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Die Aufdeckung krankheitsbedingter Unterschiede und die Identifizierung neuer Biomarker sind essenziell für Diagnose und Behandlung verschiedener Erkrankungen. Unterschiede zwischen Erkrankungen können u.a. durch Analyse des Lipidprofils aufgedeckt werden, da dieses eng mit dem Phänotyp verknüpft ist. Ein unvoreingenommenes Screening gewährt einen umfassenderen Einblick in den metabolischen Zustand als eine gezielte Untersuchung weniger Analyten und kann neue Hypothesen generieren. Deshalb wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Screening-Methode zur untargeted Untersuchung des Lipidoms in biologischen Proben entwickelt. Durch die Kombination aus Umkehrphasenchromatographie und hochauflösender Massenspektrometrie mit datenabhängiger Aufnahme von MS/MS-Spektren konnten in Humanplasma 440 Lipide aus mehr als 15 Lipidklassen identifiziert werden. Die mehrstufige Identifizierung der Analyten, basierend auf der exakten Masse ±5 ppm, der Isotopenverteilung, der MS/MS-Fragmentierungsmuster in beiden Ionisationsmodi sowie der chromatographischen Auftrennung von Isomeren und Isobaren, erfolgte mit hoher Selektivität. Mit der vorgestellten Methode können sowohl Lipidklassen als auch einzelne Lipide relativ zu den internen Standards quantifiziert werden.
Der Probendurchsatz wurde erhöht, um den Einsatz der Methode im Rahmen größerer klinischer Studien zu ermöglichen und vorhandene Ressourcen effizient einzusetzen. Dabei wurden die Inkubationszeiten während der Flüssig-Flüssig-Extraktion mit MTBE:Methanol deutlich reduziert und die Handhabung vereinfacht bei gleichbleibend hoher Wiederfindung. Der hohe Probendurchsatz wird weiter unterstützt durch die kurze chromatographische Laufzeit von 17 min pro Ionisationsmodus. Die Auswertung der Ergebnisse ist der heikelste und zeitintensivste Schritt bei der Entwicklung und Anwendung von Screening-Methoden, deshalb wurde der Arbeitsablauf zur univariaten Analyse durch Entwicklung von R Skripten vereinfacht und beschleunigt.
Die Qualität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sind essenziell. Aus diesem Grund wurde die Qualität der entwickelten Methode, angelehnt an den strikten Vorgaben der FDA und EMA zur Validierung von quantitativen Methoden, sichergestellt, obwohl eine Methodenüberprüfung im Bereich von untargeted Methoden nicht verbreitet ist. Die Reproduzierbarkeit der relativen Lipidkonzentrationen konnte z.B. durch die Messung von Kontrollplasmaproben über einen Zeitraum von 10 Monaten gezeigt werden. Außerdem wurde die Linearität der Verdünnung von Plasmaproben bestätigt und eine Verschleppung in darauffolgende Proben ausgeschlossen. Die Stabilität der Proben muss in jeder Messphase inklusive der Präanalytik durch geeignete Untersuchungen und Maßnahmen sichergestellt werden. Anhand einer Studie zur präanalytischen Stabilität humaner Blutproben konnte ein Protokoll zur Probennahme und -vorbereitung für weitere klinische Studien erarbeitet werden. Die Stabilität des Lipidoms in Vollblut und Plasma konnte durch den Einsatz von Natriumfluorid/Citrat als Antikoagulans verbessert werden. Auch die Stabilität der Proben während der Lipidextraktion und Messung konnte gezeigt werden. Es wurden 16 verschiedene Probenarten analysiert, darunter Plasmaproben, verschiedene Mausgewebe und Zellpellets.
Mit der entwickelten Methode wurden die Unterschiede im Lipidprofil im Plasma und Gewebe von Mäusen mit einer akuten Entzündung durch LPS bzw. Zymosan-Injektion aufgedeckt. Dabei wurden die Ether-Phosphatidylcholine als potenzielle Entzündungsmarker identifiziert. Die entwickelte Methode wurde außerdem erfolgreich im Rahmen anderer Arbeiten für die Untersuchung verschiedener Erkrankungen angewendet.
In der vorliegenden Arbeit wird demnach eine schnelle, reproduzierbare und vor allem selektive LC-MS-Screening-Methode vorgestellt, die Veränderungen des Lipidstoffwechsels aufdecken und potenzielle Biomarker identifizieren kann.
Nanoarzneimittel haben in den letzten Jahren in der Therapie verschiedener Erkrankungen immer mehr an Bedeutung gewonnen. Dadurch hat auch die Anzahl zugelassener Arzneimittel mit an Arzneistoffträgern wie Liposomen gebundenen Wirkstoffen zugenommen. Weil für die Zulassung, neben der Wirksamkeit und Unbedenklichkeit, auch die Qualität der neuen Arzneimittel gewährleistet sein muss, spielen die verschiedenen Eigenschaften der Arzneistoffträger eine wichtige Rolle in der Qualitätskontrolle. Neben der Partikelgröße, der Partikelgrößenverteilung und der Oberflächenladung spielt die (Rest-)Kristallinität des Wirkstoffs und die Wirkstofffreisetzung eine wesentliche Rolle für die erfolgreiche in vivo-Performance von Nanoarzneimitteln. Zur Bestimmung der Wirkstofffreisetzung aus kolloidalen Arzneistoffträgern wie Liposomen, Nanopartikeln oder Mizellen gibt es bis heute keine Standardmethoden. In der Forschung und der pharmazeutischen Industrie werden folglich verschiedene Methoden wie Filtration, Zentrifugation oder Dialyse verwendet, um den freigesetzten Wirkstoff zu bestimmen. Dabei ist die Wahl der Separationsmethode auf die Eigenschaften der Arzneistoffträger abzustimmen.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine dialysebasierte Apparatur, der Dispersion Releaser (DR), zur Untersuchung der in vitro Wirkstofffreisetzung aus kolloidalen Trägersystemen eingesetzt. Diese kann direkt mit den Apparaturen I/II der Arzneibücher der Europäischen Union (Ph. Eur.) und der Vereinigten Staaten (USP) gekoppelt werden. Zur Untersuchung der Wirkstofffreisetzung wird die Formulierung in das Donorkompartiment gegeben, sodass der freigesetzte Wirkstoff infolge über die Dialysemembran in das Akzeptorkompartiment permeiert. Dort kann dieser mittels HPLC analysiert werden. Besonders hervorzuheben ist das synchrone Rühren in beiden Kompartimenten des DR, worüber andere dialysebasierte Apparaturen nicht verfügen.
Die Entwicklung und Patentierung eines funktionsfähigen Prototyps des DR erfolgte an der Goethe Universität, Frankfurt am Main und wurde im Rahmen dieser Arbeit gemeinsam mit der Pharma Test Apparatebau AG (Hainburg, Deutschland) zu einer kommerziell erwerbbaren Apparatur (Pharma Test Dispersion Releaser, PTDR) weiterentwickelt. Innerhalb dieser Kollaboration wurde der Prototyp des DR unter Einbezug der Anforderungen der pharmazeutischen Industrie rekonstruiert. Eine erleichterte Anwendung für den Nutzer wurde dabei mitberücksichtigt.
Die finale Apparatur wurde zuletzt einer ausgiebigen Validierung unterzogen, bei der Diclofenac und Hydrocortison als Modellarzneistoffe dienten. Neben Untersuchungen zur Hydrodynamik und dem Einfluss der Umdrehungszahl auf die Membranpermeationsrate kM wurde eine Methode mit Gold-Nanopartikeln zur Bestimmung der Dichtigkeit des Systems entwickelt. Hierbei wurden Messungen mit einer UV/Vis-Methode und mit dynamischer Lichtstreuung durchgeführt, um die Abwesenheit der Goldpartikel im Akzeptorkompartiment nachzuweisen. Der Einfluss von Proteinen im Freisetzungsmedium auf die Membran-permeation wurde ebenfalls untersucht.
Der DR wurde ursprünglich zur Untersuchung von parenteralen Nanoformulierungen entwickelt. Aufgrund der bisher noch nicht erfolgten Untersuchung von halbfesten Zubereitungen im DR, wurde die Apparatur im Rahmen dieser Forschungsarbeit für zwei verschiedene Diclofenac-Gele (Voltaren® Emulgel, Olfen® Gel) unter verschiedenen Bedingungen evaluiert. Dabei konnte unter non-sink-Bedingungen der Einfluss der lipophilen Phase des Voltaren® Emulgels (GlaxoSmithKline Consumer Healthcare GmbH & Co. KG, München, Deutschland) gezeigt werden. Im Vergleich zum fettfreien Olfen® Gel (Mepha Pharma AG, Basel, Schweiz) zeigte Voltaren® Emulgel eine vollständige Freisetzung unter den erschwerten Löslichkeitsbedingungen.
Mit Hydrocortison als Modellsubstanz wurden vier verschiedene Proliposomen zur vaginalen An¬wendung formuliert. Neben der Charakterisierung der Partikelgröße und der Verkapselungs¬effizienz wurden Messungen mit dynamischer Differenzkalorimetrie durch-geführt und Aufnahmen zur morphologischen Charakterisierung mittels Transmissions-elektronen¬mikroskopie der Liposomen erstellt. Die Wirkstofffreisetzung des Hydrocortisons aus dem rekonstituierten liposomalen Gel sowie die Permeabilität über eine Zellmonoschicht wurde vergleichend untersucht. Dabei wurden Zelllinien aus humanem Cervixkarzinom beziehungsweise Endometriumkarzinom eingesetzt. Die Unterschiede der Formulierungen konnten vom DR sensitiver erfasst werden und die Verkapselungseffizienz als relevanter Faktor für die in vivo-Performance festgelegt werden.
Weil die tatsächliche Wirkstofffreisetzung durch die Permeation über die Dialysemembran überlagert werden kann, wurde neben der Standardisierung der Konstruktion die Auswertung mit Hilfe eines neuen mathematischen Modells, das auf dem Fick’schen Diffusionsgesetz basiert, verbessert. Das Normalisieren des Freisetzungsprofils mit Hilfe des mathematischen Modells dient dazu, die tatsächliche Wirkstofffreisetzung zu berechnen und den Vergleich verschiedener Freisetzungen ohne den Einfluss der Membranpermeation zu ermöglichen. Im Zuge der Validierung des DR wurde das mathematische Modell ebenfalls erfolgreich validiert.
In der vorliegenden Forschungsarbeit wurde eine neue Konstruktion des DR für die kommerzielle Anwendung entwickelt und validiert. Nebenbei wurde der Auswerteprozess zur Berechnung der diffusionsbereinigten Wirkstofffreisetzung vereinheitlicht und validiert. Zuletzt wurde das Anwendungsgebiet des DR von parenteralen Nanoformulierungen auf halbfeste Arzneiformen erweitert.
Guanosine triphosphate (GTP) cyclohydrolase I (GCH1) catalyzes the conversion of GTP to dihydroneopterin triphosphate (H2NTP), the initiating step in the biosynthesis of tetrahydrobiopterin (BH4). Besides other roles, BH4 functions as cofactor in neurotransmitter biosynthesis. The BH4 biosynthetic pathway and GCH1 have been identified as promising targets to treat pain disorders in patients. The function of mammalian GCH1s is regulated by a metabolic sensing mechanism involving a regulator protein, GCH1 feedback regulatory protein (GFRP). GFRP binds to GCH1 to form inhibited or activated complexes dependent on availability of cofactor ligands, BH4 and phenylalanine, respectively. We determined high-resolution structures of human GCH1−GFRP complexes by cryoelectron microscopy (cryo-EM). Cryo-EM revealed structural flexibility of specific and relevant surface lining loops, which previously was not detected by X-ray crystallography due to crystal packing effects. Further, we studied allosteric regulation of isolated GCH1 by X-ray crystallography. Using the combined structural information, we are able to obtain a comprehensive picture of the mechanism of allosteric regulation. Local rearrangements in the allosteric pocket upon BH4 binding result in drastic changes in the quaternary structure of the enzyme, leading to a more compact, tense form of the inhibited protein, and translocate to the active site, leading to an open, more flexible structure of its surroundings. Inhibition of the enzymatic activity is not a result of hindrance of substrate binding, but rather a consequence of accelerated substrate binding kinetics as shown by saturation transfer difference NMR (STD-NMR) and site-directed mutagenesis. We propose a dissociation rate controlled mechanism of allosteric, noncompetitive inhibition.
Die Entstehung von Leukämien steht meist im Zusammenhang mit chromosomalen Translokationsereignissen, bei denen vor allem das MLL (Mixed Lineage Leukemia)-Gen auf Chromosom 11q23 involviert ist. Die häufigste Translokation, die eine Akute Lymphatische Leukämie (ALL) bei Kleinkindern auslöst, stellt die t(4;11)-Translokation dar. Die Rekombination der Chromosomen 11 und 4 führt hierbei zur Entstehung der beiden Fusionsproteine MLL-AF4 und AF4-MLL. Bisherige Studien, die den Krankheitsmechanismus hinter dieser ALL-Form untersuchten, identifizierten eine charakteristische Überexpression der HOXA-Gene als einen besonderen Treiber dieser Krankheitsentstehung. Durch die Deregulierung des HOX-Clusters durch das chimäre MLL-AF4-Protein wird ein Differenzierungs- und Apoptoseblock induziert und eine stetige Proliferation der Zellen gefördert. Arbeiten von Trentin et al. (2009) klassifizierten eine Subgruppe von t(4;11)-Patienten, die, im Gegensatz zu den bisher charakterisierten ALL-Leukämien, eine Reprimierung ihrer HOXA-Cluster aufwiesen und mit einer schlechteren Prognose assoziiert waren. Das Genexpressionsprofil dieser HOXAlow-Patienten sprach für einen neuen Krankheitsmechanismus. Allen HOXAlow-Patienten war zudem gemein, dass sie eine Überexpression des Transkriptionsfaktors IRX1 aufwiesen. Die Relevanz dieses Transkriptionsfaktors im Kontext einer t(4;11)-Leukämie wurde durch diese Doktorarbeit genauer untersucht. Durch Vorarbeiten mit transient exprimiertem IRX1 in HEK293T-Zellen wurde eine DNA-Microarray-Analyse durchgeführt, durch die ein Genexpressionsprofil (GEP) dieser Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen (mit dem Leervektor transfiziert) erstellt wurde. Dies schuf die Grundlage für die Durchführung weiterer Experimente, die mit Hilfe von RT-PCR-, Chromatin-Immunpräzipitations-, Co-Immunpräzipitations- und Western Blot-Versuchen den Effekt und das Verhalten des IRX1-Proteins im Zusammenhang mit MLL-AF4, bzw. die Funktion von IRX1 alleine, charakterisieren sollten. Es zeigte sich, dass IRX1 eine Reprimierung der HOXA-Gene induziert und dieser Effekt über den aktivierenden Effekt des chimären MLL-AF4-Proteins dominiert. Dies geschah jedoch auf zwei unterschiedliche Wege, da zum einen das IRX1 in der Abwesenheit von MLL-AF4 nicht direkt an die HOXA-Gene binden kann und zum anderen durch MLL-AF4 eine Inkorporation des IRX1 in den Multiproteinkomplex des chimären Onkoproteins stattfindet und IRX1 dadurch direkt an die HOXA-Promotoren gelangt. Zudem wurden weitere direkte und indirekte Zielgene des IRX1 identifiziert. Zu ihnen zählen MEIS1, HOXB4 und EGR1-3. Durch die Erweiterung der Versuche durch Behandlungen mit dem pan-HDAC-Inhibitor Trichostatin A konnte belegt werden, dass MLL-AF4 vom Promotor seiner Zielgene dissoziiert und durch das endogene wt-MLL ersetzt werden kann. Trotz der inhibitorischen Wirkung des IRX1 auf das MLL-AF4 verursacht es eine Stabilisierung des MLL-AF4 an den Promotoren seiner Zielgene, was eine Dissoziation des Komplexes durch TSA verhindert. Die Applikation von TSA führt unabhängig von der vorherigen Konstitution (±IRX1) aber auch zu einer Normalisierung der HOXA-Expression. Die vorgelegten Daten verdeutlichen, dass IRX1 kausal für das GEP der HOXAlow-Patienten verantwortlich ist und durch seine Anwesenheit wichtige Regulatoren der Differenzierung und der Zellzyklusregulierung gestört werden. Zudem wurde der Benefit einer Histondeacetylaseinhibitor (HDACi)-Behandlung bei dieser Patientenkohorte hervorgehoben, da der inhibierende Effekt des IRX1 auf die HOXA-Gene aufgehoben und das wt-MLL in seiner Funktionsfähigkeit nicht beeinträchtigt wurde. Die Relevanz des IRX1 im Kontext einer t(4;11)-Leukämie wurde somit aufgeklärt und ein neuer Krankheits-mechanismus der HOXAlow-Patientenkohorte definiert. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Etablierung eines Transfektionsprotokolls, um eine stabile Integrationen der Sleeping Beauty-Konstrukte in t(4;11)-Suspensionszellen zu ermöglichen. Bisher war es nur über lentivirale Methoden möglich, diese Zellen genetisch zu manipulieren. Durch die hier vorgestellte Methode können nun SEM-Zellen (B-Zell-Vorläuferzellen einer ALL mit t(4;11)) über Elektroporation stabil transfiziert und anschließend über Selektion zu einer homogenen Zellpopulation positiv transfizierter Zellen herangezogen werden. Hierdurch wird eine Übertragung bisheriger Methoden in ein leukämisches Zellsystem möglich, wodurch genetische Manipulationen in einer physiologischen Umgebung getestet werden können, ohne in S2-Laboratorien arbeiten zu müssen.
Die Bande q23 auf Chromosom 11 ist in zahlreiche reziproke chromosomale Translokationen verwickelt. Diese sind dominant mit dem Krankheitsphänotyp einer AML, ALL und seltener mit malignen Lymphomen und myelodysplastischen Syndromen assoziiert. Mittlerweile sind fünfundachtzig cytogenetische Aberrationen der Bande 11q23 bekannt. Das auf 11q23 betroffene Gen wird als das Mixed Lineage Leukemia (MLL), Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL-1), Human Homolog of trithorax (HRX) oder als Human Trithorax 1 (Htrx1) bezeichnet. Die häufigsten Partnergene des MLL sind AF4 (40 %), AF9 (27 %), sowie ENL, AF6, ELL und AF10 (4-7 %).
Die Bruchpunkte von t(11;V) Translokationen sind nicht gleichmäßig über das gesamte, 92 kb große humane MLL-Gen verteilt, sondern liegen alle in der 8,3 kb großen Bruchpunktsregion Bpr. Auch innerhalb der Bpr ist die Verteilung der Translokationsbruchpunkte nicht homogen. Die Bruchpunkte von Patienten mit de novo Leukämien und einem Alter über einem Jahr liegen mehrheitlich in der 5’-Hälfte der Bpr, dem Subcluster I. Dagegen liegen die Bruchpunkte von Patienten mit therapiebedingten Leukämien und einem Alter unter einem Jahr überwiegend in der 3’-Hälfte der Bpr, dem Subcluster II.
Neuere Forschungsergebnisse zeigten, daß DNA-Doppelstrangbrüche auf zwei verschiedenen Chromosomen eine hinreichende Voraussetzung für das Entstehen chromosomaler Translokationen sind. Aufgrund der inhomogenen Verteilung der Translokationsbruchpunkte im MLL-Gen stellte sich die Frage, ob bestimmte Regionen dieses Gens für DNA-Doppelstrangbrüche prädisponiert sind. Interessanterweise ist Subcluster II extrem sensitiv gegenüber DNA-Doppelstrangbrüchen, die durch cytotoxische Agenzien oder Apoptose-auslösende Ereignisse induziert werden können. In unserer Arbeitsgruppe konnte eine etwa 200 bp große Region lokalisiert werden, über die sich nahezu alle Etoposid-induzierten DNA-Doppelstrangbrüche verteilten.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, daß die Bildung von DNA-Doppelstrangbrüchen in dieser Region durch die Gabe eines Caspase-Inhibitors gehemmt werden kann. Eine Etoposid-induzierte Protein-DNA-Wechselwirkung konnte allerdings nicht nachgewiesen werden. In der Literatur fanden sich Hinweise darauf, daß Subcluster II im Gegensatz zu Subcluster I eine verstärkte Histonacetylierung aufweist. Basierend auf diesen Hinweisen sollte die Arbeitshypothese untersucht werden, ob Subcluster II einen geninternen Promotor des MLL-Gens darstellt.
Die potentielle Promotorregion wurde zunächst durch Computeranalysen eingegrenzt. Mit RT-PCR Experimenten wurde anschließend der potentielle geninterne Promotor des murinen Mll-Gens in einer murinen Fibroblastenzellinie lokalisiert, die einen Transkriptionsstop und eine Polyadenylierungssequenz in Exon 4 des Mll-Gens trug. Um die am Mausmodell gewonnenen Erkenntnisse auch im humanen System zu überprüfen, wurde die geninterne Promotorregion des humanen MLL Gens vor ein Luciferasereportergen kloniert. Durch RTPCR konnte der geninterne Transkriptionsstart im Subcluster II des humanen MLL-Gens lokalisiert werden. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, daß Transkriptionsinitiation und genetische Instabilität im Subcluster II des humanen MLL-Gens kolokalisieren.
Durch Deletionsmutanten wurde die Bedeutung der einzelnen Module dieser Promotorregion ermittelt. Dabei zeigte sich, daß die Anwesenheit von zwei retromobilen Elementen eine Enhancer-Funktion haben. Demgegenüber zeigte die homologe murine Sequenz, die in unserer Arbeitsgruppe gleichzeitig von S. Scharf untersucht wurde und für die keine erhöhte Anfälligkeit für DNA-Doppelstrangbrüche bekannt ist, nur eine schwache Promotoraktivität. Dies weist auf einen Zusammenhang zwischen der genetischen Instabilität von Subcluster II und der Rate geninterner Transkriptionsinitiationsprozesse hin.
Das Protein, für das das Transkript des geninternen murinen Promotors kodiert, wurde mittels immunhistologischer und Western Blot Experimente nachgewiesen. Dabei konnte gezeigt werden, daß dieses Protein, wie auch das MLL-Protein, proteolytisch durch Taspase1 und daß sich ein Mini-MLL-Komplex bildet.
Approximately 80 % of persistent wound infections are affected by the presence of bacterial biofilms, resulting in a severe clinical challenge associated with prolonged healing periods, increased morbidity, and high healthcare costs. Unfortunately, in vitro models for wound infection research almost exclusively focus on early infection stages with planktonic bacteria. In this study, we present a new approach to emulate biofilm-infected human wounds by three-dimensional human in vitro systems. For this purpose, a matured biofilm consisting of the clinical key wound pathogen Pseudomonas aeruginosa was pre-cultivated on electrospun scaffolds allowing for non-destructive transfer of the matured biofilm to human in vitro wound models. We infected tissue-engineered human in vitro skin models as well as ex vivo human skin explants with the biofilm and analyzed structural tissue characteristics, biofilm growth behavior, and biofilm-tissue interactions. The structural development of biofilms in close proximity to the tissue, resulting in high bacterial burden and in vivo-like morphology, confirmed a manifest wound infection on all tested wound models, validating their applicability for general investigations of biofilm growth and structure. The extent of bacterial colonization of the wound bed, as well as the subsequent changes in molecular composition of skin tissue, were inherently linked to the characteristics of the underlying wound models including their viability and origin. Notably, the immune response observed in viable ex vivo and in vitro models was consistent with previous in vivo reports. While ex vivo models offered greater complexity and closer similarity to the in vivo conditions, in vitro models consistently demonstrated higher reproducibility. As a consequence, when focusing on direct biofilm-skin interactions, the viability of the wound models as well as their advantages and limitations should be aligned to the particular research question of future studies. Altogether, the novel model allows for a systematic investigation of host-pathogen interactions of bacterial biofilms and human wound tissue, also paving the way for development and predictive testing of novel therapeutics to combat biofilm-infected wounds.
Approximately 80 % of persistent wound infections are affected by the presence of bacterial biofilms, resulting in a severe clinical challenge associated with prolonged healing periods, increased morbidity, and high healthcare costs. Unfortunately, in vitro models for wound infection research almost exclusively focus on early infection stages with planktonic bacteria. In this study, we present a new approach to emulate biofilm-infected human wounds by three-dimensional human in vitro systems. For this purpose, a matured biofilm consisting of the clinical key wound pathogen Pseudomonas aeruginosa was pre-cultivated on electrospun scaffolds allowing for non-destructive transfer of the matured biofilm to human in vitro wound models. We infected tissue-engineered human in vitro skin models as well as ex vivo human skin explants with the biofilm and analyzed structural tissue characteristics, biofilm growth behavior, and biofilm-tissue interactions. The structural development of biofilms in close proximity to the tissue, resulting in high bacterial burden and in vivo-like morphology, confirmed a manifest wound infection on all tested wound models, validating their applicability for general investigations of biofilm growth and structure. The extent of bacterial colonization of the wound bed, as well as the subsequent changes in molecular composition of skin tissue, were inherently linked to the characteristics of the underlying wound models including their viability and origin. Notably, the immune response observed in viable ex vivo and in vitro models was consistent with previous in vivo reports. While ex vivo models offered greater complexity and closer similarity to the in vivo conditions, in vitro models consistently demonstrated higher reproducibility. As a consequence, when focusing on direct biofilm-skin interactions, the viability of the wound models as well as their advantages and limitations should be aligned to the particular research question of future studies. Altogether, the novel model allows for a systematic investigation of host-pathogen interactions of bacterial biofilms and human wound tissue, also paving the way for development and predictive testing of novel therapeutics to combat biofilm-infected wounds.
Ubiquitination is regarded as one of the key post-translational modifications in nearly all biological processes, endowed with numerous layers of complexity. Deubiquitinating enzymes (DUBs) dynamically counterbalance ubiquitination events by deconjugating ubiquitin signals from substrates. Dysregulation of the ubiquitin code and its negative regulators drive various pathologies, such as neurological disorders and cancer.
The DUB ubiquitin-specific peptidase 22 (USP22) is well-known for its essential role in the human Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase (SAGA) complex, mediating the removal of monoubiquitination events from Histone 2A and 2B (H2A and -B), thereby regulating gene transcription. In cancer, USP22 was initially described as a part of an 11-gene expression signature profile, predicting tumor metastasis, reoccurrence and death after therapy in a wide range of tumor cells. However, novel roles for USP22 have emerged recently, accrediting USP22 essential roles in regulating tumor development as well as apoptotic cell death signaling.
One of the hallmarks of cancer is the evasion of cell death, especially apoptosis, a form of programmed cell death (PCD). Necroptosis, a regulated form of necrosis, is regarded as an attractive therapeutic strategy to overcome apoptosis-resistance in tumor cells, although a profound understanding of the exact signaling cascade still remains elusive. Nevertheless, several ubiquitination and deubiquitination events are described in fine-tuning necroptotic signaling.
In this study, we describe a novel role for USP22 in regulating necroptotic cell death signaling in human tumor cell lines. USP22 depletion significantly delayed TNFa/Smac mimetic/zVAD.fmk (TBZ)-induced necroptosis, without affecting TNFa-induced nuclear factor-kappa B (NF-KB) signaling or TNFa-mediated extrinsic apoptosis. Intriguingly, re-expression of USP22 wildtype in the USP22 knockout background could re-sensitize HT-29 cells to TBZ-induced necroptosis, whereas re-constitution with the catalytic inactive mutant USP22 Cys185Ser did not rescue susceptibility to TBZ-induced necroptosis, confirming the USP22 DUB-function a pivotal role in regulating necroptotic cell death. USP22 depletion facilitated ubiquitination and unexpectedly also phosphorylation of Receptor-interacting protein kinase 3 (RIPK3) during necroptosis induction, as shown by Tandem Ubiquitin Binding Entities (TUBE) pulldowns and in vivo (de)ubiquitination immunoprecipitations. To substantiate our findings, we performed mass-spectrometric ubiquitin remnant profiling and identified the three novel USP22-regulated RIPK3 ubiquitination sites Lysine (K) 42, K351 and K518 upon TBZ-induced necroptosis. Further assessment of these ubiquitination sites unraveled, that mutation of K518 in RIPK3 reduced necroptosis-associated RIPK3 ubiquitination and additionally affected RIPK3 phosphorylation upon necroptosis induction. At the same time, genetic knock-in of RIPK3 K518R sensitizes tumor cells to TNFa-induced necroptotic cell death and amplified necrosome formation.
In summary we identified USP22 as a new regulator of TBZ-induced necroptosis in various human tumor cell lines and further unraveled the distinctive role of DUBs and (de)ubiquitination events in controlling programmed cell death signaling.
Unraveling the activation mechanism of taspase1 which controls the oncogenic AF4–MLL fusion protein
(2015)
We have recently demonstrated that Taspase1-mediated cleavage of the AF4–MLL oncoprotein results in the formation of a stable multiprotein complex which forms the key event for the onset of acute proB leukemia in mice. Therefore, Taspase1 represents a conditional oncoprotein in the context of t(4;11) leukemia. In this report, we used site-directed mutagenesis to unravel the molecular events by which Taspase1 becomes sequentially activated. Monomeric pro-enzymes form dimers which are autocatalytically processed into the enzymatically active form of Taspase1 (αββα). The active enzyme cleaves only very few target proteins, e.g., MLL, MLL4 and TFIIA at their corresponding consensus cleavage sites (CSTasp1) as well as AF4–MLL in the case of leukemogenic translocation. This knowledge was translated into the design of a dominant-negative mutant of Taspase1 (dnTASP1). As expected, simultaneous expression of the leukemogenic AF4–MLL and dnTASP1 causes the disappearance of the leukemogenic oncoprotein, because the uncleaved AF4–MLL protein (328 kDa) is subject to proteasomal degradation, while the cleaved AF4–MLL forms a stable oncogenic multi-protein complex with a very long half-life. Moreover, coexpression of dnTASP1 with a BFP-CSTasp1-GFP FRET biosensor effectively inhibits cleavage. The impact of our findings on future drug development and potential treatment options for t(4;11) leukemia will be discussed.
Uncaging approach, native membrane dynamics and lipidic cubic phases in biomolecular solid-state NMR
(2019)
It was previously shown for the Escherichia coli diacylglycerol kinase (DgkA) that enzyme-reactions at the membrane interface can be monitored by solid-state NMR. However, such studies can face problems due to limited accessibility of the active sites: Natural substrates for membrane enzymes, but also ligands for membrane proteins or lipid mediators, are either partitioning into the membrane and cannot be added easily, or if soluble exhibit accessibility restrictions, as they cannot freely pass through lipid bilayers. This situation complicates quantitative kinetic analysis of biochemical processes such as enzyme activity, ligand binding, but also oligomerization or folding reactions in the membrane or at its interface under MAS NMR conditions.
To overcome these limitations the feasibility and possible advantages of the uncaging approach as a new tool for biomolecular solid-state NMR to trigger reactions by light have been explored. DgkA’s enzymatic activity, exemplary of a biochemical process on the membrane interface, was thereby triggered in situ during MAS by light-induced release of its substrates that were rendered inactive with photolabile protecting groups. To be capable of uncaging sufficient amounts of substrate during MAS to follow the enzymatic reaction via 31P real-time NMR measurements, several illumination variants including an existing illumination setup to study retinal proteins under cryogenic conditions via DNP enhanced NMR were tested. As uncaging of micromole amounts of substrates requires a higher flux compared to initiation of a photocycle in retinal proteins, a new illumination setup was built with Bruker Biospin and Leoni Fibertech. It consists of a modified MAS probe and a suitable fiber bundle, allowing to efficiently couple light from high power LEDs into a sapphire rotor containing the sample, without disturbing the magnetic field homogeneity or sample rotation. By reducing the sample volume to the illuminated area up to 60 mM ATP were released by uncaging NPE ATP to initiate DgkA’s activity in several tested membrane mimetics. These mimetics included liposomes and bicelles, which are well established in the field of biomolecular solid state NMR as well as the optically transparent lipidic cubic phase of monoolein, widely used in membrane protein crystallography, but not yet well characterized as membrane mimetic under MAS conditions. A unique and powerful but compared to time and spatial resolution often underrepresented advantage of the uncaging approach for biophysical studies has been demonstrated by successful uncaging of a non-miscible lipid substrate to trigger DgkA’s kinase reaction: Initiation of processes that cannot easily be triggered by mixing. Examples of these are reactions involving highly hydrophobic, membrane partitioning compounds including lipid substrates, ligands or interaction partners, but also oligomerization or folding of biomacromolecules. The herein performed experiments therefore serve as a first demonstration of the uncaging approach’s feasibility and compatibility with a wide variety of membrane mimetics and give a first indication of its potential for a variety of biomolecular solid state NMR experiments.
As high accessibility for solutes has been a second focus for the choice of membrane mimetics, DgkA’s activity in the lipidic cubic phases of monoacylglycerols with its two continuous networks of water channels has been further characterized. Kinetic parameters obtained from 31P real time solid state NMR experiments revealed that DgkA’s activity is similar to activities obtained in swollen cubic phases in a bath solution with wider water channels. Diffusion of ATP in a non swollen cubic phase was however strongly reduced compared to ATP in solution as diffusion measurements showed. Therefore, saturation of the enzyme required distinctly higher ATP concentrations. These results thereby underline the advantage of a non invasive and label free method like NMR to directly gain information about enzymatic reactions of immobilized enzymes in porous materials. The obtained wealth of information from 31P real time NMR experiments and biochemical assays in different membrane mimetics in presence and absence of lipid substrates and activators also provided further insight into DgkA’s enzymatic activity. It confirms ATP binding and hydrolysis in the absence of a lipid substrate, in agreement with the proposed mode of substrate binding, and allowed to estimate the in vivo relevance of previously observed ATPase activity in liposomes.
Further exploration of the cubic phase as membrane mimetic for protein solid state NMR revealed its high stability under MAS at elevated temperatures and capacity to reconstitute sufficient amounts of DgkA. Unlike monoolein, DgkA was cross-polarizable in a cubic phase and exhibited similar dynamics compared to DgkA reconstituted into liposomes, allowing to acquire the herein shown dipolar coupling based 2D protein spectra. As lipidic cubic phases are not containing phospholipids, monoacylglycerols could be especially useful as membrane mimetics for 31P correlation spectra. Initial experiments under DNP conditions, where in liposomes line broadening causes severe overlap of phospholipid signals and unspecific cross polarization highlight this aspect.
In summary, herein reported results of the experiments performed with lipidic cubic phases demonstrate that they are robust and versatile membrane mimetics. They could be of advantage for a variety of solid-state NMR experiments where either optical transparency for efficient illumination is desired, accessibility for solutes and membrane components under MAS is required, or interference of phosphorous signals of other membrane mimetics must be avoided.
In the second chapter of this thesis 1H solid-state NMR as a label free method to probe membrane order and dynamics directly within a cellular and disease relevant context was used to observe the effects of soluble epoxide hydrolase (sEH) encoding gene knock-outs on membrane dynamics. Knock-out of the sEH encoding gene changed the overall membrane dynamics in the physiological temperature range of native membranes derived from mouse brains, making the bulk membrane more dynamic. To confirm that these effects are related to the enzymatic activity of sEH, substrates and products of sEH were added to evaluate their effects on membrane dynamics. 19,20 dihydroxydocosapentaenoic acid (DHDP), a product of sEH, partially reversed the knock out phenotype in a concentration dependent manner whereas the substrate 19,20 epoxydocosapentaenoic acid did not cause any effects. As both polyunsaturated fatty acids did not show differences in phase behavior in a simple phospholipid bilayer these results provide evidence that the previously observed concentration dependent DHDP induced relocation of cholesterol away from detergent resistant lipid raft fractions is associated with alteration of membrane dynamics. Therefore, also the effect of cholesterol removal via cyclodextrin on membrane dynamics was analyzed. Removal of cholesterol led to a similar temperature profile of wild type and knock out membranes thereby supporting the hypothesis that DHDP induced relocation of cholesterol is causing altered membrane dynamics. These alterations have been shown by the lead authors of the collaborative research project to induce relocation of various membrane proteins and are involved in the development of diabetic retinopathy. Furthermore, in this context inhibition of sEH has been shown to inhibit diabetic retinopathy and proposed as target for prevention of one of the leading causes of blindness in the developed world.
The family of phytochrome photoreceptors contains proteins with different domain architectures and spectral properties. Knotless phytochromes are one of the three main subgroups classified by their distinct lack of the PAS domain in their photosensory core module, which is in contrast to the canonical PAS-GAF-PHY array. Despite intensive research on the ultrafast photodynamics of phytochromes, little is known about the primary kinetics in knotless phytochromes. Here, we present the ultrafast Pr ⇆ Pfr photodynamics of SynCph2, the best-known knotless phytochrome. Our results show that the excited state lifetime of Pr* (~200 ps) is similar to bacteriophytochromes, but much longer than in most canonical phytochromes. We assign the slow Pr* kinetics to relaxation processes of the chromophore-binding pocket that controls the bilin chromophore’s isomerization step. The Pfr photoconversion dynamics starts with a faster excited state relaxation than in canonical phytochromes, but, despite the differences in the respective domain architectures, proceeds via similar ground state intermediate steps up to Meta-F. Based on our observations, we propose that the kinetic features and overall dynamics of the ultrafast photoreaction are determined to a great extent by the geometrical context (i.e., available space and flexibility) within the binding pocket, while the general reaction steps following the photoexcitation are most likely conserved among the red/far-red phytochromes.
In the last twenty years, there has been splendid progress in energy conversion technologies to have sustainable energy sources. For example, solar cells contribute significantly to energy production as the sun is an enormous source for renewable energy. Currently, the most common commercialized photovoltaic devices are silicon-based. The scientists' main targets are high efficiency, low cost, environmentally friendly, and easy to synthesize new semiconductor materials to replace silicon. Furthermore, understanding the photophysical properties of these materials is very important for designing high efficient photoconversion systems.
This thesis investigates the photophysics of lead-based wide-bandgap perovskites with different dimensionality (2D, 3D) and how they can be optimized for optoelectronic applications. In chapter 1, we present the background and progress in perovskite research. The basic concepts of semiconductor and spectroscopic methods of the applied techniques in this work are discussed in chapter 2.
In the first project (chapter 3.1), we used our time-resolved techniques to study the ultrafast dynamics of energy transfer from the inorganic to the organic layer in a series of three lead-based mixed-halide 2D perovskites containing benzyl ammonium (BA), 1-naphthyl methyl ammonium (NMA), and 1-pyrene methyl ammonium (PMA) thin films.
In the second project (chapter 3.2), we used time-resolved spectroscopic techniques to study the effect of adding 5% of Cs on the dynamics of a mixed-cation wide bandgap bromide-based 3D perovskite.
In another side project (chapter 4), we present the photophysics properties of newly synthesized new Schiff bases containing indole moieties using piperidine as an organic base catalyst and Au@TiO2 as a heterogeneous catalyst. Finally, the results of this work are summarized in Chapter 5 with an outlook and a discussion of open questions for further research.
De novo fatty acid biosynthesis in humans is accomplished by a multidomain protein, the type I fatty acid synthase (FAS). Although ubiquitously expressed in all tissues, fatty acid synthesis is not essential in normal healthy cells due to sufficient supply with fatty acids by the diet. However, FAS is overexpressed in cancer cells and correlates with tumor malignancy, which makes FAS an attractive selective therapeutic target in tumorigenesis. Herein, we present a crystal structure of the condensing part of murine FAS, highly homologous to human FAS, with octanoyl moieties covalently bound to the transferase (MAT) and the condensation (KS) domain. The MAT domain binds the octanoyl moiety in a novel (unique) conformation, which reflects the pronounced conformational dynamics of the substrate binding site responsible for the MAT substrate promiscuity. In contrast, the KS binding pocket just subtly adapts to the octanoyl moiety upon substrate binding. Besides the rigid domain structure, we found a positive cooperative effect in the substrate binding of the KS domain by a comprehensive enzyme kinetic study. These structural and mechanistic findings contribute significantly to our understanding of the mode of action of FAS and may guide future rational inhibitor designs.
Two salts of the 6,6-difluoro-6H-dibenzo[c,e][1,2]oxaborinin-6-ide anion with different cations
(2020)
The crystal structures are reported of the 6,6-difluoro-6H-dibenzo[c,e][1,2]oxaborinin-6-ide (or 9,9-difluoro-10-oxa-9-boraphenanthren-9-ide) anion with two different cations, namely, potassium 6,6-difluoro-6H-dibenzo[c,e][1,2]oxaborinin-6-ide, K+·C12H8BF2O−, (II), featuring a polymeric structure, and bis(tetraphenylphosphonium) bis(6,6-difluoro-6H-dibenzo[c,e][1,2]oxaborinin-6-ide) acetonitrile trisolvate, 2C24H20P+·2C12H8BF2O−·3CH3CN, (III), which is composed of discrete cations, anions and acetonitrile solvent molecules linked by C—H...O, C—H...N and C—H...F hydrogen bonds. There are only minor differences in the geometrical parameters of the anions in these structures.
Protein quality control (PQC) machinery is in charge of ensuring protein homeostasis in the cell, i.e. proteostasis. Chaperones assist polypeptides throughout their maturation until functionality is achieved. This process might be disrupted in the presence of mutations or external damaging agents that affect the folding and stability of proteins. In this case, proteins can be efficiently recognized and targeted for degradation in a controlled manner. Ubiquitylation refers to the covalent attachment of one or more ubiquitin moieties to faulty proteins, thus triggering their degradation by the 26S proteasome.
More than 30% of proteins need cofactor molecules. Lack of cofactors renders proteins non-functional. We wanted to understand how the PQC deals with wild-type proteins in the absence of their cofactors. Several studies have indicated the importance of the riboflavin-derived cofactor FAD in the stability of individual flavoproteins, and hence we assumed that loss of flavin should mediate a targeted degradation of this group of proteins. Indeed, our mass spectrometry experiments showed that flavoproteome levels decreased under riboflavin starvation. The oxidoreductase NQO1 was used as a model enzyme to further investigate the mechanism of flavoproteome targeting by the PQC. We showed that cofactor loading determines ubiquitylation of NQO1 by the co-chaperone CHIP, both in vivo and in vitro. Furthermore, subtle changes in the C-terminus of NQO1 in the absence of FAD seemed to be crucial for this recognition event. ApoNQO1 interactome differed from holoNQO1. Chaperones and degradation factors were enriched on NQO1 upon cofactor withdrawal, probably to support maturation and prevent aggregation of the enzyme.
Loss of protein folding and stability, even to a small extent, can enhance the aggregating behavior of proteins. Proper loading with FAD reduced the co-aggregation of NQO1 with Aβ1-42 peptide. We assumed that the flavoproteome might represent aggregating-prone species under riboflavin deprivation. Supportingly, reversible apoNQO1 aggregates were observed in vivo in the absence of cofactor. General amyloidogenesis in vivo also increased under these conditions, apparently as a result of flavoproteome destabilization. In this context, we think that our data might have important implications considering the onset and development of conformational diseases.
This work has shed some light on the therapeutic implications of riboflavin deficiency as well. The sensitivity of melanoma cells towards the alkylating agent methyl methanesulfonate (MMS) increased under riboflavin starvation. Subsequent analyses indicated that a complex metabolic reorganization, mostly affecting proliferation and energy metabolism, occurs in response to starvation. What we suggest to call “flavoaddiction” can be understood as the dependence of melanoma cells on the flavoproteome structural and functional intactness to survive chemotherapy. Understanding this cellular reprogramming in detail might reveal new possibilities for future therapies.
Transport mechanism of a multidrug resistance protein investigated by pulsed EPR spectroscopy
(2019)
In human several diseases result from malfunctions of ATP-binding cassette (ABC) systems, which form one of the largest transport system superfamily. Many ABC exporters contain asymmetric nucleotide-binding sites (NBSs) and some of them are inhibited by the transported substrate.1 For the active transport of diverse chemically substrates across biological membranes, ABC transport complexes use the energy of ATP binding and subsequent hydrolysis. In this thesis, the heterodimeric ABC exporter TmrAB2,3 from Thermus thermophilus, a functional homolog of the human antigen translocation complex TAP, was investigated by using pulsed electron-electron double resonance (PELDOR/DEER) spectroscopy. In the presence of ATP, TmrAB exists in an equilibrium between inward- and outward-facing conformations. This equilibrium can be modulated by changing the ATP concentration, showing asymmetric behaviour in the open-to-close equilibrium between the consensus and the degenerate NBSs. At the degenerate NBS the closed conformation is more preferred and closure of one of the NBSs is sufficient to open the periplasmic gate at the transmembrane domain (TMD).3 By determining the temperature dependence of this conformational equilibrium, the thermodynamics of the energy coupling during ATP-induced conformational changes in TmrAB were investigated. The results demonstrate that ATP-binding alone drives the global conformational switching to the outward-facing state and allows the determination of the entropy and enthalpy changes for this step. With this knowledge, the Gibbs free energy of this ATP induced transition was calculated. Furthermore, an excess of substrate, meaning trans-inhibition of the transporter is resulting mechanistically in a reverse transition from the outward-facing state to an occluded conformation predominantly.3 This work unravels the central role of the reversible conformational equilibrium in the function and regulation of an ABC exporter. For the first time it is shown that the conformational thermodynamics of a large membrane protein complex can be investigated. The presented experiments give new possibilities to investigate other related medically important transporters with asymmetric NBSs or other similar protein complexes.
Ribosomes catalyze protein synthesis by cycling through various functional states. These states have been extensively characterized in vitro, yet their distribution in actively translating human cells remains elusive. Here, we optimized a cryo-electron tomography-based approach and resolved ribosome structures inside human cells with a local resolution of up to 2.5 angstroms. These structures revealed the distribution of functional states of the elongation cycle, a Z tRNA binding site and the dynamics of ribosome expansion segments. In addition, we visualized structures of Homoharringtonine, a drug for chronic myeloid leukemia treatment, within the active site of the ribosome and found that its binding reshaped the landscape of translation. Overall, our work demonstrates that structural dynamics and drug effects can be assessed at near-atomic detail within human cells.
Despite a high clinical need for the treatment of colorectal carcinoma (CRC) as the second leading cause of cancer-related deaths, targeted therapies are still limited. The multifunctional enzyme Transglutaminase 2 (TGM2), which harbors transamidation and GTPase activity, has been implicated in the development and progression of different types of human cancers. However, the mechanism and role of TGM2 in colorectal cancer are poorly understood. Here, we present TGM2 as a promising drug target.
In primary patient material of CRC patients, we detected an increased expression and enzymatic activity of TGM2 in colon cancer tissue in comparison to matched normal colon mucosa cells. The genetic ablation of TGM2 in CRC cell lines using shRNAs or CRISPR/Cas9 inhibited cell expansion and tumorsphere formation. In vivo, tumor initiation and growth were reduced upon genetic knockdown of TGM2 in xenotransplantations. TGM2 ablation led to the induction of Caspase-3-driven apoptosis in CRC cells. Functional rescue experiments with TGM2 variants revealed that the transamidation activity is critical for the pro-survival function of TGM2. Transcriptomic and protein–protein interaction analyses applying various methods including super-resolution and time-lapse microscopy showed that TGM2 directly binds to the tumor suppressor p53, leading to its inactivation and escape of apoptosis induction.
We demonstrate here that TGM2 is an essential survival factor in CRC, highlighting the therapeutic potential of TGM2 inhibitors in CRC patients with high TGM2 expression. The inactivation of p53 by TGM2 binding indicates a general anti-apoptotic function, which may be relevant in cancers beyond CRC.
Transfer RNAs (tRNAs) are highly structured non-coding RNAs which play key roles in translation and cellular homeostasis. tRNAs are initially transcribed as precursor molecules and mature by tightly controlled, multistep processes that involve the removal of flanking and intervening sequences, over 100 base modifications, addition of non-templated nucleotides and aminoacylation. These molecular events are intertwined with the nucleocy- toplasmic shuttling of tRNAs to make them available at translating ribosomes. Defects in tRNA processing are linked to the development of neurodegenerative disorders. Here, we summarize structural aspects of tRNA processing steps with a special emphasis on intron-containing tRNA splicing involving tRNA splicing endonuclease and ligase. Their role in neurological pathologies will be discussed. Identification of novel RNA substrates of the tRNA splicing machinery has uncovered functions unrelated to tRNA processing. Future structural and biochemical studies will unravel their mechanistic underpinnings and deepen our understanding of neurological diseases.