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Die Knochenansammlung im grauen vulkanischen Tuff der Südserengeti gibt als ökologisch unmögliches
Gemisch ein gutes Abbild des Gesamtbestandes und des Lebensraumes der altquartärcn ost- und innerafrikanischen Fauna. Diese lebte formenreich in Urwald, Savanne und offener Steppe. Das Fehlen wasserlebender Tiere ist hier auf örtliche Umstände zurückzuführen: die vulkanischen Aschen gingen auf Steppenboden nieder, Die benachbarten, ungefähr gleichalten Knochenlager enthalten solche Tiere. Neu ist an der Serengetifauna der bereits beträchtliche Anteil von Kleinsäugern (Nager; Insektivoren fehlen noch). Diese wird weitere Forschung vermehren. Die klimatische Entsprechung der Fauna wird in tropischen, feuchtwarmen Bedingungen erblickt. Obwohl viele tertiäre Formen enthaltend, wird die Fauna nicht als jungtertiär angesehen, sondern wegen des Auftretens moderner· Formen als eine Tiergesellschaft, welche das Quartär eröffnet. Als Leitfossil für dessen Beginn wird der Gattung Archidiskodon, aus welcher die echten Elefanten, darunter auch der afrikanische (Loxodonta africana ) entstanden sind, vor den Equiden der Vorzug gegeben.
Ostafrika, das ja als Tierparadies schlechthin gilt, lebte bis vor kurzem noch im Quartär. Das Schrifttum über seine Tierwelt scheint zwar fast unermeßlich groß, aufs Ganze gesehen ist das Wissen weder tief noch auch nur oberflächlich vollständig. Die Hauptleistung des "weißen Mannes" bestand in der Störung und Vernichtung der Fauna. Aber die Natur ist groß; sie hält noch einen Schatz im Inneren ihrer Gebirge bereit, damit der Mensch seine Stellung zu ihr und den Sinn seines Lebens ergründe, einen von vielen: dle quartäre Lebewelt selbst. Möge die hohe Aufgabe, ihn zu heben, uns Deutschen vergönnt sein! Eine Probe hat Dr. KOHL-LARSEN gesichert.
Die vorliegende Arbeit hat die Charakterisierung und Untersuchung des Stabilitätsverhaltens von
Parvulustat (PL), einem Homologen des α-Amylase-Inhibitors Tendamistat, zum Inhalt. Zur
weitreichenden Charakterisierung wurden verschiedene Proteinregionen des Parvulustats der CTerminus,
das hydrophobe Cluster, die Disulfidbrücken sowie die Proline auf ihren jeweiligen
Einfluss auf die Struktur und die thermodynamische Stabilität untersucht. In der vorliegenden
Zusammenfassung werden die Ergebnisse dieser Studien komprimiert präsentiert:
· Charakterisierung des Parvulustat-Wildtyps
Es galt vorweg herauszufinden, wie sich der Inhibitor unter nativen und denaturierten
Bedingungen verhält, um Rückschlüsse auf seine Merkmale und Strukturen zu ziehen. Die
erzielten Ausbeuten und die hohe Reinheit des isolierten Parvulustats erlaubten eine umfassende
Charakterisierung, einschließlich zahlreicher Kristallisationsexperimente, die vermuten lassen,
dass eine Kristallisation möglich sein sollte. Aufgrund der Tatsache, dass die Struktur des
Parvulustats bis 2009 unbekannt war, wurde die sekundäre Struktur mittels Circulardichroismus
und Fluoreszenzspektroskopie untersucht. Die Analyse des fernen UV-CD-Spektrums bei pH 7,0
und 25°C offenbarte eine „all-b-sheet“ Protein-Struktur. Mittels Fluoreszenzspektroskopie wurde
deutlich, dass die aromatischen Aminosäuren exponiert vorliegen. Um zunächst einen Einblick in
die Strukturveränderungen und die thermodynamische Stabilität zu erhalten, wurde der
temperaturinduzierte Entfaltungsübergang mittels CD-Spektroskopie verfolgt. Das Angleichen der
bei 230 nm gemessenen CD-Daten nach der linearen Extrapolations-Methode für eine
Zweizustands-Faltung ergab einen Tm-Wert von 82°C und D H(Tm) von 201,6 kJ/mol. Die
beträchtlichen Werte veranschaulichen die hohe Stabilität des Parvulustats. Eine aus den CDMessungen
bei 50° ergebende Übergangskurve zeigte, dass sich die Sekundärstruktur mit einem
Übergangsmittelpunkt bei 5,62 M GdnHCl kooperativ und reversibel entfaltet. Das Protein
entfaltet sogar infolge einer pH-Wert-Senkung bis auf pH 1 nicht vollständig, sondern es wechselt
direkt in einen Säure-Zustand („acid-state“). Dieser Zustand zeigt spektroskopisch die gleichen
Eigenschaften wie das native Protein, wobei die volle Inhibierungs-Aktivität nicht erhalten bleibt.
In sehr basischem Milieu bei pH 14 nimmt Parvulustat einen alkalisch denaturierten
Zwischenzustand IB an, der sich erheblich von dem GdnHCl-denaturierten, dem säurebehandelten
oder vom „molten globule“ Zustand unterscheidet. Allgemein behielt Parvulustat
über ein breites pH-Wert Spektrum (1,0-10,0) die native Struktur, bzw. eine „native like“ Struktur,
was erneut auf die enorme Stabilität des Proteins hindeutet. Die von Rehm et al. (Rehm et al.,
Theoretischer Teil
-4-
2009) aufgeworfene Hypothese des „induced fit“ Inhibierungsmechanismus des Parvulustats
konnte durch die in dieser Arbeit durchgeführten Experimenten bekräftigt werden. Mittels
Sekundärstrukturbestimmungen des Parvulustats unter Komplexbildung mit der a-Amylase
konnte eindeutig gezeigt werden, dass strukturelle Veränderungen am Inhibitor im Komplex
vorliegen. Durch zahlreiche Tests konnte festgestellt werden, dass die WRY-Region des
Parvulustats sich der Struktur der a-Amylase anpasst. Die Komplexierung des Parvulustats
bewirkte aber eine thermodynamische Destabilisierung der Inhibitor-Struktur.
· Einfluss des C-Terminus auf die Stabilität des Parvulustats
Um die Ursachen für die hohe Stabilität des Parvulustats auch im Vergleich zu Tendamistat (Tm:
79°C) zu finden, wurde der Einfluss des hoch flexiblen C-Terminus untersucht. Die Derivate mit
um zwei (PL-2AA), vier (PL-4AA) und sieben (PL-7AA) Aminosäuren verkürztem C-Terminus
wurden isoliert und analysiert. Die Entfaltungstemperaturen der verkürzten Derivate des
Parvulustats sinken mit abnehmender Zahl der Aminosäuren. Die Ergebnisse suggerieren, dass
der C-Terminus des Parvulustats eine entscheidende Rolle in der strukturellen Vollständigkeit des
Proteins während der thermischen Entfaltung spielt und damit auch in der Faltung (Tab.: 2.1). Der
Vergleich der Inhibitoraktivitäten der verkürzten Proteine mit dem nativen Parvulustat ergibt für
die Varianten PL-2AA und PL-4AA eine dem Wildtyp ähnliche Aktivität. Die Variante PL-7AA
weist eine leicht verringerte Aktivität auf.
Tabelle 2.1: ...
Einfluss hydrophober Oberflächenclustern auf Stabilität und Faltung
des Parvulustats
Parvulustat besitzt in der Mitte des ersten b-Faltblatts, um die Position 22 liegend, einen
hydrophoben Oberflächencluster. Wie mit Hilfe von Substitutionsexperimenten in dieser Region
gezeigt werden konnte, ist die thermodynamische Stabilität des Parvulustats in hohem Maße von
der Bildung dieses kleinen aber wichtigen hydrophoben Kerns bestimmt. Demnach muss das b-
Faltblatt I und das b-Hairpin I eine entscheidende Rolle in der Faltung von Parvulustat spielen.
Position 22 ist in zweierlei Hinsicht für die Stabilität des Parvulustats wichtig: einerseits durch die
energetisch wichtigen Wasserstoffbrückenbindungen und zum zweiten steuert die Stelle zur
Formation des hydrophoben Kerns bei. Die Daten suggerieren, dass es auch eine
thermodynamische Kopplung zwischen dem hydrophoben Effekt und der Präsenz von
Wasserstoffbrückenbindungen geben könnte. Zumindest aus der Sicht der Stabilität ist es
eindeutig, dass interatomare Interaktionen wie Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waalsund
Dipol-Dipol-Wechselwirkungen notwendig sind, um eine stabile Bildung von b-Faltblättern
in Parvulustat und seinen Derivaten zu verwirklichen.
· Der Effekt der Proline auf die Stabilität des Parvulustats
Der Effekt der Substitution des Prolins durch Alanin an verschiedenen Positionen des Parvulustats
wurde ebenfalls untersucht. Im Ganzen betrachtet führt auch die Mehrfachsubstitution von Prolin
zu keiner nennenswerten strukturellen Veränderung im Parvulustat. Die durchgeführten
thermischen Entfaltungsexperimente bestätigen diese Beobachtungen. Alle Einzelmutanten (P5A,
P42A, P48A, P72A) zeigten eine höhere thermische Stabilität als der Wildtyp (Abb. 2.1).
Abbildung 2.1: Tm-Werte des Parvulustat-Wildtyps und seinen Prolin Mutanten.
Theoretischer Teil
-6-
Die fast gleich bleibenden Tm-Werte bzw. die Erhöhung der Stabilität des Parvulustats sind durch
die strukturelle Fluktuationen zu erklären, denn die rigide XAS-Pro-Bindung wurde durch die
flexible XAS-Ala-Bindung ersetzt.
· Der Einfluss der Disulfidbindung auf die Stabilität des Parvulustats
Der Einfluss der zwei Disulfidbrücken des Parvulustats wurde bezüglich Aktivität, spektraler
Eigenschaften sowie Stabilität untersucht. Hierfür wurden 25 Inhibitorvarianten mittels gezielter
Mutagenese gewonnen, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die im natürlich vorkommenden
Parvulustat Disulfidbrücken bilden, durch andere Aminosäuren ersetzt wurden. Die Ergebnisse
zeigten, dass die Faltung Parvulustats ein zwei Zustand Verhalten besitzt, das außer in
Tendamistat in keinem anderen disulfid-verknüpftem Protein gefunden wurde. Dieses Verhalten
wurde durch die Entfernung von Disulfidbrücken nicht beeinflusst. Wie durch die CD- und
fluoreszenzspektroskopischen Experimente belegt werden konnte, ist die native Struktur des
Parvulustats durch die Entfernung der C43-C70-Disulfidbindung tiefgreifend verändert worden.
Passend zu den Veränderungen der Struktur haben die Mutationen schwerwiegende
Destabilisierungseffekte auf das Protein verursacht, was auch an der Erniedrigung der Freien
Gibbs Energie der Denaturierung und der Tm-Werte zu erkennen ist. Die Untersuchung des
Einflusses der Aminosäure-Substitution in den Positionen 43 und 70 auf die thermodynamische
Stabilität des Parvulustats führt zum Ergebnis, dass die Hydrophobizität und Polarität des Restes
70 einen bedeutenden Effekt auf die Stabilität des Proteins besitzt. Die Betrachtung der
thermodynamischen Daten macht deutlich, dass der Beitrag der freien Energie zur Stabilisierung
nicht nur abhängig von der eingeführten Aminosäure ist, sondern zum Teil auch von dem
strukturellen Kontext abhängt. Die Daten zeigen, dass die Substitution des Alanins an der Stelle
70 durch Leucin oder Threonin die Struktur um 0,3 bzw. 1,7 kJ/mol stabilisieren. Zusätzliche
Beiträge zum Unterschied bezüglich des ΔG°-Werts zwischen den Varianten C43AC70L/T und
C43L/TC70A können sich auch durch die unterschiedliche lokale Umgebung, wie z.B. die
Seitenketten von benachbarten Aminosäuren um die zwei Mutationsstellen ergeben. Der Tm-Wert
des Wildtyp-Proteins beträgt 82°C. Die Vergleiche dieser Größe mit der von der stabilsten
Cystein-defizitären Doppelmutante C43AC70T (47,3°C) ergibt eine Differenz von 34,7°C. Dieses
Ergebnis untermauert, dass die Disulfidbindung 2 eine extrem wichtige strukturelle Komponente
in der ungewöhnlich hohen Stabilität des Parvulustats darstellt.
Das Ziel der Arbeit war es dennoch die Daten der Stabilitäten einzelner Disulfidmutanten zu
sammeln und zu erfassen, um dadurch allgemeine Grundregeln für eine rationale Gestaltung der
Elimination beider Disulfidbrücken im Sinne einer vorhersagbaren Auswirkung auf die
Proteinstabilität zu bekommen.
Theoretischer Teil
-7-
Der Versuch ein disulfidfreies Protein in großen Mengen aus S. lividans zu isolieren, stellte sich
aber als extrem schwierig dar. Nach der Änderung des Stamms des Wirtsorganismus
(Streptomyces lividans TK23), Erhöhung der Qualität der Protoplasten und der Expressions-
Bedingungen (19°C, 150 rpm) konnten auf dem SDS-Gel stärkere Banden des Derivats
C9AC25TC43AC70T-4AA beobachtet werden. Die Expression der Mutante
C9AC25TC43AC70L-4AA konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Die anschließende
Reinigung des Derivats C9AC25TC43AC70T-4AA des Parvulustats mittels Gelfiltration und RPHPLC
bzw. Isolierung des Proteins aus dem SDS-Gel brachte das erwünschte Produkt. Dieses
konnte mit der MALDI-Massenspektroskopie eindeutig nachgewiesen werden. Das aktive
Cystein-freie Derivat C9AC25TC43AC70T-4AA konnte auch auf dem a-Amylase Plattentest
nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Expression und der Nachweis einer
cystein-freien Variante möglich sind, dennoch haben die Ausbeuten dieses Proteins für
weiterreichende Analytik nicht ausgereicht. Demnach sind die Disulfidbrücken für die Stabilität
und Struktur des Parvulustats von enormer Bedeutung dennoch sind sie nicht zwingend
erforderlich für die Aktivität und die Expression in S. lividans.
1. Die vorliegenden vergleichend-morphologischen Untersuchungen an den Borstenmustern der Larven der Lepidoptera wurden mit dem Ziel durchgeführt, die Kenntnis des Borstenmusters der Lepidopterenlarven zu vertiefen, die auf die Borstenmuster anwendbare vergleichendmorphologische Methodik zu verfeinern und damit auch clie Grundlagen für eine vergleichende Untersuchung der Borstenmuster auf höherer taxionomischer Ebene (Borstenmuster bei Insekten verschiedener Ordnungen) zu liefern. Dabei wurde angestrebt, das ermittelte Verhalten der Borstenmuster während der Phylogenie einer evolutionstheoretischen Interpretation zuzuführen.
2. Zunächst wurde ein kurzer überblick über die wesentlichsten Charakteristika der Borstenmuster der Lepidopterenlarven gegeben. Sie bestehen aus zweierlei Musterelementen - den Borsten (setae) und den sog. Poren (punctures); der charakteristische Bau dieser Musterelemente, ihre Funktion und ihr Verhalten während der Larvalentwicklung wurden erörtert. Die Borsten bilden ein System taktiler Sinnesorgane, während die Poren sehr wahrscheinlich über die Beanspruchung der Cuticula Auskunft geben.
3. Im Interesse einer rationellen Arbeitsweise wurde eine neue Einteilung der Muster und der Musterelemente in verschiedene Kategorien eingeführt. Die Einteilung geschah nach jeweils nur einem Gesichtspunkt, und zwar werden unterschieden: a) nach der Konstanz der Lage der Musterelemente - zwischen den konstanten regulären und den nicht konstanten irregulären Muster(elemente)n; b) nach dem erstmaligen Auftreten der Musterelemente während der Larvalentwicklung - zwischen primären (treten im 1. Larvalstadium auf), subprimären (im 2. Larvalstadium) und sekundären Musterelementen (treten erstmalig in einem späteren Larvalstadium auf); c) nach dem relativen phylogenetischen Alter der Musterelemente - zwischen archaiischen und neuen Musterelementen (z. B. archiprimären, neoprimären, archisubprimären Borsten usw.); d) nach der Größenordnung der Borsten - zwischen (propriorezeptorischen) Mikro- und (taktilen) Makroborsten.
4. In der vorliegenden Arbeit wurden nur die regulären Borstenmuster der Lepidopterenlarven behandelt und zwar nur die Borstenmuster der Kopfkapsel und des Rumpfes (die Sensillen der Kopfanhänge und die Borstenmuster der Thorakalbeine sind nicht berücksichtigt worden). Reguläre Borstenmuster liegen bei allen Larvalstadien der sog. "nackten" Raupen und auch im 1. Larvalstadium der sog. "behaarten" Raupen vor. Diese weisen in späteren Larvalstadien zahlreiche irreguläre Sekundärborsten auf. Im Gegensatz zu den irregulären Borstenmustern sind die regulären Borstenmuster bei den Lepidopterenlarven in den Grundzügen gleichartig, die einzelnen Musterelemente können daher homologisiert und die Differenzen in den Borstenmustern der rezenten Lepidopterenlarven systematisch ausgewertet werden (Chaetotaxie).
5. Das Problem der Homologie und Homonomie der regulären Musterelemente wurde grundsätzlich erörtert. Die Homologisierung der Musterelemente erfolgt primär durch Ermittlung komplexer übereinstimmungen (Grundmethode) , die auch den Hauptkriterien der Homologie nach REMANE zugrunde liegt. Vielfach ist auch eine indirekte Methode anwendbar, die darauf beruht, daß man von Merkmalen, die sich in der lmtersuchten Organismengruppe bei den nach der Grundmethode sicher homologisierten Musterelementen als unveränderlich erweisen, annehmen kann, daß sie auch bei denj enigen Vertretern der Gruppe nicht verändert worden sind, bei denen die Musterelemente nach Vergleichend . morphologische Analyse der regulären Borstenmuster der Grundmethode nicht mehr homologisiert werden können. Solche Merkmale können dann als mehr oder minder spezifische Kennzeichen homologer Musterelemente gelten. Da nach der Grundmethode sicher homologe Musterelemente in der Evolution auch durch "Parallelentwicklung" entstanden sein können, berechtigt diese Homologie nicht in jedem Einzelfall automatisch zum Schluß, daß die betreffenden Musterelemente direkt von einer gemeinsamen Ahnenform übernommen worden sind. Der Nachweis der direkten Herkunft eines Musterelementes von einer gemeinsamen Ahnenform ist in jedem Einzelfall erst durch die Analyse der Verteilung des Musterelementes bei den Vertretern der jeweils betrachteten Gruppe zu erbringen. Es wird daher zwischen einer Homologie im weiteren Sinne (Homologie s. 1. - infolge nicht zufällig übereinstimmender Merkmalskomplexe) und einer Homologie im engeren Sinne (Homologie s. str. - infolge direkter Übernahme der Struktur von einem gemeinsamen Vorfahren) untersehieden. Soweit bei Einzelmerkmalen von Homologie ge· sprochen wird, kann es sieh hierbei nur um die Homologie s. str. handeln (Hilfskriterien der Homologie nach REMANE).
6. Entspreehend der Unterscheidung der Homologie im engeren und weiteren Sinne wurde hier auch zwischen einer Homonomie s. 1. und einer Homonomie s. str. untersehieden. Homonomie s. str. liegt vor, WOlm die betrachteten meristischen Strukturen in der Evolution wirklieh einmal gleich bzw. gleichartig gewesen sind; für die Homonomie s. 1. wird diese Bedingung nicht gestellt, und es ist nur erforderlich, daß nicht zufällige komplexe Übereinstimmungen bei den meristischen Strukturen nachweisbar sind. Es konnte evident gemacht werden, daß die 4 verschiedenen segmentalen Borstenmustertypen (Prothorax, Meso· und Metathorax, Abdominalsegment 1-9, Analsegment) der Lepidopterenlarven nicht homonom s. str. sein können: die Differenzierung der ehemals gleichartigen (im engeren Sinne homonomen) Segmente in die entsprechenden 4 verschiedenen Segmenttypen ist in der Evolution sicher sehr viel früher erfolgt als die Ausbildung des regulären Borstenmusters der Lepidopterenlarven, so daß diese Borstenmuster auf den bereits differenten Segmenten von vornherein unterschiedlich angelegt worden sind. Homonom s. str. sind bis zu einem gewissen Grade nur die Borsten. muster des gleichen Segmenttypus (also des Meso- und Metathorax einerseits und der Abdominalsegmente 1-9 andererseits, wobei hinsichtlich des 9. Abdominalsegmentes Einsehränkungen zu machen sind). Die speziellen Methoden, die Homonomie s. 1. der regulären Musterelemente verschiedenen Segmenttypus festzustellen, wurden eingehend erörtert (S. 228).
7. Die Grundzüge der bisherigen versehiedenen Benennungssysteme der homologen Musterelemente der regulären Borstenmuster der Lepidopterenlarven wurden zusammenfassend dargestellt.
8. Die weitgehende Gleichartigkeit der regulären Borstenmuster nahezu aller Lepidopterenlarven und die bereits hinreichend gut fundierte Einsicht in die phylogenetische Verwandtschaft der älteren Teilgruppen der Lepidoptera (HENNIG 1953) ermöglichte es, die einzelnen evolutiven Abwandlungen im regulären Borstenmuster durch vergleichend-morphologische Untersuchungen zu erfassen und das ancestrale Borstemuust,er der Lepidopterenlarven bis zu einem gewissen Grade zu rekonstruieren. Dazu wurden außer den eigenen Untersuchungsergebnissen an über 100 Arten aus verschiedenen Lepidopterenfamilien alle die zahlreichen (vor allem in der larvalsystematischen) Literatur niedergelegten erreichbaren Daten über die regulären Borstenmuster der Lepidopterenlarven herangezogen.
9. Die hier angewendete Methode der Rekonstruktion ancestraler Strukturausprägungen an rezentem Material wurde eingehend dargestellt. Sie gründet sich auf den Prinzipien der Phylogenetischen Systematik nach HENNIG und beruht auf der Analyse der Ausprägungsformen von Einzelme1"7cmalen, wobei aus der Verteilung der Ausprägungsformen der Einzelmerkmale bei den Vertretern einer Gruppe auf die ursprüngliche (plesiomorphe) Ausprägungsform geschlossen wird, die auch bei der jüngsten gemeinsamen Ahnen/orm der betrachteten Gruppe vorgelegen haben muß. Die Sicherheit der Schlußfolgerung ist dabei abhängig von der Labilität des Einzelmerkmales (bzw. der Struktur), worunter hier die Häufigkeit verstanden wird, mit der die Ausprägungsform des Merkmals in der Evolution der betrachteten Gruppe in irgendeiner Weise abgewandelt worden ist. (Anhaltspunkte über die Labilität eines Merkmals oder einer Struktur sind in etwa durch die Zahl der monophyletischen Teilgruppen gegebenen, in denen mehr als eine Ausprägungsform des Mcrkmals oder der Struktur vorkommen.) Dem gegenüber wird als Flexibilität das Ausmaß der Mannigfaltigkeit in den Abwandlungsformen des Merkmals oder der Struktur in der Evolution einer Gruppe bezeichnet. Für die einzelnen Merkmale lassen sich Flexibilitätsgrenzen finden, die durch die extremsten Ausprägungsformen der Merkmale innerhalb der betrachteten Gruppe gegeben sind. Die Sicherheit der Aussage über die ancestrale Ausprägungsform eines Merkmals ist bei stabilen (d. h. nicht labilen) Merkmalen maximal und nimmt mit zunehmender Labilität des Merkmals ab (also mit der zunehmenden Häufigkeit von Abänderungen des Merkmals in der Evolution der Grnppe). Bei sehr labilen Merkmalen kann nur angegeben werden, innerhalb welcher Flexibilitätsgrenzen das Merkmal bei der Ahnenform ausgebildet gewesen sein muß. Die im einzehlen als plesioI)1orph (ancestral) ermittelten Merkmalsausprägungen ergeben dann insgesamt ein Bild der ancestralen Strukturen. Die Anwendung dieser Methode setzt eine sichere Kenntnis der phylogenetischen Verwandtschaftsbeziehungen der älteren Teilgruppen der betrachteten Gruppe voraus (was bei den Lepidoptera hinreichend gegeben ist); Vergleichend-morphologische Analyse der regulären Borstenmuster andernfalls sind Aussagen über die ancestrale Ausprägungsform nur hinsichtlich der stabilen Merkmale möglich.
10. Das ancestrale reguläre Borstenmuster der Lepidopterenlarven wurde soweit wie möglich rekonstruiert (Abschnitt 0), wobei im einzelnen die jüngsten gemeinsamen Ahnenformen der Glossata, Neolepidoptera, Eulepidoptera und Ditrysia (mit Af I-IV bezeichnet - s. S. 259) behandelt wurden. Da die plesiomorphen Schwestergruppen der Neolepidoptera, Eulepidoptera und Ditrysia, also die Dacnonypha (Eriocraniidae), Aplostomatoptera (Hepialidae) und Incurvariina (Incurvariidae, Adelidae) artenarm, "relictär" sind und offenbar zahlreiche Autapomorphien aufweisen, konnte über die älteren Ahnenformen weniger ausgesagt werden als über die jüngste gemeinsame Ahnenform der sehr artenreichen Ditrysia (Af IV). Das reguläre Borstenmuster der Rumpfsegmente der Af IV ließ sich so gen au rekonstruieren, daß es schematisch gezeichnet werden konnte (Abb. 19). Es ließ sich zeigen, daß die Larven dieser Ahnenformen der Lepidoptera nur das reguläre Borstenmuster besessen haben können, also vom Typus der "nackten" Raupen gewesen sind - Larven vom "behaarten" Raupentypus sind erst sehr viel später als Apomorphien in einzelnen apomorphen Lepidopterengruppen aufgetreten.
11. Im Laufe dieser Untersuchungen zeigte es sich, daß die Psychidae die älteste Teilgruppe der Ditrysia sein müssen. Sie haben nämlich (im larvalen Borstenmuster) symplesiomorphe Merkmalsausprägungen mit den "monotrysischen" Lepidoptera gemeinsam, während alle übrigen hier erfaßten Ditrysia (einschließlich Tineidae) in den gleichen Merkmalen synapomorph sind (S. 261).
12. Die beobachteten evolutiven Abwandlungen im regulären Borstenmuster der Lepidopterenlarven betreffen in der Regel nur einzelne Musterelemente, wobei die Abwandlung eines Musterteiles oder eines Merkmals eines Musterelementes im allgemeinen nicht zwangsläufig zu einer Abwandlung weiterer Musterteile oder weiterer Merkmale des Musterelementes geführt hat (nicht ausgeprägte bzw. geringe Kopplung bei der evolutiven Abänderung von Musterteilen oder der Merkmale eines Musterelementes). Häufige Abänderungen sind: Verlagerung des Ortes einzelner Musterelemente oder Musterelementgruppen, .Änderungen der Borstenform und der relativen Länge einzelner Borsten. Nicht ganz so häufig ist die Reduktion oder das Neuauftreten einzelner Musterelmente (darunter vor allem der sog. "labilen Borsten") . Außerordentlich selten sind .Änderungen des Zeitpunktes, in dem ein Musterelement während der Larvalentwicklung erstmalig auftritt (Subprimärwerden primärer Borsten) und die Umwandlung einer Pore in eine Borste.
13. Das Phänomen der Labilität wurde am Verhalten der sog. "labilen B01'8ten" in der Evolution eingehender untersucht. Die "labilen Borsten" sind archaische Musterelernente, die nur im Auftreten labil sind, während sie in allen anderen Merkmalen weitgehend stabil sind. Ihre Homologie s.1. ist auf Grund der übereinstimmenden Merkmalskomplexe gesichert. Es ließ sich zeigen, daß die labilen Borsten sowohl jeweils unabhängig reduziert als auch unabhängig voneinander aufgetreten sein können (polytope Entstehung der Borsten - "Parallelentwicklungen"), und es konnte auch wahrscheinlich gemacht werden, daß ein Wiederauftreten einmal reduzierter Musterelemente in der Evolution durchaus möglich ist. Weiterhin konnte demonstriert werden, daß im weiteren Sinne homonome Musterelemente auf verschiedenen Segmenten nicht unbedingt gleichzeitig in der Evolution aufgetreten zu sein brauchen (S. 335).
14. Aus den beobachteten Abwandlungsvorgängen und dem erschlossenen Verhalten der labilen Borsten wurde versucht, Anhaltspunkte über die phänogenetisohen Bedingtheiten bei der Bildung des
regulären Borstenmusters zu gewinnen. Es zeigte sich, daß die Ausprägungsform der Merkmale jedes einzelnen Musterelementes für jedes Musterelement durch einen oharakteristischen Komplex von ontogenetischen Entwicklungsfaktoren bedingt sein muß, und es gibt Momente, die dafür sprechen, daß besonders die zur Homologisierung der Musterelemente herangezogenen Merkmale der einzelnen Musterelemente (Art des Musterelementes - Pore oder Borste, Ort, Größe und der Zeitpunkt des erstmaligen Auftretens während der Larvalentwicklung) entwicklungsphysiologisch enger korreliert sind. Der Komplex der Entwicklungsfaktoren jedes einzelnen Musterelementes wurde hier Musterlocus genannt. Ähnlich wie die regulären Musterelemente selber sind auch deren Loci (wenigstens theoretisch) homologisierbar.
15. Das Phänomen der "labilen Borsten" (polytope Entstehung von im weiteren Sinne homologen Borsten, Wiederauftreten eines Musterelementes nach erfolgter Reduktion) kann mit Hilfe des Begriffes der Musterloci so erklärt werden, daß die Loci nicht in jedem Falle morphologisch in Erscheinung treten müssen, sondern auch latent (virtuell bzw. morphogenetisch inaktiv) bleiben können. Durch direkte Übernahme solcher latenter Loci von einer gemeinsamen Ahnenform und durch die voneinander unabhängige Manifestation der Loci wird die polytope Entstehung von im weiteren Sinne homologen Borsten ohne weiteres verständlich - und damit ist auch ein Modell für die kausale Deutung der Pa1'ipotenz im Sinne von HAEoKER gewonnen. Bei der Reduktion (Wegfallen) eines Musterelementes wird offenbar der zugehörige Locus aus dem aktiven in den latenten Zustand versetzt, ohne daß das Gefüge des Locus zerstört oder wesentlich verändert wird, so eine erneute Manifestation des Musterelementes ermöglichend.
16. Das Inaktivwerden (Wegfallen, Reduktion des Musterelementes) bzw. die Aktivierung (Neuauftreten, Realisation oder Manifestation eines Musterelementes) eines Locus kann als Schwelleneffekt gedeutet werden: Vergleichend-morphologische Analyse der regulären Borstenmuster latente Loci sind unterschwellig, morphogenetisch aktive überschwellig. Reduktion und Manifestation können so als entgegengesetzt gerichtete SchweZlenübergänge eines Locus aufgefaßt werden. Die weiteren schwellentheoretischen Folgerungen über die HäufigkeitsverteiJung der labilen Borsten im regulären Borstenmuster der Lepidopterenlarven stimmen mit der beobachteten I-Iäufigkeitsverteilung gut überein.
17. Die ermittelten evolutiven Abänderungen im regulären Borstenmuster lassen sich - soweit sie qualitative oder quantitative Abänderungen der Ausprägungsform der einzelnen Merkmale betreffen - auf Änderungen des Gefüges der einzelnen Musterloci zurückführen, während Reduktion bzw. Neuauftreten als Unter- bzw. überschwelligwerden der Loci gedeutet werden können, wobei das Gefüge der Loci nicht entscheidend geändert wird.
18. Schließlich wurde der Versuch unternommen, an Hand bekannter entwicklungsphysiologischer und genetischer Tatsachen, eine kausale Interpretation der Schwellenübergänge der Loci zu geben. Die Realisation eines latenten Musterlocus ist dabei ein Beispiel für das Manifestwerden
latenter Entwicklungspotenzen überhaupt. Am Beispiel der bereits lange bekannten Ommochrombildung bei Insekten wird auf die Existenz von "unvollständigen morphogenetischen Komplexen" hingewiesen, das sind morphogenetische Reaktionskomplexe, bei denen irgendein Glied einer für das Zustandekommen der Struktur unbedingt notwendigen entwicklungsphysiologischen Reaktionskette ausgefallen ist (etwa durch einen genetischen Block). Die Ausbildung der Struktur wird durch den Ausfall einer derartigen "sine-qua-non" -Bedingung verhindert, wobei jedoch alle übrigen Reaktionsglieder funktionstüchtig bleiben. Die latenten Loci lassen sich als derartige "unvollständige Morphogenesen" auffassen - durch Schließung der Lücke in der "Reaktionskette" wird die Morphogenese vollständig und der latente Locus morphologisch manifest. Umgekehrt bedeutet die Reduktion eines Musterelementes,daß eine sine-qua-non-Bedingtmg für das Musterelement ausgefallen und der Locus des Musterelementes mithin latent geworden ist. Das Verhalten der labilen Borsten in der Evolution der Lepidoptera läßt sich im Sinne der aufgestellten Schwellentheorie durch in der Evolution erfolgte unregelmäßige quantitative Schwankungen eines für das Zustandekommen der Musterelemente unbedingt notwendigen Entwicklungsfaktors (sine-qua-non-Bedingung) wiedergeben. Diese quantitativen Schwankungen des Entwicklungsfaktors sind ihrerseits auf die Veränderungen der Konstitution des Genoms während der Evolution zurückführbar, wobei die Quantität des Entwicklungsfaktors sicher polyfaktoriell bedingt ist. Die hier vorgelegte Konzeption der Realisierung virtueller Entwicklungspotenzen wurde als "Hypothese der unvollständigen morphogenetischen Komplexe" bezeichnet.
Bei meinen Untersuchungen über die Algenflora Lettlands habe ich bisher einigen Gruppen weniger Aufmerksamkeit widmen können; es sind das besonders die farblosen Monaden und die Chrysophyceen. In den letzten Jahren habe ich von Zeit zu Zeit, unter anderen Arbeihm, nach Möglichkeit auch diese zwei Gruppen beachtet. Selbstverständlich setzt das die Untersuchung von lebendem Materiale voraus und womöglich gleich nach dem Einsammeln, da viele in Frage kommende Formen beim längeren Stehen der Proben sehr bald eingehen und verschwinden; an ihrer Stelle treten danach einige verbreitete Saprophyten und andere ubiquitäre Monaden in Vordergrund: Vielfach erwies es sich auch nötig, um die Entwicklungsgeschichte einzelnen Typen einigermassen lernen zu können, mit isolierten Hängetropfkulturen zu arbeiten,was jedoch meist nur dann möglich war, wenn die Monade für die Isolierung in etwas reichlicherer Menge vorlag. Nun konnten die meisten gefundenen Formen der Rhizomastigaceen, Monadaceen und Bodonaceen, sowie die Mehrzahl der untersuchten Eugleninen nicht mit den schon bekannten Arten identifiziert werden. Von den unten berücksichtigten 12 Cyanophyceen, 125 Flagellaten im engeren Sinne, 1 Kalkflagellate, 8 Peridineen und 14 Volvocineen, insgessamt etwa 160 Arten (incl. einiger Varietäten), erwies sich die reichlich grösste Hälfte als neu.
Aus Bequemlichkeitsgründen habe ich auch in diesem Teil meiner Beiträge vorläufig noch die frühere Gruppeneinteilung beibehalten, obwohl diese unseren gegenwärtigen Kenntnissen über die verwandschaftlichen Beziehungen innerhalb der Protisten nicht völlig entsprechen.
Es werden auch 8 neue Gattungen beschrieben. Davon gehört Parabodo zu den Bodonaceen, Kathablepharis und Spiromonas zu den Cryptomonadalen, Gyropaigne und Protaspis zu den Eugleninen, endlich Aulacomonas, Gyromitus lmd Hemitoma zu den Volvocineen. Drei von diesen repräsentieren
meines Erachtens zwei besondere Familien - die der Kathablepharitdaceen und Protaspidaceen.
Die Hitzestresstranskriptionsfaktoren HsfA1 und HsfA2 repräsentieren wichtige transkriptionelle Regulatoren in der Regulation der Hitzestressantwort von Lycopersicon esculentum (Tomate). Unter Stressbedingungen induziert HsfA1 die Expression von HsfA2 und bildet heterooligomere HsfA1/HsfA2 Komplexe, die im Zusammenhang mit der erhöhten Expression von Hitzestressgenen stehen (Scharf et al., 1998b, Mishra et al., 2002, Port et al., 2004). Durch funktionelle Charakterisierungen der Wechselwirkung zwischen HsfA1 und HsfA2 werden neue Aspekte der spezifischen und synergistischen Aktivierung durch HsfA1 und HsfA2 erläutert. - Die Spezifität der funktionellen Interaktion zwischen HsfA1 und HsfA2 wird in Vergleich mit weiteren Klasse A Hsfs, HsfA3, HsfA4b und HsfA5 anhand von GUS Reporter Assays, Coimmunpräzipitationsanalysen und der interaktionsvermittelten Kernretention von GFP-HsfA2 verdeutlicht. Trotz des Potenzials von HsfA2, multiple Wechselwirkungen einzugehen, ist die Spezifität zwischen HsfA1 und HsfA2 am höchsten. Für die Analyse der synergistische Aktivierung durch HsfA1 und HsfA2 werden 3HA-HsfA1 und 3HA-HsfA2 in unterschiedlichen Mengenverhältnissen coexprimiert. Sowohl am Hsp17.3B-CI::GUS Reporter als auch an der induzierte, endogene Tabak Hsp17-CI Expression kann der spezifische Effekt der synergistischen Aktivierung durch HsfA1 und HsfA2 demonstriert werden. - Um die strukturellen Voraussetzungen der synergistischen Aktvierung zu definieren, werden Mutanten mit Defekten in der DNA Bindung, Oligomerisierung und Aktivierung in funktionellen Analysen der transkriptionellen Aktivität (GUS Reporter Assays, Induktion endogener Hsp17-CI Expression), Komplexbildung (Co-Immunpräzipitation) und der HsfA1 vermittelte Kernretention von HsfA2 (Immunfluoreszenz) untersucht. Die synergistische Aktivierung erfordert die Bildung heterooligomerer HsfA1/HsfA2 Komplexe, die über eine Kombination ihrer C-terminalen Aktivierungsdomänen kooperativ aktivieren. Dagegen hat die DNA Bindung durch die DBDs beider Hsfs einen geringen Anteil an der synergistischen Aktivierung. Zur Verifizierung der funktionellen Unterschiede zwischen HsfA1 und HsfA2 werden HsfA1-HsfA2 Hybride durch Coexpression mit HsfA1 und HsfA2 Wildtypformen analysiert. Heterooligomere Komplexe aus Wildtyp und Hybrid-Hsfs zeigen ausschließlich eine synergistische Aktivierung, wenn die C-terminalen Aktivierungsdomänen von beiden Hsf Typen stammen, während heterooligomere HsfA1/HsfA2 Komplexe mit typgleichen C-Termini nicht synergistisch aktivieren. Weiterhin wird gezeigt, dass Wildtyp- Hybridkomplexe mit identischen HR-A/B Regionen in der synergistischen Aktivierung abgeschwächt sind. - Die Bildungseigenschaften der DNA-Hsf Komplexe (DNP) von HsfA1 und HsfA2 werden in Hinblick auf qualitative Veränderungen unter Coexpressionsbedingungen betrachtet. Interessanterweise konnte die Bildung intermediärer DNPs sowie von Hsf-Komplexen mit intermediärer Größe in Gelfiltrationsanalysen als Indizien für qualitativ veränderte HsfA1/HsfA2 Komplexen nachgewiesen werden. Die funktionelle Analyse von HsfA1 C-terminalen Deletionsmutanten führt zur Identifizierung einer de-regulierten HsfA1 Mutante, die trotz de-regulierter Aktivität mit HsfA2 zur synergistische Aktivierung fähig ist. - Zur Verifizierung der interaktionsvermittelten synergistischen Aktivierung wird die Oligomerisierung partiell deletierter HsfA2 HR-A/B Mutanten ermittelt. Da diese Mutanten intermediäre Oligomerisierungszustände zeigen, werden durch die systematische Deletionsmutation der HR-A/B Region von HsfA2 strukturellen Voraussetzungen für die synergistische Aktivierung durch HsfA1 und HsfA2 charakterisiert. Co-Immunpräzipitationsversuche belegen, dass die Integrität der HR-A/B Region für die Bildung stabiler HsfA1/HsfA2 Komplexe benötigt wird, jedoch eine transiente und spezifische Interaktion über die C-terminalen L2 und HR-B Regionen für die synergistische Aktivierung ausreicht. - In der Charakterisierung der kooperativen, synergistischen Aktivierung durch beide CTADs werden Mutanten der vier vorhandenen AHA Motive von HsfA1 und HsfA2 durch Coexpression mit dem Wildtyp Hsf Partner getestet. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass jedes der AHA Motive unterschiedlich zur synergistischen Aktivierung beitragen.
Aus dem Dogger Norddeutschlands und des nordwestlichen Polens sowie aus Dogger-Geschieben werden 1 Art der Neritimorpha und 30 Arten der Caenogastropoda beschrieben. Neu sind 7 Arten. 14 Arten werden bereits beschriebenen Arten zugeordnet und 10 unter offener Nomenklatur beschrieben. Neu sind die Gattung Bicorempterus (Aporrhaidae) und die Familien Naricopsinidae, Tripartellidae und Maturifusidae. Die beschriebenen Caenogastropoden zeigen mehr Gemeinsamkeiten zu bisher aus dem Dogger Mittel- und Westeuropas bekannt gemachten Faunen als es bei den Archaeogastropoda und den Heterostropha der Fall war. Die Gleichsetzung der hier vorgestellten Arten mit aus der Literatur bekannten ist oftmals problematisch. Taxonomisch relevante Details besonders der Frühontogenese wurden bisher kaum beschrieben. Auch Fragen der innerartlichen Variation wurden nur gelegentlich angesprochen. Vatopsis antiquus n. sp. ist der älteste genauer bekannte Vertreter der Cerithiopsoidea. Pictavia und Oonia konnten als Vertreter der Ampullospiridae erkannt werden (Ausbildung des Protoconchs). Naricopsina repräsentiert eine Gruppe, die möglicherweise zu den echten Naticidae führte. Einige Gattungen der Aporrhaidae können genauer gefaßt werden. Maturifusus ist der älteste sichere Vertreter der höheren Caenogastropoda (Neomesogastropoda).
I) Durch die vielen Extrem-Faktoren, die im Seewinkel zusammentreffen, erscheint dieses Steppengebiet, das östlich des Neusiedlersees gelegen ist, als besonders geeignetes Untersuchungsobjekt, sowohl für faunistische als auch für ökologische Forschungen. II) Die geologischen Verhältnisse und III) die Entstehungstheorien der Lacken werden in großen Zügen skizziert. IV) Das Klima ist als kontinental zu bezeichnen, es unterscheidet sich aber vom typischen Steppenklima der Ungarischen Tiefebene. V) Die Salzlacken sind durch eine hohe Alkalinitkit, bedeutende Salzgehalte, die zum Großteil auf Soda zurückzuführen sind, ihre große Härte, vor allem aber die Schwankungen im Ionenverhältnis und in der Gesamtkonzentration gekennzeichnet. Die Brunnen sind ebenso wie die Schottergruben als Süßwasser anzusprechen. VI) Es wurden insgesamt 32 Locken, 3 Brunnen, 3 Schottergruben und 7 Kanäle auf ihre Turbellarienfauna untersucht. VII) Die in den Gewässern gefundenen Turbellarien (30 an der Zahl) werden systematisch geordnet. Auch ihre Verteilung auf die einzelnen Lacken in den verschiedenen Monaten wird erläutert. Castrada gigantea ist eine neue Castrada-Art, die in zwei chemisch sehr verschiedenen Lacken gefunden wurde. Die allgemeine Organisation weicht von der der anderen Castraden nicht ab, auffallend ist hier lediglich der sehr große Kopulatiol1sapparat und die eigenartige "pflastersteinartige" Bestachelung der Bursa. Es sind vor allem die Karbonat-, in geringem Maße die Chlorid- und Sulfatkonzentrationen, die für das Artengefüge ausschlaggebend und als auslesender Faktor wirksam sind. Die meisten Turbellarien vertragen nur mittlere und niedere Konzentrationen, die Art der Ionen scheint dann eine untergeordnetere Rolle zu spielen. VIII) Zur Autökologie der Arten in den einzelnen Gewässertypen wird Stellung genommen und mit ihrem von anderen Autoren beschriebenen Vorkommen verglichen. Auf Grund der großen jahreszeitlichen Temperaturschwankungen ist es verständlich, daß wir im Gebiet einen starken Faunenwechsel vermerken können. In den Lacken haben die Temperaturänderungen aber gleichzeitig eine solche der Konzentration zur Folge, diese beiden Faktoren ließen sich nur im Experiment trennen. Man findet in den Lacken hauptsächlich Frühjahrsformen, einige davon erscheinen neben neu hinzutretenden auch im Herbst. Stenostomum leucops ist die einzige Art, die das ganze Jahr hindurch zu finden ist. Übersichtlich sind die Verhältnisse in den Brunnen, da hier die Schwankungen im Chemismus nicht so groß sind. Da das Brunnenwasser viel kühler ist und auch im Sommer nicht versiegt, können sich hier mehrere Arten über das ganze Jahr behaupten. IX) Abschließend wird auf den Entwicklungszyldus von Monocystella Arndti, einer parasitischen Gregarine, die in den Planarien des Brunnens am Sandeck vorkommt, eingegangen.
Die Pilzgattung Hygrocybe wird taxonomisch besprochen, wobei die bisherige Sektion Oreocybe Boertmann (subgenus Cuphophyllus) den Status einer eigenen Untergattung erhält. Ein Bestimmungsschlüssel zur Gattung wird vorgelegt, wobei Gruppen sehr ähnlicher Arten, die früher teilweise nicht getrennt wurden, im Hauptschlüssel zu Aggregaten zusammen gefaßt wurden. Diese Aggregate werden getrennt aufgeschlüsselt. 50 europäische Arten der Gattung Hygrocybe werden schließlich hinsichtlich ihrer Morphologie, Taxonomie, Ökologie und Verbreitung vorgestellt.
Scharben und Scharbenfischerei : nach einem Vortrag in der "Ornithologischen Gesellschaft in Bayern"
(1938)
Im Jahre 1932 wurden 4 Beobachtungen über Strömungen im Schwarzen Meere (Meerbusen Mamaia) mit folgendem Ergebnis angestellt: 1. Zwischen 24. Juni und 2. Juli wurde eine S.N.-Strömung beobachtet, deren Wasser am 26. Juni in den Meerbusen Mamaia eindrang und da ein plötzliches Temperatursinken um 8,40 C hervorrief. Die Fischbevölkerung änderte sich ebenso rasch, da mit dem kalten Wasser grosse Exemplare von Mugil cephalus, Temnedon saltator und Trachurus trachurus an der Stelle der sonst täglich an der Küste angetroffenen Fische traten. 2. Zwischen 5. und 12. Juli wurde eine Verminderung der Dichte von 1,010 auf 1,005 binnen 24 Stunden bei fast gleichbleibender Wassertemperatur festgestellt. Parallel mit der Verminderung des Salzgehaltes wurden im Meere grosse Mengen Süsswasserfische, besonders Karpfen, die aus der Donaugegend stammten, gefischt; andererseits warfen die Wellen Zweige und Wurzeln von Weidebäumen an die Küste. Diese Erscheinungen sprechen für das Vorhandensein einer N.S.-Strömung, die in dieser Zeit in den Mamaiaer Meerbusen einströmte. 3. In der Zeitspanne 22. August - 18. September wurde die N.S.-Strömung wieder beobachtet, da sie eine abermalige Verminderung des Salzgehaltes im Meerbusen herbeiführte. Am 23. August wurde die Hauptströmung zirka 10 km. vor Constantza, in der Gegend der 20-25 m. Tiefenlinie gefunden (bei 27° C war die Dichte 1,005). Durch langanhaltende und wiederholte N.O.- und O.-Winde wurde das warme Wasser der N.S.-Strömung in den Meerbusen Mamaia getrieben, sodass dort am 11. September das Dichteminimum von 1,0039 bei 22,5° C erreicht wurde. 4· Schliesslich wurde zwischen 31. Oktober und 7. November ein Eindringen von kaltem Wasser in denselben Meerbusen beobachtet, das ein plötzliches Temperatursinken von 16° C auf 6,50 C bei fast gleichbleibenden Dichtewerten zur Folge hatte. Dieses kalte Wasser gehörte der S.N.-Strömung an, denn wir stellten in dieser Zeit fest, dass die Stellnetze 100-.300 m. weit nordwärts von ihrem Platze getrieben wurden . Der Fischfang zeigte sich ergiebig zwischen 15,5° C und 8° C., während bel 6,5° C die Makrelen, die vorher in grossen Mengen gefangen wurden, ausblieben.
Einleitung: Ernährungsbiologische Untersuchungen dienen unter anderem dazu, die Position einzelner Tierarten in der jeweiligen Lebensgemeinschaft, der sie angehören, näher zu bestimmen. Dabei wird man sich nicht darauf beschränken können, die Nahrungsbestandteile in kleinen Serien zu ermitteln, denn die Zusammensetzung der Nahrung variiert entsprechend den Umweltbedingungen und dem physiologischen Zustand des Tieres. Die Variationsbreite des Nahrungsspektrums ist allerdings bei omnivoren Tieren, zu denen auch die Sperlinge zählen, verhaltnismäßig schwer zu erfassen, und es bedarf dazu einer grösseren Anzahl von Stichproben aus verschiedenen Populationen, die in unterschiedlichen Lebensräumen vorkommen. Noch schwieriger ist es, die Variationsursachen zu erkennen, denn dazu sind quantitative Untersuchungen über das Nahrungsangebot und seine Ausnutzung notwendig. Die Arbeiten in dieser Richtung sind in den letzten Jahren vor allem von L. Tinbergen und seinen Schülern, denen Vögel und Arthropoden als Forschungsobjekte dienten, entscheidend gefördert worden. Doch auch viele andere Forscher davor und danach befassten sich mit Nahrungsuntersuchungen an Vögeln und begründeten damit eine Sammlung von Faktenmaterial zur Problemstellungen, die zum Teil nur im Rahmen ökologischer Komplexaufgaben sinnvoll bearbeitet werden können. Im Internationalen Biologischen Programm bot sich eine Gelegenheit, die Ergebnisse vieler tausender Arbeitsstunden, die der Erforschung der Ernährung von Haus- und Feldsperling gewidmet waren, zusammenzufassen und einer allgemeinen Synthese zuzuführen. Auf Grund ihrer weiten Verbreitung und der hohen Dominanz, dle die Sperlinge stellenweise erreichen können, ist nicht nur ihre Bedeutung im Artengefüge (species network; Elton 1966) von Ökosystemen ziemlich hoch einzuschätzen, sondern es besteht auch ein begründetes volkswirtschaftliches Interesse an der Verringerung der von ihnen in der Landwirtschaft verursachten Schäden. Die im folgenden vorgetragenen Fakten und Vorstellungen sollen dazu beitragen, ein Modell zu finden, das die Rolle der Sperlinge in verschiedenen Ökosystemen zum Ausdruck bringt und uns dadurch befähigt, zweckmässigere Wege bei der Regulierung von Sperlingspopulationen einzuschlagen. Es kann jedoch nicht die Aufgabe dieser Abhandlung sein, die trophische Position der Sperlinge in verschiedenen Klima- und Vegetationsgsbieten erschöpfend zu analysieren und quantitativ zu vergleichen, da dies einen Gesamtüberblick über das produktionsbiologische Datenmaterial voraussetzt, der erst noch in Gemeinschaftsarbeit geschaffen werden muss.
Nahrungsmittelallergikern steht aufgrund inakzeptabler Nebenwirkungen bei der spezifischen Immuntherapie zurzeit noch keine kausale Therapie dieser Erkrankung zur Verfügung. Demzufolge bleibt die Vermeidung der entsprechenden Lebensmittel für Nahrungsmittelallergiker der einzige Weg möglicherweise lebensbedrohlichen allergischen Reaktionen zu entgehen. Ziel dieser Arbeit war es, das Potential eines viralen Vektors für die Verwendung bei der spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie zu untersuchen. Die Überlegung dahinter war, das Risiko eines anaphylaktischen Schocks, der bei Injektion eines Allergens immer gegeben ist, durch intrazelluläre Expression des Proteins über das rekombinante Virus zu verringern. Zusätzlich dazu bringt das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA) ideale Voraussetzungen für eine Allergievakzine mit: Die Infektion mit MVA führt zu einer stark Th1-gerichteten Immunantwort gegen die viral exprimierte Proteine, die möglicherweise die allergische Th2-gerichtete Immunantwort modulieren kann. Die prophylaktische Immunisierung mit MVA-OVA im Mausmodell der systemischen Sensibilisierung gegen Ovalbumin (OVA) führte dosisabhängig zur Suppression der spezifischen IgE-Antwort und somit zum Schutz vor allergischer Sensibilisierung. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass die Vakzinierung mit MVA-OVA eine dauerhafte spezifische IgG-Antwort induziert. Diese Daten unterstützen das Konzept einer Modulation der Sensibilisierung durch MVA-Vakzine. Weiterhin wurden zwei rekombinante Vakzinen generiert, mittels derer entweder das Tropomyosin aus Garnelen (Pen a 1) oder das Lipid-Transfer-Protein aus Haselnuss (Cor a 8) intrazellulär exprimiert werden konnte. Dass die Sensibilisierung gegen diese Allergene häufig mit schweren allergischen Reaktionen korreliert, unterstreicht die Notwendigkeit einer verbesserten Immuntherapie in diesem Bereich. Während MVA-Pen a 1 in ausreichender Menge und Qualität für die Verwendung im Mausmodell hergestellt werden konnte, gelang es nicht, eine homogene Population von MVA-Cor a 8 zu gewinnen, in der das Selektionsgen K1L nicht mehr vorhanden war. Parallel zur Virusherstellung wurden Mausmodelle der Sensibilisierung gegen Cor a 8 und Pen a 1 entwickelt. Vergleiche unterschiedlicher Mausstämme ergaben, dass sich Mäuse des Stammes CBA/J am empfänglichsten für eine systemische Sensibilisierung mit Cor a 8 sind. Aufgrund von Erfahrungen zur Sensibilisierung gegen Pen a 1 wurden Mäuse des Stammes C3H/HeJ bei der Etablierung eines Garnelenallergiemodells verwendet. Es zeigte sich, dass durch die intragastrale Applikation von 0,1 mg Pen a 1 sowie Choleratoxin als Adjuvanz (drei Gaben in dreiwöchigem Abstand), gefolgt von einer systemischen Gabe des Allergens mit Aluminiumhydroxid eine spezifische Sensibilisierung hervorgerufen werden konnte, die nach Exposition mit Pen a 1 zu allergischen Symptomen führte. Auch in diesem Modell bot die prophylaktische Immunisierung mit MVA-Pen a 1 Schutz vor Pen a 1spezifischer Sensibilisierung. Um die therapeutische Effektivität der Vakzine ermitteln zu können, muss die begonnene Etablierung eines Allergiemodells mit symptomauslösenden Provokationen und immunologischen Analysen weitergeführt werden. Der in dieser Studie beobachtete starke schützende Effekt einer Vakzinierung mit MVA vor allergischer Sensibilisierung und das sehr gute Sicherheitsprofil dieses Vektors in klinischen Studien zu anderen Erkrankungen belegt die Möglichkeit einer Verwendung von MVA zur erfolgreichen spezifischen Immuntherapie der Lebensmittelallergie.
Die Arbeit enthält Ergänzungen und Korrekturen zu Teil I der Revision, insbesondere einen revidierten Bestimmungsschlüssel für die in Europa vertretenen Gattungen und Bemerkungen zur Taxonomie und Verbreitung der Arten. Zusätzlich wird die Gattung Baryenemis Förster revidiert. Es werden eine Gattung (Gelanes spec. nov.; Typusart Thersylochus fusculus Holmgren) und 30 Arten neu beschrieben, sechs bisher als Gattungen ausgefaßte Taxa als Untergattungen eingeordnet und neun Arten neu synonymisiert.
"Neobiota" ist ein biologischer Begriff zur Bezeichnung von nicht-einheimischen Arten, welche infolge direkter oder indirekter menschlicher Einwirkungen in neue geografische Gebiete eindringen. Biologische Invasionen durch neue gebietsfremde Lebewesen (Neobiota), die sowohl Tierarten (Neozoa) als auch Pftanzenarten (Neophyta) betreffen, wurden in den letzten Jahren zunehmend von Interesse, da ihre Anzahl und Ausbreitung ständig zunimmt. Solche Fremdlinge (Aliens) verändern oft ihre neue Umwelt, die einheimischen bodenständigen Planzen- und Tierarten müssen sich an diese ungewohnte Umgebung anpassen. Insbesondere invasive fremde Arten werden als eine der Hauptursachen für Verluste an Biodiversität erachtet. In der vorliegenden Arbeit werden für Südtirol einige markante Beispiele rezent einschleppter Tier- und Pflanzenarten erörtert. Es wird der bestehende Trend einer rezenten Zunahme von Neobiota aufgezeigt, als Folge einer Zunahme von Verkehr und Warenaustausch, und auf die Notwenigkeit hingewiesen, die Einschleppungswege und Zeiträume genau zu verfolgen und zu registrieren. Insgesamt werden hier 44 Tierarten behandelt: davon 40 Invertebraten und 4 Vertebrata, sowie 5 Pflanzenarten. Davon sind einige Arten auch Neumeldungen für Südtirol: Diptera: Rhagoletis alternata, Rhagoletis completa; Heteroptera: Leptoglossus occidentalis; Pisces: Rhodeus amarus, Pseudorasbora parva; Crustacea: Procambarus klarkii; Araneae: Atea triguttata und Araniella displicata (beides heimische Arten), Tegenaria atrica (adventiv).
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung des Proteoglykans Biglycan und seiner Funktion als Signalmolekül in inflammatorischen und autoimmunen Prozessen. Die biologische Bedeutung der in vitro gewonnenen Ergebnisse in primären Makrophagen und dendritischen Zellen wurde durch in vivo Modelle der Pathogenvermittelten-und nicht-Pathogen-vermittelten Inflammation und der Autoimmun-Erkrankung Lupus Nephritis bestätigt. In primären Makrophagen und dendritischen Zellen induziert Biglycan die Produktion proinflammatorischer Zytokine und Chemokine durch Interaktion mit Toll-like Rezeptor (TLR) 2 und 4. Mit nucleotide-binding oligomerization like Rezeptorprotein3 (NLRP3)-,apoptosisassociated speck-like protein containing a CARD (ASC)- , Caspase-1- und TLR2/4- defizienten Mäusen und verschiedenen pharmakologischen Inhibitoren war es möglich in primären murinen peritonealen und Knochenmark-Makrophagen nachzuweisen, dass Biglycan die Caspase-1 NLRP3/ASC-abhängig aktivierte und damit die Prozessierung der Proform und Sekretion von reifem IL-1β induzierte. Durch Bindung an TLR2/TLR4 aktivierte Biglycan die NFκB, Erk und p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) Signalwege und stimulierte die Expression von Interleukin-1 beta (IL-1β). Biglycan aktivierte zudem den P2X7 Rezeptor (P2X7R) in Makrophagen und ist somit in der Lage auch ohne zusätzliche Ko-Stimulation, beispielsweise durch ATP, das NLRP3 Inflammasom zu stimulieren und die Prozessierung von aktivem IL-1β anzuregen. In einem Pathogenvermittelten (Lipopolysaccharid (LPS)-induzierte Sepsis) wie auch –nicht-athogenvermittelten (unilaterale Uretherobstruktion, UUO) Mausmodell der Inflammation wurde die biologische Relevanz dieser Prozesses gezeigt. Die Defizienz von Biglycan ging in diesen Modellen mit verminderter Aktivierung des NLRP3/Caspase-1 Inflammasomes, geringeren Spiegeln von reifem IL-1β und geringerer Organschädigung einher. Nachdem aufgezeigt werden konnte, dass die Biglycan-Konzentrationen in Nierenbiopsien und im Plasma von Patienten mit Lupus Nephritis stark erhöht waren, wurde seine Relevanz in Immunitätsreaktionen einschließlich autoinflammatorischen Prozessen genauer untersucht. Die Effekte von Biglycan in verschiedenen Stadien der Erkrankung wurden mit der MRL-Faslpr (kurz MRL/lpr) Maus, einem etablierten Modell der Lupus Nephritis (LN) und einem dafür generierten Modell der Defizienz (Bgn-/- MRL/lpr) und Überexpression von Biglycan (hBGN MRL/lpr) analysiert. In den verschiedenen Stadien der LN nahm die Konzentration von zirkulierendem und renalem Biglycan in MRL/lpr Mäusen zu und korrelierte gleichermaßen mit dem Fortschreiten der Erkrankung. Die Defizienz von Biglycan verminderte hingegen stark die renale Infiltration von Entzündungszellen, insbesondere B1-Zellen, außerdem die Zytokin-, Chemokin- und Immunglobulin-Konzentrationen und minderte die Progredienz der Niereninsuffizienz verglichen mit Lupus Mäusen gleichen Alters. In der Initialphase der Lupus Nephritis induzierte Biglycan in Mäusen, transient transgen für humanes Biglycan (hBGN MRL/lpr), vermehrte renale Zellinfiltration und Albuminurie als Zeichen nephrotischer Dysfunktion. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Produktion des stark proinflammatorischen Zytokines IL-1β in jungen Lupus Nephritis Mäusen NLRP3/Caspase-1-abhängig ist und durch Biglycan verstärkt wurde. Die Mechanismen, durch die endogenes Biglycan die Leukozyteninfiltration in Lupus Mäusen induzierte und somit inflammatorische und autoimmune Vorgänge potenzierte, wurden insbesondere an B-Zellen untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Biglycan die renale Migration von einem besonderen B-Zell Subtyp, B1-Zellen, verantwortlich für die T-Zellenunabhängige Autoimmunglobulinproduktion beim LN, unterhielt. Dabei vermittelte Biglycan die Rekrutierung von B1-Zellen in die Niere durch Regulation der Expression und Synthese der B-Zell C-X-C Chemokin Ligand 13 (CXCL13) in der Niere und in residenten peritonealen Makrophagen. In vitro konnte zudem der Mechanismus aufgeklärt werden, über den Biglycan CXCL13 reguliert. In primären Makrophagen und dendritischen Zellen induziert Biglycan die Expression und Sekretion von CXCL13 über TLR2 und TLR4. Die Daten zeigen auf, dass Biglycan als endogenes Gefahrensignal starke proinflammatorische Reaktionen hervorruft. Über Rezeptoren des angeborenen Immunsystems, TLR2 und TLR4, aktiviert Biglycan des weiteren Zellen des adaptiven Immunsystems und inuziert die Rekrutierung weiterer Lymphozyten. Demnach kann postuliert werden, dass Biglycan als Brückenmolekül das anegborene und adaptive Immunsystem verbindet, und somit ein potenzielles neues „drug target“ in autoinflammatorischen, wie auch autoimmunen Vorgängen darstellt.
Die Gattung Phormictopuswurde im Jahre 1901 von POCOCK aufgestellt. In seine neue Gattung nahm er als Typusart Mygale cancerides LATREILLE, 1806 von der Insel Hispaniola auf, dazu kam Lasiodora cautus AUSSERER, 1875, eine Art, die ohne Angabe des locus typicus beschrieben worden war. Bisher waren 14 Arten und 2 Unterarten bekannt, von denen 5 aus Südamerika stammen. Die vorliegende Arbeit reduziert die Artenzahl auf 12, wobei 5 neue Arten beschrieben und 4 synonymisiert, 3 zu nomina dubia (Typus verschollen), und 3 "incertae sedis" (in andere Gattungen gehörig) erklärt werden.
Aus den vorhergehenden Untersuchungen erhellt, dass die fossilen Hölzer von König-Karls-Land ein aussergewöhnliches Interesse beanspruchen. Sie umfassen sechs Arten, die zu fünf verschiedenen Gattungen gehören, und zwar: Phyllocladoxylon sp., Xenoxylon phyllocladoides GOTHAN, Cupressinoxylon cf. McGeei KNOWLTON, Cedroxylon cedroides n. sp., Cedroxylon transiens n. sp., Protopiceoxylon exstinctum n. gen. et sp. und dazu noch ein paar nicht bestimmbare Arten.
In der vorliegenden monographischen Studie sollen die indomalayischen Arten der Gattung Pycnolejeunea Spruce einer kritischen Betrachtung unterzogen werden. Nach der Feststellung, welche systematische Bedeutung den Einzelmerkmalen innerhalb der Gattung zukommt. wird im speziellen Teil zuerst das untersuchte Herbarmaterial quellemnässig aufgeführt. Es folgt dann als Hauptteil die Behandlung der wichtigsten Fragen, die sich während der Arbeit herausstellten und von grundlegender Bedeutung für einzelne Arten sind. Im dritten Abschnitt wird die Abgrenzung sowohl der Arten untereinander als auch die der Gattung gegen andere klargestellt. Die Beschreibung der im Material vorhandenen neuen Arten beendet diesen Teil. Zum Schluss folgen einige geographische Einzelheiten der indomalayische Formen.
In den vorliegenden Untersuchungen wurde anhand umfangreichen Herbarmateriala sowie über längere Zeit ausgedehnter Geländestudien versucht, zwei Problemen nachzugehen, einem allgemeinen und einem speziellen. Bei den Flechten werden seit langem relativ primitiv gebaute krustige und morphologisch wie anatomisch hochentwickelte laubige und strauchige Typen unterschieden. Anhand einer Gruppe, die am Übergang zwischen beiden Lebensformen steht, eben der als (Sektion oder) Untergattung Placodium des Genus Lecanora sensu amplo zusammengefaßten Arten, sollte nun geprüft werden, wie sich die morphologische Differenzierung von Randloben usw. im anatomischen Bau auswirkt. Die leitenden Prinzipien finden sich nun gleichsam in den verschiedenen systematisohen Einheiten manifestiert und können etwa folgendermaßen skizziert werden: Die primitiveren, rein krustigen oder auch schon primitiv gelappten Formen verfügen noch nicht über eine echte Rinde. Die sog. Rinde besteht bei ihnen aus absterbendem und kollabierendem Thallusgewebe mit Einschluß alter Algernüllen. Als nächsthöhere Stufe sind die Arten mit einfacher, echter Rinde aufzufassen, welche als spezielles Organ aufgebaut wird und keine toten Algenhüllen mehr enthält. Im weiteren Verlauf der angenommenen Entwicklung kommt es zu einer verschiedenartigen Differenzierung der Rinde unter gleichzeitiger Reduktion des Markes. Bei den als Gattung Squamarina ausgeschiedenen Arten wird die Oberrinde allein zum formgebenden Element des Fleohtenkörpers; sie ist auch durch auffällige Starrheit ausgezeichnet. Das streng abgesetzte Mark wird weit mehr als bei den vorher genannten Typen zum Ablagerungsplatz anorganischer Bestandteile. Bei den meisten Arten von § Placodium ist der Cortex dagegen in eine Vielzahl kegeliger, unter sich nur wenig zusammenhängender Teile aufgelöst die jeweils straff mit dem Mark verbunden sind und den Loben dadurch ihre flache Gestalt geben. Von hier, wie von den Arten mit einfacher echter Rinde, führt nun durch Ausdifferrenzierung einer Unterrinde, die zusammen mit der Oberrrinde als Außenskelett wirkt, der Weg zu blattflechtenähnlichen Typen, bei denen das Mark mehr und mehr zum Verschwinden kommt bzw. nur als sehr lockeres Füllorgan dient. Als hier anzuschließende Sonderform können die Schildflechten gelten, die bei gleicher Grundstruktur ihre Verbindung mit dem Substrat auf einen Punkt reduziert haben. Parallel zur anatomiechen Differenzierung der Pilzkomponente steht das Verhalten der Algen: im Anfang eine mehrminder regellose Verteilung in den oberen Partien des Flechtenkörpers, dann die Entstehung einer fest definierten schicht, schließlich wieder - bei den auch unterseits berindeten Formen, bei denen das Mark sehr aufgelockert ist - die Auflösung dieser Ordnung und das Wandern der Algen in die für die Assimilation günstig gelegenen, belichteten Teile des Flechtdnkörpers. Die höchstentwickelten Formen verschiedener Gruppen können bereits als echte Laubflechten gelten, womit auch in einem kleinen Bereich wieder der Beweis erbracht wäre, daß die Lebensformen der Flechten nur als Entwicklungsstufen, nicht aber als reelle systematische Einheiten höherer Ordnung aufzufassen sind. Als zweites Problem sollte, im Zusammenhang mit den eben kurz skizzierten Untersuchungen und unter Berüoksichtigung der gefundenen Tatsachen, eine systematische Gliederung und Bewertung der lobaten Arten der Sammelgattung Lecanara erarbeitet werden. Die großen Verschiedenheiten der entsprechenden Spezies führten dabei zu einer Auflösung der ganzen Einheit, also zur Erkenntnis der Polyphylie der Gruppe und damit zum Nachweis vielfältiger, parallel gerichteter Entwicklungstendenzen. Insgesamt werden -- einige species incertae sedis ausgenommen - 88 Arten behandelt und auf 4 Gattungen verteilt, von denen eine -- Squamarina mit 15 Arten in 2 Sektionen -- neu aufgestellt werden mußte. Die bei Leoanora verbleibenden Arten werden in 11, größtenteils aus Sektionen bewertete Gruppen gegliedert. Eine Anzahl bisher anerkannter Spezies mußte eingezogen werden; 14 neue aus den Alpen, dem Mittelmeergebiet, dem Himalaya und aus Innerasien werden beschrieben.
Untersuchungen zum Target und Wirkmechanismus der eNOS-Transkriptionsverstärker AVE9488 und AVE3085
(2008)
Die Substanzen AVE9488 und AVE3085 der neuen chemischen Klasse der eNOS-Transkriptionsverstärker führen zu einer signifikanten Aktivierung des eNOSPromotors, die in vitro und in vivo in einer Erhöhung der eNOS-Expression auf mRNAund Proteinebene resultiert. Als Folge davon kommt es zu einer signifikant gesteigerten Synthese von bioverfügbarem Stickstoffmonoxid (NO). Dieser Effekt führt in Kombination mit einer ebenfalls beobachteten Normalisierung der eNOS-Entkopplung zu einer deutlichen antiatherosklerotischen Wirkung in ApoE-Knockout-Mäusen. AVE9488 und AVE3085 wurden initial durch eine phänotypische Reihentestung chemischer Bibliotheken in einer stabilen eNOS-Promotor-Reporter-Endothelzelllinie identifiziert. Daher waren bis zum heutigen Zeitpunkt molekulare Targets und ihre Wirkweise unbekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, Targetproteine der eNOS-Transkriptionsverstärker zu identifizieren, zu validieren und Hinweise auf den zugehörigen Wirkmechanismus zu sammeln. Zur Identifizierung potenzieller Zielproteine wurden zwei unterschiedliche Strategien verfolgt. In einem genomischen Ansatz sollten einzelne, für die Aktivierung des eNOSPromotors durch AVE9488 und AVE3085 essentielle Transkriptionsfaktoren identifiziert werden. Eine in silico-Analyse des für die Substanzwirkung notwendigen 300bp-Promotorbereichs vor Transkriptionsstart auf konservierte Transkriptionsfaktor-Bindemotive ergab potenzielle Bindungsstellen für insgesamt 105 Transkriptionsfaktoren. In Gel-Retardierungsexperimenten mit Oligonukleotiden, die aufbauend auf der bioinformatischen Analyse die konservierten cis-Elemente in diesem Sequenzbereich abdeckten, und Kernextrakten aus Endothelzellen, die mit AVE9488 behandelt worden waren, konnte eine Abschwächung der DNA-Protein-Komplexbildung beobachtet werden. Diese Effekte konnten jedoch mit dieser Technologie aufgrund der hohen Anzahl möglicher bindender Transkriptionsfaktoren nicht auf einzelne eingeengt werden. Im Folgenden wurden daher einzelne Transkriptionsfaktoren ausgewählt, die eine nachgewiesene Rolle bei der Regulation der eNOS-Transkription besitzen, und auf ihre Bedeutung bei der Substanz- ermittelten eNOS-Promotoraktivierung untersucht. Nach Ausschaltung durch siRNA von Sp1, GATA-2, Ets-1, MAZ und PATZ1 im eNOS-Transkriptionstest konnten bei Sp1, GATA-2 und MAZ lediglich eine Erniedrigung der basalen eNOS-Promotoraktivitätfestgestellt werden. Da die Substanz-induzierte eNOS-Transkriptionserhöhung bei keinem der untersuchten Transkriptionsfaktoren beeinflusst wurde, scheinen diese Proteine bei diesem Prozess keine Rolle zu spielen. Als zweite Strategie kamen Proteomik-Techniken zur Identifizierung möglicher Targetprot eine durch ihre direkte biochemische Affinität zum Pharmakophor der eNOS-Transkriptionsverstärker zum Einsatz. Durch die chromatographische Anreicherung bindender Proteine aus Endothelzelllysaten an spezifischen Affinitätsmaterialien und der Markierung rekombinanter, humaner Proteine auf Protein-Mikroarrays mit Biotinmarkierten eNOS-Transkriptionsverstärkern konnte eine Gesamtliste mit insgesamt 18 potenziellen Targetkandidaten ermittelt werden. Die weitere zelluläre Validierung dieser Kandidaten erfolgte durch ihre siRNA-vermittelte Ausschaltung im eNOS-Transkriptionstest. Innerhalb aller potenziellen Targets konnte nur nach Ausschalten von Häm-bindenden Protein 1 (HEBP1) der eNOS-Promotor durch AVE3085 nur noch signifikant abgeschwächt gegenüber der Kontrolle aktiviert werden. Dieses Protein stellte somit den einzigen Targetkandidaten dar, der bei der Aktivierung des eNOS-Promotors eine Rolle zu spielen scheint. Nach rekombinanter Expression des humanen HEBP1 konnte die Bindung der eNOS-Transkriptionsverstärker an dieses Protein durch zwei unabhängige biochemische Methoden konfirmiert werden. Bei Messungen der Tryptophanfluoreszenz des HEBP1 konnte der eNOS-Transkriptionsverstärker 9257 den Liganden Hämin, der eine Quenchung der Fluoreszenz bewirkt, aus der Bindung verdrängen. Weiterhin konnte mit Hilfe einer Fluoreszenz-markierten eNOS-Substanz ihre direkte Bindung an das HEBP1 durch Messung der Fluoreszenzpolarisation nachgewiesen und ein KD-Wert von 11,7μM ermittelt werden. Abschließend konnte in ersten Untersuchungen der Hebp1-Expression in einem Herz-Kreislauf-relevanten Tiermodell für chronische Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt die differentielle Hochregulation des Hebp1-Gens um den Faktor 2,5 unter pathologischen Bedingungen nachgewiesen werden, die jedoch nicht durch die Behandlung mit AVE3085 beeinflusst wurde.
Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein weit verbreitetes Humanpathogen, welches den menschlichen Magen besiedelt und zu schwerwiegenden entzündlichen Erkrankungen des gastralen Traktes führen kann. Bereits 1994 wurde das Bakterium als ein Klasse 1 Karzinogen deklariert, da H. pylori im erwiesenen Maße mit der Entstehung von hochinvasivem Magenkrebs in Verbindung gebracht wird. In vitro induziert H. pylori eine starke Migration der infizierten Epithelzellen, die unter anderem mit der Auflösung der Zellkontakte einhergeht. Die zugrunde liegenden molekularen Zusammenhänge konnten bisher noch nicht vollständig aufgeklärt werden. Die Mechanismen der Auflösung der Zelladhäsion wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht, um einen tieferen Einblick in die H. pylori vermittelten Virulenz zu erhalten. So konnte eine H. pylori-induzierte Dissoziation des E-Cadherin Komplexes, bestehend aus p120, 􀄮- und 􀈕-Catenin beobachtet werden, der in einem Verlust der Zelladhäsion resultierte. Es konnte darüber hinaus eine Spaltung der extrazellulären Domäne von ECadherin detektiert werden, die wahrscheinlich zu einer Destabilisierung und somit zur Auflösung des gesamten E-Cadherin Komplexes führte. Durch den Zerfall der Adhärenzverbindungen wurden Catenine in den zytoplasmatischen Pool freigegeben, von denen p120 in den Zellkern translozierte und die Transaktivierung von Zielgenen auslöste, die in diesem Zusammenhang mit Hilfe von Reportergenanalysen quantifiziert wurden. Diese Prozesse zeigten sich von dem Pathogenitätsfaktor CagA (cytotoxin associated gene A) unabhängig, der über das bakterielle Typ IV Sekretionssystem in die Wirtszellen transloziert wird und krebsassoziierte Signaltransduktionswege aktivieren kann. In weiteren Untersuchungen wurden deshalb die Auswirkungen löslicher H. pylori Faktoren auf die Spaltung von E-Cadherin und folglich auf die Zellmotilität und Morphologie epithelialer Zellen analysiert. Aufgrund dieser Beobachtungen wurden in weiteren Experimenten proteolytische Aktivitäten von H. pylori untersucht. Dabei konnte erstmalig die hypothetische Protease HtrA (high temperature requirement protein A) von H. pylori durch massenspektrometrischen Analysen als eine caseinolytisch aktive Protease gefunden werden. Nach der Klonierung und Aufreinigung von HtrA konnte darüber hinaus auch E-Cadherin als spezifisches biologisches Substrat der Wirtszellen für HtrA identifiziert werden. Diese selektive Fragmentierung von E-Cadherin durch HtrA fügt sich als ein neues Element in das Modell der H. pylori Pathogenese, die einen initialen Schritt in der frühen Phase der Infektion darstellen könnte.
Identifizierung und Charakterisierung neuartiger 5-Lipoxygenase-Inhibitoren – in silico und in vitro
(2009)
Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung neuer potenter 5-LO-Inhibitoren unter Verwendung sowohl computergestützter als auch experimenteller Methoden. Ausgangspunkt war ein ligandenbasiertes virtuelles Screening unter Verwendung der ladungsbasierten Deskriptoren Charge 3D und TripleCharge3D. Hierbei konnten zwei neue direkte 5-LO-Inhibitoren identifiziert werden. Jede dieser beiden Substanzen diente als Startpunkt weiterer virtueller Screenings mit dem Ziel, die Potenz der Substanzen zu verbessern bzw. eine SAR der Substanzklasse zu erhalten. Dabei zeigte sich für die Klasse der Thiazolinone, dass eine hohe Toleranz gegenüber unterschiedlichen Substituenten am Grundgerüst bezüglich der Auswirkung auf die Aktivität vorliegt: insbesondere werden relativ große Substituenten toleriert. Des Weiteren scheint der 2-Phenylsubstituent für die 5-LO-inhibitorische Aktivität essentiell zu sein, da Derivate, die einen Heterozyklus an dieser Position aufweisen, inaktiv sind. Eines der aktivsten Derivate dieser Klasse, C06 (Substanz 12), konnte weiter molekular-pharmakologisch charakterisiert werden. Die Substanz zeigt keine offensichtlichen zytotoxischen Effekte, ist unabhängig vom Stimulus der 5-LO-Aktivierung und zeigt nanomolare inhibitorische Aktivität sowohl in intakten PMNL (IC50-Wert 0,65 =M) als auch in PMNL-Homogenaten (IC50-Wert 0,66 =M) sowie in zellfreiem PMNL-S100 (IC50-Wert 0,26 =M) und am gereinigten Enzym (IC50-Wert 0,3 =M). C06 ist selektiv für die 5-LO, da andere arachidonsäurebindende Proteine (PPARs, cPLA2 und 12- und 15-LO) nicht beeinflusst werden. Auch Nager-5-LO (aus der Ratte und der Maus) wird inhibiert mit IC50-Werten im nanomolaren Bereich. Allerdings zeigte sich die Substanz inaktiv in einem menschlichen Vollblutassay in Gegenwart von Serum. C06 scheint nicht an die für die Interaktion der 5-LO mit der Membran verantwortliche C2-ähnliche Domäne der 5-LO zu binden. Ebenso hat der Membranbestandteil Phosphatidylcholin keinen bzw. nur geringen Einfluss auf das inhibitorische Potential von C06. Aktivitätstests mit steigender Substratkonzentration deuten auf einen allosterischen Bindemodus von C06 hin. Diese experimentellen Daten flossen in die Identifizierung des putativen putativen Bindemodus an der 5-LO ein. Hierzu wurde zunächst ein Homologie- Modell der 5-LO unter Verwendung der kürzlich neu veröffentlichten Daten der Röntgenkristallstruktur der Kaninchen-15-LO (PDB-Code: 2p0m [Choi et al., 2008]) erstellt. Durch eine Bindetaschenvorhersage mit dem Programm PocketPicker und einer pseudorezptorbasierten Auswahl der potentiellen Bindetasche mit anschliessendem Liganden-Docking konnten zwei Bindebereiche postuliert werden, beide an einer Oberflächenbindetasche der 5-LO ausserhalb des aktiven Zentrums. .....
In der vorliegenden Dissertation konnte gezeigt werden, dass Hyperforin wichtige Funktionnen von Keratinozyten beeinflusst. Hyperforin triggert die Ausdifferenzierung der epidermalen Zellen und inhibiert gleichzeitig ihre Proliferation. Diese Ergebnisse zeigen die physiologische Relevanz der Hyperforin-vermittelten Effekte, da diese beiden Prozesse in der Haut normalerweise gegenläufig ablaufen. Weiterhin war die von Hyperforin ausgeübte Ausdifferenzierungs-Zunahme und Proliferationshemmung vergleichbar mit den Effekten einer hohen [Ca2+]ex, die in vivo die Funktionen von Keratinozyten steuert. Die Frage, die aus diesen Ergebnissen resultierte, war, über welchen Mechanismus Hyperforin die Effekte in Keratinozyten beeinflusst. Die Untersuchung des Mechanismus der Hyperforin-induzierten Effekte zeigte, dass Hyperforin über die Aktivierung des TRPC6-Kanals einen Calcium-Influx in Keratinozyten bewirkt und resultierend daraus die Ausdifferenzierung von Keratinozyten anregt. Auch hier ergeben sich Parallelen zu der durch hohes [Ca2+]ex -induzierten Ausdifferenzierung, die ebenfalls einen Calcium-Einstrom in Keratinozyten auslöst. Eine Microarray-Analyse von Hyperforin-inkubierten Keratinozyten und anschließende Experimente mit selektiven Inhibitoren zeigte die Beteiligung der PKC/Ras/MEK/ERK-Signalkaskade. Interessanterweise gibt es hier ebenfalls Ähnlichkeiten zwischen Hyperforin und einer hohen [Ca2+]ex, da bekannt ist, dass eine hohe [Ca2+]ex die Ausdifferenzierung zumindest teilweise über diesen Signatransduktions-Weg steuert. Aufgrund der Parallelen zwischen der Hyperforin- und Ca2+-induzierten Ausdifferenzierung und den vermehrten Hinweisen auf die wichtige Rolle von TRPC-Kanälen in Keratinozyten, stellte sich die Frage, ob eine hohe [Ca2+]ex ebenfalls zur Aktivierung von TRPC-Kanälen führt. Tatsächlich konnten wir in dieser Arbeit zeigen, dass Calcium in Keratinozyten mehrere TRPC-Kanäle aktiviert und so einer Erhöhung der [Ca2+]i führt. Hierdurch konnte zum ersten Mal auch die Beteiligung von DAG-aktivierten TRPC-Kanälen an der Ca2+-induzierten Ausdifferenzierung gezeigt werden. Bei der Untersuchung von Psoriasis-Keratinozyten, die eine Hyperproliferation und erniedrigte Ausdifferenzierung in vivo aufweisen, konnte in der vorliegenden Dissertation eine grundlegende Störung des Calcium-Haushaltes festgestellt werden. Dabei zeigten die Psoriasis-Keratinozyten im Vergleich zu gesunden hPKs eine abnorme Antwort auf unterschiedliche Stimuli, die zu einer Erhöhung der [Ca2+]i führen. Sowohl eine hohe [Ca2+]ex, als auch Hyperforin führte zu einem deutlich erniedrigten Calcium-Einstrom in den Keratinozyten der Psoriasis-Patienten. Aus diesen Ergebnissen resultiert die Frage nach den Ursachen dieser Störungen. Da in dieser Arbeit bereits gezeigt werden konnte, dass Hyperforin und eine hohe [Ca2+]ex über TRPC-Kanäle die Ausdifferenzierung in Ketatinozyten beeinflussen, untersuchten wir die Expression von TRPC-Kanälen in Psoriasis-Keratinozyten. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression aller TRPC-Kanäle signifikant erniedrigt war. Vor dem Hintergrund der wichtigen Rolle der TRPC-Kanäle für die Calcium-Homöostase und Ausdifferenzierung von epidermalen Zellen, ist dies durchaus eine denkbare und plausible Erklärung für die Defekte der Psoriasis-Keratinozyten. Weiterhin zeigten unsere Ergebnisse, dass der CaR in Psoriasis-Keratinozyten vermindert exprimiert wird. Da dem CaR eine wichtige Rolle in der Regulation der [Ca2+]i als Antwort auf eine Änderung der [Ca2+]ex zugeschrieben wird, könnte dies eine weitere mögliche Erklärung für die gefundenen Störungen der Psoriasis-Keratinozyten sein.
Strukturelle Analyse des CusCBA-Systems von Escherichia coli Kupfer ist als Kofaktor in vielen Enzymen ein essentielles Spurenelement. Die Aufrechterhaltung der Kupferhomöostase ist für die Zelle enorm wichtig, da es sich um ein redox-aktives Übergangsmetall handelt, das selbst in geringsten Konzentrationen toxisch wirkt. Gewöhnlich ist in der Zelle kein einziges freies Kupferion nachweisbar, da die Zelle redundante Mechanismen für die Detoxifikation von Kupfer besitzt. Ein Mechanismus zur Detoxifikation von Kupfer und Silber in E. coli ist das Cus-System. Es handelt sich um einen vierteiligen Effluxkomplex, der sich aus dem inneren Membranprotein CusA, dem periplasmatischen Membranfusionsprotein CusB und dem TolC ähnlichen äußeren Membranprotein CusC zusammensetzt. Das vierte Protein dieses Systems, CusF, dient im Periplasma als Kupferchaperon. Dieser Komplex ermöglicht das Ausschleusen von Cu(I)- und Ag(I)-Ionen aus dem Cytoplasma über das Periplasma und die äußere Membran in einem einzigen Schritt. In dieser Arbeit sollte die Röntgenstruktur des periplasmatischen Proteins CusB geklärt werden, um anhand struktureller Daten analysieren zu können wie CusA und CusC über CusB miteinander verbunden sind und welche Konformationsänderungen dabei vonstatten gehen. CusB wurde dafür über Ni2+-Chelat-Affinitätschromatographie und Größenausschluss-Chromatographie bis zur Homogenität gereinigt. Das Protein lag in Lösung als Monomer vor. Kristalle von CusB wurden nach der Dampfdiffusionsmethode des hängenden Tropfens hergestellt, wobei Kristalle in nur einem von 500 verschiedenen Ansätzen entstanden sind. Röntgenstreuung wurde bis zu einer Auflösung von 8 Å am ESRF (European Synchrotron Radiation Facility) in Grenoble gemessen. Die Streuung der Kristalle ließ starke Anisotropie und hohe Mosaizität erkennen. Um die Qualität der Kristalle von CusB zu verbessern, wurden Kristalle des Proteins ohne Hexahistidinanhängsel hergestellt. Diese Kristalle zeigten in Röntgenstreuungsexperimenten keine Verbesserung der Auflösung und Qualität. Die Röntgenstrukturen und Analysen durch Protease-Verdau von den zu CusB verwandten Proteinen AcrA und MexA zeigten, dass in diesen die N-Termini und C-Termini unstrukturiert sind. Deswegen wurden zunächst Konstrukte von CusB hergestellt in denen verschieden lange Bereiche des N-Terminus deletiert wurden. Ein Konstrukt von CusB, in dem die ersten 20 Aminosäuren deletiert waren, konnte in 10 von 500 Ansätzen kristallisiert werden. Nach Feinabstimmung der initialen Ansätze wurde für Kristalle dieses Konstrukts eine Auflösung von 5,3 Å am ESRF in Grenoble gemessen. Allerdings wies die Röntgenstreuung ebenfalls ein starke Anisotropie und Mosaizität auf, so dass die Struktur dieses Proteins nicht gelöst werden konnte. Strukturelle Analyse des RNAi-Suppressors B2 des Nodamura Virus: RNAi (RNA-Interferenz) bezeichnet einen sequenzspezifischen RNA-Degradationsprozess, um die Synthese eines Proteins zu verhindern. Zwei RNA-Typen wirken als Auslöser der RNAi: Doppelsträngige RNA dient als Vorläufer von siRNAs (small interfering RNAs), während einzelsträngige RNA mit Stamm-Schleifen-Strukturen als Vorläufer der miRNA (microRNA) dient. SiRNA und miRNA werden durch die Typ III Endonuklease Dicer im Cytoplasma produziert, sind 21-30 Nukleotide lang mit charakteristischen 2-NukleotidÜberhängen am 3’-Ende. Über den Komplex aus Dicer und dem doppelsträngige RNA-bindenden Protein R2D2 werden diese kleinen RNAs an das Protein Argonaute (AGO) abgeben. Dieses baut einen Strang der doppelsträngigen, kleinen RNAs über seine RNAse-Aktivität ab und hält den anderen (Führungs-) Strang gebunden. Daraufhin wird entweder komplementäre mRNA abgebaut oder die Translation komplementärer mRNA verhindert. RNAi dient im Organismus unter anderem der Verteidigung gegen Viren, wobei die Expression viraler Proteine durch RNAi verhindert wird. Durch Koevolution haben Viren allerdings Mechanismen zur Unterdrückung der RNAi in den Wirtszellen entwickelt. Ein RNAi Suppressor ist das Protein B2 des Nodamura Virus (NMV B2). Um Mechanismen und Gemeinsamkeiten der RNAi Suppression durch Viren analysieren zu können, wurde in dieser Arbeit die Röntgenstruktur der RNA bindenden Domäne von NMV B2 gelöst. Hierfür wurde ein Konstrukt (Aminosäuren 1-79) bis zur Homogenität aufgereinigt. Kristalle wurden mit einer Proteinkonzentration von 15 mg/ml mittels der Dampfdiffusions-Methode des hängenden Tropfens hergestellt. Diese wuchsen innerhalb von zwei Tagen als lange Nadeln mit Ausmaßen von 200 x 10 x 10 μm. Bei Messungen am ESRF in Grenoble wurde eine Auflösung bis 2,5 Å erreicht. Das Protein kristallisierte mit einem Dimer pro asymmetrischer Einheit. Die Kristalle wuchsen in der Raumgruppe P212121 mit den Einheitszelldimensionen a = 32.2, b = 56.6, c = 98.6. Die Phase wurde über molekularen Ersatz mit der Struktur des homologen Proteins B2 des Flock House Virus (FHV B2) bestimmt. Die Struktur stellte sich als ein gestrecktes Dimer mit einer Größe von ca. 55 x 10 x 15 Å, bestehend aus drei Alpha-Helices pro Monomer dar. Trotz geringer Sequenzidentität von NMV B2 und FHV B2 zeigten beide Strukturen ein Vier-Helix-Bündel, das von einer sehr kurzen Helix am C-Terminus bedeckt ist. Bei einem Vergleich der RNA-bindenden Aminosäurereste der beiden Strukturen fällt ein hoher Grad an Konservierung auf. Von zehn RNA-interagierenden Resten sind fünf identisch. Die RNA bindenden Reste werden von beiden Monomeren des Dimers beigetragen. So ist wohl mindestens ein Dimer für die RNA-Bindung durch B2 Proteine notwendig.
Die zellfreie Proteinsynthese hat sich in den letzten Jahren zu einem potenten Werkzeug – auch in der Produktion von Membranproteinen – entwickelt. Da keine lebenden Zellen genutzt werden, kann der Prozess der präparativen Membranproteinproduktion vereinfacht und individuell optimiert werden. Im Gegensatz zu konventionellen zellbasierten Expressionssystemen gewährleistet die zellfreie Proteinsynthese die direkte Zugänglichkeit zum Reaktionsort und damit die Möglichkeit der unmittelbaren Kontrolle. Dies ermöglicht eine genaue Anpassung der Reaktionsbedingungen auf das Zielprotein. Die Verbesserung und Entwicklung neuer Modi der zellfreien Membranproteinsynthese war ein Teil der vorliegenden Arbeit. Setzt man dem Zellfrei-System von Außen keine hydrophobe Umgebung zu, so präzipitiert das neu-synthetisierte Membranprotein im Reaktionsmix (P-CF). Interessanter Weise unterscheiden sich diese Präzipitate von den aus der E.coli zellbasierten Proteinproduktion bekannten Einschlußkörperchen, da sie sich teilweise leicht in mildem Detergenz resolubilisieren lassen. Zudem konnte für verschiedene Transportproteine, die aus Präzpitat resolubilisiert und danach in Liposomen rekonstituiert wurden, spezifische Transportaktivität gezeigt werden (z.B. eukaryotische Ionentransporter, Multi-Drug Resistenzproteine von E.coli). Alternativ können die Membranproteine direkt, durch die Zugabe von Detergenzien in den Reaktionsmix, solubilisiert werden (D-CF). Um die einzelnen Expressionsmodi zu optimieren wurden 24 gebräuchliche Detergenzien auf ihre Eigenschaft hin gestestet, strukturell sehr unterschiedliche Membranproteine zu solubilisieren. Die Familie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether hat sich dabei als sehr geeignet erwiesen um das prokaryotische α-helikale Multi-Drug Resistenzprotein EmrE, den bakteriellen vornehmlich aus ß-sheets bestehenden Transporter Tsx und den eukaryotischen G-Protein gekoppelten Vasopressin Rezeptor V2R direkt im D-CF Modus zu solubilisieren. Zudem konnte eine Abhängigkeit der spezifischen Aktivität von Tsx vom verwendeten Expressionsmodus bzw. des verwendeten Detergenz mit Hilfe der Black Lipid Membrane´ Methode gezeigt werden. Die Expression eines repäsentativen Teils von 134 Zielproteinen des inneren Membranproteoms von E.coli wurde in drei verschiedenen Zellfrei-Expressionsmodi getestet. Ein an jedes Zielprotein des Membranroteoms C-terminal fusioniertes GFP diente der Konzentrationsbestimmung im D-CF Expressionsmodus. Die Faltung von GFP ist in Anwesenheit von Detergenz signifikant reduziert. Zunächst wurden alle Zielproteine in einem batch´ System im D-CF Modus im Mikrotiterplatten Maßstab mit Hilfe eines Roboters hergestellt. Die Etablierung einer robotergestützten Plattform, welche das Pipettieren, Inkubieren und Detektieren kombiniert, diente als Grundlage für den Herstellungsprozess des Membranroteoms von E.coli in einem Medium-Durchsatz Verfahren in batch´ Konfiguration. In dieser ersten Stufe des Screens im D-CF Modus konnten 84 Zielproteine (63%) aufgrund der detektierten GFP-Fluoreszens in Mengen von 1 bis 60μg pro mL Reaktion als erfolgreich produziert identifiziert werden. Zudem wurde das Membranproteom in dem effektiveren continous exchange (CE) Verfahren im P-CF, wie auch im D-CF Modus wiederholt exprimiert. Im Vergleich zur batch´ Konfiguration konnten im CE D-CF Modus deutlich mehr Zielproteine (75%) als positiv identifiziert werden. 16 Zielproteine wurden dabei bereits in Expressionsmengen von mehr als 100μg solubilisierte Membranproteinfusion pro mL Reaktionsmix gewonnen. 99 Zielproteine (74%) konnten als positiv identifiziert werden, nachdem die unlösliche Fraktion der CE P-CF Reaktion elektrophoretisch getrennt und angefärbt wurde. Für 66 Kandidaten (49%) stellt das produzierte Protein nach Coomassie-Färbung eine dominante Bande, und damit (semi-)präparative Proteinmengen, dar. Der Erhalt von Detergenz-solubilisierten Membranproteinproben von hoher Qualität ist ein wichtiger Schritt zur Gewinnung struktureller sowie biochemischer Daten. Das E.coli α-helikale Multi- Drug Resistenz Protein SugE konnte im CE P-CF Verfahren in präparativen Mengen von mehr als 2mg Protein pro mL des Reaktionsansatzes gewonnen werden. Durchgeführte analytische Größenausschlusschromatographie zeigte, dass der Transporter unter optimierten Reaktionsbedingungen in einem homogenen, schlanken Peak eluiert. Mittels elektronenmikroskopischer Gefrierbruchanalysen konnte eine effiziente und homogene Rekonstitution von SugE in E.coli Liposomen gezeigt werden. Bindungsstudien unter der Verwendung fluoreszensbasierter Anisotropie-Messungen haben gezeigt dass Proflavin – im Gegenteil zu Ethidium – ein Substrat von SugE ist. YedZ ist ein 24kDa leucinreiches Membranprotein mit sechs putativen Transmembransegmenten und enthält zwei Kofaktoren, ein Häm b und ein Flavin-mononukleotid (FMN). Im P-CF Modus exprimiertes YedZ kann effizient in den Detergenzien LMPG, LPPG, SDS und DPC resolubilisiert werden. Analytische Größenausschlusschromatographie zeigte einen symmetrischen Elutionspeak der apo-Form. Mittels CD-Spektroskopie des gereinigten apo-YedZ in 0.02% DDM wurde ein α-helikaler Sekundärstrukturanteil von 55% ermittelt. Zur Gewinnung von holo-YedZ wurde anstatt Hämb das chemisch verwandte Hemin eingesetzt. Die aufgenommenen UV/Vis Spektren der zellfrei produzierten holo-YedZ Proteinprobe in ihrer oxydierten und reduzierten Form, zeigen zu einer in vivo exprimierten Vergleichsprobe identische Absorptionsmaxima. Für sechs G-Protein gekoppelten Rezeptoren konnte die zellfreie Expression in präparativen Mengen gezeigt werden. Das Steroid-Derivat Digitonin, sowie einzelne Mitglieder der Detergenzfamilie der langkettigen Polyoxyethylen-alkyl Ether, wurden als am geeignetsten für die lösliche Expression der GPCRs im CE D-CF Verfahren ermittelt. Löslich in Anwesenheit von Brij78 produzierter GPCR Proben, zeigten nach Negativfärbung in elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalysen eine homogene Probenpräparation und geben Hinweis auf eine strukturelle Dimerisierug der Rezeptoren. Detergenzsolubilisierte Rezeptoren konnten in Liposomen, basierend auf E.coli Lipid-Mischungen, rekonstituiert werden. Elektronen-mikroskopische Gefrierbruchanalysen zeigten eine homogene Rekonstitution, welche auf eine funktionelle Faltung der Rezeptoren schließen lässt.
NADPH-Oxidasen der Nox-Familie sind eine wichtige Quelle für reaktive Sauerstoffspezies (ROS, reactive oxygen species) in verschiedenen Geweben und Zellen. Die Isoformen der NADPH-Oxidase unterscheiden sich dabei in ihrer physiologischen Funktion: Während Nox1 und Nox2 eher akute, Agonisten-induzierte ROS-Signaltransduktion vermitteln, sind Nox4-abhängig produzierte ROS an chronischen Prozessen wie Differenzierung beteiligt. Die Isoformen der NADPH-Oxidase unterscheiden sich darüber hinaus in ihrer intrazellulären Lokalisation, der Art der Aktivierung und der Spezies der abgegebenen ROS. Nox1 muss durch die Interaktion mit zytosolischen Untereinheiten (NoxA1 und NoxO1) aktiviert werden und produziert dann hauptsächlich Superoxidanionradikale (O2-). Nox4 dagegen ist unabhängig von zytosolischen Untereinheiten und somit konstitutiv aktiv und setzt eher Wasserstoffperoxid (H2O2) in den Extrazellulärraum frei. Zwischen diesen Unterschieden, deren strukturelle Ursachen weitgehend unbekannt sind, und den unterschiedlichen Funktionen von Nox1 und Nox4 besteht wahrscheinlich ein Zusammenhang. In transfizierten HEK293-Zellen konnte zunächst durch Immunofluoreszenz-Mikroskopie und subzelluläre Fraktionierung gezeigt werden, dass Nox1 in der Plasmamembran lokalisiert ist und Nox4 in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) verbleibt. Um die strukturellen Unterschiede zwischen Nox1 und Nox4, die eine Rolle bei der intrazellulären Lokalisation, den Aktivierungsmechanismen und der Art der abgegebenen ROS spielen könnten, zu identifizieren, wurden chimäre Proteine aus Nox1 und Nox4 konstruiert und analysiert. Zunächst konnte gezeigt werden, dass die konstitutive Aktivität von Nox4 durch den zytosolischen Bereich vermittelt wird. Dafür ist allerdings der komplette zytosolische Bereich ab der 6. Transmembrandomäne nötig, chimäre Konstrukte mit einem kürzeren Anteil des zytosolischen Bereichs von Nox4 waren nicht aktiv. Für die Aktivierung von Nox1 dagegen ist der zytosolische Bereich nicht ausreichend, vermutlich spielen weitere Interaktionen mit Bereichen im transmembranen Teil des Proteins ebenfalls eine Rolle. Für die korrekte intrazelluläre Lokalisation benötigen Membranproteine ein N-terminales Signalpeptid. Wenn das vorhergesagte Signalpeptid von Nox1 durch das von Nox4 ausgetauscht wurde, zeigte dieses chimäre Protein keine Plasmamembran-Lokalisation mehr, es war stattdessen in vesikelähnlichen Strukturen unterhalb der Plasmamembran lokalisiert. Das Signalpeptid von Nox1 war nicht dazu in der Lage, Nox4 zur Plasmamembran zu transportieren, das Protein war weiterhin im ER lokalisiert, was darauf hindeutet, dass Nox4 noch weitere Mechanismen besitzt, die seine ER-Lokalisation bedingen. Der Austausch des Signalpeptids von Nox4 gegen das von Nox1 führte dazu, dass das chimäre Protein statt H2O2 O2- produzierte. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass der N-Terminus von Nox4 bei der H2O2-Produktion eine Rolle spielt. Experimente mit Nox1 und Nox4 mit N-terminalem Myc-Tag deuteten darauf hin, dass nur der N-Terminus von Nox1 prozessiert wird, also dass das Signalpeptid während der co-translationalen Translokation abgespalten wird. Ohne Signalpeptid waren sowohl Nox1 als auch Nox4 inaktiv. Die dritte extrazytoplasmatische Schleife von Nox4 enthält 28 zusätzliche Aminosäuren verglichen mit Nox1, die sich auf zwei Bereiche aufteilen. Eine Deletion der Aminosäuren, die nur in Nox4 vorhanden sind, führte dazu, dass das Protein O2- anstelle von H2O2 produzierte, ohne dass die intrazelluläre Lokalisation verändert wurde. Zwei konservierte Cysteine innerhalb der deletierten Bereiche scheinen bei diesem Prozess eine Rolle zu spielen, vermitteln den Effekt aber nicht alleine, da nach Mutation dieser Cysteine die Umkehr der ROS-Produktion nicht ganz so stark war wie bei der Deletion der kompletten Bereiche. In Nox1 sind die Cysteine wahrscheinlich in die Aktivierung des Proteins involviert, da deren Mutation die Aktivität von Nox1 reduzierte. Der N-Terminus und die dritte extrazytoplasmatische Schleife von Nox4 sind somit an einem Prozess beteiligt, der die H2O2-Produktion von Nox4 vermittelt. Die entsprechenden Abschnitte in Nox1 scheinen andere Funktionen zu erfüllen. Das Signalpeptid von Nox1 ist für die korrekte intrazelluläre Lokalisation in der Plasmamembran verantwortlich; die dritte extrazytoplasmatische Schleife ist wahrscheinlich an der Aktivierung des Proteins beteiligt. In dieser Arbeit konnten also strukturelle Unterschiede zwischen Nox1 und Nox4 in verschiedenen Bereichen der Proteine identifiziert werden, die für die unterschiedliche intrazelluläre Lokalisation und die Art der produzierten ROS verantwortlich sind.
Neuropathische Schmerzen werden durch Läsionen im zentralen oder peripheren Nervensystem ausgelöst. Sie treten z.B. bei der diabetischen Polyneuropathie oder nach einem Bandscheibenvorfall auf und sind durch die Symptome Allodynie und Hyperalgesie gekennzeichnet. Bislang lassen sich neuropathische Schmerzen nur unzureichend behandeln, weshalb ein großer Bedarf an neuen, besser wirksamen und verträglicheren Arzneimitteln besteht. Die Voraussetzung für die Entwicklung neuer Arzneimittel ist die Erforschung der molekularen Mechanismen von Neuropathien. Im ersten Projekt dieser Dissertation sollten deshalb mit Hilfe der differenziellen Gelelektrophorese Proteine identifiziert werden, die nach Induktion neuropathischer Schmerzen im Lumbalmark von Ratten reguliert sind. Durch vergleichende Proteomanalyse konnte gezeigt werden, dass 55 Proteine 7 Tage nach Induktion neuropathischer Schmerzen im Lumbalmark der Ratte differenziell exprimiert werden. 54 Proteine zeigten ein verminderte, und ein Protein eine gesteigerte Expression im Modell der „spared nerve injury“ (SNI). Durch massenspektrometrische Analyse der Proteinspots konnten 38 Proteine eindeutig identifiziert werden. Einige dieser Proteine sind möglicherweise an zentralen Sensibilisierungsvorgängen beteiligt und könnten somit als neue Zielmoleküle für die Schmerztherapie fungieren. Die meisten der deregulierten Proteine stehen im Zusammenhang mit dem Energiestoffwechsel und dem zellulären Metabolismus. Aufgrund der verminderten Expression dieser Proteine deutet vieles darauf hin, dass es 7 Tage nach SNI auf spinaler Ebene zu degenerativen Prozessen wie z.B. dem Abbau der Myelinscheide kommt. Mit einer Reihe ausgewählter Proteine wurden zusätzlich Genexpressionsanalysen mittels RT-PCR durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass zahlreiche Proteine, die im DIGE Experiment auf Proteinebene eine reduzierte Expression aufwiesen, schon auf Transkriptionsebene reguliert sind. Einige Gene waren in ihrer mRNA-Expression jedoch nicht verändert, was ein Hinweis darauf ist, dass die beobachteten Regulationen auf translationale bzw. posttranslationale Modifikationen zurückzuführen sind. Eines der Proteine, welches aufgrund der peripheren Nervenläsion eine deutlich geringere spinale Expression zeigte, wurde anhand des Massenspektrums als Latexin identifiziert. Latexin ist ein Inhibitor der Carboxypeptidase A Aktivität und spielt bei der Schmerzweiterleitung und Schmerzverarbeitung eine Rolle. Darüber hinaus wurde der Abbau von Latexin in der Literatur mit der neurodegenerativen Erkrankung Morbus Alzheimer in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Arbeit wurde die periphere und zentrale Expression von Latexin mit Hilfe verschiedener molekularbiologischer Methoden untersucht. Dabei zeigte sich, dass Latexin unter neuropathischen Bedingungen im Lumbalmark sowohl auf Transkriptionsebene, als auch auf Translationsebene signifikant reduziert vorliegt. Zusätzlich wurde mit Hilfe eines Aktivitätsassays nachgewiesen, dass eine verminderte Latexinexpression zu einer signifikanten Erhöhung der Carboxypeptidase-Aktivität führt. Im peripheren Nervensystem konnte im Gegensatz zum zentralen Nervensystem keine Modulation von Latexin beobachtet werden. Um die funktionelle Relevanz von Latexin bei neuropathischen Schmerzen zu charakterisieren, wurden am Ende der Dissertation rekombinante Adenoviren hergestellt, mit deren Hilfe eine spinale Latexinüberexpression erreicht werden sollte. Die dazugehörigen Tierversuche wurden erst nach Abschluss dieser Arbeit durchgeführt. Im Vorfeld dieser Arbeit wurden mit NF-kappaB p50 Knockout-Mäusen mehrere Schmerztests durchgeführt, die gezeigt haben, dass p50 Knockout-Mäuse im Vergleich zu Wildtyp-Tieren signifikant weniger akute und chronische Entzündungsschmerzen hatten. In einem zweiten Projekt sollte deshalb untersucht werden, welche molekularen Mechanismen dem verminderten Schmerzverhalten der Knockout Tiere zugrunde liegen. Anhand von RT-PCR Experimenten konnte gezeigt werden, dass das NF-kappaB abhängige, proinflammatorische Gen COX-2 8 Stunden nach Zymosaninjektion in eine Hinterpfote bei den Wildtyp-Tieren im Lumbalmark signifikant erhöht war, während bei den Knockout-Mäusen keine signifikante Veränderung zu beobachten war. Weiterhin wurden Änderungen der Proteinexpression und der Genexpression im Lumbalmark von NF-kappaB Knockout- und Wildtyp-Tieren mittels 2D-Gelelektrophorese bzw. RNA-Microarray untersucht. Beim Vergleich der Proteinexpressionsmuster zeigten sich bei 5 Proteinen Regulationen infolge der p50 Deletion, während mit Hilfe des RNA-Microarrays 7 differenziell exprimierte Gene identifiziert werden konnten, die auf das Fehlen der p50 Untereinheit zurückzuführen sind. Zusammenfassend lässt sich aus diesen Befunden schlussfolgern, dass die p50 Untereinheit des Transkriptionsfaktors NF-kappaB als Zielmolekül für die Therapie akuter und chronischer Entzündungsschmerzen geeignet sein könnte. Es wird vermutet, dass die p50 Untereinheit von NF-kappaB bei chronischen Entzündungsschmerzen auf zentraler Ebene an einer Aktivierung proinflammatorischer Stimuli beteiligt ist, während p50 bei akuten Schmerzen wahrscheinlich eine konstitutive Rolle spielt.
Channelrhodopsin-2, or ChR2, is a light-gated inward rectifying cation channel. Ever since its first characterisation (Nagel et al., 2003), it has been used extensively in the light-activated control of neural cells in culture as well as in living animals like mice, Caenorhabditis elegans and Drosophila melanagaster. Despite its broad application in the field of neuroscience, little is known about the properties of this ion channel. The aim of this thesis is to elucidate the single channel conductance under different conditions using stationary noise analysis on whole cell recordings of a HEK293 cell line that stably expresses the truncated ChR2 (amino acids 1-315), which behaves identically to the full length protein (Nagel et al., 2003). Stationary noise analysis is based on the fact that the ion channel noise due their opening and closing has a characteristic form of a plateau at low frequency points and a following decrease of power with 1/f² in difference power spectra, which are composed of the difference of fast Fourier transformed (FFT) stationary whole-cell recordings with and without illumination. From the parameters yielded by an approximation of the power spectra with a Lorentzian function the single channel conductance can be estimated. The single channel conductance of ChR2 was determined at -60 mV applied for different cations, yielding values of 91 ± 25 fS (Guanidine+), 42 ± 7 fS (Na+), 61 ± 18 fS (Li+) and 37 ± 14 fS (Methylammonium+). With 200 mM Guanidine+ outside of the cells and measurements between 0 mV and -60 mV applied, it could be shown that the inward rectification is still present on the scale of the single channel. Noise Analysis with concentrations between 40 and 200 mM Guanidine+ showed a saturation of the single channel conductance with high Guanidine+ concentrations with a maximal conduction of 129 ± 9 fS (Michaelis Menten approximation: Km = 82 ± 14 mM). Activation Energies of the rate constants k (2πfc, with fc = corner frequency of the Lorentzian function) and koff (1/τoff, with τoff = closing time of the channel at -60 mV) were determined to be 75 ± 23 kJ/mol and 64 ± 11 kJ/mol, respectively, which are similar to the value determined for the Channelrhodopsin-1 closing times (~60 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The activation energy of the ChR2 single channel conductance was determined to be 21.2 ± 20.8 kJ/mol, which also is similar to the activation energy of the ChR1 current amplitude (20 kJ/mol; Nagel et al., 2002). The amount of active ChR2 channels in the membrane (160,000 or 226 ChR2/μm²) as well as the single channel current (-7.5 ± 0.6 fA) could be determined by variation of the light intensity (0.05 mW mm-2 to 5.3 mW mm-2). In the course of this thesis, the single channel parameters of the ChR2 mutant H134R were also determined. H134R had been previously published as a “gainof- function” mutant (Nagel et al., 2005a). The increased macroscopic current amplitude of H134R could be explained by an increased lifetime of the channel in comparison to the wildtype ChR2. Within the margin of error both single channel conductances in the presence of 200 mM Guanidine+ of the wildtype (91.1 ± 24.9 fS) and the H134R (89.4 ± 30.7 fS) are the same. In the presence of 200 mM Lithium+ values of 60.6 ± 17.8 fS for the wildtype ChR2 and 50.8 ± 9.6 fS for the H134R mutant were determined. This thesis marks the first in depth analysis of the single channel conductance of ChR2. Using stationary noise analysis the single channel conductance of Channelrhodopsin-1 as well as interesting Channelrhodopsin-2 mutants can also be analysed in the future.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion des in der Membran des Endoplasmatischen Retikulum lokalisierten Proteins Gsf2 der Hefe Saccharomyces cerevisiae näher charakterisiert. Gsf2 ist ein 46 kDa großes ER-Transmembran-Protein mit zwei membrandurchspannenden Domänen, wobei C- und N-Terminus cytosolisch orientiert sind. Zudem besitzt Gsf2 C-terminal ein klassisches Dilysin-Motiv. Dies deutet daraufhin, dass Gsf2 über den retrograden Transportweg mittels COPI-Vesikel recycelt wird. Dies impliziert auch einen Transport von Gsf2 über den anterograden Transportweg [COPII]. Bisherige Befunde deuteten darauf hin, dass Gsf2 in das sekretorische System involviert ist. Eine Deletion des GSF2-Gens resultiert in einer Retention der Hexosetransporter Hxt1, Hxt3 und Gal2 im ER. Für die Identifikation von potentiellen Interaktionspartnern von Gsf2 im sekretorischen System wurden Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems [SUS] durchgeführt. Dabei konnten Interaktionen zwischen den Proteinen Sar1, Sec12, Hxt1 und dem Sec61-Translokations-Komplex mit dem vermeintlichen Verpackungschaperon Gsf2 identifiziert werden. Zusätzlich konnte unter Anwendung einer Pull-Down-Analyse die Interaktion zwischen Gsf2 und Hxt1 biochemisch bestätigt werden. Zur Aufklärung von funktionellen Domänen, wurde ein in Gsf2 identifiziertes potentielles ER-Export-Motiv [RR](F)[RR] durch den Austausch durch fünf Alanine modifiziert. Die Veränderung der Aminosäuresequenz [RR](F)[RR] (354-358 AS) in Gsf2 bewirkte einen partiellen Funktionsverlust bei einer restriktiver Temperatur von 37°C. Des Weiteren deuteten mehrere Anhaltspunkte darauf hin, dass Gsf2 mit Hxt1 in COPII Vesikel verpackt wird. Eine Aufreinigung von konstitutiven COPII-Vesikel aus in vivo erwies sich experimentell als nicht durchführbar. Deshalb wurde ein in vitro Ansatz [COPII vesicle budding assay] ausgewählt. Dafür wurden die für die Vesikelbildung benötigten Komponenten aufgereinigt und mit ER-Donormembranen inkubiert. Mittels Western-Blot-Analyse konnte Gsf2 in COPII Vesikeln nachgewiesen werden. Das Vorhandensein eines klassischen Rücktransport-Motivs (KKSN) am C-Terminus von Gsf2 weist zudem daraufhin, dass das Protein über den retrograden Transportweg [COPI] zurück zum ER transportiert wird. Durch die Blockade des retrograden Transportweges mit anschließender Lokalisationsuntersuchungen mittels Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation und Fluoreszenzmikroskopie konnte eine Fehlverteilung von Gsf2 an der Plasmamembran festgestellt werden. Somit wird Gsf2 möglicherweise über den retrograden Transportweg recycelt. Postuliert wird ein Modell bei dem Gsf2 für die Aufkonzentration spezifischer Cargomoleküle [Hxt1] an ER-Exit-Sites zuständig ist und deren Verpackung in COPII Vesikel gewährleistet. Anschließend wird es über den retrograden Transportweg zurück zu ER transportiert.
Das große therapeutische Potential der RNA Interferenz wird dadurch deutlich, dass sich wenige Jahre nach der Entdeckung die ersten potentiellen RNAi Medikamente in den klinischen Teststudien befinden. Jedoch müssen bis zur therapeutischen Anwendung im großen Maße noch einige Hindernisse überwunden werden. Um eine optimale Wirkung der siRNAs gewährleisten zu können müssen folgende Punkte beachtet werden: - Erhöhte Nuclease-Resistenz - Effiziente zelluläre Aufnahme - Keine Off-Target Effekte - in vivo geringe Toxizität Das richtige Design der siRNAs ist somit von enormer Bedeutung. Hierfür bedient man sich verschiedener Modifikationsmöglichkeiten wie z.B. Basenmodifikationen, Modifikationen an der 2´-O-Position sowie am Phosphatrückrat. Im Rahmen der vorliegenden Doktorarbeit ist es gelungen verschiedene Syntheserouten zur Darstellung von Nucleosiden mit kationischen sowie neutralen 2´-O-Modifikationsmotiven zu erarbeiten und zu optimieren. ...
1. Der Abgleich der Genprodukte von PA0119, PA0120 und PA0121 ergab, dass PA0119 68%ige Ähnlichkeit mit dem DctA-Transporter von S. meliloti besitzt. Das Genprodukt PA0120 zeigt eine 46%ige Ähnlichkeit mit dem Transkriptionsregulator LctR von E. coli und trägt konservierte Domänen der GntR- sowie der FCDSuperfamilie. Das Genprodukt PA0121 weist eine 44%ige Ähnlichkeit mit einem hypothetischen Transkriptionsregulator von Streptomyces ambofaciens auf. 2. Es konnte gezeigt werden, dass die drei offenen Leserahmen (ORFs) PA0119, PA0120 und PA0121 von P. aeruginosa in mRNA transkribiert werden und somit Gene sind. In den späten CF-Isolaten M25 und M26 ist deren Transkriptmenge im Vergleich zum frühen CF-Isolat M1 sowie zum Referenzstamm P. aeruginosa PAO1 um das 14fache erhöht. 3. Mit Hilfe von RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass die drei Gene PA0119, PA0120 und PA0121 eine Transkriptionseinheit bilden und somit in einem Operon P0119-PA0121 organisiert sind. Die angrenzenden ORFs PA0118 und PA0122 konnten dieser Transkriptionseinheit nicht zugeordnet werden. 4. Analysen der Promotor-Reportergenfusion führten zu dem Schluss, dass die Strukturgene PA0119, PA0120 und PA0121 des Operons von einer stromaufwärts von PA0119 lokalisierten Promotorsequenz transkribiert werden. Der Promotor liegt ca. 237 bp vor dem Start von PA0119. Darüber hinaus konnte eine FadR-ähnliche Bindestelle in der Promotorregion P119-121 abgeleitet werden. 5. Der Promotor P119-121 zeigt in mit Dicarboxylaten supplementiertem Minimalmedium M9 eine 2-3fach erhöhte Promotoraktivität gegenüber dem mit Glukose supplementierten Minimalmedium M9. In Gegenwart von Dicarboxylaten erfährt der Promotor P119-121 somit eine Induktion bzw. durch Glukose eine Repression. 6. Der Promotor P119-121 wird wachstumsphasenabhängig reguliert. Die Abhängigkeit der Promotoraktivität von RhlI, RhlR und RpoS indiziert eine Quorum Sensingsowie RpoS-abhängige Regulation des Promotors P119-121. 7. Eine mit PA0119 durchgeführte heterologe Komplementation einer DctA-Mutante von S. meliloti führte zu einer partiellen Wiederherstellung der Fähigkeit der DctAMutante, auf den Dicarboxylaten Succinat und Fumarat wachsen zu können. Dieser Befund indiziert zusammen mit den vier konservierten Motiven, die bisher in charakterisierten Dicarboxylat-Transportern gefunden wurden, dass PA0119 potentiell einen Dicarbonsäure-Transporter in P. aeruginosa darstellt. 8. Mutantenstudien mit den generierten Mutanten ΔPA0119Ω, PA0120Ω und ΔPA0121Ω zeigten im Vergleich zum Wildtyp allerdings kein abweichendes Kulturwachstum; weder in den nährstoffreichen Medien ASM und LB noch im Minimalmedium M9, das jeweils mit 40 mM Succinat bzw. Glutamat supplemiert wurde. Dies wurde durch MicroArrayTM-Analysen mit den Biolog-Platten PM1 und PM2 bestätigt. Daraus wird deutlich, dass keine der hier angebotenen C-Quellen (siehe Anhang) ausschließlich von PA0119 transportiert wird. Auch die Verwertung dieser C-Quellen wird nicht durch die in den Mutanten PA0120::Ω und ΔPA0121::Ω ausgeschalteten Genprodukte beeinflusst. 9. In der Biolog-Platte PM10a schien ΔPA0119::Ω gegenüber PAO1 in den Kavitäten C1 (pH5.5, Methionin) und C10 (pH 5.5, Ornithin) eine leicht abweichende Stoffwechselaktivität zu besitzen. Dies indiziert eine mögliche pH-Abhängigkeit des potentiellen PA0119-Transporters. 10. Im Minimalmedium M9, supplemiert mit Glutamat, zeigt die Mutante ΔPA0119::Ω unter unter erhöhten osmotischen Bedingungen gegenüber dem Wildtyp PAO1 eine reduzierte Wachstumsrate. Dies indiziert, dass PA0119 unter erhöhten osmotischen Bedingungen am Transport von Dicarboxylaten, wie Glutamat, in die Zelle beteiligt sein könnte. 11. Biofilmbildung stellt die bevorzugte Wachstumsform von P. aeruginosa in der CF-Lunge dar. Das Genprodukt PA0120 zeigt zudem eine Ähnlichkeit mit dem Regulator LctR, und es wurde gezeigt, dass eine LctR-Mutante von E. coli in ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung beeinträchtigt ist. Die Untersuchung der ΔPA0119::Ω- und der PA0120::Ω-Mutanten zeigt im Vergleich zum Wildtyp im LB-Medium eine Beeinträchtigung in der Anheftung an Mikrotiterplatten. Dies indiziert, dass sowohl der potentielle Transporter PA0119 als auch der potentielle Transkriptionsregulator PA0120 an der Biofilmbildung von P. aeruginosa beteiligt sind. 12. Die Messung der Promotoraktivität in der ΔPA0119::Ω-Mutante zeigt eine Repression des Promotors an. In der PA0120::Ω-Mutante dagegen findet sich eine zweifache Induktion des Promotors vor PA0119-PA0121. Dies Ergebnis wird durch die Ergebnisse der Real-Time-PCR-Analysen untermauert, da in der PA0120::Ω-Mutante signifikant erhöhte Transkriptmengen des PA0119-Gens detektiert wurden. Bei der ΔPA0121::Ω-Mutante liegt die Promotor-Aktivität im Bereich von PAO1. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass das Genprodukt von PA0119 auf den Promotor P119-121 aktivierend wirkt, während das PA0120-Genprodukt die P119-121- Promotoraktivität negativ reguliert. 13. Zur Identifizierung weiterer PA0120-regulierter Gene wurde eine Transkriptomanalyse der PA0120::Ω-Mutante durchgeführt. Diese ergab, dass neben PA0119 vier weitere Gene, und zwar PA0656, PA0810, PA1852 und PA5261, signifikant hoch reguliert wurden. Vermutlich sind diese Genprodukte zusammen mit dem Regulator PA0120 Teile eines regulatorischen Netzwerks zur Anpassung von P. aeruginosa an die CF-Lunge.
Die 4. Fassung der Roten Liste der Brutvögel Deutschlands wurde durch das "Nationale Gremium Rote Liste Vögel" erarbeitet, in dem die wissenschaftlichen Institutionen der Ornithologie und Avifaunistik in Deutschland vertreten sind. Die Rote Liste ersetzt die 3. Fassung aus dem Jahr 2002 (BAUER et al. 2002); sie wurde erstmalig nach dem für alle Tier- und Pflanzenartengruppen sowie den Pilzen in Deutschland entwickelten Kriterienschema (5. LUDWIG et al. 2007) erarbeitet. Somit wird ein direkter Vergleich der Gefährdungssituation zwischen diesen Gruppen ermöglicht. Bestandsgröße, kurzfristiger (25 Jahre) und langfristiger (50-150 Jahre) Bestandstrend sind die wichtigsten Parameter zur Gefahrdungseinstufung der einzelnen Arten. Zusätzlich wurde jeweils die Wirksamkeit von Risikofaktoren artspezifisch identifiziert und berücksichtigt. Alle Einstufungen werden transparent vorgenommen und in der Anhangsliste publiziert. Der Dachverband Deutscher Avifaunisten (DDA) hat zur Erstellung der Datengrundlagen mit Stand 2005 für die Gefahrdungseinstufung ein neues Abfrageschema entwickelt, in dem die relevanten Informationen aus den nationalen Vogelmonitoring-Programmen aufgearbeitet und als Hintergrunddaten für die Einschätzungen von Bestandstrend und -größe auf Landesebene bereitgestellt wurden. Dadurch gewinnen die Einstufungen an Verlässlichkeit und Nachvollziehbarkeit. Der langfristige Trend wurde vom "Nationalen Gremium Rote Liste Vogel" ermittelt. Vor der Einstufung der Brutvogelarten wurde je Art eine Statuszuordnung vorgenommen, von denen nur die regelmäßig brütenden einheimischen Arten den weiteren Weg der Rote Liste-Erstellung durchlaufen. In der Roten Liste 2007 werden insgesamt 260 regelmäßige einheimische Brutvogelarten in Deutschland berücksichtigt, 25 weitere Arten brüteten nur unregelmäßig ('vermehrungsgäste': Status II), zudem wurden 29 Neozoen-Arten ermittelt (Status III), von denen 20 regelmäßig brüten. Dies ergibt zusammen 314 Arten, die höchste Zahl an Brutvogelarten, die je für eine Rote Liste zu Grunde gelegt wurde. Insgesamt befinden sich 110 regelmäßige Brutvogelarten in den Kategorien der Roten Liste 2007 (0 = ausgestorben, 1 = vom Aussterben bedroht, 2 :: stark gefährdet, 3 :: gefährdet und R = extrem selten), das entspricht 42,3 % der Arten, was einer minimal geringeren Gefahrdungsquote gegenüber der Vorgängerliste entspricht. Erfreulich ist, dass mit dem Bruchwasserläufer und dem Steinrötel zwei ehemals in Deutschland ausgestorbene Arten zwischen 2000 und 2005 wieder regelmäßig gebrütet haben. Dem entgegen ist mit der Blauracke eine weitere Art ausgestorben. Schwarzstorch, Wanderfalke, Seeadler und Uhu sind hier erstmals seit der ersten deutschen Roten Liste 1971 nicht mehr aufgeführt - ein Erfolg jahrzehntelanger direkter Schutzmaßnahmen der ehrenamtlichen und amtlichen Vogelschützer und gleichzeitig ein Beweis, dass sich Vogelschutz bei stark gefährdeten Arten lohnen kann. Andererseits sind mit Schreiadler, Zwergseeschwalbe oder Großem Brachvogel Alien in die höchste Gefährdungskategorie eingestuft worden, die zwar auch im Fokus des Vogelschutzes standen und stehen, bei denen aber bislang Maßnahmen nicht ausreichend erfolgreich umgesetzt werden konnten. Gerade die Kategorie "vom Aussterben bedroht" umfasst mit nunmehr 30 Arten den höchsten Wert seit Erscheinen der gesamtdeutschen Roten Liste. Der Analyse der aktuellen deutschen Brutvogelfauna zufolge sind die Boden brütenden Vogelarten, Großinsektenfresser und Langstreckenzieher am stärksten von Gefährdungen betroffen. Vogelgruppen mit einem hohen Anteil gefährdeter Arten sind demzufolge Hühnervögel, Rallen, Limikolen und Würger, während Eulen und Schnäpperverwandte derzeit vergleichsweise wenig gefährdet sind. Zudem erfolgt deutschlandweit ein weiteres Ausdünnen der typischen Vögel in der Normallandschaft, was sich vor allem in den Trendanalysen manifestiert, aber in der Roten Liste noch nicht sehr stark zum Ausdruck kommt. Die Nutzungsintensivierungen von Land- und Forstwirtschaft in jüngster Zeit geben hier großen Anlass zur Sorge in diesen Großlebensräumen. Diese Rote Liste stellt erneut ein kritisches Zeugnis über den Zustand der deutschen Vogelwelt aus. Aufgrund der in jüngster Zeit stark ausgeweiteten Monitoringprogramme wird es in Deutschland zukünftig noch besser möglich sein, die Gefahrdung aufzuzeigen. Um den dauerhaften Rückgang der Vogelbestände zu stoppen oder wenigstens zu verlangsamen, müssen die wirksamen Gefahrdungsfaktoren reduziert und minimiert werden. Dem gezielten Vogelartenschutz stellen sich dabei folgende vordringliche Aufgaben: Erhaltung der offenen Kulturlandschaft, Erhaltung strukturreicher Walder, Erhaltung nährstoffarmer Lebensräume, Sicherung der Schutzgebiete - insbesondere Natura 2000, Stärkung der internationalen Zusammenarbeit im Vogelschutz, Reduktion der Populationsverluste durch Unfälle und menschliche Verfolgung sowie Förderung des vogelkundlichen Nachwuchses.
Von den Canaren waren nur wenige Thysanopteren bekannt. Es ist daher um so mehr zu begrüßen, daß Titschack auf seiner Canaren-Reise im Frühjahre 1931 den Thysanopteren seine besondere Aufmerksamkeit schenkte. Ich freue mich, hervorheben zu können, daß dieses Material nicht nur durch seinen Reichtum an Individuen zu einer besonders exakten Bearbeitung geeignet war, sondern daß Titschack auch selbst das ganze Material in Canadabalsam-Präparate übertragen, dadurch der Zerstörung entrissen und damit das Hamburger Museum um eine prächtige Sammlung tadelloser Präparate bereichert hat. ... Die Ausbeute umfaßt 13 bereits bekannte und 14 für die Wissenschaft neue Arten; nur einige zweifelhafte Stücke wurden hier nicht behandelt. Die bekannten Arten sind 3 Kosmopoliten: Limothrips cerealium Hal., Thrips tabaci Lind. und Haplothrips gowdeyi Frkl. Eine Anzahl - wohl auch der größte Teil der neuen Arten - gehört dem Mediterranen Faunengebiet an, einzelne sind weiter verbreitet. Haplothrips retamae (Enderl.) ist nur von den Canaren bekannt. Ich gehe gleich in die Besprechung bzw. Beschreibung der Arten ein...
Regulation des matrizellulären Proteins SMOC-1 durch Zytokine und Stickoxid in Rattenmesangiumzellen
(2009)
Zytokine stimulieren in Mesangiumzellen die Produktion und die Freisetzung großer Mengen entzündlicher Mediatoren. In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der RAP-PCR („RNA arbitrarily primed polymerase chain reaction“), einer auf mRNA basierenden „Differential display“-Methode, die Effekte von Interleukin-1β (IL-1β) auf das Genexpressionsmuster in glomerulären Rattenmesangiumzellen untersucht. Dabei wurde das matrizelluläre Glykoprotein „Secreted modular calcium-binding protein-1“ (SMOC-1) identifiziert, welches in Mesangiumzellen durch IL-1β herunterreguliert wird. SMOC-1 wird von verschiedenen Zelltypen exprimiert und sezerniert, doch seine biologische Funktion konnte bisher nicht aufgedeckt werden. Weitere Experimente bestätigten, dass die mRNA- und Proteinexpression von SMOC-1 durch proinflammatorische Zytokine, wie IL-1β und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) herunterreguliert wird. Dieser Effekt wird zu einem großen Teil durch die endogene Freisetzung von Stickoxid (NO) aufgrund der Aktivität der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) und der nachfolgenden Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) vermittelt. Außerdem tragen auch reaktive Sauerstoffver-bindungen (ROS), deren Bildung durch die Zytokine verstärkt wird, zur Herunter-regulierung der SMOC-1-Expression bei. Durch In-situ-Hybridisierungsexperimente konnte ferner gezeigt werden, dass die Hemmung der NO-Synthese durch den spezifischen iNOS-Inhibitor L-NIL in einem Rattenmodell der anti-Thy1.1-Glomerulonephritis die SMOC-1-Expression deutlich erhöhte. Dies belegt somit auch in vivo die biologische Relevanz von NO in der Modulierung der SMOC-1-Expression. Die funktionelle Rolle von SMOC-1 in Mesangiumzellen wurde durch die Hemmung der SMOC-1-Expression mit Hilfe einer spezifischen siRNA untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Hemmung von SMOC-1 eine deutliche Inhibierung der mRNA-Expression von „Transforming growth factor β1“ (TGF-β1) sowie dessen Gesamtproteinspiegel zur Folge hat. Auch die Aktivität von TGF-β1 wurde reduziert, wie anhand der verringerten Spiegel an aktivem TGF-β1-Protein und der verringerten mRNA-Expression bekannter TGF-β-regulierter Gene, wie „Connective tissue growth factor“ (CTGF), „Plasminogen activator inhibitor-1“ (PAI-1) und Biglykan gezeigt wurde. Diese Ergebnisse deuten auf eine Rolle von SMOC-1 bei der Modulierung des TGF-β1-Signalwegs hin. Zusammenfassend betrachtet scheint NO die SMOC-1-Expression in der akuten glomerulären Entzündung zu vermindern und dadurch die TGF-β-getriebenen profibrotischen Signalprozesse zu limitieren. Der zweite Aspekt dieser Arbeit befasst sich mit der Rolle von Peroxisomen-Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) in der IL-1β-vermittelten Expression der induzierbaren NO-Synthase. PPARα-Aktivatoren steigern in Mesangiumzellen die IL-1β-induzierte Aktivität der iNOS, während die Hemmung von PPARα durch spezifische Inhibitoren oder siRNA die iNOS-Expression/-Aktivität deutlich reduziert. Die Ergebnisse von Promotor-studien zeigten die essentielle Rolle einer möglichen PPAR-Bindestelle im iNOS-Promotor. IL-1β scheint die Bildung eines endogenen PPAR-Liganden zu induzieren, wodurch die Bindung von PPAR-Proteinkomplexen an das regulatorische DNA-Element im iNOS-Promotor verstärkt und dessen Aktivität gesteigert wird. Daneben scheinen jedoch auch Nebeneffekte der PPAR-Aktivatoren, wie die Freisetzung von ROS, zur synergistischen Wirkung auf die IL-1β-induzierte iNOS-Expression beizutragen. Die Wirkung von dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf entzündliche Prozesse wird seit längerem diskutiert, daher wurden die biologischen Effekte von neu synthetisierten möglichen dualen PPARα/γ-Aktivatoren auf Entzündungsparameter, wie z. B. die iNOS-Expression, in Mesangiumzellen untersucht. Alle untersuchten Aktivatoren steigerten in der Form von Esterverbindungen die IL-1β-induzierte Expression der iNOS sowie der sekretorischen Phospholipase A2 (sPLA2), während die entsprechenden freien Säuren wenig Effekte zeigten. Diese proinflammatorische Wirkung scheint jedoch weniger auf einer Aktivierung des PPAR-Rezeptors zu beruhen als auf der Freisetzung von ROS, die durch die Aktivatoren teilweise deutlich erhöht wurde. Weitere Experimente zur Charakterisierung der PPAR-spezifischen Wirkung der Aktivatoren sowie zur optimalen Wirkkonzentration sind nötig, bevor der Effekt dieser Aktivatoren auf die inflammatorische Genexpression genau bewertet werden kann.
In der vorliegenden Arbeit wurden zehn Substanzen, die im Rahmen des Projekts INTAFERE analytisch in verschiedenen Gewässersystemen des Hessischen Rieds nachgewiesen werden konnten, ökotoxikologisch charakterisiert. Neben der Bestimmung der Akut- und der chronischen Toxizität wurde auch das endokrine Potential mit Hilfe eines rekombinanten Hefe-Assays ermittelt.Die akute Toxizität zeigt zwischen den verschiedenen Substanzen große Differenzen. Die drei Organophosphate TCPP, TBEP und TCEP zeigen selbst bei hohen Konzentrationen keine oder nur sehr geringe Effekte, während 4-NP, 4-t-OP, BPA, TDCPP, AHTN und Terbutryn mit LC50-Werten bis zu 5 mg/l eine höhere Toxizität besitzen.Im Hefe-Assay kann in mehreren Versuchswiederholungen das östrogene Potential von 4-NP (MW: 6,71x10-6 M), 4-t-OP (MW: 7,16x10-6 M) und BPA (MW: 4,88x10-6 M), sowie die antiandrogene Wirkung des Bisphenols (5,29x10-5 M) bestätigt werden. Im Gegensatz dazu können im Yeast Antiestrogen Screen zum ersten Mal Hinweise auf die antiöstrogene Wirkung von TCPP (MW: 6,86x10-5 M), Terbutryn (MW: 3,99x10-5 M), TDCPP (MW: 2,65x10-6 M) und TBP (MW: 2,28x10-5 M) aufgezeigt werden.TBP und TDCPP führen auch in der chronischen Exposition bei Potamopyrgus antipodarum zu einer Reduktion in der Embryonenzahl (mehrfach beobachtete NOEC beider Substanzen: 6,25 mg/kg), ein Effekt, der zunächst nicht von einer toxischen Wirkung unterschieden werden kann. Allerdings scheint sich ein antiöstrogener Wirkmechanismus auf die Schnecken bei den Versuchen zur Mischtoxizität zu bestätigen, da die gleichzeitige Exposition gegenüber BPA und 4-tOP zu einer geringfügigen Aufhebung des Effekts führt. Potamopyrgus reagiert ebenfalls mit einer Reduktion der Embryonenzahl bei der Exposition gegenüber AHTN (mehrfach beobachtete NOEC: 2 mg/kg), zeigt sich aber insensitiv gegenüber der Belastung mit Terbutryn.Die Exposition von Chironomus riparius gegenüber den verschiedenen Substanzen führt bis auf eine Ausnahme zu keinen signifikanten substanzbedingten Beeinträchtigungen. Einzig das s-Triazin Terbutryn verursacht eine hohe Mortalität mit einer NOEC (28 d) von 250 μg/kg. Eine Toxizität auf den Anneliden Lumbriculus variegatus zeigt sich lediglich bei derExposition gegenüber BPA (NOEC: 10 mg/kg; Biomasse, 28 d) und 4-NP (EC10: 6,88 mg/kg; 95% KI: 3,97-11,9; Reproduktion, 28 d). Die durchgeführten Versuche zur Toxizität von Mischungen zeigen eine größere Gefährdung auf als bei Vorliegen der Einzelsubstanzen in Konzentrationen unterhalb ihres Schwellenwertes zu vermuten wäre. Allerdings lassen sich die mit dem Hefe-Assay erzielten Ergebnisse aufgrund großer Variabilitäten zwischen den einzelnen Versuchswiederholungen nicht immer eindeutig mit Hilfe des additiven oder des unabhängigen Modells beschreiben, zeigen dabei jedoch trotzdem ein gegenüber den Einzelsubstanzergebnissen verändertes Risiko auf. Um diesem in der Risikobewertung Rechnung zu tragen, wird ein Verfahrensvorschlag entwickelt, in dem durch zusätzliche Sicherheitsfaktoren für PNECs ein Überschreiten des risikoanzeigenden Werts von 1 des PEC/PNEC-Quotienten einer Mischung verhindert werden kann.
Die oftmals apostrophierten Schwierigkeiten bei der taxonomischen Behandlung der Gattung Hylaeus F. können spätestens seit den genitalmorphologischen Untersuchungen von MEHELY (1935) als prinzipiell bewältigt gelten. Auf die beträchtlichen Unterschiede im Bau des Kopulationsapparates der Männchen hatte bereits E. SAUNDERS (1882a,b) unter Beifügung genauet Zeichnungen hingewiesen. Damit war der Schlüssel zur zuverlässigen Bestimmung dieser kleinen und relativ uniformen Bienen gegeben, aber leider hat in Europa bisher nur ELFVING (1951) versucht, diese Merkmale mit Bestimmungstabellen zu verbinden, wie es etwa in der Neuen Welt längst unumgänglich ist (vgl. z. B. METZ 1911, SNELLING 1966-1970). POPOV (1939) gründete seine subgenerische Einteilung der Gattung auf die Erkenntnisse von MEHELY, und diese hat sich trotz einseitiger Anlage, obwohl nur die 33 berücksichtigt wurden, bis heute weitgehend bewährt. Die Erfahrung lehrt, daß einzelne Insektengruppen erst über geeignete Bestimmungsliteratur auch mehr Bearbeiter finden und einem breiteren, kooperativen Studium zugänglich werden. Im gegenwärtigen Stand bedürfen die Hj/acus vor allem eingehender biologischer Bearbeitung von vielen Seiten. Insbesondere sollte unsere Kenntnis ihrer natürlichen Variation, Bionomie und Verbreitung ergänzt werden, bevor taxonomische Konsequenzen gezogen werden. Das vorliegende Manuskript ist deshalb in erster Linie als Arbeitsmaterial zur Verständigung und Diskussion angelegt und berücksichtigt praktische Erfordernisse, insbesondere die der Determinationspraxis. Trotzdem hat sich daraus gleichwohl von selbst eine Revision der Untergattungen (unter Einbeziehung der ... ) und eine nicht geringe Anzahl systematischer Anmerkungen ergeben. Durch die freundliche Vermittlung von Herrn Dr. KÖNIGSMANN (Berlin) konnte aus dem Nachlaß BLÜTHGENS ein umfangreiches, wenn auch unvollständiges Manuskript mit dem Arbeitstitel "Die mitteleuropäischen Arten der Gattung Prosopis F." mit ausgewertet werden. Für den Druck ist dieser Text, an dem BLÜTHGEN vor und noch neben seiner Vespoiden-Arbeit (1961) schrieb, viel zu breit angelegt. Von seiner Intention dürfte aber viel in die vorliegende Untersuchung eingeflossen sein. Außerdem habe ich seine sorgfältig recherchierte Synonymie weitgehend übernommen. Sie wurde nach Möglichkeit kontrolliert und ergänzt, ohne jedoch Vollständigkeit anzustreben. Die langen Listen von LEcLERcg (I964) und WARNCKE (1972 ) konnten nur insoweit überprüft werden, als es Fragen von akuter nomenklatorischer Relevanz betraf. Der Praktiker benötigt ohnehin zunächst nur die Angaben, die ihm den Anschluß an die (wenige) Spezialliteratur der jüngeren Vergangenheit erlauben. Diese Synonymie ist vollständig. Die Tabellen beziehen sich auf das gesamte Europa von Gibraltar bis zum Ural und schließen die großen Mittelmeerinseln ein; Zypern, wiewohl Kleinasien vorgelagert, wurde zusätzlich aufgenommen, denn die wenigen Formen (meist Endemiten) lassen sich nahtlos anfügen. Die Aufteilung der europäischen geographischen Regionen folgt dem allgemeinen Verständnis: Es werden West-, Ost-, Mittel-, Nord- und Südeuropa unterschieden (Abkürzungen: W, E, C, N, S). SE-Europa bezieht sich insonderheit auf den Balkan und die S-Ukraine. Zoogeographische Grenzen bestehen vor allem zwischen W- und C-Europa, wobei sich die Iberische Halbinsel noch einmal absetzt, sowie zwischen S- und C-Europa mit den Alpen als Barriere. Der Kaukasus gehört nur teilweise zu Europa, er wurde und wird aber gern besammelt und deshalb mit verlangt. In seinem westlichen Teil ist die Fauna noch sehr zentraleuropäisch, im östlichen zeigen sich verstärkt auch klein- und mittelasiatische Arten, die, soweit bekannt, ~inbegriffen wurden. Es sind alle Arten berücksichtigt, die nach meiner Kenntnis bisher für das Gesamtgebiet als gesichert gelten bzw. noch zu erwarten sind. Daß auch weiterhin mit neuen Arten zu rechnen ist, ergaben vorbereitende Studien (DATHE 1977, 1979b). Wenig an Fundangaben und Material lag mir aus dem europäischen Teil der RSFSR (E-Europa) vor. Die Bearbeitung für die europäische UdSSR von OSYCNJUK (1978) stellt erst einen Anfang dar. Von allen verzeichneten Arten werden Abbildungen der Gesichtsmaske und des Kopulationsapparates (...) gegeben. Der Verweis auf eine bestimmte Abbildungsnummer steht in eckigen Klammern. Alle Beschreibungen wurden in standardisierter Form völlig neu angefertigt. Dazu stund das umfangreiche Material des Zoologischen Museums Berlin (ZMB) zur Verfügung, insbesondere die Sammlungen von ALFKEN und BLÜTHGEN.
Die Gattung Aspilota FOERSTER ist als solche verhältnismäßig leicht zu erkennen. Die Bestimmung der Arten hingegen stößt auf ungewöhnliche Schwierigkeiten. Es ist fast sicher, daß erst ein kleiner Teil der existierenden Arten entdeckt ist. Der vorliegende Beitrag hat jedoch nicht das Ziel, neue Arten zu beschreiben, sondern stellt einen ersten Versuch dar, wenigstens den Großteil der schon bekannten Spezies in ein zusammenfassendes taxonomisches System zu bringen.
Nach einer Betrachtung über die Geschichte und den. Stand der Erforschung der 2. Stufe des Mittleren Keupers, des "Schilfsandsteins", wurde der hisher bekannte Fossilinhalt der Stufe überprüft. Die in einer Tonstein-Grube von Eberstadt (Württ.) entdeckte neue, reiche Lamellibranchiaten-Fauna mit 47 sp. ssp. in 17 Gattungen wurde untersucht und beschriehen. Die Fauna ist marin und hat keine Beziehungen mehr zur Fauna der Germanischen Trias, im besonderen zu der verarmten Muschelkalk-Fauna des Lettenkeupers und Unteren Gipskeupers. Die Eberstadter Muschelfauna ist (vielleicht mit einer Ausnahme) nicht von S, aus dem alpinen Karn, eingewandert. Sie muß, als eigenständige Lamellibranchiaten-Fauna des Karn, von N, aus Richtung der heutigen Nordsee, gekommen sein; von dort floß Meerwasser in den Sedimentationsraum der Schilfsandstein-Stufe ein und nach S wieder aus. Einzelne Arten der Muschelfauna nehmen schon rhaetische und liassische Formen vorweg. Die Schilfsandstein-Stufe des süddeutschen Mittelkeupers ist mit ihren Peliten und ihrer autochthonen marinen Fauna als Ablagerung eines weiten, extrem flachen Binnen-Schelfmeeres zu verstehen, in das zusätzlich aus dem kontinentalen Raum im NO Sand eingeschüttet wurde.