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We performed an X-ray crystallographic study of complexes of protein kinase PIM-1 with three inhibitors comprising an adenosine mimetic moiety, a linker, and a peptide-mimetic (d-Arg)6 fragment. Guided by the structural models, simplified chemical structures with a reduced number of polar groups and chiral centers were designed. The developed inhibitors retained low-nanomolar potency and possessed remarkable selectivity toward the PIM kinases. The new inhibitors were derivatized with biotin or fluorescent dye Cy5 and then applied for the detection of PIM kinases in biochemical solutions and in complex biological samples. The sandwich assay utilizing a PIM-2-selective detection antibody featured a low limit of quantification (44 pg of active recombinant PIM-2). Fluorescent probes were efficiently taken up by U2OS cells and showed a high extent of co-localization with PIM-1 fused with a fluorescent protein. Overall, the developed inhibitors and derivatives represent versatile chemical tools for studying PIM function in cellular systems in normal and disease physiology.
Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is a widespread neurotropic virus. Primary infection of HSV-1 in facial epithelium leads to retrograde axonal transport to the central nervous system (CNS) where it establishes latency. Under stressful conditions, the virus reactivates, and new progeny are transported anterogradely to the primary site of infection. During the late stages of neuronal infection, axonal damage can occur, however, the impact of HSV-1 infection on the morphology and functional integrity of neuronal dendrites during the early stages of infection is unknown. We previously demonstrated that acute HSV-1 infection in neuronal cell lines selectively enhances Arc protein expression - a major regulator of long-term synaptic plasticity and memory consolidation, known for being a protein-interaction hub in the postsynaptic dendritic compartment. Thus, HSV-1 induced Arc expression may alter the functionality of infected neurons and negatively impact dendritic spine dynamics. In this study we demonstrated that HSV-1 infection induces structural disassembly and functional deregulation in cultured cortical neurons, an altered glutamate response, Arc accumulation within the somata, and decreased expression of spine scaffolding-like proteins such as PSD-95, Drebrin and CaMKIIβ. However, whether these alterations are specific to the HSV-1 infection mechanism or reflect a secondary neurodegenerative process remains to be determined.
KdpFABC, a high-affinity K+ pump, combines the ion channel KdpA and the P-type ATPase KdpB to secure survival at K+ limitation. Here, we apply a combination of cryo-EM, biochemical assays, and MD simulations to illuminate the mechanisms underlying transport and the coupling to ATP hydrolysis. We show that ions are transported via an intersubunit tunnel through KdpA and KdpB. At the subunit interface, the tunnel is constricted by a phenylalanine, which, by polarized cation-π stacking, controls K+ entry into the canonical substrate binding site (CBS) of KdpB. Within the CBS, ATPase coupling is mediated by the charge distribution between an aspartate and a lysine. Interestingly, individual elements of the ion translocation mechanism of KdpFABC identified here are conserved among a wide variety of P-type ATPases from different families. This leads us to the hypothesis that KdpB might represent an early descendant of a common ancestor of cation pumps.
Im Rahmen dieser kumulativen Dissertation konnte eine Methode mitentwickelt werden, die die Bestimmung der absoluten Konfiguration pharmazeutischer Verbindungen aus Röntgenpulverbeugungsdaten ermöglicht. Die Methode basiert auf der Bildung von Salzen. Die notwendige Herstellung dieser Salze mit Salzbildnern bekannter Konfiguration wurde hinsichtlich einer minimalen Ansatzgröße optimiert und erlaubt ein Arbeiten mit Mengen von unter zehn Mikrogramm. Die Kristallisation konnte sogar direkt in den Kapillaren für die Aufnahme der Pulverdiagramme durchgeführt werden. Die absolute Konfiguration einiger als Testfälle gewählter pharmazeutischer Wirkstoffe konnte auf diese Art erfolgreich bestimmt werden. Dies stellt eine erfolgreiche Erweiterung bisher verfügbarer Methoden dar.
1,1,3,3-Tetraethyl-5-nitroisoindolin (TENI) und 1,1,3,3-Tetraethyl-5-nitroisoindolin-2-oxyl (TENO) sind Zwischenstufen in der Synthese von RNS-Spinlabeln für die EPR-Spektroskopie. Die Kristallstrukturen beider Verbindungen konnten aus Einkristallbeugungsdaten bestimmt werden. TENI hat einen Schmelzpunkt nahe der Raumtemperatur. TENO hat dagegen einen wesentlich höheren Schmelzpunkt, obwohl das Molekül nur ein Sauerstoffatom zusätzlich hat. Die Kristallstruktur liefert die Erklärung für dieses Phänomen: In der Kristallstruktur von TENI findet sich als stärkste intermolekulare Wechselwirkung eine einzelne schwache, sehr lange Wasserstoffbrückenbindung.
6-Amino-2-iminiumyl-4-oxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidin-5-aminiumsulfat, ein Edukt der Synthese von Leukopterin konnte als Hydrat erhalten werden. Die Kristallstruktur dieses Monohydrats konnte problemlos bestimmt werden, ebenso wie die von synthetisiertem 4-Amino-2,6-dimethylpyrimidin.
Natriumethanolat wurde nach einer 180 Jahre alten Vorschrift von Liebig synthetisiert. Wie die Röntgenpulverdiagramme zeigen, bilden sich dabei jedoch Gemische von verschiedenen Phasen. Die Kristallstruktur von reinem NaOEt konnte aus Pulverdaten bestimmt werden. Ebenfalls wurden ein Diethanolsolvat sowie zwei weitere Phasen identifiziert. Vom Diethanolsolvat NaOEt · 2 HOEt konnten Einkristalle hergestellt und die Kristallstruktur aus diesen bestimmt werden. Die Kristallstrukturen von Natrium-n-propanolat (NaOnPr), Natrium-n-butanolat (NaOnBu) und Natrium-n-amylat (NaOnAm) konnten ebenfalls aus Pulverdaten aufgeklärt werden. Sie weisen ein ähnliches Na-O-Gitter wie Natriumethanolat auf, allerdings kristallisieren sie in der Raumgruppe P 4/n m m. Die abweichende Raumgruppe des NaOEt (P -4 21 m) liegt am sterischen Anspruch der Ethylgruppe. Die längeren Alkylgruppen sind hochgradig fehlgeordnet und somit im Mittel zylinderförmig. Die Ethylgruppe dagegen hat einen weniger symmetrischen Raumbedarf. Die Solvate der Alkalialkoholate wurden mit zunehmender Länge der Alkylketten instabiler. Nichtsdestotrotz konnten drei verschiedene Solvate hergestellt werden: NaOnPr · 2 HOnPr, NaOiPr · 5 HOiPr und NaOtAm · HOtAm. Ihre Kristallstrukturen konnten aus Einkristallbeugungsdaten bestimmt werden. In diesen Strukturen zeigen sich sehr unterschiedliche Strukturmotive, die teilweise die mögliche Existenz weiterer Solvatstufen andeuten.
Die industriellen Rotpigmente Pigment Red 52 und Pigment Red 48 wurden im Labor unter verschiedenen Bedingungen synthetisiert. Dabei wurden neben den kommerziell verfügbaren Phasen einige neue Phasen identifiziert. Erstmals konnten Kristallstrukturen von P.R.52 und P.R.48 bestimmt werden. Von Pigment Red 52 konnte ein bisher unbekanntes Mononatriumsalz hergestellt werden. Von diesem Salz konnte ein DMSO-Solvat-Monohydrat kristallisiert werden. Aus erhaltenen Einkristallen konnte die Struktur bestimmt werden. Von Pigment Red 48 konnte ebenfalls ein bisher nicht literaturbekanntes Mononatriumsalz isoliert werden. Von zwei Hydratstufen dieser Verbindung konnten Einkristalle hergestellt und ihre Kristallstrukturen bestimmt werden. Eine weitere Phase wurde als Anhydrat identifiziert. Vom Di-Natriumsalz des P.R.52 sowie von seinem Calciumsalz wurden insgesamt fünf verschiedene Hydratstufen gefunden. Die Kristallstrukturen dieser Hydrate konnten aus Röntgenpulverbeugungsdaten bestimmt werden. Von einer Hydratstufe konnte ebenfalls ein Einkristall erhalten und die Struktur bestätigt werden. Eine Veröffentlichung ist in Vorbereitung.
Die Isomere des Orangepigments Perinon werden nach gemeinsamer Synthese industriell durch Überführung in „Trennsalze“ getrennt. Weder die Molekülkonstitution der Trennsalz-Ionen, noch die chemische Zusammensetzung der Feststoffe, noch deren Kristallstrukturen waren bisher bekannt. Die industrielle Form des „trans-Trennsalzes“ konnte im Labor hergestellt werden. Eine weitere Phase des trans-Perinontrennsalzes konnte hergestellt und identifiziert werden. Durch die nachfolgende Einkristallstrukturanalyse zeigte sich, dass die Trennsalze eine völlig andere Molekülkonstitution haben, als in der Literatur beschrieben war: Statt eines planaren Perinongerüsts enthält das Trennsalz ein verdrehtes Bis(benzimidazolat)naphthalindicarboxylat-tetraanion, dessen Ladung durch Kalium-Kationen kompensiert wird. Das bisher nie als Feststoff beschriebene cis-Perinontrennsalz wurde hergestellt und kristallisiert. Es konnten Einkristalle hergestellt und die Kristallstruktur aus diesen bestimmt werden. Alle Perinontrennsalze enthalten im Kristallgitter eine beträchtliche Anzahl Wasser- und Ethanolmoleküle. Durch Festkörper-NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass das Wasser-Ethanol-Netzwerk stark dynamisch ist. Bei der Hydrolyse der Trennsalze entstehen wieder die ursprünglichen, wasser- und lösungsmittelfreien Perinonpigmente.
Viele Studien konnten nachweisen, dass die Produktion von cGMP eine entscheidende Funktion im nozizeptiven System einnimmt. Hierbei wurde vor allem die cGMP-Produktion über lösliche Guanylatzyklasen untersucht. Welche Rolle die partikulären Guanlyatzyklasen bei der Entstehung von Schmerzen haben ist weitgehend ungeklärt. Die vorliegende Arbeit zeigte, dass die partikuläre Guanylatzyklase NPR2 stark in DRG-Neuronen exprimiert wird und dort mit cGKI-alpha sowie CRP4 colokalisiert ist. Aktiviert wird NPR2 über den Peptidliganden CNP. Hervorzuheben ist, dass CNP nicht in primär afferenten Neuronen, dafür jedoch vermehrt im Dorsalhorn des Rückenmarks gebildet wird. Tierexperimentelle Untersuchungen zeigten, dass SNS-Npr2-/--Mäuse ein verringertes Schmerzverhalten bei thermischer Stimulation aufwiesen. Während sie im Capsaicin-Test keinen Phänotyp zeigten, wiesen sie in Phase II des Formalin-Modells ein signifikant reduziertes Leckverhalten auf. Diese Ergebnisse liefern Hinweise für eine Beteiligung des CNP/NPR2/cGKI Signalwegs an der Detektion von Hitzeschmerz und an der TRPA1-vermittelten Schmerzantwort. Dabei scheint NPR2 eine pronozizeptive Funktion zu besitzen. CRP4 als Zielprotein scheint hingegen eine antinozizeptive Wirkung zu haben. Zudem kann die Hypothese aufgestellt werden, dass CNP über einen retrograden Transport aus dem Rückenmark die Aktivierung von NPR2 auslösen könnte. Zusammengefasst zeigen die Daten dieser Arbeit, dass eine cGMP-abhängige Aktivierung durch NPR2 primär für die Detektion thermischer Reize zuständig ist, während die Literatur Hinweise darauf gibt, dass lösliche Guanylatzyklasen vor allem an inflammatorischen und neuropathischen Prozessen beteiligt sind. Daher scheinen partikuläre und lösliche Guanylatzyklasen unterschiedliche Eigenschaften im nozizeptiven System zu besitzen.
Die Synthese und Charakterisierung von neuartigen metallorganischen Koordinationsverbindungen hat in den vergangenen Jahrzehnten einen wahren Aufschwung erlebt. Aufgrund ihrer außerordentlichen strukturellen Vielfalt eröffnen sich zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten über alle naturwissenschaftlich-technischen Domänen hinweg. Daher besteht ein allgemeines Interesse nicht nur in der Entwicklung neuer Verbindungen und Untersuchungen von Struktur-Eigenschafts-Beziehungen, sondern auch in einer Verbesserung ihrer Darstellungsmethoden.
Diese Dissertation beschäftigt sich mit Koordinationspolymeren und -netzwerken, die aus zweiwertigen 3d-Übergangsmetallhalogeniden (MX2, wie bspw. MnCl2 oder FeBr2) und Pyridin (py) bzw. Pyridinderivaten (CNpy, wie bspw. 3-Cyanopyridin) aufgebaut sind. Die Darstellung der Koordinationsverbindungen erfolgte in erster Linie über gewöhnliche Kristallisationsexperimente in alkoholischer Lösung, bei denen Phasen der Stöchiometrie [MX2(CNpy)4] oder [MX2(CNpy)2]n anfielen. Diese wurden anschließend systematisch erhitzt (“getempert“), was in der Regel zu einer stufenweisen und irreversiblen Abgabe eines Teils der Liganden führte, also bspw. von [MX2(CNpy)2]n zu [MX2(CNpy)1]n. Für diesen sog. „thermischen Abbau“ hat sich die Verwendung eines DTA-TG-Gerätes bewährt. Da die Zielverbindungen als mikrokristalline Pulver anfielen, erfolgte die Bestimmung ihrer Kristallstrukturen auf Basis von Röntgenpulverdaten.
Insgesamt wurden im Rahmen dieser Arbeit 41 neue Phasen synthetisiert und deren Kristallstrukturen aus Röntgenpulverdaten bestimmt. Zusammenfassend ist für die verschiedenen Pyridinderivate folgendes zu konstatieren:
3-Cyanopyridin
Im Falle der MBr2-Serie wurden für M = Mn, Fe, Co und Ni Koordinationsverbindungen der Stöchiometrie [MBr2(3-CNpy)4] erhalten, deren Kristallstrukturen aus diskreten Komplexmolekülen bestehen. Derart ligandenreiche Verbindungen konnten bei keiner der übrigen Serien erhalten werden. Alle Kristallstrukturen der Zusammensetzung [MX2(3-CNpy)2]n zeigen bei M = Mn, Fe, Co, Ni und Cu eine Kettenstruktur, in der die Halogenatome als µ2-Brückenliganden fungieren. Die Ketten weisen eine Fischgrät-Anordnung auf. Im Falle von [ZnX2(3-CNpy)2] werden ausschließlich diskrete Komplexmoleküle beobachtet. In allen Kristallstrukturen der [MCl2(3-CNpy)1]n-Serie liegen Doppelketten mit µ2- und µ3-verbrückenden Cl-Atomen vor. Hingegen weisen die Verbindungen der [MBr2(3-CNpy)1]n-Serie Netzwerkstrukturen auf, in denen, zusätzlich zu µ2-Cl-Atomen, über NCN-Atome gebrückt wird.
3,5-Dicyanopyridin
Aufgrund der umfassenden Erkenntnislage bei [NiCl2(CNpy)x]n und [NiCl(py)x]n- Verbindungen wurde NiCl2 für erste Experimente mit 3,5-Dicyanopyridin als neuem, bifunktionalem Liganden ausgewählt. Erwartungsgemäß führte deren Umsetzung zur Bildung von [NiCl2(3,5-CNpy)2]n, dessen Kristallstruktur das hinlänglich bekannte charakteristische Kettenmotiv aufweist. Thermischer Abbau von [NiCl2(3,5-CNpy)2]n führt indes nicht zur Bildung von [NiCl2(3,5-CNpy)1]n (bzw. grundsätzlich zu [NiCl2(3,5-CNpy)x<2]n (mit bi- oder gar tridentatem Liganden), sondern unmittelbar zur vollständigen Zersetzung in NiCl2 und 3,5-CNpy. Daher sollten weitere Experimente mit NiBr2 als Edukt durchgeführt werden, da in [NiBr2(CNpy)1]n neben Npy auch NCN an Ni-Atome zu koordinieren vermag, wodurch ja deren Netzwerkstrukturen resultieren.
4-Cyanopyridin
Alle Kristallstrukturen der Zusammensetzung [MX2(4-CNpy)2]n zeigen bei M = Mn, Fe, Co, Ni und Cu ebenfalls eine Kettenstruktur, in der die Halogenatome als µ2-Brückenliganden fungieren. Auch in diesen Kristallstrukturen liegt eine Fischgrät-Anordnung der Ketten vor. Im Falle von [ZnX2(4-CNpy)2] werden ausschließlich diskrete Komplexmoleküle beobachtet. In allen Kristallstrukturen der [MX2(4-CNpy)1]n-Serie liegen Netzwerkstrukturen vor, in denen die Metallatome über µ2-Halogenatome und NCN-Atome verbrückt werden. Alle Kristallstrukturen der [MBr2(4-CNpy)1]n-Serie sind charakteristisch fehlgeordnet, da die Orientierung der 4-CNpy-Liganden invertiert wird („Kopf-Schwanz“-Fehlordnung).
Extracts of frankincense, the gum resin of Boswellia species, have been extensively used in traditional folk medicine since ancient times and are still of great interest as promising anti-inflammatory remedies in Western countries. Despite their common therapeutic use and the intensive pharmacological research including studies on active ingredients, modes of action, bioavailability, pharmacokinetics, and clinical efficacy, frankincense preparations are available as nutraceuticals but have not yet approved as a drug on the market. A major issue of commercially available frankincense nutraceuticals is the striking differences in their composition and quality, especially related to the content of boswellic acids (BAs) as active ingredients, mainly due to the use of material from divergent Boswellia species but also because of different work-up and extraction procedures. Here, we assessed three frequently used frankincense-based preparations for their BA content and the interference with prominent pro-inflammatory actions and targets that have been proposed, that is, 5-lipoxygenase and leukotriene formation in human neutrophils, microsomal prostaglandin E2 synthase-1, and inflammatory cytokine secretion in human blood monocytes. Our data reveal striking differences in the pharmacological efficiencies of these preparations in inflammation-related bioassays which obviously correlate with the amounts of BAs they contain. In summary, high-quality frankincense extracts display powerful anti-inflammatory effectiveness against multiple targets which can be traced back to BAs as bioactive ingredients.
Although overexpression and hyperactivity of protein kinases are causative for a wide range of human cancers, protein kinase inhibitors currently approved as cancer drugs address only a limited number of these enzymes. To identify new chemotypes addressing alternative protein kinases, the basic structure of a known PLK1/VEGF-R2 inhibitor class was formally dissected and reassembled. The resulting 7-(2-anilinopyrimidin-4-yl)-1-benzazepin-2-ones were synthesized and proved to be dual inhibitors of Aurora A kinase and VEGF receptor kinases. Crystal structures of two representatives of the new chemotype in complex with Aurora A showed the ligand orientation in the ATP binding pocket and provided the basis for rational structural modifications. Congeners with attached sulfamide substituents retained Aurora A inhibitory activity. In vitro screening of two members of the new kinase inhibitor family against the cancer cell line panel of the National Cancer Institute (NCI) showed antiproliferative activity in the single-digit micromolar concentration range in the majority of the cell lines.
Leukemia patients bearing t(6;11)(q27;q23) translocations can be divided in two subgroups: those with breakpoints in the major breakpoint cluster region of MLL (introns 9–10; associated mainly with AML M1/4/5), and others with breakpoints in the minor breakpoint cluster region (introns 21–23), associated with T-ALL. We cloned all four of the resulting fusion genes (MLL-AF6, AF6-MLL, exMLL-AF6, AF6-shMLL) and subsequently transfected them to generate stable cell culture models. Their molecular function was tested by inducing gene expression for 48 h in a Doxycycline-dependent fashion. Here, we present our results upon differential gene expression (DGE) that were obtained by the “Massive Analyses of cDNA Ends” (MACE-Seq) technology, an established 3′-end based RNA-Seq method. Our results indicate that the PHD/BD domain, present in the AF6-MLL and the exMLL-AF6 fusion protein, is responsible for chromatin activation in a genome-wide fashion. This led to strong deregulation of transcriptional processes involving protein-coding genes, pseudogenes, non-annotated genes, and RNA genes, e.g., LincRNAs and microRNAs, respectively. While cooperation between the MLL-AF6 and AF6-MLL fusion proteins appears to be required for the above-mentioned effects, exMLL-AF6 is able to cause similar effects on its own. The exMLL-AF6/AF6-shMLL co-expressing cell line displayed the induction of a myeloid-specific and a T-cell specific gene signature, which may explain the T-ALL disease phenotype observed in patients with such breakpoints. This again demonstrated that MLL fusion proteins are instructive and allow to study their pathomolecular mechanisms.
Acinetobacter baumannii is a worldwide opportunistic pathogen responsible for nosocomial infections. One of the main factors contributing to multidrug resistance in A. baumannii is the upregulation of various chromosomally encoded or acquired efflux pumps, which expel toxic compounds out of the cells with high efficiency.
The resistance-nodulation-cell division (RND)-type efflux pump gene deletion strains ∆adeAB, ∆adeFG or ∆adeIJ and the major facilitator superfamily (MFS) chloramphenicol efflux pump gene deletion strain ∆craA of A. baumannii ATCC 19606 were created and a differential gene expression study was conducted via RT-qPCR. The expression of efflux pump genes adeB, adeG, adeJ, craA, and the outer membrane protein ompA were examined in the absence and presence of chloramphenicol. No significant up- or downregulation of these genes for any of these deletion strains in comparision to the wild-type strain in absence of the drug chloramphenicol.
In contrast, craA was significantly up-regulated in A. baumannii exposed to chloramphenicol, emphasizing the importance of CraA in chloramphenicol resistance. CraA is widely present in clinical isolates of A. baumannii. It is homologous to the well-studied multiple-drug efflux transporter MdfA from Escherichia coli (61% similarity), but surprisingly reported to be acting as a specific chloramphenicol transporter of A. baumannii (Roca et al., 2009).
The drug susceptibility assay done with A. baumannii ATCC 19606 ΔcraA showed that CraA could confer resistance towards phenicols (chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol), which was in line with the previous report. CraA was heterologously overproduced in E. coli BW25113 ∆emrE∆mdfA and its substrate specificity was determined by drug susceptibility assays and whole cell fluorescent dye uptake experiments. We observed that the substrate specificity of craA overexpressed in E. coli was more diverse and resembling that of the E. coli MdfA homolog. Apart from resistance towards phenicols (chloramphenicol, thiamphenicol, and florfenicol), CraA also confer resistance towards monovalent cationic drugs (benzalkonium, TPP+, and ethidium), long dicationic drugs (dequalinium and chlorhexidine), fluoroquinolones (norfloxacin and ciprofoxacin) and anticancer drugs (mitomycin C). We showed that CraA is a drug/H+ antiporter by ACMA quenching in inverted CraA or CraA variant containing membrane vesicles.
To address the molecular determinants for multidrug binding and transport, 45 mostly single Ala-substitution variants of CraA were created. These include substitution variants for membrane-embedded proton-titratable residues (E38, D46, and E338) and residues predicted to be important for binding and transport of drug, as inferred from docking experiments on basis of a MdfA-derived CraA model. The combined results indicated a high degree of functional similarities between MdfA and CraA. The conserved titratable residues E26 and D34 (E38 and D46 in CraA) are important for transport in both these homologs. The CraA variant E38A is inactive against all tested drugs, but D46A is only inactive for some drugs, suggesting that only E38 is involved in H+-transport.
Another focus of this thesis is the three tetracycline transporters of A. baumannii strain AYE, TetA, TetG and TetA(A). Susceptibility assays involving tetracycline, minocycline, doxycycline and the last-resort antibiotic tigecycline were conducted on E. coli BW25113 ∆emrE∆mdfA overexpressing these transporters. TetA(A) was excluded from further study due to toxicity of the cells caused by protein overexpression. Both TetA and TetG confer resistance against tetracycline, minocycline and doxycycline. Although tigecycline was reported not to be recognized by tetracycline efflux pumps, we surprisingly found that TetA is able to transport tigecycline. The role of TetA in tigecycline efflux in A. baumannii was confirmed by conducting tigecycline susceptibility assays on A. baumannii.
We speculate that TetA embedded in the inner membrane acts in cooperation with RND-type tripartite systems that span the inner and outer membrane to extrude tigecycline from the periplasm across the outer membrane. A. baumannii ATCC 19606 ∆adeAB were indeed sensitive to tigecycline in comparison to wild-type strain. Deletion of adeIJ also leads to sensitivity to tigecycline, but less so compared to the DadeAB phenotype, while A. baumannii ATCC 19606 ∆adeFG did not show any difference compared to wild-type strain in tigecycline susceptibility. Differential gene expression analysis of the RND efflux pumps (adeB, adeG and adeJ) and tetA of A. baumannii strain AYE showed that the expression of tetA expression is significantly upregulated when tigecycline is present in the growth medium.
We conclude that craA encodes a broad-spectrum efflux pump rather than a specific chloramphenicol transporter. In A. baumannii, the synergistic effects with the outer membrane and/or the presence of other transporters could result in the discrepancy observed. Thus, the possibility of CraA in conferring multidrug resistance should not be overlooked, especially when it is up-regulated under antibiotic stress conditions.
Leukemia patients bearing t(6;11)(q27;q23) translocations can be divided in two subgroups: those with breakpoints in the major breakpoint cluster region of MLL (introns 9–10; associated mainly with AML M1/4/5), and others with breakpoints in the minor breakpoint cluster region (introns 21–23), associated with T-ALL. We cloned all four of the resulting fusion genes (MLL-AF6, AF6-MLL, exMLL-AF6, AF6-shMLL) and subsequently transfected them to generate stable cell culture models. Their molecular function was tested by inducing gene expression for 48 h in a Doxycycline-dependent fashion. Here, we present our results upon differential gene expression (DGE) that were obtained by the “Massive Analyses of cDNA Ends” (MACE-Seq) technology, an established 3′-end based RNA-Seq method. Our results indicate that the PHD/BD domain, present in the AF6-MLL and the exMLL-AF6 fusion protein, is responsible for chromatin activation in a genome-wide fashion. This led to strong deregulation of transcriptional processes involving protein-coding genes, pseudogenes, non-annotated genes, and RNA genes, e.g., LincRNAs and microRNAs, respectively. While cooperation between the MLL-AF6 and AF6-MLL fusion proteins appears to be required for the above-mentioned effects, exMLL-AF6 is able to cause similar effects on its own. The exMLL-AF6/AF6-shMLL co-expressing cell line displayed the induction of a myeloid-specific and a T-cell specific gene signature, which may explain the T-ALL disease phenotype observed in patients with such breakpoints. This again demonstrated that MLL fusion proteins are instructive and allow to study their pathomolecular mechanisms.
Resistant microbes are a growing concern. It was estimated that about 33,000 of people die because of the infections caused by multidrug resistant bacteria each year in Europe (ECDC, 2018, https://www.ecdc.europa.eu/). Bacteria can acquire resistance against toxic compounds via different mechanisms and intrinsic active efflux is one of the first mechanisms deployed by bacterial cells. The membrane-localized efflux pumps catalysing this reaction, extract toxic compounds from the interior of the cell and transport these to the outside, thereby maintaining sub-lethal toxin levels in the cytoplasm, periplasm and membranes. Gram-negative three-component efflux pumps, analysed in this study, are composed of an inner membrane protein, a member of the Resistance-Nodulation cell Division (RND) superfamily, an Outer Membrane Factor (OMF) protein and a Membrane Fusion Protein (MFP) that connects the two afore mentioned components into an active efflux pump. The pumps described in this work, AcrAB-TolC and EmrAB-TolC, are drug efflux pumps belonging to the RND and MFS superfamilies, respectively, while CusCBA is an efflux pump that belongs to the RND heavy metal efflux family. Another efflux pump that was used as a model for the design of an in vitro assay for the silver ion transport studies, CopA, belongs to the P-type ATPase superfamily. All pumps analysed in this study are part of the resistance system of Escherichia coli, which is a highly clinically relevant pathogen.
In order to examine the AcrAB-TolC, CopA and CusA efflux pumps, the individual components were separately produced in E. coli, purified to monodispersity and reconstituted in large unilamellar vesicles, LUVs. Means for the optimized production and adequate conditions for efficient reconstitution were presented in this study. The activity of AcrB in LUVs was detected using fluorescence quenching of the dye 8-hydroxy-1,3,6 pyrenetrisulfonate (pyranine), which is incorporated inside the proteoliposomes and is sensitive to the pH changes in its surrounding. The inactive AcrB variant with a substitution in the proton relay network, D407N, showed no activity in proteoliposomes, which correlates with the measurements done in empty liposomes. When AcrA was co-reconstituted with AcrB D407N proteoliposomes it did not restore protein activity. To test the assembly of the AcrAB-TolC pump out of its single components, an in vitro assay was established where the complex assembly was tested with AcrAB- and TolC-containing liposomes. These experiments showed putative AcrAB-TolC formation in the presence or absence of a pump substrate, taurocholate, as well as in the presence of the pump inhibitor, MBX3132. The assembly appeared stable over time and results were invariant in the presence or absence of a pH gradient across the AcrAB-containing membrane.
After determination of the ATPase activity of the P-type ATPase, CopA, in detergent micelles, the protein was reconstituted in LUVs. Quenching of the Ag+-sensitive dye Phen Green SK (PGSK), present on the inside of the CopA-containing proteoliposomes, was observed in presence of ATP and Ag+. Under the same conditions, but in absence of Ag+-ions, quenching was reduced by 80 % after 300 seconds. No PGSK-quenching was observed in control liposomes in the presence of ATP and Ag+. The additional presence of sodium azide led to minimal reduction of the PGSK-quenching as expected since sodium azide is not an inhibitor of P-type ATPases, but the quenching rate was similar to that of the same experimental condition with control liposomes.
The RND superfamily member CusA, as part of the tripartite CusCBA efflux pump, has been proposed to sequester Ag+ or Cu+ from either the cytoplasmic or periplasmic side of the inner membrane. The periplasmic transport of silver ions was implied from an in vitro assay where the quenching of a pH sensitive dye, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine (ACMA), indicates acidification of the lumen of the proteoliposomes containing CusA when an inwardly directed pH was imposed. The same experiment with the CusA D405N variant, which was previously reported to be an inactive variant, also led to ACMA quenching, although at a slightly lower rate. Under application of an inwardly directed pH and a (negative inside), CusA-containing proteoliposomes showed a strong quenching of the incorporated PGSK dye, suggesting strong Ag+ influx.
The Major Facilitator Superfamily-(MFS-) type EmrAB-TolC pump has an analogous structural setup as the RND-type AcrAB-TolC pump. To examine the efflux of one of its substrates, carbonyl - cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), a plate-based susceptibility assay was used. The presence of the EmrAB-TolC pump confers lower susceptibility levels towards CCCP in E. coli, compared to cells not expressing the pump or cells expressing only the MFS component, indicating that EmrAB-TolC extrudes CCCP.
The work done in this study opens up a path towards investigation of drug and metal resistance in vitro. The methodologies to obtain proteoliposomal samples of multicomponent efflux pumps and subsequent measurements of drug/metal ion and H+ fluxes, as well as the determination of pump assembly are crucial for the future research on pump catalysis and transport kinetics. The in vivo drug-plate assays done in this work provide initial insights for future investigations of the drug susceptibility of E. coli expressing the MFS-type tripartite efflux pumps.
Die Funktion nukleärer Rezeptoren (NR) beruht auf einem empfindlichen Zusammenspiel zwischen ihren Domänen, Coregulatoren und Liganden. Die meisten Rezeptoren binden die DNA als Homo- oder Heterodimere und transregulieren die Gentranskription in Folge von Ligandenbindung. Klassische Assay-Systeme, die sich auf die Untersuchung der NR-Funktion oder auf die Charakterisierung von Substanzen richten, bilden nur die Coregulator-Rekrutierung zu isolierten NR-Ligandenbindungsdomänen (LBDs) ab und vernachlässigen dabei die NR:NR-Interaktion. Damit klammern sie die NR:NR-Wechselwirkung aus, obwohl die Rekrutierung von Cofaktoren durch allosterischen Crosstalk mit der Oligomerisierung verbunden ist. Dies war die Motivation dafür, Assay-Systeme zu entwickeln, welche die Untersuchung von NR-Interaktionen,
insbesondere der NR-Dimerisierung, und deren Modulation durch verschiedene Arten von Liganden ermöglichen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wird ein vielfältiges modulares Set von Assays für die Untersuchung der NR-Dimerisierung und NR-Coregulator-Rekrutierung vorgestellt und deren Anwendbarkeit auf eine Vielzahl von NRs demonstriert. Die Verwendung einer
rekrutierungsunfähigen RXRα-Variante mit einer mutierten AF-2-Domäne ermöglichte den spezifischen Nachweis der Coaktivatorrekrutierung durch PPARγ im Kontext des Heterodimers mit seinem obligatorischen Dimerpartner RXRα. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der RXRα LBD mit ihrem Agonisten SR11237 zu einer Destabilisierung des RXRα-Homodimers, aber zu einer Förderung der Bildung des Heterodimers mit der PPARγ LBD führte.
Ein zentrales Ergebnis war das Phänomen, dass der Einbau von PPARγ in das Heterodimer zu einem erheblichen Anstieg an Affinität gegenüber Coaktivatoren führt, auch in Abwesenheit von Liganden. Somit fördert die RXRα-Aktivierung die Coaktivator-Rekrutierung von PPARγ indirekt durch eine Verschiebung der Oligomerisierungspräferenz von RXRα in Richtung des Heterodimers. Zusätzlich wurde die Wirkung von Tetrac, einem nicht-klassischen Schilddrüsenhormon, auf PPARγ und RXRα untersucht und dessen Aktivierungsvermögen gegenüber beiden Rezeptoren mit einer deutlich vervielfachten Wirkung auf das Heterodimer demonstriert. Mit Hilfe des neu etablierten Cofaktor-Rekrutierungsscreens konnte die Dynamik
zwischen dem Nurr1 NR und 29 kanonischen Coregulatoren, von denen einige ligandenabhängig hohe Affinitäten zum Rezeptor aufwiesen, beleuchtet werden. Diese Interaktionen wurden
bidirektional durch eine Reihe von strukturell unterschiedlichen nicht-steroidalen Antirheumatika moduliert, die auch die Affinitäten sowohl des Nurr1-Homodimers als auch des Heterodimers mit der RXRα LBD beeinflussen konnten. Die Nurr1-Dimere zeigten zudem auch eine hohe Empfindlichkeit gegenüber dem Endocannabinoid Anandamid. Zusätzlich zu PPARγ, RXRα und Nurr1 wurden erste Schritte zur Untersuchung der TLX NR-Funktion unternommen. Unter Anwendung der entwickelten Assays konnte die Heterodimerbildung der TLX und der RXRα LBD
beschrieben und die ligandenabhängige Rekrutierung des Corepressors SMRT beobachtet werden.
Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit einen Satz von Werkzeugen für die Untersuchung von ligandenabhängiger NR-Coregulator-Interaktion und Oligomerisierung. Auf diese Weise trug sie zu einer umfassenderen Identifizierung und Charakterisierung von NR-Liganden bei und stellt eine valide Basis für die weitere Assayentwicklung und Ligandendesign dar.
The deubiquitinase USP32 regulates non-proteolytic ubiquitination in the endosomal-lysosomal system
(2021)
The regulation of essential cellular processes requires tightly controlled and directed transport of proteins and membranes. The highly dynamic endosomal and lysosomal system forms the key network for exchange and trafficking of molecules with its early endosomes, recycling endosomes, late endosomes, lysosomes, and additionally autophagosomes.
In this system, the small GTPase Rab7 has an essential role at the late endosomal stage regulating vesicle transport, tethering, and fusion, and retromer mediated receptor recycling back to the trans-Golgi network (TGN). Thus, Rab7 is also important for autophagosomes and lysosomes.
Lysosomes do not only represent the end point of the degradation pathway with several feeder pathways. But these organelles are also a dynamic signaling hub for a variety of metabolic processes. The ever-important regulator of cellular biosynthetic pathways mTORC1 dynamically associates with lysosomes where it is activated. mTORC1 activation is a complex multi-step process where a series of signaling events converge in dependence of amino acid levels thereby enabling interactions between the lysosomal v-ATPase, Ragulator complex (consisting of LAMTOR1-5), and Rag GTPases.
Ubiquitin signals are involved in almost all cellular processes. With this, their regulatory mechanism is also described for the endosomal-lysosomal system as well as mTORC1 signaling. Deubiquitinases (DUBs) release conjugated ubiquitin from proteins and thereby maintain the dynamic state of the cellular ubiquitinome.
The ubiquitin-specific protease 32 (USP32) is a poorly characterized DUB with only emerging cellular function. However, its predicted domain structure includes two unique domains within the entire DUB family. It has been linked to the development of breast cancer and small cell lung cancer. Furthermore, overexpressed GFP-USP32 was localized at the TGN, and a global mass spectrometry-based DUB interactome study suggested an interaction with the retromer complex. Based on these data, USP32 was a very interesting candidate to study its cellular function in this PhD project.
To investigate the function without disease background, a polyclonal USP32 knockout (USP32KO) RPE1 cell line was generated using the CRISPR/Cas9 technology. First experiments revealed different protein expression levels in various cell lines, and a subcellular localization of USP32 at membranes of the Golgi and lysosomal compartments. In a subsequent SILAC-based ubiquitinome analysis potential substrates of USP32 were identified. Interestingly, various proteins of the endosomal-lysosomal system were detected with enriched non-proteolytic ubiquitination upon USP32 depletion.
The further characterization of Rab7 as USP32 substrate confirmed the USP32-sensitive ubiquitination of Rab7 at lysine (K) residues 191 and 194. The ubiquitination in USP32KO cells did not change the subcellular localization of Rab7, but enhanced the interaction with the effector protein RILP. This implied that Rab7 was either more active or RILP had higher affinity to ubiquitinated Rab7. The subsequent results verified this theory. The retromer mediated recycling of CI-M6PR back to the TGN was faster or more efficient in USP32-depleted cells.
Accompanying this, levels of hydrolases were enriched in lysosomes isolated from USP32KO cells. Notably, USP32 had no direct effect on expression level or assembly of the retromer complex itself.
The observed lysosomal phenotypes connected another identified substrate to the function of USP32 in the endosomal-lysosomal system: LAMTOR1. LAMTOR1 is a component of the Ragulator complex and thus involved in the activation of mTORC1 at the lysosomal surface. Similar as for Rab7, the first experiments to characterize LAMTOR1 as USP32 substrate confirmed the USP32-sensitive ubiquitination at K20 independent of amino acid availability. However, ubiquitination of LAMTOR1 decreased its lysosomal localization in untreated and amino acid starved USP32KO cells. The following label-free interactome study detected a reduced interaction of LAMTOR1 and subunits of the lysosomal v-ATPase upon loss of USP32. This resulted in a shifted subcellular localization of mTOR (subunit of mTORC1) away from lysosomes. Furthermore, direct substrates of mTORC1 were less or slower re-phosphorylated after long amino acid starvation and re-activation of mTORC1 in USP32KO cells indicating a reduced mTORC1 activity.
Both USP32-dependent regulations of Rab7 and LAMTOR1/Ragulator converged in enhanced autophagic processes analyzed by increased LC3 levels upon amino acid starvation and USP32 depletion.
In summary, the presented thesis described the diverse role of USP32 in the endosomal and lysosomal system, and contributes to the understanding of novel ubiquitin signals in this context.
RNA ist vor allem als Vermittler von Erbinformationen bekannt. Doch neben der Translation in Proteine ist sie auch maßgeblich an regulatorischen Prozessen in der Zelle beteiligt. So kommen in vielen Organismen Argonautenproteine vor, die zusammen mit microRNA einen Komplex bilden, der in der Lage ist, mRNA zu spalten oder auf andere Weise deren Translation zu unterdrücken. Da die Deregulierung von microRNA bei verschiedenen Krankheiten wie Krebs, Parkinson oder Alzheimer auftritt, wurden in dieser Arbeit Alkylanzien entwickelt, die zur besseren Inhibierung von microRNA beitragen sollen.
Als Alkylierungsmittel wurden ortho-Chinonmethide verwendet, die zunächst in geschützter Form synthetisiert wurden und nach Aktivierung mit einer Nukleobase reagieren können. Für die Erkennung der miRNA-Sequenz wurden diese zu einem Konjugat mit Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) verbunden. Es wurden zwei Arten von Chinonmethid-Präkursoren hergestellt: Mit o Nitrobenzyl photolabil geschützte, die sich mit Licht der Wellenlänge 365 nm aktivieren lassen, und über ein Disulfid geschützte, die mithilfe eines Reduktionsmittels aktiviert werden. Die photolabil geschützten Derivate lassen sich damit gezielt örtlich und zeitlich aktivieren. Vom reduktiv aktivierbaren Präkursor wurden drei Derivate mit sterisch unterschiedlichen Resten am Disulfid (Benzyl-, Isopropyl- oder tert-Butyl-Rest) hergestellt, die einen Einfluss auf die Kinetik der Entschützung haben. Diese Derivate können nach Eintritt in eine Zelle durch die dort vorherrschende hohe Glutathion-Konzentration aktiviert werden, während sie extrazellulär unreaktiv sind.
Zunächst wurde die Kinetik eines photolabil geschützten Konjugats ohne RNA untersucht. Hier kommt es nach Bestrahlung zur Selbstalkylierung, bei der die Nukleobasen der PNA angegriffen werden. Bei 37 °C erfolgte dies mit einer Halbwertszeit von 0.43 h unter Annahme einer Reaktion 1. Ordnung. Die Kinetik der Alkylierung der komplementären RNA ließ sich durch zwei parallel ablaufende Reaktionen 1. Ordnung abbilden. Die Schnelle hatte eine Halbwertszeit von 0.42 h und die Langsame 11 h mit einer Ausbeute von 73 % nach 168 h. Bei Bestrahlung des Konjugats und erst anschließender Zugabe der RNA wurde ebenfalls eine Halbwertszeit von 11 h bei einer einzelnen Reaktionen 1. Ordnung erhalten. Dies lässt sich mit der Reversibilität mancher Reaktionsprodukte erklären. Die schnelle Reaktion entspricht der direkten Reaktion des Chinonmethids mit der RNA, die langsame entsteht durch Umlagerung von reversiblen Addukten.
Die Analyse der RNA-Alkylierung erfolgte mithilfe von denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese, bei der in Abhängigkeit der Gel-Temperatur scheinbar unterschiedliche Kinetiken gemessen wurden. Dies ist ebenfalls eine Folge der Reversibilität. Bei 57 °C kann ein Teil der Bindungen zwischen RNA und den Konjugaten brechen und es wird am Anfang der Reaktion eine geringere Ausbeute gemessen als bei 25 °C Geltemperatur. Die Ausbeute nach 168 h änderte sich jedoch nicht, da im Verlauf der Reaktion die reversiblen Addukte in irreversible umgewandelt werden.
Mit miRNA-20a als Ziel wurden mit einem 10mer Konjugat zunächst nur 13 % Ausbeute nach 72 h und mit einem 15mer Konjugat 41 % nach 75 h erreicht. Durch internen Einbau des Chinonmethid-Präkursors in die PNA, sodass es einem Adenosin der RNA gegenübersteht, konnte die Ausbeute auf 75 % nach 72 h gesteigert werden, da Adenosin bevorzugt alkyliert wird.
Bei den reduktiv aktivierbaren Chinonmethid-Präkursoren waren alle synthetisierten Konjugate in Puffer ohne Glutathion (GSH) stabil. Die Reihenfolge der Reaktionsgeschwindigkeit der Disulfidspaltung war bei 0.5 mM und 10 mM GSH: Benzyl > Isopropyl > tert-Butyl. Die Halbwertszeit bei 10 mM GSH betrug weniger als 5 min (Benzyl-Konjugat) bis 2 h (t Butyl Konjugat). Jedoch bildeten sich mit allen Konjugaten bei 10 mM GSH auch Addukte mit GSH.
Die Reaktivitätsreihenfolge blieb bei der Alkylierung von RNA erhalten. Allein das Benzyl-Konjugat erreichte bei einer GSH-Konzentration von 0.5 mM schon die gleiche Reaktionsgeschwindigkeit wie das photolabil geschützte Chinonmethid. Bei 10 mM GSH erreichten die Derivate zwar nach wenigen Stunden ihre maximale Ausbeute, diese betrug jedoch nur 23 % (tert-Butyl-Konjugat) bis 43 % (Benzyl-Konjugat), da die Chinonmethide auch durch GSH als Nukleophil abgefangen werden.
Mit einem Konjugat, das ein photolabiles Chinonmethid sowie Biotin trägt, wurde ein Fluoreszenzpulldown mit Cy5-markierter RNA durchgeführt. Hier zeigte die bestrahlte Probe eine deutlich höhere Fluoreszenz (6.8x), als eine unbestrahlte Vergleichsprobe. Bei einem Pulldown-Versuch mit miRNA-20a bzw. mit RISCs aus HeLa-Zelllysat konnte das Argonautenprotein jedoch nicht eindeutig mittels Westernblot nachgewiesen werden.
Anhand des reduktiv aktivierbaren Benzyl-Konjugats konnte gezeigt werden, dass sich das Konjugat in Zelllysat zersetzt und nur ein Teil zu Addukten mit Nukleobasen reagiert. Die Ursache wurde in der hydrolyselabilen Abgangsgruppe gesehen, sodass weitere photolabil geschützte Derivate mit Dimethylamino-, Trimethylammonium-, Pivaloylester- und Benzoylestergruppe synthetisiert wurden. Von diesen war nur das Benzoylester-Konjugat in der Lage, RNA mit 72 % Ausbeute nach 48 Stunden zu alkylieren. Zudem war es für mindestens 1 h in Zelllysat stabil.
Polyketides are highly valuable natural products, which are widely used as pharmaceuticals due to their beneficial characteristics, comprising antibacterial, antifungal, immunosuppressive, and antitumor properties, among others. Their biosynthesis is performed by large and complex multiproteins, the polyketide synthases (PKSs). This study solely focuses on the class of type I PKSs, which arrange all their enzymatic domains on one or more polypeptides. Despite their high medical value, little is known about mechanistic details in PKSs.
One central domain is the acyl transferase (AT), which is present in all PKSs and channels small acyl substrates into the enzyme. More precisely, the AT loads the substrates onto the essential acyl carrier protein (ACP), which subsequently shuttles the substrates and all intermediates for condensation and modification to additional domains to build the final polyketide.
Some PKSs use their domains several times during biosynthesis and work iteratively – these are called iterative PKSs. Others feature several sets of domains, each being used only once during biosynthesis – these PKSs are called modular PKSs. All PKSs or PKS modules consist of minimum three essential domains to connect the acyl substrates. Three modifying domains are optional and can enlarge the minimal set. According to the domain composition, the acyl substrate is fully reduced, partly reduced, or not reduced at all. This variation of modifying domains accounts for the huge structural and therefore functional variety of polyketides.
Even though the structure of fatty acids is not exactly reminiscent of polyketides, their biosynthetic pathways are closely related. Fatty acid biosynthesis is carried out by fatty acid synthases (FASs), which share many similarities with PKSs. Both megasynthases feature the same domains, performing the same reactions to connect and modify small acyl substrates. In contrast to PKSs, FASs always contain one full set of modifying domains which is used iteratively, leading to fully reduced fatty acids.
The present thesis extensively analyzes the AT of different PKSs in its substrate selectivity, AT-ACP domain-domain interaction, and enzymatic kinetic properties. The following key findings are revealed through comparison: 1.) ATs of PKSs appear slower than the ones of FASs, which may reflect the different scopes of biosynthetic pathways. Fatty acids as essential compounds in all organisms are needed in high amounts for physiological functions, whereas polyketides as secondary metabolites only require basal concentrations to take effect. 2.) The slower ATs from modular PKSs do not load non-native substrates even in absence of the native substrates. This is different to the faster ATs from iterative PKSs and FASs, which indicates high substrate specificity solely for the ATs from modular PKSs and emphasizes their role as gatekeepers in polyketide synthesis. 3.) The substrate selectivity can emerge in either the first or the second step of the AT-mediated ACP loading and is not assured by a hydrolytic proofreading function.
Moreover, a mutational study on the AT-ACP interaction in the modular PKS 6-deoxyerythronolide B synthase (DEBS) shows that single surface point mutations can influence AT-mediated reactions in a complex manner. Data reveals high enzyme kinetic plasticity of the AT-ACP interaction, which was also recently demonstrated for the interaction in a type II FAS.
Based on these findings, the mammalian FAS is engineered towards a modular PKS-like as- sembly line with the long-term goal to rationally synthesize new products. Basically, three important aspects need to be considered: 1.) AT’s loading needs to be splitted in specific loading of a priming substrate by a priming AT and in specific loading of an elongation substrate by an elongation AT. 2.) FAS-based elongation modules need to be designed with varying domain compositions for introducing functional groups in the product. 3.) Covalent and non-covalent linkers need to be designed for connection of priming and elongation modules.
This study focuses on the first aspect, splitting loading of priming and elongation substrates. An elongation substrate-specific AT is installed in the mammalian FAS via domain swapping. Since ATs from modular PKSs were proven to be substrate specific, these are used to exchange the mammalian FAS AT. This work demonstrates that it is extremely challenging to create stable and functional chimeras, but first essential steps are taken. Proper domain boundaries for AT swapping are established and a stable chimera with 70 % wild type AT activity is created. However, this chimera is only of limited value for application in an elongation module due to the intrinsic slow turnover rate of the wild type AT. Using another PKS AT, a stable elongation module is designed and analyzed in its activity in combination with a priming module. These experiments demonstrate that the loading of priming substrates are successfully suppressed in the elongation module, but nonetheless only minor turnover rates are detected in the assembly line.
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Organ-on-a-chip technology has the potential to accelerate pharmaceutical drug development, improve the clinical translation of basic research, and provide personalized intervention strategies. In the last decade, big pharma has engaged in many academic research cooperations to develop organ-on-a-chip systems for future drug discoveries. Although most organ-on-a-chip systems present proof-of-concept studies, miniaturized organ systems still need to demonstrate translational relevance and predictive power in clinical and pharmaceutical settings. This review explores whether microfluidic technology succeeded in paving the way for developing physiologically relevant human in vitro models for pharmacology and toxicology in biomedical research within the last decade. Individual organ-on-a-chip systems are discussed, focusing on relevant applications and highlighting their ability to tackle current challenges in pharmacological research.
In den letzten 20 Jahren haben sich zunehmend Schülerlabore an Universitäten und Forschungszentren etabliert, um naturwissenschaftliche Kompetenzen von Schülern/innen aufzubauen und zu fördern. Das wachsende Feld der Schülerlaborforschung zeigt allerdings auf, dass die Eingangsvoraussetzungen, mit denen die Schüler/innen an der naturwissenschaftlichen Lernumgebung teilnehmen, einen starken Einfluss auf die Annahme sowie die Entwicklung von interessens-, selbstkonzept- und motivationsbezogenen Persönlichkeitsmerkmalen haben können. Diese Erkenntnisse lenken den Blick auf die Entwicklungsumwelt der Familien, in der die Eltern von Geburt an auf die kindliche Persönlichkeitsentwicklung und Lernprozesse einwirken. Die Integration des vielversprechenden familiären Kontexts in eine naturwissenschaftliche Lernumgebung wird seit 2008 anhand des Eltern-Kind-Projekts KEMIE® an der Ruhr-Universität Bochum umgesetzt, indem Eltern-Kind-Paare gemeinsam an alltagsnahen naturwissenschaftlichen Phänomenen experimentieren. Seit 2016 wird KEMIE® zudem an der Goethe-Universität Frankfurt am Main im Goethe-Schülerlabor Chemie durchgeführt.
Am Beispiel des Frankfurter KEMIE®-Projekts will die vorliegende Arbeit das Potential von Eltern-Kind-Interaktionen für naturwissenschaftliche Lernprozesse untersuchen. Mithilfe der Grounded-Theory-Methodologie wurde das zentrale Forschungsdesiderat der Eltern-Kind-Interaktion über die Projektjahre 2016/17 und 2017/18 herausgestellt sowie mögliche Erhebungsmethoden pilotiert. Im Projektjahr 2018/19 konnte dieses schließlich in einer Mixed-Methods-Studie multiperspektivisch beforscht werden. Dafür wurden Interviews, Beobachtungen und Pre-Posttest-Daten von 46 teilnehmenden Eltern-Kind-Paaren sowie weitere Kontrollgruppendaten von 202 Frankfurter Familien erhoben.
Um zunächst die naturwissenschaftliche Lernumgebung zu beschreiben, wurden die vorherrschenden Einflussfaktoren identifiziert, die zugehörigen Phänomene beschrieben sowie die prozess- und personenbezogenen Verhaltensmuster herausgestellt. Über letztere können die Eltern-Kind-Interaktionen in das SELE-Modell elterlicher Unterstützungsmaßnahmen eingeordnet werden, wobei sich das Ermöglichen von Selbsttätigkeit als herausragendes Merkmal für die naturwissenschaftliche Lernumgebung manifestiert. Zudem zeigt sich, dass das Projekt positive Effekte auf naturwissenschaftsbezogene Werteorientierungen der Kinder sowie deren Interesse an den Naturwissenschaften hat.
Anhand der Entwicklung eines induktiven Beobachtungsschemas, konnten die Familien schließlich über die Verhaltensmerkmale der Eltern-Kind-Interaktion gruppiert und Zusammenhänge zu sowohl den Vorbedingungen als auch den Konsequenzen für die psychischen Dispositionen der Kinder aufgedeckt werden. Erste Erkenntnisse dieser explorativen Erhebung zeigen, dass das akademische Selbstkonzept und die naturwissenschaftsbezogenen Werteorientierungen der Eltern und Kinder die Verhaltensmuster in der naturwissenschaftlichen Umgebung determinieren. Auf der anderen Seite können die Kinder gerade hinsichtlich dieser beiden Faktoren am meisten profitieren. Dabei können diese positiven Effekte auf eine Regulation seitens der Eltern, das gemeinsame Ausführen von Tätigkeiten sowie den Einbezug in die Gestaltung der Lernumgebung zurückgeführt werden.
Osteopontin levels in human milk are related to maternal nutrition and infant health and growth
(2021)
Background: Osteopontin (OPN) is a glycosylated phosphoprotein found in human tissues and body fluids. OPN in breast milk is thought to play a major role in growth and immune system development in early infancy. Here, we investigated maternal factors that may affect concentrations of OPN in breast milk, and the possible associated consequences for the health of neonates. Methods: General characteristics, health status, dietary patterns, and anthropometric measurements of 85 mothers and their babies were recorded antenatally and during postnatal follow-up. Results: The mean concentration of OPN in breast milk was 137.1 ± 56.8 mg/L. Maternal factors including smoking, BMI, birth route, pregnancy weight gain, and energy intake during lactation were associated with OPN levels (p < 0.05). Significant correlations were determined between body weight, length, and head circumference, respectively, and OPN levels after one (r = 0.442, p = < 0.001; r = −0.284, p = < 0.001; r = −0.392, p = < 0.001) and three months (r = 0.501, p = < 0.001; r = −0.450, p = < 0.001; r = −0.498, p = < 0.001) of lactation. A negative relation between fever-related infant hospitalizations from 0–3 months and breast milk OPN levels (r = −0.599, p < 0.001) was identified. Conclusions: OPN concentrations in breast milk differ depending on maternal factors, and these differences can affect the growth and immune system functions of infants. OPN supplementation in infant formula feed may have benefits and should be further investigated.
Pancreatic cancer is a common malignant tumor with a high incidence and mortality rate. The prognosis of patients with pancreatic cancer is considerably poor due to the lack of effective treatment in clinically. Despite numerous studies have revealed that baicalein, a natural product, is responsible for suppressing multiple cancer cells proliferation, motility and invasion. The mechanism by which baicalein restraining pancreatic cancer progression remains unclear. In this study, we firstly verified that baicalein plays a critical role in inhibiting pancreatic tumorigenesis in vitro and in vivo. Then we analyzed the alteration of microRNAs (miRNAs) expression levels in Panc-1 cells incubated with DMSO, 50 and 100 μM baicalein by High-Throughput sequencing. Intriguingly, we observed that 20 and 39 miRNAs were accordingly up- and down-regulated through comparing Panc-1 cells exposed to 100 μM baicalein with the control group. Quantitative PCR analysis confirmed that miR-139-3p was the most up-regulated miRNA after baicalein treatment, while miR-196b-5p was the most down-regulated miRNA. Further studies showed that miR-139-3p induced, miR-196b-5p inhibited the apoptosis of Panc-1 cells via targeting NOB1 and ING5 respectively. In conclusion, we demonstrated that baicalein is a potent inhibitor against pancreatic cancer by modulating the expression of miR-139-3p or miR-196b-5p.