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In der vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass Hyperforin wichtige Funktionnen von Keratinozyten beeinflusst. Hyperforin triggert die Ausdifferenzierung der epidermalen Zellen und inhibiert gleichzeitig ihre Proliferation. Diese Ergebnisse zeigen die physiologische Relevanz der Hyperforin-vermittelten Effekte, da diese beiden Prozesse in der Haut normalerweise gegenläufig ablaufen. Weiterhin war die von Hyperforin ausgeübte Ausdifferenzierungs-Zunahme und Proliferationshemmung vergleichbar mit den Effekten einer hohen [Ca2+]ex, die in vivo die Funktionen von Keratinozyten steuert. Die Frage, die aus diesen Ergebnissen resultierte, war, über welchen Mechanismus Hyperforin die Effekte in Keratinozyten beeinflusst. Die Untersuchung des Mechanismus der Hyperforin-induzierten Effekte zeigte, dass Hyperforin über die Aktivierung des TRPC6-Kanals einen Calcium-Influx in Keratinozyten bewirkt und resultierend daraus die Ausdifferenzierung von Keratinozyten anregt. Auch hier ergeben sich Parallelen zu der durch hohes [Ca2+]ex -induzierten Ausdifferenzierung, die ebenfalls einen Calcium-Einstrom in Keratinozyten auslöst. Eine Microarray-Analyse von Hyperforin-inkubierten Keratinozyten und anschließende Experimente mit selektiven Inhibitoren zeigte die Beteiligung der PKC/Ras/MEK/ERK-Signalkaskade. Interessanterweise gibt es hier ebenfalls Ähnlichkeiten zwischen Hyperforin und einer hohen [Ca2+]ex, da bekannt ist, dass eine hohe [Ca2+]ex die Ausdifferenzierung zumindest teilweise über diesen Signatransduktions-Weg steuert. Aufgrund der Parallelen zwischen der Hyperforin- und Ca2+-induzierten Ausdifferenzierung und den vermehrten Hinweisen auf die wichtige Rolle von TRPC-Kanälen in Keratinozyten, stellte sich die Frage, ob eine hohe [Ca2+]ex ebenfalls zur Aktivierung von TRPC-Kanälen führt. Tatsächlich konnten wir in dieser Arbeit zeigen, dass Calcium in Keratinozyten mehrere TRPC-Kanäle aktiviert und so einer Erhöhung der [Ca2+]i führt. Hierdurch konnte zum ersten Mal auch die Beteiligung von DAG-aktivierten TRPC-Kanälen an der Ca2+-induzierten Ausdifferenzierung gezeigt werden. Bei der Untersuchung von Psoriasis-Keratinozyten, die eine Hyperproliferation und erniedrigte Ausdifferenzierung in vivo aufweisen, konnte in der vorliegenden Dissertation eine grundlegende Störung des Calcium-Haushaltes festgestellt werden. Dabei zeigten die Psoriasis-Keratinozyten im Vergleich zu gesunden hPKs eine abnorme Antwort auf unterschiedliche Stimuli, die zu einer Erhöhung der [Ca2+]i führen. Sowohl eine hohe [Ca2+]ex, als auch Hyperforin führte zu einem deutlich erniedrigten Calcium-Einstrom in den Keratinozyten der Psoriasis-Patienten. Aus diesen Ergebnissen resultiert die Frage nach den Ursachen dieser Störungen. Da in dieser Arbeit bereits gezeigt werden konnte, dass Hyperforin und eine hohe [Ca2+]ex über TRPC-Kanäle die Ausdifferenzierung in Ketatinozyten beeinflussen, untersuchten wir die Expression von TRPC-Kanälen in Psoriasis-Keratinozyten. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression aller TRPC-Kanäle signifikant erniedrigt war. Vor dem Hintergrund der wichtigen Rolle der TRPC-Kanäle für die Calcium-Homöostase und Ausdifferenzierung von epidermalen Zellen, ist dies durchaus eine denkbare und plausible Erklärung für die Defekte der Psoriasis-Keratinozyten. Weiterhin zeigten unsere Ergebnisse, dass der CaR in Psoriasis-Keratinozyten vermindert exprimiert wird. Da dem CaR eine wichtige Rolle in der Regulation der [Ca2+]i als Antwort auf eine Änderung der [Ca2+]ex zugeschrieben wird, könnte dies eine weitere mögliche Erklärung für die gefundenen Störungen der Psoriasis-Keratinozyten sein.
In allen bislang durchgeführten Experimenten zur Mutagenese von embryonalen Stammzellen war auffällig, dass Gene, die für sekretierte oder membranständige Proteine kodieren, stark unterrepräsentiert waren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Genfallen untersucht, die speziell diese Gene mutieren sollten. Als Selektionskassetten tragen beide Genfallen den 5' Bereich des humanen CD2, der eine kryptische Spleißakzeptorsequenz enthält und für eine Transmembrandomäne kodiert, als Fusion mit der bakteriellen Neomycinphosphotransferase. U3Ceo trägt diese Kassette als klassische retrovirale Genfalle im LTR des Mouse Molony Leukemia Virus, wogegen die ebenfalls retrovirale FlipRosaCeo Genfalle die Selektionskassette im Viruskörper enthält. Diese wird von Rekombinaseerkennungssequenzen flankiert, welche eine konditionale Aktivierung der Mutation für die spätere Analyse in einem Mausmodell ermöglichen. Beide Genfallen zeigten mit ca. 80% aller Integrationen eine hohe Spezifität für Gene, die für sezernierte und membranständige Proteine kodieren. Allerdings war die Frequenz für Insertionen in sogenannte „hot spots“ bei beiden Genfallen aufgrund der geringeren Zahl an Zielgenen höher als bei anderen im GGTC verwendeten Genfallen (z.B. FlipRosabetageo). Innerhalb dieser „hot spots“ zeigte sich die bekannte Präferenz retroviraler Genfallenvektoren, in das 5’ Ende von Genen zu integrieren, wobei hier meist die größten Introns zu finden sind. Ebenso zeigte sich für die in dieser Arbeit untersuchten sekretorischen Genfallen genau wie bei anderen bekannten Genfallen eine bevorzugte Integration in Chromosomen mit einer hohen Gendichte. Die Funktionalität der konditionalen Genfalle konnte in vitro sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten durch Einbringen der Genfalle und der jeweiligen Rekombinasen bestätigt werden. In ES Zellen, die eine X-chomosomale Integration aufwiesen, wurde der Mechanismus durch transiente Expression der Rekombinasen in Klonen überprüft. Hierbei stellte sich heraus, dass das Wildtyptranskript eines mutierten Gens nach der einmaligen Rekombination der FlipRosaCeo wieder exprimiert wird und nicht durch die auf dem Gegenstrang befindliche Genfalle beeinflusst wird. Nach einer weiteren Rekombination mittels FLPe konnte der mutagene Ausgangszustand der Genfalle wieder hergestellt werden. Die Mutagenität der beiden Genfallen wurde durch Überprüfung der Konzentration der restlichen endogenen Transkripts der mutierten Gene per quantitativer PCR an X-chromosomalen Klonen analysiert. Hier konnte bei etwa 80% der untersuchten Klone eine sehr starke Mutation des jeweils getroffenen Gens festgestellt werden. Zur in vivo Überprüfung der U3Ceo Genfalle wurde ein Mausmodell durch Blastozysteninjektion des ES Zellklons M076C04 generiert. Die Integration der Genfalle in das erste Intron des Gens C030019F02Rik sollte eine deutliche Verkürzung des membranständigen Genproduktes bewirken. In Gehirnen von homozygoten Mäusen konnte die Expression des Wildtyptranskripts nicht mehr festgestellt werden, so dass diese Mauslinie eine Nullmutation des Gens trägt. Die in dieser Arbeit untersuchte KO Maus zeigte bisher keinen feststellbaren Phänotyp, obwohl das Genprodukt in vielen Spezies hoch konserviert vorliegt und auch nur in bestimmten Bereichen im Organismus nachweisbar ist, so dass eine wichtige Funktion des Proteins anzunehmen ist. Eine weitere Analyse dieser Mauslinie wird sich dieser Arbeit anschließen.
Cytochrome b561 (cyt b561) proteins are members of the recently identified eukaryotic ascorbate reducible protein family named CYBASC (CYtochrome B, ASCorbate reducible). CYBASC proteins are di-heme-b-containing membrane proteins that catalyze the transmembrane electron transfer from ascorbate. The function of the CYBASC proteins has been correlated with ascorbate recycling and/or iron facilitation uptake. Therefore, investigations on this family are of great interest as ascorbate is one of the most powerful antioxidants and iron is essential for cell survival both in animals and plants. As the amino acid sequence conservation of animal and plant CYBASC proteins is relatively high, all CYBASC members are proposed to share the same structural motifs. However, no three-dimensional structure of any representative member of the CYBASC family has been determined to date. In the Arabidopsis thaliana (A. thaliana) genome, two complete putative CYBASC open reading frames (ORFs), artb561-a and artb561-b were identified. In this thesis, these two A. thaliana CYBASC ORFs, encoding for Acytb561-A and Acytb561-B proteins respectively, were investigated and obtained main results are listed. 1. A. thaliana CYBASC proteins were heterologously produced in Pichia pastoris and Escherichia coli and purified by a single-step immobilized metal affinity chromatography (IMAC). To facilitate detection and purification, the recombinant A. thaliana CYBASC proteins were produced in both expression systems with the histidine affinity tag. Pure and stable preparations of the cytochromes were obtained via a single-step IMAC in sufficient amounts to perform biochemical characterizations. 2. Detergent solubilized recombinant Acytb561-A and Acytb561-B are dimers. As previously suggested for other CYBASC proteins, analytical gel filtration experiment suggested that both detergent solubilized cytochromes are dimers. 3. Spectroscopic features of Acytb561-B differed from those of previously described bovine chromaffin granule cyt b561. A distinctive feature of the first identified CYBASC protein, the cyt b561 from bovine chromaffin vesicles of adrenal medulla (Bcytb561-CG), is that its differential visible absorbance spectra (visible-spectra) revealed an asymmetric α-band with a maximum at 562 nm and a clear shoulder at 557 nm. This feature was recently used to discriminate CYBASC proteins from not-CYBASC proteins. However, in this thesis, it is shown for the first time that not all CYBASC proteins display in their reduced-minus-oxidized visible-spectra an asymmetric α- band and therefore, this feature can not be used as a discriminating CYBASC characteristic. 4. Ascorbate dependent reduction of the A. thaliana CYBASC proteins is inhibited by diethylpyrocarbonate (DEPC). As previously reported for the Bcytb561-CG, the ascorbatedependent reduction of the A. thaliana CYBASC proteins was inhibited by DEPC treatment. In addition, the ‘ascorbate protectant’ effect against DEPC that was observed on the Bcytb561-CG was also observed on the Acytb561-A and Acytb561-B proteins. Furthermore, as the physiological electron donor of all CYBASC proteins is supposed to be ascorbate, ascorbate-affinity of Acytb561- A and Acytb561-B was monitored and was found to be in the same range of the one of the Bcytb561- CG. 5. A. thaliana CYBASC proteins are Fe3+-chelate reductases. Recently, the Fe3+-chelate reductase activity of various CYBASC proteins was presented. In this thesis, it is shown that also both A. thaliana CYBASC proteins reduced Fe3+-chelates such as Fe3+-EDTA and Fe3+-citrate. Consistently, heme potentiometric reductive-oxidative titration of purified Acytb561-A and Acytb561-B indicated that the midpoint potential of the two heme centres of both cytochromes was lower than the one of those Fe3+-chelates. The values of both heme centre potentials of Acytb561-A and Acytb561-B are also consistent with the observation that both cytochromes were only partially reducible by ascorbate and were fully reduced with the non-physiological reductant Na-dithionite. In summary, this work describes the heterologous production, purification and initial characterizations of two distinct CYBASC proteins from A. thaliana: Acytb561-A and Acytb561-B. Biochemical characterization of these cytochromes showed that the shape of the α-band in the differential spectra is not a discriminating factor for CYBASC proteins but it is likely the DEPC sensitivity and the Fe3+-chelate reductase activity. Establishment of a purification strategy to obtain sufficient amounts of monodispersed and stable A. thaliana CYBASC proteins has also enabled initial screening of three dimensional crystallization conditions which are a prerequisite for a deeper understanding of this new eukaryotic redox enzyme family.
In der vorliegenden Arbeit wurde das Insektenzellen /Baculovirus-System für die heterologe Expression der NTPDase6 etabliert. Nach der Herstellung und Selektion des NTPDase6-positiven Baculovirus wurden drei Insektenzelllinien hinsichtlich der optimalen Expressions-bedingungen für die NTPDase6 analysiert. In Sf9(+Serum)-, Sf9(-Serum)- und High FiveTM-Zellen wurde eine Expression und Sekretion des aktiven Enzyms nachgewiesen. Ferner konnte durch die Analyse mit PNGaseF eine partielle N-Glykosilierung experimentell gezeigt werden. Die Aktivität im Kulturüberstand übertraf generell die Aktivität in der löslichen Zellfraktion. Die höchste GDPase-Aktivität war mit 22,96 nmol Pi /(106 Zellen x min) nach 6 Tagen im Kulturüberstand der SF9(-Serum)-Zellen zu verzeichnen. Nachdem die Erntequelle sowie der Erntezeitpunkt feststanden, wurden in den folgenden Experimenten verschiedene chromatographische Verfahren für eine Reinigung der NTPDase6 analysiert. Eine Bindung der NTPDase6 konnte für die Chromatographie mit Con A-Sepharose 4B, Q Sepharose Fast Flow, Reactive Red 120-Agarose, Reactive Green 19-Agarose, Cibacron Blue 3GA-Agarose und die Reactive Brown 10-Agarose verzeichnet werden. Hingegen wurde eine nur partielle Bindung der NTPDase6 für die Reactive Yellow 86-Agarose, Reactive Blue 4-Agarose und die Ni2+-NTA-Agarose nachgewiesen. Nicht oder kaum NTPDase6-bindend waren die CM Cellulose, GDP-Agarose, Protino Ni-TED und BD TALON. Ebenfalls analysiert wurde die Größenausschluss-Chromatographie mit Sephacryl S-100 HR unter verschiedenen Bedingungen. Für das finale Reinigungsschema wurde die Con A-Sepharose 4B-Chromato-graphie aufgrund der geringen Kosten und des großen Volumens als erster Reinigungsschritt eingesetzt. Als zweite Phase der sequentiellen Reinigung wurde die Cibacron Blue 3GA-Agarose ausgewählt, da in der Pilotstudie über die Reaktivfarbstoffe mit diesem Material die höchste Elution der GDPase-Aktivität beobachtet werden konnte. Für den dritten Schritt wurde aufgrund der hohen Trennschärfe die Ni2+-NTA-Agarose verwendet. Insgesamt wurde mit diesen drei Schritten eine 180 fache, partielle Reinigung der NTPDase6 erreicht. Es erwies sich, dass die erhaltene Proteinmenge für die geplanten Röntgenstrukturanalyse und die Elektronenspin-Resonanz-Spektroskopie nicht ausreichte. Als weitere Möglichkeit für die Untersuchung des angereicherten Enzyms stand die MALDI-TOF-Analyse zur Verfügung. In diesen Untersuchungen wurde die Aminosäuresequenz zu 43,9 % verifiziert und es ergaben sich Hinweise darauf, dass die potenzielle N256-Glykosilierungssstelle bei der heterologen Expression in Insektenzellen nicht genutzt wird. Weiterhin wurden die potenziellen N-terminale Signalpeptide und Spaltstellen der NTPDase6 in silico mit Hilfe des SignalP 3.0-Algorithmus analysiert. Diese Untersuchungen ergaben putative Spaltstellen an den Aminosäurepositionen L25 und A40 mit einer Wahrscheinlichkeit von 37 % und 7 %. Mit Triton X-114-Separationen wurde ferner nachgewiesen, dass 60,7 % der NTPDase6 in der Zelle in löslicher Form und 39,3 % in membrangebundener Form vorliegen. Die hier erbrachten Nachweise einer putativen N-terminalen Spaltstelle und der intrazellulären Spaltung des hydrophoben Signalpeptides deuten darauf hin, dass es sich bei der Sekretion des Proteins um einen physiologischen Vorgang handelt. Es ist wahrscheinlich, dass die gleichzeitige Lokalisation des Enzyms im Golgi-Apparat und im Kulturüberstand einen physiologisch relevanten Mechanismus darstellt und das Enzym extra- sowie intra-zellulär für die Hydrolyse von 5’-Nukleosid-Diphosphaten verantwortlich ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Lokalisation der NTPDase6 in vivo untersucht. Dazu wurden NTPDase6-Antikörper hergestellt und mit Hilfe von Immunoblots sowie in der Immunzytologie charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die NTPDase6-Antikörper nur in der Immunzytologie verwendet werden können. Zur Untersuchung der zellspezifischen Expression der NTDPase6 wurden anschließend immunhistologische Analysen am adulten Rattengehirn durchgeführt. Markierte Zellen präsentierten sich z.B. im gesamten Kortex des Gehirns, im Gyrus dentatus des Hippokampus, im Corpus striatum und im Septum. Die markierten Zellen zeigten eine organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns, die eine Markierung von Golgi-Stapeln vermuten lässt. Nur in Zellen mit einem großen Nukleus, bei welchen es sich um große Nervenzellen handeln dürfte, konnte die beschriebene Fluoreszenz nachgewiesen werden. Diese Markierungen als NTPDase6-spezifisch zu beurteilen ist jedoch schwierig, da die Präimmunkontrollen eine schwache, organelläre Fluoreszenz im Bereich des Zellkerns von Zellen mit einem großen Nukleus aufwiesen. Insgesammt liefern die Untersuchungen einen neuen Beitrag zum Verständnis der Struktur und der Prozessierung der NTPDase6 sowie ein Verfahren zur heterologen Expression und zur anschließenden partiellen Aufreinigung des Enzyms.
IL-18 ist ein proinflammatorisches Zytokin mit tumorsuppressiven Eigenschaften. Daher befindet es sich derzeit in klinischen Studien der Phase II zur Behandlung immunsensitiver Tumore. Erste Ergebnisse dieser Studien sind vielversprechend, zumal IL-18 im Vergleich zu beispielsweise IL-1Beta und IL-12 eine hohe Verträglichkeit im Menschen aufweist. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass IL-18 nicht nur in soliden Tumoren, sondern auch in leukämischen Zellen wie AML-Zellen zur Expression eines Genmusters führt, welches hohes antileukämisches Potential aufweist. Diese Erkenntnis wurde mittels einer Microarray-Analyse gewonnen und in unabhängigen Versuchen überprüft. Zu den hochregulierten Genen gehören neben IFNY und Fas-Ligand die in der vorliegenden Arbeit untersuchten angiostatischen Chemokine IP10 und I-TAC sowie EBI3, die Beta-Kette des heterodimeren Zytokins IL-27. Da die Regulation des humanen EBI3-Gens bislang schlecht charakterisiert war, schloss sich eine Promotoranalyse des humanen EBI3-Promotors an. Diese brachte hervor, dass zwei NFKB-Bindungsstellen des Promotors für die Expression von EBI3 unter dem Einfluß von proinflammatorischen Zytokinen unabdingbar sind. Der humane Promotor wurde dabei in dieser Arbeit zum ersten Mal im humanen Kontext betrachtet. Weiterhin konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass IL-27 die Fähigkeit besitzt, humane myeloisch-leukämische Zellen zu aktivieren und Signale in Form von STAT1 und STAT3-Phosphorylierung sowie Hochregulation von SOCS3- Expression zu induzieren. Interessanterweise lassen sich die potentiell tumorsuppressiven Eigenschaften von IL-18 in Bezug auf KG1 Zellen durch eine Zugabe von Zink verstärken. So kommt es unter dem Einfluß von Zink zu einer Verstärkung der Expression von IFNY und EBI3. Dieser synergistische Effekt besitzt allgemeinere Gültigkeit, da die hier durchgeführten Experimente an humanen PBMC zeigten, dass eine Erhöhung des extrazellulären Zinkgehalts um den Faktor 2 im Vergleich zu dem physiologisch zugänglichen Zinkgehalt im Blutplasma zu einer Potenzierung der Freisetzung von IFNY durch die proinflammatorischen Zytokine IL-1Beta, IL-18 und IL-12 führt. Diese Ergebnisse waren besonders in Bezug auf IL-1Beta unerwartet und tragen ihren Anteil zum Verständnis der erhöhten Sensibilität von Leukozyten unter zinksupplementierten Bedingungen bei. Weitere Studien werden zeigen, ob eine Therapie mit IL-18 und möglicherweise auch in Kombination mit Zink eine alternative Option bei AML Patienten bietet, die besonders responsiv auf dieses Zytokin reagieren.
Methanosarcina acetivorans kann Kohlenmonoxid (CO) als Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen. Als Endprodukte entstehen bei der Verwertung von CO neben Methan signifikante Mengen an Azetat und Formiat sowie Dimethylsulfid (DMS). In dieser Arbeit sollten verschiedene Aspekte dieses außergewöhnlichen CO-Stoffwechsels analysiert werden. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1) Weder die Methanogenese, noch die Bildung eines der anderen Metaboliten wird durch hohe CO-Partialdrücke gehemmt. Inhibitorstudien mit BES belegen, dass die CO-Oxidation und die Bildung von Azetat, Formiat und DMS nicht an die Methanogenese gekoppelt sind. Inhibitorstudien legen nahe, dass die Methanogenese aus CO am Aufbau eines Na+-Gradienten beteiligt ist und das Vorhandensein eines vom Protonenpotential-abhängigen Schrittes. 2) Eine neue, kostengünstige Transformationsmethode mittels Polyethylenglykol (PEG) konnte für M. acetivorans etabliert werden. Die Transformationshäufigkeit betrug ca. 1,1 x 107 Transformanden/μg DNA und liegt damit im Bereich von der der bisher etablierten Liposomen-vermittelten Transformationsmethode. 3) Mutantenanalysen und physiologische Studien belegen eine Beteiligung der Mts-Proteine in der DMS-Bildung und DMS-Verwertung, da in ihrer Abwesenheit kein DMS aus CO gebildet, kein Methan aus DMS produziert wird, und M. acetivorans nicht mehr auf DMS als Energiequelle wachsen kann. Die Mts-Proteine sind für das carboxidotrophe Wachstum jedoch nicht essentiell. Immunologische Analysen belegen eine substratabhängige Regulation von MtsF und weisen auf genetische Interaktionen der einzelnen Loci oder der Isoformen selbst hin. 4) Die monofunktionellen CODH-Isoformen von M. acetivorans sind am carboxidotrophen Wachstum beteiligt, jedoch nicht essentiell. Die beiden Isoformen der bifunktionellen CODH/ACS sind funktionell, und wenigstens eine von ihnen ist für autotrophes als auch carboxidotrophes Wachstum notwendig. Eine mögliche posttranslationale Modifikation von Cdh1 weist auf unterschiedliche physiologische Funktion und/oder Lokalisation hin. 5) Die F420H2-Dehydrogenase ist essentiell für methylotrophes, nicht jedoch für carboxidotrophes Wachstum.
Zwei der wichtigsten Leistungen eines sich entwickelnden Embryos sind der Aufbau des Blutkreislauf- und des Nervensystems. Beide Systeme sind hierarchisch organisierte Strukturen, deren Verzweigungen nahezu alle Teile des Körpers erreichen. Es gibt eine zunehmende Zahl von Hinweisen darauf, dass ihre Entwicklung eng miteinander verknüpft ist, nach ähnlichen Prinzipien verläuft und verwandte molekulare Mechanismen verwendet. Die Entstehung eines funktionellen vaskulären Netzwerks erfordert Signale, die Prozesse wie die Lenkung und die Verzweigung von Gefäßen in den Zielgeweben kontrollieren. Ähnliche Anforderungen werden an wachsende Axone bei der Knüpfung der Verbindungen des Nervensystems während der Embryonalentwicklung gestellt. Einige der Faktoren, die die Lenkung der Axone kontrollieren, spielen auch eine ähnliche Rolle in der vaskulären Entwicklung. Lenkungsmoleküle, die eine Richtungsinformation vermitteln, sind für die Wegfindung der Axone besonders wichtig. Die größte Familie solcher Lenkungsmoleküle wird durch die Semaphorine gebildet. Semaphorine können in acht Klassen unterteilt werden, deren gemeinsames Merkmal eine konservierte Semaphorin-Domäne ist und die unterschieden werden anhand ihrer Klassen-spezifischen carboxyterminalen Domänen. Die Semaphorin-Familie umfasst sowohl sekretierte als auch membrangebundene Proteine. Die am besten charakterisierten hiervon sind die sekretierten Klasse 3 Semaphorine. Eine Kombination von in vitro und in vivo Ansätzen zeigte, dass die Klasse 3 Semaphorine an der Steuerung der Axon- und Dendritenlenkung, der Bildung von Axonbündeln und der neuronalen Migration während der Entwicklung des Nervensystems beteiligt sind. Sie agieren hauptsächlich als repulsiv wirkende Signale, die Axone aus Regionen ausschließen, von den Geweben weg, in denen sie exprimiert sind. Diese Wirkung wird über die Semaphorin-Domäne vermittelt. Verschiedene Hinweise deuten auf eine Beteiligung von Semaphorinen an der Entwicklung des vaskulären Systems. Sowohl homozygote Sema3a- als auch Sema3c-Mausnullmutanten sterben nach der Geburt aufgrund kardiovaskulärer Defekte. Darüber hinaus binden die Rezeptoren für die Klasse 3 Semaphorine, Neuropilin-1 (Nrp-1) und –2 (Nrp-2), einige Isoformen des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF). Neuropilin-1 und Neuropilin-2-defiziente Mäuse und Neuropilin-1/-2-Doppelmutanten weisen Defekte des Gefäßsystems auf, wie z.B. eine Rückbildung der neuralen Vaskularisierung und Abweichungen in der Entwicklung des Herzens und der großen Gefäße. Die membrangebundenen Semaphorine sind bisher nur wenig untersucht, da zuverlässige in vitro Assays fehlen. Somit ist ein genetischer Ansatz der beste Weg, die physiologische Funktion dieser Proteine zu untersuchen. Aus diesen Gründen war die Zielsetzung dieser Arbeit, durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen eine Mauslinie herzustellen, die ein Nullallel des membrangebundenen Sema5a-Gens trägt. Für diesen Ansatz wurde ein Mitglied der Klasse 5 Semaphorine gewählt, da es nur zwei Mitglieder dieser Klasse im Mausgenom gibt, die weitgehend komplementäre Expressionsmuster aufweisen. Damit unterscheiden sie sich von den anderen Klassen der Semaphorine, deren Mitglieder stark überlappende Expressionsmuster zeigen. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit einer gegenseitigen funktionellen Kompensation nach Mutation eines Gens. Die Klasse 5 Semaphorine sind auch deshalb besonders interessant, da sie die einzigen sind, die sowohl in Vertebraten als auch in Invertebraten vertreten sind. Sie sind gekennzeichnet durch sieben carboxyterminale Typ 1-Thrombospondinmodule (TSP) in ihrer extrazellulären Domäne. TSPs wurden ursprünglich in den Proteinen Thrombospondin 1 und 2 gefunden, in denen sie das Auswachsen von Neuriten verschiedener Nervenzelltypen fördern. Dies lässt vermuten, dass Klasse 5 Semaphorine sowohl inhibierende als auch stimulierende Effekte haben könnten, in dem sie unterschiedliche Rezeptoren mit der Semaphorin-Domäne oder der TSPs aktivieren. Das Expressionsmuster von Sema5A und die bekannte Funktion von Semaphorinen in der Ausbildung neuronaler Verbindungen lassen es sinnvoll erscheinen, bei der Untersuchung der mutanten Tiere den Schwerpunkt auf die Entwicklung des Nerven- und des Gefäßsystems zu legen. Aufgrund technischer Schwierigkeiten konnte innerhalb der Bearbeitungszeit dieser Doktorarbeit nur der Phänotyp des vaskulären Systems untersucht werden. Die Inaktivierung des Sema5a-Gens wurde durch die Verwendung eines ‚Targeting’-Vektors erreicht, welcher die Exone 4 und 5 des Sema5a-Gens durch eine Neomycin-Selektionskassette ersetzte. Aus 144 untersuchten ES-Zellklonen wurden drei ES-Zellinien mit einem rekombinierten Sema5a-Locus identifiziert. Zwei der positiven Klone wurden zur Herstellung einer chimären Maus durch die Morula-Aggregationsmethode verwendet. Mit einem der Klone konnte eine männliche Chimäre erzeugt werden, die nach Kreuzung mit NMRI-Wildtyptieren die Mutation an die Nachkommen weitergab. Der Verlust der Proteinexpression in homozygoten Sema5a-Mutanten wurde durch Westernblot-Analyse von Zellmembranpräparationen homozygoter Embryonen unter Verwendung eines Antikörpers gegen das zytoplasmatische Ende von Sema5A bestätigt. Dieses Ergebnis bestätigte, dass die Deletion des vierten und fünften Exons des Sema5a-Gens ein Nullallel hervorbringt. Nach Verpaarungen heterozygoter Mutanten konnten keine Neugeborenen identifiziert werden, die homozygot für das mutierte Allel waren. Homozygte Mutanten starben zwischen E11,5 und E12,5 der Embryonalentwicklung, der Verlust von Sema5A ist also embryonal letal. Die Morphologie der homozygoten Tiere zeigte keinen offensichtlichen Unterschied zu den heterozygoten Embryonen oder zu Wildtyp-Geschwistern auf. Frühe embryonale Musterbildungsprozesse in Sema5a-Nullmutanten sind also nicht gestört. Ein Tod bei dieser Entwicklungsstufe deutet auf einen Defekt in der Entwicklung des Blutgefäßsystems hin, da die Embryonalstadien zwischen E9 und E13 besonders wichtig für die Ausbildung dieser Gefäße sind und viele Mutationen, die Herz und Blutgefäßen beeinträchtigen, den Tod der Embryonen in diesem Stadium bewirken. Das embryonale Blutgefäßsystem in E10,5 und E11,5 Embryonen wurde durch immunhistochemische Färbungen ganzer Embryonen unter Verwendung eines spezifischen gegen das Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule (PECAM) gerichteten Antikörpers dargestellt, welches in vaskulären Endothelzellen exprimiert ist. Die allgemeine Architektur des Gefäßsystems war in homo- und heterozygoten Mutanten ähnlich und wies weder an E10,5 noch an E11,5 besondere Abweichungen auf. Es wurden bei der Lage und der Anzahl intersomitischer Gefäße, der Entwicklung der dorsalen Aorta oder der Vaskularisierung der Extremitätenanlagen keine Abweichungen festgestellt. Morphologische Defekte konnten jedoch bei E10,5 in den Verästelungen der Blutgefäße detektiert werden, die von den Hauptvenen der Cranialregion abzweigen. Die Verzweigungen waren geringer ausgeprägt als in heterozygoten oder Wildtyp-Vergleichstieren. Insbesondere zeigte sich eine Verringerung der Anzahl sekundärer und tertiärer Verzweigungen. In dem sich entwickelnden Embryo führt die wiederholte Verzweigung von Ästen der Hauptvenen zu einem hierarchisch gegliederten Netzwerk großer Gefäße in der Region des medialen Kopfes. Während die Ausbildung dieses Netzwerkes in den Sema5a-/--Tieren beeinträchtigt ist, erscheint die Organisation der kleinen Gefäße in den mehr dorsal und peripher gelegenen Regionen des Kopfes normal. In heterozygoten und homozygoten Mutanten bilden die kleineren Gefäße ein dicht verzweigtes Netzwerk. Die Verminderung der Komplexität der größeren Gefäße konnte in allen untersuchten Nullmutanten beobachtet werden. Es variierte jedoch die Penetranz des Phänotyps. In allen Fällen war die Anzahl primärer Verzweigungen unverändert, während die Anzahl der sekundären und der tertiären Verzweigungen zu unterschiedlichen Graden reduziert war. Im Gegensatz dazu zeigte sich im Verzweigungsmuster von heterozygoten Mutanten und beim Wildtyp nur eine geringe Variabilität zwischen individuellen Embryonen. Dies belegt, dass die Verminderung des Verzweigungsgrades größerer Gefäße nicht innerhalb der normalen Variabilität liegt, sondern durch die Inaktivierung des Sema5a-Gens verursacht wird. Dieser Phänotyp ist in späteren Stadien sogar deutlicher ausgeprägt. In E11,5 Embryonen waren die Stämme der großen Blutgefäße in den Nullmutanten weniger komplex und in einigen Fällen trat sogar eine Reduzierung der Anzahl primärer Verzweigungen auf. Diese spätere Verminderung der Anzahl bereits ausgebildeter primärer Verzweigungen legt nahe, dass der Phänotyp durch eine Rückbildung von Verzweigungen aufgrund möglicher Defizite in deren Reifung und/oder Stabilisierung erfolgt. Die interessanteste Besonderheit der vaskulären Defekte in den Nullmutanten liegt in ihrer regionalen Spezifität. Bis hier ist das Netzwerk großer Gefäße, welches der anterioren Hauptvene entspringt, das einzige Gefäßsystem, in dem Abweichungen entdeckt wurden. Dieses Netzwerk wird durch die strukturelle Umbildung des primären kapillaren Plexuses gebildet. Zwischen E9,5 und E12 sprießen Zweige rostral aus der Hauptvene, um ein hierarchisch organisiertes Netzwerk von Gefäßen zu bilden. Die Umbildung des primären kapillaren Plexus in den mehr rostral und ventral gelegenen Kopfregionen führt zu der Bildung eines hochverzweigten vaskulären Netzwerkes, welches jedoch bei E10,5 noch nicht hierarchisch organisiert erscheint. Die Signale, die für diesen unterschiedlichen Ablauf der Musterbildung während der Entwicklung des Gefäßsystems des Kopfes verantwortlich sind, sind noch unbekannt. Die besonderen Defekte in der stereotypischen Organisation der cranialen Gefäße in Sema5a-Mutanten legt nahe, dass Sema5A eines dieser Signale sein könnte. Es könnte Teil eines Rezeptor/Ligandenkomplexes sein, welcher positionelle Signale für das Verzweigen und das Wachstum großer Gefäße in rostraler Richtung liefert. Sema5A könnte die Bildung von Verzweigungen durch die Regulierung der Wanderung endothelialer Zellen, ihrer Proliferation oder ihrer Interaktion mit unterstützenden Zellen oder der extrazellulären Matrix kontrollieren. Sema5A könnte Teil eines neuen Signalweges sein oder als Teil eines der bekannten Signalwegs wirken, welcher die Entwicklung des Gefäßsystems reguliert. Einer der Signalwege, die essentiell für die Gefäßbildung sind, wird durch VEGF und Angiopoietin (Ang-1) reguliert. Sowohl in VEGF-, als auch in Ang-1-Mutanten ist die Gefäßumbildung im Kopf beeinträchtigt. Insbesondere erscheint das Netzwerk kleiner Gefäße in den Ang-1 Nullmutanten als nur nur teilweise restrukturiert und die großen Gefäße als weniger komplex. Das Verzweigungsmuster der großen Gefäße in den Ang-1- Nullmutanten ähnelt auffallend dem der Sema5a-Nullmutanten. Eine zweite Ähnlichkeit in den Phänotypen von Ang-1- und Sema5a-Mutanten zeigt sich in der Reduzierung der primären Verzweigungen, welche in den Sema5a-Nullmutanten bei E11,5 beobachtet wird. Hier könnte die Verminderung aus einer Rückbildung von Gefäßen resultieren, wie sie auch typischerweise in Mutanten für Ang-1 oder dessen Rezeptor auftritt. Diese Beobachtung legt nahe, dass Sema5A ein neuer Teilnehmer innerhalb des Ang-1-Signalweges ist, welcher die Auswirkung von Ang-1 auf die endothelialen Zellen der großen Gefäße entweder vermittelt oder moduliert und dadurch das spezifische Muster der Blutgefäße des Kopfes beeinflußt. Mit dieser Doktorarbeit wird zum ersten Mal eine funktionelle Untersuchung des Klasse 5 Semaphorins Sema5A vorgestellt. Die phänotypische Untersuchung von Mäusen, die Nullallele für Sema5a-Gens tragen ergab, dass dieses membrangebundene Protein essentiell für die embryonale Entwicklung ist. Es ist an der Musterbildung des Gefäßsystems beteiligt. Seine Aufgabe besteht möglicherweise darin, die Bereitstellung positioneller Signale für die Ausbildung von Gefäßverzweigungen zu gewährleisten. Einige grundlegende Fragen werden durch diesen Phänotyp aufgeworfen. Sowohl die Ursache für die embryonale Sterblichkeit als auch die zellulären Prozesse, welche in den Sema5a-Nullmutanten beeinträchtigt sind, müssen noch beschrieben werden. Unbekannt ist ebenfalls, ob zusätzlich zu der hier beschriebenen Rolle von Sema5A in der Gefäßbildung dieses an der Entwicklung des Nervensystems beteiligt ist. Die ersten Daten über die physiologische Rolle von Sema5A, welche mit dieser Arbeit vorgelegt werden, öffnen den Weg für weitergehende Untersuchungen über die Funktion des Proteins während der Embrionalentwicklung. Das hier erstmals vorgestellte Modellsystem ermöglicht es, Sema5A regulierte zelluläre Mechanismen zu untersuchen. Zusätzlich stellt es ein Werkzeug zur Verfügung, um die funktionelle Beziehung zwischen der Entwicklung des kardiovaskulären Systems und des Nervensystems zu untersuchen. Damit können die Aufgaben der Semaphorin-Proteinfamilie, die an diesen beiden wichtigen Prozessen beteiligt sind, näher charakterisiert werden.
Genetic analysis of salt adaptation in Methanosarcina mazei Gö1 : the role of abl, ota and otb genes
(2008)
1. M. mazei ist ein halotolerantes methanogenes Archäon und akkumuliert kompatible Solute als längerfristige Anpassung an erhöhte Osmolarität in der Umgebung. Bei intermediären Salzkonzentrationen (~ 400 mM NaCl) wird vorzugsweise α-Glutamat gebildet und bei höheren Salzkonzentrationen (~ 800 mM NaCl) wird Nε-Acetyl-ß-Lysin zusätzlich zu Alpha-Glutamat synthetisiert. 2. Eine Analyse der intrazellulären Solutezusammensetzung mittels NMR ergab, dass M. mazei Glycin-Betain als Osmolyt akkumulieren kann. Für die Aufnahme von Glycin-Betain konnten zwei putative Glycin-Betain-Transporter in M. mazei identifiziert werden, Ota und Otb. Ota steht für „osmoprotectant transporter A“ und Otb für „osmoprotectant transporter B“. Das Genom von M. mazei wurde, nachdem es vollstänidg sequenziert war, nach Genen durchsucht, die eine Rolle bei der Aufnhame von Glycin-Betain oder anderen kompabtiblen Solute spielen könnten. Dafür wurde die Sequenz eines Substratbindeproteins eines bekannten bakteriellen Glycin-Betain-Transporters, opuAC aus B. subtillis als Referenzsequenz verwendet. Hierbei konnte ein Homolog, otaC, in M. mazei identifiziert werden. otaC ist Teil eines Genclusters, welches für einen ABC-Transporter kodiert. otb wurde bei einer genomweiten Expressionsanalyse zur Salzadaptation von M. mazei identifiziert. Es wurden Gene eines putativen ABC-Transporters identifiziert, die unter Hochsalzbedingungen leicht induziert waren. Es stellte sich heraus, dass es sich hierbei um einen zweiten putativen Glycin-Betain-Transporter handelte. Otb gehört auch zur Familie der ABC-Transporter. Vergleichsanalysen zeigten, dass die beiden Transporter keine große Ähnlichkeit zueinander aufweisen. Die Funktion und Rolle der beiden ABC-Transporter, vor allem von Otb, war zu Beginn dieser Arbeit unklar. 3. Bei Analysen des intrazellulären Solutepools im Wildtyp von M. mazei stellte sich heraus, dass in Anwesenheit von Glycin-Betain die Konzentration von Glutamat und NE- Acetyl-ß-Lysin verringert war. Bei 400 mM NaCl reduzierte Glycin-Betain die Glutamat- Konzentration um 16% und bei 800 mM NaCl um 29%. Besonders deutlich zeigte sich der Einfluß von Glycin-Betain bei der Akkumulation von NE-Acetyl-ß-Lysin. Bei 400 mM NaCl reduzierte Glycin-Betain die Konzentration an NE-Acetyl-ß-Lysin um 60% und bei 800 mM NaCl um 50%. Der Einfluß von Glycin-Betain konnte auf verschiedenen Ebenen in M. mazei beobachten werden. Es konnte gezeigt werden, dass die relative Transkriptimenge von ota unter Hochsalzbedingungen zunimmt. Glycin-Betain reduzierte die Transkription von ota bei verschiedenen Salzkonzentrationen. Die relative Transkriptmenge an mRNA von ota wurde mittels quantitativer real-time PCR (qRT-PCR) quantifiziert und war bis zu 52% reduziert in Zellen, die in Gegenwart von Glycin-Betain gewachsen waren. Die Transkriptmenge von otb war unter den gleichen Bedingungen nicht beeinflusst und zeigte generell keine Zunahme mit der Salinität des Mediums. Des Weiteren konnte ein Effekt von Glycin-Betain auf Ebene der Transportaktivität von Ota gezeigt werden. Hier zeigte sich, dass Zellen, die bei 400 mM NaCl in Gegenwart von Glycin-Betain gezogen waren, eine geringere Transportaktivität aufweisen, als Zellen, die bei 400 mM NaCl ohne Glycin-Betain gewachsen waren. Die Transportaktivität war um 90% geringer. Es muss jedoch berücksichtigt werden, dass es sich bei den Zellen, die ohne Glycin-Betain gewachsen waren, um eine Nettoaufnahme von Glycin-Betain handelte. Im Gegensatz dazu, ist davon auszugehen, dass Zellen, die in Gegenwart von Glycin-Betain gewachsen waren, eine Austaschreaktion zwischen bereits vorhandenem intrazellulärem und extrazellulär angebotenem Glycin-Betain vornehmen. [Die dem letzten Punkt zugrundeliegenden Daten wurden von Silke Schmidt im Rahmen einer Diplomarbeit erhoben, die von mir mitbetreut wurde. Aus Gründen der vollständigen Darstellung des Projektverlaufes werden diese Daten mitaufgeführt.] 4. Zur weiteren Klärung der Rolle und Funktion der beiden putativen Glycin-Betain- Transporter Ota und Otb war es Ziel, Mutantenstudien durchzuführen. Eine Vorraussetzung für die Generierung von Mutanten ist, dass der Organismus auf Agarplatten wächst und Einzelkolonien von einer einzelnen Zelle ausgehend bildet. Dies ist ein wichtiger Punkt bei Methanosarcina spp., die Zellpakete, sogenannte Sarcinen bilden. Deshalb wurde zunächst nach den optimalsten Plattierungsbedingungen gesucht, unter denen M. mazei keine Sarcinen bildet und die Plattierungseffizienz am höchsten war. Die Plattierungseffizienz betrug im Durchschnitt 54%. Für das Einbringen von DNA in die Zellen wurde eine Liposomen-vermittelte Transformation getestet. Ein ähnliches Vorgehen war bereits für Methanosarcina acetivorans beschrieben, konnte bislang aber noch nicht erfolgreich für M. mazei Gö1 und andere Stämme von M. mazei angwendet werden. Erste Schritte zur Anpassung des Transformations-Protokolles beinhalteten das Testen von DOTAP verschiedener Hersteller, sowie die Konzentration an eingesetzter DNA. Das jeweilige Zielgen/Zieloperon, welches deletiert werden sollte, wurde durch eine pac-Kassette ersetzt. Diese kodiert für eine Puromycin-Transacetylase und verleiht dem Organismus Puromycin- Resistenz. Die pac-Kassette wurde von umgebenden Bereichen des Ziellocus flankiert und integrierte mit Hilfe dieser flankierenden Bereiche über doppelt-homologe Rekombination in das Genom. 5. Mit dem oben beschriebenen Verfahren wurden ota::pac- und otb::pac-Mutanten erzeugt und über Southern-Blot Analyse verifiziert. Eine erste Charakterisierung der Mutanten mittels qRT-PCR zeigte, dass auf mRNA-Ebene keine Transkripte von ota in M. mazei ota::pac oder otb in M. mazei otb::pac nachweisbar waren. Zusätzlich konnte auf Proteinebene das Substratbindeprotein OtaC in M. mazei ota::pac und OtbC in M. mazei otb::pac nicht über einen Antikörper gegen das jeweilige Substratbindeprotein nachgewiesen, was die erfolgreiche Deletion bestätigte. Erste phänotypische Charakterisierungen zeigten, dass das Wachstum von M. mazei ota::pac und M. mazei otb::pac unter Hochsalzbedingungen nicht beeinträchtigt und vergleichbar mit dem des Wildtyps war. Auch bei kälteren Wachstumstemperaturen von 22°C wuchsen die Mutanten ohne Phänotyp. 6. Radioaktive Transportstudien mit M. mazei otb::pac zeigten, dass diese Mutante, die noch ein funktionelles Ota besitzt, [14C]Glycin-Betain aufnehmen kann. Es stellte sich heraus, dass diese Mutante eine höhere Transportrate für Glycin-Betain aufwies, als der Wildtyp. Die Aufnahmerate war um einen Faktor 2 höher als beim Wildtyp. Zusätzlich konnten qRT-PCR Analysen zeigen, dass die relative Transkriptmenge an ota in der otb::pac-Mutante um einen Faktor 2 höher war, als im Wildtyp. Umgekehrt konnte dieser Effekt nicht beobachtet werden, d.h. eine erhöhte Transkriptmenge an otb in M. mazei ota::pac. Auf Proteinebene konnte beobachtet werden, dass die intrazelluläre Konzentration an OtaC in der Mutatne leicht höher war als im Wildtyp. Jedoch stellte sich heraus, dass die intrazelluläre Glycin-Betain-Konzentration bei 400 mM NaCl in der Mutante nicht erhöht war verglichen mit Wildtyp, sondern die Konzentrationen gleich waren. Bei höheren Salzkonzentrationen (800 mM NaCl) zeigte sich jedoch ein anderes Bild: die intrazelluläre Glycin-Betain-Konzentration war in der Mutante um 60% erhöht. Dies könnte auf die erhöhte Transportaktivität von M. mazei otb::pac zurückzuführen sein. Die Konzentration anderer kompatibler Solute wie Glutamat und NE-Acetyl-ß-Lysin waren in diesen Zellen bis zu 48% reduziert. In vorherigen Studien konnte gezeigt werden, dass heterolog überproduziertes Ota von M. mazei in E. coli MKH13, eine E. coli-Mutante, die keine Glycin-Betain-Transporter mehr besitzt, die Aufnahme von Glycin-Betain wieder herstellen konnte [die Daten von ota in E. coli MKH13 wurden in der bereits oben erwähnten Diplomarbeit von Silke Schmidt erhoben]. Zur Klärung der Funktion von Otb wurde der gleiche Versuch mit otb in E. coli MKH13 durchgeführt. Jedoch konnte eine heterologe Produktion von Otb aus M. mazei die Aufnahme von Glycin-Betain in E. coli MKH13 nicht wieder herstellen. Hierbei wurde über Western-Blot Analyse sichergestellt, dass Otb tatsächlich in der Membran vorhanden war. Auch Transportstudien mit der Mutante M. mazei ota::pac zeigten, dass diese Mutante kein [14C]Glycin-Betain mehr aufnehmen konnte. Es konnte auch keine Akkumulation von Glycin-Betain mittels NMR in dieser Mutante gemessen werden. Des Weiteren zeigte sich, dass die intrazellulären Konzentrationen an Glutamat und Nε-Acetyl-ß-Lysin bei 400 mM und 800 mM NaCl in der Mutante unbeeinflusst von der Glycin-Betain-Konzentration im Medium waren. Weitere Transportstudien mit M. mazei ota::pac zur Aufnahme von [14C]Cholin zeigten, dass dieses Molekül weder vom Wildtyp, noch von der Mutante aufgenommen wurde. Dieses Ergebnis wurde durch Messung des Solutepools mittels NMR bestätigt. Somit kann ausgeschlossen werden, dass Otb unter den gemessenen Bedingungen weder ein Glycin- Betain-Transporter noch ein Cholin-Transporter in M. mazei ist. Diese Beobachtungen belegen eindeutig, dass Ota der einzige funktionelle Glycin-Betain-Transporter in M. mazei ist, während die Rolle von Otb bislang noch ungeklärt ist. 7. Nε-Acetyl-ß-Lysin, das dominante kompatible Solut in M. mazei bei 800 mM NaCl, wird durch die Enzyme AblA, einer Lysin-2,3-Aminomutase und AblB, einer ß-Lysin- Acetyltransferase synthetisiert. In dieser Arbeit wurde eine Δabl::pac-Mutante generiert, um die Fragen zu klären, ob die beiden Enzyme vom postulierten abl-Operon kodiert werden und wenn ja, welchen Phänotyp eine Nε-Acetyl-ß-Lysin-freier-Mutante bei Salzstress zeigt. NMR-Analysen zeigten, dass in der abl::pac-Mutante kein Nε-Acetyl-ß-Lysin mehr nachweisbar war. Dies belegt, dass die Gene ablA und ablB und deren Genprodukte für die Synthese von NE-Acetyl-ß-Lysin in M. mazei essentiell sind. Unter Hochsalzbedingungen ist das Wachstum von M. mazei abl::pac im Vergleich zum Wildtyp deutlich verlangsamt. Dieses Ergebnis war unerwartet, da eine abl::pac-Mutante von Methanococcus maripaludis unter Hochsalzbedingungen nicht mehr wachsen konnte. Unter Niedrigsalz und bei intermediären Salzkonzentration war das Wachstum von M. mazei abl::pac nicht eingeschränkt und verhielt sich wie der Wildtyp. In Gegenwart von Glycin-Betain akkumulierte die abl::pac-Mutante von M. mazei unter Hochsalzbedingungen 2,4 mal mehr Glycin-Betain als der Wildtyp, um das Defizit im Solutepool auszugleichen und Wachstum bei Hochsalz zu ermöglichen. Dadurch war sie in der Lage, wieder wie der Wildtyp zu wachsen. 8. Der Verlust von NE-Acetyl-ß-Lysin wurde unter Hochsalzbedingungen durch erhöhte Konzentrationen an Glutamat und einem neuen kompatiblen Solut kompensiert. NMRAnalysen zeigten, dass es sich hierbei um Alanin handelte. Bis jetzt wurde die Verwendung von Alanin als kompatibles Solut noch nie beschrieben. Um sicherzustellen, dass Alanin als kompatibles Solut in M. mazei abl::pac dient, wurde die Konzentration bei verschiedenen Salzkonzentrationen gemessen. Die Konzentration an Alanin nahm mit steigender Salzkonzentration zu. Bei 800 mM NaCl war die Konzentration 12 fach erhöht verglichen mit der Konzentration bei 400 mM NaCl. Außerdem redzierte Glycin-Betain die Alanin- Konzentration bei 800 mM NaCl um 58%. Transportexperimente zeigten, dass M. mazei kein Alanin aus dem Medium aufnehmen kann. 9. Erste Analysen möglicher Synthesewege für Alanin zeigten, dass die Alanin- Dehydrogenase nicht auf Transkriptebene unter Hochsalzbedingungen induziert war und somit keine Rolle in der Synthese von Alanin als kompatibles Solut spielen dürfte. Es könnten jedoch Aminotransferasen eine Rolle bei der Biosynthese von Alanin spielen. Des Weiteren sind die Enzyme, die für die Synthese von Glutamat als kompatibles Solut verantwortlich sind, unbekannt. Dies gilt für alle bis jetzt untersuchten Organismen, die Glutamat als kompatibles Solut nutzen. In dieser Arbeit wurde versucht, mit Hilfe der abl::pac-Mutante, die erhöhte Glutamat-Mengen zum Osmoschutz produziert, der Frage nachzugehen, welche Gene/Enzyme eine Rolle spielen könnten bei der Synthese von Glutamat als kompatibles Solut. Dazu wurden unter Hochsalzbedingungen die Transkriptmengen verschiedener Genen, die an der Glutamat-Synthese beteiligt sein könnten, in der Mutante und im Wildtyp untersucht. Hierbei zeigte sich, dass mehrere Gene verschiedener Enzyme unter Hochsalzbedingungen in der Mutante leicht induziert waren. Eines dieser Enzyme ist die Glutaminsynthetase. Dieses Enzym ist für die Umsetzung von Glutamat zu Glutamin unter Verbrauch von ATP verantwortlich. M. mazei besitzt zwei Gene, die für eine putative Gluaminsynthetase kodieren. In M. mazei abl::pac ist unter Hochsalzbedingungen das Gen glnA2 im Vergleich zum Wildtyp (4,03 ± 1,14) leicht induziert (7,63 ± 2,2). Des weiteren konnte in der Mutante eine leichte Induktion von gltB1, gltB2 und gltB3 unter Hochsalz beobachtet werden. Diese Gene kodieren für die einzelnen Domänen einer Glutamatsynthase. Diese ersten Analysen geben einen Hinweis darauf, dass die Synthese von Glutamat als kompatibles Solut über eine gekoppelte Reaktion der Glutaminsynthetase und der Glutamatsynthase verlaufen könnte.
Zur erfolgreichen Behandlung von Tumorerkrankungen sind effiziente Therapien notwendig. Oftmals kommt es nach einer klassischen Tumortherapie zum Auftreten von Rezidiven, die aus residuellen Tumorzellen hervorgehen. Grund hierfür können eine bereits erfolgte Metastasierung oder Resistenzmechanismen der Tumorzellen sein. Auf Grund ihrer Fähigkeit Gewebe aktiv zu infiltrieren bietet der Einsatz zytotoxischer Lymphozyten im Rahmen einer zellulären Immuntherapie den Vorteil, auch bereits metastasierte Tumorzellen zu erreichen. Dadurch können auch Tumorzellen eliminiert werden, die Resistenzmechanismen meist im oberen Teil apoptotischer Signalkaskaden aufweisen. Eine spezifische Ausrichtung zytotoxischer Lymphozyten auf Tumorantigene ist grundsätzlich über chimäre Antigenrezeptoren möglich. Dabei bietet die Generierung von Tumor-spezifischen zytotoxischen Effektorzelllinien den Vorteil, Zellklone mit definierter Aktivität und Spezifität bereitstellen zu können. Im Hinblick auf einen klinischen Einsatz scheint hierfür die Natürliche Killerzelllinie NK-92 besonders geeignet. Die Ergebnisse einer klinischen Studie mit parentalen NK-92 Zellen zeigten eine gute Verträglichkeit ohne Nebenwirkungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden NK-92 Zellen genetisch so modifiziert, dass sie chimäre Antigenrezeptoren mit Spezifität für die Tumorantigene CD20, EpCAM, GD2 und CD138 exprimieren. In der Tumortherapie stellen das mit Tumoren der B-Zell-Reihe assoziierte CD20-Molekül und das auf den meisten Tumorzellen epithelialen Ursprungs exprimierte EpCAM-Protein wichtige Zielantigene monoklonaler Antikörper dar. Studien zeigten, dass auch die auf Tumorzellen des Neuroblastoms bzw. Multiplen Myeloms exprimierten Moleküle GD2 bzw. CD138 geeignete Angriffspunkte für immuntherapeutische Ansätze sein könnten. Die chimären Antigenrezeptoren sind aus einem Antigenspezifischen scFv-Antikörperfragment aufgebaut, das über ein Fragment der CD8alpha-Kette mit der CD3zeta-Kette als Signaltransduktionsdomäne verbunden ist. Nach retroviraler Transduktion zeigte sich eine hohe und homogene Oberflächenexpression dieser Rezeptoren auf modifizierten NK-92 Zellen. Auf das Oberflächenprotein CD20 ausgerichtete NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen wiesen gegen CD20- positive Tumorzelllinien und primäre Tumorzellen eine hohe zytotoxische Aktivität auf. Im Vergleich waren parentale NK-92 Zellen gegen diese Tumorzellen nicht oder deutlich weniger aktiv. Dabei war die zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen mit dem monoklonalen anti-CD20 Antikörper Rituximab kompetitierbar. Mit Hilfe der gegen parentale und modifizierte NK-92 Zellen resistenten Zelllinie NIH3T3 wurde gezeigt, dass allein über die stabile Expression des CD20-Proteins in NIH3T3 Zellen die Resistenz gegen modifizierte NK-92 Zellen überwunden werden kann. NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen waren in der Lage, CD20-positive NIH3T3-CD20 Zellen auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen effizient abzutöten. In Mischkulturen aus NIH3T3 und NIH3T3-CD20 Zellen war zudem eine selektive zytotoxische Aktivität der NK-92-scFv(Leu-16)-Zeta Zellen ausschließlich gegen Antigen-positive Zellen nachweisbar. Über die Analyse von Zellkonjugaten zwischen zytotoxischen Effektorzellen und ihren Zielzellen, deren Bildung grundsätzliche Voraussetzung für eine Eliminierung ist, wurden Hinweise erhalten, dass der chimäre Antigenrezeptor hierzu keinen Beitrag zu leisten scheint, sondern vor allem die anschließende Aktivierung der modifizierten NK-92 Zellen bewirkt. Mit EpCAM-spezifischen NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen war auch bei niedrigen E/T-Verhältnissen eine effiziente Abtötung von unterschiedlichen Tumorzelllinien epithelialen Ursprungs möglich. Eine erfolgreiche Blockierung dieser zytotoxischen Aktivität mit dem monoklonalen Antikörper MOC31 bestätigte, dass diese spezifisch über den chimären Antigenrezeptor vermittelt wurde. Die untersuchten epithelialen Zelllinien erwiesen sich dagegen als vollkommen resistent gegen parentale bzw. mit demleeren Expressionsvektor modifizierte NK-92-Mock Zellen. Weitere Ergebnisse zeigten, dass die zytotoxische Aktivität von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen tatsächlich über Granzym B vermittelt wird. Eine erhöhte FasL-Oberflächenexpression infolge der Cokultur mit Antigen-positiven Zielzellen war dagegen nicht nachweisbar. Anhand dieser Ergebnisse kann eine signifikante Beteiligung von FasL an der zytotoxischen Aktivität der modifizierten NK-92 Zellen ausgeschlossen werden. Weiterhin wurden therapeutische Effekte von NK-92-scFv(MOC31)-Zeta Zellen in einem Xenograftmodell in NOD-scid/scid Mäusen mit einer humanen EpCAM-positiven Tumorzelllinie untersucht. Hier wurde im Vergleich zur Kontrollgruppe durch Behandlung mit EpCAM-spezifischen NK-92 Zellen, unerwarteterweise aber auch mit NK-92-Mock Zellen, ein signifikant längeres Überleben der Tiere beobachtet. Nach der Ableitung CD138-spezifischer NK-92-scFv(B-B4)-Zeta Zellen wurde zwar eine hohe zytotoxische Aktivität gegen CD138-positive Zelllinien erhalten. Es war jedoch keine im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen weiter verstärkte Zytotoxizität nachweisbar. Als Ursache hierfür ist eine mangelnde Funktionalität des scFv-Antikörperfragments im Kontext des chimären Antigenrezeptors denkbar. Da die Bindungseigenschaften von scFv-Fragmenten entscheidend durch die Anordnung ihrer schweren und leichten Antikörperketten zueinander beeinflusst werden können, wurden NK-92 Zellen etabliert, die ein scFv-Fragment mit umgekehrter Orientierung der Antikörperketten in ihrem chimären Antigenrezeptor tragen. Diese werden derzeit im Rahmen einer externen Zusammenarbeit auf ihre Funktionalität hin überprüft. Zur Konstruktion gegen das Disialogangliosid GD2 gerichteter chimärer Antigenrezeptoren wurden parallel zwei scFv-Fragmente des Antikörpers ch14.18 eingesetzt, die sich in der Orientierung der schweren und leichten Antikörperketten zueinander unterscheiden. Mit den Antigenrezeptorkonstrukten modifizierte NK-92 Zellen zeigten eine im Vergleich zu parentalen NK-92 und NK-92-Mock Zellen stark erhöhte Zytotoxizität gegen GD2 exprimierende humane Tumorzelllinien. Dabei wurde weder bei der Expressionsdichte der chimären Antigenrezeptoren noch in der zytotoxischen Aktivität modifizierter NK-92 Zellen mit unterschiedlicher Anordnung der variablen Antikörperdomänen im scFv Antikörperfragment ein signifikanter Unterschied beobachtet. Mit der extrazellulären Domäne von CTLA-4 als Modellprotein wurde der mögliche Einsatz einer zu scFv-Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomäne geprüft. CTLA-4 wird normalerweise auf T-Zellen exprimiert und bindet an CD80 bzw. CD86 auf APCs. CD80- und/oder CD86-positive Zielzellen wurden von NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen im Vergleich zu parentalen NK-92 Zellen spezifisch und mit hoher Effizienz lysiert. In Zytotoxizitätsassays wurde mit Hilfe einer sowohl gegen parentale als auch modifizierte NK-92 Zellen resistenten Tumorzelllinie gezeigt, dass allein die stabile Expression des CD86 Proteins in dieser Zelllinie ausreicht, um die Resistenz gegen NK-92-sCTLA-4-Zeta Zellen aufzuheben. Daraus kann geschlossen werden, dass grundsätzlich auch der Einsatz von zu scFv- Antikörperfragmenten alternativen Antigenbindungsdomänen eine spezifische Ausrichtung und effiziente Aktivierung von NK-92 Zellen gewährleistet. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die genetische Modifikation der Natürlichen Killerzelllinie NK-92 zur Ausrichtung auf Tumor-spezifische Zielstrukturen einen grundsätzlich geeigneten Ansatz zur Behandlung maligner Erkrankungen darstellt. Eine Weiterentwicklung Antigen-spezifischer NK-92 Derivate als mögliche Zelltherpeutika erscheint daher sinnvoll und vielversprechend.