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Die Oberflächenchemie ist mittlerweile in vielen chemischen, biochemischen und anderen Forschungsbereichen präsent und stellt eine interdisziplinäre Forschungsdisziplin dar. Diese Arbeit fokussierte sich auf die Interaktionen von biochemischen Systemen mit Oberflächen, insbesondere auf die Entwicklung von biochemischen Sensoren. Die Optimierung der Sensoroberfläche, insbesondere die Erhöhung der Selektivität durch die Verwendung von Polyglycerol (PG), wurde untersucht. Insgesamt wurden vier Teilprojekte durchgeführt, die sich auf die Unterdrückung unerwünschter Interaktionen, die Einführung von Bioerkennungsstellen, die Stabilisierung von PG-Filmen und die Entwicklung eines leitfähigen Hybridmaterials konzentrierten.
Teilprojekt 1: Stabilisierung von PG-Filmen durch Quervernetzung
Im ersten Abschnitt wurde die Stabilisierung von PG-Filmen durch eine oberflächeninitiierte ringöffnende Polymerisationsreaktion auf SiOx-Substrate realisiert. Dabei wurde die Dicke der Filme (10, 50 und 100 nm) über die Reaktionszeit kontrolliert. Die Quervernetzung erfolgte mit Ethylenglycoldiglycidylether (EGDGE), Divinylsulfon (DVS), Glutaraldehyd (GA), 1,11-Di(mesyl-oxy)-3,6,9-trioxaundecan (TEG-Ms2) und 1,11-Dibrom-3,6,9-trioxaundecan (TEG-Br2). Die Wahl des Quervernetzungsmittels zeigte signifikante Auswirkungen auf die Dicke der Filme und deren Biorepulsivität. Insbesondere die Untersuchungen an PG-EGDGE-Filmen waren vielversprechend, da sie nicht nur Biorepulsivität zeigten, sondern auch eine hohe mechanische Stabilität aufwiesen. Die Erkenntnis, dass dünnere Filme mit einem höheren Elastizitätsmodul gewünscht waren, erforderte eine gezielte Auswahl des Quervernetzungsmittels.
Teilprojekt 2: Einführung einer Bioerkennungsstelle auf einem EGDGE-quervernetzten PG-Film
Im nächsten Abschnitt wurde die Einführung einer Bioerkennungsstelle auf einem EGDGE-quervernetzten PG-Film erforscht. Hierbei kam ein Nitrilotriessigsäure (NTA)-Derivat (NTA4-Cyclen) zum Einsatz, um Histidin (His)-Tag-markierte Proteine selektiv zu binden. Die Modifikation erfolgte durch die Polymerisation von Glycidol auf ein amino-terminiertes Disulfid, gefolgt von einer Quervernetzung mit EGDGE. Die optimierte Synthese des NTA-Derivats ermöglichte nicht nur die erfolgreiche Anbindung von His-markierten Proteinen, sondern auch eine quasi-reversible Anbindung. Diese Erkenntnisse eröffnen neue Möglichkeiten für die Regenerierbarkeit von biochemischen Oberflächen.
Teilprojekt 3: Entwicklung eines leitfähigen und biorepulsiven Hybridmaterials
Das dritte Teilprojekt konzentrierte sich auf die Entwicklung eines leitfähigen und biorepulsiven Hybridmaterials. Ein PG-funktionalisiertes Pyrrol-Derivat (PyPG) wurde elektrochemisch polymerisiert, wodurch Netzwerke aus PG-funktionalisierten Polypyrrol-Strängen (PPG) auf Goldoberflächen entstanden. Die Elektropolymerisation wurde detailliert durch Cyclovoltammetrie (CV) und einer Quarzkristall-Mikrowaage (QCM) charakterisiert. Dabei konnte ein selbstterminierender Mechanismus identifiziert werden, der von der Anwesenheit der verzweigten PG-Gruppen dominiert wird. Mit Hilfe der elektrochemischen Impedanzspektroskopie (EIS) wurde gezeigt, dass dünnere Schichten mit geringerer Schichtdicke hoch leitfähig sind und dass die Veränderungen der Leitfähigkeit tatsächlich nur durch die äußere Oberflächenschicht bestimmt wird. Die Biorepulsivität des Materials wurde durch Proteinadsorptions- und Bakterienadhäsions-Assays nachgewiesen. Der zweite Abschnitt dieses Projekts konzentrierte sich auf die Einführung einer Erkennungsstelle basierend auf Glycosiden, um nicht nur eine Oberflächenbindung, sondern auch eine Quantifizierung von Biomolekülen zu ermöglichen. Die elektrochemische Charakterisierung der Nanoschichtsysteme zeigte eine sehr gute Linearität der Ladungsübertragungsadmittanz (Sct) in Abhängigkeit von der Anbindung der Bakterienstämme. Dies eröffnet Perspektiven für die selektive Quantifizierung von biologischen Analyten mittels elektrochemischer Methoden.
Understanding the functional roles of cells in neuronal circuits and behavior requires the ability to control neuronal activity in an acute and precise way. The field of optogenetics offers a variety of molecular tools to excite or inhibit neurons with light. In the last decade, several strategies have been proposed for reversible silencing of neurotransmission. These tools vary widely in their mechanisms: ranging from opsin-based light-driven ion pumps or anion channels, which are known to hyperpolarize the cell, to alter ionic gradients or cellular biochemistry; over metabotropic receptors, to tools damaging the neurotransmitter release machinery, that allow only long-term silencing as their recovery requires de novo synthesis of targeted proteins. Therefore, the optogenetic toolbox still lacks tools that combine fast activation and fast reversibility with the ability of long-term silencing.
In this study, the optogenetic tool optoSynC (optogenetic synaptic vesicle clustering) was characterized in depth. optoSynC utilizes the light-induced homo-oligomerization of Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) for silencing synaptic transmission via clustering of synaptic vesicles (SVs). CRY2 was targeted to the SV membrane by fusion to the SV transmembrane protein synaptogyrin-1 (SNG-1). The silencing kinetics of optoSynC were determined with analyses of swimming and crawling behavior in Caenorhabditis elegans (C. elegans). Pan-neuronally expressed optoSynC reduced swimming locomotion by 80% within 30 s following photo-stimulation (τon ~7.2 s). Locomotion recovered within 15 min in darkness (τoff ~6.5 min). Analysis of crawling behavior indicated even faster activation within 2 s and an almost complete inhibition of the LITE-1-mediated escape response. This escape response occurs at high blue light intensities and results in an increased velocity, which was not detected after optoSynC activation. However, optoSynC can exert its full effect at significantly lower intensities (25 µW/mm²) and is so light-sensitive that it can even be activated at 1.4 µW/mm². optoSynC could be fully recovered and reactivated at least twice without decreased efficiency. With a combination of pharmacological analysis and optogenetics, it has been demonstrated that optoSynC can inhibit neurotransmitter release for several hours. To realize its full potential, optoSynC should be expressed in an sng-1 mutant background. Expression along with endogenous SNG-1 decreases the effectiveness of optoSynC by 50%. Specific expression of optoSynC in cholinergic or GABAergic neurons could robustly inhibit swimming behavior by 55% and 30%, respectively. Moreover, optoSynC can selectively inhibit individual neurons like the nociceptive neuron pair PVD. When PVD is photoactivated by Chrimson, a red-light activatable channelrhodopsin, forward locomotion increases. Activation of optoSynC reduced this behavior by 50%. Besides my experiments in C. elegans, my cooperation partners Dr. Holger Dill and Yilmaz Arda Ateş demonstrated silencing of neurotransmission with optoSynC in zebrafish, and Dr. Shigeki Watanabe and Brady D. Goulden in murine hippocampal neurons.
The clustering of SVs as the mode of action of optoSynC could be confirmed using transmission electron microscopy. Analysis of micrographs of cholinergic synapses stimulated with and without light revealed that distances of neighboring synaptic vesicles in the cytosol were reduced by around 14% after photoactivation. Distances of docked SVs at the plasma membrane remained unaffected. However, near the dense projection, docked SVs accumulated, while other docked SVs were depleted after optoSynC activation. Activation of optoSynC increased the appearances of SVs and dense core vesicles (DCVs) in micrographs. It is unclear whether sizes became physically larger due to lateral pressure by CRY2 aggregates in the SV membrane or if oligomer formation only altered their appearance in micrographs. optoSynC did not accumulate in the plasma membrane to the extent that abnormal structures at the plasma membrane or dense projection were observed. Recycling of SVs remained unaffected by optoSynC as no unusual number of large vesicles was determined. Therefore, optoSynC inhibits neuronal activity mainly by clustering of cytosolic SVs.
To study the precise sequence and timing of events of vesicle mobilization, it is necessary to introduce known stops in the synaptic vesicle cycle which can be achieved by optoSynC. The C. elegans mutation dyn-1(ts-) is a temperature-sensitive dynamin mutation that blocks the recycling of SVs from the plasma membrane and early endosomes at temperatures exceeding 25 °C. By expressing optoSynC in dyn-1(ts-) animals, a novel assay was established, enabling the transfer of SVs between different stages in the SV cycle. Cluster formation of reserve pool SVs blocks the SV cycle before the process of docking and priming begins, while the SV cycle is blocked after the fusion of SVs at high temperatures. It could be demonstrated that behavior returned 15 min after optoSynC activation while animals without optoSynC remained immobile. Unfortunately, the time scale of the recovery from inhibition by optoSynC is too long to effectively study vesicle mobilization.
In spite of the increasing number of biologics license applications, the development of covalent inhibitors is still a growing field within drug discovery. The successful approval of some covalent protein kinase inhibitors, such as ibrutinib (BTK covalent inhibitor) and dacomitinib (EGFR covalent inhibitor), and the very recent discovery of covalent inhibitors for viral proteases, such as boceprevir, narlaprevir, and nirmatrelvir, represent a new milestone in covalent drug development. Generally, the formation of covalent bonds that target proteins can offer drugs diverse advantages in terms of target selectivity, drug resistance, and administration concentration. The most important factor for covalent inhibitors is the electrophile (warhead), which dictates selectivity, reactivity, and the type of protein binding (i.e., reversible or irreversible) and can be modified/optimized through rational designs. Furthermore, covalent inhibitors are becoming more and more common in proteolysis, targeting chimeras (PROTACs) for degrading proteins, including those that are currently considered to be ‘undruggable’. The aim of this review is to highlight the current state of covalent inhibitor development, including a short historical overview and some examples of applications of PROTAC technologies and treatment of the SARS-CoV-2 virus.
Die Charakterisierung reaktiver Intermediate ist experimentell äußerst anspruchsvoll und häufig nicht eindeutig möglich. Die chemische Fachliteratur ist daher durchzogen von Arbeiten, in denen Intermediate anhand chemischer Intuition oder aufgrund spekulativer Interpretationen experimenteller Daten postuliert werden. Auch wenn es die Chemie wie kaum eine andere wissenschaftliche Disziplin geschafft hat, naturgegebene Zusammenhänge intuitiv erfassbar zu machen und es Chemikern somit möglich ist, mit Zettel und Stift Moleküle mit gewünschten Eigenschaften zu designen und komplexe Reaktionen zu planen, so ist doch davon auszugehen, dass zahlreiche in der Literatur postulierte Intermediate nicht korrekt zugeordnet wurden. Durch die massive Steigerung der Leistungsfähigkeit von Computern und Software in den vergangenen Jahrzehnten lassen sich quantenchemisch immer größere Systeme mit hinreichender Genauigkeit behandeln, sodass es in vielen Fällen möglich ist, experimentelle Untersuchungen theoretisch zu evaluieren und auch experimentell nicht nachweisbare Moleküle detailliert zu untersuchen. Insbesondere durch kombinierte experimentelle und quantenchemische Studien können komplexe chemische Zusammenhänge detailliert verstanden werden. Dadurch lassen sich neue Konzepte entwickeln, die eine Weiterentwicklung chemischer Intuition ermöglichen. Anhand dieses Leitbilds wurde in dieser Arbeit die Stoffklasse der Metallopniktinidene sowie daraus abgeleitete Verbindungen quantenchemisch untersucht.
The impact of 2-desaza-annomontine on processes of inflammation and its resolution in leukocytes
(2024)
This present study investigated the effects of the b-carboline derivative C81, also called 2-desaza-annomontine, on the inflammatory response and resolution processes in vivo and in vitro. The study focused on leukocytes and on the elucidation of the underlying pharmacological mode of action. C81 potently reduced the inflammatory response in an imiquimod-induced psoriasis mouse model and additionally resolved the inflammation more quickly. In a CNV model, C81 significantly decreased the microglial infiltration in the inflamed laser lesion in vivo. In vitro experiments revealed that C81 inhibits the migration of macrophages and leukocyte-endothelial cell interaction by reducing the activation of integrins on leukocytes, in particular LFA-1, without affecting the total protein level on the cell surface.
Further experiments revealed that C81 inhibited the expression of EPAC-1, required for Rap1 activation. Consequently, C81 reduced the LPS/PMA-induced Rap1 activity, which is responsible for integrin activation. Moreover, C81 potently reduced the LPS-induced formation of pro-inflammatory mediators, including cytokines and eicosanoids, in macrophages. The C81-derived inhibition of eicosanoid release was surprisingly potent, probably due to the C81-evoked inhibition of cPLA2 expression, resulting in less liberated arachidonic acid, the precursor for eicosanoids. At the same time, C81 only delayed COX-2 expression, but completely diminished LPS-induced mPGES-1 expression. In addition to the potent anti-inflammatory effects in vitro, C81-derived impact was complemented with promising pro-resolving effects. Hence, C81 significantly induced neutrophil apoptosis without affecting the cell viability of other leukocytes, such as macrophages. Accordingly, the caspase 3 activity in neutrophils increased upon C81 treatment. The underlying mechanism altered by C81 was the expression of the anti-apoptotic mediator Mcl-1, which is required for the survival of neutrophils, but not macrophages. Furthermore, neutrophils treated with C81 were significantly better efferocytosed by macrophages. Analyzes of the pharmacological mode of action of C81 revealed DYRK1B as the key target kinase in inflammatory processes in leukocytes. Of note, experiments with pharmacological inhibition of DYRK1B by C81 or the ‘selective’ DYRK1B inhibitor AZ-DYRK1B-33, could not completely exclude the involvement of the CLKs and other DYRKs. Therefore, DYRK1B knockdown and overexpression experiments were conducted to elucidate the impact of DYRK1B alone. Pharmacological inhibition of DYRK1B and DYRK1B knockdown phenocopied the inhibitory effect of C81 on leukocyte adhesion. In parallel, DYRK1B overexpression mitigated the C81-evoked effect, supporting the hypothesis that C81 inhibits DYRK1B to mediate its effects on leukocytes. Furthermore, DYRK1B inhibition and DYRK1B knockdown resulted in depletion of STAT3 phosphorylation. In addition, C81-evoked STAT3 inhibition was again mitigated by DYRK1B overexpression, suggesting a link or even an interaction between DYRK1B and STAT3. Indeed, direct interaction between DYRK1B and STAT3 was confirmed by a NanoBRET assay. Importantly, in vitro experiments demonstrated, that C81 did not affect LPS recognition mechanisms, investigated by TLR-4 and CD14 expression, and other important inflammatory signaling pathways. Although C81 inhibited the regeneration of IkBa, this had no effect on the translocation of the NFkB subunit p65. Furthermore, C81 did not alter the activation of MAPK pathways, including p38, JNK and ERK. As a result, the focus was on the potent inhibition of LPS-nduced STAT3 activation mediated by DYRK1B, which was shown to be IL-6 independent. Indeed, direct STAT3 inhibition by Stattic phenocopied all tested C81-derived effects on leukocytes, including migration, adhesion, pro-inflammatory cytokine expression, eicosanoid formation and cell type specific induction of neutrophil apoptosis. The underlying mechanisms altered by Stattic in terms of migration/adhesion and lipid mediator formation were the same as for C81. STAT3 inhibition led to decreased EPAC1 expression and accordingly to reduced Rap1 activation. In addition, inhibited STAT3 phosphorylation resulted in reduced cPLA2 expression and also in attenuated mPGES-1 expression.
Finally, the C81-derived depleted Mcl-1 expression was linked to reduced STAT3 inhibition. As C81 abolished STAT3 phosphorylation, less STAT3 was translocated into the nucleus upon LPS stimulation and less STAT3 enrichment at the MCL1 promoter was observed, leading to reduced gene expression and consequently protein levels.
In summary, using the natural product-derived compound C81, the DYRK1B/STAT3 axis was identified as a novel key regulator of inflammatory processes in human leukocytes. This present study revealed that interfering with the DYRK1B-STAT3 signaling can address essential cell functions including leukocyte extravasation, pro-inflammatory mediator release, neutrophil apoptosis and efferocytosis (Figure 1). Furthermore, two different mouse models demonstrated the in vivo relevance of this signaling axis and highlight DYRK1B as an important kinase modulating inflammation and resolution.
K + is the most abundant cytosolic cation in bacteria, and its homeostasis is vital for bacterial survival, playing roles in many essential processes like pH homeostasis, protein synthesis and osmoregulation. When surrounding K + concentrations become very low, bacteria require an active high-affinity uptake system to ensure sufficient cellular K + levels. In many prokaryotes, this system is the K + pump KdpFABC. Peculiarly, KdpFABC forms a functional chimera between a channel-like subunit (KdpA) and a P-type ATPase (KdpB), and for a long time, the mechanism of how transport and ATP hydrolysis between these subunits are coordinated remained unclear. By applying a combination of cryo-EM, biochemical assays, and MD simulations, we have been able to shed light on a unique transport mechanism that combines both the channel and P-type ATPase subunits.
At high K + levels, KdpFABC needs to be inhibited to prevent excessive K + accumulation. This is achieved by a phosphorylation of the serine residue in the TGES 162 motif in the A domain of the pump subunit KdpB, which was shown to stall the complex in the E1P intermediate. Using cryo-EM studies under turnover conditions, we illuminated how stalling in this high-energy intermediate is possible.
Furthermore, we identify a previously uncharacterized atypical serine kinase domain in the sensor histidine kinase KdpD as the responsible kinase for KdpB phosphorylation, giving it a dual role in transcriptional and post-translational regulation of the Kdp system.
Amyloid pathology reduces ELP3 expression and tRNA modifications leading to impaired proteostasis
(2023)
Highlights
• Amyloid pathology impacts the tRNA epitranscriptome.
• Expression of the tRNA modifying enzyme ELP3 is reduced in the brains of Alzheimer's disease (AD) patients.
• Expression levels of ELP3 negatively correlate with amyloid plaque burden in AD.
• ELP3 and ELP3-tRNA dependent modifications are relevant for maintaining neuronal proteostasis.
• ELP3 differential expression and tRNA hypomodification are cellular responses to the accumulation of toxic Aβ forms.
Abstract
Alzheimer's Disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by accumulation of β-amyloid aggregates and loss of proteostasis. Transfer RNA (tRNA) modifications play a crucial role in maintaining proteostasis, but their impact in AD remains unclear. Here, we report that expression of the tRNA modifying enzyme ELP3 is reduced in the brain of AD patients and amyloid mouse models and negatively correlates with amyloid plaque mean density. We further show that SH-SY5Y neuronal cells carrying the amyloidogenic Swedish familial AD mutation (SH-SWE) display reduced ELP3 levels, tRNA hypomodifications and proteostasis impairments when compared to cells not carrying the mutation (SH-WT). Additionally, exposing SH-WT cells to the secretome of SH-SWE cells led to reduced ELP3 expression, wobble uridine tRNA hypomodification, and increased protein aggregation. Importantly, correcting tRNA deficits due to ELP3 reduction reverted proteostasis impairments. These findings suggest that amyloid pathology dysregulates proteostasis by reducing ELP3 expression and tRNA modification levels, and that targeting tRNA modifications may be a potential therapeutic avenue to restore neuronal proteostasis in AD and preserve neuronal function.
Ataxia Telangiectasia (A-T) is a rare monogenetic, autosomal recessive disorder with an incidence of 1 in 40,000-100,000 live births caused by mutations in the ataxia telangiectasia mutated (ATM) gene. The encoded serine/threonine protein kinase (ATM) plays a major role in DNA damage response as well as apoptosis, cell cycle regulation, cell survival, oxidative stress response and genomic stability. Biallelic mutations result in partial or complete loss of ATM expression and/or ATM protein activity. A-T is a disease characterized by progressive cerebellar degeneration, telangiectasia, immunodeficiency (impaired B- and T-cell development), recurrent sinopulmonary infections, radiation sensitivity, premature aging, and a predisposition to cancer. Life expectancy of these patients is highly compromised, with only around 50% expected to reach 20 years of age. Malignancies and pulmonary diseases are the two main causes of death. There is currently no therapy available for A-T patients. There are symptomatic treatments available (e.g. immunoglobulin replacement therapy, therapy with antioxidants, and the administration of growth hormone or glucocorticoids as anti- inflammatory hormones) and in some patients, allogeneic hematopoietic stem cell transplantations from matched donors were performed with improved disease outcome. Unfortunately, suitable donors are not available for most patients. An autologous hematopoietic stem cell (HSC)-directed gene therapy approach is a promising alternative, since no matching donor is needed. The patient’s own cells are used, modified ex-vivo (e.g. delivering a healthy copy of the gene with viral vectors or directly correcting the mutation with gene editing). Afterwards, modified HSCs are given back to the patient thereby repopulating the bone marrow and re-establishing the whole blood system. The aim of this project was to develop a gene transfer tool for Atm.
In the first part of this project, retroviral vectors containing the full-length murine Atm cDNA were generated. Gene transfer of Atm with retroviral vectors is challenging, as the Atm cDNA is 9.1 kb in size reaching the packaging capacity of retroviral vectors. Although the foamy viral vector is described to have superior abilities to transfer large sequences, produced titers of the foamy viral Atm vectors were low and transductions of Atm-deficient fibroblasts were inefficient. In contrast, gene transfer of Atm with gammaretroviral and lentiviral vectors was possible, and because lentiviral vectors harboring the full-length Atm coding sequence were produced with the highest viral titers, this vector was used to transduce Atm-deficient fibroblasts. Following transduction, ATM protein levels were restored (40 - 50% of wild-type level). In addition, transduced cells showed increased levels of phosphorylated ATM downstream substrates (γH2AX, pKap1 and p-p53) after irradiation, demonstrating functional reconstitution. However, efficient transduction of murine lineage marker negative cells, the target cells for an Atm gene therapy approach, was not possible and viability of these cells was highly compromised after transduction.
Therefore, a dual vector system was developed in the second part of the project to circumvent the packaging limit of retroviral vectors. Protein halves were fused with split inteins which catalyze their self-excision followed by the formation of a full-length protein in a process called protein trans-splicing. The split Atm cDNA was delivered with lentiviral vectors and sufficient viral titers were achieved for efficient double transduction of Atm-deficient fibroblasts. Whereas the reconstitution of full-length ATM protein was low in cells transduced with vectors containing Npu split inteins, the use of Rma split inteins showed superior reconstitution. When comparing reconstitution levels with two different split sites within the ATM protein, no major differences were observed. Because a proof of ATM functionality could not be shown with these vector pairs, the F2A site used to co-deliver a marker gene was replaced by an IRES element. After transduction with split intein Atm vectors containing IRES elements, the level of ATM protein reached only 10% of the wild-type level. Nevertheless, an increased amount of pKap1 and p-p53 was detected demonstrating a functional kinase activity of reconstituted ATM protein. Furthermore, a partial repair of cell cycle defects in Atm-deficient fibroblasts was demonstrated.
In parallel to the development of a gene transfer tool for Atm, preliminary experiments were performed in Atm-deficient mice to create optimal transplantation conditions for gene-corrected HSCs that could be performed in the future. Because Atm-deficient mice are highly sensitive to irradiation, conventional conditioning regimes (e.g. total body irradiation or myeloablative conditioning with chemotherapeutics) cannot be used prior to HSC transplantation. Therefore, Atm-deficient mice were pretreated with different conditioning regimens and subsequently received a bone marrow transplantation. Mice that did not receive preconditioning prior to transplantation showed no chimerism in peripheral blood, bone marrow or spleen samples, indicating that preconditioning of mice is required for donor cell engraftment. A non-myeloablative conditioning regimen with cyclophosphamide and immunosuppressive CD4 and CD8 antibodies and the application of a mobilizing agent (Plerixafor) one hour before transplantation showed the highest chimerism in recipient mice. None of the mice developed a thymic tumor, and lymphoid-biased differentiation of the donor cells was observed, as chimerism was highest in T cells in the blood, bone marrow and spleen. In addition, chimerism was higher in lymphoid progenitor cells than in myeloid progenitors. Blood counts (white blood cell and lymphocyte counts) were normal 20 weeks after transplantation (comparable to wild-type mice), making this preconditioning regime suitable for Atm-deficient mice.
Taken together, this data paves the way for using split intein-based lentiviral vectors for Atm delivery in preclinical models and opens new possibilities for developing gene therapy for A-T patients.
SEDDS-loaded mucoadhesive fiber patches for advanced oromucosal delivery of poorly soluble drugs
(2022)
To date, buccal administration of lipophilic drugs is still a major challenge due to their poor solubility in saliva and limited penetration into mucosal tissues. To overcome these limitations, we developed electrospun patches combining the benefits of mucoadhesive fibers and self-emulsifying drug delivery systems (SEDDS).
The fiber system comprises a combination of mucoadhesive thiolated polyacrylic acid fibers and SEDDS-loaded fibers fabricated by parallel electrospinning. The resulting mucoadhesive electrospun SEDDS patches were systemically investigated for fiber characteristics, self-emulsification, mucoadhesion, drug penetration into porcine buccal tissue and biocompatibility.
The patches showed high encapsulation efficiency for SEDDS without causing fiber defects or leakage. SEDDS incorporation enhanced the spinning process and reduced the fiber diameter and fiber size distribution. Hydration-dependent self-emulsification provided a controlled release of curcumin being encapsulated in nano-scaled o/w emulsion for over 3 h. Due to the thiolated polyacrylic acid fibers, the buccal residence time of patches was 200-fold prolonged. Further, they promoted a significantly increased drug penetration into buccal tissue compared to fiber patches without SEDDS. Finally, biocompatibility and improved therapeutic effects of curcumin-loaded patches on human keratinocytes and fibroblasts were confirmed.
Mucoadhesive electrospun SEDDS patches represent a promising approach to overcome current challenges in the oromucosal delivery of lipophilic drugs to unlock their full therapeutic potential.
Highlights
• Self-emulsifying drug delivery systems (SEDDS) were electrospun into polymer fibers patches for oromucosal drug delivery.
• High loading capacity of the fibers with SEDDS was shown (up to 50% of polymer weight).
• 200-fold prolonged buccal patch residence time was achieved by parallel electrospinning of polyacrylic acid thiomer fibers.
• SEDDS-loaded fibers ensured prolonged release of curcumin and led to 1200-fold increase in aqueous solubility.
• In contrast to conventional fiber patches, SEDDS-loaded mucoadhesive fibers enabled deep mucosal penetration of curcumin.
We introduce a platform for the fabrication of customizable wound healing dressing. The platform integrates electrospun nanofibers, bioprinted hydrogels, and cellular spheroids into hierarchical, fiber-reinforced hybrid constructs. The construct leverages the mechanical strength of polycaprolactone (PCL) nanofibers and the ECM-like properties of GelMA/PEGDA hydrogel. These materials support the incorporation of bone marrow-derived mesenchymal stem cell (BM-hMSC) spheroids, which act as a supportive “cell niche,” enhancing the viability of the hMSC during and after bioprinting, and facilitating their spreading across the construct during the maturation phase. The characterization of the hybrid constructs demonstrated strong structural integrity and enhanced mechanical properties, making them well-suited for clinical wound dressing applications. In vitro assays, including live/dead staining, MTT assays, and scratch assays, revealed increased cell attachment, proliferation, and migration. The spheroids maintained their viability over extended periods, significantly contributing to wound closure in the scratch assay. This innovative approach, which combines electrospinning and light-based bioprinting, offers a promising strategy for the development of customizable wound dressings that closely adapt to the complex architecture of human skin. The bioprinting approach allows for the creation of tailored geometries for specific clinical requirements. Future research will focus on optimizing scaffold design and conducting long-term in vivo studies to validate the platform’s clinical potential.
The sessile lifestyle of plants requires an immediate response to environmental stressors that affect photosynthesis, growth, and crop yield. Here, we showed that three abiotic perturbations—heat, cold, and high light—triggered considerable changes in the expression signatures of 42 epitranscriptomic factors (writers, erasers, and readers) with putative chloroplast-associated functions that formed clusters of commonly expressed genes in Arabidopsis. The expression changes under all conditions were reversible upon deacclimation, identifying epitranscriptomic players as modulators in acclimation processes. Chloroplast dysfunctions, particularly those induced by the oxidative stress-inducing norflurazon in a largely GENOME UNCOUPLED-independent manner, triggered retrograde signals to remodel chloroplast-associated epitranscriptomic expression patterns. N6-methyladenosine (m6A) is known as the most prevalent RNA modification and impacts numerous developmental and physiological functions in living organisms. During cold treatment, expression of components of the primary nuclear m6A methyltransferase complex was upregulated, accompanied by a significant increase in cellular m6A mRNA marks. In the cold, the presence of FIP37, a core component of the writer complex, played an important role in positive regulation of thylakoid structure, photosynthetic functions, and accumulation of photosystem I, the Cytb6f complex, cyclic electron transport proteins, and Curvature Thylakoid1 but not that of photosystem II components and the chloroplast ATP synthase. Downregulation of FIP37 affected abundance, polysomal loading, and translation of cytosolic transcripts related to photosynthesis in the cold, suggesting m6A-dependent translational regulation of chloroplast functions. In summary, we identified multifaceted roles of the cellular m6A RNA methylome in coping with cold; these were predominantly associated with chloroplasts and served to stabilize photosynthesis.
Rearrangements des MLL Gens sind für 5-10% aller akuten Leukämien, biphenotypischen Leukämien und myelodysplastischen Syndrome im Kindes- und Erwachsenenalter verantwortlich. 5-10% dieser MLL Aberrationen sind wiederum therapiebedingt.
Die 43 heute schon bekannten Partnergene und die mindestens 36 noch nicht identifizierten Partnergene stellen dabei ein großes Problem für die MLL-Diagnostik dar, denn nach der zytogenetischen Analyse werden nur die am häufigsten auftretenden Partnergene MLLT2, MLLT3, MLLT1, MLLT4, ELL, und MLLT10 über RT-PCR untersucht. Dagegen werden die nicht so häufig auftretenden oder unbekannten Partnergene von einer weiteren Untersuchung ausgeschlossen.
Wenn auch alle MLL Translokationen mit einer Hochrisiko-Leukämie in Verbindung gebracht werden, bestimmt jedoch das Partnergen den Verlauf der Leukämie mit günstiger oder schlechter Prognose. Deshalb ist eine schnelle Identifizierung des Partnergens wichtig, um somit einer optimalen Behandlung beginnen zu können.
Aus diesem Grund ist eine universelle Diagnostik-Methode entwickelt worden, die es ermöglicht, alle MLL Rearrangements innerhalb der MLL Bruchpunktsregion zu ermitteln, auch wenn das Partnergen noch nicht bekannt ist. Diese Methode beruht auf der inversen Long Range PCR (LDI-PCR), einer Methode zur Amplifizierung von unbekannten DNA Sequenzen (Partnergen), die von bekannten DNA Sequenzen (MLL Gen) flankiert werden.
Mit dieser universellen Diagnostik-Methode konnten 340 Patienten aus 15 unterschiedlichen europäischen Diagnostikzentren erfolgreich untersucht werden. Die 340 Patienten setzen sich aus 238 Kindern und 102 Erwachsenen zusammen. Bei 157 Patienten (66 Kinder und 91 Erwachsene) konnte über eine Voruntersuchung ein MLL Rearrangement festgestellt werde. 183 Patienten (172 Kinder und 11 Erwachsene) sind vorher nicht auf eine MLL Aberration hin untersucht worden. Insgesamt konnten mit dieser Methode 144 Patienten mit mindestens einem MLL Rearrangement identifiziert werden. Bei diesen Rearrangements handelte es sich in den meisten Fällen um reziproke balancierte Translokationen, aber es konnten mit dieser Methode auch Deletionen, Inversionen, Insertionen und eine Tandem-Duplikation (MLL-PTD) identifiziert werden. Von den 172 vorher nicht untersuchten pädiatrischen Patienten konnten 11 (ca. 6%) mit einer MLL Aberration identifiziert werden. Dies entspricht in etwa der in der Literatur beschriebenen Häufigkeit von 10%. 12 (8%) der schon voruntersuchten Patienten konnten mit dieser Methode nicht verifiziert werden. Diese Fälle sollten weiter untersucht werden, um die Methode dieser Problematik entsprechend zu optimieren.
Während dieser Arbeit konnten auch die 6 neuen Partnergene ACACA, ARHGEF17, SMAP1, SELB und TIRAP (DCPS) identifiziert werden. Damit steigt die Zahl der charakterisierten Partnergene von 43 auf 49.
Diese Ergebnisse zeigen, dass sich diese Methode sehr gut für die Identifizierung von bekannten und unbekannten Partnergenen des MLL Gens eignet. In Verbindung mit der Split-Signal FISH Technik kann diese Methode sehr gut für eine Routinediagnostik und einen hohen Durchsatz an Proben herangezogen werden. Ein langfristiges Ziel wird die Analyse des MLL Rekombinoms sein, denn mindestens 36 Partnergene (40%) warten noch auf ihre Identifizierung.
Darüber hinaus können die patientenspezifischen chromosomalen Fusionssequenzen für das Monitoren von leukämischen Zellen über quantitative PCR Methoden herangezogen werden. Diese genomischen MRD Marker können dann in den einzelnen Zentren genutzt werden und dazu beitragen, dass in Zukunft die Therapieprotokolle und der Therapieerfolg verbessert werden. Erste Studien sind mit Hilfe der von uns generierten molekularen Marker bereits an zwei Zentren durchgeführt worden.
Dank intensiver Forschung konnte Stickstoffmonoxid (NO) innerhalb der letzten Jahrzehnte als ein gasförmiges Signalmolekül (second messenger) identifiziert werden, das innerhalb der Zelle verschiedene Signalkaskaden beeinflusst. Dabei spielt sowohl der Syntheseort als auch die synthetisierte NO-Menge eine entscheidende Rolle für die Spezifität des über NO vermittelten Signals. Dies spiegelt sich unter Anderem in den zahlreichen regulatorischen Mechanismen, denen die NO-Synthasen unterliegen, wider. In jüngster Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass nicht nur der Aktivitätsstatus der NO-Synthasen, sondern ebenfalls deren subzelluläre Lokalisation durch solche Mechanismen entscheidend beeinflusst werden. Von besonderer Bedeutung scheinen dabei mit den NO-Synthasen interagierende Proteine zu sein. So resultiert beispielsweise eine Überexpression von NOSIP – einem eNOS interagierenden Protein – in CHO-NOS-Zellen in einer Umverteilung von eNOS von der Plasmamembran hin zu intrazellulären Kompartimenten. Diese Umverteilung führt zu einem signifikanten Aktivitätsverlust der eNOS. Die physiologische Relevanz dieser Interaktion wird sowohl durch den Interaktionsnachweis der endogenen Proteine in Endothelzellen als auch durch eine weitreichende Co-Expression in Gastro-Intestinaltrakt, Leber und Bauchspeicheldrüse der Ratte gestützt.
Eine nähere Charakterisierung dieser Interaktion war bisher jedoch noch nicht erfolgt. Auch blieben die biochemischen Eigenschaften von endogenem NOSIP bisher unerforscht. Daher war es Ziel dieser Arbeit, endogenes NOSIP näher zu charakterisieren und dadurch die Voraussetzungen für eine physiologische Interaktion zwischen NOSIP und eNOS aufzuklären. Dabei konnte festgestellt werden, dass es sich bei NOSIP um ein überwiegend nukleär lokalisiertes Protein handelt. Diese nukleäre Lokalisation wird über ein zweiteiliges Kernlokalisationssignal (NLS = nuclear localisation signal) vermittelt. Sukzessive Mutation dieses Signals resultiert in einer zytoplasmatischen Akkumulation von NOSIP. Ferner ist das NLS nach Fusion an heterologe Proteine in der Lage, deren Lokalisation in Richtung Zellkern zu verschieben. In Heterokaryon-Assays konnte gezeigt werden, dass NOSIP zusätzlich aus dem Kern exportiert wird und daher ein zwischen Kern und Zytoplasma wanderndes Protein ist. Dieses „trafficking“ wird über ein dynamisches Gleichgewicht aus Kernimport und Kernexport reguliert. Der Kernexport von NOSIP wird durch einen ungewöhnlichen - nicht durch Leptomycin B inhibierbaren - Mechanismus bewerkstelligt. Entsprechend findet sich innerhalb der NOSIP-Sequenz kein typisches, leucinreiches Exportsignal, durch welches gewöhnlich Kernexport über Bindung an Crm1 (chromosome region maintenance 1) vermittelt wird. Das dynamische Gleichgewicht zwischen Kernimport und Kernexport, verschiebt sich in Abhängigkeit vom Zellzyklus in der G2-Phase in Richtung Export, was in einer zytoplasmatischen Akkumulation von NOSIP resultiert. Beeinflusst wird das dynamische Gleichgewicht dabei möglicherweise von einer Interaktion zwischen NOSIP und der Zellzyklus-regulatorischen Kinase CDK1 (cyclin dependent kinase 1).
In Bezug auf eNOS ist diese zytoplasmatische Lokalisation von NOSIP von entscheidender Bedeutung, wie in vergleichenden Transfektionsexperimenten mit zytoplasmatischen NOSIP-Mutanten in CHO-NOS-Zellen gezeigt werden konnte. Danach vermittelt ausschließlich Transfektion dieser Mutanten eine Translokation von eNOS an das Aktin-Zytoskelett, während natives, primär nukleär lokalisiertes NOSIP keinen Einfluss auf die eNOS-Lokalisation hat. Analog dazu resultiert die zytoplasmatische Akkumulation von endogenem NOSIP in der G2-Phase des Zellzyklus ebenfalls in einer Translokation von eNOS an das Aktin-Zytoskelett, welche eine signifikante Aktivitätsminderung der NO-Synthase zur Folge hat. Diese zellzyklusspezifischen, eNOS-regulativen Effekte erfolgen in Abhängigkeit von endogenem zytoplasmatischem NOSIP, wie mittels RNA-Interferenzexperimente belegt werden konnte. Danach können sowohl die Umverteilung von eNOS als auch die daraus resultierende Aktivitätsminderung durch eine Expressionsunterdrückung von NOSIP vollständig inhibiert werden.
Die innerhalb dieser Arbeit erhobenen Daten stellen den ersten Bericht über eine Zellzyklusabhängige Regulation einer NOS-Isoform dar. Diese negative Regulation wird durch eine Umverteilung von eNOS an ein inaktives Kompartiment erreicht, welche wiederum über eine zellzyklusabhängige Lokalisationsänderung von NOSIP bewerkstelligt wird. In der Literatur finden sich zahlreiche Berichte über die Auswirkungen von exogen verabreichtem NO auf Zellzyklus-gesteuerte Ereignisse, wie Apoptose oder Proliferation. In diesem Zusammenhang zeigen die hier erhobenen Daten, dass die endogene NO-Menge tatsächlich zellzyklusspezifisch reguliert wird. Diese Regulation könnte möglicherweise ein Teil eines endogenen, NO-abhängigen Mechanismus darstellen, der die Apoptose und/oder die Proliferation beeinflusst.
Manipulation of neuronal or muscular activity by optogenetics or other stimuli can be directly linked to the analysis of Caenorhabditis elegans (C. elegans) body length. Thus, WormRuler was developed as an open-source video analysis toolbox that offers video processing and data analysis in one application. Utilizing this novel tool, the super red-shifted channelrhodopsin variant, ChrimsonSA, was characterized in C. elegans. Expression and activation of ChrimsonSA in GABAergic motor neurons results in their depolarization and therefore elongation of body length, the extent of which providing information about the strength of neuronal transmission.
Biological drug substance (DS) is typically stored frozen to increase stability. However, freezing and thawing (F/T) of DS can impact product quality and therefore F/T processes need to be controlled. Because active F/T systems for DS bottles are lacking, freezing is often performed uncontrolled in conventional freezers, and thawing at ambient temperature or using water baths.
In this study, we evaluated a novel device for F/T of DS in bottles, which can be operated in conventional freezers, generating a directed air stream around bottles. We characterized the F/T geometry and process performance in comparison to passive F/T using temperature mapping and analysis of concentration gradients. The device was able to better control the F/T process by inducing directional bottom-up F/T. As a result, it reduced cryo-concentration during freezing as well as ice mound formation. However, freezing with the device was dependent on freezer performance, i.e. prolonged process times in a highly loaded freezer were accompanied by increased cryo-concentrations. Thawing was faster compared to without the device, but had no impact on concentration gradients and was slower compared to thawing in a water bath.
High-performance freezers might be required to fully exploit the potential of directional freezing with this device and allow F/T process harmonization and scaling across sites.
Die sekretorischen Phospholipasen A2 (sPLA2) sind eine Familie von Enzymen, die von Glycerophospholipiden spezifisch Fettsäuren abspalten. Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt wurden im Menschen neun verschiedene sPLA2-Subtypen identifiziert, die in zahlreiche physiologische und pathophysiologische Prozesse involviert sind. So sind sPLA2s in der humanen Epidermis maßgeblich am Aufbau der Permeabilitätsbarriere beteiligt. Darüber hinaus kontrollieren sie die Freisetzung von Arachidonsäure für die Produktion von Eicosanoiden, die sowohl für die Proliferation der Keratinozyten als auch für inflammatorische Prozesse und die Entstehung von Tumoren in der Haut von entscheidender Bedeutung sind.
Da bislang weder das detaillierte Expressionsmuster der einzelnen sPLA2-Enzyme noch deren spezifische Funktion in humaner Epidermis bekannt war, wurde in der vorliegenden Arbeit eine umfassende Analyse an Biopsien gesunder und erkrankter humaner Haut durchgeführt. Zusätzlich zum Nachweis der sPLA2-Expression in vivo wurden humane primäre Keratinozyten in vitro verwendet, um die Auswirkungen der Differenzierung der Keratinozyten auf die Expression der verschiedenen sPLA2-Enzyme zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen sowohl in gesunder Haut als auch in primären Keratinozyten eine starke Expression der sPLA2-IB, -IIF und -X in differenzierten Zellen, während die der sPLA2-IID und -V auf proliferierende Zellen beschränkt war. Die sPLA2-IIA hingegen wurde in gesunder Haut vor allem in der äußersten, verhornten Schicht der Epidermis nachgewiesen. Die Analyse der Haut von Patienten mit Psoriasis oder Atopischer Dermatitis, beides Erkrankungen, die mit einer Störung der Permeabilitätsbarriere assoziiert sind, zeigte im Vergleich zu gesunder Haut ein deutlich verändertes Expressionsmuster. So konnte in Biopsien kranker Haut eine verstärkte Expression der sPLA2-IIA und -IID nachgewiesen werden, während die sPLA2-V nicht detektiert werden konnte. Besonders auffallend war das Verteilungsmuster der sPLA2-X, die, im Gegensatz zu gesunder Haut, in der Epidermis erkrankter Haut nicht zu detektieren war. Dagegen konnte hier eine starke Färbung der Dermis nachgewiesen werden. Die Abwesenheit der sPLA2-X in der Epidermis unter entzündlichen Bedingungen könnte durch die Sekretion des Enzyms erklärt werden. So führte die Behandlung von HaCaT-Zellen, die als in vitro Modellsystem dienten, mit Psoriasistypischen TH-1-Zytokinen wie TNF a und IFN g zur Freisetzung der sPLA2-X ins Kulturmedium. Zudem induzierte die exogene Stimulation der Zellen mit rekombinanter sPLA2-X die Synthese des Eicosanoids Prostaglandin E2 (PGE2), das zu Entzündungsreaktionen in der Haut entscheidend beiträgt. Die weitere Analyse des Signaltransduktionsweges zeigte, dass der Effekt der exogenen sPLA2-X sowohl durch den Einsatz des sPLA2-spezifischen Inhibitors Methyl-Indoxam als auch durch die Hemmung der katalytischen Aktivität der zytosolischen PLA2 a (cPLA2 a) blockiert werden konnte. Da zudem Hydrolyse-Produkte der PLA2s, wie freie Fettsäuren und deren Metabolite, endogene Aktivatoren der Transkriptionsfaktoren PeroxisomProliferator-aktivierte Rezeptoren (PPAR) darstellen, wurde auch deren Rolle bei der PGE2-Produktion untersucht. Experimente mit dem PPAR g Antagonisten GW 9662 und dem PPAR g Aktivator Ciglitazon und die Untersuchung des Bindungsverhaltens der PPARs an ihre DNA-Konsensus-Sequenz nach Stimulation mit exogener sPLA2-X zeigten, dass insbesondere PPAR g (PPAR g) an der Signalweiterleitung beteiligt ist. Zudem hatte die Herunterregulation der sPLA2-X mittels RNA-Interferenz die Suppression von differenzierungsassoziierten Proteinen wie Involucrin und PPAR g zur Folge.
Die unterschiedliche Lokalisation der untersuchten sPLA2-Enzyme in gesunder und erkrankter Haut lässt darauf schließen, dass die einzelnen Subtypen in der humanen Epidermis unterschiedliche Funktionen wahrnehmen. So ist einerseits die sPLA2-IIA mit inflammatorischen Prozessen der Haut verbunden, andererseits korreliert insbesondere der Verlust der sPLA2-X in der Epidermis mit einer Störung der epidermalen Permeabilitätsbarriere, so dass dieses Enzym offenbar zum Aufbau der Permeabilitätsbarriere beiträgt. Unter entzündlichen Bedingungen kommt es allerdings, induziert durch Zytokine, zur Sekretion der sPLA2-X. In großen, nicht-physiologischen Mengen freigesetzt, ist das Enzym in der Lage, die Synthese von Eicosanoiden wie PGE2 zu steigern, und unterstützt dadurch die Entzündungsreaktionen in der Haut.
Four different structural models, which all fit the same X-ray powder pattern, were obtained in the structure determination of 4,11-difluoroquinacridone (C20H10N2O2F2) from unindexed X-ray powder data by a global fit. The models differ in their lattice parameters, space groups, Z, Z′, molecular packing and hydrogen bond patterns. The molecules form a criss-cross pattern in models A and B, a layer structure built from chains in model C and a criss-cross arrangement of dimers in model D. Nevertheless, all models give a good Rietveld fit to the experimental powder pattern with acceptable R-values. All molecular geometries are reliable, except for model D, which is slightly distorted. All structures are crystallochemically plausible, concerning density, hydrogen bonds, intermolecular distances etc. All models passed the checkCIF test without major problems; only in model A a missed symmetry was detected. All structures could have probably been published, although 3 of the 4 structures were wrong. The investigation, which of the four structures is actually the correct one, was challenging. Six methods were used: (1) Rietveld refinements, (2) fit of the crystal structures to the pair distribution function (PDF) including the refinement of lattice parameters and atomic coordinates, (3) evaluation of the colour, (4) lattice-energy minimizations with force fields, (5) lattice-energy minimizations by two dispersion-corrected density functional theory methods, and (6) multinuclear CPMAS solid-state NMR spectroscopy (1H, 13C, 19F) including the comparison of calculated and experimental chemical shifts. All in all, model B (perhaps with some disorder) can probably be considered to be the correct one. This work shows that a structure determination from limited-quality powder data may result in totally different structural models, which all may be correct or wrong, even if they are chemically sensible and give a good Rietveld refinement. Additionally, the work is an excellent example that the refinement of an organic crystal structure can be successfully performed by a fit to the PDF, and the combination of computed and experimental solid-state NMR chemical shifts can provide further information for the selection of the most reliable structure among several possibilities.