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The Kinase Chemogenomic Set (KCGS): An open science resource for kinase vulnerability identification
(2019)
We describe the assembly and annotation of a chemogenomic set of protein kinase inhibitors as an open science resource for studying kinase biology. The set only includes inhibitors that show potent kinase inhibition and a narrow spectrum of activity when screened across a large panel of kinase biochemical assays. Currently, the set contains 187 inhibitors that cover 215 human kinases. The kinase chemogenomic set (KCGS) is the most highly annotated set of selective kinase inhibitors available to researchers for use in cell-based screens.
Oligonucleotide-based therapeutics have made rapid progress in clinical treatment of a variety of disease indications. Since most therapeutic oligonucleotides serve more than just one function and tend to have a prolonged lifetime, spatio-temporal control of these functions would be desirable. Photoswitches like azobenzene have proven themselves as useful tools in this matter. Upon irradiation, the photoisomerization of the azobenzene moiety causes destabilization in adjacent base pairs, leading to a decreased hybridization affinity. Since the way the azobenzene is incorporated in the oligonucleotide is of utmost importance, we synthesized locked azobenzene C-nucleosides and compared their photocontrol capabilities to established azobenzene C-nucleosides in oligonucleotide test-sequences by means of fluorescence-, UV/Vis-, and CD-spectroscopy.
YEATS-domain-containing MLLT1 is an acetyl/acyl-lysine reader domain, which is structurally distinct from well-studied bromodomains and has been strongly associated in development of cancer. Here, we characterized piperazine-urea derivatives as an acetyl/acyl-lysine mimetic moiety for MLLT1. Crystal structures revealed distinct interaction mechanisms of this chemotype compared to the recently described benzimidazole-amide based inhibitors, exploiting different binding pockets within the protein. Thus, the piperazine-urea scaffold offers an alternative strategy for targeting the YEATS domain family.
RNA sequencing analyses are often limited to identifying lowest p value transcripts, which does not address polygenic phenomena. To overcome this limitation, we developed an integrative approach that combines large-scale transcriptomic meta-analysis of patient brain tissues with single-cell sequencing data of CNS neurons, short RNA sequencing of human male- and female-originating cell lines, and connectomics of transcription factor and microRNA interactions with perturbed transcripts. We used this pipeline to analyze cortical transcripts of schizophrenia and bipolar disorder patients. Although these pathologies show massive transcriptional parallels, their clinically well-known sexual dimorphisms remain unexplained. Our method reveals the differences between afflicted men and women and identifies disease-affected pathways of cholinergic transmission and gp130-family neurokine controllers of immune function interlinked by microRNAs. This approach may open additional perspectives for seeking biomarkers and therapeutic targets in other transmitter systems and diseases.
RNA-sequencing analyses are often limited to identifying lowest p-value transcripts, which does not address polygenic phenomena. To overcome this limitation, we developed an integrative approach that combines large scale transcriptomic meta-analysis of patient brain tissues with single-cell sequencing data of CNS neurons, short RNA-sequencing of human male- and female-originated cell lines, and connectomics of transcription factor- and microRNA-interactions with perturbed transcripts. We used this pipeline to analyze cortical transcripts of schizophrenia and bipolar disorder patients. While these pathologies show massive transcriptional parallels, their clinically well-known sexual dimorphisms remain unexplained. Our method explicates the differences between afflicted men and women, and identifies disease-affected pathways of cholinergic transmission and gp130-family neurokine controllers of immune function, interlinked by microRNAs. This approach may open new perspectives for seeking biomarkers and therapeutic targets, also in other transmitter systems and diseases.
The SLC26 family of transporters maintains anion equilibria in all kingdoms of life. The family shares a 7 + 7 transmembrane segments inverted repeat architecture with the SLC4 and SLC23 families, but holds a regulatory STAS domain in addition. While the only experimental SLC26 structure is monomeric, SLC26 proteins form structural and functional dimers in the lipid membrane. Here we resolve the structure of an SLC26 dimer embedded in a lipid membrane and characterize its functional relevance by combining PELDOR/DEER distance measurements and biochemical studies with MD simulations and spin-label ensemble refinement. Our structural model reveals a unique interface different from the SLC4 and SLC23 families. The functionally relevant STAS domain is no prerequisite for dimerization. Characterization of heterodimers indicates that protomers in the dimer functionally interact. The combined structural and functional data define the framework for a mechanistic understanding of functional cooperativity in SLC26 dimers.
We propose a generalized modeling framework for the kinetic mechanisms of transcriptional riboswitches. The formalism accommodates time-dependent transcription rates and changes of metabolite concentration and permits incorporation of variations in transcription rate depending on transcript length. We derive explicit analytical expressions for the fraction of transcripts that determine repression or activation of gene expression, pause site location and its slowing down of transcription for the case of the (2’dG)-sensing riboswitch from Mesoplasma florum. Our modeling challenges the current view on the exclusive importance of metabolite binding to transcripts containing only the aptamer domain. Numerical simulations of transcription proceeding in a continuous manner under time-dependent changes of metabolite concentration further suggest that rapid modulations in concentration result in a reduced dynamic range for riboswitch function regardless of transcription rate, while a combination of slow modulations and small transcription rates ensures a wide range of finely tuneable regulatory outcomes.
De novo fatty acid biosynthesis in humans is accomplished by a multidomain protein, the type I fatty acid synthase (FAS). Although ubiquitously expressed in all tissues, fatty acid synthesis is not essential in normal healthy cells due to sufficient supply with fatty acids by the diet. However, FAS is overexpressed in cancer cells and correlates with tumor malignancy, which makes FAS an attractive selective therapeutic target in tumorigenesis. Herein, we present a crystal structure of the condensing part of murine FAS, highly homologous to human FAS, with octanoyl moieties covalently bound to the transferase (MAT) and the condensation (KS) domain. The MAT domain binds the octanoyl moiety in a novel (unique) conformation, which reflects the pronounced conformational dynamics of the substrate binding site responsible for the MAT substrate promiscuity. In contrast, the KS binding pocket just subtly adapts to the octanoyl moiety upon substrate binding. Besides the rigid domain structure, we found a positive cooperative effect in the substrate binding of the KS domain by a comprehensive enzyme kinetic study. These structural and mechanistic findings contribute significantly to our understanding of the mode of action of FAS and may guide future rational inhibitor designs.
Chlorsilane stellen Schlüsselsubstanzen zur Herstellung von elementarem Silicium dar. Zum Beispiel ist HSiCl3 ein wichtiger Ausgangsstoff im Siemensprozess[1, 2]. Chlorsilane werden unter anderem zur Herstellung von Silikonen im Müller-Rochow-Prozess[3-5] verwendet. Bei beiden Prozessen werden Silylene[6-10] als Schlüsselmediate in den Reaktionen angenommen. So auch bei der Bildung von höheren Perchlorsilanen (Reaktion b), die nur in Form komplexer Polymergemischen erhalten werden. In der vorliegenden Dissertation wurde die Plausibilität eines auf Silylen basierenden Reaktionsmechanismus zur Bildung und Reaktivität von Chlorsilanen quantenchemisch untersucht.Mit den Berechnungen aus dieser Arbeit konnten diese molekularen Prozesse aufgeklärt werden[33-35].
Die quantenchemischen Rechnungen aus dieser Arbeit umfassen Kalibrierungsrechnungen an Chlorsilanen, um die Leistungsfähigkeit der quantenchemischen Methoden zu beurteilen.
Hierbei wurden berechnete Strukturen mit den experimentellen verglichen. Zusätzlich wurden Standardbildungsenthalpien berechnet, um diese auch mit den experimentellen Daten zu vergleichen. Nach Prüfung der Validität der Referenzmethoden wurde die Tragfähigkeit der rechengünstigeren Methoden der Dichtefunktionaltheorie evaluiert.
In Vereinbarung von Rechenaufwand und Genauigkeit einer Rechenmethode wurden thermochemische Stabilitäten, Reaktionsenergien zur Bildung von Chlorsilanen aus Schema 1 berechnet. Die Betrachtung der Reaktionsmechanismen erfolgte sowohl in der Gasphase als auch in Lösung. Dabei wurden die Bildung von cyclo-Chlorsilanen, kettenförmigen und verzweigten Chlorsilanen betrachtet. Unterstützend konnten alle Intermediate und Produkte unter Verwendung der ausgewählten quantenchemischen Methode mit 29Si-NMR-Rechnungen begleitet werden. Hierbei wurden auch Vergleichsdaten von nicht literaturbekannten 29Si-NMR Verschiebungen erstellt.
In the recent years, myxobacteria have emerged as a novel source of natural compounds with structural diversity and biological activity for drug discovery. In this work, the two myxobacterial compounds archazolid and vioprolide were characterized for their potential pharmacological effects in vascular endothelial cells. Archazolid is a wellestablished v-ATPase inhibitor found in Archangium gephyra and Cystobacter spec. As the v-ATPase represents a promising target in cancer treatment, the effects of archazolid have been intensively studied in cancer cells, but rarely in endothelial cells. Vioprolide is an antifungal and cytotoxic metabolite obtained from Cystobacter violaceus. There are only few studies on vioprolide, most of them focusing on its biosynthesis. Preliminary studies revealed that it inhibited TNF-induced expression of ICAM-1, indicating possible anti-inflammatory properties. As the endothelium plays an important role in cancer and inflammation, it represents an attractive drug target. Therefore, the archazolid and vioprolide were investigated regarding their effects on endothelial cells.
V-ATPase inhibition by archazolid resulted in anti-tumor and anti-metastatic effects in vitro and in vivo. Archazolid was used to study the consequences of v-ATPase inhibition in endothelial cells that might contribute to the anti-metastatic activities observed in vivo. To analyze the impact of archazolid on the interaction endothelial and cancer cells, in vitro cell adhesion and transmigration assays were performed using primary HUVEC or immortalized HMEC-1 and different cancer cell types (MDA-MB-231, PC-3 and Jurkat cells). For these experiments, only the endothelial cells were treated with archazolid. VATPase inhibition by archazolid led to an increased adhesion of the metastatic breast cancer cell line MDA-MB-231 and prostate cancer cell line PC-3 onto endothelial cells whereas the adhesion of Jurkat cells was unaffected. Interestingly, archazolid treatment of HUVECs decreased the transendothelial migration of MDA-MB-231 cells. Endothelial ICAM-1, VCAM-1, E-selectin and N-cadherin are potential ligands of interacting cancer cells. Therefore, the mRNA and surface protein levels of these cell adhesion molecules were measured via qRT-PCR and flow cytometry, respectively. These adhesion molecules were not responsible for the archazolid-induced cancer cell adhesion, as archazolid treatment of HUVECs did not upregulate their mRNA or surface expression. Instead, cell adhesion assays using a monoclonal antibody against integrin subunit β1 showed that β1-integrins expressed on MDA-MB-231 and PC-3 cells mediated the archazolid-induced cancer cell adhesion. Cell adhesion assays onto plastic coated with ECM components which are the major ligands of β1-integrins, revealed that MDA-MB231 and PC-3 cells preferably interact with collagen. So next, we investigated the influence of archazolid on surface collagen levels in HUVECs by immunostaining, which demonstrated an increase of nearly 50 % upon archazolid treatment. We confirmed the hypothesis that the expression and activity of cathepsin B, a lysosomal enzyme that degrades extracellular matrix components including collagen, was inhibited by archazolid in endothelial cells. Finally, overexpression of cathepsin B reduced the cancer cell adhesion on archazolid-treated HUVECs, but also in control cells, indicating a negative correlation between cathepsin B expression and cancer cell adhesion.
The influence of vioprolide on the interaction of endothelial cells with leukocytes was analyzed by in vitro cell adhesion assays using HUVECs and primary monocytes, THP-1 or Jurkat cells. Vioprolide inhibited the adhesion of these cells onto TNF-activated HUVECs. In addition, the endothelial-leukocyte interaction was observed in vivo by intravital microscopy in the mouse cremaster muscle. Vioprolide prevented the TNFinduced firm adhesion and transmigration of leukocytes, while leukocyte rolling was not affected. ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin are cell adhesion molecules, which are upregulated by TNF and mediate leukocyte adhesion onto endothelial cells. Therefore, flow cytometric analysis was performed to measure their surface expression. Vioprolide significantly decreased TNF-induced expression of surface ICAM-1, VCAM-1 and E-selectin, which was in line with the in vitro results. In vivo, vioprolide may act in a different way on E-selectin expression, so that leukocyte rolling, which is governed by E-selectin, remained unaffected. qRT-PCR experiments revealed that the mRNA expression of ICAM-1 and VCAM-1 were also reduced by vioprolide, indicating a regulation on transcriptional level. In contrast, the mRNA expression of E-selectin was not decreased at the timepoint when surface protein expression was diminished. The induction of these cell adhesion molecules is mainly mediated by the transcription factor NFκB. A Dual-Luciferase® reporter assay was used to study the impact of vioprolide on the TNF-induced NFκB promotor activity. Vioprolide blocked the TNF-induced NFκB promotor activity while the TNF-induced IκBα degradation and nuclear translocation of the NFκB subunit p65 was not altered by vioprolide. Western blot analysis revealed that vioprolide had no effect on the activation of MAPK (p38, JNK) and AKT by TNF, which could interfere with the NFκB-dependent gene expression.
Taken together, archazolid and vioprolide are interesting myxobacterial compounds with different modes of actions. The study suggests that the v-ATPase inhibitor archazolid impairs the expression and activity of cathepsin B in endothelial cells, which leads to a higher amount of collagen on the endothelial surface. As a result, the adhesion of β1-integrin expressing metastatic cancer cells onto archazolid-treated endothelial cells increased while transendothelial migration was reduced. Further, archazolid represents a promising tool to elucidate the role of v-ATPase in endothelial cells. Vioprolide was able to prevent TNF-induced endothelial-leukocyte interaction in vitro and in vivo by interfering with NFκB-dependent gene expression. Further research is required to enlighten the underlying mechanism and the direct target of vioprolide.
Double reduction of the THF adduct of 9H-9-borafluorene (1⋅THF) with excess alkali metal affords the dianion salts M2[1] in essentially quantitative yields (M=Li–K). Even though the added charge is stabilized through π delocalization, [1]2− acts as a formal boron nucleophile toward organoboron (1⋅THF) and tetrel halide electrophiles (MeCl, Et3SiCl, Me3SnCl) to form B−B/C/Si/Sn bonds. The substrate dependence of open-shell versus closed-shell pathways has been investigated.
Photobleaching is a major challenge in fluorescence microscopy, in particular if high excitation light intensities are used. Signal-to-noise and spatial resolution may be compromised, which limits the amount of information that can be extracted from an image. Photobleaching can be bypassed by using exchangeable labels, which transiently bind to and dissociate from a target, thereby replenishing the destroyed labels with intact ones from a reservoir. Here, we demonstrate confocal and STED microscopy with short, fluorophore-labeled oligonucleotides that transiently bind to complementary oligonucleotides attached to protein-specific antibodies. The constant exchange of fluorophore labels in DNA-based STED imaging bypasses photobleaching that occurs with covalent labels. We show that this concept is suitable for targeted, two-color STED imaging of whole cells.
Ribonucleic acid oligonucleotides (RNAs) play pivotal roles in cellular function (riboswitches), chemical biology applications (SELEX-derived aptamers), cell biology and biomedical applications (transcriptomics). Furthermore, a growing number of RNA forms (long non-coding RNAs, circular RNAs) but also RNA modifications are identified, showing the ever increasing functional diversity of RNAs. To describe and understand this functional diversity, structural studies of RNA are increasingly important. However, they are often more challenging than protein structural studies as RNAs are substantially more dynamic and their function is often linked to their structural transitions between alternative conformations. NMR is a prime technique to characterize these structural dynamics with atomic resolution. To extend the NMR size limitation and to characterize large RNAs and their complexes above 200 nucleotides, new NMR techniques have been developed. This Minireview reports on the development of NMR methods that utilize detection on low-γ nuclei (heteronuclei like 13C or 15N with lower gyromagnetic ratio than 1H) to obtain unique structural and dynamic information for large RNA molecules in solution. Experiments involve through-bond correlations of nucleobases and the phosphodiester backbone of RNA for chemical shift assignment and make information on hydrogen bonding uniquely accessible. Previously unobservable NMR resonances of amino groups in RNA nucleobases are now detected in experiments involving conformational exchange-resistant double-quantum 1H coherences, detected by 13C NMR spectroscopy. Furthermore, 13C and 15N chemical shifts provide valuable information on conformations. All the covered aspects point to the advantages of low-γ nuclei detection experiments in RNA.
The single crystal growth of 19 different intermetallic compounds within the LnT2X2 family (with Ln = lanthanides, T = Co, Ru, Rh, Ir, and X = Si, P) is presented, by employing a high-temperature metal-flux technique. The habitus of the obtained crystals is platelet-like with the crystallographic c direction perpendicular to the surface and with individual masses between 1 and 100 mg. The magnetic properties of these crystals are characterized by magnetization, heat-capacity, and resistivity measurements. These crystals form the materials basis for a thorough study of exciting surface properties by angle-resolved photoemission spectroscopy.
Autophagy is a highly conserved catabolic process through which defective or otherwise harmful cellular components are targeted for degradation via the lysosomal route. Regulatory pathways, involving post-translational modifications such as phosphorylation, play a critical role in controlling this tightly orchestrated process. Here, we demonstrate that TBK1 regulates autophagy by phosphorylating autophagy modifiers LC3C and GABARAP-L2 on surface-exposed serine residues (LC3C S93 and S96; GABARAP-L2 S87 and S88). This phosphorylation event impedes their binding to the processing enzyme ATG4 by destabilizing the complex. Phosphorylated LC3C/GABARAP-L2 cannot be removed from liposomes by ATG4 and are thus protected from ATG4-mediated premature removal from nascent autophagosomes. This ensures a steady coat of lipidated LC3C/GABARAP-L2 throughout the early steps in autophagosome formation and aids in maintaining a unidirectional flow of the autophagosome to the lysosome. Taken together, we present a new regulatory mechanism of autophagy, which influences the conjugation and de-conjugation of LC3C and GABARAP-L2 to autophagosomes by TBK1-mediated phosphorylation.
Entzündungen sind eine Gegenreaktion des Körpers auf einen schädlichen Stimulus. Eine akute Entzündung zeichnet sich durch typische Zeichen wie Schwellung, Rötung, Überwärmung, Schmerz und eingeschränkter Funktionsfähigkeit aus.Findet die Auflösung der Entzündung nur sehr langsam oder nicht statt, entsteht eine chronische Entzündung. Eine chronische Entzündung kann Auslöser vieler schwerwiegender Krankheiten, wie Diabetes mellitus, Krebs oder kardiovaskulärer Erkrankungen sein. Die symptomatische Behandlung einer chronischen Entzündung erfolgt unter anderem durch NSAIDs. Diese haben bei einer Langzeiteinnahme schwere Nebenwirkungen wie gastrointestinale Blutungen oder nephrotoxische Eigenschaften.NSAIDs greifen in den Metabolismus der Arachidonsäure-Kaskade ein. Die Arachidonsäure wird über mehrere Enzyme metabolisiert, die drei Hauptmetabolismuswege erfolgen über die Cyclooxygenase- (COX), 5-Lipoxygenase- (5-LOX) und Cytochrom P450-Enzyme (CYP450). Studien ergaben, dass die Inhibition eines Metabolismusweges eine Verschiebung der Lipidwerte innerhalb des Arachidonsäurestoffwechsels verursacht. Viele dieser Nebenwirkungen bei einer Langzeitmedikation kommen vermutlich durch die Verschiebung der Metabolite zustande.8 Diese Problematik könnte möglicherweise durch eine Inhibition mehrerer Metabolismuswege umgangen werden. Tierstudien belegen eine bessere Wirksamkeit dualer Inhibitoren gegenüber der Einzelverabreichung von „selektiven“ Inhibitoren und zudem wird ein erhöhtes Sicherheitsprofil für duale Inhibitoren postuliert.9,10 Im Rahmen dieser Arbeit wurden einerseits duale Inhibitoren der löslichen Epoxidhydrolase (sEH) und Leukotrien-A4-Hydrolase (LTA4H) und anderseits der sEH und der 5-Lipoxygenase entworfen, synthetisiert und in vitro gegenüber den betreffenden Enzymen in einem Aktivitätsassay evaluiert.
Es ist gelungen, duale Inhibitoren der sEH und LTA4H mit IC50-Wert im submikromolaren Bereich zu synthetisieren. Dies wurde durch die Erweiterung des Fragments 3-(4-(Benzyloxy)phenyl)propan-1-ol, welches Amano et al. publizierten, bewerkstelligt.11 Die synthetisierten Inhibitoren wurden analytisch charakterisiert und in vitro auf ihr inhibitorisches Potential untersucht. Des Weiteren konnte die Kristallstruktur eines dualen Inhibitors in der Bindetasche der sEH gelöst werden und damit weitere Erkenntnisse über den Bindungsmodus des Inhibitors gewonnen werden. Es konnten auch duale Inhibitoren der sEH und 5-LOX synthetisiert werden und jene auf ihr inhibitorisches Potential untersucht werden. Es wurden einige Inhibitoren mit submikromolaren bis nanomolaren IC50-Werten gegenüber beiden Zielproteinen entworfen, synthetisiert und analytisch charakterisiert. Da mehrere Inhibitoren zwei stereogene Zentren aufweisen, wurde ein Inhibitor mit definierten Stereozentren durch eine asymmetrische Synthese generiert. Ein stereogenes Zentrum wurde über drei Schritte synthetisiert und zum Nachweis der Reinheit des Enantiomeres zum Diastereomer gekuppelt. Per NMR-Spektroskopie wurde das Verhältnis (dr 9:1) der Diastereomere zueinander bestimmt. Das andere stereogene Zentrum wurde mit Hilfe eines Evans-Auxiliar über eine achtstufige Synthese dargestellt und mit dem Enantiomer aus der dreistufigen Synthese verknüpft. Per HPLC konnte ein dr-Verhältnis von 99:1 für den Inhibitor HK330 bestimmt werden. Das andere Diastereomer wurde mittels HPLC aus dem Recemat isoliert. Eine in vitro Evaluation zeigte, dass der Einfluss des stereogenen Zentrums auf das Inhibitionsvermögen marginal ist.
Nach einer Evaluation des Inhibitionsvermögens, der Löslichkeit, der Zelltoxizität, der metabolischen Stabilität und der synthetischen Zugänglichkeit, wurde der Inhibitor HK330 weiter untersucht. In einem Zellassay konnte jener die 5-LOX-Aktivität senken, die 12- und 15-LOX wurde jedoch nicht inhibiert. Des Weiteren wurde der Inhibitor in einer pharmakokinetischen Studie untersucht und erreichte Plasmawerte, die bis zu 4 h in der aktiven Konzentration des Inhibitors lagen. LC-MS/MS Untersuchungen der Plasmaproben ergaben ein erhöhtes EETs/DHETs-Verhältnis, welches die in vivo Inhibition der sEH bestätigt. Die Verbindung HK330 besitzt vielversprechende Eigenschaften und deshalb soll die Wirksamkeit des Inhibitors in einem Tiermodell getestet werden. Geeignete Tiermodelle wie die unilaterale Harnleiterobstruktion (unilateral ureteral obstruction, UUO) in Mäusen könnten Aufschlüsse über die Wirksamkeit von HK330 geben. Denn sowohl die Inhibition der 5-LOX als auch der sEH sind renoprotektiv.12,13 Die profibrinolytischen und anti-inflammatorischen Eigenschaften eines sEH-Inhibitors könnten auch in einem Tiermodell zur gestörten Wundheilung untersucht werden. In einem murinen Ohrwundmodell wurde gezeigt, dass eine Behandlung mit Epoxyeicosatriensäuren (EETs) die Wundheilung signifikant beschleunigte.15 Ramalho et al. zeigten, dass die Leukotriene des 5-LOX-Metabolisimusweges eine verminderte Wundheilung in diabetischen Mäusen (Typ 1) bewirkten.
Die Akademische Feier der Vereinigung von Freunden und Förderern der Goethe-Universität schafft es wie keine andere Veranstaltung, jedes Jahr aufs Neue in nur knapp zwei Stunden den Wissenschaftskosmos dieser Universität abzubilden: In kurzweiligen, auch für Laien verständlichen Vorstellungen skizzierten die Laudatoren, worüber die 13 Preisträgerinnen und Preisträger in ihren ausgezeichneten Arbeiten geforscht hatten.
Persistent and, in particular, neuropathic pain is a major healthcare problem with still insufficient pharmacological treatment options. This triggered research activities aimed at finding analgesics with a novel mechanism of action. Results of these efforts will need to pass through the phases of drug development, in which experimental human pain models are established components e.g. implemented as chemical hyperalgesia induced by capsaicin. We aimed at ranking the various readouts of a human capsaicin–based pain model with respect to the most relevant information about the effects of a potential reference analgesic. In a placebo‐controlled, randomized cross‐over study, seven different pain‐related readouts were acquired in 16 healthy individuals before and after oral administration of 300 mg pregabalin. The sizes of the effect on pain induced by intradermal injection of capsaicin were quantified by calculating Cohen's d. While in four of the seven pain‐related parameters, pregabalin provided a small effect judged by values of Cohen's d exceeding 0.2, an item categorization technique implemented as computed ABC analysis identified the pain intensities in the area of secondary hyperalgesia and of allodynia as the most suitable parameters to quantify the analgesic effects of pregabalin. Results of this study provide further support for the ability of the intradermal capsaicin pain model to show analgesic effects of pregabalin. Results can serve as a basis for the designs of studies where the inclusion of this particular pain model and pregabalin is planned.
Paul Ehrlich's concept of the magic bullet, by which a single drug induces pharmacological effects by interacting with a single receptor has been a strong driving force in pharmacology for a century. It is continually thwarted, though, by the fact that the treated organism is highly dynamic and the target molecule(s) is (are) never static. In this article, we address some of the factors that modify and cause the mobility and plasticity of drug targets and their interactions with ligands and discuss how these can lead to unexpected (lack of) effects of drugs. These factors include genetic, epigenetic, and phenotypic variability, cellular plasticity, chronobiological rhythms, time, age and disease resolution, sex, drug metabolism, and distribution. We emphasize four existing approaches that can be taken, either singly or in combination, to try to minimize effects of pharmacological plasticity. These are firstly, to enhance specificity using target conditions close to those in diseases, secondly, by simultaneously or thirdly, sequentially aiming at multiple targets, and fourthly, in synchronization with concurrent dietary, psychological, training, and biorhythm‐synchronizing procedures to optimize drug therapy.
Hintergrund: Die Komplexität einer medikamentösen Behandlung steigt mit der Anzahl der Medikamente, der Einzeldosen und der Darreichungsformen und bedroht dadurch die Adhärenz der Patienten. Patienten mit Multimorbidität benötigen oft flexible, individualisierte Behandlungsschemata. Häufige Medikationsänderungen im Verlauf der Behandlung können jedoch die Komplexität einer Therapie weiter erhöhen.
Ziel: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Medikationsveränderungen bei älteren Patienten mit Multimorbidität und Multimedikation in der hausärztlichen Praxis zu beschreiben und deren Abhängigkeit von soziodemographischen und weiteren Merkmalen zu untersuchen. Zudem sollten die Medikationsveränderungen in den Daten der cluster-randomisierten kontrollierten PRIMUM-Studie (Priorisierung der MUltimedication in Multimorbidity) analysiert werden, um Effekte der komplexen PRIMUM-Intervention zu untersuchen und damit einen Beitrag zur Prozessevaluation zu leisten.
Methoden: In der vorliegenden Arbeit wurden Daten der PRIMUM-Studie, die in 72 Allgemeinpraxen durchgeführt wurde, retrospektiv analysiert. Dazu wurde ein Algorithmus entwickelt, der die Wirkstoffe, die Wirkstärke, die Dosierung und die Darreichungsform zur Beurteilung von Änderungen an der von Ärzten berichteten Medikationsdaten während zweier Intervalle (Basiswert bis sechs Monate: Δ1; sechs bis neun Monate: Δ2) untersucht. Diese Veränderungen wurden auf Verordnungs- und Patientenebene deskriptiv sowie auf die Assoziation zu soziodemographischen und Versorgungsmerkmalen uni- und multivariat analysiert und auf Interventionswirkungen überprüft.
Ergebnisse: Von 502 Patienten (im Durchschnitt 72 Jahre, 52% weiblich) beendeten 464 die Studie. Medikationsveränderungen traten bei 98,6% der Patienten auf. Die maximale Anzahl an Medikationsänderungen pro Patient betrug 21 in Δ1 und 20 in Δ2. Die Gesamtzahl der Medikamente pro Patient blieb dabei weitgehend konstant und betrug im Median zu allen drei Messzeitpunkten 8 (IQR an T0 und IQR an T1: 6-9 und IQR an T2: 6-10). Änderungen bezogen auf den Wirkstoff während Δ1 und Δ2 traten bei 414 (82,5%) und 338 (67,3%) Patienten auf, Dosierungsänderungen bei 372 (74,1%) und 296 (59,2%) und in der Wirkstärke bei 158 (31,5%) bzw. 138 (27,5%). Die Darreichungsform wurde bei 79 (16%) der Patienten sowohl in Δ1 als auch in Δ2 geändert. Simvastatin, Ramipril, Metformin und Aspirin waren am häufigsten von Veränderungen betroffen. Am häufigsten verordnet waren ASS, Metoprolol und Bisoprolol sowie Simvastatin. Medikationsänderungen traten häufiger nach vorhergehenden Aufenthalten im Krankenhaus auf und Dosisreduktion war bei männlichen Patienten häufiger zu verzeichnen. In der Interventionsgruppe waren Medikationsänderungen um 19% wahrscheinlicher. Insbesondere waren Dosisreduktionen und das Ansetzen von neuen Medikamenten in der Interventionsgruppe signifikant häufiger.
Schlussfolgerungen: Bei älteren Patienten mit Multimedikation und Multimorbidität wurden die Therapiepläne häufig geändert. Auf Verordnungsebene ist dies hauptsächlich auf Absetzen und Dosisanpassungen zurückzuführen, gefolgt von Ansetzen und Wiederansetzen von Medikamenten. Dies kann die (longitudinale) Komplexität der Medikation für Patienten erhöhen und ggf. nachteilige Folgen für Therapieadhärenz und Arzneimitteltherapiesicherheit haben. Zudem wird deutlich, dass die medikamentöse Verordnungsqualität in querschnittlichen Erhebungen nicht zuverlässig beurteilt werden kann. In der PRIMUM-Studie wurden häufiger Änderungen in der Interventions- gegenüber der Kontrollgruppe vorgenommen - hauptsächlich das Ansetzen neuer Medikamente und Dosisreduktion. Damit konnten Effekte der komplexen Intervention gezeigt werden, die im Einklang mit den Zielen der Intervention zur Optimierung von Multimedikation steht.
This dissertation contains two chapters. Each chapter covers a unique topic within RNA sci-ence and is divided in two sub sections, part A and B. Each chapter contains an introduction.
Chapter 1 gives an insight into challenges encountered during sample design and preparation for single molecule Förster energy transfer (smFRET) spectroscopy and offers a solution via a newly establishedestablished workflow to obtain accurate smFRET constructs. Following this workflow, a FRET network could be generated, which allowed a detailed structural dynamics study on H/ACA RNP during catalysis with smFRET spectroscopy. This led to detailed mech-anistic insights into H/ACA RNPs dynamics during catalysis.
Chapter 2 deals with RNA synthetic biology whereby a novel eclectic design strategy for RNA of interest (ROI) release platform is presented, which allows to release a diverse ROI se-quences with single nucleotide precision triggered by an external stimulus. This design strat-egy was used to establish a ROI release system and its powerful performance in in vitro and in vivo applications was shown.
Das Glykoprotein AICL gehört zur Familie der C-Typ Lektin-ähnlichen Rezeptoren und wird nach Aktivierung humaner NK Zellen und Makrophagen auf deren Oberfläche exprimiert. Die Bindung von AICL an den genetisch gekoppelten, aktivierenden NKRezeptor NKp80, der auf allen reifen humanen NK Zellen exprimiert ist, induziert Effektorfunktionen von NK Zellen, wie Zytotoxizität und Zytokinsekretion. AICL Glykoproteine werden in ruhenden NK Zellen intrazellulär zurückgehalten und gelangen erst nach Zellaktivierung an die Oberfläche (Klimosch et al. 2013). Der Mechanismus dieser Regulation ist bisher unbekannt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden, um weitere Einblicke in die Funktion des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares im Rahmen einer Immunantwort zu ermöglichen.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach der Aktivierung von NK Zellen sowohl präformierte im Golgi-Komplex zurückgehaltene als auch de novo synthetisierte AICL Glykoproteine an die Zelloberfläche gelangen. Bei der intrazellulären Retention von AICL handelt es sich um eine intrinsische Eigenschaft von AICL, die auch im ektopen Kontext von Insektenzellen auftritt. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die N-Glykosylierungen von AICL differentiell die AICLOberflächenexpression bestimmen. Die AICL Ektodomäne wird an einer nichtkonventionellen (N-X-C) und an drei konventionellen (N-X-S/T) N-Glykosylierungsstellen glykosyliert, wobei die Glykosylierung an ersterer ineffizient ist, sodass stets zwei Glykoisoformen vorhanden sind. Während die Glykosylierung zumindest einer konventionellen Stelle essenziell für die AICL-Oberflächenexpression ist, und diese mit zunehmender Glykosylierung konventioneller Stellen zunimmt, vermindert die nichtkonventionelle Glykosylierungsstelle die AICL-Oberflächenexpression. Für eine effiziente Oberflächenexpression ist auch die Ausbildung einer nicht-konservierten Disulfidbrücke erforderlich, die im membran-distalen Bereich der C-Typ Lektindomäne AICL-Homodimere miteinander verknüpft. Das Fehlen dieser Disulfidbrücke führt auch zu dem Verlust der NKp80-Bindung. Die intrazelluläre Reifung von AICL Glykoproteinen ist, im Gegensatz zu dem verwandten Glykoprotein KACL, in besonderem Maße abhängig von der Interaktion mit den ER-ständigen Proteinen der Proteinqualitätskontrolle. Insbesondere konnte mit Hilfe massenspektrometrischer Analysen eine starke Interaktion von AICL mit dem ER Chaperone Calnexin gezeigt werden. Entsprechend ist die zelluläre Expression von AICL in Abwesenheit von Calnexin stark reduziert. Massenspektrometrisch konnte auch eine spezifische Interaktion von AICL mit dem Protein ITM2A gezeigt werden, wobei allerdings eine funktionelle Relevanz in Folgeversuchen nicht bestätigt werden konnte. Schließlich konnte eine zusätzliche Regulation der AICL-Oberflächenexpression durch proteasomale Degradation nachgewiesen werden, die über zwei Lysine im kurzen zytoplasmatischen Bereich von AICL bestimmt wird.
Frühere Untersuchungen hatten eine Bindung von sowohl AICL- als auch NKp80-Ektodomänen an K562 Zellen, eine Erythroleukämie-zelllinie, ergeben. Da K562 Zellen weder NKp80 noch AICL exprimieren, handelt es sich bei der gebundenen Struktur um einen potenziellen weiteren Liganden des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares. Hier konnte gezeigt werden, dass es sich bei der Bindestruktur um ein Oberflächenprotein der K562 Zellen handelt, das allerdings nicht identifiziert werden konnte.
Insgesamt konnten im Rahmen dieser Arbeit mehrere AICL-spezifische, molekulare Mechanismen identifiziert und charakterisiert werden, die die aktivierungsabhängige Oberflächenexpression von AICL regulieren. Offensichtlich unterliegt diese einer strikten Kontrolle auf mehreren Ebenen, was vermutlich mit der Funktion von AICL als Ligand für einen aktivierenden Immunrezeptor auf zytotoxischen NK Zellen erklärbar ist. Weitere Untersuchungen zur AICL-Expressionsregulation und zur Funktion des NKp80-AICL Rezeptor-Ligand-Paares in vivo sind erforderlich, um ein besseres Verständnis der Immunbiologie von NK Zellen zu erreichen.
Uncontrolled constitutive activation of Wnt signaling is a hallmark of colorectal cancer (CRC), which is responsible for the initiation of the vast majority of CRC cases (Fearon and Vogelstein, 1990; Morin et al., 1997; Wood et al., 2007). Paneth cells support the small intestinal stem cells by providing them with the required niche factors and especially Wnt3. Although the normal colonic epithelium does not contain Paneth cells, Paneth cell metaplasia is frequently observed in human and mouse adenoma (Joo et al., 2009). The occurrence of Paneth cells suggests the presence of high levels of Wnt ligands with unknown function in the tumor microenvironment of Wnt-independent tumor cells. Tumor progression is recognized as result of evolving crosstalk between tumor cells and their surrounding non-transformed stromal cells (Hanahan and Weinberg, 2011; Wang et al., 2017). Although Wnt signaling has been intensively studied in colorectal cancer (CRC) cells (Zhan et al., 2017), it remains unclear whether Wnt activity in the tumor-associated stroma contributes to the tumor malignancy. The present thesis used the organoid 3D cell culture system, genetically modified mouse models as well as next generation sequencing technology to identify and characterise the role of Wnt signaling in the tumor microenvironment of CRC.
Krebs ist und wird voraussichtlich auch in näherer Zukunft eine der häufigsten Todesursachen weltweit bleiben. Trotz vielversprechenden Fortschritten in Therapeutik und Diagnostik bedarf es noch weiterer Forschung, um die vielfältigen molekularen Mechanismen zu entschlüsseln, welche dem Verlauf von malignen Tumorerkrankungen bestimmen und zu beeinflussen vermögen. Das RNA-Bindeprotein Hu antigen R (HuR) reguliert Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene, indem es durch Bindung an Ziel mRNAs Einfluss auf deren Abbau, Lokalisation oder Translationseffizienz nimmt. Darüber hinaus zeigte sich in den letzten Jahren, dass HuR diese Prozesse auch indirekt durch Interaktion mit regulatorischen RNAs beeinflusst. In Krebszellen lässt sich häufig eine erhöhte Aktivität von HuR beobachten, welche in Verbindung mit verschiedenen tumorigenen Prozessen gebracht wird. Unter anderem trägt HuR zur Deregulation des Zellzyklus bei, indem es die Expression der Cycline A2, B1, D1 und E1 erhöht. Weiterhin unterstützt HuR das Tumorwachstum durch Regulation von proangiogenen Faktoren wie VEGF, IL8 und COX2. Da HuR generell eine prominente Rolle bei der Regulation von Immunantworten, sowohl in Immunzellen selbst als auch in solidem Gewebe einnimmt, wurde HuR in der Vergangenheit häufig auch mit der Ausbildung des inflammatorischen Tumormikromilieus in Verbindung gebracht, jedoch ist die Datenlage in dieser Hinsicht bis heute uneindeutig. Obwohl eine Großzahl an Zytokinen und inflammatorischen Faktoren prinzipiell als HuR Zielgene beschrieben sind, gibt es nur für die wenigsten dieser Proteine entsprechende Untersuchungen in Tumorzellen.
Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von HuR in Tumoren auf die Rekrutierung von Makrophagen zu evaluieren. Hierfür bot sich als in vitro Modell die Brustkrebszelllinie MCF-7 an, da diese unter entsprechenden Kultivierungsbedingungen dreidimensionale Sphäroide bildet. Solch ein Sphäroidmodell bietet sich als Kompromiss zwischen der klassischen zweidimensionalen Zellkultur an, welche zwar höchst artifiziell, jedoch leicht zu handhaben und zu kontrollieren ist, und den physiologischeren, aber gleichzeitig experimentell unzugänglicheren und speziesfremden Tiermodellen. Mittels lentiviraler Transduktion wurde ein small hairpin RNA (shRNA) vermittelter stabiler Knockdown von HuR in MCF-7 erzielt, welcher zu vermindertem Zellwachstum führte, jedoch keinen weiteren Einfluss auf die Bildung von Sphäroiden hatte. Um die initiale Suche nach HuR-regulierten, potenziell relevanten Faktoren möglichst breit und unvoreingenommen zu halten, wurde die Expression von 174 Zytokinen in Wildtyp- und HuR-knockdown Sphäroiden mittels eines Protein Arrays untersucht. Überraschenderweise zeigte der Großteil der veränderten Proteins einen negativen Zusammenhang mit HuR, welches eigentlich eher als positiv regulierendes Protein beschrieben ist. Bemerkenswerterweise befand sich unter den mit am stärksten regulierten Faktoren das Chemokin CCL5 (auch RANTES genannt), welches einerseits als einer der beiden zentralen Faktoren für die Makrophageninfiltration in Brustkrebs gilt, andererseits bisher noch nicht in Verbindung mit HuR gebracht wurde.
Im Folgenden untersuchte ich zuerst den mechanistischen Hintergrund dieser Regulation. Da diese sich auch in adhärenten Zellrasen zeigte, wechselte ich für die entsprechenden Experimente zu zweidimensionaler Zellkultur. Eine negative regulatorische Funktion von HuR wird meist in Verbindung mit verminderter Translation von Zielfaktoren gebracht. Da die mRNA Level von CCL5 dem Effekt auf Proteinebene entsprachen, konnten entsprechende Mechanismen als Grund für die veränderten CCL5 Level ausgeschlossen werden. Desweiteren blieb die mRNA Stabilität ungeachtet der HuR Level konstant; dabei zeigte sich zudem, dass mRNA Abbau generell keinen relevanten Einfluss auf die Expression von CCL5 in MCF-7 hatte. Da diese Ergebnisse auf eine transkriptionelle Regulation hindeuteten, untersuchte ich im Folgenden den Einfluss von HuR auf die Promoteraktivität von CCL5. Hierfür isolierte ich zunächst die CCL5-Promoterregion aus genomischer DNA von MCF-7 Zellen und inserierte diese dann in einen zuvor promoterlosen Luciferase-Expressionsvektor. In den folgenden Reporteranalysen zeigte sich, dass HuR tatsächlich einen negativen Einfluss auf die Promoteraktivität von CCL5 ausübt. Durch sukzessive Verkürzung ließ sich der entscheidende DNA-Bereich auf die letzten 140 Nukleotide vor dem Transkriptionsstartpunkt eingrenzen. Dieser Bereich enthält vier prominente und sehr gut charakterisierte regulatorische Abschnitte: zwei benachbarte NF-κB Bindestellen sowie je ein Interferon-stimulated Response Element (ISRE) und ein C/EBPβ Erkennungsmotiv. Während das C/EBP Element keine funktionelle Relevanz in den Reporteranalysen hatte, reduzierte sich durch Deletion sowohl der ISRE als auch der NF-κB Elemente die Promoteraktivität um mehr als 50%, allerdings nur im ISRE-Deletionskonstrukt unter Nivellierung des HuR-abhängigen Unterschiedes. Somit ließ sich der Einfluss von HuR auf die CCL5 Promoteraktivität vollständig und ausschließlich auf das ISRE zurückführen. Im Gegensatz zu dem in Tumorzellen häufig basal überaktiven NF-κB Signalweg sind die kanonischen, ISRE-assoziierten Typ I Interferon Signalkaskaden und ihre vermittelnden Transkriptionsfaktoren, die sogenannten Interferon Regulatory Factors (IRFs) nicht konstitutiv überaktiviert. Eine Sonderstellung nehmen dabei die Faktoren IRF1 und IRF2 ein, da sie, für Proteine abseits der Stimulus-getriebenen ISRE-Interferon Achse, auch als konstitutive Transkriptionsfaktoren beschrieben sind, wobei IRF2 in diesem Kontext als IRF1-Antagonist und somit Transkriptionsrepressor fungiert. Überraschenderweise ließ sich mittels Chromatin Immunopräzipitation eine Assoziation von IRF1 mit dem CCL5 Promoter nur in Wildtyp-, jedoch nicht in HuR-knockdown Zellen nachweisen. Im Gegensatz dazu ergaben mRNA Expressionsanalysen der Tumor-relevanten IRFs, dass die CCL5 Induktion in HuR-depletierten Zellen mit einer allgemeinen, jedoch niedrigschwelligen Erhöhung von Typ I Interferon-assoziierten Signalen einhergeht. Interessanterweise korrelierte Interferon β zwar mit CCL5 auf mRNA Ebene, jedoch hatte eine Blockade des Interferon-α/β Rezeptors in HuR-depletierten Zellen keinen akuten Effekt auf CCL5. Umgekehrt zeigte sich auch keine erhöhten CCL5 Level in Wildtypzellen unter Kokultur mit HuR-knockdown Zellen, wie es bei parakriner Induktion durch Interferon β zu erwarten wäre. Ebenso konnte alternatives ISRE Signaling durch einen Komplex aus unphosphoryliertem Stat1 und IRF9, wie es in vitro unter länger anhaltender Niedriglevel Exposition mit Interferon β beobachtet wurde, ausgeschlossen werden. Um sicher zu stellen, dass diese Erhöhung kein sequenzabhängiges off-target Artefakt ist, wie es in der Vergangenheit für einzelne small hairpin RNAs (shRNAs) beobachtet wurde, wurde eine entsprechende Aktivierung von IRF3 und damit des IRF3/IRF7 Aktivierungsweges untersucht und ausgeschlossen. Zusätzlich konnte durch Tests unterschiedlicher shRNA Sequenzen sowie Zellsysteme demonstriert werden, dass die CCL5 Aktivierung tatsächlich ein spezifischer und in einer größeren Bandbreite an Krebszelllinien unterschiedlicher Herkunft, darunter Brust- und Lungenkarzinom, Glioblastom- sowie Melanom- Zelllinien, reproduzierbarer Effekt von HuR-Defizienz ist.
Da CCL5 als eines der zentralen Chemokine bei der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen in Tumore beschrieben ist, stellte sich die Frage, ob HuR mit diesem Vorgang in Verbindung zu bringen ist. Brusttumore weisen oft eine hohe Zahl von Tumor-assoziierten Makrophagen auf, welche von eingewanderten Blutmonozyten abstammen. Ein Einfluss von HuR auf diesen Vorgang in vitro konnte mittels einer Kokultur von Sphäroiden mit zuvor frisch aus Humanblut isolierten Primärmonozyten nachgewiesen werden. Hierbei wiesen HuR-knockdown Sphäroide trotz ihres geringeren Durchmessers eine erhöhte Anzahl von Monozyten/Makrophagen auf. Da sich in diesen Zellen weder Proliferation noch relevante Apoptose zeigte, ließ sich die erhöhte Anzahl auf verstärkte Einwanderung in das Sphäroid zurückführen. Hierbei erwies sich der direkte Zellkontakt zwischen Monozyten und Tumorzellen als erforderlich, da Monozyten keine unterschiedliche Chemotaxis gegenüber entsprechenden Sphäroidüberständen zeigten. Dass die erhöhte Infiltration in HuR-defizienten Sphäroiden tatsächlich auf CCL5 zurückzuführen ist, konnte in Kokulturexperimenten durch Inhibierung von CCL5 gezeigt werden. Unterstütztend wurde ein Zusammenhang zwischen HuR, CCL5 und Tumor assoziierten Makrophagen in silico unter Zuhilfenahme des TCGA Datensets für Estrogenrezeptor-positive Brusttumore untersucht. Im Einklang mit meinen Ergebnissen zeigte sich eine negative Korrelation zwischen HuR und CCL5. Außerdem ließ sich ein negativer Zusammenhang zwischen HuR und einer Makrophagensignatur feststellen, während CCL5 wie erwartet mit dieser Signatur positiv korrelierte.
Zusammenfassend zeigte sich in dieser Arbeit, dass HuR eine Rolle bei der zellulären Zusammensetzung des inflammatorischen Tumor-Mikromilieus spielt. Der Verlust von HuR in Tumorzellen führte zu einer erhöhten Expression des Chemokins CCL5. Dies ließ sich in Brust- und Lungenkarzinom-, Glioblastom- sowie Melanom- Zelllinien beobachten. In Brustkrebszellen zeigte sich, dass diese Regulation auf verstärkte Transkription, vermittelt durch ein ISRE innerhalb des CCL5 Promoters, zurückzuführen ist. Funktionell konnte die erhöhte CCL5 Produktion in HuR-defizienten Tumorsphäroiden in Verbindung mit verstärkter Infiltration von Monozyten/Makrophagen gebracht werden. Unterstützend zeigte sich auch bei einer in silico Analyse von Estrogenrezeptor-positiven Brusttumoren eine negative Korrelation zwischen HuR und CCL5, was mit einer entsprechend veränderten Makrophagensignatur einherging. Im Hinblick auf derzeit diskutierte Ansätze, das Wachstum von Tumoren mittels HuR Blockade zu inhibieren, sind meine Ergebnisse potenziell von therapeutischer Relevanz. Basierend auf meiner Arbeit sollte dabei in zukünftigen Studien näher untersucht werden, wie sich Inhibierung von HuR in Tumoren auf die Zusammensetzung und Funktion des Tumormikromilieus auswirkt und daraus resultierende Effekte auf das Tumorwachstum in Relation zu der allgemein wachstumsfördernden Rolle von HuR in Tumorzellen gesetzt werden.
Stickstoff (NO), Kohlenmonoxid (CO) und Schwefelwasserstoff (H2S) gehören zur Gruppe der Gasotransmitter. Dabei handelt es sich um kleine gasförmige Signalmoleküle, welche innerhalb des Körpers gebildet werden und dort wichtige physiologische Funktionen bei der Regulation der Apoptose, der Proliferation, der Entzündungsreaktion und der Genexpression übernehmen. Aufgrund ihrer Membranpermeabilität ist die Wirkung der Gasotransmitter nicht an die Interaktion mit spezifischen membranständigen Rezeptoren gebundenen. Je nach Organ, Gewebe und Konzentration können diese Mediatoren unterschiedliche Prozesse beeinflussen und teils sogar gegenteilige Wirkungen hervorrufen.H2S beispielsweise kann im Verlauf der Leukozytenadhäsion im Epithelium anti-inflammatorisch, bei Brandwunden oder rheumatischen Erkrankungen jedoch pro-inflammatorisch wirken. Im Kreislaufsystem hingegen bewirkt H2S durch die Aktivierung von ATP-abhängigen K+-Kanälen und die damit zusammenhängende Vasorelaxion der glatten Muskelzellen einen eindeutig protektiven Effekt.
H2S kann je nach Substrat und Zelltyp durch eines von 3 Enzymen gebildet werden. Die Cystathionin-γ-Lyase (CSE) und die Cystathionin-β-Synthase (CBS) nutzen L-Cystein als Substrat für die Synthese von H2S. Das dritte H2S-bildende Enzym, die 3-Mercaptopyruvate Sulfurtransferase (3-MST) verwendet α-Ketoglutarat als Substrat, welches zuvor von der Cystein-Aminotransferse (CAT) aus L-Cystein synthetisiert wurde. Während die beiden Enzyme CSE und CBS im Zytosol der Zelle zu finden sind, ist die 3-MST hauptsächlich in den Mitochondrien der Zelle zu finden. Im Gegensatz zur CBS, welche eher ein konstitutiv exprimiertes Protein ist, wird die Expression der CSE auf der Transkriptionsebene durch u.a. Entzündungsmediatoren wie TNF-α oder Wachstumsfaktoren wie PDGF-BB induziert.
Ein Ziel der Arbeit war es, die Wirkung von H2S bei der Wundheilung, bei entzündlichen glomerulären Erkrankungen der Niere und beim Schlaganfall zu untersuchen. Für diesephänotypische Analysen stand ein Knockoutmodell für die CSE zur Verfügung.
Zudem wurden in dieser Arbeit Untersuchungen mit einem Knockoutmodell für das zytoskeletäre Protein durchgeführt. Bei Clp36 (PDLIM1) handelt es sich um ein PDLIM-Protein (PDZ and LIM domain protein),welches durch die Gasotransmitter NO und H2S auf transkriptioneller und translationaler Ebene reguliert wird ist und aufgrund seiner Assoziation mit dem Zytoskelett dynamische Vorgänge der Zelle moduliert. Es ist bereits bekannt, dass Clp36 ein negativer Regulator des Glykoprotein VI (GPVI), welches eine wichtige Rolle bei der Aktivierung von Thrombozyten spielt, ist.
Beide Knockoutmodelle wurden in murinen Mesangiumzellen der Niere und in Krankheitsmodellen der Haut (kutane Wundheilung)und des Gehirns (Schlaganfall mit dem MCAO-Modell) analysiert.
Neben nicht signifikanten Effekten im MCAO-Modell, konnten sowohl Effekte des CSE-, als auch des CLP36-KOs auf die Migration und Proliferation und im Falle der CSE auch auf die Adhäsion der murinen Mesangiumzellen beobachtet werden. Die Depletion von Clp36 führte zu einer Verringerung der Migrations- und einer Erhöhung der Proliferationsrate, wohingegen die Depletion der CSE zu einer Erhöhung der Migrations-, Proliferations- und Adhäsionsrate führte. Die vielversprechendsten Ergebnisse konnten im Tiermodell der kutanen Wundheilung generiert werden. Untersucht wurde die Expression der H2S-produzierenden Enzyme CSE, CBS und 3-MST. Alle drei Enzyme zeigten im Tiermodell keine transkriptionelle Regulation und blieben auch während der akuten Entzündungsphase und der proliferativen Phase der Wundheilung unverändert. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die Expression der CSE in der späten Phase der Wundheilung signifikant anstieg, wenn die Proliferation innerhalb des Granulationsgewebes und der Neoepidermis geringer wurde. Die Vermutung, dass H2S in dieser Phase eine wichtige Rolle spielt, konnte durch die Analyse der CSE-KO Mäuse bekräftigt werden, da dort der Verlust der CSE offenbar durch die CBS kompensiert wurde.
In immunhistochemischen Untersuchungen konnten insbesondere follikuläre Keratinozyten der Neo-Epidemis als Quelle der CSE-Expression identifiziert werden. Durch in-vitro Studien auf mRNA und Proteinebene in HaCaT Zellen wurde gezeigt, dass H2S die Keratinozyten-Differenzierung beeinflusst. Der langsam freisetzendeH2S-Donor GYY4137 konnte in humanen Keratinozyten zu einer signifikanten Erhöhung der Ca2+- induzierten Expression der frühen Keratinozyten-Differenzierungsmarker Cytokeratin 10 (CK10) und Involucrin (IVN) beitragen.
Im Laufe dieser Arbeit konnte der molekulare Mechanismus hinter diesen Beobachtungen noch nicht geklärt werden.
Durch weitere Versuche meiner Arbeitsgruppe konnte jedoch gezeigt werden, dass die GYY4137-abhängige Induktion der CK10-Expression durch eine verstärkte Bindung der RNA-Polymerase II an den CK10 Promotor zustande kommt.
The work of this thesis focuses on the targeting of G-quadruplexes (G4s), wherein several specific and potential ligands were designed, synthesized and characterized for its structural and biological activity. G4s are nucleic acid secondary structures that may form in single-stranded guanine (G)-rich sequences under physiological conditions. Four Guanines (Gs) bind via Hoogsteen-type hydrogen bonds base pairing to yield G-quartets, which in turn stack on top of each other to form the G4. G4s are highly polymorphic, both in terms of strand stoichiometry (forming both inter and intramolecular structures) and strand orientation/topology. The presence of K+ cations specifically supports G4 formation and stability. In the human genome G4 DNA motifs have been found in telomeres, G-rich micro and mini-satellites, up-stream to oncogene promoters and within the ribosomal DNA (rDNA). Human G4 DNA motifs are over-expressed in recombinogenic regions, which are associated with genomic damage in cancer cells.
In the present work, we focus on lead identification with specificity towards the c-MYC promoter G4s. Drug discovery is a highly time consuming and costly process. Lead identification and development are key steps in the drug discovery program. Studies have suggested that a large number of commercially available drugs exhibit deep structural similarity to the lead compounds from which they were developed. Quality lead identification in terms of compounds with high potency and selectivity, favorable physicochemical parameters and in vitro Absorption Distribution Metabolism and Excretion (ADME) parameters are the foremost requirements for the success of the drug discovery process. We herein describe the fragment-based drug design approach for the development of pyrrolidine-substituted 5-nitroindole derivatives as a new class of G4 ligands that exhibit high affinity and selectivity for the c-MYC promoter G-quadruplex. This chapter focuses on the methodology explored whilst finding a suitable hit and its optimization with fragment expansion strategies which undergo efficient G4 binding.
To target G4 DNA, screenings of numerous heterocycles have been reported including indoles, 7-azaindoles, 1H-indazol-3-yl, benzothiazole, imidazo[1,5-a]pyridine, 2,6- diaminopyrimidin-4-ol, 1H-pyrazolo[4,3 d]pyrimidin-7-amine, morpholino, bis-indoles, 2-hydroxynaphthalene-1,4-dione, 1,4-dihydroxyanthracene-9,10-dione, benzofuran and piperonal derived from several alkaloids. In this part of the thesis, we set out to identify new binders targeting the c-MYC G-quadruplex starting from the indole fragment. Several synthetic strategies are reported to optimize and generate best hits starting from 5-nitro indole derivatives by introducing the secondary cationic linked pyrrolidine side chain. Interestingly, all improved versions of G4-indole fragments 5, 7 and 12 contain this 5-nitro functionality, which may aid in the electrostatic binding and contributes to hydrogen binding interactions of the ligands to G4 DNA. In-silico drug design, biological and biophysical analyses illustrated that the substituted 5-nitro indoles scaffolds show preferential affinity towards the c-MYC promoter G-quadruplex compared to other G-quadruplexes and double stranded DNA. In vitro cellular studies confirm that the substituted indole scaffolds downregulate c-MYC expression in cancer cells and have the potential to induce cell cycle arrest in the G0/G1 phase. NMR analysis suggests that 5, 7, and 12 interacts in a fast exchange regime with the terminal G-quartets (5’ and 3’end) in a 2:1 stoichiometry.
To further optimize the fragment generated in chapter II, a novel series of triazole linked indole derivatives as a potential G quadruplex stabilizers have been described in chapter III. The potential ligands can be obtained through an efficient, convergent, synthetic route in moderate to good yields. The synthesized triazole linked indole derivatives are selective towards c- MYC G4-DNA vs. duplex-DNA. The planarity of the aromatic core and its ability to occupy more surface area by stacking over the G4 greatly affect the ability of the compounds to stabilize the G4. Further biophysical and biological studies revealed that the triazole linked nitro indoles are more promising than the amino indole derivatives.
Additionally, the importance of the nitro functional group has been justified by molecular docking studies, where hydrogen-bonding interactions were observed in between the nitro group and the G4 base pairs of the G-quadruplex. In biological findings, most of the synthesized triazole linked nitro indoles has found to be effective against human carcinoma (cervical) HeLa cell lines. Furthermore, western blot and cell cycle analysis confirms that the novel triazole linked 5-nitro indole derivatives (9b) could down-regulate c-MYC oncogene expression in cancer cells via stabilizing its promoter quadruplex structure, arresting cell cycle in G0/G1 phase. NMR analysis suggests that 9b interacts in slow exchange regime with the terminal G-quartets (5’ and 3’-end).
In chapter IV of the thesis, we have developed the synthetic strategies to generate more potent G4 ligands via Knoevenagel condensation. To investigate novel and selective G4 ligands for cancer chemotherapy, we designed and synthesized a series of azaindolin-2-one derivatives (11, 14, 15, 16 and 22) by attaching cationic pyrrolidine side chains and introducing a fluorine atom into the aromatic chromophore (Fig. 3). Fluorine atoms, with high electronegativity and small size, often exhibit unique properties in functional molecules. The electron-withdrawing effect of fluorine could reduce the electron density of the aromatic chromophore, which might favor a stronger interaction with the electron-rich π-system of the G-quartet. In addition, the introduction of fluorine atoms into small molecules might improve lipophilicity and thus the bioavailability. Fluorescent indicator displacement assay (FID) assays suggests that the synthesized azaindolin-2-one derivatives are selective towards c-MYC G4-DNA vs. duplex-DNA and showed potent anticancer activity against human carcinoma (cervical) HeLa cell lines. They down-regulate c-MYC expression in cancer cells via stabilizing its promoter quadruplex structure, arresting cell cycle in G0/G1 phase. Furthermore, NMR spectroscopy suggests that azaindolin-2-one conjugate interacts with terminal G-quartets as well as with the nearby G-rich tract (G13-G14-G15 and G8-G9-G10) of c-MYC quadruplex in intermediate exchange regime.
Im Forschungsgebiet der Proteomik hat sich die Massenspektrometrie als essenzielles Werkzeug etabliert. Zur Probengewinnung und deren Präparation für die chromatogra-phische Trennung und massenspektrometrische Analyse existieren eine Vielzahl von Protokollen, deren Verwendung jedoch unterschiedlichste Vor- und Nachteile mitbringt. Im Idealfall wäre ein solches Protokoll schnell und kostengünstig durchführbar, würde mit hoher Robustheit die Proteine aus den Ausgangszellmaterial quantitativ extrahieren und Probenverluste auf ein Minimum beschränken. Ziel dieser Arbeit war es, in einem strukturierten Ansatz sich diesem Ideal zu nähern und mögliche Kompatibilitaten mit anderen Methoden wie dem Arg-C analogen Proteinverdau zu untersuchen. Als Maß-stäbe dienen hierbei die aktuellen Standardprotokolle: die Acetonfällung der Proteine mit anschließender Solublisieung und das FASP-Protokoll, bei dem die zur Proteinpro-zessierung notwendigen Arbeitsschritte auf einer Größenausschlussmembran stattfinden. Dazu wurde zunächst das Adsorptionsverhalten von Proteinen auf den Silica-Oberflächen paramagnetischer Beads untersucht und dabei insbesondere der Einfluss von Chemikalien zur Zell-Lyse und den im Anschluss verwendeten Reduktions- und Alkylierungsreagenzien analysiert. Dabei wurde festgestellt, dass die Proteine aus dem Totalzelllysat sehr effektiv an die Silicaoberfläche binden und dass der Prozess der Re-duktion von Disulfidbrücken mit nachfolgender Carbamidomethylierung positiv zur Adsorption beiträgt und negative Einflüsse auf die Immobilisierung negieren kann. Dar-aus wurde ein Protokoll zur kombinierten Lyse, Aufreinigung, Modifikation und Proteo-lyse (abgekürzt: ABP) entwickelt. Parallel dazu konnte die Kompatibilität des Protokolls mit dem ArgC-analogen Verdau gezeigt werden und in der Folge konnte die Komple-mentarität der Methoden erfolgreich getestet werden. Mit frischen Zell-Lysaten wurde der Einfluss der Lysisreagentien unter Einschluss einer kommerziellen Variante ("Bug-buster" Lysis-Puffer) bestimmt und Harnstoff konnte als Mittel der Wahl definiert wer-den, da mit diesem höhere Identifikationszahlen erreicht wurden, lipophile Proteine vermehrt in der Probe erhalten blieben und größere Ionscores ermittelt werden konnten. Das Potential von ABP wurde im Direktvergleich mit FASP und dem Verdau in Lösung anhand eines humanen Proteoms genauestens untersucht, wobei eine konsequente Ver-besserung gegenüber beiden Methoden festgestellt werden konnte, insbesondere im Hinblick auf Praktikabilität und die Zahl der erforderlichen Arbeitsschritte, Reprodu-zierbarkeit und Zahl der identifizierten Peptide. Ein Bias des ABP zugunsten spezieller Proteineigenschaften konnte nach ausführlicher Analyse der identifizierten Proteine und Peptide nicht festgestellt werden. Eine vermehrt auftretende Oxidation von Methionin wurde identifiziert, allerdings zeigten sich keine negativen Auswirkungen auf die Pro-teinidentifizierungen. Zur Unterdrückung potentieller und unerwünschter Nebenpro-dukte in Form von Methylierungen, die als Folge des ursprünglichen ArgC-analogen Verdaus36 auftreten, wurde mit Verwendung von Acetonitril eine Alternative erfolg-reich getestet. Ein humanes Proteom wurde mittels des formulierten Protokolls sowohl tryptisch als auch mit ArgC-analogen Verdau (mit Acetonitril bzw. Methanol) analysiert. In diesem Zusammenhang wurde die Vollständigkeit der Modifikation der Lysine unter Verwendung von ACN mit zufriedenstellenden 99% bestätigt und die unerwünschte Carbamylierung der Aminosäure durch Harnstoff als Lysisreagenz konnte ausgeschlos-sen werden. Beide Ansätze zum ArgC-analogen Verdau erwiesen sich zudem gegenüber der tryptischen Variante als überlegen, was sich in einer Erhöhung der Identifikations-zahlen des humanen Proteoms widerspiegelt. Insbesondere wenig abundante Proteine, Histone und membranassoziierte Proteine bildeten den Großteil der zusätzlich identifi-zierten Proteine. Zusätzlich konnte eine günstigeres Fragmentierungsverhalten beobach-tet werden. Die effektiven Grenzen des ABP im Hinblick auf die erforderliche Protein-menge wurden untersucht und beschrieben. Der zu erwartende Zusammenhang zwi-schen abnehmender Proteinmenge und Identifikationszahlen niedrig abundanter Protei-ne wurde bestätigt und ein effektiver Grenzwert von 5µg Ausgangsmenge humanen Proteoms ermittelt. Abschließend wurden Dauer und Aufwand der Probenvorbereitung durch Etablierung paralleler Reduktion, Carbamidomethylierung und Propionylierung minimiert und damit zusätzlich Probenverluste reduziert. Die dadurch erreichte Erhö-hung der Identifikationszahlen ergab sich wiederum aus der höheren Repräsentanz nied-rig abundanter Proteine.
Im Rückblick ist es überraschend, dass die Verwendung der Adsorptionstendenzen von Proteinen bisher keine größere Rolle in der Probenvorbereitung proteomischer Analysen eingenommen hat. Die symbiotisch wirkende, aktive Denaturierung als Resultat der durchgeführten Derivatisierung zur Analysenpräparation macht die Adsorption auf Sili-ca-Oberflächen zum prädestinierten Mittel der Probengewinnung und schafft die Vo-raussetzung für die erreichte Verkürzung der Arbeitsabläufe und Verbesserung der Ergebnisse.
In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen an zwei verschiedenen Retinalproteinen durchgeführt. Das erste analysierte Retinalprotein, Channelrhodopsin 2, wurde hauptsächlich auf die Beziehung zwischen Retinalisomerisierung und Photozyklus bzw. Funktionalität untersucht. Hierfür wurde das Chromophor all-trans Retinal durch verschiedene, sterisch anspruchsvolle, Retinalanaloga ersetzt. Das 9,12-Phenylretinal wurde bereits in BR erfolgreich eingesetzt, um die Isomerisierung des all-trans Retinals zum 13-cis Retinal in der Bindetasche zu verhindern und die Funktionalität des Proteins zu stoppen. In ChR2 hingegen kann das Phenylretinal nach Lichtanregung isomerisieren und ein Photoprodukt bilden, welches anschließend einen modifizierten Photozyklus durchläuft. In diesen Photozyklus zerfällt das erste Photoprodukt P1' sehr schnell und bildet ein zusätzliches Intermediat, Px, welches zeitlich zwischen dem P1' und P2' Intermediat liegt und eine grundzustandsähnliche Absorptionsbande besitzt. Im Vergleich zum Wildtyp läuft der modifizierte Photozyklus schneller ab als im Wildtyp und das Protein behält seine Funktion. Ein weiteres Retinalanalogon ist das trans-locked Retinal, welches sich als schwierig in das Protein einzubauen erwies. Dies resultierte in zwei verschiedenen Absorptionsbanden, wobei nicht klar war, welche die mit dem korrekt eingebauten Retinal war. Beide Banden wurden in Ultrakurzzeitexperimenten angeregt, hierbei stellte sich heraus, dass die bathochrom verschobene Spezies das korrekt eingebaute Retinal besitzt, da diese auch eine Schwingungsfeinstruktur, wie auch der Wildtyp, zeigt. Das trans-locked Retinal kann ChR2 erfolgreich an der Isomerisierung hindern und zeigt nach dem Zerfall des angeregten Zustandes keine Photoprodukt-Bildung.
Bei dem zweiten Retinalprotein, welches in dieser Arbeit untersucht wurde, handelt es sich um Krokinobacter eikaustus rhodopsin 2. Zuerst wird in dieser Arbeit die Primärreaktion des Proteins untersucht. Diese wurde unter verschiedenen Salzbedingungen, welche wichtig für die spätere Funktion des Proteins sind, jedoch auch Einfluss auf die Ultrakurzzeitdynamik des Proteins nehmen, analysiert. Der angeregte Zustand des Proteins zerfällt biexponentiell, wobei die erste Komponente den reaktiven Pfad und die langsamere Komponente den nicht-reaktiven Pfad beschreibt. Der reaktive Pfad bildet innerhalb einiger hundert Femtosekunden das bathochrom verschobene, isomerisierte J Intermediat, welches durch Kühlprozesse auf der unteren Pikosekundenzeitskala in das K Intermediat übergeht. Beim nicht-reaktiven Pfad zerfällt der angeregte Zustand innerhalb einiger Pikosekunden und geht in den Grundzustand über, ohne dass eine Isomerisierung des Retinals stattfindet. Sind Na+ oder K+ Ionen in der Lösung anwesend, sind diese Prozesse gleich schnell. In Abwesenheit dieser Ionen wird der nicht-reaktive Pfad stärker populiert und zerfällt langsamer. Das gleiche salzabhängige Verhalten konnte mit der Mutante H30A gezeigt werden. Die Aminosäure H30 sitzt im Interface zweier Oligomere in der Nähe der extrazellulären Na+ Bindestelle. Durch die Mutation von Histidin zu Alanin, wird das Protein fast ausschließlich zu einer Na+-Pumpe und pumpt kaum noch Protonen. Die Ultrakurzzeitdynamik bleibt jedoch unbeeinflusst davon und unterscheidet sich nicht vom Wildtyp. Neben dem normalen all-trans Retinal wurden auch hier, wie schon für Channelrhodopsin 2, Retinalanaloga im Wildtyp untersucht, hier hauptsächlich unter dem Aspekt der Farbanpassung. Die hier verwendeten Analoga waren das A2 Retinal und das MMA Retinal (MMAR), die beide durch die Erweiterung des -Systems zum Grundzustand rotverschobene Absorptionsspektren aufweisen. Das A2 Retinal besitzt eine weitere Doppelbindung und das MMAR zwei weitere Doppelbindungen im -Jonen Ring im Vergleich zum Retinal. Das MMAR hat zusätzlich noch eine weitere Methylamino-Gruppe. Durch das größere -System hat das MMAR auch die größere Rotverschiebung im Spektrum. Beide Retinalanaloga zeigen sehr breite ESA Banden und isomerisieren nur zu einem geringen Prozentsatz, die Hauptpopulation der angeregten Moleküle geht über den nicht-reaktiven Pfad zurück in den Grundzustand.
Der Photozyklus von KR2 wurde ebenfalls untersucht. Hierbei wird unter anderem das Verhalten des Proteins unter verschiedenen pH- und Salzbedingungen analysiert. Hierbei konnte festgestellt werden, dass die Dynamik des Natrium-Pump-Zyklus unabhängig vom pH Wert ist. In einem pH Bereich zwischen 6 und 9.5 ändern sich die Lebenszeiten des Zyklus nicht signifikant, jedoch wird die Amplitude des O Intermediats, welches als Indikator für den (nicht Protonen) Ionentransport genutzt wird, bei niedrigem pH Wert geringer. Die geringere Amplitude weist auf einen geringeren Na+-Transport hin. Dies liegt an der Kompetition der zu transportierenden Ionen, in diesem Fall Na+ und H+. Ist die H+ Konzentration viel höher als die Na+ Konzentration, so fängt das Protein an H+ zu pumpen. Unter physiologischen Bedingungen handelt es sich bei KR2 jedoch um eine reine Na+-Pumpe. Sind Kalium-Ionen bei pH 9.5 anwesend, so zeigt das Protein wie auch beim Natrium-Pump-Zyklus ein starkes O Intermediat, was darauf hindeutet, dass auch K+ transportiert werden kann. Dies konnte von Dr. Janina Sörmann (Arbeitsgruppe Bamberg, MPI für Biophysik Frankfurt) auch in elektrophysiologischen Messungen gezeigt werden. Bisher wurde in der Literatur davon ausgegangen, dass K+ vom Wildtyp nicht transportiert werden kann. Um die Photozyklusdynamik des Natrium-Pumpzyklus besser verstehen zu können, wurde die Temperaturabhängigkeit des Photozkylus mit Hilfe der Target Analysis untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass das simple sequentielle Modell K -> L -> M -> O -> GS die besten Fitresultate liefert, obwohl viele verschiedene Modelle mit Verzweigungen oder Rückraten ebenfalls getestet wurden. Resultat der Target Analysis sind unter anderem die Evolution Associated Difference Spectra (EADS). Diese beinhalten die Differenzspektren der einzelnen Zustände, welche um das Grundzustandsbleichen korrigiert werden können, um die Evolution Associated Spectra (EAS) zu bilden. Durch Entfaltung dieser EAS (auf der Energieskala) konnten die Reinspektren der einzelnen Photointermediate K, L, M und O berechnet werden. Auffällig hierbei war, dass das M Intermediat eine geringere Blauverschiebung als erwartet aufwies, was höchstwahrscheinlich an der Elektrostatik in der Retinal-Bindetasche liegt. Durch die Entfaltung der Spektren konnten ebenfalls die Gleichgewichte, welche zu schnell sind, um in der Target Analysis aufgelöst zu werden, bestimmt werden. Die K, L und M Intermediate stehen, je nach Temperatur, in verschiedenen Gleichgewichten zueinander, während das O Intermediat, keine Gleichgewichte eingeht und nur separiert von den anderen Intermediaten auftaucht. Dies bedeutet, dass sich zwischen M und O Intermediat ein unidirektionaler Schritt im Photozyklus befinden muss. Dieser hängt wahrscheinlich mit dem Na+-Transport zusammen, da das Ion beim Übergang vom M zum O aufgenommen und an der Schiffbase vorbei transportiert werden muss.
Um den Photozyklus besser untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Anlage zur transienten Blitzlichtphotolyse aufgebaut und die bestehende Breitband-Blitzlichtphotolyse automatisiert und verbessert. Hierfür wurden mithilfe von MATLAB und LABVIEW verschiedene Programme zur Datenakquisition, -verarbeitung und -analyse geschrieben. Für die transiente Blitzlichtphotolyse musste ein Datenreduzierungsprogramm entwickelt werden, um die mehrere Gigabyte großen Datensätze auf eine verarbeitbare Größe, mit gleichzeitiger Verbesserung des Signal-zu-Rausch-Verhältnisses, zu bringen. In der Breitband-Blitzlichtphotolyse konnte ein Pulsverzögerungsgenerator als zentrale Steuereinheit aller Komponenten der Breitband-Blitzlichtphotolyse eingesetzt und programmiert werden, um das Messverfahren zu automatisieren. Anschließend musste noch ein neues Datenverarbeitungsprogramm geschrieben werden, welches die Daten für die anschließende Analyse zusammenstellt und vorbereitet. Die neuen Programme gewähren einen reibungslosen Anschluss an die Analysesoftware OPTIMUS, welche in der Arbeitsgruppe genutzt wird.
Since the early 2000s, nucleic acid aptamers have gained considerable attention of life science communities. This is in particular due to the fact that aptamers are known to function as artificial riboswitches, which presents an efficient way to regulate gene expression. A promising candidate is the tetracycline-binding RNA aptamer (TC-aptamer) since the TC-aptamer is known to function in vivo and exhibits a very high affinity towards its ligand tetracycline (TC) (Kd = 800 pM at 10mM Mg2+). Although a highly resolved crystal structure exists in the ligand bound state, questions related to dynamics cannot be answered with X-ray crystallography. In this work, pulsed electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was used to study different biochemical and structural aspects of the TC-aptamer.
On the one hand, pulsed hyperfine spectroscopy was used to study the binding of TC via Mn2+ to the TC-aptamer at lower and thus more physiological divalent metal ion concentrations. In a first step, a protocol for the relatively new pulsed hyperfine technique electron-electron double resonance detected NMR (ELDORdetected NMR or just EDNMR) was developed for Q-band frequencies (34 GHz). After a successful verification of the EDNMR technique at Q-band frequencies on Mn2+ model complexes ([Mn(H2O)6]2+ and Mn-DOTA), two dimensional hyperfine techniques were used to confirm the formation of a ternary RNA-Mn2+- TC complex at physiological divalent metal ion concentrations. Correlation signals between 13C (13C-labeled TC) and 31P (from the RNA backbone) to the same Mn2+ electron spin were detected with 2D-EDNMR and triple hyperfine correlation spectroscopy (THYCOS).
On the other hand, pulsed electron-electron double resonance (PELDOR) spectroscopy on a doubly nitroxide-labeled TC-aptamer was used to investigate the conformational rearrangement upon ligand binding and how the conformational flexibility is affected by different Mg2+ concentrations. The Çm spin label was used as a nitroxide spin probe. Due to its rigidity and low degree of internal flexibility, the Çm spin label yields very narrow distance distributions and pronounced orientation selection (OS). As a consequence, the width of the distance distributions can be used to draw conclusions about the conformational flexibility of the spin-labeled helices. Analysis of the distance distributions showed that at high Mg2+ concentrations, the TC-aptamer is in its folded state, irrespective of the fact if TC is present or absent. Orientation selective PELDOR revealed that the orientation of the spin-labeled helices in frozen solution is the same as in the crystal structure. First Mn2+-nitroxide pulsed electron electron double resonance (PELDOR) measurements on a singly nitroxide-labeled and Mg2+/Mn2+-substituted TCaptamer at different Mn2+ concentrations in the presence and absence of TC gave insight into the affinities of the additional divalent metal ion binding sites of the TC-aptamer.
The enzyme 5-lipoxygenase (5-LO) occupies a central role in the biosynthesis of inflammatory leukotrienes and thus takes part in the pathogenesis of related diseases. Its occurrence is mainly restricted to cells of the immune system including granulocytes, monocytes/macrophages or B-lymphocytes and can be induced by cell differentiation of myeloid cells after treatment with differentiating agents, such as DMSO, retinoic acid or the combination of TGFβ/1,25(OH)2D3. The latter contribute to the highest level of induction of mRNA and protein expression. Its cell specific occurrence is at least partly due to DNA methylation in cells that do not exhibit 5-LO activity and genetic regulation is further dependent on histone acetylation. 5-LO expression is controlled by transcription factors binding to the promoter sequence of the ALOX5 gene that induce basal promoter activity, as well as promoter independent effects including transcript initiation and elongation, which are mostly attributed to TGFβ/1,25(OH)2D3 signaling. The ALOX5 gene resembles a typical housekeeping gene, hence lacks TATA- or CAAT-boxes for transcriptional regulation, but displays a high GC-content with eight GC-boxes, five of which are arranged in tandem, that provide binding sites for transcription factors Sp1, Sp3 and Egr-1.
The proximal ALOX5 promoter is furthermore a target for additional factors, such as TGFβ effector proteins SMADs or the vitamin D receptor and possesses additional consensus sequences for transcriptional regulators, including NF-κB or PU.1. However, as yet no actual binding of these proteins to the promoter sequence was demonstrated and an unbiased screening for identifying further ALOX5 promoter interacting proteins, which might have impact on 5-LO expression, is still lacking. For this purpose, the present study focused on the identification of significantly interacting proteins, employing DNA-affinity enrichment coupled to label-free quantitative proteomics, spanning a sequence of about 270 base pairs of the proximal ALOX5 promoter. For the elucidation of potential cell specific differences in protein patterns and compositions, DNA pulldowns were performed by using oligonucleotide stretches comprising the core promoter sequence including the 5-fold GC-box, which were incubated with different cell lines and differentiation states of myeloid, as well as B-lymphocytic lineages. In order to compare different mass spectrometric quantification strategies that would allow for identification of interactors, dimethyl labeling and label-free techniques were used. Since the label-free approach outperformed the label-based one in initial experiments, it was established as standard quantification strategy in all DNA pulldowns performed. The pulldowns of myeloid cell lines in both undifferentiated and differentiated state and B-lymphocytes resulted in a cell-unspecific protein pattern whose composition was similar, regardless of cell lineage. Additionally, further DNA sequences comprising either a vitamin D response element or a SMAD binding element were investigated in the promyelocytic model cell line HL-60 in both undifferentiated and differentiated state. The identified proteins confirmed known interaction partners and furthermore revealed novel potential regulators of the 5-LO promoter. Out of these, the most prominently identified and promising proteins included transcription factors of the KLF- and CCAAT/enhancer binding protein-family. In this context, KLF5 and KLF13 are both involved in the regulation of inflammatory processes, the former additionally being an effector protein of TGFβ-signaling, whose functional characterization is of utmost interest in terms of regulation of 5-LO expression. Further protein characterization will be inevitable for the CCAAT/enhancer binding proteins C/EBPα, C/EBPβ and C/EBPε. These transcription factors are involved in the regulation of inflammatory processes and heterodimers thereof (C/EBPα/β) are known to control TGFβ/1,25(OH)2D3-mediated effects of the CD14 gene.
Several of the identified proteins of the pulldowns containing the tandem GC-box represented interactors of G-quadruplex DNA, including the helicases BLM and DHX36, the ribonucleoproteins hnRNP D and hnRNP K and transcription factor MAZ. Since G-quadruplexes form in G-rich DNA sequences as secondary DNA structures and exhibit substantial regulatory effects on the transcription of their target genes, the potential formation thereof in the ALOX5 core promoter sequence was investigated in a second project. Out of the proteins mentioned above, MAZ is shown to exert resolving effects on G4-DNA and synergistically induce Sp1-dependent gene activation of oncogene h-RAS, which displays analogous promoter characteristics to the ALOX5 gene. A DNA stretch comprising the tandem GC-box was used for elucidating the potential of secondary DNA structure formation. Intriguingly, both immune-based and spectroscopic methods provided clear evidence for the in vitro G-quadruplex formation of the proximal promoter sequence for the first time. In order to provide additional information on a possible regulatory effect of existing G-quadruplex structures on 5-LO transcription, differentiated HL-60 cells were subsequently treated with two distinct G4-DNA stabilizing agents. A porphyrin analogon (TMPyP4) did not exhibit any effects on 5-LO mRNA and protein expression after cell treatment. A second G4-DNA stabilizing agent (pyridostatin) on the other hand revealed significant reduction on 5-LO protein expression after cellular treatment. These mixed results render further experiments inevitable, in order to provide a clear assertion as to whether 5-LO expression is regulated by G-quadruplex structures or not.
Altogether, this study enlarges the knowledge of ALOX5 proximal promoter interacting proteins by corroborating the binding of already known transcription factors and identifying novel interactors. It yields essential groundwork for subsequent functional studies of proteins involved in 5-LO transcription and introduces G-quadruplexes as a new potential mechanism in ALOX5 gene regulation.
Lange ging man davon aus, dass die Physiologie der Thyroidhormone weitestgehend erforscht ist und nahm an, dass sämtliche Thyroidhormon-Wirkungen auf einer Bildung von L-Thyroxin (T4) und einer anschließenden Deiodierung zu Triiodthyronin (T3) beruhen, welches an die nukleären Thyroidhormon Rezeptoren (THRs) bindet. Über die THRs werden genomische Signalwege vermittelt, die während der Wachstums- und Entwicklungsphase essentiell sind. Beim Erwachsenen werden zudem vorwiegend katabole Stoffwechsel-Prozesse induziert. Jedoch zeigte sich in den letzten 20 Jahren, dass die Signalwege der Thyroidhormone komplexer sind als bisher angenommen. Vor allem die Metabolite des in der Schilddrüse gebildeten T4s, zeigen ein breites Interaktions-Profil mit anderen molekularen Zielstrukturen. Thyronamine, die decarboxylierten Thyroidhormon-Metabolite, binden beispielsweise den G-Protein-gekoppelten Trace Amine Associated Receptor 1 (TAAR1). Wird dieser Rezeptor aktiviert, kommt es innerhalb kürzester Zeit zu einem rapiden Abfall der Köpertemperatur, sowie zu einer akuten Bradykardie. Die durch oxidative Deaminierung gebildeten Iodthyroacetate Tetraiodthyroacetat (TETRAC) und Triiodthyroacetat (TRIAC) sind Antagonisten des Membran-Rezeptors Integrin αVβ3 und besitzen antiproliferative und pro-apoptotische Eigenschaften.
In dieser Arbeit sollte die Hypothese untersucht werden, ob Thyroidhormone neben diesen neuen zumeist nicht-genomischen Signalwegen, auch THR-unabhängige genomische Wirkmechanismen besitzen.
Mit Hilfe eines Gal4-Luciferase-Reportergen-Assays wurde in einem Screening die Aktivität einiger Thyroidhormone und Thyroidhormon-Metabolite an elf THR-ähnlichen Rezeptoren und den drei Retinoid X Rezeptor (RXR)-Subtypen untersucht. Es konnte detektiert werden, dass Thyroidhormone, vor allem TETRAC, potente Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPAR)γ-Agonisten sind, die zum Teil zusätzlich dessen Heterodimer-Partner RXR aktivieren können. Diese PPARγ- und RXR-Aktivität wurde zunächst mit Hilfe eines Coaktivator-Rekrutierungs-Assays, einer Isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) und einer Kristallstrukturanalyse genauer charakterisiert. Zum einen konnte nachgewiesen werden, dass sowohl PPARγ, als auch RXR in artifizielleren Testsystemen durch Thyroidhormone aktiviert werden. Zum anderen konnte die für permissive Heterodimere, wie das PPARγ/RXR-Heterodimer, typische additive Transaktivierungs-Effizienz nach Bindung beider Heterodimer-Partner bestätigt werden. Außerdem zeigte die Untersuchung der Kristallstruktur von TETRAC und PPARγ, dass Thyroidhormone einen abweichenden Bindungsmodus im Vergleich zu anderen PPARγ Agonisten, wie den Glitazonen und entsprechende Fettsäuren oder Fettsäuremimetika, besitzen.
Die Evaluation der biologischen Relevanz der PPARγ/RXR-Heterodimer-Aktivierung ergab zudem, dass TETRAC, als potentester PPARγ-Agonist, in der Lage ist die Differenzierung von Präadipocyten zu Adipocyten zu induzieren. Außerdem wurde die mRNA-Expression wichtiger PPARγ-regulierter Gene in Hepatozyten trotz knockdown beider THR-Isoformen signifikant durch Thyroidhormone induziert.
Für eine erste Abschätzung einer möglichen physiologischen Relevanz der PPARγ/RXR-Aktivierung durch Thyroidhormone, wurde die Bildung von TETRAC nach Inkubation von Hepatozyten mit T4 quantifiziert. Es konnte festgestellt werden, dass ausreichend TETRAC in den Hepatozyten gebildet werden kann, um PPARγ zu aktivieren. Auch in einem in vivo-Experiment, bei dem Mäusen ein mit Brom substituiertes T4-Analog (Br-T4) appliziert wurde, um Interferenzen mit der endogenen Thyroidhormon-Produktion zu verhindern, konnte gezeigt werden, dass die PPARγ-regulierte Genexpression in den Lebern der Tiere induziert wurde. Dies deutete auf eine physiologisch relevante Bildung von Br-TETRAC hin, da Br-TETRAC analog zu TETRAC eine hohe Bindungs-Aktivität an PPARγ besaß, während Br-T4 keine Aktivität an diesem Rezeptor aufwies.
Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass Thyroidhormone neben den THR-vermittelten Effekten auch andere genomische Wirkmechanismen besitzen, indem sie das PPARγ/RXR-Heterodimer aktivieren. Diese biologische Aktivität könnte sowohl eine physiologische als auch eine pharmakologische Relevanz besitzen. Die beiden T4-Metabolite T3 und TETRAC sind in der Lage komplementäre Signalwege zu induzieren. Wird T4 deiodiert kommt es zur Bildung von T3, welches den THR aktiviert. Durch oxidative Deaminierung des T4s bildet sich TETRAC, das wiederum PPARγ bindet und aktiviert. Durch die vermehrte Bildung von TETRAC und anschließende Aktivierung von PPARγ könnte die katabole Wirkung der THR-Signalwege abgeschwächt werden und so eine Art negative Rückkopplung gewährleistet werden. Die physiologische Bedeutung der Interaktion von Thyroidhormonen mit PPARγ/RXR muss jedoch noch genauer untersucht werden.
Aber auch pharmakologisch könnte die Iodthyroacetat-Aktivität an PPARγ eine Rolle spielen. TETRAC könnte durch seinen individuellen Bindungsmodus als Leitstruktur für neue PPARγ-Partialagonisten mit verbessertem Nebenwirkungs-Profil dienen. Außerdem wird das Thyroidhormon-Derivat TRIAC schon jetzt als Leitstruktur für die Entwicklung von Thyroidhormon-Analoga mit THRβ-Selektivität verwendet. Durch die zusätzliche PPARγ-Aktivität könnte zukünftig ein dualer THRβ/PPARγ-Agonist bei Erkrankungen, die mit einer Insulinresistenz einhergehen, Verwendung finden.
Zusammenfassend stellt die Entdeckung der Aktivität von Thyroidhormonen an PPARγ und RXR einen weiteren Baustein im komplexen System der Thyroidhormone dar.
Die vorliegende Dissertation gliedert sich in 2 Abschnitte: Im 1. Abschnitt wurden die Auswirkungen des Naturstoffs Phytol auf den Krankheitsverlauf des murinen EAE-Modells charakterisiert, während im 2. Abschnitt die immunmodulierenden Eigenschaften der neuartigen Leitsubstanzen Silvestrol sowie Steroid Substanz 1o untersucht wurden.
Vorarbeiten zeigten einen positiven Einfluss von Phytol auf den Krankheitsverlauf im murinen EAE-Modell für Multiple Sklerose, eine verringerte Proliferationsfähigkeit von Splenozyten sowie eine Regulation der NOX2 mRNA-Expression (Blum et al., 2018b).
In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Gabe von Phytol den Prozess der Demyelinisierung im lumbalen Rückenmark deutlich reduzierte und die Anzahl der Immunzellen in den inguinalen Lymphknoten sowie im lumbalen Rückenmark signifikant verringerte. Weiterhin konnte eine Regulation der spezifischen T-Zell Transkriptionsfaktoren T Bet sowie Foxp3 nachgewiesen werden. Es zeigte sich, dass Phytansäure, nicht jedoch Pristansäure, die beiden Metaboliten von Phytol, die Proliferationsfähigkeit der T-Zellen signifikant verringerte. Beide Metaboliten zeigten zusätzlich unterschiedlichen Einfluss auf die T-Zell Subtypen. Hultqvist et al. konnten eine verstärkte Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Phytol nachweisen (Hultqvist et al., 2006). Vorarbeiten zeigten eine Steigerung der mRNA-Expression des ROS-produzierenden Enzymkomplex NOX2 im Verlauf des EAE-Modells sowie eine Regulation der NOX2-Expression im lumbalen Rückenmark und in den inguinalen Lymphknoten durch Phytol (Blum et al., 2018b). Deshalb wurde die Rolle von NOX2 an den Phytol-vermittelten Effekten weiter charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die gesteigerte NOX2-Expression im lumbalen Rückenmark auf die eingewanderten Immunzellen zurückzuführen war. Die von NOX2 im zentralen Nervensystem (ZNS) gebildeten ROS, welche zur Schädigung der Myelinschicht beitragen können, wurden durch die Gabe von Phytol im lumbalen Rückenmark verringert. Untersuchungen in NOX2KO-Mäusen zeigten, dass die beobachteten ex vivo Effekte von Phytol sowie dessen Metaboliten nur teilweise NOX2-abhängig waren. Im murinen EAE-Modell mit NOX2KO-Mäusen zeigte Phytol weiterhin einen positiven Einfluss auf die klinischen Symptome. Auffällig war dabei, dass NOX2KO-Tiere grundsätzlich weniger klinische Scores zeigten als Wildtyp Tiere. In NOX2-Chimären hatte Phytol keinen signifikanten Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Grund dafür könnte eine Beschädigung der Blut-Hirn-Schranke bei der Generierung der Chimären und eine damit verbundene verstärkte Infiltration von Immunzellen in das ZNS gewesen sein. Weiterhin konnte Phytol möglicherweise über die geschädigte Blut-Hirn-Schranke verstärkt in das ZNS eindringen und dort über eine gesteigerte ROS-Produktion zu schädigenden Effekten führen.
Die in vivo Daten weisen auf einen überwiegend NOX2-unabhängigen Wirkmechanismus von Phytol hin. Dennoch scheint NOX2 bei einigen Effekten zumindest beteiligt zu sein. Zusammenfassend zeigte die Gabe von Phytol einen überwiegend positiven Einfluss auf den Krankheitsverlauf im murinen EAE-Modell, dennoch ist die Phytol-vermittelte Induktion von NOX2 und die Bildung von ROS kritisch zu sehen, da diese sowohl positive als auch negative Effekte vermitteln und stark von der Quantität sowie der Lokalisation der Bildung abhängig sind.
Im 2. Teilprojekt wurden die immunmodulierenden Auswirkungen der neuartigen Leitsubstanzen Silvestrol sowie Steroid Substanz 1o charakterisiert. Der anti-viral wirksame Naturstoff Silvestrol zeigte dabei diverse Auswirkungen auf die Differenzierung sowie Polarisierung von humanen Makrophagen. Während der Differenzierung inhibierte Silvestrol das anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Potential der Makrophagen durch eine Reduktion der resolutionsfördernden Oberflächenmarker CD206 und TREM2. Weiterhin wurde die Sezernierung der anti-inflammatorischen Zyto- bzw. Chemokine IL-10 und CCL18 verringert. Der pro-inflammatorische Phänotyp von M1-Makrophagen wurde weiterhin durch die vermehrte Bildung von TNF-α unterstützt, während bei M2-Makrophagen der anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Phänotyp verstärkt wurde. In Dendritischen Zellen schien Silvestrol sowohl die Differenzierung als auch die Aktivierung zu inhibieren, da zahlreiche Oberflächenmarker und sezernierte Zytokine signifikant verringert wurden. Die Stoffwechselwege der oxidativen Phosphorylierung und der Glykolyse wurden sowohl in Makrophagen als auch in Dendritischen Zellen signifikant reduziert. Demnach ist unklar, ob in der Summe die pro- oder anti-inflammatorischen Aspekte von Silvestrol überwiegen und ob der Einfluss auf den Stoffwechsel die Immunantwort beeinträchtigt.
Der anti-parasitäre Wirkstoff Steroid Substanz 1o zeigte keinen negativen Einfluss auf die Viabilität in primären humanen Immunzellen bis zu einer Konzentration von 50 µM und verstärkte das pro-inflammatorische Profil von M1-Makrophagen. Weiterhin wurde der anti-inflammatorische bzw. resolutionsfördernde Phänotyp von M2-Makrophagen unterdrückt und stattdessen die pro-inflammatorischen Aspekte verstärkt. Diese Beobachtungen der veränderten Oberflächenmarker sowie der sezernierten Zytokine wurden weiterhin durch die Veränderung des zellulären Stoffwechsels gestützt. Dabei steigerte Steroid Substanz 1o die Glykolyse in M2-Makrophagen, welche eigentlich für M1-Makrophagen charakteristisch ist. Dadurch kann die Verschiebung der M2-Makrophagen zu einem M1-Phänotyp erklärt werden. Weiterhin beeinträchtigte Steroid Substanz 1o die Differenzierung und Aktivierung von Dendritischen Zellen. Zusammenfassend verstärkte Steroid Substanz 1o überwiegend die pro-inflammatorischen Aspekte der Immunreaktion durch eine Aktivierung der M1-Makrophagen. Bei der möglichen Anwendung als Therapeutikum für Malaria sowie Schistosomiasis kann somit das Immunsystem bei der initialen Abwehr der Parasiten unterstützt werden.
Objectives: The main objective of the present work was to combine in vitro and in silico tools to better understand the in vivo behavior of the immediate release (IR) formulation of zolpidem in the fasted and fed states.
Methods: The dissolution of zolpidem was evaluated using biorelevant media simulating the gastric and intestinal environment in the fasted and fed states. Additionally, the influence of high viscosity and high fat content on the release of zolpidem under fed state conditions was investigated. The in vitro results were combined with a physiologically based pharmacokinetic (PBPK) model constructed with Simcyp to simulate the zolpidem pharmacokinetic profile in both prandial states.
Key findings: In vitro biorelevant dissolution experiments representing the fasted and fed states, combined with PBPK modelling, were able to simulate the plasma profiles from the clinical food effect studies well. Experiments reflecting the pH and fat content of the meal led to a good prediction of the zolpidem plasma profile in the fed state, whereas increasing the viscosity of the gastric media led to an under-prediction.
Conclusions: This work demonstrates that the combination of biorelevant dissolution testing and PBPK modelling is very useful for understanding the in-vivo behavior of zolpidem in the fasted and fed states. This approach could be implemented in the development of other drugs exhibiting negative food effects, saving resources and bringing new drug products to the market faster.
The electron transport chain (ETC) is used by cells to create an electrochemical proton gradient which can be used by the ATP synthase to produce ATP. ETC, also called respiratory chain, is formed in mitochondria by four complexes (complex I-IV) and mediated by two electron carriers: cytochrome c and ubiquinone. Electrons are passed from one complex to another in a series of redox reactions coupling proton pumping from the negative (N) side of the membrane to the positive (P) side. Complex I can introduce electrons into the ETC by oxidizing NADH to NAD+ and reducing quinone (Q) to quinol (QH2). The process accomplishes pumping of four protons across the membrane. Complex II is another electrons entry point. It catalyzes the oxidation of succinate to fumarate while reducing Q to QH2. Complex III, also called cytochrome bc1 complex, can transfer the electrons from QH2 to cytochrome c and couple to proton pumping. In complex III the Q-cycle contributes four proton translocations: two protons are required for the reduction of one quinone to a quinol and two protons are released to the P side. Complex IV (cytochrome c oxidase), the terminal complex of the ETC, catalyzes the electron transfer to oxygen and pumps four protons to the P side. Structures of ETC complexes are available. However, the structure of a hyperthermophilic cytochrome bc1 complex has not been elucidated till now. Additionally, the dimeric crystal structure of cytochrome c oxidase from bovine has been discussed controversially.
To build up a functional complex, cofactors are required. The active site of A- and B-type cytochrome c oxidases contain the high spin heme a which is synthesized by the integral membrane protein heme A synthase (HAS). HAS can form homooligomeric complexes and its oligomerization is essential for the biological function of HAS. HAS is evolutionarily conserved among prokaryotes and eukaryotes. Despite its importance, little is known about the detailed structural properties of HAS oligomers.
During my PhD studies, I focused on the cytochrome c oxidase (AaCcO), the cytochrome bc1 complex (Aabc1) and the heme A synthase (AaHAS) from Aquifex aeolicus. This organism is one of the most hyperthermophilic ones and can live at extremely high temperatures, even up to 95 °C. Respiratory chain complexes provide energy for the metabolism of organisms, and their structures have been studied extensively in the past few years. However, there has been a lack of atomic structures of complexes from hyperthermophilic and ancient bacteria, so little is known about the mechanism of these macromolecular machines under hyperthermophilic conditions. Therefore, my PhD studies had four main objectives: 1) to structurally and functionally characterize AaCcO, 2) to reveal the mechanism of Aabc1 thermal stability based on its structure, 3) to determine the oligomerization of AaHAS, 4) to provide valuable insights into the relationship between function and oligomerization of AaHAS.
1) Structure of AaCcO
Heme-copper oxidases (HCOs) catalyze the oxygen reduction reaction being the terminal enzymes in the plasma membranes in many prokaryotes or of the aerobic respiratory chain in the inner mitochondrial membrane. By coupling this exothermic reaction to proton pumping across the membrane to the P side, they contribute to the establishment of an electrochemical proton gradient. The energy in the proton electrochemical proton gradient is used by the ATP synthase to generate ATP. HCOs are classified into three major families: A, B and C, based on phylogenetic comparisons. The well-studied aa3-type cytochrome c oxidase from Paracoccus denitrificans (P. denitrificans) represents A-family HCOs. So far, the only available structure of the ba3-type cytochrome c oxidase from Thermus thermophilus represents the B-family of HCOs. This family contains a number of bacterial and archaeal oxidases. The C-family contains only cbb3-type cytochrome c oxidases.
The AaCcO is one of the ba3-type cytochrome c oxidases. Based on the genomic DNA sequence analysis, it has been revealed that A. aeolicus possesses two operons coding for cytochrome c oxidases (two different subunit I genes, two different subunit II genes and one subunit III gene). So far, only subunits CoxB2 and CoxA2 were identified. The presence of the additional subunit IIa was reported in 2012. Moreover, a previous paper reported that AaCcO can use horse heart cytochrome c and decylubiquinol as electron donors and the typical cytochrome c oxidase inhibitor cyanide does not block the reaction completely.
In the course of my PhD studies, I performed heterologous expression of AaCcO in Pseudomonas stutzeri (P. stutzeri) and co-expression with AsHAS in Escherichia coli, respectively. The subcomplex CoxA2 and CoxB2 can be purified from P. stutzeri, however, it lacks heme A. Additionally, a protocol for the heterologous production of cytochrome c555 from A. aeolicus was established. In parallel, I also purified the AaCcO from native membranes according to previously reported methods with some modifications. The activity of AaCcO with its native substrate, cytochrome c555, was 14 times higher than with horse heart cytochrome c.
To enable a detailed investigation and comparison of AaCcO and other cytochrome c oxidases, the cryo-EM structure of AaCcO was determined to 3.4 Å resolution. It shows that the three subunits CoxA2, CoxB2, and IIa are tightly bound together to form a dimer in the membrane. Surprisingly, CoxA2 contains two additional TMHs (TMH13 and TMH14) to enhance the protein stability. The cofactors heme a3, heme b, CuA and CuB are also identified. Interestingly, two molecules of 1,4-naphthoquinone and cardiolipin were observed in the dimer interface. Based on the structure analysis, the AaCcO possesses only the K-pathway for proton delivery to the active site and proton pumping.
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Uncaging approach, native membrane dynamics and lipidic cubic phases in biomolecular solid-state NMR
(2019)
It was previously shown for the Escherichia coli diacylglycerol kinase (DgkA) that enzyme-reactions at the membrane interface can be monitored by solid-state NMR. However, such studies can face problems due to limited accessibility of the active sites: Natural substrates for membrane enzymes, but also ligands for membrane proteins or lipid mediators, are either partitioning into the membrane and cannot be added easily, or if soluble exhibit accessibility restrictions, as they cannot freely pass through lipid bilayers. This situation complicates quantitative kinetic analysis of biochemical processes such as enzyme activity, ligand binding, but also oligomerization or folding reactions in the membrane or at its interface under MAS NMR conditions.
To overcome these limitations the feasibility and possible advantages of the uncaging approach as a new tool for biomolecular solid-state NMR to trigger reactions by light have been explored. DgkA’s enzymatic activity, exemplary of a biochemical process on the membrane interface, was thereby triggered in situ during MAS by light-induced release of its substrates that were rendered inactive with photolabile protecting groups. To be capable of uncaging sufficient amounts of substrate during MAS to follow the enzymatic reaction via 31P real-time NMR measurements, several illumination variants including an existing illumination setup to study retinal proteins under cryogenic conditions via DNP enhanced NMR were tested. As uncaging of micromole amounts of substrates requires a higher flux compared to initiation of a photocycle in retinal proteins, a new illumination setup was built with Bruker Biospin and Leoni Fibertech. It consists of a modified MAS probe and a suitable fiber bundle, allowing to efficiently couple light from high power LEDs into a sapphire rotor containing the sample, without disturbing the magnetic field homogeneity or sample rotation. By reducing the sample volume to the illuminated area up to 60 mM ATP were released by uncaging NPE ATP to initiate DgkA’s activity in several tested membrane mimetics. These mimetics included liposomes and bicelles, which are well established in the field of biomolecular solid state NMR as well as the optically transparent lipidic cubic phase of monoolein, widely used in membrane protein crystallography, but not yet well characterized as membrane mimetic under MAS conditions. A unique and powerful but compared to time and spatial resolution often underrepresented advantage of the uncaging approach for biophysical studies has been demonstrated by successful uncaging of a non-miscible lipid substrate to trigger DgkA’s kinase reaction: Initiation of processes that cannot easily be triggered by mixing. Examples of these are reactions involving highly hydrophobic, membrane partitioning compounds including lipid substrates, ligands or interaction partners, but also oligomerization or folding of biomacromolecules. The herein performed experiments therefore serve as a first demonstration of the uncaging approach’s feasibility and compatibility with a wide variety of membrane mimetics and give a first indication of its potential for a variety of biomolecular solid state NMR experiments.
As high accessibility for solutes has been a second focus for the choice of membrane mimetics, DgkA’s activity in the lipidic cubic phases of monoacylglycerols with its two continuous networks of water channels has been further characterized. Kinetic parameters obtained from 31P real time solid state NMR experiments revealed that DgkA’s activity is similar to activities obtained in swollen cubic phases in a bath solution with wider water channels. Diffusion of ATP in a non swollen cubic phase was however strongly reduced compared to ATP in solution as diffusion measurements showed. Therefore, saturation of the enzyme required distinctly higher ATP concentrations. These results thereby underline the advantage of a non invasive and label free method like NMR to directly gain information about enzymatic reactions of immobilized enzymes in porous materials. The obtained wealth of information from 31P real time NMR experiments and biochemical assays in different membrane mimetics in presence and absence of lipid substrates and activators also provided further insight into DgkA’s enzymatic activity. It confirms ATP binding and hydrolysis in the absence of a lipid substrate, in agreement with the proposed mode of substrate binding, and allowed to estimate the in vivo relevance of previously observed ATPase activity in liposomes.
Further exploration of the cubic phase as membrane mimetic for protein solid state NMR revealed its high stability under MAS at elevated temperatures and capacity to reconstitute sufficient amounts of DgkA. Unlike monoolein, DgkA was cross-polarizable in a cubic phase and exhibited similar dynamics compared to DgkA reconstituted into liposomes, allowing to acquire the herein shown dipolar coupling based 2D protein spectra. As lipidic cubic phases are not containing phospholipids, monoacylglycerols could be especially useful as membrane mimetics for 31P correlation spectra. Initial experiments under DNP conditions, where in liposomes line broadening causes severe overlap of phospholipid signals and unspecific cross polarization highlight this aspect.
In summary, herein reported results of the experiments performed with lipidic cubic phases demonstrate that they are robust and versatile membrane mimetics. They could be of advantage for a variety of solid-state NMR experiments where either optical transparency for efficient illumination is desired, accessibility for solutes and membrane components under MAS is required, or interference of phosphorous signals of other membrane mimetics must be avoided.
In the second chapter of this thesis 1H solid-state NMR as a label free method to probe membrane order and dynamics directly within a cellular and disease relevant context was used to observe the effects of soluble epoxide hydrolase (sEH) encoding gene knock-outs on membrane dynamics. Knock-out of the sEH encoding gene changed the overall membrane dynamics in the physiological temperature range of native membranes derived from mouse brains, making the bulk membrane more dynamic. To confirm that these effects are related to the enzymatic activity of sEH, substrates and products of sEH were added to evaluate their effects on membrane dynamics. 19,20 dihydroxydocosapentaenoic acid (DHDP), a product of sEH, partially reversed the knock out phenotype in a concentration dependent manner whereas the substrate 19,20 epoxydocosapentaenoic acid did not cause any effects. As both polyunsaturated fatty acids did not show differences in phase behavior in a simple phospholipid bilayer these results provide evidence that the previously observed concentration dependent DHDP induced relocation of cholesterol away from detergent resistant lipid raft fractions is associated with alteration of membrane dynamics. Therefore, also the effect of cholesterol removal via cyclodextrin on membrane dynamics was analyzed. Removal of cholesterol led to a similar temperature profile of wild type and knock out membranes thereby supporting the hypothesis that DHDP induced relocation of cholesterol is causing altered membrane dynamics. These alterations have been shown by the lead authors of the collaborative research project to induce relocation of various membrane proteins and are involved in the development of diabetic retinopathy. Furthermore, in this context inhibition of sEH has been shown to inhibit diabetic retinopathy and proposed as target for prevention of one of the leading causes of blindness in the developed world.
The endosteal bone marrow niche and vascular endothelial cells provide sanctuaries to leukemic cells. In murine chronic myeloid leukemia (CML) CD44 on leukemia cells and E-selectin on bone marrow endothelium are essential mediators for the engraftment of leukemic stem cells (LSC). We hypothesized that non-adhesion of CML-initiating cells to E-selectin on the bone marrow endothelium may lead to superior eradication of LSC in CML after treatment with imatinib than imatinib alone. Indeed, here we show that treatment with the E-selectin inhibitor GMI-1271 in combination with imatinib prolongs survival of mice with CML via decreased contact time of leukemia cells with bone marrow endothelium. Non-adhesion of BCR-ABL1+ cells leads to an increase of cell cycle progression and an increase of expression of the hematopoietic transcription factor and protooncogene Scl/Tal1 in leukemia-initiating cells (LIC). We implicate SCL/TAL1 as indirect phosphorylation target of BCR-ABL1 and as a negative transcriptional regulator of CD44 expression. We show that increased SCL/TAL1 expression is associated with improved outcome in human CML. These data demonstrate the BCR-ABL1-specific, cell-intrinsic pathways leading to altered interactions with the vascular niche via the modulation of adhesion molecules - a strategy therapeutically exploitable in future.
In der vorliegenden Arbeit konnte die Entwicklung und Evaluierung einer neuen Apparatur zur Untersuchung der Freisetzungseigenschaften von kolloidalen Arzneiträgern erfolgreich umgesetzt werden. Verschiedene Prototypen und Versionen des Dispersion Releasers konnten entwickelt und mit Hilfe der Werkstatt des Fachbereiches 14 umgesetzt werden. Dabei ermöglicht die letzte Optimierung (Version 3) den Einsatz beider relevanter Dialysemembranen. Sowohl regenerierte Cellulose als auch Celluloseacetat konnten zur Freisetzungsuntersuchung eingesetzt werden. Vorteilhaft ist diese Optionalität vor allem, da auf diese Weise Partikelsysteme und Wirkstoffe mit unterschiedlichen physiko-chemischen Eigenschaften in der gleichen Apparatur auf das Freigabeverhalten untersucht werden können. Darüber hinaus hat der Dispersion Releaser das Potential, sich im Bereich der Freisetzungsuntersuchungen kolloidaler Arzneiträger über den Arbeitskreis von Dr. Wacker hinaus zu einem bevorzugten Testsystem zu entwickeln. In diesem speziellen Gebiet der Freisetzungsuntersuchung von kolloidalen Arzneiträgern wie Nanopartikeln oder Liposomen existiert bisher keine Apparatur, die als sogenannter Gold-Standard angesehen werden kann. Untersuchungen mittels der Durchflusszelle, dem A4D oder Sample & Separate Methoden im Labormaßstab unterliegen kaum standardisierbaren Bedingungen und diversen Limitierungen. Der Dispersion Releaser ist einfach zu handhaben und mit wenig Aufwand in die Freisetzungsapparatur 2 nach Ph. Eur. einzubauen. Zu den zahlreichen Vorteilen gehören außerdem die Kontrolle der Rührgeschwindigkeit sowie der Temperatur und der mögliche Probenzug in beiden Kompartimenten der Dialysezelle. Würden mehr Freisetzungsuntersuchungen von kolloidalen Arzneiträgern mit der gleichen, im besten Falle standardisierten, Apparatur durchgeführt, so würde dies die Vergleichbarkeit der Resultate erheblich verbessern.
Die präparierten Modellarzneiformen der beiden Arzneistoffe mTHPC und Flurbiprofen konnten die Funktionalität des Dispersion Releasers mittels der erhobenen Freisetzungsprofile belegen. Es konnten sowohl schnell als auch langsamer freisetzende kolloidale Formulierungen produziert und identifiziert werden. Als Standard-Freisetzungsmedium diente ein 10 mM Phosphatpuffer versetzt mit Natrium- und Kaliumchlorid bei pH 7,4. Dieser im Hinblick auf pH-Wert, Osmolalität und Pufferkapazität dem Blut angepasste Puffer lieferte reproduzierbare Freisetzungsprofile für alle untersuchten Partikelsysteme. Der Zusatz von Plasmaproteinen erfolge durch Zufügen von FBS zu diesem Standardpuffersystem oder durch Verwendung des im Ph. Eur. gelisteten Phosphatpuffers pH 7,2 mit Rinderalbumin. Der Effekt der im Plasma natürlicherweise enthaltenen Komponenten, insbesondere der Plasmaproteine, auf das Freisetzungsprofil zeigt in dieser Arbeit, dass -wie erwartet- die Freisetzungseigenschaften in komplexen, bzw. physiologischen Medien deutlich von denen in einfachen Puffersystemen abweichen können. Die Anwesenheit von Plasmaproteinen führte zu einer veränderten Freisetzungsrate, sowohl im Falle von Flurbiprofen als auch im Falle von mTHPC. Für mTHPC konnte außerdem der Zusatz von lösungsvermittelndem Methyl-ß-cyclodextrin zum Freisetzungsmedium etabliert werden. Gegenüber üblicherweise eingesetzten Tensiden verändert dieses cyclische Zuckermolekül die Oberflächenspannung des Mediums und damit die Benetzbarkeit der Partikel nicht.
Die mittels Dispersion Releaser und Dialysesack erhobenen Freisetzungsdaten des Wirkstoffes Flurbiprofen wurden in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Li Kirsamer einer mathematischen Auswertung unterzogen. Auf diese Weise konnte zunächst das Freisetzungsprofil beider Kompartimente der Dialyse dargestellt werden, wodurch weitere Erkenntnisse der Qualität des kolloidalen Trägers und seiner Eignung für den jeweiligen Arzneistoff abgeleitet werden können. Die Auswertung an Hand dieses Modells berücksichtigt zwar die Fraktion des freigesetzten Wirkstoffes in beiden Kompartimenten, ermittelt jedoch keine theoretische Freisetzungsrate welche ohne Membrankinetik messbar wäre. Dies wäre in der Auswertung von Freisetzungsdaten ebenfalls von Interesse, konnte jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht näher untersucht werden. Berechnungen wie diese können in weiterführenden Arbeiten möglicherweise dazu dienen, in vitro Freisetzungsdaten mit Plasmaprofilen zu korrelieren. Mit dem Erwerb der Rechte an dem Dispersion Releaser durch die Firma Pharma Test Apparatebau AG im Jahr 2016 wurde der Weg für eine mögliche breite und auch kommerzielle Nutzung der neuartigen Apparatur eingeleitet. Diese Transaktion und die andauernde Kooperation zwischen Pharmatest und dem Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. Wacker soll die erfolgreiche Beantwortung der Fragestellungen innerhalb der vorliegenden Arbeit mit dem Titel „Entwicklung einer Apparatur zur in vitro Testung der Wirkstofffreisetzung aus kolloidalen Arzneistoffträgern“ hervorheben.
The members of the multidrug/oligosaccharidyl-lipid/polysaccharide (MOP) transporter superfamily mediate export of a wealth of molecules of physiological and pharmacological importance. According to the Transporter Classification Database (TCDB), the MOP superfamily is mainly categorized into six distantly related families functionally characterized families: the multidrug and toxic compound extrusion (MATE), the polysaccharide transporter (PST), the oligosaccharidyl-lipid flippase (OLF), the mouse virulence factor (MVF) the agrocin 84 antibiotic exporter (AgnG), and the progressive ankylosis (Ank) family. Among these, the multidrug resistance MATE family transporters are most ubiquitous, being present in all domains of life: Archaea, Bacteria and Eukarya. As secondary active transporters, they utilize transmembrane electrochemical ion gradients of Na+ and/or H+ in order to drive the efflux of xenobiotics or cytotoxic metabolic waste products with specificity mainly for polyaromatic and cationic substrates. Active efflux of drugs and toxic compounds carried out by multidrug transporters is one of the strategies developed by bacterial pathogens to confer multidrug resistance. MATE proteins provide resistance to, e.g., fluoroquinolone, aminoglycoside antibiotics, and anticancer chemotherapeutical agents, thus serving as promising pharmacological targets for tackling a severe global health issue. Based on their amino acid sequence similarity, the MATE family members are classified into the NorM, the DNA-damage-inducible protein F (DinF), and the eukaryotic subfamilies. Structural information on the alternate conformational states and knowledge of the detailed mechanism of the MATE transport are of great importance for the structure-aided drug design. Over the past decade, the crystal structures of representative members of the NorM, DinF and eukaryotic subfamilies have been presented. They all share similar overall architecture comprising 12 transmembrane helices (TMs) divided into two domains, the N-terminal domain (TMs 1-6) and the C-terminal domain (TMs 7-12), connected by a cytoplasmic loop between TM6 and TM7 (Fig. II.1). Since all available MATE family structures are known only in V-shaped outward-facing states with the central binding cavity open towards the extracellular side, a detailed understanding of the complete transport cycle has remained elusive. In order to elucidate the underlying steps of the MATE transport mechanism, structures of distinct intermediates, particularly inward-facing conformation, are required.In my PhD project, structural and functional studies have been performed on a MATE family (DinF subfamily) transporter, PfMATE, from the hyperthermophilic and anaerobic archaeon Pyrococcus furiosus. This protein was produced homologously in Pyrococcus furiosus as well as heterologously in Escherichia coli, and used for the subsequent purification and crystallization trials by the vapor diffusion (VD) and lipidic cubic phase (LCP) method. To the best of my knowledge, PfMATE is the first example of a successful homologous production of a membrane protein in P. furiosus. Due to the very low final amount of the purified protein from the native source, the heterologously produced PfMATE samples were typically used for the extensive structural studies. Crystal structures of PfMATE have been previously determined in an outward-facing conformation in two distinct states (bent and straight) defined on the arrangement of TM1. A pH dependent conformational transition of this helix regulated by the protonation state of the conserved aspartate residue Asp41 was proposed. However, it has been discussed controversially, leading to the hypothesis about TM1 bending to be rather affected by interactions with exogenous lipids (monoolein) present under the crystallization conditions. Based on these open questions, an experimental approach to investigate the role of lipids as structural and functional modulators of PfMATE has been taken in the course of my PhD project. The interplay between membrane proteins and lipids can affect membrane protein topology, structure and function. Considering differences between archaeal and bacterial lipid composition, cultivation of P. furiosus cells and extraction of its lipids was followed by the mass spectrometry (MS) based lipidomics for identification of individual lipid species in the archaeal extract. In order to assess the effects of lipids on PfMATE, different lipid molecules were used for co-purification and co-crystallization trials. This dissertation presents a workflow leading to the structure determination of a MATE transporter in the long sought-after inward-facing state, which has been achieved upon purification and crystallization of the heterologously produced PfMATE in the presence of lipids from its native source P. furiosus. Also, the PfMATE outward-facing state obtained from the crystals grown at the acidic pH conditions sheds light on the previously proposed pH-dependent structural alterations within TM1. It is interesting to note that the inward and outward-facing states of PfMATE were obtained from the crystals grown under similar conditions, but in the presence and absence of native lipids, respectively. This observation supports the hypothesis about physiologically relevant lipids to act as conformational modulators or/and a new class of substrates, expanding the substrate spectrum of the MATE family transporters. Comparative analysis of two PfMATE states reveals that transition from the outward to the inward-facing state involves rigid body movements of TMs 2-6 and 8-12 to form an inverted V, facilitated by a loose binding of TMs 1 and 7 to their respective bundles and their conformational flexibility. Local fluctuations within TM1 in the inward-facing structure, including bending and unwinding in the intracellular half of the helix, invoke its highly flexible nature, which is suitable for ion and substrate gating.
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Food allergies are defined as an adverse health effect arising from a specific immune response that occurs reproducibly on exposure to a given food. The prevalence of food allergies has increased in the past decade. Epidemiologic studies involving controlled food challenges for the diagnosis of food allergies indicated that between 1 % to 10.8 % of the population have immunemediated non-toxic food hypersensitivity.
Despite the increasing prevalence, no curative treatment has been established for food allergies so far except the complete avoidance of the elicited food. To establish safe and effective immunotherapy for food allergies, it is of crucially importance to elucidate pathological mechanism of such diseases.
Food allergies are classified into IgE-mediated and non-IgE mediated (T-cell mediated) allergies, depending on the immunologic pathways and the role of the IgE on the pathogenesis of the disease. Allergic enteritis (AE) is a gastrointestinal form of food allergy. It is classified as non-IgE-mediated food allergy. However, patients with AE often develop IgE and high levels of IgE have been associated with development of persistent AE. The gastrointestinal symptoms of AE are nonspecific, resulting in the fact that a broad differential diagnoses including diagnostic approaches for allergic diseases are necessary to rule out other gastrointestinal pathologies. Biopsies of patients with allergic enteritis have shown infiltration of inflammatory cells (e.g. mast cells, eosinophils, neutrophils, and T cells) in the lamina propria, disruption of intestinal villi, edema, and presence of goblet cells in the intestine...
This dissertation contains two chapters. Each chapter covers a unique topic within RNA science and is divided in two sub sections, part A and B. Each chapter contains an introduction.
Chapter 1 gives an insight into challenges encountered during sample design and preparation for single molecule Förster energy transfer (smFRET) spectroscopy and offers a solution via a newly establishedestablished workflow to obtain accurate smFRET constructs. Following this workflow, a FRET network could be generated, which allowed a detailed structural dynamics study on H/ACA RNP during catalysis with smFRET spectroscopy. This led to detailed mechanistic insights into H/ACA RNPs dynamics during catalysis.
Chapter 2 deals with RNA synthetic biology whereby a novel eclectic design strategy for RNA of interest (ROI) release platform is presented, which allows to release a diverse ROI sequences with single nucleotide precision triggered by an external stimulus. This design strategy was used to establish a ROI release system and its powerful performance in in vitro and in vivo applications was shown.
Eukaryotische Zellen sind durch, aus Lipiddoppelschichten bestehenden, Membranen in Kompartimente mit unterschiedlichen Funktionen eingeteilt. Um einen Transport von Molekülen über die Membranen hinweg zu gewährleisten, werden Kanälen und Transporter benötigt. Eine Familie von Transportern sind die ATP-binding cassette (ABC) Transporter, die in allen Lebewesen, von Bakterien bis zum Menschen, vorkommen. Ein Mitglied dieser Familie ist der transporter associated with antigen processing-like (TAPL oder ABCB9). TAPL ist ein lysosomaler Polypeptidtransporter der per ATP-Hydrolyse Peptide von 6 – 59 Aminosäuren Länge vom Zytosol in das Lumen der Lysosomen transportiert. Hierbei kann TAPL, das ein Homodimer ist, in zwei funktionale Domänen geteilt werden. Der Teil des Komplexes, der für den Transport zuständig ist, wird als coreTAPL bezeichnet. Dieser beinhaltet die zytosolischen nucleotide binding domains (NBDs), die ATP binden und hydrolysieren können, und die Transmembrandomänen (TMDs), die Peptide binden und sie durch konformationelle Änderungen auf der anderen Membranseite freilassen. Die zweite Domäne ist eine N-terminale TMD, die als TMD0 bezeichnet wird. Dieser, aus vier Transmembranhelices (TMHs) bestehende Teil des Proteins, ist für die Lokalisation von TAPL in der lysosomalen Membran verantwortlich, sowie für die Interaktion mit den dort lokalisierten Membranproteinen LAMP-1 und LAMP-2. CoreTAPL ohne die TMD0s erreicht nicht die Lysosomen, sondern liegt in der Plasmamembran (PM) der Zelle vor. Die TMD0 hingegen benötigt coreTAPL nicht um korrekt in der lysosomalen Membran lokalisiert zu sein.
Die korrekte Lokalisation in der Zelle ist ein kritischer Punkt für ein Protein, um seine Funktion ausüben zu können. Die Transportprozesse vom Ort der Synthese des Proteins, dem Endoplasmatischem Reticulum (ER), zum Organell wo es seine Funktion ausüben soll, umfassen dutzende Proteine und Proteinkomplexe und ein komplexes Zusammenspiel zwischen Proteinen und den einzigartigen Lipidzusammensetzungen der Membranen verschiedener Organellen. Auf das Einfachste heruntergebrochen benötigt ein Transmembranprotein eine kurze Aminosäuresequenz auf der zytosolischen Seite, die Signalsequenz. Diese Sequenz wird von sogenannten Adapterproteinen erkannt, die wiederum andere Bestandteile der zellulären Maschinerie rekrutieren, die letztlich Vesikelbildung, Transport und Fusion mit der Zielorganelle vermitteln. Allerdings weisen nicht alle lysosomalen Transmembranproteine eine solche Signalsequenz auf, sondern besitzen unkonventionelle Zieldeterminanten, wie posttranslationale Modifikationen, oder sie interagieren mit anderen Proteinen, die wiederum die Interaktion mit den Adapterproteinen vermitteln.
Der Fokus der vorliegenden Arbeit liegt in der erfolgreichen Entwicklung von vier neuen Methoden zur Darstellung von Sulfonen und von einer neuen Methode zur Synthese von N-Aminosulfonamiden. Dabei sollen die Strukturmotive von Sulfonen und Sulfonamiden aus stabilen Startmaterialien in einer einfachen Durchführung, vorzugsweise in einer Eintopf-Synthese oder Multikomponenten-Reaktion, aufgebaut und der Reaktionsmechanismus weitestgehend experimentell aufgeklärt werden. In diesem Rahmen konnte die Lücke einer Nickel-katalysierten Darstellung von Diarylsulfonen sowohl unter thermischen als auch unter photochemischen Bedingungen gefüllt werden. Zusätzlich konnten im Bereich der SO2-Fixierung Sulfonylradikale mittels Diaryliodoniumsalzen und sichtbaren Licht erzeugt werden, die mit dem entsprechenden Quencher zum Sulfonamid oder Sulfon weiter reagieren konnten.
Protein quality control (PQC) machinery is in charge of ensuring protein homeostasis in the cell, i.e. proteostasis. Chaperones assist polypeptides throughout their maturation until functionality is achieved. This process might be disrupted in the presence of mutations or external damaging agents that affect the folding and stability of proteins. In this case, proteins can be efficiently recognized and targeted for degradation in a controlled manner. Ubiquitylation refers to the covalent attachment of one or more ubiquitin moieties to faulty proteins, thus triggering their degradation by the 26S proteasome.
More than 30% of proteins need cofactor molecules. Lack of cofactors renders proteins non-functional. We wanted to understand how the PQC deals with wild-type proteins in the absence of their cofactors. Several studies have indicated the importance of the riboflavin-derived cofactor FAD in the stability of individual flavoproteins, and hence we assumed that loss of flavin should mediate a targeted degradation of this group of proteins. Indeed, our mass spectrometry experiments showed that flavoproteome levels decreased under riboflavin starvation. The oxidoreductase NQO1 was used as a model enzyme to further investigate the mechanism of flavoproteome targeting by the PQC. We showed that cofactor loading determines ubiquitylation of NQO1 by the co-chaperone CHIP, both in vivo and in vitro. Furthermore, subtle changes in the C-terminus of NQO1 in the absence of FAD seemed to be crucial for this recognition event. ApoNQO1 interactome differed from holoNQO1. Chaperones and degradation factors were enriched on NQO1 upon cofactor withdrawal, probably to support maturation and prevent aggregation of the enzyme.
Loss of protein folding and stability, even to a small extent, can enhance the aggregating behavior of proteins. Proper loading with FAD reduced the co-aggregation of NQO1 with Aβ1-42 peptide. We assumed that the flavoproteome might represent aggregating-prone species under riboflavin deprivation. Supportingly, reversible apoNQO1 aggregates were observed in vivo in the absence of cofactor. General amyloidogenesis in vivo also increased under these conditions, apparently as a result of flavoproteome destabilization. In this context, we think that our data might have important implications considering the onset and development of conformational diseases.
This work has shed some light on the therapeutic implications of riboflavin deficiency as well. The sensitivity of melanoma cells towards the alkylating agent methyl methanesulfonate (MMS) increased under riboflavin starvation. Subsequent analyses indicated that a complex metabolic reorganization, mostly affecting proliferation and energy metabolism, occurs in response to starvation. What we suggest to call “flavoaddiction” can be understood as the dependence of melanoma cells on the flavoproteome structural and functional intactness to survive chemotherapy. Understanding this cellular reprogramming in detail might reveal new possibilities for future therapies.
Epigenetic mechanisms largely influence how genetic information on DNA level is translated into different phenotypes. DNA methylations and histone post-translational modifications make up what is referred to as "epigenetic landscape", an interconnected pattern that regulates access to genes and serves as platform for specific binding partners. The epigenetic landscape is maintained by "writers", which add the modifications, "erasers", which delete the modifications and "readers" which specifically bind modifications and mediate their location to other proteins connected to transcription. In the context of acetylations, which are the focus of this thesis, the writers are called histone acetyl transferases (HATs), the erasers are called histone deacetylases (HDACs) and the readers comprise Bromodomains (BRDs) as well as Yaf9, ENL, AF9, Taf14, Sas5 (YEATS) domains. An aberrant epigenetic landscape and mutated forms of epigenetic readers can lead to diseases including cancer and inflammatory diseases, making epigenetic reader domains attractive drug targets.
The focus of this thesis were YEATS domains and the development of inhibitors for this new class of epigenetic readers. Eleven-nineteen-leukemia protein (ENL) and ALL1-fused gene from chromosome 9 protein (AF9) are also part of the super elongation complex and are common fusion partners of mixed lineage leukemia protein (MLL) in acute myeloid leukemia (AML) (Wan et al., 2017, Erb et al., 2017). In this thesis, the first ligand-free crystal structure of ENL YEATS revealed an inherent flexibility of the Y78 side chain in the aromatic triad and two conserved water molecules. Soaking experiments led to the first co-crystal structures between a YEATS domain and small molecule inhibitors and defined prerequisites for ENL YEATS inhibitor scaffolds. The discovered inhibitory fragments had a central amide bond in common, which replaced one of the two conserved water molecules to form beta-sheet-like hydrogen bonds between the loop 6 backbone and the S58 side chain. The amide bond was flanked by two aromatic moieties, of which one stacks with H56 in the front pocket and the other interacts with the aromatic triad in the rear pocket. The development of the first chemical probe for ENL/AF9, SGC-iMLLT, show that the affinity is increased to low nanomolar levels if the rear flanking aromatic moiety forms additional hydrogen bonds with loop 6 and the side chain of E75 (Moustakim et al., 2018). In case of the probe, this is achieved with a 2-methyl-pyrrolidine-benzimidazole moiety. The probe binds with high affinity to ENL (129 nM) and AF9 (77 nM) and shows no significant affinity towards other human YEATS domains or BRDs. Target engagement was shown by fluorescence recovery after photobleaching (FRAP), cellular thermal shift assay (CETSA) and in case of AF9 also with NanoBRET. The probe changed the expression of three AML-related genes (MYC, dendrin and CD86) in MV4;11 cells, encouraging application of this probe in more AML cell lines.
This doctoral thesis deals with the structural and dynamical NMR characterization of biomolecules, covering a broad range of proteins, from small peptides to large GPCRs proteins. This work consists of two projects, which are presented in chapter II and III. Chapter II is focused on the structural screening of peptides and small proteins ranging from 14 to 71 amino acids, while chapter III describes the structure and light dynamics of the disease relevant rhodopsin G90D mutant. The main method used to investigate both types of proteins is NMR spectroscopy. Both chapters comprise individual general introduction, materials and methods, results and discussion sections, and a final conclusion paragraph.
‘Chapter I: Methodological aspects of protein NMR spectroscopy’ presents an overview of different NMR methods developed for the rapid characterization of protein structure and dynamics. Multidimensional NMR, which is routinely used in structural biology, is indispensable for protein structure determination in solution. However, detailed information with resolution at the atomic level is time consuming and requires weeks of expensive measurement time, followed by the manual data analysis. Therefore, the development of time-saving NMR techniques is highly required for screening studies of a large amount of proteins, and can be also helpful for studying unstable biomolecules, as their short lifetime often restricts the experimental procedure.
This chapter covers the two main approaches to accelerate a multidimensional NMR experiment: fast-pulsing techniques that aim to reduce the duration of an individual measurement, and non-uniform sampling technique (NUS), which was developed to reduce the overall number of increments in virtual time domains. A combination of both approaches, fast-pulsing and non-uniform sampling, allows speeding up the measurement time by 2-3 orders of magnitude. Furthermore, recently developed software called TA (targeted acquisition) combines various time-saving approaches, including fast-pulsing, non-uniform sampling and targeted acquisition. Targeted acquisition algorithm records a set of multidimensional NMR spectra in semi-interleaved incremental mode. This provides the ability to monitor the quality of the recorded spectra in real-time and therefore enables the completion of the experiments after the desired quality is achieved. Using this approach will greatly reduce the measurement time without losing important structural information. The implemented automated FLYA assignment further contributes to the rapid and simplified readout of the chemical shift assignment progress of the TA program. During this doctoral dissertation, the scientific collaboration with the TA software developer Prof. Vladislav Orekhov (Sweden) took place, and resulted in the successful establishing of this new NMR technology in the Schwalbe laboratory. TA is now routinely applied in Prof. Schwalbe group for the structure elucidation of small proteins.
‘Chapter II: Rapid NMR and biophysical characterization of small proteins’ describes the structural analysis of peptides and small proteins, which were recently identified within the framework of the Priority Program (SPP 2002). Due to technical limitations in detections of small systems and strict assumptions concerning the smallest size of the gene that can be translated, small open reading frames (sORFs) were excluded from the automated gene annotation for a very long time. Thanks to the newly developed computational and experimental approaches, the ability to identify and detect the small proteins consisting of less than approximately 70 amino acids sparked a growing scientific interest by microbiologist. In the past years, hundreds of new short protein sequences were discovered. Although some peptides were found to be involved in diverse essential biological processes, the functional elucidation of a large number of recently discovered peptides and small proteins remains a challenging task. It is well established that the structure of proteins is often linked to their function. However, the size of small constructs often restricts the possible diversity of secondary structure elements that might be adopted by a protein. Furthermore, as was shown for intrinsic discorded proteins (IDPs), the absence of a well-defined three-dimensional structure does not necessarily mean lack of function. Moreover, peptides, which are initially unstructured in the isolated form can fold in a stable structured conformation upon interaction with their biological partners. Solution state NMR spectroscopy is perfectly amenable for the structural characterization of systems of this size. It provides a rapid readout about the conformational state of small peptides unambiguously, distinguishing between folded, molten globule and unstructured conformations.
During this doctoral thesis the workflow protocol for fast screening of peptides and small proteins was established and applied to 20 candidates ranging from 14 to 71 amino acids, which were identified and selected by six microbiological groups, all members of the Priority Program on small proteins (SPP2002) funded by the German research foundation (DFG). The screening protocol includes sample preparation and biochemical characterization. Peptides containing less than 30 amino acids were synthesized by solid phase synthesis (SPPS), while small proteins containing more than 30 amino acids were heterologously expressed in E. coli.
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Die Kenntnis der Struktur von Biomolekülen und der biologischen Abläufe, in welche diese involviert sind, ist grundlegend für die Entwicklung von medizinischen Behandlungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Systeme zur Untersuchung von Biomolekülen, insbesondere Proteinen, hergestellt. Im Mittelpunkt stand die Entwicklung von Materialien, welche neue Möglichkeiten zur Präparation von Proteinen zur Untersuchung derer Struktur mittels Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) eröffnen. In zwei weiteren Projekten wurden biomimetische Systeme aufgebaut, welche die Oberfläche eines Biomoleküls oder biologischen Ensembles nachahmen und hierdurch deren Untersuchung ermöglichen. Hier wurden Systeme zur einfachen Nachbildung biologischer Membranen oder Proteinoberflächen betrachtet.
Eine wichtige Methode zur Untersuchung der dreidimensionalen Struktur von Biomolekülen ist die Kryo-TEM. Zur Mikroskopie werden die Biomoleküle in wenige Mikrometer großen Löchern eines amorphen Kohlenstofflochfilms mittels einer wenige Nanometer dicken Schicht aus amorphem Eis fixiert. Hierfür wird ein dünner Film einer wässrigen Probe auf den Kohlenstofflochfilm aufgebracht und gefroren. Insbesondere für Membranproteine ist die Herstellung derartiger Proben schwierig, da die Proteinpartikel zur Aggregation und Adsorption an dem Kohlenstofflochfilm neigen, wodurch keine Partikel in den Löchern des Kohlenstofffilmes auftreten, welche mikroskopiert werden können.
In dieser Arbeit wurden Materialien zur Verbesserung der Präparation von Proteinen für die Kryo-TEM entwickelt. Es wurden hierfür verschiedene biorepulsive Materialien, auch solche, welche eine spezifische Anbindung der Biomoleküle erlauben, untersucht. Da in der TEM die Probe durchstrahlt wird, eignen sich Nanometer dünne Membranen dieser Materialien als Trägermaterial für die Biomoleküle, da sie nur zu einem geringen Hintergrund führen. Zum einen wurden Nanomembranen durch die chemische Quervernetzung von Nanometer dicken Hydrogelfilmen mit verschiedenen quervernetzenden Molekülen hergestellt. Zum anderen wurden Trägerfilme, wie amorphe Kohlenstofffilme oder Kohlenstoffnanomembranen (engl. carbon nanomembranes, CNM) biorepulsiv funktionalisiert. Darüber hinaus wurde eine Nitrilotriessigsäure(NTA)-funktionalisierte Hydrogel-beschichtete Nanomembran entwickelt, welche markierte Proteine selektiv über einen His-Tag bindet.
Neben der Entwicklung von Materialien zur Untersuchung von Proteinen mittels Kryo-TEM wurden Beschichtungen hergestellt, welche die Oberfläche eines Biomoleküls oder eines Ensembles von Biomolekülen nachahmen. Diese Modelloberflächen sollten ebenfalls die Untersuchung von Eigenschaften der biologischen Systeme ermöglichen. Biologische Membranen bestehen aus einem Ensemble von Biomolekülen. Eine Vielzahl verschiedener Biomolekülen tritt in einer komplexen Anordnung in diesen dünnen Membranen auf. Es wurde versucht, strukturierte Membranen mit lokalen Variationen der physikalischen und chemischen Eigenschaften, jedoch weitaus weniger komplexen Aufbau, herzustellen. Die hergestellten Membranen mit biologisch relevanten Strukturen im Mikrometer- bis Zentimeterbereich, können nach weiterer Forschung als einfache Modellsysteme zur Nachahmung ihrer komplexen biologischen Vorbilder dienen.
In einem weiteren Projekt wurde eine Modelloberfläche für die Bindungstasche des Proteins FimH, welches eine wichtige Rolle in der bakteriellen Adhäsion spielt, entwickelt. In dem Kooperationsprojekt mit der Arbeitsgruppe Lindhorst wurde ein Modellsystem entwickelt, welches dazu dient, herauszufinden, inwiefern eine Funktionalisierung einer Aminosäurevon FimH über eine vorgeschlagenen Ligationsstrategie möglich ist. Das Modellsystem besteht aus einer biorepulsiven Hydrogel-Matrix, aus welcher die Seitenkette der Aminosäure Tyrosin in die Lösung exponiert ist. Die Substrat-katalysierte Reaktion der Aminosäuren-Seitenkette mit dem Photoschalter wurde mithilfe eines Bakterienadhäsionstests untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sich die vorgeschlagene Ligationsstrategie unter Berücksichtigung von Nebenreaktionen zur Modifizierung des Proteins eignet.
Es konnten vier neuartige Systeme, welche die Probenpräparation zur Untersuchung von Proteinen mittels Kryo-TEM vereinfachen, entwickelt werden. Die Ergebnisse sind von wissenschaftlicher Relevanz, da sie die Strukturbestimmung vieler Proteine deutlich vereinfachen und hierdurch beschleunigen können. Außerdem wurden biomimetische Beschichtungen entwickelt, welche entweder Proteinoberflächen oder Biomembranen nachahmen. Die entwickelten Modellsysteme erweitern das Spektrum an Möglichkeiten, Biomoleküle oder biologische Ensembles zu untersuchen.
An essential part of the animal survival strategy comprises the ability to control body movement and coordinate long-term navigational strategies, in order to maintain locomotion towards a nutrition source and stay in its vicinity. In the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) this function is carried out by neuronal circuits, that vary their activity in response to diverse environmental condition.
This comprises different classes of neurons, acting together in a sensory, signaling and modulatory system to control body posture and induce behavioral responses. For this reason, one particular goal in the field of neuroscience research is to elucidate the mechanisms of how neuronal circuits integrate multiple sensory cues to navigate the environment. Aim of this study was to analyze the function of a neuronal network comprising the interneurons AVK, as well as the identification of signaling molecules, controlling body posture during food related locomotory behavior. This should be achieved by establishing optogenetic approaches, which provide a non inversive and temporally precise control of neuronal activity and drives the activation or silencing of individual neurons, to alter the neuronal basis of behavior. Animals exposed to food perform a dwelling-like behavior, characterized by a slowing of locomotion with a reduced crawling distance and an irregular movement, accompanied by a high frequency of pauses, reversals and directional changes. Upon food-removal, they initiate a local-search behavior with the same behavioral characteristics, but with a more pronounced sinusoidal movement. After a prolonged period of unsuccessful food finding, animals exhibited long runs with reduced pauses, reversals and turnings, increasing their maximal covered distance, indicated as dispersal behavior. Acute photoinhibition of AVK neurons, mediated by cell-specific expression of halorhodopsin (NpHR) caused the animals to perform a dwelling-like locomotory state with increased bending angles, as seen during local-search behavior. Thus, food-induced behavioral effects are mimicked by the optogenetic manipulation of AVK interneurons.
In this study, signaling molecules were ascertained by cell specific mRNA profiling of AVK neurons, mediating these behavioral responses. It was able to demonstrate, that flp-1, coding for a FMRFamidelike neuropeptide, is one of the genes with the highest distribution in AVK. In the absence of food, AVK neurons continuously release the FMRFamide-like neuropeptide FLP-1 to inhibit a subset of target motoneurons, leading the animals to maintain a low body curvature to promote dispersing behavior.
Conversely, if AVK was inhibited by NpHR or the presence of food, less FLP-1 was secreted to the body fluid, indicated by reduced intracellular fluorescence levels of mCherry-tagged FLP-1 proteins in the scavenger cells. The search of a FLP-1 receptor was successful by in vitro investigation on G protein-coupled receptors (GPCRs) and neuropeptide ligands, revealing NPR-6 to be activated by FLP-1 neuropeptides, but with a low potency. Expression pattern of the NPR-6 receptor indicated receptor localization in in the VC ventral cord and SMB head motoneurons, as well as in a subset of other neurons required for chemosensation and feeding. AVK interneurons are highly coupled to SMB head motoneurons, forming electrical synapses composed of the gap junction protein subunits UNC-7 and UNC-9. Elimination of SMB or gap junction genes using cell ablation and RNA interference, respectively, phenocopied effects of AVK inhibition on bending angles. Furthermore, this study was able to demonstrate that these neurons get inhibited during FLP-1 transmission to the NPR-6 receptor, which was required to mediate AVK effects on crawling behavior. Consequently, photoinhibition of AVK caused disinhibition of VC and SMB neurons, in order to enhance sinusoidal movement and to induce a local-search related locomotory behavior.
Thereby, FLP-1 neuropeptide transmission is the preferred used signaling pathway over direct gap junction coupling. Additional neuropeptides and receptors were identified to be essential downstream to AVK neurons to mediate effects on body curvature and locomotory behavior as well. The high-potency FRPR-7 receptor was shown to mediate FLP-1 peptide effects on undulatory motion during swimming in a liquid environment, rather than crawling locomotion on a solid surface. This result suggests that the receptor NPR-6 is required for FLP-1 peptide effects on bending and crawling locomotion, whereas conversely the receptor FRPR-7 is addressed by FLP-1 peptides to exclusively regulate swimming behavior. The FRPR-7 receptor is expressed in the AIM and NSM motoneurons, which are suggested to be the primary neuronal candidates mediating swimming behavior. Furthermore, this study provides evidence, that FRPR-7 acts in the DVC interneuron to control spontaneous reversal behavior, most probably by inhibitory FLP-1 signaling from the AVK neurons. Among other neuropeptides, the FMRFamide-like peptide FLP-26 binds with higher affinity to NPR-6 receptors than FLP-1 peptides. FLP-26 peptides are expressed in the SMB motoneurons, where they are able to further potentiate FLP-1 inhibitory effects by simultaneous binding to NPR-6.
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Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most frequent pediatric soft-tissue sarcoma comprising two major subtypes – the alveolar and the embryonal rhabdomyosarcoma. The current therapeutic regime is multimodal including surgery, radiation and chemotherapy with cytostatic drugs. Although the prognosis for RMS patients has steadily improved to a 5-year overall survival rate of 70% for ERMS and 50% for ARMS, prognosis for subgroups with primary metastases or relapsed patients is still less than 25%, highlighting the need for development of new therapies for these subgroups. Since cancer cells are addicted to their cancer promoting transcriptional program, remodeling transcription by targeting bromodomain and extraterminal (BET) proteins has emerged as compelling anticancer strategy. However, in many cancer types BET inhibition was proved cytostatic but not cytotoxic emphasizing the need for combination protocols.
In this study we identify a novel synergistic interaction of the BET inhibitor JQ1 with p110α-isoform-specific Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K) inhibitor BYL719 (Alpelisib) to induce mitochondrial apoptosis and global reallocation of BRD4 to chromatin. At first, we showed that JQ1 single treatment had cytostatic effects at nanomolar concentrations and inhibited MYC and Hedgehog (Hh) signaling in RMS known to promote proliferation of RMS. However, JQ1 single treatment barely induced cell death in RMS cells even at concentrations of up to 20 µM (< 20% cell death). Thus, we next tested combination approaches to elicit cell death. Since we previously identified synergistic cell death induction of Hh inhibition and PI3K inhibition in RMS cells we tested JQ1 in combination with the pan-PI3K/mTOR inhibitor PI-103 and the p110α-isoform-specific PI3K inhibitor BYL719. In addition, we tested JQ1 in combination with distinct HDAC inhibitors namely JNJ-26481585, SAHA (Vorinostat), MS-275 (Entinostat) and LBH-589 (Panobinostat) since the synergistic interaction of BET and HDAC inhibition has previously been described for other tumor entities.
Interestingly the synergism of cell death induction of JQ1/BYL719 co-treatment is superior to the synergism of JQ1 with pan-PI3K/mTOR inhibitor PI-103 or the tested HDAC inhibitors as confirmed by calculation of combination index. To investigate the molecular mechanisms underlying the synergy of JQ1/BYL719 co-treatment, we performed RNA-Seq and BRD4 ChIP-Seq experiments. RNA-Seq exhibited, that JQ1/BYL719 co-treatment shifted the overall balance of BCL-2 family gene expression towards apoptosis and increased gene expression of proapoptotic BMF, BCL2L11 (BIM) and PMAIP1 (NOXA) while decreasing gene expression of antiapoptotic BCL2L1 (BCL xL). These changes were verified by qRT-PCR and Western blot. Notably, BRD4 is phosphorylated upon JQ1/BYL719 co-treatment and globally reallocates BRD4 to chromatin. This BRD4 reallocation includes enrichment of BRD4 at the super-enhancer site of BMF, at the super-enhancer, typical enhancer and promoter regions of BCL2L11 (BIM) and at the PMAIP1 (NOXA) promoter, while JQ1 alone, as expected, reduces global chromatin binding of BRD4. Integration of RNA-Seq and BRD4 ChIP-Seq data underlines the transcriptional relevance of reallocated BRD4 upon JQ1/BYL719 co-treatment. Immunopreciptation studies showed, that RMS cells are initially primed to undergo mitochondrial apoptosis since BIM is constitutively bound to antiapoptotic BCL-2, BCL xL and MCL-1. JQ1/BYL719 co-treatment increased BIM expression and its neutralization of antiapoptotic BCL-2, BCL-xL and MCL-1 thereby rebalancing the ratio of pro- and antiapoptotic BCL-2 proteins in favor of apoptosis. This promotes activation of BAK and BAX resulting in caspase-dependent apoptosis. The functional relevance of proapoptotic re-balancing for the execution of JQ1/BYL719-mediated apoptosis was confirmed by individual silencing of BMF, BIM, NOXA or overexpression of BCL-2 or MCL-1, which all significantly rescued JQ1/BYL719-induced cell death. Execution of cell death by mitochondrial caspase-dependent apoptosis was veryfied by individual knockdown of BAK and BAX or caspase inhibitor N-Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me) fluoromethylketone (zVAD.fmk), which all significantly rescued JQ1/BYL719-induced cell death.
In summary, combined BET and PI3Kα inhibition cooperatively induces mitochondrial apoptosis by proapoptotic re-balancing of BCL-2 family proteins accompanied by reallocation of BRD4 to transcriptional regulatory elements of BH3-only proteins.
Die Plasmamembran eukaryotischer Zellen dient als Barriere zwischen dem Inneren einer Zelle und ihrer Umgebung. Eine wichtige Aufgabe von Proteinen, die sich in der Plasmamembran befinden, besteht in der Erkennung der Umgebung, der Übermittlung dieser Informationen über die Plasmamembran in das Innere einer Zelle und der Einleitung einer zellulären Antwort. Membranrezeptoren binden Liganden, was zu ihrer Aktivierung und der Rekrutierung von intrazellulären Proteinen führt. Funktionelle Signalkomplexe werden gebildet und leiten einen Informationstransfer durch die Zellmembran ein, so dass die Expression bestimmter Gene stimuliert oder unterdrückt wird. Eine Störung der Signalinitiierung und -übertragung tritt bei vielen Krankheiten auf, so dass Membranproteine ein wichtiges Ziel in der Medikamentenentwicklung sind.
In dieser Arbeit wird die Fragestellung bearbeitet, wie der Tumornekrosefaktor-Rezeptor 1 (TNFR1) in funktionelle Komplexe in der Plasmamembran einer intakten Zelle organisiert ist. TNFR1 besitzt vier cysteinreiche Domänen (CRDs) in seiner extrazellulären Region. Die erste und von der Plasmamembran am weitesten entfernte CRD ist die Pre-Ligand Assembly Domain (PLAD). Kristallstrukturen zeigten, dass sich in einem TNFR1-Dimer zwei PLAD in unmittelbarer Nähe befinden. Crosslinking-Experimente berichteten über mehrere oligomere Zustände von TNFR1; die Ergebnisse unterschieden sich nach Art und Konzentration des Crosslinkers. In der nativen Umgebung einer intakten Zelle wurde der oligomere Zustand von TNFR1 bisher nicht bestimmt. Der kanonische Ligand für TNFR1 ist der Tumornekrosefaktor alpha (TNF), ein Homotrimer, welches in löslicher oder membrangebundener Form vorliegt. Nach der Bindung von TNF an TNFR1 bilden sich Rezeptortrimere. Diese Proteinkomplexe rekrutieren intrazellulär Proteine und bilden einen funktionellen Membrankomplex, der intrazelluläre Signalkaskaden aktiviert. Die kanonische Signalweiterleitung erfolgt durch den nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B-cells (NF-B), welcher Zellteilung oder Entzündung induziert. TNFR1 kann auch andere Signalwege wie beispielsweise Apoptose durch einen zytosolischen Komplex und die Procaspase-8, oder Nekroptose durch das Nekrosom und die mixed lineage kinase domain-like (MLKL)-Domäne einleiten. Die Dysregulation von TNFR1 ist bei einer Vielzahl von Krankheiten zu finden. Erhöhte TNFR1-Expressiosraten treten bei acquired immune deficiency syndrome (AIDS), multipler Sklerose und verschiedenen Krebsarten auf.
In einem zweiten Projekt wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. Michael Lanzer (Heidelberg, Germany) der Expressionsgrad des Proteins VAR2CSA in membranassoziierten knobs bestimmt, welche in Erythrozyten vorkommen, die mit dem Parasiten Plasmodium falciparum infizierten wurden. VAR2CSA gehört zur Proteinfamilie des Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 (pfEMP1). Nach einer Infektion wird VAR2CSA zur Wirtszellmembran transportiert und in knobs eingelagert. Patienten, die Sichelzellenanämie-Erythrozyten (HbAS) aufweisen, sind im Gegensatz zu Patienten mit gesunden Erythrozyten (HbAA) immun gegen Malaria. Während die beiden Erythrozytentypen eine unterschiedliche Morphologie der knobs aufweisen, blieb ihre Zusammensetzung in Bezug auf VAR2CSA bisher ungeklärt.
Das Verständnis der Proteinfunktion erfordert eine Beschreibung der molekularen Organisation funktioneller Einheiten in der zellulären Umgebung. Hierfür ist die Fluoreszenzmikroskopie eine geeignete Methode, da sie eine gezielte Markierung von Zielproteinen ermöglicht. Die hohe Sensitivität ermöglicht die Visualisierung einzelner Proteine. Eine Einschränkung in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie ist die Auflösungsgrenze. Strukturelle Elemente, die kleiner als etwa die halbe Anregungswellenlänge sind (für die meisten Anwendungen 200 bis 300 nm) können nicht aufgelöst werden. Die Entwicklung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie ermöglichte es, diese Auflösungsgrenze zu umgehen und eine räumliche Auflösung von wenigen Nanometern zu erreichen, was die Visualisierung und Charakterisierung einzelner Proteinkomplexe ermöglichte. Eine Art der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie ist die single-molecule localization microscopy (SMLM), die auf der Detektion einzelner Fluorophore, einer genauen Bestimmung ihrer Position (Lokalisation) und der Erzeugung eines rekonstruierten Bildes unterhalb der optischen Auflösungsgrenze basiert. Da die meisten Proben in der Fluoreszenzmikroskopie eine zu hohe räumliche Dichte an Fluorophoren aufweisen, um den Nachweis von einzelnen Fluorophoren zu ermöglichen, werden Verfahren zur Kontrolle der Emission von Fluorophoren eingesetzt. Eine Möglichkeit ist der Einsatz von Fluorophoren, die optisch zwischen einem nicht-fluoreszierenden und einem fluoreszierenden Zustand geschaltet werden können, z.B. photoschaltbare fluoreszierende Proteine in photoactivated localization microscopy (PALM) oder organische Farbstoffe in (direct) stochastic optical reconstruction microscopy ((d)STORM). SMLM erreicht eine räumliche Auflösung von 20 nm, was in den meisten Fällen ausreicht, um einzelne Proteinkomplexe in einer Zelle aufzulösen. Diese räumliche Auflösung ist jedoch nicht ausreichend, um Untereinheiten innerhalb eines Proteinkomplexes zu visualisieren. Zu diesem Zweck wurde SMLM erweitert und die verfügbare kinetische Information genutzt, die bei der Detektion einzelner Fluorophore ausgelesen wird. Viele Fluorophore weisen metastabile Dunkelzustände auf, die eine Lebensdauer von bis zu Sekunden aufweisen. Diese Übergänge erscheinen als "Blinken" der Fluoreszenzemission. In Kombination mit kinetischen Modellen kann aus der Anzahl an Blink-Ereignissen die Anzahl der Fluorophore ermittelt werden. Angewendet auf hochaufgelöste Proteinkomplexe kann die Auflösungsgrenze von hochauflösender Mikroskopie umgangen werden, und die Anzahl der Protein-Untereinheiten in einem hochaufgelösten Proteincluster ermittelt werden. Hierzu wird beispielsweise das photoschaltbare fluoreszierende Protein mEos2 an ein Zielprotein funsioniert (quantitative PALM (qPALM)).
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Electron microscopy (EM) demarcates itself from other structural biology techniques by its applicability to a large range of biological objects that spans from whole cells to individual macromolecules. In single-particle cryo-EM, frozen-hydrated samples, prepared by vitrification with liquid ethane, retain macromolecules in a medium that approximates their natural aqueous environment and that, in this way, preserves high-resolution structural information. Nonetheless, the sensitivity of biological specimens to the high-energy electron beam introduces restrictions on the total dose that can be used during imaging while avoiding significant radiation damage. Consequently, the signal-to-noise ratio attained in each individual image is very low, and structures with high-resolution detail must be recovered by averaging thousands of projections in random orientations. This is achieved through the use of image processing algorithms capable of aligning and classifying particle images through the evaluation of cross-correlation functions between each particle and a reference.
In recent years, several innovations took place in the field of single-particle cryo-EM, among which the development of direct electron detectors must be highlighted. Direct electron detectors have a better detective quantum efficiency (DQE) than both photographic film and CCD cameras, and offer a fast readout, compatible with the acquisition of movie stacks. Additionally, new image processing software has become available, with more sophisticated algorithms and designed to take advantage of the specific characteristics of the movies produced with direct electron detectors. These technological advances in both hardware and software catalyzed a revolution in single-particle cryo-EM, which is now routinely used for the determination of near-atomic structures. As a result, the range of macromolecules accessible to cryo-EM has increased drastically, as targets that were unsuitable before for imaging due to their small dimensions can now be adequately visualized and refined to high-resolution.
During my doctoral work, I have used single-particle cryo-EM to structurally characterize challenging membrane proteins, with a strong emphasis on protein complexes from aerobic respiratory chains. In chapter I of this thesis, I present my results on the bovine respirasome, a mitochondrial supercomplex composed of complexes I, III and IV. Chapter II is dedicated to the analysis of the structure of alternative complex III (ACIII) from Rhodothermus marinus, a bacterial quinol:cytochrome c/HiPIP oxidoreductase unrelated to the canonical cytochrome bc1 complex (complex III). In addition, in chapter III I describe the structure of KimA, a high-affinity potassium transporter that drives the transport of its substrate by using the energy stored in the form of a proton gradient. These three membrane proteins, with molecular weights ranging from 140 kDa to 1.7 MDa, illustrate the possibilities and limitations faced in single-particle cryo-EM.
The aerobic respiratory chain is responsible for the generation of a transmembrane difference of electrochemical potential that is then used by ATP synthase for the production of ATP or for driving solute transport over the membrane. They catalyze the transfer of electrons from a substrate, such as NADH or succinate, to molecular oxygen and use the chemical energy released in these redox reactions to drive the translocation of protons, or in some cases sodium ions, to the intermembrane space in mitochondria or the periplasm in bacteria.
In mitochondria, the respiratory chain is composed of four complexes: complex I (NADH:ubiquinone oxidoreductase), complex II (succinate dehydrogenase), complex III (cytochrome bc1 complex) and complex IV (cytochrome c oxidase). While it was for a long time believed that these complexes existed as single entities in the membrane, the use of milder procedures for protein purification and analysis revealed that respiratory complexes associate into well-ordered structures, known as supercomplexes. These have been proposed to offer different structural and functional advantages that are still controversial, including substrate channeling, stabilization of individual complexes and reduction of reactive oxygen species (ROS) production. The most thoroughly studied respiratory supercomplex has been the respirasome, conserved in higher eukaryotes and composed of one copy of complex I, a complex III dimer and one complex IV. By single-particle cryo-EM analysis, I retrieved a 9 Å map of the respirasome from Bos taurus, which allowed the accurate docking of atomic models of the three component complexes. The structure shows that complex III associates to the concave side of the membrane arm of complex I, while complex IV is located between the end of the complex I hydrophobic arm and complex III. Several defined protein-protein contacts are observed between the component complexes, which are mediated predominantly by supernumerary subunits and close to the membrane surfaces. The interactions established between complex I and complex III are extensive and may support the argument that the association of complex I into supercomplexes is required for the stabilization or even the biogenesis of this complex.
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Polyketide synthases (PKSs) are large megaenzymes that occur in bacteria, fungi, and plants and produce polyketides, a class of secondary metabolites. Many polyketide natural products exhibit high biological activities e.g. as antibiotics or anti-fungal compounds. The modular architecture of assembly line PKSs makes them exciting targets for engineering approaches via the exchange of whole modules or single domains. Although many engineering attempts have been pursued over the last three decades, the resulting chimeric PKSs often exhibit decreased turnover rates or diminished product yields.
In this thesis, new approaches to engineer chimeric PKSs were explored, each targeting a different aspect of the chimeric system: First the relative contribution of protein-protein and protein-substrate recognition on the turnover of chimeric PKS was assessed, revealing the importance of protein-protein interactions between the acyl carrier protein (ACP) and the ketosynthase (KS) domain in the chain translocation step. Directed evolution experiments followed to optimize the protein-protein interaction across a chimeric interface. Additionally, different junction sites for the generation of chimeric PKSs were compared, showing the ability for recombination without interfering with the chain translocation reaction, and highlighting the use of SYNZIP domains to bridge PKS modules. To optimize chimeric PKSs even further, multipoint mutagenesis of KS domains was established, with positive effects on the activity of chimeric systems.
To support engineering attempts, several structure elucidation techniques were combined with in silico modeling to characterize the architecture of a PKS module and the domain-domain interactions within it. Preliminary results show a strong conformational flexibility of the PKS module and the great potential of these techniques to define the multitude of transient interactions in PKS modules.
Transport mechanism of a multidrug resistance protein investigated by pulsed EPR spectroscopy
(2019)
In human several diseases result from malfunctions of ATP-binding cassette (ABC) systems, which form one of the largest transport system superfamily. Many ABC exporters contain asymmetric nucleotide-binding sites (NBSs) and some of them are inhibited by the transported substrate.1 For the active transport of diverse chemically substrates across biological membranes, ABC transport complexes use the energy of ATP binding and subsequent hydrolysis. In this thesis, the heterodimeric ABC exporter TmrAB2,3 from Thermus thermophilus, a functional homolog of the human antigen translocation complex TAP, was investigated by using pulsed electron-electron double resonance (PELDOR/DEER) spectroscopy. In the presence of ATP, TmrAB exists in an equilibrium between inward- and outward-facing conformations. This equilibrium can be modulated by changing the ATP concentration, showing asymmetric behaviour in the open-to-close equilibrium between the consensus and the degenerate NBSs. At the degenerate NBS the closed conformation is more preferred and closure of one of the NBSs is sufficient to open the periplasmic gate at the transmembrane domain (TMD).3 By determining the temperature dependence of this conformational equilibrium, the thermodynamics of the energy coupling during ATP-induced conformational changes in TmrAB were investigated. The results demonstrate that ATP-binding alone drives the global conformational switching to the outward-facing state and allows the determination of the entropy and enthalpy changes for this step. With this knowledge, the Gibbs free energy of this ATP induced transition was calculated. Furthermore, an excess of substrate, meaning trans-inhibition of the transporter is resulting mechanistically in a reverse transition from the outward-facing state to an occluded conformation predominantly.3 This work unravels the central role of the reversible conformational equilibrium in the function and regulation of an ABC exporter. For the first time it is shown that the conformational thermodynamics of a large membrane protein complex can be investigated. The presented experiments give new possibilities to investigate other related medically important transporters with asymmetric NBSs or other similar protein complexes.
Many processes in living cells involve interaction and cooperation of multiple proteins to fulfill a specific function. To understand biological processes in their full complexity, it is not sufficient to only identify the molecules being involved but also to understand the kinetic aspects of a reaction. Mass spectrometry (MS) is a very powerful tool which allows to precisely identify the molecules of a reaction. Usually this is done with tandem-MS experiments for purpose of de-novo peptide sequencing. However, since this involves protein digestion, a statement of the in-vivo constitution of non-covalently bound protein complexes is not possible. In order to detect an intact protein complex it is necessary to analyze the biological system softly and in a near-native environment with native MS. Native MS allows the non-destructive analysis of these non-covalent protein complexes as well as to detect their components. However, up to now native MS does not offer a possibility to resolve the timing of the constitution of protein complexes on a fast time-scale. Therefore, the progress of reactions on fast time-scales is invisible. However, a method which delivers both types of information - identification of the components of a protein complex, as well as time-resolving their interaction - would be of high interest.
A suitable ionization technique for native MS is laser-induced liquid-bead ion desorption (LILBID). LILBID employs well-defined droplets which are irradiated by IR laser pulses to generate gas phase ions. The not-continuous, repetitive nature of ion generation offers itself to the development of a time-resolved (TR) native MS system which is able to investigate protein complexes on a fast time scale. The LILBID-droplets can serve as reaction vessels if they are levitated in an electrodynamic Paul-trap. This new setup would allow sample manipulation and MS analysis on precise and fast reaction time-scales. The first part of this dissertation presents the construction and characterization of a setup for TR-LILBID-MS.
An example for a complex biological system is the self-assembly of beta-amyloid (Aβ). This small peptide is the major component in plaques related to Alzheimer’s disease. Clinically relevant is especially the 42 amino acid peptide Aβ42 which aggregates from monomers to oligomers through to fibrils. The oligomers are the neurotoxic species in this process and thus of high interest. Nevertheless, standard analytical techniques are unable to detect those oligomers which makes MS an optimal tool to study the oligomerization process of Aβ with the focus on disease relevant oligomers. TR-LILBID-MS allows to follow the oligomerization of Aβ enabling to study molecules which influence this kinetic. Combining MS with ion-mobility spectrometry adds an additional dimension - the collision cross section - to the mass-to-charge ratio obtained from MS. Therewith structural alterations induced by ligands can be correlated to differences in the aggregation kinetic. This allows to draw a picture of the aggregation process of Aβ for the development of disease-relevant small oligomers on a molecular level.
Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Reaktivität zweifach reduzierter 9,10-Dihydro-9,10-diboraanthracene [A]2– erweitern das Einsatzspektrum von Hauptgruppenverbindungen im Hinblick auf die Aktivierung kleiner Moleküle. Komplementär zu Übergangsmetallkomplexen und FLPs ermöglichen die Salze M2[A] (M+ = Li+, Na+, K+) die Entwicklung neuartiger Synthesestrategien. Als besondere Herausforderung gilt die Aktivierung des stabilen H2-Moleküls, dessen Bindung die Dianionen [A]2– homolytisch in einer konzertierten Reaktion spalten.
Untersuchungen zur Kinetik der H2-Addition an M2[A] stellten die Abhängigkeit dieses Reaktionsschritts vom borgebundenen Substituenten und vom Kation heraus. Eine geringe sterische Abschirmung der Boratome durch kleine borgebundene Substituenten (C≡CtBu, Me, H) begünstigt die H2-Aufnahme gegenüber großen Substituenten (pTol, Xyl, Et). Die maximale Ausbeute an M2[A-H2] wird für M+ = Li+ erst nach mehreren Tagen bei 100 °C erhalten, während einige Stunden bei nur 50 °C für die quantitative Bildung von K2[A-H2] ausreichen.
Unter den Salzen M2[A] eignet sich Li2[68] mit borgebundenen Me-Substituenten besonders gut für den Einsatz als Hydrierungskatalysator. Mit Li2[68] konnten das Imin Ph(H)C=NtBu, das terminale Alken Ph2C=CH2 und Anthracen erfolgreich im NMR-Maßstab hydriert werden (Katalysatorladung 37 mol%, THF-d8, 1 atm H2-Initialdruck, 100 °C, 16 h). Im Reaktionsautoklaven war für die Hydrierung von Ph(H)C=NtBu eine Verringerung der Katalysatorladung auf 10 mol% Li2[68] möglich (THF, 7 atm H2-Initialdruck, 100 °C, 18 h). Konkurrenzreaktionen begründen Einschränkungen in Bezug auf die Substratpalette, da M2[68] (M+ = Li+, Na+) mit elektronenarmen ungesättigten Verbindungen, die C=C-, C≡C-, C=O- oder C=N-Bindungen enthalten, [4+2]-Cycloadditionsprodukte bilden können. Die Reversibilität dieser Reaktion entscheidet, ob Li2[68] als Katalysator fungiert oder irreversibel in den Strukturen gebunden bleibt.
Vielseitiger sind die H2-Aktivierungsprodukte M2[A-H2] als H–-Donoren geeignet: Na2[68-H2] ersetzt Halogenid- durch H–-Substituenten in Bromethan, sowie in Chlorsilanen und PCl3; CO2 wird in Natriumformiat überführt. Unabhängig von der Anzahl der Chlorliganden werden die Produkte immer vollständig hydriert. Eine erneute Reduktion von 68 kann wieder Na2[68] bereitstellen, das H2 aufnimmt und Na2[68-H2] regeneriert, welches für neue H–-Abgaben zur Verfügung steht. Bei der experimentellen Umsetzung des Kreislaufs ist es wichtig, die beschriebenen Reaktionsschritte nacheinander auszuführen und jeweils nur stöchiometrische Mengen des Elektrophils zuzugeben. Bei Abweichungen vom schrittweisen Syntheseprotokoll finden formale nukleophile Substitutionen mit M2[68] statt und monoanionische Spezies entstehen, z. B. wenn Et3SiBr als Elektrophil anwesend ist.
Gegenüber CO2 zeigt Li2[68] eine hohe Reaktivität, durch die selektiv CO und [CO3]2– gebildet werden. Wie zuvor bei den H–-Transferreaktionen ermöglicht die Reduktion der Neutralverbindung 68 die Regeneration von Li2[68].
Die Dianionen [A]2– stechen unter anderen cyclischen Borverbindungen in niedrigen Oxidationsstufen heraus, da mit [A]2– nicht nur die Aktivierung von H2 oder CO2 gelang, sondern erstmalig über die Einbindung der Additionsprodukte in zum Teil katalytische Folgereaktionen berichtet werden konnte.
Multidomain enzymes, such as fatty acid synthases (FASs) or polyketide synthases (PKSs), play a crucial role in the biosynthesis of important natural products. They have a high significance in the development of new pharmaceuticals and various research approaches focus on the engineering of these proteins. For example, human type I FAS is an interesting therapeutic target. Owing to its importance in lipogenesis, upregulation of human type I FAS expression has been observed in numerous cancers. Type I FAS is also regarded as important target in antiobesity treatment. Both multidomain enzyme classes - FASs and PKSs - show high structural and functional similarities. Particularly animal type I FAS is most relevant as evolutionary precursor of the PKS family. Therefore, the well characterized FASs are suitable model proteins for the poorly characterized PKSs, to gain deeper understanding in these megasynthases.
Furthermore, fatty acids are considered to be strategically important platform chemicals accessible through sustainable microbial approaches. The recently acquired structural information on FASs provides an excellent understanding of the molecular basis of fatty acid synthesis. The specific understanding of chain-length control, the characterization of a multitude of substrate-specific thioesterases, and the emerging tools and means for metabolic engineering have fostered targeted approaches for modulating chain length. There is large interest in short-chain fatty acids, since these compounds are biotechnologically valuable platform chemicals and biofuel precursors, and attempts on the synthesis of short-chain fatty acids have been reported during the last years.
Primary focus of this thesis lies on the animal type I FASs, which exhibit large conformational variety, as seen in electron microscopy and high-speed atomic force microscopy. Conformational dynamics facilitate productive protein-protein interactions between catalytic domains within the enzyme and aid acyl carrier protein (ACP)-mediated substrate shuttling during the catalytic cycle of fatty acid biosynthesis. To gain deeper insight into the fundamental processes of ACP-mediated substrate shuttling and the underlying conformational dynamics, spectroscopic methods like Förster resonance energy transfer and electron paramagnetic resonance spectroscopy shall be employed. These spectroscopic methods demand site-specific labeling of proteins with fluorophore or spin labels, which can be accomplished with the amber codon suppression technology. Through amber codon suppression, a non-canonical amino acid (ncAA) with an orthogonal functional group is incorporated site-specifically into the protein sequence, which can be used in chemoselective reactions for protein labeling.
This thesis is at the forefront of employing the technology of amber codon suppression for addressing complex biological questions on megasynthases. The successful production of ncAA-modified FASs is challenging. With the aim of incorporating ncAAs into the multidomain 540 kDa large murine FAS, we by far exceed boundaries of documented application of amber codon suppression. Most of the proteins that are reported by Liu & Schultz in applications of amber codon suppression are in the range of 30kDa - for example the TE domain of human FAS. In the same review, the largest protein amber codon suppression was applied to is a potassium channel with roughly 80 kDa. Thus, to the best of my knowledge no protein exceeding 100 kDa has been used in amber codon suppression so far.
In this thesis a low-complex, well-plate based reporter assay is presented, based on an ACP-GFP fusion protein for fast and efficient screening of ncAA incorporation. Reliability and applicability of the reporter assay is demonstrated by successful upscaling to larger protein constructs and increased expression scale.
As outlined in this thesis, we have carefully set up methods for the modification of murine FAS and made several achievements:
(i) We have created our own toolbox with a multitude of suppressor plasmids and various orthogonal pairs. pACU and pACE plasmids are compatible for fast exchange of cassettes, and cloning procedures are optimized for modification of synthetases by site-directed mutagenesis. (ii) We have organic synthesis of several ncAAs stably running in the lab and synthesis of other ncAAs can be established when required. Therefore, extensive screening at moderate costs is possible. (iii) We have established a reporter assay for screening our own library of vectors for amber codon suppression and for optimizing incorporation of ncAAs. (iv) We successfully incorporated ncAAs into subconstructs and full-length murine FAS, and collected initial promising results for the application of these proteins in spectroscopic methods. Thus, laying the foundation for future studies to address fundamental questions of the ACP-mediated substrate shuttling and other conformational dynamics of these enzymes.
Paramyxo- and pneumoviruses include many pathogens with great relevance for human and animal health. To identify common host factors involved in the Paramyxo- and Pneumoviridae life cycle as a basis for new insights in the biology of these viruses and the development of rationally designed therapeutics, genome scale siRNA screens with wild-type measles, mumps, and respiratory syncytial viruses in A549 cells, a human lung adenocarcinoma cell line, were performed. A comparative bioinformatics analysis yielded different members of the coatomer complex I, the translation factors ABCE1 and eIF3A, and several RNA binding proteins as cellular proteins with proviral activity for all three viruses. The strongest common hit, ABCE1, an ATP-binding cassette transporter member, was chosen for further study. We found that ABCE1 supports replication of all three viruses, confirming its importance for both virus families. While viral protein kinetics showed that ABCE1 knockdown resulted in a drastic decrease of MeV protein expression, viral mRNA kinetics are not directly affected by a reduction of ABCE1.
The impact of ABCE1 on viral and global cellular translation was investigated using both 35S metabolic labelling and non radioactive fluorescent protein labelling. ABCE1 knockdown strongly inhibited the production of MeV proteins, while only modestly affecting global cellular protein synthesis and showed that ABCE1 is specifically required for efficient viral, but not general cellular, protein synthesis, indicating that paramyxoand pneumoviral mRNAs may exploit specific translation mechanisms.
In a second approach the efficacy of the small-molecule polymerase inhibitor ERDRP-0519 against MeV was assessed in squirrel monkeys. Animals treated with the drug experienced less severe clinical disease compared to untreated controls, and this effect correlated with the onset of drug treatment.
We observed a reduction of levels of PBMC-associated viremia and virus release in the upper airways, illustrating effective inhibition of virus replication by the drug treatment. ERDRP-0519 drug treatment also alleviated MeV-induced immunosuppression. In addition to providing proof-of-concept for the support of MeV eradication efforts by preventing disease and transmission with a small-molecule polymerase inhibitor, this dissertation provides a novel perspective on cellular proteins that impact the replication of MeV, MuV and HRSV and highlights the role of ABCE1 as host factor that is required for efficient paramyxo- and pneumovirus translation.
ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute an omnipresent superfamily of integral membrane proteins, which catalyze the translocation of a multitude of chemically diverse substrates across biological membranes. In humans, ABC transporters typically act as highly promiscuous exporters, responsible for many physiological processes, multi-drug resistance, and severe diseases, such as hypercholesterolemia, lipid trafficking disorders, and immune deficiency. In all ABC transporters, ATP-driven movements within two highly conserved nucleotide-binding domains (NBDs) are coupled to conformational changes of two transmembrane domains (TMDs), which provide a framework for substrate binding and release on the opposite side of the membrane and enable the transporter to cycle between inward-facing and outward-facing orientations. Several structures of ABC transporters determined either by X-ray crystallography or single-particle electron cryo-microscopy (cryo-EM) have been reported, mostly exhibiting a variation of the inward-facing state, which highlights their dynamic behavior. However, for a complete understanding of the conformational dynamics, further structural information on intermediates is needed – especially for heterodimeric ABC transporters, which are predominant in humans and for which only limited structural information is available.
One prime example of such human heterodimeric ABC transport complexes is the transporter associated with antigen processing (TAP). TAP is a key player of the adaptive immune response, because it translocates proteasomal degradation products into the ER lumen for loading of MHC I molecules. Many functional aspects of TAP have been disclosed in recent years. However, structural information is lacking far behind and a major challenge in the field of medical relevant transporters. Recently, the heterodimeric ABC export system TmrAB (Thermus thermophilus multidrug resistance proteins A and B) was identified as an ortholog of TAP, by sharing structural homology with TAP and, intriguingly, being able to restore antigen presentation in human TAP-deficient cells. Thus, TmrAB is a biochemically well-characterized ABC exporter that can be regarded as a functional ortholog of TAP and serves as a model system for (heterodimeric) ABC export systems in general.
Thus, to illuminate the molecular basis of substrate translocation by single-particle cryo-EM, one of the main objectives of this work was the generation of stabilizing chaperones (synthetic antibodies, nanobodies, cyclic peptides) to reduce the conformational heterogeneity of TAP and TmrAB. Selected antibodies were analyzed with respect to stable complex formation, conformational trapping, and the ability to serve as alignment tools for structural studies by single-particle cryo-EM. Both antibody types were shown to form sufficiently stable complexes to serve as a rigid body for EM analyses. However, all selected antibodies bound to the inward-facing state exclusively.
Hence, for EM studies, various ligands were added to elucidate the full spectrum of conformational states during the catalytic cycle. For TAP, first attempts by negative-stain EM revealed a homogenous distribution of particles on the grid. Surprisingly, no transporter-like features were observed although various attempts were applied to increase the overall sample quality.
For TmrAB, in contrast, the complete conformational space in a native-like lipid environment under turnover conditions was mapped. Cryo-EM analysis of TmrAB incubated with ATP-Mg2+ and substrate revealed two distinct inward-facing conformations (IFwide and IFnarrow) as well as two asymmetric conformations with dimerized NBDs, which were markedly different from all previously reported structures. Here, the catalytically active site was slightly wider and contained ADP, while ATP was still bound at the catalytically-inactive site within the NBDs, demonstrating an asymmetric post-hydrolysis state. Intriguingly for the inward-facing conformations, a weak additional density close to residues M139TmrB and W297TmrB was observed in the inward-facing conformation, which displayed a higher degree of cytosolic gate opening (IFwide) indicating the presence of substrate. To verify that this density corresponds to substrate, single alanine mutations of M139TmrB and W297TmrB were introduced, leading to a strong reduction in substrate binding and transport. Since substrate release requires the opening of the extracellular gate, the absence of an outward-facing open conformation indicated that the opening must be highly transient. In order to explore the outward-facing open conformation, a cryo-EM analysis of the catalytically-inactive TmrAE523QB mutant upon incubation with ATP-Mg2+ was performed. Remarkably, within the same dataset, two different outward-facing conformations (occluded and open) were resolved, both in an ATP-bound state, which indicated that binding of ATP is sufficient to drive the large-scale conformational transition from inward-facing to outward-facing open. To explore the effect of nucleotide hydrolysis, TmrAB was trapped by vanadate. Again, two populations were observed, representing the outward-facing open and outward-facing occluded conformation.
Based on several structures of key intermediates, determined under turnover conditions or trapped in the pre-hydrolysis and hydrolysis transition state, for the first time the complete description of the ATP hydrolysis and translocation cycle of a heterodimeric ABC transport complex was elucidated in one single study. By mapping the conformational landscape during active turnover, aided by mutational and chemical modulation of kinetic rates, fundamental and so-far hidden steps of the substrate translocation cycle of asymmetric ABC transporters were resolved and a general template for (heterodimeric) ABC exporter-catalyzed substrate translocation was provided.
Proteostasis stressors that destabilize the cellular proteome, like heat shock, trigger transcription and translational reactions leading to the accumulation of heat shock proteins, also called molecular chaperones. During stress, induction of stress response genes is prioritized so that molecular chaperones and other stress response proteins are synthesized to cope with proteome misfolding and aggregation. In order to promote the selective translation of stress-specific genes, translation of others genes that are nonessential for cell survival has to stop. Nonessential protein-coding mRNAs accumulate in the cytosol with the associated proteins to form granular structures called stress granules (SG). These membrane-less organelles are thought to be involved in cell survival, mRNA stabilization and mRNA triage. They were proposed to form via the liquid-liquid phase separation which can be triggered by the high local concentration of RNA-binding proteins. mRNAs were long thought to simply play a scaffolding role by bringing RNA-binding proteins together and allowing their concentration and local aggregation. Recently, the active role of mRNAs in the SG assembly became apparent, too. For example, the spontaneous assembly of total yeast RNA into granules was observed, and these RNA granules showed a large overlap with SG transcriptome. Furthermore, cytosolic mRNAs can be released from polyribosomes under stress and be exposed to the cytosolic contents as free mRNAs. It has been suggested that this massive increase of free mRNA in the cytosol might overload the capacities of RNA-stabilizing proteins. The remaining free mRNA molecules would then become exposed to misfolded and aggregation-prone proteins and trigger granulation.
We investigated the role of free mRNAs in different stress conditions during the early and chronic phases of stress response and explored their involvement in SGs assembly and amlyoidogenesis. We identified and studied the interactome of a free mRNA probe incubated with heat shocked cell lysate by means of quantitative mass spectrometry. Proteomics analysis allowed us to identify 79 interactors of free mRNA. Among these interactors, we focused on the translation initiation factor eIF2α and on the RNA methyltransferase TRMT6/61A. Both interactions were verified biochemically, which confirmed that the association is enhanced in heat shocked lysate. In vitro reconstitution showed that free mRNA and TRMT6 interact directly. Ex vivo pulldowns revealed that eIF2α and TRMT6/61A interact under stress conditions and that this interaction is RNA-dependent.
TRMT6/61A is a tRNA methytransferase responsible for the methylation of the adenosine 58 at the position 1 producing m1A. However, also mRNAs have been recently found to be methylated by TRMT6/61A. Our bioinformatics analyses revealed that significantly more mRNAs enriched in SG contain the motif for methylation than SG-depleted mRNAs. We hypothesized that m1A methylation of mRNAs could constitute a tag for the mRNAs targeting to SGs. TRMT61A knock-down (KD) cell lines were generated using the CRISPR-Cas9 technique. In TRMT61A KD cells, m1A was significantly reduced on mRNAs, which correlated with an increased sensitivity of the cells to proteostasis stress. KD cells also showed defects in SG assembly. In heat shocked cells, an m1A motif-containing mRNA recovered better after returning to normal temperature than a control mRNA with mutated motif. In addition, we could isolate SGs and analyze their m1A and m6A content by mass spectrometry. While m6A content in SG mRNAs was very similar to cytosolic mRNAs, m1A was almost 8 times enriched in SGs. Thus, we could confirm experimentally the results of the bioinformatics analysis and directly support the hypothesis that m1A is a tag to direct mRNAs for sequestration. Finally, we compared amyloidogenesis in wild-type and TRMT61A KD cell lines. Cells with reduced levels of TRMT61A demonstrated an increased accumulation of transfected Aβ and an impaired aggregate clearance. Various assays led us to conclude that the lack of m1A deposition on mRNAs enhanced RNA co-aggregation with amyloids.
Based on our results, we propose a model explaining the fate of free mRNA during proteostasis stress. Upon polysome disassembly, free mRNA is released and becomes free to interact with other proteins, including the methyltransferase TRMT6/61A. TRMT6/61A methylates the freed mRNAs containing the cognate motif. The m1A tag then targets mRNAs to SGs promoting sequestration. Upon stress release, SGs disassemble, thus releasing rescued mRNAs which could now reenter translation and support cell recovery. On the other hand, non-sequestered mRNAs increasingly co-aggregate with aggregating proteins. Thus, deficiency of the N1-adenine methylation of mRNAs due to the lack of TRMT6/61A increases the amount of unpacked mRNAs. The deposition of m1A on mRNAs could then be a way to protect them during exposure to stress, to limit their co-aggregation with misfolded proteins and to allow a faster recovery upon stress release.
Enolase is a glycolytic enzyme, which catalyzes the inter-conversion of 2-phosphoglycerate to phosphoenolpyruvate. Altered expression of this enzyme is frequently observed in cancer and accounts for the Warburg effect, an adaptive response of tumor cells to hypoxia. In addition to its catalytic function, ENO-1 exhibits other activities, which strongly depend on its cellular and extracellular localization. For example, the association of ENO-1 with mitochondria membrane was found to be important for the stability of the mitochondrial membrane, and ENO-1 sequestration on the cell surface was crucial for plasmin-mediated pericellular proteolysis. The latter activity of ENO-1 enables many pathogens but also immune and cancer cells to invade the tissue, leading further to infection, inflammation or metastasis formation. The ability of ENO-1 to conduct so many diverse processes is reflected by its contribution to a high number of pathologies, including type 2 diabetes, cardiovascular hypertrophy, fungal and bacterial infections, cancer, systemic lupus erythematosus, hepatic fibrosis, Alzheimer’s disease, rheumatoid arthritis, and systemic sclerosis. These unexpected non-catalytic functions of ENO-1 and their contributions to diseases are the subjects of this review.
Die Lebensfunktion der Zelle beruht unter anderem auf der Funktion und Wechselwirkung der Nukleinsäuren DNA (2’-Desoxyribonukleinsäure) und RNA (Ribonukleinsäure). Mit Hilfe von PDS (engl. ’pulsed dipolare spectroscopy’)-Techniken, basierend auf der EPR (engl. ’electron paramagnetic resonance’)-Spektroskopie, können Abstände in einem Bereich von 2-10 nm zwischen zwei markierten Positionen einer Nukleinsäure bestimmt werden. Daneben kann mit der Abstandsverteilung auf die Flexibilität des Moleküls geschlossen werden. Durch PDS-Messungen eröffnet sich die Möglichkeit, Bewegungen und Zustandsänderungen zu untersuchen. Die Messungen beruhen auf der dipolaren Kopplung von Radikalen (Spinlabel). Da die gemessenen dipolaren Kopplungen eine anisotrope Wechselwirkung sind, können an starren Systemen neben den Abstandsinformationen auch die Orientierungen der beiden Spinlabel zueinander bestimmt werden. Diese zusätzliche Information ermöglicht es, mittels orientierungsselektiver PDS-Messungen noch genauer die Geometrie und Flexibilität des Systems zu untersuchen. Klassischerweise werden alle Messungen mit der Doppelfrequenztechnik PELDOR (engl. ’pulsed electron-electron double resonance’) durchgeführt. Einzelfrequenzmethoden basieren dagegen auf Breitbandanregung, die mit den technischen Gegebenheiten l nge nicht möglich war. Eine solche Sequenz ist 2D-SIFTER.ImmRahmen dieser Arbeit von PELDOR ausgehende, weiterentwickelte Simulationsprozedur etabliert. Eine große Herausforderung ist die eindeutige Interpretation der sensitiven orientierungsselektiven PELDOR-Messungen. Sie mittels MD (Moleküldynamik)-Simulationen zu beschreiben war bisher nur qualitativ möglich. Allerdings wurden mehrere neue Kraftfelder publiziert. Mit einem quantitativen Vergleich mit orientierungsselektiven PELDOR-Daten kann sichergestellt werden, dass die Flexibilität des Systems durch Kraftfelder richtig beschrieben ist. PELDOR-Zeitspuren, gemessen bei Raumtemperatur und 50 K, unterscheiden sich besonders in ihrer Dämpfung. Der physikalische Unterschied beider Messungen konnte durch MD-Simulationen qualitativ nachvollzogen worden. Eine Schwierigkeit für speziell orientierungsselektive PELDOR-Messungen ist die aufwendige Synthese von mit dem starren Ç-Label markierten Nukleinsäuren. Als Alternative wurde in der Sigurdsson-Gruppe das halbstarre IMU-Label entwickelt. Die Analyse der orientierungsselektiven Daten ergab ein klares Bild der Dynamik dieses Labels. Ein weiterer interessanter Spinlabel ist der `G. Dieser Label ist nicht kovalent gebunden, sondern interkaliert in eine Stelle der Nukleinsäure, in der eine Guanin- Base fehlt. MD-Simulationen im quantitativen Vergleich mit orientierungsselektiven PELDOR-Messungen an verschiedenen Magnetfeldern haben eine hohe Übereinstimmung. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Label, interkaliert in eine dsDNA, flippen kann, was zu einer Ausmittelung der Anisotropie führt, allerdings zu keiner Verbreiterung der Abstandsverteilung. Dagegen wird in der dsRNA dieses Flippen um die Einfachbindung sterisch gehindert, so dass neben dem Abstand auch die Orientierung des Labels bestimmt werden kann. Kurze dsRNA-Bausteine tendieren dazu, Oligomere zu bilden, was zu Multispineffekten führte. Zusätzlich beeinflusst diese Aggregation die Dynamik der einzelnen RNAs. Daher musste dieses ’end-to-end’-Stacking verhindert werden. Eine Nukleobasean einem Ende der dsRNA führt zu einer Dimerisierung, während eine Nukleobase an beiden Seiten dieses Stacking vollständig verhindert. Messungen mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen konnten zusätzlich zeigen, dass die Interaktion zweier dsRNAs bei höheren Salzkonzentrationen zunimmt.
The three major autoimmune diseases (ADs) of the liver are primary biliary cholangitis (PBC), primary sclerosing cholangitis (PSC), and autoimmune hepatitis (AIH). All of those diseases show an aggressive immune reaction resulting in the destruction of liver tissue and finally to the development of hepatic fibrosis.
PSC is an autoimmune mediated disease of unknown etiology. It is characterized by inflammation of intra- and extrahepatic bile ducts. The progressive destruction of the bile ducts can lead to liver cirrhosis and finally to liver failure. Clinical signs for PSC are increased alkaline phosphatase (AP) and gamma glutamyltransferase (GGT) levels, presence of perinuclear anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (pANCA) and bile ducts with characteristic strictures and dilations of the biliary tree as well as onion skin fibrosis surrounding the damaged bile ducts. Currently, there is no established treatment for PSC patients. The administration of ursodeoxycholic acid (UDCA) is being use as a therapy. However, it merely serves a symptomatic treatment to reduce serum AP and GGT as well as the formation of gallstones. In the advanced stage of PSC, liver transplantation is the last therapeutic option. Mdr2-/- mice are an excepted mouse model for human PSC. Such mice show lymphocytes infiltration into the liver, bile duct lesions, as well as the presence of the typical onion skin-like pericholangitis and periductal fibrosis.
AIH is a rare chronic autoimmune disease of the liver that results from the loss of self-tolerance to hepatocytes and leads to destruction of the hepatic parenchyma with the onset of cirrhosis. Clinical signs for AIH are elevated alanine aminotransferase (ALT) and aspartate transaminase (AST) levels, hypergammaglobulinemia and different types of autoantibodies. In addition, interphase hepatitis with lymphocytic and plasmacellular infiltrates in the periportal field are characteristic for AIH. Two different subtypes of AIH exist and depending on their autoantibody profile they can be distinguished into AIH type 1 which is characterized by the presence of anti-nuclear (ANA) and/or anti-smooth muscular (SMA) autoantibodies, and AIH type 2 showing liver/kidney microsomal autoantibodies (LKM-1). LKM-1 recognizes the major autoantigen, the 2D6 isoform of the cytochrome P450 enzyme family (CYP2D6). One mouse model for AIH is the CYP2D6 model in which the injection of Ad-2D6 leads to a breakdown of the immune tolerance by the destruction of hepatocytes.
There are some patients with autoimmune diseases of the liver who have both cholestatic and hepatic liver enzymes and histological features suggestive of two different liver diseases. These patients are diagnosed with an overlap syndrome (OS).
In my thesis I generated an animal model with characteristics of both diseases, which would mimic features of human PSC-AIH OS. Mdr2-/- mice which spontaneously develop PSC were infected with Ad-2D6 to trigger the autoimmune-driven hepatic injury. Pathogenesis of PSC-AIH OS mice was compared to mice with solitary PSC or AIH. Naïve FVB wild type mice have been used as healthy controls. The characterization of the PSC-AIH OS model was done by analyzing serological parameters like ALT, AP, different antibodies like pANCA, LKM-1 like CYP2D6 and total IgG. Additionally, fibrosis and cholangitis were analyzed by immunohistochemistry and Western blotting. Moreover, cellular infiltrations of CD4+ and CD8+ T cells, dendritic cells (DCs), monocytes/macrophages and neutrophils were determined with immunohistochemistry. Finally, the overall immune balance in the liver and the frequency of CYP specific T cells were analyzed via flow cytometry. Our new mouse model indeed represents the characteristics of both PSC and AIH and mimics features of the human PSC-AIH OS. It allows studying the development of a PSC-AIH OS and how the two overlapping diseases are influencing one another. In a second approach I wanted to induce CYP2D6-specific tolerance in AIH mice. Therefore, I tried four different approaches, namely intranasal peptide administration, injection of tolerogenic DCs, antigen-coupled splenocytes, and Ag-coupled nanoparticles (NP) and evaluated their potential to induce CYP2D6 specific Treg with the capacity to prevent AIH in mice. Unfortunately, the intranasal peptide administration and also the injection of tolerogenic DCs did not increase the amount of CYP2D6 specific Treg which would lead to a reduction of the frequency of inflammatory T cells. Surprisingly, the injection of antigen-coupled splenocytes showed the opposite effect characterized by a very strong cytokine secretion in the tolerized mice. The use of NPs led to an increase in CYP2D6 specific Treg as well as in decrease in the frequency of inflammatory T cells and finally has the potential for a therapeutic approach.
In summary, the generated PSC-AIH OS model represents many clinical signs which can also be observed in PSC-AIH OS patients. This model can be used to study the etiology of this overlap syndrome and further to test potential therapeutic approaches. The different immune tolerance induction pathways which I tried in the AIH model show that NPs have to potential to induce immune tolerance but this approach has to be refined and the outcome has to be characterized in more detail.
Die CXCR4-CXCL12-Signalachse gilt als eines der bislang am besten studierten Signalsysteme in der Hämatopoese. Allerdings stammt unser Wissen über diesen kritischen Signalweg maßgeblich aus subtraktiven Studien, wie z.B. knock-out Modellen oder pharmakologischer Inaktivierung. Zwar können aus diesen Modellen wichtige Erkenntnisse über die physiologische Rolle dieses Signalwegs abgeleitet werden, aber dennoch bleiben einige Phänomene ungeklärt. So konnte gezeigt werden, dass es sowohl bei CXCR4-Defizienz als auch bei Patienten mit dem WHIM-Syndrom (ausgelöst durch eine überaktive CXCR4-Mutante) zu einer ausgeprägten B-Zellaplasie kommt. Dies scheint intuitiv nicht vereinbar. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit ein Modell mit einer überaktiven CXCR4- Mutante (CXCR41013/1013) hinsichtlich der (un)reifen Hämatopoese systematisch untersucht.
Zunächst wurden hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) hinsichtlich der aberranten CXCR4-Signalweiterleitung ex vivo analysiert. Die CXCR4-Überaktivierung konnte sowohl in frühen Effekten nach Aktivierung des Rezeptors (F-Aktinpolymerisierung, Aktivierung des MAPK- Signalweges), als auch in späten, zellfunktionellen Effekten (Migrationsassay) nachgewiesen werden. Die veränderte CXCR4 Signalintegration hatte auch bereits in der Homöostase organismische Konsequenzen im Mausmodell. So konnte eine massiv vergrößerte HSPC-Population in der Milz von CXCR41013/1013-Tieren detektiert werden, im Sinne einer extramedullären Hämatopoese. Knochenmarks-HSPC aus CXCR41013/1013-Tiere zeigten ein massiv eingeschränktes (serielles) Repopulationspotenzial. Kombiniert mit der oben genannten ausgeprägten extramedullären Hämatopoese in diesen Tiere interpretieren wir diese Beobachtung als starken Hinweis auf eine dysfunktionelle Interaktion der Stammzellen mit der hämatopoetischen Stammzellnische im Knochenmark. In diesem Zusammenhang besonders interessant ist die Tatsache, dass auch ein Kompetitorknochenmark das Überleben einer Sekundärtransplantation nicht sichert. Dabei ist zu diskutieren, ob dieser Effekt durch eine effizientere Besetzung von Stammzellnischen durch CXCR41013/1013-Zellen, eine Akkumulation von CXCL12 in der Knochenmarkflüssigkeit (siehe unten) oder eventuell sogar ein vesikelabhänginger Transport von mutiertem CXCR4 in Kompetitorzellen ausgelöst wird. Ein weiteres Merkmal dieser Dysfunktion könnte ebenfalls die gezeigte Akkumulation von CXCL12 in der Knochenmarkflüssigkeit von CXCR41013/1013-Tiere darstellen. Diese Akkumulation könnte die Suppression co-transplantierter wildtypischer Hämatopoese sowie die verminderte Effizienz der G-CSF-induzierten Stammzellmobilisierung funktionell erklären. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Mobilisierung von Stammzellen aus dem Knochenmark durch einen CXCR4- Inhibitor in CXCR41013/1013-Tieren ebenfalls erheblich hinter der in Wildtypmäusen zurückbleibt.
Analog zu Patienten mit WHIM-Syndrom zeichnen sich CXCR41013/1013-Mäuse weiterhin durch eine ausgeprägte Leukopenie, insbesondere durch einen schweren B-Zell-Mangel, aus. Aus diesem Grund wurde die B-Lymphopoese und humorale Immunfunktion genauer analysiert. Eine grundsätzliche humorale Immunkompetenz von CXCR41013/1013-Tieren konnte nachgewiesen werden, jedoch ist die B-Memory-Funktion erheblich eingeschränkt. Durchflusszytometrisch und funktionell konnte eine reduzierte preB/pro-B Population im Knochenmark bei einer gleichzeitig vergrößerten preB/pro-B Population in der Milz (vgl. extramedulläre Hämatopoese) nachgewiesen werden. Ebenfalls konnten wir in dieser Zellpopulation eine stark erhöhte CXCR4-Oberflächenexpression im Vergleich zu wildtypischen Zellen nachweisen. Da diese unreifen B-Zellen keine verstärke Apoptoserate aufweisen, gehen wir derzeit davon aus, dass der Differenzierungsstopp nicht durch selektiven Zelltod, sondern durch aberrante Retention der preB/proB-Zellen in einer primitiven B-Vorläufer- Nische im Knochenmark zustande kommt, beziehungsweise durch eine gestörte Migration in differenzierende Nischen im Knochenmark. Alternativ könnte die Überdosis CXCR4-Signal differenzierenden Signalen entgegenstehen. Beide Hypothesen können das eingangs erwähnte Paradoxon bezüglich einer B-Zellaplasie in CXCR4-defizienten und CXCR4-überaktiven Zellen hinreichend erklären.
As central component of the peptide loading complex, the ABC transporter TAP is a key player in the adaptive immune response. By recognizing and translocating antigenic peptides derived from proteasomal degradation into the ER lumen it connects the processing of harmful intruders and the marking of an infected cell for elimination. This work focused mainly on the interaction between TAP and one of its viral inhibitors. Of the five known TAP inhibitors, ICP47 is the only one that is not anchored in the ER membrane and has a nonomolar affinity to TAP. These properties and its specific architecture make it an interesting protein engineering tool that can be used in a variety of ways to generate functionally arrested TAP complexes. Different lengths of ICP47 were chosen to map the optimal distance between the binding pocket and the N-terminal elbow helix of either TAP1 or TAP2. I demonstrated that the interaction of fused ICP47 with coreTAP inhibits antigen presentation via MHC I. Interestingly, the loss of MHC I surface expression only depended on the presence of the active domain and not on the length of the fused ICP47 fragments. Summarizing it can be said that TAP complexes containing an intact active domain of ICP47 successfully suppressed MHC I surface expression. Considering the MHC I surface expression in the use of free ICP47 fragments it was revealed that the active domain may not be sufficient. All free constructs, except the one that contains exclusively the active domain (1-35), were able to fully arrest peptide translocation, while the fragment 1-35 partially restored MHC I surface expression. This was the first evidence suggesting that more residues might be present in the ICP47 sequence that contribute to the interaction with TAP.
Further characterization of the ICP47-coreTAP fusion complexes comprised the determination of their thermostability and melting temperatures. The ICP47-coreTAP fusion complexes revealed a preferred orientation for ICP47. The ICP47(1-65) fragment led to a stable complex only if fused to TAP2, highlighting an interesting asymmetry at the TAP1/TAP2 interface, which suggests a shorter distance of the C-terminus of the stabilizing region to the elbow helix of TAP2 than of TAP1. The shorter fragments 1-35 and 1-50, and the ICP47 linker fragments, which inhibited, but did not trigger any thermostabilizing effects on TAP, revealed a second hint for the presence of other residues important for the ICP47/TAP interaction. To define the thermostability in more detail, the melting temperature of complexes with fused or freely bound ICP47 fragments was determined. Short fused fragments of ICP47 (residues 1-35 or 1-50) did not fully stabilize the TAP complex. Only ICP47 fragments longer than residues 1-50 raised the melting temperature to the full extent and led to a completely stabilized complex, suggesting that the critical melting temperature, which determines whether a complex is fully stabilized or not, is about 44-45°C. By comparing different ICP47 proteins from the herpesviral clade, I further noticed that the 21 residues following the active domain are highly conserved. The residues in this region were exchanged by glycines and alanines to study their impact on the thermostabilization of TAP. I demonstrated that several charged residues, an alanine rich, and a proline rich sequence were mainly responsible for the preservation of high melting temperatures. In summary, these findings reveal a dual inhibition mechanism of ICP47. While the active domain of ICP47 is wedged at the TAP1/2 interface and arrests the complex in an open-inward facing conformation, the highly conserved C-terminal region stabilizes the ICP47/TAP interaction and generates a thermostabilized TAP complex.
The second part of this thesis deals with two alternative expression and stabilization strategies for coreTAP, designed to provide a 1:1 ratio of TAP subunits during protein biosynthesis. Different glycine-serine (GS) linkers and a self cleaving 2A site were im- plemented into the TAP sequence and used for comparison with the classical coreTAP. Despite their functionality in antigen translocation, the utilization of GS linkers proved to be unsuitable due to low expression and scarce purification efficiency caused by the unfeasible orthogonal purification. In contrast, the use of a 2A site allowed orthogonal His10- and SBP-tag purification and yielded comparable amounts to the classical coreTAP. However, the ICP47/coreTAP interaction appeared to be hampered by the modified N-terminus of ICP47, due to the cleavage process.
The third and last part of this work deals with the Thermus thermophilus ABC trans- porter TmrAB, which was identified to be part of the same ABC subfamily as TAP. The structure of TmrAB is similar to that of coreTAP and includes a TMD and an NBD for each subunit. In comparison to TAP, TmrAB has a broader substrate range, but it can transport peptides, which are also transported by TAP. Since the natural substrate, and thus the actual function, of TmrAB has not yet been identified, it is counted among the multidrug resistance ABC transporters, from where it also takes its name. In this work, the question was investigated whether TmrAB can be utilized as a TAP substitute. To compare the function of TmrAB and TAP in a natural cell environment, the N-terminal domains of the TAP subunits called TMD0s were fused to the TmrAB subunits and subsequently expressed as different combinations. I found that especially the hybrid complexes containing a TMD0 of TAP2 were functional in terms of MHC I surface expression. Furthermore, TmrAB with TMD0 co-localized prevalently with the ER marker PDI while complexes without TMD0 did not co-localize. Interestingly, the analysis of the interaction with components of the PLC revealed that interaction with tapasin could only occur when a TMD0 was present. In turn, calreticulin, MHC I, and ERp57 were bound, regardless of the presence of a TMD0. It is remarkable that a bacterial protein, sharing only 27-30% sequence identity with human TAP is able to take over a key function of our adaptive immune system. Yet, TmrAB originates from a hyperthermophilic bacterium and may have assembly and folding difficulties that the human cell seeks to overcome by recruiting chaperones like calreticulin and ERp57. Although further experiments will be necessary to analyze the interaction of TmrAB with the PLC components in more detail, TmrAB appears to be homologous to coreTAP, not only in terms of sequence and structure, but also in terms of function.
Supersaturating formulations are widely used to improve the oral bioavailability of poorly soluble drugs. However, supersaturated solutions are thermodynamically unstable and such formulations often must include a precipitation inhibitor (PI) to sustain the increased concentrations to ensure that sufficient absorption will take place from the gastrointestinal tract. Recent advances in understanding the importance of drug-polymer interaction for successful precipitation inhibition have been encouraging. However, there still exists a gap in how this newfound understanding can be applied to improve the efficiency of PI screening and selection, which is still largely carried out with trial and error-based approaches. The aim of this study was to demonstrate how drug-polymer mixing enthalpy, calculated with the Conductor like Screening Model for Real Solvents (COSMO-RS), can be used as a parameter to select the most efficient precipitation inhibitors, and thus realise the most successful supersaturating formulations. This approach was tested for three different Biopharmaceutical Classification System (BCS) II compounds: dipyridamole, fenofibrate and glibenclamide, formulated with the supersaturating formulation, mesoporous silica. For all three compounds, precipitation was evident in mesoporous silica formulations without a precipitation inhibitor. Of the nine precipitation inhibitors studied, there was a strong positive correlation between the drug-polymer mixing enthalpy and the overall formulation performance, as measured by the area under the concentration-time curve in in vitro dissolution experiments. The data suggest that a rank-order based approach using calculated drug-polymer mixing enthalpy can be reliably used to select precipitation inhibitors for a more focused screening. Such an approach improves efficiency of precipitation inhibitor selection, whilst also improving the likelihood that the most optimal formulation will be realised.
Objectives: The objective of this review is to provide an overview of PK/PD models, focusing on drug-specific PK/PD models and highlighting their value-added in drug development and regulatory decision-making.
Key findings: Many PK/PD models, with varying degrees of complexity and physiological understanding, have been developed to evaluate the safety and efficacy of drug products. In special populations (e.g. pediatrics), in cases where there is genetic polymorphism and in other instances where therapeutic outcomes are not well described solely by PK metrics, the implementation of PK/PD models is crucial to assure the desired clinical outcome. Since dissociation between the pharmacokinetic and pharmacodynamic profiles is often observed, it is proposed that physiologically-based pharmacokinetic (PBPK) and PK/PD models be given more weight by regulatory authorities when assessing the therapeutic equivalence of drug products.
Summary: Modeling and simulation approaches already play an important role in drug development. While slowly moving away from “one-size fits all” PK methodologies to assess therapeutic outcomes, further work is required to increase confidence in PK/PD models in translatability and prediction of various clinical scenarios to encourage more widespread implementation in regulatory decision-making.
Die Steuerung biochemischer Prozesse oder die Verbesserung von Materialien erfordert zunächst ein tiefgründiges Verständnis über die zugrundeliegenden Systeme. Zur Untersuchung eignet sich Licht als ideales Werkzeug, da hiermit nützliche Informationen über die chemische Struktur, ihre Eigenschaften sowie den zusammenhängenden, schnellen Reaktionsabläufen erhalten werden können. Um die Aufklärung zu erleichtern können kleine, chemische Verbindungen eingeführt werden, welche beispielsweise ein Fluoreszenzmarker, eine photolabile Schutzgruppe oder eine photoschaltbare Verbindung sein können. Von jeweils einem Vertreter dieser Moleküle wurden unterschiedliche Studien durchgeführt, dessen Ergebnisse in dieser Arbeit in insgesamt drei Projekten zusammengefasst werden.
Zunächst wurde die Funktionalität der Helikase RhlB untersucht, die der Familie der DEAD-Box Proteine zugeordnet wird, und RNA-Duplexe in ihre Einzelstränge entwindet. Als RNA-Modellduplex diente JM2h, an dem ein RNA-Einzelstrang fluoreszenzmarkiert war (M2AP6). Die Einführung dieses Markers ermöglichte die Durchführung von statischen Fluoreszenzmessungen sowie von Mischexperimenten, die mit Hilfe der stopped-flow-Technik durchgeführt wurden. In den einleitenden Studien wurde die Helikase weggelassen, wodurch der Fokus auf den Fluoreszenzeigenschaften der RNA gelegt wurde. Die Ergebnisse hierzu zeigten, dass die Fluoreszenzintensität des Einzelstrangs durch Zugabe des komplementären Strangs deutlich abnimmt, wobei das Minimum bei einem äquimolaren Verhältnis erreicht wird. Die dazugehörigen stopped-flow-Messungen zeigten eine Beschleunigung der Hybridisierungsreaktion, wenn höhere Konzentrationen des Gegenstrangs in der Lösung vorhanden waren. Nach anschließender Zugabe der Helikase zur Lösung wurde ein Anstieg der Fluoreszenzintensität erwartet, der vom separierten Einzelstrang M2AP6 herrühren sollte. Dieser Anstieg wurde jedoch erst nach weiterer Zugabe von ATP beobachtet, der auf eine ATP-Abhängigkeit der Entwindungsreaktion von RhlB hindeutet. Diese Abhängigkeit wurde auch bereits für andere Helikasen der DEAD-Box Familie entdeckt. Die korrekte Funktionalität sowie die ATP-Abhängigkeit wurden in stopped-flow-Messungen verfiziert, bei denen der Fluoreszenzanstieg auch zeitaufgelöst betrachtet werden konnte. Für die spektralen Korrekturen der Fluoreszenzspektren wurde ein selbstgeschriebenes MATLAB-Programm namens FluCY verwendet (engl.: Fluorescence Correction & Quantum yield), welches eine schnelle und fehlerfreie Verarbeitung des Datensatzes ermöglichte.
Die zwei im folgenden beschriebenen Projekte handeln von photoaktivierbaren Molekülen. Zum einen photolabile Verbindungen, welche die Funktion z.B. eines Biomoleküls durch eine chemische Modifikation deaktivieren können. Durch eine lichtinduzierte Reaktion kommt es zur Abspaltung der Modifikation und die Funktion ist wiederhergestellt. In dieser Arbeit wurden verschiedene photolabile Schutzgruppen untersucht, die denselben Chromophor BIST (BIsStyryl-Thiophen) tragen. Durch die Einführung dieses Chromophors absorbierten sämtliche untersuchte Verbindungen sehr effizient sichtbares Licht (epsilon(445)=55.700 M^(-1) cm^(-1)), wodurch der photoinduzierte Bindungsbruch mit Wellenlängen durchgeführt werden, die bei einer biologischen Anwendungen keinen Schaden an der Zelle anrichten würden. Hieraufhin wurden in statischen und zeitaufgelösten Absorptionsmessungen Teilschritte der Freisetzungsreaktion untersucht, indem nach Photoanregung die Absorptionsänderungen auf verschiedenen Zeitskalen analysiert wurden. Die ultraschnelle Dynamik im Piko- bis Nanosekundenbereich (10^(-12)-10^(-9) s) wird durch eine spektral breite, positive Absorptionsänderng dominiert. Diese impliziert, dass die Deaktivierung über den Triplettpfad abläuft, der die vergleichsweise niedrigen Freisetzungsausbeuten erklärt (phi(u) < 5). Aufgrund des hohen Extinktionskoeffizienten reichen dennoch bereits niedrige Strahlungsdosen aus, um eine Freisetzung zu initiieren. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt dieser Reaktion ist dem Zerfall des aci-nitro Intermediats zugeordnet. Für ein sekundäres Amin, welches mit BIST geschützt wurde, ist eine Lebensdauer des Intermediats von 71 µs gefunden worden.
In einigen Fällen ist es erwünscht, eine vorliegende Aktivität nicht nur ein-, sondern auch ausschalten zu können, wofür photochrome Verbindungen (oder Photoschalter) verwendet werden. Die in dieser Arbeit untersuchte Verbindung ceCAM ist ein Alken-Photoschalter und vollführt bei Bestrahlung mit Licht eine cis/trans-Isomerisierung. ceCAM ist das Cyanoester-Derivat (ce) von Cumarin-substituierten Allylidenmalonat, von denen beide Konformere sehr effizient sichtbares Licht absorbieren trans: epsilon(489)=50.300 M^(-1) cm^(-1); cis: epsilon(437)=18.600 M^(-1) cm^(-1)). Andere photophysikalische Eigenschaften umfassen u.a. hohe thermische und photochemische Stabilität. Letztere wurde über ein Experiment nachgewiesen, bei dem die lichtinduzierte Isomerisierung alternierend durchgeführt wurde und selbst bei über 250 Zyklen keine signifikate Abnahme der Absorption beobachtet werden konnte. Des Weiteren konnte die Reaktion mit Quantenausbeuten von 39% (trans) und 42% (cis) induziert werden, wobei im photostationären Gleichgewicht auch hohe Isomerenverhältnisse mit bis zu 80% (trans) und 96% (cis) akkumuliert werden konnten. Die Geschwindigkeit der Reaktion wurde mit Hilfe der Ultakurzzeit-Spektroskopie untersucht. Die Dynamik im Zeitbereich von ps-ns zeigte, dass die trans/cis-Isomerisierung unterhalb von 0,5 ns und die umgekehrte Reaktion noch viel schneller (wenige ps) abgeschlossen ist. Durch die Untersuchungen in dieser Arbeit an den BIST-Verbindungen und ceCAM sind viele vorteilhafte, photophysikalische Eigenschaften charakterisiert worden, wodurch sie als verbesserte Alternative zu den bisher bekannten photolabilen Schutzgruppen oder Photoschaltern anzusehen sind.