102 mg/l, and the ozonation product COFA significantly inhibited growth of green algae R. subcapitata (EC10 = 14.1 mg/l). In the present case, advanced wastewater treatment was shown to lead to the formation of TPs, that reveal a higher toxicity towards investigated organisms, than the parent compound. Results highlight the necessity of further research related to the topic of identification and characterization of TPs, formed during advanced wastewater treatment processes.
To investigate the potential reduction or enhancement of toxic effects of nine differently treated wastewater effluents, selected bioassays with Daphnia magna, Lumbriculus variegatus and Lemna minor were conducted in flow-through test systems on a pilot treatment plant. The different treatment processes included ozonation of conventional biological treatment, with subsequent filtration processes as well as membrane bioreactor treatment in combination with ozonation. While exposure to the conventionally treated wastewater did not result in significant impairing effects on D. magna and L. minor, a reduced abundance of L. variegatus (by up to 46%) was observed compared to the medium control. Subsequent ozonation and additional filtration of the wastewater enhanced water quality, visible in an improved performance of L. variegatus. In general, direct evidence for the formation of toxic TPs due to the advanced wastewater treatments was not found, at least not in concentrations high enough to cause measurable effects in the investigated test systems. Additionally, no evidence for immunotoxic effects of the investigated wastewater effluents were observed. Yet, study-site- and species-specific effects hindered the definite interpretation of results. That underline the importance of a suitable test battery consisting of representatives of different taxonomic groups and trophic levels, to ensure a comprehensive evaluation of the complex matrix of wastewater and to avoid false-negative or false-positive results.
With aim to improve knowledge regarding immunotoxicity in invertebrates, the potential immunotoxic effects of the immunosuppressive pharmaceutical cyclosporine A (CsA) were investigated by applying the host-parasite model system Daphnia magna – Pasteuria ramosa in an adapted host resistance assay. Co-exposure to CsA and Pasteuria synergistically affected long-term survival of D. magna. Additionally, the enhanced virulence of the pathogen upon chemical co-exposure was expressed in synergistically increased infection rates and an increased speed of Pasteuria-induced host sterilization. In conclusion, results provide evidence for a suppressed disease resistance in a chemically stressed invertebrate host, highlighting the importance of investigating the conjunction of environmental pollutants and pathogens in the environmental risk assessment of anthropogenic pollutants.
Application of a developed tool to visualize newly synthesized AMPA receptor components in situ
(2018)
The information flow between neurons happens at contact points, the synapses. One underlying mechanism of learning and memory is the change in the strength of information flow in selected synapses. In order to match the huge demand in membranes and proteins to build and maintain the neurites' complex architecture, neurons use decentralized protein synthesis. Many candidate proteins for local synthesis are known, and the need of de novo synthesis for memory formation is well established. The underlying mechanisms of how somatic versus dendritic synthesis is regulated are yet to be elucidated. Which proteins are newly synthesized in order to allow learning?
In this thesis protein synthesis is studied in hippocampal neurons. The fractional distribution of somatic and dendritic synthesis for candidate proteins and their subsequent transport to their destination are investigated using a newly developed technique. In the first part of this study we describe the development of this technique and use it in the second part to answer biological questions.
We focus here on AMPA receptor subunits, the key players in fast excitatory transmission. AMPA receptors contain multiple subunits with diverse functions. It remains to be understood, when and where in a neuron these subunits come together to form a protein complex and how the choice of subunits is regulated.
The investigation of the subunits' site of synthesis and redistribution kinetics in this study will help us to understand how neurons are able to change their synaptic strength in an input specific manner which eventually allows learning and memory.
Key questions which are addressed in this study:
How can specific newly synthesized endogenous proteins be visualized in situ? What are the neuron's abilities to locally synthesize and fully assemble AMPA receptor complexes?
How fast do different AMPA receptor subunits redistribute within neurons after synthesis?
Cells within a tissue form highly complex, cellular interactions. This architecture is lost in two-dimensional (2D) cell cultures. To close the gap between 2D cell cultures and in vivo tissues, three-dimensional (3D) cell cultures such as spheroids or embryoid bodies were developed. To fully take advantage of the third dimension, imaging techniques are essential. The emerging field of "image-based systems biology" exploits the information in images and builds a connection between experimental and theoretical investigation of biological processes. Such interdisciplinary approaches strongly depend on the development of protocols to establish 3D cell cultures, innovations in sample preparation, well-suited imaging techniques and quantitative segmentation methods.
Although 3D cell cultures and image-based systems biology provide a great potential, 2D methods are still not completely replaced by 3D methods. This is mainly due to methodical and technical hurdles. Therefore, this thesis provides a significant contribution to overcome these hurdles and to further develop 3D cell cultures. I established computational and experimental methods related to 3D aggregates and investigated fundamental, cellular processes such as adhesion, growth and differentiation.
The automatic segmentation method "PAS" and "LoS" were developed in the context of this thesis. They extract essential biological properties such as the projected area or features of cell nuclei from 2D or 3D images of 3D aggregates. Both algorithms show their accuracy robustly over image data from different samples and different microscopes. In addition, the superior performance of PAS and LoS was proven in a comparison with state-of-the-art methods.
The PAS approach served as an essential basis for investigating cellular processes such as adhesion and growth which are tightly regulated to contribute to tissue integrity. These processes are involved in the formation of spheroids. The temporally resolved data of spheroid formation of three mammary epithelial cell lines revealed differences in their formation dynamics as well as in the onset of spheroid formation phases (aggregation, compaction and growth). Despite these differences, adhesion- and growth-associated proteins such as E-cadherin, actin, microtubules, and the focal adhesion kinase show similar importance in a particular phase. Notably, certain proteins (e.g. E-Cadherin) contribute differently to spheroid formation of cells from different cell types in terms of cell adhesion and growth. Overall, analyses of the individual phases of spheroid formation revealed the temporal coordination of fundamental tissue-specific processes. The results contribute to a better understanding of the maintenance and disruption of tissue integrity.
An important but yet unknown process is how cells accomplish to arrange themselves against the gravitational force to form a spheroid. Live imaging with light sheet-based microscopy provides the best solution for a temporally and in particular spatially resolved investigation of spheroid formation. Although the imaging possibilities increase with this particular microscopy technique, available sample preparation methods are rare. Therefore, I have significantly optimized "agarose beaker" as preparation method for 3D long-term imaging of spheroid formation. The data show that upward movement of the cells takes place early. This movement is initiated in the centre of the initially flat cell layer. Subsequently, the cells move from the periphery of the cell layer toward the centre. Cells rearrange within the spheroid which is followed by growth. It is very likely that 3D aggregates form by adopting an energetically favoured, spherical shape by increasing cell-cell or cell-matrix contacts.
Besides the knowledge gained from the examination of the self-assembly process in different contexts, fully formed cellular aggregates can serve as basis to investigate differentiation processes. Differentiation guide cell fate specification during early embryonic development (i.e. preimplantation) and is not fully understood yet. Due to the lack of an in vitro system for preimplantation, I have developed "blastoids". These are 3D multicellular aggregates of mouse embryonic stem cells which represent important phases of preimplantation and beyond. In qualitative and quantitative analyses, a strong similarity was proven between blastoids and the inner cell mass of in vivo mouse embryos. Further results strongly suggest that both, the cell number and the trophectoderm play a subordinate role for cell fate decision during preimplantation. Furthermore, 3D neighbourhood analyses have shown that both, blastoids and mouse embryos, do not show a random "salt-and-pepper" pattern during differentiation. Instead, they show a yet unknown local clustering of cells with identical fates, suggesting local cell interactions that influence cell fate decision. Furthermore, the data indicate that the maturation of the epiblast in the later stages of preimplantation is initiated by an interaction between cells of the epiblast and the primitive endoderm.
Using image-based systems biology, I have investigated fundamental cellular processes such as adhesion, growth and differentiation in the context of tissue integrity and early embryonic development using 3D cellular aggregates. This highly interdisciplinary work is a major contribution to 3D cell biology and demonstrates how cells bind and interact within a complex system. The main methods developed in this thesis as well as the biological findings can be used not only in further biological but also in medical and pharmacological studies. They have the potential to advance our understanding of complex biological systems and to provide new opportunities for practical applications.
Im ersten Projekt der vorliegenden Arbeit wurden CD - 1 Mäuse mit drei unterschiedlichen Diäten für zwei Wochen ad libitum gefüttert. Die Diäten bestanden aus zwei kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten und einer Standard Haltungsdiät. Die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten enthielten entweder Triheptanoin (dreifach mit Heptanoat verestertes Glycerol) oder Soja - Öl als Fettkomponente (jeweils 35 % der Gesamtkalorien). Nach zwei Wochen wurde ein ischämischer Schlaganfall für 90 min. mithilfe eines Silikonfadens induziert. Die Leber, das Blut und das Gehirn wurden nach dem Schlaganfall entnommen und die Konzentrationen der Metabolite β - Hydroxybutyrat, Glukose, Laktat und Citrat wurden mit der zuvor etablierten GC - MS-Methode ermittelt. Unter gleichen Bedingungen wurde eine Mikrodialysestudie durchgeführt.
Bei den Tieren, die die kohlenhydratarmen, fettreichen Diäten erhielten, konnte in den Leber - und Hirnhomogenaten, im Plasma sowie im Mikrodialysat eine Ketose festgestellt werden. Die BHB Konzentrationen durch eine Soja Diät erreichten im Leberhomogenat bis zu 4 mM, im Plasma bis zu 1,5 mM, im Hirnhomogenat bis zu 1,5 mM und im Mikrodialysat bis zu 30 µM. Um eine Aussage treffen zu können, ob das Gehirn die von der Leber produzierten Ketonkörper als Energiesubstrate nutzen kann, wurde eine Folgestudie (unter gleichen Bedingungen) durchgeführt. Bei dieser Studie wurde der Zeitpunkt der Gewebeentnahme 60 min. nach Entfernen des Fadens (Reperfusion) gewählt. In den Leber – und Hirnhomogenaten konnten erniedrigte Konzentrationen des Ketonkörpers BHB nachgewiesen werden. Die nicht operierten Tiere, die eine fettreiche Diät erhielten, hatten erhöhte Konzentrationen an Citrat in den genannten Geweben. Durch den Abbau des Ketonkörpers BHB können bei Verstoffwechslung in Geweben außerhalb der Leber, zwei Moleküle Acetyl - CoA gebildet werden. Diese gebildeten Acetyl - CoA Moleküle können in den Citratzyklus eingespeist werden.
Um diesen Befund mechanistisch besser verstehen zu können, wurde den Mäusen Propranolol (ein unselektiver β - Blocker) verabreicht, und zwar kurz nachdem der Faden die mittlere Zerebralarterie verschlossen hatte. Als Folge blieb bei den fettreich gefütterten Tieren die zuvor beobachtete Ketose, aus. Daraus wurde geschlossen, dass die auftretende Ketose bei den fettreich gefütterten Tieren durch adrenerge β - Rezeptoren vermittelt wurde. Zusammengefasst kann eine fettreiche bzw. ketogene Ernährung im Falle einer Ischämie die Versorgung des Gehirns durch die Bildung von Ketonkörper gewährleisten.
Die zu beobachtende hepatische Ketogenese aus dem ersten Projekt hat die Frage entstehen lassen, ob eine akute Gabe von β - Hydroxybutyrat (BHB) bei Entfernen des Fadens schützende Effekte auf das Verhalten bzw. die Mitochondrien als Kraftwerke der Zelle hat. Hierzu wurde BHB bei Reperfusion gegeben und die Wirkungen dieser Einmalgabe nach 24 h untersucht. Als erster Schritt wurde der Nachweis erbracht, dass eine exogene Gabe von BHB das Gehirn erreicht. Im zweiten Schritt wurde das Verhalten der Mäuse nach 24 h untersucht. Hierbei erbrachte die Gabe von BHB eine signifikante Verbesserung der sensorischen und motorischen Fähigkeiten der Mäuse. Die metabolischen Veränderungen nach 24 h wurden erneut in Leberhomogenaten und Plasma vermessen. Eine Einzelgabe von BHB bewirkte eine milde Ketose auch 24 h nach Reperfusion der mittleren Zerebralarterie. Um eine detailliertere Erkenntnis über die Wirkung von BHB zu erlangen, wurden die Mitochondrien als potentielles Ziel für BHB in den Fokus genommen. Die Einmalgabe von BHB verhinderte ein Absinken der Komplex – II Aktivität. Außerdem kann die Aktivität der Citratsynthase unter der Gabe von BHB erhalten werden, sodass die Mitochondrien vor allem im wichtigen Zeitraum nach der Reperfusion geschützt werden. Im Rahmen der Untersuchungen der Mitochondrien wurden unterschiedliche Substrateinflüsse auf die Respiration der isolierten Mitochondrien getestet. Bei Zugabe von BHB, Oxalacetat + Acetat oder Citrat zu dem Respirationsmedium stieg die Respiration der Mitochondrien an. Im Falle von Glukose, Propranolol oder Acetat wird die Respiration verringert. Bei Zugabe von Laktat, verbleibt die Respiration auf Ausgangsniveau. Abschließend ist festzustellen, dass die Einzelgabe von BHB nach 24 h das Verhalten der Mäuse verbessert, eine milde Ketose induziert, sowie Mitochondrien und die Citratsynthase gegen ischämische Ereignisse schützt.
Um die in dieser Arbeit gezeigten Daten über metabolische Veränderungen zeigen zu können, musste eine vorherige Etablierung der GC – MS Analytik vollzogen werden. Auf der einen Seite musste die Probenvorbereitung, aber auch die gesamte Vermessung der Proben aufgebaut werden. Es wurden insgesamt 11 Analyte in vier unterschiedlichen Kompartimenten quantifiziert. Die Nachweisgrenze lag bei diesen 11 Analyten bei 0,01 - 1 ng/µl, was einer umgerechneten Stoffmengenkonzentration von 0,5 - 10 µM entspricht. Mithilfe dieser Methode können optional weitere Substanzen aus verschiedenen Geweben zugänglich gemacht werden. Diese Arbeit bietet hierzu eine Anleitung, wie die Etablierung erfolgen kann. Im Rahmen der Probenvorbereitung wurden alle Schritte systematisch verbessert. Dazu wurden Wiederholungsmessungen für unterschiedliche Modalitäten vollzogen. Die Abundance und die Zeitbeständigkeit waren die wesentlichen Beurteilungskriterien. So wurden die Daten für die Extraktionseffektivität, die Lösungsmittelabhängigkeit der Silylierung, der Zusatz von Hünig - Base sowie die Temperatur und Zeitabhängigkeit der Silylierung in dieser Arbeit erarbeitet. Die Quantifizierung wurde anhand von internen Standardverbindungen durchgeführt. Die jeweiligen Response – Faktoren blieben über die gesamte Zeit nach der Etablierung konstant und erlaubten die Quantifizierung mit geringen Fehlern. Die Beurteilung der ermittelten Daten über die Validierung wurden anhand von geltenden Regelwerken der pharmazeutischen Industrie entschieden. Es wurde ein Protokoll entwickelt, das im Rahmen der universitären Forschung eine vertrauenswürdige Aussage über Veränderungen von Metabolitenspiegeln in vielen Geweben der Maus und der Ratte geben kann.
Modellierung der klimatischen Habitateignung verschiedener krankheitsübertragender Vektorarten
(2018)
Der Klimawandel hat einen starken Einfluss auf die Verbreitungsgebiete von Arten. Infolgedessen kann sich das Verbreitungsgebiet von Arten verschieben, einschränken oder ausweiten. Bei thermophilen Arten wird vermutet, dass sie von den klimatischen Änderungen profitieren und sie sich wahrscheinlich ausbreiten werden. Eine solche Ausbreitung, wozu auch die Einwanderung von gebietsfremden Arten zählt, hätte nicht nur zahlreiche Konsequenzen für diese Ökosysteme, sondern könnte sich auch zu einem ernsten Gesundheitsrisiko entwickeln, wenn es sich bei den einwandernden Neobiota um Vektorarten handelt.
Stechmücken und Sandmücken, als blutsaugende Insekten, zählen zu den bekanntesten Vektorarten. Sie sind in der Lage, eine Vielzahl von Infektionskrankheiten wie das Denguefieber oder das Gelbfieber, aber auch protozoische Parasiten wie "Leishmania"-Arten zu übertragen. Als thermophile Arten sind viele dieser Vektoren aktuell in ihrer Verbreitung weitgehend auf tropische und subtropische Gebiete beschränkt. Eine Einwanderung in gemäßigtere Gebiete kann zu einer Einschleppung der durch sie übertragenden Erreger führen und damit zum Ausbruch von Infektionskrankheiten. Aufgrund der medizinischen Relevanz dieser Arten ist es essentiell, die räumliche Verbreitung, sowie die abiotischen Ansprüche der Vektorarten zu kennen, um deren mögliche Ausbreitung nachzuvollziehen.
Vor diesem Hintergrund beschäftigte sich die vorliegende kumulative Dissertation mit den klimawandelinduzierten Änderungen der Habitateignung verschiedener medizinisch relevanter Vektorarten. Dabei wurden die zwei invasiven Stechmückenarten "Aedes albopictus" (I-III) und "Aedes japonicus" (III), sowie zehn in Europa bereits vorkommende Sandmückenarten der Gattung "Phlebotomus" (IV), untersucht. Die Arbeit basiert auf vier (ISI-) Publikationen. Unter Verwendung ökologischer Nischenmodellierung wurden geeignete Gebiete unter aktuellen und zukünftigen Klimabedingungen bestimmt. Um dabei sowohl räumliche als auch zeitliche Aspekte zu berücksichtigen, wurden mehrere räumliche Skalen (Deutschland und Europa), sowie Zeitperioden (2030, 2050 und 2070) betrachtet. Des Weiteren wurden verschiedene Ansätze (einzelne Algorithmen und Ensemble-Modelle) zur Modellierung der Habitateignung verwendet.
Die Ergebnisse dieser Dissertation zeigen eine zukünftige klimawandelbedingte Ausweitung der geeigneten Gebiete für viele der betrachteten Vektorarten. So konnte gezeigt werden, dass die Habitateignung für "Aedes albopictus" in Deutschland (I) und in Europa (III) zukünftig deutlich zunimmt. Auch für die Sandmückenarten "Phlebotomus alexandri", "Phlebotomus neglectus", "Phlebotomus papatasi", "Phlebotomus perfiliewi" und "Phlebotomus tobbi" konnte eine deutliche Zunahme der klimatisch geeigneten Gebieten projiziert werden (IV).
Lediglich Arten, wie die Asiatische Buschmücke "Aedes japonicus" (III) und auch kältetolerantere Sandmücken, wie "Phlebotomus ariasi" und "Phlebotomus mascittii" (IV) scheinen weniger von diesen klimatischen Veränderungen zu profitieren und könnten in Zukunft sogar aktuell geeignete Gebiete verlieren (klimawandelinduzierte Arealverkleinerung). Bei "Aedes japonicus" konnte dies auf eine engeren Nische mit einem Optimum bei vergleichsweise niedrigen Temperaturen zurückgeführt werden (III).
Am Beispiel von "Aedes albopictus" wurden ferner Umweltfaktoren identifiziert, die die Verbreitung der Art limitieren (II). Als wärmeliebende Art spielen bei "Aedes albopictus" in Mitteleuropa insbesondere die niedrigen Temperaturen eine Rolle, während in Zukunft die Sommertrockenheit in Südeuropa zunehmend eine Rolle spielen könnte.
Nischenmodellierung stellt trotz ihrer vereinfachenden Annahmen und Unsicherheiten, eine hilfreiche Methode zur Untersuchung klimawandelinduzierter Arealverschiebungen dar. Mit Hilfe der Modellierungsergebnisse konnten Gebiete mit einem hohen Etablierungsrisiko für die Vektorarten identifiziert werden, welche daher im Fokus künftiger Überwachungsprogramme stehen sollten. In Zukunft könnten mehr Vektorarten geeignete Bedingungen in Mitteleuropa finden, wodurch die Vektordiversität zunehmen wird. Dadurch könnte auch das Risiko für einen Ausbruch der durch die Vektoren übertragenen Krankheiten steigen.
Auch wenn das Vorhandensein eines kompetenten Vektors eine unerlässliche Voraussetzung für den Ausbruch einer Infektionskrankheit darstellt, gibt es noch weitere Faktoren, wie das Vorhandensein des Erregers. In Bezug auf die Risikoabschätzung vektorassoziierter Krankheiten sollten neben der Verbreitung des Vektors und des Erregers auch die abiotischen Bedingungen für die Entwicklung des Erregers berücksichtigt werden. Neben neu eingewanderten Arten sollten zudem auch die heimischen Arten in Bezug auf ihre Vektorkompetenz untersucht werden, da diese ebenfalls als potentielle Vektoren dienen und somit das Gesundheitsrisiko weiter erhöhen könnten.
Angesichts heutiger Umweltprobleme ist die Stärkung positiver Mensch-Natur-Beziehungen wichtiger denn je. Zeitgenössische Umweltbildung zielt darauf ab, Motivation und Einstellungen zu fördern sowie eine grundlegende Wissensbasis zu schaffen (IUCN, UNEP, & WWF, 1991; Potter, 2010), um einen selbstbestimmten, verantwortungsvollen Umgang mit der Natur zu ermöglichen. Positiver Naturbezug und Umwelteinstellungen gelten als Basis für aktiven Umweltschutz. Direkte Naturerfahrungen gelten dabei als didaktische Möglichkeit, die Motivation für Umweltschutz zu festigen (Kaiser, Roczen, & Bogner, 2008). Einstellungen verändern sich im Laufe des Lebens und so kann das Alter eine wichtige Rolle bezüglich der Effektivität von Umweltbildungsprogrammen spielen (Ernst & Theimer, 2011). Auch Umweltwissen gilt als Grundlage von Umwelthandeln. Denn sinnliche Erfahrungen allein führen nicht zum Verständnis ökologischer Zusammenhänge (Frick, Kaiser, & Wilson, 2004; Liefländer, Bogner, Kibbe, & Kaiser, 2015). Die biologiedidaktische Forschung sieht Fakten-, Handlungs- und Effektivitäts-wissen als zentral für die Genese von Umwelthandeln (Frick, Kaiser, & Wilson, 2004). Isoliertes Fachwissen wiederum führt nach aktueller Erkenntnis auch nicht zur Entwicklung von Haltungen und Wertvorstellungen, welche unser Handeln beeinflussen (Barr, 2003; Finger, 2010; Leiserowitz, Kates, & Parris, 2005).
Bis heute sind altersbasierte Unterschiede bei Schülerinnen und Schülern bezüglich ihrer Naturverbundenheit und Umwelteinstellungen nicht hinreichend untersucht. Auch ist die nötige Dauer der Naturerfahrungen noch nicht nachgewiesen. Es gibt bislang keine Studie, die Umwelteinstellungen, -wissen und –handeln von Kindern verschiedener Regionen der Erde untersucht und Daten auf internationaler Ebene erhoben und ausgewertet hat. Die gezielte Integration der drei Umweltwissensarten in ein solch globales Umweltbildungsprojekt stellt eine zusätzliche bislang nicht angegangene Aufgabe dar. Die vorliegende Arbeit schließt diese Forschungslücken, indem sie auf internationaler Ebene jene Variablen mit einbezieht, die einen nahezu vollständigen Eindruck der Effektivität von Umweltbildung in verschiedenen Regionen, Sozialisationen und Altersklassen zulässt. So wird der Einfluss eines umfassenden Umweltbildungsprogramms auf Naturverbundenheit, Umwelteinstellungen und -wissen der verschiedenen Typen untersucht und ein Bezug zur eventuellen Veränderung des Umwelthandelns hergestellt. Dabei stehen sowohl traditionelle als noch unerforschte mögliche Einflussfaktoren im Fokus. Die Studie umfasst insgesamt 1454 Schülerinnen und Schüler aus Bangladesch, Malaysia, Deutschland und Singapur, die alle an dem Umweltbildungsprojekt „Global denken, lokal handeln – wir schützen unsere Umwelt!“ bzw. “Think global, act local – we protect our environment!“ teilgenommen haben.
Zur Messung der Naturverbundenheit diente Schulz’ INS-Skala (Inclusion of Nature in Self) (2002). Umwelteinstellungen wurden mit dem 2-MEV-Modell (Two Major Environmental Values) gemessen (Johnson & Manoli, 2011). Eine Skala zur Erhebung von Umweltwissen wurde eigens erstellt und hinsichtlich der drei Wissenstypen nochmals modelliert. Eine Skala zur Ermittlung von Umwelthandeln wurde auf Grundlage von Bögeholz (1999) erstellt. Alle Skalen waren Teil eines Fragebogens, welcher in Form eines Pre-, Post- und Follow-up-Test eingesetzt wurde. Kinder aus Parallelklassen, die nicht am Projekt teilnahmen, aber Klassenunterricht zu den jeweiligen Themen erhielten, dienten als Kontrollgruppen.
Die Ergebnisse bestätigen einen positiven Effekt außerschulischer Umweltbildung bezüglich der Entwicklung der untersuchten Variablen. So wurde nach der Teilnahme am eintägigen und auch nach dem fünftägigen Umweltbildungsprogramm eine signifikante Verstärkung des Naturbezugs gemessen, wohingegen die Kontrollgruppen keine messbare Veränderung zeigten. Jedoch nur die fünftägige Intervention führte auch zu nachhaltigen Veränderungen. Hierbei am stärksten beeinflusst wurden Kinder zwischen sieben und neun Jahren.
Bei der Untersuchung demographischer Einflussfaktoren auf Umwelteinstellung, -wissen und –handeln stellten sich das Wohnsitzland sowie die städtische bzw. ländliche Prägung der Wohngegend als entscheidend heraus. So waren dies die einflussreichsten Determinanten zur Vorhersage des Grundvorhandenseins sowie Veränderungen der untersuchten Variablen in Folge der Bildungsmaßnahme. Einzig bei der Entwicklung des Umwelthandelns schien die direkte Naturerfahrung unwesentlich, zeigten die Kontrollgruppen ähnlichen Wandel in ihrem aktiven Einsatz für die Umwelt. Im internationalen Vergleich scheint die komplexe Verkettung diverser einflussnehmender Faktoren, wie der Wohlstand des jeweiligen Staates, das generelle politische System sowie spezifische bildungspolitische Begebenheiten, den Erfolg von Umweltbildungsprogrammen mit zu bestimmen.
Die Daten zeigen, dass Faktenwissen Grundlage für Handlungs- und Effektivitätswissen ist. Alle Dimensionen wurden durch die Intervention signifikant gesteigert. Effektivitätswissen wuchs am stärksten. Auch das Umweltverhalten wurde positiv verstärkt. Jedoch ließen sich nur schwache Korrelationen zwischen den einzelnen Wissenstypen und Handeln feststellen. Zusammenfassend war das durchgeführte Bildungsprojekt erfolgreich in der Förderung von Naturverbundenheit sowie Umwelteinstellungen, -wissen und- handeln. Die Ergebnisse werden im Rahmen dieser Arbeit im Hinblick auf ihre Bedeutung für die schulische Umweltbildung sowie die didaktische Forschung erörtert.
Um molekulare Mechanismen in biologischen Prozessen zu verstehen, ist es unerlässlich biologisch aktive Verbindungen zu kontrollieren. Dabei spielt besonders die Aktivierung bzw. Desaktivierung von Genabschnitten eine zentrale Rolle in der gegenwärtigen chemischen, biologischen und medizinischen Forschung. Nukleinsäuren sind dabei offenkundige Zielmoleküle, da sie die Genexpression auf unterster Ebene regulieren und auf vielfältige Art und Weise an biologischen Prozessen beteiligt sind. Um solch eine genaue Steuerung zu erreichen, werden Nukleinsäuren häufig photolabil modifiziert und unter die Kontrolle von Licht gebracht. Da hochentwickelte Technologien es erlauben Photonen bestimmter Energie unter präziser räumlicher und zeitlicher Auflösung zu dosieren, ist Licht als nicht invasives Triggersignal ein besonders geeignetes Werkzeug um molekulare Prozesse zu kontrollieren.
Die Verwendung photolabiler Schutzgruppen („cage“) ermöglicht es, diese lichtaktivierbaren Nukleinsäuren („caged compound“) herzustellen. Üblicherweise werden Oligonukleotide damit an funktionsbestimmenden Stellen versehen, woraufhin die Funktion der Oligonukleotide unterdrückt wird. Die biologische Aktivität kann durch Bestrahlung mit Licht wieder hergestellt werden, da die photolabile Schutzgruppe durch den Lichtimpuls abgespalten wird. Neben der zeitweiligen Maskierung der Nukleinsäureaktivität existiert auch eine Methode, die als „photoaktivierbarer Strangbruch“ (‘‘caged strand break‘‘) bezeichnet wird. Dabei werden mit Hilfe von photolabilen Linkern (‘‘Verknüpfer‘‘) lichtinduzierte Strangbrüche in Oligonukleotiden ausgelöst, um so beispielsweise die Struktur eines Nukleinsäurestrangs zu zerstören. Die Idee der photoaktivierbaren Strangbrüche ist nicht neu, dennoch werden photolabile Schutzgruppen überwiegend nach der erstgenannten Strategie verwendet. Im Rahmen dieses Promotionsvorhabens wurden neue photosensitive Linkerbausteine für Oligonukleotide entwickelt und hergestellt, welche sich vor allem im Hinblick auf die Anwendbarkeit in lebenden biologischen Systemen von den bisherigen photolabilen Linkern unterscheiden.
Im ersten Projekt wurde ein nicht-nukleosidischer, photolabiler Linker, basierend auf dem Cumaringrundgerüst, entwickelt. Das Ziel war hier, vor allem, einen zweiphotonenaktiven Linker für biologische Anwendungen und Zweiphotonen-Fragestellungen nutzbar zu machen. Bisherige Zweiphotonen-Linker konnten hauptsächlich nur für Proteinverknüpfungen bzw. Neurotransmitter verwendet werden oder mussten chemisch umständlich (z.B. Click-Chemie) und postsynthetisch in Oligonukleotide eingeführt werden. Der neu entwickelte Zweiphotonen-Linker wurde als Phosphoramiditbaustein für die Oligonukelotid-Festphasensynthese synthetisiert, was einen problemlosen und automatisierten Einbau garantiert. Mit einem modifizierten Oligonukleotid konnten die photochemischen Eigenschaften des Linkers bestimmt und mit Hilfe eines fluoreszenzbasierten Verdrängungsassays und Lasertechniken der Zweiphotonen-Effekt visualisiert werden. Dazu wurde ein Hairpin-DNA-Strang hergestellt, welcher eine Linkermodifikation im Bereich der Loopregion enthält. Durch eine Thiolmodifikation am 5‘-Ende des Oligonukleotidstranges war es möglich, diesen in einem Maleimid-funktionalisierten Hydrogel zu fixieren. Ein DNA-Duplex mit einem Fluorophor/Quencherpaar und einer korrespondierenden Sequenz zum modifizierten Hairpin-Strang wurde ebenfalls dem System zugegeben, allerdings wurde dieser nicht fixiert, um Diffusion zu ermöglichen. Durch die räumliche Nähe des Fluorophors zum Quencher konnte im unbelichteten Zustand zunächst keine Fluoreszenz gemessen werden. Mit einem (Femtosekunden-)gepulsten Laser und dem damit verbundenen Bindungsbruch im Hairpin-Strang durch Zweiphotonen-Effekte wurde es dem fluoreszierenden Strang des DNA-Duplex ermöglicht, sich vom Quencher-Strang zu lösen und an den fixierten Strang zu hybridisieren. Das Photolyse-Ereignis konnte so in ein lokales Fluoreszenzsignal übersetzt und detektiert werden.
Der eindeutige Beweis, dass es sich tatsächlich um ein Zweiphotonen-induziertes Ereignis handelt, konnte durch die dreidimensional aufgelöste Photolyse und über die quadratische Anhängigkeit des Fluoreszenzsignals von der eingestrahlten Laserleistung erbracht werden.
Die generelle Kompatibilität des Cumarin-Linkers mit biologischen Systemen konnte in Zellkulturexperimenten gezeigt werden. Dazu wurde eine Transkriptionsfaktor-DNA Decoy-Strategie entwickelt, in der Linker-modifizierte DNA Decoys an regulatorische Transkriptionsfaktoren binden und diese aber auch photochemisch wieder freisetzen können („catch and release-Strategie“). Zellkulturexperimente, um mit dieser Methode das Transkriptionsfaktor-gesteuerte und endogene Gen für Cyclooxygenase-2 (COX2) zu regulieren, lieferten keine aussagekräftigen Ergebnisse. Daher wurden die verwendeten Zellen dahingehend manipuliert, sodass sie das Protein GFP (grün fluoreszierendes Protein) in Abhängigkeit von der Anwesenheit eines Transkriptionsfaktors exprimieren. Das so durch die Zellen verursachte Fluoreszenzsignal steht in direkter Abhängigkeit zur Decoy-Aktivität. Mit Hilfe modifizierter GFP-Decoys konnte hierbei eine Regulation auf Transkriptionsebene in biologischen Organismen erreicht werden. Mit dem Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA), einer molekularbiologischen in vitro-Analysetechnik, wurden die Interaktionen zwischen modifizierten Decoys und dem Transkriptionsfaktor untersucht.
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Macrophages in the tumor microenvironment respond to complex cytokine signals. How these responses shape the phenotype of tumor-associated macrophages (TAMs) is incompletely understood. Here we explored how cytokines of the tumor milieu, interleukin (IL)-6 and IL-4, interact to influence target gene expression in primary human monocyte-derived macrophages (hMDMs). We show that dual stimulation with IL-4 and IL-6 synergistically modified gene expression. Among the synergistically induced genes are several targets with known pro-tumorigenic properties, such as CC-chemokine ligand 18 (CCL18), transforming growth factor alpha (TGFA) or CD274 (programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1)). We found that transcription factors of the signal transducer and activator of transcription (STAT) family, STAT3 and STAT6 bind regulatory regions of synergistically induced genes in close vicinity. STAT3 and STAT6 co-binding further induces the basic leucine zipper ATF-like transcription factor (BATF), which participates in synergistic induction of target gene expression. Functional analyses revealed increased MCF-7 and MDA-MB 231 tumor cell motility in response to conditioned media from co-treated hMDMs compared to cells incubated with media from single cytokine-treated hMDMs. Flow cytometric analysis of T cell populations upon co-culture with hMDMs polarized by different cytokines indicated that dual stimulation promoted immunosuppressive properties of hMDMs in a PD-L1-dependent manner. Analysis of clinical data revealed increased expression of BATF together with TAM markers in tumor stroma of breast cancer patients as compared to normal breast tissue stroma. Collectively, our findings suggest that IL-4 and IL-6 cooperate to alter the human macrophage transcriptome, endowing hMDMs with pro-tumorigenic properties.
Lizards of Paraguay: an integrative approach to solve taxonomic problems in central South America
(2018)
Paraguay is located in the center of South America with drier and warmer climatic conditions in the western part of the country, and more temperate and humid in the eastern region. Biogeographically, Paraguay is a key spot in South America, where several ecoregions converge. In my study, I sampled most of the ecoregions of Paraguay. The main objective of my work is to solve taxonomic problems, identified through genetic barcoding analyses, in the central region of South America. To achieve this objective, I used selected taxa of the Paraguayan Squamata as models taking into consideration the crucial geographic position of the country, plus the scarce available genetic data of Paraguayan reptiles.
The collecting activities were performed in the framework of a barcoding inventory project of the Paraguayan herpetofauna and carried out mostly in rural areas searching for animals in different types of habitats using active search as the sampling technique.
For genetics, the extraction of DNA was performed with DNeasy® Blood & Tissue Kit of Qiagen® for sets of few samples, and the fiber glass plate protocol for sets of 96 samples. I assessed the quality of sequences after amplification in agarose gel electrophoresis. The first marker sequenced was 16S mtDNA, used for barcoding analysis. A DNA barcode is a genetic identifier for a species. Once a taxonomic problem was detected, I generate more gene sequences to target the issue.
All the analyses to test phylogenetic hypotheses (based on single genes or concatenated datasets) were performed under Maximum Likelihood and Bayesian approaches. To root the phylogenetic trees, I chose the available taxon (or taxa) most closely related to the respective studied group as outgroups. For the general tree of Paraguayan Squamata, based on barcodes of 16S, I chose Sphenodon punctatus.
I generated a total of 142 sequences of 64 species of Squamata from Paraguay (Appendix I). The final alignment of 615 bp comprised 249 samples. The best substitution model for the Barcoding dataset based on the gene 16S was GTR+G, according to the BIC.
To complement molecular evidence generated with the ML grouping of 16S barcodes, I took a morphological approach based on voucher specimens collected during fieldwork (usually the same specimens that I used for genetic analysis), supplemented by the revision of museum collections.
Summarizing my results, samples of Colobosaura exhibit large genetic distances, and accordingly I revalidated Colobosaura kraepelini (Appendix II). Tropidurus of the spinulosus group show two clades and among them there is little genetic and morphological variation, I synonymized T. tarara and T. teyumirim with T. lagunablanca, and T. guarani with T. spinulosus (Appendix III). I detected the presence of candidate species of Homonota, and I restricted the name H. horrida for Argentina, and described two new species of Homonota (Appendices IV and V), and a new species of Phyllopezus also in the Family Phyllodactylidae (Appendix VI).
In this work I present the most comprehensive analysis of genetic samples of Squamata from Paraguay. The results obtained here will be useful to help to clarify further taxonomic issues regarding the squamate fauna from the central region of South America. Moreover, the data generated for this study will have a positive impact in a larger geographic context, beyond Paraguayan borders.
Regarding the conservation of the Paraguayan reptiles, and considering the taxonomic changes accomplished here, it is important to note that many species lack legal protection. In Paraguay, the major problem for conservation is habitat loss due to extensive crop farming. Thus, currently, the protected areas are the best strategy for conservation of biodiversity in the country. However, many such areas face legal problems (e.g., lack of official measurements, management plans, forest guards, infrastructure, etc.) so that the maintenance of their biodiversity over time is not guaranteed.
In conclusion, in this study I present contributions on the taxonomy of mostly lizards from Paraguay. Due to lack of samples, I was not able to deal with a deep taxonomic revision of the country's snakes. Based on my results, I can argue that analyses of Xenodontini and Pseudoboini are currently a pressing research issue. This barcoding project may continue since some colleagues in Paraguay are interested in collaboration. Given that the sequenced specimens are yet a small portion of the actual diversity of Paraguay, it will be of utmost importance to continue and expand these studies that will further improve our taxonomic knowledge. Furthermore, it is desirable to have Paraguayan scientists not only involved, but to see them taking the lead of high quality taxonomic research.
Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist die häufigste chronisch-entzündliche Gelenkerkrankung, die inadäquat therapiert zu Gelenkzerstörung und resultierender Invalidität führen kann. Genetische Risikofaktoren sowie Lebensstileinflüsse führen in präklinischen Erkrankungsstadien zu posttranslationalen Modifikationen körpereigener Strukturen, die die immunologische Selbst-Toleranz brechen und zur immunologischen Fehlerkennung von Gelenkstrukturen durch B- und T-Lymphozyten führen.
Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit war die Aufklärung von Wirkmechanismen eines für die immunmodulatorische Therapie der RA entwickelten innovativen Ansatzes zur Rekonstitution der immunologischen Autotoleranz mittels rekombinant hergestellter MHC-Klasse-II/Peptidkomplexe durch Induktion regulatorischer T-Zellen. Im Mittelpunkt der in vitro Studien steht hierbei eine über Speziesbarrieren hinweg evolutionär konservierte, von T-Lymphozyten auf dem Kollagen Typ-II (CII) erkannte, durch Glykosylierung posttranslational modifizierte, autoantigene Strukturdeterminante. Dieses T-Zellepitop (CII-Peptid) stellt sowohl in der humanen RA als auch in der murinen Experimentalerkrankung der CIA (Collagen induced arthritis) eine immunodominante Struktur der arthritogenen Autoimmunität dar. Für die modellhaften in vitro Studien zur Aufklärung der Wirkweise rekombinanter MHC-II/Peptidkomplexe auf humane T-Zellen, standen über eine Kooperation mit Prof. Rikard Holmdahl (Karolinska Institut, Stockholm) T-Zell-Hydridome mit transgener Expression des humanen MHC-II/Moleküls DR4 (DRA1/DRB1*04:01) mit unterschiedlicher Epitopspezifität (T-Zell-Hybridom 3H8, Spezifität: unmodifiziertes CII-Peptid und mDR1.1, Spezifität: galaktosyliertes CII-Peptid an Position K264) zur Verfügung. Das aus einer α- und β-Kette bestehende MHC-II/Molekül DR4 ist durch das DRA1-Gen und allelische Varianten des DRB1-Locus (stärkste RA-Assoziation: DRB1*04:01) kodiert und bildet die Form seiner Bindungstasche für die Präsentation antigener Peptide an den T-Zell-Rezeptor (TCR) auf der Oberfläche antigenpräsentierender Zellen (APC). In den Studien zur Stimulation der Hybridomzellen konnte gezeigt werden, dass die T-Zellstimulation und die daraus resultierende Zytokinausschüttung (IL-2 und IL-10) kontextabhängig ist. Je nach Stimulationsart, ob festphasengebunden- oder löslich, erfolgt die Stimulusperzeption über differente TCR-Anordnungen in Mikrodomänen der Zelloberfläche und resultiert in entsprechend modulierten Signalstärken. So führt die Zellaktivierung über die festphasengebundene Stimulation mittels MHC-II/Peptidkomplexen zur Ausbildung einer hohen TCR-Dichte, die über hohe Signalstärken zu einer spezifischen IL-2 Sekretion als Antwort führen. Die Stimulation mit monomeren DR4/CII-Peptidkomplexen in gelöster Form adressiert dagegen die auf der gesamten Zelloberfläche verteilten T-Zell-Rezeptoren, was in einer geringeren Aktivierungsdichte und einer attenuierten Gesamtsignalstärke sowie der Sekretion des immunsupressiv wirkenden IL-10 resultiert. Für den angestrebten pharmakologischen Einsatz der DR4/CII-Peptidkomplexe ist bedeutsam, dass die aktivierende TCR-Bindung der gelösten monomeren Komplexe nur partiell agonistisch wirkt und die Induktion immunregulatorischer IL-10 Zytokinantworten begünstigt. Neben der direkten T-Zellinteraktion konnte auch die Möglichkeit einer indirekten Aktivierung unter Vermittlung von APCs nach Endozytose der DR4/CII-Peptidkomplexe, ihrer lysosomalen Prozessierung und Präsentation auf endogenen neusynthetisierten DR4/Molekülen experimentell u.a. unter Verwendung der HLA-DR4- exprimierenden murinen Makrophagenlinie BL25 als APC-Modell belegt werden. Im Hinblick auf die intendierte Weiterentwicklung zu therapeutischen Anwendungen der MHC-II/CII-Peptidkomplexe unter Gesichtspunkten der Arzneimittelsicherheit ist wichtig, dass der aufgezeigte indirekte Weg der T-Zellaktivierung nach vorausgehender Prozessierung durch APCs ineffizient ist. Dieser Weg erfordert nämlich sehr hohe Konzentrationen an MHC-II/Peptidkomplexen, welche weit oberhalb der in tierexperimentellen Studien unter therapeutisch wirksamen Dosierungen erreichten Gewebespiegel liegen.
Darüber hinaus ist es uns gelungen, methodisch den Nachweis CII-spezifischer T-Zellen, die im Gesamtrepertoire der CD4+ T-Zellen im peripheren Blut von RA-Patienten (HLA-DRB1*04:01) nur in sehr niedriger Frequenz vorkommen, mittels T-Zellaktivierung und spezifischer Tetramerbindung als phänotypischen Marker zu verbessern. Für die Tetramerbindung wurden Monomere mit dem galaktosylierten CII-Peptid (CIIgal259-273) beladenen DR4/Moleküle über einen aminoterminal konjugierten Biotinrest mittels eines Fluorochromgekoppelten Streptavidins tetramerisiert. Unter Einsatz dieser Methoden ist es gelungen, aus den durchflusszytometrisch sortierten CII-spezifischen Zellen, mittels Nukleotidsequenzierung, ihr TCR-Repertoire zu analysieren und hinsichtlich präferentieller V-Genverwendung zu charakterisieren. Für zwei humane DR4-restringiert gal264CII-spezifische T-Zell-Rezeptoren aus RA-Patienten konnte die Funktionalität und Epitopspezifität durch rekombinante Expression demonstriert werden. Auf Basis der gemeinsamen Vorarbeiten mit Prof. Rikard Holmdahl im murinen CIA-Modell und den bekannten Daten zur Induktion regulatorischer T-Zellen (Tr1-Zellen) durch MHC-II/CII-Peptidkomplexe, wurden in vitro Differenzierungsexperimente an humanen PBMCs DR4-positiver RA-Patienten unter dem Einfluss von DR4/gal264CII-Peptidkomplexen durchgeführt. Die Studien belegen, dass die Komplexe mit den antigenspezifischen T-Zellen interagieren und zur Induktion von Markern eines Tr1-Phänotyps, darunter PD-1 und IL-10 führen. Zukünftige Kristallstrukturanalysen eines TCR/DR4/gal264CII-Komplexes sollen dem verbesserten molekularen Verständnis der TCR-Erkennung von CII als Autoantigen insbesondere bzgl. des flexibleren Galaktoserestes für Arthritogenität und Tolerogenität dienen. Fernziel ist die Entwicklung einer wirksamen und sicheren immunmodulatorischen Therapie der RA durch Induktion regulatorischer T-Zellen.
Eine qualitative und quantitative Studie zum Einsatz der virtuellen Mikroskopie in der Schule
(2019)
Das Mikroskop stellt in der Alltagswelt ein Sinnbild für naturwissenschaftliches Arbeiten dar (Coleman 2009, Paulsen 2010). Im Bereich der Lehre eröffnet dieses Laborgerät das Eintauchen in die mikroskopische Dimension und besitzt eine wesentliche Rolle bei der damit verbundenen Erkenntnisgewinnung, insbesondere von funktionsmorphologischen Konzepten (Gropengießer & Kattmann 2008, Kremer 2002). Jedoch wird die Durchführung der klassischen Mikroskopie und damit die aktive Auseinandersetzung mit mikroskopischen Präparaten im schulischen (Biologie-)Unterricht durch verschiedene Faktoren erschwert. Zu den Limitierungen gehören beispielsweise die Verfügbarkeit geeigneter Mikroskope und Dauerpräparate, die aufwendige Vor- und Nachbereitungszeit sowie der zeitliche Aufwand bei der Herstellung hochwertiger mikroskopischer Frischpräparate. Die virtuelle Mikroskopie könnte diese Schwierigkeiten umgehen. Das virtuelle Mikroskop kann als eine Simulation verstanden werden, bei der die bildanalytischen Vorgehensweisen bei mikroskopischen Präparaten analog zur klassischen Mikroskopie nachvollzogen werden können (Gu & Oglivie 2005, Hentschel 2009). Hierbei umfasst das virtuelle Mikroskop ein Akquisitionssystem zum Einscannen und Digitalisieren mikroskopischer Präparate, einen Server zum Speichern und Bereitstellen der entstandenen virtuellen hochauflösenden Aufnahmen (WSI) sowie eine Bildbetrachtungssoftware auf einem Anwendungsrechner (Kalinski et al. 2006). Basierend auf einer Nutzerbefragung wurde eine Betrachtungssoftware programmiert, die hinsicht¬lich ihrer Benutzerfreundlichkeit und ihren Eigenschaften auf den schulischen Einsatz angepasst wurde. Um die Relevanz in diesem Anwendungsfeld zu testen, wurden die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit sowohl im Schülerlabor Goethe BioLab als auch in der universitären Lehre der Abteilung für Didaktik der Biowissen¬schaften der Goethe–Universität Frankfurt am Main durchgeführt. Der Schülerlabortag „Blut und das virtuelle Mikroskop“ wurde entwickelt, um die computerbasierte virtuelle Mikroskopie mit Schülern ergänzend zur klassischen Mikroskopie in einem fachlichen Kontext anzuwenden und zu erforschen.
Beruhend auf der Vergleichbarkeit beider Mikroskopiemethoden (Paulsen et al. 2010) lagen die Forschungsschwerpunkte neben der Nutzung der Software durch Schülerinnen und Schülern auf einer gegenüberstellenden Beurteilung beider mikroskopischer Verfahren von Schülern und Lehramtsstudierenden. Es wurden in diesem Zusammenhang drei zentrale Forschungsfragen formuliert.
Die erste Forschungsfrage untersucht das Nutzerverhalten der Schüler (n = 123) bei der virtuellen Mikroskopie mittels automatisch generierter Datensätze während der Anwendung der Bildbetrachtungssoftware. Die Analyse der Anwendungsdaten zeigt, dass das mikroskopische Sehen, insbesondere das Fokussieren auf relevante Bildbereiche, im virtuellen Humanblutausstrich angewandt wurde.
Die zweite Forschungsfrage untersuchte das aktuelle Interesses bei Schülern (n = 293) im direkten Vergleich zwischen virtueller und klassischer Mikroskopie. Dabei wurde das aktuelle Interesse aufgrund des engen Zusammenhangs zum Lernen (vgl. Krapp 1992a) als Indikator der Lernwirksamkeit gewählt. Die Erhebung erfolgte mittels eines Fragebogens. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigen, dass der Einsatz beider mikroskopischer Verfahren das aktuelle Interesse fördert, das emotionale und das wertbezogene Merkmal sich jedoch zugunsten der klassischen Mikroskopie signifikant unterscheiden.
Im Rahmen der dritten Forschungsfrage erfolgte eine Beurteilung der Vorteile virtueller Mikroskopie gegenüber der klassischen Mikroskopie von Schülern (n = 504) sowie Lehramtsstudierenden (n = 247). Hierbei diente ebenfalls ein Fragebogen als Grundlage der Erhebung. Die Auswertung zeigt, dass sowohl die Schüler als auch die Studierenden die Vorteile der virtuellen Mikroskopie klar erkennen. Es liegen jedoch signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen vor. Die Schüler bewerten die Vorteile betreffend der Förderung von Lernprozessen, des Erkennens von Strukturen und des mikroskopischen Zeichnens höher.
Zusammenfassend bestärken die Ergebnisse dieser Studie die Ansicht, dass das virtuelle Mikroskop nicht als Ersatz, sondern als sinnvolle Ergänzung zu der klassischen Lichtmikroskopie angesehen werden sollte (Bloodgood et al. 2006, Berg et al. 2016, Braun & Kearns 2008, Hufnagl et al. 2012, Mione et al. 2013, Santiago 2018, Scoville & Buskirk 2007). Dabei sollte die vorliegende Arbeit als Einstieg verstanden werden, um bestehende Forschungslücken zu verkleinern, damit ein Transfer der virtuellen Mikroskopie in den schulischen Kontext möglichst lernwirksam erfolgen kann.
Die Neurowissenschaften sind in Forschungsarbeiten für Schüler und Studierende immer wieder als eines der schwierigsten Teilgebiete der Biologie angeführt. Die Inhalte werden überwiegend nicht verstanden. Als mögliche Ursache gelten die seltenen praktischen Zugänge für die Lernenden aufgrund limitierter Ressourcen. Diese Ursache konnte in der vorliegenden Arbeit durch eine Befragung der Lehrkräfte zu ihren Praxisumsetzungen bestätigt werden. 70 % der Lehrkräfte gaben an, dass sie keine Experimente in der Schule zum Thema Nervenzellen anbieten. Experimente zur Verhaltensbiologie führen 65 % der Lehrkräfte nicht durch.
Um Schülern die Möglichkeit zu geben, sich experimentell mit den Themenfeldern der Neuro- und Verhaltensbiologie auseinanderzusetzen, wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit Schülerlabortage auf dem Feld der Neurowissenschaften konzipiert. Die Konzepte wurden schülerorientiert umgesetzt und neurowissenschaftliche Forschung durch den eigenen Umgang mit modernen Forschungsapparaturen erfahrbar gemacht. Die drei Labortage für die Sekundarstufe II wurden wissenschaftlich begleitet: 1) Verhaltensbiologie, 2) systemische Ebene der Elektrophysiologie, 3) elektrophysiologische Forschungsmethoden. Um die Qualität und Wirksamkeit der Labortage beurteilen zu können, wurden sie mit Feedbackerhebungen begleitet. Die drei Labortage wurden sowohl von den Lehrkräften als auch von den Schülern bezüglich ihrer Qualität positiv bewertet. Für die Schüler konnte gezeigt werden, dass die Beurteilung weitgehend unabhängig von einem zugrunde liegenden Interesse an Biologie und Forschung ausfällt. Anhand einer retrospektiven Erhebung wird außerdem gezeigt, dass alle drei Labortage eine höchst signifikante, selbsteingeschätzte Steigerung des „Wissens“, der „Anwendungszuversicht“ und des „Interesses“ bewirken. Schüler mit niedrigen Ausgangswerten zeigen einen besonders hohen Anstieg. Für das Interesse kann weiter gezeigt werden, dass auch Schüler mit hohem Ausgangswert eine große Interessenssteigerung durch den Labortag aufweisen. Das Interesse für den verhaltensbiologischen Labortag liegt etwas niedriger – die Labortage mit elektrophysiologischen Inhalten zeigen dagegen für die Anwendungszuversicht etwas niedrigere Werte.
Der Fokus der fachdidaktischen Forschung lag auf der Betrachtung des experimentellen Zugangs zur Elektrophysiologie über ein entwickeltes „EPhys-Setup“. Dabei handelt es sich um einen quasi-realen Messaufbau. Die Umsetzung kombiniert dazu Komponenten eines realen Elektrophysiologie-Setups (Hands-on Komponenten) mit einer speziell entwickelten schülerfreundlichen Software (Neurosimulation) und einem virtuellen Nervensystem in Form einer Platine. Als Modellnervensystem werden für diese Umsetzung Ganglien von Hirudo medicinalis verwendet – der Neurosimulation liegen originale elektrophysiologische Messspuren des Ganglions zugrunde. Experimentelle Vermittlungsansätze für die Elektrophysiologie finden sich kaum für den Schulbereich. Dem Bedarf einer entsprechenden Beforschung wurde mit verschiedenen Testinstrumenten nachgegangen, um den Vermittlungsansatz mit dem EPhys-Setup bewerten zu können. Dafür fand eine Wirksamkeitsanalyse über die Erhebung der Motivation der Schüler statt (Lab Motivation Scale; Dohn et al. 2016). Von Bedeutung war auch, inwiefern gegenüber der Umsetzung eine Technologieakzeptanz vorliegt (Technology Acceptance Model; Davis 1989), die im Schulkontext ausgehend von der steigenden Einbindung von Technologien einen entsprechenden Forschungsbedarf aufweist. Weiter wurde untersucht, ob sich die Bewertung des EPhys-Setups von der Bewertung einer Kontrollgruppe unterscheidet. Für die Kontrollgruppe wurde die Neurosimulation von den Hands-on Komponenten gelöst und die Schüler arbeiteten ausschließlich PC-basiert. Die Ergebnisse zeigen, dass beide Umsetzungen die Motivation förderten und eine Technologieakzeptanz bei den Schülern aufwiesen. Der Unterschied der Untersuchungsgruppen fällt gering aus. Die Abhängigkeiten, die für die verwendete Simulationsumsetzung gefunden wurden, beziehen sich ausschließlich auf Komponenten der „Freude“. Somit wird der intrinsische Bereich von den Schülern die am EPhys-Setup gearbeitet haben höher bewertet. Zur weiteren Analyse der Testinstrumente wurde auch eine Abhängigkeit der Bewertung vom zugrunde liegenden Biologieinteresse sowie von den Computerfähigkeiten vergleichend betrachtet. Der Einfluss auf die Bewertungen der drei Testskalen ist in vielen Fällen höher als der Einfluss der verwendeten Simulation. Vom individuellen Biologieinteresse der Schüler zeigen alle untersuchten Komponenten eine Abhängigkeit. Die größeren Effekte beziehen sich auf die Komponenten der „Lernwirksamkeit“ oder der „Freude“. Von den individuellen Computerfähigkeiten der Schüler zeigen Komponenten zur „Zuversicht bezüglich der Methoden und der Inhalte“ eine Abhängigkeit.
Auf den Einsatz von Tieren im Rahmen der (Umwelt-)Risikobewertung von Stoffen kann nach wie vor nicht verzichtet werden. Dabei führen die Überprüfungen einer zunehmenden Anzahl neu entwickelter Stoffe, aber auch die gestiegenen Anforderungen der Gesetzgebungen zu einem hohen Verbrauch von Versuchstieren. Diese Untersuchungen sind wichtig, da viele der in Gebrauch befindlichen und in allen Bereichen genutzten Chemikalien potentiell endokrin wirksam sind, auf unterschiedlichen Wegen in die Umwelt gelangen und sich potentiell negativ auf die Gesundheit von Mensch und Tier auswirken können.
Bei den bisher verwendeten Methoden werden vor allem juvenile oder adulte Tiere, aber auch Tiere zur Untersuchung des kompletten Lebenszyklus über eine oder mehrere Generationen für die Beurteilung von Substanzen eingesetzt. Dabei ist bekannt, dass die Entstehung reproduktiver Störungen in der Embryonalphase der jeweiligen Individuen auftritt. Um den Tierverbrauch zu reduzieren, werden teilweise In-vitro-Testsysteme angewendet. Es zeigt sich aber, dass diese Tests lediglich einen bestimmten Zelltyp in einem bestimmten Entwicklungsstadium abbilden können, was die Aussagekraft über die tatsächliche Wirkung auf ein komplexes Gewebe und dessen Entwicklung, erst Recht für den kompletten Organismus, stark einschränkt. Die Aussagekraft dieser Methoden ist daher in bestimmten eingeschränkten Grenzen zu sehen. In der vorliegenden Arbeit wird eine alternative Ersatzmethode vorgestellt mit dem Ziel einer stärkeren Aussagekraft bei toxikologisch und ökotoxikologisch relevanten Endpunkten. Im Fokus stehen hierbei die Effekte von androgenen und estrogenen Substanzen auf die Geschlechtsentwicklung von Hühnerembryonen (Gallus gallus domesticus) auf Ebene der Expression der mRNA, vereint mit Effekten auf Ebene der Organhistologie und – morphologie, verglichen mit den Normalzuständen unbehandelter Individuen. Die neu entwickelte Methode zur Beurteilung solcher Substanzen kann im Rahmen der human- und umwelttoxikologischen Risikobewertung von Stoffen eingesetzt werden und ist ein geeignetes Werkzeug, um die notwendigen Untersuchungen mit der gefordert hohen Beurteilungsqualität durchzuführen. Gleichzeitig kann mit dieser Tierversuchsersatzmethode bei hoher Aussagekraft auch der Verbrauch an weiter und höher entwickelten Versuchstieren verringert werden, was auch einem gesellschaftlich-ethischen Bedürfnis gerecht wird.
Durch natürliche Selektion werden Funktionen, die dem Überleben und dem Fortpflanzungserfolg eines Organismus dienen, optimiert. Da die Struktur eines Organs dessen Funktion und umgekehrt die Funktion eines Organs dessen Struktur bestimmt, kann durch das Studium der Morphologie die Funktionsweise von Organen verstanden werden. Trotz des umfangreichen Wissens über die Struktur von Nervensystemen sowohl auf mikro- als auch auf makroskopischer Ebene, ist es weiterhin unklar, wie Bewusstsein und ein kohärentes Abbild der Umwelt im Gehirn erzeugt werden. Der Grund hierfür ist vor allem die gewaltige Komplexität neuronaler Netzwerke, die unmöglich geistig erfasst werden können. Eine Möglichkeit, das Gehirn ohne das detaillierte Wissen über all seine Bestandteile zu verstehen, bietet das Studium von Optimierungsprinzipien und deren Anwendung in theoretischen Modellen. So wie eingangs erwähnt die Funktion von Organen durch natürliche Selektion optimiert wird, sollte auch die Funktion neuronaler Netzwerke optimiert werden und neuronale Netzwerke sollten entsprechend solcher Optimierungsprinzipien aufgebaut sein. Ein wichtiges Prinzip, das essenziell für die Effizienz neuronaler Netzwerke ist, ist die Minimierung der Verbindungslänge zwischen Neuronen. Basierend auf diesem Prinzip wurde im Rahmen dieser Dissertation eine algorithmische Methode etabliert, die es ermöglicht Vorhersagen der relativen Position von Neuronen anhand ihrer Verbindungen zu treffen. Diese neuronale Platzierungsmethode beruht darauf, dass Neuronen mit ähnlicher Verbindungsnachbarschaft näher zueinander platziert werden als zu Neuronen mit weniger ähnlichen Verbindungsnachbarn, wodurch die durchschnittliche Verbindungslänge minimiert wird. Nach der Etablierung dieser Methode, wurde diese benutzt um Modelle zu erstellen, die es ermöglichen die Entstehung neuronaler Karten und kortikaler Faltungen im Zusammenhang mit der Konnektivität und der Anzahl der Neuronen zu untersuchen.
Neuronale Karten sind geordnete Muster auf der Oberfläche des Kortex, die durch die präferierte Aktivität einzelner Neuronen in Antwort auf Stimuli einer Modalität beobachtet werden können. Im visuellen Kortex existieren sogar mehrere Karten, je nachdem welche Qualität visueller Stimuli man betrachtet. Abhängig von der Präferenz für einen Sehwinkel, ein stimuliertes Auge oder der Orientierung eines Balken-Stimulus, können retinotopische Karten, Karten mit streifenartigen Mustern oder Karten mit sogenannten „Pinwheel“-Strukturen beobachtet werden. Pinwheels sind periodische Strukturen, die sichtbar werden indem man die Orientierungspräferenz von Neuronen für die spezifische Orientierung eines Balken-Stimulus mit der entsprechenden Farbe des Farbkreises visualisiert. Da diese Strukturen eine Ähnlichkeit mit bunten Windrädern haben, werde sie als Pinwheels bezeichnet. Die in dieser Dissertation erstellten Modelle sagen vorher, dass die Entstehung strukturierter neuronaler Karten im Allgemeinen von der Anzahl der Neuronen abhängt. In der Tat könnte diese Abhängigkeit auch für neuronale Karten im Kortex gelten. Während strukturierte Karten im visuellen Kortex in verschiedenen Säugerordnungen wie Primaten, Karnivoren und Huftieren existieren, sind sie in kleinen Nagern mit weniger Neuronen nicht vorhanden, trotz ähnlicher Verbindungsspezifizität. Folglich müssen Unterschiede in der Struktur neuronaler Karten im Kortex nicht zwangsläufig mit einer unterschiedlichen Funktionsweise zusammenhängen, sondern könnten auch durch allgemeine Optimierungsprinzipien beim Aufbau neuronaler Netzwerke bedingt werden. Eine weitere Gemeinsamkeit zwischen verschiedenen Säugetierordnungen ist, dass die relative Dichte der Pinwheels ziemlich genau bei der Zahl Pi liegt. Entsprechend der Ergebnisse dieser Dissertation könnte dies dadurch erklärt werden, dass für neuronale Karten ähnlicher Struktur die Anzahl der Neuronen pro Pinwheel relativ konstant ist. Unterschiede in der räumlichen Dichte der Pinwheels könnten dann einfach durch Unterschiede in der Dichte der Neuronen erklärt werden.
Neben den Modellen für neuronale Karten wurde im Rahmen dieser Dissertation auch ein Modell kortikaler Faltungen mit derselben neuronalen Platzierungsmethode erstellt. Die Existenz kortikaler Faltungen wird gemeinhin damit erklärt, dass der Kortex ohne Faltungen wegen seiner verhältnismäßig großen Oberfläche nicht in den Schädel gepackt werden könnte. Allerdings haben Experimente gezeigt, dass die Faltungen nicht durch eine Restriktion des wachsenden Kortex an der Schädeloberfläche entstehen, da auch mit mehr Platz für die Expansion des Kortex die gleichen Faltungsmuster exprimiert werden. Interessanterweise entstehen die kortikalen Faltungen erst, wenn die Proliferation der Neuronen während der Entwicklung größtenteils abgeschlossen ist und die Neuronen anfangen ihre Verbindungen auszubilden. Um kortikale Faltungen basierend auf der Konnektivität zwischen Neuronen im Modell vorherzusagen, genügt es das allgemeine Muster einer starken lokalen, aber schwachen globalen Konnektivität zwischen Neuronen nachzubilden. Abhängig von Variationen dieser Konnektivität, der Anzahl der kortikalen Kolumnen und der Neuronenanzahl innerhalb dieser Kolumnen, können im Modell viele Eigenschaften kortikaler Faltungsmuster in Säugetieren vorhergesagt werden. Ähnlich wie in Säugetieren ist der Faltungsgrad der vom Modell vorhergesagt wird von dem Verhältnis zwischen Parametern, die die Größe und Dicke des Kortex beschreiben, abhängig. Dementsprechend werden mehr und mehr Faltungen mit steigender Anzahl der Kolumnen, aber gleicher Anzahl von Neuronen pro Kolumne vorhergesagt. Wie in Säugetieren entstehen dabei auch die größeren primären Faltungen zuerst bevor es innerhalb der größeren Faltungen zu kleineren Faltungen höherer Ordnung kommt. Neben der Abhängigkeit des Faltungsgrads von der Größe des Kortex können Variationen in der Konnektivität erklären, wie es einerseits zu stereotypischen Faltungsmustern kommen kann, aber andererseits auch warum der Faltungsgrad zwischen verschiedenen Säugerordnungen unterschiedlich mit der Größe des Kortex skaliert. Letztlich könnten pathologische Veränderungen der Konnektivität zu den entsprechenden Änderungen im Faltungsmuster führen.
Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass mittels einfacher Prinzipien, die die Verbindung zwischen Neuronen und deren relative Position zueinander beschreiben, komplexe neuroanatomische Strukturen vorhergesagt werden können. Da mit derselben Methode zur neuronalen Platzierung sowohl neuronale Karten als auch kortikalen Faltungen, also sehr unterschiedliche Strukturen vorhergesagt werden konnten, stellt sich die Frage, ob diese Strukturen durch einen gemeinsamen biologischen Mechanismus entstehen. Neuronale Zugkräfte sind ein möglicher Mechanismus, der die Entstehung kortikaler Faltungen erklären könnte. Auch wenn es eher unwahrscheinlich ist, dass die Entstehung neuronaler Karten von Zugkräften zwischen Neuronen abhängt, kann es nicht vollständig ausgeschlossen werden. Ob solche Kräfte an der Selbstorganisation neuronaler Netzwerke beteiligt sein könnten, ist eine interessante Fragestellung für zukünftige empirische Studien.
Aufgrund des großen Potenzials der Nanotechnologie ist in Zukunft eine Zunahme der Produktion und Verwendung von Nanomaterialien zu erwarten, wodurch mit einer steigenden Freisetzung in der Umwelt zu rechnen ist. In der vorliegenden Dissertation werden daher Methoden zur Untersuchung von Nanomaterialien betrachtet und Effekte von NP auf Algen untersucht.
In Teil I wurden Silber-, Titandioxid- und Polystyrol-Nanopartikel sowie Kohlenstoffnano-röhrchen untersucht. Von jedem Nanomaterial standen eine unmodifizierte Form sowie zwei modifizierte Partikeltypen mit geladener Oberfläche und zusätzlich Polystyrol-Mikropartikel zur Verfügung. Zunächst erfolgte eine Charakterisierung der Materialien mittels Transmissions-elektronenmikroskopie, wobei die Größe der Objekte gemessen und das Verhalten beschrieben wurde. Zudem wurde im Fall der Polystyrol-Nanopartikel der Einfluss mehrerer Chemikalien getestet, welche im Zusammenhang mit der Probenvorbereitung für das Elektronen¬mikroskop zum Einsatz kamen. In einem nächsten Schritt erfolgte die Untersuchung von Nanomaterialien in umweltrelevanten Matrices. Hierbei wurden Boden- und Wasserproben sowie humane Körperflüssigkeiten und Fischgewebe elektronenmikroskopisch auf die Anwesenheit von synthetischen Nanomaterialien untersucht und Proben mit Nanomaterialien versetzte, um die Nachweisbarkeit mit dem Elektronenmikroskop bewerten zu können. Zusätzlich wurden verschiedene Zellkulturen und Gewebe auf morphologische Auffälligkeiten im Zusammenhang mit einer Exposition gegenüber Nanomaterialien untersucht.
Die durchgeführten Versuche zeigen, dass die Transmissionselektronenmikroskopie für viele Nanomaterialien ein sinnvolles Charakterisierungswerkzeug darstellt. Die Untersuchung besonders kleiner Partikel mit einem Durchmesser im einstelligen Nanobereich gestaltet sich jedoch schwierig bis unmöglich. Für den Nachweis von Nanomaterialien in Umweltmatrices und Zellen ist die Methode nur bedingt geeignet, wobei insbesondere niedrige Partikelkonzentrationen problematisch sind. Die Methode ist somit lediglich als Ergänzung zu anderen Nachweismethoden zu betrachten, kann jedoch hilfreiche Informationen zur Lokalisation von Nanoobjekten in Zellen und zu ihrem Verhalten in Umweltproben liefern.
In Teil II wurden die beiden Grünalgen Raphidocelis subcapitata und Chlamydomonas reinhardtii sowie die Diatomee Cyclotella meneghiniana gegenüber unterschiedlich modifizierten Silber-, Titandioxid- und Polystyrol-Nanopartikeln exponiert. Die Beurteilung der Toxizität wurde anhand der über die Absorption gemessenen Zellzahl, des Chlorophyll a Gehalts, der über die Chlorophyllfluoreszenz gemessenen Parameter Fv/Fm und NPQ sowie der transmissions¬elektronenmikroskopischen Untersuchung der Algenzellen vorgenommen. Zudem wurde der Einfluss der Beschattung von Algenzellen durch die Nanopartikel experimentell untersucht.
Die Untersuchungen zeigen, dass Nanomaterialien bei Absorptionsmessungen in Abhängigkeit von ihrem Grundmaterial, ihrer Oberflächenmodifikation und dem umgebenden Medium ein mehr oder weniger starkes Streuungsverhalten zeigen. Auch die Anwesenheit von Algen kann einen deutlichen Einfluss haben. Trotz der Beeinflussung der Lichtstreuung hat die Beschattung von Algen durch die Trübung des Mediums durch Nanomaterialien keinen Einfluss auf das Wachstum der Testorganismen. Die direkte Exposition der Algen gegenüber den Nanomaterialien zeigt, dass Silber-Nanopartikel die toxischste Wirkung haben. Die Abgabe von Silberionen durch die Partikel kann hierbei die auftretenden Effekte erklären. Auch Titandioxid-Nanopartikel führen zu negativen Effekten, wobei mögliche Gründe die Toxizität des Materials und die physikalische Isolierung der Zellen sind. Die Polystyrol-Nanopartikel haben eine stimulierende Wirkung auf die Algenzellen, welche auf einer Präferenz von adhäsivem Wachsen und dem Hormesis-Effekt beruhen kann. Die Oberflächenmodifikation der Nanomaterialien hat zwar einen Effekt auf die Toxizität, ihr Einfluss wird jedoch durch andere Faktoren überlagert. In Bezug auf die unterschiedlichen Methoden zum Nachweis der Toxizität, ist die Bestimmung des Chlorophyll a-Gehalts als besonders sensitiv zu bewerten und kann zudem auf alle Partikel angewandt werden. Hinsichtlich der Absorptionsmessung besteht teilweise ein Einfluss durch die Partikelstreuung. Die Messung der Chlorophyllfluoreszenz scheint einer starken Beeinflussung durch externe Faktoren und ggf. die Nanomaterialien selbst zu unterliegen. Die elektronenmikroskopische Untersuchung ist vergleichsweise wenig sensitiv, kann jedoch ergänzende Informationen bezüglich der Wirkweise von Nanomaterialien liefern. Der Vergleich der Testorganismen zeigt, dass Raphidocelis subcapitata empfindlicher reagiert als Chlamydomonas reinhardtii. Eine allgemeingültige Sensitivitätsabstufung zwischen den Grünalgen und der Diatomee ist nicht möglich, da die Reaktionen in Abhängigkeit von Medium bzw. Partikelgrundmaterial unterschiedlich ausfallen.
Cardiovascular diseases are still regarded as the main cause of death in the modern world. However, the generic term "cardiovascular diseases" is not uniformly defined. It essentially describes diseases of the cardiovascular system and includes diseases such as hypertension, arteriosclerosis, myocardial infarctions, heart failure, coronary heart diseases, rheumatic heart diseases and heart valve defects. In addition to the well-known risk factors such as obesity, smoking, hypercholesterolemia and lack of exercise, age is a further risk factor that plays an important role in the development of cardiovascular diseases. As the modern societies age; this becomes an increasing problem.
But why does the prevalence of cardiovascular diseases increase with age? In gen-eral, age-dependent changes at the cellular level are assumed to be responsible for the pathological changes in the cardiac and vascular tissues. Important mechanisms such as autophagy, oxidative stress, mitochondrial dysfunctions, genomic instability, cellular senescence and disturbances in signaling pathways of growth factors play a decisive role. In old age, myocardial hypertrophy occurs, which results in cardiac wall thickening and an altered geometry of the ventricle. Chronic inflammations, paracrine and age-dependent cell-intrinsic factors further lead to activation of cardiac fibro-blasts with increase cell proliferation, collagen secretion and matrix cross-linking. The consequences are interstitial and perivascular fibrosis, which stiffen the heart and blood vessels. Oxidative stress and inflammations additionally attack the blood ves-sels and impair endothelial function, which is further aggravated by possible pre-existing conditions such as diabetes mellitus and hypertension.
In the past decades, the main focus has therefore been on researching these age-dependent changes in the hope of better understanding cardiovascular ageing and developing possible regenerative interventions. By studying the repair mechanisms of other organs such as the lungs and the bone marrow, the endothelium in particular showed a high regenerative capacity, which influences the proliferation and cell func-tion of the surrounding cells.
For a long time, the general opinion was that the endothelium is only the internal lin-ing of blood and lymphatic vessels, as well as the heart chambers, which as a single-layer barrier guarantees the integrity of the blood vessels. However, endothelial cells are very heterogeneous, depending on the type of blood vessel and the type of tis-sue they serve. In addition to their barrier function, endothelial cells also regulate the exchange of substances between blood and tissue, stimulate the formation of new blood vessels and re-model existing vascular networks. They are also able to re-structure the extracellular matrix that surrounds them. They release not only matrix proteins, but also cytokines and growth factors into the extracellular space. On de-mand, these factors are then released and stimulate angiogenesis or cell prolifera-tion. In addition, the secretion of various matrix proteins not only stabilizes the cellu-lar neighborhood, but also regulates various cell functions.
By modelling the endothelial environment - the so-called vascular niche - endothelial cells are able to communicate with the surrounding cells. As a result, a regenerative effect of the vascular niche has already been described in various organs. In the liv-er, for example, it has been shown that increased concentrations of endothelial Ang2 and decreased endothelial activin A after partial hepatectomy stimulate the prolifera-tion of hepatocytes and thus liver regeneration. In the bone marrow, endothelial cells mobilize stem cells via nitric oxide and in the lungs, endothelial MMP14 releases growth factors from the extracellular matrix, which stimulate epithelial cell prolifera-tion after partial pneumectomy. Whether such a regenerative effect of the vascular niche also plays a role in the heart is largely unknown.
Since both the regenerative capacity of the heart and endothelial function decrease with age, the aim of this dissertation was to investigate the role of the vascular niche and endothelial cell communication in the aged heart. Human cell lines as well as mouse and artificial rat models were used for these investigations. Since this thesis is a cumulative dissertation with partially published papers, it is divided into three parts.
In the first part of this thesis, the transcriptional signature of secretory genes in the aged cardiac endothelium was studied. Perfused endothelial cells from hearts of young (12-week-old animals) and old mice (20-month-old animals) were isolated and used for bulk RNA sequencing. The two matrix proteins laminin β1 and β2 were among the top-regulated genes. While laminin β2 was particularly expressed in the young cardiac endothelium, laminin β1 was predominantly found in the old endotheli-um. This change in laminin expression was confirmed histologically at protein level and its autocrine function was investigated in vitro. To mimic the in vivo situation in vitro, cell culture dishes were coated with human recombinant laminin 421 or laminin 411 and sutured with human endothelial cells from the umbilical vein (HUVEC). Di-verse functional investigations showed that endothelial cells migrated and adhered poorly in the presence of laminin 411, while in Matrigel tube formation assays HU-VEC formed reduced endothelial networks when cultured on LM 411.
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Biodiversity is threatened worldwide because of ongoing habitat loss and fragmentation, overexploitation, pollution, biological invasions and a changing global climate. Due to the major importance of biological diversity for modern human living, efficient conservation and management strategies are required to protect endangered habitats and species. For this purpose, ambitious multilateral agreements on regional and global scale were declared to prevent biodiversity loss.
Efficient biomonitoring methods are required to adequately implement these biodiversity conventions. Species monitoring as a core activity in biodiversity research is an effective tool to assess the status of species and trends within habitats. Data collection can be obtained with visual, electronic or genetic surveys. Still, these monitoring programs can be expensive, laborious and inefficient for accurate species assessments. New techniques based on environmental DNA (eDNA) allows for the detection of DNA traces in environmental samples (soil, sediment, water and air samples) and open up new possibilities for species monitoring. The eDNA methodology enables detection of single species in a qualitative (presence/absence) or (semi-) quantitative way. eDNA metabarcoding approaches can be an effective community structure assessment method.
This thesis, located at the interface between experimental and applied research, illustrates the suitability of the eDNA methodology in applied biomonitoring using the example of the water-borne crayfish plague pathogen Aphanomyces astaci (Schikora 1906). The obtained results provide new insights into A. astaci sporulation dynamics in natural water courses. A. astaci sporulation is influenced by seasonal variation of water temperatures and life history traits (molting, activity, mating) of infected crayfish. The results also imply a high transmission risk of A. astaci spores during the complete year. This thesis compares two eDNA methods, which are successfully and consistently detecting A. astaci spores. Each approach is suitable for different biomonitoring tasks due to the method-specific requirements. The obtained results also reveal spatial variation in A. astaci occurance in the tested water bodies. A. astaci spore estimates are positively correlated with population density and pathogen loads of captured A. astaci- positive crayfish. eDNA results show a downstream zoospore transport of up to three kilometres distance from a distribution hot spot area of A. astaci-infected crayfish. The eDNA methodology is helpful in gaining reliable information on A. astaci occurrence in large water bodies. This information is urgently needed to initiate efficient management decisions for the conservation of European crayfish species.
eDNA-based methods such as for A. astaci detection are a useful complement for conventional monitoring and should have a strong impact on conservation policy. eDNA methodology will be helpful for the practical implementation of the main aims of key conservation agreements and thus will make important contributions to biodiversity protection.
Cerebellar ataxias are a group of neurodegenerative disorders primarily affecting the cerebellum. Although causative mutations in several genes have been identified there is currently no cure for ataxias.
The first part of this dissertation is focused on Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2). SCA2 is a dominant ataxia caused by repeat expansion mutations in the ATXN2 gene, which encodes the protein Ataxin2 (ATXN2). A polyglutamine (polyQ) tract consisting of CAG repeats interrupted by CAA was identified at exon 1 of ATXN2. Healthy individuals have between 22 and 23 glutamines, while expansions longer than 33 CAG repeats cause SCA2. The most noticeable symptom that SCA2 patients show is ataxic gait; however, they also show cerebellar dysarthria, dysdiadochokinesia, and ocular dysmetria caused by the progressive cerebellar degeneration.
To model the SCA2 disease, we generated a new mouse model where 100 CAG repeats were introduced in the mouse Atxn2 gene via homologous recombination. The characterization of this mouse model, Atxn2-CAG100-KIN, demonstrated that it reproduces the symptomatology observed in SCA2 patients. These animals showed significant loss of weight over time, brain atrophy, and motor deficits.
In addition, ATXN2 intermediate expansions have been linked to the pathology of Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) as a risk factor. ALS is a fatal neurodegenerative disease where the motor neurons in the brain and spinal cord degenerate. A hallmark of ALS is the presence of TDP43-positive inclusions in neurons and glia. Further studies of post mortem spinal cord samples from SCA2 patients showed severe and widespread neurodegeneration of the central somatosensory system. Therefore, it was of interest to further investigate the pathology affection of this tissue in the Atxn2-CAG100-KIN line and the relationship between ATXN2 and TDP43. The characterization of the spinal cord pathology via protein quantification, transcript quantification, and immunohistochemistry showed a preferential affection of RNA binding proteins (RBP) in the spinal cord rather than the cerebellum. The ALS-linked factors TDP43 and TIA1 showed time-dependent co-aggregation with ATXN2 in spinal cord sections together with an increase of CASP3 levels. Therefore, this mouse model can help develop new therapies and evaluate their effect in differently affected areas.
A transcriptome data set from Atxn2-CAG100-KIN spinal cord samples at the final disease stage of this mouse model showed a strong up-regulation of RNA toxicity-, immune- and lysosome-implicated factors. These data pointed to a pathological reactivation of the synaptic pruning and phagocytosis in microglia. ATXN2-positive aggregates were found in microglia from spinal cord sections of 14-month-old Atxn2-CAG100-KIN via immunohistochemistry. The characterization of microglial response and the potentially deleterious effects of the expanded ATXN2 in this cell type could lead to therapies to improve patients’ living standards or delay the symptoms’ onset.
The second part of this thesis was focused on an autosomal recessive form of cerebellar ataxia, Ataxia Telangiectasia (A-T), with childhood onset. A-T patients show severe cerebellar atrophy manifesting as ataxia when the child starts to walk. The genetic cause of A-T is loss-of-function-mutations in the Ataxia Telangiectasia Mutated gene (ATM). ATM is a kinase involved in DNA damage response, oxidative stress, insulin resistance, autophagy via mTOR signaling, and synaptic function.
Working with proteome data from cerebrospinal fluid of 12 A-T patients and 12 healthy controls, we aimed to define novel biomarkers that would allow following the neurodegeneration in extracellular fluid. Additional validation efforts with ~2-month-old Atm-knock-out (Atm-/-) cerebellar samples helped us to define a scenario were the deficit of vesicle-associated ATM alters the secretion of ApoB, reelin, and glutamate. As extracellular factors, apolipoproteins and their cargo such as vitamin E may be useful for neuroprotective interventions.
BACKGROUND: Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD) is one of the most common neurodevelopmental disorders worldwide. As described in the DSM-5, ADHD is clinically heterogeneous with three main subtypes; predominant hyperactive, predominant attention deficit and combined. The severity of symptoms widely differs among the patients and interferes with the person functioning, negatively impacting social and occupational activities (American Psychiatric Association, 2013). Despite the many efforts, the etiology of the disorder is still unclear. Therefore, there is an increasing demand of models that would help elucidating the causative mechanisms of the disorder and, in parallel, would be valuable tools to discover new and effective treatments. The main goal of the study is the identification of disease specific cellular phenotypes related to Attention-Deficit/Hyperactivity Disorder (ADHD) in cellular models from patients carrying rare copy number variants (CNVs) in the PARK2 locus that have been previously associated with ADHD (Elia et al., 2010; Jarick et al., 2014).
METHODS: Human dermal fibroblast (HDF) cultures were obtained from skin punches and reprogrammed into human induced pluripotent stem cells (HiPSC) and successively induced to differentiate into HiPSC-derived dopaminergic neurons. Both HiPSC and HiPSC-derived neurons, were proven to be bona fide models by morphological analysis, RT-PCR, RT-qPCR, immunofluorescence, embryoid body assay, molecular karyotyping and dopamine level quantification. A total of six donors were selected for HiPSC and dopaminergic neuron generation: 3 adult ADHD PARK2 CNV risk carriers (1 duplication and 2 deletion carriers, 1 ADHD non-risk CNV variant carrier and 2 healthy controls).
We conducted stress-response experiments (nutrient deprivation and CCCP administration) that are well known to increase PARK2 expression, on both fibroblasts and HiPSC. After assessing PARK2 gene and protein expression levels, we evaluated the gene expression of genes that are involved with different processes orchestrated by PARK2. We then performed a series of assays with a special focus on mitochondrial function and energy metabolism (ATP production, basal oxygen consumption rates, ROS abundance) and evaluated changing in the mitochondrial network morphology.
To evaluate the effect of nicotine exposure, one of the best replicated prenatal risk factors for having a child later on diagnosed with ADHD, we treated HiPSC-derived dopaminergic neurons with smoking-relevant nicotine concentrations and evaluated PARK2 protein expression after treatment and gene expression by RNA sequencing.
RESULTS: The cell models created in this study passed all the characterization tests required to assess whether the lines can be considered bona fide models without underling genotype differences. The evaluation of patho-phenotypes connected with ADHD/PARK2 CNVs in HDF and HIPSC showed that, although PARK2 gene expression was unchanged, ADHD/PARK2 CNV carriers show different PARK2 protein levels possibly implying the presence of different post-transcriptional processes. ADHD/PARK2 CNV carriers show lower levels of ATP production and basal oxygen consumption rates compared to controls, a result in line with what was already reported in ADHD cybrids cells model (Verma et al., 2016). Our experiments indicate that both the amount of reactive oxygen species (ROS) and the mitochondrial network morphology is influenced by the treatment but not by the genotype. The evaluation of nicotine effects on HiPSC-derived dopaminergic neuron from aADHD patients showed no effects on PARK2 protein levels and gene expression. ADHD/PARK2 CNVs carriers show gene ontology enrichment in modules connected with the regulation of cell growth after nicotine acute treatment. Additionally, genes connected with energy production & oxidative stress response and extracellular matrix & cell adhesion were significantly differentially expressed after nicotine treatments.
CONCLUSIONS: This study points out the presence of impairment of mitochondrial energetics in cellular models derived from adult ADHD patients carrying rare CNVs within the PARK2 locus. In the last years, several studies have linked mitochondrial impairments to the etiology of psychiatric and neurodevelopmental disorders (McCann & Ross, 2018) and reported an overall increase of oxidative stress or insufficient response to oxidative damage both in children and adults with ADHD (Joseph, Zhang-James, Perl, & Faraone, 2015; Lopresti, 2015). Additionally, different groups have underlined an abnormal brain connectivity in ADHD patients in their work (Gehricke et al., 2017). Our preliminary investigation of the effects of a well-known prenatal risk factor for ADHD, nicotine gestation exposure, point out a susceptibility of the PARK2 CNVs carriers in processes involved in regulation of cell growth and in proteins connected with extracellular matrix composition and cell-adhesion molecules, all factors necessary for neuronal maturation and formation of proper neural connections (Washbourne et al., 2004). In conclusion, this study presents novel and fully validated cellular model systems to study the etiopathogenesis of ADHD based on rare CNVs in the PARK2 locus. Moreover, the identification of disease-relevant phenotypes in the model might be helpful in the future for testing new alternative medications.
Hypoxia is a condition in which cells are deprived of adequate oxygen supply and represents a main feature of solid tumours. Cells under hypoxic stress activate transcriptional responses driven by hypoxia-inducible factors (HIFs), which affect multiple cellular pathways, including angiogenesis, metabolic adaptation and cell proliferation. While the transcriptional changes induced in hypoxic tumours are well characterised, it is still poorly understood how hypoxia contributes to the aberrant post-transcriptional regulation observed in tumours. In this PhD thesis, I studied the RNA response to hypoxia in cancer, to provide novel insights into its regulation.
Using deep RNA-Sequencing (RNA-Seq), I investigated transcriptome changes of three human cell lines from lung, cervical and breast cancer under hypoxia, advancing our knowledge of post-transcriptional gene regulation in hypoxic cancer. I show that hypoxia induced consistent changes in transcript abundance in the three cancer types. This was coupled to divergent splicing responses, highlighting the cell type specificity of alternative splicing programs. While the mRNA levels of RNA-binding proteins were mainly reduced, hypoxia upregulated muscleblind-like protein 2 (MBNL2) in all three cell lines. Hypoxia control was specific for MBNL2, since it did not affect its paralogs MBNL1 and MBNL3. Via knockdown experiments of MBNL2 in hypoxic cells, I could show that MBNL2 induction promotes adaptation of cancer cells to low oxygen by regulating both transcript abundance and alternative splicing of hypoxia response genes. In addition, depletion of MBNL2 reduced the proliferation and migration of cancer cells, corroborating a function of MBNL2 as cancer driver.
In the last few years, a novel class of RNAs has gained attention, namely circular RNAs (circRNAs), which are produced by a particular splicing mechanism, known as back-splicing. CircRNAs have been reported to change their abundance in cancer and their high stability makes them promising candidates as diagnostic biomarkers. In this study, I took advantage of deep rRNA-depleted RNA-Seq data to comprehensively investigate the expression of circRNAs in human cancer cells and their changes in response to hypoxia. To reliably identify circRNAs, I established a pipeline that integrates two available tools. for circRNA detection with custom approaches for quantification and statistical analysis. Using this pipeline, I identified 12006 circRNAs in the three cancer cell lines. Their molecular features suggest an involvement of complementary RNA sequences as well as trans-acting factors in circRNA biogenesis, including the splicing factor HNRNPC. Remarkably, I detected 210 circRNAs that are more abundant than their linear counterparts. Upon hypoxic stress, 64 circRNAs were differentially expressed in cancer cells, in most cases in a cell type-specific manner. In summary, in this PhD thesis, I present a comparative transcriptome profiling in human cancer cell lines. It reveals MBNL2 as an important player in hypoxic cancer progression and provides novel insights into the biogenesis and regulation of circRNAs under hypoxic stress.
The existence of all living organisms depends on their multidimensional adjustment to the conditions of the environment in which they live. Organisms must constantly deal with not only abiotic stress factors (such as water availability or extreme temperatures), but also with various biotic interactions (the competition between different organisms, both intraspecific and interspecies). When there is a consensus between an organism and the environment it means that this organism is well adjusted and increases its probability of survival.
Symbiotic organisms possess the ability to establish an intimate interaction with another species (symbiont) that provides benefits for survival. Organisms that are involved in obligate symbiosis may adapt to a new environment by switching to another symbiotic partner that is locally better adapted; or by reshuffling symbiont communities present in the holobiont. This ability potentially gives them the opportunity to flexibly react to changing environmental conditions.
In this thesis I studied the genetic diversity and geographic distribution of symbiont lineages in a lichen symbiosis to better understand environmental adaptation in symbiotic systems. Lichens are symbiotic associations of photobionts (one or several green-algal species or cyanobacteria), filamentous mycobionts (lichen-forming fungi) and co-inhabiting symbiotic microorganisms (lichen-associated bacteria, endolichenic fungi, and basidiomycete yeast). The coccoid green algae of the genus Trebouxia are the most common and the most studied lichen photobionts. However, the lack of formal Trebouxia taxonomy impedes our understanding of this photobiont diversity.
Different species of mycobionts may share the same photobionts and a single species of mycobiont may associate with multiple, genetically different photobionts. Interactions among symbionts are not random and are constrained by evolutionary and environmental processes. The ability to associate with specific symbiotic partner is considered as a lichen strategy to facilitate adaptation to the constantly changing environments.
The objectives of this thesis were to 1. Elucidate the intraspecific diversity of fungal and algal symbionts in the lichen Umbilicaria pustulata, given a range-wide (Europe-wide) sampling; 2. Evaluate species delimitation in trebouxioid photobionts based on molecular data, and 3. Quantify the climatic niches of photobiont lineages within U. pustulata, to establish whether the association with particular photobionts may modify the range and ecological niche of this lichen.
The main findings of this thesis are:
1. The genetic diversity within trebouxoid photobiont of U. pustulata is higher than within the mycobiont. The most variable photobiont loci are nrITS rDNA, psbJ-L, and COX2. RbcL is the least variable photobiont locus. The most variable mycobiont loci are MCM7 and TSR1. This study shows a lack of genetic variability in the mycobiont loci EF1, nrITS rDNA, RPB1, and RPB2.
2. U. pustulata shows a low level of selectivity and is associated with numerous (most likely six) putative algal species. All photobiont haplotypes found in U. pustulata are shared between other lichen-forming fungi species, showing different patterns of species-to-species and species-to-community interactions.
3. The geographic distribution of U. pustulata symbionts associations is strongly connected to changes in the climatic niches. The mycobiont-photobiont interactions change along latitudinal temperature gradients (cold-adapted hotspot) and in Mediterranean climate zones (warm-adapted hotspot). U. pustulata broadens its distribution range by switching between photobionts that posses specific environmental preferences.
Overall, this thesis contributes to the understanding of the symbiont diversity, fungal-algal association patterns and local adaptation linked to symbiont-mediated niche expansion in lichens. While identifying intraspecific diversity of both lichen symbionts is a key predisposition to understand symbiont interactions, population dynamics or co-evolution, my comparative study of the sequence-based molecular markers is relevant to reveal cryptic diversity in other lichen-forming fungi and their photobionts.
The determination of species boundaries in lichen symbionts is essential for the study of selectivity and specificity, co-distribution, and co-evolution. Whereas the phylogenetic relationships of Trebouxiophyceae are poorly understood, the application of a novel multifaceted approach based on phylogenetic relationships, coalescence methods and morphological traits presented in this thesis is a promising tool to address species boundaries within this heterogeneous genus.
This thesis provides evidence for symbiont-mediated niche expansion in lichens and highlights the preferential photobiont association from a niche-modeling perspective. My results shed light on symbiont polymorphism and partner switching as potential mechanisms of environmental adaptation in the lichen symbiosis. The spatial genetic pattern found in U. pustulata symbionts supports the concept of ecological fitting and is consistent with patterns found in other lichen studies. Results presented here relate also to findings in different symbiotic systems, like reef-building corals, where different latitudinal patterns and symbiont switching has been reported as an adaptive response to severe bleaching events. Furthermore, this study is timely in light of global warming, because the identification of interaction hotspots among symbionts helps to understand how lichens or other symbiotic organisms adjust to the ongoing climate change. This knowledge will, in turn, facilitate the proper conservation of the most vulnerable lichen populations. My doctoral thesis provides a conceptual framework for analyzing symbiont diversity, interaction patterns, and symbiont-mediated niche expansion that could be applied to other types of lichen species as well as other organisms involved in facultative or obligate symbiosis.
Humans and other primates are highly visual animals. Our daily visual activities such as recognizing familiar faces, interacting with objects, or reading, are supported by an extensive system of interacting brain areas. The interactions between the many individual nerve cells both within and between brain areas need to be coordinated. One possible solution to achieve flexible coordination between cells in the network is rhythmic activity, or oscillations. The focus of the thesis will be activity in the largest visual area, V1, in non-human primates. In V1, high-frequency activity, so-called gamma-band activity (“gamma”, ca. 30-90 Hz) can be frequently observed and has been suggested to play a role in coordinating activity in the visual system. In Chapter 1, the coordination problem, the primate visual system and gamma-band oscillations are introduced in detail. The following chapters explore the dependence of gamma on contextual influences. Does V1 use contextual information to optimize co-ordination? In the first part, the short-term consequences of repeated encounters with visual stimuli on V1 responses are explored (Chapters 2 and 3). Inspired by results from colored, naturalistic images in the first part, the second part tests the dependence of gamma on spatial and chromatic stimulus aspects (Chapters 4 and 5).
Stimulus repetition is a simple yet powerful way to tap into our brains’ ability to learn and adapt to our environment. Repeated presentation of a visual stimulus tends to decrease responses to this stimulus. Is this accompanied by changes in the coordination of brain activity? In Chapter 2, the stimulus-specificity of repetition effects on gamma was tested using naturalistic stimuli. V1 is most typically studied using black-and-white, artificial stimuli that are very familiar to the animals. Here, colored natural images were repeatedly presented that were initially novel to the animals, to provide a wider and more naturalistic range of stimulation. Both multi-unit spiking activity (MUA) and gamma showed stimulus-specific repetition effects. MUA responses de-creased most strongly for initial repetitions and less for later repetitions. In contrast, gamma could increase or decrease for initial repetitions, but tended to increase for later repetitions. This points to the operation of multiple plasticity mechanisms. One process may rapidly decrease MUA and gamma and be related to initial novelty or adaptation. The other increases gamma, is active for more repetitions, and could constitute a form of refinement of coordination over time. Moreover, based on the spacing of stimulus repetitions, stimulus memory in V1 persisted for tens of seconds.
In the following Chapter 3, the stimulus location specificity and persistence of the repetition effects for longer timescales were tested. To this end, the observation that the increase in gamma with repetition was strongest for the first tens of repetitions was used to test for location specificity and memory. Using simple artificial stimuli that were repeated many times at two alternating locations, both location specificity and memory on the order of minutes was observed. Due to the structure of the primate visual system, location specificity suggests that the repetition effects involve early to mid-level visual areas such as V1. Memory for previous stimulus presentations on the order of minutes has not been previously reported for V1 gamma. Taken together, these experiments demonstrate short-term plasticity of gamma that is stimulus- and location specific and persists on the timescale of minutes.
In Chapter 2, the average gamma-band response to the large, naturalistic stimuli was highly stimulus dependent. Relative increases in gamma-band activity scaled between tens and thousands of percent change depending on the stimulus. Particularly the color of the stimuli appeared to play a strong role, although the stimulus set was too limited and uncontrolled to draw strong conclusions. In Chapters 4 and 5, underlying mechanisms for the stimulus specificity of gamma were explored using more well-controlled, artificial stimuli that varied in color and spatial structure.
Much of vision relies on the analysis of spatial structure. Each nerve cell in V1 only responds to visual stimuli in a particular, small part of the visual field, its so-called “receptive field” (RF). Compared to isolated RF stimulation, nearby cells that are stimulated by a similar structure from different parts of visual space can show response decreases, commonly known as “surround suppression”, and may show coordinated activity in the gamma band. In Chapter 3, responses to large, uniformly colored disks are contrasted with responses to black or white (achromatic) disks. A first experiment showed that gamma-band responses were stronger for colored than achromatic stimuli, whereas MUA responses could decrease below baseline for colored stimuli. To test whether these phenomena were related to surround suppression, stimulus size was manipulated in a second experiment. When stimuli were of sufficient size to induce surround suppression, clear gamma-band responses emerged. Surround suppression and gamma were stronger for chromatic stimuli. However, the change of stimulus size could have changed not only surround suppression but also stimulus saliency. Therefore, in a third experiment, the overall size of the stimulus was kept constant, and the spatial structure of the stimulus was manipulated. In comparison to uniform, predictable stimulus structure, mismatches between the center of the stimulus and the surrounding visual space led to strong increases in MUA responses and strong de-creases in gamma-band activity. These effects were restricted to the recording sites with RFs at the mismatch location. These experiments underpin the strong role of both spatial structure and color for gamma in V1.
In Chapter 4, responses to different color hues are studied in more detail. Gamma response strength depended on hue, being strongest for red compared to blue and green stimuli when measured with a gray background. To better understand the underlying mechanisms of the differential responses, the spatio-temporal context in the form of the background color was manipulated. Background color had a strong influence on gamma strength. Using differently colored backgrounds, different parts of the color signaling pathways could be adapted. Response differences to different color hues could be explained well with a model that incorporates differences in adaptation between pathways involving long- compared to medium-wavelength cone signals.
Taken together, these experiments indicate a strong role of both spatial context (stimulus size and structure) and temporal context and drive (repetition, adaptation) for the generation of gamma-band activity in V1. Functional implications of these dependencies are considered in the final Chapter 6, and a role for gamma-band syn-chronization in a coding regime for visual inputs that generate strong drive and high predictability is suggested.
In the light of emerging resistances against common drugs, new drug leads are required. In the past natural sources have been more yielding in this respect than synthetic strategies. Fungi synthesize many natural products with biological activities and pharmacological relevance. However, only a fraction of the estimated fungal diversity has been evaluated for biological activity, and much of the Fungi’s natural chemical diversity awaits discovery. Especially promising in this context are lichenized fungi. Lichens are well known for their particularly rich and characteristic secondary chemistry which allows them to withstand intense UV radiation, protects them against herbivory, and prevents them from being overgrown. The slow growth rates of lichens and difficulties and infeasibility of large scale cultivations in the laboratory render lichens inaccessible for applied purposes. These experimental challenges have led to a poor understanding of the molecular mechanisms underlying the biosynthesis of characteristic lichen secondary metabolites. The recent development of improved sequencing techniques has enabled new strategies to address multi-species assemblages directly through metagenome sequencing and survey their biosynthetic potential through genome mining. However, whole genome sequencing of entire lichen thalli to metagenomically assess the lichen-forming fungus without the need of cultivation has not been evaluated for lichens before. This approach will enable the reconstruction of fungal genomes from mixed DNA from lichen thalli and allow the exploration of biosynthetic gene content.
My thesis was conducted in two parts: a methodological evaluation of a metagenomic strategy to reconstruct genomes and gene sets of lichen-forming fungi, and the exploration of biosynthetic gene content with the help of comparative genomics and phylogenetics. For the first part, I evaluated the quality of metagenome-derived genome assemblies and gene sets by direct comparison to culture-derived reference assemblies and gene sets of the same species. I showed that metagenome-derived fungal assemblies are comparable to culture-derived references genomes and have a similar total genome size and fungal genome completeness. The quality of assemblies was affected strongly by the choice of assembler, but not by the method of taxonomic assignment or inference of non-mycobiont DNA sequences. The fungal gene space is well covered in metagenome-derived and culture-derived fungal gene sets and overlaps to 88-90 %. Finally, the metagenome-derived assemblies reliably recover gene families of secondary metabolism. This shows the suitability of metagenomically derived genomes for mining biosynthetic genes, and potentially also other gene families. Overall, the method validation showed a high similarity between metagenome- and culture-derived genome assemblies.
For the second part of my thesis, I explored the biosynthetic gene content in two different systems: Between two sister-species with different ecological requirements but similar chemical profile, and between two species which are metabolite-rich and economically relevant in the perfume industry. I compared the diversity of biosynthetic gene clusters between the species and in the broader context of other lichenized and non-lichenized fungi. Overall, the whole genome mining revealed a large number of uncharacterised secondary metabolite gene clusters in fifteen genomes of lichen-forming fungi compared to other fungal classes. Their number highly outweighs the number of known synthesized metabolites and highlights the hidden biosynthetic potential in lichen-forming fungi. Many biosynthetic gene clusters in the ecological distinct sister-species showed a high homology in accordance with the high synteny in gene content and order in both genomes. These clusters represent ideal candidates for secondary metabolites synthesized by both species, while the remaining clusters may encode for metabolites relevant for the different ecological requirements of both species. The metabolite-rich species used in the perfume industry showed a particularly high number of biosynthetic gene clusters. An in-depth characterization of architecture and gene content of homologous gene clusters together with hints from phylogenetic relatedness to functional characterized metabolites provides promising insights into the biosynthetic gene content of these lichen-forming fungi.
In conclusion, I showed that metagenome sequencing of natural lichen thalli is a feasible approach to reconstruct the fungal mycobiont genome of lichens and circumvent time-consuming and in some cases impossible cultivation of individuals. The genome mining for secondary metabolite gene clusters in lichen-forming fungi revealed a high biosynthetic potential for the discovery of new natural products. One of the focal species, Evernia prunastri, contained the highest ever reported number (80) of biosynthetic clusters in lichenized fungi. The comprehensive cluster characterizations through annotation, comparative mapping and phylogenetics provide first valuable hints for linking metabolites to genes in these lichen-forming fungi. My results pave the way for biotechnological strategies to unlock the vast richness of natural products from lichens for applied purposes.
Transposable elements (TEs) are replicating genetic elementst hat comprise up to 50% of mammalian genomes. A specific class of TEs are retrotransposons that proliferate by transcription into a RNA intermediate, followed by genomic reintegration into another locus (so called “copy & paste” mechanism). Due to the lack of removal mechanisms and very rare parallel insertions, the presence of TE insertions at ortholgous genomic loci in multiple taxa provides a virtually homoplasy free phylogenetic marker. So far, developing phylogenetically informative markers from TE insertions has been a tedious work of testing hundreds of putative candidate loci in a trial-and error approach with low success rate. Hence, phylogenetic studies using TE insertions were often limited to a few dozen markers.
Recently, genome sequencing of multiple species using reference-mapping allowed the identification of genome-scale datasets of TE insertions. and made the ad-hoc development of phylogenetic informative markers possible. However, genome scale TE detection methods have rarely been applied to non model organisms in which data availability and quality is comparably limited. In this thesis, I developed the TeddyPi pipeline (TE detection and discovery for phylogenetic inference), a software tool that made it possible to obtain reliable genome-scale TE insertion data from low-coverage genomes. This was achieved by integrating the data from multiple TE and structural variation callers as well as applying a stringent filtering pipeline to exclude low-quality insertion calls. Whole-genome sequencing datasets of bears (Ursidae) and baleen whales (Mysticeti) were used to apply TE based phylogenetic inference and evaluate the method in comparison to sequence-based phylogenomic analyses.
In the bear genomes, TeddyPi identified 150,513 high-quality transposable element (TE) insertions, which allowed me to reconstruct the evolutionary history of bears despite extensive phylogenetic conflict (Lammers et al., 2017). The large number of detected TE insertions made also detailed network analyses possible that visualize the phylogenetic conflict. Experimental polymerase chain reaction (PCR) assays validated up to 93 % of the computationally identified TE loci and demonstrated the high accuracy of the dataset underlying the phylogenetic analyses.
Second, I present the initial genome sequencing of six baleen whales and a detailed investigation of their evolutionary history using TE insertions and established sequence-based phylogenomic methods. The taxon sampling of baleen whales included iconic species like the blue whale (Balaneoptera musculus) or the humpback whale (Megaptera novaengliae) (Árnason et al., 2018). A sequence-based reconstruction of the baleen whale species tree solved the long-debated phylogenetic position of the gray whale (Echrichtius robustus) within rorquals (Balaneopteridae) for the first time with high statistical support. Furthermore, the genome data made it possible to identify large extent of phylogenetic conflict for divergences during the radiation of rorquals that occurred 7-10 million years ago (Ma).
The phylogenomic analyses of 91,589 TE insertions in the whale genomes confirmed the sequence-based topology (Lammers et al., 2019). The quantification of phylogenetic signals obtained from the TE insertions revealed a high degree of discordance for the divergence of the gray whale and rorquals. Despite the large genome-scale dataset, statistical tests showed only marginal support for a bifurcating divergence of gray whales and the rorqual species. The limited statistical support for a strictly bifurcating tree obtained from genome-scale datasets of thousands of markers demonstrates the importance for including phylogenetic networks for displaying evolutionary divergences.
In conclusion, this thesis shows that identification of TE insertions from whole-genome resequencing provides plentiful and accurate phylogenomic markers. For the application in non model organisms, I provide a easy-to-use software to integrate multiple datasets from TE and structural variation callers in order to obtain reliable and ascertainment-bias free datasets. Detecting genome-scale datasets of TE insertions in two case studies demonstrates the applicability of this marker system for phylogenetic reconstruction and inferring phylogenetic conflict.
Alternative splicing (AS) is a co- or post-transcriptional process by which one gene gives rise to multiple isoforms. This ‘split and combine’ step multiplies eukaryotic proteome diversity several fold and is implicated in several diseases given its pervasive impact. Control of alternative splicing is brought about by cis-regulatory elements, such as RNA sequence and structure, which recruit trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Although several of these interactions are already described in detail, we lack a comprehensive understanding of the regulatory code that underlies a splicing decision.
Here, we have established a high-throughput screen to comprehensively identify and characterise cis-regulatory elements that control a specific splicing decision. A cancer-relevant splicing event in proto-oncogene RON was picked as a minigene prototype for initialising the screening approach. Then, we transfected a library of thousands of randomly mutagenised minigene variants as a pool into human cells, and subsequently quantified the spliced isoforms by RNA sequencing. Importantly, we used a barcode sequence to tag the minigene variants and thereby linked mutations to their corresponding spliced products. By using a linear regression-based modelling approach, we were able to determine the effects of single mutations on RON AS. In total, more than 700 mutations were found to significantly affect the splicing regulation of the RON alternative exon. In addition, mutation effects quantified from the screening approach correlate with RON alternative splicing in cancer patients. We discovered numerous previously unknown cis-regulatory elements in both introns and exons, and found that the RBP heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H (HNRNPH) extensively regulates RON AS at multiple levels in both cell lines and cancer. Furthermore, the large number of RBPs involved in the process, point to a complex splicing regulatory network involved in the control of RON splicing. iCLIP and synergy analysis between mutations and HNRNPH knockdown data pinpointed the most relevant HNRNPH binding sites across RON. Finally, cooperative HNRNPH binding was shown to mediate a splicing switch of RON alternative exon. In summary, our results provide an unprecedented view on the complexity of splicing regulation of an alternative exon. The novel screening approach introduces a tool to study the relationship of RNA sequence variants along with trans-acting regulators to their impact on the splicing outcome, offering insights on alternative splicing regulation and the relevance of mutations in human disease.
Cardiovascular diseases are a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Aging inflicts structural and molecular changes on the heart that oftentimes involve ischemic events, cardiomyocyte apoptosis and cardiac stiffening, which makes it a major risk factor for cardiovascular disease. After being disregarded as transcriptional noise for a long time, long non-coding RNAs have lately emerged as key regulators of many cellular processes in physiology and disease of virtually all tissues and organs, with some of them being differentially regulated during aging.
This study identified a long non-coding transcript antisense to the OXCT1 gene locus, Sarrah, to be downregulated in the heart during aging, after acute myocardial infarction and upon heart failure with preserved ejection fraction. Sarrah is expressed in several cardiac cell types with highest levels in cardiomyocytes, where it is predominantly localized in the nucleus. In mouse and human cardiomyocytes, Sarrah levels are reduced upon exposure to hypoxia or treatment with hypoxiamimetic agents in vitro.
Sarrah exerts an anti-apoptotic function in mouse and human cardiomyocytes as assessed from caspase activity and annexin V staining. Histological stainings of Sarrah-depleted human engineered heart tissue organoids and Sarrah overexpressing infarcted mouse hearts confirmed its anti-apoptotic function. Sarrah also plays a role in cardiomyocyte contractility, which is substantially impaired upon Sarrah silencing in human engineered heart tissue and neonatal rat cardiomyocytes. Additionally, cardiomyocytal Sarrah stimulates endothelial cell proliferation via paracrine effects as observed after Sarrah overexpression in mouse hearts as well as in co-culture settings with human endothelial cells and Sarrah-depleted or Sarrah overexpressing human cardiomyocytes. A microarray analysis revealed that silencing Sarrah in human cardiomyocytes induced apoptosisrelated gene expression. Mechanistically, Sarrah was predicted to form triplexes in human and mouse with promoters of genes downregulated, but not upregulated after Sarrah knockdown, suggesting that Sarrah interacts with target genes to activate their transcription. This interaction was confirmed in vitro using nucleic acid oligonucleotides containing the sequences of the Sarrah triplex motif and the Sarrah binding site of the exemplary target gene GPC6 of both human and mouse. RNA immunoprecipitation experiments in human cells demonstrated that Sarrah is associated with open chromatin, transcription factor CRIP2, transcriptional co-activator p300 and DNA-RNA hybrid structures that also occur in Sarrah target gene promoters, which indicated that Sarrah activates gene expression by triplex formation and recruitment of protein interaction partners. Deleting the triplex motif of endogenous Sarrah in mouse cardiomyocytes augmented apoptosis, showing that triplex formation is of functional relevance for Sarrah action.
Finally, overexpressing Sarrah in an acute myocardial infarction mouse model improved recovery of cardiac contractile function as assessed from ejection fraction, stroke volume, wall motion and wall thickness measured by echocardiography and magnetic resonance imaging. Infarct size was substantially reduced in Sarrah overexpressing mice compared with controls. This in vivo study implies that restoring Sarrah levels in the aged or infarcted heart bears significant therapeutic potential, which can be attributed to the combination of three Sarrah effects: increased cardiomyocytes survival, enhanced contractility of individual cardiomyocytes and paracrine stimulation of endothelial cell proliferation likely contributing to increased angiogenesis and tissue perfusion.
In summary, cardiac lncRNA Sarrah is evolutionary conserved with regard to its genomic locus, function and molecular mechanism. Via triplex formation with gene promoters, it is capable to activate a set of target genes that together mediate the anti-apoptotic and pro-contractile function of Sarrah in cardiomyocytes and that confer angiogenic effects to endothelial cells. A therapeutic utilization of Sarrah in the context of myocardial ischemia is conceivable in the future if Sarrah upregulation proves to be beneficial in further studies.
The overarching aim of this doctoral research was to examine and quantify the spatiotemporal variability in the movements of nomadic ungulates to better understand the possible drivers and characteristics of such movements as well as to examine the particular conservation challenges associated with nomadic movements.
Investigating the influence of truffle´s microbiome and genotype on the aroma of truffle fungi
(2019)
Truffles (Tuber spp.) are belowground forming fungi that develop in association with roots of various host trees and shrubs. Their fruiting bodies are renowned for their enticing aromas which vary considerably, even within truffles of the same species. This aroma variability might be attributed to factors such as geographical origin, degree of fruiting body maturation, truffle genotype and microbiome (microbial communities that colonise truffle fruiting bodies) which often co-vary. Although the influence of specific factors is highlighted by several studies, discerning the contribution of each factor remains a challenge since it requires an appropriate experimental design. The primary purpose of this thesis was to gain insight into the influence of truffle’s genotype and microbiome on truffle aroma.
This doctoral thesis is comprised of four chapters. Chapter1 (Vahdatzadeh et al., 2018) aimed to exclusively elucidate the influence of truffle genotype on truffle aroma by investigating the aroma of nine mycelial strains of the white truffle Tuber borchii. We also assessed whether strain selection could be employed to improve the human- perceived truffle aroma. Quantitative differences in aroma profiles among strains could be observed upon feeding of amino acids. Considerable aroma variabilities among strains were attributed to important truffle volatiles, many of which might be derived from amino acid catabolism through the Ehrlich pathway. 13 C-labelling experiments confirmed the existence of the Ehrlich pathway in truffles for leucine, isoleucine, methionine, and phenylalanine. Sensory analyses further demonstrated that the human nose can differentiate among strains. Our results illustrated the influence of truffle genotype on truffle aroma and showed how strain selection could be used to improve the human-perceived truffle aroma.
In chapter 2 the existing knowledge on the composition of bacterial community of four truffle species was compiled using meta-analysis approach (Vahdatzadeh et al., 2015). We highlighted the endemic microbiome of truffle as well as similarities and differences in the composition of microbial community within species at various phases of their life cycle. Furthermore, the potential contribution of truffle microbiome in the formation of truffle odorants was studied. Our findings showed that truffle fruiting bodies harbour complex microbial community composed of bacteria, yeasts, filamentous fungi, and viruses with bacteria being the dominant group. Regardless of truffle species, the composition of endemic microbiome of fruiting bodies appeared very similar and was dominated by α-Proteobacteria class. However, striking differences were observed in the bacterial community composition at various stages of the life cycle of truffle.Our analyses further suggested that odorants common to many truffle species might be produced by both truffle fungi and microbes, whereas specific truffle odorants might be derived from microbes only. Nevertheless, disentangling the origin of truffle odorants is very challenging, since acquiring microbe-free fruiting bodies are currently not possible.
Chapter 3 (Splivallo et al., 2019) further characterises truffle-associated bacterial communities of fruiting bodies of the black truffle T. aestivum from two different orchards. It aimed at defining the native microbiome in this truffle species, evaluating the variability of their microbiome across orchards, and assessing factors that shape assemblages of the bacterial communities. The dominant bacterial communities in T. aestivum revealed to be similar in both orchards: although a large portion of fruiting bodies were dominated by the α-Proteobacteria class (Bradyrhizobium genus) similar to other so far-assessed truffle species, in few cases β-Proteobacteria (Polaromonas genus), or Sphingobacteria (Pedobacter genus) were found to be predominant classes. Moreover, factors shaping bacterial communities influenced the two orchards differently, with spatial location within the orchard being the main driver in Swiss orchard and collection season in the French one. Surprisingly, in contrast to other fungi, truffle genotype and the degree of fruiting body maturity seemed not to contribute in shaping the assembly of truffle microbiome. Altogether, our data highlighted the existence of heterogeneous bacterial communities in T. aestivum fruiting bodies which are dominated by either of the three bacterial classes and mainly by the α-Proteobacteria class, irrespective of geographical origin. They further illustrated that determinants driving the assembly of various bacterial communities within truffle fruiting bodies are site-specific. Truffles are highly perishable delicacies with a short shelf life (1-2 weeks), and their aroma changes profoundly upon storage. Since truffle aroma might be at least partially produced by the truffle microbiome, chapter 4 (Vahdatzadeh et al., 2019) focuses on assessing the influence of the truffle microbiome on aroma deterioration of T.aestivum during post harvest storage. Specifically, volatile profile and bacterial communities of fruiting bodies collected from four different regions (three in France and one in Switzerland) were studied over nine days of storage. Our findings demonstrated the gradual replacement of dominant bacterial classes in fresh truffles (α-Proteobacteria, β-Proteobacteria, and Sphingobacteria) by food spoilage bacteria (members of γ- Proteobacteria and Bacilli classes), regardless of the initial diversity of the bacterial classes. This shift in the bacterial community also correlated with changes in volatile profiles, and markers for truffle freshness and spoilage could be identified. Ultimately, network analysis illustrated possible links among those volatile markers and specific bacterial classes. Our data showed that storage deeply influenced the composition of bacterial community as well as aroma of truffle fruiting bodies. They also illustrated the correlation between the shift in truffle microbiome, from commensal to detrimental, and the change of aroma profile, possibly leading to the loss of fresh truffle aroma. Overall, the work undertaken in this thesis demonstrated that truffle genotype and microbiome had a stronger influence on truffle aroma than previously believed.